説明

無機層状複水酸化物を有するデプスフィルター層

本発明は、無機層状複水酸化物を有するデプスフィルター層、それを生産するための方法、後者を含む濾過装置、少なくとも1つの上記のデプスフィルター層を用いて液体メディウムにおいて少なくとも1つの標的生成物から少なくとも1つの汚染物質を除去するための方法、および汚染物質を除去するためのデプスフィルター層の使用に関するものである。デプスフィルター層は、核酸などの汚染物質を選択的に保持し、一方で、バイオテクノロジー的プロセスの標的タンパク質は濾液内に透過し得る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、無機層状複水酸化物を有するデプスフィルター層、それを生産するための方法、これを含有する濾過装置、少なくとも1つの上流のデプスフィルター層を用いて液体メディウムにおいて少なくとも1つの標的生成物から少なくとも1つの汚染物質を分離するための方法、および汚染物質を除去するためのデプスフィルター層の使用に関するものである。これにおいて、プロセス溶液から望ましくない生物学的成分を分離するために、これらの生物学的成分および所望の標的生成物を含有する液体メディウムを本発明に従ったデプスフィルター層と接触させ、それにより、少なくとも1つの望ましくない生物学的成分がデプスフィルターに吸着により結合し、その結果、プロセス溶液から除去される。したがって、例えば治療用タンパク質などの所望の標的生成物は、デプスフィルターをスムーズにかつ活性な形態で通過し得なくてはならない。望ましくない生物学的成分には、特に生物学的汚染物質、例えば、プロセス溶液からの核酸、細胞タンパク質、ウイルス、または内毒素などが含まれる。治療用タンパク質の例は、抗体、ホルモン、酵素、またはペプチドである。
【背景技術】
【0002】
多くの治療用組換えタンパク質は、大小の産業規模でバイオリアクターまたは発酵槽において実施される細胞培養プロセスに基づくものである。細胞培養溶液は、多くの構成ステップからなるコストのかかるプロセス(「下流プロセス」)において標的タンパク質から分離されなくてはならない無傷細胞、細胞断片、およびわずかな細胞成分などの多くの他の成分のうち、所望の標的タンパク質を含有する。デプス濾過は、細胞、細胞断片、およびコロイド成分の分離において主要な役割を有する。
【0003】
セルロース繊維に基づいたデプスフィルターは、以下の特許においてとりわけ記載されている。US5,232,595は、セルロース、ポリオレフィン、ガラス、またはセラミックなどの繊維材料と、キーゼルグール(kieselguhr)またはパーライト(perlite)との組合せからなるデプスフィルターを記載している。
【0004】
US4,676,904は、中性のおよび正に荷電したセルロース繊維とキーゼルグールまたはパーライトとの組合せからなるデプスフィルター層を記載している。
【0005】
US4,007,114は、サイズが0.1〜0.7μmの電気陰性粒子を分離するための、セルロース繊維およびガラス繊維と、正に荷電したメラミンホルムアルデヒド樹脂とからなる、無粒子フィルター媒質を記載している。このフィルター系へのキーゼルグールの添加は、US4,007,113およびUS4,321,288において記載されている。
【0006】
US4,305,782は、セルロース繊維と、湿潤強度増強剤を有していないSiO/Al複合材料とからなる、正ゼータ電位を有するフィルター系を記載している。US4,305,782において記載されているフィルター系を用いて生物学的溶液からサブミクロン範囲のサイズの汚染物質を除去するための方法は、US4,366,068において記載されている。
【0007】
非粉砕セルロース繊維と粉砕セルロース繊維との組合せを、50質量パーセントのキーゼルグール/パーライトなどの粉末および正に荷電したメラミンホルムアルデヒド樹脂と共にフィルター系内に導入することは、US4,309,247において記載されている。
【0008】
US4,282,261は、セルロース繊維、キーゼルグール、およびポリアミド/ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂からなるフィルター系を用いて、不安定な飲料から懸濁物質を除去するための方法を記載している。
【0009】
US4,859,340は、少なくとも50質量パーセントのキーゼルグールなどのSiO含有粉末、セルロース繊維、および1〜3質量パーセントのポリアミド/ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂からなるデプスフィルター層を記載しており、このデプスフィルター層は、液体の電気陰性粒子汚染物質への増大した結合能力を示す。
【0010】
セルロース繊維およびキーゼルグールを含有するデプスフィルター要素内への一次電荷キャリアおよび二次電荷キャリアの導入は、US4,981,591において記載されている。ポリアミド/ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂は、一次電荷修飾作用物質としてデプスフィルター要素の表面上に吸着され、次に、一次アミン官能基および二次アミン基を有する脂肪族ポリアミンが、二次電荷修飾作用物質として一次電荷修飾作用物質のエポキシ基に結合する。US4,981,591において開示されているこれらのフィルター層を用いて水性溶液から陰イオン性汚染物質を除去するためのプロセスは、US5,085,780において記載されている。
【0011】
最新技術に従って用いられるデプスフィルター層は、一方ではフィルターの孔サイズよりも大きい粒子を分離するために(ふるい効果)用いられ、また他方では、フィルターの孔サイズよりも小さな粒子は、吸着による相互作用によりデプスフィルターによって保持される。これまでに、セルロースベースのデプスフィルター層はとりわけ、細胞培養溶液の精製のための使用を既に見出している。ここ10年間で、細胞培養プロセスにおける細胞密度は、およそ10個細胞/mlから、10個細胞/mlをはるかに上回るまでに上昇している。これに伴って細胞の生存率が顕著に低減し、このことは、包括的な細胞溶解と共に、細胞のタンパク質およびDNAの濃度の非常に顕著な増大をもたらした。現代の細胞培養プロセスは、ml当たり10個細胞を超える細胞密度および50質量%未満の生存率を示し、これにより、DNA濃度は最大10ppm(1g/l)となり得る(Tarrachら、Pharmaceutical Technology Europe、2008年4月1日、71〜77頁)。これは、細胞、細胞断片、コロイド成分、細胞タンパク質、DNAなどの望ましくない成分の分離に関して特別なデプスフィルターに対する要求が増大していることの、基本的な理由である。同時に、コストの大きい治療用標的タンパク質がスムーズにかつ活性な形態でデプスフィルターを通過し得ることを確実にしなくてはならない。したがって、標的タンパク質の十分に高い透過を伴う、高い能力および/または高い汚染物質除去という観点から、改良されたデプスフィルター層が常に要求されている。
【0012】
細胞培養DNAはヒトの病因という観点から患者に対するリスクとなるため、細胞培養DNAの枯渇は、当局により明示的に要求されている。ガイドラインは、「Points to Consider in the Manufacturing and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」(FDA CBER、1997年2月28日)および「Requirements for Biological Substances No.50.Requirements for the Use of Animal Cells as in vitro Substrates for the Production of Biologicals」(WHO Technical Report Series No.878、1998)である。ガイドラインに従うと、バイオリアクター/発酵槽の下流の精製プロセスによって、このDNAは検出限界を下回る含有量まで除去されなくてはならないため、プロセス技術に関して、高いDNA濃度は問題である。原則として、クロマトグラフィープロセス(フローモードの「捕捉ステップ」および陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質A)がDNAの枯渇に用いられる。しかし、10ppmを超える最初のDNA濃度では、これらのプロセスによる適切なDNA枯渇は、プロセス技術および経費の観点から実施不可能である(K.Tarrach、「Process Economy of Disposable Chromatography in Antibody Manufacturing」、WIBio’s BioProcess Technology 4th Annual Conference(Amsterdam、The Netherlands、2007年4月))。
【0013】
したがって、高濃度のDNAおよび汚染物質から下流のプロセスをなくすために、最初の精密検査ステップにおいてさらなるステップまたは改良された技術が必要であり、それは、現時点のクロマトグラフィー法が、伝導性プロフィールが高いと失敗するためである(J.Nolan、EMD Pharmaceuticals、Downstream Technology Forum、Boston、Massachusetts、2007年10月9日)。
【0014】
このような可能性は、より大きなデプスフィルター領域またはより大きなフィルター容積の使用により原則としてもたらされ、特に多層デプスフィルターがここでは効果的であることが見出されており、それは、より大きなフィルター高さ(2つのフィルター層が重なり合っている)の使用を介して、かつそれに伴う長い滞留時間およびより大きな結合能力によって、単層デプスフィルターを用いるよりも大量のDNAを枯渇させ得るためである。
【0015】
文献から、デプスフィルターによるDNA枯渇に対するわずかな研究のみが今までのところ知られている(Yigzawら、Biotechnol.Prog.2008、22、288〜296頁、「Exploitation of the Adsorptive Properties of Depth Filters for Host Cell Protein Removal during Monoclonal Antibody Purification」において概説されている)。これらは、DNAの結合が疎水性メカニズムおよび電荷依存性メカニズムの両方を介して起きることを示す。これにおいて、フィルターの正の表面電荷は最も重要なものであり、正に荷電したバインダーを用いて実現される。DNAの保持に対するバインダー含有量の影響はEschrichらによって研究されており、DNAの保持がバインダー含有量を介して限定的に増大され得るのみであることを示す(BioPharm、1997年1月、46〜49頁)。さらに、この方法は、デプスフィルターにおけるバインダー含有量の増大を伴う、考慮すべき不利益を有し、プロセスにおける抽出可能な成分の含有量もまた増大する。
【0016】
したがって、抽出可能な成分を同時に増大させることなくDNAの枯渇を増大させ得るデプスフィルターが所望の改良を有するものとなる。同時に、DNAの枯渇を増大させながら、例えば治療用タンパク質などの標的生成物の枯渇を増大させてはならない。この関連において、DNA枯渇デプスフィルター層が、下流プロセスにおけるクロマトグラフィープロセスの前または後にそれらを使用することを可能にする物理化学的安定性を有しているべきであることを重視することが重要である。同時に、DNA枯渇デプスフィルター層の結合能力は、記載される汚染物質の信頼性のある枯渇を可能にするために、細胞培養上清の伝導性プロフィールの範囲内にあるべきである。下流の、よりコストの大きい精製ステップへの負担を軽減するために、第1の精製ステップの後のプロセスの開始時点でこのようなデプスフィルター層を用いることが可能であり、必要である。
【0017】
Angew.Chem.2000、112、4207〜4211頁において、DNA−LDHハイブリッドの形態の無機の非細胞傷害性ベクターとして、可溶性の層状複水酸化物(LDH)が報告されている。ここで、負に荷電したDNA断片が、層状複水酸化物の正に荷電した水滑石様層の層間空間内に、イオン交換プロセスを介してインターカレートされる。この組み込みを介してDNAの分解が妨げられ、エンドサイトーシスによる哺乳動物細胞内へのDNA−LDHハイブリッドの輸送が可能になる。細胞の細胞質において、DNAは次に、さらなるプロセスのために遊離する。
【0018】
DE102 37 517A1およびDE102 37 518A1において、焼成ハイドロタルサイトなどの粉末形態の層状複水酸化物を用いた、生体分子の富化または枯渇が記載されている。多孔質の層状複水酸化物は吸着材として機能し、この吸着材は、とりわけアルギン酸塩、キトサン、ペクチン、および炭酸カルシウムなどのバインダーと結合して粒子凝集物もしくは成形体となっているか、または炭酸カルシウムなどの担体上に堆積している。それによって、焼成ハイドロタルサイトとDNAとの間、またさらに焼成ハイドロタルサイトと所望の標的タンパク質との間の高い結合能力が実現される。1μmを超えるハイドロタルサイトの平均粒子サイズ(D50)は、吸着材としての使用に特に有利であることが見出されている。DE102 37 517A1およびDE102 37 518A1に従うと、標的タンパク質からの選択的なDNA分離はこの吸着材では実現されない。
【0019】
JP2006−026566Aは、気体の吸着のため、家庭内区域における脱臭のため、食品を新鮮に保つため、および防虫剤として、有機ポリマー粒子、ハイドロタルサイト、および紙またはプラスチックフィルムに基づくフィルター材料からなるフィルム様材料を記載している。JP2003−047647Aは、ハイドロタルサイト、金属酸化物、アクリル酸(メタクリル酸)誘導体、およびオルガノポリシロキサンの脱臭組成物を記載している。WO2005/014160A1は、セルロース含有またはリグニン含有紙および無機層状複水酸化物に基づく多孔質材料を記載している。DE29520817U1は、セルロース繊維から生産される紙および湿潤強度増強剤を記載している。DE10044218A1は、湿潤強度処理された、親水性ポリイソシアネートで処理されたセルロース繊維を有するデプスフィルターを記載している。
【0020】
最新技術において、ハイドロタルサイトを用いた、またはデプスフィルター層を用いた、標的タンパク質を同時に結合することのない、DNAなどの望ましくない生体分子の選択的なかつ十分に高い枯渇については、何も知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0021】
【特許文献1】US5,232,595
【特許文献2】US4,676,904
【特許文献3】US4,007,114
【特許文献4】US4,007,113
【特許文献5】US4,321,288
【特許文献6】US4,305,782
【特許文献7】US4,366,068
【特許文献8】US4,309,247
【特許文献9】US4,282,261
【特許文献10】US4,859,340
【特許文献11】US4,981,591
【特許文献12】US5,085,780
【非特許文献】
【0022】
【非特許文献1】Tarrachら、Pharmaceutical Technology Europe、2008年4月1日、71〜77頁
【非特許文献2】「Points to Consider in the Manufacturing and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」(FDA CBER、1997年2月28日)
【非特許文献3】「Requirements for Biological Substances No.50.Requirements for the Use of Animal Cells as in vitro Substrates for the Production of Biologicals」(WHO Technical Report Series No.878、1998)
【非特許文献4】K.Tarrach、「Process Economy of Disposable Chromatography in Antibody Manufacturing」、WIBio’s BioProcess Technology 4th Annual Conference(Amsterdam、The Netherlands、2007年4月)
【非特許文献5】J.Nolan、EMD Pharmaceuticals、Downstream Technology Forum、Boston、Massachusetts、2007年10月9日
【非特許文献6】Yigzawら、Biotechnol.Prog.2008、22、288〜296頁、「Exploitation of the Adsorptive Properties of Depth Filters for Host Cell Protein Removal during Monoclonal Antibody Purification」
【非特許文献7】BioPharm、1997年1月、46〜49頁
【非特許文献8】Angew.Chem.2000、112、4207〜4211頁
【特許文献13】DE102 37 517A1
【特許文献14】DE102 37 518A1
【特許文献15】JP2006−026566A
【特許文献16】JP2003−047647A
【特許文献17】WO2005/014160A1
【特許文献18】DE29520817U1
【特許文献19】DE10044218A1
【非特許文献9】F.Cavaniら、Catalysis Today 1991、11(2)、173〜301頁
【非特許文献10】K.L.Manchester、BioTechniques 20(6)1996、968〜970頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0023】
本発明の目的は、液体メディウムからの、例えば核酸などの望ましくない生物学的汚染物質の特に高度で迅速な枯渇を可能にし、一方で同時に、例えば治療用タンパク質などの所望の標的生成物がデプスフィルターをスムーズにかつ活性な形態で通過し得る、大小の産業規模の安定で安価なデプスフィルター層を提供することである。さらに、本発明に従ったデプスフィルター層の利用、プロセス溶液から生物学的汚染物質を分離するための方法、および本発明に従ったデプスフィルター層を含有する濾過装置が提案される。
【課題を解決するための手段】
【0024】
この課題は、請求項1に記載のデプスフィルター層、請求項18に記載のデプスフィルター層を生産するための方法の提供により、請求項32に記載の発明に従ったデプスフィルター層の使用により、請求項27に記載の汚染物質から標的生成物を分離するための方法の提供により、かつ請求項1に記載のデプスフィルター層を含有する請求項26に記載の濾過装置の提供により解決される。
【0025】
標的生成物は、上流の生産プロセスによって得られる全ての生成物を意味すると理解されるべきである。これらには、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、またはホルモンなどの生体分子が含まれる。特に、標的生成物は治療用タンパク質を意味すると理解される。
【0026】
ここで、核酸は、リボ核酸(RNA)およびデオキシリボ核酸(DNA)、特に、真核生物源、原核生物源、およびウイルス源に由来するゲノムDNA、またさらにエピゲノムDNA、特に15塩基対を超える鎖長を有する核酸などの、全ての自然に生じる核酸を意味すると理解されるべきである。
【0027】
汚染物質は、標的物質とは異なり、かつプロセス溶液内に含有される、全ての物質、特に、細胞全体、ならびに細胞凝集物、細胞断片、コロイド成分、および高分子生体分子を意味し、また、後者のケースでは特に、核酸、宿主細胞タンパク質、リポ多糖、脂質、糖質などの群から選択される生体分子を意味すると理解されるべきである。プロセス溶液という用語には、標的分子が生物学的手順(発酵アプローチ)、特に真核生物および原核生物および細胞の群からの生物学的手順により生産される溶液が含まれる。さらに、これには、発酵酒に由来する溶液、特に、遠心分離、前濾過、浸透プロセス、または化学物質の希釈もしくは導入などの分離プロセスにより生産される溶液が含まれる。
【0028】
驚くべきことに、本発明に従うと、無機層状複水酸化物、特にハイドロタルサイトを含有するデプスフィルター層が、DNAなどの望ましくない生物学的汚染物質の特に高い枯渇が起こる一方で所望の標的タンパク質がデプスフィルターをスムーズに通過し得るという点で、生物学的成分を選択的に結合することが見出された。最新技術のデプスフィルターは、不十分な量のDNAのみを枯渇させ、標的タンパク質はデプスフィルターをほぼスムーズに通過する。デプスフィルター層において加工されない、最新技術のハイドロタルサイト粉末は、望ましくDNAを枯渇させ、かつまた、望ましくないことに標的タンパク質を枯渇させる。
【0029】
本発明に従ったデプスフィルター層を用いると、デプスフィルター上への所望の標的タンパク質の結合を伴うことなく、最新技術と比較して最大10倍高いDNA枯渇が達成される(以下の表3、「50質量%DBT」、例えばDF4対DF7を比較されたい)。この挙動は驚くべきことであり、それは、例えば、粉末状のハイドロタルサイトは選択性を有さず、DNAなどの生物学的汚染物質および所望の標的タンパク質の両方がかなりの程度で結合し、それにより細胞培養溶液の精製のための粉末自体の使用が不可能になるためである。得られるプロセス溶液から分離される生物学的成分に関するこの高い選択性は、唯一、本発明に従った加工、例えば、セルロース繊維、場合によりキーゼルグール、および正に荷電した湿潤強度増強剤との、デプスフィルター層への、ハイドロタルサイト粉末の加工による。明らかに、この驚くべき、かつ有利な挙動は、ハイドロタルサイトと、荷電した湿潤強度増強剤の複合構造との間の相互作用に基づくものである。
【0030】
ここで、本発明に従うと、湿潤強度増強剤は、湿潤状態のデプスフィルターの引張強度、耐折強度、破裂強度、および摩耗強度を増大させるために、デプスフィルターの生産プロセスにおいて水性懸濁液に添加される、全ての水溶性合成樹脂を意味すると理解されるべきである。ここで、ポリマー化合物または多官能性化合物が用いられるが、それが有する反応基は、乾燥条件下でセルロースおよび無機粉末のカルボキシル基および/またはOH基とのみ反応し、それによりフィルター成分を互いに架橋するものである。湿潤強度増強剤の最も重要な基は、エピクロルヒドリン樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂(MF)、尿素ホルムアルデヒド樹脂(UF)、グリオキサルポリアクリルアミド樹脂、またさらにイソシアネート樹脂である。正に荷電した湿潤強度増強剤には、好ましくは、ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミドエピクロロヒドリン樹脂、およびポリアミドポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、例えばKymene(登録商標)、Nadavin(登録商標)、またはPolycup(登録商標)が含まれ、これらにおいて、反応基としての、環が歪んだ4員環構造を有する陽イオン性アゼチジニウム基が、ホモ架橋および共架橋し得る。例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層を用いて初めて、従来の細胞および細胞断片の分離ならびにコロイド成分の除去に加えて、さらに同時に細胞培養溶液から大量のDNAも除去される、デプスフィルター層が提供され得る。したがって、例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層は、汚染物質の濃度が低下しているという観点から質が向上した濾液を生じさせ、それにより、有利なことに、「下流プロセス」における、その後の、また時にはコストのかかる精製ステップ、すなわち、標的分子を精密検査するための下流の多段階プロセスが単純化される。本発明に従ったデプスフィルター層の物理化学的安定性は、したがって、下流プロセスにおけるクロマトグラフィーステップの前およびクロマトグラフィーステップの後の両方での細胞培養溶液を濾過するためのデプスフィルターの使用を可能にする。それにより、細胞培養上清の伝導性プロフィールにおける高いDNA結合能力が実現される。
【0031】
上記で既に一部記載したように、本発明に従ったデプスフィルター層は、セルロース繊維および/またはその誘導体、少なくとも1つの無機層状複水酸化物、および少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤から生産される。
【0032】
本発明に従うと、木材(硬材もしくは軟材)または綿から本来得られるセルロース繊維および/またはその誘導体が用いられる。好ましくは、木材から得られる、特に好ましくは軟材から得られるセルロース繊維が用いられる。長さの異なる(長繊維および短繊維セルロース)セルロース繊維の混合物、および純粋な短繊維セルロースもしくは純粋な長繊維セルロースを用いることができ、ここで、繊維の長さは0.1mmから7mmであり、繊維の幅は5μmから30μmであり、好ましくは10μmから30μmである。フィルターにおいて、セルロースは3次元のネットワークを形成し、これにより、高い機械的安定性および速い流速が確実になる。3次元ネットワークの空洞、および無機粉末には、フィルターとしても機能し、フィルター表面の平滑化にも寄与する、短繊維セルロースが存在する。好ましい実施形態において、短繊維のみのセルロースがセルロース繊維として用いられる。セルロース繊維の誘導体もまた用いることができ、水溶性カルボキシアルキルセルロースが好ましい。カルボキシメチルセルロース(CMC)は、水溶性カルボキシアルキルセルロースの中でも特に好ましい。本発明に従ったデプスフィルター層の生産のために用いられる混合物におけるCMCの質量割合は、0.1から10質量%であり、好ましくは0.3から2.0質量%であり、より好ましくは0.4から1.5質量%であり、最も好ましくは0.5から1.0質量%である。CMCをエピクロロヒドリン樹脂と組み合わせると、乾燥強度および湿潤強度が向上する。さらに、セルロースの誘導体として、例えば、アンモニウムイオン担持基で官能化されたセルロース、好ましくはトリメチルアンモニウムプロピルセルロールクロリドおよび2−ヒドロキシトリメチルアンモニウムプロピルセルロースクロリド、またはアミノ基、好ましくはアルキルアミンで官能化されたセルロースなどの、陽イオン修飾セルロースを用いることができる。
【0033】
本発明に従ったデプスフィルター層の無機層状複水酸化物は、好ましくは、Catalysis Today 1991、11(2)、173〜301頁においてF.Cavaniらによって記載されているような、天然および合成のハイドロタルサイトならびにハイドロタルサイト様化合物の群から選択される。これに関連して、特に176から191頁を参照することができ、その開示の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。ハイドロタルサイトは、陽イオン性の層構造を有しており、層間空間には交換可能な陰イオンを有する。本発明に従うと、前記天然および合成のハイドロタルサイトならびにハイドロタルサイト様化合物は、例えば以下の式で説明することができる。
[(M2+1−x(M3+(OH)x+(An−x/n)・mH
[(M1−x(M3+(OH)(2x−1)+(An−(2x−1)/n)・mH
この式において、xは0から1、好ましくは0.1≦x≦0.5、より好ましくは0.2≦x≦0.33の値を取ることができる。nは1から4の値を取り得、mは結晶水含有量に応じて変化し、0を含む有理数である。適切な化合物における結晶水の最大可能量は、上記文献の189および190頁において記載されている様々なアプローチによって決定可能である。さらに、前記天然および合成のハイドロタルサイトならびにハイドロタルサイト様化合物について、例えば、MおよびM2+の両方を含有する化合物もまた挙げることができる。これらのケースでは、上記文献を同様に参照することができる。
【0034】
本発明に従うと、ハイドロタルサイトMgAl(CO)(OH)16・4HOは、好ましくは、天然または合成の非焼成生成物として用いられる。通常、用いられる層状複水酸化物は、一価、二価、および三価の金属陽イオンM、M2+、およびM3+、ヒドロキシド陰イオンOH、ならびにさらなる一価から多価の陰イオンAn−(n=1、2、3、4)、ならびに必要であれば結晶水からなる。ここで、Mは、例えばLiまたはNaなどの一価のアルカリ金属イオンであり、M2+は、例えばMg2+、Sr2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、またはCa2+などの二価のアルカリ土類金属イオンまたは遷移金属イオンであり、M3+は、例えばB3+、Al3+、Ga3+、Ni3+、Co3+、Cr3+、Fe3+、Mn3+、V3+、Ti3+、Sc3+、またはIn3+などの三価の主族元素イオンまたは遷移金属イオンであり、An−は、例えばF、Cl、Br、I、OH、NO、ClO、ClO、IO、CO2−、SO2−、PO3−、AsO3−、S2−、WO2−、CrO2−、[Fe(CN)3−、[Fe(CN)4−、[SiO(OH)などの陰イオン、ヘテロポリ酸、有機酸、または有機金属錯体である。ここで、ヘテロポリ酸の例は、(PMo12403−および(PW12403−であり、有機酸の例は、アジピン酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、セバシン酸、1,12−ドデカンジカルボン酸、アシルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩、ならびにクロロ桂皮酸であり、有機金属錯体の例は、[Ru(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリンジスルホネート)4−である。ここで、M2+とM3+とのモル比は、最大で2.5:1であり、好ましくは最大で2.3:1であり、特に好ましくは最大で2.1:1である。酸化物MOとMとの質量比として計算される、M2+とM3+との質量比は、最大で2.2:1であり、好ましくは最大で2.0:1であり、特に好ましくは最大で1.85:1である。最も好ましくは、マグネシウムおよびアルミニウムの陽イオンならびに陰イオンとしてのカルボン酸塩からなる、合成の非焼成ハイドロタルサイトが用いられる。実施例において、アルミニウムマグネシウムのヒドロキシカルボン酸塩である、Sudchemie AGから入手されるSyntal(登録商標)696が用いられ、この塩において、酸化物MgOとAlとの質量比は1.625に等しい。無機層状複水酸化物粒子の直径は、0.1μmから500μmであり、好ましくは0.3から300μmであり、特に好ましくは0.5から100μmである。用いられるハイドロタルサイトは、15m/gを超える、好ましくは25m/gを超える、特に好ましくは35m/gを超えるブルナウアー・エメット・テラー(BET)表面積を有する。特別な実施例において、50m/gまたは54m/gのBET表面積を有するハイドロタルサイト粉末が用いられる。ここで、BET表面積は、以下で述べるようにして決定される。
【0035】
本発明に従ったデプスフィルター層は、無機粉末として、無機層状材料のみを、またさらに、無機層状材料とSiOに基づいた粒子および/または少なくとも1つのその誘導体との混合物を含有し得る。SiOに基づいた粒子として、場合によってはパーライトと組み合わされた、多孔質のキーゼルグールおよび/または合成シリカゲルが、好ましくは用いられる。特に好ましくは、場合によってはパーライトと組み合わされて、珪藻土が用いられ、最も好ましくは天然の珪藻土が用いられる。天然の珪藻土は焼成されていない。SiOに基づいた粒子の誘導体には、SiOに基づいた全ての陰イオン交換材料、例えば、第4級アンモニウムイオンを含有する有機基で官能化されたSiO、特に好ましくは、トリメチルアンモニウムプロピルクロリドで官能化されたSiOが含まれる。SiOに基づいた粒子の平均粒子サイズ直径は、0.5μmから100μmであり、好ましくは2μmから40μmであり、非常に好ましくは4μmから20μmである。実施例において、8μmの平均粒子サイズ直径を有するキーゼルグールが用いられる。
【0036】
好ましくは、ハイドロタルサイトのみ、またはハイドロタルサイトとキーゼルグールとの混合物が、無機粉末として用いられる。ここで、特に好ましいものは、ハイドロタルサイトのみ、またはハイドロタルサイトの含有量がキーゼルグールの含有量よりも大きい、ハイドロタルサイトとキーゼルグールとの混合物である。本発明に従ったデプスフィルター7(HT900)についての実施例においては、ハイドロタルサイトのみが用いられ、さらなる実施例では、ハイドロタルサイトの含有量は、キーゼルグールの含有量の、好ましくは少なくとも1.7倍高く、特に好ましくは少なくとも2倍高い。
【0037】
用いられる他の成分に基づいた無機粉末の含有量は、10質量%から75質量%であり、好ましくは20質量%から70質量%であり、特に好ましくは30質量%から65質量%である。デプスフィルター層におけるハイドロタルサイトの含有量が高いほど、本発明に従ったデプスフィルターのDNA結合能力が高い。
【0038】
湿潤強度増強剤として、本発明に従うと、エピクロロヒドリン樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、尿素ホルムアルデヒド樹脂、グリオキサルポリアクリルアミド樹脂、イソシアネート樹脂、およびその混合物からなる群から得られる水溶性樹脂が用いられる。正に荷電したエピクロロヒドリン樹脂が好ましく、ポリアミド/ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、およびポリアミドエピクロロヒドリン樹脂、例えば、Kymene(登録商標)、Nadavin(登録商標)、またはPolycup(登録商標)が特に好ましい。実施例において、Herculesから入手されるKymene(登録商標)が、湿潤強度増強剤として使用される。生産プロセスにおいて、樹脂を、本発明に従ったデプスフィルター層の他の成分と接触させると、湿潤強度増強剤の反応性アゼチジニウム基またはエピクロロヒドリンに基づいた他の基と、セルロース繊維および無機粉末(無機層状複水酸化物、および場合によっては天然珪藻土または合成シリカゲルなどのSiOに基づいた粒子からなる)のカルボキシル基および/またはヒドロキシ基との間でポリマー架橋が生じ、一方、例えばエステル結合などの共有結合および非共有結合の形成を伴う化学的架橋が生じるのは、主に、フィルター生産のその後の乾燥プロセスにおいてのみである。この反応を介してのみ、デプスフィルターは、使用プロセスにおいて、正の荷電を維持しながら、その湿潤強度を保持する。添加される他のフィルター成分に基づいた湿潤強度増強剤の含有量は、0.5質量%から10質量%であり、好ましくは1質量%から5質量%である。実施例において、2質量%の湿潤強度増強剤が使用される。
【0039】
好ましい実施形態に従うと、本発明は、
− セルロース繊維および/またはその誘導体、
− 少なくとも1つの無機層状複水酸化物、ならびに
− 少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤
から生産されるデプスフィルターを提供し、このデプスフィルター層は、少なくとも1つの無機層状複水酸化物の含有量が10〜65質量%であり、セルロース繊維および/またはその誘導体の含有量が30〜80質量%であり、かつ有機湿潤強度増強剤の含有量が0.5〜10質量%であり、かつ含有量が合計100質量%である混合物から生産される。
【0040】
本発明に従ったデプスフィルター層の生産は、好ましくは、
(1)少なくとも1つの液体メディウムにおいてセルロース繊維および/またはその誘導体を調製するステップ、
(2)少なくとも1つの無機層状複水酸化物を添加するステップ
(3)ステップ(2)において得られた混合物に少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤を添加するステップ、
(4)ステップ(3)で得られた懸濁液を担体上にアプライするステップ、
(5)少なくとも1つの液体メディウムを除去するステップ、ならびに
(6)ステップ(5)において得られたデプスフィルター層を乾燥させるステップ
を含む方法により行われる。
【0041】
好ましい実施形態に従うと、セルロース繊維は、水に添加され、粉砕機を用いて所望の粉末度まで粉砕される。セルロール繊維の粉砕の程度ならびに用いられる無機粉末の粒子サイズおよびフィルター内の粉末含有量により、デプスフィルターの濾過分解が主に決定される。セルロース繊維の粉砕はまた、無機層状複水酸化物を添加した後、すなわちステップ(2)の後、または湿潤強度増強剤を添加した後、すなわちステップ(3)の後にも行われ得る。
【0042】
ここで、濾過分解は、溶液から異なるサイズの成分を分離することを意味すると理解されるべきである。デプス濾過はまた、フィルター層の孔サイズよりも小さな粒子についても行われ得る。したがって、デプスフィルターでは、濾過効果は、絶対保持率に基づいた膜のケースのように孔の直径を与えることによっては説明されない。ここでは、濾過分解の特徴付けはむしろ、所定の条件下での透水性の説明によってなされる。
【0043】
無機粉末を添加した後、セルロース繊維および無機粉末の水性懸濁液の総固体含有量はおよそ4質量%である。湿潤強度増強剤の添加は、本発明に従うと、無機粉末を添加する前または後に行うことができる。得られる懸濁液は、例えばふるい器にアプライされ、例えば、水は表面真空の適用により除去され、好ましい実施形態に従うと、その間に、濃縮懸濁液が同時にオーバートラベルローラーにより均質化され、得られるフィルター表面は平滑化されている。湿潤デプスフィルター層は、好ましくは、ローラーを用いて所望のフィルター厚さに圧縮され、好ましくは、可変的に調節可能な温度範囲を有する乾燥炉においておよそ100〜250℃で乾燥される。この間に、乾燥が、温度上昇プロフィールを伴って、または一定温度で行われ得る。好ましくは、温度プロフィールが、非常に好ましくは異なる温度範囲を有する温度プロフィールが実行される。好ましくは、本発明に従ったデプスフィルター層の厚さは1からら8mmであり、特に好ましくは2から6mmである。実施例において、厚さは3.0mmから4.5mmである。本発明に従ったデプスフィルターの濾過分解の尺度としての水流量は、1バールの差圧で100mlの蒸留水について、47mmの直径サイズを有する本発明に従ったデプスフィルターが必要とする、単位[秒]で表される時間の測定値によって得られる。水流量はまた、単位が[リットル/(mフィルター分)]の水流速として表されることも多い。およそ4mmの厚さの、20から2000 l(m分)の水流速を有する、本発明に従ったデプスフィルター層が好ましい。
【0044】
本発明のさらに好ましい実施形態に従うと、二酸化ケイ素および/または少なくとも1つのその誘導体を、前記ステップ(4)の前にさらなる成分として添加することができる。あるいは、本発明に従うと、二酸化ケイ素および/または少なくとも1つのその誘導体を、少なくとも1つの無機層状複水酸化物と共にステップ(2)において添加することができる。
【0045】
本発明のさらに好ましい実施形態に従うと、キーゼルグールおよび/またはパーライトが、前記ステップ(4)の前にさらなる成分として添加される。あるいは、本発明に従うと、キーゼルグールおよび/またはパーライトを、少なくとも1つの無機層状複水酸化物と共にステップ(2)において添加することができる。
【0046】
本発明に従ったデプスフィルター層は、液体メディウムから微粒子成分、コロイド成分、および溶解成分を除去するための濾過プロセスにおいて用いられる。ここで、分離される成分は、好ましくは、望ましくない生物学的汚染物質である。特に好ましくは、分離される成分は、例えば細胞、細胞断片、コロイド成分、細胞タンパク質、DNA、ウイルス、および内毒素などの、細胞培養溶液からの汚染物質を含む。ここで、分離には、液体メディウムからの望ましくない生物学的汚染物質の少なくとも1つが含まれ、一方、液体メディウムに同様に含有される標的生成物は、デプスフィルター層をスムーズにかつ活性な形態で通過し得る。標的生成物は、上流の生産プロセスによって得られる全ての生成物を意味すると理解される。好ましくは、標的生成物は生体分子を含む。特に好ましくは、標的生成物は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、またはホルモンを意味すると理解される。特に、標的生成物は、治療用タンパク質を意味すると理解される。ここで、液体メディウムは、分離される成分とデプスフィルターとの接触を可能にする全てのメディウムを意味すると理解される。特に、ここでは、溶液、懸濁液、ディスパーション、エマルジョン、またはコロイド溶液の形態の水性または水含有メディウムがある。これにおいて、通常の実施から生じる全ての液体メディウム、例えば生物学的およびバイオテクノロジー的溶液、医学的溶液、食品、飲料、動物の餌、および産業廃棄物処理から生じる溶液、ならびに化学産業から生じる溶液などを用いることができる。好ましくは、本発明に従ったデプスフィルター層は、生物学的、バイオテクノロジー的、および薬学的産業から生じる液体メディウム、ならびに食品および飲料の産業から生じる液体メディウムを濾過するために用いられる。特に好ましくは、デプスフィルター層は、生物学的およびバイオテクノロジー的溶液を濾過するために用いられる。実施例において、デプスフィルター層は、細胞培養溶液ならびにDNA含有およびタンパク質含有生物学的溶液を濾過するために用いられる。ここで、濾過される液体メディウムから分離される成分の除去は、サイズ排除を介して、吸着メカニズムを介して、イオン交換プロセスおよび/またはインターカレーションを介して行うことができる。
【0047】
必要であれば、プロセスに応じて、新たなデプスフィルター層が、すすぎプロセスによってそれらが用いられる前に、例えば、水または緩衝液含有溶液での事前すすぎの前に、準備されるべきである。必要であれば、濾過される液体メディウムも、例えば前濾過または遠心分離などによるプロセスに応じて、それらが用いられる前に、準備されるべきである。
【0048】
デプスフィルター層を適切に利用するために、本発明はさらに、上記で特徴付けされたデプスフィルター層を含有する濾過装置を提供する。本発明に従った濾過装置は、好ましくは、金属製の、または特に好ましくはプラスチック製もしくは同様の材料製のフィルター収納部を包含し、これにより、安価な使い切りの濾過装置および上記で特徴付けされたデプスフィルター層の少なくとも1つが可能になる。
【0049】
さらに、液体メディウムにおいて少なくとも1つの標的生成物から少なくとも1つの生物学的汚染物質を分離するための方法であって、
(a)少なくとも1つの汚染物質および少なくとも1つの標的生成物を含有する液体メディウムと、本発明に従った少なくとも1つのデプスフィルター層とを接触させるステップ、
(b)少なくとも1つのデプスフィルター層によって少なくとも1つの汚染物質を保持するステップ、ならびに
(c)少なくとも1つの標的生成物および液体メディウムを含有する濾液を得るステップ
を含む方法が提供される。
【0050】
さらなるステップ(d)として、さらなる好ましい実施形態において、濾液における少なくとも1つの標的生成物の含有量を増大させるために、デプスフィルター層の洗浄を、ステップ(c)の後に、液体メディウムおよび/またはすすぎメディウムを用いて行うことができる。
【0051】
本発明に従ったプロセスは、独立し得るか、または、さらなるその後の精製ステップを含む、より複雑なプロセスの一部であり得る。
【0052】
最後に、本発明は、汚染物質を除去するための、上記で特徴付けされたデプスフィルター層の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1】漏出曲線(breakthrough curve)を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図2】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図3】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図4】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図5】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図6】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【発明を実施するための形態】
【0054】
本発明および本発明から生じるさらなる利益は、実施例において記載される実施形態に関連して、以下の記載においてより詳細に説明される。
【実施例】
【0055】
分析方法の説明
静的なDNA結合およびタンパク質結合
無機粉末の静的な結合能力を決定するために、蒸留水中の定義された粉末懸濁液を、50mg無機粉末/ml蒸留水の含有量で調製する。懸濁液を、10mlのプラスチック製遠心分離管内の1mlのアリコートに分ける。アリコートには、さらに3.5mlの蒸留水および0.5mlの10倍濃縮PBS緩衝液(水中で、2.4gのKHPO/l、14.4gのNaHPO・2HO/l、80gのNaCl/l、2gのKCl/l)を添加し、それを、混合し、平衡のために振とうしながら10分間にわたりインキュベートする。上清を遠心分離の後に除去する。平衡粉末を、2.5mlのDNA試験溶液またはタンパク質試験溶液と共に、振とうしながら3時間にわたり室温でインキュベートする。試験溶液として、1倍濃縮PBS緩衝液内に溶解された1mg/mlの濃度のサケ精子DNA(Na塩、サイズ分布500〜1000塩基対、製品番号54653、Biomol)またはポリクローナルヒトIgG混合物(Cytoglobin(登録商標)/Bayer Vital、D−Leverkusen)を用いる。次に、遠心分離の後、上清のDNAまたはタンパクの濃度を、標準系列に基づいて測光により決定する。
【0056】
無機粉末およびデプスフィルター材料のBETの決定
ブルナウアー・エメット・テラー(BET)法による材料の吸着表面の決定は、Gemini BET系(Micromeretics)を用いて行う。調製のために、ガラス製試料管のおよそ25%を試料で満たし、乾燥のために120℃で真空下において2時間にわたり加熱する。得られた乾燥試料の質量は、空の試料管との質量差に基づいて決定する。BET表面積の測定のために、試料管を、提供された土台内のGemini BET系内に固定する。測定は、液体窒素で冷却しながら、空の参照管と比較して行う。測定および評価は、200mmHg/分の排出速度で11個の測定点を記録することによって、および窒素についての以下の物理的特性の仮定を用いて、装置のソフトウェアを開始することにより行う。
密度:0.0015468、非理想係数:0.000062、分子断面積:0.162mm
【0057】
動的なDNA結合およびタンパク質結合
デプスフィルター層への動的な結合能力の決定は、47mmの直径および13.2cmの有効フィルター領域を有する円形のプレスディスクを用いて、4.3ml/分の流速の一定流量下で、フローモードで行う。プレスディスクは、ステンスレス鋼製の濾過収納部(Sartorius Stedim Biotech GmbH)内に置き、200mlの逆浸透(RO)水で、次に60mlの1倍濃縮PBS緩衝液で、事前すすぎを行い、次にDNAまたはタンパク質試験溶液で完全にすすぐ。試験溶液として、0.5mg/mlの濃度を有するサケ精子DNA(Na塩、サイズ分布500〜1000塩基対、製品番号54653、Biomol)、または1倍濃縮PBS緩衝液内に溶解された、1mg/mlの濃度を有するポリクローナルヒトIgG混合物(Cytoglobin(登録商標)/Bayer Vital、Leverkusen)を用いる。さらに、試験溶液として、DNAとIgGとの混合物を用いる。これに、0.5mg/mlの濃度を有するサケ精子DNA(Na塩、サイズ分布500〜1000塩基対、製品番号54653、Biomol)、および、同時に、1倍濃縮PBS緩衝液内に溶解された、1mg/mlの濃度を有するポリクローナルヒトIgG混合物(Cytoglobin(登録商標)/Bayer Vital、Leverkusen)を添加する。濾液の吸光値を、オンラインの光度計によってそれぞれ260nmおよび280nmで記録し、その記録から、標準系列を用いて濃度を決定する。DNAとポリクローナルヒトIgG混合物との混合物では、DNA濃度は式A×[260nmでの吸光]−B×[280nmでの吸光]を用いて計算し、IgG濃度は式C×[280nmでの吸光]−D×[260nmでの吸光]を用いて計算する。係数A〜Dは、K.L.Manchester、BioTechniques 20(6)1996、968〜970頁において記載されているように、DNAおよびポリクローナルヒトIgG混合物の吸光係数から装置特異的定数として計算される。漏出曲線の評価は、50質量%動的漏出(DBT)と濾過の全過程にわたる累積透過の累積結合との決定によって行われる。50質量%DBTは、用いられるDNA濃度またはIgG濃度に基づいた、濾液流における50質量%濃度レベルの実現を意味すると理解される。
【0058】
水流量
水流量を測定するために、直径が47mmの円形のデプスフィルタープレスディスクを、最大容積が200mlのフィルターホルダー(Sartorius Stedim Biotech GmbH SM 16249)内に置き、1バールの差圧で100mlの水で事前すすぎをする。次に、1バールの差圧での100mlの水について、[秒]で表される流れ時間を、ストップウォッチを用いて決定する。水流速を、水流速[l/m分]=0.1[l]/(12.57×10−4[m]×時間[分])という式を用いて、有効フィルター領域が12.57cmであるという仮定で計算する。
【0059】
質量の決定、厚さの測定、および密度の決定
デプスフィルター層の質量、厚さ、および密度の決定は、17.35cmのフィルター領域に対応する47mmの直径を有する円形のプレスディスクを用いて行われる。
【0060】
質量は、試験材料モニターバランス(Sartorius LP 3200 D)を用いて1mgの精度で決定する。
【0061】
デプスフィルター試料の平均厚さの決定は、Hahn&Kolb(0.01mmの精度)から入手される厚さ測定装置を用いて行われる。厚さは、4個の端点で、およびプレスディスクの中央において測定する。平均厚さは、5個の測定点の平均として計算される。
【0062】
密度は、
密度[g/cm]=質量[g]/(17.35cm×厚さ[cm])
という式に従って、厚さおよび質量について決定された値から計算される。
【0063】
(A)用いられるデプスフィルター
デプスフィルター1:C8HP(Sartorius Stedim Biotech GmbH)
デプスフィルター2:S5P(Sartorius Stedim Biotech GmbH)
デプスフィルター3:40DE(Millipore Corp.)
デプスフィルター4:75DE(Millipore Corp.)
デプスフィルター5:(B)のように、本発明に従ったHT500
デプスフィルター6:(B)のように、本発明に従ったHT750
デプスフィルター7:(B)のように、本発明に従ったHT900
デプスフィルター8:(B)のように、本発明に従ったHT500G
(B)本発明に従ったデプスフィルターの組成
デプスフィルター5(HT500):
37.5質量パーセントのセルロース繊維(Weyerhaeuser Tyee)、0.5質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、38質量パーセントのハイドロタルサイトSyntal(登録商標)696(0.8μm〜25μm)、22質量パーセントのキーゼルグールSA3、2質量パーセントのKymene(登録商標)。
【0064】
デプスフィルター6(HT750):
32.5質量パーセントのセルロース繊維(Weyerhaeuser Tyee)、0.5質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、45質量パーセントのハイドロタルサイトSyntal(登録商標)696(0.8μm〜25μm)、20質量パーセントのキーゼルグールSA3、2質量パーセントのKymene(登録商標)。
【0065】
デプスフィルター7(HT900):
34.5質量パーセントのセルロース繊維(Weyerhaeuser Tyee)、0.5質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、63質量パーセントのハイドロタルサイトSyntal(登録商標)696(0.8μm〜25μm)、2質量パーセントのKymene(登録商標)。
デプスフィルター8(HT500G):
27.5質量パーセントのセルロース繊維(Weyerhaeuser Tyee)、0.5質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、55質量パーセントのハイドロタルサイトSyntal(登録商標)696(1μm〜278μm)、15質量パーセントのキーゼルグールSA3、2質量パーセントのKymene(登録商標)。
【0066】
(C)ハイドロタルサイト粉末Syntal(登録商標)696の特徴付け
静的系におけるサケ精子DNA:(Na塩、サイズ分布500〜1000塩基対、製品番号54653、Biomol)の結合およびポリクローナルヒトIgG混合物(Cytoglobin(登録商標)/Bayer Vital、D−Leverkusen)の結合を測定した。正確な手順は上記の「分析方法」の節において記載した。
【0067】
【表1】

【0068】
キーゼルグールはDNAをほとんど結合しない。ハイドロタルサイトは高いDNA結合を示す。不都合なことに、両方の粉末は、大量の標的タンパク質IgGを結合する。
【0069】
(D)デプスフィルターの特徴付け
デプスフィルターの水流量、厚さ、質量、密度、およびBET表面積の決定を、上記の「分析方法」の節において記載したようにして行う。
【0070】
【表2】

【0071】
動的系におけるDNA結合
動的系におけるDNA結合の決定を、上記の「分析方法」の節において記載したようにして行う。
【0072】
【表3】

【0073】
動的系におけるポリクローナルヒトIgG混合物の透過
動的系におけるIgG結合の決定を、上記の「分析方法」の節において記載した通りに行う。
【0074】
【表4】

【0075】
デプスフィルターの比較的な特徴付けのために、これらを同様の水流時間で群に分けることが必要である。以下に、10秒未満の水流時間を有するデプスフィルターを粗大デプスフィルターとして群分けし、50秒を超える水流時間を有するデプスフィルターを狭小デプスフィルターとして群分けする。ここで、水流時間は、47mmの直径を有するデプスフィルターおよび1バールの差圧での100mlの蒸留水に基づくものである。
【0076】
図1は、サケ精子DNAをロードした、本発明に従った粗大(coarse)デプスフィルターDF8についての、ならびに最新技術で知られている粗大デプスフィルターDF1およびDF3についての漏出曲線を示す。全ての3つのデプスフィルターは同様の水流時間を有し、デプスフィルターDF2、DF4、およびDF5からDF7よりも粗大である。
【0077】
図2は、サケ精子DNAをロードした、最新技術で知られている狭小デプスフィルターDF2およびDF4についての、ならびに本発明に従った狭小デプスフィルターDF5、DF6、およびDF7についての漏出曲線を示す。全ての5つのデプスフィルターは同様の水流時間を有し、デプスフィルターDF1、DF3、およびDF8よりも狭小である。
【0078】
図3は、ポリクローナルヒト免疫グロブリン混合物(IgG混合物)をロードした、最新技術で知られている粗大デプスフィルターDF1およびDF3についての、ならびに本発明に従った粗大デプスフィルターDF8についての漏出曲線を示す。
【0079】
図4は、ポリクローナルヒト免疫グロブリン混合物をロードした、最新技術で知られている狭小デプスフィルターDF2およびDF4についての、ならびに本発明に従った狭小デプスフィルターDF5、DF6、およびDF7についての漏出曲線を示す。
【0080】
図5は、サケ精子DNAとポリクローナルヒト免疫グロブリンとの混合物をロードした、本発明に従った粗大デプスフィルターDF8についての、ならびに最新技術で知られている粗大デプスフィルターDF1およびDF3についての漏出曲線を示す。
【0081】
図6は、サケ精子DNAとポリクローナルヒト免疫グロブリンとの混合物をロードした、本発明に従った狭小デプスフィルターDF5、DF6、およびDF7についての、ならびに最新技術で知られている狭小デプスフィルターDF2およびDF4についての漏出曲線を示す。
【0082】
本発明に従ったデプスフィルター層を用いると、最新技術と比較して最大10倍高い、溶液からのDNAの枯渇が得られ得る(表3、「50質量%DBT」、例えばDF4対DF7)。図1および2は、本発明に従ったデプスフィルター層を用いると、狭小の実施形態および粗大の実施形態の両方で、濾液へのDNAの漏出は、最新技術のデプスフィルター層を用いるよりも顕著に遅くにようやく起こり、すなわち、デプスフィルター層へのDNA含有溶液のロードが増大して初めて起こる。一方では、この利益は、表3の実施例における遅延したDNA漏出において見られ(表における「50質量%DBT」を比較されたい)、他方では、DNA結合能力の増大がまた、本発明に従ったデプスフィルターでのDNA漏出曲線が最新技術のデプスフィルターと比較して平らな形状となっていることにおいて見られる。後者の特性は、本発明に従ったデプスフィルターがまた、より長い曝露時間でそれらのDNA枯渇能力に関するそれらの利益を保持するという効果を有する(表3におけるDNA結合についての値を参照されたい)。
【0083】
さらに、所望の標的タンパク質、すなわちポリクローナルヒトIgG混合物は、本発明に従ったデプスフィルター層に、最新技術ほど強力には結合しない(図3および4)。したがって、粗大および狭小の実施形態における本発明に従ったデプスフィルターは、最新技術に従ったデプスフィルターと比較して、IgG混合物の動的漏出および漏出曲線の全体的な形状に関して有利な特性を有する。
【0084】
本発明に従ったデプスフィルター層のこれらの有利な特性はまた、上記の「分析方法」の節において記載されたような、リン酸緩衝食塩水における標的タンパク質および汚染物質を含有する混合物の濾過において見られる。図5および6は、標的タンパク質(ポリクローナルヒトIgG混合物)および汚染物質(サケ精子DNA)からなる2つの成分の混合物の漏出挙動を示す。最新技術に従ったデプスフィルターの全ての4つの例では、DNAの漏出は、IgG画分の漏出よりも早く起こる。したがって、最新技術のデプスフィルターでは、標的タンパク質からの汚染物質の選択的な分離は不可能である。他方で、本発明に従ったデプスフィルターは、対照的な漏出挙動を示す。最新技術に従ったデプスフィルターと同一の実験条件で、標的タンパク質の漏出は、汚染DNAの漏出のかなり前に生じる。したがって、生成物の透過が等しく良好なまま、濾液におけるDNAを顕著に低減させることは、本発明に従ったデプスフィルターによってのみ可能になる(10倍、表3の「50質量%DBT」)。図5は、粗大デプスフィルター層についての漏出挙動を示し、図6は狭小デプスフィルター層についての漏出挙動を示す。本発明に従ったデプスフィルター層の前述の利益は、両方の比較について明らかに認めることができる。本発明に従ったデプスフィルターによる汚染DNAの有利な分離は、したがって、これらのフィルターの開放性の広範な変形にわたり保持される。したがって、本発明に従ったデプスフィルターを、濾過されるメディウムの粒子分布に適合させ、かつ同時に本発明に従った汚染物質の選択的な分離を保持することが可能である。
【0085】
したがって、例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層を用いて初めて、従来の細胞および細胞断片の分離ならびにコロイド成分の除去に加えて、さらに同時に細胞培養溶液から大量のDNAを除去し、一方で標的生成物はデプスフィルターをスムーズにかつ活性な形態で通過し得る、選択的なデプスフィルター層が提供され得る。したがって、例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層は、汚染分物質の濃度が低減しているという観点から質が向上した濾液を生じさせ、それにより、有利なことに、「下流プロセス」における、その後の、また時にはコストのかかる精製ステップが単純化される。それにより、「下流」プロセスの最終部分におけるコストの大きいステップは、顕著に小さな規模で行うことができ、それにより、プロセスのコストという観点からのコストの低減がもたらされるが、また、標的タンパク質の生産損失が低くなることによるコストの低減ももたらされる。同時に、新規なデプスフィルター層の物理化学的安定性によってもまた、「下流」の細胞培養溶液の加工におけるクロマトグラフィーステップの前および後の使用が可能になり、それは、細胞培養上清の伝導性プロフィールにおける高いDNA結合能力が得られるためである。本発明に従ったデプスフィルター層は、「下流」プロセスにおける関連するプロセスウィンドウにおけるpH、温度、圧力、および流量などの関連パラメータに関して十分に高い安定性を示す。本発明に従ったデプスフィルター層は、非常に単純に使い捨て生成物に加工され得、前記生成物は、バイオテクノロジー的、医学的、および薬学的生産プロセスにおいて、二次汚染を避けて最も優れた安全可能性で使用可能である。
【0086】
無機層状複水酸化物粉末は、非常に効果的に、本発明に従ったデプスフィルター層内に組み込むことができ、適切に適合した粒子サイズ分布で、異なる開放性のまたは様々な水流速を有するデプスフィルター層もまた生産可能である。これにより、濾過される特定のプロセス溶液の要求プロフィールに対応する、デプスフィルター層のさらに柔軟な使用が可能になる。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
− セルロース繊維および/またはその誘導体、
− 少なくとも1つの無機層状複水酸化物、ならびに
− 少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤
から生産されるデプスフィルター層であって、混合物の全質量に基づいて、含有量10〜65質量%の少なくとも1つの無機層状複水酸化物、含有量30〜80質量%のセルロース繊維および/またはその誘導体、ならびに含有量0.5〜10質量%の有機湿潤強度増強剤を含む混合物から生産されるデプスフィルター層。
【請求項2】
少なくとも1つの無機層状複水酸化物が、一価のアルカリ金属イオンMおよび/または二価のアルカリ土類金属イオンもしくは遷移金属イオンM2+、三価の主族元素イオンもしくは遷移金属イオンM3+、n=1〜4のn価の陰イオンAn−、ならびにヒドロキシドイオンOHを含有することを特徴とする、請求項1に記載のデプスフィルター層。
【請求項3】
一価のアルカリ金属イオンMが、単独または組み合わされたLi、Naであり、二価のアルカリ土類金属イオンまたは遷移金属イオンM2+が、Mg2+、Sr2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、またはその組合せの群から選択され、三価の主族元素イオンまたは遷移金属イオンM3+が、B3+、Al3+、Ga3+、Ni3+、Co3+、Cr3+、Fe3+、Mn3+、V3+、Ti3+、Sc3+、In3+、またはその組合せの群から選択され、かつ、n価の陰イオンが、F、Cl、Br、I、NO、ClO、ClO、IO、CO2−、SO2−、PO3−、AsO3−、S2−、WO2−、CrO2−、[Fe(CN)3−、[Fe(CN)4−、[SiO(OH)、ヘテロポリ酸、有機酸、有機金属錯体、またはその組合せの群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載のデプスフィルター層。
【請求項4】
無機層状複水酸化物が結晶水を含有することを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項5】
無機層状複水酸化物が、式
[(M2+1−x(M3+(OH)x+(An−x/n)・mH
を有し、0.1≦x≦0.5、1≦n≦4であり、かつmが0を含む有理数であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項6】
無機層状複水酸化物が、式
[(M1−x(M3+(OH)(2x−1)+(An−(2x−1)/n)・mH
を有し、0.1≦x≦0.5、1≦n≦4であり、かつmが0を含む有理数であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項7】
無機層状複水酸化物が、ハイドロタルサイト
MgAl(CO)(OH)16・4H
であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項8】
ハイドロタルサイトが焼成されていないことを特徴とする、請求項7に記載のデプスフィルター層。
【請求項9】
少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤が、水溶性でありかつ正に荷電していることを特徴とする、請求項1から8のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項10】
少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤が、ポリアミド/ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミドエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、またはその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項9に記載のデプスフィルター層。
【請求項11】
さらに、二酸化ケイ素および/または少なくとも1つのその誘導体を用いて生産されることを特徴とする、請求項1から10のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項12】
さらに、キーゼルグール(kieselguhr)またはパーライトまたはその混合物を用いて生産されることを特徴とする、請求項1から10のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項13】
二酸化ケイ素および/または少なくとも1つの誘導体が、0.5μmから100μmの平均直径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項11に記載のデプスフィルター層。
【請求項14】
キーゼルグール、パーライト、またはその混合物が、0.5μmから100μmの平均直径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項12に記載のデプスフィルター層。
【請求項15】
少なくとも1つの無機層状複水酸化物が、0.1μmから500μmの平均直径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項1から14のいずれか1項に記載のデプスフィルター層。
【請求項16】
少なくとも1つの無機層状複水酸化物ならびに二酸化ケイ素および/または少なくとも1つのその誘導体の含有量が20〜75質量%であり、セルロース繊維および/またはその誘導体の含有量が30〜80質量%であり、かつ有機湿潤強度増強剤の含有量が0.5〜10質量%であり、かつ含有量が合計100質量%である混合物から生産されることを特徴とする、請求項11または13に記載のデプスフィルター層。
【請求項17】
少なくとも1つの無機層状複水酸化物およびキーゼルグールまたはパーライトまたはその混合物の含有量が20〜75質量%であり、セルロース繊維および/またはその誘導体の含有量が30〜80質量%であり、かつ有機湿潤強度増強剤の含有量が0.5〜10質量%であり、かつ含有量が合計100質量%である混合物から生産されることを特徴とする、請求項12または14に記載のデプスフィルター層。
【請求項18】
(1)少なくとも1つの液体メディウムにおいてセルロース繊維および/またはその誘導体を調製するステップ、
(2)少なくとも1つの無機層状複水酸化物を添加するステップ
(3)ステップ(2)において得られた混合物に少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤を添加するステップ、
(4)ステップ(3)で得られた懸濁液を担体上にアプライするステップ、
(5)少なくとも1つの液体メディウムを除去するステップ、ならびに
(6)ステップ(5)において得られたデプスフィルター層を乾燥させるステップ
を含む、請求項1から17のいずれか1項に記載のデプスフィルター層を生産するための方法。
【請求項19】
少なくとも1つの有機湿潤強度増強剤がステップ(2)において添加され、かつ少なくとも1つの無機層状複水酸化物がステップ(3)において添加されることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
【請求項20】
セルロース繊維および/またはその誘導体が、ステップ(1)の後、かつステップ(2)の前に粉砕されることを特徴とする、請求項18または19に記載の方法。
【請求項21】
デプスフィルター層がステップ(6)において100℃から250℃で乾燥されることを特徴とする、請求項18から20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項22】
二酸化ケイ素および/または少なくとも1つのその誘導体が、さらなる成分としてステップ(4)の前に添加されることを特徴とする、請求項18から21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項23】
二酸化ケイ素および/または少なくとも1つのその誘導体が、少なくとも1つの無機層状複水酸化物と共にステップ(2)において添加されることを特徴とする、請求項18から21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項24】
キーゼルグール、パーライト、またはその混合物が、さらなる成分としてステップ(4)の前に添加されることを特徴とする、請求項18から21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項25】
キーゼルグール、パーライト、またはその混合物が、少なくとも1つの無機層状複水酸化物と共に、さらなる成分としてステップ(2)において添加されることを特徴とする、請求項18から21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項26】
請求項1から17のいずれか1項に記載の少なくとも1つのデプスフィルター層を含有する濾過装置。
【請求項27】
請求項1から17のいずれか1項に記載の少なくとも1つのデプスフィルター層を用いて、液体メディウムにおいて少なくとも1つの標的生成物から少なくとも1つの汚染物質を分離するための方法であって、
(a)少なくとも1つの汚染物質および少なくとも1つの標的生成物を含有する液体メディウムと、少なくとも1つのデプスフィルター層とを接触させるステップ、
(b)少なくとも1つのデプスフィルター層によって少なくとも1つの汚染物質を保持するステップ、ならびに
(c)少なくとも1つの標的生成物および液体メディウムを含有する濾液を得るステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項28】
ステップ(c)の後に、濾液における少なくとも1つの標的生成物の含有量を増大させるために、液体メディウムおよび/またはすすぎメディウムでデプスフィルター層を洗浄する、さらなるステップ(d)が続くことを特徴とする、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
少なくとも1つの汚染物質が、核酸、細胞タンパク質、ウイルス、内毒素、またはその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項27または28に記載の方法。
【請求項30】
少なくとも1つの標的生成物がタンパク質であることを特徴とする、請求項27から29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項31】
タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素、ペプチド、またはその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
汚染物質を除去するための、請求項1から17のいずれか1項に記載のデプスフィルター層の使用。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【公表番号】特表2011−530405(P2011−530405A)
【公表日】平成23年12月22日(2011.12.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−522429(P2011−522429)
【出願日】平成21年8月11日(2009.8.11)
【国際出願番号】PCT/EP2009/005825
【国際公開番号】WO2010/017964
【国際公開日】平成22年2月18日(2010.2.18)
【出願人】(511034561)ザルトリウス ステディム ビオテック ゲーエムベーハー (1)
【Fターム(参考)】