特定の塩濃度で自己集合性が惹起されるペプチドおよびその自己集合体
本発明は、新規な自己集合性ペプチドを提供することを課題とする。特に、本発明は、両親媒性に基づく自己集合をするペプチドとは異なる機構で自己集合するペプチドを提供すること、更に、生理的塩濃度を塩濃度閾値とする塩濃度依存的ペプチド性新規自己集合素材を提供することを課題とする。 フジツボ第３接着タンパク質のアミノ酸配列の各繰り返し配列を基にした、コンセンサス配列（配列番号１）、配列番号１のＮ末端側に電荷のクラスターＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを付加した配列（配列番号２）、５回目の繰り返し配列（配列番号３）、６回目の繰り返し配列（配列番号４）、並びに配列番号５〜１２で表される自己集合性ペプチドを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、自己集合性を有すペプチドに関する。より具体的には、塩濃度を上げることにより自己集合性を示すペプチド、及びその調製方法に関する。本発明のペプチドは、バイオマテリアル等の素材として使用できる。
【背景技術】
タンパク質・ペプチドの中には、２量体、多量体などの自己集合性（自己会合性ともいう。）を示すものは知られていたものの、以前は、タンパク質・ペプチドの改変が容易でなかったので、材料工学や工学の対象とは考えられていなかった。
ところが、遺伝子組み換え技術の発達とペプチド合成装置の進歩にともない、近年、例えば、ペプチドなどの生体分子の自己集合体の、再生医療やドラッグデリバリーへの応用が検討され、これら分子自己集合性が、ナノテクノロジーの設計、製造に有用であろうと注目を集めている。
ペプチドを用いた自己集合系としては、Ａｇｇｅｌｉ等が、短いペプチドを非水溶性溶媒で、長いポリマー上のナノテープにする報告をしている（非特許文献１：Ａ．Ａｇｇｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８６，ｐｐ．２５９−２６２）。また、親水性領域と疎水性領域と２つのことなる領域を有するポリマー分子は、界面活性剤の様に、水溶液中で、疎水性部分を水相から離れさせるように互いに作用することで、自己集合を起こすことが知られており、種々の単純なペプチドを用いた実験がなされている（非特許文献２：Ｓ．Ｖａｕｔｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９ｐｐ．５３５５−５３６０）。
また、塩濃度依存的自己集合により形成されるペプチド性素材としては、例えば、アルギニンーアラニンーアスパラギン酸のような親水性と疎水性アミノ酸が交互に繰り替えす両親媒性ペプチド（非特許文献３：ＴＣ．Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，ｐｐ．６７２８−６７３３）、及び（非特許文献４：Ｓ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，８６５−８７１）について多くの研究がある。
しかし、現在まで提供されている、自己集合性ペプチドはいずれもが両親媒性に基づくベーターシート構造を利用するペプチドであった。
【非特許文献１】Ａ．Ａｇｇｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８６，ｐｐ．２５９−２６２
【非特許文献２】Ｓ．Ｖａｕｔｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９ ｐｐ．５３５５−５３６０
【非特許文献３】ＴＣ．Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，ｐｐ．６７２８−６７３３
【非特許文献４】Ｓ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，８６５−８７１
【発明の開示】
本発明は、新規な自己集合性ペプチド性素材を提供することを目的とする。特に、本発明は、両親媒性に基づく自己集合をするペプチドとは異なる自己集合性ペプチドを提供することを目的とする。更に、生理的塩濃度を塩濃度閾値とする塩濃度依存的ペプチド性新規自己集合素材を提供することも目的とする。
又、本願発明には、新規な自己集合性ペプチド、及び生理的塩濃度を塩濃度閾値とする塩濃度依存的自己集合性の新規なペプチド性材料を提供することを課題とする。
本発明者らは、新たな自己集合性ペプチドの開発のために、様々な材料を検討した結果、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９号又は（Ｋａｍｉｎｏ，Ｋ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５６，５０３−５０７）参照。Ｍｒｃｐ２０ｋとも呼ぶ。）のアミノ酸配列情報を解析し、該配列情報を利用することにより、全くあたらしいタイプの自己集合性ペプチドを提供できることを見出した。フジツボ第３接着タンパク質（Ｍｒｃｐ−２０ｋ）は、分子量２０ｋＤａ、等電点４の単純蛋白質であり、Ｃｙｓのａｌｉｇｎｍｅｎｔにより６回の繰り返し配列よりなることがわかっている。疎水性アミノ酸をほとんど含まず、電荷アミノ酸に非常に富む蛋白質である。
本発明者らは、フジツボ第３接着タンパク質のアミノ酸配列の各繰り返し配列をＣｙｓを基にアライメントし、目視で、具体的には、Ｃｙｓの並びを見ながら最適化した。それを基に、コンセンサス配列（配列番号１）を作成した。配列番号１で表されるペプチドに加え、配列番号１のＮ末端側に電荷のクラスターＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを付加した配列（配列番号２）で表されるペプチド、５回目の繰り返し配列（配列番号３）で表されるペプチド、及び６回目の繰り返し配列（配列番号４）で表されるペプチドをそれぞれＢｏｃ法により化学合成し、逆相クロマトグラフィーにより精製、凍結乾燥した。
それらを適当な水溶液に溶解後、適宜塩水溶液を添加し、それについて光散乱測定、原子間力顕微鏡観察、円二色性偏光測定、コンゴレッド染色等により確認したところ、自己集合して集合体を形成すること及びその構造を確認し、本発明を完成したものである。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−４１７２１５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、光散乱測定による配列番号１〜４のペプチドの自己集合性を塩濃度を変えて検証した結果を示す。横軸は、ＮａＣｌのモル濃度、縦軸は、光散乱測定法による見かけの分子量（ｋＤａ）を表す。又、図中の１〜４は、それぞれ配列番号１〜４をサンプルとして用いた場合の結果をしめす。
図２は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によるペプチド集合体（自己集合体）イメージ。
図３は、自己集合体構造が裸眼で観察できる膜状体を形成することを示す写真（ペプチド濃度１０ｍｇ／ｍｌ）。
図４ 配列番号３のペプチドを用いた細孔をもつ自己集合体のＡＦＭによる観察（ｐＨ８）
図５ 配列番号３のペプチドを用いた自己集合体のＡＦＭによる観察（ｐＨ６）
図６ 配列番号３のペプチドのＣＤスペクトル測定結果
図７ 配列番号３のＣｙｓをＳｅｒに置き換えたペプチドを用いた自己集合体のＡＦＭによる観察（ｐＨ８）
図８ 配列番号３のＣｙｓをＳｅｒに置き換えたペプチドのＣＤスペクトルの結果
【発明を実施するための最良の形態】
本願発明には、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に今回新たに見出された、繰り返し構造に基づく、新規自己集合ペプチドを含む。具体的には、配列番号３（ＳＫＬＰＣＮＤＥＨＰＣＹＲＫＥＧＧＶＶＳＣＤＣＫ）又は配列番号４（ＫＴＩＴＣＮＥＤＨＰＣＹＨＳＹＥＥＤＧＶＴＫＳＤＣＤＣＥ）のアミノ酸配列で表されるペプチド及び配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に１〜数個、好適には、１〜８個、より好適には、１〜４個、更に好適には、１又は２個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたペプチドであって、水溶液中において自己集合性を有するペプチドが含まれる。
更に、本願発明には、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に今回新たに見出された、繰り返し構造に基づく、コンセンサス配列からなる新規自己集合ペプチドを含む。具体的には、配列番号１で表されるペプチド（ＥＫＩＰＣＮＥＫＨＰＣＹＲＣＤＡＤＴＫＣＳＣＤＣＥ）又は配列番号１のアミノ酸配列に１〜数個、好適には、１〜８個、より好適には、１〜４個、更に好適には、１又は２個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するペプチドであって、水溶液中において自己集合性を有するペプチドが含まれる。
なお、タンパク質の繰り返し構造をマルチプル・アラインメントとみなし、これをもとに、ｈｍｍｂｕｉｌｄおよびｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅプログラムにより、プロファイルＨＭＭを作成し、このプロファイルＨＭＭから、コンセンサス配列をＨＭＭＥＲプログラム・パッケージのｈｍｍｅｍｉｔプログラムにより求めることもできる。
配列番号１のアミノ酸配列に対して欠失、置換、付加の具体例としては、例えば、３番目と４番目のＣｙｓ（アミノ末端から１４番目及び２０番目のアミノ酸）を欠失させた変異が含まれる。また、配列番号１中の（ＤとＥ）、（ＮとＱ）、（ＡとＧとＴとＳ）、及び（ＨとＲとＫ）はそれぞれの（）中では置換させることができることを意味する。又、配列番号１中の疎水性アミノ酸を相互に置換した配列も含みうる。配列番号１中、上記した欠損可能なＣｙｓを除いた４つのＣｙｓは自己集合性の発揮に必要である。二番目のＣｙｓの前はＰｒｏであることが望ましい。２番目Ｃｙｓの次のアミノ酸は（Ｂｕｌｋｙ）アミノ酸（Ｗ，Ｙ，Ｒ，Ｈ）であることが望ましい。２番目Ｃｙｓの次の次（２番目のＣｙｓから下流側２番目のアミノ残基）にある塩基性アミノ酸は配列番号１と同じであることが望ましい。１番目と二番目のＣｙｓの間のアミノ酸の数は４つであることが望ましい。また、後ろ（カルボキシル側の）の２つのＣｙｓの間隔も１アミノ酸であることが望ましい。
又、本願発明は、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に繰り返し構造又はそのコンセンサス配列に基づく自己集合性ペプチドに電荷のクラスターを有する配列を付加することができる。具体的には、ＨＥＥＤ，ＫＨＤ，ＥＥＤＨＫＨＨＤＨ，ＫＫＨ，ＨＲＫ、ＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを挙げることができ、好適には、ＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを用いることができる。更に、具体的には、配列番号１で表されるペプチドのアミノ末端側にＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを結合したポリペプチド（配列番号２：ＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤＥＫＩＰＣＮＥＫＨＰＣＹＲＣＤＡＤＴＫＣＳＣＤＣＥ）が挙げられる。
又、次に掲げるペプチドも自己集合性を有しうるペプチドであり、本願発明に包含される。
更に、本願発明には、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に繰り返し構造又はそのコンセンサス配列に基づく自己集合性ペプチド配列、並びにシロスジフジツボの接着タンパク質（特願２００３−３２５６０４）の繰り返し構造に基づく自己集合性ペプチドに細胞接着、金属結合又は抗菌性配列等のモチーフ配列を結合して調製される機能性を付した自己集合性ポリペプチドも含まれる。例えば、上記配列番号１〜１２のいずれかで表されるペプチドのＮあるいはＣ末端に細胞接着モチーフであるＲＧＤ（アルギニンーグリシンーアスパラギン酸）を結合させることができる。
本願発明には、上記した配列番号１〜１２いずれか記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つ以上の変異を有する改変ポリペプチドで表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドも包含される。
又、本願発明には、上記した配列番号１〜１２いずれかで表されるペプチドをコードする遺伝子、及び配列番号１〜１２いずれかで表されるアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドをコードする遺伝子が包含され、例えば、配列番号１３又は１４で表される配列の遺伝子が含まれ、具体的には、特開平０９−２９９０８９に記載の配列番号１の配列中塩基番号４３３〜５０１の配列及び同配列番号１の塩基番号５０２〜５８２の配列で表される遺伝子も包含する。
更に、本願発明には、上記した遺伝子を組み換えた組み換えベクター及び当該組み換えベクターを用いた、本願発明の自己集合性ペプチドを発現する方法が包含される。
本発明のペプチドは一般的な化学合成の他に、対応するＤＮＡを化学合成後、一般的な微生物や培養細胞により組み換え体を調製することによっても入手することができる。
化学合成法としては、ｔ−Ｂｏｃ法とＦｍｏｃ法を用いることができ、ペプチド合成機を利用して合成することもできる。また、遺伝子組み換え法による生産としては、例えば、配列番号１３又は１４に示される遺伝子を公知の発現ベクターを、例えば、大腸菌を宿主とする場合はｐＥＴ若しくはｐＧＥＭＥＸ、又は哺乳動物細胞を宿主とする場合はｐＣＩにそれぞれ組み換えて、発現させる方法を用いることができる。
本発明で明らかにされたペプチドは、従来知られている自己集合性ペプチドとは全く異なるアミノ酸配列を持ち、さらに異なる原理で形成されるペプチド性自己集合性素材に関するものである。
さらに、これまでのペプチド性素材はいずれもが低塩濃度でも自己集合性が引き起こされるものであったが、本発明者らが見出したペプチドは特定の塩濃度までは自己集合性が抑制されており、特定の塩濃度閾値を超えることで急激に自己集合性が発揮されてペプチド集合体を形成させるペプチドに関するものである。好適には、０．５Ｍ以上の塩濃度で自己集合化させることができ、１Ｍを越えても自己集合化させることができる。塩の自己集合化効果は、１価の塩の方が、２価の塩よりも高い。用いる塩としては、通常の適宜な塩を用いることができるが、例えば、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣａＣｌ２，ＭｇＣｌ２を用いることができる。
これらの条件下で、上記した配列番号１〜１２で表されるペプチド、例えば、配列番号１〜４で表されるペプチドは、ランダムに凝集するのではなく、塩効果で規則的に自己集合する。更に、上記した配列番号１〜１２のアミノ酸配列に１〜数個、好適には、１〜８個、より好適には、１〜４個、更に好適には、１又は２個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するペプチドであって、水溶液中において自己集合性を有するペプチドを塩に曝すことにより、ペプチドの自己集合体（ペプチド集合体）を形成することができる。
又、用いることができるペプチド濃度として、例えば、１０μＭ〜１０ｍｇ／ｍｌを挙げることができる。ペプチド濃度によっては、膜状体を形成させることも可能である。又、条件を選択することにより、ナノファイバー又はハイドロゲルとすることも可能である。また、ペプチド配列として、配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列に１又は数個のＣｙｓ以外のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドをアルカリ条件下、より好適にはｐＨ８で塩と反応させることにより、規則的な細孔を有するペプチドの自己集合体を形成することができる。用いる塩としては、通常の適宜な塩を用いることができるが、例えば、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣａＣｌ２，ＭｇＣｌ２を用いることができる。
本発明のポリペプチドの自己集合化は、本発明のポリペプチドを、上記の範囲の塩濃度の水溶液に適宜の手段で接触させることにより行うことができる。接触手段としては、例えば、特定の形状の容器中の高塩濃度の水溶液に本発明のペプチドを滴下する方法、高塩濃度の水溶液にペプチド水溶液を吐出する方法、特定の形状の容器中のペプチド水溶液に塩を溶解する方法、等を用いることができる。
これにより、例えば微生物等による組み換え発現時にも、閾値以下の塩濃度の培地中に産生させ、そこに塩をさらに加えるだけですみやかに固相化させることができる。これは例えば、微生物リアクターの作製時の微生物固相化においては立ち上げプロセスを大幅に簡略化させることができる等のメリットを含む。また組み換え発現において、目的タンパク質にこれら配列をタグとして付加することで、発現時は溶解しているが塩濃度を閾値にあげることで容易に目的タンパク質だけを回収するための要素技術として、また同配列を事前に担体等に固相化しておくことで同タグを持つ組み換え体を担体に保持する技術等にも応用可能である。
化学合成された該ペプチド及び、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成後、微生物又はや培養細胞で組み換え発現させることにより得られる該ペプチドは、組織工学用バイオマテリアルやドラッグデリバリーシステム、化粧品の基材、微生物や酵素等の固定化材等の原料として広い用途で利用されることが期待される。また、その構築原理はこれまで知られているものとは異なり、新たな原理に基づくものであり、ナノテクノロジーにおけるボトムアップ技術にも応用可能である。
【実施例１】
Ｍｒｃｐ−２０ｋ繰り返し配列の単純化
Ｍｒｃｐ−２０ｋタンパク質の繰り返し構造をマルチプル・アラインメントとみなし、これをもとに、ｈｍｍｂｕｉｌｄおよびｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅプログラムにより、プロファイルＨＭＭを作成した。このプロファイルＨＭＭから、コンセンサス配列をＨＭＭＥＲプログラム・パッケージのｈｍｍｅｍｉｔプログラムにより求め、コンセンサス配列を得た。コンセンサス配列は、配列番号１に示す。
【実施例２】
各ペプチドの合成
ＡＢＩ４３０Ａ型全自動固相合成機を用い、Ｂｏｃ法にて配列番号１，配列番号２，配列番号３，及び配列番号４のアミノ酸配列で表される４種類のペプチドを合成した。それぞれ、Ｂｏｃ−アミノ酸各４当量ずつ使用して縮合し、保護ペプチド樹脂を得た。得られた保護ペプチド樹脂を、無水フッ化水素／ｐ−クレゾール（８：２）で−２〜−５℃下６０分間処理し、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用い、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、目的ペプチドを得た。
【実施例３】
光散乱測定による自己集合性の確認
光散乱はＰＲＯＴＥＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ社製のＤｙｎａ Ｐｒｏを用いて測定した。配列番号１〜４で表される各ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるように超純水装置（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ＳＰ．ＴＯＣ．（ミリポア社製））で調製した超純水に溶解し、ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎとした。各ペプチドのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎに対してＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４あるいはＣａＣｌ２を各終濃度となるように添加し、フィルター（０．２μｍ）ろ過後測定を行った。その結果、０．５Ｍ以下の塩濃度では分子量は検出限界以下であったが、海水に近い０．５Ｍ以上の高塩濃度の条件下において急激な分子量の上昇が見られた。ＮａＣｌを塩として用いた場合の結果を図１に示す。なお図中では、配列番号１、２、３、又は４のペプチドは、それぞれ１、２、３、又は４で示されている。
これらの実験の結果から、当該ペプチドがいずれも塩濃度０．５Ｍを閾値にした塩濃度依存的な自己集合活性を有することが明らかとなった。
【実施例４】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によるペプチド自己集合体構造の確認
ＡＦＭはオリンパス社製のＮＶＢ １００を用いた。実施例２で調製した各ペプチドのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＭ）に対して、ＮａＣｌを終濃度１Ｍになるように添加し、撹拌後１０分間静置し、それを純水に対して透析した。回収後Ｍｉｃａ上に一部を滴下し、乾燥により水滴を除去、それを気中モードで測定した。測定はＴａｐｐｉｎｇ ｍｏｄｅで行い、各サンプルにつき５μｍ×５μｍの範囲で２回ずつスキャンした。
その結果、いずれのペプチドにおいても一定の幅を持った塊が進展したかのようなイメージが得られた。配列番号４の場合の結果を図２に示す。
また、ペプチド濃度を濃度１０ｍｇ／ｍｌに調製することで、目視で直に確認できる膜状体の形成も認められた。結果を図３に示す。
【実施例５】
細孔をもつペプチド集合体（自己集合体）の調製
配列番号３で表されるペプチドを、ペプチド濃度が１００μＭとなるように１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液＝（ｐＨ８）に溶解し、ポリプロピレンチューブ中で室温で一晩静置した。そのペプチド溶液に１／４量の５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えて緩やかに混合し、室温で１０分間処理した。これを２００倍量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に対して２回透析することにより、過剰なＮａＣｌを取り除いた。この手法により、細孔をもつ構造体を作成することに成功した。実施例４と同様の操作でＡＦＭによりその構造体を解析した結果を図４に示す。この構造体はペプチドを純水に溶解して塩を添加した場合には見られない細孔をもつ構造をとっていた。その孔のサイズは５０〜５００ｎｍであり、非常に規則正しい構造をとっているものである。
なお、配列番号３で表されるペプチドを、ペプチド濃度が１００μＭとなるように１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液＝（ｐＨ６）に溶解し、ポリプロピレンチューブ中で室温で一晩静置した。そのペプチド溶液に１／４量の５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えて緩やかに混合し、室温で１０分間処理した。これを２００倍量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に対して２回透析することにより、過剰なＮａＣｌを取り除いた。ＡＦＭによりその構造体を解析した結果を図５に示す。規則的な細孔は観察できない。
配列番号３のペプチドの純水およびｐＨ２〜１０のリン酸ナトリウム緩衝液中の二次構造のＣＤスペクトルを測定した。超純水装置（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ＳＰ．ＴＯＣ．（ミリポア社製））で調製した超純水に溶解した各ペプチドのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＭ）を様々なｐＨの緩衝液（ｐＨ２−３およびｐＨ６−８では１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４−５では１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９−１０では１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液）で１０倍に希釈し、室温で１２時間反応させた後に、日本分光社製のＪ７２５型円二色性分散計を用いてＣＤスペクトルを測定した。結果を図６に示す。ｐＨ８−１０（アルカリ）とｐＨ２−６（酸性）では二次構造が異なることがわかる。
次に、配列番号３の配列において全てのＣｙｓをＳｅｒに置き換えたペプチドでＡＦＭ及びＣＤスペクトルを測定した。上述の配列番号３と同じ条件で、ＡＦＭにより構造体を解析した結果は図７に示す。又ＣＤスペクトルはｐＨ２〜１０において、上記した配列番号３のｐＨ２〜６の結果と同じような結果になった。結果を図８に示す。
以上より、Ｃｙｓを含む配列で表されるペプチドを用いてアルカリ条件下で塩と反応させることにより、規則的な細孔を生成するものと考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明は、ペプチド、特に、塩濃度閾値依存的に自己集合性であるペプチド及び新規な自己集合体を提供する。
ここで「自己集合性」は、微少サイズ（ナノスケール）の構造体を構築する際のキーテクノロジーのひとつである。細胞外で機能するタンパク質複合体には自己集合性が備わっていることが多く、それらの構築原理はナノテクロジーに新たな原理を導入するために有用である。
本発明の自己集合性ペプチドはペプチド性素材として、そのままで、あるいはさらに細胞接着や金属結合、抗菌性配列等のモチーフ配列を導入することで組織工学用バイオマテリアルやドラッグデリバリーシステム、化粧品の基材、微生物や酵素等の固定化材等の原料、組み換えタンパク質技術の精製用や固相化用タグとして広い用途で利用されることが期待される。
また、その構築原理はこれまで知られているものとは異なり、新たな原理に基づくものであり、ナノテクノロジーにおけるボトムアップ技術にも応用可能である。
さらにその自己集合体自体を、外科治療や再生医療のキー素材であるバイオマテリアルそのものとして応用できる可能性や、化粧品基剤としての応用の可能性をもつ。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１は、配列番号３〜８の配列のコンセンサス配列である。
配列番号２は、配列番号１に電荷クラスターを有する配列が付加された配列である。
配列番号３−８は、それぞれ、アカフジツボ接着タンパク質の繰り返し構造中の、５、６、１、２、３、及び４回目の繰り返し構造に基づく自己集合性ペプチドである。
配列番号９−１２は、それぞれ、シロスジフジツボの接着タンパク質の繰り返し構造中、第１、２、３、及び４回目の繰り返し構造に基づく自己集合性ペプチドである。
配列番号１３又は１４は、それぞれ、配列番号３又は４をコードする遺伝子の例である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【技術分野】
本発明は、自己集合性を有すペプチドに関する。より具体的には、塩濃度を上げることにより自己集合性を示すペプチド、及びその調製方法に関する。本発明のペプチドは、バイオマテリアル等の素材として使用できる。
【背景技術】
タンパク質・ペプチドの中には、２量体、多量体などの自己集合性（自己会合性ともいう。）を示すものは知られていたものの、以前は、タンパク質・ペプチドの改変が容易でなかったので、材料工学や工学の対象とは考えられていなかった。
ところが、遺伝子組み換え技術の発達とペプチド合成装置の進歩にともない、近年、例えば、ペプチドなどの生体分子の自己集合体の、再生医療やドラッグデリバリーへの応用が検討され、これら分子自己集合性が、ナノテクノロジーの設計、製造に有用であろうと注目を集めている。
ペプチドを用いた自己集合系としては、Ａｇｇｅｌｉ等が、短いペプチドを非水溶性溶媒で、長いポリマー上のナノテープにする報告をしている（非特許文献１：Ａ．Ａｇｇｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８６，ｐｐ．２５９−２６２）。また、親水性領域と疎水性領域と２つのことなる領域を有するポリマー分子は、界面活性剤の様に、水溶液中で、疎水性部分を水相から離れさせるように互いに作用することで、自己集合を起こすことが知られており、種々の単純なペプチドを用いた実験がなされている（非特許文献２：Ｓ．Ｖａｕｔｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９ｐｐ．５３５５−５３６０）。
また、塩濃度依存的自己集合により形成されるペプチド性素材としては、例えば、アルギニンーアラニンーアスパラギン酸のような親水性と疎水性アミノ酸が交互に繰り替えす両親媒性ペプチド（非特許文献３：ＴＣ．Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，ｐｐ．６７２８−６７３３）、及び（非特許文献４：Ｓ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，８６５−８７１）について多くの研究がある。
しかし、現在まで提供されている、自己集合性ペプチドはいずれもが両親媒性に基づくベーターシート構造を利用するペプチドであった。
【非特許文献１】Ａ．Ａｇｇｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８６，ｐｐ．２５９−２６２
【非特許文献２】Ｓ．Ｖａｕｔｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９ ｐｐ．５３５５−５３６０
【非特許文献３】ＴＣ．Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，ｐｐ．６７２８−６７３３
【非特許文献４】Ｓ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，８６５−８７１
【発明の開示】
本発明は、新規な自己集合性ペプチド性素材を提供することを目的とする。特に、本発明は、両親媒性に基づく自己集合をするペプチドとは異なる自己集合性ペプチドを提供することを目的とする。更に、生理的塩濃度を塩濃度閾値とする塩濃度依存的ペプチド性新規自己集合素材を提供することも目的とする。
又、本願発明には、新規な自己集合性ペプチド、及び生理的塩濃度を塩濃度閾値とする塩濃度依存的自己集合性の新規なペプチド性材料を提供することを課題とする。
本発明者らは、新たな自己集合性ペプチドの開発のために、様々な材料を検討した結果、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９号又は（Ｋａｍｉｎｏ，Ｋ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５６，５０３−５０７）参照。Ｍｒｃｐ２０ｋとも呼ぶ。）のアミノ酸配列情報を解析し、該配列情報を利用することにより、全くあたらしいタイプの自己集合性ペプチドを提供できることを見出した。フジツボ第３接着タンパク質（Ｍｒｃｐ−２０ｋ）は、分子量２０ｋＤａ、等電点４の単純蛋白質であり、Ｃｙｓのａｌｉｇｎｍｅｎｔにより６回の繰り返し配列よりなることがわかっている。疎水性アミノ酸をほとんど含まず、電荷アミノ酸に非常に富む蛋白質である。
本発明者らは、フジツボ第３接着タンパク質のアミノ酸配列の各繰り返し配列をＣｙｓを基にアライメントし、目視で、具体的には、Ｃｙｓの並びを見ながら最適化した。それを基に、コンセンサス配列（配列番号１）を作成した。配列番号１で表されるペプチドに加え、配列番号１のＮ末端側に電荷のクラスターＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを付加した配列（配列番号２）で表されるペプチド、５回目の繰り返し配列（配列番号３）で表されるペプチド、及び６回目の繰り返し配列（配列番号４）で表されるペプチドをそれぞれＢｏｃ法により化学合成し、逆相クロマトグラフィーにより精製、凍結乾燥した。
それらを適当な水溶液に溶解後、適宜塩水溶液を添加し、それについて光散乱測定、原子間力顕微鏡観察、円二色性偏光測定、コンゴレッド染色等により確認したところ、自己集合して集合体を形成すること及びその構造を確認し、本発明を完成したものである。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−４１７２１５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、光散乱測定による配列番号１〜４のペプチドの自己集合性を塩濃度を変えて検証した結果を示す。横軸は、ＮａＣｌのモル濃度、縦軸は、光散乱測定法による見かけの分子量（ｋＤａ）を表す。又、図中の１〜４は、それぞれ配列番号１〜４をサンプルとして用いた場合の結果をしめす。
図２は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によるペプチド集合体（自己集合体）イメージ。
図３は、自己集合体構造が裸眼で観察できる膜状体を形成することを示す写真（ペプチド濃度１０ｍｇ／ｍｌ）。
図４ 配列番号３のペプチドを用いた細孔をもつ自己集合体のＡＦＭによる観察（ｐＨ８）
図５ 配列番号３のペプチドを用いた自己集合体のＡＦＭによる観察（ｐＨ６）
図６ 配列番号３のペプチドのＣＤスペクトル測定結果
図７ 配列番号３のＣｙｓをＳｅｒに置き換えたペプチドを用いた自己集合体のＡＦＭによる観察（ｐＨ８）
図８ 配列番号３のＣｙｓをＳｅｒに置き換えたペプチドのＣＤスペクトルの結果
【発明を実施するための最良の形態】
本願発明には、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に今回新たに見出された、繰り返し構造に基づく、新規自己集合ペプチドを含む。具体的には、配列番号３（ＳＫＬＰＣＮＤＥＨＰＣＹＲＫＥＧＧＶＶＳＣＤＣＫ）又は配列番号４（ＫＴＩＴＣＮＥＤＨＰＣＹＨＳＹＥＥＤＧＶＴＫＳＤＣＤＣＥ）のアミノ酸配列で表されるペプチド及び配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に１〜数個、好適には、１〜８個、より好適には、１〜４個、更に好適には、１又は２個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたペプチドであって、水溶液中において自己集合性を有するペプチドが含まれる。
更に、本願発明には、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に今回新たに見出された、繰り返し構造に基づく、コンセンサス配列からなる新規自己集合ペプチドを含む。具体的には、配列番号１で表されるペプチド（ＥＫＩＰＣＮＥＫＨＰＣＹＲＣＤＡＤＴＫＣＳＣＤＣＥ）又は配列番号１のアミノ酸配列に１〜数個、好適には、１〜８個、より好適には、１〜４個、更に好適には、１又は２個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するペプチドであって、水溶液中において自己集合性を有するペプチドが含まれる。
なお、タンパク質の繰り返し構造をマルチプル・アラインメントとみなし、これをもとに、ｈｍｍｂｕｉｌｄおよびｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅプログラムにより、プロファイルＨＭＭを作成し、このプロファイルＨＭＭから、コンセンサス配列をＨＭＭＥＲプログラム・パッケージのｈｍｍｅｍｉｔプログラムにより求めることもできる。
配列番号１のアミノ酸配列に対して欠失、置換、付加の具体例としては、例えば、３番目と４番目のＣｙｓ（アミノ末端から１４番目及び２０番目のアミノ酸）を欠失させた変異が含まれる。また、配列番号１中の（ＤとＥ）、（ＮとＱ）、（ＡとＧとＴとＳ）、及び（ＨとＲとＫ）はそれぞれの（）中では置換させることができることを意味する。又、配列番号１中の疎水性アミノ酸を相互に置換した配列も含みうる。配列番号１中、上記した欠損可能なＣｙｓを除いた４つのＣｙｓは自己集合性の発揮に必要である。二番目のＣｙｓの前はＰｒｏであることが望ましい。２番目Ｃｙｓの次のアミノ酸は（Ｂｕｌｋｙ）アミノ酸（Ｗ，Ｙ，Ｒ，Ｈ）であることが望ましい。２番目Ｃｙｓの次の次（２番目のＣｙｓから下流側２番目のアミノ残基）にある塩基性アミノ酸は配列番号１と同じであることが望ましい。１番目と二番目のＣｙｓの間のアミノ酸の数は４つであることが望ましい。また、後ろ（カルボキシル側の）の２つのＣｙｓの間隔も１アミノ酸であることが望ましい。
又、本願発明は、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に繰り返し構造又はそのコンセンサス配列に基づく自己集合性ペプチドに電荷のクラスターを有する配列を付加することができる。具体的には、ＨＥＥＤ，ＫＨＤ，ＥＥＤＨＫＨＨＤＨ，ＫＫＨ，ＨＲＫ、ＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを挙げることができ、好適には、ＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを用いることができる。更に、具体的には、配列番号１で表されるペプチドのアミノ末端側にＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤを結合したポリペプチド（配列番号２：ＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤＥＫＩＰＣＮＥＫＨＰＣＹＲＣＤＡＤＴＫＣＳＣＤＣＥ）が挙げられる。
又、次に掲げるペプチドも自己集合性を有しうるペプチドであり、本願発明に包含される。
更に、本願発明には、フジツボ第３接着タンパク質（特開平０９−２９９０８９）に繰り返し構造又はそのコンセンサス配列に基づく自己集合性ペプチド配列、並びにシロスジフジツボの接着タンパク質（特願２００３−３２５６０４）の繰り返し構造に基づく自己集合性ペプチドに細胞接着、金属結合又は抗菌性配列等のモチーフ配列を結合して調製される機能性を付した自己集合性ポリペプチドも含まれる。例えば、上記配列番号１〜１２のいずれかで表されるペプチドのＮあるいはＣ末端に細胞接着モチーフであるＲＧＤ（アルギニンーグリシンーアスパラギン酸）を結合させることができる。
本願発明には、上記した配列番号１〜１２いずれか記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つ以上の変異を有する改変ポリペプチドで表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドも包含される。
又、本願発明には、上記した配列番号１〜１２いずれかで表されるペプチドをコードする遺伝子、及び配列番号１〜１２いずれかで表されるアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドをコードする遺伝子が包含され、例えば、配列番号１３又は１４で表される配列の遺伝子が含まれ、具体的には、特開平０９−２９９０８９に記載の配列番号１の配列中塩基番号４３３〜５０１の配列及び同配列番号１の塩基番号５０２〜５８２の配列で表される遺伝子も包含する。
更に、本願発明には、上記した遺伝子を組み換えた組み換えベクター及び当該組み換えベクターを用いた、本願発明の自己集合性ペプチドを発現する方法が包含される。
本発明のペプチドは一般的な化学合成の他に、対応するＤＮＡを化学合成後、一般的な微生物や培養細胞により組み換え体を調製することによっても入手することができる。
化学合成法としては、ｔ−Ｂｏｃ法とＦｍｏｃ法を用いることができ、ペプチド合成機を利用して合成することもできる。また、遺伝子組み換え法による生産としては、例えば、配列番号１３又は１４に示される遺伝子を公知の発現ベクターを、例えば、大腸菌を宿主とする場合はｐＥＴ若しくはｐＧＥＭＥＸ、又は哺乳動物細胞を宿主とする場合はｐＣＩにそれぞれ組み換えて、発現させる方法を用いることができる。
本発明で明らかにされたペプチドは、従来知られている自己集合性ペプチドとは全く異なるアミノ酸配列を持ち、さらに異なる原理で形成されるペプチド性自己集合性素材に関するものである。
さらに、これまでのペプチド性素材はいずれもが低塩濃度でも自己集合性が引き起こされるものであったが、本発明者らが見出したペプチドは特定の塩濃度までは自己集合性が抑制されており、特定の塩濃度閾値を超えることで急激に自己集合性が発揮されてペプチド集合体を形成させるペプチドに関するものである。好適には、０．５Ｍ以上の塩濃度で自己集合化させることができ、１Ｍを越えても自己集合化させることができる。塩の自己集合化効果は、１価の塩の方が、２価の塩よりも高い。用いる塩としては、通常の適宜な塩を用いることができるが、例えば、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣａＣｌ２，ＭｇＣｌ２を用いることができる。
これらの条件下で、上記した配列番号１〜１２で表されるペプチド、例えば、配列番号１〜４で表されるペプチドは、ランダムに凝集するのではなく、塩効果で規則的に自己集合する。更に、上記した配列番号１〜１２のアミノ酸配列に１〜数個、好適には、１〜８個、より好適には、１〜４個、更に好適には、１又は２個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するペプチドであって、水溶液中において自己集合性を有するペプチドを塩に曝すことにより、ペプチドの自己集合体（ペプチド集合体）を形成することができる。
又、用いることができるペプチド濃度として、例えば、１０μＭ〜１０ｍｇ／ｍｌを挙げることができる。ペプチド濃度によっては、膜状体を形成させることも可能である。又、条件を選択することにより、ナノファイバー又はハイドロゲルとすることも可能である。また、ペプチド配列として、配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列に１又は数個のＣｙｓ以外のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドをアルカリ条件下、より好適にはｐＨ８で塩と反応させることにより、規則的な細孔を有するペプチドの自己集合体を形成することができる。用いる塩としては、通常の適宜な塩を用いることができるが、例えば、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣａＣｌ２，ＭｇＣｌ２を用いることができる。
本発明のポリペプチドの自己集合化は、本発明のポリペプチドを、上記の範囲の塩濃度の水溶液に適宜の手段で接触させることにより行うことができる。接触手段としては、例えば、特定の形状の容器中の高塩濃度の水溶液に本発明のペプチドを滴下する方法、高塩濃度の水溶液にペプチド水溶液を吐出する方法、特定の形状の容器中のペプチド水溶液に塩を溶解する方法、等を用いることができる。
これにより、例えば微生物等による組み換え発現時にも、閾値以下の塩濃度の培地中に産生させ、そこに塩をさらに加えるだけですみやかに固相化させることができる。これは例えば、微生物リアクターの作製時の微生物固相化においては立ち上げプロセスを大幅に簡略化させることができる等のメリットを含む。また組み換え発現において、目的タンパク質にこれら配列をタグとして付加することで、発現時は溶解しているが塩濃度を閾値にあげることで容易に目的タンパク質だけを回収するための要素技術として、また同配列を事前に担体等に固相化しておくことで同タグを持つ組み換え体を担体に保持する技術等にも応用可能である。
化学合成された該ペプチド及び、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成後、微生物又はや培養細胞で組み換え発現させることにより得られる該ペプチドは、組織工学用バイオマテリアルやドラッグデリバリーシステム、化粧品の基材、微生物や酵素等の固定化材等の原料として広い用途で利用されることが期待される。また、その構築原理はこれまで知られているものとは異なり、新たな原理に基づくものであり、ナノテクノロジーにおけるボトムアップ技術にも応用可能である。
【実施例１】
Ｍｒｃｐ−２０ｋ繰り返し配列の単純化
Ｍｒｃｐ−２０ｋタンパク質の繰り返し構造をマルチプル・アラインメントとみなし、これをもとに、ｈｍｍｂｕｉｌｄおよびｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅプログラムにより、プロファイルＨＭＭを作成した。このプロファイルＨＭＭから、コンセンサス配列をＨＭＭＥＲプログラム・パッケージのｈｍｍｅｍｉｔプログラムにより求め、コンセンサス配列を得た。コンセンサス配列は、配列番号１に示す。
【実施例２】
各ペプチドの合成
ＡＢＩ４３０Ａ型全自動固相合成機を用い、Ｂｏｃ法にて配列番号１，配列番号２，配列番号３，及び配列番号４のアミノ酸配列で表される４種類のペプチドを合成した。それぞれ、Ｂｏｃ−アミノ酸各４当量ずつ使用して縮合し、保護ペプチド樹脂を得た。得られた保護ペプチド樹脂を、無水フッ化水素／ｐ−クレゾール（８：２）で−２〜−５℃下６０分間処理し、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用い、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、目的ペプチドを得た。
【実施例３】
光散乱測定による自己集合性の確認
光散乱はＰＲＯＴＥＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ社製のＤｙｎａ Ｐｒｏを用いて測定した。配列番号１〜４で表される各ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるように超純水装置（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ＳＰ．ＴＯＣ．（ミリポア社製））で調製した超純水に溶解し、ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎとした。各ペプチドのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎに対してＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４あるいはＣａＣｌ２を各終濃度となるように添加し、フィルター（０．２μｍ）ろ過後測定を行った。その結果、０．５Ｍ以下の塩濃度では分子量は検出限界以下であったが、海水に近い０．５Ｍ以上の高塩濃度の条件下において急激な分子量の上昇が見られた。ＮａＣｌを塩として用いた場合の結果を図１に示す。なお図中では、配列番号１、２、３、又は４のペプチドは、それぞれ１、２、３、又は４で示されている。
これらの実験の結果から、当該ペプチドがいずれも塩濃度０．５Ｍを閾値にした塩濃度依存的な自己集合活性を有することが明らかとなった。
【実施例４】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によるペプチド自己集合体構造の確認
ＡＦＭはオリンパス社製のＮＶＢ １００を用いた。実施例２で調製した各ペプチドのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＭ）に対して、ＮａＣｌを終濃度１Ｍになるように添加し、撹拌後１０分間静置し、それを純水に対して透析した。回収後Ｍｉｃａ上に一部を滴下し、乾燥により水滴を除去、それを気中モードで測定した。測定はＴａｐｐｉｎｇ ｍｏｄｅで行い、各サンプルにつき５μｍ×５μｍの範囲で２回ずつスキャンした。
その結果、いずれのペプチドにおいても一定の幅を持った塊が進展したかのようなイメージが得られた。配列番号４の場合の結果を図２に示す。
また、ペプチド濃度を濃度１０ｍｇ／ｍｌに調製することで、目視で直に確認できる膜状体の形成も認められた。結果を図３に示す。
【実施例５】
細孔をもつペプチド集合体（自己集合体）の調製
配列番号３で表されるペプチドを、ペプチド濃度が１００μＭとなるように１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液＝（ｐＨ８）に溶解し、ポリプロピレンチューブ中で室温で一晩静置した。そのペプチド溶液に１／４量の５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えて緩やかに混合し、室温で１０分間処理した。これを２００倍量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に対して２回透析することにより、過剰なＮａＣｌを取り除いた。この手法により、細孔をもつ構造体を作成することに成功した。実施例４と同様の操作でＡＦＭによりその構造体を解析した結果を図４に示す。この構造体はペプチドを純水に溶解して塩を添加した場合には見られない細孔をもつ構造をとっていた。その孔のサイズは５０〜５００ｎｍであり、非常に規則正しい構造をとっているものである。
なお、配列番号３で表されるペプチドを、ペプチド濃度が１００μＭとなるように１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液＝（ｐＨ６）に溶解し、ポリプロピレンチューブ中で室温で一晩静置した。そのペプチド溶液に１／４量の５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えて緩やかに混合し、室温で１０分間処理した。これを２００倍量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に対して２回透析することにより、過剰なＮａＣｌを取り除いた。ＡＦＭによりその構造体を解析した結果を図５に示す。規則的な細孔は観察できない。
配列番号３のペプチドの純水およびｐＨ２〜１０のリン酸ナトリウム緩衝液中の二次構造のＣＤスペクトルを測定した。超純水装置（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ＳＰ．ＴＯＣ．（ミリポア社製））で調製した超純水に溶解した各ペプチドのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＭ）を様々なｐＨの緩衝液（ｐＨ２−３およびｐＨ６−８では１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４−５では１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９−１０では１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液）で１０倍に希釈し、室温で１２時間反応させた後に、日本分光社製のＪ７２５型円二色性分散計を用いてＣＤスペクトルを測定した。結果を図６に示す。ｐＨ８−１０（アルカリ）とｐＨ２−６（酸性）では二次構造が異なることがわかる。
次に、配列番号３の配列において全てのＣｙｓをＳｅｒに置き換えたペプチドでＡＦＭ及びＣＤスペクトルを測定した。上述の配列番号３と同じ条件で、ＡＦＭにより構造体を解析した結果は図７に示す。又ＣＤスペクトルはｐＨ２〜１０において、上記した配列番号３のｐＨ２〜６の結果と同じような結果になった。結果を図８に示す。
以上より、Ｃｙｓを含む配列で表されるペプチドを用いてアルカリ条件下で塩と反応させることにより、規則的な細孔を生成するものと考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明は、ペプチド、特に、塩濃度閾値依存的に自己集合性であるペプチド及び新規な自己集合体を提供する。
ここで「自己集合性」は、微少サイズ（ナノスケール）の構造体を構築する際のキーテクノロジーのひとつである。細胞外で機能するタンパク質複合体には自己集合性が備わっていることが多く、それらの構築原理はナノテクロジーに新たな原理を導入するために有用である。
本発明の自己集合性ペプチドはペプチド性素材として、そのままで、あるいはさらに細胞接着や金属結合、抗菌性配列等のモチーフ配列を導入することで組織工学用バイオマテリアルやドラッグデリバリーシステム、化粧品の基材、微生物や酵素等の固定化材等の原料、組み換えタンパク質技術の精製用や固相化用タグとして広い用途で利用されることが期待される。
また、その構築原理はこれまで知られているものとは異なり、新たな原理に基づくものであり、ナノテクノロジーにおけるボトムアップ技術にも応用可能である。
さらにその自己集合体自体を、外科治療や再生医療のキー素材であるバイオマテリアルそのものとして応用できる可能性や、化粧品基剤としての応用の可能性をもつ。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１は、配列番号３〜８の配列のコンセンサス配列である。
配列番号２は、配列番号１に電荷クラスターを有する配列が付加された配列である。
配列番号３−８は、それぞれ、アカフジツボ接着タンパク質の繰り返し構造中の、５、６、１、２、３、及び４回目の繰り返し構造に基づく自己集合性ペプチドである。
配列番号９−１２は、それぞれ、シロスジフジツボの接着タンパク質の繰り返し構造中、第１、２、３、及び４回目の繰り返し構造に基づく自己集合性ペプチドである。
配列番号１３又は１４は、それぞれ、配列番号３又は４をコードする遺伝子の例である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項２】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項３】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項４】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項５】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号５〜１１いずれかのアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号５〜１１のいずれか１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項６】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド
【請求項７】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項８】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項９】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項１０】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号５〜１１いずれかのアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号５〜１１のいずれか１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項１１】
請求項６〜１０いずれか１項記載の遺伝子を組み込んだ発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを用いる請求項１〜５いずれか１項記載のペプチド製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜５いずれか１項記載のペプチドを溶解した水溶液に、塩含有水溶液に添加することにより、ペプチドを自己集合させる方法。
【請求項１４】
塩濃度が０．５Ｍ以上である請求項１３項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜５いずれか１項記載のペプチドを高塩濃度下に曝すことにより自己集合化されたペプチド集合体。
【請求項１６】
膜状、ナノファイバー又はハイドロゲルである請求項１５記載のペプチド集合体。
【請求項１７】
（１）配列番号１〜１２いずれかのペプチド又は（２）配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列に１又は数個のＣｙｓ以外のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドを、アルカリ条件下で塩と反応させることにより、規則的な細孔を有するペプチド集合体を形成する方法。
【請求項１８】
（１）配列番号１〜１２いずれかのペプチド又は（２）配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列に１又は数個のＣｙｓ以外のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドを、アルカリ条件下で塩と反応させることにより形成された、規則的な細孔を有するペプチド集合体。
【請求項１９】
ナノファイバー又はナノメッシュである請求項１８記載のペプチド集合体。
【請求項１】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項２】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項３】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項４】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項５】
（ａ）又は（ｂ）のペプチド
（ａ）配列番号５〜１１いずれかのアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号５〜１１のいずれか１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項６】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド
【請求項７】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項８】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項９】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項１０】
（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする遺伝子
（ａ）配列番号５〜１１いずれかのアミノ酸配列で表されるペプチド
（ｂ）配列番号５〜１１のいずれか１のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項１１】
請求項６〜１０いずれか１項記載の遺伝子を組み込んだ発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを用いる請求項１〜５いずれか１項記載のペプチド製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜５いずれか１項記載のペプチドを溶解した水溶液に、塩含有水溶液に添加することにより、ペプチドを自己集合させる方法。
【請求項１４】
塩濃度が０．５Ｍ以上である請求項１３項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜５いずれか１項記載のペプチドを高塩濃度下に曝すことにより自己集合化されたペプチド集合体。
【請求項１６】
膜状、ナノファイバー又はハイドロゲルである請求項１５記載のペプチド集合体。
【請求項１７】
（１）配列番号１〜１２いずれかのペプチド又は（２）配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列に１又は数個のＣｙｓ以外のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドを、アルカリ条件下で塩と反応させることにより、規則的な細孔を有するペプチド集合体を形成する方法。
【請求項１８】
（１）配列番号１〜１２いずれかのペプチド又は（２）配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列に１又は数個のＣｙｓ以外のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって、塩濃度依存性自己集合性を示すペプチドを、アルカリ条件下で塩と反応させることにより形成された、規則的な細孔を有するペプチド集合体。
【請求項１９】
ナノファイバー又はナノメッシュである請求項１８記載のペプチド集合体。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６５８９
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６２６１（Ｐ２００５−５１６２６１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９１４０
【国際出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）、自己集合性タンパク質に基づくバイオマテリアル創成基盤整備事業、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５００３８６５６３）株式会社ファルマデザイン (9)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９１４０
【国際出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）、自己集合性タンパク質に基づくバイオマテリアル創成基盤整備事業、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５００３８６５６３）株式会社ファルマデザイン (9)
【Ｆターム（参考）】
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