説明

生体サンプル分析用プレート

【課題】DNAの増幅及び分析を行える生体サンプル分析用プレートにおいて、増幅したPCR反応液を分析するためのサンプル定量部へと確実に移送することができる生体サンプル分析用プレートを提供する。
【解決手段】反応チャンバーの底面中央部に柱を設けることにより、ワックスが固化する際に反応チャンバー中央部付近に孔が開くことを防ぐことが出来きる。従って、ワックスがPCR反応液の表面を均一に覆うことが出来るため、サンプル定量部への送液を確実に行うことが出来る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、DNA分析を行う生体サンプル分析用プレートに関し、より詳細には、遠心力を用いることでDNA増幅から分析までの一連の工程を自動化した生体サンプル分析用プレートに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、分子生物学分野の発展に伴い、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。また、農畜産分野においても、品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されてきており、遺伝子はより身近なものとして取り上げられるようになってきた。
【0003】
これらの技術の進歩を大きく飛躍させた技術としてPCR(Poloymerase Chaine Reaction)によるDNA増幅技術が挙げられ、PCRによる増幅の有無を見ることによって判別することもできる。PCR技術が広く普及して以来、PCRを迅速で簡便に行う技術が望まれている。
【0004】
PCRは3つの温度工程からなる。二本鎖のDNAを一本鎖へと解離させる工程(熱変性)、一本鎖に解離したDNAに増幅したい部分の両端の配列と相補的な配列を有したプライマーを結合させる工程(アニーリング)、プライマーが結合した配列からDNAポリメラーゼによってDNA鎖を伸長させる工程(伸長反応)である。熱変性では95℃で1分間温度をかけることによって、DNAを一本鎖の状態にする。アニーリングの工程では50〜60℃で30秒間反応させることにより、増幅したい領域の末端部分にプライマーと呼ばれる20塩基程度の短いDNAを結合させる。伸長反応は72℃の温度でポリメラーゼを鋳型に付加し、DNA鎖の伸長を行う。これらの温度サイクルを25〜40回行うことで、サイクル数に応じて理論的には2の25乗から40乗倍に増幅できる。実質的には目的の領域を10の6乗倍に増幅している。
【0005】
PCRを行うためのPCR反応液は、増幅するためのポリメラーゼ、ポリメラーゼが最適な環境で働くためのpHや塩濃度を調整したバッファ、dNTP、両末端のプライマー、鋳型、トータルボリュームを調整する滅菌水で構成される。これらの試薬のうち、ポリメラーゼ、バッファ、dNTP、滅菌水はどのようなDNA断片を得たい場合でも共通の試薬であるが、両末端のプライマーと鋳型は増幅したい領域に合わせて用意する必要がある。また、ポリメラーゼは活性を失わないよう細心の注意が必要であり、通常はマイナス20℃で保存されており、PCRを行う段階での調整が必要であった。
【0006】
PCRを行うためにはこれらの試薬の調整を行う必要があるが、PCRの簡略化のために開発された二つのアプローチ方法がある。一つは温度工程を簡単にし、反応時間を短時間で済ませる方法である。72℃で反応するポリメラーゼ(酵素)を改良し、66℃の低温で反応ができるようになった。この酵素の開発によって、プライマーのアニール温度と伸長反応を同じ温度設定で行うことが出来、温度工程をひとつ減らすことが可能になった。また、もう一つは、乾燥状態でも失活しない酵素が開発され、従来、反応前の最終段階で調整しなければならなかった酵素の添加をあらかじめ混ぜて用意しておくことができるようになった。
【0007】
これらの技術を利用したマイクロタスによるPCR装置の期待が高まっている。しかし、マイクロタスで行うPCRは反応液の送液の制御が難しく、温度工程時に反応液が流路を移動したり、反応液が蒸発したりするという問題点があった。従来の小型の生体サンプル分析装置は、サンプルを注入する注入部とサンプルからDNAを抽出する抽出チャンバーとPCR反応を行うPCRチャンバーとを備えたプレートを用いて、PCR増幅を自動で行う構成である。この生体サンプル分析装置は加熱機構と回転機構を持ち、プレート上のサンプル移送は遠心力と毛細管現象を利用している。PCRチャンバーへ接続される流路には、ワックスにより蓋をし、PCR反応液の移送を制御できる構成になっている。抽出チャンバーに入った細胞はアルカリ細胞溶解液で溶解され、抽出チャンバーで抽出されたDNAは回転により抽出チャンバーから増幅反応チャンバーへ移送される。この増幅チャンバーでは中和用の緩衝液が加えられた後、PCRに必要なdNTPや塩、緩衝液、酵素と溶出したDNAを含む増幅溶液が加えられ、PCR反応を行う。PCR反応後は反応サンプルを検出する検出部を設けるか、または別の外部の装置で測定を行う(例えば、特許文献1参照。)。
【0008】
さらに特許文献1の技術を改良して、同一プレート上でDNAの増幅から検出までを行える生体サンプル分析用プレートが考えられる。この生体サンプル分析用プレートでは、熱溶解したワックス層を蓋として用いてPCR反応液の蒸発を防ぎ、回転機構を用いて送液を行う。図7に、この生体サンプル分析用プレートの流路パターンの模式図を示す。流路パターンには、PCR反応を行うための反応チャンバー6とPCR後のPCR反応液を分析するためのサンプル定量部7とが配置され、送液流路15により接続されている。図8に反応チャンバー6の断面図を示す。PCR反応中は、生体サンプル分析用プレートを回転させ、遠心力により反応チャンバー6の外周側へPCR反応液20を保持する(図8上図)。PCR反応液20よりも比重の軽いワックス21を熱融解させ、PCR反応液20の液面に蒸発防止膜を形成する。PCR反応後は生体サンプル分析用プレートの回転を停止させ、PCR反応液20及びワックス21を反応チャンバー6の底面に移動させ、加熱をやめることでワックス21を凝固させる(図8下図)。生体サンプル分析用プレートを再度回転させることにより、凝固したワックス21と底面に挟まれたPCR反応液20の一部は流路15を通り、サンプル定量部7へ送液される。正電極11及び負電極12に電圧を印加して、緩衝液で満たされた流路13において電気泳動を行うことによりDNA検出を行う。
【特許文献1】特表2003−502656号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、前記従来の構成では、PCR増幅後のPCR反応液20を移送するために遠心終了後はワックス21への加熱を止めなければならない。そのため、加熱終了後、ワックスは固化すが、このワックス21がPCR反応液20の表面に均一に覆わず、チャンバー6の中央部を残して固化してしまう。その結果、図9に示すようにチャンバー6の表面のワックス21層に孔が開き、PCR反応液20が露出してしまう。この状態でチャンバー6内のPCR反応液20の送液を行えば、チャンバー6の中央部に開いたワックス21の孔を通してPCR反応液20が移動するため、送液流路7に必要量のPCR反応液20を移送できないという課題を有していた。
【0010】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、遠心後のPCR産物の送液を確実に行うことのできる生体サンプル分析用プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体サンプル分析用プレートは、回転すべき中心軸と、前記回転により分析すべき生体サンプルを送るための注入流路と、前記注入流路に接続され底面に柱を持つ反応チャンバーと、前記チャンバーから前記生体サンプルを送液するための送液流路と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【0012】
本発明の生体サンプル分析用プレートによれば、一つのプレート上でDNAの増幅から分析まで行う際、増幅したPCR反応液を分析するためのサンプル定量部へと確実に移送することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0013】
以下に、本発明の生体サンプル分析用プレートの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【0014】
(実施の形態1)
図1は、本発明の実施の形態1における生体サンプル分析用プレート101を示す平面図であり、図2はその拡大図での一つの流路パターン102を示した図である。図1を用いて、生体サンプル分析用プレート101の説明をする。生体サンプル分析用プレート101の材質はアクリル系の樹脂であり、厚みは5mmである。生体サンプル分析用プレート101の両面に、深さ50μmの流路やチャンバーとなる溝や孔が形成されている。さらにその上面に厚さ50μmのアクリル製フィルム、下面に500μmのアクリル製プレートを接着することで密閉流路を形成している。また、生体サンプル分析用プレート101の軸心103には、生体サンプル分析用プレート101を生体サンプル分析装置に固定するための孔が設けられている。本発明の実施の形態1においては、生体サンプル分析用プレート101には8つの流路パターン102が設けられている構成を例としている。
【0015】
図2を用いて、生体サンプル分析用プレート101の流路パターン102について詳細に説明する。流路パターン102には、PCR反応液を注入するためのPCR反応液注入部105と、緩衝剤を注入するための緩衝剤注入部104と、PCR反応を行うための反応チャンバー106と、PCR反応後のPCR反応液を定量するサンプル定量部107と、バッファ部108と、正電圧の印加部である正電極部111と、負電圧の印加部である負電極部112と、これらを接続する流路とからなる。
【0016】
図3に、図2における反応チャンバー106の破線A−A’の断面図を示す。図3を用いて、反応チャンバー106の形状について詳細に説明する。アクリル製プレート101の上面にアクリル製フィルム117、下面にアクリル製プレート118を貼り付けて流路を形成している。PCR反応液注入部105と反応チャンバー106を接続する注入流路114が形成される面を上面とし、サンプル定量部107と反応チャンバー106を接続する送液流路115が形成される面を下面とする。本発明の実施の形態1では下面をチャンバー106の底面とする。反応チャンバー106底面の中央部付近には柱116が形成されている。送液流路115は、生体サンプル分析用プレート回転時に前記生体サンプルが存在しない底面側に形成されている。
【0017】
以下に本発明による生体サンプルのDNAをPCR法により自動増幅した後、PCR産物を測定するまでの動作の流れを説明する。生体サンプルは、植物、動物、または人の細胞や血液等から抽出したDNAまたはRNAを使用する。本発明の実施の形態1では、DNAを用いた。PCRのために使用する溶液は、分析したいDNAを含む生体サンプルと、DNAを増幅するための酵素と、酵素が最適環境で作用するためのpHや塩濃度を調整するためのバッファと、dNTP、プライマーとを含有するPCR反応液である。プライマーは、生体サンプルの中で増幅したい領域の末端の配列を持つ配列を選択し、蛍光物質等の標識剤を修飾している(本発明の実施の形態1ではCy5を修飾した。)。酵素にはTagポリメラーゼを使用する。以上の試薬を調整し、PCR反応液を準備する。
【0018】
次に、緩衝剤としてポリマー溶液を準備する。ポリマーは分子篩効果を持つものなら何でも良く、例えば、アクリルアミドポリマーやPEG、デキストラン、セルロースなどが挙げられる。本発明の実施の形態1では、PEG(分子量50万)を50mM Tris−Borate(pH7.4)で3.5%になるように希釈し、一晩静置した後、0.45μm以下のフィルターでろ過したものを使用する。
【0019】
試料の準備が終わったところで、ポリマー溶液およびPCR反応液をプレート101内へ注入する。ポリマー溶液はピペッター等により定量を緩衝剤注入部104へ分注する。PCR反応液も同様に定量をサンプル注入部105へ分注する。分注量としては、流路パターンのスケールにより異なるが本実施の形態1においては、ポリマー溶液は18マイクロリットル、PCR反応液は30マイクロリットルとする。
【0020】
次に、プレート101をモータ等に固定して、軸心103を軸に回転を行う(例えば、本発明の実施の形態1では回転数2000rpm。)。この時分注されたポリマー溶液とPCR反応液は、遠心力により外周方向へと移動する。緩衝剤注入部107内のポリマー溶液は流路109と流路110を通り正電極部111と負電極部112へ等分され正電極部111へ移動したポリマー溶液はさらに流路113を通りサンプル定量部107まで移動する。負電極部112へ移動したポリマー溶液も同様に流路113を通りサンプル定量部107まで移動する。
【0021】

図4は回転開始後、ポリマー溶液の移動が停止した状態を示す図である。斜線で示す部分がポリマー溶液であり、ポリマー溶液は、正電極部111および負電極部112の6割程度まで充填されており、流路113を満たしサンプル定量部107で合流している。また、正電極部111と負電極部112内に存在するポリマー溶液の液面高さとサンプル定量部107の液面高さは、プレートの中心103を中心とする同一円周上となる。
【0022】
次にPCR反応液のPCR反応と移動について説明する。PCR反応は、反応チャンバー106において行われる。図5は、PCR反応中、PCR反応後、サンプル定量部への送液後、それぞれの場合の反応チャンバー106内の状態を示す。
【0023】
図5(a)に、PCR反応中の反応チャンバー106内の状態を示す。本発明の実施の形態1では、直径は6mm深さ4mmの内容積を持つ反応チャンバー106を作成した。また、柱116は、反応チャンバー106の中心に直径2mmで高さは4mmのものを作成した。PCR反応液の液量は30μL、ワックスの質量は14mgとした。PCR反応液注入部105へ注入されたPCR反応液120は、生体サンプル分析用プレート101を回転させさせることで生じる遠心力によって反応チャンバー106へ移送される。生体サンプル分析用プレート101の回転を継続させたまま、95℃で1分、55℃で30秒、72℃で30秒という熱サイクルを25サイクルから40サイクル行う。50℃以下の融点をもつワックス121は、予め反応チャンバー106に封入されており、熱サイクルの加熱により融解する。生体サンプル分析用プレート101の回転により遠心力が生じているため、PCR反応液120及び熱融解したワックス121は反応チャンバー106内の外周側へ寄せられる。PCR反応液120よりも比重が軽いワックス121の層がPCR反応液120の液面に形成され、このワックス121の層が蒸発防止膜となる。
【0024】
図5(b)に、PCR反応後の反応チャンバー106内の状態を示す。PCR反応後、生体サンプル分析用プレート101の回転を停止させると、PCR反応液120及びワックス121は反応チャンバー106の側面から底面へ移動する。このとき、ワックス121は柱116を伝わって、反応チャンバー106の底面に均一に拡がる。その結果、PCR反応液120よりも比重の軽いワックス121の層が上に形成される。その後、加熱を停止して、ワックス121が凝固する温度まで生体サンプル分析用プレート101を冷却する。本発明の実施の形態1では、50℃になるまで冷却した。
【0025】
反応チャンバー106の底面に柱を設けない場合では、ワックス121がPCR反応液120の表面に均一に覆わず、チャンバー中央部付近を残して固化してしまい、ワックス121層に孔が開いてしまった。しかし、本発明の実施の形態1ではチャンバー中央部に柱を設けることでワックス121層中央部付近に孔が開くことを防ぐことが出来た。
【0026】
ここで、本発明の実施の形態1では柱の高さをチャンバーの深さと同じにしたが、PCR反応液とワックスをチャンバー底面に満たした際の液面高さ以上であればよい。また、本発明の実施の形態1では柱116の形状を円柱としたが、柱116の高さが液面高さ以上であればその限りではなく、多角形であってもよい。
【0027】
図5(c)に、サンプル定量部への送液後の反応チャンバー106内の状態を示す。図5(b)の状態から、生体サンプル分析用プレート101を再度回転させる。この回転によって生じる遠心力により、固化したワックス121の層と反応チャンバー106の底面との間に挟まれたPCR反応液120のうち送液流路115よりも内周側を送液流路115へと送液する。送液流路115を通ったPCR反応液120は、サンプル定量部107で一定量が保持され、一定量以上は送液流路115を通りバッファ部108へと移動する。
【0028】
図6はプレートの回転を停止した後の状態を示す図である。PCR反応液120はサンプル定量部107において流路113から充填されたポリマー溶液と接している。また、PCR反応液120は、サンプル定量部107を残してすべてバッファ部108へ移送されている。
【0029】
以上により、サンプル定量部107に一定量のPCR反応液を残留させることができ、サンプル定量部107のPCR反応液が分析をする最終試料となる。
【0030】
次に、電気泳動を行う。電気泳動は正電極部111に正電極、負電極部112に負電極を、プレート101の外部からフィルムを突き破って挿入して、ポリマー溶液と接触させる。そして数百Vの電圧を印加する。すると、流路113およびサンプル定量部107において電界が発生し、サンプル定量部107に一定量残存したPCR反応液は流路113中を正電極側(図6中A方向)へ移動する。
【0031】
DNAの検出は、蛍光標識(Cy5)を修飾したDNAを635nmの光で励起し、670nm付近の光検出によって、流路113中を電気泳動するPCR反応液の状態を検出し、PCRによるDNA断片の増幅の有無を確認する。さらには、電気泳動する流路113を円弧状としたことで、生体サンプル分析用プレート1を回転させることにより、流路113中を電気泳動するDNAサンプルの分布を測定する。
以上のように、本発明の実施の形態101においては、反応チャンバー106の底面の中央部付近に柱を設けた。この柱を設けることにより、ワックス層が固化する際に孔が開くことを防ぐことが出来る。PCR反応液120の上のワックス層に孔が開くことなく覆うことにより、サンプル定量部107への送液を確実に行うことが出来る。サンプル定量部107へ充填されたPCR反応液は、電気泳動を行い、DNA解析される。
【産業上の利用可能性】
【0032】
DNAの増幅から検出までの自動装置の実現のため、同一プレート上でDNA増幅と検出が行える生体サンプル分析用プレートが必要であり、そのプレートにおけるサンプル液の保持及び送液は非常に重要である。本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、サンプル液のチャンバー間の送液を確実に行えるので、生体サンプル分析用プレートの用途を飛躍的に広げるため有用である。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】本発明の実施の形態1における生体サンプル分析用プレートを示す図
【図2】本発明の実施の形態1における生体サンプル分析用プレートに形成される流路パターンを示す図
【図3】本発明の実施の形態1における生体サンプル分析用プレートの反応チャンバーの断面を示す図
【図4】本発明の実施の形態1における生体サンプル分析用プレートにポリマー溶液を充填した状態を示す図
【図5】本発明の実施の形態1における生体サンプル分析用プレートの反応チャンバー内でのPCR反応液の状態を閉めす図
【図6】本発明の実施の形態1における生体サンプル分析用プレートにおいてPCR反応液をサンプル定量部に定量した状態を示す図
【図7】従来の生体サンプル分析用プレートの流路パターンを示す図
【図8】従来の生体サンプル分析用プレートの反応チャンバーの断面図
【図9】PCR反応終了後の反応チャンバーの表面を示す図
【符号の説明】
【0034】
4 緩衝剤注入部
5 PCR反応液注入部
6 反応チャンバー
7 サンプル定量部
8 バッファ部
9 流路
10 流路
11 正電極部
12 負電極部
13 流路
14 注入流路
15 送液流路
20 PCR反応液
21 ワックス
101 生体サンプル分析用プレート
102 流路パターン
103 軸心
104 緩衝剤注入部
105 PCR反応液注入部
106 反応チャンバー
107 サンプル定量部
108 バッファ部
109 流路
110 流路
111 正電極部
112 負電極部
113 流路
114 注入流路
115 送液流路
116 柱
117 アクリル製フィルム
118 アクリル製プレート
119 ポリマー溶液
120 PCR反応液
121 ワックス

【特許請求の範囲】
【請求項1】
回転すべき中心軸と、
前記回転により分析すべき生体サンプルを送るための注入流路と、
前記注入流路に接続され底面に柱を持つ反応チャンバーと、
前記チャンバーから前記生体サンプルを送液するための送液流路と、
を備えた生体サンプル分析用プレート。
【請求項2】
前記生体サンプルは、DNAである請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項3】
前記生体サンプルは、RNAである請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項4】
前記注入流路は、前記生体サンプル分析用プレートの上面に配置されている請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項5】
前記反応チャンバーは、加熱することにより前記生体サンプルを熱変性するために使用される請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項6】
前記反応チャンバーは、熱融解するワックス塊を有する請求項5に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項7】
前記反応チャンバーは、前記中心軸に対し前記注入流路より外周側に位置する請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項8】
前記チャンバーに形成された柱は、前記底面の中央部に設けられた請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項9】
前記チャンバーに形成された柱は、前記生体サンプルと前記ワックスを前記底面に満たした際の液面高さよりも高い請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項10】
前記送液流路は、前記底面に設けられた請求項9に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項11】
前記送液流路は、前記生体サンプル分析用プレート回転時に前記生体サンプルが存在しない前記底面に設けられた請求項10に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項12】
前記送液流路は、前記生体サンプルに近い位置にある前記底面に設けられた請求項11の生体サンプル分析用プレート。
【請求項13】
前記送液流路は、前記注入流路よりも低い位置に設けられた請求項1に記載の生体サンプル分析用プレート。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【公開番号】特開2009−168544(P2009−168544A)
【公開日】平成21年7月30日(2009.7.30)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−5355(P2008−5355)
【出願日】平成20年1月15日(2008.1.15)
【出願人】(000005821)パナソニック株式会社 (73,050)
【Fターム(参考)】