本発明は、巨核球及び血小板を生成する方法を提供する。種々の実施形態では、方法は、巨核球及び血小板へと分化させるために、ヒト胚性幹細胞由来の血管芽細胞を無血清及び無間質条件下で使用することを伴う。この系では、ｈＥＳＣは、胚様体形成及び血管芽細胞分化を介して巨核球に向けられる。血小板輸血を必要とする対象体を治療する方法が更に提供される。本発明の他の実施形態は、血小板を生成する方法を提供し、その方法は：巨核球（ＭＫ）を提供すること；およびＭＫを培養して血小板に分化させることを含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的巨核球および血小板の作製、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるすべての刊行物は、個々の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ各々明確に示されている場合と同程度にて、参照により本明細書に組み込まれる。以下の記述は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。それは、本明細書で提供されるいずれの情報についても、それが請求される本発明の先行技術であるかもしくはそれに関連するものであること、または明確にもしくは暗に参照されるいずれの刊行物についても、それが先行技術であること、を承認するものではない。
【０００３】
血管損傷が起こると、血小板は、損傷した血管に迅速に接着し、血栓の形成をもたらす複雑な事象のカスケードを引き起こす。ここ数十年の間、血小板輸血に対する需要は増加し続けている^５１（非特許文献１）。血小板を保存できるのはわずかに１週間未満であり、このことが、ドナーに依存するプログラムを継続的に困難なものとしている。血小板の供給が不足すると、特に複数の輸血を必要とする患者において、命にかかわる可能性のある結果となり得る。繰り返し輸血を行うこともまた、免疫媒介宿主反応に繋がる抵抗性応答を引き起こし得るものであり、費用のかかる患者適合が必要となり得る^{５２；５３}（非特許文献２；３）。患者に適合した血小板を生体外にて生成することができれば、このような臨床シナリオにおいて大きな利点が提供されることになる。
【０００４】
血小板の供給が限られることは、特殊な／稀な血液型を有する輸血依存患者、特に、同種免疫された患者、および癌または白血病の患者で、これらで多く見られる血小板同種免疫を発生させた患者において、命にかかわる可能性のある結果となり得る。輸血されたヒト血小板の半減期は４〜５日間であるため、臨床上、血小板の輸血を頻繁に行う必要がある。さらに、献血プログラムからの血小板は、種々の病原体による汚染のリスクが常に存在する。血小板は凍結保存することができないため、血小板を生体外で生成することができれば、臨床セッティングにおける血小板交換療法にとって大きな進歩となる。ここ１０年以上にわたって、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、または末梢血（ＰＢ）からのヒト造血幹細胞（ＨＳＣ、ＣＤ３４＋）が、巨核球（ＭＫ）および血小板の生成について研究されてきた。サイトカイン、成長因子、および／または間質フィーダー細胞と組み合わせることにより、機能的血小板のＨＳＣからの作製は大きな成功を収めてきた^１；２（非特許文献４；５）．しかし、それでもＨＳＣはドナーからのものであり、現行の培養条件下での増殖能は限られており、このことは、大規模作製および将来的な臨床適用を妨げる可能性が高い。
【０００５】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、生体外にて無限に繁殖および増殖することができ、ヒトの治療法に無尽蔵でドナーを必要としない細胞源を提供する可能性を有する。ｈＥＳＣの造血細胞への分化は、この十年の間に生体外にて広く研究されてきた。指向させたｈＥＳＣの血球分化は、生体外にて、２つの異なる種類の培養系により成功している。このうちの一方は、血清含有培地中でのｈＥＳＣと間質フィーダー細胞との共培養を採用している^３；４（非特許文献６；７）。２つ目の種類の手順では、血清有り／無しでのサイトカインの存在下における、超低細胞結合プレート（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓ）での懸濁培養条件を採用しており^５‐７（非特許文献８−１０）；そのエンドポイントはＥＢの形成である。造血前駆体、ならびに赤血球、骨髄、マクロファージ、巨核球、およびリンパ球系列を代表する成熟した機能的な後代が、上記の両方の分化ｈＥＳＣ培養系において識別された^{３‐６；８‐１４}（非特許文献６−９；１１−１７）。これまでの研究ではまた、血清の存在下にて間質細胞と共に共培養することにより、ｈＥＳＣから巨核球／血小板も生成された^{１５；１６}（非特許文献１８；１９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Reems JA, Pineault N, and Sun S. In vitro megakaryocyte production and platelet biogenesis: state of the art. Transfus. Med.Rev. 2010; 24: 33-43.
【非特許文献２】Chockalingam P, Sacher RA. Management of patients’ refractory to platelet transfusion. J.Infus.Nurs. 2007; 30 : 220-225.
【非特許文献３】Hod E, Schwartz J. Platelet transfusion refractoriness. Br.J.Haematol. 2008; 142: 348-360.
【非特許文献４】Guerriero R, Mattia G, Testa U et al. Stromal cell-derived factor 1alpha increases polyploidization of megakaryocytes generated by human hematopoietic progenitor cells. Blood 2001;97:2587-2595.
【非特許文献５】Matsunaga T, Tanaka I, Kobune M et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem Cells 2006;24:2877-2887.
【非特許文献６】Kaufman DS, Hanson ET, Lewis RL, Auerbach R, Thomson JA. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2001;98.:10716-10721.
【非特許文献７】Lu S-J, Li F, Vida L, Honig GR. CD34+CD38- hematopoietic precursors derived from human embryonic stem cells exhibit an embryonic gene expression pattern. Blood 2004;103:4134-4141.
【非特許文献８】Chadwick K, Wang L, Li L et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood 2003 2003;102:906-915.
【非特許文献９】Chang KH, Nelson AM, Cao H et al. Definitive-like erythroid cells derived from human embryonic stem cells coexpress high levels of embryonic and fetal globins with little or no adult globin. Blood 2006;108:1515-1523.
【非特許文献１０】Tian X, Morris JK, Linehan JL, Kaufman DS. Cytokine requirements differ for stroma and embryoid body-mediated hematopoiesis from human embryonic stem cells. Exp.Hematol. 2004;32:1000-1009.
【非特許文献１１】Vodyanik MA, Bork JA, Thomson JA, Slukvin II. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood 2005;105:617-626.
【非特許文献１２】Wang L, Menendez P, Shojaei F et al. Generation of hematopoietic repopulating cells from human embryonic stem cells independent of ectopic HOXB4 expression. J.Exp.Med. 2005;201:1603-1614.
【非特許文献１３】Woll PS, Martin CH, Miller JS, Kaufman DS. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. J.Immunol. 2005;175:5095- 5103.
【非特許文献１４】Zambidis ET, Peault B, Park TS, Bunz F, Civin CI. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood 2005;106:860-870.
【非特許文献１５】Qiu C, Hanson E, Olivier E et al. Differentiation of human embryonic stem cells into hematopoietic cells by coculture with human fetal liver cells recapitulates the globin switch that occurs early in development. Exp.Hematol. 2005;33:1450-1458.
【非特許文献１６】Zhan X, Dravid G, Ye Z et al. Functional antigen-presenting leucocytes derived from human embryonic stem cells in vitro. Lancet 2004;364:163-171.
【非特許文献１７】Ledran MH, Krassowska A, Armstrong L et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell 2008;3:85-98.
【非特許文献１８】Gaur M, Kamata T, Wang S et al. Megakaryocytes derived from human embryonic stem cells: a genetically tractable system to study megakaryocytopoiesis and integrin function. J.Thromb.Haemost. 2006;4:436-442.
【非特許文献１９】Takayama N, Nishikii H, Usui J et al. Generation of functional platelets from human embryonic stem cells in vitro via ES-sacs, VEGF-promoted structures that concentrate hematopoietic progenitors. Blood 2008;111:5298-5306.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｈＥＳＣ由来の血小板は、効率的および大規模に生成することができれば、輸血医療の目的のための可能性を有する。より重要なことには、血小板は、核を持たず、最小限の遺伝物質しか含有せず、輸血前に放射線照射することで、未分化ｈＥＳＣなどの不純物としての細胞のいずれをも効果的に除去することができる。従って、安全性は問題とならないはずである。しかし、上記の研究における巨核球／血小板の収率は低かった^{１５；１６}。ｈＥＳＣを、均質な巨核球集団、およびそれに続く機能的血小板へ、効率的および制御された形で分化させることが、本技術分野において依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下の実施形態およびその態様は、例示および説明のためであることが意図される組成物および方法と合わせて記載および説明され、範囲を限定するものではない。
【０００９】
本発明は、巨核球を生成する方法を提供し、その方法は：血管芽細胞を提供すること；および血管芽細胞を培養して巨核球（ＭＫ）に分化させることを含む。特定の実施形態では、血管芽細胞は、多能性幹細胞から生体外で分化させてよい。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）であってよい。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってよい。特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、ヒト由来の体細胞から誘導されてよい。特定の実施形態では、体細胞は、成人組織からのものであってよい。特定の実施形態では、体細胞は、胎児（仔）組織からのものであってよい。特定の実施形態では、多能性幹細胞の分化は、多能性幹細胞を解離させること、ならびに、ＢＭＰ‐４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で多能性幹細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を形成させることを含んでよい。特定の実施形態では、培地は、ＢＭＰ‐４およびＶＥＧＦを含んでよく、多能性幹細胞の培養は、約４８時間行ってＥＢを形成させてよい。特定の実施形態では、ＢＭＰ‐４の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＶＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌであってよい。特定の実施形態では、培地は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地であってよい。
【００１０】
特定の実施形態では、形成されたＥＢは、化学的および／または機械的に解離してよく、培地の少なくとも一部分を、ＢＭＰ‐４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で置き換えて、血管芽細胞を生成してよい。特定の実施形態では、ｂＦＧＦの濃度は、２０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＴＰＯは、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであってよく、Ｆｌｔ３リガンドは、５０ｎｇ／ｍｌであってよく、およびＳＣＦは、５０ｎｇ／ｍｌであってよい。特定の実施形態では、培地は、ＩＬ６、エストラジオール、ビタミンＢ３、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質、またはこれらの組み合わせをさらに含む。特定の実施形態では、解離されたＥＢは、芽細胞コロニー増殖培地中にて約３から４日間培養して、血管芽細胞を生成してよい。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、巨核球を生成する方法を提供し、その方法は：血管芽細胞を提供すること；および血管芽細胞を培養して巨核球（ＭＫ）に分化させることを含む。特定の実施形態では、血管芽細胞のＭＫへの分化は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地中にて、血管芽細胞を約２から８日間培養することを含んでよい。特定の実施形態では、ＴＰＯの濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＩＬ１１は、２０ｎｇ／ｍｌであってよい。特定の実施形態では、培地は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地であってよい。特定の実施形態では、この方法は、２から３日ごとに、培地の少なくとも一部分を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で置き換えて血管芽細胞をＭＫへ分化させることをさらに含んでよい。
【００１２】
本発明はまた、血小板を生成する方法も提供し、その方法は：巨核球（ＭＫ）を提供すること；およびＭＫを培養して血小板に分化させることを含む。特定の実施形態では、ＭＫは、血管芽細胞から分化させてよい。特定の実施形態では、血管芽細胞のＭＫへの分化は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地中にて、血管芽細胞を約２から８日間培養することを含んでよい。特定の実施形態では、ＴＰＯの濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＩＬ１１は、２０ｎｇ／ｍｌであってよい。特定の実施形態では、培地は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地であってよい。特定の実施形態では、この方法は、２から３日ごとに、培地の少なくとも一部分を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で置き換えて血管芽細胞をＭＫへ分化させることをさらに含んでよい。
【００１３】
特定の実施形態では、血管芽細胞は、多能性幹細胞から生体外で分化させてよい。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）であってよい。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってよい。特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、ヒト由来の体細胞から誘導されてよい。特定の実施形態では、体細胞は、成人組織からのものであってよい。特定の実施形態では、体細胞は、胎児（仔）組織からのものであってよい。特定の実施形態では、多能性幹細胞の分化は、多能性幹細胞を解離させること、ならびに、ＢＭＰ‐４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で多能性幹細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を形成させることを含んでよい。特定の実施形態では、培地は、ＢＭＰ‐４およびＶＥＧＦを含んでよく、多能性幹細胞の培養は、約４８時間行ってＥＢを形成させてよい。特定の実施形態では、ＢＭＰ‐４の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＶＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌであってよい。特定の実施形態では、培地は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地であってよい。
【００１４】
特定の実施形態では、形成されたＥＢは、化学的および／または機械的に解離してよく、培地の少なくとも一部分を、ＢＭＰ‐４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で置き換えて、血管芽細胞を生成してよい。特定の実施形態では、ｂＦＧＦの濃度は、２０ｎｇ／ｍｌであってよく、ＴＰＯは、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであってよく、Ｆｌｔ３リガンドは、５０ｎｇ／ｍｌであってよく、およびＳＣＦは、５０ｎｇ／ｍｌであってよい。特定の実施形態では、培地は、ＩＬ６、エストラジオール、ビタミンＢ３、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質、またはこれらの組み合わせをさらに含んでよい。特定の実施形態では、解離されたＥＢは、芽細胞コロニー増殖培地中にて約３から４日間培養して、血管芽細胞を生成してよい。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、血小板を生成する方法を提供し、その方法は：巨核球（ＭＫ）を提供すること；およびＭＫを培養して血小板に分化させることを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、ＭＫを再懸濁させ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地中にて少なくとも４日間培養して、血小板へ分化させてよい。特定の実施形態では、ＴＰＯの濃度は、１００ｎｇ／ｍｌであってよく、ＳＣＦは、５０ｎｇ／ｍｌであってよく、ヘパリンナトリウムは、２５ユニット／ｍｌであってよく、ＩＬ１１は、２０ｎｇ／ｍｌであってよい。特定の実施形態では、この方法は、ＭＫを少なくとも４日間培養した後に、ＧＭ６００１またはＩＬ３を添加することをさらに含んでよい。特定の実施形態では、この方法は、少なくとも２日間ごとに、培地の少なくとも一部分を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で置き換えることをさらに含んでよい。特定の実施形態では、培地は、ＩＭＤＭ培地であってよい。
【００１７】
特定の実施形態では、ＭＫは、解離し、ならびにＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地中、有糸分裂停止させたフィーダー細胞層上にて少なくとも４日間培養して血小板へ分化させてよい。特定の実施形態では、フィーダー細胞層は、ＯＰ９細胞を含んでいてよい。特定の実施形態では、フィーダー細胞層は、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞を含んでいてよい。特定の実施形態では、この方法は、ＭＫを少なくとも４日間培養した後に、ＧＭ６００１またはＩＬ３を添加することをさらに含んでよい。特定の実施形態では、この方法は、少なくとも２日間ごとに、培地の少なくとも一部分を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、およびこれらの組み合わせから成る群より選択される成長因子またはサイトカインを含む培地で置き換えることをさらに含んでよい。特定の実施形態では、培地は、ＩＭＤＭ培地であってよい。
【００１８】
本発明はまた、本発明の方法のいずれかによって生成された大量の巨核球も提供する。
【００１９】
本発明はまた、本発明の方法のいずれかによって生成された大量の血小板も提供する。特定の実施形態では、血小板は、対象に血小板を投与した際の対象におけるＨＬＡ同種免疫原性応答に寄与しない溶液中に保存することができる。特定の実施形態では、血小板は、アピラーゼおよび／またはＥＤＴＡの存在下では活性化することができない。
【００２０】
本発明はまた、細胞分化の修飾因子のためのスクリーニング方法も提供し、その方法は：大量の巨核球（ＭＫ）を提供すること；ＭＫを試験化合物と接触させること；ＭＫと試験化合物との接触からの機能的効果が存在するかまたは存在しないかを判定することを含み；ここで、機能的効果が存在する場合、それは試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成、血小板新生、および／または造血因子である可能性があることを示しており、機能的効果が存在しない場合、それは試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成、血小板新生、および／または造血因子ではない可能性があることを示している。本発明はまた、血小板輸血を必要とする対象を治療する方法も提供し、その方法は：大量の血管芽細胞を提供すること；血管芽細胞を培養して巨核球（ＭＫ）へ分化させること；ＭＫを生体外で培養して血小板へ分化させること；生体外で分化させた大量の血小板を提供すること；および血小板輸血を必要とする対象へ、生体外で分化させたその量の血小板を投与し、それによって血小板輸血を必要とする対象を治療することを含む。特定の実施形態では、生体外で分化させた血小板は、対象に適合させて、免疫媒介宿主反応を低減または除去することができる。
【００２１】
本発明のその他の特徴および利点は、本発明の実施形態の種々の特徴を例として説明する添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００２２】
代表的な実施形態を、参照図面で示す。本明細書で開示される実施形態および図面は、限定のためではなく、説明のためのものとして見なされるべきであることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】図１は、ｈＥＳＣ由来の芽細胞が、本発明の種々の実施形態に従って巨核球前駆細胞を生成することを示す。Ａ．は、血清および間質のない条件下にてｈＥＳＣから巨核球を生成するフローチャートである。前述のように、ｈＥＳＣは、懸濁培養し、ＥＢを発生させた。ＥＢは、第４日目に回収し、トリプシンで単一細胞へ解離し、その後メチルセルロースを主体とする半固体血管芽細胞培養を行った。芽細胞は、第６日目から第８日目の培養物から回収してＭＫ培養に用い、そしてこれは、続く４から６日間の間に懸濁培養にて成熟巨核球を生成した。Ｂ．は、第６日目の芽細胞コロニー（位相差、左）および芽細胞（ギムザ染色、右）の代表的なイメージである。Ｃ．は、ＨＵＥＳ３およびＨ１ ｈＥＳＣ由来ＢＣについてのＣＦＵ‐ＭＫコロニーアッセイを示す棒グラフである。Ｄ．は、Ｈ１ ｈＥＳＣ由来ＢＣから生成されたＣＤ４１染色ＣＦＵ‐ＭＫコロニーを示す顕微鏡イメージである。挿入図は、巨核球からの細胞プロセスを示す。Ｅ．は、３種類の異なるｈＥＳＣ系統：ＨＵＥＳ３、ＭＡ０１、およびＭＡ０９からの芽細胞培養物におけるＣＤ４１ａ＋細胞のパーセントの違いを示すＦＡＣＳ分析である。
【図１−２】図１は、ｈＥＳＣ由来の芽細胞が、本発明の種々の実施形態に従って巨核球前駆細胞を生成することを示す。Ａ．は、血清および間質のない条件下にてｈＥＳＣから巨核球を生成するフローチャートである。前述のように、ｈＥＳＣは、懸濁培養し、ＥＢを発生させた。ＥＢは、第４日目に回収し、トリプシンで単一細胞へ解離し、その後メチルセルロースを主体とする半固体血管芽細胞培養を行った。芽細胞は、第６日目から第８日目の培養物から回収してＭＫ培養に用い、そしてこれは、続く４から６日間の間に懸濁培養にて成熟巨核球を生成した。Ｂ．は、第６日目の芽細胞コロニー（位相差、左）および芽細胞（ギムザ染色、右）の代表的なイメージである。Ｃ．は、ＨＵＥＳ３およびＨ１ ｈＥＳＣ由来ＢＣについてのＣＦＵ‐ＭＫコロニーアッセイを示す棒グラフである。Ｄ．は、Ｈ１ ｈＥＳＣ由来ＢＣから生成されたＣＤ４１染色ＣＦＵ‐ＭＫコロニーを示す顕微鏡イメージである。挿入図は、巨核球からの細胞プロセスを示す。Ｅ．は、３種類の異なるｈＥＳＣ系統：ＨＵＥＳ３、ＭＡ０１、およびＭＡ０９からの芽細胞培養物におけるＣＤ４１ａ＋細胞のパーセントの違いを示すＦＡＣＳ分析である。
【図２−１】図２は、芽細胞培養物からの二分化能前駆細胞が、本発明の種々の実施形態に従って赤血球および巨核球系列の両方を発生させることを示す。Ａ．は、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａマーカーの発現で定められる別々の集団（左）およびソートされたＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞（右）を示す、第６日目のＨＵＥＳ３由来芽細胞のＦＡＣＳ分析である。Ｂ．は、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ−またはＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞のいずれか由来のＣＦＵ‐ＭＫコロニーのイメージである。棒グラフは、ＣＦＵ‐ＭＫコロニーアッセイの定量化を示す。Ｃ．は、ＣＤ４１ａ−ＣＤ２３５ａ＋またはＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞のいずれか由来のＣＦＵ‐Ｅコロニーのイメージである。棒グラフは、ＣＦＵ‐Ｅコロニーアッセイの定量化を示す。
【図２−２】図２は、芽細胞培養物からの二分化能前駆細胞が、本発明の種々の実施形態に従って赤血球および巨核球系列の両方を発生させることを示す。Ａ．は、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａマーカーの発現で定められる別々の集団（左）およびソートされたＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞（右）を示す、第６日目のＨＵＥＳ３由来芽細胞のＦＡＣＳ分析である。Ｂ．は、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ−またはＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞のいずれか由来のＣＦＵ‐ＭＫコロニーのイメージである。棒グラフは、ＣＦＵ‐ＭＫコロニーアッセイの定量化を示す。Ｃ．は、ＣＤ４１ａ−ＣＤ２３５ａ＋またはＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞のいずれか由来のＣＦＵ‐Ｅコロニーのイメージである。棒グラフは、ＣＦＵ‐Ｅコロニーアッセイの定量化を示す。
【図３】図３は、本発明の種々の実施形態に従う無間質条件下でのｈＥＳＣ由来芽細胞からの指向された巨核球分化を示す。Ａ．は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびその他のサイトカイン／因子の巨核球分化および増殖に対する効果である。Ｂ．は、６日間培養の間のＣＤ４１ａ＋巨核球の増殖を示す経時実験である。Ｃ．は、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ、およびＣＤ２３５ａ系列マーカーの発現レベルの変化を示す、第６日目の芽細胞培養物および第４日目のＭＫ培養物のＦＡＣＳ分析である。ＭＫ培養物中にて、ＣＤ２３５ａ＋細胞が消滅した一方、生存細胞の９０％超がＣＤ４１ａ＋となった。第６日目の芽細胞培養物中では、少数のＣＤ４１ａ＋細胞がＣＤ４２ｂに対して陽性であった（左下パネル）。ＭＫ培養物中のＣＤ４１ａ＋細胞の大部分も、第４日目までに高レベルのＣＤ４２ｂを発現し、このことは巨核球の成熟を示している（右下パネル）。
【図４−１】図４は、本発明の種々の実施形態に従って生体外で生成された巨核球の特性評価を示す。Ａ．は、６日間のＭＫ培養の間における細胞サイズの増加（上パネル）および細胞サイズ分布の変化（下パネル）を示す経時実験である。細胞サイズ（直径）は、ギムザ染色したサイトスピンスライドを用いて測定した。Ｂ．は、倍数体巨核球を示すギムザ染色イメージである。Ｃ．は、第６日目のＭＫ培養物からのＣＤ４１ａ＋巨核球内における、ＣＤ４２ｂおよびＣＤ４２ａ巨核球／血小板特異的糖タンパク質の両方の発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。Ｄ．は、第４日目のＭＫ培養物からの倍数体巨核球における、ＣＤ４１染色およびｖＷＦ染色を示す免疫蛍光イメージである。Ｅ．は、生体外ＭＫ生成の種々のステージにおける、赤血球新生／巨核球形成を制御する転写因子の発現レベルを示すＲＴ‐ＰＣＲの結果である。全ＲＮＡを、ＥＳ、第４日目のＥＢ、ＢＣ（第６日目から第８日目）、および第４日目のＭＫから、ＲＮＡ ｅａｓｙ ｍｉｎｉ‐ｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて単離した。２ｕｇの全ＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ ｋｉｔ（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））によるｃＤＮＡ合成に用いた。各サンプルについて、投入ｃＤＮＡの量に対するコントロールとしてＧＡＰＤＨ ＲＴ‐ＰＣＲを行った。Ｆ．は、第４日目のＭＫ培養物において胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）形成巨核球を示す代表的な位相差イメージである。
【図４−２】図４は、本発明の種々の実施形態に従って生体外で生成された巨核球の特性評価を示す。Ａ．は、６日間のＭＫ培養の間における細胞サイズの増加（上パネル）および細胞サイズ分布の変化（下パネル）を示す経時実験である。細胞サイズ（直径）は、ギムザ染色したサイトスピンスライドを用いて測定した。Ｂ．は、倍数体巨核球を示すギムザ染色イメージである。Ｃ．は、第６日目のＭＫ培養物からのＣＤ４１ａ＋巨核球内における、ＣＤ４２ｂおよびＣＤ４２ａ巨核球／血小板特異的糖タンパク質の両方の発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。Ｄ．は、第４日目のＭＫ培養物からの倍数体巨核球における、ＣＤ４１染色およびｖＷＦ染色を示す免疫蛍光イメージである。Ｅ．は、生体外ＭＫ生成の種々のステージにおける、赤血球新生／巨核球形成を制御する転写因子の発現レベルを示すＲＴ‐ＰＣＲの結果である。全ＲＮＡを、ＥＳ、第４日目のＥＢ、ＢＣ（第６日目から第８日目）、および第４日目のＭＫから、ＲＮＡ ｅａｓｙ ｍｉｎｉ‐ｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて単離した。２ｕｇの全ＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ ｋｉｔ（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））によるｃＤＮＡ合成に用いた。各サンプルについて、投入ｃＤＮＡの量に対するコントロールとしてＧＡＰＤＨ ＲＴ‐ＰＣＲを行った。Ｆ．は、第４日目のＭＫ培養物において胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）形成巨核球を示す代表的な位相差イメージである。
【図５】図５は、本発明の種々の実施形態に従う、ｈｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの血管芽細胞／芽細胞および造血細胞への分化を示す。Ａ．では、ｈＥＳＣ（ｉ、×１００）から得られた血管芽細胞／芽細胞（ｉｉ、×４００）を、ＣＤ７１（×１０００）、ＣＸＣＲ４（×１０００）、およびＴｐｏ受容体（×１０００）で染色した。Ｂ．では、ｈｉＰＳＣ（ｉ、×１００）から得られた血管芽細胞／芽細胞（ｉｉ、×４００）を、ＣＤ７１（×１０００）、ＣＸＣＲ４（×１０００）、およびＴｐｏ受容体（×１０００）で染色した。Ｃ．は、再播種の１４日後におけるｈｉＰＳＣ‐芽細胞から発生した複数種類の造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）であり、ＣＦＵ‐Ｅ、ＣＦＵ‐ＧＭ、およびＣＦＵ‐Ｍｋについては×１００、ＣＦＵ‐Ｇについては×４０である。（Ｄ）では、ｈｉＰＳＣから得られた血管芽細胞／芽細胞（ｉ、×２００）は、内皮細胞へ分化し、；ｈｉＰＳＣ由来内皮細胞は、マトリゲル上で血管様ネットワークを形成し（ｉｉ、×４０）、ｖＷＦ（赤色）およびＣＤ３１（ｉｉｉ、緑色、×４００）、さらにはＬＤＬ取り込み能（ｉｖ、赤色 ×４００）を有するＶＥ‐カドヘリン（ｉｖ、緑色）を発現した。
【図６】図６は、本発明の種々の実施形態に従う、機能的ＥＳ由来血小板（ＥＳ‐ＰＬＴ）の生成を示す。Ａ．は、ＯＰ９共培養から得られたＥＳ‐ＰＬＴの前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）特性を示すドットプロットである（左上）。ヒト血液の血小板に基づいてゲーティングを設定した。右上パネルは、ＥＳ‐ＰＬＴでのＣＤ４１ａ（ｙ軸）およびＣＤ４２ｂ（ｘ軸）の発現を示す。休止ＥＳ‐ＰＬＴ（中央パネル）と比較すると、トロンビン（１ｕ／ｍｌ）処理ＥＳ‐ＰＬＴは、ＰＡＣ１結合の増加を示した。平均蛍光強度は、トロンビン処理ＥＳ‐ＰＬＴにておよそ２倍に増加した。Ｂ．は、臨床グレードｈＥＳＣであるＭＡ０１およびＭＡ０９から得られたＥＳ‐ＰＬＴも、トロンビン処理に応答してＰＡＣ１結合を示している。
【図７−１】図７は、本発明の種々の実施形態に従って、ＥＳ‐ＰＬＴが固定化フィブリノゲンと結合すること、および固定化フィブリノゲンと結合したＥＳ‐ＰＬＴが微小凝集体を形成することを示す。Ａ．は、血液血小板（左パネル）およびＥＳ‐ＰＬＴ（右パネル）が、フィブリノゲンでコーティングしたスライドグラス上にて伸展可能であることを示す伸展アッセイ（Spreading assay）である。ＲＧＤＳの添加によって伸展が阻止されることから、このプロセスは、インテグリン受容体シグナル伝達に依存している。ＡＤＰ（＋ＡＤＰ）またはトロンビン（＋Ｔ）の添加により、フィブリノゲン単独（Ｃｏｎ）と比較して、フィブリノゲン上での伸展プロセスが増強される。インテグリンに依存するＦ‐アクチン線維の再構築および糸状仮足の形成が、ＣＤ４１ａ（緑色）およびファロイジン（Ｆ‐アクチン、赤色）の蛍光染色によって示される。Ｂ．は、微小凝集体形成アッセイである。同数のＰＫＨ６７（緑色）標識血液血小板（上パネル）またはＥＳ‐ＰＬＴ（下パネル）を、トロンビン（０．５ｕ／ｍｌ）の刺激下、非標識血液血小板と混合して凝集体を形成させた。位相差および蛍光イメージより、ヒト血液血小板コントロールと同等である標識ＥＳ‐ＰＬＴの微小凝集体への関与が示される。Ｃ．は、ＥＳ‐ＰＬＴ中でのＨＬＡの発現を示すＦＡＣＳ分析のヒストグラムである。血液血小板をコントロールとして用いた（左）。
【図７−２】図７は、本発明の種々の実施形態に従って、ＥＳ‐ＰＬＴが固定化フィブリノゲンと結合すること、および固定化フィブリノゲンと結合したＥＳ‐ＰＬＴが微小凝集体を形成することを示す。Ａ．は、血液血小板（左パネル）およびＥＳ‐ＰＬＴ（右パネル）が、フィブリノゲンでコーティングしたスライドグラス上にて伸展可能であることを示す伸展アッセイ（Spreading assay）である。ＲＧＤＳの添加によって伸展が阻止されることから、このプロセスは、インテグリン受容体シグナル伝達に依存している。ＡＤＰ（＋ＡＤＰ）またはトロンビン（＋Ｔ）の添加により、フィブリノゲン単独（Ｃｏｎ）と比較して、フィブリノゲン上での伸展プロセスが増強される。インテグリンに依存するＦ‐アクチン線維の再構築および糸状仮足の形成が、ＣＤ４１ａ（緑色）およびファロイジン（Ｆ‐アクチン、赤色）の蛍光染色によって示される。Ｂ．は、微小凝集体形成アッセイである。同数のＰＫＨ６７（緑色）標識血液血小板（上パネル）またはＥＳ‐ＰＬＴ（下パネル）を、トロンビン（０．５ｕ／ｍｌ）の刺激下、非標識血液血小板と混合して凝集体を形成させた。位相差および蛍光イメージより、ヒト血液血小板コントロールと同等である標識ＥＳ‐ＰＬＴの微小凝集体への関与が示される。Ｃ．は、ＥＳ‐ＰＬＴ中でのＨＬＡの発現を示すＦＡＣＳ分析のヒストグラムである。血液血小板をコントロールとして用いた（左）。
【図８−１】図８は、本発明の種々の実施形態に従ってｈＥＳＣから生成された巨核球および血小板の特性評価を示す。Ａ．は、第４日目のＭＫ培養物からの、ＣＤ４１ａおよび４２ｂ抗原の発現についての細胞のＦＡＣＳ分析である。Ｂ．は、倍数体巨核球を示すギムザ染色イメージである（１００×）。Ｃ．は、第４日目の培養物からの倍数体ＭＫにおけるＣＤ４１、ｖＷＦ、およびＤＡＰＩ染色を示す免疫蛍光イメージである（上パネル ４０×、下パネル １００×）。Ｄ．は、ＤＮＡ含有量についてのＭＫのＦＡＣＳ分析である。Ｅ．は、第４日目のＭＫ培養物において胞体突起形成巨核球を示す代表的な位相差イメージである（４０×）。Ｆ．は、ｈＥＳＣから得られた血小板についての前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ＳＳＣ）特性（左パネル）、ならびにＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現（右パネル）を示すＦＡＣＳドットプロットである。ヒト血液の血小板に基づいてゲーティングを設定した。Ｇ．は、休止（左パネル）およびトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）処理ｈＥＳＣ‐血小板（右パネル）に対するＰＡＣ１結合アッセイである。
【図８−２】図８は、本発明の種々の実施形態に従ってｈＥＳＣから生成された巨核球および血小板の特性評価を示す。Ａ．は、第４日目のＭＫ培養物からの、ＣＤ４１ａおよび４２ｂ抗原の発現についての細胞のＦＡＣＳ分析である。Ｂ．は、倍数体巨核球を示すギムザ染色イメージである（１００×）。Ｃ．は、第４日目の培養物からの倍数体ＭＫにおけるＣＤ４１、ｖＷＦ、およびＤＡＰＩ染色を示す免疫蛍光イメージである（上パネル ４０×、下パネル １００×）。Ｄ．は、ＤＮＡ含有量についてのＭＫのＦＡＣＳ分析である。Ｅ．は、第４日目のＭＫ培養物において胞体突起形成巨核球を示す代表的な位相差イメージである（４０×）。Ｆ．は、ｈＥＳＣから得られた血小板についての前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ＳＳＣ）特性（左パネル）、ならびにＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現（右パネル）を示すＦＡＣＳドットプロットである。ヒト血液の血小板に基づいてゲーティングを設定した。Ｇ．は、休止（左パネル）およびトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）処理ｈＥＳＣ‐血小板（右パネル）に対するＰＡＣ１結合アッセイである。
【図８−３】図８は、本発明の種々の実施形態に従ってｈＥＳＣから生成された巨核球および血小板の特性評価を示す。Ａ．は、第４日目のＭＫ培養物からの、ＣＤ４１ａおよび４２ｂ抗原の発現についての細胞のＦＡＣＳ分析である。Ｂ．は、倍数体巨核球を示すギムザ染色イメージである（１００×）。Ｃ．は、第４日目の培養物からの倍数体ＭＫにおけるＣＤ４１、ｖＷＦ、およびＤＡＰＩ染色を示す免疫蛍光イメージである（上パネル ４０×、下パネル １００×）。Ｄ．は、ＤＮＡ含有量についてのＭＫのＦＡＣＳ分析である。Ｅ．は、第４日目のＭＫ培養物において胞体突起形成巨核球を示す代表的な位相差イメージである（４０×）。Ｆ．は、ｈＥＳＣから得られた血小板についての前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ＳＳＣ）特性（左パネル）、ならびにＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現（右パネル）を示すＦＡＣＳドットプロットである。ヒト血液の血小板に基づいてゲーティングを設定した。Ｇ．は、休止（左パネル）およびトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）処理ｈＥＳＣ‐血小板（右パネル）に対するＰＡＣ１結合アッセイである。
【図９−１】図９は、本発明の種々の実施形態に従ってｈＥＳＣから生成された血小板の機能的特性評価を示す。ＡおよびＢ．では、マイクロタイターチャンバースライドを１００μｇ／ｍＬのフィブリノゲンでコーティングした。ヒト血液血小板（Ａ）およびｈＥＳＣ‐血小板（Ｂ）を９０分間伸展させた。接着血小板を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ファロイジン、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４１ａ抗体、およびＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で撮影した（１００×）。血小板はまた、示したように、ＲＧＤＳ（１ｍＭ）、ＡＤＰ（２０μＭ）、またはトロンビン（Ｔ、１Ｕ／ｍｌ）での処理も行った。ＣおよびＤ．は、微小凝集体形成アッセイである。同数のＰＫＨ６７（緑色）標識ヒト血液血小板（Ｃ）またはｈＥＳＣ‐血小板（Ｄ）を、トロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）の刺激下、非標識血液血小板と混合して凝集体を形成させた。位相差（左パネル）および蛍光イメージ（中央パネル）は、これを合わせることにより（右パネル）、標識血液血小板（Ｃ、右パネル）およびｈＥＳＣ血小板（Ｄ、右パネル）の微小凝集体への関与を示している。ＥおよびＦ．は、ｈＥＳＣ‐血小板（１．５×１０^７／ｍｌ、Ｅ）および血液血小板（１．５×１０^７／ｍｌ、Ｆ）を、血小板欠乏血漿中に再懸濁させた。トロンビン（２Ｕ／ｍｌ）およびＣａＣｌ_２（１０ｍＭ）を血小板懸濁液に添加し、クロット形成／退縮を誘発した（ＥおよびＦ、左パネル）。血漿のみを用いてネガティブコントロールとした。クロットの凍結切片を、抗ヒトＣＤ４１および抗ヒトフィブリン抗体で免疫染色し、続いて、それぞれ、二次ローダミン結合抗ウサギＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＭ抗体で免疫染色した。蛍光顕微鏡下にてイメージを撮影した（２０×）。
【図９−２】図９は、本発明の種々の実施形態に従ってｈＥＳＣから生成された血小板の機能的特性評価を示す。ＡおよびＢ．では、マイクロタイターチャンバースライドを１００μｇ／ｍＬのフィブリノゲンでコーティングした。ヒト血液血小板（Ａ）およびｈＥＳＣ‐血小板（Ｂ）を９０分間伸展させた。接着血小板を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ファロイジン、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４１ａ抗体、およびＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で撮影した（１００×）。血小板はまた、示したように、ＲＧＤＳ（１ｍＭ）、ＡＤＰ（２０μＭ）、またはトロンビン（Ｔ、１Ｕ／ｍｌ）での処理も行った。ＣおよびＤ．は、微小凝集体形成アッセイである。同数のＰＫＨ６７（緑色）標識ヒト血液血小板（Ｃ）またはｈＥＳＣ‐血小板（Ｄ）を、トロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）の刺激下、非標識血液血小板と混合して凝集体を形成させた。位相差（左パネル）および蛍光イメージ（中央パネル）は、これを合わせることにより（右パネル）、標識血液血小板（Ｃ、右パネル）およびｈＥＳＣ血小板（Ｄ、右パネル）の微小凝集体への関与を示している。ＥおよびＦ．は、ｈＥＳＣ‐血小板（１．５×１０^７／ｍｌ、Ｅ）および血液血小板（１．５×１０^７／ｍｌ、Ｆ）を、血小板欠乏血漿中に再懸濁させた。トロンビン（２Ｕ／ｍｌ）およびＣａＣｌ_２（１０ｍＭ）を血小板懸濁液に添加し、クロット形成／退縮を誘発した（ＥおよびＦ、左パネル）。血漿のみを用いてネガティブコントロールとした。クロットの凍結切片を、抗ヒトＣＤ４１および抗ヒトフィブリン抗体で免疫染色し、続いて、それぞれ、二次ローダミン結合抗ウサギＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＭ抗体で免疫染色した。蛍光顕微鏡下にてイメージを撮影した（２０×）。
【図９−３】図９は、本発明の種々の実施形態に従ってｈＥＳＣから生成された血小板の機能的特性評価を示す。ＡおよびＢ．では、マイクロタイターチャンバースライドを１００μｇ／ｍＬのフィブリノゲンでコーティングした。ヒト血液血小板（Ａ）およびｈＥＳＣ‐血小板（Ｂ）を９０分間伸展させた。接着血小板を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ファロイジン、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４１ａ抗体、およびＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で撮影した（１００×）。血小板はまた、示したように、ＲＧＤＳ（１ｍＭ）、ＡＤＰ（２０μＭ）、またはトロンビン（Ｔ、１Ｕ／ｍｌ）での処理も行った。ＣおよびＤ．は、微小凝集体形成アッセイである。同数のＰＫＨ６７（緑色）標識ヒト血液血小板（Ｃ）またはｈＥＳＣ‐血小板（Ｄ）を、トロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）の刺激下、非標識血液血小板と混合して凝集体を形成させた。位相差（左パネル）および蛍光イメージ（中央パネル）は、これを合わせることにより（右パネル）、標識血液血小板（Ｃ、右パネル）およびｈＥＳＣ血小板（Ｄ、右パネル）の微小凝集体への関与を示している。ＥおよびＦ．は、ｈＥＳＣ‐血小板（１．５×１０^７／ｍｌ、Ｅ）および血液血小板（１．５×１０^７／ｍｌ、Ｆ）を、血小板欠乏血漿中に再懸濁させた。トロンビン（２Ｕ／ｍｌ）およびＣａＣｌ_２（１０ｍＭ）を血小板懸濁液に添加し、クロット形成／退縮を誘発した（ＥおよびＦ、左パネル）。血漿のみを用いてネガティブコントロールとした。クロットの凍結切片を、抗ヒトＣＤ４１および抗ヒトフィブリン抗体で免疫染色し、続いて、それぞれ、二次ローダミン結合抗ウサギＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＭ抗体で免疫染色した。蛍光顕微鏡下にてイメージを撮影した（２０×）。
【図１０−１】図１０は、本発明の種々の実施形態に従う、生体マウスのレーザー誘発細動脈損傷部位で発生するマウス血小板血栓へのｈＥＳＣ‐ＰＬＴの組み込みを示す。カルセインＡＭ標識ヒト血液血小板またはＥＳＣ由来血小板、５０〜１００μｌ（５〜１０×１０^５血小板）を、レーザー誘発血管損傷の直後に大腿動脈カニューレを通して注入した。発生するマウス血小板血栓を、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６４９標識抗ＣＤ４２（０．０５μｇ／ｇ体重）の注入によってモニタリングした。２〜３つの血栓の生成後、標識血小板を２００μｌ中２×１０^６のヒト血小板に対して２０μｇのＲｅｏＰｒｏで前処理し、同一のマウスの血管損傷後に注入した。さらに２〜３つの血栓が生成した。データは、血管損傷後３分間に収集した。Ａ．は、血管損傷後の３つの時間点（０、１／２Ｔｍａｘ、およびＴｍａｘ）での代表的な蛍光イメージを示す。白色四角内の領域の拡大イメージを下部に示す。スケールバー＝１０μｍ。ＢおよびＣ．では、微小血管へ循環する標識ヒト血小板の数（Ｂ）および血管損傷部位で発生するマウス血小板血栓中に組み込まれた数（Ｃ）を、血管損傷後３分間にわたってカウントした。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで表す（ｎ＝５〜８血栓、３体のマウス）。スチューデントＴ検定、コントロールに対して^＊Ｐ＜０．０５および^＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１０−２】図１０は、本発明の種々の実施形態に従う、生体マウスのレーザー誘発細動脈損傷部位で発生するマウス血小板血栓へのｈＥＳＣ‐ＰＬＴの組み込みを示す。カルセインＡＭ標識ヒト血液血小板またはＥＳＣ由来血小板、５０〜１００μｌ（５〜１０×１０^５血小板）を、レーザー誘発血管損傷の直後に大腿動脈カニューレを通して注入した。発生するマウス血小板血栓を、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６４９標識抗ＣＤ４２（０．０５μｇ／ｇ体重）の注入によってモニタリングした。２〜３つの血栓の生成後、標識血小板を２００μｌ中２×１０^６のヒト血小板に対して２０μｇのＲｅｏＰｒｏで前処理し、同一のマウスの血管損傷後に注入した。さらに２〜３つの血栓が生成した。データは、血管損傷後３分間に収集した。Ａ．は、血管損傷後の３つの時間点（０、１／２Ｔｍａｘ、およびＴｍａｘ）での代表的な蛍光イメージを示す。白色四角内の領域の拡大イメージを下部に示す。スケールバー＝１０μｍ。ＢおよびＣ．では、微小血管へ循環する標識ヒト血小板の数（Ｂ）および血管損傷部位で発生するマウス血小板血栓中に組み込まれた数（Ｃ）を、血管損傷後３分間にわたってカウントした。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで表す（ｎ＝５〜８血栓、３体のマウス）。スチューデントＴ検定、コントロールに対して^＊Ｐ＜０．０５および^＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１１】図１１は、本発明の種々の実施形態に従って、フィーダーおよび血清のない条件下で生成されるｈＥＳＣ‐血小板の伸展アッセイを示す。マイクロタイターチャンバースライドを１００μｇ／ｍＬのフィブリノゲン（上パネル）または３０μｇ／ｍＬのｖＷＦ（中央および下パネル）でコーティングした。ｈＥＳＣ‐血小板を９０分間伸展させた。接着血小板を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ファロイジン、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４１ａ抗体、およびＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で撮影した。
【図１２】図１２は、本発明の種々の実施形態に従う、血液血小板に対するＰＡＣ‐１結合アッセイを示す。血液血小板は、トロンビン処理（１Ｕ／ｍｌ）あり（右）またはなし（左）で処理し、次にＦＡＣＳ分析によってＰＡＣ‐１結合を実施した。
【図１３−１】図１３は、本発明の種々の実施形態に従って、異なるｈＥＳＣ系統から生成されたｈＥＳＣ‐血小板の特性評価を示す。Ａ．は、臨床グレードのＭＡ０１およびＭＡ０９ ｈＥＳＣ細胞から得られたｈＥＳＣ‐血小板でのＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現である。Ｂ．において、トロンビン処理（１Ｕ／ｍｌ）に応答して、ＭＡ０１およびＭＡ０９ ｈＥＳＣ由来血小板は、休止コントロール（上パネル）と比較してＰＡＣ‐１結合の増加を示している（下パネル）。Ｃ．では、ｈＥＳＣ‐血小板は、ＩｇＧアイソタイプコントロール染色と比較して、ＨＬＡ‐ＡＢＣの発現を示す。ＦＡＣＳ分析のヒストグラムは、ｈＥＳＣ‐血小板におけるＨＬＡ発現を示している。血液血小板をコントロールとして用いた（左）。
【図１３−２】図１３は、本発明の種々の実施形態に従って、異なるｈＥＳＣ系統から生成されたｈＥＳＣ‐血小板の特性評価を示す。Ａ．は、臨床グレードのＭＡ０１およびＭＡ０９ ｈＥＳＣ細胞から得られたｈＥＳＣ‐血小板でのＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現である。Ｂ．において、トロンビン処理（１Ｕ／ｍｌ）に応答して、ＭＡ０１およびＭＡ０９ ｈＥＳＣ由来血小板は、休止コントロール（上パネル）と比較してＰＡＣ‐１結合の増加を示している（下パネル）。Ｃ．では、ｈＥＳＣ‐血小板は、ＩｇＧアイソタイプコントロール染色と比較して、ＨＬＡ‐ＡＢＣの発現を示す。ＦＡＣＳ分析のヒストグラムは、ｈＥＳＣ‐血小板におけるＨＬＡ発現を示している。血液血小板をコントロールとして用いた（左）。
【図１３−３】図１３は、本発明の種々の実施形態に従って、異なるｈＥＳＣ系統から生成されたｈＥＳＣ‐血小板の特性評価を示す。Ａ．は、臨床グレードのＭＡ０１およびＭＡ０９ ｈＥＳＣ細胞から得られたｈＥＳＣ‐血小板でのＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現である。Ｂ．において、トロンビン処理（１Ｕ／ｍｌ）に応答して、ＭＡ０１およびＭＡ０９ ｈＥＳＣ由来血小板は、休止コントロール（上パネル）と比較してＰＡＣ‐１結合の増加を示している（下パネル）。Ｃ．では、ｈＥＳＣ‐血小板は、ＩｇＧアイソタイプコントロール染色と比較して、ＨＬＡ‐ＡＢＣの発現を示す。ＦＡＣＳ分析のヒストグラムは、ｈＥＳＣ‐血小板におけるＨＬＡ発現を示している。血液血小板をコントロールとして用いた（左）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全内容が完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。それ以外の定義がなされない限りにおいて、本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３^ｒｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２００１）；Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５^ｔｈ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２００１）；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ２００１）は、本出願に用いられる用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供するものである。
【００２５】
当業者であれば、本発明の実践に用いることが可能である本明細書で述べるものと類似または同等である多くの方法および物質を識別する。実際、本発明は、記載される方法および物質に限定されるものではまったくない。本発明の目的のために、以下の用語を次のように定義する。
【００２６】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して用いる場合、「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限りにおいて、複数の言及を含む。また、本明細書で用いる場合、「中で（in）」の意味は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限りにおいて、「中で（in）」および「上で（on）」を含む。
【００２７】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）の用語は、本技術分野で用いられるように本明細書において用いられる。この用語は、細胞系統として段階的に継代培養されたものを含む、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊から得られる細胞を含む。ＥＳ細胞は、卵細胞と精子との受精から、さらにはＤＮＡ、核移植、単為生殖を用いて、またはＨＬＡ領域においてホモ接合性を有するＥＳ細胞を生成させる手段によって得られるものであってよい。ＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞との融合、核移植、単為生殖、雄性生殖、またはクロマチンの再プログラム化およびそれに続く細胞作製のための再プログラム化されたクロマチンの細胞膜への組み込みによって発生された接合体、卵割球、もしくは胚盤胞期哺乳類の胚から得られる細胞でもある。胚性幹細胞は、その作製源またはそれを作製するために用いられる特定の方法に関わらず、（ｉ）３つすべての胚葉の細胞へ分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ４およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに（ｉｉｉ）免疫不全動物へ移植された場合にテラトーマを発生させる能力、に基づいて識別することができる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「多能性幹細胞」の用語は、多能性幹細胞が得られる方法に関わらず、胚性幹細胞、胚由来幹細胞、および誘導多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、機能的に：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植された場合にテラトーマを誘発する能力を有する；（ｂ）３つすべての胚葉の細胞型へ分化する能力を有する（例：外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞型に分化することができる）；ならびに（ｃ）胚性幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する（例：Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ‐３表面抗原、ＳＳＥＡ‐４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ‐１‐６０、ＴＲＡ‐１‐８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）、幹細胞として定義される。代表的な多能性幹細胞は、例えば本技術分野で公知の方法を用いて生成することができる。代表的な多能性幹細胞としては、胚盤胞期胚のＩＣＭから得られる胚性幹細胞、さらには卵割期または桑実期胚の１つ以上の卵割球から得られる胚性幹細胞（所望に応じて、胚の残り部分を破壊することなく行ってよい）が挙げられる。そのような胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、および雄性生殖を含む無性生殖的手段によって作製される胚性物質から生成してよい。さらなる代表的な多能性幹細胞としては、因子の組み合わせ（以降本明細書にて再プログラム化因子と称する）を発現することによる体細胞の再プログラム化によって生成される誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。ｉＰＳＣは、胎児（仔）、出生後、新生児（仔）、若齢、または成体の体細胞を用いて生成してよい。
【００２９】
特定の実施形態において、体細胞を再プログラム化して多能性幹細胞とするために用いてよい因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と称される場合もある）、Ｓｏｘ２、ｃ‐Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組み合わせが挙げられる。他の実施形態において、体細胞を再プログラム化して多能性幹細胞とするために用いてよい因子としては、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも２つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも３つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも４つの再プログラム化因子が体細胞中で発現される。他の実施形態では、さらなる再プログラム化因子が識別され、それが単独で、または１つ以上の既知の再プログラム化因子と組み合わせて用いられて、体細胞が多能性幹細胞へと再プログラム化される。誘導多能性幹細胞は、機能的に明らかにされており、様々な方法（組み込みベクター、非組み込みベクター、化学的手段など）のいずれを用いて再プログラム化された細胞も含む。
【００３０】
誘導多能性幹細胞は、体細胞における再プログラム化因子のタンパク質形質導入によって作製することができる。特定の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも２つの再プログラム化タンパク質が体細胞内へ形質導入される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも３つの再プログラム化タンパク質が体細胞内へ形質導入される。他の実施形態では、体細胞の再プログラム化を成功させるために、少なくとも４つの再プログラム化タンパク質が体細胞内へ形質導入される。
【００３１】
多能性幹細胞は、いかなる種からのものであってもよい。胚性幹細胞は、例えば、マウス、非ヒト霊長類の複数の種、およびヒトで得ることに成功しており、胚性幹様細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ）は、数多くのさらなる種から生成されている。従って、当業者であれば、胚性幹細胞および胚由来幹細胞を、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄類（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼育用および野生のイヌ）、ネコ類（ライオン、トラ、チーターなど、飼育用および野生のネコ類）、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、リス、モルモット、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むいずれの種からも生成することができる。特定の実施形態では、種は、絶滅危惧種である。特定の実施形態では、種は、現在絶滅した種である。
【００３２】
同様に、ｉＰＳＣもいかなる種からのものであってもよい。これらのｉＰＳＣは、マウスおよびヒト細胞（ｈｉＰＳＣ）を用いての生成に成功している。さらに、ｉＰＳＣは、胚、胎児（胎仔）、新生児（仔）、および成体組織を用いての生成に成功している。従って、ｉＰＳＣは、いかなる種からのドナー細胞を用いても容易に生成することができる。従って、ｉＰＳＣは、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄類（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（飼育用および野生のイヌ）、ネコ類（ライオン、トラ、チーターなど、飼育用および野生のネコ類）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むいずれの種からも生成することができる。特定の実施形態では、種は、絶滅危惧種である。特定の実施形態では、種は、現在絶滅した種である。
【００３３】
誘導多能性幹細胞は、出発点として、実質的にいかなる細胞発生段階のいかなる体細胞を用いて生成してもよい。例えば、細胞は、胚、胎児（仔）、新生児（仔）、若齢、または成体ドナーからのものであってよい。用いてよい代表的な体細胞としては、皮膚サンプルもしくは生検によって得られる皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞、滑膜組織からの滑膜細胞、包皮細胞、頬細胞、または肺線維芽細胞が挙げられる。皮膚および頬は、容易に利用可能であり、簡単に入手可能である適切な細胞源を提供するが、実質的にいかなる細胞を用いてもよい。特定の実施形態では、体細胞は線維芽細胞ではない。
【００３４】
「血管芽細胞」および「血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ）」の用語は、本出願全体を通して交換可能に用いられる。これらの細胞は、数多くの構造的および機能的特徴を有する。これらの細胞の特徴の中で、宿主へ投与された場合に骨髄へ生着する能力がある。これらの細胞は、これらに限定されないが、１つ以上のマーカーの発現（ＲＮＡまたはタンパク質）、または発現（ＲＮＡまたはタンパク質）がないこと、を含む数多くの構造的および機能的特性に基づいて説明することができる。血管コロニー形成細胞は、分化して、少なくとも造血細胞型または内皮細胞型を発生させる能力を有する。好ましくは、血管コロニー形成細胞は、二分化能であり、分化して、少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を発生させる能力を有する。従って、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単分化能であり、好ましくは二分化能である。しかし、加えて、血管コロニー形成細胞は、より高い度合いの発生能を有していてよく、特定の実施形態では、分化して、その他の系列の細胞型を発生させてよい。特定の実施形態では、血管コロニー形成細胞は、分化して、心臓細胞（例えば、心筋細胞）および／または平滑筋細胞などのその他の中胚葉誘導体を発生させる能力を有する。
【００３５】
「非生着血管芽細胞（ｎｏｎ−ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ）」および「非生着血管細胞（ｎｏｎ−ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｈｅｍａｎｇｉｏ ｃｅｌｌｓ）」の用語は、本出願全体を通して、血管コロニー形成細胞の特徴の一部を共有する細胞の集団を意味するために用いられる。しかし、非生着血管細胞は、免疫不全宿主に投与された場合に骨髄へ生着しないという点で、区別することができる。この違いにも関わらず、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴および特性の１もしくは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有し得る。例えば、特定の実施形態では、非生着血管細胞は、互いに緩やかに接着している。他の実施形態では、非生着血管細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、の１もしくは２つ以上（２、３、４）を発現しない。理論に束縛されるものではないが、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞よりもある程度特殊化された独特の幹細胞集団を提供し得るが、それでも、一定範囲の造血細胞型を生成する能力を有する。
【００３６】
血小板の供給が限られることは、輸血依存患者にとって命にかかわる可能性のある結果となり得る。ｈＥＳＣは、生体外にて無限に繁殖させることができ、ヒトの治療法にとっての無尽蔵でドナーを必要としない血小板源とすることができる。適合した、または不適合性が低減されたｈＥＳＣ系統のバンクを作り出すことができることは、免疫抑制薬および／または免疫調節プロトコルの必要性を低減または除去することができる可能性を有する。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出現により^{４１；４２；４３；４４}、このような技術を、血小板同種免疫が発生している輸血依存患者のための患者特異的血小板の作製に適応させることが可能であり得る。
【００３７】
ドナーから収集される血小板は、保存期間が非常に限られており、患者の予防的輸血のための需要は高まってきている。ドナーに依存する臍帯血または骨髄ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞とは対照的に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、制御された条件下にて血小板を生体外で連続的に作製するための有望な別の選択肢としての作製源であり得る。発明者らは、血清および間質のない条件下にてｈＥＳＣから巨核球（ＭＫ）を生成する新規な系を開発した。この系では、ｈＥＳＣは、胚様体形成および血管芽細胞分化を通してｈＥＳＣを巨核球へと指向される。ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａマーカーの両方を発現する一過性の二分化能細胞集団が、血管芽細胞培養後に識別された。これらの細胞は、ＦＡＣＳソーティングおよびＣＦＵアッセイで示されるように、ＭＫおよび赤血球細胞の両方を生成する能力を有する。無血清懸濁培養におけるＴＰＯ、ＳＣＦ、およびその他のサイトカインの存在下にて、ｈＥＳＣからＭＫへ最大で１００倍までの増殖を１４〜１５日間で達成することができる。この系は、ｈＥＳＣからＭＫを生成する強力な生体外法である。ＯＰ９細胞上に播種されると、ｈＥＳＣ由来ＭＫは、血小板様粒子（ＥＳ‐ＰＬＴ）を生成することができる。このようなＥＳ‐ＰＬＴは、トロンビン刺激に対して応答性であり、微小凝集体形成に関与することができる。
【００３８】
血清および間質のない条件下にてｈＥＳＣから機能的巨核球を生成する効率的な方法について述べる。本系では、ｈＥＳＣを、血管芽細胞（本明細書にて以降芽細胞（ＢＣ）とも称する）を中間体として用いて巨核球分化へと指向させたものであり^１７、１×１０^６細胞のｈＥＳＣから最大１×１０^８の巨核球が生成され、これは、Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．^１６による最も最近報告された方法よりもおよそ１０〜２０倍高い効率である。さらなる精製を行うことなく、懸濁培養物からの生存細胞の＞９０％がＣＤ４１ａ＋であり、これらの細胞の大多数はＣＤ４２ａおよびＣＤ４２ｂも発現している。このような生体外で得られたＭＫ細胞は、細胞質顆粒中のｖＷＦのギムザ染色および免疫蛍光染色で示されるように、核内分裂を起こして成熟した倍数体ＭＫと成ることができる。重要なことには、ＭＫ培養の後期において胞体突起形成細胞が終始観察されており、このことは、本系で生成されたＭＫが、無フィーダー条件下にて最終分化を起こすことができることを示している。これらの結果はまた、ＯＰ９間質細胞上に播種された場合、これらの巨核球が、血液血小板の機能的特性を共有する血小板様粒子を生成したことも示す。
【００３９】
本明細書では、制御された条件下、ｈＥＳＣを作製源細胞として用いる生体外での巨核球の大量作製に適応可能である効率的な系について述べる。この細胞は、ＣＤ４１ａ，ＣＤ４２ａ，およびＣＤ４２ｂを発現し、核内分裂を起こして、成熟した倍数体ＭＫを形成した。さらに成熟すると、それらは、トロンビン刺激によって活性化可能であり、フィブリノゲンおよびフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）の表面上で伸展することができる血小板を生成した。このｈＥＳＣ由来血小板はまた、微小凝集体を形成し、正常なヒト血液血小板と同等な形でクロットの形成および退縮を促進した。重要なことには、これらの結果はまた、このような生体外で得られた巨核球が、その血液中対応物と機能的に同等である血小板を生成する能力を有していることも示した。このようなＥＳ‐ＰＬＴは、その接着および伸展する能力、ならびに正常血液血小板と共に微小凝集体を形成する能力を示すことによって、血小板アゴニストに対して応答性を有する。間質細胞や手選プロセス（ｈａｎｄ−ｐｉｃｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）が巨核球生成に関与しないことから、本プラットフォームは、無間質血小板生成の条件の確立も可能とする。これは、最近発表された３Ｄバイオリアクター系^３０を含む生体外血小板生成のための無間質条件が他所にて記述されていることから、技術的に可能である。エストラジオール、ビタミンＢ３、および細胞外マトリックスタンパク質を含む因子が血小板生成を向上させることは、既に報告されている^{３１‐３３}。これらの因子による、間質細胞なしでの巨核球成熟および血小板生成の刺激について、本系で試験される。
【００４０】
無血清および無間質条件下で巨核球が作製されることにより、十分に定義された条件下での巨核球形成および血小板新生の制御に不可欠である因子のスクリーニングが可能となる。このような今後の研究で識別される因子は、将来的な臨床適用に寄与する可能性がある。この分野での進歩はまた、系列拘束（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）、増殖、および成熟を含む巨核球形成の種々の側面を制御する細胞および分子メカニズムに関する見識も恐らくは提供することになるであろう。芽細胞培養物中に二分化能ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋集団を発明者らが識別したことは、赤血球対巨核球細胞の系列特定化（ｌｉｎｅａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）に関するメカニズムの研究を確実に促進させるであろう。最近、Ｋｌｉｍｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．は、ＯＰ９間質細胞上でのヒトＥＳ細胞の造血分化からの、ＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａの両方を共発現する類似の巨核球／赤血球二分化能細胞を報告した^３４。これらの細胞は、赤血球新生対巨核球形成の分岐点である可能性が高い。この集団についての詳細な研究は、造血の過程でのこの重要なプロセスの制御に関与する事象に光を当てる可能性が高い。
【００４１】
この系は、ｈＥＳＣからの巨核球分化の段階的な誘導を一体化するものである。工程内制御のさらなる最適化および確立を行うことで、臨床適用のための本系の一貫性および効率性を改善することができる。現段階では、巨核球成熟を制御する基本的な細胞または細胞外メカニズムは、完全には明らかにされていない。ＭＫ培養物中においてこれらの細胞の大部分が依然として二倍体であることから、生体外で得られた巨核球の最終分化を促進するためには、倍数体化および細胞質成熟を促進するその他の因子を識別して本系に含める必要があり得る。例えば、系において、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤は、初期段階で巨核球の核内分裂を誘発することができる。しかし、この効果は、分化する巨核球の細胞および核成熟を調整した結果というよりは、染色体分配および細胞質分裂の人工的なブロッキングに起因する可能性が高い。生体外巨核球収率、最終分化状態、および下流での明らかな条件下における機能的血小板の作製について最良の結果を達成するために、増殖、核内分裂、および細胞質成熟の間のバランスを得ることが重要である。
【００４２】
これらの実績は、生体外で得られた血小板が、アゴニスト刺激によって誘発されるインテグリン受容体リモデリングおよび血小板伸展に対して応答性であることを示した。さらに、生体外で得られた血小板は、血漿血小板と一緒に作用して、凝集体を形成することができる。このような生体外で得られたヒト血小板は、生体内でも機能することができる。ヒトＥＳ細胞由来血小板に対して発明者らが実施したＦＡＣＳ特性評価および３つの機能性試験（ＰＡＣ１結合アッセイ、伸展アッセイ、および微小凝集体アッセイ）は、生体外で作製された血小板が、正常血液血小板の形態的および機能的特性を共有していることを示している。Ｎｉｃｈｉｉ ｅｔ ａｌ．による最近の報告によると、生体外で得られたマウスＥＳ細胞由来血小板の生体内機能が試験され、有望な結果が得られた^３５。
【００４３】
生体外研究では、生物内での血小板血栓の形成および広がりの過程で発生する無数の血行動態的事象を模倣することはできない。新しい生体内イメージング技術が利用可能となったことにより、複雑な生体内系において血管損傷後に発生する血小板依存性の血栓プロセスを直接調べ、定量化する手段が提供される。高速広視野生体内顕微鏡法を用いることで、発明者らは、ｈＥＳＣ由来血小板が、正常ヒト血液血小板に類似して、生体マウスにおけるレーザー誘発細動脈壁損傷の部位で発生するマウス血小板血栓中に組み込まれることを示した。ｈＥＳＣ由来血小板およびコントロール血小板をＲｅｏＰｒｏで前処理すると、血栓中に組み込まれる血小板の数が大きく減少しており、このことから、この結合がαＩＩｂβ３インテグリンによって媒介されることが確認された。これらの結果は、ｈＥＳＣ由来血小板が、生体動物の血管損傷部位において機能性であるという貴重な証拠を提供するものである。
【００４４】
血小板は、血管損傷に応答して、組織に、および互いに接着する無核細胞である。このプロセスは、主として血小板インテグリンαＩＩｂβ３によって媒介され、これは、ｖＷＦおよびフィブリノゲンなどのいくつかの接着性基質と結合して、成長する血栓中の血小板を架橋し、これをさらに活性化する^３６。本明細書の結果は、ｈＥＳＣから生成された血小板が、生体外および生体動物内の両方において、正常血液血小板と機能的に類似していることを示している。ｈＥＳＣ‐ＰＬＴは、フィブリノゲンおよびｖＷＦコーティングした表面上で接着および伸展する能力、ならびに生理学的アゴニストによって刺激されると凝集する能力を含む、止血に関与する重要な機能を有することが示された。重要なことには、ｈＥＳＣから得られた血小板が、フィブリンクロットを退縮させることができるということが初めて示されている。この結果は、一次止血での中心的な役割に加えて、ｈＥＳＣ‐ＰＬＴが、フィブリンとの相互作用によって凝固を促進することができ、インテグリンの媒介による退縮性の挙動によって創傷治癒を促進することを示している。
【００４５】
重要な科学的及び臨床的問題は、ｈＥＳＣ由来の血小板が、複雑な生体内の設定において機能的であるか否かということである。マウスの血栓形成を研究するための多数の実験モデルが、過去十年間に確立されており、それらには、近年幾つかのグループにより使用されたレーザー損傷血栓モデルが含まれる^{３７；３８；３９}。レーザー誘導性血栓モデルでは、損傷後５〜３０秒の速さで血小板血栓形成が開始される。従って、このモデルは、迅速に除去されたヒト血小板及びｈＥＳＣ−ＰＬＴが、発生中のマウス血小板血栓に取り込まれるのをリアルタイムでモニタリングすることを可能にし、取り込みには、多数のシグナル伝達経路、酵素カスケード、並びに無数の細胞成分及びタンパク質成分の相互作用が伴う。また、このモデルは、トロンビン誘導性血栓症に関連する炎症反応を忠実に表す。
【００４６】
レーザー誘導性血管損傷モデルを使用した生体顕微鏡分析は、ｈＥＳＣ−ＰＬＴが、血液血小板のように、血管損傷後にαＩＩｂβ３インテグリンにより、発生中のマウス血小板血栓に取り込まれることを示す。マウス血小板血栓と相互作用するｈＥＳＣ−ＰＬＴの数は、ヒト血液血小板と相互作用するｈＥＳＣ−ＰＬＴの数より少なく（図９Ｃ）、これは、活性化ｈＥＳＣ−ＰＬＴに対するＰＡＣ−１の結合が、活性化ヒト血液血小板と比較して低いことよる可能性がある（図７Ｇ及び図１１）。これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＰＬＴが、生体内の血管損傷部位で機能的であるという明らかな根拠を提供する。
【００４７】
２つの先行研究は、ＭＫがｈＥＳＣから生成されることを報告している。これらの系での収量は非常に低く（本明細書で報告された収量より１００倍を超えて低い）、現行の系と異なり、血清で補完された動物性間質細胞との共培養に依存する^{１５；１６}。更に、生体外で機能的だったｈＥＳＣ−血小板の生成を示したのは、そのうちの１つだけであるが、それらの生体内での機能性は報告されなかった^１６。ｈＥＳＣ分化におけるこれらの２つの変数を排除することにより、動物性産物と接触させずに血小板を生成することが可能になる。本研究で使用された無フィーダー系は、ＭＫを高効率で生成することが観察されたが、無フィーダー条件下で機能的血小板を生成する最終ステップは、ＯＰ９細胞共培養系ほど効率的ではない。
【００４８】
従って、これらの結果は、ＯＰ９間質細胞が、ｈＥＳＣ−ＭＫからの機能的血小板の生成を増強することができる追加的な支援因子を提供することを示唆する。根底にある機序は、まだ研究されていない。血小板新生は、膜及び微小管が精巧に再編成され、顆粒及び細胞小器官が正確に分布される高度に複雑なプロセスである^４０。血小板生合成の理解が近年進歩したにもかかわらず、膜再編成、胞体突起の開始、血小板細胞小器官及び分泌性顆粒の輸送、及び血小板サイズの制御の根底にある機械論的詳細は、まだ解明されていない。無血清及び無フィーダー条件下でＭＫを生成する能力は、明確に規定された条件下で、系列拘束、増殖、及び成熟を含む巨核球形成の様々な側面を制御するのに重要な因子のスクリーニングを支援するはずである。
【００４９】
巨核球
本発明の種々の実施形態は、無間質条件下で、ヒト胚性幹細胞及び多能性幹細胞（ｉＰＳＣ及びｈｉＰＳＣを含む）から機能的な巨核球を生成する方法を提供する。ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣを含む多能性幹細胞は、血管芽細胞／芽球細胞を中間体として使用して、巨核球分化へと向けられた。
【００５０】
１つの実施形態では、本方法は、血管芽細胞（芽球細胞とも呼ばれる）を準備すること、及び血管芽細胞を巨核球へと分化させることを含む。１つの実施形態では、血管芽細胞は、ヒト血管芽細胞である。別の実施形態では、血管芽細胞は、ｈＥＳＣに由来する。別の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。別の実施形態では、血管芽細胞は、体細胞の再プログラミングに由来するヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。１つの実施形態では、体細胞は、胎児（仔）組織由来である。別の実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。代替的な実施形態では、血管芽細胞は、非生着血管芽細胞であってもよい。
【００５１】
１つの実施形態では、血管芽細胞を巨核球へと分化させることは、６日目〜８日目の血管芽細胞を精製し、ＴＰＯ、ＳＣＦで補完された培地に播種して、ＭＫへのＢＣ分化を誘導することを含む。種々の実施形態では、濃度は、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）である。別の実施形態では、濃度は、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）である。別の実施形態では、培地は、ＩＬ１１（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）ででも補完される。更なる実施形態では、ＭＫは、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ａ、及びＣＤ４２ｂを発現する。代替的な実施形態では、培地は、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、エストラジオール、ビタミンＢ３、及び／又は細胞外マトリックスタンパク質ででも補完される。更なる実施形態では、本方法は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及び／又はＩＬ１１で補完された培地を、２〜３日毎に新しい培地と交換することを更に含む。別の実施形態では、本方法は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及び／又はＩＬ１１で補完された培地の少なくとも一部を、２〜３日毎に新しい培地と交換することを含む。代替的な実施形態では、本方法は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及び／又はＩＬ１１で補完された培地の半分を、２〜３日毎に新しい培地と交換することを更に含む。種々の実施形態では、約１〜５×１０^５細胞／ｍｌが、播種される。種々の実施形態では、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地が使用される。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、細胞分化の修飾因子をスクリーニングする方法であって、ある量の巨核球（ＭＫ）を準備すること、ＭＫを試験化合物と接触させること、及びＭＫと試験化合物との接触に由来する機能的効果の存在又は非存在を決定することを含み、機能的効果の存在が、試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成、血小板新生、及び／又は造血因子（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）であることを示し、機能的効果の非存在が、試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成、血小板新生、及び／又は造血因子でないことを示す方法を提供する。他の実施形態では、巨核球形成、血小板新生、及び／又は造血因子は、機能的血小板の増殖、核内分裂、細胞質成熟、及び最終分化に関連する。
【００５３】
血小板
本発明の他の実施形態は、ヒト胚性幹細胞及び多能性幹細胞（ｉＰＳＣ及びｈｉＰＳＣを含む）から血小板を生成する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を準備すること、胚様体（ＥＢ）を形成すること、血管芽細胞（芽球細胞（ＢＣ）とも呼ばれる）を生成すること、ＢＣを巨核球へと分化させること、及び巨核球を血小板へと分化させることを含む。代替的な実施形態では、血管芽細胞は、非生着血管芽細胞であってもよい。
【００５４】
本発明の他の実施形態は、多能性幹細胞（ｐｌｕｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から血小板を生成する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を準備すること、胚様体（ＥＢ）を形成すること、血管芽細胞（芽球細胞（ＢＣ）とも呼ばれる）を生成すること、ＢＣを巨核球へと分化させること、及び巨核球を血小板へと分化させることを含む。１つの実施形態では、血管芽細胞は、ヒト血管芽細胞である。別の実施形態では、血管芽細胞は、ｈＥＳＣに由来する。別の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。１つの実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞の再プログラミングに由来するヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。１つの実施形態では、体細胞は、胎児（仔）組織由来である。別の実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。代替的な実施形態では、血管芽細胞は、非生着血管芽細胞であってもよい。
【００５５】
別の実施形態では、血小板を生成する方法は、血管芽細胞を準備すること、血管芽細胞を巨核球へと分化させること、及び巨核球を血小板へと分化させることを含む。代替的な実施形態では、血管芽細胞は、非生着血管芽細胞であってもよい。血管芽細胞を巨核球へと分化させるプロセスは、上述のように実施することができる。１つの実施形態では、血管芽細胞は、ヒト血管芽細胞である。別の実施形態では、血管芽細胞は、ｈＥＳＣに由来する。別の実施形態では、血管芽細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。１つの実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞の再プログラミングに由来するヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。１つの実施形態では、体細胞は、胎児（仔）組織由来である。別の実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。代替的な実施形態では、血管芽細胞は、非生着血管芽細胞であってもよい。
【００５６】
種々の実施形態では、巨核球を血小板へと分化させるプロセスは、巨核球の培養を継続して、巨核球が血小板へと分化することを可能にすることを含む。種々の実施形態では、巨核球を血小板へと分化させるプロセスは、無フィーダー条件下であり、４日目〜６日目の巨核球培養物から巨核球を収集すること、及びＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウムで補完された培地に巨核球を再懸濁することを含む。ある実施形態では、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、及びヘパリンナトリウム（２５単位／ｍｌ）の濃度である。ある実施形態では、培地は、ＩＬ１１（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）ででも補完される。代替的な実施形態では、培地は、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、エストラジオール、ビタミンＢ３、及び／又は細胞外マトリックスタンパク質ででも補完される。ある実施形態では、ＩＬ３が、４日目〜７日目の巨核球培養物に添加される。別の実施形態では、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＧＭ６００１が、４日目以降の巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｙｔｅ）培養物に添加される。ある実施形態では、培地は、ＩＭＤＭ培地である。更なる実施形態では、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウム、並びに随意にＩＬ１１を含む培地は、２日毎に交換される。別の実施形態では、本方法は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウム、並びに随意にＩＬ１１を含む培地の少なくとも一部を、２〜３日毎に新しい培地と交換することを更に含む。代替的な実施形態では、本方法は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウム、並びに随意にＩＬ１１を含む培地の半分を、２〜３日毎に新しい培地と交換することを更に含む。更なる実施形態では、血小板は、４日目〜１２日目の巨核球培養物から収集される。種々の実施形態では、巨核球を血小板へと分化させるプロセスは、巨核球の培養を継続して、巨核球が血小板へと分化することを可能にすることを含む。種々の実施形態では、様々な因子が、巨核球からの血小板形成の効率を向上させる。種々の実施形態では、ＩＬ６、ＩＬ３、Ｎｏｔｃｈ、又は他のタイプのサイトカイン、インターロイキン、成長因子、低分子、及びそれらの組み合わせは、巨核球からの血小板分化の効率を向上させる。
【００５７】
他の実施形態では、巨核球を血小板へと分化させる方法は、ＯＰ９間質細胞又はＣ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞と共に巨核球を共培養することを含む。種々の実施形態では、ＯＰ９間質細胞又はＣ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞と共に巨核球を共培養することは、４日目〜６日目の巨核球培養物から巨核球を収集すること、及びＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウムで補完された培地に巨核球を再懸濁することを含む。ある実施形態では、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、及びヘパリンナトリウム（２５単位／ｍｌ）の濃度である。ある実施形態では、培地は、ＩＬ１１（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）ででも補完される。代替的な実施形態では、培地は、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、エストラジオール、ビタミンＢ３、及び／又は細胞外マトリックスタンパク質ででも補完される。ある実施形態では、ＩＬ３が、４日目〜７日目の巨核球培養物に添加される。別の実施形態では、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＧＭ６００１が、４日目以降の巨核球培養物に添加される。更なる実施形態では、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウム、並びに随意にＩＬ１１を含む培地は、２日毎に交換される。別の実施形態では、本方法は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウム、並びに随意にＩＬ１１を含む培地の少なくとも一部を、２〜３日毎に新しい培地と交換することを更に含む。代替的な実施形態では、本方法は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンナトリウム、並びに随意にＩＬ１１を含む培地の半分を、２〜３日毎に新しい培地と交換することを更に含む。種々の実施形態では、様々な因子が、巨核球からの血小板形成の効率を向上させる。種々の実施形態では、ＩＬ６、ＩＬ３、Ｎｏｔｃｈ、又は他のタイプのサイトカイン、インターロイキン、成長因子、低分子、及びそれらの組み合わせは、巨核球からの血小板分化の効率を向上させる。
【００５８】
更なる実施形態では、血小板は、４日目〜１２日目の巨核球培養物から収集される。ある実施形態では、血小板は、密度勾配遠心分離を使用して精製される。更なる実施形態では、密度勾配遠心分離は、パーコール培地を使用する。別の実施形態では、血小板精製法は、ＣＤ４１ａ陰性の粒子を分離する。別の実施形態では、血小板精製法は、細胞生存能及び形態学的完全性を保持する。他の実施形態では、血小板は、ＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂを発現する。他の実施形態では、血小板は、トロンビン刺激に応答する。別の実施形態では、血小板は、フィブリノゲン及びフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）表面に伸展する（ｓｐｒｅａｄ）ことができる。代替的な実施形態では、血小板は、ＰＡＣ−１結合及びインテグリン活性化の能力を有する。別の実施形態では、血小板は、微小凝集体を形成し、クロット形成及び退縮を促進する。別の実施形態では、血小板は、アピラーゼ及び／又はＥＤＴＡの存在下で活性化されない。
【００５９】
本発明の種々の実施形態は、ｈＥＳＣ由来の血小板を使用する方法を提供する。ある実施形態では、ｈＥＳＣ由来の血小板は、血小板輸血で使用される。本方法は、ある量のｈＥＳＣ由来血小板を準備すること、及びある量のｈＥＳＣ由来血小板をその必要がある対象体に投与することを含んでいてもよい。種々の実施形態では、ｈＥＳＣ由来の血小板は、患者と一致した血小板であってもよい。別の実施形態では、血小板は、ｉＰＳＣに由来する。ある実施形態では、血小板は、ｈｉＰＳＣに由来する。他の実施形態では、血小板は、血小板を対象体に投与した際に、対象体においてＨＬＡ同種免疫原性反応に寄与しない溶液中で保管される。
【００６０】
血管芽細胞
種々の実施形態では、血管芽細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を準備すること、胚様体（ＥＢ）を形成すること、及び芽球細胞（ＢＣ）を生成することを含む方法より生成することができる。代替的な実施形態では、本方法は、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ及びｈｉＰＳＣを含む）を準備すること、胚様体（ＥＢ）を形成すること、及び芽球細胞（ＢＣ）を生成することを含む。ある実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞の再プログラミングに由来する。１つの実施形態では、体細胞は、胎児（仔）組織由来である。別の実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。
【００６１】
１つの実施形態では、ＥＢを形成することは、ｈＥＳＣを解離すること、解離されたｈＥＳＣを、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦで補完された培地に約４８時間播種すること、及びこの培地の半分を、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、及び／又はＴｐｏを含む新しい培地と交換することを含む。別の実施形態では、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、及び／又はＴｐｏで補完された培地は、２日毎に交換される。別の実施形態では、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、及び／又はＴｐｏで補完された培地の少なくとも一部は、２日毎に交換される。代替的な実施形態では、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ及びｈｉＰＳＣを含む）が、ｈＥＳＣの代りに使用される。
【００６２】
種々の実施形態では、ｈＥＳＣを解離することは、トリプシンによりｈＥＳＣを解離することを含む。１つの実施形態では、トリプシンの濃度は、０．０５％である。種々の実施形態では、培地は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地である。種々の実施形態では、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦの濃度は両方とも、５０ｎｇ／ｍｌである。種々の実施形態では、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、及びＴｐｏの濃度は、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３リガンド（５０ｎｇ／ｍｌ）、及びＴｐｏ（５０ｎｇ／ｍｌ）である。代替的な実施形態では、培地は、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、エストラジオール、ビタミンＢ３、及び／又は細胞外マトリックスタンパク質ででも補完される。別の実施形態では、ＥＢを形成することは、細胞の継続的培養を更に含む。別の実施形態では、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、及び／又はＴｐｏで補完された培地は、２日毎に交換される。別の実施形態では、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、及び／又はＴｐｏで補完された培地の少なくとも一部は、２日毎に交換される。１つの実施形態では、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、及び／又はＴｐｏで補完された培地の半分は、２日毎に交換される。
【００６３】
１つの実施形態では、血管芽細胞を生成することは、４日目にＥＢ培養物から胚様体（ＥＢ）を収集すること、ＥＢを解離すること、単一細胞懸濁物を得ること、生細胞を芽球コロニー増殖培地（ＢＧＭ）と混合すること、及び生細胞を播種して血管芽細胞を生成することを含む。
【００６４】
種々の実施形態では、ＥＢを解離することは、トリプシンにより解離することを含む。種々の実施形態では、単一細胞懸濁物を得ることは、２２ゲージ針及び４０μｍ細胞ストレーナーに細胞を通すこと、遠心分離により細胞を収集すること、及び細胞を培地に再懸濁することを含む。１つの実施形態では、培地は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地である。種々の実施形態では、生細胞を芽球コロニー増殖培地（ＢＧＭ）と混合することは、１〜２×１０^５細胞／ｍｌをＢＧＭと混合することを含む。更なる実施形態では、芽球コロニーは、生細胞を播種した３〜４日後に形成され、血管芽細胞を生成する。更なる実施形態では、血管芽細胞は、急速に増殖する。別の実施形態では、血管芽細胞は、ＣＤ７１陽性であり、ＣＸＣＲ４陽性であり、ＴＰＯ受容体を発現する。別の実施形態では、血管芽細胞は、ＣＤ３１陰性、ＣＤ３４陰性、及びＫＤＲ陰性である。
【００６５】
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３０５０号及び同ＰＣＴ／ＵＳ０９／４３０４３号は、双方ともに、２００９年５月６日に出願され、その全内容が完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、血管芽細胞および非生着血管芽細胞を生成する際の追加的な手引きを提供する。
【実施例】
【００６６】
以下の例は、特許請求されている発明をよりよく説明するために提供されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。特定の物質が言及される場合、それは例示目的に過ぎず、本発明を限定することは意図されていない。当業者であれば、発明的な能力を行使せず、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段又は反応物を開発することができる。
【００６７】
実施例１
ｈＥＳＣの培養
この研究で使用したヒトＥＳＣ系統（ＨＵＥＳ３、Ｈ１、ＭＡ０１、及びＭＡ０９）を、以前に記述されているように維持した^１８。手短に言えば、８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで補完された完全ｈＥＳＣ増殖培地中のマイトマイシンＣ処理マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で、ｈＥＳＣを増殖させた。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、６０〜８０％コンフルエンスで、３〜４日毎にｈＥＳＣを継代した。３７℃、５％ＣＯ_２下で細胞を維持し、培地を毎日補充した。
【００６８】
実施例２
胚様体（ＥＢ）形成及び芽球細胞（ＢＣ）の生成
ＥＢ形成及びＢＣ生成の手順は、以前に報告されているように実施した^{１７；１９}。手短に述べると、７０％コンフルエンスのｈＥＳＣを０．０５％トリプシンで解離し、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で補完されたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｓｉｇｍａ社）培地を有するＵｌｔｒａ−Ｌｏｗディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州）に播種した。４８時間後に、培地の半分を、同じサイトカインに加えて、ｂＦＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、及びＴｐｏ（各５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を含有する新しい培地に交換した。４日目にＥＢを収集し、０．０５％トリプシンで解離した。単一細胞懸濁物を、２２ゲージ針及び４０μｍ細胞ストレーナーに細胞を通すことにより得、遠心分離により収集し、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地に再懸濁した。生細胞をトリパンブルー排除法により計数し、１〜２×１０^５個／ｍｌを、以前に記述されているように芽球コロニー増殖培地（ＢＧＭ）と混合し、Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ皿に播種した。播種した３〜４日後に芽球コロニーが観察され、その後急速に増殖した。
【００６９】
実施例３
巨核球分化培養
６〜８日目の芽球培養物に由来するＢＣを精製し、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び他のサイトカインで補完されたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地に播種して（１〜５×１０^５個／ｍｌ）、ＭＫへのＢＣ分化を誘導した。ＭＫ培地の半分を、２日又は３日毎に新しい培地と交換した。
【００７０】
ＯＰ９間質細胞を、１５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を有するα−ＭＥＭ中で維持した。コンフルエントなＯＰ９細胞を、共培養の前日に１００ｎｇ／ｍｌマイトマイシンＣで処理した。細胞をＰＢＳで穏やかに２回洗浄し、共培養の前にＯＰ９培地中で一晩回復させた。ＯＰ９共培養の場合、４〜６日目のＭＫ培養物に由来する巨核球を収集し、Ｔａｋａｙａｍａらによる記載のように^１６、１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び２５単位／ｍｌのヘパリンナトリウムで補完されたＩＭＤＭ培地に再懸濁し、２日毎に新しくした。血小板様粒子を、４日目から１２日目まで分析用に収集した。
【００７１】
実施例４
ＦＡＣＳ分析
芽球培養又は巨核球培養に由来する細胞を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒでフローサイトメトリー分析により日常的にモニターする。系列マーカー、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、及びＣＤ２３５ａに対する蛍光色素（Ｆｌｕｒｏｃｈｒｏｍｅ）結合抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、巨核球及び赤血球系列を特徴付けた。抗体は、５％新生仔ウシ血清を有するＰＢＳで新しく調製した（ＣＤ４２ａ及びＣＤ４２ｂ抗体の場合は１：１００希釈、ＣＤ４１ａ抗体の場合は１：２５０希釈、ＣＤ２３５ａ抗体の場合は１：２０００）。典型的には、１〜２×１０^５細胞を抗体標識に使用した。細胞を、氷上で１時間１００μｌ抗体混合液中で染色し、その後緩衝液で２回洗浄し、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムで補完された２５０μｌ緩衝液に再懸濁した。ＨＬＡ−ＡＢＣの発現レベルを検出するために、血小板を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体又は対照としてのＦＩＴＣ結合マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と共にインキュベートした。その後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を使用して試料を分析し、データは、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ又はＦｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。細胞選別は、ＵＭＡＳＳメディカルスクールコア施設のＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａシステムで実施した。選別した細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより収集し、コロニー形成アッセイ用の適切な培地に再懸濁した。
【００７２】
実施例５
Ｍｅｇａｃｕｌｔ−Ｃ及びメチルセルロースを用いたコロニー形成アッセイ
Ｍｅｇａｃｕｌｔ−Ｃ及びＨ４４３６メチルセルロース培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、ＣＦＵ−ＭＫ及びＣＦＵ−Ｅコロニー形成アッセイに使用した。播種の１０日後に、製造業者の指示に従って、ＣＦＵ−ＭＫ培養物を脱水し、固定し、抗ＣＤ４１抗体で染色した。Ｍｅｇａｃｕｌｔ−Ｃプロトコルに提供されている基準に従って、ＣＦＵ−ＭＫコロニーをスコア化した。ＣＦＵ−Ｅコロニーを、１２日目にスコア化した。
【００７３】
実施例６
サイトスピン調製、ギムザ染色、及び免疫蛍光顕微鏡法
芽球培養物又は巨核球培養物のいずれかに由来する細胞（１〜２×１０^４個）を、サイト遠心分離（Ｃｙｔｏｐｒｏ社製）により、ポリリシンをコーティングしたスライドにサイトスピンした。スライドは、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ（Ｓｉｇｍａ社製）又は免疫蛍光染色のいずれかに使用した。抗ＣＤ４１（ＤＡＫＯ社製、１：１００）及び抗ｖＷＦ（ＤＡＫＯ社製、１：２００）抗体を、サイトスピン調製で巨核球を特定するために使用した。インキュベーションは全て室温で実施した。細胞を、無動物性ブロッカー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で３０分間ブロッキングした。細胞を、一次抗体と共に１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。以下のインキュベーション及び洗浄は、暗所で実施した。その後、細胞を二次抗体（各々、１：２００）と共に３０分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ中のヘキスト染料（１μｇ／ｍｌ）を使用して核ＤＮＡを５分間染色し、その後追加的な３×ＰＢＳ洗浄を行った。その後、スライドを蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸＶ）下にマウントし、検査した。蛍光画像を、ＱＩＣＡＭ Ｆａｓｔカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ社製、カナダ）を使用することにより取り込み、ＱＣａｐｔｕｒｅ Ｐｒｏバージョン５．１ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製、ベセスダ、メリーランド州）で分析した。Ｎｉｋｏｎ社製顕微鏡、ＰＡＸＣＡＭデジタルカメラ、及びＰＡＸ−ｉｔソフトウェアを使用して、位相差生細胞画像を取り込んだ。
【００７４】
実施例７
血小板の調製
ヒト末梢血小板を、１Ｕ／ｍＬアピラーゼ及び５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）と共に、血小板豊富な血漿（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社製、エメリービル、カリフォルニア州）を分画遠心分離することにより単離した。血小板を洗浄し、改変タイロード緩衝液（１２ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５．５ｍＭグルコース、２．９ｍＭ ＫＣｌ、０．４２ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に再懸濁した。ｈＥＳＣ由来の血小板（ＥＳ−ＰＬＴ）を含有する培地を穏やかに収集し、アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）及びＥＤＴＡ（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）を添加して血小板活性化を防止し、その後細胞を３００ｇで１０分間遠心して細胞をペレットにした。上清を新しいチューブに移し、アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）及びＥＤＴＡ（５ｍＭ）の存在下で１０分間１０００ｇで遠心分離して、血小板を収集した。その後、血小板を１回洗浄し、改変タイロード緩衝液に再懸濁した。洗浄した血小板を、機能性アッセイの前に１〜２時間３７℃でインキュベートした。
【００７５】
実施例８
固定化されたフィブリノゲン上での血小板の伸展
マイクロタイターウエルを有するチャンバースライド（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ社製、ロチェスター、ニューヨーク州）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．３）中の１００ｐｇ／ｍＬフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ社製）で一晩４℃でコーティングした。洗浄したヒト末梢血小板又はｈＥＳＣ−血小板（１×１０^７個／ｍＬ）を、フィブリノゲンをコーティングしたウエルに９０分間３７℃で付着及び伸展させた。幾つかの試料では、血小板を、負荷前に５分間、インテグリンアンタゴニスト、ＲＧＤＳペプチドと共にプレインキュベートした。他の試料では、血小板を、ＡＤＰ（１０μＭ）又はトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）と混合し、フィブリノゲンをコーティングしたウエルに直ちに負荷した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を固定し、透過処理し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製、ユージーン、オレゴン州）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４１ａ抗体（Ｄａｋｏ ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製、カーピンテリア、カリフォルニア州）、及びＤＡＰＩで染色した。付着血小板を、１００×／１．４０オイル対物レンズのＰｌａｎＡｐｏレンズを使用して、オリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡（ＭＶＩ社、エイボン、マサチューセッツ州）で観察した。画像を、ＱＩＣＡＭ Ｆａｓｔカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ社製、サリー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を使用することにより取得し、Ｑ Ｃａｐｔｕｒｅ バージョン５．１ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製、ベセスダ、メリーランド州）で処理した。
【００７６】
実施例９
血小板凝集
洗浄したヒト末梢血小板及びｈＥＳＣ−血小板を、改変タイロード緩衝液に再懸濁し、ＰＫＨ６７緑色蛍光細胞リンカー（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ社製、セントルイス、ミズーリ州）で標識した。ヒト末梢血小板（６×１０^７個）を、４５０μｌキュベット（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ社製、ヘイバータウン、ペンシルベニア州）中で、蛍光標識したヒト末梢血小板（３×１０^５個）又はｈＥＳＣ−血小板（３×１０^５個）と混合し、その後トロンビン（０．５Ｕ／ｍＬ）を添加し、１２００ｒｐｍ、３７℃で撹拌して血小板凝集を開始させた。対照実験では、トロンビンを添加する前に、ＲＧＤＳペプチドを３７℃で５分間血小板と共にプレインキュベートし、上記のように凝集アッセイを実施した。５０μＬ緩衝液中の血小板微小凝集体を、スライドガラスに塗布し、蛍光顕微鏡で視覚化した。
【００７７】
実施例１０
ＰＡＣ−１結合アッセイ
トロンビン刺激（１Ｕ／ｍｌ、室温で２０分間のインキュベーション）をした又はしなかったＥＳ−ＰＬＴを、改変タイロード緩衝液中のＡＰＣ結合ＣＤ４１ａ、ＰＥ結合ＣＤ４２ｂ、及びＦＩＴＣ結合ＰＡＣ−１抗体で染色した。その後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を使用して試料を分析し、ヒト血液血小板を対照として使用して、前方散乱及び側方散乱ゲーティングを決定した。ＦＡＣＳデータは、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ又はＦｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。
【００７８】
実施例１１
ｈＥＳＣに由来する芽球細胞（ＢＣ）は巨核球を生成した
本発明者らの以前の研究は、適切な条件下で、ｈＥＳＣに由来するＢＣを赤血球細胞へと生体外で効率的に分化させることができることを示した^２０。巨核球（ＭＫ）および赤血球は、哺乳動物造血中に共通の前駆体を共有するため、本発明者らは、ｈＥＳＣに由来するＢＣも、ＴＰＯ及び他のサイトカインを有する巨核球促進条件下で巨核球に分化することができると考えた。図１Ａで示されているのと類似した戦略を考案して、ｈＥＳＣからＭＫを分化させた。以前に報告されるように^{１７；１９}、初期ＥＢを、モルフォゲン及び初期造血サイトカインの組み合わせで補完された無血清培地中で培養されたｈＥＳＣから生成した。その後、ＥＢを解離し、個々の細胞を、ＢＣの成長及び増殖用の無血清半固形芽球コロニー増殖培地（ＢＧＭ）に播種した。ブドウ様芽球コロニーが、３日間の培養の始めに最初に出現し、４日目から６日目まで急速に増殖した。この段階で、ＢＣは、サイトスピン調製では形態が比較的均質であり、直径が約１５μｍのサイズを有する（図１Ｂ）。これらのＢＣを、コロニー形成単位（ＣＦＵ）−ＭＫアッセイにより、それらが巨核球になる能力について最初に試験した。図１Ｃ及び１Ｄに示されているように、ＨＵＥＳ３及びＨ１細胞の両方に由来する６日目のＢＣは、再播種後１０〜１２日目にＣＦＵ−ＭＫコロニーを発生させ、これらのコロニーは、ＣＤ４１に陽性染色された。幾つかのＣＦＵ−ＭＫコロニーでは、細胞プロセスが類似しており、ＣＤ４１陽性細胞で胞体突起が観察された（図１Ｄ挿入部分）。これらの結果は、ｈＥＳＣ由来のＢＣが、巨核球に分化することができることを示した。同時に、それらのＣＦＵ−ＭＫ能力における有意差が、ＨＵＥＳ３及びＨ１細胞系統間で観察された。ＨＵＥＳ３に由来するＢＣは、同数のＨ１芽球細胞より、およそ３．５倍より多くのＣＦＵ−ＭＫコロニーを生成した。
【００７９】
初期ＢＧＭ培地は、効率的なＢＣ生成のためのＥＰＯを含有しており、赤血球細胞（ＣＤ２３５ａ＋）は、芽球培養の後期で優勢になる^２０。本発明者らの実験の結果は、ＥＢ形成の第２期（ｈＥＳＣ播種後２日間）並びに芽球コロニー成長及び増殖物中のより高濃度のＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）が、芽球培養の終了時のＣＤ４１ａ＋細胞の割合を増加させたことを示した。ＢＧＭ培地にＩＬ−１１（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加することにより、６〜８日目の芽球培養中のＣＤ４１ａ＋細胞の比率が更に増加された。従って、本発明者らは、本研究において、これらの改変を芽球培養に応用して、巨核球系列拘束を向上させた。ＨＵＥＳ３、ＭＡ０１、及びＭＡ０９ ｈＥＳＣ系統を、この改変条件を用いて試験した。３つの系統は全て、巨核球になる能力を示した。ＣＦＵ−ＭＫアッセイでなされた観察と同様に（図１Ｃ）、様々なｈＥＳＣ系統から生成されたＢＣ（６〜８日目）中のＣＤ４１ａ＋細胞の割合における有意差が、ＦＡＣＳ分析により観察された。例えば、ＨＵＥＳ３細胞に由来するＢＣの３２．９＋８．４％（ｎ＝１３）は、ＭＡ０１及びＭＡ０９細胞系統よりも有意に多かった（Ｐ＜０．００１、スチューデント検定）。ＭＡ０１又はＭＡ０９由来の芽球細胞では、これらの細胞の１５．３％＋５．８％（ｎ＝５）又は１７．２％＋３．７％（ｎ＝５）が、それぞれＣＤ４１ａ＋だった（図１Ｅ）。
【００８０】
実施例１２
二分化能芽球細胞は、赤血球及び巨核球を両方とも生じさせた
主な増殖は、芽球培養では５日目〜８日目まで生じ、幾つかの芽球コロニーは、この期間中に赤みを帯び、赤血球拘束及びヘモグロビン合成を示した。ＦＡＣＳ分析は、巨核球マーカーＣＤ４１ａ及び赤血球マーカーＣＤ２３５ａの発現により規定されるＢＣに、４つの異なる細胞集団：ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ−、ＣＤ４１ａ−ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋、及びＣＤ４１ａ−ＣＤ２３５ａ−集団が存在したことを示した（図２Ａ）。ＣＤ４１ａ及びＣＤ２３５ａ二重陽性集団は、赤血球系列及び巨核球系列の両方のマーカーを共有するため、これらの細胞が両系列の二分化能前駆体であるか否かを試験した。
【００８１】
その後、６日目の芽球培養に由来する、選別されたＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ−、ＣＤ４１ａ−ＣＤ２３５ａ＋、及びＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞を、２つのコロニー形成アッセイにより、ＣＦＵ−ＭＫ又はＣＦＵ−Ｅ前駆体のいずれかについて試験した。これらのコロニーアッセイのために、等数の選別された細胞を播種した。予想通り、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ−及びＣＤ４１ａ−ＣＤ２３５ａ＋は、それぞれＣＦＵ−ＭＫ及びＣＦＵ−Ｅコロニーを生成した。同時に、類似した数のＣＦＵ−ＭＫコロニーが、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ−及びＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞により生成され、同程度の数のＣＦＵ−Ｅが、ＣＤ４１ａ−ＣＤ２３５ａ＋及びＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞により発生された（図２Ｂ及びＣ）。従って、これらの結果は、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞が、巨核球系列及び赤血球系列の両方の二分化能前駆体であることを示す。これらのＣＤ４１ａ＋ＣＤ２３５ａ＋細胞は、一時的な集団であると考えられ、巨核球分化培養で培養された直後に消失した。
【００８２】
実施例１３
ｈＥＳＣ由来ＢＣからの巨核球増殖及び成熟を指図する明確な培養条件の確立
巨核球の分化を更に指図するために、メチルセルロース半固形培養に由来する６日目〜８日目のＢＣを回収し、その後、無血清培地、つまりＭＫ培養用のサイトカインで補完されたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩに再懸濁した。ＣＤ４１ａ＋細胞の細胞数を測定値として使用して、懸濁培養中に増殖巨核球を決定した。それは、ＣＤ４１ａ＋（ＦＡＣＳ）の割合と総生細胞数（トリパンブルー排除法）を乗算することにより計算した。初期試験は、高濃度ＴＰＯ（５０〜１００μｇ）単独では、ＢＣからのＣＤ４１ａ＋巨核球の増殖を支援するのに十分でなかったことを示した。培地にＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加することにより、ＣＤ４１ａ＋巨核球の収量が有意に増加した（図３Ａ）。ＢＣからの巨核球の高い純度及び総収量を達成するために、一群のサイトカイン及び因子も試験した。ＩＬ９及びＢＭＰ４を含むこれらの因子は、他の系において巨核球促進因子として以前に報告されていた^{２１；２２}。
【００８３】
図３Ａに示されているように、ＩＬ９及びＢＭＰ４の添加は、ＴＰＯ及びＳＣＦのみと比較して、ＣＤ４１＋細胞の収量を向上させる明らかな効果を示さなかった。しかしながら、ある因子は、ＣＤ４１＋細胞の割合をわずかに増加させた（非表示）。ＩＬ６、ＩＬ１１、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦは全て、追加的栄養補給をしない４日間の液体培養で巨核球の収量をわずかに増加させた。しかしながら、これらの因子を一緒に混合することは、一貫した相乗効果を示さなかった（非表示）。加えて、血清又はメチルセルロースマトリックスを培養物に添加することも試みられた。これらの改変は、ＣＤ４１巨核球の収量を有意には向上させなかった。注目すべきには、巨核球核内分裂及び胞体突起形成を促進することが示された^{２３；２４}特定のＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤（Ｙ２７６３２）も試験した。４日間のＭＫ培養中に１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を包含させることは、倍数体細胞の割合を劇的に増加させた（データ非表示）。しかしながら、ＲＯＣＫ阻害剤は、同時に４日間の培養の終了時のＣＤ４１＋細胞数を低減させた。従って、ＲＯＣＫ阻害剤は、最終ＭＫ培養条件から除外された。
【００８４】
初期試験の結果に基づき、ＢＣからの至適化巨核球分化及び増殖を達成するために、ＴＰＯ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、及びＩＬ１１ ２０ｎｇ／ｍｌをＭＫ培地に含めた。ＩＬ１１は、巨核球の増殖及び成熟の両方を増強することが以前に報告された^{２５；２６}。図３Ｂは、液体培養の経時的実験を示す。６日間の培養期間にわたって、ＣＤ４１＋巨核球の細胞数が５倍増加したことが、本条件下で観察された。６日目のＢＣＳ及び４日目のＭＫ培養物に対するＦＡＣＳ分析を、２つの巨核球マーカーＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ、及び赤血球マーカーＣＤ２３５ａについて実施した。ＭＫ培養では、赤血球細胞（ＣＤ２３５ａ＋）は、２〜３日で急速に死滅する。それとは際立って対照的に、ＣＤ４１ａ＋巨核球は、劇的に増加した。ＭＫ培養の４日目までに、９０％を超える生細胞がＣＤ４１ａを発現し、これらの細胞のおよそ８０％は、成熟中の巨核球に重要な機能的役割を果たす^２７ＣＤ４２ｂにも陽性であった（図３Ｃ）。
【００８５】
実施例１４
ＢＣに由来する巨核球の特徴付け
巨核球の分化及び成熟を示す細胞表面マーカーの変化と一致して、平均細胞サイズは、ＭＫ培養中に徐々に増加した。成熟中の巨核球は、細胞サイズがより大きく、より不均一になった（図４Ａ）。１日目のＭＫ培養では、約６５％の細胞は、１０〜２０μｍの直径を有していた。残り細胞は、２０〜３０μｍだった。６日目までに、２０％を超える細胞は、サイトスピン調製での直径が４０ミクロンよりも大きかった。数パーセントの細胞は、ＭＫ培養で倍数体細胞の表現型を示した（図４Ｂ）。ＣＤ４２ｂ（ＧＰ１ｂ−アルファ）に加えて、糖タンパク質ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）も、ＭＫ培養に由来するＣＤ４１ａ＋巨核球内で高度に発現された（図４Ｃ）。ＣＤ４１及びｖＷＦの免疫蛍光染色も実施して、巨核球細胞質顆粒での特徴的なｖＷＦ発現を検査した。図４Ｄに示されているように、成熟巨核球表現型を有する大型の倍数体細胞は、ＣＤ４１に陽性染色され、細胞質におけるｖＷＦの顆粒状蓄積が検出された。
【００８６】
更に、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、Ｆｌｉ１、ＦＯＧ、及びＮＦＥ２（図４Ｅ）を含む、赤血球／巨核球形成の重要な転写修飾因子の発現レベルを検査した。これらの転写因子は全て、胚様体段階で強力に誘導され、６日目の芽球培養で発現持続を示した。興味深いことには、ＢＣが巨核球分化及び成熟に向けられた場合、ＧＡＴＡ２及びＦＯＧのＲＮＡレベルは、４日目のＭＫ培養で下方制御された。しかしながら、この観察の機械論的意味は、まだ判明していない。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＥＳ、ＥＢ、ＢＣ、及びＭＫ培養中に５つの赤血球−巨核球転写因子ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、Ｆｌｉ１、ＦＯＧ１、及びＮＦ−Ｅ２の発現を示した。
【００８７】
実施例１５
ｈＥＳＣから巨核球への増殖
細胞系統間の効率は様々であるが、試験したｈＥＳＣ系統は全て、無血清及び無間質培養条件下で巨核球（ＣＤ４１ａ＋と規定された）を生成することができた。ｈＥＳＣｓからＥＢ（増殖、１．５〜６倍）、芽球（５〜１２倍）、及びＭＫ培養（１．５〜４倍）を経由して増殖した後、この系は、ヒトＥＳ細胞から開始して、１００万個から最大１億個のＣＤ４１ａ＋巨核球を産生することが可能である。ＨＵＥＳ３、及び２つの臨床グレードの単一卵割球由来ｈＥＳＣ系統、ＭＡ０１及びＭＡ０９の巨核球産生の能力は、表１に要約されている。
【００８８】
表１．ｈＥＳＣからの巨核球の生成
ＭＫ培養に由来するＣＤ４１ａ＋細胞の割合を、ＦＡＣＳにより決定した。ｈＥＳＣから巨核球への総増殖倍数を、ＥＢ、芽球、及びＭＫ培養までの各ステップの増殖倍数を乗算することにより計算した。ＨｕＥＳ３実験Ｂは、１００万個のＥＳ細胞からのＭＫ細胞の実測計数値である。
【表１】

【００８９】
実施例１６
ｈｉＰＳＣは、血管芽細胞／ＢＣ、造血及び内皮細胞に生体外で分化することが可能である
本発明者らは、Ｔｈｏｍｓｏｎ再プログラム法（Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のレンチウイルス発現）により生成されたｈｉＰＳＣを使用して、同様の結果を達成した。これは、細胞系統ＩＭＲ９０−１、Ｆｏｒｅｓｋｉｎ−１−１、Ｆｏｒｅｓｋｉｎ−４−１、及びＦｏｒｅｓｋｉｎ−４−３を含む。それとは別に、Ｙａｍａｎａｋａ再プログラム法（Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃのレトロウイルス発現）により生成されたｈｉＰＳＣを同様に実施した。これは、細胞系統ｒｖ−ｈｉＰＳ０１、ｒｖ−ｈｉＰＳ０２、ｒｖｈｉＰＳ０３、及びｒｖ−ｈｉＰＳ０４を含む。これらのｈｉＰＳＣ系統は、多分化能の標準的マーカーを発現し、報告されているようにＳＣＩＤマウスへの接種後に奇形腫を形成し、この系統は全て、ｈＥＳＣと形態学的に区別不能だった（データ非表示）。本明細書に記載の方法を使用して、ｈｉＰＳＣ系統は、ＢＣを生成することが可能だった。まず、ｈｉＰＳＣを、ＢＣ発生用に至適化された条件下でＥＢに分化させ、個々のＥＢ細胞を、芽球コロニー発生用の芽球成長／増殖培地（ＢＧＭ）に播種した。全てのｈｉＰＳＣ系統に由来するＥＢ細胞は、播種の６日後に芽球コロニーを発生させた。様々な効率が、様々なｈｉＰＳＣ系統で観察された（表２）。にもかかわらず、ｈＥＳＣに由来するＢＣで観察されたように（図５Ａ）、ｈｉＰＳＣに由来するこれらのＢＣは、血管芽細胞マーカーＣＤ７１、ＣＸＣＲ−４、及びＴｐｏ受容体を発現したが（図５Ｂ）、これらのＢＣの大多数は、免疫細胞化学的分析により示されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、及びＫＤＲを発現しなかった。広範なサイトカインで補完された造血コロニー形成培地に１０〜１４日間再播種した後、赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）、骨髄（ＣＦＵ−Ｇ及びＣＦＵ−ＧＭ）、及びマクロファージ（ＣＦＵ−Ｍ、非表示）造血細胞コロニーが発生した（図５Ｃ）。また、ＢＣは、巨核球へと分化する能力を有するＣＦＵ−ＭＫを形成した（図５Ｃ−ｉｖ）。更に、再プログラムタンパク質Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの形質移入等の、無ウイルスベクターを使用して生成されたｈｉＰＳＣは、ＢＣ発育、ＭＫ及び血小板生成について同様の能力を示す。これらの結果は、様々な送達系（レンチウイルス、レトロウイルス、形質移入）を使用して様々な組み合わせの再プログラム因子を用いて生成されたｈｉＰＳＣが、無血清条件下で血管芽細胞、造血及び内皮系列に分化することが可能であることを明らかに示す。
【表２】

^＊播種した１００，０００個のＥＢ細胞当たり、（±）は、ほとんど０個のコロニー又は時には１０個未満のコロニーが得られる結果を表し、（＋）は、少数のコロニー（１０〜３０個）が一貫して得られる結果を表し、（＋＋）は、最大５０個の芽球コロニーの中程度の効率の収量を表す。
【００９０】
実施例１７
ｈＥＳＣ由来の巨核球は、ＯＰ９間質細胞上で機能的な血小板を生成する
ＭＫ培養での４日目から開始して、少数（およそ１〜２％）のｈＥＳＣ由来巨核球は、胞体突起様プロセスを形成することが顕微鏡で一貫して観察された（図４Ｆ）。この観察は、無間質系で生成された巨核球が、最終分化プロセスまで進行することが可能であることを示唆する。
【００９１】
近年、Ｔａｋａｙａｍａらは、機能的なＥＳ由来血小板（ＥＳ−ＰＬＴ）を産生するための、間質細胞ＯＰ９に基づく共培養系を記述した^１６。本発明者らは、細胞が血小板を機能的に製作可能であることを示すために、このＯＰ９系上の巨核球を原理の証明として試験することにした。ＭＫ培養から生成された（ＨＵＥＳ３、ＭＡ０１、及びＭＡ０９に由来した）巨核球を、原報に記載のように、ＴＰＯ １００ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、及びヘパリン ２５Ｕ／ｍｌで補完された同じ培地中の有系分裂的に停止されたＯＰ９細胞上に播種した。胞体突起形成細胞（ＰＦＣ）及び血小板様粒子（ＥＳ−ＰＬＴ）が、ＯＰ９間質層上に播種した後４日以内に出現した。ＥＳＰ−ＬＴを、６日目から１２日目まで２日毎に培地から収集した。１００万個のｈＥＳＣ由来ＭＫから、およそ２０万〜５０万個のＥＳ−ＰＬＴを、この期間中に培養物から回収することができる。以前の報告より低いＥＳ−ＰＬＴ産生効率は、培養条件の抜本的な変更の結果であり得る。また、ＯＰ９との共培養は、播種した巨核球の倍数性を著しくは増加させなかった。これも低い血小板収量／巨核球を説明することができる。にもかかわらず、ＯＰ９共培養物から回収されたＥＳ−ＰＬＴを、正常な血液血小板に重要な機能性について更に試験した。
【００９２】
実施例１８
トロンビン活性化ＥＳ−ＰＬＴは、機能的なインテグリン受容体結合活性を有する
インテグリン媒介性血小板凝集は、生体内での血栓形成に不可欠である。循環中では、血小板は、その接着性受容体を介して損傷血管壁に付着する。初期の付着は、血小板インテグリンαＩＩｂβ３の活性化に結び付くシグナル伝達カスケードを開始させ、血小板の安定的な接着、凝集、及び血栓形成に結び付く。トロンビン等の血小板アゴニストは、インテグリンαＩＩｂβ３のリガンド結合機能を活性化する。その主要リガンド、フィブリノゲンの結合は、インテグリンに依存する血小板の安定的な接着及び凝集を媒介する。また、αＩＩｂβ３の活性化は、細胞外から内部へのインテグリンシグナル伝達を媒介し、血小板細胞骨格再編成および伸展に結び付く。
【００９３】
ＯＰ９共培養から生成されたＥＳ−ＰＬＴを、血小板の主要アゴニストであるトロンビンによる活性化について試験した。インテグリンαＩＩｂβ３活性化を、ＦＡＣＳ分析により、活性化形態のインテグリンαＩＩｂβ３受容体にのみ結合するＦＩＴＣ結合ＰＡＣ−１モノクローナル抗体を用いた結合アッセイにより検査した。タイロード緩衝液に再懸濁されたＥＳ−ＰＬＴを、抗ヒトＣＤ４１ａ（インテグリンαＩＩｂ）抗体、ＣＤ４２ｂ抗体、及びＰＡＣ−１抗体の混合液と共にインキュベートした。その後、それらの表面にＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂ糖タンパク質を両方とも発現するＥＳ−ＰＬＴを、ＰＡＣ−１結合活性についてゲート制御した。トロンビン刺激に際して、ＰＡＣ−１結合は、休止対照と比較して、トロンビン処理ＥＳ−ＰＬＴで増加した。この結果は、ＥＳ−ＰＬＴが、血小板アゴニストからの刺激に応答することを示した（図６Ａ）。ＥＳ−ＰＬＴは、２つの臨床グレードのｈＥＳＣ系統、ＭＡ０１及びＭＡ０９を含む、３つのｈＥＳＣ系統に由来した。３つの系統は全て、トロンビン刺激に応答してＰＡＣ−１結合が可能なＥＳ−ＰＬＴを生じさせることができた（図６Ｂ）。
【００９４】
ＥＳ−ＰＬＴにおける細胞外から内部へのインテグリンシグナル伝達の機能的特性を、スライドガラスに固定化されたフィブリノゲン上での伸展アッセイにより更に評価した。スライドを抗ヒトＣＤ４１ａ抗体及びＤＡＰＩで染色して、血小板を特定した。ヒト血漿血小板対照と同様に、ＥＳ−ＰＬＴは、フィブリノゲンをコーティングした表面に接着及び伸展し、機能的な血小板と同様のＦ−アクチンフィラメントの再編成を示した。ＲＧＤＳペプチドは、血小板インテグリン受容体に対するフィブリノゲン結合を阻止し、フィブリノゲンをコーティングした表面へのＥＳ−ＰＬＴの接着及び伸展を消失させ、伸展がインテグリン依存性であることを示した。アゴニストの非存在下で、幾つかの血小板は、主として糸状仮足形成を有するフィブリノゲン上で不完全な伸展を示した。血小板アゴニストＡＤＰ又はトロンビンで刺激した場合、対照血漿血小板及びＥＳ−ＰＬＴは両方とも、葉状仮足及びアクチンストレス線維形成の増強を示した（図７Ａ）。
【００９５】
実施例１９
ＥＳ−ＰＬＴは、微小血栓形成に寄与することができる
アゴニスト誘導性凝集を形成するそれらの能力、血小板の重要な機能を検査するために、ＥＳ−ＰＬＴを、緑色蛍光染料で標識し、血漿由来血小板と混合した。撹拌条件下でのトロンビン刺激に応答して、血小板微小凝集体が、位相差及び蛍光顕微鏡で観察された。蛍光標識ｈＥＳＣ−血小板は、ヒト血漿由来血小板と一緒にそれら微小凝集体に均等に組み込まれた。トロンビン誘導性血小板凝集は、インテグリンアンタゴニスト、ＲＧＤＳにより阻害され、凝集がインテグリン依存性であることを示した（図７Ｂ）これらの結果は、ＥＳ−ＰＬＴが、アゴニスト誘導性微小凝集体形成において血液血小板と一緒に作用することができることを示した。要約すると、これらの結果は、培養系に由来するＥＳ−ＰＬＴが、ヒト末梢血液血小板と機能的に同等であり、これらのＥＳ−ＰＬＴは、生理学的な血小板アゴニストにより刺激することができることを示した。
【００９６】
実施例２０
ＥＳ−ＰＬＴ上でのＨＬＡクラスＩの発現
ヒト末梢血小板は、免疫関連血小板輸血不応状態（ｒｅｆｌａｃｔｉｖｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）に寄付する場合があるクラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ−ＡＢＣ）を合成及び発現する^２８。従って、ＥＳ−ＰＬＴ上でのＨＬＡクラスＩの発現も、フローサイトメトリーにより検査した。正常な血漿由来血小板は、高レベルのＨＬＡ−ＡＢＣ発現を示した。ＥＳ−ＰＬＴは、ＨＬＡクラスＩの発現レベル（平均蛍光強度）が同等であることを示した。血小板におけるＨＬＡの新規合成に加えて、可溶性ＨＬＡ抗原が、血漿から吸収され得ることも報告されている^２９。培養条件下でｈＥＳＣに由来する血小板は、他の血液細胞に由来するＨＬＡ抗原を含有する血漿を回避し、従って血小板同種異系免疫化の頻度を低減することができる。
【００９７】
実施例２１
ｈＥＳＣ由来の血管芽細胞／ＢＣからのＭＫの大規模生成
実験を実施して、ｈＥＳＣ由来ＢＣも、ＭＫに分化するように誘導することができるか否かを決定した。ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＩＬ−１１を含有する無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中で芽球培養物を６日間分化させた後、ＣＤ４１＋ＭＫの５倍の増加が得られた。また、ＦＡＣＳ分析は、分化の初期段階中に、ＣＤ２３５ａ＋細胞（赤血球細胞）が急速に減少したが、ＣＤ４１ａ＋及びＣＤ４２ｂ＋細胞（ＭＫ）は劇的に増加したことを示した。４日目までに、９０％を超える細胞がＣＤ４１ａを発現し、およそ８０％の細胞が、ＣＤ４２ｂ陽性だった（ＣＤ４２ｂは、ＭＫの成熟に重要な機能的役割を果たす）^２７（図８Ａ）。ＣＤ４２ｂに加えて、糖タンパク質ＣＤ４２ａも、ＣＤ４１ａ＋ＭＫの表面に高度に発現された（データ非表示）。６日目までに、２０％を超える細胞が４０μｍのサイズよりも大きく、３０％を超える細胞が、４Ｎを超えるＤＮＡ含有量を有する倍数体だった（図８Ｂ及び８Ｄ）。大型の倍数体細胞上のＣＤ４１及びｖＷＦについての免疫蛍光染色は、ＣＤ４１陽性膜染色を有する細胞質におけるｖＷＦの特徴的な顆粒状蓄積を示し（図８Ｃ）、細胞が成熟ＭＫだったことを確認した。

【００９８】
試験した全てのｈＥＳＣ系統（ＷＡ０７［Ｈ７］、ＨｕＥＳ−３、ＭＡ０１、及びＭＡ０９）は、これらの無血清及び無フィーダー培養条件下でＭＫを生成したが、様々な効率が観察された（表３）。８つの別々な実験では、ｈＥＳＣからＣＤ４１ａ＋ＭＫ細胞への総細胞増殖は、ＨｕＥＳ−３及びＭＡ０９ ｈＥＳＣ系統の場合、それぞれ３０〜１１１倍及び１８〜１１３倍の範囲であり、ＭＡ０９ ｈＥＳＣの６つのウエルプレート当たり（１．０×１０^７個のｈＥＳＣとほぼ等しい、表３）最大６×１０^８個のＣＤ４１ａ＋ＭＫが生成された。全体的な効率は、以前に発表された方法よりもおよそ２マグニチュード（ｔｗｏ ｍａｇｎｉｔｕｄｅｓ）高い^１６。

【表３】

【００９９】
培養に由来するＣＤ４１＋ＭＫ細胞の数は、生細胞（トリパンブルー排除法）の総数とＣＤ４１ａ＋細胞の割合（ＦＡＣＳ分析）を乗算することにより計算した。ｈＥＳＣからＭＫへの総増殖倍数は、全てのＥＢ細胞又はＢＣがその後の培養に使用された訳ではないため、ＥＢ、ＢＣ、及びＭＫ培養までの各ステップの増殖倍数を乗算することにより計算した。
【０１００】
実施例２２
ｈＥＳＣ−ＭＫからの機能的血小板の生成
無血清及び無フィーダーＭＫ培養で４日目から開始して、およそ１〜２％のＭＫが、胞体突起様細胞プロセスを形成することが観察された（図８Ｅ）。機能的な血小板が無フィーダー条件下で生成されたか否かを検査するために、本発明者らは、ＦＡＣＳ分析により、ｈＥＳＣ由来血小板（ｈＥＳＣ−ＰＬＴ）上でのＣＤ４１ａ／ＣＤ４２ｂ発現を検査した。本発明者らの結果は、無フィーダー条件下で生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴ（血液血小板対照の前方散乱及び側方散乱パターンに従ってゲート制御された）の大多数が、ＣＤ４１ａを発現したことを示した。しかしながら、これらのｈＥＳＣ−ＰＬＴの５％未満が、ＣＤ４２ｂ陽性だった。最近の研究は、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＧＭ６００１が、マウスＥＳＣ由来血小板上でのＣＤ４２ｂの発現を著しく増加させたことを示した^３５。ヒトＥＳＣ−ＰＬＴ分化の後期中にＧＭ６００１（１００μＭ）を補完することにより、ＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂ二重陽性ｈＥＳＣ−ＰＬＴが、約１５％に増加した。無フィーダーで生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴの機能を、固定化されたフィブリノゲン及びｖＷＦ上のインテグリン依存性伸展アッセイにより評価した。抗ヒトＣＤ４１ａ抗体及びＤＡＰＩ染色を使用して、血小板を特定した。無フィーダーで生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴは、フィブリノゲン及びｖＷＦをコーティングした表面上に伸展することができ（図１１）、これらのｈＥＳＣ−ＰＬＴが生体外で機能的であることを示した。
【０１０１】
ＯＰ９又はＣ３Ｈ １０Ｔ１／２マウス間質細胞は、生体外血小板生合成を支援することが示された。ＯＰ９間質細胞との共培養が、ｈＥＳＣ−ＭＫからの機能的血小板の産生を促進したか否かを試験した。ＨｕＥＳ−３、ＭＡ０１、及びＭＡ０９細胞から生成されたＭＫを、以前に記述されているように^１６、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びヘパリンで補完された同じ培地中の有系分裂的に停止されたＯＰ９細胞に播種した。胞体突起形成細胞及びｈＥＳＣ−ＰＬＴが、ＯＰ９間質層への播種後４日以内に出現した。ｈＥＳＣ−ＰＬＴを、６日目から１２日目まで２日毎に培地から収集し、ＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂ発現について分析した。無間質条件下で生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴとは対照的に、大多数のＣＤ４１ａ＋ｈＥＳＣ−ＰＬＴも、ＣＤ４２ｂを発現した（図８Ｆ、右パネル）。
【０１０２】
無フィーダー条件下で生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴと同様に、ＯＰ９細胞共培養で産生されたｈＥＳＣ−ＰＬＴは、フィブリノゲンをコーティングした表面（図９Ｂ）及びｖＷＦをコーティングした表面に接着及び伸展した。ＲＧＤＳペプチドは、血小板インテグリン受容体に対するフィブリノゲン結合を阻止し、フィブリノゲンをコーティングした表面へのヒト血液血小板及びｈＥＳＣ−ＰＬＴの両方の接着及び伸展を消失させた（図９Ｂ）。ファロイジン染色は、ヒト血液血小板での形成と同様に（図９Ａ）、ＡＤＰ及びトロンビンで刺激されたｈＥＳＣ−ＰＬＴでのＦ−アクチンストレス線維の形成を示した（図９Ｂ）。無フィーダー条件下で又はＯＰ９間質細胞上で生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴのサイズは、ヒト血液血小板よりもわずかに大きく、マウスＥＳ細胞を用いて生体外で生成された血小板と類似する^３５。
【０１０３】
ＯＰ９共培養でＨｕＥＳ−３から生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴも、血小板の主要アゴニスト、トロンビンによる活性化について試験した。フィブリノゲン模倣体としてのＰＡＣ−１モノクローナル抗体は、活性化形態のインテグリンαＩＩｂβ３受容体にのみ結合する。トロンビン刺激時に、ＰＡＣ−１結合アッセイを、ＯＰ９共培養から生成されたｈＥＳＣ−ＰＬＴに対して実施した。トロンビン処理ｈＥＳＣ−ＰＬＴでのＰＡＣ−１結合は、休止対照と比較しておよそ５倍数増加した（図８Ｇ）。トロンビン刺激後のＰＡＣ−１結合の増加は、末梢血小板対照の増加よりも弱いが（ｈＥＳＣ−ＰＬＴの２４．８％対血液血小板の５８．６％、図１２）、Ｔａｋａｙａｍａらにより以前に報告されたｈＥＳＣから生成された血小板と類似している^１６。２つの臨床グレードｈＥＳＣ系統、ＭＡ０１及びＭＡ０９に由来するｈＥＳＣ−ＰＬＴも、ＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂ抗原を発現し（図１３Ａ）、トロンビン刺激に応答してＰＡＣ−１に結合することができた（図１３Ｂ）。また、ｈＥＳＣ−ＰＬＴは、それらの表面にＨＬＡクラスＩ抗原を発現した（図１３Ｃ）。
【０１０４】
実施例２３
ｈＥＳＣ−ＰＬＴは、微小凝集体形成及びクロット形成／退縮に寄与する
損傷血管壁への血小板接着は、血小板インテグリンαＩＩｂβ３の活性化に結び付くシグナル伝達カスケードを開始させる。活性化インテグリンは、血小板凝集及び血栓形成を媒介する^４５。アゴニスト誘導性凝集を形成するそれらの能力、血小板の重要な機能を検査するために、ｈＥＳＣ−ＰＬＴを緑色蛍光染料で標識し、ヒト血液血小板と混合した。撹拌条件下でのトロンビン刺激に応答して、ｈＥＳＣ−ＰＬＴ及び血液血小板による微小凝集体の形成が、位相差及び蛍光顕微鏡法を使用して示された（図９Ｄ）。標識ｈＥＳＣ−ＰＬＴは、ヒト血液血小板と一緒に微小凝集体に組み込まれた。これらの微小凝集体におけるｈＥＳＣ−ＰＬＴの分布は、蛍光染料で標識された同数の血液血小板の分布と類似していた（図９Ｃ）。これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＰＬＴが、アゴニスト誘導性微小凝集体形成においてヒト血液血小板と一緒に作用することを示す。
【０１０５】
血管損傷部位では、活性化された血小板が、血漿フィブリノゲンから生成されたフィブリンと相互作用し、血栓形成及び血餅退縮に結び付く^４６。血餅形成及び退縮を促進するそれらの能力を検査するために、ｈＥＳＣ−ＰＬＴを血小板枯渇血漿に懸濁し、トロンビンを添加してクロット形成及び退縮を誘導した。追加的な血小板の補完をしない血小板枯渇血漿中では、１時間を超えるトロンビン刺激でさえクロットは形成されなかった。対照的に、血小板枯渇血漿へのｈＥＳＣ−ＰＬＴの添加は、トロンビン刺激後の３０分未満でクロット形成及び退縮に結び付いた（図９Ｅ、左パネル）。ｈＥＳＣ−ＰＬＴ血栓の凍結切片の免疫蛍光染色は、ヒト血液血小板で形成されたクロット切片と同様に（図９Ｆ）、フィブリン及びＣＤ４１ａの両方に陽性染色されたメッシュ様ネットワークを示した（図９Ｅ、右パネル）。これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＰＬＴが、フィブリンクロット形成を促進し、小型の血小板栓を形成するインテグリンαＩＩｂβ３依存性収縮能力を有することを示す。
【０１０６】
実施例２４
ｈＥＳＣ−ＰＬＴは、生存マウスのレーザー誘導性細動脈損傷部位で、発生中の血小板血栓に組み込まれる
ｈＥＳＣ−ＰＬＴが生体内で機能的か否かを決定するために、本発明者らは、生存マウスでの蛍光生体顕微鏡法を実施した。精巣挙筋細動脈を、ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔレーザアブレーションにより損傷させた。以前に記述されているように^４７、マウス血小板血栓が急速に形成され、Ｔｍａｘは血管損傷の７０〜９５秒後だった。ヒト末梢血小板、５〜１０×１０^５個を損傷後に注入したところ、４１．０±２．８の循環血小板が、微小循環中で検出された（図１０Ｂ）。それらの中で、６．４±１．１の血小板が、血管損傷後のＴｍａｘ（７３秒）で血管損傷部位にて、発生中のマウス血小板血栓に組み込まれた（図１０Ａ及び１０Ｃ、ビデオ１（非表示））。発生中のマウス血小板血栓へのヒト血液血小板の組み込みが、αＩＩｂβ３インテグリンにより媒介されることを確認するために、ＲｅｏＰｒｏ（ヒト血小板上のαＩＩｂβ３インテグリンに結合し、その機能を阻害するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体のＦａｂ断片）^４８を用いて、注入前にヒト血小板を前処理した。循環血小板の数は、ＲｅｏＰｒｏにより有意には影響を受けなかったが（３２．４±４．４、図１０Ｂ）、発生中の血小板血栓に結合するヒト血小板の数は、ＲｅｏＰｒｏによる処置により、血管損傷後のＴｍａｘ（６７秒）で１．６±０．５に有意に低減された（図１０Ａ及び１０Ｃ、ビデオ２（非表示）、Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ヒト血小板が、血管損傷部位で、発生中のマウス血小板血栓に結合し、そのような結合がαＩＩｂβ３インテグリンにより媒介されることを示す。ＲｅｏＰｒｏは、血管損傷部位でのマウス血小板血栓形成に影響を及ぼさなかった。
５〜１０×１０^５個のｈＥＳＣ−ＰＬＴを血管損傷後に注入したところ、３４．８±１．７の循環血小板が、微小循環中で検出された（図１０Ｂ）。それらの中で、４．３±０．７の血小板が、損傷後のＴｍａｘ（７２秒）で血管損傷部位にて、成長中のマウス血小板血栓に組み込まれた（図１０Ａ及び１０Ｃ、ビデオ３（非表示））。損傷部位で発生中のマウス血小板血栓に組み込まれるヒト血液血小板及びｈＥＳＣ−ＰＬＴの数は、統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．２８）。ＲｅｏＰｒｏによるｈＥＳＣ−ＰＬＴの前処理は、マウス血小板血栓に組み込まれた血小板の数を、血管損傷後のＴｍａｘ（９９秒）で１．２±０．４に有意に低減された（図１０Ａ及びＣ、付録ビデオ４、Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＰＬＴが、正常対照血液血小板のように、生体内の血管損傷部位で機能的であることを示す。
【０１０７】
実施例２５
動物
雄野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６〜８週齢）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（バーハーバー、メーン州）から購入した。イリノイ大学の施設内動物実験委員会は、全ての動物管理および実験手順を承認した。
【０１０８】
実施例２６
ｈＥＳＣから血管芽細胞／ＢＣを介したＭＫの生成
ｈＥＳＣ系統（ＨｕＥＳ−３、Ｈ７［ＷＡ０７］、ＭＡ０１、及びＭＡ０９）からの血管芽細胞／ＢＣ生成を、以前に報告されているように実施した^{１７；２０}。６〜８日目の培養物に由来するＢＣを精製し、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）で補完されたＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地に播種して（１〜５×１０^５個／ｍｌ）、ＭＫへのＢＣ分化を誘導した。ＭＫ培地の半分を、２日又は３日毎に新しい培地と交換した。ＭＫからの血小板生成は、無フィーダー条件下で、又はＯＰ９若しくはＣ３Ｈ １０Ｔ１／２間質細胞との共培養で実施した。無フィーダー条件の場合、４〜６日目のＭＫ培養物に由来するＭＫを収集し、記述されているように^１６、１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び２５単位／ｍｌのヘパリンナトリウムで補完されたＩＭＤＭ培地に再懸濁し、２日毎に新しくした。血小板を、４日目から１２日目まで分析用に収集した。幾つかの実験では、ＧＭ６００１（１００μＭ）を後期分化培養物に添加した。共培養実験の場合、ＯＰ９又はＣ３Ｈ １０Ｔ１／２間質細胞を、１５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を有するα−ＭＥＭ中で維持した。コンフルエントなＯＰ９又はＣ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞を、共培養の前日に１００ｎｇ／ｍｌマイトマイシンＣで処理した。細胞をＰＢＳで穏やかに２回洗浄し、共培養の前にＯＰ９培地中で一晩回復させた。４〜６日目のＭＫ培養物に由来するＭＫを収集し、上述のよう培地を有するＯＰ９又はＣＨ１／２間質細胞上に播種した。血小板を、４日目から１２日目まで分析用に収集した。
【０１０９】
実施例２７
ＦＡＣＳ分析
芽球培養またはＭＫ培養に由来する細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）またはＡｃｃｕｒｉ Ｃ６血球計算器（Ａｃｃｕｒｉ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ社製）でフローサイトメトリー分析により日常的にモニターする。系列マーカー、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、及びＣＤ２３５ａに対する蛍光色素結合抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、ＭＫ及び赤血球系列を特徴付けた。抗体は、５％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を有するＰＢＳ緩衝液で新しく調製した（ＣＤ４２ａ及びＣＤ４２ｂ抗体の場合は１：１００希釈、ＣＤ４１ａ抗体の場合は１：２５０希釈、ＣＤ２３５ａ抗体の場合は１：２０００）。典型的には、１〜２×１０^５細胞を抗体標識に使用した。細胞を氷上で１時間１００μｌ抗体混合液中で染色し、その後緩衝液で２回洗浄し、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムで補完された２５０μｌ緩衝液に再懸濁した。ＨＬＡ−ＡＢＣの発現レベルを検出するために、血小板を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体又は対照としてのＦＩＴＣ結合マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と共にインキュベートした。その後、試料を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析し、データを、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ又はＦｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。細胞選別は、ＵＭＡＳＳメディカルスクールコア施設のＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａシステムで実施した。選別した細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより収集し、コロニー形成アッセイに適切な培地に再懸濁した。倍数性分析の場合、４日目のＭＫ培養物に由来する細胞を、７０％エタノール中で２時間固定した。その後、細胞をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した後で、ＰＢＳ緩衝液中２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）で一晩４℃にて染色した。細胞内ＤＮＡ含有量を、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６血球計算器で分析した。
【０１１０】
実施例２８
サイトスピン調製、ギムザ染色、及び免疫蛍光染色
芽球培養又はＭＫ培養のいずれかに由来する細胞（１〜２×１０^４個）を、ポリリシンでコーティングしたスライド（Ｗｅｓｓｃｏ）にサイトスピンした。スライドを、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ（Ｓｉｇｍａ社製）又は免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｒｏｓｃｅｎｔ）染色のいずれかに使用した。抗ＣＤ４１（ＤＡＫＯ社製、１：１００）及び抗ｖＷＦ（ＤＡＫＯ社製、１：２００）抗体を、サイトスピン調製でＭＫを特定するために使用した。インキュベーションは全て室温で実施した。細胞を、無動物性ブロッカー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で３０分間ブロッキングし、一次抗体と共に１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。その後のインキュベーション及び洗浄は、暗所で実施した。細胞を、二次抗体（各々、１：２００）と共に３０分間インキュベートし、再度ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ中のＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を使用して核ＤＮＡを５分間染色し、その後追加的な３×ＰＢＳ洗浄を行った。その後、スライドをオリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡（ＭＶＩ社、エーボン、マサチューセッツ州）にマウントし、検査した。蛍光画像を、ＱＩＣＡＭ Ｆａｓｔカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ社製、サリー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を使用して取り込み、Ｑ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｒｏバージョン５．１ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製、ベセスダ、メリーランド州）で分析した。Ｎｉｋｏｎ社製顕微鏡、ＰＡＸＣＡＭデジタルカメラ、及びＰＡＸ−ｉｔソフトウェアを使用して、位相差生細胞画像を取り込んだ。
【０１１１】
実施例２９
ヒト血液血小板及びｈＥＳＣ由来血小板の調製
ヒト血小板を、以前に記述されているように単離した^４９。手短に言えば、クエン酸ナトリウムで処理したヒト血液を２００ｇで２０分間遠心分離することにより、ヒト血小板豊富な血漿を調製した。上清を収集し、０．５μＭ ＰＧＥ１及び１０％クエン酸ナトリウム緩衝液の存在下で１０分間７００ｇで遠心分離した。ペレットを、０．１５μＭ ＰＧＥ１を含有するＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液（１２ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５．５ｍＭグルコース、２．９ｍＭ ＫＣｌ、０．４２ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に再懸濁し、８００ｇで５分間遠心分離した。ペレットを、０．１％無脂肪酸ウシ血清アルブミン、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有するＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。洗浄した血小板の最終懸濁物を、１×１０^７血小板／ｍｌに調節した。血液試料を取得する承認は、イリノイ大学−シカゴ審査委員会から得た。インフォームドコンセントが与えられた。幾つかの実験では、ヒト血液試料を、商業的供給源（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社、エメリービル、カリフォルニア州）からも取得した。ｈＥＳＣ−ＰＬＴの場合、ｈＥＳＣ−ＰＬＴを含有する培地を穏やかに収集し、アピラーゼ（１Ｕ／ｍｌ）及びＥＤＴＡ（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）を添加して、血小板活性化を防止した。ｈＥＳＣ−ＰＬＴを、上述のように濃縮及び洗浄した。洗浄した血液血小板及びｈＥＳＣ−ＰＬＴを、機能性アッセイの前に０．５〜２時間３７℃でインキュベートした。
【０１１２】
実施例３０
固定化されたフィブリノゲン及びｖＷＦ上での血小板の伸展
マイクロタイターウエルを有するチャンバースライド（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ社製、ロチェスター、ニューヨーク州）を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．３）中の１００μｇ／ｍＬフィブリノゲン又はｖＷＦ（３０ｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）で、一晩４℃でコーティングした。洗浄したヒト血液血小板又はｈＥＳＣ−ＰＬＴ（１×１０^７個／ｍＬ）を、フィブリノゲンでコーティングしたウエルに９０分間３７℃で付着及び伸展させた。幾つかの実験では、血小板を、インテグリンアンタゴニスト、ＲＧＤＳペプチドと共に、負荷前に５分間プレインキュベートした。他の実験では、血小板を、ＡＤＰ（２０μＭ）又はトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）と混合し、フィブリノゲン又はｖＷＦでコーティングしたウエルに直ちに負荷した。ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、細胞を固定し、透過処理し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製、ユージーン、オレゴン州）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４１ａ抗体（Ｄａｋｏ ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製、カーピンテリア、カリフォルニア州）、及びＤＡＰＩで染色した。付着血小板を、１００×／１．４０オイル対物レンズのＰｌａｎＡｐｏレンズを使用して、オリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡で観察した。画像を、ＱＩＣＡＭ Ｆａｓｔカメラを使用して取得し、Ｑ Ｃａｐｔｕｒｅ バージョン５．１ソフトウェアで処理した。
【０１１３】
実施例３１
血小板微小凝集体の形成
洗浄したヒト血液血小板及びｈＥＳＣ−ＰＬＴを、改変タイロード緩衝液に再懸濁し、ＰＫＨ６７緑色蛍光細胞リンカー（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ社製、セントルイス、ミズーリ州）で標識した。ヒト血液血小板（６×１０^７個）を、４５０μｌキュベット（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ社製、ヘイバータウン、ペンシルベニア州）中で、蛍光標識したヒト血液血小板（３×１０^５個）又はｈＥＳＣ−ＰＬＴ（３×１０^５個）と混合し、トロンビン（０．５Ｕ／ｍＬ）で処理し、１２００ｒｐｍ、３７℃で撹拌して血小板凝集を開始させた。対照実験では、トロンビンを添加する前に、血小板をＲＧＤＳペプチドと共に５分間３７℃でプレインキュベートし、凝集アッセイを上記のように実施した。５０μＬ緩衝液中の血小板微小凝集体を、スライドガラスに塗布し、オリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡で視覚化した。
【０１１４】
実施例３２
ＰＡＣ−１結合アッセイ
トロンビン刺激（１Ｕ／ｍｌ、室温で２０分間のインキュベーション）をした又はしなかったヒト血液血小板又はｈＥＳＣ−ＰＬＴを、改変タイロード緩衝液中のＡＰＣ結合ＣＤ４１ａ、ＰＥ結合ＣＤ４２ｂ、及びＦＩＴＣ結合ＰＡＣ−１抗体で染色した。その後、試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して分析した。前方散乱及び側方散乱ゲーティングを、ヒト血液血小板を対照として使用して決定した。フローサイトメトリーデータは、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ又はＦｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。
【０１１５】
実施例３３
クロット形成及び退縮
ヒト血液血小板又はｈＥＳＣ−ＰＬＴ（約１．５×１０^７個／ｍｌ）を、シリコン処理したガラス管（Ｋｉｍｂｌｅ Ｃｈａｓｅ社製、バインランド、ニュージャージー州）中の５０μＬ血小板枯渇血漿に再懸濁した。トロンビン（２Ｕ／ｍｌ）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を細胞に添加して、クロット形成及び退縮を誘導した。クロットを３７℃で１時間退縮させ、画像を撮影した。クロットを、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物及びＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｃｒｙｏｍｏｌｄｓ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社製、トランス、カリフォルニア州）に埋込み、その後ドライアイスで凍結した。１０μｍのクロット切片を、凍結ミクロトームＭｉｃｒｏｍ ＨＭ５６０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カラマズー、ミシガン州）を使用して製作した。
【０１１６】
スライドをメタノール／アセトン（１：３）で３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１５ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５で透過処理した。５％ＢＳＡでブロッキングし洗浄した後、切片を、ウサギ抗ヒトインテグリンαＩＩｂ（クローンＨ−１６０）及びマウス抗ヒトフィブリン（クローンＵＣ４５）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、サンタクルーズ、カリフォルニア州）で免疫染色した。その後、切片を、ローダミンに結合された１：２００の二次抗ウサギＩｇＧ抗体及びＦＩＴＣに結合された抗マウスＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ社製）中で１時間インキュベートした。上述のように画像を撮影した。
【０１１７】
実施例３４
生体顕微鏡法
精巣挙筋微小循環の広視野多チャンネル生体顕微鏡法を、以前に記述されているように実施した^{４７；５０}。ケタミン（１２５ｍｇ／ｋｇ、Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ベッドフォード、オハイオ州）及びキシラジン（２５ｍｇ／ｋｇ、Ａｋｏｒｎ Ｉｎｃ．社製、ディケーター、イリノイ州）の腹腔内注射により、雄マウスに麻酔をかけた。気管チューブを挿入し、マウスを温度制御毛布（３７℃）に配置した。麻酔を維持するために、頚静脈に設置したカニューレ（ｃａｎｎｕｌｕｓ）で、ケタミン及びキシラジン溶液５０μｌを３０分毎に投与した。更に、１０Ｕ／ｍｌヘパリンを含有する生理食塩水で満たされたカニューレを、大腿動脈に設置した。陰嚢を切開した後、精巣挙筋を生体顕微鏡トレーに肱置した。筋肉調製物を、温度調節し（３７℃）通気した（９５％Ｎ_２、５％ＣＯ_２）重炭酸緩衝生理食塩水を用いて、実験の全体にわたって表面還流した。
【０１１８】
精巣挙筋細動脈壁を、以前に記述されているように^４７、Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔレーザーシステム（Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、サウスウィンザー、コネティカット州）を使用してレーザアブレーションにより損傷した。発生中のマウス血小板血栓を、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９標識抗ＣＤ４２（Ｅｍｆｒｅｔ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社製、体重１ｇ当たり０．０５μｇ）の注入によりモニターした。１回又は２回のパルスを血管壁内側でアブレーションさせて、血小板血栓形成を開始させた。カルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で標識されたヒト血液血小板又はｈＥＳＣ−ＰＬＴ、５０〜１００μｌ（５〜１０×１０^５血小板）を、血管損傷の直後に大腿動脈カニューレで注入した。１匹のマウス中で複数の血栓を研究し、より初期の血栓の上流に沿って新しい血栓を形成させ、以前に生成された血栓からのあらゆる寄与を回避した。以前に注入された標識ヒト血小板が完全に除去された後で、新しい血栓を生成した。２〜３個の血栓を生成した後、ＲｅｏＰｒｏ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ社製）、２００μｌ中２×１０^６個のヒト血小板毎に２０μｇで前処理した標識ヒト血小板５０〜１００μｌを、血管損傷後に同じマウスに注入した。別の２〜３個の血栓を生成した。ヒト血液血小板及びｈＥＳＣ−ＰＬＴを、異なるマウスで研究した。６０×対物レンズを備えたオリンパスＢＸ６１ＷＩ顕微鏡を使用して、微小血管データを得た。デジタル画像は、倍増管（Ｖｉｄｅｏ Ｓｃｏｐｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、ダレス、バージニア州）により高速デジタルカメラ（ｃａｍａｒａ）（Ｈａｍａｍａｔｓｕ社製Ｃ９３００）で取り込んだ。蛍光画像は、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ ｖ５．０（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社製、デンバー（Ｄｅｎｖｏｒ）、コロラド州）を使用して分析した。蛍光画像は、１０〜１００ミリ秒の露光時間で取り込み、明視野画像は、２０ミリ秒の露光時間で取り込んだ。データは、血管壁損傷後３分間収集した。画像分析を単純化するために、各擬似カラーの強度のダイナミックレンジを２値化した。微小血管を循環し、血管損傷部位で、発生中のマウス血小板血栓に組み込まれたヒト血小板の数を、血管損傷後３分間計数した。
【０１１９】
実施例３５
統計分析
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を使用して、２群を比較するためにスチューデントｔ検定により統計的に分析した。違いは、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１２０】
実施例３６
血管芽細胞から生成された血小板の密度遠心分離を使用した血小板精製法
ＭＫ分化培養に由来する血小板は、ＣＤ４１ａ陰性である粒子を含んでいる。これらの粒子は、ＭＫ分化培養に由来する粒子の最大５０％を構成する場合があり、血小板調製物の純度を増加させることが望ましい。低粘性パーコール培地等の、生存能及び形態学的完全性（ｉｎｄｅｎｓｉｔｙ）を保存する培地を使用した密度遠心分離法を使用して、血小板からＣＤ４１ａ陰性粒子を分離した。ＰＡＣ−１結合及びインテグリン活性化の能力を無効にせずに、薄層に分離されたヒト末梢血小板を、ＣＤ４１ａ陰性粒子から取り出した。
【０１２１】
本発明の種々の実施形態は、発明を実施するための形態に記述されている。これらの説明は、上記の実施形態を直接記述するが、当業者であれば、本明細書に表示及び記述されている特定の実施形態の改変及び／又は変異を企図することができることが理解される。本説明の範囲以内にあるあらゆるそのような改変又は変異も同様に本説明の範囲に含まれることが意図される。特別な注記がない限り、本明細書及び特許請求の範囲にある単語及び語句には、該当する技術分野（複数可）の当業者にとって通常の習慣的な意味が与えられることが、本発明者らの意図である。
【０１２２】
本出願の出願時に出願者に知られている本発明の種々の実施形態の先術の説明が示されており、それは、例示及び説明のためであることが意図されている。本説明は、網羅的であることも、開示された詳細な形態に本発明を限定することも意図されておらず、上記の教示に照らして多数の改変及び変異が可能である。記載された実施形態は、本発明の原理及びその実用的応用を説明し、他の当業者が、企図した特定の使用に好適なように種々の改変を施して、本発明を種々の実施形態で使用することを可能にする役目を果たす。従って、本発明は、本発明を実施するための開示された特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態が表示及び記述されているが、当業者であれば、本明細書の教示に基づき、本発明及びそのより広範な態様から逸脱せずに変更及び改変を為すことができることは明らかであり、従って添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲内にあるそのような変更及び改変を全て、それらの範囲に包含することになる。本明細書で使用されている用語は、一般的に「非限定的」な用語であると意図されていることが、当業者により一般的に理解されるだろう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「〜を含むが、限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「〜を少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「〜を含むが、限定されない」と解釈されるべきである等）。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球を生成する方法であって、
血管芽細胞を準備すること、及び
前記血管芽細胞を培養して、巨核球（ＭＫ）へと分化させることを含む方法。
【請求項２】
前記血管芽細胞が、生体外で多能性幹細胞から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
多能性幹細胞の前記分化が、前記多能性幹細胞を解離すること、並びにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地で前記多能性幹細胞を培養して、胚様体（ＥＢ）を形成することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦを含み、前記多能性幹細胞の培養が、ＥＢを形成するために約４８時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＭＰ−４の濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＶＥＧＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記形成されたＥＢを、化学的に及び／又は機械的に解離し、前記培養培地の少なくとも一部を、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と交換して、前記血管芽細胞を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ｂＦＧＦの濃度が、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯが、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、Ｆｌｔ３リガンドが、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記解離されたＥＢを、芽球コロニー増殖培地中で約３〜４日間培養して、前記血管芽細胞を生成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、ＩＬ６、エストラジオール、ビタミンＢ３、１つ又は複数の細胞外マトリックスタンパク質、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｉＰＳＣが、ヒト由来の体細胞から誘導される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記体細胞が、成体組織に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記体細胞が、胎児（仔）組織に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地である、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管芽細胞の前記ＭＫへの分化が、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地中で、約２〜８日間培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＰＯの濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１１が、２０ｎｇ／ｍｌである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と２〜３日毎に交換して、前記血管芽細胞を前記ＭＫへと分化させることを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地が、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９に記載の方法のいずれかから生成される、ある量の巨核球。
【請求項２１】
血小板を生成する方法であって、
巨核球（ＭＫ）を準備すること、及び
前記ＭＫを培養して、血小板へと分化させることを含む方法。
【請求項２２】
前記ＭＫが、血管芽細胞から分化する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血管芽細胞の前記ＭＫへの分化が、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地中で、約２〜８日間培養することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＰＯの濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１１が、２０ｎｇ／ｍｌである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と２〜３日毎に交換して、前記血管芽細胞を前記ＭＫへと分化させることを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記血管芽細胞が、生体外で多能性幹細胞から分化する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記多能性幹細胞の分化が、前記多能性幹細胞を解離すること、並びにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地で前記多能性幹細胞を培養して、胚様体（ＥＢ）を形成することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記培地が、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦを含み、前記多能性幹細胞の培養が、ＥＢを形成するために約４８時間である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＢＭＰ−４の濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＶＥＧＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
形成された前記ＥＢを、化学的に及び／又は機械的に解離し、前記培養培地の少なくとも一部を、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と交換して、前記血管芽細胞を生成する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｂＦＧＦの濃度が、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯが、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、Ｆｌｔ３リガンドが、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
解離された前記ＥＢを、芽球コロニー増殖培地中で約３〜４日間養殖して、前記血管芽細胞を生成する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記培地が、ＩＬ６、エストラジオール、ビタミンＢ３、１つ又は複数の細胞外マトリックスタンパク質、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｉＰＳＣが、ヒト由来の体細胞から誘導される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記体細胞が、成体組織に由来する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記体細胞が、胎児（仔）組織に由来する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記培地が、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＫを、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地に再懸濁し、少なくと４日間培養して、前記血小板へと分化させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴＰＯの濃度が、１００ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、５０ｎｇ／ｍｌであり、ヘパリンナトリウムが、２５単位／ｍｌであり、ＩＬ１１が、２０ｎｇ／ｍｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも４日間の前記ＭＫ培養後に、ＧＭ６００１又はＩＬ３を添加することを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と、少なくとも２日毎に交換することを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記培地が、ＩＭＤＭ培地である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＭＫを解離し、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地中の、有糸分裂的に停止されたフィーダー層上で少なくとも４日間培養して、前記血小板へと分化させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項４７】
前記フィーダー層が、ＯＰ９細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フィーダー層が、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも４日間の前記ＭＫ培養後に、ＧＭ６００１又はＩＬ３を添加することを更に含む、請求項４６に記載の方法
【請求項５０】
前記培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と、少なくとも２日毎に交換することを更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記培地が、ＩＭＤＭ培地である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
請求項２１〜５１に記載の方法のいずれかから生成される、ある量の血小板。
【請求項５３】
前記血小板が、前記血小板を対象体に投与した際に、前記対象体においてＨＬＡ同種免疫原性反応に寄与しない溶液中で保管される、請求項５２に記載の血小板。
【請求項５４】
前記血小板が、アピラーゼ及び／又はＥＤＴＡの存在下で活性化されない、請求項５２に記載の血小板。
【請求項５５】
細胞分化の修飾因子をスクリーニングする方法であって、
ある量の巨核球（ＭＫ）を準備すること、
前記ＭＫを試験化合物と接触させること、及び
前記ＭＫと前記試験化合物との接触に由来する機能的効果の存在又は非存在を決定することを含み、
前記機能的効果の存在が、前記試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成、血小板新生、及び／又は造血因子であることを示し、前記機能的効果の非存在が、前記試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成、血小板新生、及び／又は造血因子でないことを示す方法。
【請求項５６】
血小板輸血を必要とする対象体を治療する方法であって、
ある量の血管芽細胞を準備すること、
前記血管芽細胞を培養して、巨核球（ＭＫ）へと分化させること、
前記ＭＫを生体外で培養して、血小板へと分化させること、
ある量の前記生体外で分化した血小板を準備すること、及び
前記ある量の前記生体外で分化した血小板を、前記血小板輸血を必要とする前記対象体に投与して、それにより前記血小板輸血を必要とする対象体を治療することを含む方法。
【請求項５７】
前記生体外で分化した血小板を前記対象体と一致させて、免疫媒介性宿主反応を低減又は排除する、請求項５６に記載の方法。

【図１−２】

【図２−１】

【図３】

【図４−１】

【図５−１】

【図５−２】

【図６】

【図７−２】

【図８−３】

【図１０−２】

【図１２】

【図１３−１】

【図１３−２】

【図１３−３】

【図１−１】

【図２−２】

【図４−２】

【図７−１】

【図８−１】

【図８−２】

【図９−１】

【図９−２】

【図９−３】

【図１０−１】

【図１１】

【公表番号】特表２０１３−５１２６７６（Ｐ２０１３−５１２６７６Ａ）
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２２３０（Ｐ２０１２−５４２２３０）
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８９９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６９１２７
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５１２１４４８７４）ステム　セル　アンド　リジェネレイティブ　メディスン　インターナショナル，　インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】