無タンパク質での配偶子および胚の取扱培地製品ならびに培養培地製品
本願発明は生殖補助医療のための実質的に無タンパク質の細胞培養溶液およびそれらの使用方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ヒトの生殖と受精プログラムに特別化および至適化した無タンパク質培地（ＰＦＭ）に関する。本明細書に記載の実質的に無タンパク質の培地製品は、特にヒトＡＲＴの適用に関係して、とりわけおよび特にプリオンを含む、タンパク質に結合する病原体の、不妊治療を受けている患者、生殖補助医療（ＡＲＴ）により受胎した新生児、およびこれら分野で勤める従事者への感染防止に有用である。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
従来の市販されているヒトのＡＲＴ手順のための胚培養培地は、ヒトの血液および組織源から得られたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。いくつかの研究室では、同様に雌ウシの血液および組織源から得られたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もヒト胚培養手順のタンパク質源として使用されている(Loutradis et al., 1992; Quinn, 1994)。ＨＳＡを含む培地およびＢＳＡを含む培地の効率は同様であると報告された(Staessen et al., 1998)。ドナー（ヒトまたはウシ）から得られたタンパク質の培養培地での使用は、受胎補助治療を受けている患者へ病気を伝染する可能性を有する。マウス、ウサギ、および霊長類用の合成培地が近年報告されたが(Spindle, 1995; Li et al., 1996; Schramm and Bavister, 1996)、卵母細胞の収集から始まり、続いて精子洗浄、媒精、卵割胚期までの受精、および最終的な胚移植までの（添加したタンパク質もしくはアルブミン、または動物もしくはヒト由来のタンパク質抽出物を欠く）既知組成培養系での、生存可能なヒト胚の産生は記載されていない。受精用の精子は、依然として血清タンパク質を含む培地で調製されていたため、ヒトへの適用のための既知組成無タンパク質培地（ＰＦＭ）の以前の主張（previous claims）は、実際には本当の無タンパク質ではなかった(Mohr & Trounson, 1986; Serta and Kiessling 1997 (Abst); Parinaud et al. 1999)。したがって、完全に無タンパク質であるＡＲＴ手順のための培地は、今までに記載されていない。
【０００３】
潜在的に有害なドナータンパク質の使用を避けることで生殖補助治療を受けている患者の安全を保証するために、生存可能なヒトの初期卵割期胚の産生に使用する合成培地を利用可能にすることが、当該技術分野で必要とされている。特にヒトの後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および肝炎などのウイルス性疾患、あるいはプリオンによって感染するクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、あるいは血液由来産物中の他の病原性疾患の感染可能性に関する懸念は、世界的なＡＲＴの分野における多くの医療サービスの提供者を、胚の培養および取り扱い手順のためのドナータンパク質の代替物の探求へと導いた。
【０００４】
致死性のウイルス性疾患（ＡＩＤＳ）の血液由来産物を介する血友病患者への感染は、十分に実証されている(例えば Craven et al., 1997, Med. Sci. Law 37: 215-227; Keshavjee et al., 2001, Soc. Sci. Med. 53: 1081-1094; Weinberg et al., 2002, Ann. Intern. Med. 136: 312-319; Evatt, 2006, Semin. Hematol. 43: S4-9参照)。下垂体から抽出されたヒト成長ホルモンは、ヒトへＣＪＤを感染させる能力があり(Esmonde et al., 1994)、ヒトゴナドトロピンの注入も、人から人へＣＪＤを感染させることが可能であることがわかった(CDC, 1985)。（ＣＪＤプリオンの力価は血液中では低いが、）ＣＪＤは血液を介して感染可能である（Heye et al., 1994）。過去に、Ｂ型肝炎ウイルスで汚染された貯蔵血清を含む培地で培養した胚を受け取り、Ｂ型肝炎の蔓延が約２００人の体外受精（ＩＶＦ）患者で起きた(van Os et al., 1991)。近年、科学界は胚の培養および取り扱いで使用した培養培地の市販製剤が、後にＣＪＤで死亡した人間によって提供されたアルブミンで汚染されているかもしれないことを、患者に知らせることのジレンマに直面した(Kemmann, 1998)。
【０００５】
無タンパク質培地で、接合子期および卵割期からのマウス胚盤胞発生の報告が多数ある。最も初期の報告には、高分子量コロイドであるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を潤滑剤および培地の粘性を増加させる目的で使用したBrinster (1965)およびCholewaとWhitten (1970)の報告が含まれる。この研究に続いて、他の多くの研究者がマウスと同様に他の哺乳類の胚を、無タンパク質培地で培養することに成功した(Dandekar and Glass, 1990; Spindle, 1995; Li et al., 1996; Schramm and Bavister, 1996)。近年、ＰＶＰに加えて、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）(Bavister, 1995)もまた培養培地中の血清タンパク質との置き換えに使用された。例えば、Biggers et al. (1997)は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および／またはアミノ酸で置き換え、そのマウス受精卵の発生への効果について検討した。彼らは、ＰＶＡはマウス胚培養培地では完全にはＢＳＡと置換できないことを観察した。ＰＶＡの効果は、胚盤胞発生率においてはＢＳＡより少しだけ小さかったが、部分的な孵化率（rate of partial hatching）では著しく小さかった。ＰＶＡでのＢＳＡの置き換えは全体の応答を低下させたが、大きな攪乱は生じなかった。
【０００６】
多くの生物学的役割に加えて、血清タンパク質は培養培地での潤滑特性および粘性などの有用な物理的特質を与える。培養培地の増加した粘性および潤滑特性は、胚の取り扱いおよび操作を容易にし、培養ディッシュの壁や胚移植カテーテルへの胚の付着防止に必要である。ＰＶＰおよびＰＶＡを組み込むことは、単に血清タンパク質の物理的特質を複製するのに役立つだけである。しかしながら、ＰＶＰおよびＰＶＡは固定された窒素の供給源ではなく、タンパク質の様々な生物学的役割は果たさない。加えて、ＰＶＰおよびＰＶＡの催奇形性は十分に調べられてなく、ヒトの治療的生殖補助での使用に問題がある(Gardner and Lane, 1998a)。
【０００７】
最も最近ではSerta et al. (1997) およびParinaud et al. (1998a)などの複数の研究者が、生存可能なヒト胚を無タンパク質培養系で産生することを試みた。しかしながら、Sertaと共同研究者ら(1997)は、（後の培養は無タンパク質培地で行われたが、）媒精用の精子をＢＳＡのカラムを通してスイムダウンによって調製した。これら研究者は、３１％（ｎ＝４５）の妊娠率を達成し、そのうち数名は正常の出生児を満期出産するまでになった。Parinaud et al. (1998a)は、媒精を無タンパク質培地で行い、無タンパク質培地で調製した精子での受精を達成した。しかしながら、得られた接合体はＢＭ１培地で培養され、この引用文献はＢＭ１培地がタンパク質を含有しているかどうか特定していなかったが、同グループの以前の出版物ではＢＭ１培地は１％のＨＳＡを含んでいることを提示していた(Parinaud et al., 1998b)。
【０００８】
幾人かの研究者は、単一の抗酸化物質およびＥＤＴＡなどのキレーター(Mehta and Kiessling, 1990; Serta et al., 1997)での血清タンパク質の置換は、マウスおよびヒトでの受精および生存可能な胚の卵割を損なわないことを示した。しかしながら、Serta et al. (1997)は、胚移植カテーテルは無タンパク質培地で大規模にすすがれることを提示し、これは胚が胚移植カテーテルの内壁に付着する傾向にあることを暗示している。血清タンパク質は、培養培地中のｐＨを維持する役割も持っている(Moessner et al., 1993)。生物システムでの栄養素としての役割に加えて、タンパク質は連鎖破壊型抗酸化物質および金属イオンのキレーターなどの他の多くの役割を有している(Barber, 1961; Vidlakova et al., 1972; Wayner et al., 1987)。
【０００９】
アルブミンおよび血漿タンパク質の生理学的機能は一般的に十分に実証されている。膜の過酸化を防止するアルブミンの役割は、膜の安定性における直接的な役割を示している。それはキャピラリー膜透過性および浸透圧調整に関与している。アルブミンは、血漿中の全コロイド浸透圧の８０％を供給する。アルブミンは二酸化炭素の輸送に関与し、ｐＨバッファーとして作用する。アルブミンは、血漿の非炭酸水素バッファー値の最も大きな部分（９５％）を占める。タンパク質はまた、エネルギー源としての役割も持っている。脱アミノ化アラニンはピルビン酸であり、アセチルＣｏＡまたはグルコースやグリコーゲンのいずれかに変換可能である。アルブミンは脂質の可溶化を補助し得、ホルモン、ビタミンおよび金属を輸送する。それは、これら成分の放出および利用のためのリザーバーとして役立っている。
【００１０】
したがって、培養培地の血清アルブミンを置換する試みは、これらのインビボでの役割と、インビトロでの胚の取り扱いおよび操作に有用な物理的特質とを考慮に入れるべきである。単一の成分では血清タンパク質のすべての機能は満たさないであろう。
多くの動物種の発生を補助する無タンパク質培地が以前に記載されたが、かかる無タンパク質培地がヒトで成功裡に使用されたことはない。また、かかる培地がヒトの胚発生を補助する、または至適であるとも推定できなかった。したがって、特にヒトのＡＲＴおよびＩＶＦに適応する、定義された無タンパク質成育培地についての明確な必要性が存在する。
【００１１】
［関連技術の背景］
特にげっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）由来の細胞である哺乳動物細胞の治療および培養用であるが、ヒトの体外受精用の受精、胚発生、および妊娠用でもある既知の推定的な「無タンパク質」培地が存在する。Caro et al.はヒトへの適用のためのかかる「無タンパク質培地」の一つを記載した。しかしながらタンパク質は、それなくしては精子が卵子を貫通および／または受精する能力を獲得しない受精能獲得の誘導に必要であるので、彼らは精子調製培地中のタンパク質の必要性を克服することはできなかった。したがって、Caroと共同研究者らの培地系は、完全に無タンパク質ではない。同様に、Serta et al. (1997; abstract)およびParinaud et al. (1998a, abstract; 1999)もまた、ヒトのＡＲＴ用の「無タンパク質」培地を記載したが、彼ら以前のCaro et al. (1986)のように、培養系の少なくとも１つの段階でタンパク質を使用した。
【００１２】
これら引用文献に記載のように、添加したタンパク質を含有する培地で事前に調製された精子を洗浄することは、特にウイルスおよびプリオンの感染体を完全な確実性をもって除去しない。加えて、このことは精子を不必要なストレス性の洗浄条件に曝し、マンパワーおよび資源の過剰な要求を課すことになり得るため、不利益でもある。
【００１３】
ＩＶＦと関連せず、哺乳類細胞、特にヒト細胞の成育用「無タンパク質」培地が、とりわけKovar et al., 1987, Biotechnology Letters, vol. 9 no. 4, p. 259-264 “Iron Compounds at high Concentrations Enable Hybridoma Growth in a Protein-free Medium”、Keen, 1995, Cytotechnology, vol. 17: 193-202 “The culture of rat myeloma and rat hybridoma cells in a protein-free medium”、Stoll et al., 1996, J. Biotechnology, vol. 45, p. 111-123 “Systematic improvement of a chemically defined protein-free medium for hybridoma growth and monoclonal antibody production.”で開示された。この研究は、特にモノクローナル抗体生産に関し、かかる培地をＩＶＦまたはＡＲＴ使用に適応することを開示していない。ヒトのＩＶＦ手順に適応または適合しないが、無タンパク質成育培地を開示する他の出版物は、Zang et al., 1995, Biotechnology, vol. 13, p. 389-392, “Production of Recombinant Proteins in Chinese Hamster Ovary Cells Using A Protein-Free Cell Culture Medium”; and International patent application Publication no. WO 2005/120576 A2である。
【発明の概要】
【００１４】
［発明の概要］
本願発明は、ＡＲＴ手順を用いた低妊孕性（sub-fertility）および不妊性の治療および緩和における、ヒト卵子の回収（ｉ．洗浄培地）、精子の取り扱いおよび貯蔵（ｉｉ．配偶子取り扱い培地）、ヒト卵子の受精（ｉｉｉ．胚培養培地）、配偶子および胚の取り扱い（ｉｖ．配偶子および胚取り扱い培地）、および同様に、ヒトへの適用のための、得られた接合体の培養液（ｖ．胚培養培地）での１〜２の卵割周期を通じた発生のための、新規の無タンパク質胚培養培地調合物に関する。本願発明は、上記すべての新規培地溶液をその代替物／培地として置き換えおよび／または使用することができる単一培地溶液の処方を含む。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、同発明者によって以前に報告された（そこではＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂシリーズで呼ばれる）無タンパク質培地とは異なる(Ali, 1997; Ali et al., 2000)。以前の報告では、発明者は３つの前駆培地、すなわちＡＲＴ−１、ＡＲＴ−２およびＡＲＴ−３の処方に至った系統的な研究を記載した。同報告で、発明者は実質的に無タンパク質の培地シリーズであるＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂが、ＡＲＴ−１からどのように発展したかを記載した。臨床妊娠を達成するために、実質的に無タンパク質のＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂ培地シリーズ中で卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）によって産生した胚が、３９歳以下の女性２１人中１１人（５２．４％）の治療に成功裡に使用された。ＡＲＴ−１、ＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂ培地シリーズの処方は、開示されていない。本願発明はＡＲＴ−３前駆培地とは異なるが、それから調合された実質的に無タンパク質の培地を提供する。組成ではなく、ＡＲＴ−３前駆培地の開発が発明者によって記載されている(Ali,1997; Ali et al., 2000)。
【００１５】
本願発明の例示的な態様では、一連の実質的に無タンパク質の培地が特別に開示され、本明細書ではＰＦＭ−１１シリーズと名付けられている。これら培地は、配偶子および胚を害し得、ＡＲＴ治療を受けている患者、かかる治療によって受胎した新生児およびＡＲＴ治療手順に関与する医療従事者へ、現在知られているおよびこれまでに知られていない致命的な病気を潜在的に感染する可能性がある潜在的に有害な不均一の生物学的成分を欠く、均一の組成であるということだけでなく、体外受精技術および方法を管理する厳密な新基準および新規制に適合するという特別な利点を有する。
【００１６】
本願発明による実質的に無タンパク質の培地調合物の完全に定義された性質は、従前は現在利用可能な胚培養培地調合物の未定義な性質および不均一な組成のために阻まれていた着床前胚の代謝の研究を促進するのにも有用である。継続的超微小滴（continuous ultramicrodroplet、cUMD）培養法を用いて、これら実質的無タンパク質培地（ＰＦＭ）シリーズで産生したヒト２日胚の品質は、血清タンパク質を含有する市販のコントロール培地調合物で発生した胚に対し統計学的に遜色がないか、またはより優れていた。ＰＦＭ培地のヒト精子に対する毒性はなかった。通常のＩＶＦおよび卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）によるヒト胚の受精および続く発生は、コントロールと比較して遜色がなかった。
【００１７】
本発明の実質的に無タンパク質の培地は、実質的に無タンパク質のヒト胚培養および取り扱い培地としての使用にも適しており、タンパク質結合性の疾患（protein-bound diseases）が患者および新生児に感染しないことを保証する。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、有効性を失うことなく２年間まで−２０℃で冷凍保存可能である。
【００１８】
本願発明は、培養系において添加ドナータンパク質の必要性を成功裡に克服し、卵子回収から始まり、精子調製、媒精、受精、得られた胚の培養および胚移植までの、実質的に無タンパク質の培地製品を利用するヒトのＡＲＴ適用のための、実質的に無タンパク質の培地系を提供する。この特徴は、手順中のいくつかのところでタンパク質を含有する培地製品を利用したために完全に無タンパク質ではない以前に記載の「無タンパク質」培養系から、本発明の培地を有利に区別する。それゆえに、これら従来の培養培地は感染病原体に汚染される可能性があり、何らかの規制上の制約に直面し得る。本願発明の多様な成分の組成、範囲、好ましい範囲および特定の仕様が、本明細書に開示される。
【００１９】
本願発明は、インビボおよびインビトロにおけるタンパク質の多様な役割を部分的に置換できるアミノ酸、抗酸化物質およびキレーター、オスモライト、ビタミン、栄養素ならびに代替エネルギー源などの個々の成分の効果、耐性および至適レベルの決定に関する研究の産物であり、ドナー血清タンパク質を含まない本発明の多様な無タンパク質の取り扱い培地（例えば、精子および卵母細胞取り扱い培地ならびにＩＣＳＩ培地）および胚培養培地中のタンパク質の機能を例証する。記述成分の至適濃度は、多くの胚培養培地を調合するのに利用された。続いて、至適な胚発生および著しく高い胚盤胞の孵化率を示したこれら培地の最高のものが同定され、さらに添加血清タンパク質の非存在下でヒト胚発生を補助するために洗練された。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、同培地で調製した精子でヒト卵母細胞の受精を補助することが可能である。得られた接合体は、発生可能な初期卵割期ヒト胚を形成するように、引き続き実質的に無タンパク質の培地で発生させた。これら胚の移植は、正常な妊娠および出生をもたらした。
【００２０】
したがって、本願発明はＩＶＦ／ＡＲＴ手順の全過程（卵子回収、精子調製、媒精、受精、得られた胚の培養および胚移植）において有用で、培養系において添加タンパク質の必要性を克服する培地を成功裡に提供する。
【００２１】
［発明のある態様の詳細な記載］
本願発明は、タンパク質またはタンパク質様成分を欠く、胚の取り扱いおよび培養培地と一般的に呼ばれる一連の栄養溶液を提供する。これら培地は、ヒト卵子の受精および続く２〜６日までの体外インビトロでの受精卵の発生に有用である。これら栄養溶液は、「胚培養培地」と呼ばれる。ＩＶＦおよびＡＲＴに加えて、実質的に無タンパク質である栄養分の成育培地の使用が有利であると思われる他の方法論および技術には、幹細胞の技術および治療、細胞／組織再生および移植治療手順が含まれる。当業者は、かかる使用のために本明細書に係る培地の適応方法を理解するだろう。
【００２２】
以下のさらなる詳細に開示するように、本発明の実質的に無タンパク質の培地のヒト配偶子および胚についての使用は、ＩＶＦおよびＡＲＴの有効性を増加した。例えば、現在利用可能なタンパク質含有の胚培地と比較した場合（全年齢群を合わせて３３％の妊娠、Ali, 2004で引用）、実質的に無タンパク質の（ＰＦＭ−１１）培地で、通常のＩＶＦの使用により得られた臨床妊娠率は、全年齢群では５０％（２８人中１４人）にまで、そして４０歳未満の女性では５３．８％（２６人中１４人）にまで増加する。本発明の実質的に無タンパク質の培地でのＩＣＳＩ臨床妊娠率は、同様に全年齢群では４６．２％（２６人中１２人）にまで、そして４０歳未満の女性では５４．５％（２２人中１２人）にまで増加する。この差は、本発明の実質的に無タンパク質の培地にとって良い方向に統計学的に有意であり、本発明の実質的に無タンパク質の培地は、現在市場で入手可能な市販のタンパク質含有培地と少なくとも同等である（および優位になり得る）ことを示している。ＰＦＭ−１１培地で、通常のＩＶＦで産生した胚由来の出生児数は１２であり、ＩＣＳＩでは１２であった。本発明のＰＦＭ−１１で産生した胚由来の出生児は、明らかに正常で、知的で、口数が多くおよび活発である（親の報告による）。これら統計学的データは、かかる出生をした子供の少なくとも２４のサンプルから作成された。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「無タンパク質」、「本質的に無タンパク質」および「実質的に無タンパク質」の用語は、培地が非タンパク質含有成分を使用して調製されたこと（本明細書中さらに詳細に記載される）、およびタンパク質またはタンパク質含有成分が培地に添加されなかったことを意味するように意図している。
本願発明の例示的な態様には、ＰＦＭ−１１シリーズと名付けられた一連の実質的に無タンパク質の培地が含まれる。これら培地シリーズは、すなわち、
１．実質的に無タンパク質の洗浄培地（Substantially Protein-Free Flushing Medium）
２．実質的に無タンパク質の配偶子（精子）取り扱い培地（Substantially Protein-Free Gamete (Sperm) Handling Medium）
３．実質的に無タンパク質の配偶子（卵母細胞／胚）取り扱い培地（Substantially Protein-Free Gamete (Oocyte/Embryo) Handling medium）
４．実質的に無タンパク質の胚培養培地（Substantially Protein-Free Embryo Culture Medium）
の特別な培地製品の範囲を有する。
【００２４】
これら培地は以下に説明される方法に従って使用され、これら培地の使用を例証することを目的とするが、とりわけ当業者に知られているＩＶＦまたはＡＲＴの方法での培地の付加的使用に限定するものではない。本明細書に説明された実験での本発明の培地の開発において、各手順は通常のタンパク質含有培地および本発明の例示的なＰＦＭを使用して、平行して行われた。
【００２５】
ヒト精子調製
男性患者は自慰行為によってヒト精液を産生した。精子は標準的なスイムアップ技法によって、および時に密度勾配遠心で調製した。密度勾配手順では、回収したペレットは２度洗浄し、培養培地に再懸濁した。精子調製物は、適当な試験またはコントロール培地を使用して作製した。具体的には、ＩＣＳＩまたはＩＶＦ用の精子は、タンパク質欠乏の胚発生への効果実験のために、実質的に無タンパク質の（ＰＦＭ−１１）培地で調製した。収集した精子は使用まで、３７℃、気体ＣＯ２が５％の気相下でインキュベートした。
【００２６】
卵巣刺激および卵母細胞回収
卵巣刺激は、中黄体期から始まり、月経または下方制御が達成されるまで、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト(Buserelin; Suprefact; Hoescht, Frankfurt, Germany)を皮下注入して誘導した。下方制御は子宮内膜厚が４ｍｍまたはそれ以下になった場合、および血中のエストラジオール、プロゲステロンおよびＬＨレベルがベースライン値に達した場合に達成されたとみなした。卵胞刺激ホルモン(FSH; Metrodin; Serono, Rome, Italy)は、卵胞の発育（recruitment）が開始するように３日間注入投与した。その後、ヒト閉経期ゴナドトロピン(Pergonal 500; Serono, Rome, Italy)を、卵胞発生を刺激する患者の応答に従って投与した。排卵は、卵胞の大きさが１６ｍｍまたはそれ以上に達した後、１０，０００ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG; Pregnyl; Organon, Oss, Holland)の注入によって誘導した。卵母細胞回収（ＯＲ）は、超音波ガイドの膣吸引により３６時間後に行った。
【００２７】
媒精および培養技法
体外受精（ＩＶＦ）
卵母細胞は、平衡化および胚試験したミネラルオイル(M8410, Sigma Chemicals, and USA)下、平衡化した培養培地の微小滴中１００，０００／ｍＬ濃度の運動性のある精子で個別に授精した。授精した卵母細胞は、３７℃、気体ＣＯ２が５％の空気のもとで培養した。 翌朝、卵母細胞は裸化ピペット(Stripper（登録商標）, MidAtlantic Diagnostics, USA)で裸化した。
【００２８】
卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）
代替手順（例えば、ヒトの男性要因の低妊孕率の克服に使用される）において、ＩＣＳＩが行われる。卵母細胞は、ヒアルロニダーゼ溶液(80 IU/mL; Cat No. 10110010, Medi-Cult A/S, Lerso Parkalle 42, 2100 Copenhagen, Denmark)に３０秒間曝してＩＣＳＩ用に調製し、それから平衡化したMedi-CultTMまたは本発明の実質的に無タンパク質の培地中に移した。ヒト卵母細胞は、３７℃、気体ＣＯ２が５％の気相下で、培養培地中において５〜７分間インキュベートし、それから裸化ピペット(ART No.1670, International Medical Products BV, Zutphen, Holland)で裸化した。裸化したヒト卵母細胞は洗浄し、最終的にはさらに３０〜６０分間培養培地中でインキュベートした。
【００２９】
顕微操作には市販のＩＣＳＩピペットを使用した(Injection Needles, Cat No.130340B; Holding pipette, Cat No. 13030013; Laboratoire CCD, 60 Rue Pierre Charron, 75008 Paris, France or Injection needle, Cat. No.10-MIC; holding pipette, Cat. No. l0-MPH-120; Humagen, Charlottesville, Virginia 22911, USA)。ＰＶＰ(Cat No. 1089001, Medi-Cult A/S, Denmark)の超微小滴５μＬを、ペトリディッシュ(Cat No. 1006, Falcon Plastics, Becton Dickinson, Rutherford, New Jersey, 07070, USA)の中心に薄く広げた。広げたＰＶＰは最大で５つまでの、ＨＥＰＥＳ緩衝のＩＶＦ培地(Gamete-1009 Scandinavian IVF Sciences AB, Gothenberg, Sweden) １０μＬの微小滴で取り囲んだ。微小滴は、平衡化および胚試験したミネラルオイル(M8410, Sigma Chemicals, USA)で覆った。（１〜２μＬの）精子調製物は、広げたＰＶＰの中心に導入した。成熟した卵母細胞のＩＣＳＩは、（例えばPalermo et al., 1992に係る）従来法で行った。
【００３０】
超微小滴培養
培養培地の超微小滴（UMD、３〜７のヒト胚培養には１．５〜２μＬ）は、平衡化したミネラルオイルをあらかじめ入れた４ウェルディッシュ中で作った。ディッシュは、３７℃、気体ＣＯ２が５％の気相下でインキュベートした。予備実験では、培地は平衡化した培養培地を用いて、精密に引き延ばされたパスツールピペットで毎日交換したが（ＵＭＤ技法）、後の実験では３日培養まで交換しなかった（ｃＵＭＤまたは継続的ＵＭＤ）。
【００３１】
受精の判定
受精はＩＣＳＩまたはＩＶＦ後、１８時間〜２０時間で判定した。卵母細胞は、２つの異なる前核が見えたときに受精したとみなされた。受精した卵母細胞は、３７℃、気体ＣＯ２が５％の空気のもとで、平衡化した培地の微小滴または超微小滴中で培養した。卵割および胚の品質は、２４時間後評価した。
【００３２】
接合体停止率
このパラメーターは、本発明による培養培地が１細胞期で発生阻止を起こすかどうかを判定するのに利用した。培地の有効性は、このアッセイを使用して判定できる。１細胞期での発生阻止の割合がより高いことは、培地が欠乏しているまたは有効性がより低いことを示唆するだろう。
【００３３】
２日卵割胚の品質判定
２日胚の胚品質を判定するために、２つのパラメーター、すなわち平均卵割球スコアおよび平均胚グレードを使用した。これらは、以下のように決定される。
（ｉ）平均卵割球スコア＝卵割球の合計数／胚の合計数
（ｉｉ）平均胚グレード＝胚グレードの合計／胚の合計数
【００３４】
ほとんどの健康なヒト２日胚は、一般的に４細胞期を達成することから、平均卵割球スコア（２〜６の範囲）が４およびそれ以上が良好とみなされた。胚は数字１が低品質を示して４が高品質を示す、１〜４のスケールに従ってグレードした。最低３人（しかし好ましくは４人）の研究室の職員によって、胚をまとめてグレードした。加えて、卵割期胚の発生率における差を確証するために、他の２つのパラメーターを含めた。これらは、ヒトの研究における２日培養での、（ｉ）４細胞期またはそれ以上の胚の割合、および（ｉｉ）グレード３およびそれ以上の胚の割合である。
【００３５】
培地処方
本願発明の例示的な実質的に無タンパク質の培地の処方は、以下の通りである。アルブミンは、固定された窒素および栄養素の供給源、抗酸化物質および膜安定性を含む他の多くの役割を持つことで知られている。したがって、本発明の実質的に無タンパク質の培地は、アルブミンを培養物中でアルブミンの機能を個々にまたは集団的に行う他の培地成分で置換した。これら目的で使用される個々の胚培養培地の成分は、アミノ酸（アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セリンを限定することなく含む）、抗酸化物質およびキレーター（例えば、ＥＤＴＡ、還元型グルタチオン、トコフェロールなど）、代替エネルギー源（フルクトース、グルタミン、ピルビン酸ナトリウムなど）、オスモライト（マンニトールおよびミオイノシトールを含む）、ビタミン（アスコルビン酸、シアノコバラミン、葉酸、トコフェロールなど）、および元素鉄を含む。
【００３６】
最も高い胚盤胞発生を支持する個々の成分の濃度が、至適とみなされた。本願発明の開発において、３つの培地（ＡＲＴ−１、ＡＲＴ−２およびＡＲＴ−３）が調合された。以前に発明者は、培養培地ＡＲＴ−１から(Ali, 1997; Ali et al., 2000)、実質的に無タンパク質の培地ＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂシリーズを調合するために着手した多様な実験を記載した。本発明のＰＦＭ−１１無タンパク質培地シリーズは、培養培地ＡＲＴ−３(Ali, 1997; Ali et al., 2000)から調合された。
ＰＦＭ−１１シリーズの多様な培地製品の最終調合物を、以下に記載の表に示す。本明細書に記載するように、これら培地調製物のＨＥＰＥＳおよび炭酸水素塩の濃度は変動する。
【００３７】
本発明の実質的無タンパク質培地は、ミネラル塩、アミノ酸、抗酸化物質、抗体、エネルギー成分、およびバッファー成分（ＣＯ２補充条件下での培養のためのＨＥＰＥＳおよび炭酸水素塩）を含み、市販のタンパク質含有培地と似ているがその詳細において異なる。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、独自に巨大分子種（メチルセルロースおよび関連するポリマー）、および任意に代謝されない糖アルコール（Ｄ−マンニトール）を含む。
【００３８】
本発明の実質的に無タンパク質の培地に含まれる巨大分子は式Ｉ：
【化１】
式中、
各Ｒは独立してＣＨ３またはＨであり、ｎは約３４〜約４３の間である、のメチルセルロースである。
【００３９】
上記メチルセルロースの式中、ＲはＨまたはＣＨ３のいずれかになり得る。メトキシ置換の範囲は、重量で２７．５〜３１．５％の間に及ぶ。置換の程度（ＤＳ、環のヒドロキシル基へ結合した置換基の平均数）は、１．５〜１．９である。この範囲は、最大の水溶性を示す。より低いメトキシ置換は、より高い水溶性が得られ、好まれる。符号「ｎ」は重合のレベルを意味し、２０℃、２％水溶液における概算粘度指数１５ｃＰＳに関連する、１４，０００ダルトンの分子量に至適に対応する（これら特性を有するメチルセルロースは、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO USA; www.sigmaaldrich.comから市販されている）。これは、約３４〜約４３の間、好ましくは３６〜３９の「ｎ」の値に対応する。ＰＦＭ中におけるこの成分の範囲は、０．０１〜０．１５ｇ／Ｌであり、最も好ましい範囲は０．０９〜０．１ｇ／Ｌである。至適濃度は、０．１ｇ／Ｌである。
【００４０】
メチルセルロースは抗酸化物質およびオスモライトとして作用することが可能で、無毒性、酵素耐性および細胞不透過性である(Stewart et al., 1995)。環境性の傷害、特にフリーラジカルおよび浸透圧変化による攻撃に対しての配偶子および胚の保護を助ける。それは細胞膜を損傷から保護し、恒常性の維持を助ける。それはまた、界面活性剤および潤滑剤でもある。培地の粘性増加に貢献するため、配偶子および胚は、ディッシュの側面ならびにピペットおよびカテーテルの内側に固着しない。これら物理的特質は、それら機能を通常行う血清タンパク質の非存在下で供給される。この物質は不活性で、ヒトへの適用には安全である。
【００４１】
メチルセルロースは他に、ヒトの医薬品および食品産業で２５年間を優に超えて、副作用なしにヒトまたは動物の研究で使用されてきた。ＦＡＯ／ＷＨＯおよびＥＵの勧告はメチルセルロースの摂取を許容し、非発癌性であることが知られていることから、癌研究のネガティブコントロールとして使用されてきた。
【００４２】
メチルセルロースは多様な食品および化粧製品において、増粘剤および乳化剤としても使用され、便秘の治療などの医療用途を有する。それは非消化性、無毒性および非アレルゲン性である。その薬理的／臨床的用途は、賦形剤および担体材料である。それは点眼薬での使用、充填剤および緩下剤としての使用、機能性腸疾患の下痢のための使用、回腸瘻排出の調製のための使用および感染性の下痢を生じる毒性物質の吸収剤としての使用がされる。それは抗酸化物質でもある。
【００４３】
本発明の実質的に無タンパク質の培地は、Ｄ−マンニトールもまた含む。この化合物は、吸収されにくく、ほとんど変化せずに尿中に排出される。抗酸化物質およびオスモライトとして、この物質は有害な環境的影響から胚を保護できる。したがって、悪条件に対して胚を保護するために、部分的に、さらに血清タンパク質と置換することができる。Ｄ−マンニトールが培地中のタンパク質存在下においてさえも、マウス胚盤胞のインビトロでの発生にポジティブな効果を及ぼすことに注目することは興味深い。
【００４４】
本願発明の例示的な実質的に無タンパク質の培地（ＰＦＭ−１１）では、Ｄ−マンニトールは０．０５６〜６．９μＭの範囲内で、２．８μＭ（最も好ましい濃度）の好ましい濃度で存在する。より好ましい範囲は、１．４〜５．５μＭの濃度で、２．５〜３．０μＭの濃度の範囲がさらにより好ましい。最も好ましい濃度は、約２．７μＭの濃度である。Ｄ−マンニトールの実験式は、Ｃ６Ｈ１４Ｏ６であり、次の構造式を有する。
【化２】
【００４５】
Ｄ−マンニトールは、食品添加物であり、ケーキ、製菓および甘味物に使用され、スクロースより甘く、糖尿病患者のための代替甘味料と考えられている。それは、オスモライトおよび抗酸化物質である。それは３０年間を優に超えて、急性脳卒中の治療に高濃度で使用されてきた。この化合物の過剰モル濃度が、深刻な脳損傷および頭蓋内圧上昇の治療に使用される。それは利尿剤であり、中毒の場合の利尿、または細胞外液コンパートメントの測定に使用される。それはまた、ヒトを含む哺乳類において、緩下剤の効果も有する。治療薬としてのＤ−マンニトールの臨床適用での結果としては、ヒトにおける悪影響は報告されていない。複数の種においては、非細胞毒性および非変異原性でもある。Ｄ−マンニトールは吸収されにくく、排泄される(Milde, 1965; Widdowson and Dickerson, 1965)。培養培地中にこの物質を含有させることにより、血清タンパク質の存在下でさえマウスの胚盤胞発生を増加させたことから、抗酸化物質およびオスモライトとしての胚培養でのポジティブな役割が示唆される(Ali, unpublished observations)。その使用はＦＤＡおよびＥＵに許可され、ＦＡＯ／ＷＨＯは食用として安全であると結論付けた。
【００４６】
本発明の溶液および調合物には、式ＩＩのＤ−マンニトールが約０．０５マイクロモーラーから約６．９マイクロモーラーの濃度で存在する。より好ましい範囲は、１．４〜５．５マイクロモーラーである。最も好ましい濃度は、約２．８マイクロモーラーである。
【００４７】
当業者は、血清タンパク質の役割は多数であり、その非存在下において、培地中のタンパク質の完全置換は、１または２の成分自体では提供できないことを理解するだろう。したがって当業者は、本発明はメチルセルロースおよびＤ−マンニトールを補充した培地を単に提供するものではないことを認識するだろう。むしろ本発明は、併せて追加成分の複合混合物を、好ましくは至適濃度で、含む培地、および培養液中の胚に有害と判明した一般に使用される培地成分の選択的除外を提供する。そのうちいくつかは、以下を含む。
【００４８】
（ｉ）栄養および浸透圧バランスの主要なプロバイダーである２種のアミノ酸（Ｌ−タウリンおよびグルタミン酸）の独自の濃度を含む。これらアミノ酸は、１ｍＭ〜３０ｍＭのＬ−タウリンおよび１ｍＭ〜５０ｍＭのＬ−グルタミンの濃度の範囲内で提供され、より好ましくは１０ｍＭ〜３０ｍＭのＬ−タウリンおよび１０ｍＭ〜３０ｍＭのＬ−グルタミン、ならびに最も好ましくはそれぞれ２０ｍＭのＬ−タウリンおよびＬ−グルタミンである。
【００４９】
（ｉｉ）エネルギー源として、ヒト胚の発生阻止を起こしにくい化合物（Ｄ−グルコース、フルクトースまたはピルビン酸を含む）のいずれか１つまたは複数を含む。フルクトースの至適濃度は、約０．５ｍＭ〜６．０ｍＭのフルクトースで、より好ましい濃度は約１ｍＭ〜５．６ｍＭであり、最も好ましい濃度は約５．１ｍＭである。残りの２種のエネルギー源の至適濃度は、本書中の他の場所に示される。
【００５０】
（ｉｉｉ）以下の特定のアミノ酸濃度を含む。
【表１】
【００５１】
（ｉｖ）以下の水溶性ビタミン濃度を含む。
【表２】
【００５２】
（ｖ）５マイクロモーラー〜２０マイクロモーラー、より好ましくは８マイクロモーラー〜１２マイクロモーラー、さらにより好ましくは１０マイクロモーラーのビタミンＥ(Vitamin E Type 6, Sigma Chemical Co.)を含む。
（ｖｉ）接合体および初期卵割期胚の発生に有害となり得るＬ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−セリンを除外する。
（ｖｉｉ）胚発生に有害となり得る元素鉄を除外する。
（ｖｉｉｉ）６０マイクロモーラー〜５００マイクロモーラーおよびより好ましくは２５０マイクロモーラー〜３５０マイクロモーラー、さらにより好ましくは３００モーラーの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含む。
【００５３】
他の化合物
【表３】
【００５４】
＊＊ＨＥＰＥＳ
受精および胚培養培地中 ０ｍＭ
配偶子取り扱い培地中 １５ｍＭ
洗浄培地中 ２５ｍＭ
本明細書中に説明されているＰＦＭ−１１培地シリーズは、少なくとも以下の側面で通常の胚培養培地と異なる。
１．培地へドナー血清タンパク質を添加することがない−これは病気感染の可能性を排除し、本願発明によるＰＦＭ−１１培地シリーズを危険のないものにする。
２．メチルセルロースおよびＤ−マンニトールの存在
３．アミノ酸、抗酸化物質、ビタミン、エネルギー源およびミネラル塩の、すべてが胚培養に至適化した、種類および濃度に関しての培地組成の変更
【００５５】
本発明の培地の利点には、患者／医療従事者に対するリスクの低減がある。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、患者、患者の新生児および培地に曝された医療従事者に対するリスクを低減する理由でも有利である。特定のリスクは残るが、それらは本発明の実質的に無タンパク質の培地を使用して避けられる感染のリスクと比較して、小さなものである。 それらリスクには、使用される成分に対するアレルギーが含まれる。抗生物質以外の原料成分は、主に不活性および非反応性であるため、これが起こる可能性はとても考えにくい。すべての原料成分は、アレルギー応答を誘発する可能性の低い微量濃度である。
【００５６】
臨床試験
ＰＦＭ−１１培地シリーズの最終調合物で産生した胚の移植に、臨床試験が認可された。臨床試験は、通常のＩＶＦまたはＩＣＳＩのいずれかで受精が行われたときの、ＰＦＭ−１１培地シリーズの有効性の違いについても調査した。
【００５７】
統計解析
統計学的比較は、２標本ｔ検定または２×２テーブルで行われた。ｐ＜０．０５またはそれ以下の値を、統計学的に有意と考えた。
【００５８】
［結果］
通常のＩＶＦによる授精の場合でのＰＦＭ−１１無タンパク質培地およびMediCultTM胚培養培地中のヒト同胞卵母細胞の培養特性
通常のＩＶＦ後の同胞卵母細胞の受精率は、MediCultTMコントロールおよびＰＦＭ−１１培地中で同様であった（表Ａ）。ＰＦＭと比較して（２．２％）、より高い割合の接合体がMediCultTMコントロール培地中で停止していたが（８．１％）、統計学的に有意ではなかった。超微小滴培養において、ＰＦＭ−１１中で産生した２日ヒトｃＩＶＦ同胞卵割胚の品質は、コントロール培地で産生したものと比較して、卵割球数およびグレードの面で有意に優れていた。ＰＦＭ−１１培地中では、平均卵割球数は３．４であり、平均胚グレードは３．１であった（ｎ＝１１６）。コントロール培地（MediCultTM）中では、平均卵割球数は３．４と同様であり（ｐ＝０．８６５）、平均胚グレードは２．７とより有意に低くなっていた（ｐ＝０．００１、ｎ＝１１８）。４期以上を達成した胚の割合は両集団で同様であったが、３以上のグレードの胚の割合は、ＰＦＭ−１１無タンパク質集団でより有意に高くなっていた。
【００５９】
【表４】
【００６０】
通常ＩＶＦによる授精の場合でのＰＦＭ−１１無タンパク質培地およびMediCultTM胚培養培地中のヒト同胞卵母細胞の培養特性
ＩＣＳＩ後の同胞卵母細胞の受精率は、MediCultTMコントロールと比較して、無タンパク質ＰＦＭ−１１培地でより優位に高かった（７７．８％に対して６９．４％、ｐ＝０．００４３；表Ｂ）。MediCultTM培地と比較して、接合子期での発生停止がＰＦＭ−１１培地でより低下したが、この違いは統計学的に有意ではなかった（それぞれ２．８に対して６．３％、ｐ＝０．００８８）。超微小滴中での培養において、ＰＦＭ−１１培地中で産生した２日ヒトＩＣＳＩ同胞卵割胚の品質は、コントロール培地で産生したものと比較して、卵割球スコアの面で有意に優れていた（それぞれ３．８に対して３．３、ｐ＝０．００１）。ＰＦＭ−１１培地中で産生した胚の平均胚グレードは、コントロール培地中で産生した胚のものと同様であった（２．９に対して２．８、ｐ＝０．０８０）。４期以上を達成した胚の割合は、両集団において同様であったが、グレード３以上の胚の割合は、ＰＦＭ−１１無タンパク質集団でより有意に高かった。
【００６１】
【表５】
【００６２】
臨床試験
現在利用可能なタンパク質を含有する胚培地と比較した場合（全年齢集団合わせて３３％の妊娠、Ali, 2004から引用）、実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地での通常ＩＶＦ臨床妊娠率は、全年齢集団では５０％（２８人中１４人）に、４０歳未満の女性では５３．８％（２６人中１４人）にまで増加する。実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地でのＩＣＳＩ臨床妊娠率は、同様に全年齢集団では４６．２％（２６人中１２人）に、４０歳未満の女性では５４．５％（２２人中１２人）にまで増加する。この差は本願の実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地にとって良い方向に統計学的に有意であり、本願発明の実質的に無タンパク質の培地は、現在市場で入手可能な市販のタンパク質を含有する培地に少なくとも相当すること（およびより優れている可能性）を示している。通常のＩＶＦによって、ＰＦＭ−１１培地中で産生した胚由来の出生児数は、１２人（出産の治療をした女性２６人中８人の３０．８％、または出産した妊娠女性１３人中８人の６１．５％、一人の妊娠を経過観察で失った）、およびＩＣＳＩでもまた、１２人（出産の治療をした女性２２人中８人の３６％または出産した妊娠女性の６６．７％（１２人中８人））であった。本発明のＰＦＭ−１１で産生した胚由来の出生児は、明らかに正常で、知的で、口数が多く、および活発である（親の報告による）。これら統計学的データは、かかる出生をした子供の少なくとも２４のサンプルから作成された。
【００６３】
結果の有意性
生存可能な初期卵割期ヒト胚産生用の合成培地の利用可能性は、とりわけ、潜在的に危険なドナータンパク質を培地から排除することができるので、生殖補助治療（ＡＲＴ）を受けている患者の安全性を改善する。これは、特にヒトの後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および肝炎などのウイルス性疾患、あるいはプリオンによって感染するクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、あるいは血液由来産物中の他の病原性疾患の伝染に関しての特別な懸念であり、世界中多くの発生学者が胚の培養および取り扱い手順用のドナータンパク質の代替となるものを（不成功だが）探すように仕向けた。危険は確実に現実のものである。過去に、Ｂ型肝炎ウイルスで汚染された貯蔵血清を含む培地で培養した胚を受け取り、Ｂ型肝炎の蔓延が約２００人の体外受精（ＩＶＦ）患者で起きた(van Os et al., 1991)。より最近、科学界は胚の培養および取り扱いで使用した培養培地の市販製剤が、後にＣＪＤで死亡した人間によって提供されたアルブミンで汚染されているかもしれないことを、患者に知らせることのジレンマに直面した(Kemmann, 1998)。
【００６４】
病原体およびプリオンに加えて、血清およびアルブミンなどの血清由来のタンパク質は、子宮内膜症患者、反復流産患者および未解明の不妊症を被る患者にみられるような、胎児毒性因子を含んでいるかもしれない(Miller et al., 1995)。これら胎児毒性因子は、その性質はいまだ解明されていないが、インビトロにおいて胚に有害であることが示された(Miller et al., 1995; Fein et al., 1995)。さらに、血清またはアルブミンのバッチ間変動はよく認識されているので、血清またはアルブミンの使用は再現性の問題を生じる。異なるバッチの血清品質を調節できないことは、産生する胚の品質にも影響する可能性がある。胎児毒性および／または血清タンパク質品質の非再現性に関連する問題は、ドナータンパク質を含有する培養培地の代わりに合成培地を使用した場合には当然避けられる。
【００６５】
超微小滴培養条件下のＰＦＭ−１１培養培地中で産生した胚の品質は、同様の培養条件下で行った場合、タンパク質を含有するコントロール培地で産生したものと同様、またはそれらよりいくらか優れていた。より重要なことに、新規の実質的に無タンパク質の培地ＰＦＭ−１１培地中で産生した胚の受精率、接合体停止率および品質は、試験したどのパラメーターに対しても、タンパク質を含有するコントロール培地で観察されたものより劣ってはいない。一方でコントロール培地は、試験したいくつかのパラメーターで劣っていることが判明した。臨床試験は、ＰＦＭ−１１培地は２日胚について、タンパク質を含有するコントロール胚培養培地と同様に効果的またはより優れていることを示した。さらに、生物起源の危険なドナータンパク質を欠いているので、完全に安全である。
【００６６】
微小滴中で産生した胚の品質改善は、胚によって培地中へ放出された特定の成長因子のオートクリンおよびパラクリン効果が原因であることが早くに示された(Paria and Dey, 1990; Paria et al., 1991; Canesco et al, 1992)。実際にｈＩＧＦ−１の培養培地への添加は、ヒトの着床前発生を増強し、特に胚盤胞形成を著しく改善した(Lighten et al., 1998)。近年、ヒト胚の共同培養はヒトの生殖補助において、より高い着床および妊娠率を生じることが報告された(Almagor et al., 1996)。着床前発生における成長因子の効果は、Kane et al. (1997)によって広く概説された。成長因子の効果に関する以前の研究からの証拠は、インビトロにおける胚発生の明らかな成長パターンの欠如を示している。オートクリン成長因子は、ストレス性の培養条件下では胚発生には不可欠かもしれない。胚の着床前発生にポジティブな効果を示し得る成長因子には、ＣＳＦ−１；ＩＧＦ−Ｉ；ＩＧＦ−ＩＩ；ＴＧＦ−αおよびおそらくはＬＩＦが含まれる。
【００６７】
ＰＦＭ−１１培地で調製された精子で、ＰＦＭ−１１培地中にてヒト卵母細胞の受精が起こることが見出された。受精能獲得には影響はなかった。本明細書中において、ＰＦＭ−１１は、培地中の血清タンパク質の非存在下で受精を促進するのに効果的であることが示された。ＰＦＭ−１１を用いる通常のＩＶＦの間の高い受精率は、培地中のタンパク質の欠如が精子の受精能獲得、受精ならびにインビトロにおける胚発生および続く子宮内での生存率を損なわなかったことを示していた。培地中のタンパク質欠乏にもかかわらず、精子の受精能獲得、卵母細胞への精子の侵入および受精が生じた。
【００６８】
臨床妊娠率、出産率および妊娠中断率は、コントロールと比較して（通常のタンパク質含有培地を使用）、被検集団でより有意に優れていた（本発明の実質的に無タンパク質の培地を使用）。また、被検集団中の出産した妊娠女性の割合は、卵割期胚移植において報告された世界平均と同様であった(DeMouzon and Lancaster, 1997)。
【００６９】
本明細書で開示された実験結果は、以下を明らかにした。（ｉ）本発明の実質的に無タンパク質の培地ＰＦＭ−１１を使用して、通常のＩＶＦの間の精子の卵細胞への侵入、配偶子相互作用、および続く通常のＩＶＦまたはＩＣＳＩ後のヒトでの受精はどちらも損なわれず、（ｉｉ）得られた初期卵割期胚は、生存可能および臨床妊娠の誘発が可能であり、（ｉｉｉ）ＰＦＭ−１１で産生した初期卵割期胚の品質は、一般的に、血清タンパク質培地を含有するコントロール培地で産生したものと同様またはいくらか優れていた。
【００７０】
動物起源の調製物のために採用されるストリンジェントな精製および滅菌処置では、絶対的な確実性をもって未知の病原体感染の可能性を除外できない(Truyen et al., 1995)。実質的に無タンパク質の培地の処方およびCumulase（登録商標）などの組み換えヒアルロニダーゼによるヒアルロニダーゼの置換とともに、現在ではＩＶＦ患者への病気感染の明白なリスクのない、完全に研究室での生殖補助手順を行うことが可能である。
【００７１】
結論として、本願発明の実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地は、通常のＩＶＦの間の精子の卵母細胞への侵入、およびＩＣＳＩまたは通常のＩＶＦ後の受精を損なわずに効果的であることが実証された。ＰＦＭ培地で産生した胚が移植された場合、３９歳以下の女性において５０％の臨床妊娠率があり、妊娠も損なわれなかった。全体として、ＰＦＭ−１１培地は、生存可能なヒト胚の産生において血清タンパク質を含有する培地より優れていない場合は、同等に効果的であった。ヒトの受胎補助手順におけるＰＦＭの日常的な使用は、タンパク質に結合する病原体または危険なプリオンを介しての病気感染の潜在的リスクを排除できる。本研究は、添加タンパク質を欠いた培地中において、無細胞培養系で生存可能なヒト胚の産生が可能であることを示した。
【００７２】
［本発明のＰＦＭ−１１の調製］
基礎塩類溶液（ＢＳＳ）ストック溶液１：
使用される基礎塩類のストック溶液（基礎塩類溶液−ＢＳＳ）の調製は、ＰＦＭ培養培地、胚取り扱い培地、および洗浄培地の最終的な処方である。
【表６】
【００７３】
調製手順：
１．ストック溶液の調製前に、混合容器をＷＦＩ（注射用水、１８．２メガオームの抵抗）ですすぐ。
２．成分１は非常に吸湿性があるため、１０００ｍＬのＷＦＩに加える。
３．絶えず混ぜながら成分２〜７を順に加え、ＷＦＩを用いて最終容量を１０００ｍＬにする。
４．すべての溶質が完全に溶解した後、すぐに滅菌濾過を行う。溶質が残っている場合、濾過をしないこと。０．１ミクロンフィルターが使用可能であるが、濾過時の過剰な圧力を避ける。ストック１溶液は０．２ミクロンフィルターで前濾過し、続いて０．１ミクロンフィルターで濾過できる。
【００７４】
５．濾過後の沈殿物または濁りはないはずである。
６．適した容量の容器に入れる（例えば、ボトル）。
７．ボトルのふたをする（好ましくは、開封明示シールのある（tamper-evident seal）ボトル）。
８．２〜６℃の間で暗所に保管する。
【００７５】
保管および保存期間
基礎塩類溶液（ＢＳＳ）ストックは、２〜６℃の間で保管した場合、２ヶ月間安定していた。使用前には、沈殿物または濁りについて、保管しているＢＳＳストックを常に注意深く点検する。保管の間に、沈殿物が発生または溶液が濁った場合には捨てる。
【００７６】
最終製品中のＢＳＳストック１の含有容量：
炭酸水素ナトリウムが調合物（培養培地製品）中の主に有効なバッファー成分であるところ、調製した最終調合物１０００ｍＬ毎に７０ｍＬ＊＊のＢＳＳが存在しなければならない。
【００７７】
ＨＥＰＥＳが調合物（精子／洗浄培地製品）中の主に有効なバッファー成分であるところ、調製した最終調合物１０００ｍＬ毎に５０ｍＬのＢＳＳを加える。
【００７８】
培地のオスモル濃度を（それぞれ）増加または減少させるＢＳＳまたはＷＦＩ水での最終培地のオスモル濃度調整：
最終容量（すなわち、ＢＳＳ、ＢＡＡＳおよびＢＶＳを加えた後）が１０００ｍＬ以下である場合、最終培地のオスモル濃度は２８５ミリオスモルであるべきで、その後別に少量のＢＳＳをＷＦＩで希釈する。作業ＢＳＳ（ＷＢＳＳ）を得るために、１容量のＢＳＳと９容量のＷＦＩ水とを使用する。ＷＢＳＳのオスモル濃度を２８５ミリオスモルに調整する。調整したＷＢＳＳで、最終培地の最終容量を１０００ｍＬにする。
全ストック溶液由来の最終調合物の組成については、ストック４のインストラクションを参照。
【００７９】
基礎アミノ酸溶液（ＢＡＡＳ）ストック溶液２：
この手順はＰＦＭ培養培地、配偶子取り扱い培地、および洗浄培地の最終調合物中に含有する、溶液中の基礎アミノ酸（基礎５アミノ酸溶液−ＢＡＡＳ）の１リットルストック溶液の調製に使用した。
【００８０】
試薬
【表７】
【００８１】
ストック２ＢＡＡＳ調製のインストラクション
１．ＷＦＩ（注射用水、１８．２メガオームの抵抗）で混合容器をすすぐ。
２．成分１、２および４〜１１を４００ｍＬのＷＦＩ中に溶解する。
至適条件以下で溶解が困難になるかもしれないので、供給元の保管推奨条件を遵守することが必要である。沈殿物が発生した場合、廃棄して、２５ｍＬの０．１１Ｎ ＮａＯＨおよび２７５ｍＬのＷＦＩを用いて再開する。水酸化ナトリウムは、最後の選択肢としてのみ用いられる。
【００８２】
３．Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２ＯおよびＬ−バリンは溶解が難しくなる可能性があり、かかる状況においては、溶解は１Ｎ ＨＣｌを用いることによって達成することができる。成分３および１２は、別々の３００ｍＬ容量のＷＦＩに溶解すべきである。可溶化達成のためには、可能な限り最小容量の１Ｎ ＨＣｌのみを使用する。使用すべき１Ｎ ＨＣｌ（胚試験済）の最大量は、３００ｍＬのＷＦＩ中２５ｍＬである。全成分を溶解するのに、水、アルカリおよび酸の３７℃以上での加熱は避ける。
４．成分３および１２が完全に溶解したら、ステップ２で作製した水溶性アミノ酸の一部２００ｍLを、（a）全容量が５００ｍＬとなるようにL−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏの溶液３００ｍＬに、（b）全容量が５００ｍＬとなるようにＬ−バリンの溶液３００ｍＬに、段階的な方法で徐々に加えることにより、１０００ｍＬの最終容量にする。
【００８３】
５．沈殿を避けるために一定に混合しながら、段階的な方法で徐々に２つの５００ｍＬ容量を合わせる。
６．すぐに０．２ミクロンフィルターで、溶液を滅菌濾過する。
７．適当な容量の容器（例えば、ボトル）に入れる。
８．ボトルのふたをする（好ましくは、開封明示シールのあるボトル）。
９．２〜６℃の間で暗所に保管する。
【００８４】
保管および保存期間
基礎アミノ酸溶液（ＢＡＡＳ）ストックは、２〜６℃の間で保管した場合に２ヶ月間維持する。使用前には、沈殿物または濁りについて、保管しているＢＡＡＳストックを常に注意深く点検する。保管の間に、沈殿物または濁りが発生した場合には捨てる。
【００８５】
最終製品中のＢＡＡストックの含有容量：
すべての最終調合物の調製物に、１０００ｍＬあたり１０ｍＬのＢＡＡストック溶液を使用するべきである。
遊離型のＬ−チロシンおよびＬ−シスチンが市販されていないため、Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２ＯおよびＬ−シスチン・２ＨＣｌを使用した。
【００８６】
基礎ビタミン溶液（ＢＶＳ）ストック溶液３
本実施例によるプロトコルでは、ＰＦＭ培養培地、配偶子取り扱い培地、および洗浄培地の最終調合物に含有する、溶液中の基礎ビタミン（基礎ビタミン溶液−ＢＶＳ）の１リットルストック溶液を調製する。
【００８７】
試薬
【表８】
【００８８】
ストック３（ＢＶＳ）調製のインストラクション
１．８００ｍＬのＷＦＩ水（注射用水、１８．２メガオーム抵抗）中に成分１〜７を溶解する。成分が溶解しない場合、最後の選択肢として少量の０．１Ｎまたは１Ｎ ＮａＯＨを溶媒和を達成するために使用することができる。
２．成分８を０．１Ｎ ＮａＯＨ２．５ｍＬ中に溶解し、一定に混合しながら成分１〜７を含む８００ｍＬに段階的な方法で注意深く加える。
３．一定に混合しながら、ＷＦＩ水を用いて容量を１０００ｍＬにし、すぐに０．２ミクロンフィルターで適した容器中に滅菌濾過する（例えば、６０ｍＬ Nalgeneボトル、開封明示機構のあるボトル）。
４．ボトルのふたをする。
５．−２０℃で暗所に保管する。
【００８９】
保管および保存期間
基礎ビタミン溶液（ＢＶＳ）ストックは、６０ｍＬのアリコートで−２０℃に保管した場合、２ヶ月間保管できる。使用前には、沈殿物または濁りについて、解凍したＢＶＳストック３を常に注意深く点検する。沈殿物が現れた場合、または解凍した溶液が濁ってみえる場合は捨てる。
最終製品中のＢＶＳストックの含有容量：
調製したすべての最終調合物の調製物に、１０００ｍＬあたり６．０ｍＬのＢＶＳストック溶液を使用するべきである。ストック４参照。
【００９０】
ストック４溶液および最終調合組合物
ストック４の調製は、本願処方の独自の化学物質の最終添加およびストック１基礎塩類溶液（ＢＳＳ）、ストック２基礎アミノ酸溶液（ＢＡＡＳ）およびストック３基礎ビタミン溶液（ＢＶＳ）の特定容量を添加することを可能にする。プロトコルは調製される培地調合物に、すなわち培養培地、配偶子取り扱い培地、および洗浄培地に特定のバッファーおよび抗生物質を記載する。
以下のプロトコルは、培養培地、配偶子取り扱い培地、または洗浄培地の最終調合物１リットルを調製する。より大きなバッチが、適切に量をスケールアップして調製されてもよい。
【００９１】
試薬
【表９】
【００９２】
【表１０】
【００９３】
ストック４の調製および最終調合組合物のインストラクション
１．混合容器をＷＦＩ（注射用水、１８．２メガオームの抵抗）ですすぐ。
２．添加する間、継続的に混合して、７００ｍＬのＷＦＩ中に成分１〜１１を溶解する。
３．成分１２〜１５を加え、ＷＦＩで９００ｍＬにして混合し続ける。
４．基本処方タイプ、すなわちＰＦＭ培養培地、ＰＦＭ配偶子取り扱い培地およびＰＦＭ洗浄培地、の調製に依存して、成分１６〜２１を加える。
５．３種類すべての培地のオスモル濃度を調製し、０．２ミクロンの孔径フィルターを用いて別々に濾過滅菌する。０．１ミクロンフィルターも使用できるが、圧力を避ける。溶液の濾過に高圧が必要であった場合には、０．１ミクロンフィルターは使用しない。
【００９４】
６．すぐに最終包装（Nalgeneボトル）中へ滅菌濾過する。
ＰＦＭ培養培地は６０ｍＬボトル中に入れる。
ＰＦＭ配偶子取り扱い培地は６０ｍＬボトル中に入れる。
ＰＦＭ洗浄培地は１２５ｍＬボトル中に入れる。
（使用するボトルは、好ましくは開封明示機構のあるボトルである。）
７．ボトルのふたをする。
８．ボトルをラベルする。
９．２〜６℃の間で暗所に保管する。
【００９５】
ストック４および最終調合組合物についての脚注
オスモル濃度を確認する。オスモル濃度が高い場合、ＷＦＩ純水を添加して２８５ミリオスモルに調整する。添加する量は以下のように計算する。
［培地のオスモル濃度−所望のオスモル濃度（すなわち２８５）／培地のオスモル濃度］×培地容量
【００９６】
例：上記のように培地のオスモル濃度が３００で培地容量が９００ｍＬの場合、以下に示すように計算する。
［３００−２８５／３００］×９００＝１５／３００×９００＝４５
【００９７】
したがって、培地へ４５ｍＬの水を加え、その後再びオスモル濃度を測定した場合、理論的には約２８５＋／−２または３ユニットのオスモル濃度が得られるはずである。たとえストック１ＢＳＳ溶液をさらに添加して培地のオスモル濃度を戻しても、培地中の重要な成分が希釈され、培地の有効性に影響するので、水を大量に加えすぎないように大いに注意する。
しかしながら、モル浸透圧濃度が２８５ミリオスモル以下の場合、ストック１ＢＳＳのみを培地に加える。１ミリリットルあたりのストック１ＢＳＳで約２〜３ミリオスモル増加するが、常に予測可能ではないかもしれない。したがって、添加しすぎないように大いに注意する。一度に少量添加し、オスモル濃度を測定する。
【００９８】
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【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ヒトの生殖と受精プログラムに特別化および至適化した無タンパク質培地（ＰＦＭ）に関する。本明細書に記載の実質的に無タンパク質の培地製品は、特にヒトＡＲＴの適用に関係して、とりわけおよび特にプリオンを含む、タンパク質に結合する病原体の、不妊治療を受けている患者、生殖補助医療（ＡＲＴ）により受胎した新生児、およびこれら分野で勤める従事者への感染防止に有用である。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
従来の市販されているヒトのＡＲＴ手順のための胚培養培地は、ヒトの血液および組織源から得られたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。いくつかの研究室では、同様に雌ウシの血液および組織源から得られたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もヒト胚培養手順のタンパク質源として使用されている(Loutradis et al., 1992; Quinn, 1994)。ＨＳＡを含む培地およびＢＳＡを含む培地の効率は同様であると報告された(Staessen et al., 1998)。ドナー（ヒトまたはウシ）から得られたタンパク質の培養培地での使用は、受胎補助治療を受けている患者へ病気を伝染する可能性を有する。マウス、ウサギ、および霊長類用の合成培地が近年報告されたが(Spindle, 1995; Li et al., 1996; Schramm and Bavister, 1996)、卵母細胞の収集から始まり、続いて精子洗浄、媒精、卵割胚期までの受精、および最終的な胚移植までの（添加したタンパク質もしくはアルブミン、または動物もしくはヒト由来のタンパク質抽出物を欠く）既知組成培養系での、生存可能なヒト胚の産生は記載されていない。受精用の精子は、依然として血清タンパク質を含む培地で調製されていたため、ヒトへの適用のための既知組成無タンパク質培地（ＰＦＭ）の以前の主張（previous claims）は、実際には本当の無タンパク質ではなかった(Mohr & Trounson, 1986; Serta and Kiessling 1997 (Abst); Parinaud et al. 1999)。したがって、完全に無タンパク質であるＡＲＴ手順のための培地は、今までに記載されていない。
【０００３】
潜在的に有害なドナータンパク質の使用を避けることで生殖補助治療を受けている患者の安全を保証するために、生存可能なヒトの初期卵割期胚の産生に使用する合成培地を利用可能にすることが、当該技術分野で必要とされている。特にヒトの後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および肝炎などのウイルス性疾患、あるいはプリオンによって感染するクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、あるいは血液由来産物中の他の病原性疾患の感染可能性に関する懸念は、世界的なＡＲＴの分野における多くの医療サービスの提供者を、胚の培養および取り扱い手順のためのドナータンパク質の代替物の探求へと導いた。
【０００４】
致死性のウイルス性疾患（ＡＩＤＳ）の血液由来産物を介する血友病患者への感染は、十分に実証されている(例えば Craven et al., 1997, Med. Sci. Law 37: 215-227; Keshavjee et al., 2001, Soc. Sci. Med. 53: 1081-1094; Weinberg et al., 2002, Ann. Intern. Med. 136: 312-319; Evatt, 2006, Semin. Hematol. 43: S4-9参照)。下垂体から抽出されたヒト成長ホルモンは、ヒトへＣＪＤを感染させる能力があり(Esmonde et al., 1994)、ヒトゴナドトロピンの注入も、人から人へＣＪＤを感染させることが可能であることがわかった(CDC, 1985)。（ＣＪＤプリオンの力価は血液中では低いが、）ＣＪＤは血液を介して感染可能である（Heye et al., 1994）。過去に、Ｂ型肝炎ウイルスで汚染された貯蔵血清を含む培地で培養した胚を受け取り、Ｂ型肝炎の蔓延が約２００人の体外受精（ＩＶＦ）患者で起きた(van Os et al., 1991)。近年、科学界は胚の培養および取り扱いで使用した培養培地の市販製剤が、後にＣＪＤで死亡した人間によって提供されたアルブミンで汚染されているかもしれないことを、患者に知らせることのジレンマに直面した(Kemmann, 1998)。
【０００５】
無タンパク質培地で、接合子期および卵割期からのマウス胚盤胞発生の報告が多数ある。最も初期の報告には、高分子量コロイドであるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を潤滑剤および培地の粘性を増加させる目的で使用したBrinster (1965)およびCholewaとWhitten (1970)の報告が含まれる。この研究に続いて、他の多くの研究者がマウスと同様に他の哺乳類の胚を、無タンパク質培地で培養することに成功した(Dandekar and Glass, 1990; Spindle, 1995; Li et al., 1996; Schramm and Bavister, 1996)。近年、ＰＶＰに加えて、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）(Bavister, 1995)もまた培養培地中の血清タンパク質との置き換えに使用された。例えば、Biggers et al. (1997)は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および／またはアミノ酸で置き換え、そのマウス受精卵の発生への効果について検討した。彼らは、ＰＶＡはマウス胚培養培地では完全にはＢＳＡと置換できないことを観察した。ＰＶＡの効果は、胚盤胞発生率においてはＢＳＡより少しだけ小さかったが、部分的な孵化率（rate of partial hatching）では著しく小さかった。ＰＶＡでのＢＳＡの置き換えは全体の応答を低下させたが、大きな攪乱は生じなかった。
【０００６】
多くの生物学的役割に加えて、血清タンパク質は培養培地での潤滑特性および粘性などの有用な物理的特質を与える。培養培地の増加した粘性および潤滑特性は、胚の取り扱いおよび操作を容易にし、培養ディッシュの壁や胚移植カテーテルへの胚の付着防止に必要である。ＰＶＰおよびＰＶＡを組み込むことは、単に血清タンパク質の物理的特質を複製するのに役立つだけである。しかしながら、ＰＶＰおよびＰＶＡは固定された窒素の供給源ではなく、タンパク質の様々な生物学的役割は果たさない。加えて、ＰＶＰおよびＰＶＡの催奇形性は十分に調べられてなく、ヒトの治療的生殖補助での使用に問題がある(Gardner and Lane, 1998a)。
【０００７】
最も最近ではSerta et al. (1997) およびParinaud et al. (1998a)などの複数の研究者が、生存可能なヒト胚を無タンパク質培養系で産生することを試みた。しかしながら、Sertaと共同研究者ら(1997)は、（後の培養は無タンパク質培地で行われたが、）媒精用の精子をＢＳＡのカラムを通してスイムダウンによって調製した。これら研究者は、３１％（ｎ＝４５）の妊娠率を達成し、そのうち数名は正常の出生児を満期出産するまでになった。Parinaud et al. (1998a)は、媒精を無タンパク質培地で行い、無タンパク質培地で調製した精子での受精を達成した。しかしながら、得られた接合体はＢＭ１培地で培養され、この引用文献はＢＭ１培地がタンパク質を含有しているかどうか特定していなかったが、同グループの以前の出版物ではＢＭ１培地は１％のＨＳＡを含んでいることを提示していた(Parinaud et al., 1998b)。
【０００８】
幾人かの研究者は、単一の抗酸化物質およびＥＤＴＡなどのキレーター(Mehta and Kiessling, 1990; Serta et al., 1997)での血清タンパク質の置換は、マウスおよびヒトでの受精および生存可能な胚の卵割を損なわないことを示した。しかしながら、Serta et al. (1997)は、胚移植カテーテルは無タンパク質培地で大規模にすすがれることを提示し、これは胚が胚移植カテーテルの内壁に付着する傾向にあることを暗示している。血清タンパク質は、培養培地中のｐＨを維持する役割も持っている(Moessner et al., 1993)。生物システムでの栄養素としての役割に加えて、タンパク質は連鎖破壊型抗酸化物質および金属イオンのキレーターなどの他の多くの役割を有している(Barber, 1961; Vidlakova et al., 1972; Wayner et al., 1987)。
【０００９】
アルブミンおよび血漿タンパク質の生理学的機能は一般的に十分に実証されている。膜の過酸化を防止するアルブミンの役割は、膜の安定性における直接的な役割を示している。それはキャピラリー膜透過性および浸透圧調整に関与している。アルブミンは、血漿中の全コロイド浸透圧の８０％を供給する。アルブミンは二酸化炭素の輸送に関与し、ｐＨバッファーとして作用する。アルブミンは、血漿の非炭酸水素バッファー値の最も大きな部分（９５％）を占める。タンパク質はまた、エネルギー源としての役割も持っている。脱アミノ化アラニンはピルビン酸であり、アセチルＣｏＡまたはグルコースやグリコーゲンのいずれかに変換可能である。アルブミンは脂質の可溶化を補助し得、ホルモン、ビタミンおよび金属を輸送する。それは、これら成分の放出および利用のためのリザーバーとして役立っている。
【００１０】
したがって、培養培地の血清アルブミンを置換する試みは、これらのインビボでの役割と、インビトロでの胚の取り扱いおよび操作に有用な物理的特質とを考慮に入れるべきである。単一の成分では血清タンパク質のすべての機能は満たさないであろう。
多くの動物種の発生を補助する無タンパク質培地が以前に記載されたが、かかる無タンパク質培地がヒトで成功裡に使用されたことはない。また、かかる培地がヒトの胚発生を補助する、または至適であるとも推定できなかった。したがって、特にヒトのＡＲＴおよびＩＶＦに適応する、定義された無タンパク質成育培地についての明確な必要性が存在する。
【００１１】
［関連技術の背景］
特にげっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）由来の細胞である哺乳動物細胞の治療および培養用であるが、ヒトの体外受精用の受精、胚発生、および妊娠用でもある既知の推定的な「無タンパク質」培地が存在する。Caro et al.はヒトへの適用のためのかかる「無タンパク質培地」の一つを記載した。しかしながらタンパク質は、それなくしては精子が卵子を貫通および／または受精する能力を獲得しない受精能獲得の誘導に必要であるので、彼らは精子調製培地中のタンパク質の必要性を克服することはできなかった。したがって、Caroと共同研究者らの培地系は、完全に無タンパク質ではない。同様に、Serta et al. (1997; abstract)およびParinaud et al. (1998a, abstract; 1999)もまた、ヒトのＡＲＴ用の「無タンパク質」培地を記載したが、彼ら以前のCaro et al. (1986)のように、培養系の少なくとも１つの段階でタンパク質を使用した。
【００１２】
これら引用文献に記載のように、添加したタンパク質を含有する培地で事前に調製された精子を洗浄することは、特にウイルスおよびプリオンの感染体を完全な確実性をもって除去しない。加えて、このことは精子を不必要なストレス性の洗浄条件に曝し、マンパワーおよび資源の過剰な要求を課すことになり得るため、不利益でもある。
【００１３】
ＩＶＦと関連せず、哺乳類細胞、特にヒト細胞の成育用「無タンパク質」培地が、とりわけKovar et al., 1987, Biotechnology Letters, vol. 9 no. 4, p. 259-264 “Iron Compounds at high Concentrations Enable Hybridoma Growth in a Protein-free Medium”、Keen, 1995, Cytotechnology, vol. 17: 193-202 “The culture of rat myeloma and rat hybridoma cells in a protein-free medium”、Stoll et al., 1996, J. Biotechnology, vol. 45, p. 111-123 “Systematic improvement of a chemically defined protein-free medium for hybridoma growth and monoclonal antibody production.”で開示された。この研究は、特にモノクローナル抗体生産に関し、かかる培地をＩＶＦまたはＡＲＴ使用に適応することを開示していない。ヒトのＩＶＦ手順に適応または適合しないが、無タンパク質成育培地を開示する他の出版物は、Zang et al., 1995, Biotechnology, vol. 13, p. 389-392, “Production of Recombinant Proteins in Chinese Hamster Ovary Cells Using A Protein-Free Cell Culture Medium”; and International patent application Publication no. WO 2005/120576 A2である。
【発明の概要】
【００１４】
［発明の概要］
本願発明は、ＡＲＴ手順を用いた低妊孕性（sub-fertility）および不妊性の治療および緩和における、ヒト卵子の回収（ｉ．洗浄培地）、精子の取り扱いおよび貯蔵（ｉｉ．配偶子取り扱い培地）、ヒト卵子の受精（ｉｉｉ．胚培養培地）、配偶子および胚の取り扱い（ｉｖ．配偶子および胚取り扱い培地）、および同様に、ヒトへの適用のための、得られた接合体の培養液（ｖ．胚培養培地）での１〜２の卵割周期を通じた発生のための、新規の無タンパク質胚培養培地調合物に関する。本願発明は、上記すべての新規培地溶液をその代替物／培地として置き換えおよび／または使用することができる単一培地溶液の処方を含む。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、同発明者によって以前に報告された（そこではＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂシリーズで呼ばれる）無タンパク質培地とは異なる(Ali, 1997; Ali et al., 2000)。以前の報告では、発明者は３つの前駆培地、すなわちＡＲＴ−１、ＡＲＴ−２およびＡＲＴ−３の処方に至った系統的な研究を記載した。同報告で、発明者は実質的に無タンパク質の培地シリーズであるＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂが、ＡＲＴ−１からどのように発展したかを記載した。臨床妊娠を達成するために、実質的に無タンパク質のＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂ培地シリーズ中で卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）によって産生した胚が、３９歳以下の女性２１人中１１人（５２．４％）の治療に成功裡に使用された。ＡＲＴ−１、ＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂ培地シリーズの処方は、開示されていない。本願発明はＡＲＴ−３前駆培地とは異なるが、それから調合された実質的に無タンパク質の培地を提供する。組成ではなく、ＡＲＴ−３前駆培地の開発が発明者によって記載されている(Ali,1997; Ali et al., 2000)。
【００１５】
本願発明の例示的な態様では、一連の実質的に無タンパク質の培地が特別に開示され、本明細書ではＰＦＭ−１１シリーズと名付けられている。これら培地は、配偶子および胚を害し得、ＡＲＴ治療を受けている患者、かかる治療によって受胎した新生児およびＡＲＴ治療手順に関与する医療従事者へ、現在知られているおよびこれまでに知られていない致命的な病気を潜在的に感染する可能性がある潜在的に有害な不均一の生物学的成分を欠く、均一の組成であるということだけでなく、体外受精技術および方法を管理する厳密な新基準および新規制に適合するという特別な利点を有する。
【００１６】
本願発明による実質的に無タンパク質の培地調合物の完全に定義された性質は、従前は現在利用可能な胚培養培地調合物の未定義な性質および不均一な組成のために阻まれていた着床前胚の代謝の研究を促進するのにも有用である。継続的超微小滴（continuous ultramicrodroplet、cUMD）培養法を用いて、これら実質的無タンパク質培地（ＰＦＭ）シリーズで産生したヒト２日胚の品質は、血清タンパク質を含有する市販のコントロール培地調合物で発生した胚に対し統計学的に遜色がないか、またはより優れていた。ＰＦＭ培地のヒト精子に対する毒性はなかった。通常のＩＶＦおよび卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）によるヒト胚の受精および続く発生は、コントロールと比較して遜色がなかった。
【００１７】
本発明の実質的に無タンパク質の培地は、実質的に無タンパク質のヒト胚培養および取り扱い培地としての使用にも適しており、タンパク質結合性の疾患（protein-bound diseases）が患者および新生児に感染しないことを保証する。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、有効性を失うことなく２年間まで−２０℃で冷凍保存可能である。
【００１８】
本願発明は、培養系において添加ドナータンパク質の必要性を成功裡に克服し、卵子回収から始まり、精子調製、媒精、受精、得られた胚の培養および胚移植までの、実質的に無タンパク質の培地製品を利用するヒトのＡＲＴ適用のための、実質的に無タンパク質の培地系を提供する。この特徴は、手順中のいくつかのところでタンパク質を含有する培地製品を利用したために完全に無タンパク質ではない以前に記載の「無タンパク質」培養系から、本発明の培地を有利に区別する。それゆえに、これら従来の培養培地は感染病原体に汚染される可能性があり、何らかの規制上の制約に直面し得る。本願発明の多様な成分の組成、範囲、好ましい範囲および特定の仕様が、本明細書に開示される。
【００１９】
本願発明は、インビボおよびインビトロにおけるタンパク質の多様な役割を部分的に置換できるアミノ酸、抗酸化物質およびキレーター、オスモライト、ビタミン、栄養素ならびに代替エネルギー源などの個々の成分の効果、耐性および至適レベルの決定に関する研究の産物であり、ドナー血清タンパク質を含まない本発明の多様な無タンパク質の取り扱い培地（例えば、精子および卵母細胞取り扱い培地ならびにＩＣＳＩ培地）および胚培養培地中のタンパク質の機能を例証する。記述成分の至適濃度は、多くの胚培養培地を調合するのに利用された。続いて、至適な胚発生および著しく高い胚盤胞の孵化率を示したこれら培地の最高のものが同定され、さらに添加血清タンパク質の非存在下でヒト胚発生を補助するために洗練された。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、同培地で調製した精子でヒト卵母細胞の受精を補助することが可能である。得られた接合体は、発生可能な初期卵割期ヒト胚を形成するように、引き続き実質的に無タンパク質の培地で発生させた。これら胚の移植は、正常な妊娠および出生をもたらした。
【００２０】
したがって、本願発明はＩＶＦ／ＡＲＴ手順の全過程（卵子回収、精子調製、媒精、受精、得られた胚の培養および胚移植）において有用で、培養系において添加タンパク質の必要性を克服する培地を成功裡に提供する。
【００２１】
［発明のある態様の詳細な記載］
本願発明は、タンパク質またはタンパク質様成分を欠く、胚の取り扱いおよび培養培地と一般的に呼ばれる一連の栄養溶液を提供する。これら培地は、ヒト卵子の受精および続く２〜６日までの体外インビトロでの受精卵の発生に有用である。これら栄養溶液は、「胚培養培地」と呼ばれる。ＩＶＦおよびＡＲＴに加えて、実質的に無タンパク質である栄養分の成育培地の使用が有利であると思われる他の方法論および技術には、幹細胞の技術および治療、細胞／組織再生および移植治療手順が含まれる。当業者は、かかる使用のために本明細書に係る培地の適応方法を理解するだろう。
【００２２】
以下のさらなる詳細に開示するように、本発明の実質的に無タンパク質の培地のヒト配偶子および胚についての使用は、ＩＶＦおよびＡＲＴの有効性を増加した。例えば、現在利用可能なタンパク質含有の胚培地と比較した場合（全年齢群を合わせて３３％の妊娠、Ali, 2004で引用）、実質的に無タンパク質の（ＰＦＭ−１１）培地で、通常のＩＶＦの使用により得られた臨床妊娠率は、全年齢群では５０％（２８人中１４人）にまで、そして４０歳未満の女性では５３．８％（２６人中１４人）にまで増加する。本発明の実質的に無タンパク質の培地でのＩＣＳＩ臨床妊娠率は、同様に全年齢群では４６．２％（２６人中１２人）にまで、そして４０歳未満の女性では５４．５％（２２人中１２人）にまで増加する。この差は、本発明の実質的に無タンパク質の培地にとって良い方向に統計学的に有意であり、本発明の実質的に無タンパク質の培地は、現在市場で入手可能な市販のタンパク質含有培地と少なくとも同等である（および優位になり得る）ことを示している。ＰＦＭ−１１培地で、通常のＩＶＦで産生した胚由来の出生児数は１２であり、ＩＣＳＩでは１２であった。本発明のＰＦＭ−１１で産生した胚由来の出生児は、明らかに正常で、知的で、口数が多くおよび活発である（親の報告による）。これら統計学的データは、かかる出生をした子供の少なくとも２４のサンプルから作成された。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「無タンパク質」、「本質的に無タンパク質」および「実質的に無タンパク質」の用語は、培地が非タンパク質含有成分を使用して調製されたこと（本明細書中さらに詳細に記載される）、およびタンパク質またはタンパク質含有成分が培地に添加されなかったことを意味するように意図している。
本願発明の例示的な態様には、ＰＦＭ−１１シリーズと名付けられた一連の実質的に無タンパク質の培地が含まれる。これら培地シリーズは、すなわち、
１．実質的に無タンパク質の洗浄培地（Substantially Protein-Free Flushing Medium）
２．実質的に無タンパク質の配偶子（精子）取り扱い培地（Substantially Protein-Free Gamete (Sperm) Handling Medium）
３．実質的に無タンパク質の配偶子（卵母細胞／胚）取り扱い培地（Substantially Protein-Free Gamete (Oocyte/Embryo) Handling medium）
４．実質的に無タンパク質の胚培養培地（Substantially Protein-Free Embryo Culture Medium）
の特別な培地製品の範囲を有する。
【００２４】
これら培地は以下に説明される方法に従って使用され、これら培地の使用を例証することを目的とするが、とりわけ当業者に知られているＩＶＦまたはＡＲＴの方法での培地の付加的使用に限定するものではない。本明細書に説明された実験での本発明の培地の開発において、各手順は通常のタンパク質含有培地および本発明の例示的なＰＦＭを使用して、平行して行われた。
【００２５】
ヒト精子調製
男性患者は自慰行為によってヒト精液を産生した。精子は標準的なスイムアップ技法によって、および時に密度勾配遠心で調製した。密度勾配手順では、回収したペレットは２度洗浄し、培養培地に再懸濁した。精子調製物は、適当な試験またはコントロール培地を使用して作製した。具体的には、ＩＣＳＩまたはＩＶＦ用の精子は、タンパク質欠乏の胚発生への効果実験のために、実質的に無タンパク質の（ＰＦＭ−１１）培地で調製した。収集した精子は使用まで、３７℃、気体ＣＯ２が５％の気相下でインキュベートした。
【００２６】
卵巣刺激および卵母細胞回収
卵巣刺激は、中黄体期から始まり、月経または下方制御が達成されるまで、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト(Buserelin; Suprefact; Hoescht, Frankfurt, Germany)を皮下注入して誘導した。下方制御は子宮内膜厚が４ｍｍまたはそれ以下になった場合、および血中のエストラジオール、プロゲステロンおよびＬＨレベルがベースライン値に達した場合に達成されたとみなした。卵胞刺激ホルモン(FSH; Metrodin; Serono, Rome, Italy)は、卵胞の発育（recruitment）が開始するように３日間注入投与した。その後、ヒト閉経期ゴナドトロピン(Pergonal 500; Serono, Rome, Italy)を、卵胞発生を刺激する患者の応答に従って投与した。排卵は、卵胞の大きさが１６ｍｍまたはそれ以上に達した後、１０，０００ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG; Pregnyl; Organon, Oss, Holland)の注入によって誘導した。卵母細胞回収（ＯＲ）は、超音波ガイドの膣吸引により３６時間後に行った。
【００２７】
媒精および培養技法
体外受精（ＩＶＦ）
卵母細胞は、平衡化および胚試験したミネラルオイル(M8410, Sigma Chemicals, and USA)下、平衡化した培養培地の微小滴中１００，０００／ｍＬ濃度の運動性のある精子で個別に授精した。授精した卵母細胞は、３７℃、気体ＣＯ２が５％の空気のもとで培養した。 翌朝、卵母細胞は裸化ピペット(Stripper（登録商標）, MidAtlantic Diagnostics, USA)で裸化した。
【００２８】
卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）
代替手順（例えば、ヒトの男性要因の低妊孕率の克服に使用される）において、ＩＣＳＩが行われる。卵母細胞は、ヒアルロニダーゼ溶液(80 IU/mL; Cat No. 10110010, Medi-Cult A/S, Lerso Parkalle 42, 2100 Copenhagen, Denmark)に３０秒間曝してＩＣＳＩ用に調製し、それから平衡化したMedi-CultTMまたは本発明の実質的に無タンパク質の培地中に移した。ヒト卵母細胞は、３７℃、気体ＣＯ２が５％の気相下で、培養培地中において５〜７分間インキュベートし、それから裸化ピペット(ART No.1670, International Medical Products BV, Zutphen, Holland)で裸化した。裸化したヒト卵母細胞は洗浄し、最終的にはさらに３０〜６０分間培養培地中でインキュベートした。
【００２９】
顕微操作には市販のＩＣＳＩピペットを使用した(Injection Needles, Cat No.130340B; Holding pipette, Cat No. 13030013; Laboratoire CCD, 60 Rue Pierre Charron, 75008 Paris, France or Injection needle, Cat. No.10-MIC; holding pipette, Cat. No. l0-MPH-120; Humagen, Charlottesville, Virginia 22911, USA)。ＰＶＰ(Cat No. 1089001, Medi-Cult A/S, Denmark)の超微小滴５μＬを、ペトリディッシュ(Cat No. 1006, Falcon Plastics, Becton Dickinson, Rutherford, New Jersey, 07070, USA)の中心に薄く広げた。広げたＰＶＰは最大で５つまでの、ＨＥＰＥＳ緩衝のＩＶＦ培地(Gamete-1009 Scandinavian IVF Sciences AB, Gothenberg, Sweden) １０μＬの微小滴で取り囲んだ。微小滴は、平衡化および胚試験したミネラルオイル(M8410, Sigma Chemicals, USA)で覆った。（１〜２μＬの）精子調製物は、広げたＰＶＰの中心に導入した。成熟した卵母細胞のＩＣＳＩは、（例えばPalermo et al., 1992に係る）従来法で行った。
【００３０】
超微小滴培養
培養培地の超微小滴（UMD、３〜７のヒト胚培養には１．５〜２μＬ）は、平衡化したミネラルオイルをあらかじめ入れた４ウェルディッシュ中で作った。ディッシュは、３７℃、気体ＣＯ２が５％の気相下でインキュベートした。予備実験では、培地は平衡化した培養培地を用いて、精密に引き延ばされたパスツールピペットで毎日交換したが（ＵＭＤ技法）、後の実験では３日培養まで交換しなかった（ｃＵＭＤまたは継続的ＵＭＤ）。
【００３１】
受精の判定
受精はＩＣＳＩまたはＩＶＦ後、１８時間〜２０時間で判定した。卵母細胞は、２つの異なる前核が見えたときに受精したとみなされた。受精した卵母細胞は、３７℃、気体ＣＯ２が５％の空気のもとで、平衡化した培地の微小滴または超微小滴中で培養した。卵割および胚の品質は、２４時間後評価した。
【００３２】
接合体停止率
このパラメーターは、本発明による培養培地が１細胞期で発生阻止を起こすかどうかを判定するのに利用した。培地の有効性は、このアッセイを使用して判定できる。１細胞期での発生阻止の割合がより高いことは、培地が欠乏しているまたは有効性がより低いことを示唆するだろう。
【００３３】
２日卵割胚の品質判定
２日胚の胚品質を判定するために、２つのパラメーター、すなわち平均卵割球スコアおよび平均胚グレードを使用した。これらは、以下のように決定される。
（ｉ）平均卵割球スコア＝卵割球の合計数／胚の合計数
（ｉｉ）平均胚グレード＝胚グレードの合計／胚の合計数
【００３４】
ほとんどの健康なヒト２日胚は、一般的に４細胞期を達成することから、平均卵割球スコア（２〜６の範囲）が４およびそれ以上が良好とみなされた。胚は数字１が低品質を示して４が高品質を示す、１〜４のスケールに従ってグレードした。最低３人（しかし好ましくは４人）の研究室の職員によって、胚をまとめてグレードした。加えて、卵割期胚の発生率における差を確証するために、他の２つのパラメーターを含めた。これらは、ヒトの研究における２日培養での、（ｉ）４細胞期またはそれ以上の胚の割合、および（ｉｉ）グレード３およびそれ以上の胚の割合である。
【００３５】
培地処方
本願発明の例示的な実質的に無タンパク質の培地の処方は、以下の通りである。アルブミンは、固定された窒素および栄養素の供給源、抗酸化物質および膜安定性を含む他の多くの役割を持つことで知られている。したがって、本発明の実質的に無タンパク質の培地は、アルブミンを培養物中でアルブミンの機能を個々にまたは集団的に行う他の培地成分で置換した。これら目的で使用される個々の胚培養培地の成分は、アミノ酸（アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セリンを限定することなく含む）、抗酸化物質およびキレーター（例えば、ＥＤＴＡ、還元型グルタチオン、トコフェロールなど）、代替エネルギー源（フルクトース、グルタミン、ピルビン酸ナトリウムなど）、オスモライト（マンニトールおよびミオイノシトールを含む）、ビタミン（アスコルビン酸、シアノコバラミン、葉酸、トコフェロールなど）、および元素鉄を含む。
【００３６】
最も高い胚盤胞発生を支持する個々の成分の濃度が、至適とみなされた。本願発明の開発において、３つの培地（ＡＲＴ−１、ＡＲＴ−２およびＡＲＴ−３）が調合された。以前に発明者は、培養培地ＡＲＴ−１から(Ali, 1997; Ali et al., 2000)、実質的に無タンパク質の培地ＡＲＴ−７およびＡＲＴ−７ｂシリーズを調合するために着手した多様な実験を記載した。本発明のＰＦＭ−１１無タンパク質培地シリーズは、培養培地ＡＲＴ−３(Ali, 1997; Ali et al., 2000)から調合された。
ＰＦＭ−１１シリーズの多様な培地製品の最終調合物を、以下に記載の表に示す。本明細書に記載するように、これら培地調製物のＨＥＰＥＳおよび炭酸水素塩の濃度は変動する。
【００３７】
本発明の実質的無タンパク質培地は、ミネラル塩、アミノ酸、抗酸化物質、抗体、エネルギー成分、およびバッファー成分（ＣＯ２補充条件下での培養のためのＨＥＰＥＳおよび炭酸水素塩）を含み、市販のタンパク質含有培地と似ているがその詳細において異なる。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、独自に巨大分子種（メチルセルロースおよび関連するポリマー）、および任意に代謝されない糖アルコール（Ｄ−マンニトール）を含む。
【００３８】
本発明の実質的に無タンパク質の培地に含まれる巨大分子は式Ｉ：
【化１】
式中、
各Ｒは独立してＣＨ３またはＨであり、ｎは約３４〜約４３の間である、のメチルセルロースである。
【００３９】
上記メチルセルロースの式中、ＲはＨまたはＣＨ３のいずれかになり得る。メトキシ置換の範囲は、重量で２７．５〜３１．５％の間に及ぶ。置換の程度（ＤＳ、環のヒドロキシル基へ結合した置換基の平均数）は、１．５〜１．９である。この範囲は、最大の水溶性を示す。より低いメトキシ置換は、より高い水溶性が得られ、好まれる。符号「ｎ」は重合のレベルを意味し、２０℃、２％水溶液における概算粘度指数１５ｃＰＳに関連する、１４，０００ダルトンの分子量に至適に対応する（これら特性を有するメチルセルロースは、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO USA; www.sigmaaldrich.comから市販されている）。これは、約３４〜約４３の間、好ましくは３６〜３９の「ｎ」の値に対応する。ＰＦＭ中におけるこの成分の範囲は、０．０１〜０．１５ｇ／Ｌであり、最も好ましい範囲は０．０９〜０．１ｇ／Ｌである。至適濃度は、０．１ｇ／Ｌである。
【００４０】
メチルセルロースは抗酸化物質およびオスモライトとして作用することが可能で、無毒性、酵素耐性および細胞不透過性である(Stewart et al., 1995)。環境性の傷害、特にフリーラジカルおよび浸透圧変化による攻撃に対しての配偶子および胚の保護を助ける。それは細胞膜を損傷から保護し、恒常性の維持を助ける。それはまた、界面活性剤および潤滑剤でもある。培地の粘性増加に貢献するため、配偶子および胚は、ディッシュの側面ならびにピペットおよびカテーテルの内側に固着しない。これら物理的特質は、それら機能を通常行う血清タンパク質の非存在下で供給される。この物質は不活性で、ヒトへの適用には安全である。
【００４１】
メチルセルロースは他に、ヒトの医薬品および食品産業で２５年間を優に超えて、副作用なしにヒトまたは動物の研究で使用されてきた。ＦＡＯ／ＷＨＯおよびＥＵの勧告はメチルセルロースの摂取を許容し、非発癌性であることが知られていることから、癌研究のネガティブコントロールとして使用されてきた。
【００４２】
メチルセルロースは多様な食品および化粧製品において、増粘剤および乳化剤としても使用され、便秘の治療などの医療用途を有する。それは非消化性、無毒性および非アレルゲン性である。その薬理的／臨床的用途は、賦形剤および担体材料である。それは点眼薬での使用、充填剤および緩下剤としての使用、機能性腸疾患の下痢のための使用、回腸瘻排出の調製のための使用および感染性の下痢を生じる毒性物質の吸収剤としての使用がされる。それは抗酸化物質でもある。
【００４３】
本発明の実質的に無タンパク質の培地は、Ｄ−マンニトールもまた含む。この化合物は、吸収されにくく、ほとんど変化せずに尿中に排出される。抗酸化物質およびオスモライトとして、この物質は有害な環境的影響から胚を保護できる。したがって、悪条件に対して胚を保護するために、部分的に、さらに血清タンパク質と置換することができる。Ｄ−マンニトールが培地中のタンパク質存在下においてさえも、マウス胚盤胞のインビトロでの発生にポジティブな効果を及ぼすことに注目することは興味深い。
【００４４】
本願発明の例示的な実質的に無タンパク質の培地（ＰＦＭ−１１）では、Ｄ−マンニトールは０．０５６〜６．９μＭの範囲内で、２．８μＭ（最も好ましい濃度）の好ましい濃度で存在する。より好ましい範囲は、１．４〜５．５μＭの濃度で、２．５〜３．０μＭの濃度の範囲がさらにより好ましい。最も好ましい濃度は、約２．７μＭの濃度である。Ｄ−マンニトールの実験式は、Ｃ６Ｈ１４Ｏ６であり、次の構造式を有する。
【化２】
【００４５】
Ｄ−マンニトールは、食品添加物であり、ケーキ、製菓および甘味物に使用され、スクロースより甘く、糖尿病患者のための代替甘味料と考えられている。それは、オスモライトおよび抗酸化物質である。それは３０年間を優に超えて、急性脳卒中の治療に高濃度で使用されてきた。この化合物の過剰モル濃度が、深刻な脳損傷および頭蓋内圧上昇の治療に使用される。それは利尿剤であり、中毒の場合の利尿、または細胞外液コンパートメントの測定に使用される。それはまた、ヒトを含む哺乳類において、緩下剤の効果も有する。治療薬としてのＤ−マンニトールの臨床適用での結果としては、ヒトにおける悪影響は報告されていない。複数の種においては、非細胞毒性および非変異原性でもある。Ｄ−マンニトールは吸収されにくく、排泄される(Milde, 1965; Widdowson and Dickerson, 1965)。培養培地中にこの物質を含有させることにより、血清タンパク質の存在下でさえマウスの胚盤胞発生を増加させたことから、抗酸化物質およびオスモライトとしての胚培養でのポジティブな役割が示唆される(Ali, unpublished observations)。その使用はＦＤＡおよびＥＵに許可され、ＦＡＯ／ＷＨＯは食用として安全であると結論付けた。
【００４６】
本発明の溶液および調合物には、式ＩＩのＤ−マンニトールが約０．０５マイクロモーラーから約６．９マイクロモーラーの濃度で存在する。より好ましい範囲は、１．４〜５．５マイクロモーラーである。最も好ましい濃度は、約２．８マイクロモーラーである。
【００４７】
当業者は、血清タンパク質の役割は多数であり、その非存在下において、培地中のタンパク質の完全置換は、１または２の成分自体では提供できないことを理解するだろう。したがって当業者は、本発明はメチルセルロースおよびＤ−マンニトールを補充した培地を単に提供するものではないことを認識するだろう。むしろ本発明は、併せて追加成分の複合混合物を、好ましくは至適濃度で、含む培地、および培養液中の胚に有害と判明した一般に使用される培地成分の選択的除外を提供する。そのうちいくつかは、以下を含む。
【００４８】
（ｉ）栄養および浸透圧バランスの主要なプロバイダーである２種のアミノ酸（Ｌ−タウリンおよびグルタミン酸）の独自の濃度を含む。これらアミノ酸は、１ｍＭ〜３０ｍＭのＬ−タウリンおよび１ｍＭ〜５０ｍＭのＬ−グルタミンの濃度の範囲内で提供され、より好ましくは１０ｍＭ〜３０ｍＭのＬ−タウリンおよび１０ｍＭ〜３０ｍＭのＬ−グルタミン、ならびに最も好ましくはそれぞれ２０ｍＭのＬ−タウリンおよびＬ−グルタミンである。
【００４９】
（ｉｉ）エネルギー源として、ヒト胚の発生阻止を起こしにくい化合物（Ｄ−グルコース、フルクトースまたはピルビン酸を含む）のいずれか１つまたは複数を含む。フルクトースの至適濃度は、約０．５ｍＭ〜６．０ｍＭのフルクトースで、より好ましい濃度は約１ｍＭ〜５．６ｍＭであり、最も好ましい濃度は約５．１ｍＭである。残りの２種のエネルギー源の至適濃度は、本書中の他の場所に示される。
【００５０】
（ｉｉｉ）以下の特定のアミノ酸濃度を含む。
【表１】
【００５１】
（ｉｖ）以下の水溶性ビタミン濃度を含む。
【表２】
【００５２】
（ｖ）５マイクロモーラー〜２０マイクロモーラー、より好ましくは８マイクロモーラー〜１２マイクロモーラー、さらにより好ましくは１０マイクロモーラーのビタミンＥ(Vitamin E Type 6, Sigma Chemical Co.)を含む。
（ｖｉ）接合体および初期卵割期胚の発生に有害となり得るＬ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−セリンを除外する。
（ｖｉｉ）胚発生に有害となり得る元素鉄を除外する。
（ｖｉｉｉ）６０マイクロモーラー〜５００マイクロモーラーおよびより好ましくは２５０マイクロモーラー〜３５０マイクロモーラー、さらにより好ましくは３００モーラーの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含む。
【００５３】
他の化合物
【表３】
【００５４】
＊＊ＨＥＰＥＳ
受精および胚培養培地中 ０ｍＭ
配偶子取り扱い培地中 １５ｍＭ
洗浄培地中 ２５ｍＭ
本明細書中に説明されているＰＦＭ−１１培地シリーズは、少なくとも以下の側面で通常の胚培養培地と異なる。
１．培地へドナー血清タンパク質を添加することがない−これは病気感染の可能性を排除し、本願発明によるＰＦＭ−１１培地シリーズを危険のないものにする。
２．メチルセルロースおよびＤ−マンニトールの存在
３．アミノ酸、抗酸化物質、ビタミン、エネルギー源およびミネラル塩の、すべてが胚培養に至適化した、種類および濃度に関しての培地組成の変更
【００５５】
本発明の培地の利点には、患者／医療従事者に対するリスクの低減がある。本発明の実質的に無タンパク質の培地は、患者、患者の新生児および培地に曝された医療従事者に対するリスクを低減する理由でも有利である。特定のリスクは残るが、それらは本発明の実質的に無タンパク質の培地を使用して避けられる感染のリスクと比較して、小さなものである。 それらリスクには、使用される成分に対するアレルギーが含まれる。抗生物質以外の原料成分は、主に不活性および非反応性であるため、これが起こる可能性はとても考えにくい。すべての原料成分は、アレルギー応答を誘発する可能性の低い微量濃度である。
【００５６】
臨床試験
ＰＦＭ−１１培地シリーズの最終調合物で産生した胚の移植に、臨床試験が認可された。臨床試験は、通常のＩＶＦまたはＩＣＳＩのいずれかで受精が行われたときの、ＰＦＭ−１１培地シリーズの有効性の違いについても調査した。
【００５７】
統計解析
統計学的比較は、２標本ｔ検定または２×２テーブルで行われた。ｐ＜０．０５またはそれ以下の値を、統計学的に有意と考えた。
【００５８】
［結果］
通常のＩＶＦによる授精の場合でのＰＦＭ−１１無タンパク質培地およびMediCultTM胚培養培地中のヒト同胞卵母細胞の培養特性
通常のＩＶＦ後の同胞卵母細胞の受精率は、MediCultTMコントロールおよびＰＦＭ−１１培地中で同様であった（表Ａ）。ＰＦＭと比較して（２．２％）、より高い割合の接合体がMediCultTMコントロール培地中で停止していたが（８．１％）、統計学的に有意ではなかった。超微小滴培養において、ＰＦＭ−１１中で産生した２日ヒトｃＩＶＦ同胞卵割胚の品質は、コントロール培地で産生したものと比較して、卵割球数およびグレードの面で有意に優れていた。ＰＦＭ−１１培地中では、平均卵割球数は３．４であり、平均胚グレードは３．１であった（ｎ＝１１６）。コントロール培地（MediCultTM）中では、平均卵割球数は３．４と同様であり（ｐ＝０．８６５）、平均胚グレードは２．７とより有意に低くなっていた（ｐ＝０．００１、ｎ＝１１８）。４期以上を達成した胚の割合は両集団で同様であったが、３以上のグレードの胚の割合は、ＰＦＭ−１１無タンパク質集団でより有意に高くなっていた。
【００５９】
【表４】
【００６０】
通常ＩＶＦによる授精の場合でのＰＦＭ−１１無タンパク質培地およびMediCultTM胚培養培地中のヒト同胞卵母細胞の培養特性
ＩＣＳＩ後の同胞卵母細胞の受精率は、MediCultTMコントロールと比較して、無タンパク質ＰＦＭ−１１培地でより優位に高かった（７７．８％に対して６９．４％、ｐ＝０．００４３；表Ｂ）。MediCultTM培地と比較して、接合子期での発生停止がＰＦＭ−１１培地でより低下したが、この違いは統計学的に有意ではなかった（それぞれ２．８に対して６．３％、ｐ＝０．００８８）。超微小滴中での培養において、ＰＦＭ−１１培地中で産生した２日ヒトＩＣＳＩ同胞卵割胚の品質は、コントロール培地で産生したものと比較して、卵割球スコアの面で有意に優れていた（それぞれ３．８に対して３．３、ｐ＝０．００１）。ＰＦＭ−１１培地中で産生した胚の平均胚グレードは、コントロール培地中で産生した胚のものと同様であった（２．９に対して２．８、ｐ＝０．０８０）。４期以上を達成した胚の割合は、両集団において同様であったが、グレード３以上の胚の割合は、ＰＦＭ−１１無タンパク質集団でより有意に高かった。
【００６１】
【表５】
【００６２】
臨床試験
現在利用可能なタンパク質を含有する胚培地と比較した場合（全年齢集団合わせて３３％の妊娠、Ali, 2004から引用）、実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地での通常ＩＶＦ臨床妊娠率は、全年齢集団では５０％（２８人中１４人）に、４０歳未満の女性では５３．８％（２６人中１４人）にまで増加する。実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地でのＩＣＳＩ臨床妊娠率は、同様に全年齢集団では４６．２％（２６人中１２人）に、４０歳未満の女性では５４．５％（２２人中１２人）にまで増加する。この差は本願の実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地にとって良い方向に統計学的に有意であり、本願発明の実質的に無タンパク質の培地は、現在市場で入手可能な市販のタンパク質を含有する培地に少なくとも相当すること（およびより優れている可能性）を示している。通常のＩＶＦによって、ＰＦＭ−１１培地中で産生した胚由来の出生児数は、１２人（出産の治療をした女性２６人中８人の３０．８％、または出産した妊娠女性１３人中８人の６１．５％、一人の妊娠を経過観察で失った）、およびＩＣＳＩでもまた、１２人（出産の治療をした女性２２人中８人の３６％または出産した妊娠女性の６６．７％（１２人中８人））であった。本発明のＰＦＭ−１１で産生した胚由来の出生児は、明らかに正常で、知的で、口数が多く、および活発である（親の報告による）。これら統計学的データは、かかる出生をした子供の少なくとも２４のサンプルから作成された。
【００６３】
結果の有意性
生存可能な初期卵割期ヒト胚産生用の合成培地の利用可能性は、とりわけ、潜在的に危険なドナータンパク質を培地から排除することができるので、生殖補助治療（ＡＲＴ）を受けている患者の安全性を改善する。これは、特にヒトの後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および肝炎などのウイルス性疾患、あるいはプリオンによって感染するクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、あるいは血液由来産物中の他の病原性疾患の伝染に関しての特別な懸念であり、世界中多くの発生学者が胚の培養および取り扱い手順用のドナータンパク質の代替となるものを（不成功だが）探すように仕向けた。危険は確実に現実のものである。過去に、Ｂ型肝炎ウイルスで汚染された貯蔵血清を含む培地で培養した胚を受け取り、Ｂ型肝炎の蔓延が約２００人の体外受精（ＩＶＦ）患者で起きた(van Os et al., 1991)。より最近、科学界は胚の培養および取り扱いで使用した培養培地の市販製剤が、後にＣＪＤで死亡した人間によって提供されたアルブミンで汚染されているかもしれないことを、患者に知らせることのジレンマに直面した(Kemmann, 1998)。
【００６４】
病原体およびプリオンに加えて、血清およびアルブミンなどの血清由来のタンパク質は、子宮内膜症患者、反復流産患者および未解明の不妊症を被る患者にみられるような、胎児毒性因子を含んでいるかもしれない(Miller et al., 1995)。これら胎児毒性因子は、その性質はいまだ解明されていないが、インビトロにおいて胚に有害であることが示された(Miller et al., 1995; Fein et al., 1995)。さらに、血清またはアルブミンのバッチ間変動はよく認識されているので、血清またはアルブミンの使用は再現性の問題を生じる。異なるバッチの血清品質を調節できないことは、産生する胚の品質にも影響する可能性がある。胎児毒性および／または血清タンパク質品質の非再現性に関連する問題は、ドナータンパク質を含有する培養培地の代わりに合成培地を使用した場合には当然避けられる。
【００６５】
超微小滴培養条件下のＰＦＭ−１１培養培地中で産生した胚の品質は、同様の培養条件下で行った場合、タンパク質を含有するコントロール培地で産生したものと同様、またはそれらよりいくらか優れていた。より重要なことに、新規の実質的に無タンパク質の培地ＰＦＭ−１１培地中で産生した胚の受精率、接合体停止率および品質は、試験したどのパラメーターに対しても、タンパク質を含有するコントロール培地で観察されたものより劣ってはいない。一方でコントロール培地は、試験したいくつかのパラメーターで劣っていることが判明した。臨床試験は、ＰＦＭ−１１培地は２日胚について、タンパク質を含有するコントロール胚培養培地と同様に効果的またはより優れていることを示した。さらに、生物起源の危険なドナータンパク質を欠いているので、完全に安全である。
【００６６】
微小滴中で産生した胚の品質改善は、胚によって培地中へ放出された特定の成長因子のオートクリンおよびパラクリン効果が原因であることが早くに示された(Paria and Dey, 1990; Paria et al., 1991; Canesco et al, 1992)。実際にｈＩＧＦ−１の培養培地への添加は、ヒトの着床前発生を増強し、特に胚盤胞形成を著しく改善した(Lighten et al., 1998)。近年、ヒト胚の共同培養はヒトの生殖補助において、より高い着床および妊娠率を生じることが報告された(Almagor et al., 1996)。着床前発生における成長因子の効果は、Kane et al. (1997)によって広く概説された。成長因子の効果に関する以前の研究からの証拠は、インビトロにおける胚発生の明らかな成長パターンの欠如を示している。オートクリン成長因子は、ストレス性の培養条件下では胚発生には不可欠かもしれない。胚の着床前発生にポジティブな効果を示し得る成長因子には、ＣＳＦ−１；ＩＧＦ−Ｉ；ＩＧＦ−ＩＩ；ＴＧＦ−αおよびおそらくはＬＩＦが含まれる。
【００６７】
ＰＦＭ−１１培地で調製された精子で、ＰＦＭ−１１培地中にてヒト卵母細胞の受精が起こることが見出された。受精能獲得には影響はなかった。本明細書中において、ＰＦＭ−１１は、培地中の血清タンパク質の非存在下で受精を促進するのに効果的であることが示された。ＰＦＭ−１１を用いる通常のＩＶＦの間の高い受精率は、培地中のタンパク質の欠如が精子の受精能獲得、受精ならびにインビトロにおける胚発生および続く子宮内での生存率を損なわなかったことを示していた。培地中のタンパク質欠乏にもかかわらず、精子の受精能獲得、卵母細胞への精子の侵入および受精が生じた。
【００６８】
臨床妊娠率、出産率および妊娠中断率は、コントロールと比較して（通常のタンパク質含有培地を使用）、被検集団でより有意に優れていた（本発明の実質的に無タンパク質の培地を使用）。また、被検集団中の出産した妊娠女性の割合は、卵割期胚移植において報告された世界平均と同様であった(DeMouzon and Lancaster, 1997)。
【００６９】
本明細書で開示された実験結果は、以下を明らかにした。（ｉ）本発明の実質的に無タンパク質の培地ＰＦＭ−１１を使用して、通常のＩＶＦの間の精子の卵細胞への侵入、配偶子相互作用、および続く通常のＩＶＦまたはＩＣＳＩ後のヒトでの受精はどちらも損なわれず、（ｉｉ）得られた初期卵割期胚は、生存可能および臨床妊娠の誘発が可能であり、（ｉｉｉ）ＰＦＭ−１１で産生した初期卵割期胚の品質は、一般的に、血清タンパク質培地を含有するコントロール培地で産生したものと同様またはいくらか優れていた。
【００７０】
動物起源の調製物のために採用されるストリンジェントな精製および滅菌処置では、絶対的な確実性をもって未知の病原体感染の可能性を除外できない(Truyen et al., 1995)。実質的に無タンパク質の培地の処方およびCumulase（登録商標）などの組み換えヒアルロニダーゼによるヒアルロニダーゼの置換とともに、現在ではＩＶＦ患者への病気感染の明白なリスクのない、完全に研究室での生殖補助手順を行うことが可能である。
【００７１】
結論として、本願発明の実質的に無タンパク質のＰＦＭ−１１培地は、通常のＩＶＦの間の精子の卵母細胞への侵入、およびＩＣＳＩまたは通常のＩＶＦ後の受精を損なわずに効果的であることが実証された。ＰＦＭ培地で産生した胚が移植された場合、３９歳以下の女性において５０％の臨床妊娠率があり、妊娠も損なわれなかった。全体として、ＰＦＭ−１１培地は、生存可能なヒト胚の産生において血清タンパク質を含有する培地より優れていない場合は、同等に効果的であった。ヒトの受胎補助手順におけるＰＦＭの日常的な使用は、タンパク質に結合する病原体または危険なプリオンを介しての病気感染の潜在的リスクを排除できる。本研究は、添加タンパク質を欠いた培地中において、無細胞培養系で生存可能なヒト胚の産生が可能であることを示した。
【００７２】
［本発明のＰＦＭ−１１の調製］
基礎塩類溶液（ＢＳＳ）ストック溶液１：
使用される基礎塩類のストック溶液（基礎塩類溶液−ＢＳＳ）の調製は、ＰＦＭ培養培地、胚取り扱い培地、および洗浄培地の最終的な処方である。
【表６】
【００７３】
調製手順：
１．ストック溶液の調製前に、混合容器をＷＦＩ（注射用水、１８．２メガオームの抵抗）ですすぐ。
２．成分１は非常に吸湿性があるため、１０００ｍＬのＷＦＩに加える。
３．絶えず混ぜながら成分２〜７を順に加え、ＷＦＩを用いて最終容量を１０００ｍＬにする。
４．すべての溶質が完全に溶解した後、すぐに滅菌濾過を行う。溶質が残っている場合、濾過をしないこと。０．１ミクロンフィルターが使用可能であるが、濾過時の過剰な圧力を避ける。ストック１溶液は０．２ミクロンフィルターで前濾過し、続いて０．１ミクロンフィルターで濾過できる。
【００７４】
５．濾過後の沈殿物または濁りはないはずである。
６．適した容量の容器に入れる（例えば、ボトル）。
７．ボトルのふたをする（好ましくは、開封明示シールのある（tamper-evident seal）ボトル）。
８．２〜６℃の間で暗所に保管する。
【００７５】
保管および保存期間
基礎塩類溶液（ＢＳＳ）ストックは、２〜６℃の間で保管した場合、２ヶ月間安定していた。使用前には、沈殿物または濁りについて、保管しているＢＳＳストックを常に注意深く点検する。保管の間に、沈殿物が発生または溶液が濁った場合には捨てる。
【００７６】
最終製品中のＢＳＳストック１の含有容量：
炭酸水素ナトリウムが調合物（培養培地製品）中の主に有効なバッファー成分であるところ、調製した最終調合物１０００ｍＬ毎に７０ｍＬ＊＊のＢＳＳが存在しなければならない。
【００７７】
ＨＥＰＥＳが調合物（精子／洗浄培地製品）中の主に有効なバッファー成分であるところ、調製した最終調合物１０００ｍＬ毎に５０ｍＬのＢＳＳを加える。
【００７８】
培地のオスモル濃度を（それぞれ）増加または減少させるＢＳＳまたはＷＦＩ水での最終培地のオスモル濃度調整：
最終容量（すなわち、ＢＳＳ、ＢＡＡＳおよびＢＶＳを加えた後）が１０００ｍＬ以下である場合、最終培地のオスモル濃度は２８５ミリオスモルであるべきで、その後別に少量のＢＳＳをＷＦＩで希釈する。作業ＢＳＳ（ＷＢＳＳ）を得るために、１容量のＢＳＳと９容量のＷＦＩ水とを使用する。ＷＢＳＳのオスモル濃度を２８５ミリオスモルに調整する。調整したＷＢＳＳで、最終培地の最終容量を１０００ｍＬにする。
全ストック溶液由来の最終調合物の組成については、ストック４のインストラクションを参照。
【００７９】
基礎アミノ酸溶液（ＢＡＡＳ）ストック溶液２：
この手順はＰＦＭ培養培地、配偶子取り扱い培地、および洗浄培地の最終調合物中に含有する、溶液中の基礎アミノ酸（基礎５アミノ酸溶液−ＢＡＡＳ）の１リットルストック溶液の調製に使用した。
【００８０】
試薬
【表７】
【００８１】
ストック２ＢＡＡＳ調製のインストラクション
１．ＷＦＩ（注射用水、１８．２メガオームの抵抗）で混合容器をすすぐ。
２．成分１、２および４〜１１を４００ｍＬのＷＦＩ中に溶解する。
至適条件以下で溶解が困難になるかもしれないので、供給元の保管推奨条件を遵守することが必要である。沈殿物が発生した場合、廃棄して、２５ｍＬの０．１１Ｎ ＮａＯＨおよび２７５ｍＬのＷＦＩを用いて再開する。水酸化ナトリウムは、最後の選択肢としてのみ用いられる。
【００８２】
３．Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２ＯおよびＬ−バリンは溶解が難しくなる可能性があり、かかる状況においては、溶解は１Ｎ ＨＣｌを用いることによって達成することができる。成分３および１２は、別々の３００ｍＬ容量のＷＦＩに溶解すべきである。可溶化達成のためには、可能な限り最小容量の１Ｎ ＨＣｌのみを使用する。使用すべき１Ｎ ＨＣｌ（胚試験済）の最大量は、３００ｍＬのＷＦＩ中２５ｍＬである。全成分を溶解するのに、水、アルカリおよび酸の３７℃以上での加熱は避ける。
４．成分３および１２が完全に溶解したら、ステップ２で作製した水溶性アミノ酸の一部２００ｍLを、（a）全容量が５００ｍＬとなるようにL−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏの溶液３００ｍＬに、（b）全容量が５００ｍＬとなるようにＬ−バリンの溶液３００ｍＬに、段階的な方法で徐々に加えることにより、１０００ｍＬの最終容量にする。
【００８３】
５．沈殿を避けるために一定に混合しながら、段階的な方法で徐々に２つの５００ｍＬ容量を合わせる。
６．すぐに０．２ミクロンフィルターで、溶液を滅菌濾過する。
７．適当な容量の容器（例えば、ボトル）に入れる。
８．ボトルのふたをする（好ましくは、開封明示シールのあるボトル）。
９．２〜６℃の間で暗所に保管する。
【００８４】
保管および保存期間
基礎アミノ酸溶液（ＢＡＡＳ）ストックは、２〜６℃の間で保管した場合に２ヶ月間維持する。使用前には、沈殿物または濁りについて、保管しているＢＡＡＳストックを常に注意深く点検する。保管の間に、沈殿物または濁りが発生した場合には捨てる。
【００８５】
最終製品中のＢＡＡストックの含有容量：
すべての最終調合物の調製物に、１０００ｍＬあたり１０ｍＬのＢＡＡストック溶液を使用するべきである。
遊離型のＬ−チロシンおよびＬ−シスチンが市販されていないため、Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２ＯおよびＬ−シスチン・２ＨＣｌを使用した。
【００８６】
基礎ビタミン溶液（ＢＶＳ）ストック溶液３
本実施例によるプロトコルでは、ＰＦＭ培養培地、配偶子取り扱い培地、および洗浄培地の最終調合物に含有する、溶液中の基礎ビタミン（基礎ビタミン溶液−ＢＶＳ）の１リットルストック溶液を調製する。
【００８７】
試薬
【表８】
【００８８】
ストック３（ＢＶＳ）調製のインストラクション
１．８００ｍＬのＷＦＩ水（注射用水、１８．２メガオーム抵抗）中に成分１〜７を溶解する。成分が溶解しない場合、最後の選択肢として少量の０．１Ｎまたは１Ｎ ＮａＯＨを溶媒和を達成するために使用することができる。
２．成分８を０．１Ｎ ＮａＯＨ２．５ｍＬ中に溶解し、一定に混合しながら成分１〜７を含む８００ｍＬに段階的な方法で注意深く加える。
３．一定に混合しながら、ＷＦＩ水を用いて容量を１０００ｍＬにし、すぐに０．２ミクロンフィルターで適した容器中に滅菌濾過する（例えば、６０ｍＬ Nalgeneボトル、開封明示機構のあるボトル）。
４．ボトルのふたをする。
５．−２０℃で暗所に保管する。
【００８９】
保管および保存期間
基礎ビタミン溶液（ＢＶＳ）ストックは、６０ｍＬのアリコートで−２０℃に保管した場合、２ヶ月間保管できる。使用前には、沈殿物または濁りについて、解凍したＢＶＳストック３を常に注意深く点検する。沈殿物が現れた場合、または解凍した溶液が濁ってみえる場合は捨てる。
最終製品中のＢＶＳストックの含有容量：
調製したすべての最終調合物の調製物に、１０００ｍＬあたり６．０ｍＬのＢＶＳストック溶液を使用するべきである。ストック４参照。
【００９０】
ストック４溶液および最終調合組合物
ストック４の調製は、本願処方の独自の化学物質の最終添加およびストック１基礎塩類溶液（ＢＳＳ）、ストック２基礎アミノ酸溶液（ＢＡＡＳ）およびストック３基礎ビタミン溶液（ＢＶＳ）の特定容量を添加することを可能にする。プロトコルは調製される培地調合物に、すなわち培養培地、配偶子取り扱い培地、および洗浄培地に特定のバッファーおよび抗生物質を記載する。
以下のプロトコルは、培養培地、配偶子取り扱い培地、または洗浄培地の最終調合物１リットルを調製する。より大きなバッチが、適切に量をスケールアップして調製されてもよい。
【００９１】
試薬
【表９】
【００９２】
【表１０】
【００９３】
ストック４の調製および最終調合組合物のインストラクション
１．混合容器をＷＦＩ（注射用水、１８．２メガオームの抵抗）ですすぐ。
２．添加する間、継続的に混合して、７００ｍＬのＷＦＩ中に成分１〜１１を溶解する。
３．成分１２〜１５を加え、ＷＦＩで９００ｍＬにして混合し続ける。
４．基本処方タイプ、すなわちＰＦＭ培養培地、ＰＦＭ配偶子取り扱い培地およびＰＦＭ洗浄培地、の調製に依存して、成分１６〜２１を加える。
５．３種類すべての培地のオスモル濃度を調製し、０．２ミクロンの孔径フィルターを用いて別々に濾過滅菌する。０．１ミクロンフィルターも使用できるが、圧力を避ける。溶液の濾過に高圧が必要であった場合には、０．１ミクロンフィルターは使用しない。
【００９４】
６．すぐに最終包装（Nalgeneボトル）中へ滅菌濾過する。
ＰＦＭ培養培地は６０ｍＬボトル中に入れる。
ＰＦＭ配偶子取り扱い培地は６０ｍＬボトル中に入れる。
ＰＦＭ洗浄培地は１２５ｍＬボトル中に入れる。
（使用するボトルは、好ましくは開封明示機構のあるボトルである。）
７．ボトルのふたをする。
８．ボトルをラベルする。
９．２〜６℃の間で暗所に保管する。
【００９５】
ストック４および最終調合組合物についての脚注
オスモル濃度を確認する。オスモル濃度が高い場合、ＷＦＩ純水を添加して２８５ミリオスモルに調整する。添加する量は以下のように計算する。
［培地のオスモル濃度−所望のオスモル濃度（すなわち２８５）／培地のオスモル濃度］×培地容量
【００９６】
例：上記のように培地のオスモル濃度が３００で培地容量が９００ｍＬの場合、以下に示すように計算する。
［３００−２８５／３００］×９００＝１５／３００×９００＝４５
【００９７】
したがって、培地へ４５ｍＬの水を加え、その後再びオスモル濃度を測定した場合、理論的には約２８５＋／−２または３ユニットのオスモル濃度が得られるはずである。たとえストック１ＢＳＳ溶液をさらに添加して培地のオスモル濃度を戻しても、培地中の重要な成分が希釈され、培地の有効性に影響するので、水を大量に加えすぎないように大いに注意する。
しかしながら、モル浸透圧濃度が２８５ミリオスモル以下の場合、ストック１ＢＳＳのみを培地に加える。１ミリリットルあたりのストック１ＢＳＳで約２〜３ミリオスモル増加するが、常に予測可能ではないかもしれない。したがって、添加しすぎないように大いに注意する。一度に少量添加し、オスモル濃度を測定する。
【００９８】
参照
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生殖細胞のための実質的に無タンパク質の細胞培養培地であって、体外受精および他の生殖補助医療で使用されるヒト生殖細胞のインビトロの処置の全過程での使用に適しており、無機塩、アミノ酸、抗酸化物質、ビタミン、栄養素、抗生物質、Ｄ−マンニトールおよび分子量１４，０００ダルトンのメチルセルロースを含む、前記培地。
【請求項２】
メチルセルロースが、その２％溶液が２５℃で１５センチポアズの粘度を有することを特徴とする、請求項１に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３】
請求項１に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、メチルセルロースが、
式Ｉ：
【化１】
式中、
それぞれのＲは独立してＨまたはＣＨ３であり、
ｎは約３４から約４３の値を有する整数であり、
ここでメトキシ置換が２７．５重量％から３１．５重量％までである、
で表される、前記培地。
【請求項４】
式Ｉの化合物のそれぞれの糖部分に付属するＣＨ３置換基の平均数が、１．５から１．９である、請求項４に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項５】
メチルセルロースが、０．０１ｇ／Ｌ（０．７１μＭ）から０．５ｇ／Ｌ（０．０３６ｍＭ）の濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項６】
メチルセルロースが、０．０１ｇ／Ｌ（０．７１μＭ）から０．１５ｇ／Ｌ（０．０００１１ｍＭ）の濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項７】
メチルセルロースが、約０．１ｇ／Ｌ（０．００７１ｍＭ）の濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項８】
アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−タウリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンまたはグリシン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項９】
請求項８に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、アミノ酸が、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌについては約０．０１８ｍＭ〜約０．１８ｍＭ；Ｌ−シスチン・２ＨＣｌについては約０．００２５ｍＭ〜約０．０２５ｍＭ；Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏについては約０．００５ｍＭ〜約０．０５ｍＭ；Ｌ−イソロイシンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−ロイシンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−リジン・ＨＣｌについては約０．０１２５ｍＭ〜約０．１２５ｍＭ；Ｌ−メチオニンについては約０．００２５ｍＭ〜約０．０２５ｍＭ；Ｌ−フェニルアラニンについては約０．００５ｍＭ〜約０．０５ｍＭ；Ｌ−スレオニンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−トリプトファンについては約０．００１２５ｍＭ〜約０．０１２５ｍＭ；Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏについては約０．００５ｍＭ〜約０．０５ｍＭ；Ｌ−バリンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−アラニンについては約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭ；Ｌ−タウリンについては約１．０ｍＭ〜約３０ｍＭ；グルタミン酸については約０．０１ｍＭ〜約１．０ｍＭ；Ｌ−グルタミンについては約１．０ｍＭ〜約５０ｍＭ；Ｌ−グリシンについては約０．１〜約１．０ｍＭの間の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１０】
請求項９に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、アミノ酸が、０．５ｍＭ Ｌ−アルギニン；０．０１ｍＭ Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ；０．０２ｍＭ Ｌ−ヒスチジン；０．０４ｍＭ Ｌ−イソロイシン；０．０４ｍＭ Ｌ−ロイシン；０．０５ｍＭ Ｌ−リジン・ＨＣｌ；０．０１ｍＭ Ｌ−メチオニン；０．０２ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン；０．０４ｍＭ Ｌ−スレオニン；０．００５ｍＭ Ｌ−トリプトファン；０．０２ｍＭ Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ；０．０４ｍＭ Ｌ−バリン；０．５ｍＭ Ｌ−アラニン；２０ｍＭ Ｌ−タウリン；０．５ｍＭ グルタミン酸；および２０ｍＭ Ｌ−グルタミンまたは０．２５ｍＭ Ｌ−グリシンの濃度で存在する、前記培地。
【請求項１１】
培地に含まれる無機塩が、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項１２】
請求項１１に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、培地に含まれる無機塩が、塩化カルシウムについては約３．０ｍＭ（０．２３ｇ／Ｌ）〜３．６ｍＭ（０．２７ｇ／Ｌ）；硫酸マグネシウムについては約０．７ｍＭ（０．０８６ｇ／Ｌ）〜約０．８１ｍＭ（０．０９８ｇ／Ｌ）；塩化カリウムについては約４．７ｍＭ（０．３５ｇ／Ｌ）〜約５．４ｍＭ（０．４ｇ／Ｌ）；塩化ナトリウムについては約０．１Ｍ（６．１２ｇ／Ｌ）〜約０．１２Ｍ（６．９５ｇ／Ｌ）；およびリン酸二水素ナトリウムについては約０．８９ｍＭ（０．１０７ｇ／Ｌ）〜約１．０ｍＭ（０．１２２ｇ／Ｌ）の間の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１３】
請求項１２に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、培地に含まれる無機塩が塩化カルシウムについては３．１ｍＭ（０．２３５ｇ／Ｌ）；硫酸マグネシウムについては０．７２ｍＭ（０．０８７ｇ／Ｌ）；塩化カリウムについては４．８ｍＭ（０．３５５ｇ／Ｌ）；塩化ナトリウムについては０．１１Ｍ（６．１７１ｇ／Ｌ）；およびリン酸二水素ナトリウムについては０．８８ｍＭ（０．１０８ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１４】
培地に含まれるビタミンが、塩化コリン、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸、ピリドキシン・ＨＣｌ、リボフラビン、チアミン・ＨＣｌ、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項１５】
請求項１４に記載の実質的無タンパク質培地であって、培地に含まれるビタミンが、塩化コリンについては約０．００４ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）〜０．００５ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；Ｄ−ビオチンについては約０．００２４ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）〜０．００２８ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；ミオイノシトールについては約０．００６７ｍＭ（０．００１２ｇ／Ｌ）〜０．００７８ｍＭ（０．００１４ｇ／Ｌ）；ナイアシンアミドについては約０．００５ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）〜０．００５７ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；Ｄ−パントテン酸については約０．００２５ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）〜０．００３ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；ピリドキシン・ＨＣｌについては約０．００３ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）〜０．００３４ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；リボフラビンについては約０．０００１６ｍＭ（０．００００６ｇ／Ｌ）〜０．０００１９ｍＭ（０．００００７ｇ／Ｌ）；チアミン・ＨＣｌについては約０．００１８ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）〜０．００２１ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；葉酸については約０．００１４ｍＭ（０．００６ｇ／Ｌ）〜０．００１６ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；ビタミンＢ１２については約４４３ｐＭ（６００ｎｇ／Ｌ）〜８８５ｐＭ（１．２ｍｇ／Ｌ）；およびビタミンＥについては０．００８ｍＭ（０．００３ｇ／Ｌ）〜０．０１２ｍＭ（０．００５ｇ／Ｌ）の間の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１６】
請求項１５に記載の実質的無タンパク質培地であって、培地を構成するビタミンが、塩化コリンについては０．００４ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）；Ｄ−ビオチンについては０．００２４ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；ミオイノシトールについては０．００６７ｍＭ（０．００１２ｇ／Ｌ）；ナイアシンアミドについては０．００５ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；Ｄ−パントテン酸については０．００２５ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）；ピリドキシン・ＨＣｌについては０．００３ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；リボフラビンについては０．０００１６ｍＭ（０．００００６ｇ／Ｌ）；チアミン・ＨＣｌについては０．００１８ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）；葉酸については０．００１４ｍＭ（０．００６ｇ／Ｌ）；ビタミンＢ１２については６１６ｐＭ（８００ｎｇ／Ｌ）；およびビタミンＥについては０．０１０ｍＭ（０．００４ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１７】
培地に含まれる栄養素が、Ｄ−グルコース、ピルビン酸、フルクトース、乳酸、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項１８】
請求項１７に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、溶液に含まれる栄養素が、Ｄ−グルコースについては４．３ｍＭ（０．７８ｇ／Ｌ）；ピルビン酸ナトリウムについては０．３ｍＭ（０．０２９７５ｇ／Ｌ）；フルクトースについては５．１ｍＭ（０．９２ｇ／Ｌ）；および乳酸ナトリウムについては１０ｍＭ（１．１３ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１９】
Ｄ−グルコースが、３．０ｍＭ（０．７５ｇ／Ｌ）〜５．６ｍＭ（１．０ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項１８に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２０】
フルクトースが、１ｍＭ（０．１８ｇ／Ｌ）〜５．６ｍＭ（１．０１ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項１９に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２１】
溶液中の抗酸化物質が、グルタチオンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２２】
グルタチオン濃度が、約０．２５ｍＭ（０．０７７ｇ／Ｌ）〜０．３５ｍＭ（０．１１ｇ／Ｌ）の間である、請求項２１に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２３】
グルタチオン濃度が、０．３ｍＭ（０．０９２ｇ／Ｌ）である、請求項２２に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２４】
ＥＤＴＡをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２５】
ＥＤＴＡ濃度が、約０．１ｍＭ（０．０４１６ｇ／Ｌ）〜０．１０３ｍＭ（０．０４３ｇ／Ｌ）の間である、請求項２４に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２６】
ＥＤＴＡ濃度が、０．１ｍＭ（０．０４１８ｇ／Ｌ）である、請求項２５に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２７】
ＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２８】
ＨＥＰＥＳ濃度が、１５ｍＭ（３．６ｇ／Ｌ）または２５ｍＭ（５．９６ｇ／Ｌ）であり、Ｄ−グルコース濃度が、約３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間である、請求項２７に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２９】
フェノールレッドまたは他のｐＨ指示薬をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３０】
フェノールレッド濃度が、０．０３１ｍＭ（０．０１１ｇ／Ｌ）である、請求項２９に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３１】
ゲンタマイシン硫酸塩が、約１．５ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌの濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３２】
ペニシリンＧが、７５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３３】
Ｄ−マンニトールが、約０．０５６μＭから約６．９μＭの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３４】
Ｄ−マンニトールが、２．８μＭの濃度で存在する、請求項３３に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３５】
炭酸水素ナトリウムをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３６】
炭酸水素ナトリウムが、２６．２ｍＭ（２．２ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項３５に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３７】
炭酸水素ナトリウムが、４．０ｍＭ（０．３３６ｇ／Ｌ）〜２６．２ｍＭ（２．２ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項３６に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３８】
請求項３６の実質的に無タンパク質の培地とともにヒト生殖細胞取り扱いのステップを含む、生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項３９】
実質的に無タンパク質の培地が、請求項３６の培地である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４０】
ヒト生殖細胞が、未受精の卵細胞である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４１】
ヒト生殖細胞が、多数の精子である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４２】
ヒト生殖細胞が、受精卵である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４３】
培地が、子宮間授精に特異的である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地使用。
【請求項４４】
請求項１に記載のヒト生殖細胞のための実質的に無タンパク質の細胞培養培地であって、無機塩、アミノ酸、抗酸化物質、ビタミン、栄養素、抗生物質、Ｄ−マンニトールおよび分子量１４，０００ダルトンを有するメチルセルロースのストック溶液の少なくとも１または多数から調製され、ここで該ストック溶液が水で希釈されて、実質的に無タンパク質の細胞培養培地が作られる、前記培地。
【請求項４５】
ヒト生殖細胞のための実質的に無タンパク質の細胞培養培地であって、体外受精および他の生殖補助医療で使用されるヒト生殖細胞のインビトロの治療の全過程での使用に適しており、０．５ｍＭ Ｌ−アルギニン；０．０１ｍＭ Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ；０．０２ｍＭ（Ｌ−ヒスチジン；０．０４ｍＭ Ｌ−イソロイシン；０．０４ｍＭ Ｌ−ロイシン；０．０５ｍＭ Ｌ−リジン・ＨＣｌ；０．０１ｍＭ Ｌ−メチオニン；０．０２ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン；０．０４ｍＭ Ｌ−スレオニン；０．００５ｍＭ Ｌ−トリプトファン；０．０２ｍＭ Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ；０．０４ｍＭ Ｌ−バリン；０．５ｍＭ Ｌ−アラニン；２０ｍＭ Ｌ−タウリン；０．５ｍＭ グルタミン酸（０．３９ｍＭ）；２０ｍＭ Ｌ−グルタミンまたは０．２５ｍＭ Ｌ−グリシン；３．１ｍＭ（０．２３５ｇ／Ｌ）塩化カルシウム；０．７２ｍＭ（０．０８７ｇ／Ｌ）硫酸マグネシウム；４．８ｍＭ（０．３５５ｇ／Ｌ）塩化カリウム；０．１１Ｍ（６．１７１ｇ／Ｌ）塩化ナトリウム；０．８８ｍＭ（０．１０８ｇ／Ｌ）リン酸二水素ナトリウム；０．００４ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）塩化コリン；０．００２４ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）Ｄ−ビオチン；０．００６７ｍＭ（０．００１２ｇ／Ｌ）ミオイノシトール；０．００５ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）ナイアシンアミド；０．００２５ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）Ｄ−パントテン酸；０．００３ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）ピリドキシン・ＨＣｌ；０．０００１６ｍＭ（０．００００６ｇ／Ｌ）リボフラビン；０．００１８ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）チアミン・ＨＣｌ；０．００１４ｍＭ（０．００６ｇ／Ｌ）葉酸；６１６ｐＭ（８００ｎｇ／Ｌ）ビタミンＢ１２；０．０１０ｍＭ（０．００４ｇ／Ｌ）ビタミンＥ；４．３ｍＭ（０．７８ｇ／Ｌ）Ｄ−グルコース；０．３ｍＭ（０．０２９７５ｇ／Ｌ）ピルビン酸ナトリウム；５．１ｍＭ（０．９２ｇ／Ｌ）フルクトース；１０ｍＭ（１．１３ｇ／Ｌ）乳酸ナトリウム；０．３ｍＭ（０．０９２ｇ／Ｌ）グルタチオン；０．１ｍＭ（０．０４１８ｇ／Ｌ）ＥＤＴＡ；０．０３１ｍＭ（０．０１１ｇ／Ｌ）フェノールレッド；２．８μＭ Ｄ−マンニトール；２６．２ｍＭ（２．２ｇ／Ｌ）炭酸水素ナトリウム；７５ｍｇ／Ｌ ペニシリンＧ；および１．５ｍｇ／Ｌ ゲンタマイシン硫酸塩を含む、前記培地。
【請求項４６】
ゲンタマイシン硫酸塩濃度が４ｍｇ／Ｌである、請求項４５に記載の実質的無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項４７】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに１５ｍＭ（３．６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４５に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項４８】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに２５ｍＭ（５．９６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４５に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項４９】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに１５ｍＭ（３．６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４６に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項５０】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに２５ｍＭ（５．９６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４６に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項１】
ヒト生殖細胞のための実質的に無タンパク質の細胞培養培地であって、体外受精および他の生殖補助医療で使用されるヒト生殖細胞のインビトロの処置の全過程での使用に適しており、無機塩、アミノ酸、抗酸化物質、ビタミン、栄養素、抗生物質、Ｄ−マンニトールおよび分子量１４，０００ダルトンのメチルセルロースを含む、前記培地。
【請求項２】
メチルセルロースが、その２％溶液が２５℃で１５センチポアズの粘度を有することを特徴とする、請求項１に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３】
請求項１に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、メチルセルロースが、
式Ｉ：
【化１】
式中、
それぞれのＲは独立してＨまたはＣＨ３であり、
ｎは約３４から約４３の値を有する整数であり、
ここでメトキシ置換が２７．５重量％から３１．５重量％までである、
で表される、前記培地。
【請求項４】
式Ｉの化合物のそれぞれの糖部分に付属するＣＨ３置換基の平均数が、１．５から１．９である、請求項４に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項５】
メチルセルロースが、０．０１ｇ／Ｌ（０．７１μＭ）から０．５ｇ／Ｌ（０．０３６ｍＭ）の濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項６】
メチルセルロースが、０．０１ｇ／Ｌ（０．７１μＭ）から０．１５ｇ／Ｌ（０．０００１１ｍＭ）の濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項７】
メチルセルロースが、約０．１ｇ／Ｌ（０．００７１ｍＭ）の濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項８】
アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−タウリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンまたはグリシン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項９】
請求項８に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、アミノ酸が、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌについては約０．０１８ｍＭ〜約０．１８ｍＭ；Ｌ−シスチン・２ＨＣｌについては約０．００２５ｍＭ〜約０．０２５ｍＭ；Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏについては約０．００５ｍＭ〜約０．０５ｍＭ；Ｌ−イソロイシンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−ロイシンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−リジン・ＨＣｌについては約０．０１２５ｍＭ〜約０．１２５ｍＭ；Ｌ−メチオニンについては約０．００２５ｍＭ〜約０．０２５ｍＭ；Ｌ−フェニルアラニンについては約０．００５ｍＭ〜約０．０５ｍＭ；Ｌ−スレオニンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−トリプトファンについては約０．００１２５ｍＭ〜約０．０１２５ｍＭ；Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏについては約０．００５ｍＭ〜約０．０５ｍＭ；Ｌ−バリンについては約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ；Ｌ−アラニンについては約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭ；Ｌ−タウリンについては約１．０ｍＭ〜約３０ｍＭ；グルタミン酸については約０．０１ｍＭ〜約１．０ｍＭ；Ｌ−グルタミンについては約１．０ｍＭ〜約５０ｍＭ；Ｌ−グリシンについては約０．１〜約１．０ｍＭの間の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１０】
請求項９に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、アミノ酸が、０．５ｍＭ Ｌ−アルギニン；０．０１ｍＭ Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ；０．０２ｍＭ Ｌ−ヒスチジン；０．０４ｍＭ Ｌ−イソロイシン；０．０４ｍＭ Ｌ−ロイシン；０．０５ｍＭ Ｌ−リジン・ＨＣｌ；０．０１ｍＭ Ｌ−メチオニン；０．０２ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン；０．０４ｍＭ Ｌ−スレオニン；０．００５ｍＭ Ｌ−トリプトファン；０．０２ｍＭ Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ；０．０４ｍＭ Ｌ−バリン；０．５ｍＭ Ｌ−アラニン；２０ｍＭ Ｌ−タウリン；０．５ｍＭ グルタミン酸；および２０ｍＭ Ｌ−グルタミンまたは０．２５ｍＭ Ｌ−グリシンの濃度で存在する、前記培地。
【請求項１１】
培地に含まれる無機塩が、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項１２】
請求項１１に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、培地に含まれる無機塩が、塩化カルシウムについては約３．０ｍＭ（０．２３ｇ／Ｌ）〜３．６ｍＭ（０．２７ｇ／Ｌ）；硫酸マグネシウムについては約０．７ｍＭ（０．０８６ｇ／Ｌ）〜約０．８１ｍＭ（０．０９８ｇ／Ｌ）；塩化カリウムについては約４．７ｍＭ（０．３５ｇ／Ｌ）〜約５．４ｍＭ（０．４ｇ／Ｌ）；塩化ナトリウムについては約０．１Ｍ（６．１２ｇ／Ｌ）〜約０．１２Ｍ（６．９５ｇ／Ｌ）；およびリン酸二水素ナトリウムについては約０．８９ｍＭ（０．１０７ｇ／Ｌ）〜約１．０ｍＭ（０．１２２ｇ／Ｌ）の間の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１３】
請求項１２に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、培地に含まれる無機塩が塩化カルシウムについては３．１ｍＭ（０．２３５ｇ／Ｌ）；硫酸マグネシウムについては０．７２ｍＭ（０．０８７ｇ／Ｌ）；塩化カリウムについては４．８ｍＭ（０．３５５ｇ／Ｌ）；塩化ナトリウムについては０．１１Ｍ（６．１７１ｇ／Ｌ）；およびリン酸二水素ナトリウムについては０．８８ｍＭ（０．１０８ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１４】
培地に含まれるビタミンが、塩化コリン、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸、ピリドキシン・ＨＣｌ、リボフラビン、チアミン・ＨＣｌ、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項１５】
請求項１４に記載の実質的無タンパク質培地であって、培地に含まれるビタミンが、塩化コリンについては約０．００４ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）〜０．００５ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；Ｄ−ビオチンについては約０．００２４ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）〜０．００２８ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；ミオイノシトールについては約０．００６７ｍＭ（０．００１２ｇ／Ｌ）〜０．００７８ｍＭ（０．００１４ｇ／Ｌ）；ナイアシンアミドについては約０．００５ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）〜０．００５７ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；Ｄ−パントテン酸については約０．００２５ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）〜０．００３ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；ピリドキシン・ＨＣｌについては約０．００３ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）〜０．００３４ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；リボフラビンについては約０．０００１６ｍＭ（０．００００６ｇ／Ｌ）〜０．０００１９ｍＭ（０．００００７ｇ／Ｌ）；チアミン・ＨＣｌについては約０．００１８ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）〜０．００２１ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；葉酸については約０．００１４ｍＭ（０．００６ｇ／Ｌ）〜０．００１６ｍＭ（０．０００７ｇ／Ｌ）；ビタミンＢ１２については約４４３ｐＭ（６００ｎｇ／Ｌ）〜８８５ｐＭ（１．２ｍｇ／Ｌ）；およびビタミンＥについては０．００８ｍＭ（０．００３ｇ／Ｌ）〜０．０１２ｍＭ（０．００５ｇ／Ｌ）の間の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１６】
請求項１５に記載の実質的無タンパク質培地であって、培地を構成するビタミンが、塩化コリンについては０．００４ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）；Ｄ−ビオチンについては０．００２４ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；ミオイノシトールについては０．００６７ｍＭ（０．００１２ｇ／Ｌ）；ナイアシンアミドについては０．００５ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；Ｄ−パントテン酸については０．００２５ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）；ピリドキシン・ＨＣｌについては０．００３ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）；リボフラビンについては０．０００１６ｍＭ（０．００００６ｇ／Ｌ）；チアミン・ＨＣｌについては０．００１８ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）；葉酸については０．００１４ｍＭ（０．００６ｇ／Ｌ）；ビタミンＢ１２については６１６ｐＭ（８００ｎｇ／Ｌ）；およびビタミンＥについては０．０１０ｍＭ（０．００４ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１７】
培地に含まれる栄養素が、Ｄ−グルコース、ピルビン酸、フルクトース、乳酸、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項１８】
請求項１７に記載の実質的に無タンパク質の培地であって、溶液に含まれる栄養素が、Ｄ−グルコースについては４．３ｍＭ（０．７８ｇ／Ｌ）；ピルビン酸ナトリウムについては０．３ｍＭ（０．０２９７５ｇ／Ｌ）；フルクトースについては５．１ｍＭ（０．９２ｇ／Ｌ）；および乳酸ナトリウムについては１０ｍＭ（１．１３ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、前記培地。
【請求項１９】
Ｄ−グルコースが、３．０ｍＭ（０．７５ｇ／Ｌ）〜５．６ｍＭ（１．０ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項１８に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２０】
フルクトースが、１ｍＭ（０．１８ｇ／Ｌ）〜５．６ｍＭ（１．０１ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項１９に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２１】
溶液中の抗酸化物質が、グルタチオンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２２】
グルタチオン濃度が、約０．２５ｍＭ（０．０７７ｇ／Ｌ）〜０．３５ｍＭ（０．１１ｇ／Ｌ）の間である、請求項２１に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２３】
グルタチオン濃度が、０．３ｍＭ（０．０９２ｇ／Ｌ）である、請求項２２に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２４】
ＥＤＴＡをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２５】
ＥＤＴＡ濃度が、約０．１ｍＭ（０．０４１６ｇ／Ｌ）〜０．１０３ｍＭ（０．０４３ｇ／Ｌ）の間である、請求項２４に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２６】
ＥＤＴＡ濃度が、０．１ｍＭ（０．０４１８ｇ／Ｌ）である、請求項２５に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２７】
ＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２８】
ＨＥＰＥＳ濃度が、１５ｍＭ（３．６ｇ／Ｌ）または２５ｍＭ（５．９６ｇ／Ｌ）であり、Ｄ−グルコース濃度が、約３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間である、請求項２７に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項２９】
フェノールレッドまたは他のｐＨ指示薬をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３０】
フェノールレッド濃度が、０．０３１ｍＭ（０．０１１ｇ／Ｌ）である、請求項２９に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３１】
ゲンタマイシン硫酸塩が、約１．５ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌの濃度で溶液中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３２】
ペニシリンＧが、７５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３３】
Ｄ−マンニトールが、約０．０５６μＭから約６．９μＭの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３４】
Ｄ−マンニトールが、２．８μＭの濃度で存在する、請求項３３に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３５】
炭酸水素ナトリウムをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３６】
炭酸水素ナトリウムが、２６．２ｍＭ（２．２ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項３５に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３７】
炭酸水素ナトリウムが、４．０ｍＭ（０．３３６ｇ／Ｌ）〜２６．２ｍＭ（２．２ｇ／Ｌ）の濃度で存在する、請求項３６に記載の実質的に無タンパク質の培地。
【請求項３８】
請求項３６の実質的に無タンパク質の培地とともにヒト生殖細胞取り扱いのステップを含む、生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項３９】
実質的に無タンパク質の培地が、請求項３６の培地である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４０】
ヒト生殖細胞が、未受精の卵細胞である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４１】
ヒト生殖細胞が、多数の精子である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４２】
ヒト生殖細胞が、受精卵である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地の使用。
【請求項４３】
培地が、子宮間授精に特異的である、請求項３８に記載の生殖補助医療のための培地使用。
【請求項４４】
請求項１に記載のヒト生殖細胞のための実質的に無タンパク質の細胞培養培地であって、無機塩、アミノ酸、抗酸化物質、ビタミン、栄養素、抗生物質、Ｄ−マンニトールおよび分子量１４，０００ダルトンを有するメチルセルロースのストック溶液の少なくとも１または多数から調製され、ここで該ストック溶液が水で希釈されて、実質的に無タンパク質の細胞培養培地が作られる、前記培地。
【請求項４５】
ヒト生殖細胞のための実質的に無タンパク質の細胞培養培地であって、体外受精および他の生殖補助医療で使用されるヒト生殖細胞のインビトロの治療の全過程での使用に適しており、０．５ｍＭ Ｌ−アルギニン；０．０１ｍＭ Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ；０．０２ｍＭ（Ｌ−ヒスチジン；０．０４ｍＭ Ｌ−イソロイシン；０．０４ｍＭ Ｌ−ロイシン；０．０５ｍＭ Ｌ−リジン・ＨＣｌ；０．０１ｍＭ Ｌ−メチオニン；０．０２ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン；０．０４ｍＭ Ｌ−スレオニン；０．００５ｍＭ Ｌ−トリプトファン；０．０２ｍＭ Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ；０．０４ｍＭ Ｌ−バリン；０．５ｍＭ Ｌ−アラニン；２０ｍＭ Ｌ−タウリン；０．５ｍＭ グルタミン酸（０．３９ｍＭ）；２０ｍＭ Ｌ−グルタミンまたは０．２５ｍＭ Ｌ−グリシン；３．１ｍＭ（０．２３５ｇ／Ｌ）塩化カルシウム；０．７２ｍＭ（０．０８７ｇ／Ｌ）硫酸マグネシウム；４．８ｍＭ（０．３５５ｇ／Ｌ）塩化カリウム；０．１１Ｍ（６．１７１ｇ／Ｌ）塩化ナトリウム；０．８８ｍＭ（０．１０８ｇ／Ｌ）リン酸二水素ナトリウム；０．００４ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）塩化コリン；０．００２４ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）Ｄ−ビオチン；０．００６７ｍＭ（０．００１２ｇ／Ｌ）ミオイノシトール；０．００５ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）ナイアシンアミド；０．００２５ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）Ｄ−パントテン酸；０．００３ｍＭ（０．０００６ｇ／Ｌ）ピリドキシン・ＨＣｌ；０．０００１６ｍＭ（０．００００６ｇ／Ｌ）リボフラビン；０．００１８ｍＭ（０．０００５ｇ／Ｌ）チアミン・ＨＣｌ；０．００１４ｍＭ（０．００６ｇ／Ｌ）葉酸；６１６ｐＭ（８００ｎｇ／Ｌ）ビタミンＢ１２；０．０１０ｍＭ（０．００４ｇ／Ｌ）ビタミンＥ；４．３ｍＭ（０．７８ｇ／Ｌ）Ｄ−グルコース；０．３ｍＭ（０．０２９７５ｇ／Ｌ）ピルビン酸ナトリウム；５．１ｍＭ（０．９２ｇ／Ｌ）フルクトース；１０ｍＭ（１．１３ｇ／Ｌ）乳酸ナトリウム；０．３ｍＭ（０．０９２ｇ／Ｌ）グルタチオン；０．１ｍＭ（０．０４１８ｇ／Ｌ）ＥＤＴＡ；０．０３１ｍＭ（０．０１１ｇ／Ｌ）フェノールレッド；２．８μＭ Ｄ−マンニトール；２６．２ｍＭ（２．２ｇ／Ｌ）炭酸水素ナトリウム；７５ｍｇ／Ｌ ペニシリンＧ；および１．５ｍｇ／Ｌ ゲンタマイシン硫酸塩を含む、前記培地。
【請求項４６】
ゲンタマイシン硫酸塩濃度が４ｍｇ／Ｌである、請求項４５に記載の実質的無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項４７】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに１５ｍＭ（３．６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４５に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項４８】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに２５ｍＭ（５．９６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４５に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項４９】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに１５ｍＭ（３．６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４６に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【請求項５０】
Ｄ−グルコース濃度が３．３ｍＭ（０．５９ｇ／Ｌ）〜約３．６ｍＭ（０．６５ｇ／Ｌ）の間であり、さらに２５ｍＭ（５．９６ｇ／Ｌ）ＨＥＰＥＳを含む、請求項４６に記載の実質的に無タンパク質の細胞培養培地。
【公表番号】特表２０１１−５０７５３０（Ｐ２０１１−５０７５３０Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９９０８（Ｐ２０１０−５３９９０８）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８７８１８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８６１９１
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５１０１７０８９９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８７８１８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８６１９１
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５１０１７０８９９）
【Ｆターム（参考）】
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