物質が引き起こす危険を予測する方法
【課題】本発明は、評価対象化学物質に短期間暴露した被検水棲生物の網羅的遺伝子発現解析を行い、陽性対照物質暴露における解析結果と比較することで、評価対象化学物質が長期的にどのような影響をどの程度の強さで及ぼすかを予測する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明者等は、上記課題を解決するために、陽性対照物質に濃度を変えて初期生活段階の水棲生物を短期間暴露して網羅的遺伝子発現解析を行い、陽性対照物質によって特徴的に発現する遺伝子群の発現量を算出した。同時に該水棲生物が成熟するまで長期間暴露して影響評価を行った。これらの実験結果より、陽性対照物質濃度と影響の度合いとの換算式を作成した。実サンプル（化学物質、環境中のサンプル等）の短期間暴露による網羅的遺伝子発現解析結果をこの換算式に適用することにより、長期的な影響が予測できることを見出した。
【解決手段】本発明者等は、上記課題を解決するために、陽性対照物質に濃度を変えて初期生活段階の水棲生物を短期間暴露して網羅的遺伝子発現解析を行い、陽性対照物質によって特徴的に発現する遺伝子群の発現量を算出した。同時に該水棲生物が成熟するまで長期間暴露して影響評価を行った。これらの実験結果より、陽性対照物質濃度と影響の度合いとの換算式を作成した。実サンプル（化学物質、環境中のサンプル等）の短期間暴露による網羅的遺伝子発現解析結果をこの換算式に適用することにより、長期的な影響が予測できることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が被検水棲生物に及ぼす影響を網羅的遺伝子発現解析によって評価し、該被検水棲生物が長期的に受ける影響を予測する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在地球上には数千万の化学物質が存在しており、そのうち、数万種類の合成化学物質が環境中に蓄積していると考えられている。これら化学物質の中には、元の形もしくは環境中で変化した形で生態系や人体に悪影響を及ぼす物質が存在する。環境中に微量に存在する化学物質を同定・定量する技術は日々目覚しく進歩しているが、現状では環境中に存在する全ての化学物質を同定できるわけではない。また、環境中に存在する濃度そのものが環境に与える影響の強さを必ずしも反映しているわけではない。そのため、化学物質の環境影響評価は生物毒性評価試験（バイオアッセイ）を用いて行うことが重要である。
【０００３】
現在、バイオアッセイにはヒメダカなど水棲生物を中心に様々な指標生物が用いられている。バイオアッセイに関する国際的な毒性試験標準マニュアルも多数公表されており、種々の化学物質の毒性評価に広く用いられている（非特許文献１，２）。しかしながら、その多くは指標生物の致死もしくは外見上の異常を観察して評価対象化学物質の毒性を数値化するだけで、内分泌攪乱化学物質等のように致死も外見上の異常もほとんど引き起こさないが、体内で長期的に悪影響を及ぼす物質の評価には利用することは困難である。
【０００４】
この為、内分泌攪乱化学物質等の物質による影響を評価する様々な手法が新たに開発されている（非特許文献３）。これらには大きく分けて２つの手法がある。１つ目は、ある種の指標となる遺伝子もしくはタンパク質が生体内でどの程度活性化されたかを測定する方法である。これらには、ホルモン受容体の活性化の度合いを測定する手法や卵黄タンパク質前駆体（魚類などの体内で女性ホルモン作用を持つ物質によって作られるタンパク質）の作られた量を測定する手法などがある。これらの手法は、評価対象化学物質が持つ作用（女性ホルモン作用など）の強さを短時間の実験で定量的に評価できる一方、多岐にわたる反応が複雑に相互作用する生体内反応のごく一部しか評価できないという欠点がある。また単純な評価法であるがゆえに、これらの手法で得られた結果は実際に生物体内で起こる異常の度合いと相関がない場合も多い。
【０００５】
２つ目は、指標生物が生まれてから成熟し次世代を残すまで評価対象化学物質に暴露し、生物学的・形態学的・組織学的手法などを用いて長期的な影響を評価する方法である。この方法では主にヒメダカなど魚類が用いられており、微量の化学物質に長期的に暴露された際の影響を総合的に評価できる。しかしながら、１回の試験に時間（試験方法によっては半年〜１年間）がかかるため、この方法では限られた数の化学物質しか評価できない。
【０００６】
これら従来の評価法の欠点を補うと期待されているのが、ＤＮＡマイクロアレイなど網羅的遺伝子発現解析法である。この手法では、比較的短時間の実験により、種々の化学物質や産業排水、生活廃水、土壌・底質抽出水、河川・湖沼表層水等によって生体内でどのような影響が起こるかを総合的に評価することができる。この網羅的遺伝子発現解析により、正常状態の生物の生理状態や化学物質による生理状態の変化を評価することができることが知られている（特許文献１，２，３）。しかしながら、これまではある時点における生物の生理状態は評価できても、将来的にどのような生理状態へ変化するかを予測することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２４６７３９号公報
【特許文献２】特開２００８−０００１３１号公報
【特許文献３】特開２００８−１６７６９９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＯＥＣＤ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， “Ｆｉｓｈ， Ａｃｕｔｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅｓｔ” Ｖｏｌ． ２０３， １−９， １９９２
【非特許文献２】ＵＳＥＰＡ， ＥＰＡ／６００／４−９０−０２７Ｆ， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｃｕｔｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｅｆｆｌｕｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｗａｔｅｒｓ ｔｏ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ４th ｅｄ．”
【非特許文献３】環境省、Ｍｅｄａｋａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄａｋａ ａｓ Ｔｅｓｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ２００３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の状況を鑑み、本発明の課題は、評価の対象とする化学物質等を実サンプルとして短期間暴露した生物における網羅的遺伝子発現解析を行い、陽性対照物質を同生物に暴露した場合における網羅的遺伝子発現解析の結果と比較することで、評価対象化学物質が長期的にどのような影響をどの程度の強さで及ぼすかを予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の工程を実施することにより本発明の課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
最初の工程では、陽性対照物質を、濃度を段階的に変えて初期生活段階の被検水棲生物に短期間暴露した後、この水棲生物由来の生物学的試料において網羅的遺伝子発現解析を行い、陽性対照物質によって特徴的に発現する遺伝子群を特定する。特定した遺伝子群の発現量データから、陽性対照物質が濃度依存的に与える遺伝子発現への影響の度合いを数値化し、陽性対照物質濃度に対して数値化した影響の度合いをプロットすることで、陽性対照物質の濃度と遺伝子発現への影響の度合いとの換算式を作成する。
【００１２】
次の工程では、陽性対照物質を、濃度を段階的に変えて被検水棲生物に、初期生活段階から成熟するまでの間、長期的に暴露して、この水棲生物の生物学的観察を行い、陽性対照物質が濃度依存的に与える生物学的影響を数値化する。ここで、生物学的影響の数値化とは、被検水棲生物が魚類の場合、産卵数、卵の受精率、生殖腺重量、性転換率、生殖腺異常などを数値化することを指す。陽性対照物質濃度に対して数値化した生物学的影響をプロットすることで、陽性対照物質の濃度と生物学的影響との換算式を作成する。
【００１３】
上記の最初の工程と次の工程で作成した２つの換算式を組み合わせて、最初の工程で特定した遺伝子群の発現量データから長期的な生物学的影響を算出する換算式を作成する。
【００１４】
化学物質、環境中のサンプル（産業排水、生活廃水、土壌・底質の滲出もしくは抽出水、河川・湖沼・海域の表層水等）等を実サンプルとして、最初の工程と同様の条件で被検水棲生物に暴露し、この水棲生物由来の生物学的試料において網羅的遺伝子発現解析を行い、遺伝子発現への影響の度合いを調べる。そして、最初の工程で特定した遺伝子群の発現量データから、上記の最初の工程で作成した換算式を用いて、陽性対照物質の濃度に換算し、上記の次の工程で作成した換算式を用いることで、この換算された濃度に対応する生物学的影響を求めることで、被検水棲生物に対する実サンプルによる長期的な生物学的影響を予測する。
【００１５】
すなわち、本発明は次の（１）〜（７）の被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する方法、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な内分泌攪乱影響を算出する方法等に関する。
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する方法、
（ａ）陽性対照物質を濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に短期間暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物由来の生物学的試料において、網羅的遺伝子発現解析を行う工程、
（ｃ）（ｂ）の網羅的遺伝子発現解析の結果から、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程。
（２）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法、
（ａ）陽性対照物質を被検水棲生物に初期生活段階から成熟するまでの間、長期的に暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より生物学的実験結果を得る工程、
（ｃ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より上記（１）に記載の方法によって、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）の工程より、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する工程。
（３）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、実サンプルによる被検水棲生物に対する長期的な影響を予測する方法、
（ａ）実サンプルを濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に暴露し、網羅的遺伝子発現解析を行い、上記（１）に記載の方法によって、被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｂ）（ａ）の工程によって算出された被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを陽性対照物質の濃度に換算する工程、
（ｃ）（ｂ）の工程によって換算された陽性対照物質の濃度を用い、上記（２）に記載の方法によって、実サンプルによる長期的な影響を予測する工程。
（４）陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、上記（１）に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な内分泌攪乱影響の度合いを算出する方法。
（５）陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、上記（２）に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法。
（６）陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質であり、かつ実サンプルが化学物質または環境中のサンプルである、上記（３）に記載の方法による実サンプルによる長期的な内分泌攪乱影響を予測する方法。
（７）環境中のサンプルが産業排水、生活廃水、土壌・底質の滲出もしくは抽出水、河川・湖沼・海域の表層水である上記（４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、生物個体あるいは組織全体を網羅的に解析して影響の度合いを数値化するものであるから、本発明によれば個々の遺伝子についてではなく、生物個体あるいは組織全体に対する影響の強さを総合的に評価する方法を提供することができる。特に、これまでの網羅的遺伝子発現解析では生理機能が明らかでない遺伝子の発現量データはほとんど意味を持たなかったが、本発明における影響の度合いの算出においては意味のあるデータとして利用できる。
【００１７】
また、内分泌攪乱化学物質を陽性対照物質とした場合には、本発明は遺伝子発現量データからこの内分泌攪乱化学物質の長期的な生物学的影響を算出するものであるから、従来は化学物質または環境中のサンプル等、実サンプルの莫大な時間を要する長期暴露実験でしか実施できなかった、長期的な内分泌攪乱作用の強さを、短期間の暴露実験によって予測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明における、網羅的遺伝子発現解析の結果から陽性対照物質による影響の度合いを算出する方法の概念図である。
【図２】ＰＣＲによる遺伝的性別判定から得られる電気泳動写真である（実施例１および２）。
【図３】Ｅ２濃度と算出された影響の度合いとＥ２濃度との関係を示す図である（実施例１）。換算式中のｘは各濃度区における影響の度合いである。図中ではｘから対照区の影響の度合いである０．１５１を減算した値とＥ２濃度ｙをプロットしたものを示してある。
【図４】ＴＲ濃度と算出された影響の度合いとＴＲ濃度との関係を示す図である（実施例２）。換算式中のｘは各濃度区における影響の度合いである。図中では、ｘから対照区の影響の度合いである０．６９７を減算した値とＴＲ濃度ｙをプロットしたものを示してある。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態による、陽性対照物質が被検水棲生物に及ぼす影響を網羅的遺伝子発現解析によって評価し、該被検水棲生物が長期的に受ける影響を予測する方法について説明する。
【００２０】
本発明は、陽性対照物質が水棲生物に及ぼす影響を網羅的遺伝子発現解析および長期的な生物学的実験により評価する方法である。本発明において、水棲生物は特に限定されるものではないが、好ましくは魚類を、より好ましくはヒメダカやゼブラフィッシュなど孵化後２〜３ヶ月で成熟する小型の硬骨魚類を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、初期生活段階の水棲生物に陽性対照物質を暴露し網羅的遺伝子発現解析を行うが、この場合の「初期生活段階」とは魚類を用いる場合であれば、胚もしくは孵化直後（孵化してから１２時間以内）の幼魚のいずれでも構わない。
【００２２】
陽性対照物質を暴露する方法は、連続的に物質溶液を調製して連続的に被検水棲生物を暴露する流水式暴露が望ましいが、被検物質の水中における安定性もしくは流水式と同様の影響（遺伝子発現レベルおよび生物学的影響）が保証される場合は、毎日１〜２回物質溶液を全て交換する半止水式暴露でも構わない。
【００２３】
網羅的遺伝子発現解析のための暴露期間は、網羅的遺伝子発現解析によって暴露区と陽性対照物質を含まない対照区を比較した際に発現レベルの変化を検出できる程度の暴露期間であればよく、数時間から１〜２週間いずれでも構わない。また、暴露期間は１点である必要性はなく、例えば２日間と７日間のように複数点行ってもよい。
【００２４】
長期的な陽性対照物質の影響を評価するための暴露期間は、被検水棲生物が初期生活段階から成熟し次世代を残す能力を有するまでとする。例えば、ヒメダカの場合は孵化後約２〜３ヶ月までを長期的な暴露期間とする。
【００２５】
長期的な陽性対照物質の影響の評価は、生物学的・病理組織学的・分子生物学的な手法を用いて行う。例えば、魚類の場合は産卵数計測、卵の受精率計測、生殖腺の形態観察、遺伝的性別判定などがこれに該当する。
【００２６】
陽性対照物質を暴露する際に使用する水の水質、明暗周期、給餌方法などの試験条件は、使用する被検水棲生物の標準的な飼育・毒性試験マニュアル（非特許文献１、２等）に準ずる。
【００２７】
陽性対照物質は、陽性対照として用いることができる物質であればいずれの物質も用いることができるが、内分泌攪乱化学物質等の学術論文等で定められている物質を用いることが好ましい。例えば、１７β−エストラジオール等の女性ホルモン、１７β−トレンボロン等の男性ホルモン、マイトマイシンＣ等の変異原性・遺伝毒性物質等が挙げられる。
【００２８】
陽性対照物質を暴露する濃度は、被検水棲生物が初期生活段階から成熟するまで暴露された場合の長期的な影響の度合いによって定める。暴露区には、低・中・高濃度および陽性対照物質を含まない対照区の最低４濃度区が必要である。低濃度とは、長期的な影響が対照区と統計学的に有意の差が見られない濃度のことである。高濃度とは、評価したい長期的な影響が最大限観察される濃度のことであるが、評価したい影響以外の毒性影響が混在することを避けるため、長期的な影響が最大限観察されるならばできる限り低い濃度が望ましい。例えば、魚類に対して陽性対照物質として女性ホルモンを用い、この影響を評価する場合には、被検魚類が全てメス化するのに必要な濃度で、できる限り低い濃度がこの濃度に該当する。中濃度とは、低濃度と高濃度の中間に属する濃度のことである。低濃度と高濃度はそれぞれ１区でよいが、中濃度はできれば２〜３区あることが望ましい。
【００２９】
網羅的遺伝子発現解析のための暴露終了後、被検水棲生物由来の生物学的試料において、陽性対照物質の作用に関与する水棲生物遺伝子の少なくとも１つ以上の遺伝子発現レベルを決定する。被検水棲生物由来の生物学的試料は、水棲生物が小型である場合は、水棲生物全体から得た細胞試料を用いてもよい。遺伝子発現はまた、被検水棲生物の臓器や血液などから測定してもよい。
【００３０】
網羅的遺伝子発現解析に用いる遺伝子群の発現レベルはそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡを定量することで決定する。網羅的遺伝子発現解析に用いる遺伝子群およびｍＲＮＡの定量法は特に限定されるものではないが、発現レベルを決定する遺伝子群が数１０個を超える場合は、ノーザンブロッティングやＲＴ−ＰＣＲ法よりもＤＮＡマイクロアレイ法のような網羅的遺伝子発現解析手法を用いるのが望ましい。いずれの定量法を用いる場合においても、発現レベルデータの正規化・標準化を行う。
【００３１】
陽性対照物質に暴露された被検水棲生物遺伝子群の発現レベルを、対照区における該遺伝子の発現レベルと比較する。ｔ検定などの統計解析によって、陽性対照物質により特徴的な発現を示す遺伝子群を特定する。
【００３２】
陽性対照物質に特徴的に発現する遺伝子群の発現量データと数１〜３から物質濃度依存的な影響の度合いを数値化し、陽性対照物質濃度に対してプロットすることで、陽性対照物質濃度と影響の度合いとの換算式を作成する。
【００３３】
【数１】
【００３４】
【数２】
【００３５】
【数３】
【００３６】
数１では、特定遺伝子群の発現プロフィールをｎ個の要素からなるベクトルと考えた時、各暴露区および対照区における特定遺伝子群の発現量からそのベクトルの原点からの幾何学的距離（長さ）を算出する（ユークリッド距離）。
【００３７】
数２では、陽性対照物質の高濃度暴露区における特定遺伝子群のベクトルとその他濃度区（対照区を含む）のベクトルとの余弦を算出する（ピアソンの積率相関係数）。
【００３８】
数３では、数１および２で算出したベクトルの長さおよび余弦の値から、陽性対照物質の高濃度暴露区における影響の度合いを１．０とした時のその他濃度暴露区（対照区を含む）における影響の度合いを算出する（図１）。算出した影響の度合いを陽性対照物質濃度に対してプロットすることで、陽性対照物質濃度と影響の度合いとの換算式を作成する。換算式は、特に限定しないが、直線近似、多項式近似、指数近似などの中から決定係数Ｒ2値（相関係数の２乗）が大きいものを選択して用いるのがよい。
【００３９】
生物学的・病理組織学的・分子生物学的な手法を用いて行った長期的な影響の評価結果、例えば、産卵数、卵の受精率、生殖腺異常の割合、性転換率などを陽性対照物質濃度に対してプロットすることで、陽性対照物質濃度と長期的な内分泌攪乱影響との換算式を作成する。換算式は、特に限定しないが、直線近似、多項式近似、指数近似などの中からＲ2値が大きいものを選択して用いるのがよい。
【００４０】
上記２つの換算式を組み合わせて、特定遺伝子群の発現量データから長期的な影響を算出する換算式を作成する。
【００４１】
本発明において作成した、特定遺伝子群の発現量データから長期的な影響を算出する方法により、化学物質、環境中のサンプル等の実サンプルの長期的な危険の度合いを予測する。実サンプルは、単独の化学物質でも産業排水、生活廃水、土壌・底質抽出水、河川・湖沼表層水等の環境中のサンプルのような混合物でも構わない。陽性対照物質と同じ条件下で実サンプルの暴露実験および網羅的遺伝子発現解析を行い、上記計算方法により実サンプルによる長期的な内分泌攪乱影響の度合いを算出し、予測する。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
女性ホルモン様化学物質がヒメダカに及ぼす長期的影響の予測
＜ヒメダカの女性ホルモン様化学物質への曝露実験方法＞
本発明の実施にはヒメダカを指標水棲生物として用いた。ヒメダカは標準株（ＮＩＥＳ株）を国立環境研究所（日本）より入手し、株式会社日本紙パルプ研究所（日本）にて産卵させ、継代飼育を行った。胚および孵化後の飼育と曝露実験にはガラス製もしくは化学的に不活性な材質（フッ素樹脂製）でできた水槽を用いた。胚および孵化後の飼育と曝露実験の際には、水温２４±１℃、明１６時間、暗８時間の光周期を維持し、溶存酸素濃度が８０％を下回らないようにエアレーションを行った。孵化後与える飼料としては、孵化２４時間以内のアルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）製品名：ブラインシュリンプ（日清マリンテック、日本）を用い、１日２回適量を給餌した。
【００４３】
胚および孵化後の飼育と曝露実験には、飲料用水道水をＰＥＳメンブレンカートリッジ（ＴＣＳ−Ｅ０２０、ＡＤＶＡＮＴＥＣ、日本）および活性炭カートリッジフィルター（ＴＣＣ−ＷＬ−ＳＯＣＰ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ、日本）で微粒子および残留塩素をろ過・除去後、一昼夜以上曝気したものを用いた。これらフィルターは最低１ヶ月に１回は交換した。ヒメダカ成熟後は、飼育および曝露水槽中の魚体密度が１００尾／５０Ｌを超えないようにした。標準的な魚類毒性試験マニュアルでは、飼育および曝露用水の全硬度は炭酸カルシウム１０〜２５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６〜８．５の範囲であることが推奨されているが、実施例で使用した飼育および曝露用水は全硬度５０〜９０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７〜８．５の範囲に保たれていた。
【００４４】
女性ホルモンである１７β−エストラジオール（以下Ｅ２）を陽性対照物質として用い、１、３、１０、３０、１００ｎｇ／Ｌと対照区の計６濃度区で曝露を行った。Ｅ２への曝露実験は、以下のように流水式で行った。
【００４５】
Ｅ２のジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）溶液をミニケミカルポンプＳＰ−Ｄ（日本精密科学、日本）で最終濃度が上記濃度になるように曝露用水に連続的に添加して十分に攪拌後、３０Ｌのガラス製水槽に毎分１００ｍＬになるように送液した。対照区は、暴露用水に曝露区と同じ濃度になるようにＤＭＳＯを加えたものを用いた。
【００４６】
各暴露水槽に孵化直後（孵化後１２時間以内）のヒメダカの幼魚をそれぞれ２９０尾移し、曝露を開始した。曝露開始後２日目および７日目に、それぞれ各濃度区１２０尾ずつサンプリングし、３０尾ずつ約０．３ｍＬの曝露溶液中で液体窒素にて瞬間凍結し、そのまま液体窒素中で保存した。曝露開始後７日目以降残った約５０尾はそのまま孵化後２ヶ月まで曝露を継続した。曝露終了後、生存したヒメダカに対し、生物学的実験（体長・体重など体測、産卵数・卵の受精率測定、生殖腺の病理組織学実験、性別判定など）を行った。
【００４７】
女性ホルモン作用を持つとされる物質のうち、ノニルフェノール（以下ＮＰ）、エチニルエストラジオール（以下ＥＥ２）、およびビスフェノールＡ（以下ＢｐＡ）を実サンプルとして用いた。曝露に用いた濃度はそれぞれ３０μｇ／Ｌ、２０ｎｇ／Ｌ 、および１ｍｇ／Ｌを用いた。曝露およびサンプリングはＥ２の曝露およびサンプリングと同様に行った。ただし、曝露開始時のヒメダカ幼魚数は２７０尾で、孵化後２ヶ月まで曝露を継続した数は２０〜３０尾であった。
【００４８】
＜生物学的実験＞
孵化後２ヶ月までの曝露実験が終了するまでに、飼育水のみでヒメダカを飼育し、孵化後２〜３ヶ月の成熟した（産卵能力がある）ヒメダカを別途十分数確保しておいた。この成熟したヒメダカを以下正常オス、正常メスと呼ぶ。
曝露実験終了後、対照区および各濃度区につき、それぞれのオスおよびメスから無作為に１０尾ずつ選別した。オスもしくはメスが１０尾に満たない場合は、存在する数だけ選別した。選別したオスおよびメスを、それぞれ上記で確保しておいた正常メスおよび正常オスと１尾ずつペアにし、飼育水が循環しているアクリル製の１Ｌ水槽に１ペアずつ入れた。ペアにした後、７日間毎日卵を採取してペア毎に産卵数を記録後、卵を飼育水中にて１日培養して受精卵の数を計測することでペア毎の卵の受精率を算出した（表１）。この産卵実験結果およびＥ２濃度から、Ｅ２濃度と産卵数および受精率の換算式（数４〜数７）を以下のように作成した。
【００４９】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【００５０】
【表１】
【００５１】
孵化後２ヶ月までの曝露実験および産卵実験終了後、全てのヒメダカは解剖して生殖腺（卵巣もしくは精巣）を取り出し、ホルマリン含有組織固定液であるティシュー・テック ユフィックス（サクラファインテック、日本）にて一昼夜固定した後、７０％（ｖ／ｖ）エタノール（３０％は蒸留水）にて一昼夜以上置換した。ホルマリン固定した生殖腺は、自動包埋装置であるシャンドンエクセルシアＥＳ（サーモエレクトロン、米国）にて、エタノール―キシレン―パラフィンのシークエンスにより、パラフィン包埋を行った。パラフィン包埋された生殖腺は、回転式ミクロトームＲＭ２１４５（ライカマイクロシステムズ、ドイツ）により連続的に厚さ５μｍの薄切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、生殖腺の異常を観察した。
女性ホルモン様物質によって引き起こされる生殖腺の異常の内、最も顕著な現象は精巣内に卵細胞が出現する精巣卵である。病理組織学実験結果（表１）およびＥ２濃度から、Ｅ２濃度と精巣卵出現率（［精巣卵が観察された個体数］／［表現型オス（形態学上・解剖学上のオス）個体数］×１００）の換算式（数８）を以下のように作成した。
【００５２】
【数８】
【００５３】
女性ホルモン様物質に初期生活段階のヒメダカを曝露すると、性転換が起こることが知られている。ヒメダカの性染色体にはＸおよびＹ染色体があり、メスはＸＸ、オスはＸＹの組み合わせを持つ。Ｙ染色体上に性決定遺伝子であるＤＭＹが存在する。ＤＭＹに似た配列を持ち、性分化に重要な役割を果たすＤＭＲＴ１はＸおよびＹ染色体両方に存在すると考えられている。ＤＭＹおよびＤＭＲＴ１をＰＣＲ反応により、同時に増幅できるプライマー（ＤＮＡ断片）が数種類開発されている。その内、ＰＧ１７．５（配列表配列番号１）およびＰＧ１７．６（配列表配列番号２）を使うと、ＤＭＲＴ１とＤＭＹでは増幅されるＤＮＡ断片の長さが異なる為、両遺伝子が共存した場合（オス）は電気泳動において２つのバンドが観察され、ＤＭＲＴ１のみが存在する場合（メス）はバンドが１つだけ観察される（図２）。このことにより、遺伝的性別判定、つまり、形態学上・解剖学上はメスでも遺伝的なオスが女性ホルモン様化学物質によって性転換したメスと、遺伝的かつ形態学上・解剖学上のメスを区別した。
【００５４】
即ち、孵化後２ヶ月までの曝露実験および産卵実験終了後、全てのヒメダカの尾鰭を切り取り、液体窒素中で急速凍結し、以下のようにして遺伝的性別判定を行った。ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、米国）を用いて尾鰭からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡに対して、ＰＧ１７．５およびＰＧ１７．６を使い、自動ＰＣＲ装置であるＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｕｐｉｄ−Ｓｃｏｐｅ（タカラバイオ、日本）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物は、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）を用いて電気泳動解析した。本実施例において観察されたのは、オスからメスへの性転換のみで、メスからオスへの性転換は全く観察されなかった（表１）。Ｅ２濃度と各濃度区における性転換率（［性転換したオス個体数］／［遺伝的なオス個体数］×１００）の換算式（数９）を以下のように作成した。
【００５５】
【数９】
【００５６】
＜ヒメダカＤＮＡマイクロアレイ実験＞
曝露２日目および７日目の各濃度区につき４サンプルを、それぞれ乳鉢内において液体窒素存在下ですり潰し、すり潰した粉末試料からＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、米国）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出・精製した。精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）およびバイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）により、精製度および品質と濃度を調べた。
【００５７】
財団法人化学物質評価研究機構（日本）にてヒメダカ用に開発されＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国）で製品化されたＤＮＡマイクロアレイ（商品名カスタムマイクロアレイＧＥ ４×４４Ｋ、Ｇ２５１４Ｆ）を用いて、各濃度区、曝露２日目および７日目の３サンプルずつにつき網羅的に遺伝子発現量を検出した。このヒメダカ用ＤＮＡマイクロアレイ上には、米国ＤＦＣＩ（Ｔｈｅ Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ）に登録されているＥＳＴ情報に基づくものおよび財団法人化学物質評価研究機構（日本）にて独自に開発されたもの合わせて３６，３９９種類のプローブ（遺伝子断片）が搭載されている。これらのプローブは、次の１）〜４）に従って設計されたものである。
１）プローブ長を６０ｍｅｒ（ただし、設計が困難な場合は６０±５ ｍｅｒ）とする。
２）ハイブリダイゼーション温度を６５℃としたＴｍ値で設計する。
３）設計領域は３’末端から６００ｂｐ以内とする。この基準で設計が困難な場合は、領域を３’末端から１０００〜１５００ｂｐとする。
４）上記１）〜３）の基準でＤＦＣＩ Ｍｅｄａｋａ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｅｘデータベースの全配列情報に対して各遺伝子の最小ホモロジー領域を探索し、適切なプローブ配列を選択し、設計する。
精製されたｔｏｔａｌ ＲＮＡの標識化、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイのスキャニングおよびデータ化は、全てＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のプロトコールに従って行った。
【００５８】
＜マイクロアレイデータ解析とＥ２による影響の度合いの算出＞
マイクロアレイデータは全てのサンプルにつき、中央値を比較し、３６，３９９種類の遺伝子の発現量を正規化した（Ｐｅｒ ｃｈｉｐ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅｄｉａｎ）。正規化した発現量データを、まずそれぞれの遺伝子について対照区とＥ２ １００ｎｇ／Ｌ曝露区の比較を行い、曝露２日目もしくは曝露７日目においてｔ検定によって有意差（有意確率５％未満）がある遺伝子群２，１０７種類から、曝露２日目もしくは曝露７日目において遺伝子発現量が対照区と比較して２倍以上もしくは１／２倍以下に変化している遺伝子を２４０種類（プローブ名Ａ１〜Ａ２４０）選別した（表２）。プローブ名Ａ１〜Ａ１０の塩基配列を配列表配列番号３〜１２に示した。
【００５９】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【００６０】
選別した２４０種類の遺伝子群の曝露７日目における発現量データおよび数１〜３から、対照区および各曝露区におけるＥ２濃度依存的な影響の度合いを計算し、対照区の影響の度合いが０になるように補正（対照区の影響の度合い０．１５１を減算した値）した影響の度合いに対するＥ２濃度をプロットして（図３）直線回帰することにより、以下のようにＥ２濃度の換算式（数１０）を作成した。
【００６１】
【数１０】
【００６２】
＜実サンプルの長期的な女性ホルモン影響の予測と予測方法の検証＞
実サンプルであるＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露区のヒメダカに対してもＥ２と同様にマイクロアレイ実験を行い、上記２４０種類の遺伝子の発現量（表３）および数１〜３から影響の度合いを算出した。その結果、Ｅ２ １００ｎｇ／Ｌの影響の度合いを１．０とした時のＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）による影響の度合いはそれぞれ０．３５、０．４７、０．３４となった。これらの数値を換算式（数１０）に適用すると、ＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露による影響は、Ｅ２濃度に換算するとそれぞれ１８．０ｎｇ／Ｌ、３３．１ｎｇ／Ｌ、および１７．２ｎｇ／Ｌ相当であると計算された。
【００６３】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【００６４】
ＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露区のＥ２濃度換算値およびＥ２曝露実験より得られた生物学的影響の換算式（数４〜９）より、ＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露によって引き起こされる内分泌攪乱影響を予測した。予測された結果を表４にまとめた。
【００６５】
【表４】
【００６６】
［検証試験］
上記実施例１で示された予測方法の妥当性を検証するため、実施例１に追加してＥ２と同様にヒメダカが成熟するまでＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）に曝露し、実際に得られた内分泌攪乱影響（以下「実測値」）（表５）と予測された内分泌攪乱影響（以下「予測値」）を比較した。
【００６７】
【表５】
【００６８】
予測値と実測値を比較するために、まず個数（産卵数）はｌｏｇ10（産卵数＋１）によって実数変換を行い、割合（受精率、精巣卵出現率、性転換率）はａｓｉｎ（逆正弦）変換を行って、数値を標準化した（表６）。
【００６９】
【表６】
【００７０】
標準化した予測値と実測値について、ＮＰ、ＥＥ２、ＢｐＡ曝露区のそれぞれに対し回帰分析を行った結果、重決定係数Ｒ2はそれぞれ０．９９４、０．９１６、０．９５０と全て０．９を超える高い値を示した（表７）。このことから、本発明に関する危険の予測方法は妥当であり、本発明により女性ホルモンによる長期的な内分泌攪乱影響を高い精度で予測できることが明らかとなった。
【００７１】
【表７】
【実施例２】
【００７２】
男性ホルモン様化学物質がヒメダカに及ぼす長期的影響の予測
＜ヒメダカの男性ホルモン様化学物質への曝露実験方法＞
本実施例において男性ホルモンの陽性対照物質は１７β−トレンボロン（以下ＴＲ）を用い、曝露は２、６、２０、６０、２００ｎｇ／Ｌと対照区の計６濃度区で行った。実サンプルとしては、男性ホルモン作用を持つとされる物質のうち、メチルテストステロン（以下ＭＴ）を３０ｎｇ／Ｌで曝露した。ヒメダカの飼育および曝露は実施例１と同様に行った。
【００７３】
＜生物学的実験＞
実施例１と同様に産卵実験、病理組織学実験および遺伝的性別判定を行った結果を表８にまとめた。実施例１と異なり本実施例ではオス、メスともに生殖腺に異常は観察されなかった。また、本実施例において観察されたのはメスからオスへの性転換のみで、オスからメスへの性転換は全く観察されなかった（表８）。
【００７４】
以上の生物学実験結果およびＴＲ濃度から、ＴＲ濃度と産卵数、受精率および性転換率（［性転換したメス個体数］／［遺伝的なメス個体数］×１００）の換算式（数１１〜１５）を以下のように作成した。
【００７５】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【数１５】
【００７６】
【表８】
【００７７】
＜ヒメダカＤＮＡマイクロアレイデータ解析とＴＲによる影響の度合いの算出＞
ヒメダカＤＮＡマイクロアレイ実験、プローブの設計およびデータの正規化は実施例１と同様に行った。
正規化した発現量データを、まずそれぞれの遺伝子について対照区とＴＲ ２００ｎｇ／Ｌ曝露区の比較を行い、曝露２日目もしくは曝露７日目においてｔ検定によって有意差（有意確率５％未満）がある遺伝子群１７，６５８種類から、曝露２日目もしくは曝露７日目において遺伝子発現量が対照区と比較して２倍以上もしくは１／２倍以下に変化している遺伝子を３，３１９種類選別し、さらに濃度依存的に発現量が増加あるいは減少している遺伝子を２７０種類（プローブ名Ｂ１〜Ｂ２７０）選別した（表９）。プローブ名Ｂ１〜Ｂ１０の塩基配列を配列表配列番号１３〜２２に示した。
【００７８】
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【表９−４】
【表９−５】
【表９−６】
【表９−７】
【表９−８】
【００７９】
選別した２７０種類の遺伝子群の曝露７日目における発現量データおよび数１〜３から、対照区および各曝露区におけるＴＲ濃度依存的な影響の度合いを計算し、対照区の影響の度合いが０になるように補正（対照区の影響の度合い０．６９７を減算した値）した影響の度合いに対するＴＲ濃度をプロットして（図４）２項式近似することにより、以下のようにＴＲ濃度の換算式（数１６）を作成した。
【００８０】
【数１６】
【００８１】
＜実サンプルの長期的な男性ホルモン影響の予測と予測方法の検証＞
実サンプルであるＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露区のヒメダカに対してもＴＲと同様にマイクロアレイ実験を行い、上記２７０種類の遺伝子の発現量（表１０）および数１〜３から影響の度合いを算出した。その結果、ＴＲ ２００ｎｇ／Ｌの影響の度合いを１．０とした時のＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）による影響の度合いは０．９４となった。この数値を ［換算ＴＲ濃度（ｎｇ／Ｌ）］＝２４７４．６×（［影響の度合い］−０．６９７）2−８８．８８４×（［影響の度合い］−０．６９７）に適用すると、ＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露による影響はＴＲ濃度に換算すると１２１．４ｎｇ／Ｌ相当であると計算された。
【００８２】
【表１０−１】
【表１０−２】
【表１０−３】
【表１０−４】
【表１０−５】
【表１０−６】
【表１０−７】
【表１０−８】
【００８３】
ＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露区のＴＲ濃度換算値およびＴＲ曝露実験より得られた生物学的影響の換算式（数１１〜１５）より、ＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露によって引き起こされる影響を予測した。予測された結果を表１１にまとめた。
【００８４】
【表１１】
【００８５】
［検証試験］
上記実施例２で示された予測方法の妥当性を検証するため、実施例２に追加してＴＲと同様にヒメダカが成熟するまでＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）に曝露し、実際に得られた影響（以下「実測値」）（表１２）と予測された影響（以下「予測値」）を比較した。
【００８６】
【表１２】
【００８７】
予測値と実測値を比較するために、まず個数（産卵数）はｌｏｇ10（産卵数＋１）によって実数変換を行い、割合（受精率、精巣卵出現率、性転換率）はａｓｉｎ（逆正弦）変換を行って、数値を標準化した（表１３）。
【００８８】
【表１３】
【００８９】
標準化した予測値と実測値について、ＭＴ曝露区に対し回帰分析を行った結果、重決定係数Ｒ2は０．９７０と０．９を超える高い値を示した（表１４）。このことから、本発明に関する危険の予測方法は妥当であり、本発明により男性ホルモンによる長期的な影響についても高い精度で予測できることが明らかとなった。
【００９０】
【表１４】
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の方法によって、化学物質または環境中のサンプル（産業排水、生活廃水、土壌・底質抽出水、河川・湖沼表層水等）等の実サンプルが、生物に及ぼす長期的な影響を、短期間の実サンプルの曝露によって、容易に予測することができる。本発明の方法では、生物個体あるいは組織全体を網羅的に解析して影響の度合いを数値化していることから、生物個体あるいは組織全体に対する影響の強さを総合的に評価する方法を提供することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が被検水棲生物に及ぼす影響を網羅的遺伝子発現解析によって評価し、該被検水棲生物が長期的に受ける影響を予測する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在地球上には数千万の化学物質が存在しており、そのうち、数万種類の合成化学物質が環境中に蓄積していると考えられている。これら化学物質の中には、元の形もしくは環境中で変化した形で生態系や人体に悪影響を及ぼす物質が存在する。環境中に微量に存在する化学物質を同定・定量する技術は日々目覚しく進歩しているが、現状では環境中に存在する全ての化学物質を同定できるわけではない。また、環境中に存在する濃度そのものが環境に与える影響の強さを必ずしも反映しているわけではない。そのため、化学物質の環境影響評価は生物毒性評価試験（バイオアッセイ）を用いて行うことが重要である。
【０００３】
現在、バイオアッセイにはヒメダカなど水棲生物を中心に様々な指標生物が用いられている。バイオアッセイに関する国際的な毒性試験標準マニュアルも多数公表されており、種々の化学物質の毒性評価に広く用いられている（非特許文献１，２）。しかしながら、その多くは指標生物の致死もしくは外見上の異常を観察して評価対象化学物質の毒性を数値化するだけで、内分泌攪乱化学物質等のように致死も外見上の異常もほとんど引き起こさないが、体内で長期的に悪影響を及ぼす物質の評価には利用することは困難である。
【０００４】
この為、内分泌攪乱化学物質等の物質による影響を評価する様々な手法が新たに開発されている（非特許文献３）。これらには大きく分けて２つの手法がある。１つ目は、ある種の指標となる遺伝子もしくはタンパク質が生体内でどの程度活性化されたかを測定する方法である。これらには、ホルモン受容体の活性化の度合いを測定する手法や卵黄タンパク質前駆体（魚類などの体内で女性ホルモン作用を持つ物質によって作られるタンパク質）の作られた量を測定する手法などがある。これらの手法は、評価対象化学物質が持つ作用（女性ホルモン作用など）の強さを短時間の実験で定量的に評価できる一方、多岐にわたる反応が複雑に相互作用する生体内反応のごく一部しか評価できないという欠点がある。また単純な評価法であるがゆえに、これらの手法で得られた結果は実際に生物体内で起こる異常の度合いと相関がない場合も多い。
【０００５】
２つ目は、指標生物が生まれてから成熟し次世代を残すまで評価対象化学物質に暴露し、生物学的・形態学的・組織学的手法などを用いて長期的な影響を評価する方法である。この方法では主にヒメダカなど魚類が用いられており、微量の化学物質に長期的に暴露された際の影響を総合的に評価できる。しかしながら、１回の試験に時間（試験方法によっては半年〜１年間）がかかるため、この方法では限られた数の化学物質しか評価できない。
【０００６】
これら従来の評価法の欠点を補うと期待されているのが、ＤＮＡマイクロアレイなど網羅的遺伝子発現解析法である。この手法では、比較的短時間の実験により、種々の化学物質や産業排水、生活廃水、土壌・底質抽出水、河川・湖沼表層水等によって生体内でどのような影響が起こるかを総合的に評価することができる。この網羅的遺伝子発現解析により、正常状態の生物の生理状態や化学物質による生理状態の変化を評価することができることが知られている（特許文献１，２，３）。しかしながら、これまではある時点における生物の生理状態は評価できても、将来的にどのような生理状態へ変化するかを予測することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２４６７３９号公報
【特許文献２】特開２００８−０００１３１号公報
【特許文献３】特開２００８−１６７６９９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＯＥＣＤ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， “Ｆｉｓｈ， Ａｃｕｔｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅｓｔ” Ｖｏｌ． ２０３， １−９， １９９２
【非特許文献２】ＵＳＥＰＡ， ＥＰＡ／６００／４−９０−０２７Ｆ， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｃｕｔｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｅｆｆｌｕｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｗａｔｅｒｓ ｔｏ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ４th ｅｄ．”
【非特許文献３】環境省、Ｍｅｄａｋａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄａｋａ ａｓ Ｔｅｓｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ２００３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の状況を鑑み、本発明の課題は、評価の対象とする化学物質等を実サンプルとして短期間暴露した生物における網羅的遺伝子発現解析を行い、陽性対照物質を同生物に暴露した場合における網羅的遺伝子発現解析の結果と比較することで、評価対象化学物質が長期的にどのような影響をどの程度の強さで及ぼすかを予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の工程を実施することにより本発明の課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
最初の工程では、陽性対照物質を、濃度を段階的に変えて初期生活段階の被検水棲生物に短期間暴露した後、この水棲生物由来の生物学的試料において網羅的遺伝子発現解析を行い、陽性対照物質によって特徴的に発現する遺伝子群を特定する。特定した遺伝子群の発現量データから、陽性対照物質が濃度依存的に与える遺伝子発現への影響の度合いを数値化し、陽性対照物質濃度に対して数値化した影響の度合いをプロットすることで、陽性対照物質の濃度と遺伝子発現への影響の度合いとの換算式を作成する。
【００１２】
次の工程では、陽性対照物質を、濃度を段階的に変えて被検水棲生物に、初期生活段階から成熟するまでの間、長期的に暴露して、この水棲生物の生物学的観察を行い、陽性対照物質が濃度依存的に与える生物学的影響を数値化する。ここで、生物学的影響の数値化とは、被検水棲生物が魚類の場合、産卵数、卵の受精率、生殖腺重量、性転換率、生殖腺異常などを数値化することを指す。陽性対照物質濃度に対して数値化した生物学的影響をプロットすることで、陽性対照物質の濃度と生物学的影響との換算式を作成する。
【００１３】
上記の最初の工程と次の工程で作成した２つの換算式を組み合わせて、最初の工程で特定した遺伝子群の発現量データから長期的な生物学的影響を算出する換算式を作成する。
【００１４】
化学物質、環境中のサンプル（産業排水、生活廃水、土壌・底質の滲出もしくは抽出水、河川・湖沼・海域の表層水等）等を実サンプルとして、最初の工程と同様の条件で被検水棲生物に暴露し、この水棲生物由来の生物学的試料において網羅的遺伝子発現解析を行い、遺伝子発現への影響の度合いを調べる。そして、最初の工程で特定した遺伝子群の発現量データから、上記の最初の工程で作成した換算式を用いて、陽性対照物質の濃度に換算し、上記の次の工程で作成した換算式を用いることで、この換算された濃度に対応する生物学的影響を求めることで、被検水棲生物に対する実サンプルによる長期的な生物学的影響を予測する。
【００１５】
すなわち、本発明は次の（１）〜（７）の被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する方法、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な内分泌攪乱影響を算出する方法等に関する。
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する方法、
（ａ）陽性対照物質を濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に短期間暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物由来の生物学的試料において、網羅的遺伝子発現解析を行う工程、
（ｃ）（ｂ）の網羅的遺伝子発現解析の結果から、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程。
（２）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法、
（ａ）陽性対照物質を被検水棲生物に初期生活段階から成熟するまでの間、長期的に暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より生物学的実験結果を得る工程、
（ｃ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より上記（１）に記載の方法によって、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）の工程より、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する工程。
（３）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、実サンプルによる被検水棲生物に対する長期的な影響を予測する方法、
（ａ）実サンプルを濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に暴露し、網羅的遺伝子発現解析を行い、上記（１）に記載の方法によって、被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｂ）（ａ）の工程によって算出された被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを陽性対照物質の濃度に換算する工程、
（ｃ）（ｂ）の工程によって換算された陽性対照物質の濃度を用い、上記（２）に記載の方法によって、実サンプルによる長期的な影響を予測する工程。
（４）陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、上記（１）に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な内分泌攪乱影響の度合いを算出する方法。
（５）陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、上記（２）に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法。
（６）陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質であり、かつ実サンプルが化学物質または環境中のサンプルである、上記（３）に記載の方法による実サンプルによる長期的な内分泌攪乱影響を予測する方法。
（７）環境中のサンプルが産業排水、生活廃水、土壌・底質の滲出もしくは抽出水、河川・湖沼・海域の表層水である上記（４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、生物個体あるいは組織全体を網羅的に解析して影響の度合いを数値化するものであるから、本発明によれば個々の遺伝子についてではなく、生物個体あるいは組織全体に対する影響の強さを総合的に評価する方法を提供することができる。特に、これまでの網羅的遺伝子発現解析では生理機能が明らかでない遺伝子の発現量データはほとんど意味を持たなかったが、本発明における影響の度合いの算出においては意味のあるデータとして利用できる。
【００１７】
また、内分泌攪乱化学物質を陽性対照物質とした場合には、本発明は遺伝子発現量データからこの内分泌攪乱化学物質の長期的な生物学的影響を算出するものであるから、従来は化学物質または環境中のサンプル等、実サンプルの莫大な時間を要する長期暴露実験でしか実施できなかった、長期的な内分泌攪乱作用の強さを、短期間の暴露実験によって予測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明における、網羅的遺伝子発現解析の結果から陽性対照物質による影響の度合いを算出する方法の概念図である。
【図２】ＰＣＲによる遺伝的性別判定から得られる電気泳動写真である（実施例１および２）。
【図３】Ｅ２濃度と算出された影響の度合いとＥ２濃度との関係を示す図である（実施例１）。換算式中のｘは各濃度区における影響の度合いである。図中ではｘから対照区の影響の度合いである０．１５１を減算した値とＥ２濃度ｙをプロットしたものを示してある。
【図４】ＴＲ濃度と算出された影響の度合いとＴＲ濃度との関係を示す図である（実施例２）。換算式中のｘは各濃度区における影響の度合いである。図中では、ｘから対照区の影響の度合いである０．６９７を減算した値とＴＲ濃度ｙをプロットしたものを示してある。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態による、陽性対照物質が被検水棲生物に及ぼす影響を網羅的遺伝子発現解析によって評価し、該被検水棲生物が長期的に受ける影響を予測する方法について説明する。
【００２０】
本発明は、陽性対照物質が水棲生物に及ぼす影響を網羅的遺伝子発現解析および長期的な生物学的実験により評価する方法である。本発明において、水棲生物は特に限定されるものではないが、好ましくは魚類を、より好ましくはヒメダカやゼブラフィッシュなど孵化後２〜３ヶ月で成熟する小型の硬骨魚類を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、初期生活段階の水棲生物に陽性対照物質を暴露し網羅的遺伝子発現解析を行うが、この場合の「初期生活段階」とは魚類を用いる場合であれば、胚もしくは孵化直後（孵化してから１２時間以内）の幼魚のいずれでも構わない。
【００２２】
陽性対照物質を暴露する方法は、連続的に物質溶液を調製して連続的に被検水棲生物を暴露する流水式暴露が望ましいが、被検物質の水中における安定性もしくは流水式と同様の影響（遺伝子発現レベルおよび生物学的影響）が保証される場合は、毎日１〜２回物質溶液を全て交換する半止水式暴露でも構わない。
【００２３】
網羅的遺伝子発現解析のための暴露期間は、網羅的遺伝子発現解析によって暴露区と陽性対照物質を含まない対照区を比較した際に発現レベルの変化を検出できる程度の暴露期間であればよく、数時間から１〜２週間いずれでも構わない。また、暴露期間は１点である必要性はなく、例えば２日間と７日間のように複数点行ってもよい。
【００２４】
長期的な陽性対照物質の影響を評価するための暴露期間は、被検水棲生物が初期生活段階から成熟し次世代を残す能力を有するまでとする。例えば、ヒメダカの場合は孵化後約２〜３ヶ月までを長期的な暴露期間とする。
【００２５】
長期的な陽性対照物質の影響の評価は、生物学的・病理組織学的・分子生物学的な手法を用いて行う。例えば、魚類の場合は産卵数計測、卵の受精率計測、生殖腺の形態観察、遺伝的性別判定などがこれに該当する。
【００２６】
陽性対照物質を暴露する際に使用する水の水質、明暗周期、給餌方法などの試験条件は、使用する被検水棲生物の標準的な飼育・毒性試験マニュアル（非特許文献１、２等）に準ずる。
【００２７】
陽性対照物質は、陽性対照として用いることができる物質であればいずれの物質も用いることができるが、内分泌攪乱化学物質等の学術論文等で定められている物質を用いることが好ましい。例えば、１７β−エストラジオール等の女性ホルモン、１７β−トレンボロン等の男性ホルモン、マイトマイシンＣ等の変異原性・遺伝毒性物質等が挙げられる。
【００２８】
陽性対照物質を暴露する濃度は、被検水棲生物が初期生活段階から成熟するまで暴露された場合の長期的な影響の度合いによって定める。暴露区には、低・中・高濃度および陽性対照物質を含まない対照区の最低４濃度区が必要である。低濃度とは、長期的な影響が対照区と統計学的に有意の差が見られない濃度のことである。高濃度とは、評価したい長期的な影響が最大限観察される濃度のことであるが、評価したい影響以外の毒性影響が混在することを避けるため、長期的な影響が最大限観察されるならばできる限り低い濃度が望ましい。例えば、魚類に対して陽性対照物質として女性ホルモンを用い、この影響を評価する場合には、被検魚類が全てメス化するのに必要な濃度で、できる限り低い濃度がこの濃度に該当する。中濃度とは、低濃度と高濃度の中間に属する濃度のことである。低濃度と高濃度はそれぞれ１区でよいが、中濃度はできれば２〜３区あることが望ましい。
【００２９】
網羅的遺伝子発現解析のための暴露終了後、被検水棲生物由来の生物学的試料において、陽性対照物質の作用に関与する水棲生物遺伝子の少なくとも１つ以上の遺伝子発現レベルを決定する。被検水棲生物由来の生物学的試料は、水棲生物が小型である場合は、水棲生物全体から得た細胞試料を用いてもよい。遺伝子発現はまた、被検水棲生物の臓器や血液などから測定してもよい。
【００３０】
網羅的遺伝子発現解析に用いる遺伝子群の発現レベルはそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡを定量することで決定する。網羅的遺伝子発現解析に用いる遺伝子群およびｍＲＮＡの定量法は特に限定されるものではないが、発現レベルを決定する遺伝子群が数１０個を超える場合は、ノーザンブロッティングやＲＴ−ＰＣＲ法よりもＤＮＡマイクロアレイ法のような網羅的遺伝子発現解析手法を用いるのが望ましい。いずれの定量法を用いる場合においても、発現レベルデータの正規化・標準化を行う。
【００３１】
陽性対照物質に暴露された被検水棲生物遺伝子群の発現レベルを、対照区における該遺伝子の発現レベルと比較する。ｔ検定などの統計解析によって、陽性対照物質により特徴的な発現を示す遺伝子群を特定する。
【００３２】
陽性対照物質に特徴的に発現する遺伝子群の発現量データと数１〜３から物質濃度依存的な影響の度合いを数値化し、陽性対照物質濃度に対してプロットすることで、陽性対照物質濃度と影響の度合いとの換算式を作成する。
【００３３】
【数１】
【００３４】
【数２】
【００３５】
【数３】
【００３６】
数１では、特定遺伝子群の発現プロフィールをｎ個の要素からなるベクトルと考えた時、各暴露区および対照区における特定遺伝子群の発現量からそのベクトルの原点からの幾何学的距離（長さ）を算出する（ユークリッド距離）。
【００３７】
数２では、陽性対照物質の高濃度暴露区における特定遺伝子群のベクトルとその他濃度区（対照区を含む）のベクトルとの余弦を算出する（ピアソンの積率相関係数）。
【００３８】
数３では、数１および２で算出したベクトルの長さおよび余弦の値から、陽性対照物質の高濃度暴露区における影響の度合いを１．０とした時のその他濃度暴露区（対照区を含む）における影響の度合いを算出する（図１）。算出した影響の度合いを陽性対照物質濃度に対してプロットすることで、陽性対照物質濃度と影響の度合いとの換算式を作成する。換算式は、特に限定しないが、直線近似、多項式近似、指数近似などの中から決定係数Ｒ2値（相関係数の２乗）が大きいものを選択して用いるのがよい。
【００３９】
生物学的・病理組織学的・分子生物学的な手法を用いて行った長期的な影響の評価結果、例えば、産卵数、卵の受精率、生殖腺異常の割合、性転換率などを陽性対照物質濃度に対してプロットすることで、陽性対照物質濃度と長期的な内分泌攪乱影響との換算式を作成する。換算式は、特に限定しないが、直線近似、多項式近似、指数近似などの中からＲ2値が大きいものを選択して用いるのがよい。
【００４０】
上記２つの換算式を組み合わせて、特定遺伝子群の発現量データから長期的な影響を算出する換算式を作成する。
【００４１】
本発明において作成した、特定遺伝子群の発現量データから長期的な影響を算出する方法により、化学物質、環境中のサンプル等の実サンプルの長期的な危険の度合いを予測する。実サンプルは、単独の化学物質でも産業排水、生活廃水、土壌・底質抽出水、河川・湖沼表層水等の環境中のサンプルのような混合物でも構わない。陽性対照物質と同じ条件下で実サンプルの暴露実験および網羅的遺伝子発現解析を行い、上記計算方法により実サンプルによる長期的な内分泌攪乱影響の度合いを算出し、予測する。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
女性ホルモン様化学物質がヒメダカに及ぼす長期的影響の予測
＜ヒメダカの女性ホルモン様化学物質への曝露実験方法＞
本発明の実施にはヒメダカを指標水棲生物として用いた。ヒメダカは標準株（ＮＩＥＳ株）を国立環境研究所（日本）より入手し、株式会社日本紙パルプ研究所（日本）にて産卵させ、継代飼育を行った。胚および孵化後の飼育と曝露実験にはガラス製もしくは化学的に不活性な材質（フッ素樹脂製）でできた水槽を用いた。胚および孵化後の飼育と曝露実験の際には、水温２４±１℃、明１６時間、暗８時間の光周期を維持し、溶存酸素濃度が８０％を下回らないようにエアレーションを行った。孵化後与える飼料としては、孵化２４時間以内のアルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）製品名：ブラインシュリンプ（日清マリンテック、日本）を用い、１日２回適量を給餌した。
【００４３】
胚および孵化後の飼育と曝露実験には、飲料用水道水をＰＥＳメンブレンカートリッジ（ＴＣＳ−Ｅ０２０、ＡＤＶＡＮＴＥＣ、日本）および活性炭カートリッジフィルター（ＴＣＣ−ＷＬ−ＳＯＣＰ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ、日本）で微粒子および残留塩素をろ過・除去後、一昼夜以上曝気したものを用いた。これらフィルターは最低１ヶ月に１回は交換した。ヒメダカ成熟後は、飼育および曝露水槽中の魚体密度が１００尾／５０Ｌを超えないようにした。標準的な魚類毒性試験マニュアルでは、飼育および曝露用水の全硬度は炭酸カルシウム１０〜２５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６〜８．５の範囲であることが推奨されているが、実施例で使用した飼育および曝露用水は全硬度５０〜９０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７〜８．５の範囲に保たれていた。
【００４４】
女性ホルモンである１７β−エストラジオール（以下Ｅ２）を陽性対照物質として用い、１、３、１０、３０、１００ｎｇ／Ｌと対照区の計６濃度区で曝露を行った。Ｅ２への曝露実験は、以下のように流水式で行った。
【００４５】
Ｅ２のジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）溶液をミニケミカルポンプＳＰ−Ｄ（日本精密科学、日本）で最終濃度が上記濃度になるように曝露用水に連続的に添加して十分に攪拌後、３０Ｌのガラス製水槽に毎分１００ｍＬになるように送液した。対照区は、暴露用水に曝露区と同じ濃度になるようにＤＭＳＯを加えたものを用いた。
【００４６】
各暴露水槽に孵化直後（孵化後１２時間以内）のヒメダカの幼魚をそれぞれ２９０尾移し、曝露を開始した。曝露開始後２日目および７日目に、それぞれ各濃度区１２０尾ずつサンプリングし、３０尾ずつ約０．３ｍＬの曝露溶液中で液体窒素にて瞬間凍結し、そのまま液体窒素中で保存した。曝露開始後７日目以降残った約５０尾はそのまま孵化後２ヶ月まで曝露を継続した。曝露終了後、生存したヒメダカに対し、生物学的実験（体長・体重など体測、産卵数・卵の受精率測定、生殖腺の病理組織学実験、性別判定など）を行った。
【００４７】
女性ホルモン作用を持つとされる物質のうち、ノニルフェノール（以下ＮＰ）、エチニルエストラジオール（以下ＥＥ２）、およびビスフェノールＡ（以下ＢｐＡ）を実サンプルとして用いた。曝露に用いた濃度はそれぞれ３０μｇ／Ｌ、２０ｎｇ／Ｌ 、および１ｍｇ／Ｌを用いた。曝露およびサンプリングはＥ２の曝露およびサンプリングと同様に行った。ただし、曝露開始時のヒメダカ幼魚数は２７０尾で、孵化後２ヶ月まで曝露を継続した数は２０〜３０尾であった。
【００４８】
＜生物学的実験＞
孵化後２ヶ月までの曝露実験が終了するまでに、飼育水のみでヒメダカを飼育し、孵化後２〜３ヶ月の成熟した（産卵能力がある）ヒメダカを別途十分数確保しておいた。この成熟したヒメダカを以下正常オス、正常メスと呼ぶ。
曝露実験終了後、対照区および各濃度区につき、それぞれのオスおよびメスから無作為に１０尾ずつ選別した。オスもしくはメスが１０尾に満たない場合は、存在する数だけ選別した。選別したオスおよびメスを、それぞれ上記で確保しておいた正常メスおよび正常オスと１尾ずつペアにし、飼育水が循環しているアクリル製の１Ｌ水槽に１ペアずつ入れた。ペアにした後、７日間毎日卵を採取してペア毎に産卵数を記録後、卵を飼育水中にて１日培養して受精卵の数を計測することでペア毎の卵の受精率を算出した（表１）。この産卵実験結果およびＥ２濃度から、Ｅ２濃度と産卵数および受精率の換算式（数４〜数７）を以下のように作成した。
【００４９】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【００５０】
【表１】
【００５１】
孵化後２ヶ月までの曝露実験および産卵実験終了後、全てのヒメダカは解剖して生殖腺（卵巣もしくは精巣）を取り出し、ホルマリン含有組織固定液であるティシュー・テック ユフィックス（サクラファインテック、日本）にて一昼夜固定した後、７０％（ｖ／ｖ）エタノール（３０％は蒸留水）にて一昼夜以上置換した。ホルマリン固定した生殖腺は、自動包埋装置であるシャンドンエクセルシアＥＳ（サーモエレクトロン、米国）にて、エタノール―キシレン―パラフィンのシークエンスにより、パラフィン包埋を行った。パラフィン包埋された生殖腺は、回転式ミクロトームＲＭ２１４５（ライカマイクロシステムズ、ドイツ）により連続的に厚さ５μｍの薄切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、生殖腺の異常を観察した。
女性ホルモン様物質によって引き起こされる生殖腺の異常の内、最も顕著な現象は精巣内に卵細胞が出現する精巣卵である。病理組織学実験結果（表１）およびＥ２濃度から、Ｅ２濃度と精巣卵出現率（［精巣卵が観察された個体数］／［表現型オス（形態学上・解剖学上のオス）個体数］×１００）の換算式（数８）を以下のように作成した。
【００５２】
【数８】
【００５３】
女性ホルモン様物質に初期生活段階のヒメダカを曝露すると、性転換が起こることが知られている。ヒメダカの性染色体にはＸおよびＹ染色体があり、メスはＸＸ、オスはＸＹの組み合わせを持つ。Ｙ染色体上に性決定遺伝子であるＤＭＹが存在する。ＤＭＹに似た配列を持ち、性分化に重要な役割を果たすＤＭＲＴ１はＸおよびＹ染色体両方に存在すると考えられている。ＤＭＹおよびＤＭＲＴ１をＰＣＲ反応により、同時に増幅できるプライマー（ＤＮＡ断片）が数種類開発されている。その内、ＰＧ１７．５（配列表配列番号１）およびＰＧ１７．６（配列表配列番号２）を使うと、ＤＭＲＴ１とＤＭＹでは増幅されるＤＮＡ断片の長さが異なる為、両遺伝子が共存した場合（オス）は電気泳動において２つのバンドが観察され、ＤＭＲＴ１のみが存在する場合（メス）はバンドが１つだけ観察される（図２）。このことにより、遺伝的性別判定、つまり、形態学上・解剖学上はメスでも遺伝的なオスが女性ホルモン様化学物質によって性転換したメスと、遺伝的かつ形態学上・解剖学上のメスを区別した。
【００５４】
即ち、孵化後２ヶ月までの曝露実験および産卵実験終了後、全てのヒメダカの尾鰭を切り取り、液体窒素中で急速凍結し、以下のようにして遺伝的性別判定を行った。ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、米国）を用いて尾鰭からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡに対して、ＰＧ１７．５およびＰＧ１７．６を使い、自動ＰＣＲ装置であるＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｕｐｉｄ−Ｓｃｏｐｅ（タカラバイオ、日本）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物は、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）を用いて電気泳動解析した。本実施例において観察されたのは、オスからメスへの性転換のみで、メスからオスへの性転換は全く観察されなかった（表１）。Ｅ２濃度と各濃度区における性転換率（［性転換したオス個体数］／［遺伝的なオス個体数］×１００）の換算式（数９）を以下のように作成した。
【００５５】
【数９】
【００５６】
＜ヒメダカＤＮＡマイクロアレイ実験＞
曝露２日目および７日目の各濃度区につき４サンプルを、それぞれ乳鉢内において液体窒素存在下ですり潰し、すり潰した粉末試料からＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、米国）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出・精製した。精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）およびバイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）により、精製度および品質と濃度を調べた。
【００５７】
財団法人化学物質評価研究機構（日本）にてヒメダカ用に開発されＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国）で製品化されたＤＮＡマイクロアレイ（商品名カスタムマイクロアレイＧＥ ４×４４Ｋ、Ｇ２５１４Ｆ）を用いて、各濃度区、曝露２日目および７日目の３サンプルずつにつき網羅的に遺伝子発現量を検出した。このヒメダカ用ＤＮＡマイクロアレイ上には、米国ＤＦＣＩ（Ｔｈｅ Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ）に登録されているＥＳＴ情報に基づくものおよび財団法人化学物質評価研究機構（日本）にて独自に開発されたもの合わせて３６，３９９種類のプローブ（遺伝子断片）が搭載されている。これらのプローブは、次の１）〜４）に従って設計されたものである。
１）プローブ長を６０ｍｅｒ（ただし、設計が困難な場合は６０±５ ｍｅｒ）とする。
２）ハイブリダイゼーション温度を６５℃としたＴｍ値で設計する。
３）設計領域は３’末端から６００ｂｐ以内とする。この基準で設計が困難な場合は、領域を３’末端から１０００〜１５００ｂｐとする。
４）上記１）〜３）の基準でＤＦＣＩ Ｍｅｄａｋａ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｅｘデータベースの全配列情報に対して各遺伝子の最小ホモロジー領域を探索し、適切なプローブ配列を選択し、設計する。
精製されたｔｏｔａｌ ＲＮＡの標識化、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイのスキャニングおよびデータ化は、全てＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のプロトコールに従って行った。
【００５８】
＜マイクロアレイデータ解析とＥ２による影響の度合いの算出＞
マイクロアレイデータは全てのサンプルにつき、中央値を比較し、３６，３９９種類の遺伝子の発現量を正規化した（Ｐｅｒ ｃｈｉｐ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅｄｉａｎ）。正規化した発現量データを、まずそれぞれの遺伝子について対照区とＥ２ １００ｎｇ／Ｌ曝露区の比較を行い、曝露２日目もしくは曝露７日目においてｔ検定によって有意差（有意確率５％未満）がある遺伝子群２，１０７種類から、曝露２日目もしくは曝露７日目において遺伝子発現量が対照区と比較して２倍以上もしくは１／２倍以下に変化している遺伝子を２４０種類（プローブ名Ａ１〜Ａ２４０）選別した（表２）。プローブ名Ａ１〜Ａ１０の塩基配列を配列表配列番号３〜１２に示した。
【００５９】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【００６０】
選別した２４０種類の遺伝子群の曝露７日目における発現量データおよび数１〜３から、対照区および各曝露区におけるＥ２濃度依存的な影響の度合いを計算し、対照区の影響の度合いが０になるように補正（対照区の影響の度合い０．１５１を減算した値）した影響の度合いに対するＥ２濃度をプロットして（図３）直線回帰することにより、以下のようにＥ２濃度の換算式（数１０）を作成した。
【００６１】
【数１０】
【００６２】
＜実サンプルの長期的な女性ホルモン影響の予測と予測方法の検証＞
実サンプルであるＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露区のヒメダカに対してもＥ２と同様にマイクロアレイ実験を行い、上記２４０種類の遺伝子の発現量（表３）および数１〜３から影響の度合いを算出した。その結果、Ｅ２ １００ｎｇ／Ｌの影響の度合いを１．０とした時のＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）による影響の度合いはそれぞれ０．３５、０．４７、０．３４となった。これらの数値を換算式（数１０）に適用すると、ＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露による影響は、Ｅ２濃度に換算するとそれぞれ１８．０ｎｇ／Ｌ、３３．１ｎｇ／Ｌ、および１７．２ｎｇ／Ｌ相当であると計算された。
【００６３】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【００６４】
ＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露区のＥ２濃度換算値およびＥ２曝露実験より得られた生物学的影響の換算式（数４〜９）より、ＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）曝露によって引き起こされる内分泌攪乱影響を予測した。予測された結果を表４にまとめた。
【００６５】
【表４】
【００６６】
［検証試験］
上記実施例１で示された予測方法の妥当性を検証するため、実施例１に追加してＥ２と同様にヒメダカが成熟するまでＮＰ（３０μｇ／Ｌ）、ＥＥ２（２０ｎｇ／Ｌ）、ＢｐＡ（１ｍｇ／Ｌ）に曝露し、実際に得られた内分泌攪乱影響（以下「実測値」）（表５）と予測された内分泌攪乱影響（以下「予測値」）を比較した。
【００６７】
【表５】
【００６８】
予測値と実測値を比較するために、まず個数（産卵数）はｌｏｇ10（産卵数＋１）によって実数変換を行い、割合（受精率、精巣卵出現率、性転換率）はａｓｉｎ（逆正弦）変換を行って、数値を標準化した（表６）。
【００６９】
【表６】
【００７０】
標準化した予測値と実測値について、ＮＰ、ＥＥ２、ＢｐＡ曝露区のそれぞれに対し回帰分析を行った結果、重決定係数Ｒ2はそれぞれ０．９９４、０．９１６、０．９５０と全て０．９を超える高い値を示した（表７）。このことから、本発明に関する危険の予測方法は妥当であり、本発明により女性ホルモンによる長期的な内分泌攪乱影響を高い精度で予測できることが明らかとなった。
【００７１】
【表７】
【実施例２】
【００７２】
男性ホルモン様化学物質がヒメダカに及ぼす長期的影響の予測
＜ヒメダカの男性ホルモン様化学物質への曝露実験方法＞
本実施例において男性ホルモンの陽性対照物質は１７β−トレンボロン（以下ＴＲ）を用い、曝露は２、６、２０、６０、２００ｎｇ／Ｌと対照区の計６濃度区で行った。実サンプルとしては、男性ホルモン作用を持つとされる物質のうち、メチルテストステロン（以下ＭＴ）を３０ｎｇ／Ｌで曝露した。ヒメダカの飼育および曝露は実施例１と同様に行った。
【００７３】
＜生物学的実験＞
実施例１と同様に産卵実験、病理組織学実験および遺伝的性別判定を行った結果を表８にまとめた。実施例１と異なり本実施例ではオス、メスともに生殖腺に異常は観察されなかった。また、本実施例において観察されたのはメスからオスへの性転換のみで、オスからメスへの性転換は全く観察されなかった（表８）。
【００７４】
以上の生物学実験結果およびＴＲ濃度から、ＴＲ濃度と産卵数、受精率および性転換率（［性転換したメス個体数］／［遺伝的なメス個体数］×１００）の換算式（数１１〜１５）を以下のように作成した。
【００７５】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【数１５】
【００７６】
【表８】
【００７７】
＜ヒメダカＤＮＡマイクロアレイデータ解析とＴＲによる影響の度合いの算出＞
ヒメダカＤＮＡマイクロアレイ実験、プローブの設計およびデータの正規化は実施例１と同様に行った。
正規化した発現量データを、まずそれぞれの遺伝子について対照区とＴＲ ２００ｎｇ／Ｌ曝露区の比較を行い、曝露２日目もしくは曝露７日目においてｔ検定によって有意差（有意確率５％未満）がある遺伝子群１７，６５８種類から、曝露２日目もしくは曝露７日目において遺伝子発現量が対照区と比較して２倍以上もしくは１／２倍以下に変化している遺伝子を３，３１９種類選別し、さらに濃度依存的に発現量が増加あるいは減少している遺伝子を２７０種類（プローブ名Ｂ１〜Ｂ２７０）選別した（表９）。プローブ名Ｂ１〜Ｂ１０の塩基配列を配列表配列番号１３〜２２に示した。
【００７８】
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【表９−４】
【表９−５】
【表９−６】
【表９−７】
【表９−８】
【００７９】
選別した２７０種類の遺伝子群の曝露７日目における発現量データおよび数１〜３から、対照区および各曝露区におけるＴＲ濃度依存的な影響の度合いを計算し、対照区の影響の度合いが０になるように補正（対照区の影響の度合い０．６９７を減算した値）した影響の度合いに対するＴＲ濃度をプロットして（図４）２項式近似することにより、以下のようにＴＲ濃度の換算式（数１６）を作成した。
【００８０】
【数１６】
【００８１】
＜実サンプルの長期的な男性ホルモン影響の予測と予測方法の検証＞
実サンプルであるＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露区のヒメダカに対してもＴＲと同様にマイクロアレイ実験を行い、上記２７０種類の遺伝子の発現量（表１０）および数１〜３から影響の度合いを算出した。その結果、ＴＲ ２００ｎｇ／Ｌの影響の度合いを１．０とした時のＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）による影響の度合いは０．９４となった。この数値を ［換算ＴＲ濃度（ｎｇ／Ｌ）］＝２４７４．６×（［影響の度合い］−０．６９７）2−８８．８８４×（［影響の度合い］−０．６９７）に適用すると、ＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露による影響はＴＲ濃度に換算すると１２１．４ｎｇ／Ｌ相当であると計算された。
【００８２】
【表１０−１】
【表１０−２】
【表１０−３】
【表１０−４】
【表１０−５】
【表１０−６】
【表１０−７】
【表１０−８】
【００８３】
ＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露区のＴＲ濃度換算値およびＴＲ曝露実験より得られた生物学的影響の換算式（数１１〜１５）より、ＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）曝露によって引き起こされる影響を予測した。予測された結果を表１１にまとめた。
【００８４】
【表１１】
【００８５】
［検証試験］
上記実施例２で示された予測方法の妥当性を検証するため、実施例２に追加してＴＲと同様にヒメダカが成熟するまでＭＴ（３０ｎｇ／Ｌ）に曝露し、実際に得られた影響（以下「実測値」）（表１２）と予測された影響（以下「予測値」）を比較した。
【００８６】
【表１２】
【００８７】
予測値と実測値を比較するために、まず個数（産卵数）はｌｏｇ10（産卵数＋１）によって実数変換を行い、割合（受精率、精巣卵出現率、性転換率）はａｓｉｎ（逆正弦）変換を行って、数値を標準化した（表１３）。
【００８８】
【表１３】
【００８９】
標準化した予測値と実測値について、ＭＴ曝露区に対し回帰分析を行った結果、重決定係数Ｒ2は０．９７０と０．９を超える高い値を示した（表１４）。このことから、本発明に関する危険の予測方法は妥当であり、本発明により男性ホルモンによる長期的な影響についても高い精度で予測できることが明らかとなった。
【００９０】
【表１４】
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の方法によって、化学物質または環境中のサンプル（産業排水、生活廃水、土壌・底質抽出水、河川・湖沼表層水等）等の実サンプルが、生物に及ぼす長期的な影響を、短期間の実サンプルの曝露によって、容易に予測することができる。本発明の方法では、生物個体あるいは組織全体を網羅的に解析して影響の度合いを数値化していることから、生物個体あるいは組織全体に対する影響の強さを総合的に評価する方法を提供することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する方法、
（a）陽性対照物質を濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に短期間暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物由来の生物学的試料において、網羅的遺伝子発現解析を行う工程、
（ｃ）（ｂ）の網羅的遺伝子発現解析の結果から、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法、
（ａ）陽性対照物質を被検水棲生物に初期生活段階から成熟するまでの間、長期的に暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より生物学的実験結果を得る工程、
（ｃ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より請求項1記載の方法によって、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｄ）(ｂ)および（ｃ）の工程より、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する工程。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、実サンプルによる被検水棲生物に対する長期的な影響を予測する方法、
（ａ）実サンプルを濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に暴露し、網羅的遺伝子発現解析を行い、請求項１に記載の方法によって、被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｂ）（ａ）の工程によって算出された被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを陽性対照物質の濃度に換算する工程、
（ｃ）（ｂ）の工程によって換算された陽性対照物質の濃度を用い、請求項２に記載の方法によって、実サンプルによる長期的な影響を予測する工程。
【請求項４】
陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、請求項１に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な内分泌攪乱影響の度合いを算出する方法。
【請求項５】
陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、請求項２に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法。
【請求項６】
陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質であり、かつ実サンプルが化学物質または環境中のサンプルである、請求項３に記載の方法による実サンプルによる長期的な内分泌攪乱影響を予測する方法。
【請求項７】
環境中のサンプルが産業排水、生活廃水、土壌・底質の滲出もしくは抽出水、河川・湖沼・海域の表層水である請求項４に記載の方法。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する方法、
（a）陽性対照物質を濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に短期間暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物由来の生物学的試料において、網羅的遺伝子発現解析を行う工程、
（ｃ）（ｂ）の網羅的遺伝子発現解析の結果から、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法、
（ａ）陽性対照物質を被検水棲生物に初期生活段階から成熟するまでの間、長期的に暴露する工程、
（ｂ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より生物学的実験結果を得る工程、
（ｃ）（ａ）の工程を経た被検水棲生物より請求項1記載の方法によって、被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｄ）(ｂ)および（ｃ）の工程より、被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する工程。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、実サンプルによる被検水棲生物に対する長期的な影響を予測する方法、
（ａ）実サンプルを濃度依存的に初期生活段階の被検水棲生物に暴露し、網羅的遺伝子発現解析を行い、請求項１に記載の方法によって、被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを算出する工程、
（ｂ）（ａ）の工程によって算出された被検水棲生物に対する実サンプルの濃度依存的な影響の度合いを陽性対照物質の濃度に換算する工程、
（ｃ）（ｂ）の工程によって換算された陽性対照物質の濃度を用い、請求項２に記載の方法によって、実サンプルによる長期的な影響を予測する工程。
【請求項４】
陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、請求項１に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の濃度依存的な内分泌攪乱影響の度合いを算出する方法。
【請求項５】
陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質である、請求項２に記載の方法による被検水棲生物に対する陽性対照物質の長期的な影響を算出する方法。
【請求項６】
陽性対照物質が内分泌攪乱化学物質であり、かつ実サンプルが化学物質または環境中のサンプルである、請求項３に記載の方法による実サンプルによる長期的な内分泌攪乱影響を予測する方法。
【請求項７】
環境中のサンプルが産業排水、生活廃水、土壌・底質の滲出もしくは抽出水、河川・湖沼・海域の表層水である請求項４に記載の方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２６３８２２（Ｐ２０１０−２６３８２２Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１７１６５（Ｐ２００９−１１７１６５）
【出願日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（０００１５３２８１）株式会社日本紙パルプ研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（０００１５３２８１）株式会社日本紙パルプ研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
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