特異的抗Ｌ１抗体を用いる腫瘍の処置
本発明は、抗L1モノクローナル抗体9.3ならびに関連した抗体または結合性分子に関し、さらには特に腫瘍の処置における、それらの使用法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的抗L1抗体の使用による腫瘍の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行癌の標準的な処置は多くの場合、化学療法または放射線療法である。しかし、処置法に対する当初の反応にもかかわらず、種々の癌が化学療法薬または放射線療法に対する抵抗性を獲得して、腫瘍再発および患者の高頻度の死亡を招くことが往々にして観察される。多くの場合は、続いて別の化学療法薬またはより高用量に切り換えることが決められる。しかし、臨床状況の改善は観察されないことがしばしばである。
【０００３】
L1は、構造的にはIgスーパーファミリーに属する、200〜230kDaのI型膜糖タンパク質である（Moos M, Tacke R, Scherer H, Teplow D, Fruh K, Schachner M. Neural adhesion molecule L1 as a member of the immunoglobulin superfamily with binding domains similar to fibronectin. Nature 1988; 334:701-3（非特許文献1））。L1は、発生中の神経系における軸索誘導および細胞遊走において非常に重要な役割を果たす（Hortsch M. Structural and functional evolution of the L1 family: are four adhesion molecules better than one? Mol Cell Neurosci 2000; 15:1-10. （非特許文献2）, Schachner M. Neural recognition molecules and synaptic plasticity. Curr Opin Cell Biol 1997; 9:627-34（非特許文献3））。最近の研究では、L1の発現がヒト癌の進行に結びつけられている。L1の発現は、肺癌（Katayama M, Iwamatsu A, Masutani H, Furuke K, Takeda K, Wada H, et al. Expression of neural cell adhesion molecule L1 in human lung cancer cell lines. Cell Struct Funct 1997;22:511-6（非特許文献4））、グリオーマ（Senner V, Kismann E, Puttmann S, Hoess N, Baur I, Paulus W. L1 expressed by glioma cells promotes adhesion but not migration. Glia 2002;38:146-54（非特許文献5））、黒色腫（Thies A, Schachner M, Moll I, Berger J, Schulze HJ, Brunner G, et al. Overexpression of the cell adhesion molecule L1 is associated with metastasis in cutaneous malignant melanoma. Eur J Cancer 2002;38:1708-1（非特許文献6）, Fogel M, Mechtersheimer S, Huszar M, Smirnov A, Abu DA, Tilgen W, et al. L1 adhesion molecule (CD 171) in development and progression of human malignant melanoma. Cancer Lett 2003;189:237-47（非特許文献7））、腎癌（Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I. Antineuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer, 1999; 83: 401-408（非特許文献8）, Allory Y, Matsuoka Y, Bazille C, Christensen El, Ronco P, Debiec H. The L1 cell adhesion molecule is induced in renal cancer cells and correlates with metastasis in clear cell carcinomas. Clin Cancer Res 2005;11:1190-7（非特許文献9））および結腸癌（Gavert N, Conacci-Sorrell M, Gast D, Schneider A, Altevogt P, Brabletz T, et al. L1, a novel target of beta-catenin signaling, transforms cells and is expressed at the invasive front of colon cancers. J Cell Biol 2005; 168:633-42（非特許文献10））を含む、種々の腫瘍で見いだされている。さらに、L1は卵巣癌および子宮内膜癌において病期依存的な様式で過剰発現されることが当技術分野で公知である（Fogel M, Gutwein P. Mechtersheimer S, Riedle S. Stoeck A, Smirnov A, et al. L1 expression as a predictor of progression and survival in patients with uterine and ovarian carcinomas. Lancet 2003; 362:869-75（非特許文献11））。
【０００４】
当技術分野では、卵巣癌および子宮内膜癌の処置のために抗L1抗体を用いることが提案されている（参照、WO 02/04952号（特許文献1）、WO 06/013051号（特許文献2）およびArlt MJ, Novak-Hofer I, Gast D, Gschwend V, Moldenhauer G, Grunberg J, et al. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer Res 2006;66:936-43（非特許文献12））。当技術分野では、さまざまな抗L1抗体が公知である（例えば、mAb 14.10: Huszar M, Moldenhauer G, Gschwend V, Ben-Arie A, Altevogt P, Fogel M: Expression profile analysis in multiple human tumors identifies L1 (CD171) as a molecular marker for differential diagnosis and targeted therapy. Hum Pathol 37:1000-1008, 2006（非特許文献13）, mab chCE7: Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I: Anti-neuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer 83:401-408, 1999（非特許文献14）, mAb UJ127.11: Patel K, Kiely F, Phimister E, Melino G, Rathjen F, Kemshead JT: The 200/220 kDa antigen recognized by monoclonal antibody (MAb) UJ127.11 on neural tissues and tumors is the human L1 adhesion molecule. Hybridoma 10:481-491, 1991（非特許文献15）, mAb 5G3: Wolff JM, Frank R, Mujoo K, Spiro RC, Reisfeld RA, Rathjen FG: A human brain glycoprotein related to the mouse cell adhesion molecule L1. J Biol Chem 263:11943-11947, 1988（非特許文献16））。さらに、Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19):2759-68, Epub 2006 Nov 6（非特許文献17）では、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために腫瘍細胞の感受性を高める目的で抗L1抗体を用いることが提案されている。
【０００５】
改良された抗腫瘍剤に対しては常に需要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 02/04952号
【特許文献２】WO 06/013051号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Moos M, Tacke R, Scherer H, Teplow D, Fruh K, Schachner M. Neural adhesion molecule L1 as a member of the immunoglobulin superfamily with binding domains similar to fibronectin. Nature 1988; 334:701-3
【非特許文献２】Hortsch M. Structural and functional evolution of the L1 family: are four adhesion molecules better than one? Mol Cell Neurosci 2000; 15:1-10.
【非特許文献３】Schachner M. Neural recognition molecules and synaptic plasticity. Curr Opin Cell Biol 1997; 9:627-34
【非特許文献４】Katayama M, Iwamatsu A, Masutani H, Furuke K, Takeda K, Wada H, et al. Expression of neural cell adhesion molecule L1 in human lung cancer cell lines. Cell Struct Funct 1997;22:511-6
【非特許文献５】Senner V, Kismann E, Puttmann S, Hoess N, Baur I, Paulus W. L1 expressed by glioma cells promotes adhesion but not migration. Glia 2002;38:146-54
【非特許文献６】Thies A, Schachner M, Moll I, Berger J, Schulze HJ, Brunner G, et al. Overexpression of the cell adhesion molecule L1 is associated with metastasis in cutaneous malignant melanoma. Eur J Cancer 2002;38:1708-1
【非特許文献７】Fogel M, Mechtersheimer S, Huszar M, Smirnov A, Abu DA, Tilgen W, et al. L1 adhesion molecule (CD 171) in development and progression of human malignant melanoma. Cancer Lett 2003;189:237-47
【非特許文献８】Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I. Antineuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer, 1999; 83: 401-408
【非特許文献９】Allory Y, Matsuoka Y, Bazille C, Christensen El, Ronco P, Debiec H. The L1 cell adhesion molecule is induced in renal cancer cells and correlates with metastasis in clear cell carcinomas. Clin Cancer Res 2005;11:1190-7
【非特許文献１０】Gavert N, Conacci-Sorrell M, Gast D, Schneider A, Altevogt P, Brabletz T, et al. L1, a novel target of beta-catenin signaling, transforms cells and is expressed at the invasive front of colon cancers. J Cell Biol 2005; 168:633-42
【非特許文献１１】Fogel M, Gutwein P. Mechtersheimer S, Riedle S. Stoeck A, Smirnov A, et al. L1 expression as a predictor of progression and survival in patients with uterine and ovarian carcinomas. Lancet 2003; 362:869-75
【非特許文献１２】Arlt MJ, Novak-Hofer I, Gast D, Gschwend V, Moldenhauer G, Grunberg J, et al. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer Res 2006;66:936-43
【非特許文献１３】Huszar M, Moldenhauer G, Gschwend V, Ben-Arie A, Altevogt P, Fogel M: Expression profile analysis in multiple human tumors identifies L1 (CD171) as a molecular marker for differential diagnosis and targeted therapy. Hum Pathol 37:1000-1008, 2006
【非特許文献１４】Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I: Anti-neuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer 83:401-408, 1999
【非特許文献１５】Patel K, Kiely F, Phimister E, Melino G, Rathjen F, Kemshead JT: The 200/220 kDa antigen recognized by monoclonal antibody (MAb) UJ127.11 on neural tissues and tumors is the human L1 adhesion molecule. Hybridoma 10:481-491, 1991
【非特許文献１６】Wolff JM, Frank R, Mujoo K, Spiro RC, Reisfeld RA, Rathjen FG: A human brain glycoprotein related to the mouse cell adhesion molecule L1. J Biol Chem 263:11943-11947, 1988
【非特許文献１７】Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19):2759-68, Epub 2006 Nov 6
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、1つの局面において、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3によって認識されるのと同じL1エピトープと結合することのできる抗L1モノクローナル抗体に関する。
【０００９】
本発明の文脈において、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3が、驚いたことに、改良された抗腫瘍能能力を有することが見いだされた（実施例参照）。特に、モノクローナル抗体9.3は、検討したすべての抗体のうちで、腫瘍細胞の腫瘍成長および浸潤を阻害する最も優れた能力を有していた。さらに、モノクローナル抗体9.3は、WO 2008/046529号で試験した抗体11Aを上回る程度で化学療法抵抗性を消失させるように思われる（実施例13参照）。
【００１０】
モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産は先端技術であり、実施例の材料および方法の項に引用した参考文献中にも記載されている。一般に、モノクローナル抗体は、例えば、Winter & Milsteinの方法（Winter, 0. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299）に従って調製することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製することに代わる選択肢として、本発明のポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を関心対象のポリペプチドを用いてスクリーニングすることによって同定して単離することもできる。ファージディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングのためのキットは市販されている（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01；およびStratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに用いるのに特に適している方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；WO 92／18619号；WO 91／17271号；WO 92／20791号；WO 92／15679号；WO 93／01288号；WO 92／01047号；WO 92／09690号；WO 90／02809号；Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281；Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12:725-734にみることができる。
【００１１】
抗体の効果は、それが特異的エピトープと結合する能力によって媒介されるため、本発明は、抗体9.3と同じエピトープを認識するすべてのモノクローナル抗体に関する。所与の抗体のエピトープを決定するための方法は当技術分野で公知であり、これには関心対象の所与の領域の合成線状ペプチドの調製、およびその後の、抗体が前記ペプチドと結合するか否かの試験が含まれる（Epitope Mapping, A practical approach, Oxford University Press 2001, Editors: Olwyn Westwood and Frank Hayを参照）。または、関心対象の領域をカバーする種々の組換えタンパク質を作製し、抗体の結合に関して試験することもできる（Oleszewski, M., Gutwein, P.,von der Lieth, W., Rauch, U., Altevogt, P. Characterization of the L1-neurocan binding site. Implications for L1-L1 homophilic binding. J.Biol.Chem. 275: 34478-34485 (2000)。
【００１２】
さらに、モノクローナル抗体のエピトープがひとたび判明すれば、同じエピトープと結合する、以下に定義するような他の抗体、特にモノクローナル抗体または結合性分子を同定または調製することは当業者の技能の範囲内にある。例えば、エピトープマッピングの文脈で上述したペプチドまたはタンパク質を、前記抗体または結合性分子の同定または作製のために用いることが可能である。
【００１３】
実施例から把握しうるように、抗体9.3のエピトープは、L1の第1の免疫グロブリン様ドメインを備えている。このため、本発明のモノクローナル抗体のエピトープは、L1の第1の免疫グロブリン様ドメインの内部にあることが好ましい。
【００１４】
もう1つの局面において、本発明は、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3と同じ腫瘍成長阻害能力を有する抗L1モノクローナル抗体に関する。この能力は、実施例1の1.3.9項に記載したのと同じ腫瘍成長アッセイを用いることによって試験することができる。本発明によれば、「同じ能力」とは、モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体9.3の腫瘍成長阻害能力との違いが5％を上回らない腫瘍成長阻害能力を有することを意味する。
【００１５】
好ましくは、本発明のこの抗体は、抗体5G3に関して示されているように（上記参照）、L1の二量体化も阻害する。
【００１６】
もう1つの局面において、本発明は、その相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つが、
a）以下の配列
のうち1つを有すること、または
b）a）において言及した配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する配列を有すること、
を特徴とする、抗L1モノクローナル抗体に関する。
【００１７】
上述した配列は、Kabatの方法に従って決定されるモノクローナル抗体9.3のCDRを示す（実施例2参照）。そのような本発明のモノクローナル抗体は、例えば、CDRグラフティング（CDR grafting）により、または抗体の組換え作製によって作製することができる。そのような方法は技術分野で公知である（例えば、Queen、米国特許第5,585,089号、およびWinter、U.S: 5,225,539号、Cabilly U.S. 4,816,567号を参照）。
【００１８】
もう1つの局面において、本発明はまた、その相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つが、
a）以下の配列
のうち1つを有すること、または
b）a）において言及した配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する配列を有すること、
を特徴とする、抗L1モノクローナル抗体にも関する。
【００１９】
これらの配列も同じく、モノクローナル抗体9.3のCDRを示す（図12参照）が、そのCDRは、当技術分野で公知の別の方法を用いて、すなわち国際的ImMunoGeneTics情報システム（登録商標）によるIMGT（登録商標）方法に従って決定される。
【００２０】
1つの特に好ましい局面において、本発明は、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体に関する。このハイブリドーマ細胞は、Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellenにより、ブダペスト条約に準拠して2007年4月25日に寄託されている。
【００２１】
もう1つの局面において、本発明は、上記のような本発明のモノクローナル抗体を基にしたヒト化抗体に関する。
【００２２】
ヒト化抗体とは、非ヒト種由来の1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域（FR）を有する、非ヒト種由来の抗体分子のことである（例えば、Queen、米国特許第5,585,089号、およびWinter、US U.S: 5,225,539号を参照）。そのようなキメラ型モノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA技術によって作製することができる。
【００２３】
一般に、ヒト化抗体を得るためには、ヒト（アクセプター）配列の1つまたは複数のCDR配列をマウス抗体配列（ドナー配列）中の各々のCDRをコードする配列によって置き換えることにより、ヒト可変重鎖および可変軽鎖をコードする核酸配列を改変しうる。ヒトアクセプター配列は、異なる遺伝子に由来するFRを含んでもよい。
【００２４】
1つの好ましい態様において、本発明のヒト化抗体は、少なくとも1つの非ヒトCDRおよびヒトフレームワーク領域（FR）残基を有する。
【００２５】
次いで、付与された可変重鎖配列および可変軽鎖配列をヒトの定常重鎖領域および定常軽鎖領域と連結することにより、完全長抗体をコードする配列を得ることができる。好ましいヒト定常軽鎖配列にはκおよびλ定常軽鎖配列が含まれる。好ましいヒト定常重鎖配列には、IgG1、IgG2、および免疫刺激性が付与されたIgG1突然変異体をコードする配列が含まれる。そのような突然変異体は、補体および／または抗体依存性細胞傷害性を活性化する能力が低下していてもよく、それらはUS 5,624,821号；WO 99/58572号、US 6,737,056号に記載されている。特に好ましい定常重鎖は、置換E233P、L234V、L235A、A327G、A330S、P331S、および残基236の欠失を含むIgG1である。
【００２６】
もう1つの態様において、完全長抗体はIgA、IgD、IgE、IgM、IgYまたはIgW配列を含む。
【００２７】
適したヒトドナー配列は、マウスドナー配列によってコードされるペプチド配列と一群のヒト配列との、好ましくはヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子または成熟抗体遺伝子によってコードされる配列との配列比較によって決定することができる。決定された、高い配列相同性を有する、好ましくは最も高い相同性を有するヒト配列を、ヒト化工程のためのアクセプター配列として役立てることができる。
【００２８】
ヒトCDRのマウスCDRによる交換に加えて、最適化された特性（抗原の親和性など）を有するヒト化抗体をコードする配列を得るために、ヒトドナー配列におけるさらなる操作を行うこともできる。
【００２９】
1つの好ましい例においては、ヒトアクセプター配列中の重鎖残基31〜35、50〜58および95〜102、ならびに残基6、23、24および49を、マウス配列の各々の残基に対応するように改変する（Adair、U.S. 5,859,205号）。
【００３０】
さらに、改変されたヒトアクセプター抗体可変ドメイン配列を、マウスドナー配列に対応する軽鎖可変領域の位置4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98、および重鎖可変領域の位置2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92のうち1つまたは複数のアミノ酸（Kabat付番方式による）をコードするようにさせることもできる（Carter and Presta、U.S. 6,407,213号）。
【００３１】
マウスL1抗体のヒト化は実施例2に記載されている。
【００３２】
また、CDRの配列を、好ましくは保存的アミノ酸交換を招く交換によって改変することもできる。
【００３３】
一般に、操作はFR領域ならびにCDR領域における改変を結果的にもたらすと考えられ、これには残基の交換、欠失および挿入が含まれる。改変はランダムまたは定方向突然変異誘発によって誘導することができる。前に述べたような抗体ファージディスプレイ系を、所望のおよび／または改良された特性を備える突然変異体の選択のために利用することができる。
【００３４】
もう1つの局面において、本発明は、抗体9.3と同じエピトープを認識することのできるヒト抗体に関する。ヒト抗体を作製するための方法は当技術分野で公知である。これらの方法は、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されて、ヒト免疫グロブリン座位が導入されたマウスを利用する。免疫原性エピトープによる免疫処置を行うと、これらのマウスはヒト抗体を産生することができる（U.S. 5,545,807号；同5,545,806号；同5,569,825号；同5,589,369号；同5,591,669号；同5,625,126号；同5,633,425号；同5,661,016号）。
【００３５】
1つのさらなる好ましい態様において、本発明のヒト化抗体は、図8a）およびb）に示されているようなL1_9.3huまたはL1_9.3hu3の配列を含む。
【００３６】
もう1つの局面において、本発明は、
a）以下の配列
のうち少なくとも1つ、または
b）a）に挙げられた配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する、少なくとも1つの配列、
を含む、結合性分子に関する。
【００３７】
以上に説明したように、これらの配列は抗体9.3のCDRを示す（実施例2参照）。
【００３８】
もう1つの局面において、本発明は、
a）以下の配列
のうち少なくとも1つ、または
b）a）に挙げられた配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する、少なくとも1つの配列、
を含む、結合性分子に関する。
【００３９】
以上に説明したように、これらの配列も同じく、当技術分野で公知の別の方法によって決定される、モノクローナル抗体9.3のCDRを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】（A）CHO、CHO-L1、SKOV3ipおよびOVMz細胞のFACS分析。細胞を指定のmAb（10μg／ml）によって4℃で30分間にわたり染色した。その後に二次PE結合mAbを用いた。（B）ウエスタンブロット分析。CHO 野生型、CHO-L1、OVMzおよびSKOV3ip細胞からの細胞溶解物をPVDF膜に移行させ、続いてL1に対する指定のmAb（1μg／ml）とともにインキュベートし、その後にPOX-結合二次mAbを用いた。
【図２】（A）SKOV3ip細胞におけるErk-リン酸化に対する抗体の影響。細胞を、L1に対する指定の精製抗体（10μg／ml）またはアイソタイプ対照IgG1とともに37℃で24時間インキュベートした。細胞を同じくDMSO（媒体）またはMEK特異的阻害薬PD59098でも処理した。細胞溶解物をErkのリン酸化に関して調べた。（B）SKOV3ip細胞におけるErkリン酸化に対する抗体の影響。ホスホ-Erk特異的抗体およびAlexa488結合二次mAbによる抗体処置細胞の蛍光染色。
【図３】マトリゲル細胞浸潤の分析。抗体（10μg／ml）で処置したSKOV3ip細胞を4ウェルプレートに播き、20時間にわたりマトリゲル中に浸潤させた（5％ CO2；37℃）。
【図４】SKOV3ip細胞における遺伝子発現の差異。（A）SKOV3ip細胞にL1特異的siRNAまたはスクランブルsiRNAをトランスフェクトして、72時間後にmRNAを単離し、cDNAに転写させて、qPCRのためのテンプレートとして用いた（SYBRgreen分析）。（B）SKOV3ip細胞をL1-9.3mAb（10μg／ml）または対照mAB IgG1（10μg／ml）で処置して、96時間後にmRNAを単離し、cDNAに転写させて、指定の遺伝子の発現に関してqPCRによって分析した（SYBRgreen分析）。（C）残存する腫瘍細胞の遺伝子発現の差異。残存する腫瘍からのmRNAを抗体で処置した動物から単離し、cDNAに転写させて、指定の遺伝子の発現に関してqPCRによって分析した。
【図５】ヌードマウスにおける腫瘍成長。LacZでタグ標識したSKOV3ip細胞をヌードマウスに腹腔内注射し、腫瘍移植後に動物を指定のL1 mAbまたは対照mAb EpCAM（Hea125）によって処置した。30日後に腫瘍体積を決定し、X-Galで染色された腫瘍塊と全内臓（total situs）との比として提示する。各群当たり6匹の動物個体を分析した。
【図６】（A）L1-V5構築物のウエスタンブロット分析。トランスフェクトされたSf9昆虫細胞の上清をRicardo Gouveiaから受領し、L1-9.3mAbを用いるウエスタンブロットによって分析し、抗V5 mAbによって再プロービングした。（B）L1-FC構築物のウエスタンブロット分析。Jet PEI（商標）トランスフェクション試薬を記載通りに用いて、L1-FC構築物をCos-7細胞にトランスフェクトした。3日後に上清をSepharoseAを用いて精製し、L1-9.3mAbを用いるウエスタンブロットによって分析した。
【図７】同種親和性（homophilic）細胞接着アッセイ。（A）J558-L1細胞の結合を明視野顕微鏡検査によって分析した。各処置の一例をここに示している。赤のボックスにはL1-Fc（10μg／ml）によるコーティングが強調されており、黒のボックスではいずれも対照であるフィブロネクチン（10μg／ml）およびBSAが示されている。（B）このグラフは、指定の抗体または対照による処置後の結合細胞の平均±SDを示している。
【図８】ヒト化抗体を構築するために用いた抗体軽鎖および重鎖のDNA配列が、それぞれ図8aおよび8bに提示されている。
【図９】マウスL1_9.3 scFv（a）ならびにヒト化L1_9.3Hu scFv（b）およびL1_9.3Hu3 scFv（c）のアミノ酸配列。
【図１０】L1_9.3 scFv（a）、L1-9.3Hu scFv（b）およびL1_9.3Hu3 scFv（c）構築物の発現された部分のDNA配列およびアミノ酸配列。
【図１１】ヒトL1癌抗原に対するL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvの結合。列A、BおよびCはL1でコーティングされ、列D、EおよびFはストレプトアビジンでコーティングされている。ウェルの青色は個々のscFvとプレート上のL1との結合を指し示している。ストレプトアビジンでコーティングされた列に色がないことは、一本鎖抗体がL1と特異的に結合することを示している。
【図１２】モノクローナル抗体9.3の可変ドメインのゲノム配列。a）κ鎖可変領域の配列（点線：CDR1、破線：CDR2、下線：CDR3）b）重鎖可変領域の配列（点線：CDR1、破線：CDR2、下線：CDR3）
【図１３】A）ヒトPBMCおよびL1陽性OVMZ腫瘍細胞をL1-9.3mAbとともに24時間インキュベートして、結合した抗体の量をFACS分析によって分析した。B）回帰曲線から最大半値結合での濃度を用いて解離定数KDを推定した。
【図１４】L1-9.3は休止ヒトPBMCおよび活性化ヒトPBMCによるサイトカインの放出に影響を及ぼさない。3例の異なるドナーからの休止PBMCおよびOKT3で活性化したPBMCのサイトカインレベルを、20μg／mlのL1-9.3の存在下または非存在下での24時間のインキュベーション後に決定した。ロノマイシン／PMAおよびLPSを刺激対照として用いた。IFN-γ（A）およびTNF-α（B）に関する結果を示している。
【図１５】L1-9.3はT細胞増殖を誘導せず、OKT3で誘導されるT細胞増殖に対して何ら影響を及ぼさない。2例の異なるドナーからの、OKT3で活性化したPBMCの増殖を、20μg／mlのL1-9.3の存在下または非存在下で、刺激から48時間後にBrdU取り込みアッセイを用いて決定した。抗体を75ng／mlのOKT3による刺激の前、同時並行または後のいずれに添加するかにかかわらず、差はみられなかった。L1-9.3はそれ自体ではT細胞活性化をもたらさなかった。
【図１６】L1-9-3はL1の脱グリコシル化によって影響されない。非処置および脱グリコシル化された細胞溶解物におけるL1のウエスタンブロット染色が、いくつかの異なる抗L1 mAbを用いて示されている。被験抗体は、それらのグリコシル化依存性に関して3つのクラスに分けることができる：第1のクラス（グリコシル化によって影響されない）：L1-9.3。第2のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって負の影響を受ける）：11A、14.10、OV52.24およびOV549.20。第3のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって正の影響を受ける）：35.9および38.12。
【図１７】この図は、静脈内投与されたL1-9.3の、腎臓の集合管に対するインビボ結合を示している。インビボ結合は増幅システムCSA（図17A）を用いた場合にのみ検出可能であり、一方、従来のABC法を用いることによっては全くシグナルが視認されなかった（図17B）。このことからみて、L1-9.3は組織中で30〜300pmolの範囲で検出された（L1-9.3濃度はおそらく5ng／mlよりも高く、かつ50ng／ml未満であると考えられる）。陰性対照は染色を示さず、それ故に非特異的な染色の可能性は否定することができる（図17C）。インビボで結合したL1-9.3の染色パターン（図17A）は、組織切片をL1-9.3で直接染色した時の腎臓におけるL1発現パターンに対応する（図17D）。
【図１８】ヒト化L1-9.3mAbのFACS分析SKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞におけるフローサイトメトリー分析。細胞を指定のヒト化mAb（10μg／ml）によって4℃で30分間染色し、続いて二次PE結合mAbを用いた。
【図１９】マウスSKOV3ip異種移植モデル7*106個のSKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞を、6週齡のCD1 nu/nu雌性マウスに腹腔内注射した。24時間後にマウスを、マウス10匹ずつの群に無作為割り付けした。各群のマウスに対して、300μgのmAb L1-chi9.3、mAbL1-hu3またはPBSを腹腔内に週3回注射した。第33日にマウスの画像を撮影した（図2）。腫瘍体積はXENOGEN IVIS 200システムを用いて決定した。手短に述べると、マウスに麻酔をかけて、100μlのルシフェリンD（3μg／匹）を腹腔内に注射した。その後に、光放射を検出することによって腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。腫瘍体積は1秒当たりのフォトン数（全フラックス（total flux））として示されている。統計分析はスチューデントのt検定を用いて行った。
【図２０】インビボの全腫瘍塊 36日後にマウスを殺処理し、腫瘍塊を決定した。腫瘍成長は腫瘍塊と体重との比として提示される（A 個々のマウス、B 平均値）。統計分析はスチューデントのt検定を用いて行った。このように、L1 9.3抗体による免疫不全マウスの処置を、キメラ型およびヒト化型L1 9.3mAbによって再現することができた。
【図２１】PT45-P1res細胞を、1μg／mLもしくは10μg／mLの抗L1CAM抗体9.3または1μg／mLもしくは10μg／mLのアイソタイプを、一致させた対照抗体の非存在下（w／o）または存在下で、処置しないままにするか（w／o）、または20μg／mLのゲムシタビン（A）もしくはエトポシド（B）で処置した。24時間後に、細胞をカスパーゼ-3／-7アッセイによって分析した。3回の独立した実験による平均±SDを示している。*はp＜0.05を指し示している。
【図２２】Colo357細胞を、1μg／mLもしくは10μg／mLの抗L1CAM抗体9.3、または1μg／mLもしくは10μg／mLのアイソタイプを一致させた対照抗体の、非存在下（w／o）または存在下で、処置しないままにするか（w／o）、または20μg／mLのゲムシタビン（A）もしくはエトポシド（B）で処置した。24時間後に、細胞をカスパーゼ-3／-7アッセイによって分析した。3回の独立した実験による平均±SDを示している。*はp＜0.05を指し示している。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明によれば、結合性分子とは、結合L1と結合することのできる分子のことである。好ましくは、結合性分子は免疫グロブリンを含む分子であり、すなわち、少なくとも1つのIgドメインを含む。
【００４２】
1つの好ましい態様において、本発明の結合性分子は、一本鎖抗体（例えば、scFv、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）またはテトラボディ（tetrabody）のようなscFvの多量体、抗体フラグメント（例えば、Fab）、タンダブ（tandab）、フレキシボディ（flexibody）、二重特異性抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される。
【００４３】
抗体の構造、および特にそのCDRの機能は、当技術分野で公知である（Carter PJ. Potent antibody therapeutics by design. Nature Rev. Immunol. 6:343357,2006）。
【００４４】
scFvおよびその多量体、タンダブ、ダイアボディおよびフレキシボディは、例えばWO 88/1649号、WO 93/11161号、WO 99/57150号およびEP1293514B1号によって当技術分野で公知である標準的な抗体形式である。
【００４５】
一本鎖Fv（scFv）では、抗体の軽鎖および重鎖の2つの抗原結合性可変領域（VH FvおよびVL Fv）がリンカーペプチドによって人工的に結びつけられており、一本鎖可変フラグメントまたは一本鎖抗体と呼ばれる（Bird, et al. (1988) Science 242:423-426；Orlandi, et al (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:3833-3837；Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991)）。抗原結合部位はモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインで構成される。いくつかの研究により、Fvフラグメントは完全抗体の1つの結合部位の本来の抗原結合親和性のすべてを実際に有することが示されている。
【００４６】
本発明の文脈において、ダイアボディとは、2種類の結合特異性を有するscFvのことであり、これは単一特異性かつ二価、または二重特異性かつ二価のいずれでもありうる。
【００４７】
タンダブおよびフレキシボディは、例えば、US2007031436号およびEP1293514号にそれぞれ定義されている、さらなる抗体形式である。
【００４８】
タンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当技術分野で公知の手法によって作製することができる。例えば、そのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって作製しうるF(ab')2フラグメント；F(ab')2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって作製しうるFab'フラグメント；抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製しうるFabフラグメント；ならびにFvフラグメントが非限定的に含まれる。
【００４９】
キメラ抗体とは、マウスmAbに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののように、異なる部分が異なる動物種に由来する分子のことである（例えば、Cabilly et al., 米国特許第4,816,567号；およびBoss et al., 米国特許第4,816,397号を参照）。
【００５０】
二機能性または二重特異性抗体は、特異性の異なる複数の抗原結合部位を有する。さまざまな形態の二重特異性抗体が作製されている。これらには、いわゆる「ハイブリッド型ハイブリドーマ」によって分泌される、2種類の異なる重鎖および2種類の異なる軽鎖を含むIgG分子であるBSIgG、ならびに特異性の異なる複数の抗体または抗体フラグメントの化学的コンジュゲーションによって生成される抗体結合物が含まれる（Segal DM, Weiner GJ, Weiner LM. Bispecific antibodies in cancer therapy. Current Opin. Immunol. 11:558-562, 1999, Van Spriel AB, Van Ojik HH, Van de Winkel JGJ. Immunotherapeutic perspective for bispecific antibodies. Immunology Today 21:391-397, 2000）。
【００５１】
二重特異性抗体は、細胞、細胞毒または薬物を複数の特定部位に送達するために作製されている。1つの重要な用途は、ナチュラルキラーT細胞または細胞傷害性T細胞といった宿主の細胞傷害性細胞を、特定の細胞標的に送達することである（P. J. Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315 (1990)）。もう1つの重要な用途は、細胞傷害性タンパク質を特定の細胞標的に送達することである（V. Raso, T. Griffin, Cancer Res. 41:2073 (1981)；S. Honda, Y. Ichimori, S. Iwasa, Cytotechnology 4:59 (1990）)。もう1つの重要な用途は、非タンパク質性の抗癌薬を特定の細胞標的に送達することである（J. Corvalan, W. Smith, V. Gore, Intl. J. Cancer Suppl. 2:22 (1988); M. Pimm et al., British J. of Cancer 61:508 (1990)）。そのような二重特異性抗体は、化学架橋（M. Brennan et al., Science 229:81 (1985)）、ジスルフィド交換、またはハイブリッド型ハイブリドーマ（クアドローマ）の作製によって調製されている。クアドローマは、2種の異なる抗原に対して2種の異なる抗体を分泌するハイブリドーマを融合させることによって構築される（Kurokawa, T. et al., Biotechnology 7.1163 (1989)）。
【００５２】
本発明の1つの好ましい態様において、本発明の抗体または結合性分子は、活性物質、好ましくは毒素、ナノ粒子、サイトカインまたは放射性ヌクレオチドと連結される。そのような抗体結合物は当技術分野で公知である（Wu AM, Senter PD. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnol. 23:1137-1146, 2005, Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ. Immunotoxin treatment of cancer. Annu. Rev. Med. 58:221-237, 2007, WO 90/12592号、WO 2007/030642号、WO 2004/067038号、WO 2004/003183号、US 2005/0074426号、WO 94/04189号）。
【００５３】
1つの好ましい態様において、抗体または本発明の結合性分子は、L1と、少なくとも10-8の、好ましくは少なくとも10-9の、より好ましくは少なくとも10-10または10-11の親和性（KD）で結合する。
【００５４】
好ましくは、本発明の抗体は、L1-タンパク質ファミリーの他のメンバー、例えばCHL1（L1のごく近い相同体、アクセッション番号NM_006614）、NrCAM（神経細胞接着タンパク質、アクセッション番号NM_001037132またはNM_005010）および／またはNFASC（ニューロファシン、アクセッション番号NM_015090）などと有意には結合しない。好ましくは、抗体は、L1-ファミリーの他のメンバーとは、L1に対する親和性と比較して少なくとも100倍下回る親和性、より好ましくは少なくとも1000倍下回る親和性でしか結合しない。種々のタンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、実施例6に記載されているように、組換えタンパク質に対する結合親和性を測定することによって決定することができる。L1-ファミリーの種々のL1ファミリーメンバーに対する抗体の結合を、実施例1.2および実施例7に記載されているように、CHO細胞上で前記タンパク質を発現させ、FACS分析によって抗体結合を測定することによって決定することもできる。
【００５５】
抗体がサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子-αまたはインターフェロンγなどの放出を有意には増加させないことは、本発明の1つの局面である。好ましくは、放出は30％を上回っては増加せず、より好ましくは20％を上回っては増加せず、最も好ましくは10％を上回っては増加しない。サイトカインの放出は実施例8に記載された通りに試験することができる。または、抗体の投与の前および後に動物の血液中のサイトカインの濃度を決定することもできる。サイトカイン濃度は、ELISAアッセイまたは当技術分野で公知の他の方法によって決定することができる。
【００５６】
もう1つの好ましい態様において、抗体はT細胞増殖を有意には誘導せず、T細胞増殖を阻害することもない。T細胞増殖に対する抗体の影響は、実施例9に記載された通りに決定することができる。
【００５７】
本発明はさらに、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3によって認識されるのと同じL1エピトープと結合することのできる結合性分子にも関する。好ましくは、本発明のこの結合性分子に関しては、上記の結合性分子の構造に関して定義したのと同じ態様が、本発明のこの結合性分子に対しても適用される。
【００５８】
好ましくは、エピトープに対する抗体の結合は、L1タンパク質のグリコシル化状態によって有意に増加することも減少することもない。抗体結合に対するグリコシル化状態の影響は、実施例10に記載された通りに決定することができる。
【００５９】
さらに、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞にも関する。
【００６０】
さらに、本発明は、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞にも関する。
【００６１】
以上に説明したように、および実施例の項に記載されているように、本発明のモノクローナル抗体または結合性分子は、腫瘍形成性疾患の処置のために特に適している。
【００６２】
したがって、もう1つの局面において、本発明は、腫瘍形成性疾患の処置用の医薬品の調製のための、本発明の抗体または本発明の結合性分子の使用法に関する。
【００６３】
さらに、本発明はまた、腫瘍形成性疾患を処置するための方法であって、抗体または本発明の結合性分子が、対象に対して、前記疾患を処置するための有効量で投与される方法にも関する。本発明の前記方法に関しては、本発明の使用法に関して以下に定義されるようなすべての態様が同じく適用される。
【００６４】
上述したように、当技術分野において、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、腫瘍細胞の感受性を高める目的で抗L1抗体を用いることが提案されている（Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19);2759-68, Epub 2006 Nov 6を参照）。その結果として、もう1つの局面において、本発明は、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための、本発明の抗体または本発明の結合性分子の使用法に関する。
【００６５】
本発明のこの局面は、化学療法に対して、または放射線療法に対して、腫瘍細胞が少なくとも部分的に抵抗性である場合に特に有用である。
【００６６】
したがって、本発明の1つの好ましい態様において、感受性を高めようとする細胞は、前記化学療法薬による処置に対して、または放射線療法に対して、少なくとも部分的に抵抗性である。
【００６７】
本発明の文脈において、「感受性を高めること（sensitizing）」という用語は、本発明の抗L1抗体または結合性分子による処置の後に、腫瘍細胞が、前記処置の前よりも、化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して、より高い感受性を持つことと解釈されるものとする。これは例えば、患者から腫瘍細胞を単離して、前記抗体または本発明の結合性分子による処置が、細胞の感受性増加（sensitization）を結果的にもたらすか否かをインビトロで試験することによって試験することができる。この試験は、参考文献に記載された通りに行うことができる（Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19);2759-68, Epub 2006 Nov 6）。
【００６８】
1つの好ましい態様において、細胞は、本発明の抗L1抗体または結合性分子の投与の前には、処置に対して感受性を持たないか、または化学療法薬による、もしくは放射線療法による処置が、所望の処置効果を結果的にもたらさないと考えられる程度でしか感受性を持たない。
【００６９】
好ましくは、本発明の抗L1抗体または結合性分子の助けにより、感受性は少なくとも20％、より好ましくは少なくとも40％、さらにより好ましくは少なくとも100％増加する。
【００７０】
化学療法薬および放射線療法に関する概説は、例えば、Remmington's Pharmaceutical Sciences, 5th ed., chapter 33、特に624〜652ページに提示されている。
【００７１】
任意のさまざまな化学療法薬を、本発明の方法または使用法に用いることができる。これらの化合物は、例えば、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤および天然物誘導体を含む、いくつかの異なるカテゴリーに分類される。
【００７２】
本発明に用いることのできるアルキル化剤の例には、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（すなわち、シトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシンおよびチオテパが含まれる。
【００７３】
抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンC）、ミトキサントロン、ペントスタチンおよびプリカマイシンが含まれる。
【００７４】
代謝拮抗剤の例には、フルオロデオキシウリジン、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（例えば、5-フルオロウラシル（5FU））、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサートおよびチオグアニンが含まれる。
【００７５】
天然物誘導体の例には、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、タキサン系剤（例えば、パクリタキセル）、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾンおよびタモキシフェンが含まれる。
【００７６】
本発明に用いることのできる化学療法剤のその他の例には、アスパラギナーゼおよびミトタンが含まれる。
【００７７】
さらに、C2セラミドも用いることができる。
【００７８】
1つの特に好ましい態様において、化学療法薬は、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、5-FU、パクリタキセルなどのタキサン系剤、およびカルボプラチンからなる群より選択される。
【００７９】
本発明によれば、「放射線療法」という用語は、腫瘍細胞の処置のために一般的に用いられる各々の照射療法のことを指す。1つの好ましい態様において、この処置法は、γ線、X線、マイクロ波、UV照射、ならびに腫瘍細胞に対する、または腫瘍細胞に近接させての（近接照射療法）、放射性同位体の直接送達を含む。
【００８０】
上述したように、本発明のこの局面の目的は、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、腫瘍細胞の感受性を高めることである。その結果として、1つの好ましい態様においては、本発明の抗L1抗体または結合性分子による感受性増加の後に、患者を前記化学療法薬によって、または前記放射線療法によってさらに処置する。
【００８１】
本発明の文脈においては、任意の細胞種の腫瘍細胞の感受性を高めること、または任意の腫瘍形成性疾患を処置することが想定される。好ましくは、腫瘍細胞または腫瘍形成性疾患は、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、髄芽腫、黒色腫、膵癌、前立腺癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽腫、扁平上皮癌、髄芽腫、肝細胞癌、結腸癌、および中皮腫および類表皮癌からなる群より選択される種類のものである。
【００８２】
さらに、腫瘍細胞は上皮腫瘍に由来すること、または腫瘍形成性疾患は上皮腫瘍であることが好ましく、好ましくはここで上皮腫瘍は膵癌、結腸癌、卵巣癌または子宮内膜癌である。
【００８３】
1つの好ましい態様において、抗体は、処置的有効量で投与された時に神経性の副作用を誘発しない。
【００８４】
以上に考察したように、抗L1抗体または結合性分子は薬学的組成物の調製のために用いられる。
【００８５】
一般に、本発明の薬学的組成物は、処置薬の処置上の有効量、および薬学的に許容される担体を含む。1つの具体的な態様において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の監督官庁によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認知された薬局方において、動物における、より詳細にはヒトにおける使用に関して掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに処置薬が投与される、希釈剤、補助剤、添加剤または媒体のことを指す。そのような薬学的担体は、水および油などの無菌液体であってよく、これには石油、動物、植物または合成物に由来するもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが非限定的に含まれる。薬学的組成物を経口投与する場合には水が好ましい担体である。薬学的組成物を静脈内投与する場合には食塩水およびデキストロース水溶液が好ましい担体である。注射用溶液用の液体担体としては食塩液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール溶液を用いることが好ましい。適した薬学的添加剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとりうる。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体とともに坐薬として製剤化することができる。経口用製剤は、医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含みうる。適した薬学的担体の例は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、好ましくは精製された形態にある処置薬の処置上の有効量を、患者に対する適正な投与のための形態が得られるような、適した量の担体とともに含むと考えられる。製剤は投与様式に適合しているべきである。
【００８６】
1つの好ましい態様において、組成物は、ヒトに対する静脈内投与用に適合化された薬学的組成物として、定型的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液中にある溶液である。必要であれば、組成物は、溶解補助剤、および、注射部位での痛みを軽減するためのリドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、成分は、例えば有効剤の数量を表示しているアンプルまたは薬袋などの密閉封止容器内の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位投薬式剤形で、別々に供給されるかまたは混合されて供給される。組成物を輸注によって投与しようとする場合には、医薬品級の滅菌水または食塩水を含む輸液ボトルを用いてそれを投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合には、成分を投与前に混合しうるように注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを用意することができる。
【００８７】
本発明の薬学的組成物は、中性または塩の形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののような遊離カルボキシル基と形成されたもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののような遊離アミン基と形成されたもの、ならびに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムおよび水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【００８８】
特定の障害または状態の処置において有効と考えられる本発明の処置薬の量は、その障害または状態の性質に依存すると考えられ、標準的な臨床的手法によって決定することができる。加えて、最適な投与量の範囲を特定するための一助として、任意で、インビトロアッセイを用いてもよい。製剤中に用いられるべき厳密な用量は、投与の経路および疾患または障害の重大性にも依存すると考えられ、医師の判断および各患者の状況に応じて判断されるべきである。しかし、静脈内投与のために適した投与量の範囲は一般に、キログラム体重当たり約20〜500マイクログラムの活性化合物である。鼻腔内投与のために適した投与量の範囲は一般に、約0.01pg／kg体重〜1mg／kg体重である。有効用量を、インビトロまたは動物モデル試験系から導き出された用量反応曲線から外挿してもよい。一般に、坐薬は有効成分を0.5％〜10％の重量比で含みうる；経口製剤は好ましくは有効成分を10％〜95％含む。
【００８９】
さまざまな送達システムが公知であり、本発明の処置薬を投与するために用いることができ、これには例えば、リポソーム、微粒子およびマイクロカプセルへの封入：処置薬を発現することのできる組換え細胞の使用、受容体を介したエンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）の使用；レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての処置用核酸の構築がある。導入の方法には、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が非限定的に含まれる。化合物は、任意の好都合な経路によって、例えば輸注によって、ボーラス注射によって、上皮または粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通じての吸収によって投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与することもできる。投与は、全身的でも局所的でもありうる。加えて、本発明の薬学的組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適した経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合もある；脳室内注射は、例えばOmmayaリザーバーなどのリザーバーと接続された脳室内カテーテルによって容易となる。例えば吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含む製剤を用いることによって肺投与を行うこともできる。
【００９０】
1つの具体的な態様においては、本発明の薬学的組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合もある。これは例えば、限定的ではないものの、手術中の局所輸注により、例えば手術後に創傷被覆材と併せての局所適用により、注射により、カテーテルを用いることにより、坐薬を用いることにより、またはシラスティック膜などの膜もしくはファイバーを含む、多孔性、無孔性もしくはゼラチン状材料であるインプラントを用いることによって、行うことができる。1つの態様において、投与は、悪性腫瘍または腫瘍性もしくは前癌性組織の部位（または以前の部位）での直接注射によることができる。
【００９１】
もう1つの態様において、処置薬を、ベシクル、特にリポソーム（Langer, 1990, Science 249:1527-1533）、より詳細にはカチオン性リポソーム（WO 98/40052号）中にある形で送達することもできる。
【００９２】
さらにもう1つの態様において、処置薬を、放出制御システムを介して送達することもできる。1つの態様においては、ポンプを用いることができる（Langer、前記）。さらにもう1つの態様においては、放出制御システムを処置標的の近傍に配置し、それによって全身用量のごく一部しか必要でないようにすることができる。
【００９３】
本発明のこの局面の文脈の範囲内で、本発明はまた、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の有効量を患者に投与する段階を含む方法も含む。上記のすべての態様は、本発明のこの方法にも適用される。
【００９４】
本発明の全体を通して、「有効量」という用語は、ある所与の分子または化合物が、所望の処置効果を得るために十分な量で投与されることを意味する。本発明の全体を通して、2つの化合物が処置上の有効量で投与される場合、これは化合物の一方またはそれぞれが、処置量以下の量（subtherapeutic amount）で投与されること、すなわち各化合物の単独での量は処置効果をもたらすには不十分であるが、化合物の組み合わせは所望の処置効果を結果的にもたらすことを含む。しかし、化合物のそれぞれが単独でも処置上の有効量で投与されることも本発明の範囲内に含まれる。
【００９５】
本発明のもう1つの局面において、本発明は、化学療法薬によって、または放射線療法によって以前に処置された患者における腫瘍細胞の処置用の医薬品の調製のための、本発明の抗L1抗体または結合性分子の使用法に関する。
【００９６】
上述したように、抗L1抗体による腫瘍細胞の処置は、WO 02/04952号およびWO 06/013051号にすでに記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
本発明の文脈において、「以前に処置された」という用語には、例えば最近の6カ月または8カ月以内に行われた別個のレジメンの過程で、化学療法薬によって、または放射線療法によってすでに処置された患者が含まれうる。
【００９８】
化学療法薬または放射線療法による腫瘍処置の過程では、そのような処置法に対する腫瘍の初期反応（腫瘍塊縮小または疾患の安定化）の後に、腫瘍が再び進行し始めることがほとんどの事例で観察される。そのような進行は通常、そのような処置法の数週間後または数カ月後に始まる。典型的には、これらの腫瘍はその時には、以前に適用された化学療法薬によるさらなる処置に対して抵抗性になっており、他の処置手段が求められる。上記のように、そのような抵抗性腫瘍はL1を発現することが見いだされており、このため、抗L1抗体の標的となる。
【００９９】
したがって、本発明のこの態様によれば、「以前に処置された」という用語は、好ましくは、患者が以前にそのような処置を受け、そのような処置が初期効果を示したが、抗L1抗体または結合性分子による処置法の時点では腫瘍が再び進行していることを意味する。
【０１００】
さらに、「以前に処置された」という用語は、L1抗L1抗体（L1 anti-L1 antibody）または結合性分子、および化学療法薬または放射線療法を、同じレジメン内で用いる文脈においても見いだされ、このことは複数の処置が1つの処置計画内で与えられることを意味する。この文脈において、「1つの処置計画」とは、複数の処置が、同時に、一方に続いてもう一方が、または間欠的に適用されるが、上記のものとは異なり、個々の処置の間の時間的隔たりが短く（1週間以内または2〜4日以内）、処置の奏功が認められたならば腫瘍進行を待たずに次の処置を適用することを意味する。
【０１０１】
好ましくは、この文脈において、本発明は、患者が化学療法薬によって、または放射線療法によって処置され、それに引き続いて、好ましくは1週間以内またはそれ未満のうちに、より好ましくは2〜4日以内に、本発明の抗L1抗体または結合性分子による処置が開始される事例を含む。1つのさらなる好ましい態様においては、化学療法または放射線療法、および抗L1抗体または結合性分子による処置を、交互に数サイクル、好ましくは1週間またはそれ未満、より好ましくは2〜4日以内の間隔で行う。
【０１０２】
1つの好ましい態様において、患者は、前記化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して少なくとも部分的に抵抗性であり、これは前記の種類の処置の過程で往々にして観察される影響である（上記参照）。
【０１０３】
1つのさらなる局面において、本発明は、ある所与の化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して、少なくとも部分的に抵抗性である患者における腫瘍細胞の処置用の医薬品の調製のための、本発明の抗L1抗体または結合性分子の使用法に関する。
【０１０４】
本発明の文脈において、「処置に対して抵抗性である」という用語は、各々の腫瘍細胞が、化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して完全な様式では反応しないことを意味する。逆に、この腫瘍細胞に関しては、前記化学療法薬または放射線療法による処置はどちらかと言えば無効であり、またはさらには全く効果を示さない。
【０１０５】
本発明の1つのさらなる局面において、本発明は、腫瘍形成性疾患の処置用の医薬品の調製のための本発明の抗L1抗体または結合性分子の使用法であって、抗L1抗体または結合性分子が化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与される、好ましくは、化学療法薬または放射線療法が本発明の抗L1抗体または結合性分子の前に投与される、使用法に関する。
【０１０６】
本発明によれば、「腫瘍形成性疾患の処置」という用語は、腫瘍細胞の死滅、腫瘍細胞の増殖の低下（例えば、少なくとも30％、少なくとも50％、または少なくとも90％の）、ならびに腫瘍細胞の増殖の完全な阻害のことを指す。さらに、この用語は、例えば、将来の腫瘍細胞、ならびに転移の形成を招く可能性または傾向のある細胞を死滅させることによる、腫瘍形成性疾患の予防も含む。
【０１０７】
本発明によれば、「と組み合わせて」という用語は、抗L1抗体または結合性分子、および放射線療法の化学療法薬の任意の併用投与を含む。これには、薬物または放射線療法の同時適用、または好ましくは別々の投与が含まれうる。別々の投与が想定される場合には、抗L1抗体または結合性分子、および化学療法薬または放射線療法が細胞に対して依然として有利な併用効果を発揮しうるように、送達時点の間にかなりの期間が過ぎてしまわないように徹底することが好ましいと考えられる。そのような場合には、細胞を両方の作用因子に対して、互いに約1週間以内に、好ましくは約4日以内に、より好ましくは約12〜36時間以内に接触させることことが好ましい。
【０１０８】
本発明のこの局面の背景にある根拠は、化学療法薬の投与または放射線療法による処置が、腫瘍細胞の表面でのL1発現の増加を招き、それがひいては腫瘍細胞を抗L1抗体または結合性分子のより優れた標的とさせることにある。
【０１０９】
したがって、本発明のこの局面はまた、抗L1抗体または結合性分子を化学療法薬または放射線療法とさまざまな処置サイクルで組み合わせる処置レジメンも範囲に含み、ここで各サイクルは、例えば2週間継続される、処置を行わない期間によって隔てられてもよく、各サイクルは抗L1抗体もしくは結合性分子および／または化学療法薬もしくは放射線療法の反復投与を伴ってもよい。例えば、そのような処置サイクルは、化学療法薬による、または放射線療法による処置に続いて、例えば、2日以内に抗L1抗体または結合性分子の2回の適用を行うことを範囲に含みうる。
【０１１０】
本発明の全体を通して、当業者は、適用しようとする個々の処置法が、例えば患者の身体状態または疾患の重症度に依存すると考えられ、それ故に症例毎に調整しなければならないことを理解するであろう。
【０１１１】
特に、そのような反復処置サイクルの過程で、抗L1抗体または結合性分子を化学療法薬または放射線療法の前に投与することも、本発明の範囲内に想定される。
【０１１２】
本発明の上記の局面の文脈において、本発明はまた、化学療法薬によって、または放射線療法によって以前に処置された患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を患者に投与する段階を含む方法にも関する。さらに、本発明は、ある所与の化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して少なくとも部分的に抵抗性である患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を患者に投与する段階を含む方法にも関する。さらに、本発明は、患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与する段階を含む方法にも関する。さらに、本発明は、患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を患者に投与する段階を含む方法にも関する。
【０１１３】
本発明の抗体はまた、体組織または体液におけるL1タンパク質のレベルを決定する診断方法のための方法にも関する。
【０１１４】
本発明のこれらの方法に関しては、本発明のその他の使用法または方法に関して上述したすべての態様が同じく適用される。
【０１１５】
本発明はまた、腫瘍形成性疾患の処置用の医薬品として用いるための、または化学療法薬による、もしくは放射線療法による処置のために患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための本発明の抗体または結合性分子にも関する。
【０１１６】
1つの好ましい態様において、前記使用法は、本発明の使用法に関して定義したような特徴をさらに呈する。
【０１１７】
本発明はまた、本発明の抗体または結合性分子を含む薬学的組成物にも関する。前記薬学的組成物に関しては、上記のすべての態様が同じく適用される。
【０１１８】
本発明を以下の図面および実施例によってさらに例示するが、それらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１１９】
実施例
1．実施例1
1.1 実施例1の概要
L1接着分子（L1-CAM）は、発生中の神経系における細胞遊走および軸索誘導に関与する膜貫通型細胞接着分子である。L1はまた、卵巣癌および子宮内膜癌でも過剰発現される。この場合、L1発現は予後不良と関連がある。癌細胞系では、L1の過剰発現は細胞運動性、マウスにおける腫瘍成長を増強し、Erk依存性遺伝子の発現を誘導する。今回、本発明者らは、L1に対する抗体による処置が、Erk活性化を無効化し、マトリゲルへの細胞浸潤を阻止し、ヌードマウスにおける腫瘍成長を低下させることを示す。L1抗体で処置された細胞では、HOX A9、β3インテグリンおよびIER 3といったErk依存性遺伝子の誘導が、インビトロおよびインビボで逆行する。この報告で、本発明者らは、抗体L1-9.3がすべての被験L1抗体の中で最も優れた処置用抗体であることを実証する。すべての場合に、L1-9.3は、浸潤性表現型または腫瘍成長に対する処置効果に関して最も優れた結果を示した。本発明者らは、L1-9.3がL1の第1のIg様ドメインと結合して、L1-L1同種親和性結合を阻止しうることを示すことができた。同種親和性結合の阻止は、L1-9.3を用いた場合にのみ観察された。本発明者らは、L1-9.3が2つの機能を兼ね備えているために処置法において優れていると結論する：それはerk活性化を阻止し、かつL1の結合機能を妨げる。
【０１２０】
1.2 実施例1の結果
1.2.1 新たなL1抗体のFACS分析
組換えL1-Fc融合タンパク質による免疫処置を用いて、本発明者らは新規L1抗体L1-9.3、L1-14.10、L1-35.9およびL1-38.12を作製した。L1に対する特異性を明らかにするために、これらの新たなL1mAbを、内因性L1を発現する卵巣癌細胞系OVMzおよびSKOV3ip、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞CHOおよび安定的に形質導入されたCHO-L1細胞に対して、蛍光染色（図1A）およびウエスタンブロット分析（図1B）によってこれらの抗体について試験した。すべての被験抗体がCHO-L1細胞においてL1の陽性染色を示した（図1A）。OVMzおよびSKOV3ip細胞に関する染色パターンは抗体毎に異なった。興味深いことに、L1-9.3抗体は卵巣癌細胞系OVMzおよびSKOV3ipの両方で明瞭な染色を示したが、L1-14.10は非常に弱い染色しか示さなかった（図1A）。2種類のL1抗体、L1-35.9およびL1-38.12は、これらの細胞の内因性L1と結合することができなかった（図1A）。予想された通り、本発明者らが陰性対照として用いたCHO細胞では、L1の染色を観察することはできなかった。すべての新たな抗体が、CHO-L1、OVMzおよびSKOV3ip細胞溶解物における完全長L1をウエスタンブロット分析によって検出した。この場合もL1陰性CHO細胞を陰性対照として利用した。
【０１２１】
1.2.2 Erkリン酸化は抗体処置後に低下する
最近の報告は、L1の発現が血清由来増殖因子と協同して、持続的なErk活性化およびErk依存性遺伝子の誘導を招くことを示している（Silletti et al, 2004）。本発明者らは、L1-抗体の抑制効果がL1を介した遺伝子調節の妨害に起因する可能性について調べた。このために、本発明者らは、SKOV3ip細胞を用いてL1抗体の作用様式を検討した。mAb L1-11A、L1-9.3およびL1-14.10は、Erk-リン酸化（図2A）をインビトロで効果的に阻止した。アイソタイプを一致させた対照mAb、媒体としてのDMSO、またはL1の神経型アイソフォームのみと結合しうるL1抗体L1-38.12（図2A）ではいずれも阻害がみられなかった。ホスホ特異的Erk抗体を用いた蛍光分析により、活性化Erkの明らかな低下が確かめられた。L1-mAb処置細胞（L1-11A、L1-9.3およびL1-14.10）における核からの枯渇も観察された（図2B）。
【０１２２】
1.2.3 L1-抗体による抗体処置は細胞浸潤を低下させた
L1に対する抗体（L1-11A）による処置は、フィブロネクチンの走触性細胞遊走および種々の細胞系のマトリゲル浸潤を低下させることが以前に示されている（Arlt et al, 2006）。本発明者らは、種々のL1抗体で処置したSKOV3ip細胞の浸潤能力を比較した。抗体L1-11A、L1-14.10および特にL1-9.3は、SKOV3ipの浸潤を低下させた（図3）。これとは著しく対照的に、抗体L1-35.9またはL1-38.12で処置した細胞は浸潤の低下を示さなかった（図3）。
【０１２３】
1.2.4 L1に対する抗体はインビトロおよびインビボでの遺伝子発現に影響する
本発明者らはさらに、L1に対する抗体が、siRNAを介したL1の枯渇に関して観察されるのと同様の様式で、インビトロでのSKOV3ip細胞における遺伝子発現プロファイルに影響するか否かを検討した（図4A）。実際に、L1-9.3またはL1-11Aで処置した細胞のqRT-PCR分析では、対照抗体と対比して、β3インテグリン、転写因子HOXA9ならびにアポトーシス関連遺伝子IER 3およびSTK 39といったL1で調節される遺伝子の発現の有意な変化が示された（図4A）。同じ一連の遺伝子は、L1特異的siRNAが形質導入されたSKOV3ip細胞ではダウンレギュレートされた（図4B）。
【０１２４】
本発明者らは、mAb L1-9.3が、インビボのSKOV3ip細胞の遺伝子発現プロファイルに対しても、インビトロで観察されたものと同様に影響しうるか否かを検討した。この目的には、L1-9.3処置マウスまたはIgG対照処置マウスの残存腫瘍からmRNAを単離して、qRT-PCR分析に供した。L1-9.3処置は、HOXA9、β3インテグリンおよびIER 3に関して実証されたように、L1依存性遺伝子の有意な調節を招いた（図4C）。
【０１２５】
1.2.5 ヌードマウスにおける腫瘍形成性の分析
次に、本発明者らは、マウスにおけるSKOV3の腹腔内成長を、mAb L1-11A、L1-9.3またはL1-14.10による処置によって阻害することができるか否かを調べた。処置法の開始の2日前に、SKOV3ip-lacZ細胞を雌性ヌードマウスの腹腔内に注射した。10mg／kgの抗体濃度を用いて、週2回の腹腔内処置を行った。対照マウスにはPBSまたは対照抗体としてのHEA125（抗EpCAM）による処置を行った（週2回、10mg／kg腹腔内）。すべての抗L1 mAb処置群で、PBSまたは対照抗体HEA-125と比較して腫瘍塊の量の大幅な減少が認められた（図5）。対照と比較して、すべての抗L1 mAbが腹腔内腫瘍量の用量依存的な低下を招いた［L1-11A（10mg／kg）、-40％；L1-14.10（10mg／kg）、-30％；L1-9.3（10mg／kg）、-60％；図5］。L1-9.3（10mg／kg）で処置した群における腫瘍の縮小は、PBS対照と比較して統計学的に有意であった（PL1-9.3(10mg/kg)＝0.004）。HEA125対照抗体で処置したマウスは、SKOV3ip細胞上にEpCAMが存在し、HEA125が腫瘍細胞と結合しうるにもかかわらず、PBS処置群（図5）と比較して、SKOV3ip-lacZ腹腔内腫瘍量の検出可能な軽減はないことが判明した。処置の過程全体を通して、L1 mAb L1-11A、L1-9.3およびL1-14.10処置のいずれについても副作用および重度の毒性は観察されなかった。
【０１２６】
このように、L1に対する抗体による処置は腫瘍成長 SKOV3ip細胞を減少させたが（図5）、このことはL1に対する抗体が遺伝子発現を調節しうるだけでなく、インビボでの腫瘍成長にも影響しうることを示唆する。
【０１２７】
1.2.6 新たなL1抗体のBiacore試験
この試験は、実施例6に記載された通りに、Avidex（Oxford）によって行われた。表1は、新たなL1抗体の結合動態（ka、kdおよびKD）に関するこれらの結果をまとめている。
【０１２８】
1.2.7 L1-9.3結合部位エピトープマッピング
新規L1抗体の特性決定のために重要な要因の1つは、L1中のそれらの結合部位を検討することである。このため、本発明者らは、この分子のさまざまな部分をカバーする種々のL1-Fc融合タンパク質を構築した。L1外部ドメイン領域の種々の長さをコードするPCR産物を増幅した。これらの構築物をpIgベクター中にクローニングして、Fc-融合タンパク質として発現させた。精製後に、産物をウエスタンブロット分析のために用いた。結果を比較するために、本発明者らはその他の組換えL1タンパク質断片（Ricardo Gouveia, Oeiras, Portugalから入手）を分析した。L1-9.3はL1の第1のIgドメインと結合することが見いだされた（図6）。L1-14.10は第3のIgドメインと結合し、一方、L1-11AはFN3〜5部位の間に結合した（図6）。
【０１２９】
1.2.8 mAB L1-9.3はL1-L1同種親和性結合を阻止する
本発明者らは、L1抗体がL1の同種親和性結合機能を妨げることができるか否かを問うことにした。この疑問に応えるために、本発明者らは、L1をトランスフェクトした細胞を固定化L1と結合させる細胞接着アッセイを用いた。スライドガラスを組換えL1-Fc融合タンパク質、陽性対照用のフィブロネクチン（これには細胞がインテグリン依存的な様式で結合する）または陰性対照としてのBSAでまずコーティングした後に、本発明者らはJ558-L1細胞をL1-11A、L1-9.3またはL1-14.10抗体とともにインキュベートした。対照については、本発明者らはIgG-対照、PBSまたはCD24に対する抗体（SWA11）を用いた。mAb L1-9.3はL1-L1同種親和性結合を完全に阻止することができたが、他のすべての被験抗体は同種親和性結合能力を妨げることができなかった。どの抗体もフィブロネクチンに対する結合は妨げなかった（非提示データ）。
【０１３０】
1.3 材料および方法
1.3.1 細胞系および細胞培養
ヒト卵巣癌細胞系SKOV3ip（Ellen Vitetta, University of Texas, Dallas, TXにより寄贈）およびOVMzを、10％FCSを含むDMEM（Biochrom, Berlin, Germany）中にて、細胞培養条件（5％ CO2、相対湿度95％、37℃）下で増殖させた。腫瘍塊の同定および定量のためには、lacZをコードするレトロウイルスベクター（GeneSuppressor Retroviral System, Biocarta, Hamburg, Germany）によってSKOV3ip細胞に安定的に形質導入した。ヒトL1（-hL1）を安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞系CHOは、superfect（Stratagene, Heidelberg, Germany）によるトランスフェクション、ならびにmAb L1-11Aおよび磁気ビーズ（Myltenyi Biotec、Bergisch Gladbach, Germany）によるL1発現に関する選択、またはFACS Caliburによる選別によって樹立した。細胞はすべて、10％FCSを加えたDMEM中にて37℃、5％ CO2および湿度100％で培養した。ヒトL1をコードするプラスミドおよびJ558-L1細胞は、Dr. Vance Lemmon（University of Miami, Miami, FL, USA）から入手した。
【０１３１】
1.3.2 抗体
EpCAMを対象とするマウスIgG1であるHEA-125は以前に記載されており、すべてのヒト腺癌と結合する（Moldenhauer et al., 1987）。モノクローナル抗体L1-14.10（Huszar et al., 2006）、L1-9.3、L1-35.9およびL1-38.12は、L1の外部ドメインを含むヒトL1-Fcタンパク質によるマウスの免疫処置によって得た（Oleszewski et al., 1999）。ヤギ抗マウスIgGは、アフィニティー精製した上でヒト血清タンパク質に吸収させた（Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA）。
【０１３２】
1.3.3 生化学的分析
SDS-PAGE、および分離されたタンパク質のセミドライブロット法を用いたImmobilon膜への移行は、以前に記載されている（Gutwein et al., 2000）。TBS中の5％脱脂乳またはTBS／0.1％ Tween-20中の1％ BSAによるブロッキングの後に、ブロットを各々の一次抗体および続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体によって発展させ、ECL検出を行った。
【０１３３】
1.3.4 FACS分析
ハイブリドーマ上清または精製抗体のいずれかの飽和量のmAb、およびマウスIgに対するPE結合ヤギ抗体（Dianova, Hamburg, Germany）による細胞の表面染色は、別のところに記載されている（Ebeling et al., 1996）。染色された細胞をFACScan（Becton Dickinson）によって分析した。
【０１３４】
1.3.5 免疫蛍光
免疫蛍光染色に関しては、細胞をカバーガラス上で増殖させ、過酸化水素バナジン酸（pervanadate）で10分間処理した上で、4％パラホルムアルデヒド／PBSによって室温で20分間かけて固定した。細胞をPBS中で洗浄し、5％ヤギ血清を含むPBS中の0.1％ NP-40によって室温で15分間かけて透過処理を行った。続いて細胞を第1の抗体（ホスホ特異的Erk1／2）とともに1時間インキュベートした。PBSによる3回の洗浄段階の後に、細胞を第2の、Alexa488結合ヤギ抗マウスIgGとともに暗所にて30分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄した後に、染色された細胞をスライドガラスにマウントして、落射蛍光顕微鏡（Axioplan-2；Zeiss, Oberkochem）によって検査した。
【０１３５】
1.3.6 浸潤アッセイ
インビトロでの腫瘍細胞の浸潤を、Erkell et al.（1988）に以前に記載されている二重フィルターアッセイで判定した。手短に述べると、マトリゲルを、下方の孔径5μmのニトロセルロースフィルターおよび上方の孔径8μmのポリカーボネートフィルターという2つのフィルターの間に層状に挟んだ。105個の細胞を、フィルターをサンドイッチにしたものとともに1ml培地中で20時間インキュベートした後に、このサンドイッチを固定して、フィルターを分離してDAPIで染色した。下方のフィルター上のゲル中に存在する細胞を計数し、細胞の浸潤を、下方のフィルター上の細胞数と、両方のフィルター上に存在する細胞の総数との比として表した。
【０１３６】
1.3.7 定量的PCR
qPCRに関しては、cDNAをMicrospin G-50カラム（GE Healthcare、Munchen, Germany）で精製して、NanoDrop分光光度計（ND-1000. Kisker-Biotechnology, Steinfurt, Germany）によって定量した。qPCR用のプライマーはDNA Star Programを用いて設計し、MWG（Ebersberg, Germany）により製造された。β-アクチンを内部標準として用いた。PCR反応はSYBRgreen mastermix（Applied biosystems, Darmstadt, Germany）を用いて行った。
【０１３７】
1.3.8 細胞結合アッセイ
L1-Fcまたはフィブロネクチンに対する細胞結合アッセイは、Oleszewski et al（JCB 2000）中に詳細に記載されている。
【０１３８】
1.3.9 腫瘍モデルおよび処置法
病原菌を含まない雌性無胸腺CD1 nu/nuマウス（7〜9週齡；平均20g；Charles River）に対して、5×106個のlacZタグ標識ヒト卵巣癌細胞（SKOV3ip-lacZ）を第0日に腹腔内に接種し、5週間以内に腹腔内腫瘍の形成を導いた。抗L1-mAbを無菌PBS中に希釈して、処置のために必要な濃度とした。腫瘍を持つマウスに、各々の用量（投与1回につきそれぞれ10mg／kg）、媒体（PBS）またはHea125抗体対照の300μL溶液による週2回の腹腔内処置を行った。抗体処置を腫瘍細胞注射後の第3日から開始して、腫瘍細胞が腹壁内側および腹腔内臓器の表面に付着するまでの時間を与えた。剖検（第38日）の時点で腹水をすべてのマウスから採取して、体積を決定した。すべての腹腔内臓器（腫瘍塊を含む）、腹壁および横隔膜を摘出し、β-ガラクトシダーゼ基質（X-gal；Roche-Diagnostics, Penzberg, Germany）で染色して、写真を撮影して秤量した。臓器間、横隔膜上および腹壁内部の藍色の腫瘍塊を摘出して、単独で秤量した。各マウスにおける相対的腫瘍量を、腫瘍塊の重量を全内臓の重量で除算することによって算出した。
【０１３９】
2．実施例2
抗L1マウス抗体L1_9.3のヒト化
マウス抗L1抗体L1_9.3をヒト化する目的で、ヒトv-κ1（humκ1）および可変重鎖ファミリーIII（humIII）の遺伝子をアクセプター配列として利用した。これらの遺伝子に関して本明細書で用いた付番方式は、Wu and Kabat（Kabat, E. A, Wu, T. T., Perry, HM, Gottesman, KS and Foeller, C (1992) Sequences of proteins of immunological interest, Diane Books Publishing company）から採用した。マウスL1_9.3抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を、それぞれhumκ1軽鎖およびhumIII重鎖のアミノ酸配列に対してアラインメントした。ヒト抗体の6つのCDRを、マウスL1_9.3抗体由来の対応するCDRで置き換えることによって、2つのヒト化L1_9.3抗体（L1_9.3HuおよびL1_9.3Hu3）を作製した。
【０１４０】
6つの相補性決定領域（CDR）の場所
【０１４１】
マウスL1_9.3抗体のさまざまなフレームワーク残基を、ヒト化L1_9.3抗体に移行させた：
バージョン1（L1_9.3Hu）ヒト化抗体‐重鎖残基番号6、23、27、30、43、49、71、73、76、78および94ならびに軽鎖残基番号100をマウスL1_9.3抗体から移行させ、軽鎖残基番号73を、ヒトREI抗体軽鎖においてこの位置に認められる対応物（Phe）で置き換えた。
バージョン2（L1_9.3Hu3）ヒト化抗体‐重鎖残基番号6、23、27、30、71、73および94ならびに軽鎖残基番号100をマウスL1_9.3抗体から移行させた。
【０１４２】
続いて、マウスL1_9.3抗体およびこの抗体の2つのヒト化バージョン（L1_9.3HuおよびL1_9.3Hu3）の一本鎖可変フラグメント（scFv）類似体をコードするDNA配列を、大腸菌（E. coli）における発現のために作製した。これらのscFvはすべて、同じリンカー（TSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG）を含む。scFv遺伝子はGeneArt AG, Germanyにより合成された。
【０１４３】
ヒト化抗体を構築するために用いた抗体軽鎖および重鎖のDNA配列は、それぞれ図8aおよび8bに提示されている。
【０１４４】
図9a〜9cは、それぞれマウスL1_9.3 scFvおよびヒト化L1_9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvのアミノ酸配列を提示している。
【０１４５】
3．実施例3
L1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvをコードするDNAの大腸菌ペリプラズム発現ベクター中へのクローニングならびにこれらのベクターによる大腸菌の形質転換
ペリプラズムで発現されるscFvは、数多くの理由から有益である。第1に、そのようなscFvは細菌上清中に漏出し、そこから、それらの同族抗原（この場合にはL1癌抗原）との結合に関して都合良くアッセイすることができる。第2に、ペリプラズムでの発現は、可溶性の活性scFvの精製を可能にする。
【０１４６】
GeneArt AG, Germanyによって合成されたL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvをコードするDNA配列は、大腸菌ペリプラズム発現ベクター中に供給されなかった。このため、以下の方法を用いて、これらのDNA配列を大腸菌ペリプラズム発現ベクター中にクローニングした。
【０１４７】
標準的なPCR条件および試薬を用いて、以下のプライマー対により、合成されたscFvをコードするDNAをPCRでレスキューした。
プライマー配列を以下に示す。
【０１４８】
PCR産物を1.6％アガロースゲル上で泳動させ、正しいサイズのバンドを切り出して精製した。それらのPCR産物をNcoIおよびNotI制限酵素により標準的な条件下で二重消化し、続いて再精製を行った。PCR産物を、以下のものを含むIPTG誘導性ペリプラズム発現ベクター中に連結させた：
-コードされるポリペプチドをペリプラズムに導くためのpelBリーダー配列、このリーダー配列はその後ペリプラズムで切り離される
-NcoI／NotIクローニング部位
-ヒト抗体κ鎖定常領域
【０１４９】
連結されたベクターを大腸菌TG1細胞に形質転換導入して、100μg／mlのアンピシリンおよび2％グルコースを加えた2xTY寒天培地（バクトトリプトン16g／L、酵母エキス10g／L、15g／LバクトアガーおよびNaCl 5g／L）にプレーティングした。L1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFv構築物の発現された部分のDNA配列およびアミノ酸配列は、それぞれ図10a、10bおよび10cに示されている。
【０１５０】
4．実施例4
大腸菌におけるL1_9.3、L1-9.3HuおよびL1_9.3Hu3一本鎖抗体の発現
これらのベクターによって発現されたポリペプチドは、ヒト抗体のcκ定常領域がscFvのC末端と融合されたものを含む。構築物を含むこれらのcκ定常鎖を本明細書では一本鎖抗体と称する。
【０１５１】
各一本鎖抗体構築物L1_9.3、L1_9.3HuおよびL1_9Hu3に対する8つの大腸菌クローン（合計24クローン）を選定して、100μg／mlのアンピシリンおよび2％グルコースを加えた300μlの2xTY（Bacto Trypton 16g／L、酵母エキス10g／LおよびNaCl 5g／L）を含む96ウェルプレートの別々のウェルに入れた。各ウェルの体積は1mlである。培養物を、培養物のOD600がおよそ0.5に達するまで、振盪下（200rpm）にて37℃で増殖させた。続いて96ウェルプレートを3200rpmで10分間遠心し、上清を吸引して廃棄した。細菌ペレットを100μg／mlのアンピシリンおよび1mM IPTGを加えた新たな2XTY 400μl中に再懸濁させて、一本鎖抗体の発現を誘導した。培養物を200rpm、25℃で一晩振盪させた。
【０１５２】
翌日に96ウェルプレートを3200rpmで10分間遠心して、細胞をペレット化した。発現されたL1一本鎖抗体を含む上清をELISA分析のために保存した。
【０１５３】
5．実施例5
ヒトL1癌抗原に対するL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvの結合のELISAアッセイ
このELISAアッセイは、ヒト化工程がL1癌抗原に対する抗体結合の損失を招かないことを確認するため、および選定したクローンの中で一本鎖抗体構築物を正しく発現したものを同定するために行った。
【０１５４】
96ウェルプレートの3つの列を、L1タンパク質の細胞外ドメインがFcフラグメントと融合されたもの（5μg／ml）をPBS中に含む100μlのL1抗原で、1時間にわたり室温でコーティングした。別の3つの列を、対照としてのストレプトアビジン（5μg／ml）を含むPBSでコーティングした。
【０１５５】
ウェルを370μlのPBSで3回洗浄して、3％粉乳を含むPBSにより室温で1時間かけてブロックした。
【０１５６】
一晩置いた各細菌上清の50μlを、50μlの6％粉乳を含むPBSと1時間混合した。
【０１５７】
ブロックしたELISAプレートを上記の通りにPBSで2回洗浄し、一本鎖抗体を含むブロックされた上清を添加して、室温で1時間インキュベートした。
【０１５８】
96ウェルプレートをPBS 0.1％ tweenで4回洗浄し、続いて、PBS 1％ BSA中に1：5000希釈した抗ヒトκ軽鎖が結合した遊離抗体HRP結合物（Sigma A7164）の100μlを添加した。結合物を室温で1時間インキュベートし、続いてPBS 0.1％ tweenで5回洗浄した。
【０１５９】
TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate Kit（Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., USA）を製造元のプロトコールに従って添加することによって、ELISAを発展させた。ELISAプレートの画像は図4に示されている。少なくとも4つのL1結合クローンを、3種類の一本鎖抗体バージョンのそれぞれについて観察した。これらのL1結合性一本鎖抗体クローンはストレプトアビジンとは結合しない。
【０１６０】
図11は、ヒトL1癌抗原に対するL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvの結合を示している。列A、BおよびCはL1でコーティングされ、列D、EおよびFはストレプトアビジンでコーティングされている。ウェル内の青色は個々のscFvとプレート上のL1との結合を指し示している。ストレプトアビジンでコーティングされた列に色がないことは、一本鎖抗体がL1と特異的に結合することを示している。
【０１６１】
6．実施例6
結合親和性の決定
マウス抗体L1-9.3およびヒト化抗体L1-hu3を、結合動態を決定するためにBiacore分析（Biacore AB. Uppsala、Sweden）によって分析した。
【０１６２】
BIAcore CM5センサーチップをEDC／NHSで活性化し、精製組換えL1-Fc細胞外断片（515μg／ml、PBS中）を200〜3000RUの間でCM5センサーチップと結びつけた。残りの活性部位はエタノールアミン／HClでブロックした。抗体結合は、濃度6〜3333nMの抗体をKinject機能を用いて流速10ul／分濃度で添加することによって測定した。チップは、結合した抗体を除去するための、500mM NaClを含む10mMグリシンpH2.0によって再生させた。
【０１６３】
結合曲線は、BIA評価ソフトウエア（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を用いてLangmuir結合モデルに適合させた。決定されたKD値は表2に示されている。
【０１６４】
（表２）ヒト化変異体L1-hu3は、親抗体L1-9.3と同程度の高い標的親和性を示す
【０１６５】
7．実施例7
PBMCおよび癌細胞に対する抗体結合
PBMCは、健常ヒトドナーのEDTA加全血からの密度勾配遠心によって入手した。培養したOVMZ腫瘍細胞はトリプシン処理によって収集した。1×105個／ウェル（75μl）をFACSチューブに播いた。L1-9.3 mAbの希釈物を10mM EDTAを含む培地中に調製し、75μl／ウェルのL1-mAb希釈物をPBMCおよびOVMZ細胞に添加して最終濃度が6.6×10-13〜6.6×10-8 Molとなるようにした。引き続いて細胞をインキュベーター内にて37℃／5％ CO2で一晩（ほぼ24時間）インキュベートした。2mlのFACS緩衝液を用いて細胞をFACSチューブ内で直接洗浄し、その後に300g／5分間／4℃の遠心を行った。上清をピペット処理によって除去した。染色に関しては、PE標識したロバ抗マウス二次抗体（Dako）を150μl／ウェルの体積で添加し、その後に4℃で30分間インキュベートした。洗浄段階を上記の通りに繰り返し、細胞を200μl PBS／1％ホルムアルデヒド中で固定した。続いて試料の平均蛍光をFACS分析によって測定した。
【０１６６】
図13に示されているように、L1-9.3 mAbは、腫瘍L1と比較してPBMC上のL1に対する親和性が強く低下している。PBMCに対するL1-9.3結合はナノモル濃度の範囲で検出されたが（破線）、一方、腫瘍細胞に対する結合はピコモル濃度（実線）で観察された。B）解離定数KDは、最大半値結合の濃度を用いて回帰曲線から推定した。PBMC上のL1-9.3のKDは腫瘍細胞上よりも少なくとも400倍の小ささであった。
【０１６７】
8．実施例8
サイトカイン放出の決定
PBMCを、健常ヒトドナーのクエン酸加全血から密度勾配遠心によって入手した。細胞をRPMI 1640／5％ヒト血清／5ml NEAA／5ml-グルタミン／5mlピルビン酸ナトリウム（Natrium-Pyruvat）中に再懸濁させた。100μl当たり1×105個の細胞を平底96ウェルプレートに播いた。第2の段階では、LPS（10ng／ml）、L1-9.3 mAb（20μg／ml）、OKT3 mAB（ebioscience）（75ng／ml）またはイオノマイシン／PMA（1μg／ml ／ 5ng／ml）を含む100μlの培地を3つずつ添加し、その後に37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした。陰性対照としては、非処置PBMCを用いた。24時間後に、サイトカインであるインターフェロンγおよび腫瘍壊死因子のレベルを、CBA-Cytokin-Flex-Sets（BD）を製造元の情報に従って用いるFACS分析によって測定した。
【０１６８】
その結果得られたサイトカインレベルを図14に描写している。OKT3 mAB、イオノマイシン／PMAおよびLPSとは対照的に、L1-9.3はPBMCによるTNFおよびIFNγの放出をいずれも有意には増加させなかった。
【０１６９】
9．実施例9
T細胞増殖アッセイ
PBMCを、2例の健常ヒトドナーのクエン酸加全血から密度勾配遠心によって入手した。1ウェル当たり1×105個の細胞を平底96ウェルプレートに播いた。第2の段階では、L1-9.3 mAb（20μg／ml）およびOKT3（ebioscience、75ng／ml）またはL1-9.3 mAb（20μg／ml）もしくはOKT3（75ng／ml）のいずれかを含む100μlの培地を3組ずつに添加した。1時間後に、後者2つにそれぞれOKT3またはL1-9.3を加えた。抗体に関連する活性化の可能性を否定するために、L1-9.3を伴うか伴わないPBMCを、OKT3の非存在下でインキュベートした。37℃、5％ CO2での24時間のインキュベーションの後に、T細胞の増殖を、BrdU取り込みアッセイ（Roche）を製造元の情報に従って用いて評価した。
【０１７０】
図15に示された結果から、L1-9.3 mAbはT細胞増殖を誘導することもせず、OKT3で誘導されるT細胞増殖を阻害することもないと結論づけることができる。
【０１７１】
10．実施例10
抗体結合のグリコシル化依存性
2×106個のSKOV3ip細胞を10cmペトリ皿に播き、37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした。24時間後に細胞をPBSで洗浄し、500μlのM-PER試薬（Pierce）を用い、Seize Classic Mammalian Immunoprecipitation Kit（Pierce）に記載されたプロトコールに従って溶解させた。SkOv3ip細胞溶解物を、Enzymatic CarboRelease Kit（QA_Bio）に記載された通りに脱グリコシル化した。手短に述べると、2.5μlの変性溶液を35μlの細胞溶解物に添加した。この試料をthermoblock内で100℃で5分間インキュベートし、続いて氷上で冷却した。最後に、2.5μlのTriton-X、およびEnzymatic CarboRelease Kit（QA_Bio）に含まれる1μlの各グリコシダーゼ（PGNアーゼF、O-グリコシダーゼ、シアリダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコサミニダーゼ）を製造元のプロトコールに従って添加し、その後に37℃で3時間インキュベートした。グリコシル化および脱グルコシル化したものを、SDS PAGEおよび引き続いてウエスタンブロット法にかけた。ウエスタンブロットを、それらの染色能力に応じて種々のL1抗体とともにインキュベートした。濃度は1μg／ml（9.3、11Aおよび14.10）、5μg／ml（35.9）または10μg／ml（OV52.24、OV543.18、38.12、OV549.20）を用いた。ウエスタンブロットに対するL1抗体の結合は、HRP標識抗マウス抗体（Dianova）によって検出した。
【０１７２】
図16に示されているように、被験抗L1抗体はそれらのグリコシル化依存性に関して3つのクラスに分けることができる：第1のクラス（グリコシル化によって影響されない）：L1-9.3。第2のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって負の影響を受ける）：11A、14.10、OV52.24およびOV549.20。第3のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって正の影響を受ける）：35.9および38.12。
【０１７３】
11．実施例11
ウサギにおけるL1-9.3の生体内分布
雌性ウサギ（White Himalayan）に、L1-9.3を2回（0h、24時間）、静脈内投与経路を介して10mg／kgの用量で注射した。1匹の対照動物には同等な体積のPBSを投与した。動物個体を第1の投与から72時間後に剖検した。臓器を4％緩衝ホルマリン中で固定して、パラフィン中に包埋した。組織スライドを調製し、免疫組織検査を行った。L1-9.3処置動物および対照動物の組織切片を、静脈内投与後のL1-9.3の結合を検出するために抗マウス抗体で染色した。シグナルはDAB（Sigma）によって描出した。従来のアビジン／ビオチン複合体（Avidin/Biotin Complex）法またはチラミドシグナル増幅システムCSA II法（Dako）という2種類の検出システムを用い、インビボで結合したL1-9.3の量のおおよその推定が可能となった。従来のアビジン／ビオチン複合体法（Vector Laboratories）は、50ng／mlまたはそれ以上の濃度のL1-9.3を検出することができ、一方、ビオチンを含まないチラミドシグナル増幅システムCSA II（Dako）の検出限界は5ng／mlである。L1発現パターンを明らかにするために、対照動物の組織を一次抗体L1-9.3および検出用抗体とともにインキュベートした。ABC法についてはビオチン化抗マウス抗体（Dianova、1：3000希釈）を検出用抗体として用い、CSA法は製造元のプロトコールに従って行った。
【０１７４】
図17は、静脈内投与されたL1-9.3の腎臓の集合管に対するインビボ結合を示している。インビボ結合は増幅システムCSA（図17A）を用いた場合にのみ検出可能であり、一方、従来のABC法を用いることによっては全くシグナルが視認されなかった（図17B）。このことからみて、L1-9.3は組織中で30〜300pmolの範囲で検出された（L1-9.3濃度はおそらく5ng／mlよりも高く、かつ50ng／ml未満であると考えられる）。陰性対照は染色を示さず、それ故に非特異的な染色の可能性は否定することができる（図17C）。インビボで結合したL1-9.3の染色パターン（図17A）は、組織切片をL1-9.3で直接染色した時の腎臓におけるL1発現パターンに対応する（図17D）。静脈内投与されたL1-9.3抗体は末梢組織へと血管外漏出しうると結論づけることができる。
【０１７５】
12．実施例12
ヌードマウスにおけるヒト化型のL1 9.3mAbの機能
本発明者らは、ヒト化型のmAb L1 9.3がインビボでの卵巣癌の腫瘍成長も阻害しうるか否かを調べた。第1に、本発明者らは、選定した細胞系に対する2つのヒト化型L1 9.3の結合について分析した。このため、SKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞に対してフローサイトメトリーを行った（図18）。どちらのmAbも腫瘍細胞系に対する強い結合を示し、ネイティブなL1 9.3 mAbと同様な結合の成績が得られた。
【０１７６】
SKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞を、処置を開始する24時間前に免疫不全マウスに注射した。ヒト化抗体（300μg）またはPBSを腹腔内に週3回注射した。インビボでの腫瘍成長を検出するために、Xenogen IVIS 200システムを用いてマウスの画像を週1回撮影した。マウスに麻酔をかけて、ルシフェリンDを注射し、その後に、腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を通じて生成される光放射を検出した。時間経過の間に、本発明者らは、ヒト化mAbで処置したマウスの群では対照と比較して腫瘍成長がより緩徐であることを検出した。第33日に最後の画像データを撮影した。画像化の結果により、hu3 mAbを用いると腫瘍体積が80％前後減少し、chiL1 9.3についてはおよそ50％の減少であることが得られた。いずれの結果も極めて有意であった（図19）。36日後にマウスを殺処理して腫瘍塊を測定した。どちらのヒト化抗L1 mAb処置群でも、PBS群と比較して腫瘍塊の大幅な減少が測定された（図20（A、B））。
【０１７７】
13．実施例13
抗L1CAMモノクローナル抗体9.3を用いた処置による化学療法抵抗性の消失は、WO 2008/046529号、実施例3に記載された通りに試験した（WO 2008/046529号の図17eも参照）。それらの結果は図21および22に示されている。モノクローナル抗体9.3が化学療法抵抗性を消失させることを実証することができた。その効果はWO 2008/046529号で試験した抗体11Aのそれよりも強いように思われる。
【０１７８】
（表１）この表は表記のアッセイにおいて試験した抗体の概要を示している
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的抗L1抗体の使用による腫瘍の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行癌の標準的な処置は多くの場合、化学療法または放射線療法である。しかし、処置法に対する当初の反応にもかかわらず、種々の癌が化学療法薬または放射線療法に対する抵抗性を獲得して、腫瘍再発および患者の高頻度の死亡を招くことが往々にして観察される。多くの場合は、続いて別の化学療法薬またはより高用量に切り換えることが決められる。しかし、臨床状況の改善は観察されないことがしばしばである。
【０００３】
L1は、構造的にはIgスーパーファミリーに属する、200〜230kDaのI型膜糖タンパク質である（Moos M, Tacke R, Scherer H, Teplow D, Fruh K, Schachner M. Neural adhesion molecule L1 as a member of the immunoglobulin superfamily with binding domains similar to fibronectin. Nature 1988; 334:701-3（非特許文献1））。L1は、発生中の神経系における軸索誘導および細胞遊走において非常に重要な役割を果たす（Hortsch M. Structural and functional evolution of the L1 family: are four adhesion molecules better than one? Mol Cell Neurosci 2000; 15:1-10. （非特許文献2）, Schachner M. Neural recognition molecules and synaptic plasticity. Curr Opin Cell Biol 1997; 9:627-34（非特許文献3））。最近の研究では、L1の発現がヒト癌の進行に結びつけられている。L1の発現は、肺癌（Katayama M, Iwamatsu A, Masutani H, Furuke K, Takeda K, Wada H, et al. Expression of neural cell adhesion molecule L1 in human lung cancer cell lines. Cell Struct Funct 1997;22:511-6（非特許文献4））、グリオーマ（Senner V, Kismann E, Puttmann S, Hoess N, Baur I, Paulus W. L1 expressed by glioma cells promotes adhesion but not migration. Glia 2002;38:146-54（非特許文献5））、黒色腫（Thies A, Schachner M, Moll I, Berger J, Schulze HJ, Brunner G, et al. Overexpression of the cell adhesion molecule L1 is associated with metastasis in cutaneous malignant melanoma. Eur J Cancer 2002;38:1708-1（非特許文献6）, Fogel M, Mechtersheimer S, Huszar M, Smirnov A, Abu DA, Tilgen W, et al. L1 adhesion molecule (CD 171) in development and progression of human malignant melanoma. Cancer Lett 2003;189:237-47（非特許文献7））、腎癌（Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I. Antineuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer, 1999; 83: 401-408（非特許文献8）, Allory Y, Matsuoka Y, Bazille C, Christensen El, Ronco P, Debiec H. The L1 cell adhesion molecule is induced in renal cancer cells and correlates with metastasis in clear cell carcinomas. Clin Cancer Res 2005;11:1190-7（非特許文献9））および結腸癌（Gavert N, Conacci-Sorrell M, Gast D, Schneider A, Altevogt P, Brabletz T, et al. L1, a novel target of beta-catenin signaling, transforms cells and is expressed at the invasive front of colon cancers. J Cell Biol 2005; 168:633-42（非特許文献10））を含む、種々の腫瘍で見いだされている。さらに、L1は卵巣癌および子宮内膜癌において病期依存的な様式で過剰発現されることが当技術分野で公知である（Fogel M, Gutwein P. Mechtersheimer S, Riedle S. Stoeck A, Smirnov A, et al. L1 expression as a predictor of progression and survival in patients with uterine and ovarian carcinomas. Lancet 2003; 362:869-75（非特許文献11））。
【０００４】
当技術分野では、卵巣癌および子宮内膜癌の処置のために抗L1抗体を用いることが提案されている（参照、WO 02/04952号（特許文献1）、WO 06/013051号（特許文献2）およびArlt MJ, Novak-Hofer I, Gast D, Gschwend V, Moldenhauer G, Grunberg J, et al. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer Res 2006;66:936-43（非特許文献12））。当技術分野では、さまざまな抗L1抗体が公知である（例えば、mAb 14.10: Huszar M, Moldenhauer G, Gschwend V, Ben-Arie A, Altevogt P, Fogel M: Expression profile analysis in multiple human tumors identifies L1 (CD171) as a molecular marker for differential diagnosis and targeted therapy. Hum Pathol 37:1000-1008, 2006（非特許文献13）, mab chCE7: Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I: Anti-neuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer 83:401-408, 1999（非特許文献14）, mAb UJ127.11: Patel K, Kiely F, Phimister E, Melino G, Rathjen F, Kemshead JT: The 200/220 kDa antigen recognized by monoclonal antibody (MAb) UJ127.11 on neural tissues and tumors is the human L1 adhesion molecule. Hybridoma 10:481-491, 1991（非特許文献15）, mAb 5G3: Wolff JM, Frank R, Mujoo K, Spiro RC, Reisfeld RA, Rathjen FG: A human brain glycoprotein related to the mouse cell adhesion molecule L1. J Biol Chem 263:11943-11947, 1988（非特許文献16））。さらに、Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19):2759-68, Epub 2006 Nov 6（非特許文献17）では、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために腫瘍細胞の感受性を高める目的で抗L1抗体を用いることが提案されている。
【０００５】
改良された抗腫瘍剤に対しては常に需要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 02/04952号
【特許文献２】WO 06/013051号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Moos M, Tacke R, Scherer H, Teplow D, Fruh K, Schachner M. Neural adhesion molecule L1 as a member of the immunoglobulin superfamily with binding domains similar to fibronectin. Nature 1988; 334:701-3
【非特許文献２】Hortsch M. Structural and functional evolution of the L1 family: are four adhesion molecules better than one? Mol Cell Neurosci 2000; 15:1-10.
【非特許文献３】Schachner M. Neural recognition molecules and synaptic plasticity. Curr Opin Cell Biol 1997; 9:627-34
【非特許文献４】Katayama M, Iwamatsu A, Masutani H, Furuke K, Takeda K, Wada H, et al. Expression of neural cell adhesion molecule L1 in human lung cancer cell lines. Cell Struct Funct 1997;22:511-6
【非特許文献５】Senner V, Kismann E, Puttmann S, Hoess N, Baur I, Paulus W. L1 expressed by glioma cells promotes adhesion but not migration. Glia 2002;38:146-54
【非特許文献６】Thies A, Schachner M, Moll I, Berger J, Schulze HJ, Brunner G, et al. Overexpression of the cell adhesion molecule L1 is associated with metastasis in cutaneous malignant melanoma. Eur J Cancer 2002;38:1708-1
【非特許文献７】Fogel M, Mechtersheimer S, Huszar M, Smirnov A, Abu DA, Tilgen W, et al. L1 adhesion molecule (CD 171) in development and progression of human malignant melanoma. Cancer Lett 2003;189:237-47
【非特許文献８】Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I. Antineuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer, 1999; 83: 401-408
【非特許文献９】Allory Y, Matsuoka Y, Bazille C, Christensen El, Ronco P, Debiec H. The L1 cell adhesion molecule is induced in renal cancer cells and correlates with metastasis in clear cell carcinomas. Clin Cancer Res 2005;11:1190-7
【非特許文献１０】Gavert N, Conacci-Sorrell M, Gast D, Schneider A, Altevogt P, Brabletz T, et al. L1, a novel target of beta-catenin signaling, transforms cells and is expressed at the invasive front of colon cancers. J Cell Biol 2005; 168:633-42
【非特許文献１１】Fogel M, Gutwein P. Mechtersheimer S, Riedle S. Stoeck A, Smirnov A, et al. L1 expression as a predictor of progression and survival in patients with uterine and ovarian carcinomas. Lancet 2003; 362:869-75
【非特許文献１２】Arlt MJ, Novak-Hofer I, Gast D, Gschwend V, Moldenhauer G, Grunberg J, et al. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer Res 2006;66:936-43
【非特許文献１３】Huszar M, Moldenhauer G, Gschwend V, Ben-Arie A, Altevogt P, Fogel M: Expression profile analysis in multiple human tumors identifies L1 (CD171) as a molecular marker for differential diagnosis and targeted therapy. Hum Pathol 37:1000-1008, 2006
【非特許文献１４】Meli ML, Carrel F, Waibel R, Amstutz H, Crompton N, Jaussi R, Moch H, Schubiger PA, Novak-Hofer I: Anti-neuroblastoma antibody chCE7 binds to an isoform of L1-CAM present in renal carcinoma cells. Int J Cancer 83:401-408, 1999
【非特許文献１５】Patel K, Kiely F, Phimister E, Melino G, Rathjen F, Kemshead JT: The 200/220 kDa antigen recognized by monoclonal antibody (MAb) UJ127.11 on neural tissues and tumors is the human L1 adhesion molecule. Hybridoma 10:481-491, 1991
【非特許文献１６】Wolff JM, Frank R, Mujoo K, Spiro RC, Reisfeld RA, Rathjen FG: A human brain glycoprotein related to the mouse cell adhesion molecule L1. J Biol Chem 263:11943-11947, 1988
【非特許文献１７】Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19):2759-68, Epub 2006 Nov 6
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、1つの局面において、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3によって認識されるのと同じL1エピトープと結合することのできる抗L1モノクローナル抗体に関する。
【０００９】
本発明の文脈において、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3が、驚いたことに、改良された抗腫瘍能能力を有することが見いだされた（実施例参照）。特に、モノクローナル抗体9.3は、検討したすべての抗体のうちで、腫瘍細胞の腫瘍成長および浸潤を阻害する最も優れた能力を有していた。さらに、モノクローナル抗体9.3は、WO 2008/046529号で試験した抗体11Aを上回る程度で化学療法抵抗性を消失させるように思われる（実施例13参照）。
【００１０】
モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産は先端技術であり、実施例の材料および方法の項に引用した参考文献中にも記載されている。一般に、モノクローナル抗体は、例えば、Winter & Milsteinの方法（Winter, 0. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299）に従って調製することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製することに代わる選択肢として、本発明のポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を関心対象のポリペプチドを用いてスクリーニングすることによって同定して単離することもできる。ファージディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングのためのキットは市販されている（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01；およびStratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに用いるのに特に適している方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；WO 92／18619号；WO 91／17271号；WO 92／20791号；WO 92／15679号；WO 93／01288号；WO 92／01047号；WO 92／09690号；WO 90／02809号；Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281；Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12:725-734にみることができる。
【００１１】
抗体の効果は、それが特異的エピトープと結合する能力によって媒介されるため、本発明は、抗体9.3と同じエピトープを認識するすべてのモノクローナル抗体に関する。所与の抗体のエピトープを決定するための方法は当技術分野で公知であり、これには関心対象の所与の領域の合成線状ペプチドの調製、およびその後の、抗体が前記ペプチドと結合するか否かの試験が含まれる（Epitope Mapping, A practical approach, Oxford University Press 2001, Editors: Olwyn Westwood and Frank Hayを参照）。または、関心対象の領域をカバーする種々の組換えタンパク質を作製し、抗体の結合に関して試験することもできる（Oleszewski, M., Gutwein, P.,von der Lieth, W., Rauch, U., Altevogt, P. Characterization of the L1-neurocan binding site. Implications for L1-L1 homophilic binding. J.Biol.Chem. 275: 34478-34485 (2000)。
【００１２】
さらに、モノクローナル抗体のエピトープがひとたび判明すれば、同じエピトープと結合する、以下に定義するような他の抗体、特にモノクローナル抗体または結合性分子を同定または調製することは当業者の技能の範囲内にある。例えば、エピトープマッピングの文脈で上述したペプチドまたはタンパク質を、前記抗体または結合性分子の同定または作製のために用いることが可能である。
【００１３】
実施例から把握しうるように、抗体9.3のエピトープは、L1の第1の免疫グロブリン様ドメインを備えている。このため、本発明のモノクローナル抗体のエピトープは、L1の第1の免疫グロブリン様ドメインの内部にあることが好ましい。
【００１４】
もう1つの局面において、本発明は、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3と同じ腫瘍成長阻害能力を有する抗L1モノクローナル抗体に関する。この能力は、実施例1の1.3.9項に記載したのと同じ腫瘍成長アッセイを用いることによって試験することができる。本発明によれば、「同じ能力」とは、モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体9.3の腫瘍成長阻害能力との違いが5％を上回らない腫瘍成長阻害能力を有することを意味する。
【００１５】
好ましくは、本発明のこの抗体は、抗体5G3に関して示されているように（上記参照）、L1の二量体化も阻害する。
【００１６】
もう1つの局面において、本発明は、その相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つが、
a）以下の配列
のうち1つを有すること、または
b）a）において言及した配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する配列を有すること、
を特徴とする、抗L1モノクローナル抗体に関する。
【００１７】
上述した配列は、Kabatの方法に従って決定されるモノクローナル抗体9.3のCDRを示す（実施例2参照）。そのような本発明のモノクローナル抗体は、例えば、CDRグラフティング（CDR grafting）により、または抗体の組換え作製によって作製することができる。そのような方法は技術分野で公知である（例えば、Queen、米国特許第5,585,089号、およびWinter、U.S: 5,225,539号、Cabilly U.S. 4,816,567号を参照）。
【００１８】
もう1つの局面において、本発明はまた、その相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つが、
a）以下の配列
のうち1つを有すること、または
b）a）において言及した配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する配列を有すること、
を特徴とする、抗L1モノクローナル抗体にも関する。
【００１９】
これらの配列も同じく、モノクローナル抗体9.3のCDRを示す（図12参照）が、そのCDRは、当技術分野で公知の別の方法を用いて、すなわち国際的ImMunoGeneTics情報システム（登録商標）によるIMGT（登録商標）方法に従って決定される。
【００２０】
1つの特に好ましい局面において、本発明は、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体に関する。このハイブリドーマ細胞は、Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellenにより、ブダペスト条約に準拠して2007年4月25日に寄託されている。
【００２１】
もう1つの局面において、本発明は、上記のような本発明のモノクローナル抗体を基にしたヒト化抗体に関する。
【００２２】
ヒト化抗体とは、非ヒト種由来の1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域（FR）を有する、非ヒト種由来の抗体分子のことである（例えば、Queen、米国特許第5,585,089号、およびWinter、US U.S: 5,225,539号を参照）。そのようなキメラ型モノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA技術によって作製することができる。
【００２３】
一般に、ヒト化抗体を得るためには、ヒト（アクセプター）配列の1つまたは複数のCDR配列をマウス抗体配列（ドナー配列）中の各々のCDRをコードする配列によって置き換えることにより、ヒト可変重鎖および可変軽鎖をコードする核酸配列を改変しうる。ヒトアクセプター配列は、異なる遺伝子に由来するFRを含んでもよい。
【００２４】
1つの好ましい態様において、本発明のヒト化抗体は、少なくとも1つの非ヒトCDRおよびヒトフレームワーク領域（FR）残基を有する。
【００２５】
次いで、付与された可変重鎖配列および可変軽鎖配列をヒトの定常重鎖領域および定常軽鎖領域と連結することにより、完全長抗体をコードする配列を得ることができる。好ましいヒト定常軽鎖配列にはκおよびλ定常軽鎖配列が含まれる。好ましいヒト定常重鎖配列には、IgG1、IgG2、および免疫刺激性が付与されたIgG1突然変異体をコードする配列が含まれる。そのような突然変異体は、補体および／または抗体依存性細胞傷害性を活性化する能力が低下していてもよく、それらはUS 5,624,821号；WO 99/58572号、US 6,737,056号に記載されている。特に好ましい定常重鎖は、置換E233P、L234V、L235A、A327G、A330S、P331S、および残基236の欠失を含むIgG1である。
【００２６】
もう1つの態様において、完全長抗体はIgA、IgD、IgE、IgM、IgYまたはIgW配列を含む。
【００２７】
適したヒトドナー配列は、マウスドナー配列によってコードされるペプチド配列と一群のヒト配列との、好ましくはヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子または成熟抗体遺伝子によってコードされる配列との配列比較によって決定することができる。決定された、高い配列相同性を有する、好ましくは最も高い相同性を有するヒト配列を、ヒト化工程のためのアクセプター配列として役立てることができる。
【００２８】
ヒトCDRのマウスCDRによる交換に加えて、最適化された特性（抗原の親和性など）を有するヒト化抗体をコードする配列を得るために、ヒトドナー配列におけるさらなる操作を行うこともできる。
【００２９】
1つの好ましい例においては、ヒトアクセプター配列中の重鎖残基31〜35、50〜58および95〜102、ならびに残基6、23、24および49を、マウス配列の各々の残基に対応するように改変する（Adair、U.S. 5,859,205号）。
【００３０】
さらに、改変されたヒトアクセプター抗体可変ドメイン配列を、マウスドナー配列に対応する軽鎖可変領域の位置4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98、および重鎖可変領域の位置2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92のうち1つまたは複数のアミノ酸（Kabat付番方式による）をコードするようにさせることもできる（Carter and Presta、U.S. 6,407,213号）。
【００３１】
マウスL1抗体のヒト化は実施例2に記載されている。
【００３２】
また、CDRの配列を、好ましくは保存的アミノ酸交換を招く交換によって改変することもできる。
【００３３】
一般に、操作はFR領域ならびにCDR領域における改変を結果的にもたらすと考えられ、これには残基の交換、欠失および挿入が含まれる。改変はランダムまたは定方向突然変異誘発によって誘導することができる。前に述べたような抗体ファージディスプレイ系を、所望のおよび／または改良された特性を備える突然変異体の選択のために利用することができる。
【００３４】
もう1つの局面において、本発明は、抗体9.3と同じエピトープを認識することのできるヒト抗体に関する。ヒト抗体を作製するための方法は当技術分野で公知である。これらの方法は、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されて、ヒト免疫グロブリン座位が導入されたマウスを利用する。免疫原性エピトープによる免疫処置を行うと、これらのマウスはヒト抗体を産生することができる（U.S. 5,545,807号；同5,545,806号；同5,569,825号；同5,589,369号；同5,591,669号；同5,625,126号；同5,633,425号；同5,661,016号）。
【００３５】
1つのさらなる好ましい態様において、本発明のヒト化抗体は、図8a）およびb）に示されているようなL1_9.3huまたはL1_9.3hu3の配列を含む。
【００３６】
もう1つの局面において、本発明は、
a）以下の配列
のうち少なくとも1つ、または
b）a）に挙げられた配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する、少なくとも1つの配列、
を含む、結合性分子に関する。
【００３７】
以上に説明したように、これらの配列は抗体9.3のCDRを示す（実施例2参照）。
【００３８】
もう1つの局面において、本発明は、
a）以下の配列
のうち少なくとも1つ、または
b）a）に挙げられた配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する、少なくとも1つの配列、
を含む、結合性分子に関する。
【００３９】
以上に説明したように、これらの配列も同じく、当技術分野で公知の別の方法によって決定される、モノクローナル抗体9.3のCDRを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】（A）CHO、CHO-L1、SKOV3ipおよびOVMz細胞のFACS分析。細胞を指定のmAb（10μg／ml）によって4℃で30分間にわたり染色した。その後に二次PE結合mAbを用いた。（B）ウエスタンブロット分析。CHO 野生型、CHO-L1、OVMzおよびSKOV3ip細胞からの細胞溶解物をPVDF膜に移行させ、続いてL1に対する指定のmAb（1μg／ml）とともにインキュベートし、その後にPOX-結合二次mAbを用いた。
【図２】（A）SKOV3ip細胞におけるErk-リン酸化に対する抗体の影響。細胞を、L1に対する指定の精製抗体（10μg／ml）またはアイソタイプ対照IgG1とともに37℃で24時間インキュベートした。細胞を同じくDMSO（媒体）またはMEK特異的阻害薬PD59098でも処理した。細胞溶解物をErkのリン酸化に関して調べた。（B）SKOV3ip細胞におけるErkリン酸化に対する抗体の影響。ホスホ-Erk特異的抗体およびAlexa488結合二次mAbによる抗体処置細胞の蛍光染色。
【図３】マトリゲル細胞浸潤の分析。抗体（10μg／ml）で処置したSKOV3ip細胞を4ウェルプレートに播き、20時間にわたりマトリゲル中に浸潤させた（5％ CO2；37℃）。
【図４】SKOV3ip細胞における遺伝子発現の差異。（A）SKOV3ip細胞にL1特異的siRNAまたはスクランブルsiRNAをトランスフェクトして、72時間後にmRNAを単離し、cDNAに転写させて、qPCRのためのテンプレートとして用いた（SYBRgreen分析）。（B）SKOV3ip細胞をL1-9.3mAb（10μg／ml）または対照mAB IgG1（10μg／ml）で処置して、96時間後にmRNAを単離し、cDNAに転写させて、指定の遺伝子の発現に関してqPCRによって分析した（SYBRgreen分析）。（C）残存する腫瘍細胞の遺伝子発現の差異。残存する腫瘍からのmRNAを抗体で処置した動物から単離し、cDNAに転写させて、指定の遺伝子の発現に関してqPCRによって分析した。
【図５】ヌードマウスにおける腫瘍成長。LacZでタグ標識したSKOV3ip細胞をヌードマウスに腹腔内注射し、腫瘍移植後に動物を指定のL1 mAbまたは対照mAb EpCAM（Hea125）によって処置した。30日後に腫瘍体積を決定し、X-Galで染色された腫瘍塊と全内臓（total situs）との比として提示する。各群当たり6匹の動物個体を分析した。
【図６】（A）L1-V5構築物のウエスタンブロット分析。トランスフェクトされたSf9昆虫細胞の上清をRicardo Gouveiaから受領し、L1-9.3mAbを用いるウエスタンブロットによって分析し、抗V5 mAbによって再プロービングした。（B）L1-FC構築物のウエスタンブロット分析。Jet PEI（商標）トランスフェクション試薬を記載通りに用いて、L1-FC構築物をCos-7細胞にトランスフェクトした。3日後に上清をSepharoseAを用いて精製し、L1-9.3mAbを用いるウエスタンブロットによって分析した。
【図７】同種親和性（homophilic）細胞接着アッセイ。（A）J558-L1細胞の結合を明視野顕微鏡検査によって分析した。各処置の一例をここに示している。赤のボックスにはL1-Fc（10μg／ml）によるコーティングが強調されており、黒のボックスではいずれも対照であるフィブロネクチン（10μg／ml）およびBSAが示されている。（B）このグラフは、指定の抗体または対照による処置後の結合細胞の平均±SDを示している。
【図８】ヒト化抗体を構築するために用いた抗体軽鎖および重鎖のDNA配列が、それぞれ図8aおよび8bに提示されている。
【図９】マウスL1_9.3 scFv（a）ならびにヒト化L1_9.3Hu scFv（b）およびL1_9.3Hu3 scFv（c）のアミノ酸配列。
【図１０】L1_9.3 scFv（a）、L1-9.3Hu scFv（b）およびL1_9.3Hu3 scFv（c）構築物の発現された部分のDNA配列およびアミノ酸配列。
【図１１】ヒトL1癌抗原に対するL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvの結合。列A、BおよびCはL1でコーティングされ、列D、EおよびFはストレプトアビジンでコーティングされている。ウェルの青色は個々のscFvとプレート上のL1との結合を指し示している。ストレプトアビジンでコーティングされた列に色がないことは、一本鎖抗体がL1と特異的に結合することを示している。
【図１２】モノクローナル抗体9.3の可変ドメインのゲノム配列。a）κ鎖可変領域の配列（点線：CDR1、破線：CDR2、下線：CDR3）b）重鎖可変領域の配列（点線：CDR1、破線：CDR2、下線：CDR3）
【図１３】A）ヒトPBMCおよびL1陽性OVMZ腫瘍細胞をL1-9.3mAbとともに24時間インキュベートして、結合した抗体の量をFACS分析によって分析した。B）回帰曲線から最大半値結合での濃度を用いて解離定数KDを推定した。
【図１４】L1-9.3は休止ヒトPBMCおよび活性化ヒトPBMCによるサイトカインの放出に影響を及ぼさない。3例の異なるドナーからの休止PBMCおよびOKT3で活性化したPBMCのサイトカインレベルを、20μg／mlのL1-9.3の存在下または非存在下での24時間のインキュベーション後に決定した。ロノマイシン／PMAおよびLPSを刺激対照として用いた。IFN-γ（A）およびTNF-α（B）に関する結果を示している。
【図１５】L1-9.3はT細胞増殖を誘導せず、OKT3で誘導されるT細胞増殖に対して何ら影響を及ぼさない。2例の異なるドナーからの、OKT3で活性化したPBMCの増殖を、20μg／mlのL1-9.3の存在下または非存在下で、刺激から48時間後にBrdU取り込みアッセイを用いて決定した。抗体を75ng／mlのOKT3による刺激の前、同時並行または後のいずれに添加するかにかかわらず、差はみられなかった。L1-9.3はそれ自体ではT細胞活性化をもたらさなかった。
【図１６】L1-9-3はL1の脱グリコシル化によって影響されない。非処置および脱グリコシル化された細胞溶解物におけるL1のウエスタンブロット染色が、いくつかの異なる抗L1 mAbを用いて示されている。被験抗体は、それらのグリコシル化依存性に関して3つのクラスに分けることができる：第1のクラス（グリコシル化によって影響されない）：L1-9.3。第2のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって負の影響を受ける）：11A、14.10、OV52.24およびOV549.20。第3のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって正の影響を受ける）：35.9および38.12。
【図１７】この図は、静脈内投与されたL1-9.3の、腎臓の集合管に対するインビボ結合を示している。インビボ結合は増幅システムCSA（図17A）を用いた場合にのみ検出可能であり、一方、従来のABC法を用いることによっては全くシグナルが視認されなかった（図17B）。このことからみて、L1-9.3は組織中で30〜300pmolの範囲で検出された（L1-9.3濃度はおそらく5ng／mlよりも高く、かつ50ng／ml未満であると考えられる）。陰性対照は染色を示さず、それ故に非特異的な染色の可能性は否定することができる（図17C）。インビボで結合したL1-9.3の染色パターン（図17A）は、組織切片をL1-9.3で直接染色した時の腎臓におけるL1発現パターンに対応する（図17D）。
【図１８】ヒト化L1-9.3mAbのFACS分析SKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞におけるフローサイトメトリー分析。細胞を指定のヒト化mAb（10μg／ml）によって4℃で30分間染色し、続いて二次PE結合mAbを用いた。
【図１９】マウスSKOV3ip異種移植モデル7*106個のSKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞を、6週齡のCD1 nu/nu雌性マウスに腹腔内注射した。24時間後にマウスを、マウス10匹ずつの群に無作為割り付けした。各群のマウスに対して、300μgのmAb L1-chi9.3、mAbL1-hu3またはPBSを腹腔内に週3回注射した。第33日にマウスの画像を撮影した（図2）。腫瘍体積はXENOGEN IVIS 200システムを用いて決定した。手短に述べると、マウスに麻酔をかけて、100μlのルシフェリンD（3μg／匹）を腹腔内に注射した。その後に、光放射を検出することによって腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。腫瘍体積は1秒当たりのフォトン数（全フラックス（total flux））として示されている。統計分析はスチューデントのt検定を用いて行った。
【図２０】インビボの全腫瘍塊 36日後にマウスを殺処理し、腫瘍塊を決定した。腫瘍成長は腫瘍塊と体重との比として提示される（A 個々のマウス、B 平均値）。統計分析はスチューデントのt検定を用いて行った。このように、L1 9.3抗体による免疫不全マウスの処置を、キメラ型およびヒト化型L1 9.3mAbによって再現することができた。
【図２１】PT45-P1res細胞を、1μg／mLもしくは10μg／mLの抗L1CAM抗体9.3または1μg／mLもしくは10μg／mLのアイソタイプを、一致させた対照抗体の非存在下（w／o）または存在下で、処置しないままにするか（w／o）、または20μg／mLのゲムシタビン（A）もしくはエトポシド（B）で処置した。24時間後に、細胞をカスパーゼ-3／-7アッセイによって分析した。3回の独立した実験による平均±SDを示している。*はp＜0.05を指し示している。
【図２２】Colo357細胞を、1μg／mLもしくは10μg／mLの抗L1CAM抗体9.3、または1μg／mLもしくは10μg／mLのアイソタイプを一致させた対照抗体の、非存在下（w／o）または存在下で、処置しないままにするか（w／o）、または20μg／mLのゲムシタビン（A）もしくはエトポシド（B）で処置した。24時間後に、細胞をカスパーゼ-3／-7アッセイによって分析した。3回の独立した実験による平均±SDを示している。*はp＜0.05を指し示している。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明によれば、結合性分子とは、結合L1と結合することのできる分子のことである。好ましくは、結合性分子は免疫グロブリンを含む分子であり、すなわち、少なくとも1つのIgドメインを含む。
【００４２】
1つの好ましい態様において、本発明の結合性分子は、一本鎖抗体（例えば、scFv、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）またはテトラボディ（tetrabody）のようなscFvの多量体、抗体フラグメント（例えば、Fab）、タンダブ（tandab）、フレキシボディ（flexibody）、二重特異性抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される。
【００４３】
抗体の構造、および特にそのCDRの機能は、当技術分野で公知である（Carter PJ. Potent antibody therapeutics by design. Nature Rev. Immunol. 6:343357,2006）。
【００４４】
scFvおよびその多量体、タンダブ、ダイアボディおよびフレキシボディは、例えばWO 88/1649号、WO 93/11161号、WO 99/57150号およびEP1293514B1号によって当技術分野で公知である標準的な抗体形式である。
【００４５】
一本鎖Fv（scFv）では、抗体の軽鎖および重鎖の2つの抗原結合性可変領域（VH FvおよびVL Fv）がリンカーペプチドによって人工的に結びつけられており、一本鎖可変フラグメントまたは一本鎖抗体と呼ばれる（Bird, et al. (1988) Science 242:423-426；Orlandi, et al (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:3833-3837；Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991)）。抗原結合部位はモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインで構成される。いくつかの研究により、Fvフラグメントは完全抗体の1つの結合部位の本来の抗原結合親和性のすべてを実際に有することが示されている。
【００４６】
本発明の文脈において、ダイアボディとは、2種類の結合特異性を有するscFvのことであり、これは単一特異性かつ二価、または二重特異性かつ二価のいずれでもありうる。
【００４７】
タンダブおよびフレキシボディは、例えば、US2007031436号およびEP1293514号にそれぞれ定義されている、さらなる抗体形式である。
【００４８】
タンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当技術分野で公知の手法によって作製することができる。例えば、そのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって作製しうるF(ab')2フラグメント；F(ab')2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって作製しうるFab'フラグメント；抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製しうるFabフラグメント；ならびにFvフラグメントが非限定的に含まれる。
【００４９】
キメラ抗体とは、マウスmAbに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののように、異なる部分が異なる動物種に由来する分子のことである（例えば、Cabilly et al., 米国特許第4,816,567号；およびBoss et al., 米国特許第4,816,397号を参照）。
【００５０】
二機能性または二重特異性抗体は、特異性の異なる複数の抗原結合部位を有する。さまざまな形態の二重特異性抗体が作製されている。これらには、いわゆる「ハイブリッド型ハイブリドーマ」によって分泌される、2種類の異なる重鎖および2種類の異なる軽鎖を含むIgG分子であるBSIgG、ならびに特異性の異なる複数の抗体または抗体フラグメントの化学的コンジュゲーションによって生成される抗体結合物が含まれる（Segal DM, Weiner GJ, Weiner LM. Bispecific antibodies in cancer therapy. Current Opin. Immunol. 11:558-562, 1999, Van Spriel AB, Van Ojik HH, Van de Winkel JGJ. Immunotherapeutic perspective for bispecific antibodies. Immunology Today 21:391-397, 2000）。
【００５１】
二重特異性抗体は、細胞、細胞毒または薬物を複数の特定部位に送達するために作製されている。1つの重要な用途は、ナチュラルキラーT細胞または細胞傷害性T細胞といった宿主の細胞傷害性細胞を、特定の細胞標的に送達することである（P. J. Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315 (1990)）。もう1つの重要な用途は、細胞傷害性タンパク質を特定の細胞標的に送達することである（V. Raso, T. Griffin, Cancer Res. 41:2073 (1981)；S. Honda, Y. Ichimori, S. Iwasa, Cytotechnology 4:59 (1990）)。もう1つの重要な用途は、非タンパク質性の抗癌薬を特定の細胞標的に送達することである（J. Corvalan, W. Smith, V. Gore, Intl. J. Cancer Suppl. 2:22 (1988); M. Pimm et al., British J. of Cancer 61:508 (1990)）。そのような二重特異性抗体は、化学架橋（M. Brennan et al., Science 229:81 (1985)）、ジスルフィド交換、またはハイブリッド型ハイブリドーマ（クアドローマ）の作製によって調製されている。クアドローマは、2種の異なる抗原に対して2種の異なる抗体を分泌するハイブリドーマを融合させることによって構築される（Kurokawa, T. et al., Biotechnology 7.1163 (1989)）。
【００５２】
本発明の1つの好ましい態様において、本発明の抗体または結合性分子は、活性物質、好ましくは毒素、ナノ粒子、サイトカインまたは放射性ヌクレオチドと連結される。そのような抗体結合物は当技術分野で公知である（Wu AM, Senter PD. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnol. 23:1137-1146, 2005, Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ. Immunotoxin treatment of cancer. Annu. Rev. Med. 58:221-237, 2007, WO 90/12592号、WO 2007/030642号、WO 2004/067038号、WO 2004/003183号、US 2005/0074426号、WO 94/04189号）。
【００５３】
1つの好ましい態様において、抗体または本発明の結合性分子は、L1と、少なくとも10-8の、好ましくは少なくとも10-9の、より好ましくは少なくとも10-10または10-11の親和性（KD）で結合する。
【００５４】
好ましくは、本発明の抗体は、L1-タンパク質ファミリーの他のメンバー、例えばCHL1（L1のごく近い相同体、アクセッション番号NM_006614）、NrCAM（神経細胞接着タンパク質、アクセッション番号NM_001037132またはNM_005010）および／またはNFASC（ニューロファシン、アクセッション番号NM_015090）などと有意には結合しない。好ましくは、抗体は、L1-ファミリーの他のメンバーとは、L1に対する親和性と比較して少なくとも100倍下回る親和性、より好ましくは少なくとも1000倍下回る親和性でしか結合しない。種々のタンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、実施例6に記載されているように、組換えタンパク質に対する結合親和性を測定することによって決定することができる。L1-ファミリーの種々のL1ファミリーメンバーに対する抗体の結合を、実施例1.2および実施例7に記載されているように、CHO細胞上で前記タンパク質を発現させ、FACS分析によって抗体結合を測定することによって決定することもできる。
【００５５】
抗体がサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子-αまたはインターフェロンγなどの放出を有意には増加させないことは、本発明の1つの局面である。好ましくは、放出は30％を上回っては増加せず、より好ましくは20％を上回っては増加せず、最も好ましくは10％を上回っては増加しない。サイトカインの放出は実施例8に記載された通りに試験することができる。または、抗体の投与の前および後に動物の血液中のサイトカインの濃度を決定することもできる。サイトカイン濃度は、ELISAアッセイまたは当技術分野で公知の他の方法によって決定することができる。
【００５６】
もう1つの好ましい態様において、抗体はT細胞増殖を有意には誘導せず、T細胞増殖を阻害することもない。T細胞増殖に対する抗体の影響は、実施例9に記載された通りに決定することができる。
【００５７】
本発明はさらに、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3によって認識されるのと同じL1エピトープと結合することのできる結合性分子にも関する。好ましくは、本発明のこの結合性分子に関しては、上記の結合性分子の構造に関して定義したのと同じ態様が、本発明のこの結合性分子に対しても適用される。
【００５８】
好ましくは、エピトープに対する抗体の結合は、L1タンパク質のグリコシル化状態によって有意に増加することも減少することもない。抗体結合に対するグリコシル化状態の影響は、実施例10に記載された通りに決定することができる。
【００５９】
さらに、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞にも関する。
【００６０】
さらに、本発明は、DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞にも関する。
【００６１】
以上に説明したように、および実施例の項に記載されているように、本発明のモノクローナル抗体または結合性分子は、腫瘍形成性疾患の処置のために特に適している。
【００６２】
したがって、もう1つの局面において、本発明は、腫瘍形成性疾患の処置用の医薬品の調製のための、本発明の抗体または本発明の結合性分子の使用法に関する。
【００６３】
さらに、本発明はまた、腫瘍形成性疾患を処置するための方法であって、抗体または本発明の結合性分子が、対象に対して、前記疾患を処置するための有効量で投与される方法にも関する。本発明の前記方法に関しては、本発明の使用法に関して以下に定義されるようなすべての態様が同じく適用される。
【００６４】
上述したように、当技術分野において、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、腫瘍細胞の感受性を高める目的で抗L1抗体を用いることが提案されている（Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19);2759-68, Epub 2006 Nov 6を参照）。その結果として、もう1つの局面において、本発明は、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための、本発明の抗体または本発明の結合性分子の使用法に関する。
【００６５】
本発明のこの局面は、化学療法に対して、または放射線療法に対して、腫瘍細胞が少なくとも部分的に抵抗性である場合に特に有用である。
【００６６】
したがって、本発明の1つの好ましい態様において、感受性を高めようとする細胞は、前記化学療法薬による処置に対して、または放射線療法に対して、少なくとも部分的に抵抗性である。
【００６７】
本発明の文脈において、「感受性を高めること（sensitizing）」という用語は、本発明の抗L1抗体または結合性分子による処置の後に、腫瘍細胞が、前記処置の前よりも、化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して、より高い感受性を持つことと解釈されるものとする。これは例えば、患者から腫瘍細胞を単離して、前記抗体または本発明の結合性分子による処置が、細胞の感受性増加（sensitization）を結果的にもたらすか否かをインビトロで試験することによって試験することができる。この試験は、参考文献に記載された通りに行うことができる（Sebens Muerkoster et al., Oncogene. 2007 Apr 26;26(19);2759-68, Epub 2006 Nov 6）。
【００６８】
1つの好ましい態様において、細胞は、本発明の抗L1抗体または結合性分子の投与の前には、処置に対して感受性を持たないか、または化学療法薬による、もしくは放射線療法による処置が、所望の処置効果を結果的にもたらさないと考えられる程度でしか感受性を持たない。
【００６９】
好ましくは、本発明の抗L1抗体または結合性分子の助けにより、感受性は少なくとも20％、より好ましくは少なくとも40％、さらにより好ましくは少なくとも100％増加する。
【００７０】
化学療法薬および放射線療法に関する概説は、例えば、Remmington's Pharmaceutical Sciences, 5th ed., chapter 33、特に624〜652ページに提示されている。
【００７１】
任意のさまざまな化学療法薬を、本発明の方法または使用法に用いることができる。これらの化合物は、例えば、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤および天然物誘導体を含む、いくつかの異なるカテゴリーに分類される。
【００７２】
本発明に用いることのできるアルキル化剤の例には、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（すなわち、シトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシンおよびチオテパが含まれる。
【００７３】
抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンC）、ミトキサントロン、ペントスタチンおよびプリカマイシンが含まれる。
【００７４】
代謝拮抗剤の例には、フルオロデオキシウリジン、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（例えば、5-フルオロウラシル（5FU））、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサートおよびチオグアニンが含まれる。
【００７５】
天然物誘導体の例には、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、タキサン系剤（例えば、パクリタキセル）、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾンおよびタモキシフェンが含まれる。
【００７６】
本発明に用いることのできる化学療法剤のその他の例には、アスパラギナーゼおよびミトタンが含まれる。
【００７７】
さらに、C2セラミドも用いることができる。
【００７８】
1つの特に好ましい態様において、化学療法薬は、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、5-FU、パクリタキセルなどのタキサン系剤、およびカルボプラチンからなる群より選択される。
【００７９】
本発明によれば、「放射線療法」という用語は、腫瘍細胞の処置のために一般的に用いられる各々の照射療法のことを指す。1つの好ましい態様において、この処置法は、γ線、X線、マイクロ波、UV照射、ならびに腫瘍細胞に対する、または腫瘍細胞に近接させての（近接照射療法）、放射性同位体の直接送達を含む。
【００８０】
上述したように、本発明のこの局面の目的は、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、腫瘍細胞の感受性を高めることである。その結果として、1つの好ましい態様においては、本発明の抗L1抗体または結合性分子による感受性増加の後に、患者を前記化学療法薬によって、または前記放射線療法によってさらに処置する。
【００８１】
本発明の文脈においては、任意の細胞種の腫瘍細胞の感受性を高めること、または任意の腫瘍形成性疾患を処置することが想定される。好ましくは、腫瘍細胞または腫瘍形成性疾患は、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、髄芽腫、黒色腫、膵癌、前立腺癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽腫、扁平上皮癌、髄芽腫、肝細胞癌、結腸癌、および中皮腫および類表皮癌からなる群より選択される種類のものである。
【００８２】
さらに、腫瘍細胞は上皮腫瘍に由来すること、または腫瘍形成性疾患は上皮腫瘍であることが好ましく、好ましくはここで上皮腫瘍は膵癌、結腸癌、卵巣癌または子宮内膜癌である。
【００８３】
1つの好ましい態様において、抗体は、処置的有効量で投与された時に神経性の副作用を誘発しない。
【００８４】
以上に考察したように、抗L1抗体または結合性分子は薬学的組成物の調製のために用いられる。
【００８５】
一般に、本発明の薬学的組成物は、処置薬の処置上の有効量、および薬学的に許容される担体を含む。1つの具体的な態様において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の監督官庁によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認知された薬局方において、動物における、より詳細にはヒトにおける使用に関して掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに処置薬が投与される、希釈剤、補助剤、添加剤または媒体のことを指す。そのような薬学的担体は、水および油などの無菌液体であってよく、これには石油、動物、植物または合成物に由来するもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが非限定的に含まれる。薬学的組成物を経口投与する場合には水が好ましい担体である。薬学的組成物を静脈内投与する場合には食塩水およびデキストロース水溶液が好ましい担体である。注射用溶液用の液体担体としては食塩液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール溶液を用いることが好ましい。適した薬学的添加剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとりうる。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体とともに坐薬として製剤化することができる。経口用製剤は、医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含みうる。適した薬学的担体の例は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、好ましくは精製された形態にある処置薬の処置上の有効量を、患者に対する適正な投与のための形態が得られるような、適した量の担体とともに含むと考えられる。製剤は投与様式に適合しているべきである。
【００８６】
1つの好ましい態様において、組成物は、ヒトに対する静脈内投与用に適合化された薬学的組成物として、定型的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液中にある溶液である。必要であれば、組成物は、溶解補助剤、および、注射部位での痛みを軽減するためのリドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、成分は、例えば有効剤の数量を表示しているアンプルまたは薬袋などの密閉封止容器内の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位投薬式剤形で、別々に供給されるかまたは混合されて供給される。組成物を輸注によって投与しようとする場合には、医薬品級の滅菌水または食塩水を含む輸液ボトルを用いてそれを投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合には、成分を投与前に混合しうるように注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを用意することができる。
【００８７】
本発明の薬学的組成物は、中性または塩の形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののような遊離カルボキシル基と形成されたもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののような遊離アミン基と形成されたもの、ならびに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムおよび水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【００８８】
特定の障害または状態の処置において有効と考えられる本発明の処置薬の量は、その障害または状態の性質に依存すると考えられ、標準的な臨床的手法によって決定することができる。加えて、最適な投与量の範囲を特定するための一助として、任意で、インビトロアッセイを用いてもよい。製剤中に用いられるべき厳密な用量は、投与の経路および疾患または障害の重大性にも依存すると考えられ、医師の判断および各患者の状況に応じて判断されるべきである。しかし、静脈内投与のために適した投与量の範囲は一般に、キログラム体重当たり約20〜500マイクログラムの活性化合物である。鼻腔内投与のために適した投与量の範囲は一般に、約0.01pg／kg体重〜1mg／kg体重である。有効用量を、インビトロまたは動物モデル試験系から導き出された用量反応曲線から外挿してもよい。一般に、坐薬は有効成分を0.5％〜10％の重量比で含みうる；経口製剤は好ましくは有効成分を10％〜95％含む。
【００８９】
さまざまな送達システムが公知であり、本発明の処置薬を投与するために用いることができ、これには例えば、リポソーム、微粒子およびマイクロカプセルへの封入：処置薬を発現することのできる組換え細胞の使用、受容体を介したエンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）の使用；レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての処置用核酸の構築がある。導入の方法には、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が非限定的に含まれる。化合物は、任意の好都合な経路によって、例えば輸注によって、ボーラス注射によって、上皮または粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通じての吸収によって投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与することもできる。投与は、全身的でも局所的でもありうる。加えて、本発明の薬学的組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適した経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合もある；脳室内注射は、例えばOmmayaリザーバーなどのリザーバーと接続された脳室内カテーテルによって容易となる。例えば吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含む製剤を用いることによって肺投与を行うこともできる。
【００９０】
1つの具体的な態様においては、本発明の薬学的組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合もある。これは例えば、限定的ではないものの、手術中の局所輸注により、例えば手術後に創傷被覆材と併せての局所適用により、注射により、カテーテルを用いることにより、坐薬を用いることにより、またはシラスティック膜などの膜もしくはファイバーを含む、多孔性、無孔性もしくはゼラチン状材料であるインプラントを用いることによって、行うことができる。1つの態様において、投与は、悪性腫瘍または腫瘍性もしくは前癌性組織の部位（または以前の部位）での直接注射によることができる。
【００９１】
もう1つの態様において、処置薬を、ベシクル、特にリポソーム（Langer, 1990, Science 249:1527-1533）、より詳細にはカチオン性リポソーム（WO 98/40052号）中にある形で送達することもできる。
【００９２】
さらにもう1つの態様において、処置薬を、放出制御システムを介して送達することもできる。1つの態様においては、ポンプを用いることができる（Langer、前記）。さらにもう1つの態様においては、放出制御システムを処置標的の近傍に配置し、それによって全身用量のごく一部しか必要でないようにすることができる。
【００９３】
本発明のこの局面の文脈の範囲内で、本発明はまた、化学療法薬による、または放射線療法による処置のために、患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の有効量を患者に投与する段階を含む方法も含む。上記のすべての態様は、本発明のこの方法にも適用される。
【００９４】
本発明の全体を通して、「有効量」という用語は、ある所与の分子または化合物が、所望の処置効果を得るために十分な量で投与されることを意味する。本発明の全体を通して、2つの化合物が処置上の有効量で投与される場合、これは化合物の一方またはそれぞれが、処置量以下の量（subtherapeutic amount）で投与されること、すなわち各化合物の単独での量は処置効果をもたらすには不十分であるが、化合物の組み合わせは所望の処置効果を結果的にもたらすことを含む。しかし、化合物のそれぞれが単独でも処置上の有効量で投与されることも本発明の範囲内に含まれる。
【００９５】
本発明のもう1つの局面において、本発明は、化学療法薬によって、または放射線療法によって以前に処置された患者における腫瘍細胞の処置用の医薬品の調製のための、本発明の抗L1抗体または結合性分子の使用法に関する。
【００９６】
上述したように、抗L1抗体による腫瘍細胞の処置は、WO 02/04952号およびWO 06/013051号にすでに記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
本発明の文脈において、「以前に処置された」という用語には、例えば最近の6カ月または8カ月以内に行われた別個のレジメンの過程で、化学療法薬によって、または放射線療法によってすでに処置された患者が含まれうる。
【００９８】
化学療法薬または放射線療法による腫瘍処置の過程では、そのような処置法に対する腫瘍の初期反応（腫瘍塊縮小または疾患の安定化）の後に、腫瘍が再び進行し始めることがほとんどの事例で観察される。そのような進行は通常、そのような処置法の数週間後または数カ月後に始まる。典型的には、これらの腫瘍はその時には、以前に適用された化学療法薬によるさらなる処置に対して抵抗性になっており、他の処置手段が求められる。上記のように、そのような抵抗性腫瘍はL1を発現することが見いだされており、このため、抗L1抗体の標的となる。
【００９９】
したがって、本発明のこの態様によれば、「以前に処置された」という用語は、好ましくは、患者が以前にそのような処置を受け、そのような処置が初期効果を示したが、抗L1抗体または結合性分子による処置法の時点では腫瘍が再び進行していることを意味する。
【０１００】
さらに、「以前に処置された」という用語は、L1抗L1抗体（L1 anti-L1 antibody）または結合性分子、および化学療法薬または放射線療法を、同じレジメン内で用いる文脈においても見いだされ、このことは複数の処置が1つの処置計画内で与えられることを意味する。この文脈において、「1つの処置計画」とは、複数の処置が、同時に、一方に続いてもう一方が、または間欠的に適用されるが、上記のものとは異なり、個々の処置の間の時間的隔たりが短く（1週間以内または2〜4日以内）、処置の奏功が認められたならば腫瘍進行を待たずに次の処置を適用することを意味する。
【０１０１】
好ましくは、この文脈において、本発明は、患者が化学療法薬によって、または放射線療法によって処置され、それに引き続いて、好ましくは1週間以内またはそれ未満のうちに、より好ましくは2〜4日以内に、本発明の抗L1抗体または結合性分子による処置が開始される事例を含む。1つのさらなる好ましい態様においては、化学療法または放射線療法、および抗L1抗体または結合性分子による処置を、交互に数サイクル、好ましくは1週間またはそれ未満、より好ましくは2〜4日以内の間隔で行う。
【０１０２】
1つの好ましい態様において、患者は、前記化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して少なくとも部分的に抵抗性であり、これは前記の種類の処置の過程で往々にして観察される影響である（上記参照）。
【０１０３】
1つのさらなる局面において、本発明は、ある所与の化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して、少なくとも部分的に抵抗性である患者における腫瘍細胞の処置用の医薬品の調製のための、本発明の抗L1抗体または結合性分子の使用法に関する。
【０１０４】
本発明の文脈において、「処置に対して抵抗性である」という用語は、各々の腫瘍細胞が、化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して完全な様式では反応しないことを意味する。逆に、この腫瘍細胞に関しては、前記化学療法薬または放射線療法による処置はどちらかと言えば無効であり、またはさらには全く効果を示さない。
【０１０５】
本発明の1つのさらなる局面において、本発明は、腫瘍形成性疾患の処置用の医薬品の調製のための本発明の抗L1抗体または結合性分子の使用法であって、抗L1抗体または結合性分子が化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与される、好ましくは、化学療法薬または放射線療法が本発明の抗L1抗体または結合性分子の前に投与される、使用法に関する。
【０１０６】
本発明によれば、「腫瘍形成性疾患の処置」という用語は、腫瘍細胞の死滅、腫瘍細胞の増殖の低下（例えば、少なくとも30％、少なくとも50％、または少なくとも90％の）、ならびに腫瘍細胞の増殖の完全な阻害のことを指す。さらに、この用語は、例えば、将来の腫瘍細胞、ならびに転移の形成を招く可能性または傾向のある細胞を死滅させることによる、腫瘍形成性疾患の予防も含む。
【０１０７】
本発明によれば、「と組み合わせて」という用語は、抗L1抗体または結合性分子、および放射線療法の化学療法薬の任意の併用投与を含む。これには、薬物または放射線療法の同時適用、または好ましくは別々の投与が含まれうる。別々の投与が想定される場合には、抗L1抗体または結合性分子、および化学療法薬または放射線療法が細胞に対して依然として有利な併用効果を発揮しうるように、送達時点の間にかなりの期間が過ぎてしまわないように徹底することが好ましいと考えられる。そのような場合には、細胞を両方の作用因子に対して、互いに約1週間以内に、好ましくは約4日以内に、より好ましくは約12〜36時間以内に接触させることことが好ましい。
【０１０８】
本発明のこの局面の背景にある根拠は、化学療法薬の投与または放射線療法による処置が、腫瘍細胞の表面でのL1発現の増加を招き、それがひいては腫瘍細胞を抗L1抗体または結合性分子のより優れた標的とさせることにある。
【０１０９】
したがって、本発明のこの局面はまた、抗L1抗体または結合性分子を化学療法薬または放射線療法とさまざまな処置サイクルで組み合わせる処置レジメンも範囲に含み、ここで各サイクルは、例えば2週間継続される、処置を行わない期間によって隔てられてもよく、各サイクルは抗L1抗体もしくは結合性分子および／または化学療法薬もしくは放射線療法の反復投与を伴ってもよい。例えば、そのような処置サイクルは、化学療法薬による、または放射線療法による処置に続いて、例えば、2日以内に抗L1抗体または結合性分子の2回の適用を行うことを範囲に含みうる。
【０１１０】
本発明の全体を通して、当業者は、適用しようとする個々の処置法が、例えば患者の身体状態または疾患の重症度に依存すると考えられ、それ故に症例毎に調整しなければならないことを理解するであろう。
【０１１１】
特に、そのような反復処置サイクルの過程で、抗L1抗体または結合性分子を化学療法薬または放射線療法の前に投与することも、本発明の範囲内に想定される。
【０１１２】
本発明の上記の局面の文脈において、本発明はまた、化学療法薬によって、または放射線療法によって以前に処置された患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を患者に投与する段階を含む方法にも関する。さらに、本発明は、ある所与の化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して少なくとも部分的に抵抗性である患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を患者に投与する段階を含む方法にも関する。さらに、本発明は、患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与する段階を含む方法にも関する。さらに、本発明は、患者における腫瘍細胞を処置するための方法であって、本発明の抗L1抗体または結合性分子の処置上の有効量を患者に投与する段階を含む方法にも関する。
【０１１３】
本発明の抗体はまた、体組織または体液におけるL1タンパク質のレベルを決定する診断方法のための方法にも関する。
【０１１４】
本発明のこれらの方法に関しては、本発明のその他の使用法または方法に関して上述したすべての態様が同じく適用される。
【０１１５】
本発明はまた、腫瘍形成性疾患の処置用の医薬品として用いるための、または化学療法薬による、もしくは放射線療法による処置のために患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための本発明の抗体または結合性分子にも関する。
【０１１６】
1つの好ましい態様において、前記使用法は、本発明の使用法に関して定義したような特徴をさらに呈する。
【０１１７】
本発明はまた、本発明の抗体または結合性分子を含む薬学的組成物にも関する。前記薬学的組成物に関しては、上記のすべての態様が同じく適用される。
【０１１８】
本発明を以下の図面および実施例によってさらに例示するが、それらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１１９】
実施例
1．実施例1
1.1 実施例1の概要
L1接着分子（L1-CAM）は、発生中の神経系における細胞遊走および軸索誘導に関与する膜貫通型細胞接着分子である。L1はまた、卵巣癌および子宮内膜癌でも過剰発現される。この場合、L1発現は予後不良と関連がある。癌細胞系では、L1の過剰発現は細胞運動性、マウスにおける腫瘍成長を増強し、Erk依存性遺伝子の発現を誘導する。今回、本発明者らは、L1に対する抗体による処置が、Erk活性化を無効化し、マトリゲルへの細胞浸潤を阻止し、ヌードマウスにおける腫瘍成長を低下させることを示す。L1抗体で処置された細胞では、HOX A9、β3インテグリンおよびIER 3といったErk依存性遺伝子の誘導が、インビトロおよびインビボで逆行する。この報告で、本発明者らは、抗体L1-9.3がすべての被験L1抗体の中で最も優れた処置用抗体であることを実証する。すべての場合に、L1-9.3は、浸潤性表現型または腫瘍成長に対する処置効果に関して最も優れた結果を示した。本発明者らは、L1-9.3がL1の第1のIg様ドメインと結合して、L1-L1同種親和性結合を阻止しうることを示すことができた。同種親和性結合の阻止は、L1-9.3を用いた場合にのみ観察された。本発明者らは、L1-9.3が2つの機能を兼ね備えているために処置法において優れていると結論する：それはerk活性化を阻止し、かつL1の結合機能を妨げる。
【０１２０】
1.2 実施例1の結果
1.2.1 新たなL1抗体のFACS分析
組換えL1-Fc融合タンパク質による免疫処置を用いて、本発明者らは新規L1抗体L1-9.3、L1-14.10、L1-35.9およびL1-38.12を作製した。L1に対する特異性を明らかにするために、これらの新たなL1mAbを、内因性L1を発現する卵巣癌細胞系OVMzおよびSKOV3ip、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞CHOおよび安定的に形質導入されたCHO-L1細胞に対して、蛍光染色（図1A）およびウエスタンブロット分析（図1B）によってこれらの抗体について試験した。すべての被験抗体がCHO-L1細胞においてL1の陽性染色を示した（図1A）。OVMzおよびSKOV3ip細胞に関する染色パターンは抗体毎に異なった。興味深いことに、L1-9.3抗体は卵巣癌細胞系OVMzおよびSKOV3ipの両方で明瞭な染色を示したが、L1-14.10は非常に弱い染色しか示さなかった（図1A）。2種類のL1抗体、L1-35.9およびL1-38.12は、これらの細胞の内因性L1と結合することができなかった（図1A）。予想された通り、本発明者らが陰性対照として用いたCHO細胞では、L1の染色を観察することはできなかった。すべての新たな抗体が、CHO-L1、OVMzおよびSKOV3ip細胞溶解物における完全長L1をウエスタンブロット分析によって検出した。この場合もL1陰性CHO細胞を陰性対照として利用した。
【０１２１】
1.2.2 Erkリン酸化は抗体処置後に低下する
最近の報告は、L1の発現が血清由来増殖因子と協同して、持続的なErk活性化およびErk依存性遺伝子の誘導を招くことを示している（Silletti et al, 2004）。本発明者らは、L1-抗体の抑制効果がL1を介した遺伝子調節の妨害に起因する可能性について調べた。このために、本発明者らは、SKOV3ip細胞を用いてL1抗体の作用様式を検討した。mAb L1-11A、L1-9.3およびL1-14.10は、Erk-リン酸化（図2A）をインビトロで効果的に阻止した。アイソタイプを一致させた対照mAb、媒体としてのDMSO、またはL1の神経型アイソフォームのみと結合しうるL1抗体L1-38.12（図2A）ではいずれも阻害がみられなかった。ホスホ特異的Erk抗体を用いた蛍光分析により、活性化Erkの明らかな低下が確かめられた。L1-mAb処置細胞（L1-11A、L1-9.3およびL1-14.10）における核からの枯渇も観察された（図2B）。
【０１２２】
1.2.3 L1-抗体による抗体処置は細胞浸潤を低下させた
L1に対する抗体（L1-11A）による処置は、フィブロネクチンの走触性細胞遊走および種々の細胞系のマトリゲル浸潤を低下させることが以前に示されている（Arlt et al, 2006）。本発明者らは、種々のL1抗体で処置したSKOV3ip細胞の浸潤能力を比較した。抗体L1-11A、L1-14.10および特にL1-9.3は、SKOV3ipの浸潤を低下させた（図3）。これとは著しく対照的に、抗体L1-35.9またはL1-38.12で処置した細胞は浸潤の低下を示さなかった（図3）。
【０１２３】
1.2.4 L1に対する抗体はインビトロおよびインビボでの遺伝子発現に影響する
本発明者らはさらに、L1に対する抗体が、siRNAを介したL1の枯渇に関して観察されるのと同様の様式で、インビトロでのSKOV3ip細胞における遺伝子発現プロファイルに影響するか否かを検討した（図4A）。実際に、L1-9.3またはL1-11Aで処置した細胞のqRT-PCR分析では、対照抗体と対比して、β3インテグリン、転写因子HOXA9ならびにアポトーシス関連遺伝子IER 3およびSTK 39といったL1で調節される遺伝子の発現の有意な変化が示された（図4A）。同じ一連の遺伝子は、L1特異的siRNAが形質導入されたSKOV3ip細胞ではダウンレギュレートされた（図4B）。
【０１２４】
本発明者らは、mAb L1-9.3が、インビボのSKOV3ip細胞の遺伝子発現プロファイルに対しても、インビトロで観察されたものと同様に影響しうるか否かを検討した。この目的には、L1-9.3処置マウスまたはIgG対照処置マウスの残存腫瘍からmRNAを単離して、qRT-PCR分析に供した。L1-9.3処置は、HOXA9、β3インテグリンおよびIER 3に関して実証されたように、L1依存性遺伝子の有意な調節を招いた（図4C）。
【０１２５】
1.2.5 ヌードマウスにおける腫瘍形成性の分析
次に、本発明者らは、マウスにおけるSKOV3の腹腔内成長を、mAb L1-11A、L1-9.3またはL1-14.10による処置によって阻害することができるか否かを調べた。処置法の開始の2日前に、SKOV3ip-lacZ細胞を雌性ヌードマウスの腹腔内に注射した。10mg／kgの抗体濃度を用いて、週2回の腹腔内処置を行った。対照マウスにはPBSまたは対照抗体としてのHEA125（抗EpCAM）による処置を行った（週2回、10mg／kg腹腔内）。すべての抗L1 mAb処置群で、PBSまたは対照抗体HEA-125と比較して腫瘍塊の量の大幅な減少が認められた（図5）。対照と比較して、すべての抗L1 mAbが腹腔内腫瘍量の用量依存的な低下を招いた［L1-11A（10mg／kg）、-40％；L1-14.10（10mg／kg）、-30％；L1-9.3（10mg／kg）、-60％；図5］。L1-9.3（10mg／kg）で処置した群における腫瘍の縮小は、PBS対照と比較して統計学的に有意であった（PL1-9.3(10mg/kg)＝0.004）。HEA125対照抗体で処置したマウスは、SKOV3ip細胞上にEpCAMが存在し、HEA125が腫瘍細胞と結合しうるにもかかわらず、PBS処置群（図5）と比較して、SKOV3ip-lacZ腹腔内腫瘍量の検出可能な軽減はないことが判明した。処置の過程全体を通して、L1 mAb L1-11A、L1-9.3およびL1-14.10処置のいずれについても副作用および重度の毒性は観察されなかった。
【０１２６】
このように、L1に対する抗体による処置は腫瘍成長 SKOV3ip細胞を減少させたが（図5）、このことはL1に対する抗体が遺伝子発現を調節しうるだけでなく、インビボでの腫瘍成長にも影響しうることを示唆する。
【０１２７】
1.2.6 新たなL1抗体のBiacore試験
この試験は、実施例6に記載された通りに、Avidex（Oxford）によって行われた。表1は、新たなL1抗体の結合動態（ka、kdおよびKD）に関するこれらの結果をまとめている。
【０１２８】
1.2.7 L1-9.3結合部位エピトープマッピング
新規L1抗体の特性決定のために重要な要因の1つは、L1中のそれらの結合部位を検討することである。このため、本発明者らは、この分子のさまざまな部分をカバーする種々のL1-Fc融合タンパク質を構築した。L1外部ドメイン領域の種々の長さをコードするPCR産物を増幅した。これらの構築物をpIgベクター中にクローニングして、Fc-融合タンパク質として発現させた。精製後に、産物をウエスタンブロット分析のために用いた。結果を比較するために、本発明者らはその他の組換えL1タンパク質断片（Ricardo Gouveia, Oeiras, Portugalから入手）を分析した。L1-9.3はL1の第1のIgドメインと結合することが見いだされた（図6）。L1-14.10は第3のIgドメインと結合し、一方、L1-11AはFN3〜5部位の間に結合した（図6）。
【０１２９】
1.2.8 mAB L1-9.3はL1-L1同種親和性結合を阻止する
本発明者らは、L1抗体がL1の同種親和性結合機能を妨げることができるか否かを問うことにした。この疑問に応えるために、本発明者らは、L1をトランスフェクトした細胞を固定化L1と結合させる細胞接着アッセイを用いた。スライドガラスを組換えL1-Fc融合タンパク質、陽性対照用のフィブロネクチン（これには細胞がインテグリン依存的な様式で結合する）または陰性対照としてのBSAでまずコーティングした後に、本発明者らはJ558-L1細胞をL1-11A、L1-9.3またはL1-14.10抗体とともにインキュベートした。対照については、本発明者らはIgG-対照、PBSまたはCD24に対する抗体（SWA11）を用いた。mAb L1-9.3はL1-L1同種親和性結合を完全に阻止することができたが、他のすべての被験抗体は同種親和性結合能力を妨げることができなかった。どの抗体もフィブロネクチンに対する結合は妨げなかった（非提示データ）。
【０１３０】
1.3 材料および方法
1.3.1 細胞系および細胞培養
ヒト卵巣癌細胞系SKOV3ip（Ellen Vitetta, University of Texas, Dallas, TXにより寄贈）およびOVMzを、10％FCSを含むDMEM（Biochrom, Berlin, Germany）中にて、細胞培養条件（5％ CO2、相対湿度95％、37℃）下で増殖させた。腫瘍塊の同定および定量のためには、lacZをコードするレトロウイルスベクター（GeneSuppressor Retroviral System, Biocarta, Hamburg, Germany）によってSKOV3ip細胞に安定的に形質導入した。ヒトL1（-hL1）を安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞系CHOは、superfect（Stratagene, Heidelberg, Germany）によるトランスフェクション、ならびにmAb L1-11Aおよび磁気ビーズ（Myltenyi Biotec、Bergisch Gladbach, Germany）によるL1発現に関する選択、またはFACS Caliburによる選別によって樹立した。細胞はすべて、10％FCSを加えたDMEM中にて37℃、5％ CO2および湿度100％で培養した。ヒトL1をコードするプラスミドおよびJ558-L1細胞は、Dr. Vance Lemmon（University of Miami, Miami, FL, USA）から入手した。
【０１３１】
1.3.2 抗体
EpCAMを対象とするマウスIgG1であるHEA-125は以前に記載されており、すべてのヒト腺癌と結合する（Moldenhauer et al., 1987）。モノクローナル抗体L1-14.10（Huszar et al., 2006）、L1-9.3、L1-35.9およびL1-38.12は、L1の外部ドメインを含むヒトL1-Fcタンパク質によるマウスの免疫処置によって得た（Oleszewski et al., 1999）。ヤギ抗マウスIgGは、アフィニティー精製した上でヒト血清タンパク質に吸収させた（Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA）。
【０１３２】
1.3.3 生化学的分析
SDS-PAGE、および分離されたタンパク質のセミドライブロット法を用いたImmobilon膜への移行は、以前に記載されている（Gutwein et al., 2000）。TBS中の5％脱脂乳またはTBS／0.1％ Tween-20中の1％ BSAによるブロッキングの後に、ブロットを各々の一次抗体および続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体によって発展させ、ECL検出を行った。
【０１３３】
1.3.4 FACS分析
ハイブリドーマ上清または精製抗体のいずれかの飽和量のmAb、およびマウスIgに対するPE結合ヤギ抗体（Dianova, Hamburg, Germany）による細胞の表面染色は、別のところに記載されている（Ebeling et al., 1996）。染色された細胞をFACScan（Becton Dickinson）によって分析した。
【０１３４】
1.3.5 免疫蛍光
免疫蛍光染色に関しては、細胞をカバーガラス上で増殖させ、過酸化水素バナジン酸（pervanadate）で10分間処理した上で、4％パラホルムアルデヒド／PBSによって室温で20分間かけて固定した。細胞をPBS中で洗浄し、5％ヤギ血清を含むPBS中の0.1％ NP-40によって室温で15分間かけて透過処理を行った。続いて細胞を第1の抗体（ホスホ特異的Erk1／2）とともに1時間インキュベートした。PBSによる3回の洗浄段階の後に、細胞を第2の、Alexa488結合ヤギ抗マウスIgGとともに暗所にて30分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄した後に、染色された細胞をスライドガラスにマウントして、落射蛍光顕微鏡（Axioplan-2；Zeiss, Oberkochem）によって検査した。
【０１３５】
1.3.6 浸潤アッセイ
インビトロでの腫瘍細胞の浸潤を、Erkell et al.（1988）に以前に記載されている二重フィルターアッセイで判定した。手短に述べると、マトリゲルを、下方の孔径5μmのニトロセルロースフィルターおよび上方の孔径8μmのポリカーボネートフィルターという2つのフィルターの間に層状に挟んだ。105個の細胞を、フィルターをサンドイッチにしたものとともに1ml培地中で20時間インキュベートした後に、このサンドイッチを固定して、フィルターを分離してDAPIで染色した。下方のフィルター上のゲル中に存在する細胞を計数し、細胞の浸潤を、下方のフィルター上の細胞数と、両方のフィルター上に存在する細胞の総数との比として表した。
【０１３６】
1.3.7 定量的PCR
qPCRに関しては、cDNAをMicrospin G-50カラム（GE Healthcare、Munchen, Germany）で精製して、NanoDrop分光光度計（ND-1000. Kisker-Biotechnology, Steinfurt, Germany）によって定量した。qPCR用のプライマーはDNA Star Programを用いて設計し、MWG（Ebersberg, Germany）により製造された。β-アクチンを内部標準として用いた。PCR反応はSYBRgreen mastermix（Applied biosystems, Darmstadt, Germany）を用いて行った。
【０１３７】
1.3.8 細胞結合アッセイ
L1-Fcまたはフィブロネクチンに対する細胞結合アッセイは、Oleszewski et al（JCB 2000）中に詳細に記載されている。
【０１３８】
1.3.9 腫瘍モデルおよび処置法
病原菌を含まない雌性無胸腺CD1 nu/nuマウス（7〜9週齡；平均20g；Charles River）に対して、5×106個のlacZタグ標識ヒト卵巣癌細胞（SKOV3ip-lacZ）を第0日に腹腔内に接種し、5週間以内に腹腔内腫瘍の形成を導いた。抗L1-mAbを無菌PBS中に希釈して、処置のために必要な濃度とした。腫瘍を持つマウスに、各々の用量（投与1回につきそれぞれ10mg／kg）、媒体（PBS）またはHea125抗体対照の300μL溶液による週2回の腹腔内処置を行った。抗体処置を腫瘍細胞注射後の第3日から開始して、腫瘍細胞が腹壁内側および腹腔内臓器の表面に付着するまでの時間を与えた。剖検（第38日）の時点で腹水をすべてのマウスから採取して、体積を決定した。すべての腹腔内臓器（腫瘍塊を含む）、腹壁および横隔膜を摘出し、β-ガラクトシダーゼ基質（X-gal；Roche-Diagnostics, Penzberg, Germany）で染色して、写真を撮影して秤量した。臓器間、横隔膜上および腹壁内部の藍色の腫瘍塊を摘出して、単独で秤量した。各マウスにおける相対的腫瘍量を、腫瘍塊の重量を全内臓の重量で除算することによって算出した。
【０１３９】
2．実施例2
抗L1マウス抗体L1_9.3のヒト化
マウス抗L1抗体L1_9.3をヒト化する目的で、ヒトv-κ1（humκ1）および可変重鎖ファミリーIII（humIII）の遺伝子をアクセプター配列として利用した。これらの遺伝子に関して本明細書で用いた付番方式は、Wu and Kabat（Kabat, E. A, Wu, T. T., Perry, HM, Gottesman, KS and Foeller, C (1992) Sequences of proteins of immunological interest, Diane Books Publishing company）から採用した。マウスL1_9.3抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を、それぞれhumκ1軽鎖およびhumIII重鎖のアミノ酸配列に対してアラインメントした。ヒト抗体の6つのCDRを、マウスL1_9.3抗体由来の対応するCDRで置き換えることによって、2つのヒト化L1_9.3抗体（L1_9.3HuおよびL1_9.3Hu3）を作製した。
【０１４０】
6つの相補性決定領域（CDR）の場所
【０１４１】
マウスL1_9.3抗体のさまざまなフレームワーク残基を、ヒト化L1_9.3抗体に移行させた：
バージョン1（L1_9.3Hu）ヒト化抗体‐重鎖残基番号6、23、27、30、43、49、71、73、76、78および94ならびに軽鎖残基番号100をマウスL1_9.3抗体から移行させ、軽鎖残基番号73を、ヒトREI抗体軽鎖においてこの位置に認められる対応物（Phe）で置き換えた。
バージョン2（L1_9.3Hu3）ヒト化抗体‐重鎖残基番号6、23、27、30、71、73および94ならびに軽鎖残基番号100をマウスL1_9.3抗体から移行させた。
【０１４２】
続いて、マウスL1_9.3抗体およびこの抗体の2つのヒト化バージョン（L1_9.3HuおよびL1_9.3Hu3）の一本鎖可変フラグメント（scFv）類似体をコードするDNA配列を、大腸菌（E. coli）における発現のために作製した。これらのscFvはすべて、同じリンカー（TSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG）を含む。scFv遺伝子はGeneArt AG, Germanyにより合成された。
【０１４３】
ヒト化抗体を構築するために用いた抗体軽鎖および重鎖のDNA配列は、それぞれ図8aおよび8bに提示されている。
【０１４４】
図9a〜9cは、それぞれマウスL1_9.3 scFvおよびヒト化L1_9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvのアミノ酸配列を提示している。
【０１４５】
3．実施例3
L1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvをコードするDNAの大腸菌ペリプラズム発現ベクター中へのクローニングならびにこれらのベクターによる大腸菌の形質転換
ペリプラズムで発現されるscFvは、数多くの理由から有益である。第1に、そのようなscFvは細菌上清中に漏出し、そこから、それらの同族抗原（この場合にはL1癌抗原）との結合に関して都合良くアッセイすることができる。第2に、ペリプラズムでの発現は、可溶性の活性scFvの精製を可能にする。
【０１４６】
GeneArt AG, Germanyによって合成されたL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvをコードするDNA配列は、大腸菌ペリプラズム発現ベクター中に供給されなかった。このため、以下の方法を用いて、これらのDNA配列を大腸菌ペリプラズム発現ベクター中にクローニングした。
【０１４７】
標準的なPCR条件および試薬を用いて、以下のプライマー対により、合成されたscFvをコードするDNAをPCRでレスキューした。
プライマー配列を以下に示す。
【０１４８】
PCR産物を1.6％アガロースゲル上で泳動させ、正しいサイズのバンドを切り出して精製した。それらのPCR産物をNcoIおよびNotI制限酵素により標準的な条件下で二重消化し、続いて再精製を行った。PCR産物を、以下のものを含むIPTG誘導性ペリプラズム発現ベクター中に連結させた：
-コードされるポリペプチドをペリプラズムに導くためのpelBリーダー配列、このリーダー配列はその後ペリプラズムで切り離される
-NcoI／NotIクローニング部位
-ヒト抗体κ鎖定常領域
【０１４９】
連結されたベクターを大腸菌TG1細胞に形質転換導入して、100μg／mlのアンピシリンおよび2％グルコースを加えた2xTY寒天培地（バクトトリプトン16g／L、酵母エキス10g／L、15g／LバクトアガーおよびNaCl 5g／L）にプレーティングした。L1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFv構築物の発現された部分のDNA配列およびアミノ酸配列は、それぞれ図10a、10bおよび10cに示されている。
【０１５０】
4．実施例4
大腸菌におけるL1_9.3、L1-9.3HuおよびL1_9.3Hu3一本鎖抗体の発現
これらのベクターによって発現されたポリペプチドは、ヒト抗体のcκ定常領域がscFvのC末端と融合されたものを含む。構築物を含むこれらのcκ定常鎖を本明細書では一本鎖抗体と称する。
【０１５１】
各一本鎖抗体構築物L1_9.3、L1_9.3HuおよびL1_9Hu3に対する8つの大腸菌クローン（合計24クローン）を選定して、100μg／mlのアンピシリンおよび2％グルコースを加えた300μlの2xTY（Bacto Trypton 16g／L、酵母エキス10g／LおよびNaCl 5g／L）を含む96ウェルプレートの別々のウェルに入れた。各ウェルの体積は1mlである。培養物を、培養物のOD600がおよそ0.5に達するまで、振盪下（200rpm）にて37℃で増殖させた。続いて96ウェルプレートを3200rpmで10分間遠心し、上清を吸引して廃棄した。細菌ペレットを100μg／mlのアンピシリンおよび1mM IPTGを加えた新たな2XTY 400μl中に再懸濁させて、一本鎖抗体の発現を誘導した。培養物を200rpm、25℃で一晩振盪させた。
【０１５２】
翌日に96ウェルプレートを3200rpmで10分間遠心して、細胞をペレット化した。発現されたL1一本鎖抗体を含む上清をELISA分析のために保存した。
【０１５３】
5．実施例5
ヒトL1癌抗原に対するL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvの結合のELISAアッセイ
このELISAアッセイは、ヒト化工程がL1癌抗原に対する抗体結合の損失を招かないことを確認するため、および選定したクローンの中で一本鎖抗体構築物を正しく発現したものを同定するために行った。
【０１５４】
96ウェルプレートの3つの列を、L1タンパク質の細胞外ドメインがFcフラグメントと融合されたもの（5μg／ml）をPBS中に含む100μlのL1抗原で、1時間にわたり室温でコーティングした。別の3つの列を、対照としてのストレプトアビジン（5μg／ml）を含むPBSでコーティングした。
【０１５５】
ウェルを370μlのPBSで3回洗浄して、3％粉乳を含むPBSにより室温で1時間かけてブロックした。
【０１５６】
一晩置いた各細菌上清の50μlを、50μlの6％粉乳を含むPBSと1時間混合した。
【０１５７】
ブロックしたELISAプレートを上記の通りにPBSで2回洗浄し、一本鎖抗体を含むブロックされた上清を添加して、室温で1時間インキュベートした。
【０１５８】
96ウェルプレートをPBS 0.1％ tweenで4回洗浄し、続いて、PBS 1％ BSA中に1：5000希釈した抗ヒトκ軽鎖が結合した遊離抗体HRP結合物（Sigma A7164）の100μlを添加した。結合物を室温で1時間インキュベートし、続いてPBS 0.1％ tweenで5回洗浄した。
【０１５９】
TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate Kit（Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., USA）を製造元のプロトコールに従って添加することによって、ELISAを発展させた。ELISAプレートの画像は図4に示されている。少なくとも4つのL1結合クローンを、3種類の一本鎖抗体バージョンのそれぞれについて観察した。これらのL1結合性一本鎖抗体クローンはストレプトアビジンとは結合しない。
【０１６０】
図11は、ヒトL1癌抗原に対するL1_9.3 scFv、L1-9.3Hu scFvおよびL1_9.3Hu3 scFvの結合を示している。列A、BおよびCはL1でコーティングされ、列D、EおよびFはストレプトアビジンでコーティングされている。ウェル内の青色は個々のscFvとプレート上のL1との結合を指し示している。ストレプトアビジンでコーティングされた列に色がないことは、一本鎖抗体がL1と特異的に結合することを示している。
【０１６１】
6．実施例6
結合親和性の決定
マウス抗体L1-9.3およびヒト化抗体L1-hu3を、結合動態を決定するためにBiacore分析（Biacore AB. Uppsala、Sweden）によって分析した。
【０１６２】
BIAcore CM5センサーチップをEDC／NHSで活性化し、精製組換えL1-Fc細胞外断片（515μg／ml、PBS中）を200〜3000RUの間でCM5センサーチップと結びつけた。残りの活性部位はエタノールアミン／HClでブロックした。抗体結合は、濃度6〜3333nMの抗体をKinject機能を用いて流速10ul／分濃度で添加することによって測定した。チップは、結合した抗体を除去するための、500mM NaClを含む10mMグリシンpH2.0によって再生させた。
【０１６３】
結合曲線は、BIA評価ソフトウエア（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を用いてLangmuir結合モデルに適合させた。決定されたKD値は表2に示されている。
【０１６４】
（表２）ヒト化変異体L1-hu3は、親抗体L1-9.3と同程度の高い標的親和性を示す
【０１６５】
7．実施例7
PBMCおよび癌細胞に対する抗体結合
PBMCは、健常ヒトドナーのEDTA加全血からの密度勾配遠心によって入手した。培養したOVMZ腫瘍細胞はトリプシン処理によって収集した。1×105個／ウェル（75μl）をFACSチューブに播いた。L1-9.3 mAbの希釈物を10mM EDTAを含む培地中に調製し、75μl／ウェルのL1-mAb希釈物をPBMCおよびOVMZ細胞に添加して最終濃度が6.6×10-13〜6.6×10-8 Molとなるようにした。引き続いて細胞をインキュベーター内にて37℃／5％ CO2で一晩（ほぼ24時間）インキュベートした。2mlのFACS緩衝液を用いて細胞をFACSチューブ内で直接洗浄し、その後に300g／5分間／4℃の遠心を行った。上清をピペット処理によって除去した。染色に関しては、PE標識したロバ抗マウス二次抗体（Dako）を150μl／ウェルの体積で添加し、その後に4℃で30分間インキュベートした。洗浄段階を上記の通りに繰り返し、細胞を200μl PBS／1％ホルムアルデヒド中で固定した。続いて試料の平均蛍光をFACS分析によって測定した。
【０１６６】
図13に示されているように、L1-9.3 mAbは、腫瘍L1と比較してPBMC上のL1に対する親和性が強く低下している。PBMCに対するL1-9.3結合はナノモル濃度の範囲で検出されたが（破線）、一方、腫瘍細胞に対する結合はピコモル濃度（実線）で観察された。B）解離定数KDは、最大半値結合の濃度を用いて回帰曲線から推定した。PBMC上のL1-9.3のKDは腫瘍細胞上よりも少なくとも400倍の小ささであった。
【０１６７】
8．実施例8
サイトカイン放出の決定
PBMCを、健常ヒトドナーのクエン酸加全血から密度勾配遠心によって入手した。細胞をRPMI 1640／5％ヒト血清／5ml NEAA／5ml-グルタミン／5mlピルビン酸ナトリウム（Natrium-Pyruvat）中に再懸濁させた。100μl当たり1×105個の細胞を平底96ウェルプレートに播いた。第2の段階では、LPS（10ng／ml）、L1-9.3 mAb（20μg／ml）、OKT3 mAB（ebioscience）（75ng／ml）またはイオノマイシン／PMA（1μg／ml ／ 5ng／ml）を含む100μlの培地を3つずつ添加し、その後に37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした。陰性対照としては、非処置PBMCを用いた。24時間後に、サイトカインであるインターフェロンγおよび腫瘍壊死因子のレベルを、CBA-Cytokin-Flex-Sets（BD）を製造元の情報に従って用いるFACS分析によって測定した。
【０１６８】
その結果得られたサイトカインレベルを図14に描写している。OKT3 mAB、イオノマイシン／PMAおよびLPSとは対照的に、L1-9.3はPBMCによるTNFおよびIFNγの放出をいずれも有意には増加させなかった。
【０１６９】
9．実施例9
T細胞増殖アッセイ
PBMCを、2例の健常ヒトドナーのクエン酸加全血から密度勾配遠心によって入手した。1ウェル当たり1×105個の細胞を平底96ウェルプレートに播いた。第2の段階では、L1-9.3 mAb（20μg／ml）およびOKT3（ebioscience、75ng／ml）またはL1-9.3 mAb（20μg／ml）もしくはOKT3（75ng／ml）のいずれかを含む100μlの培地を3組ずつに添加した。1時間後に、後者2つにそれぞれOKT3またはL1-9.3を加えた。抗体に関連する活性化の可能性を否定するために、L1-9.3を伴うか伴わないPBMCを、OKT3の非存在下でインキュベートした。37℃、5％ CO2での24時間のインキュベーションの後に、T細胞の増殖を、BrdU取り込みアッセイ（Roche）を製造元の情報に従って用いて評価した。
【０１７０】
図15に示された結果から、L1-9.3 mAbはT細胞増殖を誘導することもせず、OKT3で誘導されるT細胞増殖を阻害することもないと結論づけることができる。
【０１７１】
10．実施例10
抗体結合のグリコシル化依存性
2×106個のSKOV3ip細胞を10cmペトリ皿に播き、37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした。24時間後に細胞をPBSで洗浄し、500μlのM-PER試薬（Pierce）を用い、Seize Classic Mammalian Immunoprecipitation Kit（Pierce）に記載されたプロトコールに従って溶解させた。SkOv3ip細胞溶解物を、Enzymatic CarboRelease Kit（QA_Bio）に記載された通りに脱グリコシル化した。手短に述べると、2.5μlの変性溶液を35μlの細胞溶解物に添加した。この試料をthermoblock内で100℃で5分間インキュベートし、続いて氷上で冷却した。最後に、2.5μlのTriton-X、およびEnzymatic CarboRelease Kit（QA_Bio）に含まれる1μlの各グリコシダーゼ（PGNアーゼF、O-グリコシダーゼ、シアリダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコサミニダーゼ）を製造元のプロトコールに従って添加し、その後に37℃で3時間インキュベートした。グリコシル化および脱グルコシル化したものを、SDS PAGEおよび引き続いてウエスタンブロット法にかけた。ウエスタンブロットを、それらの染色能力に応じて種々のL1抗体とともにインキュベートした。濃度は1μg／ml（9.3、11Aおよび14.10）、5μg／ml（35.9）または10μg／ml（OV52.24、OV543.18、38.12、OV549.20）を用いた。ウエスタンブロットに対するL1抗体の結合は、HRP標識抗マウス抗体（Dianova）によって検出した。
【０１７２】
図16に示されているように、被験抗L1抗体はそれらのグリコシル化依存性に関して3つのクラスに分けることができる：第1のクラス（グリコシル化によって影響されない）：L1-9.3。第2のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって負の影響を受ける）：11A、14.10、OV52.24およびOV549.20。第3のクラス（WBにおける結合は脱グリコシル化によって正の影響を受ける）：35.9および38.12。
【０１７３】
11．実施例11
ウサギにおけるL1-9.3の生体内分布
雌性ウサギ（White Himalayan）に、L1-9.3を2回（0h、24時間）、静脈内投与経路を介して10mg／kgの用量で注射した。1匹の対照動物には同等な体積のPBSを投与した。動物個体を第1の投与から72時間後に剖検した。臓器を4％緩衝ホルマリン中で固定して、パラフィン中に包埋した。組織スライドを調製し、免疫組織検査を行った。L1-9.3処置動物および対照動物の組織切片を、静脈内投与後のL1-9.3の結合を検出するために抗マウス抗体で染色した。シグナルはDAB（Sigma）によって描出した。従来のアビジン／ビオチン複合体（Avidin/Biotin Complex）法またはチラミドシグナル増幅システムCSA II法（Dako）という2種類の検出システムを用い、インビボで結合したL1-9.3の量のおおよその推定が可能となった。従来のアビジン／ビオチン複合体法（Vector Laboratories）は、50ng／mlまたはそれ以上の濃度のL1-9.3を検出することができ、一方、ビオチンを含まないチラミドシグナル増幅システムCSA II（Dako）の検出限界は5ng／mlである。L1発現パターンを明らかにするために、対照動物の組織を一次抗体L1-9.3および検出用抗体とともにインキュベートした。ABC法についてはビオチン化抗マウス抗体（Dianova、1：3000希釈）を検出用抗体として用い、CSA法は製造元のプロトコールに従って行った。
【０１７４】
図17は、静脈内投与されたL1-9.3の腎臓の集合管に対するインビボ結合を示している。インビボ結合は増幅システムCSA（図17A）を用いた場合にのみ検出可能であり、一方、従来のABC法を用いることによっては全くシグナルが視認されなかった（図17B）。このことからみて、L1-9.3は組織中で30〜300pmolの範囲で検出された（L1-9.3濃度はおそらく5ng／mlよりも高く、かつ50ng／ml未満であると考えられる）。陰性対照は染色を示さず、それ故に非特異的な染色の可能性は否定することができる（図17C）。インビボで結合したL1-9.3の染色パターン（図17A）は、組織切片をL1-9.3で直接染色した時の腎臓におけるL1発現パターンに対応する（図17D）。静脈内投与されたL1-9.3抗体は末梢組織へと血管外漏出しうると結論づけることができる。
【０１７５】
12．実施例12
ヌードマウスにおけるヒト化型のL1 9.3mAbの機能
本発明者らは、ヒト化型のmAb L1 9.3がインビボでの卵巣癌の腫瘍成長も阻害しうるか否かを調べた。第1に、本発明者らは、選定した細胞系に対する2つのヒト化型L1 9.3の結合について分析した。このため、SKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞に対してフローサイトメトリーを行った（図18）。どちらのmAbも腫瘍細胞系に対する強い結合を示し、ネイティブなL1 9.3 mAbと同様な結合の成績が得られた。
【０１７６】
SKOV3ip pcDNA3.1ルシフェラーゼ細胞を、処置を開始する24時間前に免疫不全マウスに注射した。ヒト化抗体（300μg）またはPBSを腹腔内に週3回注射した。インビボでの腫瘍成長を検出するために、Xenogen IVIS 200システムを用いてマウスの画像を週1回撮影した。マウスに麻酔をかけて、ルシフェリンDを注射し、その後に、腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を通じて生成される光放射を検出した。時間経過の間に、本発明者らは、ヒト化mAbで処置したマウスの群では対照と比較して腫瘍成長がより緩徐であることを検出した。第33日に最後の画像データを撮影した。画像化の結果により、hu3 mAbを用いると腫瘍体積が80％前後減少し、chiL1 9.3についてはおよそ50％の減少であることが得られた。いずれの結果も極めて有意であった（図19）。36日後にマウスを殺処理して腫瘍塊を測定した。どちらのヒト化抗L1 mAb処置群でも、PBS群と比較して腫瘍塊の大幅な減少が測定された（図20（A、B））。
【０１７７】
13．実施例13
抗L1CAMモノクローナル抗体9.3を用いた処置による化学療法抵抗性の消失は、WO 2008/046529号、実施例3に記載された通りに試験した（WO 2008/046529号の図17eも参照）。それらの結果は図21および22に示されている。モノクローナル抗体9.3が化学療法抵抗性を消失させることを実証することができた。その効果はWO 2008/046529号で試験した抗体11Aのそれよりも強いように思われる。
【０１７８】
（表１）この表は表記のアッセイにおいて試験した抗体の概要を示している
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3によって認識されるのと同じL1エピトープと結合することのできる、抗L1モノクローナル抗体。
【請求項２】
エピトープがL1の第1の免疫グロブリン様ドメインの内部にある、請求項1記載の抗L1モノクローナル抗体。
【請求項３】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3と同じ腫瘍成長阻害能力を有する、抗L1モノクローナル抗体。
【請求項４】
その相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つが、
a）以下の配列
のうち1つを有すること、または
b）a）において言及した配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する配列を有すること、
を特徴とする、抗L1モノクローナル抗体。
【請求項５】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項記載のモノクローナル抗体を基にしたヒト化抗体。
【請求項７】
少なくとも1つの非ヒトCDRおよびヒトフレームワーク領域（FR）残基を有する、請求項6記載のヒト化抗体。
【請求項８】
図8a）およびb）に示されているようなL1_9.3huまたはL1_9.3hu3の配列を含む、請求項6または7のいずれか一項記載のヒト化抗体。
【請求項９】
a）以下の配列
のうち少なくとも1つ、または
b）a）に挙げられた配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する、少なくとも1つの配列、
を含む、結合性分子。
【請求項１０】
一本鎖抗体（例えば、scFv、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）またはテトラボディ（tetrabody）のようなscFvの多量体、抗体フラグメント（例えば、Fab）、タンダブ（tandab）、フレキシボディ（flexibody）、二重特異性抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項9記載の結合性分子。
【請求項１１】
活性物質、好ましくは毒素、サイトカイン、ナノ粒子または放射性ヌクレオチドと連結されている、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体、または請求項9または10のいずれか一項記載の結合性分子。
【請求項１２】
請求項1〜5のいずれか一項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１３】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞。
【請求項１４】
腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項１５】
化学療法薬による、または放射線療法による処置のために患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項１６】
化学療法薬による処置または放射線療法に対して細胞が少なくとも部分的に抵抗性である、請求項15記載の使用法。
【請求項１７】
抗L1抗体による感受性増加（sensitization）の後に、患者を化学療法薬によって、または放射線療法によってさらに処置する、請求項15または16のいずれか一項記載の使用法。
【請求項１８】
化学療法薬によって、または放射線療法によって以前に処置された患者における腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項１９】
化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して患者が少なくとも部分的に抵抗性である、請求項18の使用法。
【請求項２０】
所与の化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して少なくとも部分的に抵抗性である患者における腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項２１】
腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法であって、L1結合性分子が化学療法薬と、または放射線療法と組み合わせて投与される使用法。
【請求項２２】
化学療法薬または放射線療法が抗L1抗体の前に投与される、請求項21の使用法。
【請求項２３】
腫瘍細胞または腫瘍形成性疾患が、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、髄芽腫、黒色腫、膵癌、前立腺癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽腫、扁平上皮癌、髄芽腫、肝細胞癌、結腸癌および中皮腫および類表皮癌からなる群より選択される種類のものである、請求項14〜22のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２４】
腫瘍細胞が上皮腫瘍に由来し、または腫瘍形成性疾患が上皮腫瘍であり、好ましくはここで上皮腫瘍が膵癌、結腸癌、卵巣癌または子宮内膜癌である、請求項14〜22のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２５】
化学療法薬が、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、5-FU、タキサン系剤、好ましくはパクリタキセル、およびカルボプラチンからなる群より好ましくは選択されるDNA傷害性薬剤である、請求項15〜24のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２６】
放射線療法が、X線照射、UV照射、γ線照射、α線またはβ線照射、およびマイクロ波からなる群より選択される、請求項15〜24のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２７】
薬剤として用いるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子。
【請求項２８】
腫瘍形成性疾患の処置用の、または化学療法薬による、もしくは放射線療法による処置のために患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための薬剤として用いるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子。
【請求項２９】
請求項16〜26のいずれか一項に定義された特徴を備える、腫瘍細胞の処置における薬剤として用いるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子。
【請求項３０】
請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子を含む、薬学的組成物。
【請求項１】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3によって認識されるのと同じL1エピトープと結合することのできる、抗L1モノクローナル抗体。
【請求項２】
エピトープがL1の第1の免疫グロブリン様ドメインの内部にある、請求項1記載の抗L1モノクローナル抗体。
【請求項３】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体9.3と同じ腫瘍成長阻害能力を有する、抗L1モノクローナル抗体。
【請求項４】
その相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つが、
a）以下の配列
のうち1つを有すること、または
b）a）において言及した配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する配列を有すること、
を特徴とする、抗L1モノクローナル抗体。
【請求項５】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項記載のモノクローナル抗体を基にしたヒト化抗体。
【請求項７】
少なくとも1つの非ヒトCDRおよびヒトフレームワーク領域（FR）残基を有する、請求項6記載のヒト化抗体。
【請求項８】
図8a）およびb）に示されているようなL1_9.3huまたはL1_9.3hu3の配列を含む、請求項6または7のいずれか一項記載のヒト化抗体。
【請求項９】
a）以下の配列
のうち少なくとも1つ、または
b）a）に挙げられた配列と比較して、少なくとも1つの保存的アミノ酸交換を有する、少なくとも1つの配列、
を含む、結合性分子。
【請求項１０】
一本鎖抗体（例えば、scFv、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）またはテトラボディ（tetrabody）のようなscFvの多量体、抗体フラグメント（例えば、Fab）、タンダブ（tandab）、フレキシボディ（flexibody）、二重特異性抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項9記載の結合性分子。
【請求項１１】
活性物質、好ましくは毒素、サイトカイン、ナノ粒子または放射性ヌクレオチドと連結されている、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体、または請求項9または10のいずれか一項記載の結合性分子。
【請求項１２】
請求項1〜5のいずれか一項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１３】
DSMZ ACC2841として寄託されているハイブリドーマ細胞。
【請求項１４】
腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項１５】
化学療法薬による、または放射線療法による処置のために患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項１６】
化学療法薬による処置または放射線療法に対して細胞が少なくとも部分的に抵抗性である、請求項15記載の使用法。
【請求項１７】
抗L1抗体による感受性増加（sensitization）の後に、患者を化学療法薬によって、または放射線療法によってさらに処置する、請求項15または16のいずれか一項記載の使用法。
【請求項１８】
化学療法薬によって、または放射線療法によって以前に処置された患者における腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項１９】
化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して患者が少なくとも部分的に抵抗性である、請求項18の使用法。
【請求項２０】
所与の化学療法薬による、または放射線療法による処置に対して少なくとも部分的に抵抗性である患者における腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法。
【請求項２１】
腫瘍形成性疾患の処置用の薬剤の調製のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子の使用法であって、L1結合性分子が化学療法薬と、または放射線療法と組み合わせて投与される使用法。
【請求項２２】
化学療法薬または放射線療法が抗L1抗体の前に投与される、請求項21の使用法。
【請求項２３】
腫瘍細胞または腫瘍形成性疾患が、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、髄芽腫、黒色腫、膵癌、前立腺癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽腫、扁平上皮癌、髄芽腫、肝細胞癌、結腸癌および中皮腫および類表皮癌からなる群より選択される種類のものである、請求項14〜22のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２４】
腫瘍細胞が上皮腫瘍に由来し、または腫瘍形成性疾患が上皮腫瘍であり、好ましくはここで上皮腫瘍が膵癌、結腸癌、卵巣癌または子宮内膜癌である、請求項14〜22のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２５】
化学療法薬が、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、5-FU、タキサン系剤、好ましくはパクリタキセル、およびカルボプラチンからなる群より好ましくは選択されるDNA傷害性薬剤である、請求項15〜24のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２６】
放射線療法が、X線照射、UV照射、γ線照射、α線またはβ線照射、およびマイクロ波からなる群より選択される、請求項15〜24のいずれか一項記載の使用法。
【請求項２７】
薬剤として用いるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子。
【請求項２８】
腫瘍形成性疾患の処置用の、または化学療法薬による、もしくは放射線療法による処置のために患者における腫瘍細胞の感受性を高めるための薬剤として用いるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子。
【請求項２９】
請求項16〜26のいずれか一項に定義された特徴を備える、腫瘍細胞の処置における薬剤として用いるための、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子。
【請求項３０】
請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体または結合性分子を含む、薬学的組成物。
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１０−４】
【図１０−５】
【図１０−６】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１０−４】
【図１０−５】
【図１０−６】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１０−５２９９７０（Ｐ２０１０−５２９９７０Ａ）
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１５４２（Ｐ２０１０−５１１５４２）
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４７７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１８１９
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４３８５５１３）
【出願人】（５０９３２７８１７）メディジーン アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４７７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１８１９
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４３８５５１３）
【出願人】（５０９３２７８１７）メディジーン アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
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