特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法
【課題】図書館、文化財保管場、その他乾燥した各種工業製品や食品の保管庫など乾燥した環境下でよく繁殖する特定カビを短期間かつ高精度で検出できるマイクロアレイの提供。
【解決手段】特定の塩基配列を有するプローブ、及び、特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化した特定カビ検出用マイクロアレイ。
【解決手段】特定の塩基配列を有するプローブ、及び、特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化した特定カビ検出用マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中の真菌を分子生物学的手法によって検出するためのカビ検出技術に関し、特に図書館や文化財保管場などにおける乾燥状態で多く発生する特定カビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
図書館や文化財保管場などは、図書や文化財が損傷しないように、空気環境が管理され、高湿度を好む一般的なカビは比較的生えにくい環境となっている。
しかしながら、カビには、６０〜７０％ＲＨやそれ以下の低湿度下で多く発生する好乾性カビも存在する。このようなカビとしては、例えばユーロチウム属(Eurotium spp.)における各種カビ、及びアスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)のカビ（以下、これらを特定カビ、対象カビ又は検出対象カビと称する場合がある）を挙げることができる。
【０００３】
これらのカビは、図書館や文化財保管場のような乾燥した環境下においても繁殖するカビであり、その繁殖によって図書や文化財に害を与える危険性をもっている。
したがって、その繁殖を防止するために、これらのカビを定期的に測定検出することは、図書及び文化財保護のために重要である。
【０００４】
一方、これらのカビのような空中浮遊真菌類（糸状菌、酵母等）を採取するためには、通常１週間から１０日以上を要する上、その同定を行うためには、さらに多くの日数を要するという問題があった。また、同定には熟練した専門家が必要であり、一般の人が手軽に行い得るものではなかった。
すなわち、従来、一般的には、カビを培養してコロニーを形成させ、肉眼及び顕微鏡による観察を行うことで同定を行っていたため、カビの採取を開始してからその同定を完了するまでには、およそ３〜４週間という長期間を要するという問題があった。また、担当者の技量によって、カビの検出精度が異なってしまうという問題もあった。
【０００５】
これに対し、カビの同定を分子生物学的手法により行うことも提案されている。
例えば、特許文献１には、所定のプライマーを用いてカビのＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物の電気泳動を行うことで、対象となるカビの存否を検出する方法が記載されている。
また、特許文献２及び３には、所定のプライマーを用いてカビやダニのＤＮＡを増幅するとともに、カビやダニを検出するための所定のプローブを用い、増幅したＤＮＡ断片を、プローブにハイブリダイズさせることにより検出する方法が記載されている。
これらの検出方法によれば、カビの培養を行う必要がないため、カビの検出に要する時間を大きく低減することが可能である。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献２】特開２００７−２０２４６２号公報
【特許文献３】特開２００８−３５７７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの方法を用いても、上述したユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビは、検出精度が低く、夾雑物が存在する場合には、ほとんど検出できないという問題があった。
その主たる原因は、これらのカビのＤＮＡがＧＣリッチな配列を有する（二本鎖ＤＮＡにおいて、３つの水素結合により対合するＧとＣの対の割合が相対的に多く存在する）点にあると考えられる。すなわち、このＧＣリッチな配列により、ＰＣＲ（polymerase chain reaction ポリメラーゼ連鎖反応）においてＤＮＡが乖離しにくく、また乖離しても二次構造を形成しやすく、十分に増幅できないためであると推定される。
その結果、これらのカビのＤＮＡの増幅産物は得られにくく、検出精度が低かったと考えられる。さらに、夾雑物が存在する場合には、このような低い検出精度が一層低下するため、現実の環境下でこれらのカビを特定して検出することはできず、実用的なレベルでの検出を行うことは非常に困難であった。
【０００８】
また、特許文献１のカビ検出方法では、カビの１８ＳｒＤＮＡ領域を増幅しているが、これらは真菌類において共通性に富む遺伝子領域であるため、多種多様な真菌類の同領域が増幅されてしまう。このため、得られたＤＮＡ断片の存否を、電気泳動により検出しても、真菌類の存否を検出できるのみであり、種は勿論のこと、属や科を特定することはできなかった。
【０００９】
また、特許文献２及び３には、検出対象のカビとしてアスペルギルス属のカビが記載されているが、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビについては記載されておらず、当該種類のカビを特定して検出することはできない。また、ユーロチウム属のカビとしてユーロチウム ヘルバリオルム種（Eurotium herbariorum）が記載されているが、ユーロチウム属レベルの検出については、記載されていない。
すなわち、特許文献２及び３に記載の発明によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ、及びユーロチウム属のカビを特定して、その存否を的確に検出することはできなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、ユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを好適に特定し得る新規プローブを開発することに成功し、本発明を完成させた。また、これらのカビの検出精度を向上させることができる新規プライマー対を開発することにも成功した。さらに、ＰＣＲ反応液中に所定の割合のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えることで、検出精度を顕著に向上させることに成功した。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、好乾性カビであるユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを検出するための新規プローブを固定化した特定カビ検出用のマイクロアレイを提供することを目的とする。また、これらのカビの検出精度を向上させ得る新規プライマー対及び／又はジメチルスルホキシドを含有するＰＣＲ反応液を用いて得られた増幅産物を新規プローブにハイブリダイズさせることで、これらの特定カビを夾雑物の存在下でも検出可能とする特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出システムの使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の特定カビ検出用マイクロアレイは、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化した構成としてある。
【００１３】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号３に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号２に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、ユーロチウム属のカビを検出する構成とすることも好ましい。
【００１４】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号７に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号６に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号８に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビを検出する構成とすることも好ましい。
【００１５】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号５に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビを検出する構成とすることも好ましい。
【００１６】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸が増幅され、試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する構成とすることも好ましい。
【００１７】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、上記ＰＣＲ反応液が、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有する構成とすることも好ましい。
【００１８】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法は、ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビ、又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイに、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化し、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸を増幅し、試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する方法としてある。
【００１９】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法において、上記ＰＣＲ反応液に、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有させることも好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、マイクロアレイを用いた特定カビの検出において、ユーロチウム属のカビ、及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出感度を大きく向上させることができ、夾雑菌の存在下、対象カビ濃度が低濃度であってもこれらをそれぞれ選択的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施形態における新規プライマー対のカビ遺伝子における位置を示す図である。
【図２】実施例１−６、参考例１の試験結果を示す図である。
【図３】実施例、参考例で使用したゲノムの種類と菌株を示す図である。
【図４】実施例７−１３の試験結果を示す図である。
【図５】実施例１４−１８、参考例２，３の試験結果を示す図である。
【図６】本発明の実施形態におけるプライマーの影響について示す図である。
【図７】本発明の実施形態におけるＤＭＳＯ濃度の影響について示す図である。
【図８】本発明の実施形態におけるＤＭＳＯ濃度とプライマーの影響について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
［マイクロアレイ］
本実施形態のマイクロアレイは、本実施形態の検出対象である特定カビを検出するための所定のプローブの少なくともいずれか１つを、基板上に固定化したものであれば特に限定されるものではなく、例えばスポット型ＤＮＡマイクロアレイ、合成型ＤＮＡチップなどを用いることができる。
【００２３】
本実施形態の対象カビを検出するためのプローブは、配列番号１〜９によりそれぞれ特定される塩基配列からなるＤＮＡ断片である。このうち、配列番号１、配列番号２、配列番号３により特定されるものが、ユーロチウム属のカビを検出するためのプローブであり、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９により特定されるものが、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを検出するためのプローブである。
【００２４】
これらの検出対象カビは、６０〜７０％ＲＨ、あるいはそれ以下の低湿度下で多く発生する、好乾性カビである。このような好乾性カビは、低湿度に保たれている図書館や文化財保管場などでも生育し、図書や文化財を損傷し得るものである。
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、上記プローブにより、これらの特定カビをそれぞれ選択的に高感度で検出することができる。
【００２５】
なお、より詳細に系統まで考慮すれば、配列番号４、配列番号５、配列番号９は、アスペルギルス ビトリコラ（Aspergillus vitricola）の系統を検出するためのプローブであり、配列番号６、配列番号７、配列番号８は、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides）の系統を検出するためのプローブである。分類学は発展途上にあり、現在の通説では、これらはいずれもアスペルギルス ペニシリオイデス種として取り扱われている。
【００２６】
これらの対象カビを検出するためのプローブは、いずれもそれぞれのカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を探索して得られた塩基配列にもとづき作成されたものである。
【００２７】
ここで、配列番号３のプローブによれば、実施例において後述するように、ユーロチウム属における、環境下で一般によく検出される頻出種である主要６種の菌株のＤＮＡを検出することが可能である。このため、配列番号３のプローブを使用することで、実用上は、ユーロチウム属に存在するほとんどのカビを特定的に検出することが可能になっている。本実施形態では、この配列番号３のプローブと共に、配列番号１及び配列番号２のプローブを補助的に使用することで、検出の確実性を向上させている。また、配列番号３のプローブと共に、配列番号１及び配列番号２のプローブのうちいずれか一方を補助的に使用してもよい。
【００２８】
配列番号１は、ユーロチウム属におけるヘルバリオルム種（Eurotium herbariorum）のカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域から、配列番号２は、ユーロチウム属におけるトノフィラム種（Eurotium tonophilum）のカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域から、それぞれ選択されたものである。
例えば、配列番号３のプローブが何らかの理由によりマイクロアレイに適切に固定化されなかった場合など、当該プローブでは検出できない場合に、配列番号１又は２のプローブによる検出が行われていれば、新たなマイクロアレイを使用して再確認を行うことができ、検出の確実性を向上させることが可能となる。
【００２９】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビに特異的な配列であり、これらの配列からなるプローブは、上述したように、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを選択的に検出することが可能である。
【００３０】
ここで、後述する実施例によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種におけるアスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビについては、配列番号７のプローブの蛍光強度が最も大きくなっている。このため、配列番号７のプローブを主たるプローブとして用いると共に、配列番号６のプローブ、及び／又は、配列番号８のプローブを補助的なプローブとして使用することも好ましい。これにより、アスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビの検出の確実性を向上させることが可能となる。
また、同様に、アスペルギルス ペニシリオイデス種におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビについては、配列番号５のプローブの蛍光強度が最も大きくなっている。このため、配列番号５のプローブを主たるプローブとして用いると共に、配列番号４のプローブ、及び／又は、配列番号９のプローブを補助的なプローブとして使用することも好ましい。これにより、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビの検出の確実性を向上させることが可能となる。
【００３１】
さらに、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに、配列番号１〜９の全てのプローブを固定化することで、ユーロチウム属及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを同時に、かつそれぞれを特定して検出することが可能となる。
【００３２】
［プローブの合成］
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化される上記プローブは、いずれも２０ｍｅｒ（塩基）程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成できる。
後述する実施例で用いた本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化した配列番号１〜９の配列からなる各プローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用している。
なお、後述する実施例で用いた配列番号１０及び１１の配列からなるプライマー対も同様に２０ｍｅｒ（塩基）程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用している。
【００３３】
また、本実施形態における配列番号１〜９の配列からなる各プローブとしては、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブを用いることができ、また配列番号１〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１〜９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００３４】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００３５】
なお、配列番号１０及び１１の配列からなるプライマー対についても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対を用いることができる。また、配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対を用いることもできる。
【００３６】
［マイクロアレイの作成］
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、配列番号１〜９の配列をそれぞれ備えたプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡマイクロアレイを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをスライドガラス上に固定化することによって、作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することによってプローブを生成し、本実施形態のマイクロアレイを作成することができる。
【００３７】
［特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法］
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、図書館や文化財保管場等の室内空気から採取された試料に、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在するか否かを検出するために使用する。
このため、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、以下の工程により、例えば室内空気から採取された試料のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、得られた増幅産物を当該マイクロアレイに固定化したプローブにハイブリダイズさせることで使用する。
【００３８】
まず、後述する専用のＰＣＲ反応液を用いて、核酸増幅装置により試料に含まれる特定のＤＮＡ領域を増幅する。
そして、得られた増幅産物を本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ上のプローブにハイブリダイズさせ、標識検出装置により増幅産物の標識を検出することで、試料に特定カビのＤＮＡが含まれているか否かを検出する。
【００３９】
次に、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法について、カビの採取工程から詳細に説明する。
（１）カビの採取
まず、エアーサンプラーを用いて、図書館や文化財保管場の室内空気を採取する。採取した空気を専用培地に吹き付けて培養する。培地としては、好乾性カビの生育に適したＭ４０Ｙ培地やジクロラン-グリセロール（ＤＧ−１８）寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
【００４０】
次に、１ストリップ中のコロニーを一括して採取し、事前にφ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたねじ口バイアル瓶に入れる。ねじ口バイアル瓶ごと液体窒素に浸して試料を凍結し、振盪装置により試料を破砕する。
【００４１】
（２）ＤＮＡの抽出
試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【００４２】
（３）ＰＣＲ法による特定カビのｒＤＮＡにおけるＩＴＳ１領域の増幅
本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）と、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，終濃度で０．５〜７容量％（以下、単に％と称する場合がある））、試料のゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ抽出液）、及び上述したその他の所定の試薬を混合して、本実施形態のＰＣＲ反応液を作成する。
なお、ＤＭＳＯは、融点が１８℃付近の単体の有機化合物であり、室温では通常液体状態となっている。
【００４３】
本実施形態で使用するＰＣＲ反応液は、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）に規定の処方に従って作成することができる。
なお、本実施形態で使用するＰＣＲ反応液にはＤＭＳＯが含まれるが、酵素は高濃度のＤＭＳＯによって容易に破壊され得る。このため、ＤＮＡ合成酵素はＰＣＲ反応液に最後に混合し、混合後は、核酸増幅装置により直ちに増幅反応を開始させることが好ましい。
【００４４】
本実施形態において特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）を使用する場合、核酸増幅装置のＰＣＲ反応条件は、高い増幅効果を得るために、次のようなものにすることが好ましい。
（ａ）ＤＮＡ鎖の乖離（ＤＮＡ変性）工程 ９３〜９７℃ ２０〜４０秒
（ｂ）プライマーの対合（アニーリング）工程 ５０〜６０℃ １０〜５０秒
（ｃ）ＤＮＡ合成工程 ７０〜７４℃ ５０〜７０秒
【００４５】
具体的には、ＰＣＲ反応条件を、例えば次のようなものにすることが好ましい。
（i）９５℃ １０分、（ii）９５℃ ３０秒、（iii）５６℃ ３０秒、（iv）７２℃ ６０秒（（ii）〜（iv）を４０サイクル）、（v）７２℃ １０分、（vi）４℃ ∞（保持）
【００４６】
（４）マイクロアレイによるハイブリダイズ及び蛍光検出
次に、ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ上に滴下して、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブにハイブリダイスしたＰＣＲ増幅産物の標識を検出する。
【００４７】
具体的には、例えば次のように行うことができる。
まず、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合し、９４℃で５分間加温することで、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に乖離させる。これを氷上にて急冷し、マイクロアレイに滴下する。
次に、マイクロアレイを４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイスしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流す。
そして、マイクロアレイを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、試料中に特定カビが存在するか否かを検出する。
【００４８】
［ＰＣＲ反応液］
本実施形態で使用するＰＣＲ反応液は、例えば以下のような組成とすることが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP；４００μＭ、dATP、dTTP、dGTP；５００μＭ each） ５容量％）、フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ５容量％）、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ５容量％）、核酸合成酵素（ＮｏｖａＴａｑ １容量％）、標識成分（１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ １容量％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ ２容量％）、試料のゲノム（所定量、例えば０．１ｎｇ〜３００ｎｇ）、緩衝液（６０容量％）、及び残りの容量％の成分として水を含むものとすることが好ましい。なお、緩衝液は、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社 島津製作所）のＰＣＲ処方における緩衝液として、Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−１、Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−２、及びＡｍｐｄｉｒｅｃｔをそれぞれ２０容量％ずつ含有させることができる。
【００４９】
このＰＣＲ反応液において、特定カビのＤＮＡ増幅用のプライマー対のフォワードプライマー（正プライマー）としては、配列番号１０の配列からなるものを使用し、リバースプライマー（逆プライマー）としては、配列番号１１の配列からなるものを使用する。
図１に示すように、フォワードプライマーは、真菌類のｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）における１８Ｓから選択された配列からなる新規プライマーである。また、リバースプライマーは、同５．８Ｓから選択された配列からなる新規プライマーである。
なお、塩基配列には方向性があり、配列番号に示される塩基配列は、５’末端から３’末端方向の配列を示している。
【００５０】
これらの新規プライマー対を用いた場合、検出対象の特定カビであるユーロチウム属のカビ、又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのゲノムＤＮＡを増幅すると、同図に示すように、主としてＩＴＳ１領域の塩基配列からなるおよそ２５０〜３３０ｂｐ（base pair 塩基対）の短鎖の増幅産物が得られる。
これらの新規プライマー対を用いて、例えばユーロチウム属のカビ（JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のＤＮＡを増幅した場合、２５８ｂｐの増幅産物が得られる。また、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini）のＤＮＡを増幅した場合、３０９ｂｐの増幅産物が得られる。
【００５１】
一方、フォワードプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーを用い、かつリバースプライマーとして、例えば２８Ｓにおける塩基配列からなる既存の各種プライマーを用いてこれらのカビのＤＮＡを増幅する場合、後述する比較例２（配列番号１０及び配列番号１２のプライマー対を使用）に示されるように、ユーロチウム属のカビでは約５８０ｂｐ、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビでは約６５０ｂｐの長鎖の増幅産物が得られる。
このように、本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用のプライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）を用いることにより、従来のおよそ１／２あるいはそれ以下の長さのＤＮＡ断片を得ることができる。本発明の発明者らは、このような短いＤＮＡ断片を使用することで、マイクロアレイに固定されたプローブとのハイブリダイズ効率を向上させることに成功している。
【００５２】
ここで、増幅産物の塩基長が２５０ｂｐ未満の場合、ユーロチウム属及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のゲノムＤＮＡ中において、その短鎖の増幅産物を得るためのプライマー対と類似した配列が存在する可能性が高くなり、ＩＴＳ１領域以外の部分が多数増幅される。その結果、対象カビが存在していても、蛍光強度が低下し、検出精度が低下する場合がある。また、このような部分の領域内に、本実施形態の新規プローブとハイブリダイズする配列が含まれていると、誤反応を引き起こし、対象カビを特定的に検出することが困難となる。一方、増幅産物の塩基長が３３０ｂｐを上回る場合は、これ以下の場合と比較してハイブリダイズの効率が低くなり、検出感度が低下する場合がある。
【００５３】
また、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、ＰＣＲ反応において、鋳型となるゲノムＤＮＡとプライマーとの非特異的な結合を抑制し、特異的な結合を促進する。また、１０容量％濃度で約５℃程度、溶解温度（Ｔｍ，二本鎖ＤＮＡ〈ｄｓＤＮＡ〉の半分が一本鎖分子に乖離するのに必要な温度）を低下させることにより、ＤＮＡの変性（ｄｓＤＮＡの鎖状分子二本が、乖離して一本鎖のｓｓＤＮＡになること）を促進する。さらに、ＧＣ繰り返し配列などによる二次構造を抑制して直鎖状にする。すなわち、一本鎖ＤＮＡが捩れや折れ曲がりなど立体的な構造をとることを防止する。
【００５４】
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによる検出対象の特定カビのＤＮＡは、ＧＣリッチな塩基配列を有しているが、このようなＤＭＳＯの作用によって、ＧＣ配列が分離しやすくなり、また分離後の二次構造化を抑制することができ、増幅効率が顕著に向上したと推測される。特に実施例で示されるように、特定カビのＤＮＡを本実施形態における新規プライマーを用いて増幅することにより、ＰＣＲ反応液に単にＤＭＳＯを添加した場合に比較してより一層高い増幅効率を得ることができるようになっている。
その結果、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用することで、従来の手法では実用的なレベルでの検出が困難であった、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出精度を、大きく向上させることが可能となっている。
【００５５】
なお、ＤＭＳＯは、上記のような効果がある一方、過剰に添加した場合には酵素活性を低下させる性質も有している。このため、本実施形態のＰＣＲ反応液を作成するにあたっては、成分の混合順序として、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を最後に添加することが好ましい。また、多数の試料に対する検出を行う場合は、作業性を考慮して、酵素を最後から２番目に添加し、最後に試料のゲノムＤＮＡを添加することが好ましい。さらに、酵素としては、ホットスタート機能を付加したもの（所定の高温（９５℃などのＤＮＡ変性工程の温度）に曝されて初めて、ＤＮＡ合成活性を発揮するように、修飾された酵素）を用いることが好ましい。いずれの場合にも、酵素を入れる前にＤＭＳＯを添加して、よく混合した上で、その濃度を終濃度で０．５〜７容量％になるようにしておくことが好ましい。また、終濃度で０．５〜５容量％になるようにすることがより好ましく、終濃度で５容量％になるようにすることがさらに好ましい。
【００５６】
ＰＣＲ反応液におけるＤＭＳＯの終濃度が０．５容量％未満の場合は、ＤＭＳＯの効果が小さく、特に夾雑ゲノムが混在する場合における、対象種であるユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが増幅されにくくなるため、検出感度が低下する場合がある。一方、ＤＭＳＯの終濃度が７容量％より大きい場合は、ＤＮＡ合成酵素の活性が阻害されやすく、失活する場合もある。このため、対象種のみならず夾雑種も含めてＤＮＡ増幅が行われにくくなり、検出感度が低下するか、又は検出不能となるおそれがある。
【００５７】
ＰＣＲ反応液におけるその他の成分、すなわち核酸合成基質、核酸合成酵素、標識成分、及び緩衝液等については、一般に使用されている試薬を適宜使用することができる。
【００５８】
［核酸増幅装置］
核酸増幅装置は、本実施形態における専用のＰＣＲ反応液を使用して、試料における特定カビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅するＰＣＲ装置である。一般的なサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ 温度制御装置）に、上記専用のＰＣＲ反応液を入れて構成することができる。
本実施形態のＰＣＲ反応液に含まれる特定カビのＤＮＡを増幅可能な新規プライマー対は、試料中にユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在する場合には、そのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅することができる。
【００５９】
一方、従来のＰＣＲ反応液では、本実施形態の検出対象の特定カビのＤＮＡを単独ではある程度までは増幅するものの、非対象の夾雑菌が並存していると、実用化可能なレベルで十分に増幅することはできなかった。
すなわち、従来のＰＣＲ反応液を用いた場合、試料中にユーロチウム属のカビ及び／又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在していても、そのゲノムＤＮＡの特性上、これを検出しうるまで効率的に増幅することは困難であった。また、試料中に、従来のプライマー対により増幅される夾雑菌が含まれている場合には、その夾雑菌のＤＮＡが競合して増幅され、対象カビを十分に増幅して検出することが困難であった。
これに対して、本実施形態における上記専用のＰＣＲ反応液を用いれば、核酸増幅装置により、本実施形態の検出対象の特定カビのＤＮＡをより効率的に増幅することができ、試料中にその他の夾雑菌が含まれている場合でも、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いて、特定カビを検出することが可能となっている。
【００６０】
具体的には、従来のＰＣＲ反応液では、検出対象カビが、混在ゲノムＤＮＡ中に少なくともEurotium spp.では１／６、A.penicillioidesでは１／３より多くなければ検出できなかった。また、ＰＣＲ反応液１０μｌ中に検出対象カビが０．２ｎｇ存在している場合、単独なら検出できたが、夾雑物（混在ゲノムＤＮＡ）が０．２ｎｇ存在すればもはや検出することが困難であった。このため、従来のＰＣＲ反応液は、様々なカビが存在し得る環境下で、特定カビを検出するために実用化できるものではなかった。
これに対し、本実施形態のＰＣＲ反応液では、以下の実施例で示されるように、夾雑物が６ｎｇ存在する場合でも、検出対象カビが０．１ｎｇ（１００ｐｇ）存在すれば検出することが可能である。
【００６１】
なお、図１に示すように、本実施形態の増幅産物には、５．８Ｓ領域の配列も部分的に含まれるが、上述したように５．８Ｓ領域は真菌類に共通する配列を備えており、種を特定可能な配列はＩＴＳ１領域にあることから、本実施形態のＰＣＲ反応液を用いて増幅される領域をＩＴＳ１領域と称している。
【００６２】
［標識検出装置］
標識検出装置は、マイクロアレイ上でプローブにハイブリダイスした増幅産物（ＤＮＡ断片）に結合している標識を検出する。この標識検出装置としては、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。
本実施形態では、ＰＣＲ反応液に含まれるＣｙ５−ｄＣＴＰによって標識された増幅産物の蛍光強度を、標識検出装置により検出している。
なお、本実施形態の特定カビ検出システムにおいて使用する標識成分は、Ｃｙ５−ｄＣＴＰに限定されるものではなく、放射性同位元素やジゴキシゲニンなどその他の標識成分を用いて標識することも可能である。
【００６３】
以上説明したように、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによれば、ユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出精度を顕著に向上させることができ、誤検出等を大きく低減することが可能となる。
すなわち、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブのうち、配列番号１〜３からなるプローブは、ユーロチウム属のカビの検出に適した配列からなるものであり、配列番号４〜９からなるプローブは、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出に適した配列からなるものである。これらのプローブを用いることにより、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを実用レベルで特異的に検出することが可能となっている。
【００６４】
また、本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対を用いることで、従来の半分以下の短い増幅産物を得ることができ、プローブとのハイブリダイズをより効率的に行うことが可能となっている。
さらに、本実施形態で用いられるＰＣＲ反応液にはＤＭＳＯが所定の濃度で含有されており、これによって、ユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡの変性が促進されるとともに、二次構造の形成が抑制されてＰＣＲ反応の誤作動を低減させることができ、検出対象カビのＤＮＡの増幅反応を促進させることが可能となっている。
【００６５】
また、このような短鎖の増幅産物を得ることができる新規プライマー対と、ＰＣＲ反応液におけるＤＭＳＯの相乗効果により、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビをより効率的に増殖でき、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイにより、これらのカビを優れた精度で検出することができるようになっている。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイによるユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビについての検出精度を確認するために行った実施例及び参考例について説明する。これらの実施例及び参考例では、いずれも配列番号１〜９のプローブを全て固定化した上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用した。
【００６７】
（実施例１）
試験番号（１）：対象ゲノム（ユーロチウム属のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
上記実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用の新規プライマー対（配列番号１０及び１１により特定される塩基配列からなるプライマー対）を含有し、ＤＭＳＯを２容量％含有するＰＣＲ反応液を用いて、検出対象カビであるユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応液に夾雑物は含まれていない。そして、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用して、増幅産物をハイブリダイズさせ、蛍光検出を行った。
【００６８】
具体的には、ＰＣＲ反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを１０μｌ作成した。
１．５×Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−１ ２．０μｌ
２．５×Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−２ ２．０μｌ
３．５×Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ ２．０μｌ
４．核酸合成基質 ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ ０．５μｌ
（dCTP；４００μＭ、dATP、dTTP、dGTP；５００μＭ each）
５．フォワードプライマー（配列番号１０：オペロンテクノロジー株式会社により合成） ０．５μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
６．リバースプライマー（配列番号１１：同上） ０．５μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
７．核酸合成酵素 ＮｏｖａＴａｑ ０．１μｌ
８．標識成分 １ｍＭ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ ０．１μｌ
９．対象カビ及び夾雑物のゲノム ユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手） ０．１ｎｇ（１００ｐｇ）
１０．水（全体が１０．０μｌになるまで加水）
【００６９】
このＰＣＲ反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
１．９５℃ １０分
２．９５℃ ３０秒
３．５６℃ ３０秒
４．７２℃ ６０秒（２〜４を４０サイクル）
５．７２℃ １０分
６．４℃保持 ∞
【００７０】
マイクロアレイには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を使用し、これに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９によりそれぞれ特定される塩基配列からなるプローブと、これらに相補的なプローブとを固定化した。
【００７１】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣ〈クエン酸−生理食塩水、株式会社ニッポンジーン社製〉に０．３％ＳＤＳ〈ドデシル硫酸ナトリウム、株式会社ニッポンジーン社製〉を添加）を混合して９４℃で５分間加温し、氷上にて急冷してマイクロアレイに滴下した。
【００７２】
このマイクロアレイを４５℃で１時間静置した。次に、上記緩衝液を用いてハイブリダイスしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
【００７３】
そして、マイクロアレイを標識検出装置（GenePix4100A Molecular Devices社製）にかけて蛍光強度を測定した。蛍光強度は、レーザー光で励起して標識成分（Cy5）を発光させ、それを検出器内に取り付けた光電子倍増管（ＰＭＴ）の受光面にて光量を電気信号に置換し、それを数値化することで測定した。この蛍光強度は、当該装置での強度指標であり、単位はなく、バックグラウンドの数値が０になるように補正して算出される。また、このようなマイクロアレイによる検出を、同じプローブを固定化した別個の４つのマイクロアレイでも同様に、同一の増幅産物を用いて行った。そして、各蛍光強度を測定し、５回の平均をとることで、プローブ毎の蛍光強度を算出した。その結果を図２に示す。
【００７４】
同図において、「試験番号」は、試験ごとに付された連番である。「実施例等」は、実施例、参考例の番号をそれぞれ「実」「参」の後に示す。「ゲノム」は、ＰＣＲ反応液に含まれるゲノムＤＮＡの種類と量を示し、「ユーロ混入（ｎｇ）」にはユーロチウム属のカビの種類と量が、「アスペル混入」にはアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの種類と量が、「夾雑物混入」には夾雑物のカビの種類と量が、それぞれ表示されている。「↑」は上欄と同条件であることを示している。また、蛍光強度３０以上を太枠で示している。図４以降の試験結果についても同様である。また、実施例及び参考例で用いたカビの種類について、図３に示す。
【００７５】
（実施例２）
試験番号（２）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１，アスペルギルス ペニシリオイデス，JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini）のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７６】
（実施例３）
試験番号（３）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ２，アスペルギルス ビトリコラ，NBRC8155 Aspergillus penicillioides（Synonym Aspergillus vitricola Otsuki））のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７７】
（参考例１）
試験番号（４）：対象ゲノムなし、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液に、対象ゲノム及び夾雑物を混入させることなく、その他の条件は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７８】
（実施例４）
試験番号（５）：対象ゲノム（ユーロチウム属のカビと夾雑物のみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビ（Ａ１）のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いるとともに、夾雑物（Ｃ，NBRC4026 Alternaria alternata（Fries）Keissler，NBRC6348 Cladosporium cladosporioides（Fresenius）de Vries，（独）製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門より入手，各３ｎｇ、合計６ｎｇ）をＰＣＲ反応液に添加した点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７９】
（実施例５）
試験番号（６）：対象ゲノムではないアスペルギルス ペニシリオイデスの近縁種のＤＮＡ（ＡＶ，ＡＲ）を含む、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムと共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種の近縁種のカビとして、アスペルギルス レストリクタス（ＡＲ，JCM1727 Aspergillus restrictus G.Smith，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手）、及びアスペルギルス ヴェルシカラー（ＡＶ，JCM10258 Aspergillus versicolor（Vuillemin）Tiraboschi，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手）のゲノムＤＮＡをそれぞれ０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００８０】
（実施例６）
試験番号（７）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビと夾雑物のみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムを含有させることなく、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００８１】
（実施例７）
試験番号（８）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種２のカビ（Ａ２，NBRC8157 Eurotium tonophilum Otsuki）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いると共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８２】
（実施例８）
試験番号（９）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ３）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種３のカビ（Ａ３，JCM1568 Eurotium chevalieri L.Mangin）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８３】
（実施例９）
試験番号（１０）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ４）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種４のカビ（Ａ４，JCM1565 Eurotium amstelodami Mangin）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８４】
（実施例１０）
試験番号（１１）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ５）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種５のカビ（Ａ５，JCM1580 Eurotium repens de Bary）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８５】
（実施例１１）
試験番号（１２）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ６）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種６のカビ（Ａ６，JCM22942 Eurotium rubrum Konig et al.）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８６】
（実施例１２）
試験番号（１３）：対象ゲノム（アスペルギルス ビトリコラ Ｂ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１ ０．１ｎｇ）と共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのうち、Ｂ１と同種かつ別個の系統のアスペルギルス ビトリコラ（Ｂ２，NBRC8155 Aspergillus penicillioides（Synonym Aspergillus vitricola Otsuki））のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８７】
（実施例１３）
試験番号（１４）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス２種 Ｂ１，Ｂ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１ ０．１ｎｇ）と共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのうち、Ｂ１とＢ２の両方のＤＮＡをそれぞれ０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８８】
（実施例１４）
試験番号（１５）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度０％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１ ０．１ｎｇ）と、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１ ０．１ｎｇ）を用い、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを添加することなく、その他の点は実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００８９】
（実施例１５）
試験番号（１６）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度０．５％
ＤＭＳＯを０．５容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９０】
（実施例１６）
試験番号（１７）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＤＭＳＯを２容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９１】
（実施例１７）
試験番号（１８）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度５％
ＤＭＳＯを５容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９２】
（実施例１８）
試験番号（１９）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度７％
ＤＭＳＯを７容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９３】
（参考例２）
試験番号（２０）：対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、ＤＭＳＯ濃度０％
配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９４】
ここで、配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を用いて、ユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のＤＮＡを増幅すると、５７６ｂｐの増幅産物が得られる。この増幅産物のＤＮＡ配列の長さは、実施例１における同種のＤＮＡの増幅産物２５８ｂｐの２倍以上に相当する。また、同様に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１，JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini）のＤＮＡを増幅すると、６４３ｂｐの増幅産物が得られる。この増幅産物のＤＮＡ配列の長さも、実施例２における同種のＤＮＡの増幅産物３０９ｂｐの２倍以上に相当する。以下、このような従来のリバースプライマーを含むプライマー対を用いて得られた長い増幅産物を長鎖と称し、上記実施形態の新規プライマーによる短い増幅産物を短鎖と称する場合がある。
【００９５】
（参考例３）
試験番号（２１）：対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例１６と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９６】
次に、上記の試験結果にもとづいて、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法の効果について説明する。
上記各実施例及び参考例において、試験結果における蛍光強度（光量）が、５０以上の場合は、標識検出装置（GenePix4100A）から出力される画像データにおいて、肉眼で識別可能なレベルの強度であり、対象ゲノムを検出している可能性が高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、３０〜５０未満の場合は、肉眼ではほとんど識別できないが、明らかに反応が見られ、対象ゲノムを検出している可能性が比較的高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、１０〜３０未満の場合は、明らかに反応が見られるが、対象ゲノム以外の類似するゲノムを検出している可能性も高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、１０未満の場合は、試験番号８に示されるように、ノイズの検出と考えられる。以上のことから、以下の説明では、蛍光強度３０以上を有効な検出として説明している。
【００９７】
＜１．特定カビの検出＞
まず、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法による対象カビの特定的検出について、図２及び図４を参照して説明する。
参考例１に示されるように、ＰＣＲ反応液に検出対象カビが含まれていない場合、有効な光量は検出されていない。
これに対し、実施例１〜３に示されるように、ＰＣＲ反応液に検出対象カビが含まれている場合は、それぞれのカビに対応するプローブの多くに有効な光量が検出されている。また、実施例４〜６に示されるように、夾雑物存在下においても、検出することができている。
【００９８】
また、ユーロチウム属のカビについては、実施例４，実施例７〜１１に示されるように、夾雑物存在下、主要な６種全てについて検出することが可能になっている。特に、Ａ２〜Ａ６のユーロチウム属のカビについては、配列番号１，２で表される配列からなるプローブ、又はこれらと相補的な配列からなるプローブにも有効な光量、あるいは有効ではないものの比較的高い光量が検出されている。よって、これらを配列番号３で表される配列からなるプローブ及びこれと相補的な配列からなるプローブと共に補助的に使用することで、検出の確実性をより向上させることが可能である。
また、これらＡ１〜Ａ６のカビは、ユーロチウム属のカビのうちの多くを占める頻出種であり、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビをほぼ属レベルで特定的に検出することができる。
【００９９】
次に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビについては、実施例６，１２，１３に示されるように、アスペルギルス ペニシリオイデス、及びアスペルギルス ビトリコラのいずれの系統でも、多くのプローブで有効な検出が得られている。
また、実施例５のＰＣＲ反応液には、アスペルギルス属でペニシリオイデス種ではない近縁の種のカビである、アスペルギルス レストリクタス（ＡＲ）、及びアスペルギルス ヴェルシカラー（ＡＶ）のゲノムＤＮＡが含まれているが、これらについては、有効な検出は得られず、偽陽性反応は見られなかった。
したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを選択的に特定できることがわかる。
【０１００】
また、実施例７〜１３の結果から明らかなように、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが混在し、かつ夾雑物が存在する環境下においても、これらを同時に、かつそれぞれを特定して検出することが可能になっている。
このように、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを、それぞれ選択的に検出することが可能である。
【０１０１】
＜２．プライマーの影響＞
次に、上記実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用の新規プライマー対（配列番号１０及び１１に示す塩基配列からなるプライマー対）が、対象カビの検出精度に与える影響について、図６を参照して説明する。なお、図６において、注目すべき部分を太枠で示している。図７及び図８においても同様である。
同図に示す実施例１６と参考例３とは、ＰＣＲ反応液に含まれるプライマー対のみが相違し、その他については同一条件で試験を行ったものである。すなわち、実施例１６では上記実施形態における新規プライマー対を使用し、参考例３では従来のリバースプライマーを含むプライマー対を使用している。
これらの試験による蛍光強度のうち、良く反応しているプローブについて比較すると、実施例１６の蛍光強度は、参考例３の蛍光強度のおよそ約２．５〜１７倍となっている。
【０１０２】
これは、上記実施形態における新規プライマー対を用いて検出対象カビのゲノムＤＮＡを増幅すると、参考例３のプライマー対を用いる場合の約半分の短鎖の増幅産物が得られることによるものと推定される。このような短鎖の増幅産物は、長鎖の増幅産物に比較して、プローブとのハイブリダイズ効率が高いと考えられる。
その結果、上記実施形態における新規プライマー対を使用して短鎖の増幅産物を生成し、これを上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いてプローブにハイブリダイズさせることで、検出対象カビをより高い精度で検出することが可能になっていると考えられる。
【０１０３】
＜３．ＤＭＳＯ濃度の影響＞
次に、ＰＣＲ反応液のＤＭＳＯ濃度が、対象カビの検出精度に与える影響について、図７を参照して説明する。
実施例１４〜１８に示されるように、ユーロチウム用プローブの配列番号３に示す塩基配列からなるプローブでは、ＤＭＳＯ濃度が０％の時に比較して、ＤＭＳＯ濃度が０．５％，２％で約６倍、ＤＭＳＯ濃度が５％で約１０倍、ＤＭＳＯ濃度が７％で約３倍に蛍光強度が増加している。
【０１０４】
また、アスペルギルス ペニシリオイデス用の多くのプローブでも、ＤＭＳＯ濃度が０％の時に比較して、ＤＭＳＯ濃度が０．５％〜７％の場合に蛍光強度の増加が認められ、特にＤＭＳＯ濃度が５％の場合に大きく増加している。
したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによれば、夾雑物が多く存在し、検出対象カビであるユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが比較的少ない環境下であっても、ＤＭＳＯを添加することで、蛍光強度を増大させ、より高い精度で検出できることがわかる。
また、このような検出精度の向上効果は、次に説明するように、上記実施形態における新規プライマーを組み合わせることで、より一層増大させることが可能となっている。
【０１０５】
＜５．ＤＭＳＯ濃度とプライマーの影響＞
次に、ＰＣＲ反応液のＤＭＳＯ濃度、及び新規プライマー対が、対象カビの検出精度に与える影響について、図８を参照して説明する。
同図には、ユーロチウム用の主たるプローブである配列番号３のプローブ、及びアスペルギルス ペニシリオイデス用の主たるプローブである配列番号７のプローブについて、短鎖の増幅産物が得られる新規プライマー対を用いたとき、及び長鎖の増幅産物が得られる従来のリバースプライマーを含むプライマー対を用いたときのそれぞれにおける、ＤＭＳＯ濃度が０％，２％の場合の蛍光強度の比較結果が示されている。
【０１０６】
同図に示される通り、長鎖の増幅産物が得られる場合よりも、短鎖の増幅産物が得られる場合の方が、ＤＭＳＯが良く効くことがわかる。
すなわち、配列番号３のプローブでは、参考例２及び３のプライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度は１．９倍に増加している。これに対し、実施例１４及び実施例１６の新規プライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度は５．７倍に増加している。
【０１０７】
また、配列番号７のプローブでは、参考例２及び３のプライマー対を用いた場合、ＤＭＳＯの効果が認められず、むしろ蛍光強度が低減している。これに対し、実施例１４及び実施例１６の新規プライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度が３．６倍に増加している。
これは、長鎖の増幅産物が得られる場合よりも、短鎖の増幅産物が得られる場合の方が、ＤＭＳＯを添加した場合のＰＣＲ増幅効率が高くなることによるものと推定される。
このように、ＰＣＲ反応液に上記実施形態における新規プライマー対を含有させるとともに、ＤＭＳＯを含有させることで、対象カビの検出精度をより一層向上できることが明らかとなった。
【０１０８】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、ＰＣＲ反応液として本発明における新規プライマーとＤＭＳＯが含有され、本発明と同様の効果を奏することができるものであれば、その他の成分は適宜変更することが可能である。
また、本実施形態における検出対象カビは、図書館や文化財保管場におけるものに限定されず、例えば香辛料や穀物などの乾燥食品、皮革や綿などの乾燥した工業製品の保管庫におけるものなど、ユーロチウム属又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビであれば、その検出場所はどこであってもかまわない。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、図書館、文化財保管場、その他乾燥した各種工業製品や食品の保管庫など乾燥した環境下でよく繁殖するユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを、短期間で検出する必要がある場合などに好適に利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中の真菌を分子生物学的手法によって検出するためのカビ検出技術に関し、特に図書館や文化財保管場などにおける乾燥状態で多く発生する特定カビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
図書館や文化財保管場などは、図書や文化財が損傷しないように、空気環境が管理され、高湿度を好む一般的なカビは比較的生えにくい環境となっている。
しかしながら、カビには、６０〜７０％ＲＨやそれ以下の低湿度下で多く発生する好乾性カビも存在する。このようなカビとしては、例えばユーロチウム属(Eurotium spp.)における各種カビ、及びアスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)のカビ（以下、これらを特定カビ、対象カビ又は検出対象カビと称する場合がある）を挙げることができる。
【０００３】
これらのカビは、図書館や文化財保管場のような乾燥した環境下においても繁殖するカビであり、その繁殖によって図書や文化財に害を与える危険性をもっている。
したがって、その繁殖を防止するために、これらのカビを定期的に測定検出することは、図書及び文化財保護のために重要である。
【０００４】
一方、これらのカビのような空中浮遊真菌類（糸状菌、酵母等）を採取するためには、通常１週間から１０日以上を要する上、その同定を行うためには、さらに多くの日数を要するという問題があった。また、同定には熟練した専門家が必要であり、一般の人が手軽に行い得るものではなかった。
すなわち、従来、一般的には、カビを培養してコロニーを形成させ、肉眼及び顕微鏡による観察を行うことで同定を行っていたため、カビの採取を開始してからその同定を完了するまでには、およそ３〜４週間という長期間を要するという問題があった。また、担当者の技量によって、カビの検出精度が異なってしまうという問題もあった。
【０００５】
これに対し、カビの同定を分子生物学的手法により行うことも提案されている。
例えば、特許文献１には、所定のプライマーを用いてカビのＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物の電気泳動を行うことで、対象となるカビの存否を検出する方法が記載されている。
また、特許文献２及び３には、所定のプライマーを用いてカビやダニのＤＮＡを増幅するとともに、カビやダニを検出するための所定のプローブを用い、増幅したＤＮＡ断片を、プローブにハイブリダイズさせることにより検出する方法が記載されている。
これらの検出方法によれば、カビの培養を行う必要がないため、カビの検出に要する時間を大きく低減することが可能である。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献２】特開２００７−２０２４６２号公報
【特許文献３】特開２００８−３５７７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの方法を用いても、上述したユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビは、検出精度が低く、夾雑物が存在する場合には、ほとんど検出できないという問題があった。
その主たる原因は、これらのカビのＤＮＡがＧＣリッチな配列を有する（二本鎖ＤＮＡにおいて、３つの水素結合により対合するＧとＣの対の割合が相対的に多く存在する）点にあると考えられる。すなわち、このＧＣリッチな配列により、ＰＣＲ（polymerase chain reaction ポリメラーゼ連鎖反応）においてＤＮＡが乖離しにくく、また乖離しても二次構造を形成しやすく、十分に増幅できないためであると推定される。
その結果、これらのカビのＤＮＡの増幅産物は得られにくく、検出精度が低かったと考えられる。さらに、夾雑物が存在する場合には、このような低い検出精度が一層低下するため、現実の環境下でこれらのカビを特定して検出することはできず、実用的なレベルでの検出を行うことは非常に困難であった。
【０００８】
また、特許文献１のカビ検出方法では、カビの１８ＳｒＤＮＡ領域を増幅しているが、これらは真菌類において共通性に富む遺伝子領域であるため、多種多様な真菌類の同領域が増幅されてしまう。このため、得られたＤＮＡ断片の存否を、電気泳動により検出しても、真菌類の存否を検出できるのみであり、種は勿論のこと、属や科を特定することはできなかった。
【０００９】
また、特許文献２及び３には、検出対象のカビとしてアスペルギルス属のカビが記載されているが、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビについては記載されておらず、当該種類のカビを特定して検出することはできない。また、ユーロチウム属のカビとしてユーロチウム ヘルバリオルム種（Eurotium herbariorum）が記載されているが、ユーロチウム属レベルの検出については、記載されていない。
すなわち、特許文献２及び３に記載の発明によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ、及びユーロチウム属のカビを特定して、その存否を的確に検出することはできなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、ユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを好適に特定し得る新規プローブを開発することに成功し、本発明を完成させた。また、これらのカビの検出精度を向上させることができる新規プライマー対を開発することにも成功した。さらに、ＰＣＲ反応液中に所定の割合のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えることで、検出精度を顕著に向上させることに成功した。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、好乾性カビであるユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを検出するための新規プローブを固定化した特定カビ検出用のマイクロアレイを提供することを目的とする。また、これらのカビの検出精度を向上させ得る新規プライマー対及び／又はジメチルスルホキシドを含有するＰＣＲ反応液を用いて得られた増幅産物を新規プローブにハイブリダイズさせることで、これらの特定カビを夾雑物の存在下でも検出可能とする特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出システムの使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の特定カビ検出用マイクロアレイは、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化した構成としてある。
【００１３】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号３に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号２に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、ユーロチウム属のカビを検出する構成とすることも好ましい。
【００１４】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号７に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号６に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号８に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビを検出する構成とすることも好ましい。
【００１５】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号５に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビを検出する構成とすることも好ましい。
【００１６】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸が増幅され、試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する構成とすることも好ましい。
【００１７】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、上記ＰＣＲ反応液が、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有する構成とすることも好ましい。
【００１８】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法は、ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビ、又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイに、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化し、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸を増幅し、試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する方法としてある。
【００１９】
また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法において、上記ＰＣＲ反応液に、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有させることも好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、マイクロアレイを用いた特定カビの検出において、ユーロチウム属のカビ、及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出感度を大きく向上させることができ、夾雑菌の存在下、対象カビ濃度が低濃度であってもこれらをそれぞれ選択的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施形態における新規プライマー対のカビ遺伝子における位置を示す図である。
【図２】実施例１−６、参考例１の試験結果を示す図である。
【図３】実施例、参考例で使用したゲノムの種類と菌株を示す図である。
【図４】実施例７−１３の試験結果を示す図である。
【図５】実施例１４−１８、参考例２，３の試験結果を示す図である。
【図６】本発明の実施形態におけるプライマーの影響について示す図である。
【図７】本発明の実施形態におけるＤＭＳＯ濃度の影響について示す図である。
【図８】本発明の実施形態におけるＤＭＳＯ濃度とプライマーの影響について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
［マイクロアレイ］
本実施形態のマイクロアレイは、本実施形態の検出対象である特定カビを検出するための所定のプローブの少なくともいずれか１つを、基板上に固定化したものであれば特に限定されるものではなく、例えばスポット型ＤＮＡマイクロアレイ、合成型ＤＮＡチップなどを用いることができる。
【００２３】
本実施形態の対象カビを検出するためのプローブは、配列番号１〜９によりそれぞれ特定される塩基配列からなるＤＮＡ断片である。このうち、配列番号１、配列番号２、配列番号３により特定されるものが、ユーロチウム属のカビを検出するためのプローブであり、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９により特定されるものが、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを検出するためのプローブである。
【００２４】
これらの検出対象カビは、６０〜７０％ＲＨ、あるいはそれ以下の低湿度下で多く発生する、好乾性カビである。このような好乾性カビは、低湿度に保たれている図書館や文化財保管場などでも生育し、図書や文化財を損傷し得るものである。
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、上記プローブにより、これらの特定カビをそれぞれ選択的に高感度で検出することができる。
【００２５】
なお、より詳細に系統まで考慮すれば、配列番号４、配列番号５、配列番号９は、アスペルギルス ビトリコラ（Aspergillus vitricola）の系統を検出するためのプローブであり、配列番号６、配列番号７、配列番号８は、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides）の系統を検出するためのプローブである。分類学は発展途上にあり、現在の通説では、これらはいずれもアスペルギルス ペニシリオイデス種として取り扱われている。
【００２６】
これらの対象カビを検出するためのプローブは、いずれもそれぞれのカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を探索して得られた塩基配列にもとづき作成されたものである。
【００２７】
ここで、配列番号３のプローブによれば、実施例において後述するように、ユーロチウム属における、環境下で一般によく検出される頻出種である主要６種の菌株のＤＮＡを検出することが可能である。このため、配列番号３のプローブを使用することで、実用上は、ユーロチウム属に存在するほとんどのカビを特定的に検出することが可能になっている。本実施形態では、この配列番号３のプローブと共に、配列番号１及び配列番号２のプローブを補助的に使用することで、検出の確実性を向上させている。また、配列番号３のプローブと共に、配列番号１及び配列番号２のプローブのうちいずれか一方を補助的に使用してもよい。
【００２８】
配列番号１は、ユーロチウム属におけるヘルバリオルム種（Eurotium herbariorum）のカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域から、配列番号２は、ユーロチウム属におけるトノフィラム種（Eurotium tonophilum）のカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域から、それぞれ選択されたものである。
例えば、配列番号３のプローブが何らかの理由によりマイクロアレイに適切に固定化されなかった場合など、当該プローブでは検出できない場合に、配列番号１又は２のプローブによる検出が行われていれば、新たなマイクロアレイを使用して再確認を行うことができ、検出の確実性を向上させることが可能となる。
【００２９】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビに特異的な配列であり、これらの配列からなるプローブは、上述したように、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを選択的に検出することが可能である。
【００３０】
ここで、後述する実施例によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種におけるアスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビについては、配列番号７のプローブの蛍光強度が最も大きくなっている。このため、配列番号７のプローブを主たるプローブとして用いると共に、配列番号６のプローブ、及び／又は、配列番号８のプローブを補助的なプローブとして使用することも好ましい。これにより、アスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビの検出の確実性を向上させることが可能となる。
また、同様に、アスペルギルス ペニシリオイデス種におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビについては、配列番号５のプローブの蛍光強度が最も大きくなっている。このため、配列番号５のプローブを主たるプローブとして用いると共に、配列番号４のプローブ、及び／又は、配列番号９のプローブを補助的なプローブとして使用することも好ましい。これにより、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビの検出の確実性を向上させることが可能となる。
【００３１】
さらに、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに、配列番号１〜９の全てのプローブを固定化することで、ユーロチウム属及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを同時に、かつそれぞれを特定して検出することが可能となる。
【００３２】
［プローブの合成］
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化される上記プローブは、いずれも２０ｍｅｒ（塩基）程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成できる。
後述する実施例で用いた本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化した配列番号１〜９の配列からなる各プローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用している。
なお、後述する実施例で用いた配列番号１０及び１１の配列からなるプライマー対も同様に２０ｍｅｒ（塩基）程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用している。
【００３３】
また、本実施形態における配列番号１〜９の配列からなる各プローブとしては、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブを用いることができ、また配列番号１〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１〜９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００３４】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００３５】
なお、配列番号１０及び１１の配列からなるプライマー対についても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対を用いることができる。また、配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対を用いることもできる。
【００３６】
［マイクロアレイの作成］
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、配列番号１〜９の配列をそれぞれ備えたプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡマイクロアレイを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをスライドガラス上に固定化することによって、作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することによってプローブを生成し、本実施形態のマイクロアレイを作成することができる。
【００３７】
［特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法］
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、図書館や文化財保管場等の室内空気から採取された試料に、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在するか否かを検出するために使用する。
このため、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、以下の工程により、例えば室内空気から採取された試料のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、得られた増幅産物を当該マイクロアレイに固定化したプローブにハイブリダイズさせることで使用する。
【００３８】
まず、後述する専用のＰＣＲ反応液を用いて、核酸増幅装置により試料に含まれる特定のＤＮＡ領域を増幅する。
そして、得られた増幅産物を本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ上のプローブにハイブリダイズさせ、標識検出装置により増幅産物の標識を検出することで、試料に特定カビのＤＮＡが含まれているか否かを検出する。
【００３９】
次に、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法について、カビの採取工程から詳細に説明する。
（１）カビの採取
まず、エアーサンプラーを用いて、図書館や文化財保管場の室内空気を採取する。採取した空気を専用培地に吹き付けて培養する。培地としては、好乾性カビの生育に適したＭ４０Ｙ培地やジクロラン-グリセロール（ＤＧ−１８）寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
【００４０】
次に、１ストリップ中のコロニーを一括して採取し、事前にφ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたねじ口バイアル瓶に入れる。ねじ口バイアル瓶ごと液体窒素に浸して試料を凍結し、振盪装置により試料を破砕する。
【００４１】
（２）ＤＮＡの抽出
試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【００４２】
（３）ＰＣＲ法による特定カビのｒＤＮＡにおけるＩＴＳ１領域の増幅
本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）と、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，終濃度で０．５〜７容量％（以下、単に％と称する場合がある））、試料のゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ抽出液）、及び上述したその他の所定の試薬を混合して、本実施形態のＰＣＲ反応液を作成する。
なお、ＤＭＳＯは、融点が１８℃付近の単体の有機化合物であり、室温では通常液体状態となっている。
【００４３】
本実施形態で使用するＰＣＲ反応液は、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）に規定の処方に従って作成することができる。
なお、本実施形態で使用するＰＣＲ反応液にはＤＭＳＯが含まれるが、酵素は高濃度のＤＭＳＯによって容易に破壊され得る。このため、ＤＮＡ合成酵素はＰＣＲ反応液に最後に混合し、混合後は、核酸増幅装置により直ちに増幅反応を開始させることが好ましい。
【００４４】
本実施形態において特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）を使用する場合、核酸増幅装置のＰＣＲ反応条件は、高い増幅効果を得るために、次のようなものにすることが好ましい。
（ａ）ＤＮＡ鎖の乖離（ＤＮＡ変性）工程 ９３〜９７℃ ２０〜４０秒
（ｂ）プライマーの対合（アニーリング）工程 ５０〜６０℃ １０〜５０秒
（ｃ）ＤＮＡ合成工程 ７０〜７４℃ ５０〜７０秒
【００４５】
具体的には、ＰＣＲ反応条件を、例えば次のようなものにすることが好ましい。
（i）９５℃ １０分、（ii）９５℃ ３０秒、（iii）５６℃ ３０秒、（iv）７２℃ ６０秒（（ii）〜（iv）を４０サイクル）、（v）７２℃ １０分、（vi）４℃ ∞（保持）
【００４６】
（４）マイクロアレイによるハイブリダイズ及び蛍光検出
次に、ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ上に滴下して、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブにハイブリダイスしたＰＣＲ増幅産物の標識を検出する。
【００４７】
具体的には、例えば次のように行うことができる。
まず、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合し、９４℃で５分間加温することで、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に乖離させる。これを氷上にて急冷し、マイクロアレイに滴下する。
次に、マイクロアレイを４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイスしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流す。
そして、マイクロアレイを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、試料中に特定カビが存在するか否かを検出する。
【００４８】
［ＰＣＲ反応液］
本実施形態で使用するＰＣＲ反応液は、例えば以下のような組成とすることが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP；４００μＭ、dATP、dTTP、dGTP；５００μＭ each） ５容量％）、フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ５容量％）、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ５容量％）、核酸合成酵素（ＮｏｖａＴａｑ １容量％）、標識成分（１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ １容量％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ ２容量％）、試料のゲノム（所定量、例えば０．１ｎｇ〜３００ｎｇ）、緩衝液（６０容量％）、及び残りの容量％の成分として水を含むものとすることが好ましい。なお、緩衝液は、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社 島津製作所）のＰＣＲ処方における緩衝液として、Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−１、Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−２、及びＡｍｐｄｉｒｅｃｔをそれぞれ２０容量％ずつ含有させることができる。
【００４９】
このＰＣＲ反応液において、特定カビのＤＮＡ増幅用のプライマー対のフォワードプライマー（正プライマー）としては、配列番号１０の配列からなるものを使用し、リバースプライマー（逆プライマー）としては、配列番号１１の配列からなるものを使用する。
図１に示すように、フォワードプライマーは、真菌類のｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）における１８Ｓから選択された配列からなる新規プライマーである。また、リバースプライマーは、同５．８Ｓから選択された配列からなる新規プライマーである。
なお、塩基配列には方向性があり、配列番号に示される塩基配列は、５’末端から３’末端方向の配列を示している。
【００５０】
これらの新規プライマー対を用いた場合、検出対象の特定カビであるユーロチウム属のカビ、又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのゲノムＤＮＡを増幅すると、同図に示すように、主としてＩＴＳ１領域の塩基配列からなるおよそ２５０〜３３０ｂｐ（base pair 塩基対）の短鎖の増幅産物が得られる。
これらの新規プライマー対を用いて、例えばユーロチウム属のカビ（JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のＤＮＡを増幅した場合、２５８ｂｐの増幅産物が得られる。また、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini）のＤＮＡを増幅した場合、３０９ｂｐの増幅産物が得られる。
【００５１】
一方、フォワードプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーを用い、かつリバースプライマーとして、例えば２８Ｓにおける塩基配列からなる既存の各種プライマーを用いてこれらのカビのＤＮＡを増幅する場合、後述する比較例２（配列番号１０及び配列番号１２のプライマー対を使用）に示されるように、ユーロチウム属のカビでは約５８０ｂｐ、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビでは約６５０ｂｐの長鎖の増幅産物が得られる。
このように、本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用のプライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）を用いることにより、従来のおよそ１／２あるいはそれ以下の長さのＤＮＡ断片を得ることができる。本発明の発明者らは、このような短いＤＮＡ断片を使用することで、マイクロアレイに固定されたプローブとのハイブリダイズ効率を向上させることに成功している。
【００５２】
ここで、増幅産物の塩基長が２５０ｂｐ未満の場合、ユーロチウム属及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のゲノムＤＮＡ中において、その短鎖の増幅産物を得るためのプライマー対と類似した配列が存在する可能性が高くなり、ＩＴＳ１領域以外の部分が多数増幅される。その結果、対象カビが存在していても、蛍光強度が低下し、検出精度が低下する場合がある。また、このような部分の領域内に、本実施形態の新規プローブとハイブリダイズする配列が含まれていると、誤反応を引き起こし、対象カビを特定的に検出することが困難となる。一方、増幅産物の塩基長が３３０ｂｐを上回る場合は、これ以下の場合と比較してハイブリダイズの効率が低くなり、検出感度が低下する場合がある。
【００５３】
また、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、ＰＣＲ反応において、鋳型となるゲノムＤＮＡとプライマーとの非特異的な結合を抑制し、特異的な結合を促進する。また、１０容量％濃度で約５℃程度、溶解温度（Ｔｍ，二本鎖ＤＮＡ〈ｄｓＤＮＡ〉の半分が一本鎖分子に乖離するのに必要な温度）を低下させることにより、ＤＮＡの変性（ｄｓＤＮＡの鎖状分子二本が、乖離して一本鎖のｓｓＤＮＡになること）を促進する。さらに、ＧＣ繰り返し配列などによる二次構造を抑制して直鎖状にする。すなわち、一本鎖ＤＮＡが捩れや折れ曲がりなど立体的な構造をとることを防止する。
【００５４】
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによる検出対象の特定カビのＤＮＡは、ＧＣリッチな塩基配列を有しているが、このようなＤＭＳＯの作用によって、ＧＣ配列が分離しやすくなり、また分離後の二次構造化を抑制することができ、増幅効率が顕著に向上したと推測される。特に実施例で示されるように、特定カビのＤＮＡを本実施形態における新規プライマーを用いて増幅することにより、ＰＣＲ反応液に単にＤＭＳＯを添加した場合に比較してより一層高い増幅効率を得ることができるようになっている。
その結果、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用することで、従来の手法では実用的なレベルでの検出が困難であった、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出精度を、大きく向上させることが可能となっている。
【００５５】
なお、ＤＭＳＯは、上記のような効果がある一方、過剰に添加した場合には酵素活性を低下させる性質も有している。このため、本実施形態のＰＣＲ反応液を作成するにあたっては、成分の混合順序として、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を最後に添加することが好ましい。また、多数の試料に対する検出を行う場合は、作業性を考慮して、酵素を最後から２番目に添加し、最後に試料のゲノムＤＮＡを添加することが好ましい。さらに、酵素としては、ホットスタート機能を付加したもの（所定の高温（９５℃などのＤＮＡ変性工程の温度）に曝されて初めて、ＤＮＡ合成活性を発揮するように、修飾された酵素）を用いることが好ましい。いずれの場合にも、酵素を入れる前にＤＭＳＯを添加して、よく混合した上で、その濃度を終濃度で０．５〜７容量％になるようにしておくことが好ましい。また、終濃度で０．５〜５容量％になるようにすることがより好ましく、終濃度で５容量％になるようにすることがさらに好ましい。
【００５６】
ＰＣＲ反応液におけるＤＭＳＯの終濃度が０．５容量％未満の場合は、ＤＭＳＯの効果が小さく、特に夾雑ゲノムが混在する場合における、対象種であるユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが増幅されにくくなるため、検出感度が低下する場合がある。一方、ＤＭＳＯの終濃度が７容量％より大きい場合は、ＤＮＡ合成酵素の活性が阻害されやすく、失活する場合もある。このため、対象種のみならず夾雑種も含めてＤＮＡ増幅が行われにくくなり、検出感度が低下するか、又は検出不能となるおそれがある。
【００５７】
ＰＣＲ反応液におけるその他の成分、すなわち核酸合成基質、核酸合成酵素、標識成分、及び緩衝液等については、一般に使用されている試薬を適宜使用することができる。
【００５８】
［核酸増幅装置］
核酸増幅装置は、本実施形態における専用のＰＣＲ反応液を使用して、試料における特定カビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅するＰＣＲ装置である。一般的なサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ 温度制御装置）に、上記専用のＰＣＲ反応液を入れて構成することができる。
本実施形態のＰＣＲ反応液に含まれる特定カビのＤＮＡを増幅可能な新規プライマー対は、試料中にユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在する場合には、そのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅することができる。
【００５９】
一方、従来のＰＣＲ反応液では、本実施形態の検出対象の特定カビのＤＮＡを単独ではある程度までは増幅するものの、非対象の夾雑菌が並存していると、実用化可能なレベルで十分に増幅することはできなかった。
すなわち、従来のＰＣＲ反応液を用いた場合、試料中にユーロチウム属のカビ及び／又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在していても、そのゲノムＤＮＡの特性上、これを検出しうるまで効率的に増幅することは困難であった。また、試料中に、従来のプライマー対により増幅される夾雑菌が含まれている場合には、その夾雑菌のＤＮＡが競合して増幅され、対象カビを十分に増幅して検出することが困難であった。
これに対して、本実施形態における上記専用のＰＣＲ反応液を用いれば、核酸増幅装置により、本実施形態の検出対象の特定カビのＤＮＡをより効率的に増幅することができ、試料中にその他の夾雑菌が含まれている場合でも、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いて、特定カビを検出することが可能となっている。
【００６０】
具体的には、従来のＰＣＲ反応液では、検出対象カビが、混在ゲノムＤＮＡ中に少なくともEurotium spp.では１／６、A.penicillioidesでは１／３より多くなければ検出できなかった。また、ＰＣＲ反応液１０μｌ中に検出対象カビが０．２ｎｇ存在している場合、単独なら検出できたが、夾雑物（混在ゲノムＤＮＡ）が０．２ｎｇ存在すればもはや検出することが困難であった。このため、従来のＰＣＲ反応液は、様々なカビが存在し得る環境下で、特定カビを検出するために実用化できるものではなかった。
これに対し、本実施形態のＰＣＲ反応液では、以下の実施例で示されるように、夾雑物が６ｎｇ存在する場合でも、検出対象カビが０．１ｎｇ（１００ｐｇ）存在すれば検出することが可能である。
【００６１】
なお、図１に示すように、本実施形態の増幅産物には、５．８Ｓ領域の配列も部分的に含まれるが、上述したように５．８Ｓ領域は真菌類に共通する配列を備えており、種を特定可能な配列はＩＴＳ１領域にあることから、本実施形態のＰＣＲ反応液を用いて増幅される領域をＩＴＳ１領域と称している。
【００６２】
［標識検出装置］
標識検出装置は、マイクロアレイ上でプローブにハイブリダイスした増幅産物（ＤＮＡ断片）に結合している標識を検出する。この標識検出装置としては、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。
本実施形態では、ＰＣＲ反応液に含まれるＣｙ５−ｄＣＴＰによって標識された増幅産物の蛍光強度を、標識検出装置により検出している。
なお、本実施形態の特定カビ検出システムにおいて使用する標識成分は、Ｃｙ５−ｄＣＴＰに限定されるものではなく、放射性同位元素やジゴキシゲニンなどその他の標識成分を用いて標識することも可能である。
【００６３】
以上説明したように、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによれば、ユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出精度を顕著に向上させることができ、誤検出等を大きく低減することが可能となる。
すなわち、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブのうち、配列番号１〜３からなるプローブは、ユーロチウム属のカビの検出に適した配列からなるものであり、配列番号４〜９からなるプローブは、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出に適した配列からなるものである。これらのプローブを用いることにより、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを実用レベルで特異的に検出することが可能となっている。
【００６４】
また、本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対を用いることで、従来の半分以下の短い増幅産物を得ることができ、プローブとのハイブリダイズをより効率的に行うことが可能となっている。
さらに、本実施形態で用いられるＰＣＲ反応液にはＤＭＳＯが所定の濃度で含有されており、これによって、ユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡの変性が促進されるとともに、二次構造の形成が抑制されてＰＣＲ反応の誤作動を低減させることができ、検出対象カビのＤＮＡの増幅反応を促進させることが可能となっている。
【００６５】
また、このような短鎖の増幅産物を得ることができる新規プライマー対と、ＰＣＲ反応液におけるＤＭＳＯの相乗効果により、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビをより効率的に増殖でき、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイにより、これらのカビを優れた精度で検出することができるようになっている。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイによるユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビについての検出精度を確認するために行った実施例及び参考例について説明する。これらの実施例及び参考例では、いずれも配列番号１〜９のプローブを全て固定化した上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用した。
【００６７】
（実施例１）
試験番号（１）：対象ゲノム（ユーロチウム属のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
上記実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用の新規プライマー対（配列番号１０及び１１により特定される塩基配列からなるプライマー対）を含有し、ＤＭＳＯを２容量％含有するＰＣＲ反応液を用いて、検出対象カビであるユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応液に夾雑物は含まれていない。そして、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用して、増幅産物をハイブリダイズさせ、蛍光検出を行った。
【００６８】
具体的には、ＰＣＲ反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを１０μｌ作成した。
１．５×Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−１ ２．０μｌ
２．５×Ａｍｐ ａｄｄｉｔｉｏｎ−２ ２．０μｌ
３．５×Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ ２．０μｌ
４．核酸合成基質 ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ ０．５μｌ
（dCTP；４００μＭ、dATP、dTTP、dGTP；５００μＭ each）
５．フォワードプライマー（配列番号１０：オペロンテクノロジー株式会社により合成） ０．５μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
６．リバースプライマー（配列番号１１：同上） ０．５μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
７．核酸合成酵素 ＮｏｖａＴａｑ ０．１μｌ
８．標識成分 １ｍＭ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ ０．１μｌ
９．対象カビ及び夾雑物のゲノム ユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手） ０．１ｎｇ（１００ｐｇ）
１０．水（全体が１０．０μｌになるまで加水）
【００６９】
このＰＣＲ反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
１．９５℃ １０分
２．９５℃ ３０秒
３．５６℃ ３０秒
４．７２℃ ６０秒（２〜４を４０サイクル）
５．７２℃ １０分
６．４℃保持 ∞
【００７０】
マイクロアレイには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を使用し、これに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９によりそれぞれ特定される塩基配列からなるプローブと、これらに相補的なプローブとを固定化した。
【００７１】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣ〈クエン酸−生理食塩水、株式会社ニッポンジーン社製〉に０．３％ＳＤＳ〈ドデシル硫酸ナトリウム、株式会社ニッポンジーン社製〉を添加）を混合して９４℃で５分間加温し、氷上にて急冷してマイクロアレイに滴下した。
【００７２】
このマイクロアレイを４５℃で１時間静置した。次に、上記緩衝液を用いてハイブリダイスしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
【００７３】
そして、マイクロアレイを標識検出装置（GenePix4100A Molecular Devices社製）にかけて蛍光強度を測定した。蛍光強度は、レーザー光で励起して標識成分（Cy5）を発光させ、それを検出器内に取り付けた光電子倍増管（ＰＭＴ）の受光面にて光量を電気信号に置換し、それを数値化することで測定した。この蛍光強度は、当該装置での強度指標であり、単位はなく、バックグラウンドの数値が０になるように補正して算出される。また、このようなマイクロアレイによる検出を、同じプローブを固定化した別個の４つのマイクロアレイでも同様に、同一の増幅産物を用いて行った。そして、各蛍光強度を測定し、５回の平均をとることで、プローブ毎の蛍光強度を算出した。その結果を図２に示す。
【００７４】
同図において、「試験番号」は、試験ごとに付された連番である。「実施例等」は、実施例、参考例の番号をそれぞれ「実」「参」の後に示す。「ゲノム」は、ＰＣＲ反応液に含まれるゲノムＤＮＡの種類と量を示し、「ユーロ混入（ｎｇ）」にはユーロチウム属のカビの種類と量が、「アスペル混入」にはアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの種類と量が、「夾雑物混入」には夾雑物のカビの種類と量が、それぞれ表示されている。「↑」は上欄と同条件であることを示している。また、蛍光強度３０以上を太枠で示している。図４以降の試験結果についても同様である。また、実施例及び参考例で用いたカビの種類について、図３に示す。
【００７５】
（実施例２）
試験番号（２）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１，アスペルギルス ペニシリオイデス，JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini）のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７６】
（実施例３）
試験番号（３）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ２，アスペルギルス ビトリコラ，NBRC8155 Aspergillus penicillioides（Synonym Aspergillus vitricola Otsuki））のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７７】
（参考例１）
試験番号（４）：対象ゲノムなし、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液に、対象ゲノム及び夾雑物を混入させることなく、その他の条件は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７８】
（実施例４）
試験番号（５）：対象ゲノム（ユーロチウム属のカビと夾雑物のみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビ（Ａ１）のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いるとともに、夾雑物（Ｃ，NBRC4026 Alternaria alternata（Fries）Keissler，NBRC6348 Cladosporium cladosporioides（Fresenius）de Vries，（独）製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門より入手，各３ｎｇ、合計６ｎｇ）をＰＣＲ反応液に添加した点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００７９】
（実施例５）
試験番号（６）：対象ゲノムではないアスペルギルス ペニシリオイデスの近縁種のＤＮＡ（ＡＶ，ＡＲ）を含む、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムと共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種の近縁種のカビとして、アスペルギルス レストリクタス（ＡＲ，JCM1727 Aspergillus restrictus G.Smith，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手）、及びアスペルギルス ヴェルシカラー（ＡＶ，JCM10258 Aspergillus versicolor（Vuillemin）Tiraboschi，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手）のゲノムＤＮＡをそれぞれ０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００８０】
（実施例６）
試験番号（７）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビと夾雑物のみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムを含有させることなく、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
【００８１】
（実施例７）
試験番号（８）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種２のカビ（Ａ２，NBRC8157 Eurotium tonophilum Otsuki）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いると共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８２】
（実施例８）
試験番号（９）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ３）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種３のカビ（Ａ３，JCM1568 Eurotium chevalieri L.Mangin）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８３】
（実施例９）
試験番号（１０）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ４）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種４のカビ（Ａ４，JCM1565 Eurotium amstelodami Mangin）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８４】
（実施例１０）
試験番号（１１）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ５）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種５のカビ（Ａ５，JCM1580 Eurotium repens de Bary）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８５】
（実施例１１）
試験番号（１２）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ６）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種６のカビ（Ａ６，JCM22942 Eurotium rubrum Konig et al.）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８６】
（実施例１２）
試験番号（１３）：対象ゲノム（アスペルギルス ビトリコラ Ｂ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１ ０．１ｎｇ）と共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのうち、Ｂ１と同種かつ別個の系統のアスペルギルス ビトリコラ（Ｂ２，NBRC8155 Aspergillus penicillioides（Synonym Aspergillus vitricola Otsuki））のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８７】
（実施例１３）
試験番号（１４）：対象ゲノム（アスペルギルス ペニシリオイデス２種 Ｂ１，Ｂ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１ ０．１ｎｇ）と共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのうち、Ｂ１とＢ２の両方のＤＮＡをそれぞれ０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
【００８８】
（実施例１４）
試験番号（１５）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度０％
ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１ ０．１ｎｇ）と、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１ ０．１ｎｇ）を用い、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを添加することなく、その他の点は実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００８９】
（実施例１５）
試験番号（１６）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度０．５％
ＤＭＳＯを０．５容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９０】
（実施例１６）
試験番号（１７）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
ＤＭＳＯを２容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９１】
（実施例１７）
試験番号（１８）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度５％
ＤＭＳＯを５容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９２】
（実施例１８）
試験番号（１９）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度７％
ＤＭＳＯを７容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９３】
（参考例２）
試験番号（２０）：対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、ＤＭＳＯ濃度０％
配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９４】
ここで、配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を用いて、ユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575 Eurotium herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のＤＮＡを増幅すると、５７６ｂｐの増幅産物が得られる。この増幅産物のＤＮＡ配列の長さは、実施例１における同種のＤＮＡの増幅産物２５８ｂｐの２倍以上に相当する。また、同様に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１，JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini）のＤＮＡを増幅すると、６４３ｂｐの増幅産物が得られる。この増幅産物のＤＮＡ配列の長さも、実施例２における同種のＤＮＡの増幅産物３０９ｂｐの２倍以上に相当する。以下、このような従来のリバースプライマーを含むプライマー対を用いて得られた長い増幅産物を長鎖と称し、上記実施形態の新規プライマーによる短い増幅産物を短鎖と称する場合がある。
【００９５】
（参考例３）
試験番号（２１）：対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例１６と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
【００９６】
次に、上記の試験結果にもとづいて、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法の効果について説明する。
上記各実施例及び参考例において、試験結果における蛍光強度（光量）が、５０以上の場合は、標識検出装置（GenePix4100A）から出力される画像データにおいて、肉眼で識別可能なレベルの強度であり、対象ゲノムを検出している可能性が高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、３０〜５０未満の場合は、肉眼ではほとんど識別できないが、明らかに反応が見られ、対象ゲノムを検出している可能性が比較的高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、１０〜３０未満の場合は、明らかに反応が見られるが、対象ゲノム以外の類似するゲノムを検出している可能性も高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、１０未満の場合は、試験番号８に示されるように、ノイズの検出と考えられる。以上のことから、以下の説明では、蛍光強度３０以上を有効な検出として説明している。
【００９７】
＜１．特定カビの検出＞
まず、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法による対象カビの特定的検出について、図２及び図４を参照して説明する。
参考例１に示されるように、ＰＣＲ反応液に検出対象カビが含まれていない場合、有効な光量は検出されていない。
これに対し、実施例１〜３に示されるように、ＰＣＲ反応液に検出対象カビが含まれている場合は、それぞれのカビに対応するプローブの多くに有効な光量が検出されている。また、実施例４〜６に示されるように、夾雑物存在下においても、検出することができている。
【００９８】
また、ユーロチウム属のカビについては、実施例４，実施例７〜１１に示されるように、夾雑物存在下、主要な６種全てについて検出することが可能になっている。特に、Ａ２〜Ａ６のユーロチウム属のカビについては、配列番号１，２で表される配列からなるプローブ、又はこれらと相補的な配列からなるプローブにも有効な光量、あるいは有効ではないものの比較的高い光量が検出されている。よって、これらを配列番号３で表される配列からなるプローブ及びこれと相補的な配列からなるプローブと共に補助的に使用することで、検出の確実性をより向上させることが可能である。
また、これらＡ１〜Ａ６のカビは、ユーロチウム属のカビのうちの多くを占める頻出種であり、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビをほぼ属レベルで特定的に検出することができる。
【００９９】
次に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビについては、実施例６，１２，１３に示されるように、アスペルギルス ペニシリオイデス、及びアスペルギルス ビトリコラのいずれの系統でも、多くのプローブで有効な検出が得られている。
また、実施例５のＰＣＲ反応液には、アスペルギルス属でペニシリオイデス種ではない近縁の種のカビである、アスペルギルス レストリクタス（ＡＲ）、及びアスペルギルス ヴェルシカラー（ＡＶ）のゲノムＤＮＡが含まれているが、これらについては、有効な検出は得られず、偽陽性反応は見られなかった。
したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを選択的に特定できることがわかる。
【０１００】
また、実施例７〜１３の結果から明らかなように、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが混在し、かつ夾雑物が存在する環境下においても、これらを同時に、かつそれぞれを特定して検出することが可能になっている。
このように、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを、それぞれ選択的に検出することが可能である。
【０１０１】
＜２．プライマーの影響＞
次に、上記実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用の新規プライマー対（配列番号１０及び１１に示す塩基配列からなるプライマー対）が、対象カビの検出精度に与える影響について、図６を参照して説明する。なお、図６において、注目すべき部分を太枠で示している。図７及び図８においても同様である。
同図に示す実施例１６と参考例３とは、ＰＣＲ反応液に含まれるプライマー対のみが相違し、その他については同一条件で試験を行ったものである。すなわち、実施例１６では上記実施形態における新規プライマー対を使用し、参考例３では従来のリバースプライマーを含むプライマー対を使用している。
これらの試験による蛍光強度のうち、良く反応しているプローブについて比較すると、実施例１６の蛍光強度は、参考例３の蛍光強度のおよそ約２．５〜１７倍となっている。
【０１０２】
これは、上記実施形態における新規プライマー対を用いて検出対象カビのゲノムＤＮＡを増幅すると、参考例３のプライマー対を用いる場合の約半分の短鎖の増幅産物が得られることによるものと推定される。このような短鎖の増幅産物は、長鎖の増幅産物に比較して、プローブとのハイブリダイズ効率が高いと考えられる。
その結果、上記実施形態における新規プライマー対を使用して短鎖の増幅産物を生成し、これを上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いてプローブにハイブリダイズさせることで、検出対象カビをより高い精度で検出することが可能になっていると考えられる。
【０１０３】
＜３．ＤＭＳＯ濃度の影響＞
次に、ＰＣＲ反応液のＤＭＳＯ濃度が、対象カビの検出精度に与える影響について、図７を参照して説明する。
実施例１４〜１８に示されるように、ユーロチウム用プローブの配列番号３に示す塩基配列からなるプローブでは、ＤＭＳＯ濃度が０％の時に比較して、ＤＭＳＯ濃度が０．５％，２％で約６倍、ＤＭＳＯ濃度が５％で約１０倍、ＤＭＳＯ濃度が７％で約３倍に蛍光強度が増加している。
【０１０４】
また、アスペルギルス ペニシリオイデス用の多くのプローブでも、ＤＭＳＯ濃度が０％の時に比較して、ＤＭＳＯ濃度が０．５％〜７％の場合に蛍光強度の増加が認められ、特にＤＭＳＯ濃度が５％の場合に大きく増加している。
したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによれば、夾雑物が多く存在し、検出対象カビであるユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが比較的少ない環境下であっても、ＤＭＳＯを添加することで、蛍光強度を増大させ、より高い精度で検出できることがわかる。
また、このような検出精度の向上効果は、次に説明するように、上記実施形態における新規プライマーを組み合わせることで、より一層増大させることが可能となっている。
【０１０５】
＜５．ＤＭＳＯ濃度とプライマーの影響＞
次に、ＰＣＲ反応液のＤＭＳＯ濃度、及び新規プライマー対が、対象カビの検出精度に与える影響について、図８を参照して説明する。
同図には、ユーロチウム用の主たるプローブである配列番号３のプローブ、及びアスペルギルス ペニシリオイデス用の主たるプローブである配列番号７のプローブについて、短鎖の増幅産物が得られる新規プライマー対を用いたとき、及び長鎖の増幅産物が得られる従来のリバースプライマーを含むプライマー対を用いたときのそれぞれにおける、ＤＭＳＯ濃度が０％，２％の場合の蛍光強度の比較結果が示されている。
【０１０６】
同図に示される通り、長鎖の増幅産物が得られる場合よりも、短鎖の増幅産物が得られる場合の方が、ＤＭＳＯが良く効くことがわかる。
すなわち、配列番号３のプローブでは、参考例２及び３のプライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度は１．９倍に増加している。これに対し、実施例１４及び実施例１６の新規プライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度は５．７倍に増加している。
【０１０７】
また、配列番号７のプローブでは、参考例２及び３のプライマー対を用いた場合、ＤＭＳＯの効果が認められず、むしろ蛍光強度が低減している。これに対し、実施例１４及び実施例１６の新規プライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度が３．６倍に増加している。
これは、長鎖の増幅産物が得られる場合よりも、短鎖の増幅産物が得られる場合の方が、ＤＭＳＯを添加した場合のＰＣＲ増幅効率が高くなることによるものと推定される。
このように、ＰＣＲ反応液に上記実施形態における新規プライマー対を含有させるとともに、ＤＭＳＯを含有させることで、対象カビの検出精度をより一層向上できることが明らかとなった。
【０１０８】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、ＰＣＲ反応液として本発明における新規プライマーとＤＭＳＯが含有され、本発明と同様の効果を奏することができるものであれば、その他の成分は適宜変更することが可能である。
また、本実施形態における検出対象カビは、図書館や文化財保管場におけるものに限定されず、例えば香辛料や穀物などの乾燥食品、皮革や綿などの乾燥した工業製品の保管庫におけるものなど、ユーロチウム属又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビであれば、その検出場所はどこであってもかまわない。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、図書館、文化財保管場、その他乾燥した各種工業製品や食品の保管庫など乾燥した環境下でよく繁殖するユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを、短期間で検出する必要がある場合などに好適に利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化したことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項２】
配列番号３に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号２に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、ユーロチウム属のカビを検出する
ことを特徴とする請求項１記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項３】
配列番号７に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号６に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号８に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビを検出する
ことを特徴とする請求項１又は２記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項４】
配列番号５に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビを検出する
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項５】
ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビを検出するための、以下の（１）〜（３）のいずれかのプローブを固定化した、及び／又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための、以下の（４）〜（６）のいずれかのプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
（１）配列番号１〜３に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２）配列番号１〜３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（４）配列番号４〜９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（５）配列番号４〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（６）（４）又は（５）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項６】
配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸が増幅され、
前記試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項７】
前記プライマー対が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項６載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
（Ａ）配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
（Ｂ）配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。
【請求項８】
前記ＰＣＲ反応液が、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有することを特徴とする請求項６又は７記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項９】
ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビ、又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイに、
配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化し、
配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸を増幅し、
前記試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
ことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲ反応液に、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有させることを特徴とする請求項９記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
【請求項１１】
ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビを検出するための、以下の（１）〜（３）のいずれかのプローブを固定化した、及び／又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための、以下の（４）〜（６）のいずれかのプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項９又は１０記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
（１）配列番号１〜３に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２）配列番号１〜３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（４）配列番号４〜９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（５）配列番号４〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（６）（４）又は（５）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項１２】
前記プライマー対が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
（Ａ）配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
（Ｂ）配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。
【請求項１】
配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化したことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項２】
配列番号３に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号２に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、ユーロチウム属のカビを検出する
ことを特徴とする請求項１記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項３】
配列番号７に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号６に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号８に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビを検出する
ことを特徴とする請求項１又は２記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項４】
配列番号５に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビを検出する
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項５】
ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビを検出するための、以下の（１）〜（３）のいずれかのプローブを固定化した、及び／又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための、以下の（４）〜（６）のいずれかのプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
（１）配列番号１〜３に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２）配列番号１〜３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（４）配列番号４〜９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（５）配列番号４〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（６）（４）又は（５）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項６】
配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸が増幅され、
前記試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項７】
前記プライマー対が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項６載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
（Ａ）配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
（Ｂ）配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。
【請求項８】
前記ＰＣＲ反応液が、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有することを特徴とする請求項６又は７記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
【請求項９】
ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビ、又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイに、
配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１〜９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化し、
配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸を増幅し、
前記試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
ことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲ反応液に、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５〜７容量％含有させることを特徴とする請求項９記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
【請求項１１】
ユーロチウム属（Eurotium spp.）のカビを検出するための、以下の（１）〜（３）のいずれかのプローブを固定化した、及び／又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種（Aspergillus penicillioides）のカビを検出するための、以下の（４）〜（６）のいずれかのプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項９又は１０記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
（１）配列番号１〜３に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２）配列番号１〜３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（４）配列番号４〜９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（５）配列番号４〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（６）（４）又は（５）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項１２】
前記プライマー対が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
（Ａ）配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
（Ｂ）配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１５５９１２（Ｐ２０１１−１５５９１２Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０５７１（Ｐ２０１０−２０５７１）
【出願日】平成２２年２月１日（２０１０．２．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）刊行物名 ：日本防菌防黴学会 第３６回年次大会 要旨集 発行者 ：日本防菌防黴学会 発行日 ：平成２１年９月１４日 （２）刊行物名 ：日本防菌防黴学会 第３６回年次大会で使用されたポスター 研究集会名 ：日本防菌防黴学会 第３６回年次大会 主催者 ：日本防菌防黴学会 開催日 ：平成２１年９月１４日〜平成２１年９月１５日
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１日（２０１０．２．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）刊行物名 ：日本防菌防黴学会 第３６回年次大会 要旨集 発行者 ：日本防菌防黴学会 発行日 ：平成２１年９月１４日 （２）刊行物名 ：日本防菌防黴学会 第３６回年次大会で使用されたポスター 研究集会名 ：日本防菌防黴学会 第３６回年次大会 主催者 ：日本防菌防黴学会 開催日 ：平成２１年９月１４日〜平成２１年９月１５日
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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