熱サイクル装置
【課題】熱サイクルを迅速に行うポリメラーゼ連鎖反応を実施するための装置装置を提供する。
【解決手段】一実施形態は、第１の層１８と、第１の層に隣接する第２の層２０と、第１の層の反対側で第２の層に隣接する第３の層２２とを備える。連続チャネル５４が、第１の層１８、第２の層２０、及び第３の層２２の内部に形成される。連続チャネル５４は、複数のサイクル区間を有し、各サイクル区間は、第１の層１８内に配置された第１の区間５８と、第３の層２２内に配置された第２の区間６２と、第２の層２０内に配置された第３の区間６６とを含む。第１の層１８を第１の温度に、第３の層２２を、第２の温度に維持するために、一体又は別個の温度源１４、１６を設けることができる。熱伝導によって、第３の層２２は、第１の温度と第２の温度の間に維持される。
【解決手段】一実施形態は、第１の層１８と、第１の層に隣接する第２の層２０と、第１の層の反対側で第２の層に隣接する第３の層２２とを備える。連続チャネル５４が、第１の層１８、第２の層２０、及び第３の層２２の内部に形成される。連続チャネル５４は、複数のサイクル区間を有し、各サイクル区間は、第１の層１８内に配置された第１の区間５８と、第３の層２２内に配置された第２の区間６２と、第２の層２０内に配置された第３の区間６６とを含む。第１の層１８を第１の温度に、第３の層２２を、第２の温度に維持するために、一体又は別個の温度源１４、１６を設けることができる。熱伝導によって、第３の層２２は、第１の温度と第２の温度の間に維持される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、２００４年２月２４日出願の米国仮特許出願第６０／５４７，０３６号、及び２００４年１１月２２日出願の同第６０／６２９，９１０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、熱サイクル装置に関し、より詳細には、生命科学、医療装置、及びバイオテクノロジー分野に適した、多層熱サイクル装置に関する。適当な一応用例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施である。
【背景技術】
【０００３】
生命科学、医療装置、及びバイオテクノロジーなど、様々な分野では、様々な反応を実施するための熱サイクルが必要とされることが多い。反応の１つのタイプは、ＤＮＡ断片などの生体試料がそれにおいて複製される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
【０００４】
ＰＣＲは、特異的に単独の核酸成分を、他の成分が入り組んだ試料内で複製又は「増幅」するための、好ましい方法である。ＰＣＲプロトコールの要件の中には、生体試料及びＰＣＲ試薬からなるＰＣＲ試料を、３つの異なる温度に特定の長さの時間暴露することがある。暴露の温度及び時間は、所望される特定の核酸配列に対して最適化される。ＰＣＲ試料が、３つの温度に複数回暴露されることもまた、要件の１つである。科学的通称において、これら２つの要件は、一般に熱サイクルと呼ばれる。
【０００５】
ヒトゲノム計画などの科学的な試み、及びその他の同様の努力では、極めて多数のＰＣＲ反応を行うことが必要とされる。ＰＣＲの実施に伴う費用及び時間は、何千回又は何百万回ものＰＣＲ反応を必要とする科学的研究にとって法外なものとなり得る。費用削減は、小型化によりＰＣＲ反応をうまく行うのに必要とされる材料の量を削減することによって実現することができる。全ＰＣＲ反応時間は、試料を暴露して所定のＰＣＲプロトコールにおける各温度設定点で平衡化させるのに必要な時間を減少させることによって減少させることができる。
【０００６】
現在の技術は、これらの目標を達成するために、様々な手段に依存している。各方法及び装置は、ＰＣＲ試料内の迅速な温度変化を妨げる、以下の１つ又は複数の特性を有する。１つ又は複数の熱エネルギー源の温度を変化させて、各温度設定点を確立しなくてはならない。これに必要な時間は、装置材料の熱伝導度によって決定され、これは本来的にＰＣＲ試料自体よりも遅い。一定温度の熱源が使用される場合、装置の局所的な領域が所望の温度設定点で平衡化するが、装置内のその周辺領域においては、その材料の熱伝導特性により、漸進的に温度変化が進行する。このため、試料が装置を通って移動するとき、その熱遷移が遅くなる。これらの遷移温度範囲を横断するための時間によって、突然の又は即時の変化をもたらす方法に比べて全反応時間が増大される。装置がより大きいことも必要とされるため、高度の小型化が行われない。従って、ＰＣＲ試料の量の削減によるコストの利益を完全には実現していない。
【０００７】
熱サイクルとも呼ばれる温度サイクルを促進するための装置及び方法が、かなり発達している。Ｄａｎｉｅｌ Ｃｈｕらによる「多容器反応装置のための温度制御（ＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥ ＣＯＮＴＲＯＬ ＦＯＲ ＭＵＬＴＩ−ＶＥＳＳＥＬ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ）」という名称の米国特許第６，３３７，４３５号には、多数ウェル容器内の１つ又は複数の試料が、多数ウェル容器と加熱装置の間の物理的接触により生じる温度変化に曝される手法が記載されている。熱サイクルを実施するために必要とされる時間は、加熱装置の熱量及びその他の物理的性質によって主に決定され、従って比較的遅い。
【０００８】
多数ウェル装置は、試料の導入及び除去のためのウェルへのアクセスを提供するために、通常その頂部が開いている。これは、望ましくない試料の蒸発環境を生み出す。上述の特許並びにその他の特許は、カバーをすることによりこの作用を低減させるよう試みている。カバーによって、蒸発が減少するが、望ましくない凝縮の機会がもたらされる。この影響は、カバーを加熱することによって軽減されるが、これによって、システムに競合温度源が導入され、全ＰＣＲ反応時間がさらに増大される。
【０００９】
開いたウェル／容器システムの欠点を軽減するために、閉じた小型装置を製作するための著しい努力が、生物工学界においてなされてきた。閉じた小型システムの利点は、試料の蒸発が低減され、凝縮が低減され、且つ、より少量の試料及び試薬量の使用によって費用が削減されることである。そのような小型システムの例が、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍａｔｈｉｅｓ及びＡｄａｍ Ｗｏｏｌｌｅｙによる「小型反応チャンバ及びそれを組み込む装置（ＭＩＮＩＡＴＵＲＥ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＣＨＡＭＢＥＲ ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＮＧ ＳＡＭＥ）」という名称の米国特許第６，２８４，５２５号、及びＲｉｃｈａｒｄ Ｍａｔｈｉｅｓ、Ｐｅｔｅｒ Ｓｉｍｐｓｏｎ、及びＳｔｅｐｈｅｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓによる、「一体型ＰＣＲ−ＣＥ装置の微細加工のためのプロセス及びそれにより製造される製品（ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＡＮ ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ ＰＣＲ−ＣＥ ＤＥＶＩＣＥ ＡＮＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＰＲＯＤＵＣＥＤ ＢＹ ＴＨＥ ＳＡＭＥ）」である。そのような装置は、閉じた反応チャンバを備えて製造される。試料及び試薬液が、流体チャネルネットワークを通じて、それらのチャンバに流入及び流出する。抵抗ワイヤなどの加熱要素が、これらのチャンバ内に製作され、ＰＣＲアッセイの実施に必要とされる加熱エネルギーを提供する。
【００１０】
より大きい開いたシステムと同様、装置の熱的性質及び構造設計が、反応時間を主に決定する。これらのシステムは、既に述べた手法に対する改善ではあるが、このような構造の熱特性が限定要因となる。また、その所定位置にある加熱要素を製造し、制御し、監視することは困難を伴い、装置の費用がかなり追加される。
【００１１】
ＰＣＲプロセスの加速を試みる別の方法が、Ｊｏｃｈｅｎ Ｆａｎｚｅｎによる「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による極めて高速のＤＮＡ複製のための方法及び装置（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＥＸＴＲＥＭＥＬＹ ＦＡＳＴ ＤＮＡ ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＢＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ （ＰＣＲ））」という名称の米国特許第６，１８０，３７２号に記載されている。この実施の形態では、マイクロ流体チャネルの２次元ネットワークが、２つの温度加熱／冷却要素内に含まれている。このマイクロチャネル装置は、装置の上下の加熱／冷却要素内の変化による急速な温度変化に曝される。このシステムは、加熱／冷却要素が物理的に完全に接触するため、要素間のエネルギー移動が非常に効率的である。ただし、総ＰＣＲ反応時間は、加熱／要素内及びマイクロチャネル材料内の温度を変化させる能力によって、依然限定される。
【００１２】
上記装置及び方法は、要素から装置への、最終的にはその中に収容されるＰＣＲ試料へのエネルギー移動を最適化しようと試みる、加熱要素の様々な構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）によって、ＰＣＲのための熱サイクルの問題に対処する。これらの方法及び装置は総て、装置を通じて試料へと熱エネルギーを伝達するその能力によって制限されている。ＰＣＲ試料をＰＣＲプロトコールの所望の各温度設定点に暴露するために、加熱要素自体が温度変化しなければならない場合にはまた、更なる制限が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，３３７，４３５号
【特許文献２】米国特許第６，１８０，３７２号
【特許文献３】米国特許第６，１８０，３７２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、熱サイクルを迅速に実施するための装置が提供されるように、従来の知られた装置の熱的制限を低減させるとともに、蒸発、凝縮、及び費用を減少させる、熱サイクル装置を提供することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、改善された熱サイクル実施のための方法及び装置を提供する。
本発明の一態様では、装置は、第１の層と、第１の層に近接する第２の層と、第１の層と反対側で第２の層に近接する第３の層と、連続チャネルとを備える。当該連続チャネルは、前記第１の層、第２の層、及び第３の層内に形成される。当該連続チャネルは、複数のサイクル区間を有する。各サイクル区間は、前記第１の層内に配置された第１の部分、前記第２の層内に配置された第２の部分、及び前記第３の層内に配置された第３の部分を備える。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、反応を実施するための装置が、第１の加熱手段と、第１の加熱手段に熱的に連結された第１の熱伝導層と、第１の熱伝導層に近接する第１の絶縁層と、第１の絶縁層に直接隣接する第２の熱伝導層と、第２の熱伝導層に直接隣接する第２の絶縁層を備える。第３の熱伝導層が、第１の層の反対側で第２の層に近接して配置される。連続チャネルが、第１の熱伝導層、第１の絶縁層、第２の熱伝導層、第２の絶縁層、及び第３の熱伝導層を通って形成される。当該連続チャネルは、複数のサイクル区間を有し、各サイクル区間は、第１の熱伝導層内に配置された第１の部分と、第３の熱伝導層内に配置された第２の部分と、第２の熱伝導層内に配置された第３の部分とを含む。
【００１７】
本発明のさらに別の態様では、反応の実施方法は、第１の層、第２の層、及び第３の層を有する装置内に試料を導入することと、第１の層におけるサイクルの第１の部分を第１の温度で実施することと、試料を第３の層に移動させることと、その後第３の層におけるサイクルの第２の部分を第１の温度より低い第２の温度で実施することと、試料を第２の層に移動させることと、その後第２の層におけるサイクルの第３の部分を第１の温度と第２の温度との間の第３の温度で実施することと、第１の部分、第２の部分、及び第３の部分を、反応を実施するための所定の回数繰り返して実施することとを含む。
【００１８】
本発明の１つの利点は、３つの異なる温度を用いるポリメラーゼ連鎖反応を実施するために、熱エネルギー源が２つしか必要とされないことである。うまく上層及び下層が１つの温度に維持されるので、各層の熱サイクルによる遅延が存在しない。これによって、既存の技術に比べてプロセス全体が促進される。
【００１９】
本発明のその他の利点及び特徴は、添付の図面及び添付の特許請求の範囲と関連付けて、好ましい実施の形態の詳細な説明を考慮して見ると明らかになるであろう。
【００２０】
本発明の様々な特徴及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むと容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態による熱サイクル装置の第１の実施例を示す斜視図である。
【図２】図１の熱サイクル装置の分解図である。
【図３】図１及び図２に示す熱サイクル装置の部分破断断面図である。
【図４】図１から図３の装置のチャネルを示す斜視図である。
【図５】本発明の第２の実施形態を示す分解図である。
【図６】図５の装置の断面図である。
【図７】本発明の熱サイクル装置の第３の実施形態を示す断面図である。
【図８】本発明による熱サイクル装置の第４の実施形態を示す断面図である。
【図９】本発明に従って形成された加熱器を示す斜視図である。
【図１０Ａ】図９に従って形成された加熱器の、厚さに対するバルク抵抗率の図表である。
【図１０Ｂ】図９に示す加熱器の、ｎ型キャリアドーピングに対するバルク抵抗率の図表である。
【図１１】本発明の第５の実施形態を示す断面図である。
【図１２】ＰＣＲアナライザ及びそのためのキットを示す概略図である。
【図１３】熱サイクルを改善するために泡を使用するチャネルを示す断面図である。
【図１４】ＬＥＤ及びフォトダイオードをその中に有するチャネル部分を示す断面図である。
【図１５】本発明による装置の概略図である。
【図１６】本発明の第６の実施形態を示す断面図である。
【図１７】第７の実施形態を示す断面図である。
【図１８】本発明に従って形成された流体試験装置を示す斜視図である。
【図１９】図１８の装置の分解図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
添付の図では、同一の構成要素を識別するために同一の参照番号を使用する。試薬、時間、材料、及びチャネル構成を含む、様々な実施例を例として以下で説明するが、それらは限定を意図するものではないことに留意されたい。また本発明を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関して説明する。ただし、本発明の使用により、様々な生物学的及び化学的分野に利益をもたらすことができる。本装置は熱サイクルに適しているが、加熱装置を本装置と一体にしなくてもよいことにも留意されたい。すなわち、加熱装置は、本装置に連結される外部装置とすることができる。
【００２３】
ここで図１を参照すると、熱サイクル装置１０は、流体装置１２、第１の温度源１４、及び第２の温度源１６を備える。流体装置は、図示のように、第１の熱伝導層１８、第２の熱伝導層２０、及び第３の熱伝導層２２から形成される。層は平坦な矩形とすることができる。層はまた、同一の熱伝導層の別々の層（ｌａｙｅｒ ｏｒ ｓｔｒａｔａ）とすることができる。すなわち、装置において層は、装置全体にわたり温度が同一の領域とすることができる。装置の材料は、以下でさらに説明するように、同じでも異なってもよく、絶縁体を有しても有さなくてもよい。高い熱伝導度を有する様々なタイプの材料を、本発明に使用することができる。熱伝導度が高いことによって、層全体にわたる温度が等温になる。例えば、アルミニウム上の鋼などの金属、及びシリコンなどの半導体は、最も好ましい材料である。ただし、ガラス及び様々なタイプの複合プラスチックなど、その他の材料を熱伝導性材料に使用することもできる。各層は、それぞれ異なる材料で形成しても同一の材料で形成してもよい。層は互いに近接する。すなわち、層同士は、直接隣接したり、隣接し、或いは、それらの間に配置された加熱器、絶縁体、又はその他の構造を有することができる。
【００２４】
様々な層を少なくとも部分的に熱的に絶縁させるために、絶縁層を使用することができる。第１の絶縁体２４が、第１の熱伝導層１８と第２の熱伝導層２０の間に配置される。第２の絶縁体２６が、第２の熱伝導層２０と第３の熱伝導層２２の間配置される。第１の絶縁体２４及び第２の絶縁体２６は、熱伝導層間に平坦な層として形成することができる。もちろん、そのような絶縁体のその他の実施形態が当業者には明らかであろう。第１の絶縁体２４及び第２の絶縁体２６は、好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、又はポリイミドなど、低い熱伝導特性を有する材料から製作される。図２に最もよく示されるように、絶縁体２４、２６は、熱伝導層間で流体を移送することができるように、それを貫通する様々なポート２８を備える。これらの層を穿孔し、又はこれらの層に反応性イオンで深いエッチングを行えばよい。絶縁体２４及び２６は、２つの温度源を使用して３つの温度を維持することができるように、層間の熱バッファとして作用する。すなわち、各層は迅速に平衡化して等温となる。等温層がもたらされることによって、温度伝達が非常に急速になる。ＰＣＲプロセスにおける２つの限定要因は、試料の熱吸収、及び化学反応における酵素の働きである。こうしてＰＣＲを、本来的に可能な限り高速で実施することができる。
【００２５】
ポート２８は、穿孔及びレーザアブレーションを含めて、様々なやり方で形成することができる。１層形態の場合、第１の絶縁体は、頂面３０及び底面３２を有する。頂面３０は、第１の伝導層１８の底面３４に隣接する。絶縁体２４の底面３２は、熱伝導層２０の頂面３８に直接隣接する。第２の熱伝導層２０の底面４０は、第２の絶縁層２６の頂面４２に直接隣接する。絶縁体２６の底面４４は、第３の熱伝導層２２の頂面４６に直接隣接する。第１の熱伝導層１８の頂面３６は、入口ポート５０をその中に有する。入口ポート５０は、流体装置１２に流体試料を供給するために使用することができる。出口ポート５２は、流体装置１２から流体試料を除去するために使用することができる。エポキシ又はその他の接着剤の薄層を使用して、層を互いに結合させることができる。位置合せガイド又はピンを、製造時の装置の位置合せに使用することができる。
【００２６】
以下でさらに説明するように、様々なタイプ及び位置の温度源１４、１６を使用することができる。プラテンなどの別個の装置又は一体装置を使用することができる。図３に示すように、第１の温度源１４及び第２の温度源１６は、それぞれ熱伝導層１８の頂面３６及び第３の層２２の底面４８に直接隣接する。積層された温度源１４、１６は、こうして図３の装置１２と一体になる。
【００２７】
第３の熱伝導層２２を貫通する、出口ポート５２を示す。出口ポートによって、流体試料を装置から出すことが可能になる。装置を貫通する、連続チャネル５４を示す。連続チャネルは、装置の各層に対応する部分を有する、様々なサイクルに分断することができる。ＰＣＲ環境では、３つの異なる温度が望ましい。３つの異なる温度への暴露は、ＰＣＲ反応の１増幅サイクルを形成する。
【００２８】
連続チャネルは、入口部分５６、第１の熱伝導層１８内に配置された第１のサイクル部分５８、及び、第１の熱伝導層１８からの流体試料を第３の熱伝導層２２に連結させる、接続部分６０を備える。第３の熱伝導層２２は、その中に第２のサイクル部分６２を有し、こうして、第１の熱伝導層の第１の温度未満の第２の温度に暴露される。第２のサイクル部分６２は、第２のサイクル部分６２からの流体を第３のサイクル部分６６に連結させる、第２の接続部分６４に流体的に連結される。第３のサイクル部分６６は、第２の熱伝導層２０内に配置される。以下で説明するように、ＰＣＲプロセスにおける様々なパラメータ及び所望の増幅に応じて、第１の部分５８、第２の部分６２、及び第３の部分６６を通る様々な数のサイクルを実施することができる。装置内を通る所定の数のサイクルが実施されると、流体試料は、第３の層２２を通る出口部分６８を通って装置を離れる。流体装置１２内に形成された所望の数のサイクル内を流体が通過するとき、出口部分６８が実施される。第１の部分５８、第２の部分６２、及び第３の部分６６の長さ及び断面積は、各通路内の流体試料が所定の長さの時間その温度に暴露されるようにサイズ決めされる。通路のサイズは、断面積及び長さを変えることによって変化させることができる。滞留時間は、長さに比例し、チャネル断面積に反比例する。流体入口５０及び流体出口５２は、様々な層に配設することができる。この位置は、流体装置がそれに取り付けられる設備の構成に応じて、便宜上の問題により決定される。
【００２９】
第１の温度源１４及び第２の温度源１６は、電気薄膜装置、抵抗ワイヤ装置、プラテン、又はその他の一定温度源など、様々なタイプの材料により構成することができる。図３の実施形態で、上層の温度は、第１の温度源１４を用いて第１の温度に維持され、第３の層２２は、第２の温度源１６によって、第１の温度未満の第２の温度に維持される。第１の層の上面及び第３の層２２の下面は、それぞれ温度源１４、１６が接触しているものとして示す。１つ又は両方の層の１つ又は複数の縁部にも、温度源を接触させることができることに留意されたい。好ましくは、温度源は調整される。サーミスタ又は熱電対など様々なフィードバック装置を、制御装置にフィードバックを供給するために使用することができる。第２の熱伝導層２０は、各層からの熱を、制御された方法で絶縁体２４、２６を通して吸収する。すなわち、絶縁体を通る熱伝導量を厚さ又は材料の選択により制御することによって、吸収量を制御することができる。第２の層の温度は、第１の温度と第２の温度の間の、第３の所定の温度に維持される。装置全体が平衡状態に到達するためには、ゼロではないある長さの時間がかかるであろう。伝導層は、好ましくは高度に熱伝導性であり、それによって等温性である。平衡状態に到達した後、流体又は流体試料を、連続チャネル５４を通して、異なる各サイクルにおいて異なる各層に暴露させることができる。層１８、２０、及び２２は、高度に熱伝導性とすることができるので、熱伝導層内で低い又はほぼ０の温度差を支持することができる。絶縁層２４及び２６は熱伝導度が低い材料製であるので、それらの層内で、高い温度差を支持することができる。第２の熱伝導層２０又は伸張層は、第１の伝導層１８又は変性層（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｌａｙｅｒ）からの、上方絶縁層を通じた熱の流入によって加熱される。第２の熱伝導層２０又は伸張層は、対流、放射、又はその縁部からの伝導、下方絶縁層を通じた流出、及びアニーリング層からの液体の流入によって冷却される。その定常状態温度は、これらの競合エネルギー束を平衡化させた結果である。装置の保持装置の設計によって、縁部損失をごくわずかにすることができる。絶縁層の熱抵抗は、２つの事項を考慮して選択される。液体が流れていないとき、伸張層の定常状態温度は、２つの絶縁層の相対的な熱抵抗によって設定される。流れが存在するとき、伸張層の定常状態温度は、流入液体を加熱するのに必要とされるエネルギーに応じた量低下する。この低下は、ＰＣＲが許容することができる伸張温度範囲内でなければならない。この制約によって、絶縁層の熱抵抗の上限、及び従って装置に供給しなければならないエネルギーの下限が設定される。通常、装置に供給しなければならないエネルギーは２つの点からなり、これらは、変性温度とアニーリング温度との差にいずれも比例する。第１の点は、液体が存在しないときに定常状態の熱流束を確立する部分であり、第２の点は、変性及び伸張層に入る加熱液体のオーバーヘッドによる。縁の影響を度外視すると、装置に供給される総てのエネルギーを、適当なヒートシンクを用いて取り除くことができる。
【００３０】
流体試料は、プロセスの速さに対する一つの限定要因であるある吸収速度を有する。化学反応での酵素（ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）もまた、制限となり得る。先行技術とは逆に、本発明は、これら２つの制約のみによって制限される。その他の技術の幾何学的形態は、プロセスの速さを制限する。通常、長い通路は、そのような装置における熱遮断を実現するために存在する。
【００３１】
連続チャネル５４内に流体を置かれた時点で、毛管力、真空、圧力源又はその他の手段など、試料を移動させるための様々な手段を付与すればよい。移動手段を、第１の移動手段７０及び第２の移動手段７２として示す。一方又は両方の手段７０、７２が存在することがある。
【００３２】
本実施形態で使用されるサイズ、材料、及び製造技術は、特定用途の要求に最も有効に対処するように選択することができる。例えば、成形、機械加工、鋳造、押出、並びに様々なタイプの金属及びプラスチックを、流体装置１２に使用することができる。また、様々なタイプの加熱器を使用することもできる。微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）もまた、そのような装置を製造するために使用することができる。フォトリソグラフィプロセスによって、適当な通路、入口及び出口ポート、並びに装置を通るポートを含む、異なる材料の多数の層を作り出すことができる。また、１つの流体装置を示す。多数流体装置を、多重反応装置内で、互いに隣接させて使用することができることに留意されたい。すなわち、装置内で、いくつかの反応を同時又は連続的に行うことができる。流路は、平行に接続されたいくつかの個別のチャネルとすることができる。これは、大量の流体の熱サイクルをより迅速に行うために有用となり得る。装置はまた、１回使用で使い捨てとしてもよく、洗浄して再使用してもよい。
【００３３】
次に図４を参照すると、層なしで連続チャネル５４’のみを示す、１０サイクル装置１２’が示されている。本実施形態では、連続チャネル５４の第１の部分５８’を示す。この第１の部分を第２の部分６２’に接続する接続部分６０’も示す。第２の部分６２’を離れた後、流体は、第２の接続部分６４’に入る。流体は次いで、第３の接続部分６８’に入る前に、第３の部分６６’に入る。従って部分５８から６８は、装置を通る１サイクルを示す。ＰＣＲ装置内において、第１の部分は変性部分である。第１の部分５８’は、変性部分である。第２の部分６２’は、アニーリング部分であり、第３の部分６６’は、伸張部分を実施する。この図では、上向き位置で示され熱伝導層１８に対応する出口５２’に試料が到達するまで、サイクルが１０回繰り返される。入口ポート５０及び出口ポート５２の様々な位置は、当業者にとって明らかであると思われる。本実施形態では、チャネルを管状構造として形成し、オーバーモールドして単一装置を形成することができる。管状装置を、図１から図３に示す３つの熱伝導層でオーバーモールドすることができることにも留意されたい。
【００３４】
次に図５を参照すると、第２の実施の形態７４の分解図が示されている。本実施形態では、流体入口ポート５０’’が、第３の層２２’’に配置される。流体入口ポート５０’’は、第２の絶縁体２６’’、第２の熱伝導層２０’’、第１の絶縁体２４’’、及び第１の熱伝導層１８’’を通って延びる。初期変性チャネル７６が、熱伝導層１８’’内に形成される。この構築された実施形態では、初期変性チャネル７６は、６．５ｍｍであった。本実施形態で示すチャネル部分は、断面が三角形である。チャネルは、フォトリソグラフィ技術を用いた方位依存性エッチングを用いて形成された。第１の熱伝導層１８’’内に、複数の第１のサイクル部分５８’’を示す。第１のサイクル部分５８’’は、初期変性チャネル７６に流体的に連結される。本実施形態では、複数の接続部分６０’’を示す。これらの部分には、穿孔又は反応性イオンによる深いエッチングを行うことができる。本実施形態は、縦軸Ｘ及び横軸Ｙを有する。第１の部分５８’’、第２の部分６２’’、及び第３の部分６６’’はそれぞれ、第１の部分５８’’上のわずかなＬ字形変形部以外は横方向に配置される。本実施形態では、流体は一般に、熱伝導層１８’’から第３の層２２’’へ第１の接続部分６０’’を通って流れる。流体は次いで、第２の層２０’’である伸張プレートに入る。従って流体は、第３の部分６６’’の中央から横方向外側に通過し、次いで第１の部分５８’’の列のうちの１つまで通過する。以下図６で説明するように、流体は、各サイクルで装置の側部を交互に通過する。本実施形態では、チャネルは、第１の熱伝導層１８’’の下面３４’’内、第２の層２０’’の頂面３８’’、及び底部層２２’’の頂面４６’’内にエッチングされる。第１の絶縁体２４’’及び第２の絶縁体２６’’は、流体通路チャネルの画定するのを助ける。構築された実施形態では、次及び後続の変性チャネルが長さ１ｍｍである６．５ｍｍの初期変性チャネルで、３０回のＰＣＲサイクルが実施される。アニーリングチャネル又は第３の部分６６’’もまた、長さ１ｍｍである。伸張チャネル又は第２の部分６２’’は、長さ２ｍｍである。伝導層及び絶縁層を互いに結合させるために、エポキシ又はその他の接着剤を使用することができることに留意されたい。
【００３５】
装置は、サーマルインクジェットカートリッジ及び集積チップ製造から取り入れた技術を用いて、製作することができる。装置は、シリコンで形成し、後に、互いに結合させた後でダイスカットすることができる。装置内に位置合せのための要素を組み込んで、様々な固定具によって装置の組立てを助けることを可能にすることができる。
【００３６】
図６Ａ〜図６Ｃに最もよく示されるように、第１のサイクル部分５８’’内の流体流れは、横方向内向きに延び、第１の接続部分６０ａ’’を通り、そこで第２のサイクル部分６２ａ’’に入る。第２のサイクル部分６２ａ’’内の流体流れもまた、横方向内向きである。流体は次いで、第２の接続部分６４ａ’’のうちの１つを通り、第３のサイクル部分６６ａ’’を通って横方向外向きに流れる。こうして、流体はこの時点で、第１のサイクル部分５８’’に流体が入ったときと比べて、流体装置１２’’の横方向反対側にある。流体は次いで、第３の接続位置６８ａ’’に入り、そこで、第１のサイクル部分から見て装置の反対側にある、別の第１の部分５８ｂ’’に入り、第１のサイクルからの流体とは反対方向に横方向内向きに移動する。流体が第１の部分５８ｂ’’に入ると、第２サイクルが開始する。流体は次いで、上記方向と反対方向に流れ、すなわち、第２の部分６２ｂ’’内で、流体は横方向内向きに左側から装置の中央へと流れる。様々な熱伝導層間を移行するとき、流体は、第１の絶縁体２４’’及び第２の絶縁体２６’’それぞれの内部にある様々なポート２８’’内を通過する。また、本実施形態では、出口ポート５２’’は、第３の熱伝導層２２’’を貫通する。図３に最もよく示すように、第３のサイクルは、第１のサイクル部分５８ｃ’’内で始まる。
【００３７】
次に図７を参照すると、流体装置１２’’’の第３の実施形態８０が示されている。本実施形態では、ガラス層８２が、第１熱伝導層１８’’’上に設けられる。ガラス層８２によって、蛍光Ｘ線又はその他の光検波がそこを通ることが可能になる。ガラス層８２は、好ましくは検出波長で透過性であり、従って、第１の部分５８’’’内のＤＮＡ量をモニタすることができる。また本実施形態では、第１の熱伝導層１８’’’と第１の絶縁体２４’’’の間で、加熱器層８４を使用する。第２の多結晶シリコン加熱器層８６はまた、図１〜図４に示す加熱器の位置で使用することもできる。適当なタイプの加熱器の１つは、多結晶シリコン加熱器である。様々な多結晶シリコン被覆が、インクジェット装置に一般に使用される。加熱器を、別個の層として示すが、層を形成するためにドーピングを用いることもできる。また、層は、エピタキシャルに形成することができる。他で説明するように、加熱器は、縁部、又は層の面に接触することができる。
【００３８】
次に図８を参照すると、電気式「ジュール」加熱装置を使用する、第４の実施形態９０が示される。第１の電源９２及び第２の電源９４が、それぞれジュール加熱器９６及び９８に結合される。すなわちジュール加熱器９６は、熱伝導層１８’’’’の上面上に配置することができる。第２のジュール加熱器９８は、第３の層２２’’’’の底面上に配置される。実際的な実施形態で、温度を制御するために、熱電対、サーミスタ、又はその他の感知装置が必要とされることがある。装置は、当業者に知られた様々な方法で、熱サイクル装置に外付けし、又はそれと一体にすることができる。
【００３９】
図９に最もよく示すように、１対の接点１００、１０２を使用して、装置に電流を流すことができる。電気接点は、一般に用いられる様々な手段によって、シリコンの表面上又は縁部に製作することができる。接点１００、１０２の間に電位差をもたらすことによって、所定量の電流がそこを通過し、特定量の熱を生じることができる。必要とされる導電率は、Ω／□又は単にΩの単位を用いて、材料の表面抵抗ｑｓによって特徴付けることができる。ｑｓは、バルク抵抗率ｑｂを導電層の厚さで割ったものである。バルク伝導の場合、シリコン層の厚さ全体を用いることができる。図９に示すように、最も単純な状況では、装置の幅の両端間の接触が各端部で生み出される。電流は、その構成に応じて、表面の層又はバルクを通って流れる。電力は、単位面積当りＶ２／ｑｓＬ２として散逸され、単位幅当りの電流は、Ｖ／ｑｓＬとなる。Ｌが１ｃｍ、ｑｓが１０Ω／□の装置の場合、１０Ｖ印加することによって、幅１ｃｍ当り１Ａの電流密度で、１０Ｗ／□ｃｍ２の散逸が生じる。いかなる特定の装置も、この加熱量より大きい、しかし通常は大幅により小さい加熱量を必要とすることができる。
【００４０】
次に図１０Ａ及び図１０Ｂを参照すると、図１０Ａは、指定された厚さの導電層に対する、１０Ω／□を達成するために必要とされるバルク抵抗率を示す。例えば、厚さ５００μｍ（０．５５ｍｍ）のシリコンウェハは、バルク抵抗率が０．５Ω・ｃｍの場合、１０Ω／□の表面抵抗を有する。０．０１Ω・ｃｍの抵抗率を有する厚さ１０μｍの層が、金属めっき、イオン注入、又はイオン拡散技術によってシリコン表面上に作り出される場合、同じ表面抵抗が生じる。ドーピング又は注入を用いる場合、図１０Ｂは、所要のバルク抵抗率を達成するために必要とされるｎ型キャリアのレベルを示す。Ｐ型ドーピングを用いることもできる。
【００４１】
次に図１１を参照すると、シリコン層内でバルクジュール加熱が用いられる場合、装置の横方向（又は縦方向）縁部上に接点を設けることができる。図示のように、接点１０４及び１０６が、第１の熱伝導層１８’’’’に設けられる。第２組の接点１０８、１１０が、第３の層２２’’’’に結合される。電気接点は、装置と一体でもそれと別個であってもよいことに留意されたい。こうして、電流が装置を通って大量に流れ、指定されたジュール熱を生み出すことができる。そのような構成もまた、ガラス層８２を備えることができる。上記様々なタイプの加熱器は、図７、図８又は図１１で説明したいかなる実施形態と共に用いることもできる。
【００４２】
次に図１２を参照すると、ランダムアクセスＰＣＲアナライザ１２０が示される。本実施形態では、試料容器１２２及び１２４内の試料が、ＤＮＡ／ＲＮＡ試料調製ブロック１２６へと供給される。試料調製キット１３０は、熱サイクル装置を備えることができる。必要に応じて、ブロック１２８で逆転写酵素反応を実施して、ＲＮＡからｃＤＮＡを形成することができる。試料調製キット１３０を、ブロック１３０として全体的に示す。試料調製キット１３０を使用して、組織又は流体の投入試料から、ＤＮＡ材料を抽出することができる。試料調製キット１３０は、試験キットと一体にすることができる。調整後、試料アリコートを試料から取り出し、容器Ａ３、Ａ２、及びＡ１内に分配する。様々なプライマー、プローブ、特別に緩衝された溶液、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰがブロック１３２に示されており、これらを、試験キット１３６、１３８及び１４０内に供給することができる。ＰＣＲプロセス時に、プロセスの酵素はある反応時間を有する。その反応時間は、特定のプロセス及び試料の熱吸収率に応じて変わる。こうして流体の循環速度は、この吸収及び酵素の反応時間によって制限される。熱サイクル要素１４２、１４４、及び１４６もまた、試験キット内に設けることができる。熱サイクル要素に適当な変性及びアニーリング温度を提供するために、プラテン１４８及び１５０を使用することができる。試料の挿入前に、インキュベータ１５２を形成するプラテン１４８、１５０の間に、熱サイクル要素を挿入する。こうして熱サイクル要素１４２、１４４、１４６は、所望の温度まで上げられ、試料は、所定の速度で装置を通って抜き出され又は押し出される。ブロック１５４は、蛍光励起、レーザなどを用いてリアルタイム検出を提供する。熱サイクル要素の様々な地点で、増幅量を検出することができる。プロセスの最後に、終点検出１５６を設けることができる。試料は、様々なタイプの分析に使用することができる。終点検出１５６の後、試料及び試薬の混合物を廃棄することができる。
【００４３】
サイズが小さく、期待される費用が低く、使い捨て可能な性質の熱サイクル要素によって、ランダムアクセスＰＣＲアナライザを製作することが可能になる。本実施形態以前は、実質的に全てのＰＣＲ反応が、回分操作として、システム内の熱サイクル炉の数によって決定される同時に行われる様々な反応の回数分実施されていた。１つのタイプの増幅システムは、２つの熱サイクルを有し、従って３つ以上の異なるプロトコールを同時に行うことはできない。ＰＣＲ試験の回数が時間とともに増加するので、ランダムアクセスアナライザに対する需要はより多くなるであろう。熱サイクル装置は、多数の試験を実施することができる。ランダムアクセスアナライザは、アナライザに与えられるそれぞれ及び全ての試料に対して、利用可能な試験のいかなる組合せをも行う能力を有するものとして定義することができる。従って、様々な数の加熱器又は内蔵加熱器を、各熱サイクル要素に設けることができる。従って、様々な数の試料及び様々な数の熱サイクル要素を、同時に実施することができる。例えば、様々な温度を様々な熱サイクル要素内で実現することができるように、中央制御装置によって加熱量を制御することができる。ランダムアクセスアナライザは、バッチアナライザに勝るいくつかの利点を有する。すなわち、それらはバッチアナライザよりも速く、より柔軟性が高く、より多目的であり、より生産的である。ＰＣＲ増幅を実施するための、非常に多くの特定タイプの熱サイクル要素及び必要な試薬をそれぞれ含む、様々なＰＣＲキットを製作できることが想像される。キットは、様々なポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、特別に配合された緩衝液、及びプライマーを備えることができる。任意で、試料調製及び検出のためのその他の試剤を提供することもできる。従って、温度をプログラムする能力を有することによって、様々なＰＣＲ試験プロトコールを行うことができる。インキュベータ１５２は、熱サイクル装置を通して流体を抜き出す手段を備えることができる。細胞試料を溶解してＤＮＡを放出する、又は逆転写酵素反応を実施してＲＴ−ＰＣＲ用のｃＤＮＡを作り出すなど、様々な試料調製を実施することもできる。
【００４４】
図１３を参照すると、チャネル５４の一部が示されている。この部分を、第１の部分５８として示す。試料１６０が、チャネルの第１の部分５８内に配置される。１対の泡１６２、１６４が、その中に試料１６０の範囲を区切る。泡１６２、１６４は、流体を個々の試料区間１６０に分割するのに十分なサイズで、流れの中に断続的に導入される。これは、密閉混合によってＤＮＡ溶質の温度−時間経験の平均化を促進する（ドウェル時間のばらつきを低減する）ために行われ、流体試料が蛇行通路を通って移動するときに、分離混合も生じる。泡１６２、１６４の存在によって、流体区間試料１６０内の矢印１６６で示される循環が押し進められる。流体は、壁のところで静止しなければならないので、ほぼ環状の流れプロファイルが存在する。いかなる流体要素の速度の分布、及び従ってその時間温度プロファイルの分布も、区間の範囲によって限定される。実際は、流体に対する泡の比率を可能な限り低く保つことが望ましい。図では、比率は約２０％である。図はまた、流体コラムの長さの増大に関連するオーバーヘッドを表すので、比率を最低限に保つことが望ましい。最大の時間のばらつきの測定は、流体区間の長さを単一サイクルの長さと比べることによって得ることができる。流体区間が５〜１０ダイアメータであり、単一サイクルの長さが１００ダイアメータである場合、時間のばらつきは、約５〜１０％となる。ＰＣＲ装置は一般に、１０未満、またしばしば１未満の低いレイノルズ数で動作するので、泡の使用によって熱サイクルを改善することができる。これは、処理される流体の量が少ない、すなわち数ナノリットルから数十マイクロリットルの範囲であるため生じる。これはまた、流体への熱伝導が、深さの平方に比例し流体の拡散率に反比例するその熱緩和量によって規定されるため生じる。それに関連する時間は、深さが１００〜２００μｍの間である場合数十秒であるが、断面がより大きいチャネルでは、二乗依存のため急速に増加することがある。流れに関連付けられるレイノルズ数が低い場合、慣性効果は粘性力に支配され、混合は最低限となり又は存在しない。長いチャネルでは、流れはポアズイユ流に近づく。ポアズイユ流れの状態では、混合が生じない。中心付近の材料は、平均速度の２倍で流れるが、壁付近の材料は、大幅に低速で進む。こうして、ＰＣＲ環境内で、チャネル中心付近の材料は、平均時間の約半分でマイクロチャネル内を高速で移動し、サイクル増幅の有効性を潜在的に制限する。一方、壁に最も近い材料は、平均時間より大幅に低速で移動するが、その他の有害な作用が存在することがある。分子レベルではブラウン運動があり、従っていくらかの混合が生じることに留意されたい。こうして、上記泡１６２、１６４を提供することによって、より全体的な混合を行うことができる。
【００４５】
次に図１４を参照すると、非常に多数のＬＥＤ１６８及びフォトダイオード１７０を、プロセス全体を通して、様々な地点、及び様々なサイクル部分内に設けることができる。図示の通り、ＬＥＤ１６８及びフォトダイオード１７０を、第１の部分５８内に設けることができる。また、フォトダイオード及びＬＥＤの位置は、第１の部分、第２の部分、又は第３の部分、或いはそれらの様々な組合せなど、連続チャネル内の様々な位置に位置決めすることができる。例えば、全て又は多数のアニーリング通路が、ＬＥＤ及びフォトダイオードを備えることができる。検出結果を改善するために、光濾過要素を使用することもできる。存在するＤＮＡの量を監視するために、こうしてフォトダイオードを、アナライザ装置に結合することができる。上述したように、存在するＤＮＡの量はまた、ウィンドウを透過する蛍光放射によって測定することもできる。レーザ又はＬＥＤは、測定される蛍光の供給源を提供することができる。ワイヤ１６９、１７１を、制御装置又はアナライザ装置に結合させることができる。
【００４６】
同一又は別の装置で、ＰＣＲ増幅産物を繰り返し再循環させることを可能にするために、外部手段を使用することもできる。各装置の間で、増幅を定量するために検出を実施することができる。
【００４７】
次に図１５を参照すると、熱サイクル要素１８５に結合された、再循環装置の一実施例が示されている。図１５では、ポンプ１７６が上側チャンバ１７８に結合される。すなわち、ポンプ１７６は、試料をチャンバ１７８内へと抜き出す。これを実施するために、ポンプが吸引するときに、試料をチャンバ１７８へと供給する弁１８０を開く。弁１８２及び１８４を閉じる。次いで、弁１８０を閉じ、弁１８２を閉じ、弁１８４を開けて通気し、ポンプ１７６を作動させて試料を下側チャンバ１８６に分配する。こうして、熱サイクル要素１８５は、試料が第１のチャンバ１７８から第２のチャンバ１８６へと通過するときにそれを増幅する。再循環操作は、第１の弁１８０を閉じ、第２の弁１８２を開き、第３の１８４を通気のために開くことによって実施することができる。熱サイクル要素１８５を通る所望の数のサイクルが実施された後、第１の弁１８０を開き、第２の弁１８２を開き、第３の弁１８４を閉じ、ポンプを分配モードで動作させることによって、流体を分配することができる。様々なときに、小部分を分配することができ、又は、熱サイクル要素１８５内で増幅量を測定することができる。
【００４８】
上述のように、装置を製作するために様々な技術を使用することができる。例えば、図４に記載したように管を予め構成することができ、次いでその周りに可撓性材料を成形することができる。層を分離するために、様々な層内に絶縁体を成形することができる。また、外面に対するチャネル層の位置は、ＰＣＲプロトコールによって要求される３つの望ましい温度で、チャネル通路が平衡化するように選択することができる。
【００４９】
本発明を操作するための方法は、複数の層を有する装置内に試料を導入することを含む。試料の導入前に、各層の温度は、ＰＣＲプロトコールで要求される３つの温度を維持する。本実施形態では、底部熱伝導層の温度は、上部熱伝導層よりも低い。こうして、３つの伝導層が定常状態に到達したら、試料を装置内に導入する。熱平衡時は、上層全体が温度源と同じ温度であり、下層全体が、下側温度源の温度であることに留意されたい。こうして、装置は平衡状態となる。中間層は、より高温とより低温の間の平衡温度である。投入ポートを通じて試料を配置し、第２の実施形態の場合は、その他の変性ステージよりも長い初期変性ステージに供給する。これは、実施されるＰＣＲのタイプによって要求され、又は要求されないことがある。ＰＣＲ試料は、第１の温度で、サイクルの第１の部分内を循環する。試料を、第１及び第２の層の間にある第３の層を通して、下層である第２の層へと移動させる。試料はまた、絶縁体２４及び２６を通る。流体装置を通して流体を押し進めるために、真空、圧力ポンプ、毛管力、又はその他の手段など、様々な手段を使用することができる。流体流れの速度によって、第１の部分内でＰＣＲ試料が最高温度下に置かれる時間の長さが決定される。第１の部分の最後が実施された後、流体は、中間層を通じて底部流体層へと通過する。第１のサイクルの３つのチャネル部分を全て横断した後、流体試料は、第１の層内の第２のサイクルに入る。図５に示すように、第１の部分の様々な列を小型の構造内に設けることができるので、小さい領域内により多くの熱サイクルを設けることができる。
【００５０】
実施されるＰＣＲのタイプに応じて、様々な数のサイクルを様々な装置内に設けることができることに留意されたい。図５の３０ＰＣＲサイクルに比べて、より多い又はより少ない数のサイクルを設けることができる。図１５に関して上述したように、熱サイクル要素は、流体を再循環させて装置内に戻すために、装置に結合させることができる。これは、増幅量を検出する検出ステージへの、フィードバック応答として行うことができる。所望の量の増幅が実施されていない場合、流体試料を再循環させて熱装置内に戻すことができる。十分な量の試薬が反応に使用可能となるように、様々な試薬を試料と共に様々なときに投入することもできることにも留意されたい。
【００５１】
次に図１６を参照すると、本発明の第６の実施形態が示されている。本実施形態では、第３の温度源２００を示す。第３の温度源２００は、第１の接点２０２及び第２の接点２０４を備える。接点は、図１１に関して上述したのと同様のやり方で構成することができる。すなわち、装置及び第２の層２０Ｖを通して、ジュール加熱を実施することができる。すなわち、伸張層を加熱することもできる。本実施形態では、各層が熱的に無関係又はほぼ無関係となるように、絶縁層２４Ｖ及び２６Ｖの絶縁特性を増大させることができる。すなわち、３つの温度源を備える一実施形態では、各層の熱依存性を低減させる又はなくすことが望ましいことがある。もちろん、上記で説明した多結晶シリコン加熱器などの、独立した加熱層によって加熱を行うこともできる。すなわち、多結晶シリコン加熱器など、独立した加熱器は、絶縁層２４Ｖ、２６Ｖの一方又は両方と、第２の層２０Ｖとの間に配置されることになる。また、本実施形態では、第１及び第２の温度源のための様々な構成を含むことができる。すなわち、多結晶シリコンなど様々なタイプの加熱器を含むことができ、装置を加熱するために、表面加熱又は外部プラテンを使用することができる。
【００５２】
次に図１７を参照すると、本発明の第７の実施形態２１０が示されている。この実施形態は、以前の実施形態で述べたように３つではなく、流体熱伝導層を２つだけ有する。本実施形態では、第１の層２１２及び第２の層２１６が、絶縁層２１４によって分離されている。層２１２及び２１６は、熱伝導層である。本実施例では、第１の層及び第２の層が、その内部に連続チャネル２１８を有する。連続チャネル２１８は、第１の部分２２０及び第２の部分２２２を有する。第１の部分２２０は、第１の層内に配置され、第２の部分２２２は、第２の層２１６内に配置される。ＰＣＲのいくつかの形では、伸張温度とアニーリング温度が重複することがある。従って、アニーリング及び伸張は、同じ層内で実施することができる。こうして、本実施形態は、サイクルを形成する２つの層及び２つの異なる温度部分を有する。絶縁層２１４が任意であることにも留意されたい。すなわち、第１の部分及び第２の部分が、変性層と同様アニーリング及び伸張のための所望の温度を有することができるように、適切な温度勾配を装置に加えることができる場合、いくつかの実施形態で絶縁層２１４をなくすことができる。
【００５３】
本実施形態はまた、上記様々な加熱手段を含むことができる。すなわち、様々なプラテン又はその他のタイプの加熱器を、装置の様々な部分に配置することができる。加熱器は、絶縁層２１４と、層２１６又は層２１２、或いは両方との間に配置することができる。様々な数のサイクルを装置内に設けることができることにも留意されたい。
【００５４】
様々な数のサイクルを有する様々な実施形態を示してきた。検出又はさらなる変性などのサイクル変化の後又はその間に、アニーリング又は伸張ステップを実施することができることに留意されたい。例えば、最後の伸張ステップの後に、余分の変性ステップを含むことができる。また、第１のサイクル部分又は第１及び第２のサイクル部分で、延長された変性ステップを行うこともできる。
【００５５】
次に図１８及び１９を参照すると、熱サイクル装置２５２用の試験用取付け具２５０が示されている。熱サイクル装置２５２の中心に、流体装置１２がある。熱サイクル装置２５２は、流体装置１２を備え、上部キャップアセンブリ２５４及び下部キャップアセンブリ２５６を備える。取付け具アセンブリ２５８は、取付け頂部２６２に結合された脚部２６０を備える。取付け頂部２６２は、熱サイクル装置２５２を受けるための凹部２６４を備える。上部キャップアセンブリ２５４及び下部キャップアセンブリ２５６は、ＰＣＲ装置内の変性加熱器及びアニーリング加熱器である。
【００５６】
上部キャップアセンブリは、内部にチャネル２７２を有するキャップハウジング２７０を備える。チャネル２７２は、プラテン２７４を受ける。プラテンをキャップ部片２７０内に固定するために、端部キャップ２７６が使用される。ロッド加熱器２７８及び熱電対２８０が、端部キャップ２７６内の開口２８２内に挿入される。ロッド加熱器は、流体装置１２に温度が与えられるように、プラテンを所定の温度に加熱するために使用される。より具体的には、流体装置１２の上面が、プラテン２７４に結合される。
【００５７】
下部キャップアセンブリ２５６は、頂部２６２の凹部２６４内で受けられる案内特徴２９２を有する、下部キャップハウジング２９０を備える。プラテン２９４が、下部キャップアセンブリ内で受けられる。ロッド加熱器２９６及び熱電対２９８は、ロッド加熱器が下部プラテン２９４に熱を供給し、プラテンを所定の温度に加熱するために熱電対２９８が使用されるように、端部キャップ３０２内の開口３００内に挿入される。プラテン２９４はまた、入力チューブ３１０及び出力チューブ３１２に結合することもできる。プラテンを貫通して、入力チャネル３１４及び出力チャネル３１６を設けることができる。流体装置１２とプラテン２９４の間の流体漏れを防ぐために、それらの間にガスケット３１８、３２０を結合することができる。装置は、ねじ切りされた締結具３４０と共に保持される。
【００５８】
下部キャップ２９０に、ヒートシンク３５０を結合することができる。上部プラテン２７４は、下部プラテン２９４より高温であるので、ヒートシンク３５０によって熱が放散される。これは、流体装置１２の変性層及びアニーリング層を所定の温度に維持するのに役立つ。
【００５９】
入力チューブ３１０及び出力チューブ３１２を熱サイクル装置２５２に固定するために、１対のホースクランプ３５２、３５４を使用することもできる。
【００６０】
構築された流体装置の一実施形態では、０．０２２ｍｍ２のチャネル断面積を用いた。変性部分のチャネル長さは１ｍｍであり、伸張部分は２ｍｍであった。構築された本実施形態では、３０サイクルを使用した。予備変性チャネル長さは、９ｍｍであった。シリコン層の厚さは、０．５７５ｍｍであった。伝導率は、１３０Ｗ／ｍ・℃であった。ポリイミド厚さは、０．１２５ｍｍであり、その伝導率は、０．３１Ｗ／ｍ・℃であった。
【００６１】
反応溶液は、５フェムトモル濃度のヒトゲノム鋳型ＤＮＡを含むことができる。市販のＰＣＲ緩衝液は、決定的に重要な成分である、ｐＨ安定性のためのトリス塩酸緩衝液、及びポリメラーゼ活性に決定的に重要なＭｇ＋＋イオンを提供するためのＭｇＣｌ２を有する。Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのそれぞれに、２００マイクロモル濃度のデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）が提供された。それぞれ２００マイクロモル濃度の１００〜２００塩基対のアンプリコンを規定するために、２０〜３０ヌクレオチドの長さのヒトゲノム鋳型に特有のフォワード及びリバースプライマーが選択された。１反応当り１ユニットの、Ｔａｑポリメラーゼ酵素が選択された。上記の試験用取付け具は、シリンジポンプ（図示せず）に結合され、そこから熱サイクル装置１２を通して反応溶液が給送される。加熱されたプラテンは、９６±１℃の変性温度、及び５４±１℃のアニーリング温度を維持する。プラテン加熱器、及び内蔵熱電対を有する温度制御装置は、それぞれ１６ワットを供給する。３．７５℃／Ｗの熱抵抗を有するヒートシンクを、アニーリングプラテンの露出面に取り付けた。使用したシリンジポンプは、１０μＬの容量、及び１ｍｍ／ｓの流速で０．２２μＬ／ｓの流量を有する。増幅産物は、装置の出力口で収集される。産物中に存在する増幅されたＤＮＡ材料の存在及び量を検出するために、様々な手段を用いることができる。一般的な方法では、分子量によってＰＣＲ産物を空間的に分離するための電気泳動、及びＤＮＡ産物に結合して濃度を示す蛍光プローブを用いる。
【００６２】
本発明を、１つ又は複数の実施形態と関連付けて説明してきたが、本発明はこれらの実施形態に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本発明は、特許請求の範囲の精神及び範囲内に包含することができる、全ての代替例、修正例、及び同等物を網羅することが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、２００４年２月２４日出願の米国仮特許出願第６０／５４７，０３６号、及び２００４年１１月２２日出願の同第６０／６２９，９１０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、熱サイクル装置に関し、より詳細には、生命科学、医療装置、及びバイオテクノロジー分野に適した、多層熱サイクル装置に関する。適当な一応用例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施である。
【背景技術】
【０００３】
生命科学、医療装置、及びバイオテクノロジーなど、様々な分野では、様々な反応を実施するための熱サイクルが必要とされることが多い。反応の１つのタイプは、ＤＮＡ断片などの生体試料がそれにおいて複製される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
【０００４】
ＰＣＲは、特異的に単独の核酸成分を、他の成分が入り組んだ試料内で複製又は「増幅」するための、好ましい方法である。ＰＣＲプロトコールの要件の中には、生体試料及びＰＣＲ試薬からなるＰＣＲ試料を、３つの異なる温度に特定の長さの時間暴露することがある。暴露の温度及び時間は、所望される特定の核酸配列に対して最適化される。ＰＣＲ試料が、３つの温度に複数回暴露されることもまた、要件の１つである。科学的通称において、これら２つの要件は、一般に熱サイクルと呼ばれる。
【０００５】
ヒトゲノム計画などの科学的な試み、及びその他の同様の努力では、極めて多数のＰＣＲ反応を行うことが必要とされる。ＰＣＲの実施に伴う費用及び時間は、何千回又は何百万回ものＰＣＲ反応を必要とする科学的研究にとって法外なものとなり得る。費用削減は、小型化によりＰＣＲ反応をうまく行うのに必要とされる材料の量を削減することによって実現することができる。全ＰＣＲ反応時間は、試料を暴露して所定のＰＣＲプロトコールにおける各温度設定点で平衡化させるのに必要な時間を減少させることによって減少させることができる。
【０００６】
現在の技術は、これらの目標を達成するために、様々な手段に依存している。各方法及び装置は、ＰＣＲ試料内の迅速な温度変化を妨げる、以下の１つ又は複数の特性を有する。１つ又は複数の熱エネルギー源の温度を変化させて、各温度設定点を確立しなくてはならない。これに必要な時間は、装置材料の熱伝導度によって決定され、これは本来的にＰＣＲ試料自体よりも遅い。一定温度の熱源が使用される場合、装置の局所的な領域が所望の温度設定点で平衡化するが、装置内のその周辺領域においては、その材料の熱伝導特性により、漸進的に温度変化が進行する。このため、試料が装置を通って移動するとき、その熱遷移が遅くなる。これらの遷移温度範囲を横断するための時間によって、突然の又は即時の変化をもたらす方法に比べて全反応時間が増大される。装置がより大きいことも必要とされるため、高度の小型化が行われない。従って、ＰＣＲ試料の量の削減によるコストの利益を完全には実現していない。
【０００７】
熱サイクルとも呼ばれる温度サイクルを促進するための装置及び方法が、かなり発達している。Ｄａｎｉｅｌ Ｃｈｕらによる「多容器反応装置のための温度制御（ＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥ ＣＯＮＴＲＯＬ ＦＯＲ ＭＵＬＴＩ−ＶＥＳＳＥＬ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ）」という名称の米国特許第６，３３７，４３５号には、多数ウェル容器内の１つ又は複数の試料が、多数ウェル容器と加熱装置の間の物理的接触により生じる温度変化に曝される手法が記載されている。熱サイクルを実施するために必要とされる時間は、加熱装置の熱量及びその他の物理的性質によって主に決定され、従って比較的遅い。
【０００８】
多数ウェル装置は、試料の導入及び除去のためのウェルへのアクセスを提供するために、通常その頂部が開いている。これは、望ましくない試料の蒸発環境を生み出す。上述の特許並びにその他の特許は、カバーをすることによりこの作用を低減させるよう試みている。カバーによって、蒸発が減少するが、望ましくない凝縮の機会がもたらされる。この影響は、カバーを加熱することによって軽減されるが、これによって、システムに競合温度源が導入され、全ＰＣＲ反応時間がさらに増大される。
【０００９】
開いたウェル／容器システムの欠点を軽減するために、閉じた小型装置を製作するための著しい努力が、生物工学界においてなされてきた。閉じた小型システムの利点は、試料の蒸発が低減され、凝縮が低減され、且つ、より少量の試料及び試薬量の使用によって費用が削減されることである。そのような小型システムの例が、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍａｔｈｉｅｓ及びＡｄａｍ Ｗｏｏｌｌｅｙによる「小型反応チャンバ及びそれを組み込む装置（ＭＩＮＩＡＴＵＲＥ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＣＨＡＭＢＥＲ ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＮＧ ＳＡＭＥ）」という名称の米国特許第６，２８４，５２５号、及びＲｉｃｈａｒｄ Ｍａｔｈｉｅｓ、Ｐｅｔｅｒ Ｓｉｍｐｓｏｎ、及びＳｔｅｐｈｅｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓによる、「一体型ＰＣＲ−ＣＥ装置の微細加工のためのプロセス及びそれにより製造される製品（ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＡＮ ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ ＰＣＲ−ＣＥ ＤＥＶＩＣＥ ＡＮＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＰＲＯＤＵＣＥＤ ＢＹ ＴＨＥ ＳＡＭＥ）」である。そのような装置は、閉じた反応チャンバを備えて製造される。試料及び試薬液が、流体チャネルネットワークを通じて、それらのチャンバに流入及び流出する。抵抗ワイヤなどの加熱要素が、これらのチャンバ内に製作され、ＰＣＲアッセイの実施に必要とされる加熱エネルギーを提供する。
【００１０】
より大きい開いたシステムと同様、装置の熱的性質及び構造設計が、反応時間を主に決定する。これらのシステムは、既に述べた手法に対する改善ではあるが、このような構造の熱特性が限定要因となる。また、その所定位置にある加熱要素を製造し、制御し、監視することは困難を伴い、装置の費用がかなり追加される。
【００１１】
ＰＣＲプロセスの加速を試みる別の方法が、Ｊｏｃｈｅｎ Ｆａｎｚｅｎによる「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による極めて高速のＤＮＡ複製のための方法及び装置（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＥＸＴＲＥＭＥＬＹ ＦＡＳＴ ＤＮＡ ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＢＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ （ＰＣＲ））」という名称の米国特許第６，１８０，３７２号に記載されている。この実施の形態では、マイクロ流体チャネルの２次元ネットワークが、２つの温度加熱／冷却要素内に含まれている。このマイクロチャネル装置は、装置の上下の加熱／冷却要素内の変化による急速な温度変化に曝される。このシステムは、加熱／冷却要素が物理的に完全に接触するため、要素間のエネルギー移動が非常に効率的である。ただし、総ＰＣＲ反応時間は、加熱／要素内及びマイクロチャネル材料内の温度を変化させる能力によって、依然限定される。
【００１２】
上記装置及び方法は、要素から装置への、最終的にはその中に収容されるＰＣＲ試料へのエネルギー移動を最適化しようと試みる、加熱要素の様々な構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）によって、ＰＣＲのための熱サイクルの問題に対処する。これらの方法及び装置は総て、装置を通じて試料へと熱エネルギーを伝達するその能力によって制限されている。ＰＣＲ試料をＰＣＲプロトコールの所望の各温度設定点に暴露するために、加熱要素自体が温度変化しなければならない場合にはまた、更なる制限が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，３３７，４３５号
【特許文献２】米国特許第６，１８０，３７２号
【特許文献３】米国特許第６，１８０，３７２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、熱サイクルを迅速に実施するための装置が提供されるように、従来の知られた装置の熱的制限を低減させるとともに、蒸発、凝縮、及び費用を減少させる、熱サイクル装置を提供することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、改善された熱サイクル実施のための方法及び装置を提供する。
本発明の一態様では、装置は、第１の層と、第１の層に近接する第２の層と、第１の層と反対側で第２の層に近接する第３の層と、連続チャネルとを備える。当該連続チャネルは、前記第１の層、第２の層、及び第３の層内に形成される。当該連続チャネルは、複数のサイクル区間を有する。各サイクル区間は、前記第１の層内に配置された第１の部分、前記第２の層内に配置された第２の部分、及び前記第３の層内に配置された第３の部分を備える。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、反応を実施するための装置が、第１の加熱手段と、第１の加熱手段に熱的に連結された第１の熱伝導層と、第１の熱伝導層に近接する第１の絶縁層と、第１の絶縁層に直接隣接する第２の熱伝導層と、第２の熱伝導層に直接隣接する第２の絶縁層を備える。第３の熱伝導層が、第１の層の反対側で第２の層に近接して配置される。連続チャネルが、第１の熱伝導層、第１の絶縁層、第２の熱伝導層、第２の絶縁層、及び第３の熱伝導層を通って形成される。当該連続チャネルは、複数のサイクル区間を有し、各サイクル区間は、第１の熱伝導層内に配置された第１の部分と、第３の熱伝導層内に配置された第２の部分と、第２の熱伝導層内に配置された第３の部分とを含む。
【００１７】
本発明のさらに別の態様では、反応の実施方法は、第１の層、第２の層、及び第３の層を有する装置内に試料を導入することと、第１の層におけるサイクルの第１の部分を第１の温度で実施することと、試料を第３の層に移動させることと、その後第３の層におけるサイクルの第２の部分を第１の温度より低い第２の温度で実施することと、試料を第２の層に移動させることと、その後第２の層におけるサイクルの第３の部分を第１の温度と第２の温度との間の第３の温度で実施することと、第１の部分、第２の部分、及び第３の部分を、反応を実施するための所定の回数繰り返して実施することとを含む。
【００１８】
本発明の１つの利点は、３つの異なる温度を用いるポリメラーゼ連鎖反応を実施するために、熱エネルギー源が２つしか必要とされないことである。うまく上層及び下層が１つの温度に維持されるので、各層の熱サイクルによる遅延が存在しない。これによって、既存の技術に比べてプロセス全体が促進される。
【００１９】
本発明のその他の利点及び特徴は、添付の図面及び添付の特許請求の範囲と関連付けて、好ましい実施の形態の詳細な説明を考慮して見ると明らかになるであろう。
【００２０】
本発明の様々な特徴及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むと容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態による熱サイクル装置の第１の実施例を示す斜視図である。
【図２】図１の熱サイクル装置の分解図である。
【図３】図１及び図２に示す熱サイクル装置の部分破断断面図である。
【図４】図１から図３の装置のチャネルを示す斜視図である。
【図５】本発明の第２の実施形態を示す分解図である。
【図６】図５の装置の断面図である。
【図７】本発明の熱サイクル装置の第３の実施形態を示す断面図である。
【図８】本発明による熱サイクル装置の第４の実施形態を示す断面図である。
【図９】本発明に従って形成された加熱器を示す斜視図である。
【図１０Ａ】図９に従って形成された加熱器の、厚さに対するバルク抵抗率の図表である。
【図１０Ｂ】図９に示す加熱器の、ｎ型キャリアドーピングに対するバルク抵抗率の図表である。
【図１１】本発明の第５の実施形態を示す断面図である。
【図１２】ＰＣＲアナライザ及びそのためのキットを示す概略図である。
【図１３】熱サイクルを改善するために泡を使用するチャネルを示す断面図である。
【図１４】ＬＥＤ及びフォトダイオードをその中に有するチャネル部分を示す断面図である。
【図１５】本発明による装置の概略図である。
【図１６】本発明の第６の実施形態を示す断面図である。
【図１７】第７の実施形態を示す断面図である。
【図１８】本発明に従って形成された流体試験装置を示す斜視図である。
【図１９】図１８の装置の分解図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
添付の図では、同一の構成要素を識別するために同一の参照番号を使用する。試薬、時間、材料、及びチャネル構成を含む、様々な実施例を例として以下で説明するが、それらは限定を意図するものではないことに留意されたい。また本発明を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関して説明する。ただし、本発明の使用により、様々な生物学的及び化学的分野に利益をもたらすことができる。本装置は熱サイクルに適しているが、加熱装置を本装置と一体にしなくてもよいことにも留意されたい。すなわち、加熱装置は、本装置に連結される外部装置とすることができる。
【００２３】
ここで図１を参照すると、熱サイクル装置１０は、流体装置１２、第１の温度源１４、及び第２の温度源１６を備える。流体装置は、図示のように、第１の熱伝導層１８、第２の熱伝導層２０、及び第３の熱伝導層２２から形成される。層は平坦な矩形とすることができる。層はまた、同一の熱伝導層の別々の層（ｌａｙｅｒ ｏｒ ｓｔｒａｔａ）とすることができる。すなわち、装置において層は、装置全体にわたり温度が同一の領域とすることができる。装置の材料は、以下でさらに説明するように、同じでも異なってもよく、絶縁体を有しても有さなくてもよい。高い熱伝導度を有する様々なタイプの材料を、本発明に使用することができる。熱伝導度が高いことによって、層全体にわたる温度が等温になる。例えば、アルミニウム上の鋼などの金属、及びシリコンなどの半導体は、最も好ましい材料である。ただし、ガラス及び様々なタイプの複合プラスチックなど、その他の材料を熱伝導性材料に使用することもできる。各層は、それぞれ異なる材料で形成しても同一の材料で形成してもよい。層は互いに近接する。すなわち、層同士は、直接隣接したり、隣接し、或いは、それらの間に配置された加熱器、絶縁体、又はその他の構造を有することができる。
【００２４】
様々な層を少なくとも部分的に熱的に絶縁させるために、絶縁層を使用することができる。第１の絶縁体２４が、第１の熱伝導層１８と第２の熱伝導層２０の間に配置される。第２の絶縁体２６が、第２の熱伝導層２０と第３の熱伝導層２２の間配置される。第１の絶縁体２４及び第２の絶縁体２６は、熱伝導層間に平坦な層として形成することができる。もちろん、そのような絶縁体のその他の実施形態が当業者には明らかであろう。第１の絶縁体２４及び第２の絶縁体２６は、好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、又はポリイミドなど、低い熱伝導特性を有する材料から製作される。図２に最もよく示されるように、絶縁体２４、２６は、熱伝導層間で流体を移送することができるように、それを貫通する様々なポート２８を備える。これらの層を穿孔し、又はこれらの層に反応性イオンで深いエッチングを行えばよい。絶縁体２４及び２６は、２つの温度源を使用して３つの温度を維持することができるように、層間の熱バッファとして作用する。すなわち、各層は迅速に平衡化して等温となる。等温層がもたらされることによって、温度伝達が非常に急速になる。ＰＣＲプロセスにおける２つの限定要因は、試料の熱吸収、及び化学反応における酵素の働きである。こうしてＰＣＲを、本来的に可能な限り高速で実施することができる。
【００２５】
ポート２８は、穿孔及びレーザアブレーションを含めて、様々なやり方で形成することができる。１層形態の場合、第１の絶縁体は、頂面３０及び底面３２を有する。頂面３０は、第１の伝導層１８の底面３４に隣接する。絶縁体２４の底面３２は、熱伝導層２０の頂面３８に直接隣接する。第２の熱伝導層２０の底面４０は、第２の絶縁層２６の頂面４２に直接隣接する。絶縁体２６の底面４４は、第３の熱伝導層２２の頂面４６に直接隣接する。第１の熱伝導層１８の頂面３６は、入口ポート５０をその中に有する。入口ポート５０は、流体装置１２に流体試料を供給するために使用することができる。出口ポート５２は、流体装置１２から流体試料を除去するために使用することができる。エポキシ又はその他の接着剤の薄層を使用して、層を互いに結合させることができる。位置合せガイド又はピンを、製造時の装置の位置合せに使用することができる。
【００２６】
以下でさらに説明するように、様々なタイプ及び位置の温度源１４、１６を使用することができる。プラテンなどの別個の装置又は一体装置を使用することができる。図３に示すように、第１の温度源１４及び第２の温度源１６は、それぞれ熱伝導層１８の頂面３６及び第３の層２２の底面４８に直接隣接する。積層された温度源１４、１６は、こうして図３の装置１２と一体になる。
【００２７】
第３の熱伝導層２２を貫通する、出口ポート５２を示す。出口ポートによって、流体試料を装置から出すことが可能になる。装置を貫通する、連続チャネル５４を示す。連続チャネルは、装置の各層に対応する部分を有する、様々なサイクルに分断することができる。ＰＣＲ環境では、３つの異なる温度が望ましい。３つの異なる温度への暴露は、ＰＣＲ反応の１増幅サイクルを形成する。
【００２８】
連続チャネルは、入口部分５６、第１の熱伝導層１８内に配置された第１のサイクル部分５８、及び、第１の熱伝導層１８からの流体試料を第３の熱伝導層２２に連結させる、接続部分６０を備える。第３の熱伝導層２２は、その中に第２のサイクル部分６２を有し、こうして、第１の熱伝導層の第１の温度未満の第２の温度に暴露される。第２のサイクル部分６２は、第２のサイクル部分６２からの流体を第３のサイクル部分６６に連結させる、第２の接続部分６４に流体的に連結される。第３のサイクル部分６６は、第２の熱伝導層２０内に配置される。以下で説明するように、ＰＣＲプロセスにおける様々なパラメータ及び所望の増幅に応じて、第１の部分５８、第２の部分６２、及び第３の部分６６を通る様々な数のサイクルを実施することができる。装置内を通る所定の数のサイクルが実施されると、流体試料は、第３の層２２を通る出口部分６８を通って装置を離れる。流体装置１２内に形成された所望の数のサイクル内を流体が通過するとき、出口部分６８が実施される。第１の部分５８、第２の部分６２、及び第３の部分６６の長さ及び断面積は、各通路内の流体試料が所定の長さの時間その温度に暴露されるようにサイズ決めされる。通路のサイズは、断面積及び長さを変えることによって変化させることができる。滞留時間は、長さに比例し、チャネル断面積に反比例する。流体入口５０及び流体出口５２は、様々な層に配設することができる。この位置は、流体装置がそれに取り付けられる設備の構成に応じて、便宜上の問題により決定される。
【００２９】
第１の温度源１４及び第２の温度源１６は、電気薄膜装置、抵抗ワイヤ装置、プラテン、又はその他の一定温度源など、様々なタイプの材料により構成することができる。図３の実施形態で、上層の温度は、第１の温度源１４を用いて第１の温度に維持され、第３の層２２は、第２の温度源１６によって、第１の温度未満の第２の温度に維持される。第１の層の上面及び第３の層２２の下面は、それぞれ温度源１４、１６が接触しているものとして示す。１つ又は両方の層の１つ又は複数の縁部にも、温度源を接触させることができることに留意されたい。好ましくは、温度源は調整される。サーミスタ又は熱電対など様々なフィードバック装置を、制御装置にフィードバックを供給するために使用することができる。第２の熱伝導層２０は、各層からの熱を、制御された方法で絶縁体２４、２６を通して吸収する。すなわち、絶縁体を通る熱伝導量を厚さ又は材料の選択により制御することによって、吸収量を制御することができる。第２の層の温度は、第１の温度と第２の温度の間の、第３の所定の温度に維持される。装置全体が平衡状態に到達するためには、ゼロではないある長さの時間がかかるであろう。伝導層は、好ましくは高度に熱伝導性であり、それによって等温性である。平衡状態に到達した後、流体又は流体試料を、連続チャネル５４を通して、異なる各サイクルにおいて異なる各層に暴露させることができる。層１８、２０、及び２２は、高度に熱伝導性とすることができるので、熱伝導層内で低い又はほぼ０の温度差を支持することができる。絶縁層２４及び２６は熱伝導度が低い材料製であるので、それらの層内で、高い温度差を支持することができる。第２の熱伝導層２０又は伸張層は、第１の伝導層１８又は変性層（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｌａｙｅｒ）からの、上方絶縁層を通じた熱の流入によって加熱される。第２の熱伝導層２０又は伸張層は、対流、放射、又はその縁部からの伝導、下方絶縁層を通じた流出、及びアニーリング層からの液体の流入によって冷却される。その定常状態温度は、これらの競合エネルギー束を平衡化させた結果である。装置の保持装置の設計によって、縁部損失をごくわずかにすることができる。絶縁層の熱抵抗は、２つの事項を考慮して選択される。液体が流れていないとき、伸張層の定常状態温度は、２つの絶縁層の相対的な熱抵抗によって設定される。流れが存在するとき、伸張層の定常状態温度は、流入液体を加熱するのに必要とされるエネルギーに応じた量低下する。この低下は、ＰＣＲが許容することができる伸張温度範囲内でなければならない。この制約によって、絶縁層の熱抵抗の上限、及び従って装置に供給しなければならないエネルギーの下限が設定される。通常、装置に供給しなければならないエネルギーは２つの点からなり、これらは、変性温度とアニーリング温度との差にいずれも比例する。第１の点は、液体が存在しないときに定常状態の熱流束を確立する部分であり、第２の点は、変性及び伸張層に入る加熱液体のオーバーヘッドによる。縁の影響を度外視すると、装置に供給される総てのエネルギーを、適当なヒートシンクを用いて取り除くことができる。
【００３０】
流体試料は、プロセスの速さに対する一つの限定要因であるある吸収速度を有する。化学反応での酵素（ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）もまた、制限となり得る。先行技術とは逆に、本発明は、これら２つの制約のみによって制限される。その他の技術の幾何学的形態は、プロセスの速さを制限する。通常、長い通路は、そのような装置における熱遮断を実現するために存在する。
【００３１】
連続チャネル５４内に流体を置かれた時点で、毛管力、真空、圧力源又はその他の手段など、試料を移動させるための様々な手段を付与すればよい。移動手段を、第１の移動手段７０及び第２の移動手段７２として示す。一方又は両方の手段７０、７２が存在することがある。
【００３２】
本実施形態で使用されるサイズ、材料、及び製造技術は、特定用途の要求に最も有効に対処するように選択することができる。例えば、成形、機械加工、鋳造、押出、並びに様々なタイプの金属及びプラスチックを、流体装置１２に使用することができる。また、様々なタイプの加熱器を使用することもできる。微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）もまた、そのような装置を製造するために使用することができる。フォトリソグラフィプロセスによって、適当な通路、入口及び出口ポート、並びに装置を通るポートを含む、異なる材料の多数の層を作り出すことができる。また、１つの流体装置を示す。多数流体装置を、多重反応装置内で、互いに隣接させて使用することができることに留意されたい。すなわち、装置内で、いくつかの反応を同時又は連続的に行うことができる。流路は、平行に接続されたいくつかの個別のチャネルとすることができる。これは、大量の流体の熱サイクルをより迅速に行うために有用となり得る。装置はまた、１回使用で使い捨てとしてもよく、洗浄して再使用してもよい。
【００３３】
次に図４を参照すると、層なしで連続チャネル５４’のみを示す、１０サイクル装置１２’が示されている。本実施形態では、連続チャネル５４の第１の部分５８’を示す。この第１の部分を第２の部分６２’に接続する接続部分６０’も示す。第２の部分６２’を離れた後、流体は、第２の接続部分６４’に入る。流体は次いで、第３の接続部分６８’に入る前に、第３の部分６６’に入る。従って部分５８から６８は、装置を通る１サイクルを示す。ＰＣＲ装置内において、第１の部分は変性部分である。第１の部分５８’は、変性部分である。第２の部分６２’は、アニーリング部分であり、第３の部分６６’は、伸張部分を実施する。この図では、上向き位置で示され熱伝導層１８に対応する出口５２’に試料が到達するまで、サイクルが１０回繰り返される。入口ポート５０及び出口ポート５２の様々な位置は、当業者にとって明らかであると思われる。本実施形態では、チャネルを管状構造として形成し、オーバーモールドして単一装置を形成することができる。管状装置を、図１から図３に示す３つの熱伝導層でオーバーモールドすることができることにも留意されたい。
【００３４】
次に図５を参照すると、第２の実施の形態７４の分解図が示されている。本実施形態では、流体入口ポート５０’’が、第３の層２２’’に配置される。流体入口ポート５０’’は、第２の絶縁体２６’’、第２の熱伝導層２０’’、第１の絶縁体２４’’、及び第１の熱伝導層１８’’を通って延びる。初期変性チャネル７６が、熱伝導層１８’’内に形成される。この構築された実施形態では、初期変性チャネル７６は、６．５ｍｍであった。本実施形態で示すチャネル部分は、断面が三角形である。チャネルは、フォトリソグラフィ技術を用いた方位依存性エッチングを用いて形成された。第１の熱伝導層１８’’内に、複数の第１のサイクル部分５８’’を示す。第１のサイクル部分５８’’は、初期変性チャネル７６に流体的に連結される。本実施形態では、複数の接続部分６０’’を示す。これらの部分には、穿孔又は反応性イオンによる深いエッチングを行うことができる。本実施形態は、縦軸Ｘ及び横軸Ｙを有する。第１の部分５８’’、第２の部分６２’’、及び第３の部分６６’’はそれぞれ、第１の部分５８’’上のわずかなＬ字形変形部以外は横方向に配置される。本実施形態では、流体は一般に、熱伝導層１８’’から第３の層２２’’へ第１の接続部分６０’’を通って流れる。流体は次いで、第２の層２０’’である伸張プレートに入る。従って流体は、第３の部分６６’’の中央から横方向外側に通過し、次いで第１の部分５８’’の列のうちの１つまで通過する。以下図６で説明するように、流体は、各サイクルで装置の側部を交互に通過する。本実施形態では、チャネルは、第１の熱伝導層１８’’の下面３４’’内、第２の層２０’’の頂面３８’’、及び底部層２２’’の頂面４６’’内にエッチングされる。第１の絶縁体２４’’及び第２の絶縁体２６’’は、流体通路チャネルの画定するのを助ける。構築された実施形態では、次及び後続の変性チャネルが長さ１ｍｍである６．５ｍｍの初期変性チャネルで、３０回のＰＣＲサイクルが実施される。アニーリングチャネル又は第３の部分６６’’もまた、長さ１ｍｍである。伸張チャネル又は第２の部分６２’’は、長さ２ｍｍである。伝導層及び絶縁層を互いに結合させるために、エポキシ又はその他の接着剤を使用することができることに留意されたい。
【００３５】
装置は、サーマルインクジェットカートリッジ及び集積チップ製造から取り入れた技術を用いて、製作することができる。装置は、シリコンで形成し、後に、互いに結合させた後でダイスカットすることができる。装置内に位置合せのための要素を組み込んで、様々な固定具によって装置の組立てを助けることを可能にすることができる。
【００３６】
図６Ａ〜図６Ｃに最もよく示されるように、第１のサイクル部分５８’’内の流体流れは、横方向内向きに延び、第１の接続部分６０ａ’’を通り、そこで第２のサイクル部分６２ａ’’に入る。第２のサイクル部分６２ａ’’内の流体流れもまた、横方向内向きである。流体は次いで、第２の接続部分６４ａ’’のうちの１つを通り、第３のサイクル部分６６ａ’’を通って横方向外向きに流れる。こうして、流体はこの時点で、第１のサイクル部分５８’’に流体が入ったときと比べて、流体装置１２’’の横方向反対側にある。流体は次いで、第３の接続位置６８ａ’’に入り、そこで、第１のサイクル部分から見て装置の反対側にある、別の第１の部分５８ｂ’’に入り、第１のサイクルからの流体とは反対方向に横方向内向きに移動する。流体が第１の部分５８ｂ’’に入ると、第２サイクルが開始する。流体は次いで、上記方向と反対方向に流れ、すなわち、第２の部分６２ｂ’’内で、流体は横方向内向きに左側から装置の中央へと流れる。様々な熱伝導層間を移行するとき、流体は、第１の絶縁体２４’’及び第２の絶縁体２６’’それぞれの内部にある様々なポート２８’’内を通過する。また、本実施形態では、出口ポート５２’’は、第３の熱伝導層２２’’を貫通する。図３に最もよく示すように、第３のサイクルは、第１のサイクル部分５８ｃ’’内で始まる。
【００３７】
次に図７を参照すると、流体装置１２’’’の第３の実施形態８０が示されている。本実施形態では、ガラス層８２が、第１熱伝導層１８’’’上に設けられる。ガラス層８２によって、蛍光Ｘ線又はその他の光検波がそこを通ることが可能になる。ガラス層８２は、好ましくは検出波長で透過性であり、従って、第１の部分５８’’’内のＤＮＡ量をモニタすることができる。また本実施形態では、第１の熱伝導層１８’’’と第１の絶縁体２４’’’の間で、加熱器層８４を使用する。第２の多結晶シリコン加熱器層８６はまた、図１〜図４に示す加熱器の位置で使用することもできる。適当なタイプの加熱器の１つは、多結晶シリコン加熱器である。様々な多結晶シリコン被覆が、インクジェット装置に一般に使用される。加熱器を、別個の層として示すが、層を形成するためにドーピングを用いることもできる。また、層は、エピタキシャルに形成することができる。他で説明するように、加熱器は、縁部、又は層の面に接触することができる。
【００３８】
次に図８を参照すると、電気式「ジュール」加熱装置を使用する、第４の実施形態９０が示される。第１の電源９２及び第２の電源９４が、それぞれジュール加熱器９６及び９８に結合される。すなわちジュール加熱器９６は、熱伝導層１８’’’’の上面上に配置することができる。第２のジュール加熱器９８は、第３の層２２’’’’の底面上に配置される。実際的な実施形態で、温度を制御するために、熱電対、サーミスタ、又はその他の感知装置が必要とされることがある。装置は、当業者に知られた様々な方法で、熱サイクル装置に外付けし、又はそれと一体にすることができる。
【００３９】
図９に最もよく示すように、１対の接点１００、１０２を使用して、装置に電流を流すことができる。電気接点は、一般に用いられる様々な手段によって、シリコンの表面上又は縁部に製作することができる。接点１００、１０２の間に電位差をもたらすことによって、所定量の電流がそこを通過し、特定量の熱を生じることができる。必要とされる導電率は、Ω／□又は単にΩの単位を用いて、材料の表面抵抗ｑｓによって特徴付けることができる。ｑｓは、バルク抵抗率ｑｂを導電層の厚さで割ったものである。バルク伝導の場合、シリコン層の厚さ全体を用いることができる。図９に示すように、最も単純な状況では、装置の幅の両端間の接触が各端部で生み出される。電流は、その構成に応じて、表面の層又はバルクを通って流れる。電力は、単位面積当りＶ２／ｑｓＬ２として散逸され、単位幅当りの電流は、Ｖ／ｑｓＬとなる。Ｌが１ｃｍ、ｑｓが１０Ω／□の装置の場合、１０Ｖ印加することによって、幅１ｃｍ当り１Ａの電流密度で、１０Ｗ／□ｃｍ２の散逸が生じる。いかなる特定の装置も、この加熱量より大きい、しかし通常は大幅により小さい加熱量を必要とすることができる。
【００４０】
次に図１０Ａ及び図１０Ｂを参照すると、図１０Ａは、指定された厚さの導電層に対する、１０Ω／□を達成するために必要とされるバルク抵抗率を示す。例えば、厚さ５００μｍ（０．５５ｍｍ）のシリコンウェハは、バルク抵抗率が０．５Ω・ｃｍの場合、１０Ω／□の表面抵抗を有する。０．０１Ω・ｃｍの抵抗率を有する厚さ１０μｍの層が、金属めっき、イオン注入、又はイオン拡散技術によってシリコン表面上に作り出される場合、同じ表面抵抗が生じる。ドーピング又は注入を用いる場合、図１０Ｂは、所要のバルク抵抗率を達成するために必要とされるｎ型キャリアのレベルを示す。Ｐ型ドーピングを用いることもできる。
【００４１】
次に図１１を参照すると、シリコン層内でバルクジュール加熱が用いられる場合、装置の横方向（又は縦方向）縁部上に接点を設けることができる。図示のように、接点１０４及び１０６が、第１の熱伝導層１８’’’’に設けられる。第２組の接点１０８、１１０が、第３の層２２’’’’に結合される。電気接点は、装置と一体でもそれと別個であってもよいことに留意されたい。こうして、電流が装置を通って大量に流れ、指定されたジュール熱を生み出すことができる。そのような構成もまた、ガラス層８２を備えることができる。上記様々なタイプの加熱器は、図７、図８又は図１１で説明したいかなる実施形態と共に用いることもできる。
【００４２】
次に図１２を参照すると、ランダムアクセスＰＣＲアナライザ１２０が示される。本実施形態では、試料容器１２２及び１２４内の試料が、ＤＮＡ／ＲＮＡ試料調製ブロック１２６へと供給される。試料調製キット１３０は、熱サイクル装置を備えることができる。必要に応じて、ブロック１２８で逆転写酵素反応を実施して、ＲＮＡからｃＤＮＡを形成することができる。試料調製キット１３０を、ブロック１３０として全体的に示す。試料調製キット１３０を使用して、組織又は流体の投入試料から、ＤＮＡ材料を抽出することができる。試料調製キット１３０は、試験キットと一体にすることができる。調整後、試料アリコートを試料から取り出し、容器Ａ３、Ａ２、及びＡ１内に分配する。様々なプライマー、プローブ、特別に緩衝された溶液、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰがブロック１３２に示されており、これらを、試験キット１３６、１３８及び１４０内に供給することができる。ＰＣＲプロセス時に、プロセスの酵素はある反応時間を有する。その反応時間は、特定のプロセス及び試料の熱吸収率に応じて変わる。こうして流体の循環速度は、この吸収及び酵素の反応時間によって制限される。熱サイクル要素１４２、１４４、及び１４６もまた、試験キット内に設けることができる。熱サイクル要素に適当な変性及びアニーリング温度を提供するために、プラテン１４８及び１５０を使用することができる。試料の挿入前に、インキュベータ１５２を形成するプラテン１４８、１５０の間に、熱サイクル要素を挿入する。こうして熱サイクル要素１４２、１４４、１４６は、所望の温度まで上げられ、試料は、所定の速度で装置を通って抜き出され又は押し出される。ブロック１５４は、蛍光励起、レーザなどを用いてリアルタイム検出を提供する。熱サイクル要素の様々な地点で、増幅量を検出することができる。プロセスの最後に、終点検出１５６を設けることができる。試料は、様々なタイプの分析に使用することができる。終点検出１５６の後、試料及び試薬の混合物を廃棄することができる。
【００４３】
サイズが小さく、期待される費用が低く、使い捨て可能な性質の熱サイクル要素によって、ランダムアクセスＰＣＲアナライザを製作することが可能になる。本実施形態以前は、実質的に全てのＰＣＲ反応が、回分操作として、システム内の熱サイクル炉の数によって決定される同時に行われる様々な反応の回数分実施されていた。１つのタイプの増幅システムは、２つの熱サイクルを有し、従って３つ以上の異なるプロトコールを同時に行うことはできない。ＰＣＲ試験の回数が時間とともに増加するので、ランダムアクセスアナライザに対する需要はより多くなるであろう。熱サイクル装置は、多数の試験を実施することができる。ランダムアクセスアナライザは、アナライザに与えられるそれぞれ及び全ての試料に対して、利用可能な試験のいかなる組合せをも行う能力を有するものとして定義することができる。従って、様々な数の加熱器又は内蔵加熱器を、各熱サイクル要素に設けることができる。従って、様々な数の試料及び様々な数の熱サイクル要素を、同時に実施することができる。例えば、様々な温度を様々な熱サイクル要素内で実現することができるように、中央制御装置によって加熱量を制御することができる。ランダムアクセスアナライザは、バッチアナライザに勝るいくつかの利点を有する。すなわち、それらはバッチアナライザよりも速く、より柔軟性が高く、より多目的であり、より生産的である。ＰＣＲ増幅を実施するための、非常に多くの特定タイプの熱サイクル要素及び必要な試薬をそれぞれ含む、様々なＰＣＲキットを製作できることが想像される。キットは、様々なポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、特別に配合された緩衝液、及びプライマーを備えることができる。任意で、試料調製及び検出のためのその他の試剤を提供することもできる。従って、温度をプログラムする能力を有することによって、様々なＰＣＲ試験プロトコールを行うことができる。インキュベータ１５２は、熱サイクル装置を通して流体を抜き出す手段を備えることができる。細胞試料を溶解してＤＮＡを放出する、又は逆転写酵素反応を実施してＲＴ−ＰＣＲ用のｃＤＮＡを作り出すなど、様々な試料調製を実施することもできる。
【００４４】
図１３を参照すると、チャネル５４の一部が示されている。この部分を、第１の部分５８として示す。試料１６０が、チャネルの第１の部分５８内に配置される。１対の泡１６２、１６４が、その中に試料１６０の範囲を区切る。泡１６２、１６４は、流体を個々の試料区間１６０に分割するのに十分なサイズで、流れの中に断続的に導入される。これは、密閉混合によってＤＮＡ溶質の温度−時間経験の平均化を促進する（ドウェル時間のばらつきを低減する）ために行われ、流体試料が蛇行通路を通って移動するときに、分離混合も生じる。泡１６２、１６４の存在によって、流体区間試料１６０内の矢印１６６で示される循環が押し進められる。流体は、壁のところで静止しなければならないので、ほぼ環状の流れプロファイルが存在する。いかなる流体要素の速度の分布、及び従ってその時間温度プロファイルの分布も、区間の範囲によって限定される。実際は、流体に対する泡の比率を可能な限り低く保つことが望ましい。図では、比率は約２０％である。図はまた、流体コラムの長さの増大に関連するオーバーヘッドを表すので、比率を最低限に保つことが望ましい。最大の時間のばらつきの測定は、流体区間の長さを単一サイクルの長さと比べることによって得ることができる。流体区間が５〜１０ダイアメータであり、単一サイクルの長さが１００ダイアメータである場合、時間のばらつきは、約５〜１０％となる。ＰＣＲ装置は一般に、１０未満、またしばしば１未満の低いレイノルズ数で動作するので、泡の使用によって熱サイクルを改善することができる。これは、処理される流体の量が少ない、すなわち数ナノリットルから数十マイクロリットルの範囲であるため生じる。これはまた、流体への熱伝導が、深さの平方に比例し流体の拡散率に反比例するその熱緩和量によって規定されるため生じる。それに関連する時間は、深さが１００〜２００μｍの間である場合数十秒であるが、断面がより大きいチャネルでは、二乗依存のため急速に増加することがある。流れに関連付けられるレイノルズ数が低い場合、慣性効果は粘性力に支配され、混合は最低限となり又は存在しない。長いチャネルでは、流れはポアズイユ流に近づく。ポアズイユ流れの状態では、混合が生じない。中心付近の材料は、平均速度の２倍で流れるが、壁付近の材料は、大幅に低速で進む。こうして、ＰＣＲ環境内で、チャネル中心付近の材料は、平均時間の約半分でマイクロチャネル内を高速で移動し、サイクル増幅の有効性を潜在的に制限する。一方、壁に最も近い材料は、平均時間より大幅に低速で移動するが、その他の有害な作用が存在することがある。分子レベルではブラウン運動があり、従っていくらかの混合が生じることに留意されたい。こうして、上記泡１６２、１６４を提供することによって、より全体的な混合を行うことができる。
【００４５】
次に図１４を参照すると、非常に多数のＬＥＤ１６８及びフォトダイオード１７０を、プロセス全体を通して、様々な地点、及び様々なサイクル部分内に設けることができる。図示の通り、ＬＥＤ１６８及びフォトダイオード１７０を、第１の部分５８内に設けることができる。また、フォトダイオード及びＬＥＤの位置は、第１の部分、第２の部分、又は第３の部分、或いはそれらの様々な組合せなど、連続チャネル内の様々な位置に位置決めすることができる。例えば、全て又は多数のアニーリング通路が、ＬＥＤ及びフォトダイオードを備えることができる。検出結果を改善するために、光濾過要素を使用することもできる。存在するＤＮＡの量を監視するために、こうしてフォトダイオードを、アナライザ装置に結合することができる。上述したように、存在するＤＮＡの量はまた、ウィンドウを透過する蛍光放射によって測定することもできる。レーザ又はＬＥＤは、測定される蛍光の供給源を提供することができる。ワイヤ１６９、１７１を、制御装置又はアナライザ装置に結合させることができる。
【００４６】
同一又は別の装置で、ＰＣＲ増幅産物を繰り返し再循環させることを可能にするために、外部手段を使用することもできる。各装置の間で、増幅を定量するために検出を実施することができる。
【００４７】
次に図１５を参照すると、熱サイクル要素１８５に結合された、再循環装置の一実施例が示されている。図１５では、ポンプ１７６が上側チャンバ１７８に結合される。すなわち、ポンプ１７６は、試料をチャンバ１７８内へと抜き出す。これを実施するために、ポンプが吸引するときに、試料をチャンバ１７８へと供給する弁１８０を開く。弁１８２及び１８４を閉じる。次いで、弁１８０を閉じ、弁１８２を閉じ、弁１８４を開けて通気し、ポンプ１７６を作動させて試料を下側チャンバ１８６に分配する。こうして、熱サイクル要素１８５は、試料が第１のチャンバ１７８から第２のチャンバ１８６へと通過するときにそれを増幅する。再循環操作は、第１の弁１８０を閉じ、第２の弁１８２を開き、第３の１８４を通気のために開くことによって実施することができる。熱サイクル要素１８５を通る所望の数のサイクルが実施された後、第１の弁１８０を開き、第２の弁１８２を開き、第３の弁１８４を閉じ、ポンプを分配モードで動作させることによって、流体を分配することができる。様々なときに、小部分を分配することができ、又は、熱サイクル要素１８５内で増幅量を測定することができる。
【００４８】
上述のように、装置を製作するために様々な技術を使用することができる。例えば、図４に記載したように管を予め構成することができ、次いでその周りに可撓性材料を成形することができる。層を分離するために、様々な層内に絶縁体を成形することができる。また、外面に対するチャネル層の位置は、ＰＣＲプロトコールによって要求される３つの望ましい温度で、チャネル通路が平衡化するように選択することができる。
【００４９】
本発明を操作するための方法は、複数の層を有する装置内に試料を導入することを含む。試料の導入前に、各層の温度は、ＰＣＲプロトコールで要求される３つの温度を維持する。本実施形態では、底部熱伝導層の温度は、上部熱伝導層よりも低い。こうして、３つの伝導層が定常状態に到達したら、試料を装置内に導入する。熱平衡時は、上層全体が温度源と同じ温度であり、下層全体が、下側温度源の温度であることに留意されたい。こうして、装置は平衡状態となる。中間層は、より高温とより低温の間の平衡温度である。投入ポートを通じて試料を配置し、第２の実施形態の場合は、その他の変性ステージよりも長い初期変性ステージに供給する。これは、実施されるＰＣＲのタイプによって要求され、又は要求されないことがある。ＰＣＲ試料は、第１の温度で、サイクルの第１の部分内を循環する。試料を、第１及び第２の層の間にある第３の層を通して、下層である第２の層へと移動させる。試料はまた、絶縁体２４及び２６を通る。流体装置を通して流体を押し進めるために、真空、圧力ポンプ、毛管力、又はその他の手段など、様々な手段を使用することができる。流体流れの速度によって、第１の部分内でＰＣＲ試料が最高温度下に置かれる時間の長さが決定される。第１の部分の最後が実施された後、流体は、中間層を通じて底部流体層へと通過する。第１のサイクルの３つのチャネル部分を全て横断した後、流体試料は、第１の層内の第２のサイクルに入る。図５に示すように、第１の部分の様々な列を小型の構造内に設けることができるので、小さい領域内により多くの熱サイクルを設けることができる。
【００５０】
実施されるＰＣＲのタイプに応じて、様々な数のサイクルを様々な装置内に設けることができることに留意されたい。図５の３０ＰＣＲサイクルに比べて、より多い又はより少ない数のサイクルを設けることができる。図１５に関して上述したように、熱サイクル要素は、流体を再循環させて装置内に戻すために、装置に結合させることができる。これは、増幅量を検出する検出ステージへの、フィードバック応答として行うことができる。所望の量の増幅が実施されていない場合、流体試料を再循環させて熱装置内に戻すことができる。十分な量の試薬が反応に使用可能となるように、様々な試薬を試料と共に様々なときに投入することもできることにも留意されたい。
【００５１】
次に図１６を参照すると、本発明の第６の実施形態が示されている。本実施形態では、第３の温度源２００を示す。第３の温度源２００は、第１の接点２０２及び第２の接点２０４を備える。接点は、図１１に関して上述したのと同様のやり方で構成することができる。すなわち、装置及び第２の層２０Ｖを通して、ジュール加熱を実施することができる。すなわち、伸張層を加熱することもできる。本実施形態では、各層が熱的に無関係又はほぼ無関係となるように、絶縁層２４Ｖ及び２６Ｖの絶縁特性を増大させることができる。すなわち、３つの温度源を備える一実施形態では、各層の熱依存性を低減させる又はなくすことが望ましいことがある。もちろん、上記で説明した多結晶シリコン加熱器などの、独立した加熱層によって加熱を行うこともできる。すなわち、多結晶シリコン加熱器など、独立した加熱器は、絶縁層２４Ｖ、２６Ｖの一方又は両方と、第２の層２０Ｖとの間に配置されることになる。また、本実施形態では、第１及び第２の温度源のための様々な構成を含むことができる。すなわち、多結晶シリコンなど様々なタイプの加熱器を含むことができ、装置を加熱するために、表面加熱又は外部プラテンを使用することができる。
【００５２】
次に図１７を参照すると、本発明の第７の実施形態２１０が示されている。この実施形態は、以前の実施形態で述べたように３つではなく、流体熱伝導層を２つだけ有する。本実施形態では、第１の層２１２及び第２の層２１６が、絶縁層２１４によって分離されている。層２１２及び２１６は、熱伝導層である。本実施例では、第１の層及び第２の層が、その内部に連続チャネル２１８を有する。連続チャネル２１８は、第１の部分２２０及び第２の部分２２２を有する。第１の部分２２０は、第１の層内に配置され、第２の部分２２２は、第２の層２１６内に配置される。ＰＣＲのいくつかの形では、伸張温度とアニーリング温度が重複することがある。従って、アニーリング及び伸張は、同じ層内で実施することができる。こうして、本実施形態は、サイクルを形成する２つの層及び２つの異なる温度部分を有する。絶縁層２１４が任意であることにも留意されたい。すなわち、第１の部分及び第２の部分が、変性層と同様アニーリング及び伸張のための所望の温度を有することができるように、適切な温度勾配を装置に加えることができる場合、いくつかの実施形態で絶縁層２１４をなくすことができる。
【００５３】
本実施形態はまた、上記様々な加熱手段を含むことができる。すなわち、様々なプラテン又はその他のタイプの加熱器を、装置の様々な部分に配置することができる。加熱器は、絶縁層２１４と、層２１６又は層２１２、或いは両方との間に配置することができる。様々な数のサイクルを装置内に設けることができることにも留意されたい。
【００５４】
様々な数のサイクルを有する様々な実施形態を示してきた。検出又はさらなる変性などのサイクル変化の後又はその間に、アニーリング又は伸張ステップを実施することができることに留意されたい。例えば、最後の伸張ステップの後に、余分の変性ステップを含むことができる。また、第１のサイクル部分又は第１及び第２のサイクル部分で、延長された変性ステップを行うこともできる。
【００５５】
次に図１８及び１９を参照すると、熱サイクル装置２５２用の試験用取付け具２５０が示されている。熱サイクル装置２５２の中心に、流体装置１２がある。熱サイクル装置２５２は、流体装置１２を備え、上部キャップアセンブリ２５４及び下部キャップアセンブリ２５６を備える。取付け具アセンブリ２５８は、取付け頂部２６２に結合された脚部２６０を備える。取付け頂部２６２は、熱サイクル装置２５２を受けるための凹部２６４を備える。上部キャップアセンブリ２５４及び下部キャップアセンブリ２５６は、ＰＣＲ装置内の変性加熱器及びアニーリング加熱器である。
【００５６】
上部キャップアセンブリは、内部にチャネル２７２を有するキャップハウジング２７０を備える。チャネル２７２は、プラテン２７４を受ける。プラテンをキャップ部片２７０内に固定するために、端部キャップ２７６が使用される。ロッド加熱器２７８及び熱電対２８０が、端部キャップ２７６内の開口２８２内に挿入される。ロッド加熱器は、流体装置１２に温度が与えられるように、プラテンを所定の温度に加熱するために使用される。より具体的には、流体装置１２の上面が、プラテン２７４に結合される。
【００５７】
下部キャップアセンブリ２５６は、頂部２６２の凹部２６４内で受けられる案内特徴２９２を有する、下部キャップハウジング２９０を備える。プラテン２９４が、下部キャップアセンブリ内で受けられる。ロッド加熱器２９６及び熱電対２９８は、ロッド加熱器が下部プラテン２９４に熱を供給し、プラテンを所定の温度に加熱するために熱電対２９８が使用されるように、端部キャップ３０２内の開口３００内に挿入される。プラテン２９４はまた、入力チューブ３１０及び出力チューブ３１２に結合することもできる。プラテンを貫通して、入力チャネル３１４及び出力チャネル３１６を設けることができる。流体装置１２とプラテン２９４の間の流体漏れを防ぐために、それらの間にガスケット３１８、３２０を結合することができる。装置は、ねじ切りされた締結具３４０と共に保持される。
【００５８】
下部キャップ２９０に、ヒートシンク３５０を結合することができる。上部プラテン２７４は、下部プラテン２９４より高温であるので、ヒートシンク３５０によって熱が放散される。これは、流体装置１２の変性層及びアニーリング層を所定の温度に維持するのに役立つ。
【００５９】
入力チューブ３１０及び出力チューブ３１２を熱サイクル装置２５２に固定するために、１対のホースクランプ３５２、３５４を使用することもできる。
【００６０】
構築された流体装置の一実施形態では、０．０２２ｍｍ２のチャネル断面積を用いた。変性部分のチャネル長さは１ｍｍであり、伸張部分は２ｍｍであった。構築された本実施形態では、３０サイクルを使用した。予備変性チャネル長さは、９ｍｍであった。シリコン層の厚さは、０．５７５ｍｍであった。伝導率は、１３０Ｗ／ｍ・℃であった。ポリイミド厚さは、０．１２５ｍｍであり、その伝導率は、０．３１Ｗ／ｍ・℃であった。
【００６１】
反応溶液は、５フェムトモル濃度のヒトゲノム鋳型ＤＮＡを含むことができる。市販のＰＣＲ緩衝液は、決定的に重要な成分である、ｐＨ安定性のためのトリス塩酸緩衝液、及びポリメラーゼ活性に決定的に重要なＭｇ＋＋イオンを提供するためのＭｇＣｌ２を有する。Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのそれぞれに、２００マイクロモル濃度のデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）が提供された。それぞれ２００マイクロモル濃度の１００〜２００塩基対のアンプリコンを規定するために、２０〜３０ヌクレオチドの長さのヒトゲノム鋳型に特有のフォワード及びリバースプライマーが選択された。１反応当り１ユニットの、Ｔａｑポリメラーゼ酵素が選択された。上記の試験用取付け具は、シリンジポンプ（図示せず）に結合され、そこから熱サイクル装置１２を通して反応溶液が給送される。加熱されたプラテンは、９６±１℃の変性温度、及び５４±１℃のアニーリング温度を維持する。プラテン加熱器、及び内蔵熱電対を有する温度制御装置は、それぞれ１６ワットを供給する。３．７５℃／Ｗの熱抵抗を有するヒートシンクを、アニーリングプラテンの露出面に取り付けた。使用したシリンジポンプは、１０μＬの容量、及び１ｍｍ／ｓの流速で０．２２μＬ／ｓの流量を有する。増幅産物は、装置の出力口で収集される。産物中に存在する増幅されたＤＮＡ材料の存在及び量を検出するために、様々な手段を用いることができる。一般的な方法では、分子量によってＰＣＲ産物を空間的に分離するための電気泳動、及びＤＮＡ産物に結合して濃度を示す蛍光プローブを用いる。
【００６２】
本発明を、１つ又は複数の実施形態と関連付けて説明してきたが、本発明はこれらの実施形態に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本発明は、特許請求の範囲の精神及び範囲内に包含することができる、全ての代替例、修正例、及び同等物を網羅することが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための装置であって、
第１の層と、
第１の層に近接する（ｐｒｏｘｉｍａｔｅ）第２の層と、
前記第１の層及び前記第２の層内に形成された連続チャネルとを備え、
前記連続チャネルが、複数のサイクル区間を有し、各サイクル区間が、前記第１の層内に配置された変性部分、並びに前記第２の層内に配置されたアニーリング及び伸張部分を含む装置。
【請求項２】
前記第１の層と前記第２の層が、両者の外延が揃った状態で積層されている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１の層及び第２の層が、熱伝導性である、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の層と第２の層との間に配置された第１の絶縁体をさらに備える、請求項１から３の何れか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記第１の層が、平坦な層である、請求項１から４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記第２の層が、前記第１の層に隣接して（ａｄｊａｃｅｎｔ）配置された平坦な層である、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記第１の層に熱的に連結され、それを第１の温度に維持する第１の温度源と、第２の層に熱的に連結され、それを第１の温度より低い第２の温度に維持する第２の温度源とをさらに備える、請求項１から６の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記第１の層及び前記第２の層が、同じ材料からなる、請求項１から７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記第１の層及び前記第２の層が、異なる材料からなる、請求項１から７の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記連続チャネル内に配置されたＬＥＤ及び光検出器をさらに備える、請求項１から９の何れか１項に記載の装置。
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための装置であって、
第１の層と、
第１の層に近接する（ｐｒｏｘｉｍａｔｅ）第２の層と、
前記第１の層及び前記第２の層内に形成された連続チャネルとを備え、
前記連続チャネルが、複数のサイクル区間を有し、各サイクル区間が、前記第１の層内に配置された変性部分、並びに前記第２の層内に配置されたアニーリング及び伸張部分を含む装置。
【請求項２】
前記第１の層と前記第２の層が、両者の外延が揃った状態で積層されている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１の層及び第２の層が、熱伝導性である、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の層と第２の層との間に配置された第１の絶縁体をさらに備える、請求項１から３の何れか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記第１の層が、平坦な層である、請求項１から４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記第２の層が、前記第１の層に隣接して（ａｄｊａｃｅｎｔ）配置された平坦な層である、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記第１の層に熱的に連結され、それを第１の温度に維持する第１の温度源と、第２の層に熱的に連結され、それを第１の温度より低い第２の温度に維持する第２の温度源とをさらに備える、請求項１から６の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記第１の層及び前記第２の層が、同じ材料からなる、請求項１から７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記第１の層及び前記第２の層が、異なる材料からなる、請求項１から７の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記連続チャネル内に配置されたＬＥＤ及び光検出器をさらに備える、請求項１から９の何れか１項に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１１−２０６０５９（Ｐ２０１１−２０６０５９Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３６５２９（Ｐ２０１１−１３６５２９）
【出願日】平成２３年６月２０日（２０１１．６．２０）
【分割の表示】特願２００７−５０１００８（Ｐ２００７−５０１００８）の分割
【原出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０６２８６３７５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２０日（２０１１．６．２０）
【分割の表示】特願２００７−５０１００８（Ｐ２００７−５０１００８）の分割
【原出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０６２８６３７５）
【Ｆターム（参考）】
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