焼きパンの製造における老化防止酵素混合物の使用
【課題】老化の防止されたパンの製造方法を提供する。
【解決手段】デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって、穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは最適温度が５０℃を超える）と、ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼとを含む２種以上の酵素の組み合わせを前記生地に持ち込む。マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの組み合わせは、非常に有効な老化防止剤である。
【解決手段】デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって、穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは最適温度が５０℃を超える）と、ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼとを含む２種以上の酵素の組み合わせを前記生地に持ち込む。マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの組み合わせは、非常に有効な老化防止剤である。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
発明の詳細な説明
発明の技術分野
本発明は、焼きパンの老化防止に関する。より詳細には、本発明は、このような老化を防ぐための、マルトース生成型アミラーゼとアミログロコシダーゼとを含む酵素混合物の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
焼き食品（パンなど）の老化はよく知られた問題である。老化、または「老化してくる」とは、焼き食物におけるそのおいしさを減少させる化学的および物理的過程である。老化は、パンの中身の硬さの増加、パンの中身芯の弾性または弾力性の低下、およびパンの外皮が硬くなり革のようになる変化としてはっきりと表れるようになる。老化の最も重要な側面であると考えられるパンの中身の硬さの増加は、パン製品が別の面で消費に不適当となるよりはるかに前に、消費者に気付かれる。
【０００３】
老化は、一般に考えられるように、水の蒸発に起因する単なる乾ききり過程ではない。パンは、湿った環境中でも老化する傾向があり、凍結温度のすぐ上の温度では最も急速に老化する。老化の正確な機構は依然として知られていないが、１つの重要な機構は、デンプン顆粒から間隙空間への水分の移動、ならびにデンプンのアミロースおよびアミロペクチン分子の再編成であると思われる。デンプン分子の再編成の過程は、老化と呼ばれる。老化の際、デンプン顆粒中に元々存在するものと同様の結晶様構造が形成することがあり、その過程は再結晶化と呼ばれる。老化は通常、パンの中身のテクスチャが硬くなり、弾力性が低下した、老化したパンをもたらす。
【０００４】
デンプンは、焼き食品の必須成分である。焼きプロセスの間に、デンプンはゼラチン化し、大量の水を吸収する；その一方、タンパク質は変性する。焼いた直後、デンプンは老化し始める。パン芯の硬さは増加するが、これは最初の数時間ではまだ利点と見なされる。特に、パンの中身の切りやすさと咀嚼特性はこの期間中に改善される。
【０００５】
さらなる保存中に、非分枝状デンプン画分であるアミロースが最初に老化した後、デンプンの分枝状画分であるアミロペクチンが老化すると推測される。同時に、パン芯はより硬くなり、時間の経過と共にますます弾性が低くなり、最終的には乾燥し、硬くなる、すなわちパンは老化してしまう。さらに、保存中に、パンの外皮はパリパリした食感を失い、革のようになる。これは、水が老化により放出され、パンの中身からパンの外皮に外に向かって拡散した結果であると推測される。
【０００６】
これらの老化現象の全てに関する原因的な重要反応がデンプン老化であることは明白である。この現象を抑制または回避することが、多数の保護権および刊行物の主題である。
【０００７】
保存中にパンの中身がかなり固くなることを少なくとも部分的に防ぐための１つの戦略は、既に長い間知られている。すなわち、パンの中身を最初からより柔らかくすることである。これを行うための選りすぐりの手段は、モノグリセリド／ジグリセリドなどの乳化剤であり、これを生地に添加し、最初から特に柔らかいパンの身の構造を作り出す。Aspergillus oryzaeなどの真菌に由来するα−アミラーゼの使用は同様の効果を有する。それは損傷したデンプン粒子に対して作用し、それによって、生地の粘度を低下させ、発酵可能性糖を作り出す。その結果、出来上がった焼き上げ品の体積が増すが、これはより柔らかいパンの中身と一致する。新鮮なパンが柔らかいという事実は別として、この戦略は、パンの中身が老化する際の、より固く、より低い弾性のコンシステンシーの発現を防止しないか、または不十分に防止する。
【０００８】
さらなる戦略は、焼いている間に２つのデンプン部分の酵素媒介性部分的加水分解により老化を抑制させることである。パンの中身の酵素媒介性加水分解は、好ましくは、デンプンがゼラチン化した後に、すなわち、約６５℃超で起こるべきである。その結果、焼き製品中のデンプンの構造は根本的に変化し、老化する能力が制限される。デンプンの部分加水分解により生成された断片は、短すぎて再結晶化できず、残存する高分子量デンプンと結合することにより、再結晶化の速度が低下する。Bacillus由来の熱安定性マルトース生成型アミラーゼは、商標名Novamyl 10,000（登録商標）（Novozymes A/S、デンマークの製品）で市販されており、デンプンゼラチン化温度でデンプンを加水分解することにより老化を抑制させる能力のおかげで、老化防止剤として製パン工業において広く使用されている（WO91/04669）。Novamyl 10,000（登録商標）は、６０〜７０℃で最も活性が高い(Christophersen, C.ら、1997, Starch, Vol. 50, No. 1, 3945)。
【０００９】
焼きパン中の老化防止剤としてのマルトース生成型アミラーゼの使用にかなりの費用が伴うので、費用対効果のより高い老化防止剤が必要とされている。
【００１０】
発明の概要
本発明者らは、極めて有効であり、使用時コストが現行の酵素性老化防止剤、特に熱安定性マルトース生成型アミラーゼより低い、焼きパンのための酵素性老化防止剤を提供することができた。
【００１１】
本発明者らは、老化防止剤としての熱安定性マルトース生成型アミラーゼの有効性を、そのようなアミラーゼをアミログルコシダーゼと組み合わせることにより実質的に改善することができることを発見した。
【００１２】
したがって、本発明の一態様は、デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって、
・穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは、至適温度が５０℃を超える）と；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．００のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを生地に持ち込むことを含む方法に関する。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、上記の方法により得られる焼きパンに関する。
【００１４】
マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの組み合わせの使用は、WO 2011/039324に記載されている。この国際特許出願は、１種以上のマルトース生成型アルファ−アミラーゼと、１種以上の生デンプン分解酵素と、少なくとも１種の脂肪分解性酵素とを用いて蒸しパンを製造するために使用される生地を作製する工程を含む、蒸しパン組成物を調製するための方法を記載している。WO2011/039324のExamples 7〜10は、Opticake（商標） 50 BG（マルトース生成型アルファ−アミラーゼ）とTrametes（商標）AMG（生デンプン分解酵素）との組み合わせを使用する蒸しパンの製造を記載している。
【００１５】
さらに、Gerrardら(The Role of Maltodextrins in the Staling of Bread, Journal of Cereal Science 26(1997) 201〜209)は、パンの老化に対するアルファ−アミラーゼ（Novamyl（登録商標））の添加および／または非常に高レベルのグルコアミラーゼ（GA300N、Genencor）の添加の効果を精査した研究の結果を記載している。
【００１６】
凍結し、発酵した層状生地における熱安定性アミログルコシダーゼと非熱安定アミラーゼとの組み合わせの使用が、US5,589,207に記載されている。より詳細には、この米国特許は、６０℃の温度で不活性になる真菌アミラーゼを、約６０℃を超えても活性状態を維持するアミログルコシダーゼと組み合わせて用いることを教示している。この特許の例は、真菌アミラーゼFungamyl（登録商標）Mg 35000とアミログルコシダーゼAMG 300 MGとの組み合わせの使用を記載している。この米国特許では、熱安定性アミログルコシダーゼの使用が、酵母活性が利用可能でなくなった後の単糖類の形成を確保し、それにより、これらの単糖類がパンの外皮の着色反応に関与し得ると説明されている。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって：
・穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える）と；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを前記生地に持ち込むことを含む方法を提供する。
【００１８】
用語「マルトース生成型アミラーゼ」は、ここで使用する限りにおいて、ＩＵＰＡＣ分類番号がＥＣ ３．２．１．１．であり、マルトトリオースをマルトースとグルコースとに加水分解することができるデンプン分解酵素（グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ）を指す。
【００１９】
用語「アミログルコシダーゼ」は、ここで使用する限りにおいて、ＩＵＰＡＣ分類番号がＥＣ ３．２．１．３．であるもう１つのデンプン分解酵素を指す。アミログルコシダーゼ（または１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）は、アミロースとアミロペクチンとの非還元性末端の最後のα（１−４）グリコシド結合を切断してグルコースをもたらすだけでなく、α（１−６）グリコシド結合も切断する。
【００２０】
酵素の「至適温度」をここで参照する場合はいつでも、酵素活性が最も高い温度を意味する。マルトース生成型アミラーゼについては、至適温度はｐＨ５．０で好適に決定される。アミログルコシダーゼについては、至適温度はｐＨ４．２で好適に決定される。
【００２１】
酵素の「至適ｐＨ」は、酵素活性が最も高いｐＨである。至適ｐＨは、６０℃で好適に測定される。
【００２２】
マルトース生成型アミラーゼ活性の１単位（ＭＡＵ）は、３７℃でｐＨ５．０の０．１Ｍシトラートバッファー１ｍｌあたりマルトトリオース基質１０ｍｇの濃度で１秒あたりに１ナノモルのマルトースを放出させるのに必要な酵素の量と定義される。
【００２３】
アミログルコシダーゼ活性の１単位（ＡＧＵ）は、３７℃でｐＨ５．０の０．１Ｍシトラートバッファー１ｍｌあたりマルトース基質１０ｍｇの濃度で１秒あたりに１ナノモルのグルコースを放出させるのに必要な酵素の量と定義される。
【００２４】
本発明の方法は、様々な種類のアミログルコシダーゼを好適に用いることができる。好ましくは、用いられるアミログルコシダーゼは、Aspergillus、RhizopusまたはTalaromycesの真菌株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである。好適な真菌の例としては、Aspergillus niger、Rhizopus delemar、Rhizopus niveus、Rhizopus oryzaeおよびTalaromyces emersoniiが挙げられる。最も好ましくは、本発明に従って用いられるアミログルコシダーゼは、Aspergillus nigerの株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである。
【００２５】
本発明の方法において用いられるアミログルコシダーゼは、典型的には、至適ｐＨが１．５〜５．５の範囲内、特に、２．０〜４．５の範囲内にある。
【００２６】
有利には、アミログルコシダーゼは、穀粉１ｋｇあたり４０〜４０，０００ＡＧＵ、より好ましくは、穀粉１ｋｇあたり８０〜２３，０００ＡＧＵの量で生地中に持ち込まれる。別の表現をすれば、アミログルコシダーゼは、好ましくは、ＭＡＵ活性１単位あたり０．０５〜０．５０ＡＧＵの量、最も好ましくは、ＭＡＵ活性１単位あたり０．１０〜０．３０ＡＧＵの量で生地中に持ち込まれる。
【００２７】
本発明の方法において用いられるマルトース生成型アミラーゼは、好ましくは、至適温度が５２〜９０℃の範囲内、最も好ましくは、５５〜８５℃の範囲内にある。
【００２８】
マルトース生成型アミラーゼの至適ｐＨは、好ましくは、４．０〜７．５の範囲内、最も好ましくは、４．５〜７．０の範囲内にある。
【００２９】
本発明者らは、アミログルコシダーゼの至適温度がマルトース生成型アミラーゼの至適温度よりも実質的に低い場合でも、老化を非常に効果的に最小化することができることを見出した。好ましくは、アミログルコシダーゼの至適温度は、マルトース生成型アミラーゼの最適温度よりも少なくとも１０℃、より好ましくは少なくとも１２℃、最も好ましくは少なくとも１４℃低い。典型的には、アミログルコシダーゼの至適温度は、５５℃未満である。
【００３０】
本発明に従って用いられるマルトース生成型アミラーゼは、好ましくは、Bacillus株、最も好ましくはGeobacillus stearothermophilusの株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである。
【００３１】
マルトース生成型アミラーゼは、典型的には、穀粉１ｋｇあたり１，０００〜４０，０００ＭＡＵ、最も好ましくは、穀粉１ｋｇあたり１，５００〜７，５００ＭＡＵの量で生地中に持ち込まれる。
【００３２】
１つの好ましい態様によれば、本発明の方法において用いられるパン生地は、ライ麦粉／小麦粉混合生地である。別の好ましい実施形態によれば、パン生地は小麦粉生地である。
【００３３】
本発明の方法において、デンプン質生地は、典型的には、穀粉と、水と、酵母と、マルトース生成型アミラーゼと、アミログルコシダーゼと、任意の他の製パン成分とを組み合わせることにより調製される。マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの他に、本発明の方法は、α−アミラーゼ、キシラナーゼおよびプロテアーゼなどの他の食品等級酵素を用いてもよい。
【００３４】
デンプン質生地は、好ましくは、１８０℃を超える温度、より好ましくは２００℃を超える温度で焼く。生地が酵母含有生地である場合、生地を、好ましくは、焼く前に発酵させる。
【００３５】
本発明の方法の特に好ましい態様によれば、製パン改良剤を生地に持ち込むことによって生地を製造し、前記製パン改良剤は、
・乾燥物質１ｋｇあたり７，５００〜７５，０００，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える）と；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを含む。
【００３６】
上記製パン改良剤は、典型的には、穀粉の０．１〜１０重量％、特に、０．３〜５重量％の濃度でパン生地中で用いられる。
【００３７】
典型的には、アミログルコシダーゼは、乾燥物質１ｋｇあたり１００〜１２０，０００，０００ＡＧＵの量、さらにより好ましくは、乾燥物質１ｋｇあたり５００〜３０，０００，０００ＡＧＵの量、最も好ましくは、乾燥物質１ｋｇあたり７５０〜４，０００，０００ＡＧＵの量で製パン改良剤中に存在する。
【００３８】
マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの他に、本発明の方法において用いられる製パン改良剤は好ましくは、以下の製パン成分のうちの１種以上、より好ましくは２種以上、最も好ましくは３種以上を含む：
・乳化剤；
・トリグリセリド油または脂肪；
・他の酵素、とりわけ、α−アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよびこれらの組み合わせから選択される酵素；
・グルテン；
・アスコルビン酸；
・保存補助剤、例えば、プロピオン酸カルシウム；
・化学膨張剤；
・穀粉（cereal flour）。
【００３９】
典型的には、上記の製パン成分は、全体として、製パン改良剤の少なくとも５０重量％、より好ましくは、少なくとも７０重量％に相当する。
【００４０】
本発明の方法において用いられる製パン改良剤は、好ましくは、液体または粒子状製品である。より好ましくは、製パン改良剤は、質量加重平均粒径が１０〜１０００μｍ、より好ましくは５０〜８００μｍ、最も好ましくは１００〜５００μｍの範囲内にある粉末または顆粒である。
【００４１】
本発明のもう１つの態様は、ここで先に定義された方法により得られる焼きパンに関する。
【００４２】
本発明を、以下の例によってさらに説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【００４３】
例
例１
ライ麦／小麦パン生地を、表１に示すレシピを基に、成分をDiosnaミキサー中で６分間ゆっくりと混合し、２分間速く混合することにより調製した。
【表１】
【００４４】
２つの異なる生地を、以下の老化防止酵素を使用して調製した：
製品Ｉ： ８０ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG：小麦粉１ｋｇあたり６０８０ＭＡＵ、
製品ＩＩ： ６０ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG：小麦粉１ｋｇあたり４５６０ＭＡＵ＋２０ｐｐｍのBakezyme（登録商標）AG 800 BG：小麦粉１ｋｇあたり８４０ＡＧＵ（DSM製、オランダ）。
【００４５】
上記の市販の酵素調製物の活性を表２で特定する。
【表２】
【００４６】
混合した後、生地を周囲温度で３０分間休ませた。その後、１１００ｇの生地片を成型し、缶に入れ、３２℃で５０分間発酵させた。発酵後、生地片をデッキオーブン中で５０分間焼いた。オーブンの温度は、２６０℃で１０分間維持した後、その後の４０分間の間に２６０から２３０℃に直線的に低下するようにプログラムした。
【００４７】
パンを、周囲温度で最大９日間、標準的なポリエチレン袋中で保存した。
【００４８】
パンの中身の硬さを、Stable Micro SystemsからのTA.XT Plusテクスチャ分析装置により測定した。使用した方法は以下の通りであった：円筒状のパンの中身を焼きパンの中心から切り取った。円筒の直径は４５ｍｍであり、その長さは３０ｍｍであった。測定プローブの直径は５０ｍｍであり、試験速度は２ｍｍ／ｓｅｃであり、プローブはパンの中身に１０ｍｍ進入した。これを行うのに必要な力をｇ単位で測定し、この力は硬さに等しい。
【００４９】
４回の反復に基づいて２つの異なる製品について得られた結果を、表３に示す。
【表３】
【００５０】
例２
小麦生地を、表４に示すレシピを基に、成分をDiosnaスパイラルミキサー中、２分間ゆっくりと混合し、６分間速く混合することにより調製した。
【表４】
【００５１】
２つの異なる生地を、以下の老化防止酵素を使用して調製した：
製品Ｉ： ５０ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG
製品ＩＩ： ３６ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG＋７ｐｐｍのBakezyme（登録商標）AG 800 BG（DSM製、オランダ）。
【００５２】
混合した後、生地を１０分間休ませた。その後、５５０ｇの生地片を成型し、缶に入れ、３２℃で５０分間発酵させた。次に、生地片を２４０℃のWachtelデッキオーブン中で３３分間焼いた。
【００５３】
パンを周囲温度で最大９日間、標準的なポリエチレン袋中で保存した。
【００５４】
パンの中身の硬さを、例１に記載のものと同じ方法を用いて測定した。４回の反復に基づいて２つの異なる製品について得られた結果を、表５に示す。
【表５】
【００５５】
例３
Spezyme GA 300 N（Genencor）の活性は１９９４年頃に判定された。測定された活性は４６０ＡＧＵ／μｌであった。
【００５６】
Gerrardら(The Role of Maltodextrins in the Staling of Bread, Journal of Cereal Science 26 (1997) 201〜209)は、マルトース生成型アミラーゼ（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標））とグルコアミラーゼ（ＧＡ３００Ｎ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）とを、それぞれ、穀粉１ｇあたり０．８ｍｇの濃度と穀粉１ｇあたり２０μｌの濃度とでパン生地に添加した実験を記載している。マルトース生成型アミラーゼは、活性が１ｍｇあたり１１．４ＭＡＵであるため、この特定の実験において、アミログルコシダーゼが、ＭＡＵ活性１単位あたり３ＡＧＵよりも非常に高い量で適用されたと算出することができる。
【発明の概要】
【０００１】
発明の詳細な説明
発明の技術分野
本発明は、焼きパンの老化防止に関する。より詳細には、本発明は、このような老化を防ぐための、マルトース生成型アミラーゼとアミログロコシダーゼとを含む酵素混合物の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
焼き食品（パンなど）の老化はよく知られた問題である。老化、または「老化してくる」とは、焼き食物におけるそのおいしさを減少させる化学的および物理的過程である。老化は、パンの中身の硬さの増加、パンの中身芯の弾性または弾力性の低下、およびパンの外皮が硬くなり革のようになる変化としてはっきりと表れるようになる。老化の最も重要な側面であると考えられるパンの中身の硬さの増加は、パン製品が別の面で消費に不適当となるよりはるかに前に、消費者に気付かれる。
【０００３】
老化は、一般に考えられるように、水の蒸発に起因する単なる乾ききり過程ではない。パンは、湿った環境中でも老化する傾向があり、凍結温度のすぐ上の温度では最も急速に老化する。老化の正確な機構は依然として知られていないが、１つの重要な機構は、デンプン顆粒から間隙空間への水分の移動、ならびにデンプンのアミロースおよびアミロペクチン分子の再編成であると思われる。デンプン分子の再編成の過程は、老化と呼ばれる。老化の際、デンプン顆粒中に元々存在するものと同様の結晶様構造が形成することがあり、その過程は再結晶化と呼ばれる。老化は通常、パンの中身のテクスチャが硬くなり、弾力性が低下した、老化したパンをもたらす。
【０００４】
デンプンは、焼き食品の必須成分である。焼きプロセスの間に、デンプンはゼラチン化し、大量の水を吸収する；その一方、タンパク質は変性する。焼いた直後、デンプンは老化し始める。パン芯の硬さは増加するが、これは最初の数時間ではまだ利点と見なされる。特に、パンの中身の切りやすさと咀嚼特性はこの期間中に改善される。
【０００５】
さらなる保存中に、非分枝状デンプン画分であるアミロースが最初に老化した後、デンプンの分枝状画分であるアミロペクチンが老化すると推測される。同時に、パン芯はより硬くなり、時間の経過と共にますます弾性が低くなり、最終的には乾燥し、硬くなる、すなわちパンは老化してしまう。さらに、保存中に、パンの外皮はパリパリした食感を失い、革のようになる。これは、水が老化により放出され、パンの中身からパンの外皮に外に向かって拡散した結果であると推測される。
【０００６】
これらの老化現象の全てに関する原因的な重要反応がデンプン老化であることは明白である。この現象を抑制または回避することが、多数の保護権および刊行物の主題である。
【０００７】
保存中にパンの中身がかなり固くなることを少なくとも部分的に防ぐための１つの戦略は、既に長い間知られている。すなわち、パンの中身を最初からより柔らかくすることである。これを行うための選りすぐりの手段は、モノグリセリド／ジグリセリドなどの乳化剤であり、これを生地に添加し、最初から特に柔らかいパンの身の構造を作り出す。Aspergillus oryzaeなどの真菌に由来するα−アミラーゼの使用は同様の効果を有する。それは損傷したデンプン粒子に対して作用し、それによって、生地の粘度を低下させ、発酵可能性糖を作り出す。その結果、出来上がった焼き上げ品の体積が増すが、これはより柔らかいパンの中身と一致する。新鮮なパンが柔らかいという事実は別として、この戦略は、パンの中身が老化する際の、より固く、より低い弾性のコンシステンシーの発現を防止しないか、または不十分に防止する。
【０００８】
さらなる戦略は、焼いている間に２つのデンプン部分の酵素媒介性部分的加水分解により老化を抑制させることである。パンの中身の酵素媒介性加水分解は、好ましくは、デンプンがゼラチン化した後に、すなわち、約６５℃超で起こるべきである。その結果、焼き製品中のデンプンの構造は根本的に変化し、老化する能力が制限される。デンプンの部分加水分解により生成された断片は、短すぎて再結晶化できず、残存する高分子量デンプンと結合することにより、再結晶化の速度が低下する。Bacillus由来の熱安定性マルトース生成型アミラーゼは、商標名Novamyl 10,000（登録商標）（Novozymes A/S、デンマークの製品）で市販されており、デンプンゼラチン化温度でデンプンを加水分解することにより老化を抑制させる能力のおかげで、老化防止剤として製パン工業において広く使用されている（WO91/04669）。Novamyl 10,000（登録商標）は、６０〜７０℃で最も活性が高い(Christophersen, C.ら、1997, Starch, Vol. 50, No. 1, 3945)。
【０００９】
焼きパン中の老化防止剤としてのマルトース生成型アミラーゼの使用にかなりの費用が伴うので、費用対効果のより高い老化防止剤が必要とされている。
【００１０】
発明の概要
本発明者らは、極めて有効であり、使用時コストが現行の酵素性老化防止剤、特に熱安定性マルトース生成型アミラーゼより低い、焼きパンのための酵素性老化防止剤を提供することができた。
【００１１】
本発明者らは、老化防止剤としての熱安定性マルトース生成型アミラーゼの有効性を、そのようなアミラーゼをアミログルコシダーゼと組み合わせることにより実質的に改善することができることを発見した。
【００１２】
したがって、本発明の一態様は、デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって、
・穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは、至適温度が５０℃を超える）と；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．００のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを生地に持ち込むことを含む方法に関する。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、上記の方法により得られる焼きパンに関する。
【００１４】
マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの組み合わせの使用は、WO 2011/039324に記載されている。この国際特許出願は、１種以上のマルトース生成型アルファ−アミラーゼと、１種以上の生デンプン分解酵素と、少なくとも１種の脂肪分解性酵素とを用いて蒸しパンを製造するために使用される生地を作製する工程を含む、蒸しパン組成物を調製するための方法を記載している。WO2011/039324のExamples 7〜10は、Opticake（商標） 50 BG（マルトース生成型アルファ−アミラーゼ）とTrametes（商標）AMG（生デンプン分解酵素）との組み合わせを使用する蒸しパンの製造を記載している。
【００１５】
さらに、Gerrardら(The Role of Maltodextrins in the Staling of Bread, Journal of Cereal Science 26(1997) 201〜209)は、パンの老化に対するアルファ−アミラーゼ（Novamyl（登録商標））の添加および／または非常に高レベルのグルコアミラーゼ（GA300N、Genencor）の添加の効果を精査した研究の結果を記載している。
【００１６】
凍結し、発酵した層状生地における熱安定性アミログルコシダーゼと非熱安定アミラーゼとの組み合わせの使用が、US5,589,207に記載されている。より詳細には、この米国特許は、６０℃の温度で不活性になる真菌アミラーゼを、約６０℃を超えても活性状態を維持するアミログルコシダーゼと組み合わせて用いることを教示している。この特許の例は、真菌アミラーゼFungamyl（登録商標）Mg 35000とアミログルコシダーゼAMG 300 MGとの組み合わせの使用を記載している。この米国特許では、熱安定性アミログルコシダーゼの使用が、酵母活性が利用可能でなくなった後の単糖類の形成を確保し、それにより、これらの単糖類がパンの外皮の着色反応に関与し得ると説明されている。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって：
・穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える）と；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを前記生地に持ち込むことを含む方法を提供する。
【００１８】
用語「マルトース生成型アミラーゼ」は、ここで使用する限りにおいて、ＩＵＰＡＣ分類番号がＥＣ ３．２．１．１．であり、マルトトリオースをマルトースとグルコースとに加水分解することができるデンプン分解酵素（グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ）を指す。
【００１９】
用語「アミログルコシダーゼ」は、ここで使用する限りにおいて、ＩＵＰＡＣ分類番号がＥＣ ３．２．１．３．であるもう１つのデンプン分解酵素を指す。アミログルコシダーゼ（または１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）は、アミロースとアミロペクチンとの非還元性末端の最後のα（１−４）グリコシド結合を切断してグルコースをもたらすだけでなく、α（１−６）グリコシド結合も切断する。
【００２０】
酵素の「至適温度」をここで参照する場合はいつでも、酵素活性が最も高い温度を意味する。マルトース生成型アミラーゼについては、至適温度はｐＨ５．０で好適に決定される。アミログルコシダーゼについては、至適温度はｐＨ４．２で好適に決定される。
【００２１】
酵素の「至適ｐＨ」は、酵素活性が最も高いｐＨである。至適ｐＨは、６０℃で好適に測定される。
【００２２】
マルトース生成型アミラーゼ活性の１単位（ＭＡＵ）は、３７℃でｐＨ５．０の０．１Ｍシトラートバッファー１ｍｌあたりマルトトリオース基質１０ｍｇの濃度で１秒あたりに１ナノモルのマルトースを放出させるのに必要な酵素の量と定義される。
【００２３】
アミログルコシダーゼ活性の１単位（ＡＧＵ）は、３７℃でｐＨ５．０の０．１Ｍシトラートバッファー１ｍｌあたりマルトース基質１０ｍｇの濃度で１秒あたりに１ナノモルのグルコースを放出させるのに必要な酵素の量と定義される。
【００２４】
本発明の方法は、様々な種類のアミログルコシダーゼを好適に用いることができる。好ましくは、用いられるアミログルコシダーゼは、Aspergillus、RhizopusまたはTalaromycesの真菌株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである。好適な真菌の例としては、Aspergillus niger、Rhizopus delemar、Rhizopus niveus、Rhizopus oryzaeおよびTalaromyces emersoniiが挙げられる。最も好ましくは、本発明に従って用いられるアミログルコシダーゼは、Aspergillus nigerの株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである。
【００２５】
本発明の方法において用いられるアミログルコシダーゼは、典型的には、至適ｐＨが１．５〜５．５の範囲内、特に、２．０〜４．５の範囲内にある。
【００２６】
有利には、アミログルコシダーゼは、穀粉１ｋｇあたり４０〜４０，０００ＡＧＵ、より好ましくは、穀粉１ｋｇあたり８０〜２３，０００ＡＧＵの量で生地中に持ち込まれる。別の表現をすれば、アミログルコシダーゼは、好ましくは、ＭＡＵ活性１単位あたり０．０５〜０．５０ＡＧＵの量、最も好ましくは、ＭＡＵ活性１単位あたり０．１０〜０．３０ＡＧＵの量で生地中に持ち込まれる。
【００２７】
本発明の方法において用いられるマルトース生成型アミラーゼは、好ましくは、至適温度が５２〜９０℃の範囲内、最も好ましくは、５５〜８５℃の範囲内にある。
【００２８】
マルトース生成型アミラーゼの至適ｐＨは、好ましくは、４．０〜７．５の範囲内、最も好ましくは、４．５〜７．０の範囲内にある。
【００２９】
本発明者らは、アミログルコシダーゼの至適温度がマルトース生成型アミラーゼの至適温度よりも実質的に低い場合でも、老化を非常に効果的に最小化することができることを見出した。好ましくは、アミログルコシダーゼの至適温度は、マルトース生成型アミラーゼの最適温度よりも少なくとも１０℃、より好ましくは少なくとも１２℃、最も好ましくは少なくとも１４℃低い。典型的には、アミログルコシダーゼの至適温度は、５５℃未満である。
【００３０】
本発明に従って用いられるマルトース生成型アミラーゼは、好ましくは、Bacillus株、最も好ましくはGeobacillus stearothermophilusの株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである。
【００３１】
マルトース生成型アミラーゼは、典型的には、穀粉１ｋｇあたり１，０００〜４０，０００ＭＡＵ、最も好ましくは、穀粉１ｋｇあたり１，５００〜７，５００ＭＡＵの量で生地中に持ち込まれる。
【００３２】
１つの好ましい態様によれば、本発明の方法において用いられるパン生地は、ライ麦粉／小麦粉混合生地である。別の好ましい実施形態によれば、パン生地は小麦粉生地である。
【００３３】
本発明の方法において、デンプン質生地は、典型的には、穀粉と、水と、酵母と、マルトース生成型アミラーゼと、アミログルコシダーゼと、任意の他の製パン成分とを組み合わせることにより調製される。マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの他に、本発明の方法は、α−アミラーゼ、キシラナーゼおよびプロテアーゼなどの他の食品等級酵素を用いてもよい。
【００３４】
デンプン質生地は、好ましくは、１８０℃を超える温度、より好ましくは２００℃を超える温度で焼く。生地が酵母含有生地である場合、生地を、好ましくは、焼く前に発酵させる。
【００３５】
本発明の方法の特に好ましい態様によれば、製パン改良剤を生地に持ち込むことによって生地を製造し、前記製パン改良剤は、
・乾燥物質１ｋｇあたり７，５００〜７５，０００，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼ（前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える）と；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを含む。
【００３６】
上記製パン改良剤は、典型的には、穀粉の０．１〜１０重量％、特に、０．３〜５重量％の濃度でパン生地中で用いられる。
【００３７】
典型的には、アミログルコシダーゼは、乾燥物質１ｋｇあたり１００〜１２０，０００，０００ＡＧＵの量、さらにより好ましくは、乾燥物質１ｋｇあたり５００〜３０，０００，０００ＡＧＵの量、最も好ましくは、乾燥物質１ｋｇあたり７５０〜４，０００，０００ＡＧＵの量で製パン改良剤中に存在する。
【００３８】
マルトース生成型アミラーゼとアミログルコシダーゼとの他に、本発明の方法において用いられる製パン改良剤は好ましくは、以下の製パン成分のうちの１種以上、より好ましくは２種以上、最も好ましくは３種以上を含む：
・乳化剤；
・トリグリセリド油または脂肪；
・他の酵素、とりわけ、α−アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよびこれらの組み合わせから選択される酵素；
・グルテン；
・アスコルビン酸；
・保存補助剤、例えば、プロピオン酸カルシウム；
・化学膨張剤；
・穀粉（cereal flour）。
【００３９】
典型的には、上記の製パン成分は、全体として、製パン改良剤の少なくとも５０重量％、より好ましくは、少なくとも７０重量％に相当する。
【００４０】
本発明の方法において用いられる製パン改良剤は、好ましくは、液体または粒子状製品である。より好ましくは、製パン改良剤は、質量加重平均粒径が１０〜１０００μｍ、より好ましくは５０〜８００μｍ、最も好ましくは１００〜５００μｍの範囲内にある粉末または顆粒である。
【００４１】
本発明のもう１つの態様は、ここで先に定義された方法により得られる焼きパンに関する。
【００４２】
本発明を、以下の例によってさらに説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【００４３】
例
例１
ライ麦／小麦パン生地を、表１に示すレシピを基に、成分をDiosnaミキサー中で６分間ゆっくりと混合し、２分間速く混合することにより調製した。
【表１】
【００４４】
２つの異なる生地を、以下の老化防止酵素を使用して調製した：
製品Ｉ： ８０ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG：小麦粉１ｋｇあたり６０８０ＭＡＵ、
製品ＩＩ： ６０ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG：小麦粉１ｋｇあたり４５６０ＭＡＵ＋２０ｐｐｍのBakezyme（登録商標）AG 800 BG：小麦粉１ｋｇあたり８４０ＡＧＵ（DSM製、オランダ）。
【００４５】
上記の市販の酵素調製物の活性を表２で特定する。
【表２】
【００４６】
混合した後、生地を周囲温度で３０分間休ませた。その後、１１００ｇの生地片を成型し、缶に入れ、３２℃で５０分間発酵させた。発酵後、生地片をデッキオーブン中で５０分間焼いた。オーブンの温度は、２６０℃で１０分間維持した後、その後の４０分間の間に２６０から２３０℃に直線的に低下するようにプログラムした。
【００４７】
パンを、周囲温度で最大９日間、標準的なポリエチレン袋中で保存した。
【００４８】
パンの中身の硬さを、Stable Micro SystemsからのTA.XT Plusテクスチャ分析装置により測定した。使用した方法は以下の通りであった：円筒状のパンの中身を焼きパンの中心から切り取った。円筒の直径は４５ｍｍであり、その長さは３０ｍｍであった。測定プローブの直径は５０ｍｍであり、試験速度は２ｍｍ／ｓｅｃであり、プローブはパンの中身に１０ｍｍ進入した。これを行うのに必要な力をｇ単位で測定し、この力は硬さに等しい。
【００４９】
４回の反復に基づいて２つの異なる製品について得られた結果を、表３に示す。
【表３】
【００５０】
例２
小麦生地を、表４に示すレシピを基に、成分をDiosnaスパイラルミキサー中、２分間ゆっくりと混合し、６分間速く混合することにより調製した。
【表４】
【００５１】
２つの異なる生地を、以下の老化防止酵素を使用して調製した：
製品Ｉ： ５０ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG
製品ＩＩ： ３６ｐｐｍのNovamyl（登録商標）10,000 BG＋７ｐｐｍのBakezyme（登録商標）AG 800 BG（DSM製、オランダ）。
【００５２】
混合した後、生地を１０分間休ませた。その後、５５０ｇの生地片を成型し、缶に入れ、３２℃で５０分間発酵させた。次に、生地片を２４０℃のWachtelデッキオーブン中で３３分間焼いた。
【００５３】
パンを周囲温度で最大９日間、標準的なポリエチレン袋中で保存した。
【００５４】
パンの中身の硬さを、例１に記載のものと同じ方法を用いて測定した。４回の反復に基づいて２つの異なる製品について得られた結果を、表５に示す。
【表５】
【００５５】
例３
Spezyme GA 300 N（Genencor）の活性は１９９４年頃に判定された。測定された活性は４６０ＡＧＵ／μｌであった。
【００５６】
Gerrardら(The Role of Maltodextrins in the Staling of Bread, Journal of Cereal Science 26 (1997) 201〜209)は、マルトース生成型アミラーゼ（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標））とグルコアミラーゼ（ＧＡ３００Ｎ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）とを、それぞれ、穀粉１ｇあたり０．８ｍｇの濃度と穀粉１ｇあたり２０μｌの濃度とでパン生地に添加した実験を記載している。マルトース生成型アミラーゼは、活性が１ｍｇあたり１１．４ＭＡＵであるため、この特定の実験において、アミログルコシダーゼが、ＭＡＵ活性１単位あたり３ＡＧＵよりも非常に高い量で適用されたと算出することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって、
・穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼと、前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを前記生地に持ち込むことを含む方法。
【請求項２】
前記アミログルコシダーゼは、Aspergillus nigerの真菌株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミログルコシダーゼは、至適ｐＨが１．５〜５．５、好ましくは２．０〜４．５の範囲にある請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミログルコシダーゼを、穀粉１ｋｇあたり４０〜４０，０００ＡＧＵの量で前記生地に持ち込む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記アミログルコシダーゼを、ＭＡＵ活性１単位あたり０．０５〜０．５０ＡＧＵの量で前記生地に持ち込む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アミログルコシダーゼの至適温度は、前記マルトース生成型アミラーゼの至適温度より少なくとも１０℃低い請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マルトース生成型アミラーゼは、至適温度が５５〜９０℃の範囲にある請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マルトース生成型アミラーゼは、Geobacillus stearothermophilusの株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生地は、ライ麦粉／小麦粉混合生地である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
穀粉と、水と、酵母と、前記マルトース生成型アミラーゼと、前記アミログルコシダーゼと、任意の他の製パン成分とを組み合わせることによって前記生地を製造する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生地を焼く前に発酵させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記デンプン質生地を１８０℃を超える温度で焼く請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
製パン改良剤を前記生地に持ち込むことにより前記生地を製造し、前記製パン改良剤は、
・乾燥物質１ｋｇあたり７，５００〜７５，０００，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼと、前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記製パン改良剤は、質量加重平均粒径が１０〜１０００μｍの範囲にある粉末または顆粒である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により得られる焼きパン。
【請求項１】
デンプン質生地を焼くことにより焼きパンを製造する方法であって、
・穀粉１ｋｇあたり７５０〜７５，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼと、前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを前記生地に持ち込むことを含む方法。
【請求項２】
前記アミログルコシダーゼは、Aspergillus nigerの真菌株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミログルコシダーゼは、至適ｐＨが１．５〜５．５、好ましくは２．０〜４．５の範囲にある請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミログルコシダーゼを、穀粉１ｋｇあたり４０〜４０，０００ＡＧＵの量で前記生地に持ち込む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記アミログルコシダーゼを、ＭＡＵ活性１単位あたり０．０５〜０．５０ＡＧＵの量で前記生地に持ち込む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アミログルコシダーゼの至適温度は、前記マルトース生成型アミラーゼの至適温度より少なくとも１０℃低い請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マルトース生成型アミラーゼは、至適温度が５５〜９０℃の範囲にある請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マルトース生成型アミラーゼは、Geobacillus stearothermophilusの株において見つかるＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生地は、ライ麦粉／小麦粉混合生地である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
穀粉と、水と、酵母と、前記マルトース生成型アミラーゼと、前記アミログルコシダーゼと、任意の他の製パン成分とを組み合わせることによって前記生地を製造する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生地を焼く前に発酵させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記デンプン質生地を１８０℃を超える温度で焼く請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
製パン改良剤を前記生地に持ち込むことにより前記生地を製造し、前記製パン改良剤は、
・乾燥物質１ｋｇあたり７，５００〜７５，０００，０００のマルトース生成型アミラーゼ単位（ＭＡＵ）の量のマルトース生成型アミラーゼと、前記マルトース生成型アミラーゼは至適温度が５０℃を超える；
・ＭＡＵ活性１単位あたり０．０１〜３．０のアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）の量のアミログルコシダーゼと
を含む２種以上の酵素の組み合わせを含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記製パン改良剤は、質量加重平均粒径が１０〜１０００μｍの範囲にある粉末または顆粒である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により得られる焼きパン。
【公開番号】特開２０１３−４６６１４（Ｐ２０１３−４６６１４Ａ）
【公開日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１８６５８２（Ｐ２０１２−１８６５８２）
【出願日】平成２４年８月２７日（２０１２．８．２７）
【出願人】（５０５１５２４８０）シーエスエム・ネーデルランド・ビー．ブイ． (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１８６５８２（Ｐ２０１２−１８６５８２）
【出願日】平成２４年８月２７日（２０１２．８．２７）
【出願人】（５０５１５２４８０）シーエスエム・ネーデルランド・ビー．ブイ． (9)
【Ｆターム（参考）】
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