環状デプシペプチド
【課題】医薬品として用いた場合に副作用を回避できる程度の適度な生理活性を有する新規な環状デプシペプチドを提供する。
【解決手段】頭楯目の海洋肉食性軟体動物由来のPhilinopsis speciosakulokekahilide-7Aの構造あるいはkulokekahilide-7Bの構造式を有する新規な環状デプシペプチド。この新規デプシペプチドは医薬品として副作用を回避できる制癌剤として特に有用である。
【解決手段】頭楯目の海洋肉食性軟体動物由来のPhilinopsis speciosakulokekahilide-7Aの構造あるいはkulokekahilide-7Bの構造式を有する新規な環状デプシペプチド。この新規デプシペプチドは医薬品として副作用を回避できる制癌剤として特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質としての新規な環状デプシペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年，医薬品の素材として海洋生物の生産する生理活性物質が注目され、海洋生物由来の新規な環状デプシペプチドの単離が試みられている。また、環状デプシペプチドは、癌に対する薬理作用等の生理活性を有することが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。例えば、海洋軟体生物であるアメフラシ科のタツナミガイ（Dolabella auricularia）から単離された環状デプシペプチドの一つであるオーリライドは非常に強力な細胞毒性を示す（例えば、特許文献４参照）。
【０００３】
また、本発明者らは、制癌剤として有用である新規な環状デプシペプチドの創出につき鋭意検討する中で、頭楯目の海洋肉食性軟体動物であるPhilinopsis speciosaに着目し、Philinopsis speciosaの抽出物の分画を進めたところ、純粋な活性ペプチドの単離に成功し、これをkulokekahilide-2と命名してJ. Nat. Prod.（非特許文献１）に報告した。天然由来のkulokekahilide-2の生理活性について検証したところ、ガン細胞株であるＰ３８８、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、及びＡ−１０に対してＩＣ５０の値が、それぞれ、4.2、7.5、14.6、及び59.1nMという強い細胞毒性を示すことを発見した。
【０００４】
さらに、この天然由来のkulokekahilide-2について高分解能質量分析および一次元および二次元ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ）の解析に基づいて構造解析を行った結果、当該ペプチドがＣ４４Ｈ６７Ｎ５Ｏ１０の組成式を有し、alanine（Ａｌａ）、Isoleucine（Ｉｌｅ）、N-methylglycine（ＮＭｅＧｌｙ）、N-methylphenylalanine（ＮＭｅＰｈｅ）、およびalanineの５つのアミノ酸、ならびに、2-hydroxyisocaproic acid（leucic acid 、Ｈｉｃａ）および5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-2,8-decadienoic acid（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ-Ｄｔｄａ）の２つのヒドロキシ脂肪酸から構成されている新規な環状デプシペプチドであることを導出し、また、その構成アミノ酸の立体配置についても推定した。
【０００５】
本発明者らは上述の構造解析の結果に基づいて種々の立体異性体の合成を試みた。そして合成に成功した全ての立体異性体について生理活性を測定し、天然由来のkulokekahilide-2のスペクトルと全く同様なスペクトルを示す化合物（５）を合成異性体の中から見出し、この合成異性体は天然物と同等の細胞毒性を示した（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２３３０８４号公報
【特許文献２】特表２００６−５０１２９１号公報
【特許文献３】特表２００６−５２３２１４号公報
【特許文献４】特開２００３−６４０９７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Y. Nakao, W. Y. Yoshida, Y. Takada, J. Kimura, L. Yang, S. L .Mooberry, and P. J. Scheuer, J.Nat.Prod., 2004, 67 1332-1340
【非特許文献２】Y. Takadda, M. Umehara, Y. Nakao, J. Kimura, Tetrahedron Lett., 2008, 49, 1163-1165
【化１】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、この（５）に示す構造式で表される化合物は、細胞毒性が強いため、制癌剤等の医薬品に用いた場合に副作用を引き起こす虞がある。本発明者らは上述したkulokekahilide-2の立体異性体の合成を進めたところ、本発明に係る適度な生理活性を有する環状デプシペプチドを見出した。
【０００９】
本発明の目的は、医薬品として用いた場合に副作用を回避できる程度の適度な生理活性を有する新規な環状デプシペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明に係る環状デプシペプチドによれば、
一般式（１）
【化２】
【００１１】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体が提供される。（上記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
また、本発明に係る環状デプシペプチドによれば、
一般式（２）
【化３】
【００１２】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体が提供される。（上記一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明の環状デプシペプチドによれば、適度な生理活性を有し、制癌剤等の医薬品に用いた場合に副作用を回避できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態に係る環状デプシペプチドについて説明するが、本発明は、以下に述べる実施の形態に限定されるものではない。本実施の形態に係る環状デプシペプチドであるkulokekahilide-7Aの構造を下記式（３）に、kulokekahilide-7Bの構造式を下記式（４）にそれぞれ示す。なお、下記式（３）及び（４）は原子省略法によって記載され、省略された末端はすべてメチル基である。
【化４】
【化５】
【００１５】
本実施の形態に係るkulokekahilide-7A及びkulokekahilide-7Bは、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｎ−メチルグリシン（ＮＭｅＧｌｙ）、Ｄ−メチルフェニルアラニン（Ｄ−ＭｅＰｈｅ）、及びＤ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）の５つのアミノ酸、ならびに、２−ヒドロキシイソカプロン酸（Ｄ−ｌｅｕｃｉｃ ａｃｉｄ、Ｈｉｃａ）および５，７−ジヒドロキシー２，６，８−トリメチルー２，８デカジエン酸（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａ）の２つのヒドロキシ脂肪酸から構成されている環状デプシペプチドである。
【００１６】
また、本実施の形態に係るkulokekahilide-7A及びkulokekahilide-7Bは、Ｐ３８８マウス白血病細胞及びヒト子宮がん由来ＨａＬａ細胞に対して適度な細胞毒性を示す。
【００１７】
本発明の化合物の構造及び生理活性について説明したが、次に本実施の形態に係る環状デプシペプチドの製造方法について説明する。本実施の形態に係るkulokekahilide-7A及びkulokekahilide-7Bは、以下に示す手順により合成される。
【００１８】
まず、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）のカルボキシル基をトリクロロエチル基（Ｔｃｅ）で保護し、カルボシル基が保護されたＬ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とする。そして、縮合剤を用い、Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅとアミノ基がｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護されたＮ−メチルグリシン（Ｂｏｃ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ）と反応させ、Ｂｏｃ−ジペプチド（Ｂｏｃ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００１９】
次に、Ｄ−メチルフェニルアラニンのアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護したＤ−メチルフェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ）と、Ｂｏｃ−ジペプチドのＮ末端側の保護基Ｂｏｃを除去したジペプチド（Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とを縮合剤を用いて反応させ、Ｂｏｃ−トリペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２０】
そして、アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護したＤ−アラニン（Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ）と、Ｂｏｃ−トリペプチドのＮ末端側の保護基Ｂｏｃを除去したトリペプチド（Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）と縮合剤を用いて反応させ、Ｂｏｃ−テトラペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２１】
そして、後述する方法により合成されるＤ−２−ヒドロキシイソカプロン酸（Ｄ−Ｈｉｃａ）とＢｏｃ−テトラペプチドのＮ末端側の保護基Ｂｏｃを除去したテトラペプチド（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とを縮合剤を用いて反応させ、ペンタペプチド（Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２２】
そして、後述する合成方法により得られる５，７−ジヒドロキシー２，６，８−トリメチルー２，８デカジエン酸（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａ）の５位をメチルチオメチル基（ＭＴＭ）、７位をｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）で保護し、ペンタペプチドと縮合剤を用いて反応させ、デプシヘキサペプチド（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２３】
最後に、Ｄ−アラニンのアミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）で保護したＦｍｏｃ−Ｄ−アラニンと、ＴＢＳ基を除去したデプシヘキサペプチド（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，５−Ｏ−ＭＴＭ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とを縮合剤を用いて反応させ、デプシヘプタペプチド（ Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）−５−Ｏ−ＭＴＭ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｍｅ−Ｐｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２４】
そして、デプシヘプタペプチドのＦｍｏｃ基を除去し、縮合剤（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ）を用いて環化させ、MTM基を除去後kulokakahalide-7A及び7Bを得る。
【００２５】
上述の実施の形態において縮合剤として、１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ）、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスジメチルアミノホスホニウム塩（Ｂｏｐ）及びＢｏｐ誘導体のホスホニウム塩等を用いることができる。
【００２６】
また、上述の実施の形態において添加剤を用いることもでき、添加剤としてジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を用いることができる。
【００２７】
また、上述の実施の形態において、縮合反応に用いる溶媒として、無水または含水のクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ピリジン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメトキシエタン、アセトニトリル等が挙げられ、そして必要に応じてこれらの溶媒の２種以上を混合して用いることができる。
【００２８】
ここで、上述のkulokekahilide-7A及び7Bの合成に用いられるＤ−Ｈｉｃａ及び５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａの合成方法について説明する。
【００２９】
Ｄ−Ｈｉｃａは、市販のＬ−２−ヒドロキシイソカプロン酸（Ｌ−Ｈｉｃａ）のカルボキシル基をメチルエステル化し、安息香酸を用いた光延反応により水酸基が結合している炭素の立体配置を反転させ、アルカリを用いて加水分解を行うことにより得られる。
【００３０】
次に、５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａの合成方法について説明する。市販の（Ｓ）−（＋）−４−イソプロピルー３プロピオニル−２−オキサゾリジノンを出発物質に用いてアンチ選択的アルドール縮合を行い、Ｄｔｄａの６〜１０位に相当する炭素骨格を有する化合物が得られる。この化合物をアルデヒドに変換し、向山アルドール反応を行うと５位の水酸基の立体がＲ体である化合物が得られる。この５位の水酸基の立体をＳ体に反転させ、メチルチオメチル基で保護し、加水分解することにより５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａが得られる。
【００３１】
なお、本実施の形態において、上記の式（３）または（４）に示した構造式によって表される化合物について説明したが、式（３）または（４）で表される化合物の他、当該化合物の薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体であってもよい。薬理上許容される塩とは、常法に従って式（３）または（４）に示した構造式によって表される化合物を酸または塩基で処理することにより得られる塩であって、著しい毒性を有さず、医薬として使用され得る塩をいう。このような酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸等の有機酸等による付加塩があげられ、塩基による塩としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、グアニジン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基による塩が挙げられる。
【００３２】
また、薬理上許容されるエステル誘導体とは、例えば上述の実施の形態において、式（３）または（４）に示した構造式によって表される化合物の水酸基が保護されたエステル誘導体をいう。本実施の形態においては、式（３）または（４）で示した化合物の水酸基中の水素原子をアシル基で置換することによってエステル誘導体を形成することができる。
【実施例】
【００３３】
次に本実施の形態に係る環状デプシペプチドの実施の形態ついて、実施例を用いてより具体的に説明を行う。kulokekahilide-7A及び7Bは、以下の手順により得られる。
【００３４】
（１）ジペプチド（Ｂｏｃ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ（１．３９ｇ、６．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１６．０ｍＬ）に溶液に、トリクロロエタノール（ＴｃｅＯＨ、０．６９ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、縮合剤にＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１．３８ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加え、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＴｃｅを得た。これに４Ｍ塩酸ジオキサン溶液（１２ｍＬ）で処理し、Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＴｃｅ・ＨＣｌとした。この塩酸塩をＣＨ２Ｃｌ２−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１：１、２４ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ、０．８４ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−ＮＭｅＧｌｙ（１．３６ｇ、７．２ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ（９７３ｍｇ、７．２ｍｍｏｌ）、そしてＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１．３８ｇ、７．２．０ｍｍｏｌ）を加え、縮合し、Ｂｏｃ−ジペプチド（２．３６ｇ、５．４５ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００３５】
（２）トリペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−ジペプチド（３．７１ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）を、４Ｍ塩酸−ジオキサン溶液（２０ｍＬ）で処理し、ジペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩（６４４ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１：１、６ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ２Ｎｅｔ、０．９４ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ｄ−ＮＭｅＰｈｅ（５４２ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ)を加え、ＨＢＴＵ（７９２ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を用いて縮合し、Ｂｏｃ−トリペプチド（８８２ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
【００３６】
（３）テトラペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−トリペプチド（２．２３ｇ、２．７６ｍｍｏｌ）を、４Ｍ塩酸−ジオキサン溶液（７．０ｍＬ）で処理し、トリペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩（２．０２ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１：１、１５．０ｍＬ）溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．５２ｍＬ、３．７６ｍｍｏｌ）、ｉＰｒ２ＮＥｔ（１．３３ｍＬ、７．５１ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（８５３ｍｇ、４．５１ｍｍｏｌ）及びＰｙＢＯＰ（登録商標）（(Benzotriazol-1-yloxy）tripyrrolidinophosphonium hexafluorophospate 、２．３５ｇ、４．５１ｍｍｏｌ）を加え縮合し、Ｂｏｃ−テトラペプチド（１．４３ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、５６％）を得た。
【００３７】
（４）ペンタペプチド（Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−テトラペプチド（１．３３ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を、４Ｍ塩酸−ジオキサン溶液（４．０ｍＬ）で処理し、トリペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩（１．１８g、１．９５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１：１、８．０ｍＬ）溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．２７ｍＬ、１．９５ｍｍｏｌ）、Ｄ−Ｈｉｃａ（３２３ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ（２７８ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（７８５ｍｇ、３．９０ｍｍｏｌ）を加え縮合し、ペンタペプチド（１．４３ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、５６％）を得た。
【００３８】
（５）デプシヘキサペプチド（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ)
ペンタペプチド（４６３ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３．０ｍＬ）溶液に、５位をメチルチオメチル基（ＭＴＭ）、７位をｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）で保護したジヒドロキシ酸（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ、２３６ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６９．３ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ)、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（２１７ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え縮合し、デプシヘキサペプチド（４５６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、７５％）を得た。
【００３９】
（６）デプシヘプタペプチド［Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ］
デプシヘキサペプチド（４３７ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）をフッ化水素−ピリジン塩（１．５３ｇ）のピリジン−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１：４、７．８ｍＬ）混合溶液（９．０ｍＬ）に溶かし、５５℃で反応させ、７位のＴＢＳ基を除去した（３４６ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、８８％）。このアルコール（３３１ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．４ｍＬ）溶液に、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（２１４ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４１．９ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌ（２６４ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を加え、縮合し、デプシヘプタペプチド（４０５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、９４％）を得た。
【００４０】
（７）環化前駆体［Ｈ２Ｎ−Ｄ−Ａｌａ−（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＣＯＯＨ］
デプシヘプタペプチド（３８０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１２．１ｍＬ）溶液に、１Ｍ酢酸アンモニウム（２．０ｍＬ）、および亜鉛粉末（１．３９ｍｇ、２１．２ｍｍｏｌ）を加え、Ｃ−末端側のＴｃｅ基を脱離し、遊離カルボン酸（３１４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、９２％）とし、このカルボン酸（２８４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１２．６ｍＬ）溶液に、ジエチルアミン（１．３ｍＬ）を加え、Ｎ−末端側のＦｍｏｃ基を除去し、環化前駆体（２０３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、８９％）を得た。
【００４１】
（８）環状化合物
環化前駆体（１９０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１０：１、２０９ｍＬ）混合溶液に、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、５７０ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（８０４ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ)を加え、マクロラクタム化させ、環状化合物（１５２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、８２％）を得た。この環状化合物（１２８ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ−水（４：１、５．０ｍＬ）混合溶液に、２，６−ルチジン（０．３３７ｍＬ、２．８９ｍｍｏｌ）および硝酸銀（９８２ｍｇ、５．７８ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で反応させ、ジヒドロキシ酸のＭＴＭ保護基を除去し、kulokekahilide-7A及び7Bの混合物（１０９ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００４２】
（９）kulokekahilide-7A及び7Bの単離
ＨＰＬＣ（Cosmosil 5C18-MS, 250×10mm、溶媒：50%アセトニトリル水、flow rate：２．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）を用いてkulokekahilide-7A（保持時間９１分）及び7B (保持時間１３３分)を単離し、kulokekahilide7A及び7Bをおよそ３：１の割合で得た。
【００４３】
上述した手順で合成したkulokekahilide-7Aの物理化学的性質を下記の表１に、kulokekahilide-7Bの物理化学的性質を下記の表２にそれぞれ示す。
【表１】
【表２】
【００４４】
（生理活性測定）
上述した手順で合成したkulokekahilide-7A及び7Bについて下記に示す条件の下、生理活性測定を行った。あわせて、比較例として、kulokekahilide-2、抗癌作用を示す抗生物質として既知のアドリアマイシン（ＡＤＭ）についても同様の条件下で生理活性測定を行った。ガン細胞株として、ヒト子宮がん由来ＨｅＬａ細胞、およびＰ３８８マウス白血病細胞を選択し、これらの細胞株のそれぞれについて、上記化合物をサンプルとして下記の条件で細胞毒性（ＩＣ５０）を測定した。なお、ＩＣ５０値は、サンプルを加えていないコントロールの吸収値から各サンプル投与群の吸収値を差し引き、これをコントロールの吸収値で割り、１００をかけて細胞増殖阻害率（％）としたうえで、各濃度での細胞増殖阻害率（％）を片対数グラフにプロットし、５０％阻害を与える濃度を算出することにより求めた。
【００４５】
（Ｈｅｌａ細胞）
ヒト子宮がん由来ＨｅＬａ細胞は、２μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍＬの抗生物質を添加し、１ＭＨＣｌでｐＨ７．０−７．４に調節したＭＥＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で培養を行った。９６穴マクロプレートの各ウェルに細胞を含む２００μＬ（１０００細胞／ｍＬ）の培地を加えて２４時間培養を行った後に、各濃度のサンプル溶液２μＬを添加して９６時間培養を行った。５０μＬの3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide（ＭＴＴ） 生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え３時間培養を続けた。上清を除去後、生じた沈殿にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて溶解し５１０ｎｍの吸収を測定した。
【００４６】
（Ｐ−３８８細胞）
Ｐ３８８マウス白血病細胞（ＪＣＲＢ１７）は、１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１０％ウシ胎児血清、１０μＭの２−ヒドロキシエチルジスルフィドを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ）中で、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で培養を行った。９６穴マクロプレートの各ウェルに１００μＬの細胞懸濁液（１×１０４細胞／ｍＬ）と１００μＬのサンプルを含む培地を加え、９６時間培養を行った。５０μＬの3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide（ＭＴＴ）生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え３時間培養を続けた。上清を除去後、生じた沈殿にＤＭＳＯを加えて溶解し５１０ｎｍの吸収を測定した。
【００４７】
以上、説明した条件で行った生理活性測定の結果を下記表３に示す。なお、下記表３において、Ｋ−７Ａはkulokekahilide-7Aを、Ｋ−７Ｂはkulokekahilide-7Bを、Ｋ−２はkulokekahilide-2を、ＡＤＭはアドリアマイシンを示すものとする。
【表３】
【００４８】
上述した結果より、本実施例に係るkulokekahilide-7A及び7Bは、Ｐ３８８マウス白血病細胞及びヒト子宮がん由来ＨａＬａ細胞に対して、kulokekahilide-2及びこれらの２細胞に対して抗癌作用を示すアドリアマイシンよりも細胞毒性としては弱いが、適度な細胞毒性を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明に係る環状デプシペプチドによれば、適度な生理活性を有し、制癌剤等の医薬品として用いた場合に副作用を回避することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質としての新規な環状デプシペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年，医薬品の素材として海洋生物の生産する生理活性物質が注目され、海洋生物由来の新規な環状デプシペプチドの単離が試みられている。また、環状デプシペプチドは、癌に対する薬理作用等の生理活性を有することが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。例えば、海洋軟体生物であるアメフラシ科のタツナミガイ（Dolabella auricularia）から単離された環状デプシペプチドの一つであるオーリライドは非常に強力な細胞毒性を示す（例えば、特許文献４参照）。
【０００３】
また、本発明者らは、制癌剤として有用である新規な環状デプシペプチドの創出につき鋭意検討する中で、頭楯目の海洋肉食性軟体動物であるPhilinopsis speciosaに着目し、Philinopsis speciosaの抽出物の分画を進めたところ、純粋な活性ペプチドの単離に成功し、これをkulokekahilide-2と命名してJ. Nat. Prod.（非特許文献１）に報告した。天然由来のkulokekahilide-2の生理活性について検証したところ、ガン細胞株であるＰ３８８、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、及びＡ−１０に対してＩＣ５０の値が、それぞれ、4.2、7.5、14.6、及び59.1nMという強い細胞毒性を示すことを発見した。
【０００４】
さらに、この天然由来のkulokekahilide-2について高分解能質量分析および一次元および二次元ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ）の解析に基づいて構造解析を行った結果、当該ペプチドがＣ４４Ｈ６７Ｎ５Ｏ１０の組成式を有し、alanine（Ａｌａ）、Isoleucine（Ｉｌｅ）、N-methylglycine（ＮＭｅＧｌｙ）、N-methylphenylalanine（ＮＭｅＰｈｅ）、およびalanineの５つのアミノ酸、ならびに、2-hydroxyisocaproic acid（leucic acid 、Ｈｉｃａ）および5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-2,8-decadienoic acid（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ-Ｄｔｄａ）の２つのヒドロキシ脂肪酸から構成されている新規な環状デプシペプチドであることを導出し、また、その構成アミノ酸の立体配置についても推定した。
【０００５】
本発明者らは上述の構造解析の結果に基づいて種々の立体異性体の合成を試みた。そして合成に成功した全ての立体異性体について生理活性を測定し、天然由来のkulokekahilide-2のスペクトルと全く同様なスペクトルを示す化合物（５）を合成異性体の中から見出し、この合成異性体は天然物と同等の細胞毒性を示した（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２３３０８４号公報
【特許文献２】特表２００６−５０１２９１号公報
【特許文献３】特表２００６−５２３２１４号公報
【特許文献４】特開２００３−６４０９７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Y. Nakao, W. Y. Yoshida, Y. Takada, J. Kimura, L. Yang, S. L .Mooberry, and P. J. Scheuer, J.Nat.Prod., 2004, 67 1332-1340
【非特許文献２】Y. Takadda, M. Umehara, Y. Nakao, J. Kimura, Tetrahedron Lett., 2008, 49, 1163-1165
【化１】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、この（５）に示す構造式で表される化合物は、細胞毒性が強いため、制癌剤等の医薬品に用いた場合に副作用を引き起こす虞がある。本発明者らは上述したkulokekahilide-2の立体異性体の合成を進めたところ、本発明に係る適度な生理活性を有する環状デプシペプチドを見出した。
【０００９】
本発明の目的は、医薬品として用いた場合に副作用を回避できる程度の適度な生理活性を有する新規な環状デプシペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明に係る環状デプシペプチドによれば、
一般式（１）
【化２】
【００１１】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体が提供される。（上記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
また、本発明に係る環状デプシペプチドによれば、
一般式（２）
【化３】
【００１２】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体が提供される。（上記一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明の環状デプシペプチドによれば、適度な生理活性を有し、制癌剤等の医薬品に用いた場合に副作用を回避できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態に係る環状デプシペプチドについて説明するが、本発明は、以下に述べる実施の形態に限定されるものではない。本実施の形態に係る環状デプシペプチドであるkulokekahilide-7Aの構造を下記式（３）に、kulokekahilide-7Bの構造式を下記式（４）にそれぞれ示す。なお、下記式（３）及び（４）は原子省略法によって記載され、省略された末端はすべてメチル基である。
【化４】
【化５】
【００１５】
本実施の形態に係るkulokekahilide-7A及びkulokekahilide-7Bは、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｎ−メチルグリシン（ＮＭｅＧｌｙ）、Ｄ−メチルフェニルアラニン（Ｄ−ＭｅＰｈｅ）、及びＤ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）の５つのアミノ酸、ならびに、２−ヒドロキシイソカプロン酸（Ｄ−ｌｅｕｃｉｃ ａｃｉｄ、Ｈｉｃａ）および５，７−ジヒドロキシー２，６，８−トリメチルー２，８デカジエン酸（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａ）の２つのヒドロキシ脂肪酸から構成されている環状デプシペプチドである。
【００１６】
また、本実施の形態に係るkulokekahilide-7A及びkulokekahilide-7Bは、Ｐ３８８マウス白血病細胞及びヒト子宮がん由来ＨａＬａ細胞に対して適度な細胞毒性を示す。
【００１７】
本発明の化合物の構造及び生理活性について説明したが、次に本実施の形態に係る環状デプシペプチドの製造方法について説明する。本実施の形態に係るkulokekahilide-7A及びkulokekahilide-7Bは、以下に示す手順により合成される。
【００１８】
まず、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）のカルボキシル基をトリクロロエチル基（Ｔｃｅ）で保護し、カルボシル基が保護されたＬ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とする。そして、縮合剤を用い、Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅとアミノ基がｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護されたＮ−メチルグリシン（Ｂｏｃ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ）と反応させ、Ｂｏｃ−ジペプチド（Ｂｏｃ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００１９】
次に、Ｄ−メチルフェニルアラニンのアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護したＤ−メチルフェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ）と、Ｂｏｃ−ジペプチドのＮ末端側の保護基Ｂｏｃを除去したジペプチド（Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とを縮合剤を用いて反応させ、Ｂｏｃ−トリペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２０】
そして、アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護したＤ−アラニン（Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ）と、Ｂｏｃ−トリペプチドのＮ末端側の保護基Ｂｏｃを除去したトリペプチド（Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）と縮合剤を用いて反応させ、Ｂｏｃ−テトラペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２１】
そして、後述する方法により合成されるＤ−２−ヒドロキシイソカプロン酸（Ｄ−Ｈｉｃａ）とＢｏｃ−テトラペプチドのＮ末端側の保護基Ｂｏｃを除去したテトラペプチド（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とを縮合剤を用いて反応させ、ペンタペプチド（Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２２】
そして、後述する合成方法により得られる５，７−ジヒドロキシー２，６，８−トリメチルー２，８デカジエン酸（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａ）の５位をメチルチオメチル基（ＭＴＭ）、７位をｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）で保護し、ペンタペプチドと縮合剤を用いて反応させ、デプシヘキサペプチド（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２３】
最後に、Ｄ−アラニンのアミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）で保護したＦｍｏｃ−Ｄ−アラニンと、ＴＢＳ基を除去したデプシヘキサペプチド（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，５−Ｏ−ＭＴＭ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）とを縮合剤を用いて反応させ、デプシヘプタペプチド（ Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）−５−Ｏ−ＭＴＭ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｍｅ−Ｐｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）を得る。
【００２４】
そして、デプシヘプタペプチドのＦｍｏｃ基を除去し、縮合剤（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ）を用いて環化させ、MTM基を除去後kulokakahalide-7A及び7Bを得る。
【００２５】
上述の実施の形態において縮合剤として、１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ）、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスジメチルアミノホスホニウム塩（Ｂｏｐ）及びＢｏｐ誘導体のホスホニウム塩等を用いることができる。
【００２６】
また、上述の実施の形態において添加剤を用いることもでき、添加剤としてジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を用いることができる。
【００２７】
また、上述の実施の形態において、縮合反応に用いる溶媒として、無水または含水のクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ピリジン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメトキシエタン、アセトニトリル等が挙げられ、そして必要に応じてこれらの溶媒の２種以上を混合して用いることができる。
【００２８】
ここで、上述のkulokekahilide-7A及び7Bの合成に用いられるＤ−Ｈｉｃａ及び５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａの合成方法について説明する。
【００２９】
Ｄ−Ｈｉｃａは、市販のＬ−２−ヒドロキシイソカプロン酸（Ｌ−Ｈｉｃａ）のカルボキシル基をメチルエステル化し、安息香酸を用いた光延反応により水酸基が結合している炭素の立体配置を反転させ、アルカリを用いて加水分解を行うことにより得られる。
【００３０】
次に、５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａの合成方法について説明する。市販の（Ｓ）−（＋）−４−イソプロピルー３プロピオニル−２−オキサゾリジノンを出発物質に用いてアンチ選択的アルドール縮合を行い、Ｄｔｄａの６〜１０位に相当する炭素骨格を有する化合物が得られる。この化合物をアルデヒドに変換し、向山アルドール反応を行うと５位の水酸基の立体がＲ体である化合物が得られる。この５位の水酸基の立体をＳ体に反転させ、メチルチオメチル基で保護し、加水分解することにより５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−Ｄｔｄａが得られる。
【００３１】
なお、本実施の形態において、上記の式（３）または（４）に示した構造式によって表される化合物について説明したが、式（３）または（４）で表される化合物の他、当該化合物の薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体であってもよい。薬理上許容される塩とは、常法に従って式（３）または（４）に示した構造式によって表される化合物を酸または塩基で処理することにより得られる塩であって、著しい毒性を有さず、医薬として使用され得る塩をいう。このような酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸等の有機酸等による付加塩があげられ、塩基による塩としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、グアニジン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基による塩が挙げられる。
【００３２】
また、薬理上許容されるエステル誘導体とは、例えば上述の実施の形態において、式（３）または（４）に示した構造式によって表される化合物の水酸基が保護されたエステル誘導体をいう。本実施の形態においては、式（３）または（４）で示した化合物の水酸基中の水素原子をアシル基で置換することによってエステル誘導体を形成することができる。
【実施例】
【００３３】
次に本実施の形態に係る環状デプシペプチドの実施の形態ついて、実施例を用いてより具体的に説明を行う。kulokekahilide-7A及び7Bは、以下の手順により得られる。
【００３４】
（１）ジペプチド（Ｂｏｃ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ（１．３９ｇ、６．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１６．０ｍＬ）に溶液に、トリクロロエタノール（ＴｃｅＯＨ、０．６９ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、縮合剤にＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１．３８ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加え、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＴｃｅを得た。これに４Ｍ塩酸ジオキサン溶液（１２ｍＬ）で処理し、Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＴｃｅ・ＨＣｌとした。この塩酸塩をＣＨ２Ｃｌ２−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１：１、２４ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ、０．８４ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−ＮＭｅＧｌｙ（１．３６ｇ、７．２ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ（９７３ｍｇ、７．２ｍｍｏｌ）、そしてＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１．３８ｇ、７．２．０ｍｍｏｌ）を加え、縮合し、Ｂｏｃ−ジペプチド（２．３６ｇ、５．４５ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００３５】
（２）トリペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−ジペプチド（３．７１ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）を、４Ｍ塩酸−ジオキサン溶液（２０ｍＬ）で処理し、ジペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩（６４４ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１：１、６ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ２Ｎｅｔ、０．９４ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ｄ−ＮＭｅＰｈｅ（５４２ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ)を加え、ＨＢＴＵ（７９２ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を用いて縮合し、Ｂｏｃ−トリペプチド（８８２ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
【００３６】
（３）テトラペプチド（Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−トリペプチド（２．２３ｇ、２．７６ｍｍｏｌ）を、４Ｍ塩酸−ジオキサン溶液（７．０ｍＬ）で処理し、トリペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩（２．０２ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１：１、１５．０ｍＬ）溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．５２ｍＬ、３．７６ｍｍｏｌ）、ｉＰｒ２ＮＥｔ（１．３３ｍＬ、７．５１ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（８５３ｍｇ、４．５１ｍｍｏｌ）及びＰｙＢＯＰ（登録商標）（(Benzotriazol-1-yloxy）tripyrrolidinophosphonium hexafluorophospate 、２．３５ｇ、４．５１ｍｍｏｌ）を加え縮合し、Ｂｏｃ−テトラペプチド（１．４３ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、５６％）を得た。
【００３７】
（４）ペンタペプチド（Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ）
Ｂｏｃ−テトラペプチド（１．３３ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を、４Ｍ塩酸−ジオキサン溶液（４．０ｍＬ）で処理し、トリペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩（１．１８g、１．９５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１：１、８．０ｍＬ）溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．２７ｍＬ、１．９５ｍｍｏｌ）、Ｄ−Ｈｉｃａ（３２３ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ（２７８ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（７８５ｍｇ、３．９０ｍｍｏｌ）を加え縮合し、ペンタペプチド（１．４３ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、５６％）を得た。
【００３８】
（５）デプシヘキサペプチド（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ)
ペンタペプチド（４６３ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３．０ｍＬ）溶液に、５位をメチルチオメチル基（ＭＴＭ）、７位をｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）で保護したジヒドロキシ酸（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ、２３６ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６９．３ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ)、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（２１７ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え縮合し、デプシヘキサペプチド（４５６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、７５％）を得た。
【００３９】
（６）デプシヘプタペプチド［Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｔｃｅ］
デプシヘキサペプチド（４３７ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）をフッ化水素−ピリジン塩（１．５３ｇ）のピリジン−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１：４、７．８ｍＬ）混合溶液（９．０ｍＬ）に溶かし、５５℃で反応させ、７位のＴＢＳ基を除去した（３４６ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、８８％）。このアルコール（３３１ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．４ｍＬ）溶液に、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（２１４ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４１．９ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌ（２６４ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を加え、縮合し、デプシヘプタペプチド（４０５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、９４％）を得た。
【００４０】
（７）環化前駆体［Ｈ２Ｎ−Ｄ−Ａｌａ−（５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）−５−Ｏ−ＭＴＭ−７−Ｏ−ＴＢＳ−Ｄｔｄａ−Ｄ−Ｈｉｃａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＭｅＰｈｅ−Ｎ−ＭｅＧｌｙ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＣＯＯＨ］
デプシヘプタペプチド（３８０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１２．１ｍＬ）溶液に、１Ｍ酢酸アンモニウム（２．０ｍＬ）、および亜鉛粉末（１．３９ｍｇ、２１．２ｍｍｏｌ）を加え、Ｃ−末端側のＴｃｅ基を脱離し、遊離カルボン酸（３１４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、９２％）とし、このカルボン酸（２８４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１２．６ｍＬ）溶液に、ジエチルアミン（１．３ｍＬ）を加え、Ｎ−末端側のＦｍｏｃ基を除去し、環化前駆体（２０３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、８９％）を得た。
【００４１】
（８）環状化合物
環化前駆体（１９０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＤＭＦ（１０：１、２０９ｍＬ）混合溶液に、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、５７０ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（８０４ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ)を加え、マクロラクタム化させ、環状化合物（１５２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、８２％）を得た。この環状化合物（１２８ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ−水（４：１、５．０ｍＬ）混合溶液に、２，６−ルチジン（０．３３７ｍＬ、２．８９ｍｍｏｌ）および硝酸銀（９８２ｍｇ、５．７８ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で反応させ、ジヒドロキシ酸のＭＴＭ保護基を除去し、kulokekahilide-7A及び7Bの混合物（１０９ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００４２】
（９）kulokekahilide-7A及び7Bの単離
ＨＰＬＣ（Cosmosil 5C18-MS, 250×10mm、溶媒：50%アセトニトリル水、flow rate：２．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）を用いてkulokekahilide-7A（保持時間９１分）及び7B (保持時間１３３分)を単離し、kulokekahilide7A及び7Bをおよそ３：１の割合で得た。
【００４３】
上述した手順で合成したkulokekahilide-7Aの物理化学的性質を下記の表１に、kulokekahilide-7Bの物理化学的性質を下記の表２にそれぞれ示す。
【表１】
【表２】
【００４４】
（生理活性測定）
上述した手順で合成したkulokekahilide-7A及び7Bについて下記に示す条件の下、生理活性測定を行った。あわせて、比較例として、kulokekahilide-2、抗癌作用を示す抗生物質として既知のアドリアマイシン（ＡＤＭ）についても同様の条件下で生理活性測定を行った。ガン細胞株として、ヒト子宮がん由来ＨｅＬａ細胞、およびＰ３８８マウス白血病細胞を選択し、これらの細胞株のそれぞれについて、上記化合物をサンプルとして下記の条件で細胞毒性（ＩＣ５０）を測定した。なお、ＩＣ５０値は、サンプルを加えていないコントロールの吸収値から各サンプル投与群の吸収値を差し引き、これをコントロールの吸収値で割り、１００をかけて細胞増殖阻害率（％）としたうえで、各濃度での細胞増殖阻害率（％）を片対数グラフにプロットし、５０％阻害を与える濃度を算出することにより求めた。
【００４５】
（Ｈｅｌａ細胞）
ヒト子宮がん由来ＨｅＬａ細胞は、２μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍＬの抗生物質を添加し、１ＭＨＣｌでｐＨ７．０−７．４に調節したＭＥＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で培養を行った。９６穴マクロプレートの各ウェルに細胞を含む２００μＬ（１０００細胞／ｍＬ）の培地を加えて２４時間培養を行った後に、各濃度のサンプル溶液２μＬを添加して９６時間培養を行った。５０μＬの3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide（ＭＴＴ） 生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え３時間培養を続けた。上清を除去後、生じた沈殿にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて溶解し５１０ｎｍの吸収を測定した。
【００４６】
（Ｐ−３８８細胞）
Ｐ３８８マウス白血病細胞（ＪＣＲＢ１７）は、１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１０％ウシ胎児血清、１０μＭの２−ヒドロキシエチルジスルフィドを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ）中で、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で培養を行った。９６穴マクロプレートの各ウェルに１００μＬの細胞懸濁液（１×１０４細胞／ｍＬ）と１００μＬのサンプルを含む培地を加え、９６時間培養を行った。５０μＬの3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide（ＭＴＴ）生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え３時間培養を続けた。上清を除去後、生じた沈殿にＤＭＳＯを加えて溶解し５１０ｎｍの吸収を測定した。
【００４７】
以上、説明した条件で行った生理活性測定の結果を下記表３に示す。なお、下記表３において、Ｋ−７Ａはkulokekahilide-7Aを、Ｋ−７Ｂはkulokekahilide-7Bを、Ｋ−２はkulokekahilide-2を、ＡＤＭはアドリアマイシンを示すものとする。
【表３】
【００４８】
上述した結果より、本実施例に係るkulokekahilide-7A及び7Bは、Ｐ３８８マウス白血病細胞及びヒト子宮がん由来ＨａＬａ細胞に対して、kulokekahilide-2及びこれらの２細胞に対して抗癌作用を示すアドリアマイシンよりも細胞毒性としては弱いが、適度な細胞毒性を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明に係る環状デプシペプチドによれば、適度な生理活性を有し、制癌剤等の医薬品として用いた場合に副作用を回避することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化６】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体。
（上記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
【請求項２】
一般式（２）
【化７】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体。
（上記一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
【請求項１】
一般式（１）
【化６】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体。
（上記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
【請求項２】
一般式（２）
【化７】
で表される化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体。
（上記一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、水素原子、または炭素原子数１〜６個の分岐または直鎖のアルキル基を示す。）
【公開番号】特開２０１０−１７４００５（Ｐ２０１０−１７４００５Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１６２２（Ｐ２００９−２１６２２）
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（３９９１０９３３３）学校法人青山学院 (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（３９９１０９３３３）学校法人青山学院 (12)
【Ｆターム（参考）】
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