生体サンプル中の酸素及び水素の同位体による腎疾患又は腫瘍の診断
【課題】腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を判定する方法を提供する。
【解決手段】腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると判定する。
【解決手段】腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腎疾患又は腫瘍性疾患の診断に関する。具体的には、本発明は、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断の基礎として、生体サンプルにおけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値を用いる。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、水と電解質との適切な均衡を維持し、酸塩基濃度を調節し、尿として排出される代謝老廃物を血液から濾過する働きをする、脊椎動物の腹腔の背部にある一対の器官又はそのいずれか１つである。このため、腎臓障害の結果として、生体全体において全体的な不均衡が生じ得る。膀胱、腸、心臓、肺及び前立腺等の多くの器官は、体の不要な残屑を濾過して取り除き、全体的な恒常性を維持する腎臓の能力に依拠している。
【０００３】
腎臓は本質的に血液を浄化する器官である。心臓から出る腎動脈は、血液を腎臓に運び、ネフロンを含有する何百万もの糸球体のネットワークによって浄化する。ネフロンは、毒素、過剰な栄養物及び体液を濾過して取り除く。浄化及び濾過された残りの血液は、続いて腎静脈を通って血液循環中に戻る。濾過して取り除かれた物質は、尿中に排出される塩、水及び老廃物のレベルを調整する尿細管を流下する。腎盂は尿を集める。尿は腎盂から尿管を流下して膀胱に入る。尿は膀胱から尿道を通って体外に放出される。
【０００４】
腎臓疾患の種類としては、高血圧、糸球体腎炎及び嚢胞が挙げられる。糖尿病はグルコースを調節する体の能力に影響を及ぼす。血液中の過剰のグルコースは、腎臓内のネフロンに損傷を与え、毒素を濾過する血管の能力を低下させる可能性がある。高血圧もネフロンに損傷を与える可能性がある。糸球体腎炎は概して、腎臓感染とは無関係の他の疾患群に関連する。
【０００５】
両方の腎臓が疾患のために機能を停止した場合、患者は末期腎疾患（ＥＳＲＤ）又は完全腎不全を呈する。腎不全とは、体がもはや或る特定の毒素を取り除くことができず、血圧及び必須栄養素を適切に調節することができないことを意味する。腎不全を呈する患者を治療しなければ、血液中の毒素及び体液の蓄積のために数日以内に死亡する可能性がある。
【０００６】
糖尿病性腎症としても知られる糖尿病性腎臓疾患は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の個体における過度の罹患率及び若年死の重要な原因である。Ｔ１ＤＭ患者のおよそ２５％〜４０％が最終的に糖尿病性腎症を発症する。糖尿病性腎症の最も深刻な長期的影響は、腎臓がベースライン機能の１０％未満でしか機能せず、腎臓機能が永久的かつほぼ完全に喪失した状態である末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に至る腎不全である。他のＥＳＲＤの原因としては、高血圧、糸球体腎炎、多嚢胞性腎、間質性疾患、閉塞性尿路疾患、全身性エリテマトーデス及び多発性骨髄腫が挙げられる。
【０００７】
腎機能障害を診断する当該技術分野で既知の従来の方法は、特定のタンパク質の検出を伴う。特許文献１は、腎不全等の病態に罹患しやすい被験体において、好ましくは血清クレアチニンの上昇の前にサンプル中のインターロイキン１８を検出する方法に関する。特許文献２は、動物において早期腎疾患を検出する方法であって、（ａ）試験対象の動物からサンプルを得る工程と、（ｂ）サンプル中のアルブミンの量を決定する工程とを含む、動物において早期腎疾患を検出する方法を提供する。特許文献３は、急性腎臓損傷（すなわち、ＡＫＩ）、腎臓虚血再灌流障害（すなわち、ＩＲＩ）、虚血性急性腎臓損傷及び／又は虚血性急性尿細管壊死に対する新規の有用なバイオマーカーであるＧＲＯ−α（すなわち、ＣＸＣＬ１、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃリガンド１、ＧＲＯ１、ＧＲＯａ、ＭＧＳＡ、ＭＧＳＡ α、ＭＧＳＡ−ａ、ＮＡＰ−３、ＳＣＹＢ１）に関する。尿又は血液サンプル中の成分を決定することによって腎機能障害を診断する多くの方法が知られているが、かかる方法には決定の結果を得るために複雑な工程を伴うという欠点がある。
【０００８】
加えて、腫瘍又はがんは依然として最もよく見られる致死的な疾患の１つである。腫瘍の発生は生涯にわたって加齢とともに増加する。腫瘍又はがんは、がん遺伝子の活性化及び／又は腫瘍抑制遺伝子の不活性化をもたらす累積した多重遺伝子突然変異によって引き起こされる。腫瘍又はがんは依然として世界的な死亡率の主要な原因である。診断及び治療の進展にもかかわらず、全生存率はここ数年で大幅には改善されていない。特に腫瘍又はがんの初期段階における腫瘍又はがんのより正確な検出及び高感度な診断手段の必要性は、依然として満たされていない。
【０００９】
水（Ｈ２Ｏ）は生命の基本であり、さらには人体で最も重要かつ最も豊富な物質であり、体重の約７０パーセントを占める。水の重要性が認識されているにもかかわらず、水同位体の独自性は見落とされていることが多い。天然の水は、微量の重同位体水素原子及び酸素原子を含有し、その中でも主要なものは２Ｈ及び１８Ｏある。１Ｈ対２Ｈの比率は約６２４０対１、又はＶ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）水質基準では約１５５ｐｐｍであり、１６Ｏ対１８Ｏの比率は約４９９対１、又は約２００５ｐｐｍである。水同位体の特有の配置及び質量分析技術の急速な進展のために、様々な生体組織における水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の安定同位体比が、古代食研究（paleodietary）、気象学、人類学、生態学及び現代食物連鎖網研究（modern food-chained network）において「原子化石（atomic fossils）又は原子トレーサー」として用いられている。
【００１０】
安定な非放射性水同位体である２Ｈ２Ｏは、ヒトの生理及び病態生理において重要な役割を果たし得る。モデル動物及び細胞培養物を用いた幾つかの研究から、食物中の水（dietary water）における２Ｈ２Ｏの増大又は枯渇が病態生理及び生理に対して顕著な影響を有することが示された。例えば、２Ｈ２Ｏはチューブリンサブユニットの重合を刺激することによって微小管の形成を促進し、細胞死をもたらし得ることが以前に示されている。加えて、２Ｈ２Ｏ含有量の増加は、高血圧自然発生ラットにおいて高血圧を予防する可能性がある。一方で、培養培地の水における重水素の枯渇は種々の動物細胞株の成長速度を低下させる。未治療のストレプトゾトシン誘発性真性糖尿病マウスの体内の水分における水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の同位体比の痕跡が、正常なマウスとは異なることも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７，１４１，３８２号
【特許文献２】米国特許第７，９３５，４９５号
【特許文献３】米国特許第７，８３３，７３２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、いずれの従来技術文献も水同位体と腎機能との関係性を開示、教示又は示唆してはいない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法であって、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を、上記測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と上記δＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値との比較に基づいて診断することとを含み、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると診断する、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明では驚くべきことに、生体サンプルにおけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値が腎臓病態及び腫瘍性疾患に関連することが発見されている。したがって、本発明では、腎疾患又は腫瘍性疾患を、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると想定される被験体に由来する生体サンプルにおけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値と、腎疾患及び腫瘍性疾患を有しない対照におけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値との比較に基づいて診断する方法が開発される。
【００１６】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により援用される。抵触の場合には、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００１７】
「検出する」又は「診断する」という用語は、腎疾患を有する患者及び／又は腎疾患を有する危険性がある患者を特定することを指す。
【００１８】
「アッセイ」という用語は、サンプル中の物質の存在及び／又はその物質の量を決定するためにサンプルに対して行われる分析を意味する。
【００１９】
「減少した量」という用語は、規定のレベルと比較して低い量を意味する。
【００２０】
「腎疾患」という用語は、個体の腎機能の障害、損傷、異常状態又は機能障害を意味する。
【００２１】
「サンプル」という用語は、哺乳動物被験体から得られた体液又は組織液のサンプルを意味する。非限定的な例としては、本発明に使用される体液又は組織液のサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、脳脊髄液、嚢胞液、腹水、糞便、胆汁、組織液及び任意の他の単離可能な体液であり得る。
【００２２】
「腫瘍」又は「がん」という用語は、乳房、前立腺、結腸、肺、膵臓、肝臓、胃、膀胱又は生殖器官（子宮頸部、卵巣、子宮内膜等）、脳及び骨髄から発生する腫瘍若しくはがん、黒色腫、又はリンパ腫を含むが、これらに限定されないものとして本明細書中で使用される。
【００２３】
本願において引用される全ての刊行物及び特許文献は、個々の刊行物又は特許文献の各々がそのように示されているかのように、その全体があらゆる目的で同じように参照により援用される。本文献における様々な参考文献の引用によって、本出願人らは任意の特定の参考文献を本発明に対する「先行技術」であると認めるわけではない。
【００２４】
一態様では、本発明は、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法であって、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を、上記測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と上記δＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値との比較に基づいて診断することとを含み、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると診断する、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法を提供する。
【００２５】
任意の哺乳動物被験体を、本発明の方法に従って試験することができる。しかしながら、典型的には、試験被験体（すなわち患者）は、腎機能障害（例えば、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎症、腎不全、高尿酸血症、糖尿病性腎臓疾患、虚血性若しくは毒物誘発性の腎損傷、慢性腎不全、急性腎不全、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、又は慢性腎盂腎炎）又は腫瘍（例えば、骨髄リンパ腫、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽腫（ganglioblastoma）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫（leimyosarcoma）、横紋皮肉腫（rhabdotheliosarcoma）、結腸癌、膵腫瘍、肝腫瘍、乳腫瘍（breast tumor）、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、頚部腫瘍、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫（ependynoma）、松果体腫、血管芽腫、網膜芽腫、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病）、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性（myelolastic）、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性のもの、及び赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、直腸癌、頭頚部腫瘍、脳腫瘍、原発部位不明の腫瘍、末梢神経系の腫瘍、中枢神経系の腫瘍、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、転移、及び非制御の又は異常な細胞成長を特徴とする任意の疾患又は障害）を患っている。好ましくは、哺乳動物被験体は、ヒト、ブタ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ヤギ又はネコである。
【００２６】
本発明では驚くべきことに、健常な被験体における水同位体の生体恒常性の存在が見出された。健常な被験体における水の状態（δ１８Ｏ及びδ２Ｈ）は、腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体とは顕著に異なる。腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体におけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２が減少していることは極めて興味深い。
【００２７】
サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と比較される参照値は、いかなる腎疾患又は腫瘍性疾患も有しない被験体（健常な被験体）から得られる。腎疾患又は腫瘍性疾患を、続いて検査対象の被験体、例えば腎疾患又は腫瘍性疾患を患っている疑いがある被験体の体液（body liquid）サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２のレベルの低下によって診断することができる。
【００２８】
本発明による方法は、健常な被験体の日常分析、すなわち、ごく初期の段階で腎疾患又は腫瘍性疾患を診断するために毎年行われる分析にも好適である。
【００２９】
最適な「対照」参照値は、健常段階の同じ又は他の被験体から得られた参照値である。具体的には、同位体比は国際Ｖ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）標準に対するδ表記（‰）で表される。本発明によると、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体のδＯ−１８（すなわち、参照値）は約−３‰〜約−４．５‰の範囲であり、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体のδＨ−２の参照値は約−３０‰〜約−３５‰の範囲である。
【００３０】
本発明によると、水同位体は腎疾患又は腫瘍性疾患の診断において減少している。すなわち、腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体のδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値は、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体よりも低い。本発明によれば、腎疾患又は腫瘍疾患を有する被験体のδＯ−１８は、約−４．５‰、約−５‰、約−６‰、約−７‰、約−８‰、約−９‰、約−１０‰、約−１１‰、約−１２‰、約−１３‰、約−１４‰、約−１５‰、約−１６‰、約−１７‰、約−１８‰、約−１９‰、約−２０‰、約−２１‰、約−２２‰、約−２３‰、約−２４‰、約−２５‰、約−２６‰、約−２７‰、約−２８‰、約−２９‰又は約−３０‰より低い。より好ましくは、δＯ−１８の値は、腎疾患については約−４．５‰〜約−３０‰；好ましくは約−４．５‰〜約−２５‰、約−４．５‰〜約−２２‰、約−４．５‰〜約−２０‰、約−４．５‰〜約−１８‰、約−４．５‰〜約−１６‰、約−４．５‰〜約−１４‰、約−４．５‰〜約−１２‰若しくは約−４．５‰〜約−１０‰；より好ましくは、約−５．０‰〜約−１６‰、約−５．０‰〜約−１４‰、約−５．０‰〜約−１２‰、又は腫瘍疾患については約−５．０‰〜約−２５‰、約−５．０‰〜約−２２‰、約−５．０‰〜約−２０‰、約−５．０‰〜約−１８‰、約−５．０‰〜約−１６‰、約−５．０‰〜約−１４‰、約−５．０‰〜約−１２‰、若しくは約−５．０‰〜約−１０‰である。好ましくは、δＯ−１８の値は、約−５．０‰〜約−２８‰、約−５．０‰〜約−２６‰、約−５．０‰〜約−２５‰、約−５．０‰〜約−２０‰、約−５．０‰〜約−１８‰、約−５．０‰〜約−１６‰、約−５．０‰〜約−１４‰、約−５．０‰〜約−１２‰又は約−５．０‰〜約−１０‰である。
【００３１】
本発明によると、腎疾患又は腫瘍疾患を有する被験体のδＨ−２の値は、約−３５‰、約−３６‰、約−３７‰、約−３８‰、約−３９‰若しくは約−４０‰、約−４２‰、約−４４‰、約−４８‰、約−５０‰、約−５５‰、約−６０‰、約−６５‰、約−７０‰、約−７５‰、約−８０‰、約−８５‰、約−９０‰、約−９５‰又は約−１００‰より低い。より好ましくは、δＨ−２の値は、約−３５‰〜約−１００‰、−３５‰〜約−９５‰、−３５‰〜約−９０‰、−３５‰〜約−８５‰、約−３５‰〜約−８０‰、約−３５‰〜約−７５‰、約−３５‰〜約−７０‰、約−３５‰〜約−６５‰、約−３５‰〜約−６０‰、約−３５‰〜約−５５‰、約−３５‰〜約−５０‰、約−３５‰〜約−４５‰、約−３５‰〜約−４０‰、約−４０‰〜約−１００‰、約−４０‰〜約−９０‰、約−４０‰〜約−８５‰、約−４０‰〜約−８０‰若しくは約−４０‰〜約−７５‰、約−４０‰〜約−７０‰又は約−４０‰〜約−６５‰である。より好ましくは、δＨ−２の値は、腎疾患については約−４０‰〜約−８０‰、約−４０‰〜約−７５‰、約−４０‰〜約−７０‰、約−４０‰〜約−６５‰、約−４０‰〜約−６０‰、約−４０‰〜約−５５‰又は約−４０‰〜約−５０‰である。より好ましくは、δＨ−２の値は、腫瘍疾患については約−４５‰〜約−１００‰、約−４５‰〜約−９５‰、約−４５‰〜約−９０‰、約−４５‰〜約−８５‰、約−４５‰〜約−８０‰、約−４５‰〜約−７０‰又は約−４５‰〜約−６０‰である。
【００３２】
本発明によると、生体サンプルは体液である。より好ましくは、体液は尿、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、脳脊髄液、嚢胞液、腹水、糞便、胆汁、組織液、及び任意の他の単離可能な体液である。含まれる同位体について測定される水を得るための当該技術分野で既知の任意の方法を本発明に使用することができる。本発明の一実施形態によると、含まれる同位体について測定される水は、サンプル中の水が乾燥剤によって吸収され、他の成分を有しない純粋な水が得られるように、体液サンプルを乾燥剤の入った密封容器に入れた後、水和した乾燥剤から水を除去することによって得られる。好ましくは、水和した乾燥剤からの水の除去は蒸留、より好ましくは真空蒸留によって行われる。本発明によると、乾燥剤はシリカゲル、活性炭、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、モンモリロナイト粘土及びモレキュラーシーブからなる群から選択される。本発明の別の実施形態によると、含まれる同位体について測定される水は逆浸透によって得られる。
【００３３】
更なる態様によると、本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットであって、腎疾患若しくは腫瘍性疾患を患っている可能性があるか、若しくは腎疾患若しくは腫瘍性疾患のリスクがある被験体に由来する生体サンプルを含有する容器、又は該サンプルを充填することが想定される容器と、生体サンプルにおけるδＯ−１８又はδＨ−２の値を測定する手段と、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断を可能にする参照値手段とを含む、本発明の方法を行うためのキットに関する。好ましくは、キットは、乾燥剤を含有する容器を更に含む。
【００３４】
δＯ−１８又はδＨ−２の値を測定する手段は、δＯ−１８又はδＨ−２を探査（probing）／定量する任意の好適な手段、例えば同位体比質量分析計から選択することができる。
【００３５】
腎疾患又は腫瘍性疾患の診断を可能にする参照レベルの手段は、好ましくは健常なヒトに由来する生体サンプルの入った容器から選択される。検量線、キットの使用説明書又はそれらの組合せが更に含まれていてもよい。好ましくは、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断に関する具体的な情報を与える好適な説明書を（例えば書面で）キットに添付すべきである。
【００３６】
本発明では、生体サンプルにおける水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の安定同位体比を研究する。生体サンプル（血漿等）中のδ２Ｈ及びδ１８Ｏが、ヒトの腎機能又は腫瘍性疾患に関連することが観察された。具体的には、対照被験体及び糖尿病被験体（腎機能障害を有しない）の血漿中のδ１８Ｏは、末期腎疾患被験体（腎機能障害の症例）よりもそれぞれ８７％及び１６０％高い。健常腎臓群（対照被験体及び糖尿病被験体）の血漿中のδ２Ｈは、腎機能障害群よりも７２％及び９２％高い。しかしながら、対照被験体及び糖尿病患者における血漿の水含有量（δ２Ｈ及びδ１８Ｏ）に違いはない。
【実施例】
【００３７】
本発明を具体的な実施形態を参照して説明したが、特定の状況に適応するために、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、その要素を均等物に置き換えることができることが当業者には理解されよう。以下の実験例は、本発明の或る特定の実施形態の様々な態様を実証し、更に説明するために提示され、その範囲を限定すると解釈されるものではない。以下の実験の開示において、以下の材料及び方法が使用される。
【００３８】
参加者
生化学的パラメータ及び参加者の病歴についての医師の記載に従って、参加者を対照被験体（ＣＳ）、末期腎疾患であると診断された患者（ＥＳＲＤ）又はがんであると診断された患者、及び糖尿病を有するが検出可能な腎機能障害を有しない個体（ＤＢ）という３つの区分に分類した。全てのＤＢ被験体は糖尿病の管理下にある。９８人の被験体（５人のＣＳ、３２人のＥＳＲＤ、１０人の乳がん被験体、１０人の子宮頸がん被験体、１０人の胃がん被験体、１０人の結腸がん被験体及び５人のＤＢ）の全てが本省人であり、台北市在住である。被験体はサンプリング日前に少なくとも３ヶ月間渡航していなかった。このため、食物及び水の地理的な同位体組成に起因する同位体比の変動を排除することができる（Bowen GJ, Wilkinson B (2002) Spatial distribution of delta O-18 in meteoric precipitation. Geology 30: 315-318、Hobson KA, Atwell L, Wassenaar LI (1999) Influence of drinking water and diet on the stable-hydrogen isotope ratios of animal tissue,. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 8003-8006、Bowen GJ, Ehleringer JR, Chesson LA, Thompson AH, Podlesak DW, et al. (2009) Dietary and physiological controls on the hydrogen and oxygen isotope ratios of hair from mid-20th century indigenous populations. Am J Phys Anthropol 139: 494-504、Chesson LA, Podlesak DW, Erkkila BR, Cerling TE, Ehleringer JR (2010) Isotopic consequences of consumer food choice: Hydrogen and oxygen stable isotope ratios in foods from fast food restaurants versus supermarkets. Food Chemistry 119: 1250-1256）。
【００３９】
水サンプル
３ｍｌのヒト血漿サンプルを１５ｍｌ容ファルコンチューブに保存する。次いで、チューブを、１５ｇのＣａＣｌ２顆粒（Sigma-Aldrich）の入った予備乾燥した真空丸底フラスコに入れる。次いで、空気中の水分がフラスコ内に入らないように慎重に丸底フラスコに蓋をし、密封する。ＣａＣｌ２がヒト血漿サンプルから水を吸収するように、フラスコを室温で７日間インキュベートする。水和したＣａＣｌ２から真空蒸留（BuchiのＧｌａｓｓ Ｏｖｅｎ Ｂ−５８５、クーゲルロール）によって水サンプル（約２ｍｌ）が得られる。
【００４０】
ヒト血漿中の水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の決定
水サンプル中の水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の評価は、以下のようにして行った。安定な酸素同位体組成を既知のＣＯ２−Ｈ２Ｏ平衡法によって分析した（Epstein S, Mayeda T (1953) Variation of O18 content of waters from natural sources. Geochimica et Cosmochimica Acta 4: 213-224、Brenninkmeijer CAM, Morrison PD (1987) An automated system for isotopic equilibration of CO2 and H2O for 18O analysis of water. Chemical Geology: Isotope Geoscience section 66: 21-26）。平衡化したＣＯ２ガスをＶＧ ＳＩＲＡ １０同位体比質量分析計によって測定した。水素同位体組成は、インディアナ大学生物地球化学研究所製の亜鉛ショットを用いて水をＨ２に還元した後に、ＶＧ ＭＭ６０２Ｄ同位体比質量分析計で決定した（Coleman ML, Shepherd TJ, Durham JJ, Rouse JE, Moore GR (1982) Reduction of water with zinc for hydrogen isotope analysis. Analytical Chemistry 54: 993-995）。全ての同位体比の結果は、国際Ｖ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）標準に対するδ表記（‰）で報告し、ＳＬＡＰ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｌｉｇｈｔ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）のδ１８Ｏ及びδ２Ｈがそれぞれ−５５．５‰及び−４２８‰となるように正規化する（Gonfiantini R (1978) Standards for stable isotope measurements in natural compounds. Nature 271: 534-536）。実験室標準に対する１σで表される分析精度はそれぞれ、δ２Ｈについては１．３‰、δ１８Ｏについては０．０８‰より良好である。水サンプルの二重分析の平均差はそれぞれ、δ２Ｈについては±１１．５‰、δ１８Ｏについては±０．１１‰である。
【００４１】
データ分析
ＡＮＯＶＡ及びスチューデントｔ検定をＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ ８．０（StatSoft. Inc.，Tulsa，OK）を用いて行った。ｋ平均クラスタリングを、データを４つのクラスターのプリセットに分割するＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１１ａ（MathWorks. Inc.，Natick，MA）で行った。ユークリッド距離を測定して、そのクラスター内のデータ点の平均であるクラスターの重心を計算する。各回で新たなセットの初期クラスター重心位置が与えられるように、合計１００００回の反復クラスタリングプロセスを行った。この手順により、各クラスターの点と重心との距離の総和が最低値となる４つのクラスターの最良の解が得られる。
【００４２】
実施例１ 本発明の方法を用いた腎疾患の診断
４２個のヒト血漿の水サンプルに由来する水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の安定な同位体比を測定した。サンプルは、絶食対照被験体（ＣＳ、ｎ＝５）、血液透析治療を受けていない絶食末期腎疾患被験体（ＥＳＲＤｎＨＤ、ｎ＝５）、血液透析治療を受けている絶食末期腎疾患被験体（ＥＳＲＤＨＤ、ｎ＝２７）及び絶食糖尿病被験体（ＤＢ、ｎ＝５）という４つの参加者の群から無作為に得た。
【００４３】
対照被験体群（ＣＳ）
表１に示されるように、ＣＳについてのδ２Ｈ及びδ１８Ｏの平均は−４．７６‰及び−３５．２‰である。
【００４４】
【表１】
ａ．５個のヒト血漿サンプル（ＣＳ−１〜ＣＳ−５）を健常な腎臓を有する対照被験体から採取した。
ｂ．全ての対照被験体は、サンプリング前３ヶ月間は渡航せず国内にいる。
ｃ．血中尿素窒素（ＢＵＮ）試験は、血液中の尿素の形態の窒素の量を測定することによって腎機能を評価するものである。血液中の尿素の正常レベルは７ｍｇ／ｄＬ〜２０ｍｇ／ｄＬである。
ｄ．クレアチニンはクレアチンの代謝産物である。クレアチニン試験は腎機能の指標として用いられる。血液中のクレアチニンの正常レベルは、男性については０．７ｍｇ／ｄＬ〜１．２ｍｇ／ｄＬ、女性については０．５ｍｇ／ｄＬ〜１．９ｍｇ／ｄＬである［４５]。
ｅ．腎機能の指標である糸球体濾過量の推定。ｅＧＦＲ値は、ＭＤＲＤ（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）式：ｅＧＦＲ＝１８６×血清クレアチニン−１．１５４×年齢−０．２０３×（黒人の場合は１．２１２）×（女性の場合は０．７４２）に基づいて算出される［４６］。
ｆ．比率は、国際Ｖ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）標準に対するδ表記（‰）で報告し、ＳＬＡＰ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｌｉｇｈｔ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）のδ１８Ｏ及びδ２Ｈがそれぞれ−５５．５‰及び−４２８‰となるように正規化する。
ｉ．括弧内の数値は各群の全ての数値の標準偏差である。
【００４５】
末期腎疾患群（ＥＳＲＤ）
δ２Ｈ及びδ１８Ｏの平均値は、ＥＳＲＤｎＨＤについては−１１．８９‰及び−７２．４４‰、ＥＳＲＤＨＤについては−１０．３７‰及び−５９．１０‰である（表２）。ＥＳＲＤＨＤ（標準偏差は、δ１８Ｏについては２．９、δ２Ｈについては１１．５４）は、ＥＳＲＤｎＨＤ（標準偏差は、δ１８Ｏについては０．９、δ２Ｈについては４．９）よりもばらつきがある（図１）。δ２Ｈに関しては、ＥＳＲＤＨＤとＥＳＲＤｎＨＤとの間の差は有意である［ｔ０．０５；３０＝２．５及びＦ０．０５；１，３０＝６．３３］。しかしながら、δ１８Ｏについては、差は有意ではない［ｔ０．０５；３０＝１．１７及びＦ０．０５；１，３０＝１．３７］。
【００４６】
【表２】
ａ．３２個のヒト血漿サンプルを８時間絶食したＥＳＲＤ（末期腎疾患）患者から採取した。これをＥＳＲＤｎＨＤ（末期腎疾患であるが、血液透析治療を受けていない）及びＥＳＲＤＨＤ（末期腎疾患であり、血液透析治療を受けている）という２つの群に分ける。
ｂ．、ｃ．、ｄ．ＢＵＮ、クレアチニン及びｅＧＦＲ試験は全て腎機能の指標である。表１の脚注ｃ、ｄ及びｅを参照されたい。
ｅ．血液中のナトリウムの濃度。血液中のナトリウムの正常レベルは１３５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１４０ｍｍｏｌ／Ｌである。
ｆ．血液中のカリウムの濃度。正常な血中カリウムレベルは３．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。
ｇ．血液中の塩化物の濃度。血液中の塩化物の正常範囲は９８ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０８ｍｍｏｌ／Ｌである。
ｈ．、i．同位体比はδ表記（‰）で報告する。詳細については表１の脚注ｃ及びｄを参照されたい。
ｊ．ＥＳＲＤｎＨＤサンプル（ＥＳＲＤ−１〜ＥＳＲＤ−５）を、血液透析治療を受けていないＥＳＲＤ患者から採取した。ＥＳＲＤｎＨＤには一価イオン試験を行っていない。
ｋ．ＥＳＲＤＨＤサンプル（ＥＳＲＤ−６〜ＥＳＲＤ−３２）を、６ヶ月間にわたって血液透析を受けているＥＳＲＤ患者から採取した。これらのサンプルは、ＥＳＲＤ患者が血液透析を受ける直前に採取した。
ｌ．括弧内の数値は各群の全ての数値の標準偏差である。
【００４７】
糖尿病群（ＤＢ）
ＤＢ群においては、血漿におけるδ２Ｈの平均は−４．０４‰、δ１８Ｏの平均は−３４．０８‰である（表３）。
【００４８】
【表３】
ａ．ＤＢ血漿サンプル（ＤＢ−１〜ＤＢ−５）を、８時間絶食させた糖尿病患者から採取した。
ｂ．腎機能の指標である血漿クレアチニン濃度。
ｃ．腎機能の指標である糸球体濾過量の推定。詳細については表１の脚注ｅを参照されたい。
ｄ．空腹時血中グルコースレベル。
ｅ．、ｆ．同位体比はδ表記（‰）で報告する。詳細については表１の脚注ｃ及びｄを参照されたい。
ｇ．括弧内の数値はＤＢの全ての数値の標準偏差である。
【００４９】
ＥＳＲＤの水のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、ＣＳよりも顕著に低い
ＥＳＲＤｎＨＤの血漿における水のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、ＣＳとは顕著に異なる特徴を示した。スチューデントｔ検定及びＡＮＯＶＡ統計分析をＥＳＲＤｎＨＤ及びＣＳのデータセットに適用することによって、ＥＳＲＤｎＨＤ及びＣＳにおける血漿の水含有量（δ１８Ｏ及びδ２Ｈ）は有意な差を示した［δ１８Ｏについてはt０．０５；８＝１３．７８及びＦ０．０５；１，８＝１８９．８３、δ２Ｈについてはｔ０．０５；８＝１５．０８及びＦ０．０５；１，８＝２２７．４７］。ＥＳＲＤＨＤの血漿中のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの分散は、ＣＳとＥＳＲＤｎＨＤとの間でばらつきがあった。ＥＳＲＤＨＤの血漿の水におけるδ１８Ｏ及びδ２Ｈは、ＣＳよりも有意に低い。ＥＳＲＤ（ＥＳＲＤｎＨＤ及びＥＳＲＤＨＤを含む）の血漿中のδ１８Ｏ及びδ２Ｈは、ＣＳよりも８７％及び７２％低く、ＤＢよりも１６０％及び９２％低い。このため、血漿におけるδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、本研究において腎機能と相関する。正常な対照被験体及び腎臓患者の両方が同じ飲食用水の供給源を共有しているため、ＥＳＲＤ患者の血漿における水の１８Ｏ及び２Ｈのレベルの低下は興味深い。
【００５０】
２Ｈ同位体及び１８Ｏ同位体は、腎機能障害を有する患者において血漿の水から選択的に「除去される」ようである。腎臓の多くの機能の１つは、水チャネルを形成する血漿膜タンパク質である種々のタイプの腎臓アクアポリン（ＡＱＰ）によって少なくとも部分的に媒介されることが現在知られている水の再吸収である（Nielsen S, Frokiaer J, Marples D, Kwon TH, Agre P, et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiological Reviews 82: 205-244、King LS, Kozono D, Agre P (2004) From structure to disease: The evolving tale of aquaporin biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 687-698、Borgnia M, Nielsen S, Engel A, Agre P (1999) Cellular and molecular biology of the aquaporin water channels. Annual Review of Biochemistry 68: 425-458）。例えば、アクアポリン１（ＡＱＰ１）は、近位尿細管及び水の透過率を増大させる細い下行脚（descending thin limb）に局在する（Nielsen S, Smith BL, Christensen EI, Knepper MA, Agre P (1993) CHIP28 water channels are localized in constitutively water-permeable segments of the nephron. The Journal of cell biology 120: 371-383）。ＡＱＰ２、ＡＱＰ３及びＡＱＰ４は、集合管に局在し、ＡＱＰ２が集合管での水透過率のバソプレシン調節の標的である（Nielsen S, Knepper MA (1993) Vasopressin activates collecting duct urea transporters and water channels by distinct physical processes. The American journal of physiology 265: F204-213）。当然ながら、これらのアクアポリンタンパク質が腎機能障害患者における血漿の１８Ｏ及び２Ｈのレベルの低下に関与するか否かという疑問が生じる。これまでの研究では、典型的なＡＱＰ１の分子動力学（ＭＤ）シミュレーション及び溶解実験から、２Ｈ２Ｏの透過率が水と類似することが示されているが（Mamonov AB, Coalson RD, Zeidel ML, Mathai JC (2007) Water and deuterium oxide permeability through aquaporin 1: MD predictions and experimental verification. The Journal of general physiology 130: 111-116）、別の研究では、ＡＱＰ１の芳香族／アルギニン領域における点突然変異によってプロトンの通過が可能となることが示されている（Beitz E, Wu B, Holm LM, Schultz JE, Zeuthen T (2006) Point mutations in the aromatic/arginine region in aquaporin 1 allow passage of urea, glycerol, ammonia, and protons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 269-274）。さらに、ＥＳＲＤ患者において、バソプレシン濃度の上昇が見出されている（Argent NB, Baylis PH, Wilkinson R (1990) Immunoreactive vasopressin in end stage renal failure. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry 190: 185-188）。バソプレシン及び水の欠乏は腎臓集合管におけるＡＱＰ２の上方調節を伴い（Terris J, Ecelbarger CA, Nielsen S, Knepper MA (1996) Long-term regulation of four renal aquaporins in rats. The American journal of physiology 271: F414-422、Combet S, Gouraud S, Gobin R, Berthonaud V, Geelen G, et al. (2008) Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is posttranscriptional and is abolished by water deprivation. American Journal of Physiology - Renal Physiology 294: F1408-F1414）、老化に伴うＡＱＰ２の下方調節が転写後に起こる（posttranscriptional）（Combet S, Gouraud S, Gobin R, Berthonaud V, Geelen G, et al. (2008) Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is posttranscriptional and is abolished by water deprivation. American Journal of Physiology - Renal Physiology 294: F1408-F1414）。ＥＳＲＤＨＤの血漿におけるＮａ＋、Ｋ＋及びＣｌ−等の一価イオンのレベルの更なる調査によってヘンレ係蹄上行脚の能動輸送の正常な機能が明らかとなったが（表２）、ネフロンのこの部分はアクアポリンを含有しない（Nielsen S, Frokiaer J, Marples D, Kwon TH, Agre P, et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiological Reviews 82: 205-244、King LS, Kozono D, Agre P (2004) From structure to disease: The evolving tale of aquaporin biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 687-698）。したがって、組織的かつ原子的な分解能での安定な同位体におけるＥＳＲＤのアクアポリンの生理学的役割の研究は、腎機能障害患者における重水の減少を解明する可能性がある。
【００５１】
血漿の１８Ｏ及び２Ｈの恒常性は、水供給源の１８Ｏ及び２Ｈのレベルの変動に対抗する
降水のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値は季節によって変動する。血漿中の水の２Ｈ及び１８Ｏの大部分は、最終的には飲食用水の供給源である降水に由来し得るため、雨水及び血漿の水におけるδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値の関係性を調べることは興味深い。
【００５２】
２０００年から２０１０年までの台北の毎月の降水のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値を含むデータの値を比較した（Peng T-R, Wang C-H, Huang C-C, Fei L-Y, Chen C-TA, et al. (2010) Stable isotopic characteristic of Taiwan's precipitation: A case study of western Pacific monsoon region. Earth and Planetary Science Letters 289: 357-366）。１月から５月にかけて、雨水のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値は変動をほとんど示さなかった。これらの値は６月に低下し始め、７月及び８月に最小値に達し、９月から１２月にかけて盛り返した。一方で、ＣＳ群における血漿の水同位体比は、１月から５月にかけて常に降水よりも低かった。しかしながら、血漿の水の同位体比は、７月から１２月にかけて降水の標準誤差内であった。したがって、ＣＳ群の血漿における同位体δ２Ｈ及びδ１８Ｏの恒常性が、日々の摂取水の変動に対抗することが観察された。
【００５３】
台湾の７月における頻繁な台風のために、降水の同位体含有量は、他の全ての月に比べて最も少ないが最も変動する。７月及び３月におけるＥＳＲＤＨＤの血漿の水の同位体比は降水よりも有意に低く、同様に雨水に対する強い独立性を示す。９月における降水の同位体比はＣＳの同位体比に近く、降水よりも約３５％低いＥＳＲＤｎＨＤの同位体比においても同じことが観察される。ＤＢ群については、１２月における血漿の水のδ１８Ｏは降水と同程度であるが［ｔ０．０５；１４＝０．２７及びＦ０．０５；１，１４＝０．０７］、血漿の水のδ２Ｈは降水に対する独立性を示す［t０．０５；１４＝３．０３及びＦ０．０５；１，１４＝９．２１］。
【００５４】
ＤＢ群及びＣＳ群における水のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は類似している
ＤＢに由来するδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、ＣＳに類似している。ＡＮＯＶＡ分析から、ＤＢ及びＣＳの血漿の水含有量（δ１８Ｏ及びδ２Ｈ）が同程度であることが示唆される［δ１８ＯについてはＦ０．０５；１，８＝４．６３；δ２ＨについてはＦ０．０５；１，８＝０．２０］。
【００５５】
腎臓状態の相違を反映する水同位体の生体恒常性の微調整が存在するようである。例えば、ＥＳＲＤｎＨＤ及び正常腎臓群（ＣＳ及びＤＢ）は異なる恒常性レベルを有する。正常な腎機能を有する２つの群（表１及び表３）について、ＣＳ及びＤＢのδ１８Ｏ及びδ２Ｈのレベルが類似していることに留意されたい。加えて、本発明者らは、ＣＳ被験体の年齢（２７歳〜６７歳の範囲である）が、ＤＢ被験体及びＥＳＲＤ被験体とは独立している（ｐ＝０）ことに注目している。ＥＳＲＤＨＤ群における１８Ｏ及び２Ｈの恒常性の欠如は、各血液透析の回数及び期間、並びに種々のＥＳＲＤＨＤ被験体の水和状態に起因し得る（Konings CJ, Kooman JP, Schonck M, Cox-Reijven PL, van Kreel B, et al. (2002) Assessment of fluid status in peritoneal dialysis patients. Perit Dial Int 22: 683-692）。
【００５６】
腎機能障害の原因は通常は非常に複雑であり、薬物療法、真性糖尿病、高血圧、敗血症、個人のライフスタイル等を含む。それにもかかわらず、腎臓の障害は、１Ｈによる２Ｈ及び１６Ｏによる１８Ｏの置き換えをもたらす代謝産物の蓄積を引き起こす。これは最終的に血漿の同位体の減少をもたらす。本研究では、腎機能障害がヒト血漿中のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの大幅な減少に関連することが示唆される。腎機能障害患者においては血漿の同位体の減少の痕跡が示されるが、健常な個体又は糖尿病患者においては示されないことが観察された。このデータ及び結果は、血漿のδ１８Ｏ及びδ２Ｈが腎機能に強く影響を受けるが、恐らくは生体の同位体恒常性のために年齢、人種及び食生活には影響されないようであることを示唆している。要するに、本予備研究は生物学的データとともに、腎機能障害の潜在的マーカーとして血漿におけるδ１８Ｏ及びδ２Ｈのレベルを用いることの可能性を示唆するものである。
【００５７】
実施例２ 本発明の方法を用いた腫瘍性疾患の診断
対照被験体及びがん被験体（乳がん被験体、子宮頸がん被験体、胃がん被験体及び結腸がん被験体）の血漿サンプルを、実施例の上記の材料及び方法に言及されるように処理した。ヒト血漿中の水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の決定並びにデータ分析を、実施例の上記の材料及び方法に言及されるように行った。がん被験体の血漿中のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの平均を下記の表に挙げる。
【００５８】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腎疾患又は腫瘍性疾患の診断に関する。具体的には、本発明は、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断の基礎として、生体サンプルにおけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値を用いる。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、水と電解質との適切な均衡を維持し、酸塩基濃度を調節し、尿として排出される代謝老廃物を血液から濾過する働きをする、脊椎動物の腹腔の背部にある一対の器官又はそのいずれか１つである。このため、腎臓障害の結果として、生体全体において全体的な不均衡が生じ得る。膀胱、腸、心臓、肺及び前立腺等の多くの器官は、体の不要な残屑を濾過して取り除き、全体的な恒常性を維持する腎臓の能力に依拠している。
【０００３】
腎臓は本質的に血液を浄化する器官である。心臓から出る腎動脈は、血液を腎臓に運び、ネフロンを含有する何百万もの糸球体のネットワークによって浄化する。ネフロンは、毒素、過剰な栄養物及び体液を濾過して取り除く。浄化及び濾過された残りの血液は、続いて腎静脈を通って血液循環中に戻る。濾過して取り除かれた物質は、尿中に排出される塩、水及び老廃物のレベルを調整する尿細管を流下する。腎盂は尿を集める。尿は腎盂から尿管を流下して膀胱に入る。尿は膀胱から尿道を通って体外に放出される。
【０００４】
腎臓疾患の種類としては、高血圧、糸球体腎炎及び嚢胞が挙げられる。糖尿病はグルコースを調節する体の能力に影響を及ぼす。血液中の過剰のグルコースは、腎臓内のネフロンに損傷を与え、毒素を濾過する血管の能力を低下させる可能性がある。高血圧もネフロンに損傷を与える可能性がある。糸球体腎炎は概して、腎臓感染とは無関係の他の疾患群に関連する。
【０００５】
両方の腎臓が疾患のために機能を停止した場合、患者は末期腎疾患（ＥＳＲＤ）又は完全腎不全を呈する。腎不全とは、体がもはや或る特定の毒素を取り除くことができず、血圧及び必須栄養素を適切に調節することができないことを意味する。腎不全を呈する患者を治療しなければ、血液中の毒素及び体液の蓄積のために数日以内に死亡する可能性がある。
【０００６】
糖尿病性腎症としても知られる糖尿病性腎臓疾患は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の個体における過度の罹患率及び若年死の重要な原因である。Ｔ１ＤＭ患者のおよそ２５％〜４０％が最終的に糖尿病性腎症を発症する。糖尿病性腎症の最も深刻な長期的影響は、腎臓がベースライン機能の１０％未満でしか機能せず、腎臓機能が永久的かつほぼ完全に喪失した状態である末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に至る腎不全である。他のＥＳＲＤの原因としては、高血圧、糸球体腎炎、多嚢胞性腎、間質性疾患、閉塞性尿路疾患、全身性エリテマトーデス及び多発性骨髄腫が挙げられる。
【０００７】
腎機能障害を診断する当該技術分野で既知の従来の方法は、特定のタンパク質の検出を伴う。特許文献１は、腎不全等の病態に罹患しやすい被験体において、好ましくは血清クレアチニンの上昇の前にサンプル中のインターロイキン１８を検出する方法に関する。特許文献２は、動物において早期腎疾患を検出する方法であって、（ａ）試験対象の動物からサンプルを得る工程と、（ｂ）サンプル中のアルブミンの量を決定する工程とを含む、動物において早期腎疾患を検出する方法を提供する。特許文献３は、急性腎臓損傷（すなわち、ＡＫＩ）、腎臓虚血再灌流障害（すなわち、ＩＲＩ）、虚血性急性腎臓損傷及び／又は虚血性急性尿細管壊死に対する新規の有用なバイオマーカーであるＧＲＯ−α（すなわち、ＣＸＣＬ１、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃリガンド１、ＧＲＯ１、ＧＲＯａ、ＭＧＳＡ、ＭＧＳＡ α、ＭＧＳＡ−ａ、ＮＡＰ−３、ＳＣＹＢ１）に関する。尿又は血液サンプル中の成分を決定することによって腎機能障害を診断する多くの方法が知られているが、かかる方法には決定の結果を得るために複雑な工程を伴うという欠点がある。
【０００８】
加えて、腫瘍又はがんは依然として最もよく見られる致死的な疾患の１つである。腫瘍の発生は生涯にわたって加齢とともに増加する。腫瘍又はがんは、がん遺伝子の活性化及び／又は腫瘍抑制遺伝子の不活性化をもたらす累積した多重遺伝子突然変異によって引き起こされる。腫瘍又はがんは依然として世界的な死亡率の主要な原因である。診断及び治療の進展にもかかわらず、全生存率はここ数年で大幅には改善されていない。特に腫瘍又はがんの初期段階における腫瘍又はがんのより正確な検出及び高感度な診断手段の必要性は、依然として満たされていない。
【０００９】
水（Ｈ２Ｏ）は生命の基本であり、さらには人体で最も重要かつ最も豊富な物質であり、体重の約７０パーセントを占める。水の重要性が認識されているにもかかわらず、水同位体の独自性は見落とされていることが多い。天然の水は、微量の重同位体水素原子及び酸素原子を含有し、その中でも主要なものは２Ｈ及び１８Ｏある。１Ｈ対２Ｈの比率は約６２４０対１、又はＶ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）水質基準では約１５５ｐｐｍであり、１６Ｏ対１８Ｏの比率は約４９９対１、又は約２００５ｐｐｍである。水同位体の特有の配置及び質量分析技術の急速な進展のために、様々な生体組織における水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の安定同位体比が、古代食研究（paleodietary）、気象学、人類学、生態学及び現代食物連鎖網研究（modern food-chained network）において「原子化石（atomic fossils）又は原子トレーサー」として用いられている。
【００１０】
安定な非放射性水同位体である２Ｈ２Ｏは、ヒトの生理及び病態生理において重要な役割を果たし得る。モデル動物及び細胞培養物を用いた幾つかの研究から、食物中の水（dietary water）における２Ｈ２Ｏの増大又は枯渇が病態生理及び生理に対して顕著な影響を有することが示された。例えば、２Ｈ２Ｏはチューブリンサブユニットの重合を刺激することによって微小管の形成を促進し、細胞死をもたらし得ることが以前に示されている。加えて、２Ｈ２Ｏ含有量の増加は、高血圧自然発生ラットにおいて高血圧を予防する可能性がある。一方で、培養培地の水における重水素の枯渇は種々の動物細胞株の成長速度を低下させる。未治療のストレプトゾトシン誘発性真性糖尿病マウスの体内の水分における水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の同位体比の痕跡が、正常なマウスとは異なることも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７，１４１，３８２号
【特許文献２】米国特許第７，９３５，４９５号
【特許文献３】米国特許第７，８３３，７３２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、いずれの従来技術文献も水同位体と腎機能との関係性を開示、教示又は示唆してはいない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法であって、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を、上記測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と上記δＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値との比較に基づいて診断することとを含み、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると診断する、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明では驚くべきことに、生体サンプルにおけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値が腎臓病態及び腫瘍性疾患に関連することが発見されている。したがって、本発明では、腎疾患又は腫瘍性疾患を、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると想定される被験体に由来する生体サンプルにおけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値と、腎疾患及び腫瘍性疾患を有しない対照におけるδＨ−２（δ２Ｈ）及び／又はδＯ−１８（δ１８Ｏ）の値との比較に基づいて診断する方法が開発される。
【００１６】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により援用される。抵触の場合には、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００１７】
「検出する」又は「診断する」という用語は、腎疾患を有する患者及び／又は腎疾患を有する危険性がある患者を特定することを指す。
【００１８】
「アッセイ」という用語は、サンプル中の物質の存在及び／又はその物質の量を決定するためにサンプルに対して行われる分析を意味する。
【００１９】
「減少した量」という用語は、規定のレベルと比較して低い量を意味する。
【００２０】
「腎疾患」という用語は、個体の腎機能の障害、損傷、異常状態又は機能障害を意味する。
【００２１】
「サンプル」という用語は、哺乳動物被験体から得られた体液又は組織液のサンプルを意味する。非限定的な例としては、本発明に使用される体液又は組織液のサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、脳脊髄液、嚢胞液、腹水、糞便、胆汁、組織液及び任意の他の単離可能な体液であり得る。
【００２２】
「腫瘍」又は「がん」という用語は、乳房、前立腺、結腸、肺、膵臓、肝臓、胃、膀胱又は生殖器官（子宮頸部、卵巣、子宮内膜等）、脳及び骨髄から発生する腫瘍若しくはがん、黒色腫、又はリンパ腫を含むが、これらに限定されないものとして本明細書中で使用される。
【００２３】
本願において引用される全ての刊行物及び特許文献は、個々の刊行物又は特許文献の各々がそのように示されているかのように、その全体があらゆる目的で同じように参照により援用される。本文献における様々な参考文献の引用によって、本出願人らは任意の特定の参考文献を本発明に対する「先行技術」であると認めるわけではない。
【００２４】
一態様では、本発明は、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法であって、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を、上記測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と上記δＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値との比較に基づいて診断することとを含み、上記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると診断する、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法を提供する。
【００２５】
任意の哺乳動物被験体を、本発明の方法に従って試験することができる。しかしながら、典型的には、試験被験体（すなわち患者）は、腎機能障害（例えば、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎症、腎不全、高尿酸血症、糖尿病性腎臓疾患、虚血性若しくは毒物誘発性の腎損傷、慢性腎不全、急性腎不全、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、又は慢性腎盂腎炎）又は腫瘍（例えば、骨髄リンパ腫、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽腫（ganglioblastoma）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫（leimyosarcoma）、横紋皮肉腫（rhabdotheliosarcoma）、結腸癌、膵腫瘍、肝腫瘍、乳腫瘍（breast tumor）、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、頚部腫瘍、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫（ependynoma）、松果体腫、血管芽腫、網膜芽腫、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病）、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性（myelolastic）、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性のもの、及び赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、直腸癌、頭頚部腫瘍、脳腫瘍、原発部位不明の腫瘍、末梢神経系の腫瘍、中枢神経系の腫瘍、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、転移、及び非制御の又は異常な細胞成長を特徴とする任意の疾患又は障害）を患っている。好ましくは、哺乳動物被験体は、ヒト、ブタ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ヤギ又はネコである。
【００２６】
本発明では驚くべきことに、健常な被験体における水同位体の生体恒常性の存在が見出された。健常な被験体における水の状態（δ１８Ｏ及びδ２Ｈ）は、腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体とは顕著に異なる。腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体におけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２が減少していることは極めて興味深い。
【００２７】
サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と比較される参照値は、いかなる腎疾患又は腫瘍性疾患も有しない被験体（健常な被験体）から得られる。腎疾患又は腫瘍性疾患を、続いて検査対象の被験体、例えば腎疾患又は腫瘍性疾患を患っている疑いがある被験体の体液（body liquid）サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２のレベルの低下によって診断することができる。
【００２８】
本発明による方法は、健常な被験体の日常分析、すなわち、ごく初期の段階で腎疾患又は腫瘍性疾患を診断するために毎年行われる分析にも好適である。
【００２９】
最適な「対照」参照値は、健常段階の同じ又は他の被験体から得られた参照値である。具体的には、同位体比は国際Ｖ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）標準に対するδ表記（‰）で表される。本発明によると、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体のδＯ−１８（すなわち、参照値）は約−３‰〜約−４．５‰の範囲であり、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体のδＨ−２の参照値は約−３０‰〜約−３５‰の範囲である。
【００３０】
本発明によると、水同位体は腎疾患又は腫瘍性疾患の診断において減少している。すなわち、腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体のδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値は、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体よりも低い。本発明によれば、腎疾患又は腫瘍疾患を有する被験体のδＯ−１８は、約−４．５‰、約−５‰、約−６‰、約−７‰、約−８‰、約−９‰、約−１０‰、約−１１‰、約−１２‰、約−１３‰、約−１４‰、約−１５‰、約−１６‰、約−１７‰、約−１８‰、約−１９‰、約−２０‰、約−２１‰、約−２２‰、約−２３‰、約−２４‰、約−２５‰、約−２６‰、約−２７‰、約−２８‰、約−２９‰又は約−３０‰より低い。より好ましくは、δＯ−１８の値は、腎疾患については約−４．５‰〜約−３０‰；好ましくは約−４．５‰〜約−２５‰、約−４．５‰〜約−２２‰、約−４．５‰〜約−２０‰、約−４．５‰〜約−１８‰、約−４．５‰〜約−１６‰、約−４．５‰〜約−１４‰、約−４．５‰〜約−１２‰若しくは約−４．５‰〜約−１０‰；より好ましくは、約−５．０‰〜約−１６‰、約−５．０‰〜約−１４‰、約−５．０‰〜約−１２‰、又は腫瘍疾患については約−５．０‰〜約−２５‰、約−５．０‰〜約−２２‰、約−５．０‰〜約−２０‰、約−５．０‰〜約−１８‰、約−５．０‰〜約−１６‰、約−５．０‰〜約−１４‰、約−５．０‰〜約−１２‰、若しくは約−５．０‰〜約−１０‰である。好ましくは、δＯ−１８の値は、約−５．０‰〜約−２８‰、約−５．０‰〜約−２６‰、約−５．０‰〜約−２５‰、約−５．０‰〜約−２０‰、約−５．０‰〜約−１８‰、約−５．０‰〜約−１６‰、約−５．０‰〜約−１４‰、約−５．０‰〜約−１２‰又は約−５．０‰〜約−１０‰である。
【００３１】
本発明によると、腎疾患又は腫瘍疾患を有する被験体のδＨ−２の値は、約−３５‰、約−３６‰、約−３７‰、約−３８‰、約−３９‰若しくは約−４０‰、約−４２‰、約−４４‰、約−４８‰、約−５０‰、約−５５‰、約−６０‰、約−６５‰、約−７０‰、約−７５‰、約−８０‰、約−８５‰、約−９０‰、約−９５‰又は約−１００‰より低い。より好ましくは、δＨ−２の値は、約−３５‰〜約−１００‰、−３５‰〜約−９５‰、−３５‰〜約−９０‰、−３５‰〜約−８５‰、約−３５‰〜約−８０‰、約−３５‰〜約−７５‰、約−３５‰〜約−７０‰、約−３５‰〜約−６５‰、約−３５‰〜約−６０‰、約−３５‰〜約−５５‰、約−３５‰〜約−５０‰、約−３５‰〜約−４５‰、約−３５‰〜約−４０‰、約−４０‰〜約−１００‰、約−４０‰〜約−９０‰、約−４０‰〜約−８５‰、約−４０‰〜約−８０‰若しくは約−４０‰〜約−７５‰、約−４０‰〜約−７０‰又は約−４０‰〜約−６５‰である。より好ましくは、δＨ−２の値は、腎疾患については約−４０‰〜約−８０‰、約−４０‰〜約−７５‰、約−４０‰〜約−７０‰、約−４０‰〜約−６５‰、約−４０‰〜約−６０‰、約−４０‰〜約−５５‰又は約−４０‰〜約−５０‰である。より好ましくは、δＨ−２の値は、腫瘍疾患については約−４５‰〜約−１００‰、約−４５‰〜約−９５‰、約−４５‰〜約−９０‰、約−４５‰〜約−８５‰、約−４５‰〜約−８０‰、約−４５‰〜約−７０‰又は約−４５‰〜約−６０‰である。
【００３２】
本発明によると、生体サンプルは体液である。より好ましくは、体液は尿、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、脳脊髄液、嚢胞液、腹水、糞便、胆汁、組織液、及び任意の他の単離可能な体液である。含まれる同位体について測定される水を得るための当該技術分野で既知の任意の方法を本発明に使用することができる。本発明の一実施形態によると、含まれる同位体について測定される水は、サンプル中の水が乾燥剤によって吸収され、他の成分を有しない純粋な水が得られるように、体液サンプルを乾燥剤の入った密封容器に入れた後、水和した乾燥剤から水を除去することによって得られる。好ましくは、水和した乾燥剤からの水の除去は蒸留、より好ましくは真空蒸留によって行われる。本発明によると、乾燥剤はシリカゲル、活性炭、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、モンモリロナイト粘土及びモレキュラーシーブからなる群から選択される。本発明の別の実施形態によると、含まれる同位体について測定される水は逆浸透によって得られる。
【００３３】
更なる態様によると、本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットであって、腎疾患若しくは腫瘍性疾患を患っている可能性があるか、若しくは腎疾患若しくは腫瘍性疾患のリスクがある被験体に由来する生体サンプルを含有する容器、又は該サンプルを充填することが想定される容器と、生体サンプルにおけるδＯ−１８又はδＨ−２の値を測定する手段と、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断を可能にする参照値手段とを含む、本発明の方法を行うためのキットに関する。好ましくは、キットは、乾燥剤を含有する容器を更に含む。
【００３４】
δＯ−１８又はδＨ−２の値を測定する手段は、δＯ−１８又はδＨ−２を探査（probing）／定量する任意の好適な手段、例えば同位体比質量分析計から選択することができる。
【００３５】
腎疾患又は腫瘍性疾患の診断を可能にする参照レベルの手段は、好ましくは健常なヒトに由来する生体サンプルの入った容器から選択される。検量線、キットの使用説明書又はそれらの組合せが更に含まれていてもよい。好ましくは、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断に関する具体的な情報を与える好適な説明書を（例えば書面で）キットに添付すべきである。
【００３６】
本発明では、生体サンプルにおける水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の安定同位体比を研究する。生体サンプル（血漿等）中のδ２Ｈ及びδ１８Ｏが、ヒトの腎機能又は腫瘍性疾患に関連することが観察された。具体的には、対照被験体及び糖尿病被験体（腎機能障害を有しない）の血漿中のδ１８Ｏは、末期腎疾患被験体（腎機能障害の症例）よりもそれぞれ８７％及び１６０％高い。健常腎臓群（対照被験体及び糖尿病被験体）の血漿中のδ２Ｈは、腎機能障害群よりも７２％及び９２％高い。しかしながら、対照被験体及び糖尿病患者における血漿の水含有量（δ２Ｈ及びδ１８Ｏ）に違いはない。
【実施例】
【００３７】
本発明を具体的な実施形態を参照して説明したが、特定の状況に適応するために、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、その要素を均等物に置き換えることができることが当業者には理解されよう。以下の実験例は、本発明の或る特定の実施形態の様々な態様を実証し、更に説明するために提示され、その範囲を限定すると解釈されるものではない。以下の実験の開示において、以下の材料及び方法が使用される。
【００３８】
参加者
生化学的パラメータ及び参加者の病歴についての医師の記載に従って、参加者を対照被験体（ＣＳ）、末期腎疾患であると診断された患者（ＥＳＲＤ）又はがんであると診断された患者、及び糖尿病を有するが検出可能な腎機能障害を有しない個体（ＤＢ）という３つの区分に分類した。全てのＤＢ被験体は糖尿病の管理下にある。９８人の被験体（５人のＣＳ、３２人のＥＳＲＤ、１０人の乳がん被験体、１０人の子宮頸がん被験体、１０人の胃がん被験体、１０人の結腸がん被験体及び５人のＤＢ）の全てが本省人であり、台北市在住である。被験体はサンプリング日前に少なくとも３ヶ月間渡航していなかった。このため、食物及び水の地理的な同位体組成に起因する同位体比の変動を排除することができる（Bowen GJ, Wilkinson B (2002) Spatial distribution of delta O-18 in meteoric precipitation. Geology 30: 315-318、Hobson KA, Atwell L, Wassenaar LI (1999) Influence of drinking water and diet on the stable-hydrogen isotope ratios of animal tissue,. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 8003-8006、Bowen GJ, Ehleringer JR, Chesson LA, Thompson AH, Podlesak DW, et al. (2009) Dietary and physiological controls on the hydrogen and oxygen isotope ratios of hair from mid-20th century indigenous populations. Am J Phys Anthropol 139: 494-504、Chesson LA, Podlesak DW, Erkkila BR, Cerling TE, Ehleringer JR (2010) Isotopic consequences of consumer food choice: Hydrogen and oxygen stable isotope ratios in foods from fast food restaurants versus supermarkets. Food Chemistry 119: 1250-1256）。
【００３９】
水サンプル
３ｍｌのヒト血漿サンプルを１５ｍｌ容ファルコンチューブに保存する。次いで、チューブを、１５ｇのＣａＣｌ２顆粒（Sigma-Aldrich）の入った予備乾燥した真空丸底フラスコに入れる。次いで、空気中の水分がフラスコ内に入らないように慎重に丸底フラスコに蓋をし、密封する。ＣａＣｌ２がヒト血漿サンプルから水を吸収するように、フラスコを室温で７日間インキュベートする。水和したＣａＣｌ２から真空蒸留（BuchiのＧｌａｓｓ Ｏｖｅｎ Ｂ−５８５、クーゲルロール）によって水サンプル（約２ｍｌ）が得られる。
【００４０】
ヒト血漿中の水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の決定
水サンプル中の水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の評価は、以下のようにして行った。安定な酸素同位体組成を既知のＣＯ２−Ｈ２Ｏ平衡法によって分析した（Epstein S, Mayeda T (1953) Variation of O18 content of waters from natural sources. Geochimica et Cosmochimica Acta 4: 213-224、Brenninkmeijer CAM, Morrison PD (1987) An automated system for isotopic equilibration of CO2 and H2O for 18O analysis of water. Chemical Geology: Isotope Geoscience section 66: 21-26）。平衡化したＣＯ２ガスをＶＧ ＳＩＲＡ １０同位体比質量分析計によって測定した。水素同位体組成は、インディアナ大学生物地球化学研究所製の亜鉛ショットを用いて水をＨ２に還元した後に、ＶＧ ＭＭ６０２Ｄ同位体比質量分析計で決定した（Coleman ML, Shepherd TJ, Durham JJ, Rouse JE, Moore GR (1982) Reduction of water with zinc for hydrogen isotope analysis. Analytical Chemistry 54: 993-995）。全ての同位体比の結果は、国際Ｖ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）標準に対するδ表記（‰）で報告し、ＳＬＡＰ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｌｉｇｈｔ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）のδ１８Ｏ及びδ２Ｈがそれぞれ−５５．５‰及び−４２８‰となるように正規化する（Gonfiantini R (1978) Standards for stable isotope measurements in natural compounds. Nature 271: 534-536）。実験室標準に対する１σで表される分析精度はそれぞれ、δ２Ｈについては１．３‰、δ１８Ｏについては０．０８‰より良好である。水サンプルの二重分析の平均差はそれぞれ、δ２Ｈについては±１１．５‰、δ１８Ｏについては±０．１１‰である。
【００４１】
データ分析
ＡＮＯＶＡ及びスチューデントｔ検定をＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ ８．０（StatSoft. Inc.，Tulsa，OK）を用いて行った。ｋ平均クラスタリングを、データを４つのクラスターのプリセットに分割するＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１１ａ（MathWorks. Inc.，Natick，MA）で行った。ユークリッド距離を測定して、そのクラスター内のデータ点の平均であるクラスターの重心を計算する。各回で新たなセットの初期クラスター重心位置が与えられるように、合計１００００回の反復クラスタリングプロセスを行った。この手順により、各クラスターの点と重心との距離の総和が最低値となる４つのクラスターの最良の解が得られる。
【００４２】
実施例１ 本発明の方法を用いた腎疾患の診断
４２個のヒト血漿の水サンプルに由来する水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の安定な同位体比を測定した。サンプルは、絶食対照被験体（ＣＳ、ｎ＝５）、血液透析治療を受けていない絶食末期腎疾患被験体（ＥＳＲＤｎＨＤ、ｎ＝５）、血液透析治療を受けている絶食末期腎疾患被験体（ＥＳＲＤＨＤ、ｎ＝２７）及び絶食糖尿病被験体（ＤＢ、ｎ＝５）という４つの参加者の群から無作為に得た。
【００４３】
対照被験体群（ＣＳ）
表１に示されるように、ＣＳについてのδ２Ｈ及びδ１８Ｏの平均は−４．７６‰及び−３５．２‰である。
【００４４】
【表１】
ａ．５個のヒト血漿サンプル（ＣＳ−１〜ＣＳ−５）を健常な腎臓を有する対照被験体から採取した。
ｂ．全ての対照被験体は、サンプリング前３ヶ月間は渡航せず国内にいる。
ｃ．血中尿素窒素（ＢＵＮ）試験は、血液中の尿素の形態の窒素の量を測定することによって腎機能を評価するものである。血液中の尿素の正常レベルは７ｍｇ／ｄＬ〜２０ｍｇ／ｄＬである。
ｄ．クレアチニンはクレアチンの代謝産物である。クレアチニン試験は腎機能の指標として用いられる。血液中のクレアチニンの正常レベルは、男性については０．７ｍｇ／ｄＬ〜１．２ｍｇ／ｄＬ、女性については０．５ｍｇ／ｄＬ〜１．９ｍｇ／ｄＬである［４５]。
ｅ．腎機能の指標である糸球体濾過量の推定。ｅＧＦＲ値は、ＭＤＲＤ（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）式：ｅＧＦＲ＝１８６×血清クレアチニン−１．１５４×年齢−０．２０３×（黒人の場合は１．２１２）×（女性の場合は０．７４２）に基づいて算出される［４６］。
ｆ．比率は、国際Ｖ−ＳＭＯＷ（Ｖｉｅｎｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅａｎ Ｏｃｅａｎ Ｗａｔｅｒ）標準に対するδ表記（‰）で報告し、ＳＬＡＰ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｌｉｇｈｔ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）のδ１８Ｏ及びδ２Ｈがそれぞれ−５５．５‰及び−４２８‰となるように正規化する。
ｉ．括弧内の数値は各群の全ての数値の標準偏差である。
【００４５】
末期腎疾患群（ＥＳＲＤ）
δ２Ｈ及びδ１８Ｏの平均値は、ＥＳＲＤｎＨＤについては−１１．８９‰及び−７２．４４‰、ＥＳＲＤＨＤについては−１０．３７‰及び−５９．１０‰である（表２）。ＥＳＲＤＨＤ（標準偏差は、δ１８Ｏについては２．９、δ２Ｈについては１１．５４）は、ＥＳＲＤｎＨＤ（標準偏差は、δ１８Ｏについては０．９、δ２Ｈについては４．９）よりもばらつきがある（図１）。δ２Ｈに関しては、ＥＳＲＤＨＤとＥＳＲＤｎＨＤとの間の差は有意である［ｔ０．０５；３０＝２．５及びＦ０．０５；１，３０＝６．３３］。しかしながら、δ１８Ｏについては、差は有意ではない［ｔ０．０５；３０＝１．１７及びＦ０．０５；１，３０＝１．３７］。
【００４６】
【表２】
ａ．３２個のヒト血漿サンプルを８時間絶食したＥＳＲＤ（末期腎疾患）患者から採取した。これをＥＳＲＤｎＨＤ（末期腎疾患であるが、血液透析治療を受けていない）及びＥＳＲＤＨＤ（末期腎疾患であり、血液透析治療を受けている）という２つの群に分ける。
ｂ．、ｃ．、ｄ．ＢＵＮ、クレアチニン及びｅＧＦＲ試験は全て腎機能の指標である。表１の脚注ｃ、ｄ及びｅを参照されたい。
ｅ．血液中のナトリウムの濃度。血液中のナトリウムの正常レベルは１３５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１４０ｍｍｏｌ／Ｌである。
ｆ．血液中のカリウムの濃度。正常な血中カリウムレベルは３．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。
ｇ．血液中の塩化物の濃度。血液中の塩化物の正常範囲は９８ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０８ｍｍｏｌ／Ｌである。
ｈ．、i．同位体比はδ表記（‰）で報告する。詳細については表１の脚注ｃ及びｄを参照されたい。
ｊ．ＥＳＲＤｎＨＤサンプル（ＥＳＲＤ−１〜ＥＳＲＤ−５）を、血液透析治療を受けていないＥＳＲＤ患者から採取した。ＥＳＲＤｎＨＤには一価イオン試験を行っていない。
ｋ．ＥＳＲＤＨＤサンプル（ＥＳＲＤ−６〜ＥＳＲＤ−３２）を、６ヶ月間にわたって血液透析を受けているＥＳＲＤ患者から採取した。これらのサンプルは、ＥＳＲＤ患者が血液透析を受ける直前に採取した。
ｌ．括弧内の数値は各群の全ての数値の標準偏差である。
【００４７】
糖尿病群（ＤＢ）
ＤＢ群においては、血漿におけるδ２Ｈの平均は−４．０４‰、δ１８Ｏの平均は−３４．０８‰である（表３）。
【００４８】
【表３】
ａ．ＤＢ血漿サンプル（ＤＢ−１〜ＤＢ−５）を、８時間絶食させた糖尿病患者から採取した。
ｂ．腎機能の指標である血漿クレアチニン濃度。
ｃ．腎機能の指標である糸球体濾過量の推定。詳細については表１の脚注ｅを参照されたい。
ｄ．空腹時血中グルコースレベル。
ｅ．、ｆ．同位体比はδ表記（‰）で報告する。詳細については表１の脚注ｃ及びｄを参照されたい。
ｇ．括弧内の数値はＤＢの全ての数値の標準偏差である。
【００４９】
ＥＳＲＤの水のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、ＣＳよりも顕著に低い
ＥＳＲＤｎＨＤの血漿における水のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、ＣＳとは顕著に異なる特徴を示した。スチューデントｔ検定及びＡＮＯＶＡ統計分析をＥＳＲＤｎＨＤ及びＣＳのデータセットに適用することによって、ＥＳＲＤｎＨＤ及びＣＳにおける血漿の水含有量（δ１８Ｏ及びδ２Ｈ）は有意な差を示した［δ１８Ｏについてはt０．０５；８＝１３．７８及びＦ０．０５；１，８＝１８９．８３、δ２Ｈについてはｔ０．０５；８＝１５．０８及びＦ０．０５；１，８＝２２７．４７］。ＥＳＲＤＨＤの血漿中のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの分散は、ＣＳとＥＳＲＤｎＨＤとの間でばらつきがあった。ＥＳＲＤＨＤの血漿の水におけるδ１８Ｏ及びδ２Ｈは、ＣＳよりも有意に低い。ＥＳＲＤ（ＥＳＲＤｎＨＤ及びＥＳＲＤＨＤを含む）の血漿中のδ１８Ｏ及びδ２Ｈは、ＣＳよりも８７％及び７２％低く、ＤＢよりも１６０％及び９２％低い。このため、血漿におけるδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、本研究において腎機能と相関する。正常な対照被験体及び腎臓患者の両方が同じ飲食用水の供給源を共有しているため、ＥＳＲＤ患者の血漿における水の１８Ｏ及び２Ｈのレベルの低下は興味深い。
【００５０】
２Ｈ同位体及び１８Ｏ同位体は、腎機能障害を有する患者において血漿の水から選択的に「除去される」ようである。腎臓の多くの機能の１つは、水チャネルを形成する血漿膜タンパク質である種々のタイプの腎臓アクアポリン（ＡＱＰ）によって少なくとも部分的に媒介されることが現在知られている水の再吸収である（Nielsen S, Frokiaer J, Marples D, Kwon TH, Agre P, et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiological Reviews 82: 205-244、King LS, Kozono D, Agre P (2004) From structure to disease: The evolving tale of aquaporin biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 687-698、Borgnia M, Nielsen S, Engel A, Agre P (1999) Cellular and molecular biology of the aquaporin water channels. Annual Review of Biochemistry 68: 425-458）。例えば、アクアポリン１（ＡＱＰ１）は、近位尿細管及び水の透過率を増大させる細い下行脚（descending thin limb）に局在する（Nielsen S, Smith BL, Christensen EI, Knepper MA, Agre P (1993) CHIP28 water channels are localized in constitutively water-permeable segments of the nephron. The Journal of cell biology 120: 371-383）。ＡＱＰ２、ＡＱＰ３及びＡＱＰ４は、集合管に局在し、ＡＱＰ２が集合管での水透過率のバソプレシン調節の標的である（Nielsen S, Knepper MA (1993) Vasopressin activates collecting duct urea transporters and water channels by distinct physical processes. The American journal of physiology 265: F204-213）。当然ながら、これらのアクアポリンタンパク質が腎機能障害患者における血漿の１８Ｏ及び２Ｈのレベルの低下に関与するか否かという疑問が生じる。これまでの研究では、典型的なＡＱＰ１の分子動力学（ＭＤ）シミュレーション及び溶解実験から、２Ｈ２Ｏの透過率が水と類似することが示されているが（Mamonov AB, Coalson RD, Zeidel ML, Mathai JC (2007) Water and deuterium oxide permeability through aquaporin 1: MD predictions and experimental verification. The Journal of general physiology 130: 111-116）、別の研究では、ＡＱＰ１の芳香族／アルギニン領域における点突然変異によってプロトンの通過が可能となることが示されている（Beitz E, Wu B, Holm LM, Schultz JE, Zeuthen T (2006) Point mutations in the aromatic/arginine region in aquaporin 1 allow passage of urea, glycerol, ammonia, and protons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 269-274）。さらに、ＥＳＲＤ患者において、バソプレシン濃度の上昇が見出されている（Argent NB, Baylis PH, Wilkinson R (1990) Immunoreactive vasopressin in end stage renal failure. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry 190: 185-188）。バソプレシン及び水の欠乏は腎臓集合管におけるＡＱＰ２の上方調節を伴い（Terris J, Ecelbarger CA, Nielsen S, Knepper MA (1996) Long-term regulation of four renal aquaporins in rats. The American journal of physiology 271: F414-422、Combet S, Gouraud S, Gobin R, Berthonaud V, Geelen G, et al. (2008) Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is posttranscriptional and is abolished by water deprivation. American Journal of Physiology - Renal Physiology 294: F1408-F1414）、老化に伴うＡＱＰ２の下方調節が転写後に起こる（posttranscriptional）（Combet S, Gouraud S, Gobin R, Berthonaud V, Geelen G, et al. (2008) Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is posttranscriptional and is abolished by water deprivation. American Journal of Physiology - Renal Physiology 294: F1408-F1414）。ＥＳＲＤＨＤの血漿におけるＮａ＋、Ｋ＋及びＣｌ−等の一価イオンのレベルの更なる調査によってヘンレ係蹄上行脚の能動輸送の正常な機能が明らかとなったが（表２）、ネフロンのこの部分はアクアポリンを含有しない（Nielsen S, Frokiaer J, Marples D, Kwon TH, Agre P, et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiological Reviews 82: 205-244、King LS, Kozono D, Agre P (2004) From structure to disease: The evolving tale of aquaporin biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 687-698）。したがって、組織的かつ原子的な分解能での安定な同位体におけるＥＳＲＤのアクアポリンの生理学的役割の研究は、腎機能障害患者における重水の減少を解明する可能性がある。
【００５１】
血漿の１８Ｏ及び２Ｈの恒常性は、水供給源の１８Ｏ及び２Ｈのレベルの変動に対抗する
降水のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値は季節によって変動する。血漿中の水の２Ｈ及び１８Ｏの大部分は、最終的には飲食用水の供給源である降水に由来し得るため、雨水及び血漿の水におけるδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値の関係性を調べることは興味深い。
【００５２】
２０００年から２０１０年までの台北の毎月の降水のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値を含むデータの値を比較した（Peng T-R, Wang C-H, Huang C-C, Fei L-Y, Chen C-TA, et al. (2010) Stable isotopic characteristic of Taiwan's precipitation: A case study of western Pacific monsoon region. Earth and Planetary Science Letters 289: 357-366）。１月から５月にかけて、雨水のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの値は変動をほとんど示さなかった。これらの値は６月に低下し始め、７月及び８月に最小値に達し、９月から１２月にかけて盛り返した。一方で、ＣＳ群における血漿の水同位体比は、１月から５月にかけて常に降水よりも低かった。しかしながら、血漿の水の同位体比は、７月から１２月にかけて降水の標準誤差内であった。したがって、ＣＳ群の血漿における同位体δ２Ｈ及びδ１８Ｏの恒常性が、日々の摂取水の変動に対抗することが観察された。
【００５３】
台湾の７月における頻繁な台風のために、降水の同位体含有量は、他の全ての月に比べて最も少ないが最も変動する。７月及び３月におけるＥＳＲＤＨＤの血漿の水の同位体比は降水よりも有意に低く、同様に雨水に対する強い独立性を示す。９月における降水の同位体比はＣＳの同位体比に近く、降水よりも約３５％低いＥＳＲＤｎＨＤの同位体比においても同じことが観察される。ＤＢ群については、１２月における血漿の水のδ１８Ｏは降水と同程度であるが［ｔ０．０５；１４＝０．２７及びＦ０．０５；１，１４＝０．０７］、血漿の水のδ２Ｈは降水に対する独立性を示す［t０．０５；１４＝３．０３及びＦ０．０５；１，１４＝９．２１］。
【００５４】
ＤＢ群及びＣＳ群における水のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は類似している
ＤＢに由来するδ１８Ｏ及びδ２Ｈの値は、ＣＳに類似している。ＡＮＯＶＡ分析から、ＤＢ及びＣＳの血漿の水含有量（δ１８Ｏ及びδ２Ｈ）が同程度であることが示唆される［δ１８ＯについてはＦ０．０５；１，８＝４．６３；δ２ＨについてはＦ０．０５；１，８＝０．２０］。
【００５５】
腎臓状態の相違を反映する水同位体の生体恒常性の微調整が存在するようである。例えば、ＥＳＲＤｎＨＤ及び正常腎臓群（ＣＳ及びＤＢ）は異なる恒常性レベルを有する。正常な腎機能を有する２つの群（表１及び表３）について、ＣＳ及びＤＢのδ１８Ｏ及びδ２Ｈのレベルが類似していることに留意されたい。加えて、本発明者らは、ＣＳ被験体の年齢（２７歳〜６７歳の範囲である）が、ＤＢ被験体及びＥＳＲＤ被験体とは独立している（ｐ＝０）ことに注目している。ＥＳＲＤＨＤ群における１８Ｏ及び２Ｈの恒常性の欠如は、各血液透析の回数及び期間、並びに種々のＥＳＲＤＨＤ被験体の水和状態に起因し得る（Konings CJ, Kooman JP, Schonck M, Cox-Reijven PL, van Kreel B, et al. (2002) Assessment of fluid status in peritoneal dialysis patients. Perit Dial Int 22: 683-692）。
【００５６】
腎機能障害の原因は通常は非常に複雑であり、薬物療法、真性糖尿病、高血圧、敗血症、個人のライフスタイル等を含む。それにもかかわらず、腎臓の障害は、１Ｈによる２Ｈ及び１６Ｏによる１８Ｏの置き換えをもたらす代謝産物の蓄積を引き起こす。これは最終的に血漿の同位体の減少をもたらす。本研究では、腎機能障害がヒト血漿中のδ１８Ｏ及びδ２Ｈの大幅な減少に関連することが示唆される。腎機能障害患者においては血漿の同位体の減少の痕跡が示されるが、健常な個体又は糖尿病患者においては示されないことが観察された。このデータ及び結果は、血漿のδ１８Ｏ及びδ２Ｈが腎機能に強く影響を受けるが、恐らくは生体の同位体恒常性のために年齢、人種及び食生活には影響されないようであることを示唆している。要するに、本予備研究は生物学的データとともに、腎機能障害の潜在的マーカーとして血漿におけるδ１８Ｏ及びδ２Ｈのレベルを用いることの可能性を示唆するものである。
【００５７】
実施例２ 本発明の方法を用いた腫瘍性疾患の診断
対照被験体及びがん被験体（乳がん被験体、子宮頸がん被験体、胃がん被験体及び結腸がん被験体）の血漿サンプルを、実施例の上記の材料及び方法に言及されるように処理した。ヒト血漿中の水素（δ２Ｈ）及び酸素（δ１８Ｏ）の決定並びにデータ分析を、実施例の上記の材料及び方法に言及されるように行った。がん被験体の血漿中のδ２Ｈ及びδ１８Ｏの平均を下記の表に挙げる。
【００５８】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法であって、前記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、前記腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を、前記測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と前記δＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値との比較に基づいて診断することとを含み、前記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると診断する、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法。
【請求項２】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８の参照値が、約−３‰〜約−３．５‰の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＨ−２の参照値が、約−３０‰〜約−３５‰の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体のδＯ−１８の値が約−５‰よりも低い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体のδＨ−２の値が約−４０‰よりも低い、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生体サンプルが体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が尿、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、脳脊髄液、嚢胞液、腹水、糞便、胆汁又は組織液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記体液が血漿である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルを、該サンプルを乾燥剤の入った密封容器に入れた後、水和した乾燥剤から水を除去し、前記δＯ−１８（δ１８Ｏ）若しくはδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定するための水を得ることによって処理するか、又は前記生体サンプルを逆浸透によって処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記水和した乾燥剤からの水の除去を蒸留又は真空蒸留によって行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腎疾患が末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎症、腎不全、高尿酸血症、糖尿病性腎疾患、虚血性若しくは毒物誘発性の腎損傷、慢性腎不全、急性腎不全、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎又は慢性腎盂腎炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法を行うためのキットであって、腎疾患若しくは腫瘍性疾患を患っている可能性があるか、若しくは腎疾患若しくは腫瘍性疾患のリスクがある被験体に由来する生体サンプルを含有する容器、又は該サンプルを充填することが想定される容器と、生体サンプルにおけるδＯ−１８又はδＨ−２の値を測定する手段と、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断を可能にする参照値手段とを含む、請求項１に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１３】
乾燥剤を含有する容器を更に含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記乾燥剤がシリカゲル、活性炭、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、モンモリロナイト粘土及びモレキュラーシーブからなる群から選択される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１】
腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法であって、前記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８（δ１８Ｏ）及び／又はδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定することと、測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値とを比較することと、前記腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を、前記測定されたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値と前記δＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値との比較に基づいて診断することとを含み、前記腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体の生体サンプルにおけるδＯ−１８及び／又はδＨ−２の値が、腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８及び／又はδＨ−２の参照値よりも低い場合に、腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性があると診断する、腎疾患又は腫瘍性疾患の疑いがある被験体において腎疾患又は腫瘍性疾患の可能性を診断する方法。
【請求項２】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＯ−１８の参照値が、約−３‰〜約−３．５‰の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有しない被験体から得られたδＨ−２の参照値が、約−３０‰〜約−３５‰の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体のδＯ−１８の値が約−５‰よりも低い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記腎疾患又は腫瘍性疾患を有する被験体のδＨ−２の値が約−４０‰よりも低い、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生体サンプルが体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が尿、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、脳脊髄液、嚢胞液、腹水、糞便、胆汁又は組織液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記体液が血漿である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルを、該サンプルを乾燥剤の入った密封容器に入れた後、水和した乾燥剤から水を除去し、前記δＯ−１８（δ１８Ｏ）若しくはδＨ−２（δ２Ｈ）の値を測定するための水を得ることによって処理するか、又は前記生体サンプルを逆浸透によって処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記水和した乾燥剤からの水の除去を蒸留又は真空蒸留によって行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腎疾患が末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎症、腎不全、高尿酸血症、糖尿病性腎疾患、虚血性若しくは毒物誘発性の腎損傷、慢性腎不全、急性腎不全、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎又は慢性腎盂腎炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法を行うためのキットであって、腎疾患若しくは腫瘍性疾患を患っている可能性があるか、若しくは腎疾患若しくは腫瘍性疾患のリスクがある被験体に由来する生体サンプルを含有する容器、又は該サンプルを充填することが想定される容器と、生体サンプルにおけるδＯ−１８又はδＨ−２の値を測定する手段と、腎疾患又は腫瘍性疾患の診断を可能にする参照値手段とを含む、請求項１に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１３】
乾燥剤を含有する容器を更に含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記乾燥剤がシリカゲル、活性炭、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、モンモリロナイト粘土及びモレキュラーシーブからなる群から選択される、請求項１２に記載のキット。
【公開番号】特開２０１３−６１３３４（Ｐ２０１３−６１３３４Ａ）
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１９８７０４（Ｐ２０１２−１９８７０４）
【出願日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【出願人】（５１２２３４８９８）源清国際有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１９８７０４（Ｐ２０１２−１９８７０４）
【出願日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【出願人】（５１２２３４８９８）源清国際有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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