玄参抽出物を含有する外用剤組成物及びその皮膚保湿化粧料としての用途
本発明は、有効成分として玄参（Scrophularia buergeriana Miq.）抽出物を主成分として含有し、白茯苓（Poria cocos Wolf）抽出物をさらに含有し、皮膚の乾燥症状を改善させる外用剤組成物及びその皮膚保湿化粧料としての用途に関し、詳細には、上記組成物は、玄参、白茯苓を水、エタノール、メタノール、ヘキサン、エチルアセテート又はブタノールを使用して抽出した玄参、白茯苓抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として玄参(ゲンジン)(Scrophularia buergeriana Miq.)抽出物を主成分として含有し、白茯苓（Poria cocos Wolf）抽出物をさらに含有し、皮膚の乾燥症状などを改善させる効果がある外用剤組成物及びその皮膚保湿化粧料としての用途に関する。すなわち、玄参抽出物及び白茯苓抽出物を皮膚に塗布したとき、皮膚角質形成細胞の分化を正常に還元／維持させることによって、表皮分化の不完全に起因して発生する皮膚乾燥症状、アトピー症状及び接触性皮膚炎症状などを予防又は改善する効果がある外用剤組成物及びその皮膚保湿化粧料としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の最外側に位置する表皮の最も重要な機能は、外部の多様な刺激（化学物質、大気汚染物質、乾燥した環境、紫外線などの物理化学的刺激因子）から身体を保護すると共に、皮膚を通じる体内水分の過度な発散を防止する保護機能であり、このような保護機能は、角質形成細胞で構成された角質層が正常的に形成されているときにのみ、その機能を維持することができる。表皮の最も外側に存在する角質層は、角質形成細胞から形成され、分化が完結された角質細胞とそれを取り囲む脂質層とで構成されている（J. Invest. Dermatol. 1983;80:44-49）。角質細胞は、表皮の最下層で持続的に増殖する基底細胞が段階的に形態及び機能上の変化を経て、皮膚の表面まで上昇した特徴的な細胞であり、一定の期間が経過すれば、古い角質細胞は、皮膚から脱落し、新しい角質細胞がその機能を代行するようになるが、このような繰り返し的な一連の変化過程を「表皮細胞の分化又は角化」と呼ぶ。角化過程中に角質形成細胞は、天然保湿因子（Natural Moisturizing Factor；NMF）と細胞間脂肪質（セラマイド、コレステロール、脂肪酸）を生成しながら角質層を形成し、角質層が堅固性と柔軟性を有するようにして、皮膚障壁としての機能を保有するようにする。
【０００３】
しかし、このような角質層は、過度な洗顔や入浴などの生活習慣的要素や、乾燥した大気、汚染物質などの環境的な要因、そしてアトピー性皮膚や老人性皮膚のような内因性疾患などに起因して容易にその機能が損失され、実際に現代に入ってさらに増えた様々な要因に起因して、最近、乾燥皮膚症状及びこれによる諸障害を訴える人々がますます増加している。したがって、適切な皮膚水分を維持するために外部から水分を供給するか、体内からの水分損失を防止するための研究が多く進行されてきており、実際に水分保有能力がある様々な種類の保湿剤が開発され、主として化粧品領域において多く使用されている。
【０００４】
しかし、人間に有害な生活環境要因がますます増加し、老令人口が急激に増加するにつれて、角質層の生成−脱落速度（turnover rate）が遅くなり、角質形成細胞の脂質合成能力が低下するか、又は、表皮で正常細胞の分裂、成熟及び分化が円滑に行われないため、角質層の保湿因子と脂質の量が減少し、正常な角質層の機能を維持しない状態、すなわち皮膚障壁機能が損傷された状態の皮膚を持っている人々がますます増加する傾向にある。
【０００５】
このような非正常的な表皮細胞の分裂、分化に起因して、皮膚は、皮膚乾燥症、アトピー、乾癬などの多様な皮膚疾患を誘発するようになり、このような諸疾患は、それ自体で水分保有機能のみを有する通常の保湿剤だけではその症状を若干緩和させることはできるが、根本的な治癒を期待することは難しいことが現況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これより、本発明者らは、表皮細胞の分化を調節する物質を開発して皮膚に適用することによって、正常な角質層の生成と脱落を誘導し、皮膚角質層に存在する天然保湿因子の生成及び維持を強化させて、皮膚乾燥症とこれに伴うアトピーなどの皮膚乾燥疾患を根本的に予防又は治療することを試みた。
【０００７】
本発明者らは、表皮分化と関連した研究を行う過程で玄参抽出物及び白茯苓抽出物が角質形成細胞の分化を促進する機能があることを知見し、また、細胞間脂質であるセラマイドの合成も促進することを確認し、さらに、角質細胞分化を促進し、増殖を抑制し、細胞間脂質の合成を増加させ、抗炎作用でもその機能を有する核ホルモン受容体（nuclear hormone receptor）の一種であるPPAR-α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alpha）を活性化させることを知見し、これを通じて上記玄参抽出物及び白茯苓抽出物の効果をもう一度確認することができた。そして、外用剤の形態で動物の皮膚に適用したとき、皮膚障壁を強化する確実な結果を得ることによって、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、表皮内に存在する角質形成細胞の正常な分化を促進することによって、次のような効果を誘導することにある。第一に、角質層及び皮膚障壁を構成する骨格成分である角質細胞を正常に誘導し、外部の物理的な刺激から皮膚を保護することができるようにし、第二に、角質細胞を取り囲んで皮膚障壁を完成させる構成成分である脂質の生合成を促進し、皮膚障壁の強化を誘導することにある。このような作用を通じて、窮極的に皮膚の水分保有能力を増進させることによって、皮膚の柔軟性と堅固性を高めて、皮膚が本来の保護機能を円滑に行うようにし、付随的に、皮膚乾燥による小じわ発生の減少効果を付与し、乾燥皮膚やアトピーなどのような皮膚乾燥疾患を予防するか、又は治療することができる皮膚保湿外用剤組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物を提供する。
また、本発明による組成物は、玄参抽出物に白茯苓抽出物をさらに含有する。
上記皮膚保湿外用剤組成物は、玄参抽出物を０．０００１〜３０重量%含有することを特徴とする。
上記皮膚保湿外用剤組成物は、皮膚障壁機能強化用、角質形成細胞分化促進用、セラマイド生成促進用、PPAR-α活性化剤組成物であることを特徴とする。
また、本発明は、玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物の皮膚保湿化粧料としての用途を提供する。
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１０】
本発明で使われる“玄参”は、ゴマノハグサ科の多年生草本であって、韓国、中国、日本国などに分布し、漢方では、根を薬材として使用する。主要成分として、スクロポラリン（scrophularine）、フィトステロール、フィトステリンなどを含み、その他の糖分、精油、脂肪酸を含んでいる。玄参は、熱を下げ、心臓機能を強化し、炎症を防止する作用をし、咽喉炎、扁桃腺炎、結膜炎、リンパ腺炎などに使用され、様々な高熱が出る病に効果がある。
【００１１】
“白茯苓”は、サルノコシカケ（Polyporaceae）科であって、赤松の根に寄生する。直径が約３０〜５０cmである菌類の塊体で、外側は、松皮のように荒くて、内部は、白いか、ピンク色をしている。内部が白いものを白茯苓と言い、ピンク色のものを赤茯苓と言うが、白茯苓は赤松（pine tree）の根に寄生し、赤茯苓は黒松（Japanese pine tree）の根に寄生する。白茯苓中のトリテルペン成分は、抗嘔吐、抗炎症などの効果を有するものと報告されており、菌核には、β-パキマンが含有され、乾燥重量の約９３%を占め、トリテルペノイド化合物のパキマン酸（pachymic acid）、ツムロス酸、3β-ヒドロキシラノスタ-7,9,24-トリエン-2-酸を含有し、その他、キチン、ステロール、レシチン、アデニン、ヒスチジン、コリン、リパーゼ、 プロテイナーゼなどが含有されている。白茯苓は、昔から強壮剤として使用された。薬理実験結果によれば、利尿作用、血糖量を低める作用、及び鎮静作用などをするものとして明らかにされ、免疫賦活作用をするものとして知られている。また、婦人病に効果があると知られている
【００１２】
本発明の皮膚保湿外用剤組成物は、全体組成物のうち全体活性成分、すなわち玄参抽出物又は玄参抽出物に白茯苓抽出物をさらに含有する抽出物を組成物の全体重量に対して各々０．０００１〜３０重量%の量で含有することが好ましい。その含量が０．０００１重量%未満の場合、上記成分による皮膚保湿効果、皮膚障壁機能強化効果、及び皮膚角質形成細胞分化誘導効果などを得ることができず、含量が３０重量%を超過する場合、含量増加に比べて効果の増加が大きくないからである。
【００１３】
本発明の皮膚保湿外用剤組成物は、化粧料組成物又は薬学組成物として提供されることができ、以下では、本発明の皮膚外用剤組成物の剤形をさらに詳しく説明する。
【００１４】
本発明による化粧料組成物には、前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物以外に、本発明が目的とする主効果を損傷させない範囲内で、好ましくは、主効果を増大させることができる他の成分などを含有させてもよい。
【００１５】
本発明による前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物は、各化粧料の剤形で製造し、そのまま塗布するのに適しているが、通常の外用剤の形で製造されてもよい。
本発明の前述の玄参抽出物、白茯苓抽出物を含有する組成物が添加された化粧料は、溶液、乳化物、粘性混合物などの形状を取ることができる。
【００１６】
本発明の上記化粧料組成物は、皮膚保湿効果、皮膚障壁機能強化効果、及び皮膚角質形成細胞分化誘導効果のための化粧品などに多様に利用されることができる。本組成物を添加することができる製品として、例えば、各種クリーム、ローション、スキンなどのような化粧品類と、クレンジング、洗顔剤、せっけん、美容液などが挙げられる。
【００１７】
すなわち、本発明の化粧料は、その剤形において特に限定されず、例えば、柔軟化長水、収斂化粧水、栄養化粧水、ローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、パック、ゲル、パウダー、メーキャップベース、ファウンデーション、軟膏、パッチ、美容液、クレンジングフォーム、クレンジングクリーム、クレンジングウォーター、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤、せっけん、染毛剤、噴霧剤などのような剤形を有することができる。
【００１８】
各剤形の化粧料組成物において、前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物以外に他の成分は、その他の化粧料の剤形又は使用目的によって当業者が困難性無しに適宜選定して配合することができる。
【００１９】
本発明による薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常的に使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含有することができる。
【００２０】
その剤形として、本発明による前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物を含有する薬学組成物は、各々通常の方法によって軟膏、ゲル、クリーム、パッチ又は噴霧剤などの外用剤などを始めとして薬剤学的製剤に適したいずれの形態で剤形化して使用することができ、これらの各剤形は、その剤形の製剤化に必要で且つ適切な各種の基剤と添加物を含有することができ、これら成分の種類と量は、発明者によって容易に選定されることができる。
【００２１】
上記製剤の投与量は、対象者の年齢、性別、体重、症状、投与方法によって異なるが、１日当たり１．０乃至３．０mLの量で１日に１乃至５回塗布して１ヶ月以上投与することが良い。
【００２２】
一方、本発明の前述の玄参抽出物、白茯苓抽出物の毒性及び副作用は、ほとんどないので、予防目的に長期間安心して使用することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明で提供する外用剤組成物は、有効成分として玄参抽出物を主成分として含有し、白茯苓抽出物をさらに含有することを特徴とし、角質層及び皮膚障壁を構成する骨格成分である角質細胞を正常に誘導し、外部の物理的な刺激から皮膚を保護することができるようにし、角質細胞を取り囲んで皮膚障壁を完成させる構成成分である脂質の生合成を促進し、皮膚障壁の強化を誘導することができる。したがって、このような作用を通じて、上記玄参抽出物及び白茯苓抽出物を含有する皮膚外用剤組成物は、皮膚保湿用であって、表皮分化の不完全に起因して発生する皮膚乾燥症状、アトピー皮膚炎症状、接触性皮膚炎症状又は乾癬などを予防又は改善し、皮膚障壁機能強化用、及び皮膚角質形成細胞分化誘導用化粧料組成物又は薬学組成物として有用に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施例及び試験例を通じて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明がこれらの例にのみ限定されるものではない。
【００２５】
本発明者は、下記参考例１乃至参考例６のように、凍結乾燥した玄参、白茯苓から各抽出溶媒別に有効成分を抽出し、濃縮、乾燥させた玄参抽出物及び白茯苓抽出物を製造して使用した。
【００２６】
粉末状の乾燥した玄参の単位重量に対して水、メタノール又はエタノールなどの低級アルコール、エチルアセテート又はn-ヘキサンを玄参の重量に対して重量比で１〜１５倍で加えた後、５０〜１００℃で３乃至２４時間加熱して抽出するか、又は、４乃至２５℃で３〜４日間沈積させて有効成分を抽出した。また、無水又は含水エタノールとメタノール抽出物に適量の水とエチルアセテート、ブタノール又はヘキサンなどの混合溶媒に溶解させた後、放置し、層を分離させた後、上層を分離した。このように処理して得た抽出物は、減圧蒸発器を利用して濃縮、乾燥させた後、水やエタノール又は1,3-ブチレングリコールなどの溶媒に溶解して使用した。
【００２７】
粉末状の乾燥した白茯苓も前述の玄参と同様の方法によって製造した抽出物を使用した。すなわち、粉末状の乾燥した白茯苓の単位重量に対して水、メタノール又はエタノールなどの低級アルコール、エチルアセテート又はn-ヘキサンを白茯苓の重量に対して重量比で１〜１５倍で加えた後、５０〜１００℃で３乃至２４時間加熱して抽出するか、又は、４〜２５℃で３〜４日間沈積させて有効成分を抽出した。また、無水又は含水エタノールとメタノール抽出物に適量の水とエチルアセテート、ブタノール又はヘキサンなどの混合溶媒に溶解させた後、放置し、分離させた後、上層を分離した。このように処理して得た抽出物は、減圧蒸発器を利用して濃縮、乾燥させた後、水やエタノール又は1,3-ブチレングリコールなどの溶媒に溶解して使用した。
【００２８】
下記参考例のうち参考例１の抽出方法で得た抽出物が最も効果が高いので、本発明による玄参抽出物及び白茯苓抽出物の効果を検証するための下記試験例では、参考例１の抽出物だけについて言及する。その他、参考例２乃至６の抽出物は、全般的に参考例１の抽出物より約１０乃至５０%程度効能が低かったが、本特許の範囲には、参考例１乃至６の抽出物がすべて含まれる。
【００２９】
［参考例１］生薬材の水抽出物の製造方法
大韓民国の漢薬材商であるKunwha薬品から購入した凍結乾燥した玄参及び白茯苓を各々２００g粉砕し、重量比で１０倍の水を入れて、よく攪拌しながら８０℃で１８時間抽出した。各々の抽出物について、室温まで冷却した後、濾過紙を通じて濾過し、得られた各濾液にエタノール４kgを入れて室温で４８時間放置した。その後、さらに濾過して得られた各々の沈殿物をそれぞれ蒸留水２kgに溶解した後、再び濾過した。得られた濾液の各々を減圧蒸発器で濃縮することによって、玄参及び白茯苓の水抽出物を得た。
【００３０】
［参考例２］生薬材のエタノール抽出物の製造方法
凍結乾燥した玄参及び白茯苓を各々２００gに重量（kg）比で１０倍量の７０%エタノールを加えた後、８０℃で２時間加熱して有効成分を抽出した。これを一日間常温で放置して不純物を沈殿させた後、濾過紙を利用して２回濾過した濾液を減圧蒸発器を使用して完全に蒸発させて濃縮することによって、玄参及び白茯苓のエタノール抽出物を得た。
【００３１】
［参考例３］生薬材のメタノール抽出物の製造方法
凍結乾燥した玄参、白茯苓各２００gに重量（kg）比で１０倍量のメタノールを加えた後、７０℃で２時間加熱して有効成分を抽出した。これを一日間常温で放置して不純物を沈殿させた後、濾過紙を利用して２回濾過した濾液を減圧蒸発器を使用して完全に蒸発させて濃縮することによって、玄参及び白茯苓のメタノール抽出物を得た。
【００３２】
［参考例４］生薬材のヘキサン及びエチルアセテート層分画
上記参考例３の玄参及び白茯苓のメタノール抽出物各々に水とヘキサンを１：１で混合した混合溶媒を２０倍量加えて完全に懸濁させた後、常温で一日間放置させて層を分離する。上層液であるヘキサン層のみを分離し、減圧蒸発器で減圧濃縮させて、玄参、白茯苓抽出物の各々ヘキサン層分画を得た。
【００３３】
下層液である水層にエチルアセテート溶媒を２倍量添加して振とうした後、常温で一日間放置させて層を分離させた。上層液であるエチルアセテート層を分離し、減圧蒸発器で減圧濃縮させて、玄参及び白茯苓抽出物各々のエチルアセテート層分画を得た。
【００３４】
［参考例５］生薬材のブタノール層分画
上記参考例４のエチルアセテート層分画過程中の下層液である水層に２倍量のブタノールを添加し、上記参考例４と同様に行い、ブタノール層分画を得た。
【００３５】
［参考例６］生薬材の水層分画
上記参考例５で得られた最終の水層を減圧蒸発器で濃縮し、玄参、白茯苓各々の水層分画を得た。
【００３６】
上記の方法で抽出された玄参及び白茯苓抽出物、又は抽出後にさらに濃縮された玄参及び白茯苓抽出物を３０%水溶液、1,3-ブチレングリコールに５%（w/w）の濃度で溶解させた溶液、又はエタノールに１０%（w/w）の濃度で溶解させた溶液で製造し、柔軟化長水、栄養化粧水、エッセンス、パックなどのような化粧料剤形に添加して使用した。
【００３７】
以下、本発明者は、本発明による参考例１の玄参及び白茯苓抽出物の効果を立証するために、次のような実験を行った。下記実施例３で、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合割合は１：１にした。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［試験例１］人間角質形成細胞の分化誘導試験
玄参及び白茯苓抽出物の細胞分化促進効果を調べるために、第一に、角質形成細胞の分化時に生成される角質細胞膜（Cornified Envelop；CE）の量を吸光度を利用して測定する方法と、第二に、人間皮膚細胞株（HaCaT）の分化時に生成される角質細胞膜の量を同位元素を利用して測定する２つの方法で試験した。
第１の吸光度を利用した試験では、一次培養した人間の角質形成細胞を培養用フラスコに入れて底に付着させた後、下記表２の試験物質を表に提示した濃度で培養液に添加し、細胞が底面積の７０〜８０%程度成長するまで５日間培養した。この細胞を収獲し、リン酸緩衝食塩水（Phosphate Buffered Saline；PBS）で洗浄した後、２%ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate；SDS）と２０mM濃度のジチオスレイトール（Dithiothreitol；DTT）を含有する１０mM濃度のトリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl、pH 7.4）１mLを加えてソニケイション（sonication）、ボイリング（boiling）、及び遠心分離した沈殿物をさらにPBS １mLに懸濁させて、３４０nmでの吸光度を測定した。これと別に、上記ソニケイション後の溶液の一部を取ってタンパク質含量を測定し、細胞分化程度の評価時に基準とした。低カルシウム（０．０３mM）処理群と高カルシウム（1.2 mM）処理群を各々陰性／陽性対照群とし、低カルシウム濃度に試験物質を添加して実施した試験結果を下記表２及び図１に示した。
【００４０】
第２の同位元素を利用した試験では、一次培養した人間の人間皮膚細胞株を２４ウェル型の培養用フラスコに入れて底に付着させた後、１uCi/mLの濃度で[35S]-メチオニンを表２の試験物質とともに表に提示した濃度で培養液に添加し、細胞が底面積の７０〜８０%程度成長するまで２日間培養した。この細胞を収獲し、PBSで洗浄した後、２%SDSと２０mM濃度のDTTを含有するPBSを５００μLずつ加えて、ピペッティングした後、１００μLずつシンチレーションバイアル（scintillation vial）に分注した後、カクテル溶液（Cocktail solution）を２．５ml添加させて、液体閃光計数器（Liquid Scintillation Counter；LSC）を利用して測定し、全体タンパク質の量を決定した。決定した全体タンパク質量を基準にして、試験物質の各々の該当する量が２５mmフィルタを利用して濾過された。このような方法でフィルタにより濾過された不溶性タンパク質のみを取って、フィルタ自体をシンチレーションバイアルに入れた。２．５mlのカクテル溶液をそこに添加してフィルタをよく溶解した後、液体閃光計数器で測定した。この値を以前に測定した全体タンパク質の量で分けて、分化時に形成されるCEの量を決定した。その結果を下記表２及び図２に示した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
上記表２から明らかなように、本発明による玄参及び白茯苓抽出物は、角質形成細胞及び人間皮膚細胞株のいずれにおいても分化を促進することが分かる。また、玄参抽出物のみを使用したものより、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的であることが分かる。
【００４３】
［試験例２］人間の皮膚細胞株のトランスグルタミナーゼの発現効果
人間の皮膚細胞株を９６ウェル型の細胞培養プレートの各ウェルに５×１０4個を入れ、２４時間付着させた。付着させた皮膚細胞株に試験物質を処理した後、２日が経過してから、培地を除去し、−２０℃の冷蔵庫に保管した。凍結−解凍を２回繰り返して物質処理した細胞を破壊させた後、アセトン：エタノール＝１：１（v/v）の割合で処理し、４℃で３０分間放置して細胞を固定させた。その後、室温に放置し、有機溶媒が蒸発されるようにし、ブロッキング（1%牛血清アルブミン）、トランスグルルタミネイズ抗体（primary antibody）、HRP（horseradish peroxidase；西洋ワサビペルオキシダーゼ）アンチ−マウス抗体（secondary antibody）を行い、発色は、オルソ−フェニルジアミン（o-phenyldiamine；OPD）を添加して行った。発現量は、４９０nmで吸光度を測定し、補正は、６３０nmでバックグラウンドを測定して行った。低カルシウム（0.03 mM）処理群及び高カルシウム（1.2 mM）処理群を各々陰性／陽性対照群にし、低カルシウム濃度に試験物質を添加して実施した試験結果を下記表３及び図３に示した。
【００４４】
【表３】
【００４５】
上記表３及び図３から明らかなように、本発明による玄参及び白茯苓抽出物は、陰性対照群に比べて２倍以上の増加様相を示し、陽性対照群よりもからり多い量が発現されることが分かる。したがって、本発明による玄参及び白茯苓抽出物がトレンスグルルタミネイズの発現を向上させることが分かる。また、玄参抽出物のみを使用したものより玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的であることが分かる。
【００４６】
［試験例３］無毛マウス皮膚での皮膚障壁回復及び保湿力試験
本発明者は、玄参及び白茯苓抽出物が長期間の皮膚損傷による皮膚障壁の回復に及ぶ効果を評価するための試験を実施した。生まれ後８乃至１０週が経過した若い無毛マウスの背中にアセトンを１日２回ずつ５日間周期的に塗布し、実験動物の背中の皮膚の障壁機能を損傷させた後、蒸発計で経皮水分損失量（Transepidermal water loss；TEWL）を測定し、４０g/m2/hr以上の 経皮水分損失を示す皮膚を有する実験動物のみを対象にしてビヒクル（プロピレングリコール：エタノール＝7:3）と玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物５%を含有する試験物質を皮膚面積５cm2当たり２００μLの用量で１日２回ずつ３日間連続塗布しながら一定時間ごとにTEWLを測定した。その結果を図４に示した。
【００４７】
図４から明らかなように、全般的に玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を塗布した処理群がビヒクル群に比べてさらに速く障壁損傷が回復された。また、TEWL測定時点にドイツCourage Khazaka社のコルネオメータを使用して測定した皮膚水分量の場合にも、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を処置した群の皮膚水分量がビヒクル処置群より高かく、障壁損傷回復とともに皮膚水分量も増加した。その結果を図５に示した。
【００４８】
［試験例４］人間皮膚で表皮脂質（全体セラマイド）生成量の増加効果試験
玄参及び白茯苓抽出物が実際人間皮膚での脂質合成増加に及ぶ効果を評価するために試験を実施した。試験物質組成は、Carbopol ETD 2020 ０．５%、TEA０．４５%、試験物質５%、及び脱イオン化された水で１００を合わせて使用した。１２名の成人男女を対象にして下腕（forearm）に５０mLのポリプロピレンコニカルチューブの直径分の領域を表示した後、毎日２回ずつ対照群と玄参抽出物、白茯苓抽出物、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を２０μLずつ塗布しながら被験者を２つの群に分けて３日目と１１日目の生成脂質量を下記のような方法で脂質を抽出して分析した。水道水を利用して下腕を洗浄した後、Scotch（登録商標）810 Magic tapeで１回テープストリッピングをした後、切った５０mLのポリプロピレンコルニカルチューブを貯蔵所として使用して、１mLのシクロヘキサン／エタノールを４：１の割合で添加した後、約１分間攪拌した後、これを新しいチューブに移した。さらに１mLのシクロヘキサン／エタノールを１：１の割合で添加して約１分間攪拌した後、これを新しいチューブに集めた。その後、これを５０℃で窒素ガスを利用して乾燥させた後、５００μLのクロロホルム：メタノール＝２：１の一定量の溶液に溶解して保管した。各試料をCAMAG社のAutomated TLC sampler-4を利用してSilicagel TLC（Thin Layer chromatography）板に点滴し、AMD（Automated Multiple Development）を利用して下記表４のような組成比の展開溶媒で展開した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
TLC板を展開させた後、TLC Scanner-II（CAMAG社：濃度計）を利用して５７０nm波長で各バンドの大きさを測定した。非処置群のセラマイド生成量を１００%に換算した各処置群のセラマイド生成量は下記表５及び度６に現わした。
【００５１】
【表５】
【００５２】
上記表５及び図６から明らかなように、玄参抽出物、白茯苓抽出物、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を処置してから３日後及び１１日後に陰性対照群（無処理群／ビヒクル）に対して増加状態を示し、養成対照群（グリセリン）よりも増加を示した。これは、玄参及び白茯苓抽出物によるセラマイド増加を立証するものである。また、玄参抽出物のみを使用したものより玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的であることが分かる。
【００５３】
［試験例５］皮膚細胞分化促進、皮膚細胞増殖抑制、脂質生合成促進及び抗炎症における 役割を果たすPPAR-α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alph
a）活性化試験
猿腎臓上皮細胞株であるCV-1細胞（ATCCCCL70）をチャコール／デクストラン処理１０%牛胎児血清を含有するDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地に継代培養し、フェノールレッドのエストロゲンによる効果を除去するために、ダイコン−フェノールレッド培地を使用した。プラスミドは、一般的な培養条件でも発現されるユニバーサルプローモータ後にPPAR-（遺伝子を有するものとリガンド結合型のPPAR−）が結合して活性化されるPPRE（PPARs Response Element）をプローモータとして有し、後にレポータとして役目をする蛍ルシフェラーゼ遺伝子を有するもの、そして参照として使用されるユニバーサルプローモータにレニラルシフェラーゼ遺伝子が結合されたプラスミドが使用された。
【００５４】
CV-1細胞を９×１０4の濃度で２４ウェル型プレートに敷設した後、２４時間培養した。その後、上記３つのプラスミド遺伝子を一時的トレンスフェクション（transient transfection）した。その後、２４時間培養した後、1xPBS（Phosphate Buffered Saline）で洗浄した後、リガンド候補物質を濃度別に処理し、２４時間培養した後、1xPBSで洗浄し、1xPLB（Passive Lysis Buffer）で細胞を壊した後、Dual-Luciferase Reporter Assay System kitを使用して試料と参照のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００５５】
本実験で、陽性対照群は、PPAR-αのリガンドのうち最も強力なものと知られたWy-14,643を使用し、陰性対照群は、試料を溶解するときに使用したエタノールと無処理群にした。その結果を図７に示す。図７から明らかなように、また、玄参抽出物のみを使用したものことより玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的なPPAR-αの活性化傾向を示した。
【００５６】
以上の結果から、玄参抽出物及び白茯苓抽出物は、皮膚細胞の分化促進と増殖抑制及び角質形成細胞の分化促進、損傷された皮膚障壁回復及び皮膚保湿力増加においてその効果に非常に優れていることを確認することができた。
【００５７】
以下、上記組成物の剤形例を説明するが、本発明は、これを限定するものでなく、ただ具体的説明するものである。
下記生薬材抽出物は、実施例１〜３のうちいずれか１つの抽出物である。
【００５８】
［剤形例１］せっけん製造
生薬材抽出物：１．００（%）
油脂：適量
水酸化ナトリウム：適量
塩化ナトリウム：適量
香料：少量
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比によってせっけんを製造した。
【００５９】
［剤形例２］ローション製造
生薬材抽出物：３．００（%）
L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシュム塩：１．００
水溶性コラーゲン（1%水溶液）：１．００
クエン酸ナトリウム：０．１０
クエン酸：０．０５
甘草抽出物：０．２０
1,3-ブチレングリコール：３．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）によってローションを製造した。
【００６０】
［剤形例３］クリーム製造
生薬材抽出物：１．００（%）
ポリエチレングリコールモノステアルレート：２．００
自己乳化型モノステアル酸グリセリン：５．００
セチルアルコール：４．００
スクアレン：６．００
トリ2-エチルヘキサングリセリル：６．００
スフィンゴ糖脂質：１．００
1,3-ブチレングリコール：７．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）でクリームを製造した。
【００６１】
［剤形例４］パック製造
生薬材抽出物：５．００（%）
ポリビニルアルコール：１３．００
L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシュム塩：１．００
ラウロイルヒドロキシフロリン：１．００
水溶性コラーゲン（1%水溶液）：２．００
1,3-ブチレングリコール：３．００
エタノール：５．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）でパックを製造した。
【００６２】
［剤形例５］美容液製造
生薬材抽出物：２．００（%）
ヒドロキシエチレンセルロース（2%水溶液）：１２．００
キサンタンガム（2%水溶液）：２．００
1,3-ブチレングリコール：６．００
濃グリセリン：４．００
ヒアルロン酸ナトリウム（1%水溶液）：５．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）で美容液を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の組成物は、皮膚角質形成細胞の分化を正常に還元及び維持させることによって、表皮分化の不完全による皮膚乾燥症状、アトピー症状及び接触性皮膚炎症状などを予防又は改善することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として玄参(ゲンジン)(Scrophularia buergeriana Miq.)抽出物を主成分として含有し、白茯苓（Poria cocos Wolf）抽出物をさらに含有し、皮膚の乾燥症状などを改善させる効果がある外用剤組成物及びその皮膚保湿化粧料としての用途に関する。すなわち、玄参抽出物及び白茯苓抽出物を皮膚に塗布したとき、皮膚角質形成細胞の分化を正常に還元／維持させることによって、表皮分化の不完全に起因して発生する皮膚乾燥症状、アトピー症状及び接触性皮膚炎症状などを予防又は改善する効果がある外用剤組成物及びその皮膚保湿化粧料としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の最外側に位置する表皮の最も重要な機能は、外部の多様な刺激（化学物質、大気汚染物質、乾燥した環境、紫外線などの物理化学的刺激因子）から身体を保護すると共に、皮膚を通じる体内水分の過度な発散を防止する保護機能であり、このような保護機能は、角質形成細胞で構成された角質層が正常的に形成されているときにのみ、その機能を維持することができる。表皮の最も外側に存在する角質層は、角質形成細胞から形成され、分化が完結された角質細胞とそれを取り囲む脂質層とで構成されている（J. Invest. Dermatol. 1983;80:44-49）。角質細胞は、表皮の最下層で持続的に増殖する基底細胞が段階的に形態及び機能上の変化を経て、皮膚の表面まで上昇した特徴的な細胞であり、一定の期間が経過すれば、古い角質細胞は、皮膚から脱落し、新しい角質細胞がその機能を代行するようになるが、このような繰り返し的な一連の変化過程を「表皮細胞の分化又は角化」と呼ぶ。角化過程中に角質形成細胞は、天然保湿因子（Natural Moisturizing Factor；NMF）と細胞間脂肪質（セラマイド、コレステロール、脂肪酸）を生成しながら角質層を形成し、角質層が堅固性と柔軟性を有するようにして、皮膚障壁としての機能を保有するようにする。
【０００３】
しかし、このような角質層は、過度な洗顔や入浴などの生活習慣的要素や、乾燥した大気、汚染物質などの環境的な要因、そしてアトピー性皮膚や老人性皮膚のような内因性疾患などに起因して容易にその機能が損失され、実際に現代に入ってさらに増えた様々な要因に起因して、最近、乾燥皮膚症状及びこれによる諸障害を訴える人々がますます増加している。したがって、適切な皮膚水分を維持するために外部から水分を供給するか、体内からの水分損失を防止するための研究が多く進行されてきており、実際に水分保有能力がある様々な種類の保湿剤が開発され、主として化粧品領域において多く使用されている。
【０００４】
しかし、人間に有害な生活環境要因がますます増加し、老令人口が急激に増加するにつれて、角質層の生成−脱落速度（turnover rate）が遅くなり、角質形成細胞の脂質合成能力が低下するか、又は、表皮で正常細胞の分裂、成熟及び分化が円滑に行われないため、角質層の保湿因子と脂質の量が減少し、正常な角質層の機能を維持しない状態、すなわち皮膚障壁機能が損傷された状態の皮膚を持っている人々がますます増加する傾向にある。
【０００５】
このような非正常的な表皮細胞の分裂、分化に起因して、皮膚は、皮膚乾燥症、アトピー、乾癬などの多様な皮膚疾患を誘発するようになり、このような諸疾患は、それ自体で水分保有機能のみを有する通常の保湿剤だけではその症状を若干緩和させることはできるが、根本的な治癒を期待することは難しいことが現況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これより、本発明者らは、表皮細胞の分化を調節する物質を開発して皮膚に適用することによって、正常な角質層の生成と脱落を誘導し、皮膚角質層に存在する天然保湿因子の生成及び維持を強化させて、皮膚乾燥症とこれに伴うアトピーなどの皮膚乾燥疾患を根本的に予防又は治療することを試みた。
【０００７】
本発明者らは、表皮分化と関連した研究を行う過程で玄参抽出物及び白茯苓抽出物が角質形成細胞の分化を促進する機能があることを知見し、また、細胞間脂質であるセラマイドの合成も促進することを確認し、さらに、角質細胞分化を促進し、増殖を抑制し、細胞間脂質の合成を増加させ、抗炎作用でもその機能を有する核ホルモン受容体（nuclear hormone receptor）の一種であるPPAR-α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alpha）を活性化させることを知見し、これを通じて上記玄参抽出物及び白茯苓抽出物の効果をもう一度確認することができた。そして、外用剤の形態で動物の皮膚に適用したとき、皮膚障壁を強化する確実な結果を得ることによって、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、表皮内に存在する角質形成細胞の正常な分化を促進することによって、次のような効果を誘導することにある。第一に、角質層及び皮膚障壁を構成する骨格成分である角質細胞を正常に誘導し、外部の物理的な刺激から皮膚を保護することができるようにし、第二に、角質細胞を取り囲んで皮膚障壁を完成させる構成成分である脂質の生合成を促進し、皮膚障壁の強化を誘導することにある。このような作用を通じて、窮極的に皮膚の水分保有能力を増進させることによって、皮膚の柔軟性と堅固性を高めて、皮膚が本来の保護機能を円滑に行うようにし、付随的に、皮膚乾燥による小じわ発生の減少効果を付与し、乾燥皮膚やアトピーなどのような皮膚乾燥疾患を予防するか、又は治療することができる皮膚保湿外用剤組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物を提供する。
また、本発明による組成物は、玄参抽出物に白茯苓抽出物をさらに含有する。
上記皮膚保湿外用剤組成物は、玄参抽出物を０．０００１〜３０重量%含有することを特徴とする。
上記皮膚保湿外用剤組成物は、皮膚障壁機能強化用、角質形成細胞分化促進用、セラマイド生成促進用、PPAR-α活性化剤組成物であることを特徴とする。
また、本発明は、玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物の皮膚保湿化粧料としての用途を提供する。
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１０】
本発明で使われる“玄参”は、ゴマノハグサ科の多年生草本であって、韓国、中国、日本国などに分布し、漢方では、根を薬材として使用する。主要成分として、スクロポラリン（scrophularine）、フィトステロール、フィトステリンなどを含み、その他の糖分、精油、脂肪酸を含んでいる。玄参は、熱を下げ、心臓機能を強化し、炎症を防止する作用をし、咽喉炎、扁桃腺炎、結膜炎、リンパ腺炎などに使用され、様々な高熱が出る病に効果がある。
【００１１】
“白茯苓”は、サルノコシカケ（Polyporaceae）科であって、赤松の根に寄生する。直径が約３０〜５０cmである菌類の塊体で、外側は、松皮のように荒くて、内部は、白いか、ピンク色をしている。内部が白いものを白茯苓と言い、ピンク色のものを赤茯苓と言うが、白茯苓は赤松（pine tree）の根に寄生し、赤茯苓は黒松（Japanese pine tree）の根に寄生する。白茯苓中のトリテルペン成分は、抗嘔吐、抗炎症などの効果を有するものと報告されており、菌核には、β-パキマンが含有され、乾燥重量の約９３%を占め、トリテルペノイド化合物のパキマン酸（pachymic acid）、ツムロス酸、3β-ヒドロキシラノスタ-7,9,24-トリエン-2-酸を含有し、その他、キチン、ステロール、レシチン、アデニン、ヒスチジン、コリン、リパーゼ、 プロテイナーゼなどが含有されている。白茯苓は、昔から強壮剤として使用された。薬理実験結果によれば、利尿作用、血糖量を低める作用、及び鎮静作用などをするものとして明らかにされ、免疫賦活作用をするものとして知られている。また、婦人病に効果があると知られている
【００１２】
本発明の皮膚保湿外用剤組成物は、全体組成物のうち全体活性成分、すなわち玄参抽出物又は玄参抽出物に白茯苓抽出物をさらに含有する抽出物を組成物の全体重量に対して各々０．０００１〜３０重量%の量で含有することが好ましい。その含量が０．０００１重量%未満の場合、上記成分による皮膚保湿効果、皮膚障壁機能強化効果、及び皮膚角質形成細胞分化誘導効果などを得ることができず、含量が３０重量%を超過する場合、含量増加に比べて効果の増加が大きくないからである。
【００１３】
本発明の皮膚保湿外用剤組成物は、化粧料組成物又は薬学組成物として提供されることができ、以下では、本発明の皮膚外用剤組成物の剤形をさらに詳しく説明する。
【００１４】
本発明による化粧料組成物には、前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物以外に、本発明が目的とする主効果を損傷させない範囲内で、好ましくは、主効果を増大させることができる他の成分などを含有させてもよい。
【００１５】
本発明による前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物は、各化粧料の剤形で製造し、そのまま塗布するのに適しているが、通常の外用剤の形で製造されてもよい。
本発明の前述の玄参抽出物、白茯苓抽出物を含有する組成物が添加された化粧料は、溶液、乳化物、粘性混合物などの形状を取ることができる。
【００１６】
本発明の上記化粧料組成物は、皮膚保湿効果、皮膚障壁機能強化効果、及び皮膚角質形成細胞分化誘導効果のための化粧品などに多様に利用されることができる。本組成物を添加することができる製品として、例えば、各種クリーム、ローション、スキンなどのような化粧品類と、クレンジング、洗顔剤、せっけん、美容液などが挙げられる。
【００１７】
すなわち、本発明の化粧料は、その剤形において特に限定されず、例えば、柔軟化長水、収斂化粧水、栄養化粧水、ローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、パック、ゲル、パウダー、メーキャップベース、ファウンデーション、軟膏、パッチ、美容液、クレンジングフォーム、クレンジングクリーム、クレンジングウォーター、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤、せっけん、染毛剤、噴霧剤などのような剤形を有することができる。
【００１８】
各剤形の化粧料組成物において、前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物以外に他の成分は、その他の化粧料の剤形又は使用目的によって当業者が困難性無しに適宜選定して配合することができる。
【００１９】
本発明による薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常的に使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含有することができる。
【００２０】
その剤形として、本発明による前述の玄参抽出物及び白茯苓抽出物を含有する薬学組成物は、各々通常の方法によって軟膏、ゲル、クリーム、パッチ又は噴霧剤などの外用剤などを始めとして薬剤学的製剤に適したいずれの形態で剤形化して使用することができ、これらの各剤形は、その剤形の製剤化に必要で且つ適切な各種の基剤と添加物を含有することができ、これら成分の種類と量は、発明者によって容易に選定されることができる。
【００２１】
上記製剤の投与量は、対象者の年齢、性別、体重、症状、投与方法によって異なるが、１日当たり１．０乃至３．０mLの量で１日に１乃至５回塗布して１ヶ月以上投与することが良い。
【００２２】
一方、本発明の前述の玄参抽出物、白茯苓抽出物の毒性及び副作用は、ほとんどないので、予防目的に長期間安心して使用することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明で提供する外用剤組成物は、有効成分として玄参抽出物を主成分として含有し、白茯苓抽出物をさらに含有することを特徴とし、角質層及び皮膚障壁を構成する骨格成分である角質細胞を正常に誘導し、外部の物理的な刺激から皮膚を保護することができるようにし、角質細胞を取り囲んで皮膚障壁を完成させる構成成分である脂質の生合成を促進し、皮膚障壁の強化を誘導することができる。したがって、このような作用を通じて、上記玄参抽出物及び白茯苓抽出物を含有する皮膚外用剤組成物は、皮膚保湿用であって、表皮分化の不完全に起因して発生する皮膚乾燥症状、アトピー皮膚炎症状、接触性皮膚炎症状又は乾癬などを予防又は改善し、皮膚障壁機能強化用、及び皮膚角質形成細胞分化誘導用化粧料組成物又は薬学組成物として有用に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施例及び試験例を通じて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明がこれらの例にのみ限定されるものではない。
【００２５】
本発明者は、下記参考例１乃至参考例６のように、凍結乾燥した玄参、白茯苓から各抽出溶媒別に有効成分を抽出し、濃縮、乾燥させた玄参抽出物及び白茯苓抽出物を製造して使用した。
【００２６】
粉末状の乾燥した玄参の単位重量に対して水、メタノール又はエタノールなどの低級アルコール、エチルアセテート又はn-ヘキサンを玄参の重量に対して重量比で１〜１５倍で加えた後、５０〜１００℃で３乃至２４時間加熱して抽出するか、又は、４乃至２５℃で３〜４日間沈積させて有効成分を抽出した。また、無水又は含水エタノールとメタノール抽出物に適量の水とエチルアセテート、ブタノール又はヘキサンなどの混合溶媒に溶解させた後、放置し、層を分離させた後、上層を分離した。このように処理して得た抽出物は、減圧蒸発器を利用して濃縮、乾燥させた後、水やエタノール又は1,3-ブチレングリコールなどの溶媒に溶解して使用した。
【００２７】
粉末状の乾燥した白茯苓も前述の玄参と同様の方法によって製造した抽出物を使用した。すなわち、粉末状の乾燥した白茯苓の単位重量に対して水、メタノール又はエタノールなどの低級アルコール、エチルアセテート又はn-ヘキサンを白茯苓の重量に対して重量比で１〜１５倍で加えた後、５０〜１００℃で３乃至２４時間加熱して抽出するか、又は、４〜２５℃で３〜４日間沈積させて有効成分を抽出した。また、無水又は含水エタノールとメタノール抽出物に適量の水とエチルアセテート、ブタノール又はヘキサンなどの混合溶媒に溶解させた後、放置し、分離させた後、上層を分離した。このように処理して得た抽出物は、減圧蒸発器を利用して濃縮、乾燥させた後、水やエタノール又は1,3-ブチレングリコールなどの溶媒に溶解して使用した。
【００２８】
下記参考例のうち参考例１の抽出方法で得た抽出物が最も効果が高いので、本発明による玄参抽出物及び白茯苓抽出物の効果を検証するための下記試験例では、参考例１の抽出物だけについて言及する。その他、参考例２乃至６の抽出物は、全般的に参考例１の抽出物より約１０乃至５０%程度効能が低かったが、本特許の範囲には、参考例１乃至６の抽出物がすべて含まれる。
【００２９】
［参考例１］生薬材の水抽出物の製造方法
大韓民国の漢薬材商であるKunwha薬品から購入した凍結乾燥した玄参及び白茯苓を各々２００g粉砕し、重量比で１０倍の水を入れて、よく攪拌しながら８０℃で１８時間抽出した。各々の抽出物について、室温まで冷却した後、濾過紙を通じて濾過し、得られた各濾液にエタノール４kgを入れて室温で４８時間放置した。その後、さらに濾過して得られた各々の沈殿物をそれぞれ蒸留水２kgに溶解した後、再び濾過した。得られた濾液の各々を減圧蒸発器で濃縮することによって、玄参及び白茯苓の水抽出物を得た。
【００３０】
［参考例２］生薬材のエタノール抽出物の製造方法
凍結乾燥した玄参及び白茯苓を各々２００gに重量（kg）比で１０倍量の７０%エタノールを加えた後、８０℃で２時間加熱して有効成分を抽出した。これを一日間常温で放置して不純物を沈殿させた後、濾過紙を利用して２回濾過した濾液を減圧蒸発器を使用して完全に蒸発させて濃縮することによって、玄参及び白茯苓のエタノール抽出物を得た。
【００３１】
［参考例３］生薬材のメタノール抽出物の製造方法
凍結乾燥した玄参、白茯苓各２００gに重量（kg）比で１０倍量のメタノールを加えた後、７０℃で２時間加熱して有効成分を抽出した。これを一日間常温で放置して不純物を沈殿させた後、濾過紙を利用して２回濾過した濾液を減圧蒸発器を使用して完全に蒸発させて濃縮することによって、玄参及び白茯苓のメタノール抽出物を得た。
【００３２】
［参考例４］生薬材のヘキサン及びエチルアセテート層分画
上記参考例３の玄参及び白茯苓のメタノール抽出物各々に水とヘキサンを１：１で混合した混合溶媒を２０倍量加えて完全に懸濁させた後、常温で一日間放置させて層を分離する。上層液であるヘキサン層のみを分離し、減圧蒸発器で減圧濃縮させて、玄参、白茯苓抽出物の各々ヘキサン層分画を得た。
【００３３】
下層液である水層にエチルアセテート溶媒を２倍量添加して振とうした後、常温で一日間放置させて層を分離させた。上層液であるエチルアセテート層を分離し、減圧蒸発器で減圧濃縮させて、玄参及び白茯苓抽出物各々のエチルアセテート層分画を得た。
【００３４】
［参考例５］生薬材のブタノール層分画
上記参考例４のエチルアセテート層分画過程中の下層液である水層に２倍量のブタノールを添加し、上記参考例４と同様に行い、ブタノール層分画を得た。
【００３５】
［参考例６］生薬材の水層分画
上記参考例５で得られた最終の水層を減圧蒸発器で濃縮し、玄参、白茯苓各々の水層分画を得た。
【００３６】
上記の方法で抽出された玄参及び白茯苓抽出物、又は抽出後にさらに濃縮された玄参及び白茯苓抽出物を３０%水溶液、1,3-ブチレングリコールに５%（w/w）の濃度で溶解させた溶液、又はエタノールに１０%（w/w）の濃度で溶解させた溶液で製造し、柔軟化長水、栄養化粧水、エッセンス、パックなどのような化粧料剤形に添加して使用した。
【００３７】
以下、本発明者は、本発明による参考例１の玄参及び白茯苓抽出物の効果を立証するために、次のような実験を行った。下記実施例３で、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合割合は１：１にした。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［試験例１］人間角質形成細胞の分化誘導試験
玄参及び白茯苓抽出物の細胞分化促進効果を調べるために、第一に、角質形成細胞の分化時に生成される角質細胞膜（Cornified Envelop；CE）の量を吸光度を利用して測定する方法と、第二に、人間皮膚細胞株（HaCaT）の分化時に生成される角質細胞膜の量を同位元素を利用して測定する２つの方法で試験した。
第１の吸光度を利用した試験では、一次培養した人間の角質形成細胞を培養用フラスコに入れて底に付着させた後、下記表２の試験物質を表に提示した濃度で培養液に添加し、細胞が底面積の７０〜８０%程度成長するまで５日間培養した。この細胞を収獲し、リン酸緩衝食塩水（Phosphate Buffered Saline；PBS）で洗浄した後、２%ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate；SDS）と２０mM濃度のジチオスレイトール（Dithiothreitol；DTT）を含有する１０mM濃度のトリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl、pH 7.4）１mLを加えてソニケイション（sonication）、ボイリング（boiling）、及び遠心分離した沈殿物をさらにPBS １mLに懸濁させて、３４０nmでの吸光度を測定した。これと別に、上記ソニケイション後の溶液の一部を取ってタンパク質含量を測定し、細胞分化程度の評価時に基準とした。低カルシウム（０．０３mM）処理群と高カルシウム（1.2 mM）処理群を各々陰性／陽性対照群とし、低カルシウム濃度に試験物質を添加して実施した試験結果を下記表２及び図１に示した。
【００４０】
第２の同位元素を利用した試験では、一次培養した人間の人間皮膚細胞株を２４ウェル型の培養用フラスコに入れて底に付着させた後、１uCi/mLの濃度で[35S]-メチオニンを表２の試験物質とともに表に提示した濃度で培養液に添加し、細胞が底面積の７０〜８０%程度成長するまで２日間培養した。この細胞を収獲し、PBSで洗浄した後、２%SDSと２０mM濃度のDTTを含有するPBSを５００μLずつ加えて、ピペッティングした後、１００μLずつシンチレーションバイアル（scintillation vial）に分注した後、カクテル溶液（Cocktail solution）を２．５ml添加させて、液体閃光計数器（Liquid Scintillation Counter；LSC）を利用して測定し、全体タンパク質の量を決定した。決定した全体タンパク質量を基準にして、試験物質の各々の該当する量が２５mmフィルタを利用して濾過された。このような方法でフィルタにより濾過された不溶性タンパク質のみを取って、フィルタ自体をシンチレーションバイアルに入れた。２．５mlのカクテル溶液をそこに添加してフィルタをよく溶解した後、液体閃光計数器で測定した。この値を以前に測定した全体タンパク質の量で分けて、分化時に形成されるCEの量を決定した。その結果を下記表２及び図２に示した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
上記表２から明らかなように、本発明による玄参及び白茯苓抽出物は、角質形成細胞及び人間皮膚細胞株のいずれにおいても分化を促進することが分かる。また、玄参抽出物のみを使用したものより、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的であることが分かる。
【００４３】
［試験例２］人間の皮膚細胞株のトランスグルタミナーゼの発現効果
人間の皮膚細胞株を９６ウェル型の細胞培養プレートの各ウェルに５×１０4個を入れ、２４時間付着させた。付着させた皮膚細胞株に試験物質を処理した後、２日が経過してから、培地を除去し、−２０℃の冷蔵庫に保管した。凍結−解凍を２回繰り返して物質処理した細胞を破壊させた後、アセトン：エタノール＝１：１（v/v）の割合で処理し、４℃で３０分間放置して細胞を固定させた。その後、室温に放置し、有機溶媒が蒸発されるようにし、ブロッキング（1%牛血清アルブミン）、トランスグルルタミネイズ抗体（primary antibody）、HRP（horseradish peroxidase；西洋ワサビペルオキシダーゼ）アンチ−マウス抗体（secondary antibody）を行い、発色は、オルソ−フェニルジアミン（o-phenyldiamine；OPD）を添加して行った。発現量は、４９０nmで吸光度を測定し、補正は、６３０nmでバックグラウンドを測定して行った。低カルシウム（0.03 mM）処理群及び高カルシウム（1.2 mM）処理群を各々陰性／陽性対照群にし、低カルシウム濃度に試験物質を添加して実施した試験結果を下記表３及び図３に示した。
【００４４】
【表３】
【００４５】
上記表３及び図３から明らかなように、本発明による玄参及び白茯苓抽出物は、陰性対照群に比べて２倍以上の増加様相を示し、陽性対照群よりもからり多い量が発現されることが分かる。したがって、本発明による玄参及び白茯苓抽出物がトレンスグルルタミネイズの発現を向上させることが分かる。また、玄参抽出物のみを使用したものより玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的であることが分かる。
【００４６】
［試験例３］無毛マウス皮膚での皮膚障壁回復及び保湿力試験
本発明者は、玄参及び白茯苓抽出物が長期間の皮膚損傷による皮膚障壁の回復に及ぶ効果を評価するための試験を実施した。生まれ後８乃至１０週が経過した若い無毛マウスの背中にアセトンを１日２回ずつ５日間周期的に塗布し、実験動物の背中の皮膚の障壁機能を損傷させた後、蒸発計で経皮水分損失量（Transepidermal water loss；TEWL）を測定し、４０g/m2/hr以上の 経皮水分損失を示す皮膚を有する実験動物のみを対象にしてビヒクル（プロピレングリコール：エタノール＝7:3）と玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物５%を含有する試験物質を皮膚面積５cm2当たり２００μLの用量で１日２回ずつ３日間連続塗布しながら一定時間ごとにTEWLを測定した。その結果を図４に示した。
【００４７】
図４から明らかなように、全般的に玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を塗布した処理群がビヒクル群に比べてさらに速く障壁損傷が回復された。また、TEWL測定時点にドイツCourage Khazaka社のコルネオメータを使用して測定した皮膚水分量の場合にも、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を処置した群の皮膚水分量がビヒクル処置群より高かく、障壁損傷回復とともに皮膚水分量も増加した。その結果を図５に示した。
【００４８】
［試験例４］人間皮膚で表皮脂質（全体セラマイド）生成量の増加効果試験
玄参及び白茯苓抽出物が実際人間皮膚での脂質合成増加に及ぶ効果を評価するために試験を実施した。試験物質組成は、Carbopol ETD 2020 ０．５%、TEA０．４５%、試験物質５%、及び脱イオン化された水で１００を合わせて使用した。１２名の成人男女を対象にして下腕（forearm）に５０mLのポリプロピレンコニカルチューブの直径分の領域を表示した後、毎日２回ずつ対照群と玄参抽出物、白茯苓抽出物、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を２０μLずつ塗布しながら被験者を２つの群に分けて３日目と１１日目の生成脂質量を下記のような方法で脂質を抽出して分析した。水道水を利用して下腕を洗浄した後、Scotch（登録商標）810 Magic tapeで１回テープストリッピングをした後、切った５０mLのポリプロピレンコルニカルチューブを貯蔵所として使用して、１mLのシクロヘキサン／エタノールを４：１の割合で添加した後、約１分間攪拌した後、これを新しいチューブに移した。さらに１mLのシクロヘキサン／エタノールを１：１の割合で添加して約１分間攪拌した後、これを新しいチューブに集めた。その後、これを５０℃で窒素ガスを利用して乾燥させた後、５００μLのクロロホルム：メタノール＝２：１の一定量の溶液に溶解して保管した。各試料をCAMAG社のAutomated TLC sampler-4を利用してSilicagel TLC（Thin Layer chromatography）板に点滴し、AMD（Automated Multiple Development）を利用して下記表４のような組成比の展開溶媒で展開した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
TLC板を展開させた後、TLC Scanner-II（CAMAG社：濃度計）を利用して５７０nm波長で各バンドの大きさを測定した。非処置群のセラマイド生成量を１００%に換算した各処置群のセラマイド生成量は下記表５及び度６に現わした。
【００５１】
【表５】
【００５２】
上記表５及び図６から明らかなように、玄参抽出物、白茯苓抽出物、玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を処置してから３日後及び１１日後に陰性対照群（無処理群／ビヒクル）に対して増加状態を示し、養成対照群（グリセリン）よりも増加を示した。これは、玄参及び白茯苓抽出物によるセラマイド増加を立証するものである。また、玄参抽出物のみを使用したものより玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的であることが分かる。
【００５３】
［試験例５］皮膚細胞分化促進、皮膚細胞増殖抑制、脂質生合成促進及び抗炎症における 役割を果たすPPAR-α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alph
a）活性化試験
猿腎臓上皮細胞株であるCV-1細胞（ATCCCCL70）をチャコール／デクストラン処理１０%牛胎児血清を含有するDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地に継代培養し、フェノールレッドのエストロゲンによる効果を除去するために、ダイコン−フェノールレッド培地を使用した。プラスミドは、一般的な培養条件でも発現されるユニバーサルプローモータ後にPPAR-（遺伝子を有するものとリガンド結合型のPPAR−）が結合して活性化されるPPRE（PPARs Response Element）をプローモータとして有し、後にレポータとして役目をする蛍ルシフェラーゼ遺伝子を有するもの、そして参照として使用されるユニバーサルプローモータにレニラルシフェラーゼ遺伝子が結合されたプラスミドが使用された。
【００５４】
CV-1細胞を９×１０4の濃度で２４ウェル型プレートに敷設した後、２４時間培養した。その後、上記３つのプラスミド遺伝子を一時的トレンスフェクション（transient transfection）した。その後、２４時間培養した後、1xPBS（Phosphate Buffered Saline）で洗浄した後、リガンド候補物質を濃度別に処理し、２４時間培養した後、1xPBSで洗浄し、1xPLB（Passive Lysis Buffer）で細胞を壊した後、Dual-Luciferase Reporter Assay System kitを使用して試料と参照のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００５５】
本実験で、陽性対照群は、PPAR-αのリガンドのうち最も強力なものと知られたWy-14,643を使用し、陰性対照群は、試料を溶解するときに使用したエタノールと無処理群にした。その結果を図７に示す。図７から明らかなように、また、玄参抽出物のみを使用したものことより玄参抽出物及び白茯苓抽出物の混合物を使用したものがさらに効果的なPPAR-αの活性化傾向を示した。
【００５６】
以上の結果から、玄参抽出物及び白茯苓抽出物は、皮膚細胞の分化促進と増殖抑制及び角質形成細胞の分化促進、損傷された皮膚障壁回復及び皮膚保湿力増加においてその効果に非常に優れていることを確認することができた。
【００５７】
以下、上記組成物の剤形例を説明するが、本発明は、これを限定するものでなく、ただ具体的説明するものである。
下記生薬材抽出物は、実施例１〜３のうちいずれか１つの抽出物である。
【００５８】
［剤形例１］せっけん製造
生薬材抽出物：１．００（%）
油脂：適量
水酸化ナトリウム：適量
塩化ナトリウム：適量
香料：少量
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比によってせっけんを製造した。
【００５９】
［剤形例２］ローション製造
生薬材抽出物：３．００（%）
L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシュム塩：１．００
水溶性コラーゲン（1%水溶液）：１．００
クエン酸ナトリウム：０．１０
クエン酸：０．０５
甘草抽出物：０．２０
1,3-ブチレングリコール：３．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）によってローションを製造した。
【００６０】
［剤形例３］クリーム製造
生薬材抽出物：１．００（%）
ポリエチレングリコールモノステアルレート：２．００
自己乳化型モノステアル酸グリセリン：５．００
セチルアルコール：４．００
スクアレン：６．００
トリ2-エチルヘキサングリセリル：６．００
スフィンゴ糖脂質：１．００
1,3-ブチレングリコール：７．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）でクリームを製造した。
【００６１】
［剤形例４］パック製造
生薬材抽出物：５．００（%）
ポリビニルアルコール：１３．００
L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシュム塩：１．００
ラウロイルヒドロキシフロリン：１．００
水溶性コラーゲン（1%水溶液）：２．００
1,3-ブチレングリコール：３．００
エタノール：５．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）でパックを製造した。
【００６２】
［剤形例５］美容液製造
生薬材抽出物：２．００（%）
ヒドロキシエチレンセルロース（2%水溶液）：１２．００
キサンタンガム（2%水溶液）：２．００
1,3-ブチレングリコール：６．００
濃グリセリン：４．００
ヒアルロン酸ナトリウム（1%水溶液）：５．００
精製水で全量を１００（%）にし、上記の配合比（%）で美容液を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の組成物は、皮膚角質形成細胞の分化を正常に還元及び維持させることによって、表皮分化の不完全による皮膚乾燥症状、アトピー症状及び接触性皮膚炎症状などを予防又は改善することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物。
【請求項２】
上記組成物に白茯苓抽出物をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の外用剤組成物。
【請求項３】
上記組成物は、皮膚障壁機能を強化するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項４】
上記組成物は、角質形成細胞分化を促進するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項５】
上記組成物は、セラマイド生成を促進するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項６】
上記組成物は、PPAR-αを活性化するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項７】
上記抽出物は、０．０００１〜３０重量%の量で含有されることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項８】
上記抽出物は、玄参を水、エタノール、メタノール、ヘキサン、エチルアセテート及びブタノールで構成された群から選択された溶媒を使用して抽出するか、又は分画することによって製造されることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項９】
玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物の皮膚保湿化粧料としての用途。
【請求項１０】
上記組成物に白茯苓抽出物をさらに含有することを特徴とする請求項９に記載の外用剤組成物の皮膚保湿化粧料としての用途。
【請求項１】
玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物。
【請求項２】
上記組成物に白茯苓抽出物をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の外用剤組成物。
【請求項３】
上記組成物は、皮膚障壁機能を強化するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項４】
上記組成物は、角質形成細胞分化を促進するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項５】
上記組成物は、セラマイド生成を促進するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項６】
上記組成物は、PPAR-αを活性化するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項７】
上記抽出物は、０．０００１〜３０重量%の量で含有されることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項８】
上記抽出物は、玄参を水、エタノール、メタノール、ヘキサン、エチルアセテート及びブタノールで構成された群から選択された溶媒を使用して抽出するか、又は分画することによって製造されることを特徴とする請求項１又は２に記載の外用剤組成物。
【請求項９】
玄参抽出物を有効成分として含有する外用剤組成物の皮膚保湿化粧料としての用途。
【請求項１０】
上記組成物に白茯苓抽出物をさらに含有することを特徴とする請求項９に記載の外用剤組成物の皮膚保湿化粧料としての用途。
【公表番号】特表２０１０−５２０２３２（Ｐ２０１０−５２０２３２Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１９４８（Ｐ２００９−５５１９４８）
【出願日】平成１９年９月１９日（２００７．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００４５５６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０５５７９
【国際公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【出願人】（５０３３２７６９１）株式會社アモーレパシフィック (73)
【住所又は居所原語表記】１８１， Ｈａｎｋａｎｇ−ｒｏ ２−ｋａ， Ｙｏｎｇｓａｎ−ｋｕ， Ｓｅｏｕｌ １４０−７７７ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１９日（２００７．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００４５５６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０５５７９
【国際公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【出願人】（５０３３２７６９１）株式會社アモーレパシフィック (73)
【住所又は居所原語表記】１８１， Ｈａｎｋａｎｇ−ｒｏ ２−ｋａ， Ｙｏｎｇｓａｎ−ｋｕ， Ｓｅｏｕｌ １４０−７７７ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]