環境または臨床試料中に存在する微生物を溶解し、前記微生物から核酸を分析用に抽出する装置
本発明は、空気収集手段の内部に配置され、核酸を回収する手段を受け入れることのできるカートリッジであって、実質的に円筒状であり、微生物保持ゾーンを含み、前記保持ゾーンが微生物溶解手段を含むカートリッジに関する。本発明は、空気中に含有されている微生物を収集する装置、および微生物を溶解する装置にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、生物学的分析の分野である。より詳細には、本発明は、空気試料などの環境試料中、または臨床試料中に存在する微生物を溶解する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
数年間にわたって、病院における院内感染の再起が観察されている。これらの感染は、入院中であり、それゆえ、定義上免疫抑制されている個体が、病院環境圏に存在している病原微生物で汚染されることによって説明される。これらの微生物は、装置および表面の消毒ならびに空気処理に、常に多大な注意が払われているのにもかかわらず、破壊されていない。環境微生物学的汚染のこれらの事例がますます一般的になっていることに鑑みて、環境制御を改善および促進する装置および方法の開発が、医療従事者の主要な関心となるに至っている。
【０００３】
院内感染の問題に加えて、環境条件の制御は、過去数年間にわたって、とりわけ食品加工業、医薬品産業または化粧品産業における、工業環境に関する懸念の再来にもなっている。食品加工業では、病原微生物による製品の汚染、または出発物質の汚染さえもがもたらしうる、消費者健康への被害甚大な結果が知られている。実際、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属のものなどの細菌による食中毒は、このところ、よくあることである。空気質の制御は、医薬品産業または化粧品産業の品質アプローチにおける鍵となる過程でもある。
【０００４】
さらに、これらの制御は、ますます厳しくなっている規制に基づいて、ますます高レベルの必要条件を満たさなければならない。
【０００５】
医療従事者または製造業者が環境制御を実施するのに利用可能なツールのなかで、エアロバイオコレクターは、空気中の生物を検出するのに選択される解決策である。これらの装置は、エアロバイオコンタミネーションを測定することが望ましい敷地内の適切な場所に置かれる。それらは通常、培養培地と連結された空気収集器で構成されている。空気収集器によって収集された空気は、培養培地と接触し、収集された空気内に潜在的に含有されている微生物が培養培地上に沈着する。その後、この培養培地を回収し、微生物の増殖を促進させるために、インキュベーター内に置く。このようにして、従来の微生物学技法によって、前記微生物を検出および同定することが可能である。
【０００６】
それにもかかわらず、これらの装置は、使用技法に関連した大きな欠点を有する。この欠点は、分析結果を得るのに必要な時間である。これは、従来の微生物学技法、とりわけ細菌学技法の使用が、細胞増殖に必要なインキュベーション時間、または同定を可能にするために特定の培養培地上に再接種する段階の時間さえも固守しなければならないことを意味するからである。それゆえ、結果を得るのに必要な時間が比較的長く、実際、院内感染または食中毒の原因となる病原菌の検出および同定を意図している場合には、長すぎることにさえなる。
【０００７】
このタイプの装置の別の欠点は、培養培地の使用によって、複数の細菌属および種を相互に識別することは可能となるが、通常、同一細菌種の複数の株を相互に識別することは可能にならないということである。いまでは、考慮対象の株に応じて、微生物の病原性が著しく異なりうることが知られている。
【０００８】
さらに、空気中に存在する粒子、とりわけ微生物を回収する装置がある。すなわち、ＧＢ−２２５４０２４号明細書は、空気中に含有されている粒子を収集する装置であって、その原則がサイクロン効果に基づいている装置を記載している。そのような装置は、微生物を含めた、空気中に含有されている粒子を収集するのに適していることが見出されているが、そのようにして得られた試料の処理、とりわけ、分析用に使用されることが意図されている遺伝物質の抽出については、全く研究されていない。
【０００９】
より一般的には、微生物の同定および／または結果の迅速な提供という点で最も適切な技法は、臨床試料に関するものであるか、環境試料に関するものであるかにかかわらず、疑いなく、分子診断技法である。これらの技法は、微生物の遺伝物質、とりわけ対象とするある特定の配列の分析に基づいており、それらは培養ステップなしで済ませることを可能にするので、記録時間内に微生物の極めて正確な同定を得ることを可能にする。
【００１０】
それにもかかわらず、そのような技法の使用は、いくつかの限定を示しており、それらの中で最も重要なものは、空気中に存在している微生物の量、すなわち分析を実施するために回収可能な微生物の量が潜在的に限定されていることである。実際、環境試料、そしてそれだけでなく一部の臨床試料も、比較的少量の微生物を有していることが知られている。それゆえ、この出発物質から得られる遺伝物質の量も少ないことになる。したがって、収率に関する、核酸を抽出するのに用いられる技法の効率が必須パラメータとなる。
【００１１】
さらに、微生物を溶解するための既存の技法の大部分は長く、手作業のステップを行う適格な人員の関与を必要としている。
【００１２】
ＷＯ−Ａ−２００５／０３８０２５パンフレットは、とりわけ空気から採取された微生物から核酸を抽出する方法を記載している。この方法は、３通りの異なった溶解方法、すなわち、化学溶解、熱ショック溶解および機械的溶解を行うものである。そのような方法は、疑いなく、核酸抽出収率の最適化と、それゆえ、分析に利用可能な遺伝物質の量の増加とを可能にするが、それにもかかわらず、この収率が、依然として、回収される微生物の量に依存しているという実情はそのままである。しかし、この文書では、前記微生物の回収の最適化については何も記載されていない。
【００１３】
ＵＳ第５７０７８６１号明細書は、微生物タイプの生細胞を崩壊させる装置を記載している。この装置は、ガラスビーズのみでなく、微生物を含有する管と、前記管を保持するホルダーの穴との間に存在するギャップによる振動の効果も用いることによって、細胞の溶解を可能にする。したがって、そのような装置は、細胞溶解の最適化と、それゆえ、遺伝物質の抽出の最適化とを可能にする。そのような装置、および後者によって用いられる方法は、上述のものと同じ限定、すなわち、それらが、回収される微生物の量に依存しているままであるという限定を示している。さらに、それらは、細胞破片から前記核酸を単離するために、核酸濃縮ステップを後で行わなければならないという追加の欠点を有する。最後に、それらは、濃縮ステップの終了時に、核酸の手操作での回収を必要とする。
【００１４】
これらの問題は、ＵＳ第５５６７０５０号明細書に記載の装置でも生じる。
【００１５】
より統合的なシステムも記載されている。すなわち、ＷＯ−Ａ−２００４／０１８７０４パンフレットは、空気中の微生物を収集し、かつそれらを同定するのに、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅技法を用いる装置および方法を記載している。このシステムは、郵便仕分けセンターにおける生物学的汚染攻撃の企てと戦うのに特に適している。このシステムは、郵便輸送回路に沿って置かれた空気収集装置、サイクロン効果によって粒子を濾過または分離する装置、液体試料中の粒子を濃縮または回収する装置、および試料の一部をＣｅｐｈｅｉｄ社製のＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）ＰＣＲ分析カートリッジに移す装置でできている。その後、空気から収集された（１または複数種の）微生物を同定するために、このカートリッジを、独立した自動生物学的分析装置に手操作で移す。
【００１６】
このシステムは、上述の装置および方法に関連した多くの技術的問題の解決を可能にするが、それにもかかわらず、それは大きな欠点を有する。これらの欠点の第１は、分析カートリッジに移す前に試料を処理するシステム（収集、分離、濃縮／回収）が比較的複雑であり、かつ厄介であるということである。第２の欠点は、収集された微生物が液体試料中に回収され、上記試料の一部のみが分析されるということである。これは、すべての微生物を回収しない危険性、それゆえすべての核酸を回収しない危険性が極めて高く、それによって分析の妥当性を大きく限定することを意味する。さらに、このシステムでは、その複雑さにもかかわらず、カートリッジをＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）自動分析装置に手操作で移動する必要がある。
【発明の概要】
【００１７】
したがって、本発明の第１の目的は、普遍的な溶解を行う装置および方法であって、それらが細菌、ウイルスまたは真菌であるかにかかわらず、増殖状態でも、胞子形態でもありうる、広範な多様性の微生物に関する環境試料および臨床試料の両方に有効な装置および方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、空気などの環境試料中または臨床試料中に含有されている前記微生物から、統合された方法で核酸を抽出し、かつ前記核酸を分析用に回収するために、前記微生物を効果的に溶解できる装置を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、空気試料中に含有されているすべての微生物を収集できる装置を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、簡易設計を有する装置を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、極端に小型化された装置を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、上述した様々なステップが、その中で、外部の汚染の危険性なく行われる密閉装置を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、操作者による試料の移動なしで、前記ステップがその中で行われ、それによってその汚染が予防される装置を提供することである。
【００２４】
最後に、本発明の別の目的は、遠心処理または濾過などの追加の前処理ステップなしで、例えば増幅ステップおよび検出ステップを含む分子診断ステップで直接的に使用できる、緩衝液中の標的核酸を提供できる装置を提供することである。
【００２５】
これらの目的は、とりわけ、本発明によって実現される。本発明は、第一に、空気収集手段の内部に配置でき、かつ核酸を回収する手段を受け入れることのできるカートリッジであって、前記カートリッジが実質的に円筒状であり、かつ微生物保持ゾーンを含み、前記保持ゾーンが微生物溶解手段を含むカートリッジに関する。
【００２６】
微生物保持ゾーンは、微生物を保持し、溶解手段を適所に維持し、液体の存在下で溶解することができる物質を含むと有利である。上記物質は好ましくはゲル状物質である。
【００２７】
上記ゲル状物質は、有利には、微生物培養培地でありうる。
【００２８】
上記装置の変形形態の１つによれば、後者が、分析装置への接続のための手段を含む。
【００２９】
溶解手段は、ビーズで構成されていることが好ましい。さらに好ましくは、ビーズの直径が２００〜６００μｍである。
【００３０】
本発明は、空気中に含有されている微生物を収集する装置であって、
−空気吸入ダクトを含む上部エレメントと、空気放出ダクトを含む下部エレメントとを含む空気収集手段であって、前記空気収集手段内部に気流を生成できるように、前記上部エレメントおよび下部エレメントを相互に連結することが可能である空気収集手段と、
−微生物保持ゾーンを含む実質的に円筒状のカートリッジであって、前記保持ゾーンが微生物溶解手段を含み、前記カートリッジが前記空気収集手段の内部に配置されているカートリッジと
を含む装置にも関する。
【００３１】
空気収集手段は、空気再循環回路に接続可能である。
【００３２】
本発明は、微生物を、前記微生物から核酸を単離する目的で溶解する装置であって、
−微生物保持ゾーンに置かれた微生物を含む、本発明によるカートリッジと、
−上記カートリッジ内に装着できる、実質的に円筒状の、核酸を回収する手段と
を含み、前記微生物を溶解し、かつ核酸の放出を可能にするために、前記回収する手段が微生物溶解手段と協働する装置にも関する。
【００３３】
核酸を回収する手段は、液体を汲み上げる／送達する手段を含むと有利である。
【００３４】
特に、核酸を回収する手段は、液体貯蔵ゾーンも含む。
【００３５】
好ましい一実施形態によれば、カートリッジの内径が、核酸を回収する手段の外径より大きく、その結果、核酸を回収する手段がカートリッジ内に装着される場合、核酸を回収する手段の外壁からカートリッジの内壁を離している距離が、溶解手段がこの間隙空間内に存在することを可能にするのに十分大きく、かつ溶解手段が前記壁のいずれか１つと接触するのに十分小さい。
【００３６】
本発明は、空気中に含有されている微生物を濃縮する方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと
を含む方法にも関する。
【００３７】
特定の一実施形態によれば、上記方法は、保持ゾーン内で微生物を増殖させるステップｄ）も含む。
【００３８】
微生物は、保持ゾーン内に存在する溶解手段表面に保持されると有利である。
【００３９】
本発明は、空気中に含有されている微生物を溶解させる方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法にも関する。
【００４０】
本発明は、空気中に含有されている微生物を溶解させる方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法にも関する。
【００４１】
本発明の別の主題は、空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｈ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法に関係する。
【００４２】
本発明は、空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｈ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内への、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法にも関する。
【００４３】
これらの抽出方法は、カートリッジの保持ゾーン内に濃縮された微生物を増殖させる追加のステップｄ’）を優先的に含む。
【００４４】
この増殖は、２〜２４時間の範囲にある時間にわたって、カートリッジをインキュベーター内でインキュベートすることによって行われる。
【００４５】
本発明の別の主題は、空気中に含有されている微生物を溶解させる方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンの近くに置かれるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法に関係する。
【００４６】
本発明の別の主題は、微生物を溶解する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮されるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法に関係する。
【００４７】
本発明の別の主題は、微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮されるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｅ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内への、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法に関係する。
【００４８】
本発明の別の主題は、微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮されるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｅ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法に関係する。
【００４９】
本発明は、微生物を溶解する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、本発明によるカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法にも関係する。
【００５０】
「液体試料」という用語は、微生物を含有しうるいかなる液体試料も意味するものとする。それは、ヒト起源の液体試料でも、動物起源の液体試料でもよい。この試料は、例えば、尿試料、全血試料、血漿試料またはいかなる他の体液の試料でもよい。液体試料は、飲料などの食品起源のものでもよい。それは、水などの環境起源のものでもよい。さらに、液体試料は、ｆｌｏｃｋｅｄＳＷＡＢＳという名称でＣｏｐａｎ社によって販売されたものなど、スワブタイプの表面試料採取装置上に含有されている潜在的微生物が、前記輸送液中における前記スワブの振動によって再懸濁されている「輸送」液でもよい。
【００５１】
加えて、本発明は、微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、本発明によるカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｄ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法に関係する。
【００５２】
本発明の別の主題は、加えて、試料中に含有されている１または複数種の微生物を同定する方法であって、
ａ）本発明による装置によって、前記試料中に含有されている微生物から核酸を単離するステップと、
ｂ）そのように単離された（１または複数種の）微生物を同定するステップと
を含む方法に関係する。
【００５３】
本発明による同定方法の有利な一変形形態によると、前記方法は、核酸を精製する中間ステップも含む。この精製ステップは、溶解ステップで放出された他の細胞成分から核酸を分離することを可能にする。このステップは通常、核酸の濃縮を可能にするものであり、ＤＮＡまたはＲＮＡの精製に適合させることができる。例として、吸着または共有結合によって、任意選択でオリゴヌクレオチドでコーティングされた、磁性粒子を用い（この点に関しては、特許ＵＳ第４６７２０４０号明細書およびＵＳ第５７５０３３８号明細書を参照）、それによって、これらの磁性粒子に結合した核酸を、洗浄ステップによって精製することが可能である。この核酸精製ステップは、その後に前記核酸を増幅することが意図されている場合、とりわけ有利である。これらの磁性粒子の特に有利な一実施形態が、特許出願ＷＯ−Ａ−９７／４５２０２およびＷＯ−Ａ−９９／３５５００に記載されている。核酸を精製する方法の別の有利な例は、カラムの形態、または不活性粒子（Ｂｏｏｍ Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９０、２８（３）巻、４９５〜５０３頁）、もしくは磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）シリカ、Ｐｒｏｍｅｇａ：ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）常磁性粒子）の形態のいずれかにおけるシリカの使用である。他の極めて広範に使用されている方法は、カラムフォーマットまたは常磁性粒子フォーマット（Ｗｈａｔｍａｎ：ＤＥＡＥ−Ｍａｇａｒｏｓｅ（登録商標））（Ｌｅｖｉｓｏｎ ＰＲら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９８、３３７〜３４４頁）におけるイオン交換樹脂に基づいている。本発明に極めて適切であるが、それに限られるわけではない別の方法は、金属酸化物支持体（Ｘｔｒａｎａ社：Ｘｔｒａ−Ｂｉｎｄ（商標）マトリックス）表面への吸着による方法である。
【００５４】
詳細には、同定ステップは、
ａ）単離された核酸を特異的に増幅するサブステップと、
ｂ）そのように増幅された核酸を検出するサブステップと
を含む。
【００５５】
同定方法の優先的な一変形形態によると、同定ステップは、本発明による装置のカートリッジと液体を介して連絡している同定装置内で行われる。
【００５６】
したがって、単離された核酸は、本発明による装置の、核酸を回収する手段から、同定装置へ輸送される。
【００５７】
核酸の輸送は、核酸を含有する、対象とする液体の、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段による送達によって行われ、前記対象とする液体は、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に含有されていることが有利である。
【００５８】
微生物は、細菌、ウイルス、酵母、カビおよび寄生虫を含む群から選ばれる。
【００５９】
微生物が単離される試料は、環境起源のものである。したがって、それらは、空気試料、または水などの液体試料、または表面試料でありうる。試料は、臨床起源のもの、すなわち、微生物、任意選択で病原微生物を探索および同定するための分析の対象となりうるヒト起源または動物起源の任意の試料でもよい。
【００６０】
標的核酸の存在は、ハイブリダイゼーション反応の可視化によって実証される。「ハイブリダイゼーション反応」という用語は、捕捉核酸と、転写ステップ、逆転写ステップまたはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づいた増幅）もしくはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）タイプの増幅ステップによって単離または生成された標的核酸との間のいかなる反応も意味するものとする。
【００６１】
「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、およびリボ核酸、ならびにそれらの誘導体も意味するものとする。「オリゴヌクレオチド」という用語は、適したハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できる一連の少なくとも２つの天然または修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方）を指す。「修飾ヌクレオチド」という用語は、例えば、修飾塩基ならびに／またはヌクレオチド間結合のレベルおよび／もしくはバックボーンのレベルにおける修飾を含むヌクレオチドを意味するものとする。修飾塩基の例としては、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリンおよびブロモ−５−デオキシウリジンを挙げることができる。
【００６２】
修飾ヌクレオチド間結合を例示するためには、ホスホロチオエート結合、Ｎ−アルキルホスホラミデート結合、アルキルホスホネート結合およびアルキルホスホジエステル結合を挙げることができる。
【００６３】
ＦＲ−Ａ−２６０７５０７に記載のものなどのα−オリゴヌクレオチド、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、８巻、１６号、１９９８年８月１８日、２２１９〜２２２２頁に記載のホスホロチオエート−ＬＮＡおよび２’−チオ−ＬＮＡなどのＬＮＡ、ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２）、１１４、１８９５〜１８９７による論文の主題であるＰＮＡが、バックボーンが修飾されているヌクレオチドでできているオリゴヌクレオチドの例である。
【００６４】
ハイブリダイゼーション反応は、直接的手段または間接的な手段など、任意な検出手段によって可視化できる。
【００６５】
直接的検出、すなわち標識化を介さない検出の場合、ハイブリダイゼーション反応は、プラズモン共鳴によってか、または導電性高分子を有する電極表面でサイクリックボルタメトリーによって観察される。
【００６６】
間接的検出、すなわち標識化による検出の場合、標識化は、標的核酸上に直接行うことも、前記核酸に特異的な、事前標識化された結合パートナーによって行うこともできる。
【００６７】
「標的核酸に特異的な結合パートナー」という表現は、標的核酸と結合できるいかなるパートナーも意味するものとし、例としては、核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび酵素基質が挙げられるであろう。
【００６８】
「標識化」という用語は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成できる標識の付着を意味するものとする。これらの標識の非限定的なリストは、例えば電気化学、比色定量、蛍光、ルミネッセンス、またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、α−ガラクトシダーゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素によって検出できるシグナルを産生する酵素；酵素阻害剤；酵素補因子；金粒子などの粒子、磁性ラテックス、リポソーム；ルミネッセンス化合物または発色化合物などの発色団、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉなどの放射性分子、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ（登録商標）、ウンベリフェロン、ルミノールまたはフィコシアニンなどの蛍光分子から成る。蛍光の場合、それは、酵素基質反応の蛍光産物、蛍光色素−クエンチャーの組合せ、蛍光消光、または蛍光特性に基づいた任意な他の系を用いるものでもよい。
【００６９】
例えば、別の対であるリガンド／アンチリガンド対を用いる、間接的な系も使用できる。リガンド／アンチリガンド対は、当業者にはよく知られており、例えば、以下の対、すなわち、ビオチン／ストレプトアビジン、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／上記ポリヌクレオチドに相補的な配列を挙げることができる。この場合、結合物質を保持しているのはリガンドである。アンチリガンドは、前の段落に記載した標識を介して直接的に検出可能であることも、リガンド／アンチリガンドを介してそれ自体検出可能であることもある。
【００７０】
これらの間接的検出系は、特定の条件下でシグナルの増幅をもたらしうる。このシグナル増幅技法は、当業者にはよく知られており、出願人による先行の特許出願である、ＦＲ−Ａ−２７８１８０２もしくはＷＯ−Ａ−９５／０８０００、またはＪ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：４８１〜４９１、１９９７の論文を参照できる。
【００７１】
標的核酸の事前標識化は、ポリメラーゼによって、もしくはキナーゼによって、末端でランダムに、もしくは特異的に、標識を直接的または間接的に取り込むことによって、または分子の「中」に取り込むことによって行うことができる。
【００７２】
標的分析物に特異的な結合パートナーの標識化は、当業者には広く知られており、例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１９９６、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、５２５Ｂ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ９２１０１ ＵＳＡによって記載されている。
【００７３】
使用される結合体の標識化のタイプに応じて、例えば酵素を用いて、当業者は、標識を可視化する試薬を添加するであろう。このステップが、明らかにすることに相当する。その前に、バックグランドノイズを制限するために、反応に関与しないか、または弱くもしくは非特異的に結合する分析物または成分の画分の除去を可能にする洗浄用緩衝液の使用が先行する。
【００７４】
本発明による装置の目的および利点は、図面を参照して、決して限定的なものではない以下の実施例に照らして、より明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の第１の実施形態による空気収集手段の縦断面の分解図である。
【図２】本発明の第１の実施形態による、微生物を収集するステップ中における、カートリッジがその中に置かれている空気収集手段の縦断面図である。
【図３】本発明の第１の実施形態による、核酸を回収する手段をカートリッジの中に装着する過程の初期段階における、カートリッジ、および核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図４】本発明の第１の実施形態による、核酸を回収する手段をカートリッジの中に装着する過程の進んだ段階における、カートリッジ、および核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図５】本発明の第１の実施形態による、核酸を回収する手段をカートリッジの中に装着する過程の最終段階における、カートリッジ、および核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図６】本発明の第１の実施形態による、微生物を機械的に溶解するステップ中における、カートリッジの中に装着された、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図７】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に汲み上げるステップ中における、カートリッジの中に装着された、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図８】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体すべてが、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に汲み上げられた場合における、カートリッジの中に装着された、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図９】本発明の第１の実施形態による、微生物を同定するための手段の提示中における、カートリッジの中に装着されている、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１０】本発明の第１の実施形態による、ひとたび、微生物を同定する手段がカートリッジと液体を介して連絡してからの、カートリッジの中に装着されている、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１１】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を、微生物を同定する手段の中に輸送する初期段階における、核酸を回収する手段−カートリッジ−微生物集合体を同定する手段の縦断面図である。
【図１２】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を、微生物を同定する手段の中に輸送した後における、核酸を回収する手段−カートリッジ−微生物集合体を同定する手段の縦断面図である。
【図１３】第２の実施形態による、微生物を収集するステップ中における、カートリッジが置かれている空気収集手段の縦断面図である。
【図１４】第２の実施形態による、対象とする液体を手操作で分配するステップ中における、カートリッジの縦断面図である。
【図１５】第２の実施形態による、微生物を機械的に溶解するステップ中における、カートリッジの中に置かれた、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１６】第２の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップ中における、カートリッジの中に置かれた、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１７】本発明による装置で、エアロゾル中に含有されている細菌を捕捉する能力の試験を意図する試験台の機能的スキームを表す図である。
【図１８】本発明による装置の収集効率を、生成されたエアロゾル粒子のサイズの関数として示すグラフである。
【図１９】本発明による装置を用いた細菌溶解効率と、従来技術の代替方法を用いたものとを比較するグラフである。
【図２０】本発明による装置で、様々な懸濁液中に含有されている細菌を溶解し、かつ核酸を回収した後における、これらの細菌の、リアルタイムＮＡＳＢＡ技法を用いたリアルタイム検出を示すグラフである。
【図２１】本発明による装置で、様々な全血試料中に含有されている細菌を溶解し、かつ核酸を回収した後における、これらの細菌の、リアルタイムＮＡＳＢＡ技法を用いたリアルタイム検出を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
第１の実施形態によれば、本発明による装置を構成する第１のエレメントは、空気収集手段１０である。この手段は、上部エレメント１２および下部エレメント１４で構成されている。上部エレメント１２は、通常、円筒状の形態を有する。この円筒の下端は開いているが、上端は、水平な壁１３によって部分的に閉じている。その中央部では、この壁１３は、ダクト１８によって上部エレメント１２の内側に伸長するオリフィスを有し、ダクト１８の基部は実質的に円錐の形態である。実際、この部分は、空気収集手段１０の中への空気吸入ダクトを構成している。特定の一実施形態によれば、この空気吸入ダクトは、任意な適切な手段によって空気再循環回路のパイプに接続できる。
【００７７】
空気収集手段１０は、例えば１０〜４０ｍｍの間、好ましくは２０ｍｍの外径を有しうる。空気吸入ダクトの内径は、例えば６ｍｍである。
【００７８】
この空気収集手段１０は、有利には、とりわけオートクレーブによって、殺菌できる物質で作られたものでありうる。したがってそれは、アルミニウムまたは鋼鉄などの金属でできたものでありうる。それは、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）などの高分子でできたものでもありうる。
【００７９】
上部エレメント１２の垂直な環状壁２０の下端は、その外面上に肩２０１を含む。この凹みは、壁２０の周縁全体にわたって作られている。それは、上部エレメント１２と下部エレメント１４との連結を容易にするように意図されている。
【００８０】
下部エレメント１４も、通常、円筒状の形態である。この円筒の上端は開いているが、下端は、その中央に実質的に円筒状の空気放出ダクト２２を含む水平な壁２１によって部分的に閉じており、前記ダクトの基部は、上記水平な壁と一体化している。ダクト２２の下端は開いている。このダクトは、下部エレメント１４の内部と連絡しており、それによって、ダクト２２は、空気収集手段１０の上部エレメント１２と下部エレメント１４とが連結された際に、空気吸入ダクト１８によって空気収集手段１０の中に入れられた空気の放出ダクトの役割を果たしている。
【００８１】
下部エレメント１４の垂直な環状壁２４の上端は、その内面上に肩２４１を含む。この肩は、壁２４の周縁全体にわたって作られている。壁２０および壁２４の端は相補的な形の断面を有しており、一体に装着するのを容易にしているという事実により、それも、上部エレメント１２と下部エレメント１４との連結を容易にするように意図されている。まず第１に、この連結が可逆的であるということが重要である。ひとたび一体に装着されれば、エレメント１２およびエレメント１４は、相互に取り外し可能であるべきである。
【００８２】
エレメント１２とエレメント１４とを連結する代替の手段は、一方のエレメントをもう一方のエレメントにねじ入れることによって連結するものでありうる。このためには、エレメント１２またはエレメント１４のうちの一方の壁の端は、雄ネジを保持し、かつ第２のエレメントの壁の端は、対応するメスネジを保持しうる。
【００８３】
重要なことは、空気のいかなる寄生流入も防止するために、収集手段が密閉されていることである。
【００８４】
特定の１モードの空気収集手段の使用によれば、空気放出ダクト２２の下端を空気吸引ポンプ（表示されていない）または任意の他の同等なポンピング手段に接続することができる。このポンプは、それが望ましい場合に、例えば、病室、または医薬製品もしくは食品加工産物を生産するための部屋などの所与の環境における、環境空気の分析を行うために、空気収集手段の中への環境空気の吸入を可能にする。このためには、自律的に作動するポンピング手段を有することが好ましい場合がある。
【００８５】
図２は、その作動中に、カートリッジ３０と組み合わされている空気収集手段１０を表す。この図で見て取れるように、カートリッジ３０は、空気収集手段１０の内側に配置されている。これを行うため、空気収集手段１０を構成するエレメント１２およびエレメント１４が分離される。カートリッジ３０は、空気収集手段１０の下部エレメント１４の中に保持されるように置かれる。その後、上部エレメント１２を、下部エレメント１４の上に再配置し、これら２つの手段を連結する。空気収集手段１０およびカートリッジ３０で構成されている集合体は、その後、上述の通り、空気収集手段１０の内部の空気の循環を引き起こすために、再循環回路またはポンピング装置に接続される。
【００８６】
縦断面で、図２に表されているカートリッジ３０は、実質的に環状な横断切片を有する円筒の一般的形態を有する。この円筒の上端は開いているが、下端は、中心にオリフィスを有する壁で構成されており、前記オリフィスの伸長方向に沿って、カートリッジ３０の内側に伸長するダクト３２が存在する。このダクトの内部断面は、それがダクトの上端に接近するに従って、より小さくなる傾向があることが見出される。さらに、このダクトの下端は膜３４によって閉じており、それが隔壁の役割を果たしていることも見出される。膜３４を構成する物質は、先端のとがった物体を用いた単純な圧力によって押し破かれるのに適している。この過程は、図９および１０に関連して下記で説明する。この物質は、例えば、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）またはポリカーボネートである。
【００８７】
図２で見て取れるように、カートリッジ３０の下壁３５の内側表面は傾斜上にあり、この傾きの最低点はダクト３２と接触しており、最高点はカートリッジ３０の垂直な壁３６と接触している。この壁３５は、溶解手段３８の支持体として働き、微生物保持ゾーンを構成する。これらの溶解手段は、この場合、同一サイズのビーズによって構成される。好ましい一実施形態によれば、これらのビーズは、ガラスでできている。さりとて、それらは、鉄など、いかなる他の同等な物質でも構成されうるであろう。これらのビーズは、２００〜８００マイクロメートル（μｍ）の間の直径を有すると有利である。
【００８８】
有利な一変形形態によると、ビーズは、異なったサイズのものでありうる。すなわち、直径が２００〜３００μｍの間のビーズと、直径が４００〜６００μｍの間のビーズとの混合物を使用することが、とりわけ適している可能性がある。
【００８９】
ビーズは、１（または複数の）層のビーズが埋め込まれている層の形態で堆積しているゲル状物質によって、１または複数の重ねられた層の形態で適所に保たれる。このゲル状物質は、いくつかの制約条件を満たすべきである。第１は、カートリッジ内部で行われる過程に影響を与えないように、それが不活性であるべきであるということである。第２は、微生物溶解を実施するためにそれが捕捉している粒子を放出させるために、液体中への溶解能をそれが有するべきであるということである。そのような物質は、例えば、アガロースでありうる。
【００９０】
代替として、ゲル状物質は、有利には微生物用の培養培地でありうる。実際、寒天培養培地は、従来より、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野で極めて長い間使用されてきている。そのような培養培地の使用にはいくつかの利点がある。主な利点は、微生物の増殖段階を、後者の溶解が実行される前に可能にすることである。本発明による装置は、病原微生物の迅速な検出に結びついた必要性を満たそうとするものであるが、それでも、数分間から数時間の増殖段階によって、微生物の増殖が可能となるであろうことはそのままであり、それは、より多量の核酸を有するという直接的な効果を有する。培養培地の使用の第２の利点は、後者が、所与の１または複数の種に合わせて選択できることである。それにより、そのような培地の使用は、対象でない他の微生物および分析を妨害しうる他の微生物を阻害する、特定の病原微生物の選択的増殖と、それゆえ、それらの選択的検出とを可能にしうることになる。したがって、それぞれが特定種の微生物の検出に適している数通りの専門化したカートリッジを有することが企図できる。
【００９１】
カートリッジ３０の寸法は、内径に関して、例えば８〜１６ｍｍでありえ、１２ｍｍが好ましい。ビーズ層の全厚は、通常１〜２ｍｍであり、これは、０．４〜１グラムの間のガラスビーズの量に相当する。
【００９２】
カートリッジ３０は、注入成形技法を用いて作製すると有利である。例えば、使用される物質は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはＰＭＭＡである。
【００９３】
空気収集手段中の空気の循環が始まった際に、前記空気が従う進路は、図２中の矢印によって表されている。したがって、空気は、空気吸入ダクト１８を介して空気収集手段１０に入ることが見出される。カートリッジ３０のダクト３２は、空気吸入ダクト１８の中に部分的に挿入されているので、後者内の気流は、ダクト３２の最上部で周辺流に変換されるようになる。これは、ダクト３２の上端が実質的に円錐の形態であるという事実によって説明される。さらに、ダクト３２の基部の膜３４の存在は、ダクト３２が極めて迅速に増圧状態になるので、空気がダクト３２の中に貫入するのを防止する。吸入ダクト１８の壁と、ダクト３２の壁との間の間隙空間は、ダクト３２の端が円錐形であることによって、突然狭くなっているので、周辺気流の加速がある。それにより、後者がビーズ３８の上部層に衝突し、ゲル状物質または培養培地の表面において、圧入により、この部位における、気流中で輸送されていた微生物の残留をもたらすことになる。したがって、そのような過程は、エアロバイオコレクターで起こるものに比較的類似している。
【００９４】
空気は、ポンピング手段によって吸引されて、それとしては、その経路を継続する。それは、カートリッジ３０の垂直な壁３６の内面に沿って昇り戻り、このレベルで、循環経路が広くなることによって減速する。それは、この同じ壁の外面に沿って再降下し、再び空気放出ダクト２２の入り口で集中流に変換されるようになり、前記空気放出ダクトを介して空気収集手段１０から外に出る。
【００９５】
空気収集手段１０内の、収集される空気の流速は、例えば、２０〜１００リットル／分（ｌ／ｍｉｎ）の間でありうる。それは、５０ｌ／ｍｉｎが有利である。
【００９６】
ひとたび、カートリッジ内で微生物保持／濃縮ステップが実施されたならば、ずらすか、またはねじをゆるめてはずすことによって、空気収集手段の上部エレメント１２および下部エレメント１４をはずすことによって、カートリッジを前記手段から取り出す。
【００９７】
この段階で、カートリッジ内に濃縮された微生物を培養することが望ましい場合には、３７℃のインキュベーター内で前記カートリッジをインキュベートする機会がある。上記に既述の通り、このインキュベーションは通常、分析時間が大幅に延長されすぎないように、数十分間から数時間続けられる。さりとて、分析結果の取得が緊急でない場合には、細菌増殖の制約条件により適した、さらに長い時間、すなわち約２４時間にわたって、カートリッジをインキュベートすることが企図されうる。
【００９８】
同様に、分析を延期することが望ましい場合には、低温室など、この貯蔵に適した環境でカートリッジを保存することも企図されうる。
【００９９】
本発明の一変形形態によると、カートリッジ３０は、空気収集手段１０に直接置かれた状態で提供されうる。このタイプの提示は、使用者が空気収集手段内にカートリッジを置かなければならいことを回避し、それゆえ、このステップの間における汚染の危険性を低減するという利点を有する。空気収集手段１０がカートリッジ３０と同じ物質、すなわち、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたはＰＭＭＡでできていることは、この状況では、とりわけ有利である。したがって、注入成形による製造がとりわけ適している。
【０１００】
分析が行われる場合、カートリッジ３０は、図３に表されている通り、核酸を回収する手段４０と連結される。前記手段は、矢印Ａによって表される垂直方向の並進運動に従って、カートリッジ３０の開いている端を介してカートリッジ内に挿入される。
【０１０１】
図３の縦断面に表されている、核酸を回収する手段４０は通常、円形断面を有する円筒形のボディー４２を含む。ボディー４２は、その外壁の上部に肩４３を有し、その機能は、核酸を回収する手段がカートリッジ３０に完全に挿入された場合に、カートリッジ３０の垂直な壁３６の上端に対して押されることによって、カートリッジ３０−核酸を回収する手段４０集合体がリークタイトとなることを確実にすることである。さらに、ボディー４２の外壁は、その最上部にいくつかの連続した凹みを有する。肩４３それ自体の下に位置する凹み４４は、図５に表されているように、手段４０がカートリッジ３０の中に完全に挿入された場合、垂直な壁３６の上端で作られている肩４５に対して押されるので、肩の役割を果たす。凹み４４の下に配置されている第２の凹み４６は、ボディー４２の垂直な壁の外面と、カートリッジ３０の垂直な壁３６の内面との間に間隙空間が残るように、それとしては、ボディー４２の直径が低減することを可能にする機能を有する。この空間の役割は下記で説明されるであろう。さらに、これらのすべての肩および凹みは、カートリッジ３０および核酸を回収する手段４０で構成される集合体がリークタイトであることを強化することを可能にしている。
【０１０２】
その基部で、ボディー４２は、その中央の位置に、空洞４７を有し、それは、円形断面を有する実質的に円筒状の形態であり、その上端は、実質的に円錐の形態である。同様に、それは、その上部における中央の位置に空洞４８を含む。この空洞４８は、円形断面を有する実質的に円筒状の形態であり、その下端が実質的に円錐の形態であり、対象とする液体５０が入れられる貯蔵ゾーンを構成する。この液体は、ガラスビーズ３８の再懸濁を可能にし、それだけでなく、ひとたび微生物が溶解されたならば、核酸の回収も可能にする。したがって、この液体は、一方では微生物に関して不活性であり、かつもう一方では核酸に関しても不活性であり、それだけでなく生物学的プロトコールに関しても不活性であることが重要である。したがって、この対象とする液体は通常、生物学的プロトコールの実施に適した緩衝液である。空洞４７の中に含有される、対象とする液体の容積は、例えば、０．１〜０．４ミリリットル（ｍｌ）の間でありうる。
【０１０３】
対象とする液体がその役割を果たすことを可能にするために、空洞４８は、プランジャー５２および垂直位置にある腕５４で構成されている汲み上げ／送達手段と協働し、プランジャー５２の形態は空洞４８の下部に相補的であり、腕５４はプランジャー５２と一体になっており、かつ空洞４８の外側方向に伸長している。この腕の、プランジャー５２に付着しているのとは反対側にある端は、汲み上げ／送達手段を、実質的に垂直な運動によって並進的に駆動する手段（表されていない）を連結できる特定の形態の頭部を有しうる。この駆動手段は、自動化された手段であることが好ましい。
【０１０４】
空洞４８は、空洞４７の上端に空洞４８の下端を接続するチャネル５６によって、空洞４７と液体を介して連絡している。図３では、空洞４７の上端に配置されている膜５８によって、チャネル５６が閉じており、空洞４７が空になるのを防止している。この膜も、穿孔できる物質でできている。詳細には、この膜は、カートリッジ３０のダクト３２の上端によって穿孔されうる。
【０１０５】
図４に示す通り、核酸を回収する手段４０の外側形態は、カートリッジ３０の内部形態に完全に相補的である。それにより、手段４０は、カートリッジ３０内部に完全に収まり、ダクト３２は、それ自体を空洞４７の中に挿入することによって、ガイドの役割を果たすことになる。手段４０は、手段４０の下壁６０がビーズ３８に対して押されるまで入れられる。
【０１０６】
この段階で、図５に表されている矢印Ｂに従った、核酸を回収する手段のボディー４２と、同時に、汲み上げ／送達手段とへの圧力運動がある。汲み上げ／送達手段のこの並進運動は、チャネル５６を介した、対象とする液体５０の、空洞４７への送達、より詳細には、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間への送達をもたらす。液体によって膜５８に加えられた圧力が前記膜の穿孔または離脱をもたらすので、この送達は可能である。その後、対象とする液体５０は、ガラスビーズ３８が位置しているカートリッジの保持ゾーンへと移動し、このゾーンを満たし、ビーズを捕捉しているゲル状物質の懸濁を行い、それによって、汲み上げ／送達手段によって生成される、対象とする液体の流れにのって、ビーズが、核酸を回収する手段４０とカートリッジ３０の間の間隙空間６２に運ばれる。この間隙空間は、６００〜８００μｍの間の幅を有することが好ましいことに留意するべきである。この幅は、使用されるビーズ３８の直径に直接的に結びついている。詳細には、ビーズは、この空間内で容易に循環可能であるべきであるが、核酸を回収する手段４０による回転も可能であるべきである。このためには、ボディー４２の外側の垂直な壁６４が粗表面を有し、それがビーズの回転を容易にすることが好ましい。
【０１０７】
ひとたび、すべてのビーズがボディー４２の外側の垂直な壁６４に沿って配置されたならば、核酸を回収する手段をカートリッジの中に完全に挿入し、それによって、図５に表されている通り、それぞれカートリッジ３０の壁の端および肩４５に対して押されるとりわけ肩４３と４４の効力によって集合体をリークタイトにすることができる。
【０１０８】
当然ながら、ゲル状物質の表面およびビーズの表面に保持されている微生物は、ビーズ３と同様に、対象とする液体の流れによって、間隙空間６２に輸送される。
【０１０９】
対象とする液体の輸送に関しては、対象とする液体がチャネル５６の中に押し込まれる際に、ダクト３２内に含有されている空気が放出されるのを、ダクト３２の基部の膜３４の存在が防止するようである。それにより、捕捉された空気によってダクト３２内に生成される圧力によって、対象とする液体のダクト内への流入が防止され、それゆえ、前記対象とする液体が空洞４７の内壁と前記ダクト３２の外壁との間の間隙空間に浸潤することになる。
【０１１０】
ひとたび、ビーズ３８がボディー４２の外側の垂直な壁６４に沿って分布され、かつ核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体が連結されたならば、溶解ステップそれ自体が開始される。このステップは、図６に表されている。この図で見て取れるように、核酸を回収する手段４０は、矢印Ｃによって表されている方向に回転させる。このために、核酸を回収する手段４０のボディー４２は、任意の適した機械的共役手段によって、自動化された装置と連結されている。そのようなシステムは、とりわけ、回転速度の正確な調整を可能にする。
【０１１１】
さりとて、核酸を回収する手段を手操作で回転させることも企図できる。このために、把持手段（表されていない）をボディー４２の上部に明確に提供することもできる。それにより、一方の手でカートリッジ３０を持ちながら、これらの把持手段をもう一方の手で掴むことができる。
【０１１２】
例として、回転速度値は、３００〜２０００ｒｐｍの間、好ましくは１０００ｒｐｍでありうる。
【０１１３】
回転時間は、それとしては、通常１〜２分の間である。
【０１１４】
これらの２つのパラメータの選択が、溶解することが意図されている微生物のタイプに依存していることはかなり明白である。すなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタイプの酵母を溶解するには、最適溶解条件は、２分間の１０００ｒｐｍと等しい回転速度からなる。
【０１１５】
このステップ中に、ビーズ３８は、核酸を回収する手段のボディー４２に対する摩擦によって、対称軸の周りで回転させられる。この二重回転によって、ビーズ３８とボディー４２との間に捕捉されている微生物の機械的な溶解がもたらされる。これは、対象とする液体中への核酸の放出をもたらす結果となる。
【０１１６】
ひとたび、溶解ステップが完遂され、核酸が放出されれば、対象とする液体は、図７に表されている通り、汲み上げ／送達手段によって、空洞４８の中に汲み上げられる。詳細には、腕５４での牽引の任意の適した自動または手動手段による矢印Ｄに従った垂直方向の並進によって、汲み上げ／送達手段を移動させる。上記手段のこの並進運動は、空洞４８への、対象とする液体５０の汲み上げをもたらす。この汲み上げの間、対象とする液体は、溶解ステップの前におけるその送達中にそれが従った進路の逆の進路に従う。詳細には、それは、核酸を回収する手段４０とカートリッジ３０との間の間隙空間の中へと進行し、チャネル５６を昇り戻り、空洞４８の中に到達する。図７および８で見ることができるように、空洞４８を満たす、対象とする液体には、微生物の標的核酸７０が負荷されている。
【０１１７】
核酸を回収する手段４０はカートリッジ３０に完全に挿入されるので、ビーズを含まない微生物保持ゾーンの役割を果たす、前記手段４０の下壁６０とカートリッジの底部との間に位置する間隙空間は、ビーズ３８の移動を可能にするには十分に大きくない。それにより、ビーズ３８は、ボディー４２の垂直な壁６４に沿って配置されたまま残ることになる。
【０１１８】
同様に、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間は、フィルターの役割を果たすのに、とりわけ溶解ステップ中に産生される細胞破片を保持するのに、とりわけ適している。これは、カートリッジの製造中および核酸を回収する手段の製造中に、この間隙空間のサイズが、とりわけよく制御され、かつフィルタリング効果を最適化するようなやり方で、前記カートリッジおよび前記核酸を回収する手段の寸法を調整できるためである。
【０１１９】
ひとたび、対象とする液体がすべて空洞４８の中に汲み上げられたならば、前記液体を生物学的分析装置に輸送することが企図できる。この輸送は、分析装置の中へと直接的に行うことも、その最終エレメントが分析装置である流体回路の中へと行うこともできる。
【０１２０】
対象とする液体を装置の中に直接的に輸送する場合、（１または複数種の）微生物を同定するためのすべての核酸処理ステップが、装置それ自体の中で行われることが企図されている。したがって、例えば、装置の中で、標的核酸の増幅、これらの標的核酸の切断および標識化、および相補配列とのハイブリダイゼーションによる、その検出を行うことが企図されうる。
【０１２１】
図９では、流体分析装置８０が部分的に縦断面で表されている。この装置８０は、その上部に、核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体に流体を介して接続するための優先ゾーン８２を含む。優先接続ゾーン８２は通常、円錐の形態、より詳細にはダクト３２の形態に相補的である。その最上部で、それは、装置８０の内部流体回路８６へのアクセスを得るための開口部８４を有する。この図９で表されるように、流体分析装置８０は、矢印Ｅに従って、優先接続ゾーン８２を核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体の基部まで、詳細には、ダクト３２を閉じている膜３４のレベルまで持ち上げることによって、前記集合体に接続される。優先接続ゾーン８２の端はとがっているので、後者が膜３４と接触する際に、それは前記膜に穿孔し、ダクト３２へのアクセスを開く。その後、分析装置８０は、図１０に表すように、それが接触状態になるまで、すなわち、優先接続ゾーンの外壁がダクト３２の内壁に接触するまで、ダクト３２の中に挿入される。核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体に、分析装置８０がそのように接続された場合、優先接続ゾーン８２の端がチャネル５６の下端と接触するようになることが見出される。それにより、優先接続ゾーン８２の上部で、流体装置８０の壁が、チャネル５６と、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間との間の液体を介した連絡を断ち切ることになる。
【０１２２】
それにより、標的核酸７０で負荷されている、対象とする液体５０を操作者が分析装置８０の中に輸送しようとする際に、再び、矢印Ｂに従った空洞４８への垂直な推進によって前記手段が移動するように、汲み上げ／送達手段の腕５４に圧力を加えることが十分となる。これは図１１に表されている。
【０１２３】
汲み上げ／送達手段の移動によって、空洞４８を空洞４７に接続するチャネル５６への、対象とする液体５０および核酸７０の輸送がもたらされる。チャネル５６は、優先接続ゾーン８２の開口部８４によって、流体分析装置８０の内部流体回路８６と液体を介して直接的に連絡しているので、対象とする液体は、その後、前記液体が外部環境と接触するようになるいかなる危険性もなく、分析装置８０の中に直接的に輸送される。チャネル５６と、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間との間の液体を介したいかなる連絡も遮断されているので、核酸を回収する手段４０とカートリッジ３０との間の間隙空間の中に、対象とする液体が漏れる危険性もない。これは図１２で表されている。
【０１２４】
ひとたび、対象とする液体５０および核酸７０のすべてが流体分析装置８０に輸送されたならば、核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体から前記装置を取り外すことができる。上記集合体は使用済みなので、それらは廃棄される。流体分析装置８０は、それとしては、微生物の同定を行うのに後で使用される。
【０１２５】
有利な一実施形態によれば、図１〜１２に関連して上述したすべてのステップ、とりわけ微生物溶解、核酸抽出、および流体分析装置への前記核酸の輸送に結びついたステップをアドホックシステムによって自動化できる。
【０１２６】
図１３〜１６は、本発明による装置の第２の実施形態を表す。考慮されている装置は、第１の実施形態による装置より簡易な設計を有する。
【０１２７】
この第２の実施形態による装置も、空気収集手段９０を含む。この手段は、上部エレメント９２および下部エレメント９４で構成されている。上側のエレメント９２は通常、円筒状の形態である。この円筒の下端は開いているが、上端は、水平な壁９３によって、部分的に閉じている。この壁９３は、その中央で、ダクト９８によって上部エレメント９２の中に伸長するオリフィスを有し、ダクト９８の基部は、実質的に円錐の形態である。実際、この部分は、空気収集手段９０の中への空気吸入ダクトを構成している。特定の一実施形態によれば、この空気吸入ダクトは、任意の適切な手段によって、空気再循環回路のパイプに接続できる。
【０１２８】
その下部に、ダクト９８は、スクリーン９９を含む。このスクリーンの機能は、空気収集手段９０の内側における気流の均等な分布を可能にすることである。
【０１２９】
上部エレメント９２の垂直な環状壁１００の下端は、その外面上に肩１００１を含む。この凹みは、壁１００の周縁全体にわたって作られている。それは、上部エレメント９２と下部エレメント９４との連結を容易にするように意図されている。
【０１３０】
下部エレメント９４も、通常、円筒状の形態である。この円筒の上端は開いているが、下端は、その中央に実質的に円筒状の空気放出ダクト１０２を含む水平な壁１０１によって、部分的に閉じており、前記ダクトの基部は、上記水平な壁と一体化している。ダクト１０２の下端は開いている。このダクトは、下部エレメント９４の内部と連絡しており、それによって、空気収集手段９０の上部エレメント９２と下部エレメント９４とが連結した際に、ダクト１０２は、空気吸入ダクト９８によって、空気収集手段９０の中に入れられた空気の放出ダクトの役割を果たしている。
【０１３１】
下部エレメント１４の垂直な環状壁１０４の上端は、その内面上に肩１０４１を含む。この肩は、壁１０４の周縁全体にわたって作られている。壁１００および壁１０４の端は相補的な形の断面を有しており、一体に装着するのを容易にしているという事実により、それも、上部エレメント９２および下部エレメント９４を一体に装着するのを容易にするように意図されている。第一に、この一体の装着が可逆的であることが重要である。ひとたび一体に装着されれば、エレメント９２およびエレメント９４は、相互に取り外し可能であるべきである。
【０１３２】
エレメント９２およびエレメント９４を一体に装着する代替の手段は、一方のエレメントをもう一方にねじ入れることによって、一体に装着することでありうる。このためには、エレメント９２またはエレメント９４のうちの一方の壁の端は、雄ネジを保持し、かつ第２のエレメントの壁の端は、対応するメスネジを保持しうる。
【０１３３】
重要なことは、空気のいかなる寄生流入も防止するために、収集手段が密閉されていることである。
【０１３４】
特定の１モードの空気収集手段の使用によれば、空気放出ダクト１０２の下端を空気吸引ポンプ（表示されていない）または任意の同等なポンピング手段に接続することができる。
【０１３５】
カートリッジ１１０は空気収集手段９０の中に配置される。これを行うには、空気収集手段９０を構成するエレメント９２とエレメント９４とが分離される。カートリッジ１１０は、空気収集手段９０の下部エレメント９４の中に保持されるように置かれる。その後、上部エレメント９２を、下部エレメント９４の上に再配置し、これら２つの手段を連結する。空気収集手段９０およびカートリッジ１１０で構成されている集合体は、その後、上述の通り、空気収集手段１０の内部の空気の循環を引き起こすために、再循環回路に接続されるか、またはポンピング装置に接続される。
【０１３６】
縦断面で表されているカートリッジ１１０は、低い高さと、実質的に環状の横断面と有する円筒状の一般的形態を有する。この円筒の上端は開いているが、下端は、壁１１２で構成されている。この壁１１２は、溶解手段１１８の支持体として働き、微生物保持ゾーンを構成する。これらの溶解手段は、上述の通り、ビーズで構成されている。ビーズは、上述の通り、１（または複数の）層のビーズが埋め込まれている層の形態で堆積しているゲル状物質によって、１または複数の重ねられた層の形態で適所に保たれる。
【０１３７】
空気収集手段中の空気の循環が始まった際に、前記空気が従う進路は、図１３中の矢印によって表されている。したがって、空気は、空気吸入ダクト９８を介して空気収集手段９０に入ることが見出される。スクリーニング９９の効力によって、空気は、均等に分布され、かつビーズ１１８の上部層に衝突し、ゲル状物質または培養培地の表面において、圧入により、この部位における、気流中で輸送されていた微生物の残留をもたらす。
【０１３８】
空気は、それとしては、ポンピング手段によって吸引されて、その経路を継続する。それは、カートリッジ１１０の壁の内面に沿って昇り戻る。それは、この同じ壁の外面に沿って再降下し、再び空気放出ダクト１０２の入り口で集中流に変換されるようになり、前記空気放出ダクトを介して空気収集手段９０から外に出る。
【０１３９】
ひとたび、空気収集が行われたならば、空気収集手段９０のエレメント９２およびエレメント９４がはずされ、カートリッジ１１０が回収される。
【０１４０】
その後、図１４に表しているように、対象とする液体の分配ステップが行われる。このステップ中に、マニピュレーターが、図１４に部分的に表されているピペット１２２を用いて、所与の容積の、対象とする液体１２０をカートリッジ１１０内に入れる。上記に説明した通り、対象とする液体は、例えば、溶解緩衝液でありうる。対象とする液体と、ビーズを捕捉しているゲル状物質との間の接触によって、前記物質の懸濁と、それゆえビーズそれら自体の懸濁とがもたらされる。カートリッジ１１０に入れられる、対象とする液体の容積は、例えば、０．５ｍｌでありうる。
【０１４１】
ひとたび、このステップが行われれば、マニピュレーターは、核酸を回復する手段１２４をカートリッジ１１０の中に入れる。第１の実施形態で記述した手段４０とは異なり、手段１２４は、汲み上げ／送達手段も、対象とする液体を受容できる空洞も含まない。この手段１２４は、実質的に円筒状の横断面を有し、上部に優先把持ゾーン１２６を有する。手段１２４の下壁１２８は、実質的に平らであり、ビーズに対して押される。その後、矢印Ｆの方向で、手段１２４を対称軸の周りで回転させることによって、マニピュレーターが溶解を行う。壁１２８の回転は、対称軸の周りにおける、ビーズ１１８の回転をもたらす。この二重回転によって、ビーズ１１８と壁１２８との間に捕捉されている微生物の機械的な溶解がもたらされる。これによって、対象とする液体中への核酸の放出がもたらされる結果となる。
【０１４２】
ひとたび、溶解ステップが完遂され、核酸が放出されれば、前記核酸７０で負荷されている、対象とする液体は、図１６に表されているように、ピペット１２２によって、マニピュレーターが汲み上げる。
【０１４３】
ひとたび、対象とする液体すべてがピペットに入れば、上述の通り、分析装置内で様々な核酸処理ステップを行うために、前記液体を分析装置に輸送することができる。それは、保存するために容器の中に入れることも、核酸処理ステップの前のステップを行うことが意図されている任意な装置の中に入れることもできる。そのようなステップは、例えば、依然として存在している細胞成分からそれらを分離することによって、核酸を濃縮することが意図されている精製ステップでありうる。本発明による装置が第２の実施形態で使用される場合、第２の実施形態が簡易設計であることによって、核酸で負荷されている、対象とする液体は、第１の実施形態による装置で行われ、かつ上記に説明したいかなる濾過も施されていないので、そのようなステップは、とりわけ重要である。
【実施例】
【０１４４】
実施例１
本発明による装置を用いた、エアロゾル中に含有されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率の測定
この測定を行うために、リークタイト試験台を設計した。この試験台は図１７に表されている。それは、エアロゾル発生器２０２によって、エアロゾルが入れられる密閉空気回路２００で構成されている。この発生器は、既知濃度の胞子懸濁液から、一定量のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＣＩＰ５２．６２）胞子を気流中に導入することを可能にする。適したエアロゾル発生器は、例えば、ＴＳＩ社によって販売されている。空気は、吸引ポンプ２０４によって、回路内を循環する。空気中に含有されている粒子、とりわけほこりの粒子の除去を可能にするために、３枚のＴＨＥフィルター２０６が回路に沿って存在している。圧力計２０８は、回路内の圧力の確認を可能にし、２つの流量計２１０は、回路内における空気の流速の確認を可能にする。本発明による装置は、２１２として参照されている。それは、空気収集手段１０で構成されており、その中に、カートリッジ３０が置かれている。この収集手段は、上記に説明した通り、空気回路に接続されている。最後に、空気回路内の２つの試料採取源が、装置２１２のすぐ上流と、すぐ下流とに配置されている。これらのレベルで試料採取された空気は、一定の画分の形態で、粒子すなわち画分中に含有されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の空気力学測定を行うために、スペクトロメーター２１４に送られる。このスペクトロメーターは、ＴＳＩ社販売のＡｅｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ（登録商標）モデル３３２１である。スペクトロメーターへ送られる、この補助回路の中への空気の輸送は、バルブ２１６によって行われ、これらによって、装置２１２の上流または下流における試料採取を容認または防止することを可能にする。上流画分および下流画分の差分解析は、本発明による装置によるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率を計算することを可能にする。
【０１４５】
本発明による装置を通過する空気の流速は、制御された湿度および温度条件（２５℃、３５％の相対湿度）下で、５０ｌ／ｍｉｎである。この流速はポンプ２０４によって得られる。
【０１４６】
本発明による装置の捕捉効率を、以下の２つの条件下で試験した。
−ビーズ３６がゲル状物質なしでカートリッジ内に配置されているカートリッジを用いた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率の測定。
−ビーズ３６がカートリッジ内に配置され、かつグリセロールの薄膜コーティングで覆われているカートリッジを用いた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率の測定。この産物は、十分に高粘着性であり、収集皿へのエアロゾルの良好な接着を提供し、かつ後続の分子分析を概ね妨げない。
【０１４７】
グリセロールの存在下および非存在下で得られた結果を図１８に示す。この図では、発生器２０２によって生成されたエアロゾル粒子の直径の関数として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の収集効率を相関させることが可能である。
カートリッジ内にビーズ３６を覆うゲル状物質が存在しない場合、本発明による装置による胞子収集効率が、最大７０％超にまで及びうるようである。
カートリッジ内にビーズ３６を覆うゲル状物質が存在する場合、収集効率は、９０％超にまで上昇する。
グリセロール型のゲル状物質の存在下における収集効率の増大は、胞子がこの物質に固着したまま残るという事実によって説明される。ゲル状物質の非存在下では、ビーズ表面で胞子が跳ね返って、それによって、それらがビーズに固着したまま残るのを阻止する現象がわずかに起こる。
【０１４８】
実施例２
本発明による溶解方法と代替方法との間の比較による溶解効率の測定
この場合、以下の３通りの溶解方法が、本発明による方法と比較される。
−ＦａｓｔＰｒｅｐ（商標）装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社販売のＦＰ１２０型、ＢＩＯ１０１）を用いた機械的溶解方法。
−リゾチームを用いた酵素的溶解方法。
−細胞懸濁液を９０℃に加熱するステップおよびそれに続く細胞の凍結溶解３ステップを組み合わせた、カオトロピック試薬（グアニジウムイソチオシアネート、ＧｕＳＣＮ）を用いた方法。
この実施例では、使用される細胞は、懸濁液中のＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓである。
溶解ステップの後に、出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出システムを用いて、回収した核酸を精製する。精製された核酸は、最後に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ検出方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて定量化される。比較試験の正確なステップを以下に記載する。
【０１４９】
−ステップ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ懸濁液の調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの培養は、ＴＳＡ（トリプチケースソイ）プレートの寒天培養培地上で行う。細菌コロニーを寒天上に回収し、出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３（参照番号２８０１３２）中で洗浄する。ひとたび細胞が洗浄されたならば、波長６００ｎｍで光学濃度０．５を有する細菌懸濁液を得るために、それらを同じ抽出緩衝液５ｍｌで希釈する。
【０１５０】
−ステップ２ａ：ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）装置を用いた溶解
１ｇのガラスビーズの混合物（等しい割合の様々なサイズ、すなわち１５０〜２１２μｍ、４２０〜６００μｍおよび７００〜１１８０μｍのビーズ）で満たされた２ｍｌチューブに、細菌懸濁液０．５ｍｌを移す。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）装置を最高回転速度で（６．０に設定）６０秒間使用する。ひとたび溶解が完了したならば、精製ステップを行うために、溶解物１００μｌをＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５１】
−ステップ２ｂ：本発明による装置を用いた溶解
細菌懸濁液０．３ｍｌを上述したカートリッジ１１０と同等なカートリッジ内に移す。このカートリッジは、その後、ガラスビーズの混合物（等しい割合の様々なサイズ、すなわち１５０〜２１２μｍ、２１２〜３００μｍおよび４２０〜６００μｍのビーズ）０．４ｇで満たされる。このカートリッジを、核酸を回収する手段と接触させる。後者を２０００ｒｐｍで２分間、回転させる。ひとたびこの溶解ステップが行われたならば、精製ステップを行うために、溶解物１００μｌをＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５２】
−ステップ２ｃ：酵素的溶解
リゾチームを用いたこの溶解方法では、細菌懸濁液１００μｌをリゾチーム溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと混合する。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。このインキュベーションの後、精製ステップを行うために、全溶解物（２００μｌ）をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５３】
−ステップ２ｄ：カオトロピック溶解
細菌懸濁液１００μｌをＧｕＳＣＮの濃縮溶液（５ｍｏｌ／ｌ）１００μｌと混合し、全混合物を３０分間インキュベートする。このインキュベーションの後、精製ステップを行うために、全溶解物（２００μｌ）をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５４】
−ステップ３：ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置を用いた、溶解物の精製
精製ステップは、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置の汎用抽出プロトコールを用いて行う。出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）溶解緩衝液（参照番号２８０１３４）２ｍｌ、および出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）磁性シリカ粒子（参照番号２８０１３３）の懸濁液５０μｌを各溶解物に添加する。各溶解物の核酸を２５μｌのＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３中に溶出させる。
【０１５５】
−ステップ４：核酸の検出
各溶出液中の核酸量を決定するために、前記溶出液１０μｌを０．２ｍｌ ＰＣＲチューブ内に入れる。その後、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ溶液１８０μｌを試料に添加し、出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ＥａｓｙＱ（登録商標）装置を用いて蛍光シグナルを測定する。
【０１５６】
蛍光測定の結果は図１９に示されている。対応は以下の通りである。
Ａ＝ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）装置を用いた溶解
Ｂ＝本発明による装置を用いた溶解
Ｃ＝酵素的溶解
Ｄ＝カオトロピック溶解
【０１５７】
図１９を分析することによって、本発明による装置の溶解効率は、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）の機械的溶解方法のものと類似したものであることが見出される。さらに、これらの２つの機械的方法は、酵素的溶解方法またはカオトロピック試薬を用いた化学的溶解方法より、有意に効率的である。
【０１５８】
実施例３
ＮＡＳＢＡ法による検出と組み合わせた本発明による装置を用いたＢａｃｉｌｌｕｓ懸濁液の溶解
ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３中に希釈されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの懸濁液０．３ｍｌを本発明によるカートリッジの中に導入する。前の実施例で記載した本発明による溶解方法を２分間、再現する。溶解ステップの後に、溶解物５μｌを使用して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓに特異的なプライマーおよびプローブを用い、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ＥａｓｙＱ（登録商標）装置を用いた蛍光によって、リアルタイムＮＡＳＢＡ法による検出を行う。検出に用いる標的遺伝子はＥＦ−ｔｕ遺伝子である。増幅産物のサイズは１１５ヌクレオチドである。
６から６×１０５の範囲の様々な量のＢａｃｉｌｌｕｓを用いた。
図２０は、蛍光のリアルタイム生成を、本発明による装置に導入された様々な量のＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの関数として示す。この図では、対応は以下の通りである、
ａ＝６×１０５桿菌を含む試料
ｂ＝６×１０４桿菌を含む試料
ｃ＝６×１０３桿菌を含む試料
ｄ＝６００桿菌を含む試料
ｅ＝６０桿菌を含む試料
ｆ＝６桿菌を含む試料
ｇ＝桿菌を含まない試料
【０１５９】
図２０の観点から、検出された蛍光のレベルと、試料中に含有されていた細菌の数との間に極めて良い相関関係が観察される。さらに、細菌を含有しない試料と、６細菌のみ含有する試料との間に有意な相違が見出される。最後に、この分析の結果から、本発明による装置は、ＮＡＳＢＡ型の核酸増幅法の使用に適したレベルの実績を提供することが推論できる。
ＮＡＳＢＡ法で増幅を行う前に、核酸を濃縮することによって、この分析の感受性を改善できるであろうことに留意するべきである。そのような濃度ステップは、例えば、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置を用いて行うことができる。
【０１６０】
実施例４
本発明による装置を用いた全血試料の分析
この実施例では、本発明による装置を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの集団が添加されている全血試料を分析する。血液試料は、健康な個体から得る。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの培養は、ＴＳＡ（トリプチケースソイ）プレートの寒天培養培地上で行う。細菌コロニーを寒天上に回収し、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３で洗浄する。ひとたび細胞が洗浄されたならば、波長６００ｎｍで光学濃度０．５を有する細菌懸濁液を得るために、それらを同じ抽出緩衝液５ｍｌで希釈する。この保存懸濁液は、約２．２×１０７細菌／ｍｌを含有している。１つは１０３細菌／ｍｌ、そして１つは１０５細菌／ｍｌである異なった濃度を有する懸濁液を得るために、この保存懸濁液をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３で希釈する。
【０１６１】
各希釈懸濁液について、続いて用いられるプロトコールは以下の通りである。
１．希釈懸濁液２４μｌを血液１５０μｌに添加して、混合する。
２．本発明によるカートリッジの中に、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液１（参照番号２８０１３０）１２５μｌを導入する。
３．今度は細菌で負荷した血液試料をカートリッジに導入する。
４．カートリッジを、核酸を回収する手段と接触させることによって、溶解ステップを行う。核酸を回収する手段を２０００ｒｐｍで２分間回転させる。
５．１００μｌの溶解物をカートリッジ内に汲み上げる。
６．実施例２のステップ３に記載の通り、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置を用いて、この溶解物の精製を行い、溶出液２５μｌの回収を可能にする。
７．この溶出液５μｌを使用して、リアルタイムＮＡＳＢＡ技法を用いて、増幅および検出を行う。
【０１６２】
結果は、図２１に示されている。この図では、対応は以下の通りである。
ａ＝５３桿菌を含有する全血試料（１０５細菌／ｍｌの希釈懸濁液）
ｂ＝５桿菌を含有する全血試料（１０３細菌／ｍｌの希釈懸濁液）
ｃ＝５桿菌を含有する全血試料（１０３細菌／ｍｌの希釈懸濁液）
ｄ＝細菌を含まない全血試料
【０１６３】
示されている結果は、１０３および１０５細菌／ｍｌの希釈懸濁液に対応している。さらに、１０５細菌／ｍｌの懸濁液用の分析はデュプリケートで行われた。
【０１６４】
本発明によるカートリッジに導入された希釈懸濁液の容積の観点から、１０３細菌／ｍｌおよび１０５細菌／ｍｌの懸濁液における細菌の実際の量は、それぞれ５細菌および５３０細菌である。
【０１６５】
したがって、本発明による装置を用いた、５細菌のみを含有する試料の分析は、陽性の検出シグナル（曲線群ｂおよびｃ）を生成し、これは、細菌を含有しない試料で得られた結果（曲線ｄ）から、明確に識別できることが見出される。
【０１６６】
さらに、少量の細菌を用いた場合でさえ、結果が再現可能であることが見出される。これは、曲線ＢおよびＣによって示されている。
【０１６７】
精製ステップの終わりに得られた２５μｌのうち５μｌのみを用いただけで、この極めて良好な感受性が得られたことに留意するべきである。したがって、この感受性は、精製の後に試料を濃縮するステップを行うことによってさらに改善できる。
【０１６８】
すなわち、これらの実施例から、本発明による装置は、空気試料中に含有されている細菌を収集し、それらを溶解し、そして分析用に前記細菌から核酸を回収することを可能にする有効なツールであることが明らかになる。このために、使用される装置は、まず第一に空気収集手段の中に導入されたカートリッジと、第二に、核酸を回収する手段を組み合わされた、収集された細菌を含有するカートリッジとで構成されるであろう。
【０１６９】
本発明による装置は、全血試料などの臨床試料の分析にも完全に適している。この場合、カートリッジは空気収集手段なしで用いられる。液体試料をカートリッジの中に入れ、その後、細菌を溶解して、核酸を回収するために、後者を、核酸を回収する手段と組み合わせる。
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、生物学的分析の分野である。より詳細には、本発明は、空気試料などの環境試料中、または臨床試料中に存在する微生物を溶解する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
数年間にわたって、病院における院内感染の再起が観察されている。これらの感染は、入院中であり、それゆえ、定義上免疫抑制されている個体が、病院環境圏に存在している病原微生物で汚染されることによって説明される。これらの微生物は、装置および表面の消毒ならびに空気処理に、常に多大な注意が払われているのにもかかわらず、破壊されていない。環境微生物学的汚染のこれらの事例がますます一般的になっていることに鑑みて、環境制御を改善および促進する装置および方法の開発が、医療従事者の主要な関心となるに至っている。
【０００３】
院内感染の問題に加えて、環境条件の制御は、過去数年間にわたって、とりわけ食品加工業、医薬品産業または化粧品産業における、工業環境に関する懸念の再来にもなっている。食品加工業では、病原微生物による製品の汚染、または出発物質の汚染さえもがもたらしうる、消費者健康への被害甚大な結果が知られている。実際、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属のものなどの細菌による食中毒は、このところ、よくあることである。空気質の制御は、医薬品産業または化粧品産業の品質アプローチにおける鍵となる過程でもある。
【０００４】
さらに、これらの制御は、ますます厳しくなっている規制に基づいて、ますます高レベルの必要条件を満たさなければならない。
【０００５】
医療従事者または製造業者が環境制御を実施するのに利用可能なツールのなかで、エアロバイオコレクターは、空気中の生物を検出するのに選択される解決策である。これらの装置は、エアロバイオコンタミネーションを測定することが望ましい敷地内の適切な場所に置かれる。それらは通常、培養培地と連結された空気収集器で構成されている。空気収集器によって収集された空気は、培養培地と接触し、収集された空気内に潜在的に含有されている微生物が培養培地上に沈着する。その後、この培養培地を回収し、微生物の増殖を促進させるために、インキュベーター内に置く。このようにして、従来の微生物学技法によって、前記微生物を検出および同定することが可能である。
【０００６】
それにもかかわらず、これらの装置は、使用技法に関連した大きな欠点を有する。この欠点は、分析結果を得るのに必要な時間である。これは、従来の微生物学技法、とりわけ細菌学技法の使用が、細胞増殖に必要なインキュベーション時間、または同定を可能にするために特定の培養培地上に再接種する段階の時間さえも固守しなければならないことを意味するからである。それゆえ、結果を得るのに必要な時間が比較的長く、実際、院内感染または食中毒の原因となる病原菌の検出および同定を意図している場合には、長すぎることにさえなる。
【０００７】
このタイプの装置の別の欠点は、培養培地の使用によって、複数の細菌属および種を相互に識別することは可能となるが、通常、同一細菌種の複数の株を相互に識別することは可能にならないということである。いまでは、考慮対象の株に応じて、微生物の病原性が著しく異なりうることが知られている。
【０００８】
さらに、空気中に存在する粒子、とりわけ微生物を回収する装置がある。すなわち、ＧＢ−２２５４０２４号明細書は、空気中に含有されている粒子を収集する装置であって、その原則がサイクロン効果に基づいている装置を記載している。そのような装置は、微生物を含めた、空気中に含有されている粒子を収集するのに適していることが見出されているが、そのようにして得られた試料の処理、とりわけ、分析用に使用されることが意図されている遺伝物質の抽出については、全く研究されていない。
【０００９】
より一般的には、微生物の同定および／または結果の迅速な提供という点で最も適切な技法は、臨床試料に関するものであるか、環境試料に関するものであるかにかかわらず、疑いなく、分子診断技法である。これらの技法は、微生物の遺伝物質、とりわけ対象とするある特定の配列の分析に基づいており、それらは培養ステップなしで済ませることを可能にするので、記録時間内に微生物の極めて正確な同定を得ることを可能にする。
【００１０】
それにもかかわらず、そのような技法の使用は、いくつかの限定を示しており、それらの中で最も重要なものは、空気中に存在している微生物の量、すなわち分析を実施するために回収可能な微生物の量が潜在的に限定されていることである。実際、環境試料、そしてそれだけでなく一部の臨床試料も、比較的少量の微生物を有していることが知られている。それゆえ、この出発物質から得られる遺伝物質の量も少ないことになる。したがって、収率に関する、核酸を抽出するのに用いられる技法の効率が必須パラメータとなる。
【００１１】
さらに、微生物を溶解するための既存の技法の大部分は長く、手作業のステップを行う適格な人員の関与を必要としている。
【００１２】
ＷＯ−Ａ−２００５／０３８０２５パンフレットは、とりわけ空気から採取された微生物から核酸を抽出する方法を記載している。この方法は、３通りの異なった溶解方法、すなわち、化学溶解、熱ショック溶解および機械的溶解を行うものである。そのような方法は、疑いなく、核酸抽出収率の最適化と、それゆえ、分析に利用可能な遺伝物質の量の増加とを可能にするが、それにもかかわらず、この収率が、依然として、回収される微生物の量に依存しているという実情はそのままである。しかし、この文書では、前記微生物の回収の最適化については何も記載されていない。
【００１３】
ＵＳ第５７０７８６１号明細書は、微生物タイプの生細胞を崩壊させる装置を記載している。この装置は、ガラスビーズのみでなく、微生物を含有する管と、前記管を保持するホルダーの穴との間に存在するギャップによる振動の効果も用いることによって、細胞の溶解を可能にする。したがって、そのような装置は、細胞溶解の最適化と、それゆえ、遺伝物質の抽出の最適化とを可能にする。そのような装置、および後者によって用いられる方法は、上述のものと同じ限定、すなわち、それらが、回収される微生物の量に依存しているままであるという限定を示している。さらに、それらは、細胞破片から前記核酸を単離するために、核酸濃縮ステップを後で行わなければならないという追加の欠点を有する。最後に、それらは、濃縮ステップの終了時に、核酸の手操作での回収を必要とする。
【００１４】
これらの問題は、ＵＳ第５５６７０５０号明細書に記載の装置でも生じる。
【００１５】
より統合的なシステムも記載されている。すなわち、ＷＯ−Ａ−２００４／０１８７０４パンフレットは、空気中の微生物を収集し、かつそれらを同定するのに、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅技法を用いる装置および方法を記載している。このシステムは、郵便仕分けセンターにおける生物学的汚染攻撃の企てと戦うのに特に適している。このシステムは、郵便輸送回路に沿って置かれた空気収集装置、サイクロン効果によって粒子を濾過または分離する装置、液体試料中の粒子を濃縮または回収する装置、および試料の一部をＣｅｐｈｅｉｄ社製のＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）ＰＣＲ分析カートリッジに移す装置でできている。その後、空気から収集された（１または複数種の）微生物を同定するために、このカートリッジを、独立した自動生物学的分析装置に手操作で移す。
【００１６】
このシステムは、上述の装置および方法に関連した多くの技術的問題の解決を可能にするが、それにもかかわらず、それは大きな欠点を有する。これらの欠点の第１は、分析カートリッジに移す前に試料を処理するシステム（収集、分離、濃縮／回収）が比較的複雑であり、かつ厄介であるということである。第２の欠点は、収集された微生物が液体試料中に回収され、上記試料の一部のみが分析されるということである。これは、すべての微生物を回収しない危険性、それゆえすべての核酸を回収しない危険性が極めて高く、それによって分析の妥当性を大きく限定することを意味する。さらに、このシステムでは、その複雑さにもかかわらず、カートリッジをＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）自動分析装置に手操作で移動する必要がある。
【発明の概要】
【００１７】
したがって、本発明の第１の目的は、普遍的な溶解を行う装置および方法であって、それらが細菌、ウイルスまたは真菌であるかにかかわらず、増殖状態でも、胞子形態でもありうる、広範な多様性の微生物に関する環境試料および臨床試料の両方に有効な装置および方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、空気などの環境試料中または臨床試料中に含有されている前記微生物から、統合された方法で核酸を抽出し、かつ前記核酸を分析用に回収するために、前記微生物を効果的に溶解できる装置を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、空気試料中に含有されているすべての微生物を収集できる装置を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、簡易設計を有する装置を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、極端に小型化された装置を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、上述した様々なステップが、その中で、外部の汚染の危険性なく行われる密閉装置を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、操作者による試料の移動なしで、前記ステップがその中で行われ、それによってその汚染が予防される装置を提供することである。
【００２４】
最後に、本発明の別の目的は、遠心処理または濾過などの追加の前処理ステップなしで、例えば増幅ステップおよび検出ステップを含む分子診断ステップで直接的に使用できる、緩衝液中の標的核酸を提供できる装置を提供することである。
【００２５】
これらの目的は、とりわけ、本発明によって実現される。本発明は、第一に、空気収集手段の内部に配置でき、かつ核酸を回収する手段を受け入れることのできるカートリッジであって、前記カートリッジが実質的に円筒状であり、かつ微生物保持ゾーンを含み、前記保持ゾーンが微生物溶解手段を含むカートリッジに関する。
【００２６】
微生物保持ゾーンは、微生物を保持し、溶解手段を適所に維持し、液体の存在下で溶解することができる物質を含むと有利である。上記物質は好ましくはゲル状物質である。
【００２７】
上記ゲル状物質は、有利には、微生物培養培地でありうる。
【００２８】
上記装置の変形形態の１つによれば、後者が、分析装置への接続のための手段を含む。
【００２９】
溶解手段は、ビーズで構成されていることが好ましい。さらに好ましくは、ビーズの直径が２００〜６００μｍである。
【００３０】
本発明は、空気中に含有されている微生物を収集する装置であって、
−空気吸入ダクトを含む上部エレメントと、空気放出ダクトを含む下部エレメントとを含む空気収集手段であって、前記空気収集手段内部に気流を生成できるように、前記上部エレメントおよび下部エレメントを相互に連結することが可能である空気収集手段と、
−微生物保持ゾーンを含む実質的に円筒状のカートリッジであって、前記保持ゾーンが微生物溶解手段を含み、前記カートリッジが前記空気収集手段の内部に配置されているカートリッジと
を含む装置にも関する。
【００３１】
空気収集手段は、空気再循環回路に接続可能である。
【００３２】
本発明は、微生物を、前記微生物から核酸を単離する目的で溶解する装置であって、
−微生物保持ゾーンに置かれた微生物を含む、本発明によるカートリッジと、
−上記カートリッジ内に装着できる、実質的に円筒状の、核酸を回収する手段と
を含み、前記微生物を溶解し、かつ核酸の放出を可能にするために、前記回収する手段が微生物溶解手段と協働する装置にも関する。
【００３３】
核酸を回収する手段は、液体を汲み上げる／送達する手段を含むと有利である。
【００３４】
特に、核酸を回収する手段は、液体貯蔵ゾーンも含む。
【００３５】
好ましい一実施形態によれば、カートリッジの内径が、核酸を回収する手段の外径より大きく、その結果、核酸を回収する手段がカートリッジ内に装着される場合、核酸を回収する手段の外壁からカートリッジの内壁を離している距離が、溶解手段がこの間隙空間内に存在することを可能にするのに十分大きく、かつ溶解手段が前記壁のいずれか１つと接触するのに十分小さい。
【００３６】
本発明は、空気中に含有されている微生物を濃縮する方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと
を含む方法にも関する。
【００３７】
特定の一実施形態によれば、上記方法は、保持ゾーン内で微生物を増殖させるステップｄ）も含む。
【００３８】
微生物は、保持ゾーン内に存在する溶解手段表面に保持されると有利である。
【００３９】
本発明は、空気中に含有されている微生物を溶解させる方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法にも関する。
【００４０】
本発明は、空気中に含有されている微生物を溶解させる方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法にも関する。
【００４１】
本発明の別の主題は、空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｈ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法に関係する。
【００４２】
本発明は、空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）カートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｈ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内への、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法にも関する。
【００４３】
これらの抽出方法は、カートリッジの保持ゾーン内に濃縮された微生物を増殖させる追加のステップｄ’）を優先的に含む。
【００４４】
この増殖は、２〜２４時間の範囲にある時間にわたって、カートリッジをインキュベーター内でインキュベートすることによって行われる。
【００４５】
本発明の別の主題は、空気中に含有されている微生物を溶解させる方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンの近くに置かれるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法に関係する。
【００４６】
本発明の別の主題は、微生物を溶解する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮されるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法に関係する。
【００４７】
本発明の別の主題は、微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮されるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｅ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内への、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法に関係する。
【００４８】
本発明の別の主題は、微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮されるカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｅ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法に関係する。
【００４９】
本発明は、微生物を溶解する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、本発明によるカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法にも関係する。
【００５０】
「液体試料」という用語は、微生物を含有しうるいかなる液体試料も意味するものとする。それは、ヒト起源の液体試料でも、動物起源の液体試料でもよい。この試料は、例えば、尿試料、全血試料、血漿試料またはいかなる他の体液の試料でもよい。液体試料は、飲料などの食品起源のものでもよい。それは、水などの環境起源のものでもよい。さらに、液体試料は、ｆｌｏｃｋｅｄＳＷＡＢＳという名称でＣｏｐａｎ社によって販売されたものなど、スワブタイプの表面試料採取装置上に含有されている潜在的微生物が、前記輸送液中における前記スワブの振動によって再懸濁されている「輸送」液でもよい。
【００５１】
加えて、本発明は、微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、本発明によるカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｄ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法に関係する。
【００５２】
本発明の別の主題は、加えて、試料中に含有されている１または複数種の微生物を同定する方法であって、
ａ）本発明による装置によって、前記試料中に含有されている微生物から核酸を単離するステップと、
ｂ）そのように単離された（１または複数種の）微生物を同定するステップと
を含む方法に関係する。
【００５３】
本発明による同定方法の有利な一変形形態によると、前記方法は、核酸を精製する中間ステップも含む。この精製ステップは、溶解ステップで放出された他の細胞成分から核酸を分離することを可能にする。このステップは通常、核酸の濃縮を可能にするものであり、ＤＮＡまたはＲＮＡの精製に適合させることができる。例として、吸着または共有結合によって、任意選択でオリゴヌクレオチドでコーティングされた、磁性粒子を用い（この点に関しては、特許ＵＳ第４６７２０４０号明細書およびＵＳ第５７５０３３８号明細書を参照）、それによって、これらの磁性粒子に結合した核酸を、洗浄ステップによって精製することが可能である。この核酸精製ステップは、その後に前記核酸を増幅することが意図されている場合、とりわけ有利である。これらの磁性粒子の特に有利な一実施形態が、特許出願ＷＯ−Ａ−９７／４５２０２およびＷＯ−Ａ−９９／３５５００に記載されている。核酸を精製する方法の別の有利な例は、カラムの形態、または不活性粒子（Ｂｏｏｍ Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９０、２８（３）巻、４９５〜５０３頁）、もしくは磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）シリカ、Ｐｒｏｍｅｇａ：ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）常磁性粒子）の形態のいずれかにおけるシリカの使用である。他の極めて広範に使用されている方法は、カラムフォーマットまたは常磁性粒子フォーマット（Ｗｈａｔｍａｎ：ＤＥＡＥ−Ｍａｇａｒｏｓｅ（登録商標））（Ｌｅｖｉｓｏｎ ＰＲら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９８、３３７〜３４４頁）におけるイオン交換樹脂に基づいている。本発明に極めて適切であるが、それに限られるわけではない別の方法は、金属酸化物支持体（Ｘｔｒａｎａ社：Ｘｔｒａ−Ｂｉｎｄ（商標）マトリックス）表面への吸着による方法である。
【００５４】
詳細には、同定ステップは、
ａ）単離された核酸を特異的に増幅するサブステップと、
ｂ）そのように増幅された核酸を検出するサブステップと
を含む。
【００５５】
同定方法の優先的な一変形形態によると、同定ステップは、本発明による装置のカートリッジと液体を介して連絡している同定装置内で行われる。
【００５６】
したがって、単離された核酸は、本発明による装置の、核酸を回収する手段から、同定装置へ輸送される。
【００５７】
核酸の輸送は、核酸を含有する、対象とする液体の、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段による送達によって行われ、前記対象とする液体は、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に含有されていることが有利である。
【００５８】
微生物は、細菌、ウイルス、酵母、カビおよび寄生虫を含む群から選ばれる。
【００５９】
微生物が単離される試料は、環境起源のものである。したがって、それらは、空気試料、または水などの液体試料、または表面試料でありうる。試料は、臨床起源のもの、すなわち、微生物、任意選択で病原微生物を探索および同定するための分析の対象となりうるヒト起源または動物起源の任意の試料でもよい。
【００６０】
標的核酸の存在は、ハイブリダイゼーション反応の可視化によって実証される。「ハイブリダイゼーション反応」という用語は、捕捉核酸と、転写ステップ、逆転写ステップまたはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づいた増幅）もしくはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）タイプの増幅ステップによって単離または生成された標的核酸との間のいかなる反応も意味するものとする。
【００６１】
「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、およびリボ核酸、ならびにそれらの誘導体も意味するものとする。「オリゴヌクレオチド」という用語は、適したハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できる一連の少なくとも２つの天然または修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方）を指す。「修飾ヌクレオチド」という用語は、例えば、修飾塩基ならびに／またはヌクレオチド間結合のレベルおよび／もしくはバックボーンのレベルにおける修飾を含むヌクレオチドを意味するものとする。修飾塩基の例としては、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリンおよびブロモ−５−デオキシウリジンを挙げることができる。
【００６２】
修飾ヌクレオチド間結合を例示するためには、ホスホロチオエート結合、Ｎ−アルキルホスホラミデート結合、アルキルホスホネート結合およびアルキルホスホジエステル結合を挙げることができる。
【００６３】
ＦＲ−Ａ−２６０７５０７に記載のものなどのα−オリゴヌクレオチド、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、８巻、１６号、１９９８年８月１８日、２２１９〜２２２２頁に記載のホスホロチオエート−ＬＮＡおよび２’−チオ−ＬＮＡなどのＬＮＡ、ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２）、１１４、１８９５〜１８９７による論文の主題であるＰＮＡが、バックボーンが修飾されているヌクレオチドでできているオリゴヌクレオチドの例である。
【００６４】
ハイブリダイゼーション反応は、直接的手段または間接的な手段など、任意な検出手段によって可視化できる。
【００６５】
直接的検出、すなわち標識化を介さない検出の場合、ハイブリダイゼーション反応は、プラズモン共鳴によってか、または導電性高分子を有する電極表面でサイクリックボルタメトリーによって観察される。
【００６６】
間接的検出、すなわち標識化による検出の場合、標識化は、標的核酸上に直接行うことも、前記核酸に特異的な、事前標識化された結合パートナーによって行うこともできる。
【００６７】
「標的核酸に特異的な結合パートナー」という表現は、標的核酸と結合できるいかなるパートナーも意味するものとし、例としては、核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび酵素基質が挙げられるであろう。
【００６８】
「標識化」という用語は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成できる標識の付着を意味するものとする。これらの標識の非限定的なリストは、例えば電気化学、比色定量、蛍光、ルミネッセンス、またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、α−ガラクトシダーゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素によって検出できるシグナルを産生する酵素；酵素阻害剤；酵素補因子；金粒子などの粒子、磁性ラテックス、リポソーム；ルミネッセンス化合物または発色化合物などの発色団、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉなどの放射性分子、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ（登録商標）、ウンベリフェロン、ルミノールまたはフィコシアニンなどの蛍光分子から成る。蛍光の場合、それは、酵素基質反応の蛍光産物、蛍光色素−クエンチャーの組合せ、蛍光消光、または蛍光特性に基づいた任意な他の系を用いるものでもよい。
【００６９】
例えば、別の対であるリガンド／アンチリガンド対を用いる、間接的な系も使用できる。リガンド／アンチリガンド対は、当業者にはよく知られており、例えば、以下の対、すなわち、ビオチン／ストレプトアビジン、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／上記ポリヌクレオチドに相補的な配列を挙げることができる。この場合、結合物質を保持しているのはリガンドである。アンチリガンドは、前の段落に記載した標識を介して直接的に検出可能であることも、リガンド／アンチリガンドを介してそれ自体検出可能であることもある。
【００７０】
これらの間接的検出系は、特定の条件下でシグナルの増幅をもたらしうる。このシグナル増幅技法は、当業者にはよく知られており、出願人による先行の特許出願である、ＦＲ−Ａ−２７８１８０２もしくはＷＯ−Ａ−９５／０８０００、またはＪ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：４８１〜４９１、１９９７の論文を参照できる。
【００７１】
標的核酸の事前標識化は、ポリメラーゼによって、もしくはキナーゼによって、末端でランダムに、もしくは特異的に、標識を直接的または間接的に取り込むことによって、または分子の「中」に取り込むことによって行うことができる。
【００７２】
標的分析物に特異的な結合パートナーの標識化は、当業者には広く知られており、例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１９９６、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、５２５Ｂ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ９２１０１ ＵＳＡによって記載されている。
【００７３】
使用される結合体の標識化のタイプに応じて、例えば酵素を用いて、当業者は、標識を可視化する試薬を添加するであろう。このステップが、明らかにすることに相当する。その前に、バックグランドノイズを制限するために、反応に関与しないか、または弱くもしくは非特異的に結合する分析物または成分の画分の除去を可能にする洗浄用緩衝液の使用が先行する。
【００７４】
本発明による装置の目的および利点は、図面を参照して、決して限定的なものではない以下の実施例に照らして、より明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の第１の実施形態による空気収集手段の縦断面の分解図である。
【図２】本発明の第１の実施形態による、微生物を収集するステップ中における、カートリッジがその中に置かれている空気収集手段の縦断面図である。
【図３】本発明の第１の実施形態による、核酸を回収する手段をカートリッジの中に装着する過程の初期段階における、カートリッジ、および核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図４】本発明の第１の実施形態による、核酸を回収する手段をカートリッジの中に装着する過程の進んだ段階における、カートリッジ、および核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図５】本発明の第１の実施形態による、核酸を回収する手段をカートリッジの中に装着する過程の最終段階における、カートリッジ、および核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図６】本発明の第１の実施形態による、微生物を機械的に溶解するステップ中における、カートリッジの中に装着された、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図７】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に汲み上げるステップ中における、カートリッジの中に装着された、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図８】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体すべてが、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に汲み上げられた場合における、カートリッジの中に装着された、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図９】本発明の第１の実施形態による、微生物を同定するための手段の提示中における、カートリッジの中に装着されている、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１０】本発明の第１の実施形態による、ひとたび、微生物を同定する手段がカートリッジと液体を介して連絡してからの、カートリッジの中に装着されている、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１１】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を、微生物を同定する手段の中に輸送する初期段階における、核酸を回収する手段−カートリッジ−微生物集合体を同定する手段の縦断面図である。
【図１２】本発明の第１の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を、微生物を同定する手段の中に輸送した後における、核酸を回収する手段−カートリッジ−微生物集合体を同定する手段の縦断面図である。
【図１３】第２の実施形態による、微生物を収集するステップ中における、カートリッジが置かれている空気収集手段の縦断面図である。
【図１４】第２の実施形態による、対象とする液体を手操作で分配するステップ中における、カートリッジの縦断面図である。
【図１５】第２の実施形態による、微生物を機械的に溶解するステップ中における、カートリッジの中に置かれた、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１６】第２の実施形態による、核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップ中における、カートリッジの中に置かれた、核酸を回収する手段の縦断面図である。
【図１７】本発明による装置で、エアロゾル中に含有されている細菌を捕捉する能力の試験を意図する試験台の機能的スキームを表す図である。
【図１８】本発明による装置の収集効率を、生成されたエアロゾル粒子のサイズの関数として示すグラフである。
【図１９】本発明による装置を用いた細菌溶解効率と、従来技術の代替方法を用いたものとを比較するグラフである。
【図２０】本発明による装置で、様々な懸濁液中に含有されている細菌を溶解し、かつ核酸を回収した後における、これらの細菌の、リアルタイムＮＡＳＢＡ技法を用いたリアルタイム検出を示すグラフである。
【図２１】本発明による装置で、様々な全血試料中に含有されている細菌を溶解し、かつ核酸を回収した後における、これらの細菌の、リアルタイムＮＡＳＢＡ技法を用いたリアルタイム検出を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
第１の実施形態によれば、本発明による装置を構成する第１のエレメントは、空気収集手段１０である。この手段は、上部エレメント１２および下部エレメント１４で構成されている。上部エレメント１２は、通常、円筒状の形態を有する。この円筒の下端は開いているが、上端は、水平な壁１３によって部分的に閉じている。その中央部では、この壁１３は、ダクト１８によって上部エレメント１２の内側に伸長するオリフィスを有し、ダクト１８の基部は実質的に円錐の形態である。実際、この部分は、空気収集手段１０の中への空気吸入ダクトを構成している。特定の一実施形態によれば、この空気吸入ダクトは、任意な適切な手段によって空気再循環回路のパイプに接続できる。
【００７７】
空気収集手段１０は、例えば１０〜４０ｍｍの間、好ましくは２０ｍｍの外径を有しうる。空気吸入ダクトの内径は、例えば６ｍｍである。
【００７８】
この空気収集手段１０は、有利には、とりわけオートクレーブによって、殺菌できる物質で作られたものでありうる。したがってそれは、アルミニウムまたは鋼鉄などの金属でできたものでありうる。それは、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）などの高分子でできたものでもありうる。
【００７９】
上部エレメント１２の垂直な環状壁２０の下端は、その外面上に肩２０１を含む。この凹みは、壁２０の周縁全体にわたって作られている。それは、上部エレメント１２と下部エレメント１４との連結を容易にするように意図されている。
【００８０】
下部エレメント１４も、通常、円筒状の形態である。この円筒の上端は開いているが、下端は、その中央に実質的に円筒状の空気放出ダクト２２を含む水平な壁２１によって部分的に閉じており、前記ダクトの基部は、上記水平な壁と一体化している。ダクト２２の下端は開いている。このダクトは、下部エレメント１４の内部と連絡しており、それによって、ダクト２２は、空気収集手段１０の上部エレメント１２と下部エレメント１４とが連結された際に、空気吸入ダクト１８によって空気収集手段１０の中に入れられた空気の放出ダクトの役割を果たしている。
【００８１】
下部エレメント１４の垂直な環状壁２４の上端は、その内面上に肩２４１を含む。この肩は、壁２４の周縁全体にわたって作られている。壁２０および壁２４の端は相補的な形の断面を有しており、一体に装着するのを容易にしているという事実により、それも、上部エレメント１２と下部エレメント１４との連結を容易にするように意図されている。まず第１に、この連結が可逆的であるということが重要である。ひとたび一体に装着されれば、エレメント１２およびエレメント１４は、相互に取り外し可能であるべきである。
【００８２】
エレメント１２とエレメント１４とを連結する代替の手段は、一方のエレメントをもう一方のエレメントにねじ入れることによって連結するものでありうる。このためには、エレメント１２またはエレメント１４のうちの一方の壁の端は、雄ネジを保持し、かつ第２のエレメントの壁の端は、対応するメスネジを保持しうる。
【００８３】
重要なことは、空気のいかなる寄生流入も防止するために、収集手段が密閉されていることである。
【００８４】
特定の１モードの空気収集手段の使用によれば、空気放出ダクト２２の下端を空気吸引ポンプ（表示されていない）または任意の他の同等なポンピング手段に接続することができる。このポンプは、それが望ましい場合に、例えば、病室、または医薬製品もしくは食品加工産物を生産するための部屋などの所与の環境における、環境空気の分析を行うために、空気収集手段の中への環境空気の吸入を可能にする。このためには、自律的に作動するポンピング手段を有することが好ましい場合がある。
【００８５】
図２は、その作動中に、カートリッジ３０と組み合わされている空気収集手段１０を表す。この図で見て取れるように、カートリッジ３０は、空気収集手段１０の内側に配置されている。これを行うため、空気収集手段１０を構成するエレメント１２およびエレメント１４が分離される。カートリッジ３０は、空気収集手段１０の下部エレメント１４の中に保持されるように置かれる。その後、上部エレメント１２を、下部エレメント１４の上に再配置し、これら２つの手段を連結する。空気収集手段１０およびカートリッジ３０で構成されている集合体は、その後、上述の通り、空気収集手段１０の内部の空気の循環を引き起こすために、再循環回路またはポンピング装置に接続される。
【００８６】
縦断面で、図２に表されているカートリッジ３０は、実質的に環状な横断切片を有する円筒の一般的形態を有する。この円筒の上端は開いているが、下端は、中心にオリフィスを有する壁で構成されており、前記オリフィスの伸長方向に沿って、カートリッジ３０の内側に伸長するダクト３２が存在する。このダクトの内部断面は、それがダクトの上端に接近するに従って、より小さくなる傾向があることが見出される。さらに、このダクトの下端は膜３４によって閉じており、それが隔壁の役割を果たしていることも見出される。膜３４を構成する物質は、先端のとがった物体を用いた単純な圧力によって押し破かれるのに適している。この過程は、図９および１０に関連して下記で説明する。この物質は、例えば、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）またはポリカーボネートである。
【００８７】
図２で見て取れるように、カートリッジ３０の下壁３５の内側表面は傾斜上にあり、この傾きの最低点はダクト３２と接触しており、最高点はカートリッジ３０の垂直な壁３６と接触している。この壁３５は、溶解手段３８の支持体として働き、微生物保持ゾーンを構成する。これらの溶解手段は、この場合、同一サイズのビーズによって構成される。好ましい一実施形態によれば、これらのビーズは、ガラスでできている。さりとて、それらは、鉄など、いかなる他の同等な物質でも構成されうるであろう。これらのビーズは、２００〜８００マイクロメートル（μｍ）の間の直径を有すると有利である。
【００８８】
有利な一変形形態によると、ビーズは、異なったサイズのものでありうる。すなわち、直径が２００〜３００μｍの間のビーズと、直径が４００〜６００μｍの間のビーズとの混合物を使用することが、とりわけ適している可能性がある。
【００８９】
ビーズは、１（または複数の）層のビーズが埋め込まれている層の形態で堆積しているゲル状物質によって、１または複数の重ねられた層の形態で適所に保たれる。このゲル状物質は、いくつかの制約条件を満たすべきである。第１は、カートリッジ内部で行われる過程に影響を与えないように、それが不活性であるべきであるということである。第２は、微生物溶解を実施するためにそれが捕捉している粒子を放出させるために、液体中への溶解能をそれが有するべきであるということである。そのような物質は、例えば、アガロースでありうる。
【００９０】
代替として、ゲル状物質は、有利には微生物用の培養培地でありうる。実際、寒天培養培地は、従来より、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野で極めて長い間使用されてきている。そのような培養培地の使用にはいくつかの利点がある。主な利点は、微生物の増殖段階を、後者の溶解が実行される前に可能にすることである。本発明による装置は、病原微生物の迅速な検出に結びついた必要性を満たそうとするものであるが、それでも、数分間から数時間の増殖段階によって、微生物の増殖が可能となるであろうことはそのままであり、それは、より多量の核酸を有するという直接的な効果を有する。培養培地の使用の第２の利点は、後者が、所与の１または複数の種に合わせて選択できることである。それにより、そのような培地の使用は、対象でない他の微生物および分析を妨害しうる他の微生物を阻害する、特定の病原微生物の選択的増殖と、それゆえ、それらの選択的検出とを可能にしうることになる。したがって、それぞれが特定種の微生物の検出に適している数通りの専門化したカートリッジを有することが企図できる。
【００９１】
カートリッジ３０の寸法は、内径に関して、例えば８〜１６ｍｍでありえ、１２ｍｍが好ましい。ビーズ層の全厚は、通常１〜２ｍｍであり、これは、０．４〜１グラムの間のガラスビーズの量に相当する。
【００９２】
カートリッジ３０は、注入成形技法を用いて作製すると有利である。例えば、使用される物質は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはＰＭＭＡである。
【００９３】
空気収集手段中の空気の循環が始まった際に、前記空気が従う進路は、図２中の矢印によって表されている。したがって、空気は、空気吸入ダクト１８を介して空気収集手段１０に入ることが見出される。カートリッジ３０のダクト３２は、空気吸入ダクト１８の中に部分的に挿入されているので、後者内の気流は、ダクト３２の最上部で周辺流に変換されるようになる。これは、ダクト３２の上端が実質的に円錐の形態であるという事実によって説明される。さらに、ダクト３２の基部の膜３４の存在は、ダクト３２が極めて迅速に増圧状態になるので、空気がダクト３２の中に貫入するのを防止する。吸入ダクト１８の壁と、ダクト３２の壁との間の間隙空間は、ダクト３２の端が円錐形であることによって、突然狭くなっているので、周辺気流の加速がある。それにより、後者がビーズ３８の上部層に衝突し、ゲル状物質または培養培地の表面において、圧入により、この部位における、気流中で輸送されていた微生物の残留をもたらすことになる。したがって、そのような過程は、エアロバイオコレクターで起こるものに比較的類似している。
【００９４】
空気は、ポンピング手段によって吸引されて、それとしては、その経路を継続する。それは、カートリッジ３０の垂直な壁３６の内面に沿って昇り戻り、このレベルで、循環経路が広くなることによって減速する。それは、この同じ壁の外面に沿って再降下し、再び空気放出ダクト２２の入り口で集中流に変換されるようになり、前記空気放出ダクトを介して空気収集手段１０から外に出る。
【００９５】
空気収集手段１０内の、収集される空気の流速は、例えば、２０〜１００リットル／分（ｌ／ｍｉｎ）の間でありうる。それは、５０ｌ／ｍｉｎが有利である。
【００９６】
ひとたび、カートリッジ内で微生物保持／濃縮ステップが実施されたならば、ずらすか、またはねじをゆるめてはずすことによって、空気収集手段の上部エレメント１２および下部エレメント１４をはずすことによって、カートリッジを前記手段から取り出す。
【００９７】
この段階で、カートリッジ内に濃縮された微生物を培養することが望ましい場合には、３７℃のインキュベーター内で前記カートリッジをインキュベートする機会がある。上記に既述の通り、このインキュベーションは通常、分析時間が大幅に延長されすぎないように、数十分間から数時間続けられる。さりとて、分析結果の取得が緊急でない場合には、細菌増殖の制約条件により適した、さらに長い時間、すなわち約２４時間にわたって、カートリッジをインキュベートすることが企図されうる。
【００９８】
同様に、分析を延期することが望ましい場合には、低温室など、この貯蔵に適した環境でカートリッジを保存することも企図されうる。
【００９９】
本発明の一変形形態によると、カートリッジ３０は、空気収集手段１０に直接置かれた状態で提供されうる。このタイプの提示は、使用者が空気収集手段内にカートリッジを置かなければならいことを回避し、それゆえ、このステップの間における汚染の危険性を低減するという利点を有する。空気収集手段１０がカートリッジ３０と同じ物質、すなわち、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたはＰＭＭＡでできていることは、この状況では、とりわけ有利である。したがって、注入成形による製造がとりわけ適している。
【０１００】
分析が行われる場合、カートリッジ３０は、図３に表されている通り、核酸を回収する手段４０と連結される。前記手段は、矢印Ａによって表される垂直方向の並進運動に従って、カートリッジ３０の開いている端を介してカートリッジ内に挿入される。
【０１０１】
図３の縦断面に表されている、核酸を回収する手段４０は通常、円形断面を有する円筒形のボディー４２を含む。ボディー４２は、その外壁の上部に肩４３を有し、その機能は、核酸を回収する手段がカートリッジ３０に完全に挿入された場合に、カートリッジ３０の垂直な壁３６の上端に対して押されることによって、カートリッジ３０−核酸を回収する手段４０集合体がリークタイトとなることを確実にすることである。さらに、ボディー４２の外壁は、その最上部にいくつかの連続した凹みを有する。肩４３それ自体の下に位置する凹み４４は、図５に表されているように、手段４０がカートリッジ３０の中に完全に挿入された場合、垂直な壁３６の上端で作られている肩４５に対して押されるので、肩の役割を果たす。凹み４４の下に配置されている第２の凹み４６は、ボディー４２の垂直な壁の外面と、カートリッジ３０の垂直な壁３６の内面との間に間隙空間が残るように、それとしては、ボディー４２の直径が低減することを可能にする機能を有する。この空間の役割は下記で説明されるであろう。さらに、これらのすべての肩および凹みは、カートリッジ３０および核酸を回収する手段４０で構成される集合体がリークタイトであることを強化することを可能にしている。
【０１０２】
その基部で、ボディー４２は、その中央の位置に、空洞４７を有し、それは、円形断面を有する実質的に円筒状の形態であり、その上端は、実質的に円錐の形態である。同様に、それは、その上部における中央の位置に空洞４８を含む。この空洞４８は、円形断面を有する実質的に円筒状の形態であり、その下端が実質的に円錐の形態であり、対象とする液体５０が入れられる貯蔵ゾーンを構成する。この液体は、ガラスビーズ３８の再懸濁を可能にし、それだけでなく、ひとたび微生物が溶解されたならば、核酸の回収も可能にする。したがって、この液体は、一方では微生物に関して不活性であり、かつもう一方では核酸に関しても不活性であり、それだけでなく生物学的プロトコールに関しても不活性であることが重要である。したがって、この対象とする液体は通常、生物学的プロトコールの実施に適した緩衝液である。空洞４７の中に含有される、対象とする液体の容積は、例えば、０．１〜０．４ミリリットル（ｍｌ）の間でありうる。
【０１０３】
対象とする液体がその役割を果たすことを可能にするために、空洞４８は、プランジャー５２および垂直位置にある腕５４で構成されている汲み上げ／送達手段と協働し、プランジャー５２の形態は空洞４８の下部に相補的であり、腕５４はプランジャー５２と一体になっており、かつ空洞４８の外側方向に伸長している。この腕の、プランジャー５２に付着しているのとは反対側にある端は、汲み上げ／送達手段を、実質的に垂直な運動によって並進的に駆動する手段（表されていない）を連結できる特定の形態の頭部を有しうる。この駆動手段は、自動化された手段であることが好ましい。
【０１０４】
空洞４８は、空洞４７の上端に空洞４８の下端を接続するチャネル５６によって、空洞４７と液体を介して連絡している。図３では、空洞４７の上端に配置されている膜５８によって、チャネル５６が閉じており、空洞４７が空になるのを防止している。この膜も、穿孔できる物質でできている。詳細には、この膜は、カートリッジ３０のダクト３２の上端によって穿孔されうる。
【０１０５】
図４に示す通り、核酸を回収する手段４０の外側形態は、カートリッジ３０の内部形態に完全に相補的である。それにより、手段４０は、カートリッジ３０内部に完全に収まり、ダクト３２は、それ自体を空洞４７の中に挿入することによって、ガイドの役割を果たすことになる。手段４０は、手段４０の下壁６０がビーズ３８に対して押されるまで入れられる。
【０１０６】
この段階で、図５に表されている矢印Ｂに従った、核酸を回収する手段のボディー４２と、同時に、汲み上げ／送達手段とへの圧力運動がある。汲み上げ／送達手段のこの並進運動は、チャネル５６を介した、対象とする液体５０の、空洞４７への送達、より詳細には、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間への送達をもたらす。液体によって膜５８に加えられた圧力が前記膜の穿孔または離脱をもたらすので、この送達は可能である。その後、対象とする液体５０は、ガラスビーズ３８が位置しているカートリッジの保持ゾーンへと移動し、このゾーンを満たし、ビーズを捕捉しているゲル状物質の懸濁を行い、それによって、汲み上げ／送達手段によって生成される、対象とする液体の流れにのって、ビーズが、核酸を回収する手段４０とカートリッジ３０の間の間隙空間６２に運ばれる。この間隙空間は、６００〜８００μｍの間の幅を有することが好ましいことに留意するべきである。この幅は、使用されるビーズ３８の直径に直接的に結びついている。詳細には、ビーズは、この空間内で容易に循環可能であるべきであるが、核酸を回収する手段４０による回転も可能であるべきである。このためには、ボディー４２の外側の垂直な壁６４が粗表面を有し、それがビーズの回転を容易にすることが好ましい。
【０１０７】
ひとたび、すべてのビーズがボディー４２の外側の垂直な壁６４に沿って配置されたならば、核酸を回収する手段をカートリッジの中に完全に挿入し、それによって、図５に表されている通り、それぞれカートリッジ３０の壁の端および肩４５に対して押されるとりわけ肩４３と４４の効力によって集合体をリークタイトにすることができる。
【０１０８】
当然ながら、ゲル状物質の表面およびビーズの表面に保持されている微生物は、ビーズ３と同様に、対象とする液体の流れによって、間隙空間６２に輸送される。
【０１０９】
対象とする液体の輸送に関しては、対象とする液体がチャネル５６の中に押し込まれる際に、ダクト３２内に含有されている空気が放出されるのを、ダクト３２の基部の膜３４の存在が防止するようである。それにより、捕捉された空気によってダクト３２内に生成される圧力によって、対象とする液体のダクト内への流入が防止され、それゆえ、前記対象とする液体が空洞４７の内壁と前記ダクト３２の外壁との間の間隙空間に浸潤することになる。
【０１１０】
ひとたび、ビーズ３８がボディー４２の外側の垂直な壁６４に沿って分布され、かつ核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体が連結されたならば、溶解ステップそれ自体が開始される。このステップは、図６に表されている。この図で見て取れるように、核酸を回収する手段４０は、矢印Ｃによって表されている方向に回転させる。このために、核酸を回収する手段４０のボディー４２は、任意の適した機械的共役手段によって、自動化された装置と連結されている。そのようなシステムは、とりわけ、回転速度の正確な調整を可能にする。
【０１１１】
さりとて、核酸を回収する手段を手操作で回転させることも企図できる。このために、把持手段（表されていない）をボディー４２の上部に明確に提供することもできる。それにより、一方の手でカートリッジ３０を持ちながら、これらの把持手段をもう一方の手で掴むことができる。
【０１１２】
例として、回転速度値は、３００〜２０００ｒｐｍの間、好ましくは１０００ｒｐｍでありうる。
【０１１３】
回転時間は、それとしては、通常１〜２分の間である。
【０１１４】
これらの２つのパラメータの選択が、溶解することが意図されている微生物のタイプに依存していることはかなり明白である。すなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタイプの酵母を溶解するには、最適溶解条件は、２分間の１０００ｒｐｍと等しい回転速度からなる。
【０１１５】
このステップ中に、ビーズ３８は、核酸を回収する手段のボディー４２に対する摩擦によって、対称軸の周りで回転させられる。この二重回転によって、ビーズ３８とボディー４２との間に捕捉されている微生物の機械的な溶解がもたらされる。これは、対象とする液体中への核酸の放出をもたらす結果となる。
【０１１６】
ひとたび、溶解ステップが完遂され、核酸が放出されれば、対象とする液体は、図７に表されている通り、汲み上げ／送達手段によって、空洞４８の中に汲み上げられる。詳細には、腕５４での牽引の任意の適した自動または手動手段による矢印Ｄに従った垂直方向の並進によって、汲み上げ／送達手段を移動させる。上記手段のこの並進運動は、空洞４８への、対象とする液体５０の汲み上げをもたらす。この汲み上げの間、対象とする液体は、溶解ステップの前におけるその送達中にそれが従った進路の逆の進路に従う。詳細には、それは、核酸を回収する手段４０とカートリッジ３０との間の間隙空間の中へと進行し、チャネル５６を昇り戻り、空洞４８の中に到達する。図７および８で見ることができるように、空洞４８を満たす、対象とする液体には、微生物の標的核酸７０が負荷されている。
【０１１７】
核酸を回収する手段４０はカートリッジ３０に完全に挿入されるので、ビーズを含まない微生物保持ゾーンの役割を果たす、前記手段４０の下壁６０とカートリッジの底部との間に位置する間隙空間は、ビーズ３８の移動を可能にするには十分に大きくない。それにより、ビーズ３８は、ボディー４２の垂直な壁６４に沿って配置されたまま残ることになる。
【０１１８】
同様に、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間は、フィルターの役割を果たすのに、とりわけ溶解ステップ中に産生される細胞破片を保持するのに、とりわけ適している。これは、カートリッジの製造中および核酸を回収する手段の製造中に、この間隙空間のサイズが、とりわけよく制御され、かつフィルタリング効果を最適化するようなやり方で、前記カートリッジおよび前記核酸を回収する手段の寸法を調整できるためである。
【０１１９】
ひとたび、対象とする液体がすべて空洞４８の中に汲み上げられたならば、前記液体を生物学的分析装置に輸送することが企図できる。この輸送は、分析装置の中へと直接的に行うことも、その最終エレメントが分析装置である流体回路の中へと行うこともできる。
【０１２０】
対象とする液体を装置の中に直接的に輸送する場合、（１または複数種の）微生物を同定するためのすべての核酸処理ステップが、装置それ自体の中で行われることが企図されている。したがって、例えば、装置の中で、標的核酸の増幅、これらの標的核酸の切断および標識化、および相補配列とのハイブリダイゼーションによる、その検出を行うことが企図されうる。
【０１２１】
図９では、流体分析装置８０が部分的に縦断面で表されている。この装置８０は、その上部に、核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体に流体を介して接続するための優先ゾーン８２を含む。優先接続ゾーン８２は通常、円錐の形態、より詳細にはダクト３２の形態に相補的である。その最上部で、それは、装置８０の内部流体回路８６へのアクセスを得るための開口部８４を有する。この図９で表されるように、流体分析装置８０は、矢印Ｅに従って、優先接続ゾーン８２を核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体の基部まで、詳細には、ダクト３２を閉じている膜３４のレベルまで持ち上げることによって、前記集合体に接続される。優先接続ゾーン８２の端はとがっているので、後者が膜３４と接触する際に、それは前記膜に穿孔し、ダクト３２へのアクセスを開く。その後、分析装置８０は、図１０に表すように、それが接触状態になるまで、すなわち、優先接続ゾーンの外壁がダクト３２の内壁に接触するまで、ダクト３２の中に挿入される。核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体に、分析装置８０がそのように接続された場合、優先接続ゾーン８２の端がチャネル５６の下端と接触するようになることが見出される。それにより、優先接続ゾーン８２の上部で、流体装置８０の壁が、チャネル５６と、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間との間の液体を介した連絡を断ち切ることになる。
【０１２２】
それにより、標的核酸７０で負荷されている、対象とする液体５０を操作者が分析装置８０の中に輸送しようとする際に、再び、矢印Ｂに従った空洞４８への垂直な推進によって前記手段が移動するように、汲み上げ／送達手段の腕５４に圧力を加えることが十分となる。これは図１１に表されている。
【０１２３】
汲み上げ／送達手段の移動によって、空洞４８を空洞４７に接続するチャネル５６への、対象とする液体５０および核酸７０の輸送がもたらされる。チャネル５６は、優先接続ゾーン８２の開口部８４によって、流体分析装置８０の内部流体回路８６と液体を介して直接的に連絡しているので、対象とする液体は、その後、前記液体が外部環境と接触するようになるいかなる危険性もなく、分析装置８０の中に直接的に輸送される。チャネル５６と、空洞４７の内壁とダクト３２の外壁との間の間隙空間との間の液体を介したいかなる連絡も遮断されているので、核酸を回収する手段４０とカートリッジ３０との間の間隙空間の中に、対象とする液体が漏れる危険性もない。これは図１２で表されている。
【０１２４】
ひとたび、対象とする液体５０および核酸７０のすべてが流体分析装置８０に輸送されたならば、核酸を回収する手段４０−カートリッジ３０集合体から前記装置を取り外すことができる。上記集合体は使用済みなので、それらは廃棄される。流体分析装置８０は、それとしては、微生物の同定を行うのに後で使用される。
【０１２５】
有利な一実施形態によれば、図１〜１２に関連して上述したすべてのステップ、とりわけ微生物溶解、核酸抽出、および流体分析装置への前記核酸の輸送に結びついたステップをアドホックシステムによって自動化できる。
【０１２６】
図１３〜１６は、本発明による装置の第２の実施形態を表す。考慮されている装置は、第１の実施形態による装置より簡易な設計を有する。
【０１２７】
この第２の実施形態による装置も、空気収集手段９０を含む。この手段は、上部エレメント９２および下部エレメント９４で構成されている。上側のエレメント９２は通常、円筒状の形態である。この円筒の下端は開いているが、上端は、水平な壁９３によって、部分的に閉じている。この壁９３は、その中央で、ダクト９８によって上部エレメント９２の中に伸長するオリフィスを有し、ダクト９８の基部は、実質的に円錐の形態である。実際、この部分は、空気収集手段９０の中への空気吸入ダクトを構成している。特定の一実施形態によれば、この空気吸入ダクトは、任意の適切な手段によって、空気再循環回路のパイプに接続できる。
【０１２８】
その下部に、ダクト９８は、スクリーン９９を含む。このスクリーンの機能は、空気収集手段９０の内側における気流の均等な分布を可能にすることである。
【０１２９】
上部エレメント９２の垂直な環状壁１００の下端は、その外面上に肩１００１を含む。この凹みは、壁１００の周縁全体にわたって作られている。それは、上部エレメント９２と下部エレメント９４との連結を容易にするように意図されている。
【０１３０】
下部エレメント９４も、通常、円筒状の形態である。この円筒の上端は開いているが、下端は、その中央に実質的に円筒状の空気放出ダクト１０２を含む水平な壁１０１によって、部分的に閉じており、前記ダクトの基部は、上記水平な壁と一体化している。ダクト１０２の下端は開いている。このダクトは、下部エレメント９４の内部と連絡しており、それによって、空気収集手段９０の上部エレメント９２と下部エレメント９４とが連結した際に、ダクト１０２は、空気吸入ダクト９８によって、空気収集手段９０の中に入れられた空気の放出ダクトの役割を果たしている。
【０１３１】
下部エレメント１４の垂直な環状壁１０４の上端は、その内面上に肩１０４１を含む。この肩は、壁１０４の周縁全体にわたって作られている。壁１００および壁１０４の端は相補的な形の断面を有しており、一体に装着するのを容易にしているという事実により、それも、上部エレメント９２および下部エレメント９４を一体に装着するのを容易にするように意図されている。第一に、この一体の装着が可逆的であることが重要である。ひとたび一体に装着されれば、エレメント９２およびエレメント９４は、相互に取り外し可能であるべきである。
【０１３２】
エレメント９２およびエレメント９４を一体に装着する代替の手段は、一方のエレメントをもう一方にねじ入れることによって、一体に装着することでありうる。このためには、エレメント９２またはエレメント９４のうちの一方の壁の端は、雄ネジを保持し、かつ第２のエレメントの壁の端は、対応するメスネジを保持しうる。
【０１３３】
重要なことは、空気のいかなる寄生流入も防止するために、収集手段が密閉されていることである。
【０１３４】
特定の１モードの空気収集手段の使用によれば、空気放出ダクト１０２の下端を空気吸引ポンプ（表示されていない）または任意の同等なポンピング手段に接続することができる。
【０１３５】
カートリッジ１１０は空気収集手段９０の中に配置される。これを行うには、空気収集手段９０を構成するエレメント９２とエレメント９４とが分離される。カートリッジ１１０は、空気収集手段９０の下部エレメント９４の中に保持されるように置かれる。その後、上部エレメント９２を、下部エレメント９４の上に再配置し、これら２つの手段を連結する。空気収集手段９０およびカートリッジ１１０で構成されている集合体は、その後、上述の通り、空気収集手段１０の内部の空気の循環を引き起こすために、再循環回路に接続されるか、またはポンピング装置に接続される。
【０１３６】
縦断面で表されているカートリッジ１１０は、低い高さと、実質的に環状の横断面と有する円筒状の一般的形態を有する。この円筒の上端は開いているが、下端は、壁１１２で構成されている。この壁１１２は、溶解手段１１８の支持体として働き、微生物保持ゾーンを構成する。これらの溶解手段は、上述の通り、ビーズで構成されている。ビーズは、上述の通り、１（または複数の）層のビーズが埋め込まれている層の形態で堆積しているゲル状物質によって、１または複数の重ねられた層の形態で適所に保たれる。
【０１３７】
空気収集手段中の空気の循環が始まった際に、前記空気が従う進路は、図１３中の矢印によって表されている。したがって、空気は、空気吸入ダクト９８を介して空気収集手段９０に入ることが見出される。スクリーニング９９の効力によって、空気は、均等に分布され、かつビーズ１１８の上部層に衝突し、ゲル状物質または培養培地の表面において、圧入により、この部位における、気流中で輸送されていた微生物の残留をもたらす。
【０１３８】
空気は、それとしては、ポンピング手段によって吸引されて、その経路を継続する。それは、カートリッジ１１０の壁の内面に沿って昇り戻る。それは、この同じ壁の外面に沿って再降下し、再び空気放出ダクト１０２の入り口で集中流に変換されるようになり、前記空気放出ダクトを介して空気収集手段９０から外に出る。
【０１３９】
ひとたび、空気収集が行われたならば、空気収集手段９０のエレメント９２およびエレメント９４がはずされ、カートリッジ１１０が回収される。
【０１４０】
その後、図１４に表しているように、対象とする液体の分配ステップが行われる。このステップ中に、マニピュレーターが、図１４に部分的に表されているピペット１２２を用いて、所与の容積の、対象とする液体１２０をカートリッジ１１０内に入れる。上記に説明した通り、対象とする液体は、例えば、溶解緩衝液でありうる。対象とする液体と、ビーズを捕捉しているゲル状物質との間の接触によって、前記物質の懸濁と、それゆえビーズそれら自体の懸濁とがもたらされる。カートリッジ１１０に入れられる、対象とする液体の容積は、例えば、０．５ｍｌでありうる。
【０１４１】
ひとたび、このステップが行われれば、マニピュレーターは、核酸を回復する手段１２４をカートリッジ１１０の中に入れる。第１の実施形態で記述した手段４０とは異なり、手段１２４は、汲み上げ／送達手段も、対象とする液体を受容できる空洞も含まない。この手段１２４は、実質的に円筒状の横断面を有し、上部に優先把持ゾーン１２６を有する。手段１２４の下壁１２８は、実質的に平らであり、ビーズに対して押される。その後、矢印Ｆの方向で、手段１２４を対称軸の周りで回転させることによって、マニピュレーターが溶解を行う。壁１２８の回転は、対称軸の周りにおける、ビーズ１１８の回転をもたらす。この二重回転によって、ビーズ１１８と壁１２８との間に捕捉されている微生物の機械的な溶解がもたらされる。これによって、対象とする液体中への核酸の放出がもたらされる結果となる。
【０１４２】
ひとたび、溶解ステップが完遂され、核酸が放出されれば、前記核酸７０で負荷されている、対象とする液体は、図１６に表されているように、ピペット１２２によって、マニピュレーターが汲み上げる。
【０１４３】
ひとたび、対象とする液体すべてがピペットに入れば、上述の通り、分析装置内で様々な核酸処理ステップを行うために、前記液体を分析装置に輸送することができる。それは、保存するために容器の中に入れることも、核酸処理ステップの前のステップを行うことが意図されている任意な装置の中に入れることもできる。そのようなステップは、例えば、依然として存在している細胞成分からそれらを分離することによって、核酸を濃縮することが意図されている精製ステップでありうる。本発明による装置が第２の実施形態で使用される場合、第２の実施形態が簡易設計であることによって、核酸で負荷されている、対象とする液体は、第１の実施形態による装置で行われ、かつ上記に説明したいかなる濾過も施されていないので、そのようなステップは、とりわけ重要である。
【実施例】
【０１４４】
実施例１
本発明による装置を用いた、エアロゾル中に含有されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率の測定
この測定を行うために、リークタイト試験台を設計した。この試験台は図１７に表されている。それは、エアロゾル発生器２０２によって、エアロゾルが入れられる密閉空気回路２００で構成されている。この発生器は、既知濃度の胞子懸濁液から、一定量のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＣＩＰ５２．６２）胞子を気流中に導入することを可能にする。適したエアロゾル発生器は、例えば、ＴＳＩ社によって販売されている。空気は、吸引ポンプ２０４によって、回路内を循環する。空気中に含有されている粒子、とりわけほこりの粒子の除去を可能にするために、３枚のＴＨＥフィルター２０６が回路に沿って存在している。圧力計２０８は、回路内の圧力の確認を可能にし、２つの流量計２１０は、回路内における空気の流速の確認を可能にする。本発明による装置は、２１２として参照されている。それは、空気収集手段１０で構成されており、その中に、カートリッジ３０が置かれている。この収集手段は、上記に説明した通り、空気回路に接続されている。最後に、空気回路内の２つの試料採取源が、装置２１２のすぐ上流と、すぐ下流とに配置されている。これらのレベルで試料採取された空気は、一定の画分の形態で、粒子すなわち画分中に含有されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の空気力学測定を行うために、スペクトロメーター２１４に送られる。このスペクトロメーターは、ＴＳＩ社販売のＡｅｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ（登録商標）モデル３３２１である。スペクトロメーターへ送られる、この補助回路の中への空気の輸送は、バルブ２１６によって行われ、これらによって、装置２１２の上流または下流における試料採取を容認または防止することを可能にする。上流画分および下流画分の差分解析は、本発明による装置によるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率を計算することを可能にする。
【０１４５】
本発明による装置を通過する空気の流速は、制御された湿度および温度条件（２５℃、３５％の相対湿度）下で、５０ｌ／ｍｉｎである。この流速はポンプ２０４によって得られる。
【０１４６】
本発明による装置の捕捉効率を、以下の２つの条件下で試験した。
−ビーズ３６がゲル状物質なしでカートリッジ内に配置されているカートリッジを用いた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率の測定。
−ビーズ３６がカートリッジ内に配置され、かつグリセロールの薄膜コーティングで覆われているカートリッジを用いた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の捕捉効率の測定。この産物は、十分に高粘着性であり、収集皿へのエアロゾルの良好な接着を提供し、かつ後続の分子分析を概ね妨げない。
【０１４７】
グリセロールの存在下および非存在下で得られた結果を図１８に示す。この図では、発生器２０２によって生成されたエアロゾル粒子の直径の関数として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子の収集効率を相関させることが可能である。
カートリッジ内にビーズ３６を覆うゲル状物質が存在しない場合、本発明による装置による胞子収集効率が、最大７０％超にまで及びうるようである。
カートリッジ内にビーズ３６を覆うゲル状物質が存在する場合、収集効率は、９０％超にまで上昇する。
グリセロール型のゲル状物質の存在下における収集効率の増大は、胞子がこの物質に固着したまま残るという事実によって説明される。ゲル状物質の非存在下では、ビーズ表面で胞子が跳ね返って、それによって、それらがビーズに固着したまま残るのを阻止する現象がわずかに起こる。
【０１４８】
実施例２
本発明による溶解方法と代替方法との間の比較による溶解効率の測定
この場合、以下の３通りの溶解方法が、本発明による方法と比較される。
−ＦａｓｔＰｒｅｐ（商標）装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社販売のＦＰ１２０型、ＢＩＯ１０１）を用いた機械的溶解方法。
−リゾチームを用いた酵素的溶解方法。
−細胞懸濁液を９０℃に加熱するステップおよびそれに続く細胞の凍結溶解３ステップを組み合わせた、カオトロピック試薬（グアニジウムイソチオシアネート、ＧｕＳＣＮ）を用いた方法。
この実施例では、使用される細胞は、懸濁液中のＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓである。
溶解ステップの後に、出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出システムを用いて、回収した核酸を精製する。精製された核酸は、最後に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ検出方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて定量化される。比較試験の正確なステップを以下に記載する。
【０１４９】
−ステップ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ懸濁液の調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの培養は、ＴＳＡ（トリプチケースソイ）プレートの寒天培養培地上で行う。細菌コロニーを寒天上に回収し、出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３（参照番号２８０１３２）中で洗浄する。ひとたび細胞が洗浄されたならば、波長６００ｎｍで光学濃度０．５を有する細菌懸濁液を得るために、それらを同じ抽出緩衝液５ｍｌで希釈する。
【０１５０】
−ステップ２ａ：ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）装置を用いた溶解
１ｇのガラスビーズの混合物（等しい割合の様々なサイズ、すなわち１５０〜２１２μｍ、４２０〜６００μｍおよび７００〜１１８０μｍのビーズ）で満たされた２ｍｌチューブに、細菌懸濁液０．５ｍｌを移す。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）装置を最高回転速度で（６．０に設定）６０秒間使用する。ひとたび溶解が完了したならば、精製ステップを行うために、溶解物１００μｌをＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５１】
−ステップ２ｂ：本発明による装置を用いた溶解
細菌懸濁液０．３ｍｌを上述したカートリッジ１１０と同等なカートリッジ内に移す。このカートリッジは、その後、ガラスビーズの混合物（等しい割合の様々なサイズ、すなわち１５０〜２１２μｍ、２１２〜３００μｍおよび４２０〜６００μｍのビーズ）０．４ｇで満たされる。このカートリッジを、核酸を回収する手段と接触させる。後者を２０００ｒｐｍで２分間、回転させる。ひとたびこの溶解ステップが行われたならば、精製ステップを行うために、溶解物１００μｌをＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５２】
−ステップ２ｃ：酵素的溶解
リゾチームを用いたこの溶解方法では、細菌懸濁液１００μｌをリゾチーム溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと混合する。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。このインキュベーションの後、精製ステップを行うために、全溶解物（２００μｌ）をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５３】
−ステップ２ｄ：カオトロピック溶解
細菌懸濁液１００μｌをＧｕＳＣＮの濃縮溶液（５ｍｏｌ／ｌ）１００μｌと混合し、全混合物を３０分間インキュベートする。このインキュベーションの後、精製ステップを行うために、全溶解物（２００μｌ）をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置内に移す。
【０１５４】
−ステップ３：ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置を用いた、溶解物の精製
精製ステップは、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置の汎用抽出プロトコールを用いて行う。出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）溶解緩衝液（参照番号２８０１３４）２ｍｌ、および出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）磁性シリカ粒子（参照番号２８０１３３）の懸濁液５０μｌを各溶解物に添加する。各溶解物の核酸を２５μｌのＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３中に溶出させる。
【０１５５】
−ステップ４：核酸の検出
各溶出液中の核酸量を決定するために、前記溶出液１０μｌを０．２ｍｌ ＰＣＲチューブ内に入れる。その後、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ溶液１８０μｌを試料に添加し、出願人が販売するＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ＥａｓｙＱ（登録商標）装置を用いて蛍光シグナルを測定する。
【０１５６】
蛍光測定の結果は図１９に示されている。対応は以下の通りである。
Ａ＝ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）装置を用いた溶解
Ｂ＝本発明による装置を用いた溶解
Ｃ＝酵素的溶解
Ｄ＝カオトロピック溶解
【０１５７】
図１９を分析することによって、本発明による装置の溶解効率は、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）の機械的溶解方法のものと類似したものであることが見出される。さらに、これらの２つの機械的方法は、酵素的溶解方法またはカオトロピック試薬を用いた化学的溶解方法より、有意に効率的である。
【０１５８】
実施例３
ＮＡＳＢＡ法による検出と組み合わせた本発明による装置を用いたＢａｃｉｌｌｕｓ懸濁液の溶解
ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３中に希釈されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの懸濁液０．３ｍｌを本発明によるカートリッジの中に導入する。前の実施例で記載した本発明による溶解方法を２分間、再現する。溶解ステップの後に、溶解物５μｌを使用して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓに特異的なプライマーおよびプローブを用い、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ＥａｓｙＱ（登録商標）装置を用いた蛍光によって、リアルタイムＮＡＳＢＡ法による検出を行う。検出に用いる標的遺伝子はＥＦ−ｔｕ遺伝子である。増幅産物のサイズは１１５ヌクレオチドである。
６から６×１０５の範囲の様々な量のＢａｃｉｌｌｕｓを用いた。
図２０は、蛍光のリアルタイム生成を、本発明による装置に導入された様々な量のＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの関数として示す。この図では、対応は以下の通りである、
ａ＝６×１０５桿菌を含む試料
ｂ＝６×１０４桿菌を含む試料
ｃ＝６×１０３桿菌を含む試料
ｄ＝６００桿菌を含む試料
ｅ＝６０桿菌を含む試料
ｆ＝６桿菌を含む試料
ｇ＝桿菌を含まない試料
【０１５９】
図２０の観点から、検出された蛍光のレベルと、試料中に含有されていた細菌の数との間に極めて良い相関関係が観察される。さらに、細菌を含有しない試料と、６細菌のみ含有する試料との間に有意な相違が見出される。最後に、この分析の結果から、本発明による装置は、ＮＡＳＢＡ型の核酸増幅法の使用に適したレベルの実績を提供することが推論できる。
ＮＡＳＢＡ法で増幅を行う前に、核酸を濃縮することによって、この分析の感受性を改善できるであろうことに留意するべきである。そのような濃度ステップは、例えば、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置を用いて行うことができる。
【０１６０】
実施例４
本発明による装置を用いた全血試料の分析
この実施例では、本発明による装置を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの集団が添加されている全血試料を分析する。血液試料は、健康な個体から得る。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓの培養は、ＴＳＡ（トリプチケースソイ）プレートの寒天培養培地上で行う。細菌コロニーを寒天上に回収し、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３で洗浄する。ひとたび細胞が洗浄されたならば、波長６００ｎｍで光学濃度０．５を有する細菌懸濁液を得るために、それらを同じ抽出緩衝液５ｍｌで希釈する。この保存懸濁液は、約２．２×１０７細菌／ｍｌを含有している。１つは１０３細菌／ｍｌ、そして１つは１０５細菌／ｍｌである異なった濃度を有する懸濁液を得るために、この保存懸濁液をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液３で希釈する。
【０１６１】
各希釈懸濁液について、続いて用いられるプロトコールは以下の通りである。
１．希釈懸濁液２４μｌを血液１５０μｌに添加して、混合する。
２．本発明によるカートリッジの中に、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）抽出緩衝液１（参照番号２８０１３０）１２５μｌを導入する。
３．今度は細菌で負荷した血液試料をカートリッジに導入する。
４．カートリッジを、核酸を回収する手段と接触させることによって、溶解ステップを行う。核酸を回収する手段を２０００ｒｐｍで２分間回転させる。
５．１００μｌの溶解物をカートリッジ内に汲み上げる。
６．実施例２のステップ３に記載の通り、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）装置を用いて、この溶解物の精製を行い、溶出液２５μｌの回収を可能にする。
７．この溶出液５μｌを使用して、リアルタイムＮＡＳＢＡ技法を用いて、増幅および検出を行う。
【０１６２】
結果は、図２１に示されている。この図では、対応は以下の通りである。
ａ＝５３桿菌を含有する全血試料（１０５細菌／ｍｌの希釈懸濁液）
ｂ＝５桿菌を含有する全血試料（１０３細菌／ｍｌの希釈懸濁液）
ｃ＝５桿菌を含有する全血試料（１０３細菌／ｍｌの希釈懸濁液）
ｄ＝細菌を含まない全血試料
【０１６３】
示されている結果は、１０３および１０５細菌／ｍｌの希釈懸濁液に対応している。さらに、１０５細菌／ｍｌの懸濁液用の分析はデュプリケートで行われた。
【０１６４】
本発明によるカートリッジに導入された希釈懸濁液の容積の観点から、１０３細菌／ｍｌおよび１０５細菌／ｍｌの懸濁液における細菌の実際の量は、それぞれ５細菌および５３０細菌である。
【０１６５】
したがって、本発明による装置を用いた、５細菌のみを含有する試料の分析は、陽性の検出シグナル（曲線群ｂおよびｃ）を生成し、これは、細菌を含有しない試料で得られた結果（曲線ｄ）から、明確に識別できることが見出される。
【０１６６】
さらに、少量の細菌を用いた場合でさえ、結果が再現可能であることが見出される。これは、曲線ＢおよびＣによって示されている。
【０１６７】
精製ステップの終わりに得られた２５μｌのうち５μｌのみを用いただけで、この極めて良好な感受性が得られたことに留意するべきである。したがって、この感受性は、精製の後に試料を濃縮するステップを行うことによってさらに改善できる。
【０１６８】
すなわち、これらの実施例から、本発明による装置は、空気試料中に含有されている細菌を収集し、それらを溶解し、そして分析用に前記細菌から核酸を回収することを可能にする有効なツールであることが明らかになる。このために、使用される装置は、まず第一に空気収集手段の中に導入されたカートリッジと、第二に、核酸を回収する手段を組み合わされた、収集された細菌を含有するカートリッジとで構成されるであろう。
【０１６９】
本発明による装置は、全血試料などの臨床試料の分析にも完全に適している。この場合、カートリッジは空気収集手段なしで用いられる。液体試料をカートリッジの中に入れ、その後、細菌を溶解して、核酸を回収するために、後者を、核酸を回収する手段と組み合わせる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空気収集手段の内部に配置され、核酸を回収する手段を受け入れることのできるカートリッジであって、実質的に円筒状であり、微生物保持ゾーンを含み、前記保持ゾーンが微生物溶解手段を含むカートリッジ。
【請求項２】
微生物保持ゾーンが、微生物を保持し、溶解手段を適所に維持し、液体の存在下で溶解することができる物質を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項３】
前記物質がゲル状物質である、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項４】
前記ゲル状物質が微生物培養培地である、請求項３に記載のカートリッジ。
【請求項５】
分析装置を接続するための手段も含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項６】
溶解手段がビーズで構成されている、請求項５に記載のカートリッジ。
【請求項７】
ビーズの直径が２００〜６００μｍである、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項８】
空気中に含有されている微生物を収集する装置であって、
−空気吸入ダクトを含む上部エレメントと、空気放出ダクトを含む下部エレメントとを含む空気収集手段であって、前記空気収集手段内部に気流を生成できるように、前記上部エレメントおよび下部エレメントを相互に連結することが可能である空気収集手段と、
−前記空気収集手段の内部に配置された、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジと
を含む装置。
【請求項９】
空気収集手段が、空気再循環回路に接続可能である、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
微生物を、前記微生物から核酸を単離する目的で溶解する装置であって、
−微生物保持ゾーンに置かれた微生物を含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のカートリッジと、
−カートリッジ内に置くことができる、実質的に円筒状の、核酸を回収する手段と
を含み、前記微生物を溶解し、核酸の放出を可能にするために、前記回収する手段が微生物溶解手段と協働する装置。
【請求項１１】
核酸を回収する手段が、液体を汲み上げる／送達する手段を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
核酸を回収する手段が、液体貯蔵ゾーンも含む、請求項１０および１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
カートリッジの内径が、核酸を回収する手段の外径より大きく、その結果、核酸を回収する手段がカートリッジ内に装着される場合、核酸を回収する手段の外壁からカートリッジの内壁を離している距離が、溶解手段がこの間隙空間内に存在することを可能にするのに十分大きく、かつ溶解手段が前記壁のいずれか１つと接触するのに十分小さい、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
空気中に含有されている微生物を濃縮する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
保持ゾーン内で微生物を増殖させるステップｄ）も含む、請求項１４に記載の濃縮方法。
【請求項１６】
保持ゾーン内に存在する溶解手段上に微生物が保持される、請求項１４および１５のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項１７】
空気中に含有されている微生物を溶解する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が、懸濁液中に入るステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
空気中に含有されている微生物を溶解する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項１９】
空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｇ）前記カートリッジ内部で、前記核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｈ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法。
【請求項２０】
空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）前記カートリッジ内部で、前記核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｈ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内の、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
カートリッジの保持ゾーン内に濃縮された微生物を増殖させる追加ステップｄ’）を含む、請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
増殖が、２〜２４時間の範囲のある時間にわたって、カートリッジをインキュベーター内でインキュベートすることによって行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
微生物を溶解する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項２４】
微生物を溶解する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項２５】
微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）前記核酸を回収する手段を前記カートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）前記核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、前記核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、前記核酸を回収する手段と前記カートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、前記カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、前記カートリッジの垂直な内壁と、前記核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｅ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内の、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｅ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法。
【請求項２７】
微生物を溶解する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項２８】
微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｄ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法。
【請求項２９】
試料中に含有されている１または複数種の微生物を同定する方法であって、
−請求項８乃至１３のいずれか一項に記載の装置によって、前記試料中に含有されている微生物から核酸を単離するステップと、
−そのように単離された（１または複数種の）微生物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
核酸を精製する中間ステップも含む、請求項２９に記載の同定方法。
【請求項３１】
同定ステップが、
−単離された核酸を特異的に増幅するサブステップと、
−そのように増幅された核酸を検出するサブステップと
を含む、請求項２９および３０のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項３２】
同定ステップが、請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の装置のカートリッジと液体を介して連絡している同定装置内で行われる、請求項２９乃至３１のいずれか一項に記載の同定方法。
【請求項３３】
単離された核酸を、請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の装置の核酸を回収する手段から、同定装置に輸送する、請求項３２に記載の同定方法。
【請求項３４】
核酸を含有する、対象とする液体の、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段による送達によって核酸の輸送が行われ、前記対象とする液体が、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に含有されている、請求項３３に記載の同定方法。
【請求項１】
空気収集手段の内部に配置され、核酸を回収する手段を受け入れることのできるカートリッジであって、実質的に円筒状であり、微生物保持ゾーンを含み、前記保持ゾーンが微生物溶解手段を含むカートリッジ。
【請求項２】
微生物保持ゾーンが、微生物を保持し、溶解手段を適所に維持し、液体の存在下で溶解することができる物質を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項３】
前記物質がゲル状物質である、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項４】
前記ゲル状物質が微生物培養培地である、請求項３に記載のカートリッジ。
【請求項５】
分析装置を接続するための手段も含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項６】
溶解手段がビーズで構成されている、請求項５に記載のカートリッジ。
【請求項７】
ビーズの直径が２００〜６００μｍである、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項８】
空気中に含有されている微生物を収集する装置であって、
−空気吸入ダクトを含む上部エレメントと、空気放出ダクトを含む下部エレメントとを含む空気収集手段であって、前記空気収集手段内部に気流を生成できるように、前記上部エレメントおよび下部エレメントを相互に連結することが可能である空気収集手段と、
−前記空気収集手段の内部に配置された、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジと
を含む装置。
【請求項９】
空気収集手段が、空気再循環回路に接続可能である、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
微生物を、前記微生物から核酸を単離する目的で溶解する装置であって、
−微生物保持ゾーンに置かれた微生物を含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のカートリッジと、
−カートリッジ内に置くことができる、実質的に円筒状の、核酸を回収する手段と
を含み、前記微生物を溶解し、核酸の放出を可能にするために、前記回収する手段が微生物溶解手段と協働する装置。
【請求項１１】
核酸を回収する手段が、液体を汲み上げる／送達する手段を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
核酸を回収する手段が、液体貯蔵ゾーンも含む、請求項１０および１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
カートリッジの内径が、核酸を回収する手段の外径より大きく、その結果、核酸を回収する手段がカートリッジ内に装着される場合、核酸を回収する手段の外壁からカートリッジの内壁を離している距離が、溶解手段がこの間隙空間内に存在することを可能にするのに十分大きく、かつ溶解手段が前記壁のいずれか１つと接触するのに十分小さい、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
空気中に含有されている微生物を濃縮する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
保持ゾーン内で微生物を増殖させるステップｄ）も含む、請求項１４に記載の濃縮方法。
【請求項１６】
保持ゾーン内に存在する溶解手段上に微生物が保持される、請求項１４および１５のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項１７】
空気中に含有されている微生物を溶解する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が、懸濁液中に入るステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
空気中に含有されている微生物を溶解する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項１９】
空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｆ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｇ）前記カートリッジ内部で、前記核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｈ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法。
【請求項２０】
空気中に含有されている微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを、前記カートリッジ内部の保持ゾーンが空気収集手段の空気吸入ダクトと連絡するように、空気収集手段の内部に置くステップと、
ｂ）任意の適切な手段によって、前記空気収集手段への空気の流入を引き起こすステップと、
ｃ）カートリッジの保持ゾーンで、空気中に含有されている微生物を濃縮するステップと、
ｄ）空気収集手段からカートリッジを取り出すステップと、
ｅ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｆ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｇ）前記カートリッジ内部で、前記核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｈ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内の、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
カートリッジの保持ゾーン内に濃縮された微生物を増殖させる追加ステップｄ’）を含む、請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
増殖が、２〜２４時間の範囲のある時間にわたって、カートリッジをインキュベーター内でインキュベートすることによって行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
微生物を溶解する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、核酸を回収する手段とカートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、カートリッジの垂直な内壁と、核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項２４】
微生物を溶解する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項２５】
微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）前記核酸を回収する手段を前記カートリッジ内に装着するステップと、
ｃ）前記核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に事前に入れられた、対象とする液体の送達を引き起こすステップであって、前記核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記送達が行われ、そのように送達された液体が、前記核酸を回収する手段と前記カートリッジとの間に位置する間隙空間を満たし、それによって、前記カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入り、前記溶解手段が、前記カートリッジの垂直な内壁と、前記核酸を回収する手段の垂直な外壁との間に存在するようになるステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解させるステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させ、それによって前記微生物から核酸を放出させるステップと、
ｅ）核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内の、対象とする液体の汲み上げを引き起こすステップであって、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段によって前記汲み上げが行われ、そのように汲み上げられた、対象とする液体が、溶解中に放出された前記微生物の核酸を含有するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンで濃縮される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジを得るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）対象とする液体をカートリッジ内に導入し、それによって、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｄ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｅ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法。
【請求項２７】
微生物を溶解する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと
を含む方法。
【請求項２８】
微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）前記微生物を含有する液体試料を、保持ゾーンの近くで、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のカートリッジの中に導入し、その結果、前記液体試料によってカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段が懸濁液中に入るステップと、
ｂ）核酸を回収する手段をカートリッジ内に置くステップと、
ｃ）カートリッジ内部で、核酸を回収する手段を回転させることによって、微生物を機械的に溶解するステップであって、微生物がその上に保持されている溶解手段を、前記核酸を回収する手段が回転させるステップと、
ｄ）溶解中に放出された、前記微生物の核酸を含有する、対象とする液体を汲み上げるステップと
を含む方法。
【請求項２９】
試料中に含有されている１または複数種の微生物を同定する方法であって、
−請求項８乃至１３のいずれか一項に記載の装置によって、前記試料中に含有されている微生物から核酸を単離するステップと、
−そのように単離された（１または複数種の）微生物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
核酸を精製する中間ステップも含む、請求項２９に記載の同定方法。
【請求項３１】
同定ステップが、
−単離された核酸を特異的に増幅するサブステップと、
−そのように増幅された核酸を検出するサブステップと
を含む、請求項２９および３０のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項３２】
同定ステップが、請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の装置のカートリッジと液体を介して連絡している同定装置内で行われる、請求項２９乃至３１のいずれか一項に記載の同定方法。
【請求項３３】
単離された核酸を、請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の装置の核酸を回収する手段から、同定装置に輸送する、請求項３２に記載の同定方法。
【請求項３４】
核酸を含有する、対象とする液体の、核酸を回収する手段の汲み上げ／送達手段による送達によって核酸の輸送が行われ、前記対象とする液体が、核酸を回収する手段の貯蔵ゾーン内に含有されている、請求項３３に記載の同定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２０１０−５２８６４３（Ｐ２０１０−５２８６４３Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０８６３（Ｐ２０１０−５１０８６３）
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１０１２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００１０１０
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１０１２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００１０１０
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]