特異的ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする組換えアデノウイルス
【課題】、腫瘍の遺伝子治療方法を提供する。
【解決手段】細胞中でのヨウ素の蓄積を促進するためのアデノウイルスベクターを使用した、腫瘍細胞中のヨウ素特異的キャリア（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）（ＮＩＳ）をコードする遺伝子の挿入方法。また、ｎｉｓ遺伝子を含む複製用の欠陥組換えアデノウイルスならびに腫瘍細胞へのｎｉｓ遺伝子の導入と代謝放射線治療法とを組み合わせた癌治療法におけるベクターの使用方法。
【解決手段】細胞中でのヨウ素の蓄積を促進するためのアデノウイルスベクターを使用した、腫瘍細胞中のヨウ素特異的キャリア（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）（ＮＩＳ）をコードする遺伝子の挿入方法。また、ｎｉｓ遺伝子を含む複製用の欠陥組換えアデノウイルスならびに腫瘍細胞へのｎｉｓ遺伝子の導入と代謝放射線治療法とを組み合わせた癌治療法におけるベクターの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の遺伝子療法および治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞中へのヨウ素の蓄積を促進するためのアデノウイルスベクターによる腫瘍細胞への特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）をコードする遺伝子の移入に関する。本発明はまた、ｎｉｓ遺伝子を含む複製欠陥組換えアデノウイルスおよび腫瘍細胞へのｎｉｓ遺伝子の導入とヨウ素１３１での代謝放射線治療法とを組み合わせた癌治療法でのこれらのベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨウ素１３１は、５０年以上分化型甲状腺癌の治療に使用されてきた。その治療効果は、腫瘍組織に照射された放射線量に関連する。例えば、転移の場合、ヨウ素１３１での治療後の腫瘍反応は、腫瘍組織に送達した放射線量が８０グレイを超えた場合に認められるが、３５グレイ未満の線量では腫瘍反応レベルは低いかゼロである（Ｍａｘｏｎ、ＮＥＪＭ、３０９、９３７〜９４１、１９８３）。一般に、腫瘍体積の治療または減少に必要な全線量はその放射線感受性にしたがって４０グレイと６０グレイとの間で変化することを評価可能である。分化型甲状腺癌の固定化した転移の治療の間で行われるように、この全線量を、ヨウ素１３１を使用したいくつかの治療で送達させることができる。
【０００３】
腫瘍組織に送達される放射線量は、２つの生物学的因子（腫瘍組織中のヨウ素１３１の有効半減期（Ｔｅｆｆ）および放射能濃度）に依存する。
【０００４】
腫瘍組織中のヨウ素１３１の有効半減期（Ｔｅｆｆ）は、関連式Ｉ／Ｔｅｆｆ＝Ｉ／Ｔｂｉｏｌ＋Ｉ／Ｔｐｈｙｓによる生物学的半減期（Ｔｂｉｏｌ）および物理的半減期（Ｔｐｈｙｓ）に依存する。固定細胞中のヨウ素１３１の生物学的半減期（Ｔｂｉｏｌ）は、ヨウ素の有機化能力に依存する。例えば非甲状腺細胞のように、有機化しない場合は、生物学的半減期は短く、数時間〜数十時間である。ヨウ素１３１の物理的半減期（Ｔｐｈｙｓ）は、８．０２日である。したがって、腫瘍組織中のヨウ素１３１の有効半減期は数時間〜数十時間であることを単に評価可能である。
【０００５】
放射能濃度は、腫瘍組織によるヨウ素１３１の全固定とこの組織との間の比である。
【０００６】
例として、１ｇの組織あたりに投与された０．１％の活性のヨウ素固定および１．５日の有効半減期では、３．７ギガベクレル（すなわち１００ｍＣｉ）の投与により、腫瘍組織への３０グレイの線量が送達されると評価可能である。
【０００７】
ヨウ素１３１の全固定は、一方では患者に投与されたヨウ素１３１の活性に依存し、一方ではヨウ素１３１を濃縮する腫瘍組織の能力に依存するパラメータである。
【０００８】
患者に投与することができるヨウ素１３１の最大活性は、健常な組織、特に骨髄に送達する放射線量に起因するヨウ素１３１のヨウ素毒性によって制限される。したがって、甲状腺癌の場合、甲状腺機能低下症の患者に投与される治療活性量は、一般に３．７ＧＢｑと１０ＧＢｑ（１００〜３００ｍＣｉ）との間である。ヨウ素の保持が甲状腺機能低下症で認められた活性量の半分であるので、甲状腺機能正常患者に投与することができる最大活性量はより多くなり、８．５と２２．２ＧＢｑとの間の値（５００〜６００ｍＣｉ）に達する。
【０００９】
患者に投与された所与の活性量についての正常な組織のヨウ素１３１の濃縮能力は、ヨウ素共輸送体の発現レベルおよびその生物活性に依存する。これは、正常および罹患ヒト甲状腺組織の研究およびＮＩＳ活性のインビトロ研究によって証明された。ヨウ素１３１の比活性は高いが、投与されたヨウ素１３１の活性の増加に伴う飽和減少は認められなかった。
【００１０】
患者に投与することができるヨウ素１３１の最大活性の制限のために、ヨウ素１３１の全固定を増加させるためにヨウ素１３１を濃縮する腫瘍組織の能力を増加させることができることが望ましい。
【００１１】
腫瘍組織中でヨウ素固定が均一に増加することも重要である。実際、固定組織中のヨウ素の固定は、細胞間で、または腫瘍間で非常に不均一であり得る。腫瘍組織中の放射線量は、本質的にはヨウ素１３１のβ放射によって送達される。しかし、生体組織中のその経路は、せいぜい２〜３ｍｍである。さらに、局在部周囲では、放射線量は距離ごとに指数関数的に減少していく。この元素は、固定腫瘍領域中の高い放射能濃度を達成する重要性を強化し、一方で、可能な限り均一にヨウ素が固定される必要がある。
【００１２】
ヒト甲状腺によるヨウ素１３１の固定およびそれによる照射を、１μｇ／ｋｇ／日のＬ−トリヨードチロニンを１日３回にわけて３週間投与することによって容易に抑制する（ヨウ素１３１の測定不可能な固定）ことができることに留意すべきである。
【００１３】
ＮＩＳ輸送体は、甲状腺細胞による循環ヨウ素（ヨウ素Ｉ−の形態）の濃縮を担う（概説として、Ｐ．Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍｅｄｅｃｉｎｅ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、１０、８２５〜８２８を参照のこと）。これらの細胞中のヨウ素濃縮は、以下の特徴を示す：ヨウ素は電気化学勾配に対して３０〜４０倍の因子によって濃縮されること；ナトリウム（Ｎａ＋）が存在する必要があること；能動輸送に関連すること；一定の陰イオン（チオシアン酸塩、過塩素酸塩、過テクネチウム酸塩など）によって競合的に阻害されること。甲状腺細胞によるヨウ素の濃縮後、ヨウ素が有機化し、ヨードチロシンおよびチロイドホルモン（チロキシンＴ４およびトリヨードチロニンＴ３）が合成される。
【００１４】
ＮＩＳヨウ素のマウス輸送体（Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、４５８〜４６０、１９９６）およびヒト輸送体（Ｓｍａｎｉｋ Ｐ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２６、３３９〜３４５、１９９６）をコードする遺伝子が単離されており、これらは８４％同一である。この遺伝子は、ヒト種では染色体１９ｐ上に存在する。これは１４個のイントロンで分離された１５個のエクソンを含む。その転写によって、選択的スプライシングによる２つの形態が得られるが、そのうち甲状腺では長い方の形態が主である。そのタンパク質の分子量は５５ｋＤａであり、グリコシル化後８０ｋＤａに達する。これは甲状腺細胞の外側の基底膜に存在する。そのアミノ末端およびカルボキシ末端は細胞内である一方で、ペプチド鎖の残部は、細胞内および細胞外ループによって連結された１３個の膜貫通セグメントを含む（Ｌｅｖｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２２６５７〜２２６６３）。ＮＩＳをコードする遺伝子の非甲状腺細胞への移入により、非甲状腺細胞の甲状腺細胞と同一の性質であるヨウ捕獲能力（ナトリウム（Ｎａ＋）の存在が必要であることおよび過塩素酸塩陰イオンによる阻害）が付与される。
【００１５】
ｎｉｓ遺伝子の転写は、ＴＳＨによって甲状腺細胞中で活性化される。この効果は、サイクリックＡＭＰによって媒介される。マウス甲状腺細胞中でのタンパク質の半減期は４日間である（Ｐａｉｒｅ Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１８２４５〜１８２４９、１９９７）。甲状腺外組織では、遺伝子の活性は、基底状態での甲状腺のそれよりも低い。これは、おそらく甲状腺ｎｉｓ遺伝子のプロモーターへ結合することができるが、他の組織のプロモーターに結合しない特異的転写因子ＴＴＦ−１（甲状腺転写因子１）による甲状腺細胞中のｎｉｓ遺伝子の転写の刺激による（Ｅｎｄｏ Ｔ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１、１７４７〜１７５５、１９９７）。甲状腺以外に、一定の組織（特に唾液腺および胃粘膜）がヨウ素を捕獲および濃縮することができる。
【００１６】
最近の研究により、ヒトまたはマウス腫瘍細胞へのレトロウイルスによるｎｉｓ遺伝子の導入が報告されている（Ｍａｎｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９、６６１〜６６８、１９９９）。これらの結果は、これらの細胞が非甲状腺細胞中でｎｉｓ遺伝子を発現し、天然ではヨウ素を蓄積しない細胞中でのヨウ素の濃縮が認められるという点で興味深い。しかし、治療への適用を考慮するためのヨウ素の十分な固定レベルを達成するためには克服すべき多数の制限要因が残されている。
【００１７】
第１の要因は、腫瘍細胞中でのｎｉｓ遺伝子発現レベルの低さである。例えば、上記の研究では、インビトロで得られた結果は、非甲状腺細胞で達成されたヨウ素の濃縮が甲状腺細胞中で蓄積されたヨウ素濃度の１／２のままであることが示されている。
【００１８】
さらに、腫瘍細胞が膜レベルで示される大量の破壊を考慮すると、非腫瘍性甲状腺細胞に匹敵する効率を有する輸送体の機能的取り込みを確保するのは困難なようであう。
【００１９】
別の制限要因は、非甲状腺細胞中でヨウ素が有機化しないことである。しかし、このヨウ素の有機化は細胞中でのヨウ素の維持に必要な構成要素である。したがって、上記で報告の研究では、非甲状腺細胞におけるインビトロで蓄積されたヨウ素の非常に急速な流出（３０分と６０分との間）が認められる。
【００２０】
最後に、腫瘍細胞の不均一性および膜レベルでのこれらの細胞の広範な改変を考慮すると、腫瘍細胞膜中のＮＩＳ輸送体の均一な分配を達成することは困難なようであう。
【００２１】
したがって、現在記載されているアプローチでは、非甲状腺腫瘍治療用のヨウ素１３１の使用を考慮するのに十分な発現レベルで非甲状腺腫瘍中にヨウ素を蓄積させることは未だ不可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｍａｘｏｎ、ＮＥＪＭ、３０９、９３７〜９４１、１９８３
【非特許文献２】Ｐ．Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍｅｄｅｃｉｎｅ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、１０、８２５〜８２８
【非特許文献３】Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、４５８〜４６０、１９９６
【非特許文献４】Ｓｍａｎｉｋ Ｐ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２６、３３９〜３４５、１９９６
【非特許文献５】Ｌｅｖｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２２６５７〜２２６６３
【非特許文献６】Ｐａｉｒｅ Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１８２４５〜１８２４９、１９９７
【非特許文献７】Ｅｎｄｏ Ｔ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１、１７４７〜１７５５、１９９７
【非特許文献８】Ｍａｎｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９、６６１〜６６８、１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、遺伝子治療とヨウ素１３１を使用した放射線治療とを組み合わせた腫瘍の改良された治療法を提供する。
【００２４】
本発明は、特に、非甲状腺腫瘍レベルでのヨウ素の固定効率の増大を可能にし、それにより、甲状腺癌治療用に首尾よく開発された放射線治療の原理を非甲状腺腫瘍に適用可能な方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、欠陥組換えアデノウイルスによる特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードする遺伝子の導入により、非甲状腺腫瘍細胞中のヨウ素の非常に高い蓄積が可能となるという証明に基づく。特定の実施形態では、ｎｉｓ遺伝子を発現する欠陥アデノウイルスの供給により甲状腺細胞で認められる濃度の約５倍の濃度でヨウ素を蓄積可能である。この驚くべき非甲状腺腫瘍細胞のヨウ素１２５の蓄積能力により、今まで一定の甲状腺腫瘍の治療に限定されていたヨウ素１３１を使用した代謝放射線治療に基づくこの型の腫瘍の新規の治療アプローチを考慮可能である。
【００２６】
代謝放射線治療の主な利点は、周辺組織に有意に照射することなく固定した大放射線量の放射性同位元素を組織に送達させることである。
【００２７】
通常はヨウ素を蓄積不可能な腫瘍細胞中に実質的にヨウ素を濃縮させることが有効に可能であるという発見により、非甲状腺起源の腫瘍治療用の多数の適応症においてこの方法の適用を考慮可能である。より詳細には、以下の２つの適応症の型が考慮される：その位置により外部からの放射線治療ではほとんどアクセス不可能な腫瘍（例として、手術不可能な前立腺癌または大脳内腫瘍）、既に照射されており、最大線量が既に投与されているので更なる外部からの放射線治療が不可能な腫瘍（これは、照射領域で発症するか再発する全ての癌に関する）。この方法はまた、ヨウ素捕獲能力を喪失し、代謝治療に反応しない甲状腺腫瘍の治療に適用可能である。
【００２８】
分化型甲状腺癌の転移の場合に行われる代謝放射線治療と外部放射線治療との組み合わせも考慮可能である。この組み合わせにより、毒性を増加させることなく放射線治療の治療有効性を増大可能である。この組み合わせは、特に、放射線治療にあまり感受性を示さない腫瘍に有利なようである。さらに、過度に巨大なサイズのために代謝放射線治療でアクセス不可能な腫瘍へのこの技術の適用を考慮可能である。
【００２９】
したがって、本発明の第１の目的は、特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳまたはその誘導体をコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列を含む欠陥組換えアデノウイルスにある。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の目的では、特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳの表現「誘導体」は、ＮＩＳポリペプチドに由来し、特異的ヨウ素輸送活性を保持する任意のアナログ、フラグメント、または変異形態を意味すると理解される。種々の誘導体は、天然の状態で存在し得る。これらの誘導体は、ＮＩＳをコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の相違によって特徴づけられる対立遺伝子であるか特異的スプライシングまたは翻訳後修飾に起因し得る。これらの誘導体を、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、付加、および／または修飾によって得ることができる。これらの修飾を、当業者に公知の任意の技術によって行うことができる。これらの誘導体は、特に、その基質に高い親和性を有する分子、インビボでの改良された発現が可能な配列、プロテアーゼに対してより高い耐性を示す分子、生物学的有効性がより高いか副作用が低いか、おそらく新規の生物学的性質を有する分子である。本発明の文脈で使用することができる他の誘導体は、特に、１つまたは複数の残基が置換された分子、望ましくない活性が考慮されるか発現される結合部位との相互作用に関連しないかあまり関連しない領域の欠失によって得られた誘導体、および天然の配列に関する更なる残基（例えば、分泌シグナルおよび／または結合ペプチドなど）を含む誘導体である。
【００３１】
本発明の文脈で産生される特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳまたはその誘導体は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、または例えば１つまたは複数のイントロンが挿入されたｃＤＮＡからなるハイブリッド構築物であり得る。これには、合成または半合成配列も含み得る。有利には、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡが使用される。特に、ｇＤＮＡの使用によりヒト細胞でのより良好な発現が可能である。
【００３２】
第１の実施形態によれば、これは、マウス起源の特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードするｃＤＮＡ配列である。本発明の好ましい実施形態によれば、これは、ヒト起源の特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードするｃＤＮＡ配列である。
【００３３】
本発明の文脈で使用されるアデノウイルスは、組換えアデノウイルス（すなわち、異種ＤＮＡ配列を含む）である。有利には、これらは、欠陥組換えアデノウイルス（すなわち、標的細胞中で自律複製不可能なアデノウイルス）である。
【００３４】
本発明のアデノウイルスの構築には、種々の血清型を使用することができる。実際に多数の抗原型が存在し、その構造および性質はいくらか異なるが、類似の遺伝子構成を示す。より詳細には、組換えアデノウイルスは、ヒト起源であっても動物起源であってもよい。ヒト起源のアデノウイルスに関して、好ましくはＣ群（特に、アデノウイルス２型（Ａｄ２）、５型（Ａｄ５）、７型（Ａｄ７）、または１２型（Ａｄ１２））に分類され得る。動物起源の種々のアデノウイルスのうち、好ましくは、イヌ起源のアデノウイルス（特に、全てのＣＡＶ２アデノウイルス株（例えば、マンハッタン株またはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）））であり得る。動物起源の他のアデノウイルスは、特に、ＷＯ ９４／２６９１４に引用されている。
【００３５】
アデノウイルスゲノムは、特に、各末端の逆末端反復配列（ＩＴＲ）、キャプシド形成配列（Ｐｓｉ）、初期遺伝子、および後期遺伝子を含む。主な初期遺伝子は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域中に含まれる。これらのうち、Ｅ１領域に含まれる遺伝子は、特に、ウイルス増殖に必要である。主な後期遺伝子は、Ｌ１〜Ｌ５領域に含まれる。Ａｄ５アデノウイルスゲノムは完全に配列決定されており、データベースでアクセス可能である（特に、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ７３２６０を参照のこと）。同様に、他のアデノウイルスゲノムの一部またはさらに全部（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２など）も配列決定されている。
【００３６】
上記のように、本発明のアデノウイルスは欠陥であるので、標的細胞中で自律複製不可能である。この効果により、アデノウイルス由来の種々の構築物が調製され、種々の治療遺伝子に組み込まれている。これらの各構築物では、感染細胞中で複製不可能なようにアデノウイルスを改変されていた。したがって、先行技術に記載の構築物は、ウイルス増殖に必須のＥ１領域が欠失され、異種ＤＮＡ配列が挿入されたアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ、１０１、１９９１、１９５、Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、Ｇｅｎｅ、５０、１９８６、１６１）。さらに、ベクターの性質を改良するために、アデノウイルスゲノム中に他の欠失または改変を作製することが提案されている。したがって、熱感受性点変異をｔｓ１２５変異体に移入して、７２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を不活化させることができる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９７５、１５、２、３４８〜３５４）。他のベクターは、ウイルスの複製および／または増殖に必須の別の領域（Ｅ４領域）の欠失を含む。Ｅ４領域は、実際に、後期遺伝子の発現の調製、後期核ＲＮＡの安定性、宿主細胞タンパク質の発現の消滅、およびウイルスＤＮＡの複製効率に関連する。したがって、Ｅ１およびＥ４領域が欠失したアデノウイルスベクターは、転写バックグラウンドノイズを有し、且つウイルス遺伝子発現が非常に減少している。このようなベクターは、例えば、ＷＯ ９４／２８１５２に記載されている。さらに、ＩＶａ２遺伝子が改変されたベクターも記載されている（ＷＯ ９６／１００８）。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｃ型ヒトアデノウイルスである。より詳細には、これはＡｄ２またはＡｄ５アデノウイルスである。
【００３８】
有利には、本発明の文脈で使用される組換えアデノウイルスは、そのゲノムのＥ１領域が欠失している。さらにより詳細には、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失している。例としては、影響を与えるヌクレオチド４５４〜３３２８、３８６〜３４４６、４５９〜３５１０、または３５７〜４０２０（Ａｄ５のゲノムを基準とする）の欠失であり得る。
【００３９】
別の変形形態では、本発明の文脈で使用される組換えアデノウイルスは、少なくともＥ１およびＥ３領域の全てまたは一部が欠失している。
【００４０】
別の変形形態では、本発明の文脈で使用される組換えアデノウイルスは、Ｅ１領域の欠失に加えて、そのゲノム中のＥ４領域の影響を与える全てまたは一部が欠失している。より詳細には、Ｅ４領域の欠失は、全ての読み取り枠に影響を与える。詳細な例としては、出願ＷＯ ９５／０２６９７およびＷＯ ９６／２２３７８に記載のＥ４領域の３３４６６〜３５５３５もしくは３３０９３〜３５５３５または一部のみの欠失であり得る。
【００４１】
例えば、いわゆる第３世代組換えアデノウイルス（すなわち、Ｅ１およびＥ４領域が全体または部分的に欠失しており、任意選択的にＥ３領域が欠失している）であり得る。本発明の特定の変形形態は、以下の領域の全てまたは一部に影響を与える欠失を有するアデノウイルスの使用からなる：
−Ｅ１、Ｅ４、およびＥ３、
−Ｅ１、Ｅ４、およびＥ２、
−Ｅ１、Ｅ４、Ｅ２、およびＥ３、
−上記の領域ならびに後期アデノウイルス機能（Ｌ１〜Ｌ６）をコードする遺伝子の全部または一部、
−全てのコードウイルス領域。
【００４２】
後期機能（「最小」ベクター）または全てのコード領域（「ガットレス」ベクター）をさらに欠くアデノウイルスに関して、その構築物は、例えば、Ｐａｒｋｓら、ＰＮＡＳ、９３、１９９６、１３５６５およびＬｉｅｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１９９６、８９４４に記載されている。
【００４３】
これには、ハイブリッドアデノウイルスベクター（出願ＷＯ ９９／６０１４４に記載のものなど）も含んでもよく、このアデノウイルスは別のウイルス用のベクター（特に、レトロウイルスベクター）として使用される。
【００４４】
ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含む発現カセットを、組換えゲノムの別の部位に挿入することができる。これを、欠失配列の代わりまたは付加的にＥ１、Ｅ３、またはＥ４領域に挿入することができる。これを、ｃｉｓ中のウイルス産生に必要な配列（ＩＴＲ配列およびキャプシド形成配列）の外側の任意の他の部位に挿入することもできる。
【００４５】
本発明の目的のために、核酸の、表現「発現カセット」は、ベクターの特異的制限部位に挿入することができるＤＮＡフラグメントを意味すると理解される。このＤＮＡフラグメントは、目的のＲＮＡまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて、目的の配列の発現に必要な配列（エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化配列など）を含む。転写および／または翻訳用の適切な読み枠への前記フラグメントの挿入を確保するようにＤＮＡフラグメントおよび制限部位を設計する。
【００４６】
組換えアデノウイルスを、キャプシド形成株（すなわち、組換えアデノウイルスゲノム中の１つまたは複数の欠陥機能をトランスで補足することができる細胞株）産生させる。当業者に公知のキャプシド形成株のうち、例としては、アデノウイルスゲノムの一部が取り込まれた２９３株であり得る。より詳細には、２９３株は、左側のＩＴＲ、キャプシド形成領域、Ｅ１領域（Ｅ１ａおよびＥ１ｂを含む）、ｐＩＸタンパク質コード領域、およびｐＩＶａ２タンパク質コード領域の一部を含む血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）ゲノムの左側の末端（１１〜１２％）を含むヒト胚腎臓細胞株である。この株は、Ｅ１領域を欠く（すなわち、Ｅ１領域の全てまたは一部を欠く）組換えアデノウイルスをトランスで補足することができ、高力価のウイルスストックを産生することができる。この株はまた、許容温度（３２℃）で熱感受性Ｅ２変異をさらに含むウイルスストックを産生することができる。特に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９（ＷＯ ９４／２８１５２）またはヒト網膜芽細胞（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２１５）に基づいて、Ｅ１領域を補足することができる他の細胞株が記載されている。さらに、いくつかのアデノウイルス機能をトランスで補足することができる株が記載されている。特に、Ｅ１およびＥ４領域を補足する株（Ｙｅｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１９９６、５５９〜５６５、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．、２、１９９５、３２２、Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．、６、１９９５、１５７５）ならびにＥ１およびＥ２領域を補足する株（ＷＯ ９４／２８１５２、ＷＯ ９５／０２６９７、ＷＯ ９５／２７０７１）または特にこのようなウイルスの構築に関連する部位特異的リコンビナーゼ活性をさらに発現することにより最小アデノウイルスの産生に使用することができるそれら由来の株であり得る。
【００４７】
腫瘍レベルでの感染効率を増加させるために、組換えアデノウイルスのキャプシド構造を改変することもできる。例えば、キャプシドは、腫瘍細胞へのアデノウイルスの標的化を可能にするｕＰＡＲリガンドまたはＲＧＤモチーフを含むことができ、このようなベクターおよび標的配列は、特に出願ＷＯ ００／１２７３８に記載されている。標的配列を、ヘキソンタンパク質または繊維タンパク質に挿入することができる。好ましくは、繊維タンパク質またはヘキソンタンパク質の欠失レベルで標的配列を挿入する。有利には、Ａｄ５のヘキソンのポリペプチド配列２７９〜２９２に対応するヘキソン１３アミノ酸のポリペプチド配列から欠失する。有利には、Ａｄ５の繊維（ＨＩループ）のポリペプチド配列５３９〜５４７に対応する繊維１１アミノ酸のポリペプチド配列から欠失する。
【００４８】
組換えアデノウイルスは、通常、キャプシド形株へのウイルスＤＮＡの移入から約２〜３日後（アデノウイルスのサイクル速度は２４〜３６時間である）に細胞を溶解することによって産生される。この方法を実行するために、移入されたウイルスＤＮＡは、細胞に感染する、任意選択的に細菌（ＷＯ ９６／２５５０６）または酵母（ＷＯ ９５／０３４００）中で構築された完全な組換えウイルスゲノムであり得る。これはまた、キャプシド形成株の感染に使用される組換えウイルスであり得る。ウイルスＤＮＡを、それぞれ組換えウイルスゲノムの一部およびキャプシド形成細胞への移入後に種々のフラグメント間での相同組換えによって組換えウイルスを再構成可能な相同領域を有するフラグメント形態に挿入することもできる。
【００４９】
細胞溶解後、組換えウイルス粒子を、塩化セシウム勾配遠心分離またはクロマトグラフィーなどの任意の公知の技術によって単離することができる。別の方法は、出願ＷＯ ９８／００５２８に記載されている。
【００５０】
発現調節配列。特異的ヨウ素キャリア（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体、ＮＩＳ）をコードする遺伝子を、機能的で宿主腫瘍細胞での発現を可能にする発現を調節する任意の配列（例えば、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーなど）の調節下に置くことができる。
【００５１】
発現調節配列は、プロモーター領域に加えて、特異的ヨウ素輸送体をコードする遺伝子の３’に存在し、且つ転写終結シグナルおよびポリアデニル化部位が得られる領域を含む。これら全てのエレメントが発現カセットを構成する。
【００５２】
プロモーターは、構成性プロモーターであっても調節（誘導）プロモーターであってもよい。これは、実際の遺伝子プロモーターであり得る。これはまた、異なる起源（他のタンパク質の発現を担うか合成プロモーター）の配列を含み得る。特に、これは、真核生物またはウイルス遺伝子のプロモーター配列を含み得る。例えば、これは、トランスフェクトが望まれる細胞のゲノム由来のプロモーター配列を含み得る。同様に、これは、ウイルスゲノム（使用されるウイルスを含む）由来のプロモーター配列を含み得る。これに関して、例として、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶ−ＬＴＲ、ＭＴ−１、ＳＶ４０などのプロモーターであり得る。
【００５３】
さらに、これらの発現配列を、一定の組織中で組織特異的または主に発現可能な活性化配列または調節配列（エノラーゼプロモーターＧＦＡＰなど）の付加によって改変することができる。実際、ウイルスが腫瘍細胞に有効に感染した場合のみ、治療遺伝子がその効果を発現または産生するように腫瘍細胞中で特異的または主に活性である発現シグナルを使用することが特に有利であり得る。発現の特異的または主な特徴とは、プロモーター活性が腫瘍細胞中で有意により高いことを意味する。非特異的発現が他の細胞に存在し得るにもかかわらず、対応する活性レベルは、一般に腫瘍細胞中で認められるものよりも非常に低く（無視できるほど）、一般に少なくとも１／１０ほどである。
【００５４】
本発明の文脈で使用することができるプロモーターのうちでは、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、αアクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメントのプロモーター（デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療目的の遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子など）、組織特異的プロモーター（デシン、ミオシン、クレアチンキナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター）、増殖中の細胞でより特異的に活性なプロモーターまたは刺激に対応するプロモーター（天然のホルモン（ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸レセプターなど）に対応するプロモーターなど）、抗生物質（テトラサイクリン、ラパマイシンなど）によって調節されるプロモーター、天然または合成起源の他の分子に対応する他のプロモーター、またはウイルスゲノム由来のプロモーター配列（サイトメガロウイルスＣＭＶエンハンサー／プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子プロモーター、ＭＬＰプロモーター）であり得る。テトラサイクリンによって調節することができるプロモーターおよびＣＭＶプロモーターは、ＷＯ ９６／０１３１３、米国特許第５，１６８，０６２号、および同第５，３８５，８３９号に記載されている。
【００５５】
本発明の実施に使用することができるプロモーターのうちでは、特に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルス３’ＬＴＲ領域に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ、２２、７８７〜７９７）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８、１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、３９〜４２）、原核生物起源のプロモーター（βラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５、３７２７〜３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、２１〜２５）など（「組換え細菌由来の有用なタンパク質」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２、７４〜９４もまた参照のこと））、酵母プロモーター（Ｇａｌ４、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）、およびアルカリ性ホスファターゼなど）、および組織特異性を示し且つトランスジェニック動物に使用される以下の動物起源の転写緒節配列：膵臓の腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子の調節配列（Ｓｗｉｆｔ、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８、６３９〜６４６、Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５０、３９９〜４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、７、４２５〜５１５）、膵臓のβ細胞中で活性な遺伝子［ｌａｃｕｎａ］インスリン調節配列（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１５、１１５〜１２２）、リンパ球様細胞中で活性な免疫グロブリンの発現を調節する配列（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８、６４７〜６５８、Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１８、５３３〜５３８、Ａｌｅｘｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７、１４３６〜１４４４）、精巣細胞および乳房細胞、リンパ球および肥満細胞中で活性なマウス乳腺癌ウイルスの調節配列（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４５、４８５〜４９５）、前立腺癌中で活性なＰＳＡ遺伝子の調節配列、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子の調節配列（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、１、２６８〜２７６）、肝臓中で活性なαフェトプロテインの調節配列（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、１６３９〜１６４８、Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、５３〜５８）、肝臓中で活性なα１抗トリプシン遺伝子の調節配列（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、１、１６１〜１７１）、骨髄性細胞中で活性なβグロビン遺伝子の調節配列（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１５、３３８〜３４０、Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４６、８９〜９４）、脳の希突起膠細胞中で活性な塩基性ミエリン遺伝子の調節配列（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ、４８、７０３〜７１２）、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖２遺伝子の調節配列（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、２８３〜２８６）、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子の調節配列（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４、１３７２〜１３７８）であり得る。
【００５６】
本発明の特定の実施形態では、好ましくはＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるウイルスプロモーターの調節下で特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードする遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスを使用する。
【００５７】
本発明のベクターへのＮＩＳ遺伝子の移入とヨウ素１３１の生物学的半減期を増加可能な生物系への移入とを組み合わせることも可能である。したがって、ＮＩＳ遺伝子およびヨウ素有機化機構に関連するポリペプチドをコードする１つの遺伝子またはいくつかの遺伝子を腫瘍細胞に同時または首尾よく導入可能である。例えば、グルコースオキシダーゼをコードする遺伝子などのペルオキシダーゼ系に関連するポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。また、ヨウ素有機化過程に関連する甲状腺細胞中の酵素である甲状腺ペルオキシダーゼをコードする遺伝子（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５、６７３５〜６７３５、１９８７、配列ＧｅｎＢａｎｋ ｇ３７２５１）であり得る。甲状腺ペルオキシダーゼをコードする遺伝子の移入を、サイログロブリンの全てまたは一部（チロシン残基が豊富なサイログロブリン部分）をコードする核酸配列の移入と組み合わせることができる。
【００５８】
いくつかの導入遺伝子を発現する１つのベクター、２つのベクターの同時感染、ＮＩＳ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターおよび別のベクター、ウイルスもしくはプラスミドベクター、ヨウ素有機化機構に関連するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を発現するウイルスまたはプラスミドベクターによる腫瘍細胞へのＮＩＳ遺伝子およびヨウ素有機化機構に関連するポリペプチドをコードする１つの遺伝子またはいくつかの遺伝子の送達も考慮可能である。
【００５９】
さらに、本発明のベクターへのＮＩＳ遺伝子の移入と薬物（例えば、リチウム塩）によってヨウ素流出の抑制させる系の投与とを組み合わせ可能である。
【００６０】
別の変形形態では、ＮＩＳ遺伝子の移入と癌治療用の目的の治療遺伝子との組み合わせも考慮可能である。これには、ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子またはシトシンデアミナーゼ遺伝子などの自殺遺伝子を含み得る。これには、アポトーシスを誘導する遺伝子（ｐ５３、Ｂａｘ、ＢｃｌＸ−ｓ、Ｂａｄ、またはＢｃ１２およびＢｃｌＸ−１の任意の他のアンタゴニストなど）を含み得る。これには、改良された性質を示すこれらのタンパク質変異型（ｐ５３の変異型）（ＣＴＳ−１、ＷＯ ９７／０４０９２）をコードする遺伝子を含み得る。これにはまた、抗血管形成または血管形成阻害因子（特に、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２のリガンド、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＡＴＦ因子、プラスミノゲン誘導体、エンドセリン、トロンボスポンジン１および２、ＰＦ−４、インターフェロンαおよびβ、インターロイキン１２、ＴＮＦα、ウロキナーゼレセプター、ｆｌｔ１、ＫＤＲ、ＰＡＩ１、ＰＡＩ２、ＴＩＭＰ１、プロラクチンフラグメント）をコードする遺伝子を含み得る。これはまた、抗腫用免疫を誘導するか免疫応答を刺激することができるタンパク質（ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１２など）をコードする遺伝子を含み得る。癌治療目的のタンパク質をコードする遺伝子のうちで、抗体、抗体一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）のフラグメント、または腫瘍治療の免疫療法用の認識能力を有する任意の他の抗体フラグメント（抗ＲＡＳ抗体（ＷＯ ９４２９４４６））を強調することも重要である。
【００６１】
有利には、これには、その発現により腫瘍細胞が放射線増感される遺伝子（ｐ５３遺伝子）を含み得る。
【００６２】
ＮＩＳ輸送体をコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクターまたはウイルスまたは非ウイルス性の個別のベクターへの１つまたは複数のこれらの遺伝子移入によって、治療目的のこれらの遺伝子または上記の２つまたはそれ以上のこれらの遺伝子の組み合わせの投与を行うことができる。
【００６３】
別の変形形態では、本発明のベクターを、抗癌剤（特に、タキソール、タキソテール、および他のタキソイドなど（特に、米国特許第４，８５７，６５３号、同第４，８１４，４７０号、同第４，９２４，０１１号、同第５，２９０，９５７号、同第５，２９２，９２１号、同第５，４３８，０７２号、同第５，５８７，４９３号、欧州特許第０２５３７３８号、およびＷＯ ９１・１７９７６、ＷＯ ９３／００９２８、ＷＯ ９３／００９２９、およびＷＯ ９６０１８１５に記載されている））または他の治療用抗癌剤（シスプラチンおよび白金誘導体、エトポシドおよびリン酸エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ＣＣＮＵ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、イホスファミドなど）と組み合わせて投与することができる。
【００６４】
本発明はまた、上記のアデノウイルスベクターおよび生理学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は注射形態が好ましく、腫瘍内投与用または、経口、非経口、鼻腔内、動脈内、静脈内、または気管内経路などの投与用に処方することができる。
【００６５】
好ましくは、薬学的組成物は、腫瘍内経路による投与を意図した処方用の薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００６６】
本発明の組成物は、適用の考慮および種々のパラメータ、特に使用した投与様式または所望の発現の持続時間による当業者が容易に調整することができる種々の用量の組換えアデノウイルスを含み得る。一般に、本発明の組換えウイルスを、１０４と１０１４ｐｆｕとの間、好ましくは１０６と１０１１ｐｆｕとの間の用量の形態で処方して投与する。用語「ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）」は、ウイルスの感染力に対応し、適切な細胞培養物への感染および感染細胞プラーク数の計数によって同定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の同定技術は、文献に十分に記載されている。
【００６７】
さらに、本発明の組成物はまた、化学導入剤または生物導入剤を含み得る。要路「化学導入剤または生物導入剤」は、細胞への核酸の浸透を容易にする任意の化合物（すなわち、組換えウイルス以外）を意味すると理解される。これには、陽イオン性非ウイルス薬（陽イオン性リピド、ペプチド、ポリマー（ポリエチレンイミン、ポリリジン）、ナノ粒子など）または非陽イオン性非ウイルス薬（非陽イオン性リポソーム、ポリマー、または非陽イオン性ナノ粒子など）を含み得る。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ヨウ素輸送体ＮＩＳをコードする遺伝子を含む欠陥組換えベクターを含み、これは腫瘍内投与用に処方される。有利には、本発明の組成物は、１０４と１０１５ｐｆｕとの間、好ましくは１０７と１０１２ｐｆｕとの間を含む。
【００６９】
本発明の主題はまた、ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含む組換えベクターを１つまたは複数の適合性アジュバントおよび薬学的に受容可能なアジュバントと混合することを特徴とする、腫瘍の予防、改善、および／または治療に有用な薬物の調製法である。
【００７０】
本発明はまた、ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含む欠陥組換えアデノウイルスベクターの有効量を投与する工程を包含する、哺乳動物、特にヒトの治療法に関する。
【００７１】
用語「有効量」は、ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含むアデノウイルスの投与をヨウ素１３５での代謝放射線治療と組み合わせた場合、腫瘍体積の少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％を減少させるのみに十分な量またはさらに好ましくは腫瘍を消滅させるのに十分な量を示す。
【００７２】
本発明は、腫瘍治療、より詳細には固形腫瘍の治療に関する。本発明の主題によって治療することができる固形腫瘍のうち、特に、肉腫および悪性腫瘍（例として、線維肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、ユーイング肉腫、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、腎臓、肝臓、または胆管の癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫であるが、これらに限定されない）であり得る。
【００７３】
本発明はまた、上皮組織（子宮頚管、食道、および肺の上皮など）の増殖性障害（化生および異形成）の予防および／または治療に関する。これに関して、本発明は、特に、過形成、化生、より詳細には異形成などの非新生細胞の増殖が起こる状態での腫瘍形成または癌への進行に先立つことが公知であるか疑われる病態の治療に関する（これらの異常な増殖状態についての概説は、Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌ、１９７６、Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｄｅｒｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、６８〜７９を参照のこと）。過形成は、器官の顕著な構造的または機能的変化を伴わない器官中での細胞数の増加を含む制御された細胞増殖の形態である。例えば、子宮内膜の過形成は、子宮内膜癌に先駆けて起こる。化生は、成体または完全に分化された細胞型が別の細胞型に置換される制御された細胞増殖の形態である。化生は、上皮組織または結合組織で起こり得る。異形成は、しばしば癌の早期危険信号であり、主に上皮で見出される。これは、新生細胞増殖の最も頻繁な形態であり、各細胞の一様性の喪失および細胞の構造上の配向性の喪失を含む。異形成は、典型的には、慢性的刺激作用または炎症が存在する場合に起こり、しばしば子宮頚管、気道、声帯腔、および膀胱壁に認められる。概説として、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと。
【００７４】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に記載されるが、これらは例示であり、本発明を制限しない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】プラスミドｐＡＢ１、プラスミドｐＸＬ３０４８、およびプラスミドｐＡＢ２の線図である。プラスミドｐＸＬ３０４８は、アデノウイルス５型ゲノムの左側の末端（ヌクレオチド１〜３８２）、３つの固有のクローニング部位を含むポリリンカー、およびｐＩＸ遺伝子の一部（ヌクレオチド３４４６〜４２９６）を含む。プラスミドｐＡＢ２は、ＥｃｏＲＶで先に線状化したｐＸＬ３０４８へのｐＡＢ１のＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントのクローニングに起因する。
【図２】Ｃｒｏｕｚｅｔら、ＰＮＡＳ、９４、１４１４、１９９７に記載の方法による、プラスミドｐＡＢ２およびｐＸＬ３２１５由来の二重組換えによって作製されたプラスミドｐＸＬ３２１５の産生を示す図である。プラスミドｐＸＬ３２１５は、Ｅ１およびＥ３領域が欠失されたアデノウイルス５型ゲノムを含み、且つＮＩＳ発現カセットを含む。
【図３】Ａｄ−ＮＩＳベクターで感染された（感染多重度１０）ＦＴＲＬ−５およびＳｉＨａ細胞によるヨウ素１２５の蓄積速度を示す図である。速度の結果を、数／分／１０６細胞で示す。ヨウ素接触時のウェルあたりの細胞数の判定は、２つの測定の平均である。
【図４】３０、３００、および３０００μＭの過塩素酸塩（ＮａＣｌＯ４）の存在下でのＮＩＳによるヨウ素輸送の特異的阻害を示す図である。細胞とヨウ素１２５との間の接触時間は１５分間である。
【図５Ａ】Ａｄ−ＮＩＳベクターを感染させてない腫瘍によるインビボでのヨウ素蓄積を示す図である（コントロール）。ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳がんの腫瘍細胞）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行った。次いで、Ａｄ−ＣＭＶ−ＮＩＳベクターを一定の動物に腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍、腫瘍サイズ３〜６ｍｍ）。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射する。甲状腺上、腫瘍上、腫瘍のすぐ隣にプローブを置くことによって一定の時間間隔で１０秒間計数した。結果を、時間の関数として検出された数（１０秒間の測定）として示す。
【図５Ｂ】Ａｄ−ＮＩＳベクターを感染させた腫瘍によるインビボでのヨウ素蓄積を示す図である。ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳がんの腫瘍細胞）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行った。次いで、Ａｄ−ＣＭＶ−ＮＩＳベクターを一定の動物に腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍、腫瘍サイズ３〜６ｍｍ）。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射する。甲状腺上、腫瘍上、腫瘍のすぐ隣にプローブを置くことによって一定の時間間隔で１０秒間計数した。結果を、時間の関数として検出された数（１０秒間の測定）として示す。
【図６】腫瘍をＡｄ−ＮＩＳベクターで感染させたマウスのシンチグラフィーである。ＭＣＦ−７細胞（ヒト腫瘍細胞、乳癌）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行った。次いで、Ａｄ−ＮＩＳベクターを腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍、腫瘍サイズ３〜６ｍｍ）。注射から３日後、５０μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射する。ヨウ素注射から１時間後に計数をおこなった。画像は、動物の縦断図である。
【００７６】
材料と方法
一般的な分子生物学技術
分子生物学で慣習的に使用されている方法（プラスミドＤＮＡの予備的抽出、塩化セシウム勾配によるプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、フェノールまたはフェノール−クロロホルムによるタンパク質抽出、エタノールまたはイソプロパノールによる生理食塩水培地中でのＤＮＡの沈殿、Ｅｓｘｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの形質転換など）は、当業者に周知であり、文献中に多数記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら、「分子クローニング、実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ。、１９８２、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）。
【００７７】
ライゲーションでは、ＤＮＡフラグメントをアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によってそのサイズごとに分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させて、供給者の指示に従ってＴ４ファージＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートすることができる。
【００７８】
供給者の指示に従って、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、突出した５’末端の充填を行うことができる。供給者の指示に従って、Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で、突出した３’末端の破壊を行う。Ｓ１ヌクレアーゼで調節された処理によって突出した５’末端の破壊を行う。
【００７９】
Ａｍｅｒｓｈａｍから販売されているキットを使用し、Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３、１９８５、８７４９〜８７６４が開発した方法にしたがって、合成オリゴデオキシヌクレオチドによってインビトロで指向される変異誘発を行うことができる。
【００８０】
いわゆるＰＣＲ技術（ポリメラーゼ触媒連鎖反応、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、１９８５、１３５０〜１３５４、Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、１５５、１９８７、３３５〜３５０）によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅を、供給者の指示に従って、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を使用して行うことができる。
【００８１】
ヌクレオチド配列の評価を、Ａｍｅｒｓｈａｍから販売のキットを使用し、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、１９７７、５４６３〜５４６７が開発した方法によって行うことができる。
【実施例】
【００８２】
［実施例１］特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードする遺伝子を発現する欠陥組換えアデノウイルスの構築
本実施例は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ６０２８２を参照のこと）をコードする遺伝子を保有する欠陥アデノウイルスベクターの構築を記載する。
【００８３】
ＡａｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態のラットｎｉｓ遺伝子のヌクレオチド配列７４〜２０４６を含むフラグメント（Ｄａｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、４５８〜４６０）を、プラスミドｐＣＥＰ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。ＡａｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのＡｔＩＩ部位を、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）での処理で予め平滑にし、プラスミドｐＣＥＰ−４を挿入した。得られたプラスミドをｐＡＢ１と呼ぶ。
【００８４】
プラスミドｐＡＢ１（図１）は、サイトメガロウイルスＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ヌクレオチド−５２２〜＋７２）の調節下で発現するｎｉｓ遺伝子を含み（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５、Ｃｅｌｌ、４１、５２１〜５３０）、その後ろにＳＶ４０ウイルスポリアデニル化部位（ＳＶ４０ゲノムのヌクレオチド２５３８〜２７５９、Ｇｅｎｂａｎｋ遺伝子座ＳＶ４ＣＧ）を含む。
【００８５】
（ｉ）サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターと、（ｉｉ）ｎｉｓ遺伝子のｃＤＮＡと、（ｉｉｉ）ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化部位との組み合わせを、以後ＮＩＳ発現カセットと呼ぶ。
【００８６】
次いで、上記で定義のＮＩＳ発現カセットを含むプラスミドｐＡＢ１のＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント（３７１１ｂｐ）を、ＥｃｏＲＶで予め線状化したシャトルベクターｐＸＬ３０４８にクローン化する。得られたベクターを、ｐＡＢ２と呼ぶ（図２）。プラスミドｐＸＬ３０４８は、５型アデノウイルスゲノムの左側の末端（ヌクレオチド１〜３８２）、３つの固有のクローニング部位を含むポリリンカー、およびｐＩＸ遺伝子の一部（ヌクレオチド３４４６〜４２９６）を含むプラスミドＫａｎ−ＳａｃＢ（Ｃｒｏｕｚｅｔら、ＰＮＡＳ、９４、１４１４〜１４１９、１９９７）由来のプラスミドである。
【００８７】
アデノウイルスＡｄ−ＮＩＳを、Ｃｒｏｕｚｅｔら、ＰＮＡＳ、９４、１４１４〜１４１９、１９９７に記載の方法に従って、プラスミドｐＡＢ２とプラスミドｐＸＬ３２１５との間の相同組換えによって構築した。
【００８８】
プラスミドｐＸＬ３２１５は、そのＥ１領域（ΔＥ１ ３８６〜３４４６）にＲＳＶ−ＬａｃＺカセットを含み、Ｅ３領域（ΔＥ３ ２８５９２〜３０４７０）が欠失したアデノウイルスゲノムを含む。
【００８９】
構築の原理を、図２に示す。この二重組換えによって作製されたプラスミドｐＸＬ３２１５は、Ｅ１およびＥ３領域が欠失され、ＣＮＶ−ＮＩＳ−ポリＡ ＳＶ４０発現カセットを含む５型アデノウイルスゲノムを含む。この構築物を、ＮＩＳ発現カセットの配列決定によって評価する。
【００９０】
Ａｄ−ＮＩＳアデノウイルスを、２９３株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）へのＰａｃＩで消化したｐＸＬ３２１５のＤＮＡの挿入によって作製する。次いで、得られたウイルス粒子を、この同一の株で増幅させ、産生されたウイルスストックを、二重ＣｓＣｌ勾配によって精製する。
【００９１】
次いで、ウイルス粒子を使用して、種々の腫瘍株におけるＮＩＳ遺伝子の発現を研究する。
【００９２】
［実施例２］Ａｄ−ＮＩＳベクター感染腫瘍細胞によるインビトロでのヨウ素の蓄積
Ａｄ−ＮＩＳベクター感染細胞におけるヨウ素の蓄積能力を以下の種々の株で試験した：上皮腫瘍細胞ＳｉＨａ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３５）、乳癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣ ＨＴＢ−２２）およびＴ−４７Ｄ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３３）ならびに前立腺起源の腫瘍細胞ＤＵ−１４５（ＡＴＣＣＨＴＢ−８１）およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）。
【００９３】
細胞に感染多重度１０でＡｄ−ＮＩＳベクターを感染させた。細胞のヨウ素捕獲能力を、Ｗｅｉｓｓ らの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９８４、１１４、１０９０〜１０９８）にしたがって感染から２８〜２９時間後に試験する。感染細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄し、０．１μＣｉのヨウ素１２５を含むＨＢＳＳ緩衝液と共に図３に表示の時間接触させる。接触終了後、細胞を冷却ＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄し、冷却エタノールと２０分間インキュベートする。細胞によって捕獲されたヨウ素１２５の量を、ガンマカウンターを使用したエタノール中の放射能のアッセイによって同定する。
【００９４】
ＳｉＨａ株を使用して得られた結果を図３に示し、これを、ＦＲＴＬ−５細胞（ヨウ素を天然に捕獲し、コントロールとして使用したラット甲状腺細胞）で得られた結果と比較することができる。
【００９５】
過塩素酸塩の存在下でのＮＩＳによるヨウ素輸送体の特異的阻害を試験した。ＮａＣｌＯ４をヨウ素１２５を含むＨＢＳＳ緩衝液に添加して、３０、３００、および３０００μＭの最終濃度とする。細胞とヨウ素１２５との間の接触時間は１５分間である。結果を図４に示す。結果を、同数の細胞についての数として示す。
【００９６】
ＦＲＴＬ−５細胞（ポジティブコントロール）は、一定量のヨウ素を固定し、この現象は非常に急速である（接触から１５分後にほぼ最大に達する）ことが認められる。得られた結果より、感染していないＳｉＨａ細胞（ヒト上皮腫瘍細胞）はヨウ素を捕獲しないことが示される。驚いたことに、Ａｄ−ＮＩＳベクターを感染させたＳｉＨａ細胞はＦＲＴＬ−５細胞の５倍を超えるヨウ素を捕獲することが認められる。この現象の初速度はＦＲＴＬ−５細胞で認められた速度に匹敵することにも注目すべきである。輸送特異性を、ｎｉｓ遺伝子を含まないコントロールアデノウイルスでの感染によって確認した（結果を示さず）。
【００９７】
阻害実験の結果（図４）は、ＦＲＴＬ−５細胞のヨウ素固定が３０μＭのＮａＣｌＯ４濃度で９０％を超えて阻害されることを示す（３０μＭでは９３％、高濃度で９５％）。一方、Ａｄ−ＮＩＳを感染ＳなせたＳｉＨａ細胞では、同レベルの阻害を得るために必要なインヒビター濃度は、更により高い（３０μＭのＮａＣｌＯ４ではわずか４０％阻害、３００μＭのＮａＣｌＯ４では９２％阻害、３ｍＭのＮａＣｌＯ４では９８％阻害）ことに注目することが興味深い。
【００９８】
阻害実験により、ＮＩＳによるヨウ素イオン輸送の競合的および特異的阻害であるこの現象はＮａＣｌＯ４によって阻害されるので、Ａｄ−ＮＩＳ感染ＳｉＨａ細胞のヨウ素捕獲能力は確かにこれらの細胞中の発現ＮＩＳによると結論付けることが可能である。他のヒト腫瘍細胞株（乳癌細胞：ＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ、ならびに前立腺起源の腫瘍細胞：ＤＵ−１４５およびＰＣ−３）についても類似の結果が得られた。
【００９９】
ＮａＣｌＯ４による阻害に関する結果により、腫瘍細胞のＡｄ−ＮＩＳ感染により特に高レベルでＮＩＳが発現することも確認されるが、これはこの現象の阻害に高濃度のＮａＣｌＯ４が必要であるからである（ＳｉＨａ細胞およびＦＲＴＬ−５細胞の関連細胞の場合、同レベルの阻害を得るために１０倍を超える阻害濃度が必要である）。
【０１００】
これら全ての結果により、アデノウイルスベクターは、ｎｉｓ遺伝子の導入に特に有利なベクターであり、このようなベクターの使用により非甲状腺腫瘍細胞においてヨウ素１２５を天然に捕獲する細胞で認められるレベルの５倍の蓄積レベルを獲得可能であることが示される。
【０１０１】
［実施例３］Ａｄ−ＮＩＳベクター感染腫瘍によるインビボでのヨウ素蓄積
ＭＣＦ−７細胞（乳癌のヒト腫瘍細胞）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行い、動物の甲状腺を安静にした。次いで、Ａｄ−ＮＩＳベクターを一定の動物に腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍）。注射時の腫瘍の直径は３〜６ｍｍであった。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射し、動物の異なる部位に移動することができるプローブの支援によって１０秒間にわたり計数した。甲状腺上、腫瘍上、腫瘍のすぐ隣にプローブを置くことによって一定の時間間隔で計数した。結果を図５に示す。結果を、時間の関数として検出された数（１０秒間の測定）として示す。
【０１０２】
コントロール動物（Ａｄ−ＮＩＳを未投与）では、甲状腺は、少量のヨウ素を固定するが、チロキシンでの治療による甲状腺中のヨウ素の実質的な蓄積は長時間認められない。コントロール動物では、腫瘍中のヨウ素固定は認められない（図５Ａを参照のこと）。ＮＩＳが胃中に天然に存在するという事実およびヨウ素が尿から排泄されるという事実は、比較的高い値が認められることの説明となる（比較的高いバックグラウンドノイズ）。
【０１０３】
腫瘍内経路によって投与されたＡｄ−ＮＩＳ治療動物（図５Ｂ）では、甲状腺中の実質的なヨウ素蓄積が認められない（チロキシンの治療効果）。これらの動物では、腫瘍上にプローブを置くことによって検出されたヨウ素の量は、腫瘍付近で検出されたヨウ素量よりも系統的に高く、これはＡｄ−ＮＩＳベクターでの治療後に実際に腫瘍中でヨウ素が固定されたことを示す。
【０１０４】
腫瘍中でのヨウ素固定を確認するために、Ａｄ−ＮＩＳベクターで処理した動物におけるシンチグラフィーによる放射能測定を行った。得られた結果を図６に示す。５０μ／Ｃｉの１２３Ｉを腹腔内経路で注射する以外は上記のプロトコールにしたがって使用動物を調製し、ヨウ素注射から１時間後に画像を得た。
【０１０５】
画像は動物の縦断図である。以下の４つのヨウ素固定領域が明らかである：甲状腺、膀胱（ヨウ素排泄経路）、胃（天然でＮＩＳが発現される）、および腫瘍。これらのシンチグラフィーの結果により計数によって得られた先の結果が確認され、これは、本発明のベクターにより腫瘍中の実質的なヨウ素固定が可能であることを示す。
【０１０６】
［実施例４］Ａｄ−ＮＩＳベクター感染腫瘍によるヨウ素蓄積の定量的評価
ＳｉＨａ細胞（５×１０６細胞）を、ヌードマウス（ｎ＝１２）の両側腹に皮下注射した。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行い、動物の甲状腺を安静にした。各動物について、Ａｄ−ＮＩＳベクターを腫瘍に腫瘍内経路で注射し（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍）、他の腫瘍をコントロールとして使用した。注射時の腫瘍の直径は５〜８ｍｍであった。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを腹腔内経路でマウスに注射した。１２５Ｉ投与から９０分後に動物を屠殺し、１２５Ｉの量を同定した。結果を表１に示す。結果を、１ｇの組織に投与した１２５Ｉの百分率として示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
得られた結果により、Ａｄ−ＮＩｓベクターで治療した腫瘍はヨウ素１２５Ｉを非常に効率的に蓄積することができ、未処理腫瘍よりも２５倍まで高いことが示される。これらの結果により先の結果が確認され、本発明のベクターにより腫瘍中のヨウ素が実質的に固定可能であることが示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の遺伝子療法および治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞中へのヨウ素の蓄積を促進するためのアデノウイルスベクターによる腫瘍細胞への特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）をコードする遺伝子の移入に関する。本発明はまた、ｎｉｓ遺伝子を含む複製欠陥組換えアデノウイルスおよび腫瘍細胞へのｎｉｓ遺伝子の導入とヨウ素１３１での代謝放射線治療法とを組み合わせた癌治療法でのこれらのベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨウ素１３１は、５０年以上分化型甲状腺癌の治療に使用されてきた。その治療効果は、腫瘍組織に照射された放射線量に関連する。例えば、転移の場合、ヨウ素１３１での治療後の腫瘍反応は、腫瘍組織に送達した放射線量が８０グレイを超えた場合に認められるが、３５グレイ未満の線量では腫瘍反応レベルは低いかゼロである（Ｍａｘｏｎ、ＮＥＪＭ、３０９、９３７〜９４１、１９８３）。一般に、腫瘍体積の治療または減少に必要な全線量はその放射線感受性にしたがって４０グレイと６０グレイとの間で変化することを評価可能である。分化型甲状腺癌の固定化した転移の治療の間で行われるように、この全線量を、ヨウ素１３１を使用したいくつかの治療で送達させることができる。
【０００３】
腫瘍組織に送達される放射線量は、２つの生物学的因子（腫瘍組織中のヨウ素１３１の有効半減期（Ｔｅｆｆ）および放射能濃度）に依存する。
【０００４】
腫瘍組織中のヨウ素１３１の有効半減期（Ｔｅｆｆ）は、関連式Ｉ／Ｔｅｆｆ＝Ｉ／Ｔｂｉｏｌ＋Ｉ／Ｔｐｈｙｓによる生物学的半減期（Ｔｂｉｏｌ）および物理的半減期（Ｔｐｈｙｓ）に依存する。固定細胞中のヨウ素１３１の生物学的半減期（Ｔｂｉｏｌ）は、ヨウ素の有機化能力に依存する。例えば非甲状腺細胞のように、有機化しない場合は、生物学的半減期は短く、数時間〜数十時間である。ヨウ素１３１の物理的半減期（Ｔｐｈｙｓ）は、８．０２日である。したがって、腫瘍組織中のヨウ素１３１の有効半減期は数時間〜数十時間であることを単に評価可能である。
【０００５】
放射能濃度は、腫瘍組織によるヨウ素１３１の全固定とこの組織との間の比である。
【０００６】
例として、１ｇの組織あたりに投与された０．１％の活性のヨウ素固定および１．５日の有効半減期では、３．７ギガベクレル（すなわち１００ｍＣｉ）の投与により、腫瘍組織への３０グレイの線量が送達されると評価可能である。
【０００７】
ヨウ素１３１の全固定は、一方では患者に投与されたヨウ素１３１の活性に依存し、一方ではヨウ素１３１を濃縮する腫瘍組織の能力に依存するパラメータである。
【０００８】
患者に投与することができるヨウ素１３１の最大活性は、健常な組織、特に骨髄に送達する放射線量に起因するヨウ素１３１のヨウ素毒性によって制限される。したがって、甲状腺癌の場合、甲状腺機能低下症の患者に投与される治療活性量は、一般に３．７ＧＢｑと１０ＧＢｑ（１００〜３００ｍＣｉ）との間である。ヨウ素の保持が甲状腺機能低下症で認められた活性量の半分であるので、甲状腺機能正常患者に投与することができる最大活性量はより多くなり、８．５と２２．２ＧＢｑとの間の値（５００〜６００ｍＣｉ）に達する。
【０００９】
患者に投与された所与の活性量についての正常な組織のヨウ素１３１の濃縮能力は、ヨウ素共輸送体の発現レベルおよびその生物活性に依存する。これは、正常および罹患ヒト甲状腺組織の研究およびＮＩＳ活性のインビトロ研究によって証明された。ヨウ素１３１の比活性は高いが、投与されたヨウ素１３１の活性の増加に伴う飽和減少は認められなかった。
【００１０】
患者に投与することができるヨウ素１３１の最大活性の制限のために、ヨウ素１３１の全固定を増加させるためにヨウ素１３１を濃縮する腫瘍組織の能力を増加させることができることが望ましい。
【００１１】
腫瘍組織中でヨウ素固定が均一に増加することも重要である。実際、固定組織中のヨウ素の固定は、細胞間で、または腫瘍間で非常に不均一であり得る。腫瘍組織中の放射線量は、本質的にはヨウ素１３１のβ放射によって送達される。しかし、生体組織中のその経路は、せいぜい２〜３ｍｍである。さらに、局在部周囲では、放射線量は距離ごとに指数関数的に減少していく。この元素は、固定腫瘍領域中の高い放射能濃度を達成する重要性を強化し、一方で、可能な限り均一にヨウ素が固定される必要がある。
【００１２】
ヒト甲状腺によるヨウ素１３１の固定およびそれによる照射を、１μｇ／ｋｇ／日のＬ−トリヨードチロニンを１日３回にわけて３週間投与することによって容易に抑制する（ヨウ素１３１の測定不可能な固定）ことができることに留意すべきである。
【００１３】
ＮＩＳ輸送体は、甲状腺細胞による循環ヨウ素（ヨウ素Ｉ−の形態）の濃縮を担う（概説として、Ｐ．Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍｅｄｅｃｉｎｅ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、１０、８２５〜８２８を参照のこと）。これらの細胞中のヨウ素濃縮は、以下の特徴を示す：ヨウ素は電気化学勾配に対して３０〜４０倍の因子によって濃縮されること；ナトリウム（Ｎａ＋）が存在する必要があること；能動輸送に関連すること；一定の陰イオン（チオシアン酸塩、過塩素酸塩、過テクネチウム酸塩など）によって競合的に阻害されること。甲状腺細胞によるヨウ素の濃縮後、ヨウ素が有機化し、ヨードチロシンおよびチロイドホルモン（チロキシンＴ４およびトリヨードチロニンＴ３）が合成される。
【００１４】
ＮＩＳヨウ素のマウス輸送体（Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、４５８〜４６０、１９９６）およびヒト輸送体（Ｓｍａｎｉｋ Ｐ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２６、３３９〜３４５、１９９６）をコードする遺伝子が単離されており、これらは８４％同一である。この遺伝子は、ヒト種では染色体１９ｐ上に存在する。これは１４個のイントロンで分離された１５個のエクソンを含む。その転写によって、選択的スプライシングによる２つの形態が得られるが、そのうち甲状腺では長い方の形態が主である。そのタンパク質の分子量は５５ｋＤａであり、グリコシル化後８０ｋＤａに達する。これは甲状腺細胞の外側の基底膜に存在する。そのアミノ末端およびカルボキシ末端は細胞内である一方で、ペプチド鎖の残部は、細胞内および細胞外ループによって連結された１３個の膜貫通セグメントを含む（Ｌｅｖｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２２６５７〜２２６６３）。ＮＩＳをコードする遺伝子の非甲状腺細胞への移入により、非甲状腺細胞の甲状腺細胞と同一の性質であるヨウ捕獲能力（ナトリウム（Ｎａ＋）の存在が必要であることおよび過塩素酸塩陰イオンによる阻害）が付与される。
【００１５】
ｎｉｓ遺伝子の転写は、ＴＳＨによって甲状腺細胞中で活性化される。この効果は、サイクリックＡＭＰによって媒介される。マウス甲状腺細胞中でのタンパク質の半減期は４日間である（Ｐａｉｒｅ Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１８２４５〜１８２４９、１９９７）。甲状腺外組織では、遺伝子の活性は、基底状態での甲状腺のそれよりも低い。これは、おそらく甲状腺ｎｉｓ遺伝子のプロモーターへ結合することができるが、他の組織のプロモーターに結合しない特異的転写因子ＴＴＦ−１（甲状腺転写因子１）による甲状腺細胞中のｎｉｓ遺伝子の転写の刺激による（Ｅｎｄｏ Ｔ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１、１７４７〜１７５５、１９９７）。甲状腺以外に、一定の組織（特に唾液腺および胃粘膜）がヨウ素を捕獲および濃縮することができる。
【００１６】
最近の研究により、ヒトまたはマウス腫瘍細胞へのレトロウイルスによるｎｉｓ遺伝子の導入が報告されている（Ｍａｎｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９、６６１〜６６８、１９９９）。これらの結果は、これらの細胞が非甲状腺細胞中でｎｉｓ遺伝子を発現し、天然ではヨウ素を蓄積しない細胞中でのヨウ素の濃縮が認められるという点で興味深い。しかし、治療への適用を考慮するためのヨウ素の十分な固定レベルを達成するためには克服すべき多数の制限要因が残されている。
【００１７】
第１の要因は、腫瘍細胞中でのｎｉｓ遺伝子発現レベルの低さである。例えば、上記の研究では、インビトロで得られた結果は、非甲状腺細胞で達成されたヨウ素の濃縮が甲状腺細胞中で蓄積されたヨウ素濃度の１／２のままであることが示されている。
【００１８】
さらに、腫瘍細胞が膜レベルで示される大量の破壊を考慮すると、非腫瘍性甲状腺細胞に匹敵する効率を有する輸送体の機能的取り込みを確保するのは困難なようであう。
【００１９】
別の制限要因は、非甲状腺細胞中でヨウ素が有機化しないことである。しかし、このヨウ素の有機化は細胞中でのヨウ素の維持に必要な構成要素である。したがって、上記で報告の研究では、非甲状腺細胞におけるインビトロで蓄積されたヨウ素の非常に急速な流出（３０分と６０分との間）が認められる。
【００２０】
最後に、腫瘍細胞の不均一性および膜レベルでのこれらの細胞の広範な改変を考慮すると、腫瘍細胞膜中のＮＩＳ輸送体の均一な分配を達成することは困難なようであう。
【００２１】
したがって、現在記載されているアプローチでは、非甲状腺腫瘍治療用のヨウ素１３１の使用を考慮するのに十分な発現レベルで非甲状腺腫瘍中にヨウ素を蓄積させることは未だ不可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｍａｘｏｎ、ＮＥＪＭ、３０９、９３７〜９４１、１９８３
【非特許文献２】Ｐ．Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍｅｄｅｃｉｎｅ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、１０、８２５〜８２８
【非特許文献３】Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、４５８〜４６０、１９９６
【非特許文献４】Ｓｍａｎｉｋ Ｐ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２６、３３９〜３４５、１９９６
【非特許文献５】Ｌｅｖｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２２６５７〜２２６６３
【非特許文献６】Ｐａｉｒｅ Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１８２４５〜１８２４９、１９９７
【非特許文献７】Ｅｎｄｏ Ｔ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１、１７４７〜１７５５、１９９７
【非特許文献８】Ｍａｎｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９、６６１〜６６８、１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、遺伝子治療とヨウ素１３１を使用した放射線治療とを組み合わせた腫瘍の改良された治療法を提供する。
【００２４】
本発明は、特に、非甲状腺腫瘍レベルでのヨウ素の固定効率の増大を可能にし、それにより、甲状腺癌治療用に首尾よく開発された放射線治療の原理を非甲状腺腫瘍に適用可能な方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、欠陥組換えアデノウイルスによる特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードする遺伝子の導入により、非甲状腺腫瘍細胞中のヨウ素の非常に高い蓄積が可能となるという証明に基づく。特定の実施形態では、ｎｉｓ遺伝子を発現する欠陥アデノウイルスの供給により甲状腺細胞で認められる濃度の約５倍の濃度でヨウ素を蓄積可能である。この驚くべき非甲状腺腫瘍細胞のヨウ素１２５の蓄積能力により、今まで一定の甲状腺腫瘍の治療に限定されていたヨウ素１３１を使用した代謝放射線治療に基づくこの型の腫瘍の新規の治療アプローチを考慮可能である。
【００２６】
代謝放射線治療の主な利点は、周辺組織に有意に照射することなく固定した大放射線量の放射性同位元素を組織に送達させることである。
【００２７】
通常はヨウ素を蓄積不可能な腫瘍細胞中に実質的にヨウ素を濃縮させることが有効に可能であるという発見により、非甲状腺起源の腫瘍治療用の多数の適応症においてこの方法の適用を考慮可能である。より詳細には、以下の２つの適応症の型が考慮される：その位置により外部からの放射線治療ではほとんどアクセス不可能な腫瘍（例として、手術不可能な前立腺癌または大脳内腫瘍）、既に照射されており、最大線量が既に投与されているので更なる外部からの放射線治療が不可能な腫瘍（これは、照射領域で発症するか再発する全ての癌に関する）。この方法はまた、ヨウ素捕獲能力を喪失し、代謝治療に反応しない甲状腺腫瘍の治療に適用可能である。
【００２８】
分化型甲状腺癌の転移の場合に行われる代謝放射線治療と外部放射線治療との組み合わせも考慮可能である。この組み合わせにより、毒性を増加させることなく放射線治療の治療有効性を増大可能である。この組み合わせは、特に、放射線治療にあまり感受性を示さない腫瘍に有利なようである。さらに、過度に巨大なサイズのために代謝放射線治療でアクセス不可能な腫瘍へのこの技術の適用を考慮可能である。
【００２９】
したがって、本発明の第１の目的は、特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳまたはその誘導体をコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列を含む欠陥組換えアデノウイルスにある。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の目的では、特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳの表現「誘導体」は、ＮＩＳポリペプチドに由来し、特異的ヨウ素輸送活性を保持する任意のアナログ、フラグメント、または変異形態を意味すると理解される。種々の誘導体は、天然の状態で存在し得る。これらの誘導体は、ＮＩＳをコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の相違によって特徴づけられる対立遺伝子であるか特異的スプライシングまたは翻訳後修飾に起因し得る。これらの誘導体を、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、付加、および／または修飾によって得ることができる。これらの修飾を、当業者に公知の任意の技術によって行うことができる。これらの誘導体は、特に、その基質に高い親和性を有する分子、インビボでの改良された発現が可能な配列、プロテアーゼに対してより高い耐性を示す分子、生物学的有効性がより高いか副作用が低いか、おそらく新規の生物学的性質を有する分子である。本発明の文脈で使用することができる他の誘導体は、特に、１つまたは複数の残基が置換された分子、望ましくない活性が考慮されるか発現される結合部位との相互作用に関連しないかあまり関連しない領域の欠失によって得られた誘導体、および天然の配列に関する更なる残基（例えば、分泌シグナルおよび／または結合ペプチドなど）を含む誘導体である。
【００３１】
本発明の文脈で産生される特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳまたはその誘導体は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、または例えば１つまたは複数のイントロンが挿入されたｃＤＮＡからなるハイブリッド構築物であり得る。これには、合成または半合成配列も含み得る。有利には、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡが使用される。特に、ｇＤＮＡの使用によりヒト細胞でのより良好な発現が可能である。
【００３２】
第１の実施形態によれば、これは、マウス起源の特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードするｃＤＮＡ配列である。本発明の好ましい実施形態によれば、これは、ヒト起源の特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードするｃＤＮＡ配列である。
【００３３】
本発明の文脈で使用されるアデノウイルスは、組換えアデノウイルス（すなわち、異種ＤＮＡ配列を含む）である。有利には、これらは、欠陥組換えアデノウイルス（すなわち、標的細胞中で自律複製不可能なアデノウイルス）である。
【００３４】
本発明のアデノウイルスの構築には、種々の血清型を使用することができる。実際に多数の抗原型が存在し、その構造および性質はいくらか異なるが、類似の遺伝子構成を示す。より詳細には、組換えアデノウイルスは、ヒト起源であっても動物起源であってもよい。ヒト起源のアデノウイルスに関して、好ましくはＣ群（特に、アデノウイルス２型（Ａｄ２）、５型（Ａｄ５）、７型（Ａｄ７）、または１２型（Ａｄ１２））に分類され得る。動物起源の種々のアデノウイルスのうち、好ましくは、イヌ起源のアデノウイルス（特に、全てのＣＡＶ２アデノウイルス株（例えば、マンハッタン株またはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）））であり得る。動物起源の他のアデノウイルスは、特に、ＷＯ ９４／２６９１４に引用されている。
【００３５】
アデノウイルスゲノムは、特に、各末端の逆末端反復配列（ＩＴＲ）、キャプシド形成配列（Ｐｓｉ）、初期遺伝子、および後期遺伝子を含む。主な初期遺伝子は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域中に含まれる。これらのうち、Ｅ１領域に含まれる遺伝子は、特に、ウイルス増殖に必要である。主な後期遺伝子は、Ｌ１〜Ｌ５領域に含まれる。Ａｄ５アデノウイルスゲノムは完全に配列決定されており、データベースでアクセス可能である（特に、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ７３２６０を参照のこと）。同様に、他のアデノウイルスゲノムの一部またはさらに全部（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２など）も配列決定されている。
【００３６】
上記のように、本発明のアデノウイルスは欠陥であるので、標的細胞中で自律複製不可能である。この効果により、アデノウイルス由来の種々の構築物が調製され、種々の治療遺伝子に組み込まれている。これらの各構築物では、感染細胞中で複製不可能なようにアデノウイルスを改変されていた。したがって、先行技術に記載の構築物は、ウイルス増殖に必須のＥ１領域が欠失され、異種ＤＮＡ配列が挿入されたアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ、１０１、１９９１、１９５、Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、Ｇｅｎｅ、５０、１９８６、１６１）。さらに、ベクターの性質を改良するために、アデノウイルスゲノム中に他の欠失または改変を作製することが提案されている。したがって、熱感受性点変異をｔｓ１２５変異体に移入して、７２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を不活化させることができる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９７５、１５、２、３４８〜３５４）。他のベクターは、ウイルスの複製および／または増殖に必須の別の領域（Ｅ４領域）の欠失を含む。Ｅ４領域は、実際に、後期遺伝子の発現の調製、後期核ＲＮＡの安定性、宿主細胞タンパク質の発現の消滅、およびウイルスＤＮＡの複製効率に関連する。したがって、Ｅ１およびＥ４領域が欠失したアデノウイルスベクターは、転写バックグラウンドノイズを有し、且つウイルス遺伝子発現が非常に減少している。このようなベクターは、例えば、ＷＯ ９４／２８１５２に記載されている。さらに、ＩＶａ２遺伝子が改変されたベクターも記載されている（ＷＯ ９６／１００８）。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｃ型ヒトアデノウイルスである。より詳細には、これはＡｄ２またはＡｄ５アデノウイルスである。
【００３８】
有利には、本発明の文脈で使用される組換えアデノウイルスは、そのゲノムのＥ１領域が欠失している。さらにより詳細には、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失している。例としては、影響を与えるヌクレオチド４５４〜３３２８、３８６〜３４４６、４５９〜３５１０、または３５７〜４０２０（Ａｄ５のゲノムを基準とする）の欠失であり得る。
【００３９】
別の変形形態では、本発明の文脈で使用される組換えアデノウイルスは、少なくともＥ１およびＥ３領域の全てまたは一部が欠失している。
【００４０】
別の変形形態では、本発明の文脈で使用される組換えアデノウイルスは、Ｅ１領域の欠失に加えて、そのゲノム中のＥ４領域の影響を与える全てまたは一部が欠失している。より詳細には、Ｅ４領域の欠失は、全ての読み取り枠に影響を与える。詳細な例としては、出願ＷＯ ９５／０２６９７およびＷＯ ９６／２２３７８に記載のＥ４領域の３３４６６〜３５５３５もしくは３３０９３〜３５５３５または一部のみの欠失であり得る。
【００４１】
例えば、いわゆる第３世代組換えアデノウイルス（すなわち、Ｅ１およびＥ４領域が全体または部分的に欠失しており、任意選択的にＥ３領域が欠失している）であり得る。本発明の特定の変形形態は、以下の領域の全てまたは一部に影響を与える欠失を有するアデノウイルスの使用からなる：
−Ｅ１、Ｅ４、およびＥ３、
−Ｅ１、Ｅ４、およびＥ２、
−Ｅ１、Ｅ４、Ｅ２、およびＥ３、
−上記の領域ならびに後期アデノウイルス機能（Ｌ１〜Ｌ６）をコードする遺伝子の全部または一部、
−全てのコードウイルス領域。
【００４２】
後期機能（「最小」ベクター）または全てのコード領域（「ガットレス」ベクター）をさらに欠くアデノウイルスに関して、その構築物は、例えば、Ｐａｒｋｓら、ＰＮＡＳ、９３、１９９６、１３５６５およびＬｉｅｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１９９６、８９４４に記載されている。
【００４３】
これには、ハイブリッドアデノウイルスベクター（出願ＷＯ ９９／６０１４４に記載のものなど）も含んでもよく、このアデノウイルスは別のウイルス用のベクター（特に、レトロウイルスベクター）として使用される。
【００４４】
ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含む発現カセットを、組換えゲノムの別の部位に挿入することができる。これを、欠失配列の代わりまたは付加的にＥ１、Ｅ３、またはＥ４領域に挿入することができる。これを、ｃｉｓ中のウイルス産生に必要な配列（ＩＴＲ配列およびキャプシド形成配列）の外側の任意の他の部位に挿入することもできる。
【００４５】
本発明の目的のために、核酸の、表現「発現カセット」は、ベクターの特異的制限部位に挿入することができるＤＮＡフラグメントを意味すると理解される。このＤＮＡフラグメントは、目的のＲＮＡまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて、目的の配列の発現に必要な配列（エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化配列など）を含む。転写および／または翻訳用の適切な読み枠への前記フラグメントの挿入を確保するようにＤＮＡフラグメントおよび制限部位を設計する。
【００４６】
組換えアデノウイルスを、キャプシド形成株（すなわち、組換えアデノウイルスゲノム中の１つまたは複数の欠陥機能をトランスで補足することができる細胞株）産生させる。当業者に公知のキャプシド形成株のうち、例としては、アデノウイルスゲノムの一部が取り込まれた２９３株であり得る。より詳細には、２９３株は、左側のＩＴＲ、キャプシド形成領域、Ｅ１領域（Ｅ１ａおよびＥ１ｂを含む）、ｐＩＸタンパク質コード領域、およびｐＩＶａ２タンパク質コード領域の一部を含む血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）ゲノムの左側の末端（１１〜１２％）を含むヒト胚腎臓細胞株である。この株は、Ｅ１領域を欠く（すなわち、Ｅ１領域の全てまたは一部を欠く）組換えアデノウイルスをトランスで補足することができ、高力価のウイルスストックを産生することができる。この株はまた、許容温度（３２℃）で熱感受性Ｅ２変異をさらに含むウイルスストックを産生することができる。特に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９（ＷＯ ９４／２８１５２）またはヒト網膜芽細胞（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２１５）に基づいて、Ｅ１領域を補足することができる他の細胞株が記載されている。さらに、いくつかのアデノウイルス機能をトランスで補足することができる株が記載されている。特に、Ｅ１およびＥ４領域を補足する株（Ｙｅｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１９９６、５５９〜５６５、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．、２、１９９５、３２２、Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．、６、１９９５、１５７５）ならびにＥ１およびＥ２領域を補足する株（ＷＯ ９４／２８１５２、ＷＯ ９５／０２６９７、ＷＯ ９５／２７０７１）または特にこのようなウイルスの構築に関連する部位特異的リコンビナーゼ活性をさらに発現することにより最小アデノウイルスの産生に使用することができるそれら由来の株であり得る。
【００４７】
腫瘍レベルでの感染効率を増加させるために、組換えアデノウイルスのキャプシド構造を改変することもできる。例えば、キャプシドは、腫瘍細胞へのアデノウイルスの標的化を可能にするｕＰＡＲリガンドまたはＲＧＤモチーフを含むことができ、このようなベクターおよび標的配列は、特に出願ＷＯ ００／１２７３８に記載されている。標的配列を、ヘキソンタンパク質または繊維タンパク質に挿入することができる。好ましくは、繊維タンパク質またはヘキソンタンパク質の欠失レベルで標的配列を挿入する。有利には、Ａｄ５のヘキソンのポリペプチド配列２７９〜２９２に対応するヘキソン１３アミノ酸のポリペプチド配列から欠失する。有利には、Ａｄ５の繊維（ＨＩループ）のポリペプチド配列５３９〜５４７に対応する繊維１１アミノ酸のポリペプチド配列から欠失する。
【００４８】
組換えアデノウイルスは、通常、キャプシド形株へのウイルスＤＮＡの移入から約２〜３日後（アデノウイルスのサイクル速度は２４〜３６時間である）に細胞を溶解することによって産生される。この方法を実行するために、移入されたウイルスＤＮＡは、細胞に感染する、任意選択的に細菌（ＷＯ ９６／２５５０６）または酵母（ＷＯ ９５／０３４００）中で構築された完全な組換えウイルスゲノムであり得る。これはまた、キャプシド形成株の感染に使用される組換えウイルスであり得る。ウイルスＤＮＡを、それぞれ組換えウイルスゲノムの一部およびキャプシド形成細胞への移入後に種々のフラグメント間での相同組換えによって組換えウイルスを再構成可能な相同領域を有するフラグメント形態に挿入することもできる。
【００４９】
細胞溶解後、組換えウイルス粒子を、塩化セシウム勾配遠心分離またはクロマトグラフィーなどの任意の公知の技術によって単離することができる。別の方法は、出願ＷＯ ９８／００５２８に記載されている。
【００５０】
発現調節配列。特異的ヨウ素キャリア（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体、ＮＩＳ）をコードする遺伝子を、機能的で宿主腫瘍細胞での発現を可能にする発現を調節する任意の配列（例えば、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーなど）の調節下に置くことができる。
【００５１】
発現調節配列は、プロモーター領域に加えて、特異的ヨウ素輸送体をコードする遺伝子の３’に存在し、且つ転写終結シグナルおよびポリアデニル化部位が得られる領域を含む。これら全てのエレメントが発現カセットを構成する。
【００５２】
プロモーターは、構成性プロモーターであっても調節（誘導）プロモーターであってもよい。これは、実際の遺伝子プロモーターであり得る。これはまた、異なる起源（他のタンパク質の発現を担うか合成プロモーター）の配列を含み得る。特に、これは、真核生物またはウイルス遺伝子のプロモーター配列を含み得る。例えば、これは、トランスフェクトが望まれる細胞のゲノム由来のプロモーター配列を含み得る。同様に、これは、ウイルスゲノム（使用されるウイルスを含む）由来のプロモーター配列を含み得る。これに関して、例として、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶ−ＬＴＲ、ＭＴ−１、ＳＶ４０などのプロモーターであり得る。
【００５３】
さらに、これらの発現配列を、一定の組織中で組織特異的または主に発現可能な活性化配列または調節配列（エノラーゼプロモーターＧＦＡＰなど）の付加によって改変することができる。実際、ウイルスが腫瘍細胞に有効に感染した場合のみ、治療遺伝子がその効果を発現または産生するように腫瘍細胞中で特異的または主に活性である発現シグナルを使用することが特に有利であり得る。発現の特異的または主な特徴とは、プロモーター活性が腫瘍細胞中で有意により高いことを意味する。非特異的発現が他の細胞に存在し得るにもかかわらず、対応する活性レベルは、一般に腫瘍細胞中で認められるものよりも非常に低く（無視できるほど）、一般に少なくとも１／１０ほどである。
【００５４】
本発明の文脈で使用することができるプロモーターのうちでは、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、αアクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメントのプロモーター（デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療目的の遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子など）、組織特異的プロモーター（デシン、ミオシン、クレアチンキナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター）、増殖中の細胞でより特異的に活性なプロモーターまたは刺激に対応するプロモーター（天然のホルモン（ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸レセプターなど）に対応するプロモーターなど）、抗生物質（テトラサイクリン、ラパマイシンなど）によって調節されるプロモーター、天然または合成起源の他の分子に対応する他のプロモーター、またはウイルスゲノム由来のプロモーター配列（サイトメガロウイルスＣＭＶエンハンサー／プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子プロモーター、ＭＬＰプロモーター）であり得る。テトラサイクリンによって調節することができるプロモーターおよびＣＭＶプロモーターは、ＷＯ ９６／０１３１３、米国特許第５，１６８，０６２号、および同第５，３８５，８３９号に記載されている。
【００５５】
本発明の実施に使用することができるプロモーターのうちでは、特に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルス３’ＬＴＲ領域に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ、２２、７８７〜７９７）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８、１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、３９〜４２）、原核生物起源のプロモーター（βラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５、３７２７〜３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、２１〜２５）など（「組換え細菌由来の有用なタンパク質」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２、７４〜９４もまた参照のこと））、酵母プロモーター（Ｇａｌ４、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）、およびアルカリ性ホスファターゼなど）、および組織特異性を示し且つトランスジェニック動物に使用される以下の動物起源の転写緒節配列：膵臓の腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子の調節配列（Ｓｗｉｆｔ、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８、６３９〜６４６、Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５０、３９９〜４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、７、４２５〜５１５）、膵臓のβ細胞中で活性な遺伝子［ｌａｃｕｎａ］インスリン調節配列（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１５、１１５〜１２２）、リンパ球様細胞中で活性な免疫グロブリンの発現を調節する配列（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８、６４７〜６５８、Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１８、５３３〜５３８、Ａｌｅｘｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７、１４３６〜１４４４）、精巣細胞および乳房細胞、リンパ球および肥満細胞中で活性なマウス乳腺癌ウイルスの調節配列（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４５、４８５〜４９５）、前立腺癌中で活性なＰＳＡ遺伝子の調節配列、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子の調節配列（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、１、２６８〜２７６）、肝臓中で活性なαフェトプロテインの調節配列（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、１６３９〜１６４８、Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、５３〜５８）、肝臓中で活性なα１抗トリプシン遺伝子の調節配列（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、１、１６１〜１７１）、骨髄性細胞中で活性なβグロビン遺伝子の調節配列（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１５、３３８〜３４０、Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４６、８９〜９４）、脳の希突起膠細胞中で活性な塩基性ミエリン遺伝子の調節配列（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ、４８、７０３〜７１２）、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖２遺伝子の調節配列（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、２８３〜２８６）、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子の調節配列（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４、１３７２〜１３７８）であり得る。
【００５６】
本発明の特定の実施形態では、好ましくはＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるウイルスプロモーターの調節下で特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードする遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスを使用する。
【００５７】
本発明のベクターへのＮＩＳ遺伝子の移入とヨウ素１３１の生物学的半減期を増加可能な生物系への移入とを組み合わせることも可能である。したがって、ＮＩＳ遺伝子およびヨウ素有機化機構に関連するポリペプチドをコードする１つの遺伝子またはいくつかの遺伝子を腫瘍細胞に同時または首尾よく導入可能である。例えば、グルコースオキシダーゼをコードする遺伝子などのペルオキシダーゼ系に関連するポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。また、ヨウ素有機化過程に関連する甲状腺細胞中の酵素である甲状腺ペルオキシダーゼをコードする遺伝子（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５、６７３５〜６７３５、１９８７、配列ＧｅｎＢａｎｋ ｇ３７２５１）であり得る。甲状腺ペルオキシダーゼをコードする遺伝子の移入を、サイログロブリンの全てまたは一部（チロシン残基が豊富なサイログロブリン部分）をコードする核酸配列の移入と組み合わせることができる。
【００５８】
いくつかの導入遺伝子を発現する１つのベクター、２つのベクターの同時感染、ＮＩＳ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターおよび別のベクター、ウイルスもしくはプラスミドベクター、ヨウ素有機化機構に関連するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を発現するウイルスまたはプラスミドベクターによる腫瘍細胞へのＮＩＳ遺伝子およびヨウ素有機化機構に関連するポリペプチドをコードする１つの遺伝子またはいくつかの遺伝子の送達も考慮可能である。
【００５９】
さらに、本発明のベクターへのＮＩＳ遺伝子の移入と薬物（例えば、リチウム塩）によってヨウ素流出の抑制させる系の投与とを組み合わせ可能である。
【００６０】
別の変形形態では、ＮＩＳ遺伝子の移入と癌治療用の目的の治療遺伝子との組み合わせも考慮可能である。これには、ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子またはシトシンデアミナーゼ遺伝子などの自殺遺伝子を含み得る。これには、アポトーシスを誘導する遺伝子（ｐ５３、Ｂａｘ、ＢｃｌＸ−ｓ、Ｂａｄ、またはＢｃ１２およびＢｃｌＸ−１の任意の他のアンタゴニストなど）を含み得る。これには、改良された性質を示すこれらのタンパク質変異型（ｐ５３の変異型）（ＣＴＳ−１、ＷＯ ９７／０４０９２）をコードする遺伝子を含み得る。これにはまた、抗血管形成または血管形成阻害因子（特に、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２のリガンド、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＡＴＦ因子、プラスミノゲン誘導体、エンドセリン、トロンボスポンジン１および２、ＰＦ−４、インターフェロンαおよびβ、インターロイキン１２、ＴＮＦα、ウロキナーゼレセプター、ｆｌｔ１、ＫＤＲ、ＰＡＩ１、ＰＡＩ２、ＴＩＭＰ１、プロラクチンフラグメント）をコードする遺伝子を含み得る。これはまた、抗腫用免疫を誘導するか免疫応答を刺激することができるタンパク質（ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１２など）をコードする遺伝子を含み得る。癌治療目的のタンパク質をコードする遺伝子のうちで、抗体、抗体一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）のフラグメント、または腫瘍治療の免疫療法用の認識能力を有する任意の他の抗体フラグメント（抗ＲＡＳ抗体（ＷＯ ９４２９４４６））を強調することも重要である。
【００６１】
有利には、これには、その発現により腫瘍細胞が放射線増感される遺伝子（ｐ５３遺伝子）を含み得る。
【００６２】
ＮＩＳ輸送体をコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクターまたはウイルスまたは非ウイルス性の個別のベクターへの１つまたは複数のこれらの遺伝子移入によって、治療目的のこれらの遺伝子または上記の２つまたはそれ以上のこれらの遺伝子の組み合わせの投与を行うことができる。
【００６３】
別の変形形態では、本発明のベクターを、抗癌剤（特に、タキソール、タキソテール、および他のタキソイドなど（特に、米国特許第４，８５７，６５３号、同第４，８１４，４７０号、同第４，９２４，０１１号、同第５，２９０，９５７号、同第５，２９２，９２１号、同第５，４３８，０７２号、同第５，５８７，４９３号、欧州特許第０２５３７３８号、およびＷＯ ９１・１７９７６、ＷＯ ９３／００９２８、ＷＯ ９３／００９２９、およびＷＯ ９６０１８１５に記載されている））または他の治療用抗癌剤（シスプラチンおよび白金誘導体、エトポシドおよびリン酸エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ＣＣＮＵ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、イホスファミドなど）と組み合わせて投与することができる。
【００６４】
本発明はまた、上記のアデノウイルスベクターおよび生理学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は注射形態が好ましく、腫瘍内投与用または、経口、非経口、鼻腔内、動脈内、静脈内、または気管内経路などの投与用に処方することができる。
【００６５】
好ましくは、薬学的組成物は、腫瘍内経路による投与を意図した処方用の薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００６６】
本発明の組成物は、適用の考慮および種々のパラメータ、特に使用した投与様式または所望の発現の持続時間による当業者が容易に調整することができる種々の用量の組換えアデノウイルスを含み得る。一般に、本発明の組換えウイルスを、１０４と１０１４ｐｆｕとの間、好ましくは１０６と１０１１ｐｆｕとの間の用量の形態で処方して投与する。用語「ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）」は、ウイルスの感染力に対応し、適切な細胞培養物への感染および感染細胞プラーク数の計数によって同定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の同定技術は、文献に十分に記載されている。
【００６７】
さらに、本発明の組成物はまた、化学導入剤または生物導入剤を含み得る。要路「化学導入剤または生物導入剤」は、細胞への核酸の浸透を容易にする任意の化合物（すなわち、組換えウイルス以外）を意味すると理解される。これには、陽イオン性非ウイルス薬（陽イオン性リピド、ペプチド、ポリマー（ポリエチレンイミン、ポリリジン）、ナノ粒子など）または非陽イオン性非ウイルス薬（非陽イオン性リポソーム、ポリマー、または非陽イオン性ナノ粒子など）を含み得る。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ヨウ素輸送体ＮＩＳをコードする遺伝子を含む欠陥組換えベクターを含み、これは腫瘍内投与用に処方される。有利には、本発明の組成物は、１０４と１０１５ｐｆｕとの間、好ましくは１０７と１０１２ｐｆｕとの間を含む。
【００６９】
本発明の主題はまた、ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含む組換えベクターを１つまたは複数の適合性アジュバントおよび薬学的に受容可能なアジュバントと混合することを特徴とする、腫瘍の予防、改善、および／または治療に有用な薬物の調製法である。
【００７０】
本発明はまた、ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含む欠陥組換えアデノウイルスベクターの有効量を投与する工程を包含する、哺乳動物、特にヒトの治療法に関する。
【００７１】
用語「有効量」は、ヨウ素輸送体（ＮＩＳ）をコードする核酸を含むアデノウイルスの投与をヨウ素１３５での代謝放射線治療と組み合わせた場合、腫瘍体積の少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％を減少させるのみに十分な量またはさらに好ましくは腫瘍を消滅させるのに十分な量を示す。
【００７２】
本発明は、腫瘍治療、より詳細には固形腫瘍の治療に関する。本発明の主題によって治療することができる固形腫瘍のうち、特に、肉腫および悪性腫瘍（例として、線維肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、ユーイング肉腫、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、腎臓、肝臓、または胆管の癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫であるが、これらに限定されない）であり得る。
【００７３】
本発明はまた、上皮組織（子宮頚管、食道、および肺の上皮など）の増殖性障害（化生および異形成）の予防および／または治療に関する。これに関して、本発明は、特に、過形成、化生、より詳細には異形成などの非新生細胞の増殖が起こる状態での腫瘍形成または癌への進行に先立つことが公知であるか疑われる病態の治療に関する（これらの異常な増殖状態についての概説は、Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌ、１９７６、Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｄｅｒｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、６８〜７９を参照のこと）。過形成は、器官の顕著な構造的または機能的変化を伴わない器官中での細胞数の増加を含む制御された細胞増殖の形態である。例えば、子宮内膜の過形成は、子宮内膜癌に先駆けて起こる。化生は、成体または完全に分化された細胞型が別の細胞型に置換される制御された細胞増殖の形態である。化生は、上皮組織または結合組織で起こり得る。異形成は、しばしば癌の早期危険信号であり、主に上皮で見出される。これは、新生細胞増殖の最も頻繁な形態であり、各細胞の一様性の喪失および細胞の構造上の配向性の喪失を含む。異形成は、典型的には、慢性的刺激作用または炎症が存在する場合に起こり、しばしば子宮頚管、気道、声帯腔、および膀胱壁に認められる。概説として、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと。
【００７４】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に記載されるが、これらは例示であり、本発明を制限しない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】プラスミドｐＡＢ１、プラスミドｐＸＬ３０４８、およびプラスミドｐＡＢ２の線図である。プラスミドｐＸＬ３０４８は、アデノウイルス５型ゲノムの左側の末端（ヌクレオチド１〜３８２）、３つの固有のクローニング部位を含むポリリンカー、およびｐＩＸ遺伝子の一部（ヌクレオチド３４４６〜４２９６）を含む。プラスミドｐＡＢ２は、ＥｃｏＲＶで先に線状化したｐＸＬ３０４８へのｐＡＢ１のＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントのクローニングに起因する。
【図２】Ｃｒｏｕｚｅｔら、ＰＮＡＳ、９４、１４１４、１９９７に記載の方法による、プラスミドｐＡＢ２およびｐＸＬ３２１５由来の二重組換えによって作製されたプラスミドｐＸＬ３２１５の産生を示す図である。プラスミドｐＸＬ３２１５は、Ｅ１およびＥ３領域が欠失されたアデノウイルス５型ゲノムを含み、且つＮＩＳ発現カセットを含む。
【図３】Ａｄ−ＮＩＳベクターで感染された（感染多重度１０）ＦＴＲＬ−５およびＳｉＨａ細胞によるヨウ素１２５の蓄積速度を示す図である。速度の結果を、数／分／１０６細胞で示す。ヨウ素接触時のウェルあたりの細胞数の判定は、２つの測定の平均である。
【図４】３０、３００、および３０００μＭの過塩素酸塩（ＮａＣｌＯ４）の存在下でのＮＩＳによるヨウ素輸送の特異的阻害を示す図である。細胞とヨウ素１２５との間の接触時間は１５分間である。
【図５Ａ】Ａｄ−ＮＩＳベクターを感染させてない腫瘍によるインビボでのヨウ素蓄積を示す図である（コントロール）。ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳がんの腫瘍細胞）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行った。次いで、Ａｄ−ＣＭＶ−ＮＩＳベクターを一定の動物に腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍、腫瘍サイズ３〜６ｍｍ）。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射する。甲状腺上、腫瘍上、腫瘍のすぐ隣にプローブを置くことによって一定の時間間隔で１０秒間計数した。結果を、時間の関数として検出された数（１０秒間の測定）として示す。
【図５Ｂ】Ａｄ−ＮＩＳベクターを感染させた腫瘍によるインビボでのヨウ素蓄積を示す図である。ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳がんの腫瘍細胞）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行った。次いで、Ａｄ−ＣＭＶ−ＮＩＳベクターを一定の動物に腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍、腫瘍サイズ３〜６ｍｍ）。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射する。甲状腺上、腫瘍上、腫瘍のすぐ隣にプローブを置くことによって一定の時間間隔で１０秒間計数した。結果を、時間の関数として検出された数（１０秒間の測定）として示す。
【図６】腫瘍をＡｄ−ＮＩＳベクターで感染させたマウスのシンチグラフィーである。ＭＣＦ−７細胞（ヒト腫瘍細胞、乳癌）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行った。次いで、Ａｄ−ＮＩＳベクターを腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍、腫瘍サイズ３〜６ｍｍ）。注射から３日後、５０μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射する。ヨウ素注射から１時間後に計数をおこなった。画像は、動物の縦断図である。
【００７６】
材料と方法
一般的な分子生物学技術
分子生物学で慣習的に使用されている方法（プラスミドＤＮＡの予備的抽出、塩化セシウム勾配によるプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、フェノールまたはフェノール−クロロホルムによるタンパク質抽出、エタノールまたはイソプロパノールによる生理食塩水培地中でのＤＮＡの沈殿、Ｅｓｘｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの形質転換など）は、当業者に周知であり、文献中に多数記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら、「分子クローニング、実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ。、１９８２、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）。
【００７７】
ライゲーションでは、ＤＮＡフラグメントをアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によってそのサイズごとに分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させて、供給者の指示に従ってＴ４ファージＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートすることができる。
【００７８】
供給者の指示に従って、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、突出した５’末端の充填を行うことができる。供給者の指示に従って、Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で、突出した３’末端の破壊を行う。Ｓ１ヌクレアーゼで調節された処理によって突出した５’末端の破壊を行う。
【００７９】
Ａｍｅｒｓｈａｍから販売されているキットを使用し、Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３、１９８５、８７４９〜８７６４が開発した方法にしたがって、合成オリゴデオキシヌクレオチドによってインビトロで指向される変異誘発を行うことができる。
【００８０】
いわゆるＰＣＲ技術（ポリメラーゼ触媒連鎖反応、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、１９８５、１３５０〜１３５４、Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、１５５、１９８７、３３５〜３５０）によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅を、供給者の指示に従って、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を使用して行うことができる。
【００８１】
ヌクレオチド配列の評価を、Ａｍｅｒｓｈａｍから販売のキットを使用し、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、１９７７、５４６３〜５４６７が開発した方法によって行うことができる。
【実施例】
【００８２】
［実施例１］特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードする遺伝子を発現する欠陥組換えアデノウイルスの構築
本実施例は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ６０２８２を参照のこと）をコードする遺伝子を保有する欠陥アデノウイルスベクターの構築を記載する。
【００８３】
ＡａｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態のラットｎｉｓ遺伝子のヌクレオチド配列７４〜２０４６を含むフラグメント（Ｄａｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、４５８〜４６０）を、プラスミドｐＣＥＰ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。ＡａｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのＡｔＩＩ部位を、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）での処理で予め平滑にし、プラスミドｐＣＥＰ−４を挿入した。得られたプラスミドをｐＡＢ１と呼ぶ。
【００８４】
プラスミドｐＡＢ１（図１）は、サイトメガロウイルスＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ヌクレオチド−５２２〜＋７２）の調節下で発現するｎｉｓ遺伝子を含み（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５、Ｃｅｌｌ、４１、５２１〜５３０）、その後ろにＳＶ４０ウイルスポリアデニル化部位（ＳＶ４０ゲノムのヌクレオチド２５３８〜２７５９、Ｇｅｎｂａｎｋ遺伝子座ＳＶ４ＣＧ）を含む。
【００８５】
（ｉ）サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターと、（ｉｉ）ｎｉｓ遺伝子のｃＤＮＡと、（ｉｉｉ）ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化部位との組み合わせを、以後ＮＩＳ発現カセットと呼ぶ。
【００８６】
次いで、上記で定義のＮＩＳ発現カセットを含むプラスミドｐＡＢ１のＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント（３７１１ｂｐ）を、ＥｃｏＲＶで予め線状化したシャトルベクターｐＸＬ３０４８にクローン化する。得られたベクターを、ｐＡＢ２と呼ぶ（図２）。プラスミドｐＸＬ３０４８は、５型アデノウイルスゲノムの左側の末端（ヌクレオチド１〜３８２）、３つの固有のクローニング部位を含むポリリンカー、およびｐＩＸ遺伝子の一部（ヌクレオチド３４４６〜４２９６）を含むプラスミドＫａｎ−ＳａｃＢ（Ｃｒｏｕｚｅｔら、ＰＮＡＳ、９４、１４１４〜１４１９、１９９７）由来のプラスミドである。
【００８７】
アデノウイルスＡｄ−ＮＩＳを、Ｃｒｏｕｚｅｔら、ＰＮＡＳ、９４、１４１４〜１４１９、１９９７に記載の方法に従って、プラスミドｐＡＢ２とプラスミドｐＸＬ３２１５との間の相同組換えによって構築した。
【００８８】
プラスミドｐＸＬ３２１５は、そのＥ１領域（ΔＥ１ ３８６〜３４４６）にＲＳＶ−ＬａｃＺカセットを含み、Ｅ３領域（ΔＥ３ ２８５９２〜３０４７０）が欠失したアデノウイルスゲノムを含む。
【００８９】
構築の原理を、図２に示す。この二重組換えによって作製されたプラスミドｐＸＬ３２１５は、Ｅ１およびＥ３領域が欠失され、ＣＮＶ−ＮＩＳ−ポリＡ ＳＶ４０発現カセットを含む５型アデノウイルスゲノムを含む。この構築物を、ＮＩＳ発現カセットの配列決定によって評価する。
【００９０】
Ａｄ−ＮＩＳアデノウイルスを、２９３株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）へのＰａｃＩで消化したｐＸＬ３２１５のＤＮＡの挿入によって作製する。次いで、得られたウイルス粒子を、この同一の株で増幅させ、産生されたウイルスストックを、二重ＣｓＣｌ勾配によって精製する。
【００９１】
次いで、ウイルス粒子を使用して、種々の腫瘍株におけるＮＩＳ遺伝子の発現を研究する。
【００９２】
［実施例２］Ａｄ−ＮＩＳベクター感染腫瘍細胞によるインビトロでのヨウ素の蓄積
Ａｄ−ＮＩＳベクター感染細胞におけるヨウ素の蓄積能力を以下の種々の株で試験した：上皮腫瘍細胞ＳｉＨａ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３５）、乳癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣ ＨＴＢ−２２）およびＴ−４７Ｄ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３３）ならびに前立腺起源の腫瘍細胞ＤＵ−１４５（ＡＴＣＣＨＴＢ−８１）およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）。
【００９３】
細胞に感染多重度１０でＡｄ−ＮＩＳベクターを感染させた。細胞のヨウ素捕獲能力を、Ｗｅｉｓｓ らの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９８４、１１４、１０９０〜１０９８）にしたがって感染から２８〜２９時間後に試験する。感染細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄し、０．１μＣｉのヨウ素１２５を含むＨＢＳＳ緩衝液と共に図３に表示の時間接触させる。接触終了後、細胞を冷却ＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄し、冷却エタノールと２０分間インキュベートする。細胞によって捕獲されたヨウ素１２５の量を、ガンマカウンターを使用したエタノール中の放射能のアッセイによって同定する。
【００９４】
ＳｉＨａ株を使用して得られた結果を図３に示し、これを、ＦＲＴＬ−５細胞（ヨウ素を天然に捕獲し、コントロールとして使用したラット甲状腺細胞）で得られた結果と比較することができる。
【００９５】
過塩素酸塩の存在下でのＮＩＳによるヨウ素輸送体の特異的阻害を試験した。ＮａＣｌＯ４をヨウ素１２５を含むＨＢＳＳ緩衝液に添加して、３０、３００、および３０００μＭの最終濃度とする。細胞とヨウ素１２５との間の接触時間は１５分間である。結果を図４に示す。結果を、同数の細胞についての数として示す。
【００９６】
ＦＲＴＬ−５細胞（ポジティブコントロール）は、一定量のヨウ素を固定し、この現象は非常に急速である（接触から１５分後にほぼ最大に達する）ことが認められる。得られた結果より、感染していないＳｉＨａ細胞（ヒト上皮腫瘍細胞）はヨウ素を捕獲しないことが示される。驚いたことに、Ａｄ−ＮＩＳベクターを感染させたＳｉＨａ細胞はＦＲＴＬ−５細胞の５倍を超えるヨウ素を捕獲することが認められる。この現象の初速度はＦＲＴＬ−５細胞で認められた速度に匹敵することにも注目すべきである。輸送特異性を、ｎｉｓ遺伝子を含まないコントロールアデノウイルスでの感染によって確認した（結果を示さず）。
【００９７】
阻害実験の結果（図４）は、ＦＲＴＬ−５細胞のヨウ素固定が３０μＭのＮａＣｌＯ４濃度で９０％を超えて阻害されることを示す（３０μＭでは９３％、高濃度で９５％）。一方、Ａｄ−ＮＩＳを感染ＳなせたＳｉＨａ細胞では、同レベルの阻害を得るために必要なインヒビター濃度は、更により高い（３０μＭのＮａＣｌＯ４ではわずか４０％阻害、３００μＭのＮａＣｌＯ４では９２％阻害、３ｍＭのＮａＣｌＯ４では９８％阻害）ことに注目することが興味深い。
【００９８】
阻害実験により、ＮＩＳによるヨウ素イオン輸送の競合的および特異的阻害であるこの現象はＮａＣｌＯ４によって阻害されるので、Ａｄ−ＮＩＳ感染ＳｉＨａ細胞のヨウ素捕獲能力は確かにこれらの細胞中の発現ＮＩＳによると結論付けることが可能である。他のヒト腫瘍細胞株（乳癌細胞：ＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ、ならびに前立腺起源の腫瘍細胞：ＤＵ−１４５およびＰＣ−３）についても類似の結果が得られた。
【００９９】
ＮａＣｌＯ４による阻害に関する結果により、腫瘍細胞のＡｄ−ＮＩＳ感染により特に高レベルでＮＩＳが発現することも確認されるが、これはこの現象の阻害に高濃度のＮａＣｌＯ４が必要であるからである（ＳｉＨａ細胞およびＦＲＴＬ−５細胞の関連細胞の場合、同レベルの阻害を得るために１０倍を超える阻害濃度が必要である）。
【０１００】
これら全ての結果により、アデノウイルスベクターは、ｎｉｓ遺伝子の導入に特に有利なベクターであり、このようなベクターの使用により非甲状腺腫瘍細胞においてヨウ素１２５を天然に捕獲する細胞で認められるレベルの５倍の蓄積レベルを獲得可能であることが示される。
【０１０１】
［実施例３］Ａｄ−ＮＩＳベクター感染腫瘍によるインビボでのヨウ素蓄積
ＭＣＦ−７細胞（乳癌のヒト腫瘍細胞）を、ヌードマウスに皮下注射した（５×１０６細胞）。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行い、動物の甲状腺を安静にした。次いで、Ａｄ−ＮＩＳベクターを一定の動物に腫瘍内経路で注射した（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍）。注射時の腫瘍の直径は３〜６ｍｍであった。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを、腹腔内経路でマウスに注射し、動物の異なる部位に移動することができるプローブの支援によって１０秒間にわたり計数した。甲状腺上、腫瘍上、腫瘍のすぐ隣にプローブを置くことによって一定の時間間隔で計数した。結果を図５に示す。結果を、時間の関数として検出された数（１０秒間の測定）として示す。
【０１０２】
コントロール動物（Ａｄ−ＮＩＳを未投与）では、甲状腺は、少量のヨウ素を固定するが、チロキシンでの治療による甲状腺中のヨウ素の実質的な蓄積は長時間認められない。コントロール動物では、腫瘍中のヨウ素固定は認められない（図５Ａを参照のこと）。ＮＩＳが胃中に天然に存在するという事実およびヨウ素が尿から排泄されるという事実は、比較的高い値が認められることの説明となる（比較的高いバックグラウンドノイズ）。
【０１０３】
腫瘍内経路によって投与されたＡｄ−ＮＩＳ治療動物（図５Ｂ）では、甲状腺中の実質的なヨウ素蓄積が認められない（チロキシンの治療効果）。これらの動物では、腫瘍上にプローブを置くことによって検出されたヨウ素の量は、腫瘍付近で検出されたヨウ素量よりも系統的に高く、これはＡｄ−ＮＩＳベクターでの治療後に実際に腫瘍中でヨウ素が固定されたことを示す。
【０１０４】
腫瘍中でのヨウ素固定を確認するために、Ａｄ−ＮＩＳベクターで処理した動物におけるシンチグラフィーによる放射能測定を行った。得られた結果を図６に示す。５０μ／Ｃｉの１２３Ｉを腹腔内経路で注射する以外は上記のプロトコールにしたがって使用動物を調製し、ヨウ素注射から１時間後に画像を得た。
【０１０５】
画像は動物の縦断図である。以下の４つのヨウ素固定領域が明らかである：甲状腺、膀胱（ヨウ素排泄経路）、胃（天然でＮＩＳが発現される）、および腫瘍。これらのシンチグラフィーの結果により計数によって得られた先の結果が確認され、これは、本発明のベクターにより腫瘍中の実質的なヨウ素固定が可能であることを示す。
【０１０６】
［実施例４］Ａｄ−ＮＩＳベクター感染腫瘍によるヨウ素蓄積の定量的評価
ＳｉＨａ細胞（５×１０６細胞）を、ヌードマウス（ｎ＝１２）の両側腹に皮下注射した。１５日後（腫瘍の出現）、チロキシンの腹腔内注射（２μｇ／動物／日）を毎日１５日間行い、動物の甲状腺を安静にした。各動物について、Ａｄ−ＮＩＳベクターを腫瘍に腫瘍内経路で注射し（２×１０９ｐｆｕ／腫瘍）、他の腫瘍をコントロールとして使用した。注射時の腫瘍の直径は５〜８ｍｍであった。注射から３日後、６μＣｉの１２５Ｉを腹腔内経路でマウスに注射した。１２５Ｉ投与から９０分後に動物を屠殺し、１２５Ｉの量を同定した。結果を表１に示す。結果を、１ｇの組織に投与した１２５Ｉの百分率として示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
得られた結果により、Ａｄ−ＮＩｓベクターで治療した腫瘍はヨウ素１２５Ｉを非常に効率的に蓄積することができ、未処理腫瘍よりも２５倍まで高いことが示される。これらの結果により先の結果が確認され、本発明のベクターにより腫瘍中のヨウ素が実質的に固定可能であることが示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むこと特徴とする、欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
前記ＤＮＡ配列が特異的マウスヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
前記ＤＮＡ配列が特異的ヒトヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウイルス
【請求項６】
前記ＤＮＡ配列が腫瘍細胞中でのその発現を可能にする転写プロモーターの調節下に存在することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
前記転写プロモーターがウイルスプロモーター、好ましくはＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶ−ＬＴＲ、ＭＴ−１、ＳＶ４０のプロモーターから選択されることを特徴とする、請求項６に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
ＣＭＶプロモーターの調節下でヒトヨウ素輸送体ＮＩＳをコードするｃＤＮＡ配列を含む、欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項９】
腫瘍細胞中での主な発現を可能にするプロモーターの調節下でヨウ素輸送体ＮＩＳまたはその誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む、欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記プロモーターが、エラスターゼＩ遺伝子、インスリン遺伝子、免疫グロブリンの遺伝子、マウス乳腺癌ウイルス、ＰＳＡ遺伝子、αフェトプロテイン遺伝子、α１抗トリプシン遺伝子、βグロビン遺伝子、塩基性ミエリン遺伝子、ミオシン軽鎖２の遺伝子、およびゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子の調節配列から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
少なくともＥ１領域の全てまたは一部が欠失されており、且つＥ４領域の全部または一部が欠失されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
Ｅ４領域の全てまたは一部がさらに欠失されていることを特徴とする、請求項１１に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
ヒトアデノウイルスＡｄ２型またはＡｄ５型またはイヌアデノウイルスＣＡＶ−２型であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
グルコースオキシダーゼまたは甲状腺ペルオキシダーゼの遺伝子などのペルオキシダーゼ系に関連するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
腫瘍成長の治療および／または阻害を意図する薬学的組成物の調製用の、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアデノウイルスの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の１つまたは複数の欠陥組換えアデノウイルスを含む薬学的組成物。
【請求項１７】
注射可能形態であることを特徴とする、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
１０４と１０１４ｐｆｕ／ｍｌとの間、好ましくは１０６と１０１１ｐｆｕ／ｍｌとの間の欠陥組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする、請求項１６または１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１】
特異的ヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むこと特徴とする、欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
前記ＤＮＡ配列が特異的マウスヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
前記ＤＮＡ配列が特異的ヒトヨウ素輸送体（Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体）ＮＩＳをコードすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウイルス
【請求項６】
前記ＤＮＡ配列が腫瘍細胞中でのその発現を可能にする転写プロモーターの調節下に存在することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
前記転写プロモーターがウイルスプロモーター、好ましくはＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶ−ＬＴＲ、ＭＴ−１、ＳＶ４０のプロモーターから選択されることを特徴とする、請求項６に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
ＣＭＶプロモーターの調節下でヒトヨウ素輸送体ＮＩＳをコードするｃＤＮＡ配列を含む、欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項９】
腫瘍細胞中での主な発現を可能にするプロモーターの調節下でヨウ素輸送体ＮＩＳまたはその誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む、欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記プロモーターが、エラスターゼＩ遺伝子、インスリン遺伝子、免疫グロブリンの遺伝子、マウス乳腺癌ウイルス、ＰＳＡ遺伝子、αフェトプロテイン遺伝子、α１抗トリプシン遺伝子、βグロビン遺伝子、塩基性ミエリン遺伝子、ミオシン軽鎖２の遺伝子、およびゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子の調節配列から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の欠陥組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
少なくともＥ１領域の全てまたは一部が欠失されており、且つＥ４領域の全部または一部が欠失されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
Ｅ４領域の全てまたは一部がさらに欠失されていることを特徴とする、請求項１１に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
ヒトアデノウイルスＡｄ２型またはＡｄ５型またはイヌアデノウイルスＣＡＶ−２型であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
グルコースオキシダーゼまたは甲状腺ペルオキシダーゼの遺伝子などのペルオキシダーゼ系に関連するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
腫瘍成長の治療および／または阻害を意図する薬学的組成物の調製用の、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアデノウイルスの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の１つまたは複数の欠陥組換えアデノウイルスを含む薬学的組成物。
【請求項１７】
注射可能形態であることを特徴とする、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
１０４と１０１４ｐｆｕ／ｍｌとの間、好ましくは１０６と１０１１ｐｆｕ／ｍｌとの間の欠陥組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする、請求項１６または１７に記載の薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−４８６２６（Ｐ２０１３−４８６２６Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２２５７９４（Ｐ２０１２−２２５７９４）
【出願日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【分割の表示】特願２００１−５０２７９０（Ｐ２００１−５０２７９０）の分割
【原出願日】平成１２年６月８日（２０００．６．８）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２５７９４（Ｐ２０１２−２２５７９４）
【出願日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【分割の表示】特願２００１−５０２７９０（Ｐ２００１−５０２７９０）の分割
【原出願日】平成１２年６月８日（２０００．６．８）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
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