生体分子の選択的放射性標識
本発明によれば、生体分子上にフッ素原子を導入するための方法であって、（ｉ）チオール反応性末端及びアジド／アルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド／アルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキン基とそれぞれ反応させる段階を含んでなる方法が提供される。また、二官能性リンカー及びバイオコンジュゲートの組成物及び合成方法並びにフッ素標識生体分子を含む放射性診断剤も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子上にフッ素原子を導入するための方法に関する。本発明はまた、二官能性リンカー及びバイオコンジュゲートの組成物及び合成方法並びにフッ素標識生体分子を含む放射性診断剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸残基を含む生体分子上にフッ素原子（特に放射性フッ素原子）を導入するための方法は、大きな関心を集めている。しかし、18Ｆのような放射性フッ素原子は約１１０分という比較的短い寿命を有するので、生体分子上に放射性フッ素を導入するためには時間効率のよい方法が要求される。
【０００３】
放射性フッ素原子をはじめとするフッ素原子を生体分子上に導入するための効率的で部位特異的な方法に対するニーズは今なお存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６７３７６号パンフレット
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、ポリペプチドのような生体分子上にフッ素原子を導入するための方法が開示される。本方法は、（ｉ）チオール反応性末端及びアジド／アルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド／アルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキンとそれぞれ反応させる段階を含んでなり得る。
【０００６】
別の態様では、生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するための方法が提供される。本方法は、（ｉ）Ｎ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミドリンカー（１）のようなＭａｌ−アルキン二官能性リンカーのチオール反応性基を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び（ｉｉ）次いでリンカーのアルキン基をフッ素置換アジドと反応させる段階を含んでなる。
【０００７】
さらに別の態様では、（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなるバイオコンジュゲートが提供される。リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることで製造できる。
【０００８】
さらに別の態様では、上記の方法、リンカー及び生体分子を用いて製造されるバイオコンジュゲートが本発明によって提供される。
【０００９】
別の態様では、リンカーの組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明のこれらの態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で表されている。
【図１】図１は、非最適化系の反応混合物のＨＰＬＣ分析結果であって、18Ｆクリック標識Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（２７）を示している（ａ，放射能チャネル、ｂ，２８０ｎｍでのＵＶチャネル）。
【図２】図２は、勾配Ｉ及び２１６ｎｍのＵＶを用いた２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）含有反応混合物のＨＰＬＣ分析結果を示している（ａ，放射能チャネル，３：５１分に２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）、ｂ，ＵＶチャネル）。蒸留生成物は、２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）の存在のみを示している（ｃ，放射能チャネル、ｄ，ＵＶチャネル）。
【図３】図３は、モデル化合物（１６）及び２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）を用いて様々なアルキン（１６）濃度及び温度で生成されたトリアゾール生成物（１７）の放射化学収率のＨＰＬＣプロットを示している。
【図４】図４は、アルキニル化アフィボディ（２２）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータを示している。
【図５】図５は、アルキニル化アフィボディ（２２）とＣｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）との間のクリックコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示している。ＣｕI源及び還元剤の存在下におけるコンジュゲート生成物（２６）の予想分子量でＣｙ５色素の蛍光発光が認められる。これらが存在しない対照実験では、コンジュゲート生成物の存在は認められない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の詳細な説明は例示的なものであり、本願の発明及び該発明の用途を限定するものではない。さらに、先行する発明の背景又は以下の詳細な説明中に示されるいかなる理論によっても限定されるものではない。
【００１２】
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指示するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中に使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。単数形で記載したものであっても、前後関係から明らかでない限り、複数の場合も含めて意味する。
【００１３】
本明細書中で使用する「活性化基」という用語は、求核試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、酸塩化物及び尿素中間体）に対するカルボニル基の反応性を高める任意の基をいう。
【００１４】
本明細書中で使用する「アジド反応性末端」及び／又は「アジド反応性官能基」という用語は、アジド官能基と反応し得る任意の官能基をいう。アジド反応性官能基の若干の例には、特に限定されないが、アルキン、アレン及びホスフィンがある。
【００１５】
本明細書中で使用する「アルキン反応性末端」及び／又は「アルキン反応性官能基」という用語は、アルキン官能基と反応し得る任意の官能基をいう。アルキン反応性官能基の例には、特に限定されないが、ＣｕI源（特に限定されないが、Ｃｕ0、ＣｕI及びＣｕIIを含む）及び還元剤（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）の存在下で反応し得るアジドがある。
【００１６】
本明細書中で使用する「脂肪族ラジカル」又は「脂肪族基」という用語は、一般に、環状でなくかつｓｐ3炭素原子である結合点を有する炭素原子配列をいう。炭素原子配列はさらに、ｓｐ3、ｓｐ2又はｓｐ混成炭素原子の任意の組合せを含み得る。さらに、炭素原子配列は一価、二価又は三価であり得る。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソオクチル、ベンジル、シクロヘキシルメチル、フェネチル及び１’，１’−ジメチルベンジルがある。
【００１７】
本明細書中で使用する「芳香族ラジカル」及び／又は「芳香族基」という用語は、ｓｐ2混成炭素原子及び共役炭素−炭素二重結合の環状配列をいい、環状炭素原子配列の一部をなす芳香族ｓｐ2混成炭素原子の位置に結合点を有する。芳香族基又はラジカルは、１乃至最大許容数の置換基を有し得る。アリール基の例には、フェニル、置換フェニル、トリル、置換トリル、キシリル、メシチル、クロロフェニル、ナフチル、フリル、チエニル及びピロリルがある。
【００１８】
本明細書中で使用する「脂環式ラジカル」又は「脂環式基」という用語は、ｓｐ3混成炭素原子の環状配列をいい、環状炭素原子配列の一部をなす芳香族ｓｐ3混成炭素原子の位置に結合点を有する。炭素原子配列はさらに、ｓｐ3、ｓｐ2又はｓｐ混成炭素原子の任意の組合せを含み得る。さらに、環状炭素原子配列は１乃至最大許容数の置換基で置換されていてもよい。さらに、環状炭素原子配列はＯ、Ｎ又はＳのようなヘテロ原子を含み得る。脂環式基の例には、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、トリメチルシクロヘキシル、フェニルシクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、４−チアシクロヘキシル及びシクロオクチルがある。
【００１９】
「チオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基」という用語は、生体分子のチオール基と反応し得る基をいう。したがって、ジスルフィドはチオール反応性基とみなすことができる。ピリジルジスルフィドはかかるジスルフィドの例である。
【００２０】
本明細書中で使用する「フッ素置換アジド」という用語は、１以上のフッ素置換基を有するアジド含有化合物を意味する。さらに、フッ素置換基は任意の種類の同位体（例えば、18Ｆ及び19Ｆ）であり得る。一実施形態では、フッ素置換基は18Ｆである。アジドは脂肪族アジド、脂環式アジド又は芳香族アジドであり得る。さらに、脂環式アジド及び芳香族アジドは単環式、二環式又は多環式構造を有し得る。
【００２１】
本明細書中で使用する「フッ素置換アルキン」という用語は、１以上のフッ素置換基を有するアルキン含有化合物を意味する。さらに、フッ素置換基は任意の種類の同位体（例えば、18Ｆ及び19Ｆ）であり得る。一実施形態では、フッ素置換基は18Ｆである。アルキンは脂肪族アルキン、脂環式アルキン又は芳香族アルキンであり得る。さらに、脂環式アルキン及び芳香族アルキンは単環式、二環式又は多環式構造を有し得る。
【００２２】
本明細書中で使用する「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）にかかわらず、任意のアミノ酸連鎖を記述するために本明細書中で使用される。したがって、これらの用語は本明細書中ではアミノ酸残基のポリマーを表すため互換的に使用できる。これらの用語はまた、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。したがって、「ポリペプチド」という用語は、完全長の天然タンパク質並びに完全長の天然タンパク質或いは天然タンパク質の特定ドメイン又は部分に相当する組換え又は合成ポリペプチドを包含する。
【００２３】
「アルキル」、「脂肪族」、「脂環式」及び「芳香族」という用語に適用される「ラジカル」及び「基」という用語は、本明細書中では互換的に使用される。
【００２４】
本明細書中で使用する「チオール反応性末端」及び／又は「チオール反応性官能基」という用語は、チオール基又はメルカプタン基（即ち、−ＳＨ基）と反応し得る官能基をいう。チオール反応性官能基の例には、特に限定されないが、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、α，β−不飽和スルホン基、ビニルスルホン基、α，β−不飽和カルボニル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基がある。
【００２５】
好適なマレイミド基には、母体（非置換）基並びに脂肪族基、脂環式基又は芳香族基を置換基として含む誘導体がある。好適なα，β−不飽和カルボニル基には、アクリロイル基を含むものがある。好適なα，β−不飽和カルボニル基には、α，β−不飽和エステル及びα，β−不飽和スルホンがある。ビニルスルホン基はα，β−不飽和スルホン基の具体例である。
【００２６】
特記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲中で使用される成分の量、性質（例えば分子量）、反応条件などを表すすべての数は、あらゆる場合に「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。したがって、そうではないと表記されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲中に示される数値パラメーターは、本発明によって得ることが求められる所望の特性に応じて変動しうる近似値である。最低でも、特許請求の範囲の技術的範囲への等価物の原則の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも報告された有効数字の桁数を考慮しつつ通常の丸め技法を適用して解釈すべきである。
【００２７】
本発明の態様は、生体分子上にフッ素原子を導入するための方法に関する。本方法は、
（ｉ）チオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、
（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに
（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド又はアルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキン基とそれぞれ反応させる段階
を含んでなる。
【００２８】
本発明の別の態様は、１以上のチオール基を含む生体分子及びリンカーから導かれる構造単位を含んでなるバイオコンジュゲート組成物を提供することである。リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造できる。別の態様では、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させることによって製造できる。
【００２９】
生体分子
本明細書中で使用する「生体分子」という用語は、リンカーとの反応のために１以上のチオール基（時には「メルカプト」基ともいう）又はその反応性誘導体を含む天然の分子又は操作された分子をいう。チオール基は、生体分子中に天然に存在するものでもよいし、或いは標準の生物学的方法又は当技術分野で認められている適当な方法を用いて化学的に導入又は操作されたものでもよい。若干の実施形態では、生体分子は特に５０未満のアミノ酸残基を有するものを除外する。
【００３０】
かかる生体分子は、天然の状態で１以上のＳＨ基を有していてもよいし、或いは例えば標準の分子生物学的技法を用いて操作されていてもよい。天然にＳＨ基を有する生体分子の例には、１以上のシステインアミノ酸に結合されたものがある。「その反応性誘導体」という用語は、リンカー化合物との反応のために遊離チオール基を生成するように活性化されたＳＨ基の誘導体を意味する。
【００３１】
天然に１以上のチオール基を有するか又は化学的に操作されたチオール基を有する生体分子の例には、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、脂質、多糖、グリコサミノグリカン及びその修飾形、糖脂質、糖タンパク質、合成ポリマー、細胞応答調節剤（例えば、成長因子、走化性因子又はサイトカイン）、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン及びリボザイムがある。開示される方法はまた、チオール基を含まないが、チオール基を含む分子にコンジュゲートされる分子にも適用できる。生体分子のさらに他の例には、タンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質変異体、骨格系タンパク質、操作タンパク質、ヌクレオチド及び関連分子、核酸、オリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡペプチドコンジュゲート、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体のような抗体、及び抗体系フラグメントがある。したがって、開示される方法は、チオール基を有するポリペプチドのようなチオール含有分子と結合したデオキシリボ核酸（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド、核酸プローブ、プラスミド）及びリボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）をはじめとする核酸をフッ素化するためにも使用できる。
【００３２】
生体分子は、１以上のチオール基を有する任意の天然生体分子又は操作生体分子であり得る。すべての実施形態において、生体分子は天然アミノ酸残基及び／又は非天然アミノ酸残基を含み得る。別の実施形態では、１以上のチオール基を有する生体分子はシステイン残基又は非天然基を含む。「システイン残基」という用語は、システインが生体分子連鎖の一部として含まれた後に生じるチオール基以外の構造フラグメントを意味する。さらに別の実施形態では、リンカーと反応するための生体分子は、操作されたシステイン残基を有するものである。これは、適当な前駆体生体分子を化学的に修飾することにより、チオール基及びシステイン残基を有する所望の生体分子を生成し得ることを意味する。
【００３３】
場合によっては、生体分子を還元剤で処理して反応性チオール基を生成することができる。例えば、ジスルフィド結合を有する生体分子を適当な還元剤で還元することで、チオール基を有する生体分子２当量を生成することができる。有用な還元剤の例には、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）がある。
【００３４】
リンカー
本明細書中で使用する「リンカー」という用語は、チオール反応性末端又はその保護誘導体及びアジド又はアルキン反応性末端又はその保護誘導体を含む二官能性化合物をいう。かかるリンカーは、一端ではチオール反応性末端を介してチオール含有化合物を結合し、他端ではアジド又はアルキン反応性末端を介してアジド又はアルキン（特にフッ素置換アジド又はアルキン）をそれぞれ結合するために使用できる。本明細書中で使用する「Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカー」という用語は、第１の末端にマレイミド基を有し、第２の末端にアルキン基を有するリンカー、例えばＮ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミドリンカー（１）をいい、「Ｍａｌ−アジド二官能性リンカー」という用語は、第１の末端にマレイミド基を有し、第２の末端にアジド基を有するリンカー、例えば化合物（２）をいう。リンカーの若干の非限定的な例を下記構造（１）〜（６）に示す。
【００３５】
【化１】
若干の実施形態では、チオール反応性末端、アジド又はアルキン反応性末端、或いはチオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端の両方を前駆体誘導体で置換することができる。かかるリンカーは、一端ではチオール反応性末端を介してチオール含有化合物を結合するため、及び／又は他端ではアジド又はアルキン反応性末端を介してアジド又はアルキン（特にフッ素置換アジド又はアルキン）をそれぞれ結合するために使用できる。
【００３６】
リンカーの製造
リンカーは、チオール反応性官能基及びアジド又はアルキン反応性官能基の両方を、それぞれ（ｉ）１以上のチオール基を有する生体分子及び（ｉｉ）フッ素置換アジド又はアルキンとの反応のために利用可能にする任意の方法によって製造できる。一実施形態では、リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることで製造される。アジド又はアルキン反応性官能基を有する任意のアミン化合物が使用できる。一実施形態では、アミン化合物は下記構造（７）を有する。
Ｇ−Ｊ−ＮＨＲ1 （７）
式中、Ｇはアジド又はアルキン反応性官能基であり、Ｊは連結単位であり、Ｒ1はＨ、脂肪族基、芳香族基又は脂環式基である。二価連結単位Ｊの性質は、チオール反応性官能基及びアジド又はアルキン反応性官能基の反応性に悪影響を及ぼすことがある立体障害を最小にするように設計できる。本アプローチの利点の１つは、バイオコンジュゲートの最終性質を変更するように連結単位を調整できることである。即ち、リンカーのサイズ、極性、電荷及び化学組成を変化させることにより、溶解性及び薬物動態学／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）性質のような最終コンジュゲートの性質を変更することができる。さらにリンカーは、標的化及び／又は溶解性を向上させる基を結合するための追加の結合手（ｈａｎｄｌｅ）を含むことができる。
【００３７】
他の実施形態では、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させることで製造できる。
【００３８】
カルボン酸又は活性化エステルは、下記構造（８）を有する。
Ｌ−Ｍ−ＣＯＲ2 （８）
式中、Ｌはチオール反応性官能基又はその保護誘導体からなり、Ｍは二価連結単位であり、Ｒ2はＯＨ又は活性化基である。活性化基Ｒ2は、アジド又はアルキン反応性官能基を有するアミン化合物と構造（８）のカルボニル炭素原子との反応を容易にする。
【００３９】
別の実施形態では、下記の式を有するリンカー組成物が提供される。
Ｌ−Ｍ−ＣＯ−ＮＨ（Ｒ1）−Ｊ−Ｇ
式中、
Ｌはチオール反応性官能基であり、
Ｍ及びＪは二官能性単位／連結単位であり、
Ｒ1はＨ、脂肪族基、芳香族基又は脂環式基であり、
Ｇはアジド又はアルキン反応性官能基である。
【００４０】
構造（１）及び（２）を有するリンカーを製造するための例示的な合成アプローチを下記反応スキーム１及び２に示す。
【００４１】
【化２】
反応スキーム１及び２中、ＤＭＦはジメチルホルムアミドを表し、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンを表す。これらの方法を用いて製造できるリンカーの若干の例は、上記構造（１）〜（６）に示されている。
【００４２】
バイオコンジュゲート
リンカーと１以上のチオール基を有する生体分子との反応から得られる生成物をバイオコンジュゲートと呼ぶ。かくして一実施形態では、バイオコンジュゲートは（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなり、リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造される。別の実施形態では、バイオコンジュゲートは（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなり、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造される。別の態様では、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させることで製造できる。
【００４３】
バイオコンジュゲートのフッ素化方法
本明細書中に記載される方法は、フッ素標識バイオコンジュゲート、さらに詳しくは放射性フッ素（例えば18Ｆ）標識バイオコンジュゲートの製造を可能にする。これらの方法の利点の１つは、生体分子のチオール基をリンカーのチオール反応性官能基と選択的に反応させ得る非放射性条件下でリンカーを生体分子に選択的に結合し、得られたバイオコンジュゲートを18Ｆ又は通常のフッ素で置換されたアジド又はアルキンとの反応前に精製できることである。別の利点は、放射性フッ素標識を最終段階で選択的に付加することができ、最終バイオコンジュゲートを特にトレーサーレベルで製造する前に時間のかかる追加の精製段階を行う必要性が排除されることである。
【００４４】
本明細書中に記載される、バイオコンジュゲート上にフッ素を導入するための方法は、任意の長さのフッ素化バイオコンジュゲートを生成するために使用できる。かくして、若干の実施形態では、バイオコンジュゲートの生体分子は５０以上のアミノ酸残基又は１００以上のアミノ酸残基を含む。
【００４５】
一態様では、生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するための方法が開示される。本方法は、（ｉ）チオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド又はアルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキンとそれぞれ反応させる段階を含んでなり得る。
【００４６】
ポリペプチドのような生体分子上にフッ素原子を導入するための方法の若干の実施形態では、リンカーのチオール反応性末端は、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、ビニルスルホン基、アクリロイル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基から選択される。
【００４７】
さらに詳しくは、本明細書中に記載される方法は、Ｎ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミド（１）のようなＭａｌ−アルキン二官能性リンカーをリンカーとして用いて生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するために使用できる。かかる方法は、（ｉ）Ｎ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミド（１）のチオール反応性基を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び（ｉｉ）次いで段階（ｉ）から得られた中間生成物のアルキン基をフッ素置換アジドと反応させる段階を含んでなる。別の実施形態では、本方法は化合物（２）のようなＭａｌ−アジド二官能性リンカーをリンカーとして用いて生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するために使用できる。かかる方法は、化合物（２）のチオール反応性官能基を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び（ｉｉ）次いで段階（ｉ）から得られた中間生成物のアジド基をフッ素置換アルキンと反応させる段階を含んでなる。
【００４８】
リンカーのアジド又はアルキン反応性末端とフッ素置換アジド又はアルキンとの反応は、温和な酸性条件から温和な塩基性条件にまでわたり得る任意の媒質中で実施できる。一実施形態では、反応は約６〜約９の範囲内のｐＨを有する媒質中で実施でき、別の実施形態では、約７〜約８のｐＨ範囲内で実施できる。反応温度は室温から約７０℃まで変化し得る。反応時間は様々に変化し得るが、一般には約１０〜約６０分であり得る。若干の実施形態では、反応時間は約１０〜約３０分であり得る。しかし、それより長い反応時間も使用できる。反応は、ＣｕI又はその前駆体（特に限定されないが、Ｃｕ0、ＣｕI又はＣｕII塩を含む）及び還元剤（例えば、特に限定されないが、アスコルビン酸ナトリウム）の存在下で実施できる。反応スキーム３及び４は、フッ素標識バイオコンジュゲート（９）及び（１０）を製造するための可能なアプローチを示している。
【００４９】
【化３】
１つのアプローチでは、アルキン又はアジド含有リンカーの前駆体を最初にチオール基を含むポリペプチドと反応させ、得られた中間体を変換して所望のバイオコンジュゲートを得ることができる。別法として、アルキン又はアジド含有リンカーの前駆体を最初に変換してリンカーを得、次いでこれをチオール基を含むポリペプチドと反応させて生成物を得ることができる。
【００５０】
上述の技法を使用すれば、フッ素又は放射性フッ素原子（例えば18Ｆ）を生体分子上に導入することができる。フッ素置換アジド又はアルキンをバイオコンジュゲートと反応させた場合、フッ素置換バイオコンジュゲートが得られる。放射性フッ素置換アジド又はアルキンをバイオコンジュゲートと反応させた場合、放射性フッ素標識バイオコンジュゲートが得られる。好適なフッ素置換アジド／アルキンの非限定的な例を下記構造（１１）〜（１４）に示す。
【００５１】
【化４】
バイオコンジュゲートを製造するためには、１以上のチオール基を有する前述の生体分子（例えば、ポリペプチド）の任意のものが使用できる。１以上のチオール基を有するポリペプチド、ベクター、骨格系タンパク質及び操作結合タンパク質のような生体分子が特に有用であるが、これはかかる物質が潜在的に有用な診断学的及び治療学的価値を有するからである。かくして一実施形態では、アフィボディのような骨格系タンパク質をＮ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミドリンカー（１）のようなＭａｌ−アルキン二官能性リンカーと反応させることでバイオコンジュゲートを製造できる。別の実施形態では、アフィボディのような骨格系タンパク質を化合物（２）のようなＭａｌ−アジド二官能性リンカーと反応させることでバイオコンジュゲートを製造できる。さらに、バイオコンジュゲートをフッ素置換アジド又はアルキンと反応させることで有用なフッ素標識バイオコンジュゲートを製造できる。
【００５２】
フッ素標識バイオコンジュゲートは、診断用途において有用な物質である。18Ｆ標識バイオコンジュゲートは、当技術分野で公知のイメージング技法（例えば、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）技法）を用いて可視化できる。
【００５３】
以上、本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明してきたが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想に含まれるこのような修正及び変更のすべてを包含することを理解すべきである。
【実施例】
【００５４】
本発明の実施は、以下の実施例からなお一層完全に理解されよう。これらの実施例は例示のみを目的として本明細書中に示されるものであって、決して本発明を限定するものと解すべきでない。
【００５５】
実施例セクションで使用される略語は、以下に示す通りである。「ｍｇ」：ミリグラム、「ｍＬ」：ミリリットル、「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム／ミリリットル、「ｍｍｏｌ」：ミリモル、「μＬ」：マイクロリットル、「ＫＤａ」：キロダルトン、「ＭＡＬＤＩ−ＭＳ」：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法、「ＨＰＬＣ」：高圧液体クロマトグラフィー、「ＬＣ−ＭＳ」：液体クロマトグラフィー質量分析法、「ＥＳＩ−ＭＳ」：エレクトロスプレーイオン化質量分析法、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ」：マトリックス支援レーザー脱離イオン化−非行時間質量分析法、「ＴＦＡ」：トリフルオロ酢酸、「ＤＭＳＯ」：ジメチルスルホキシド、「ＤＴＴ」：ジチオトリエトール、「ＭｅＣＮ」：アセトニトリル、「ＰＢＳ」：リン酸緩衝食塩水、「Ｍａｌ」：マレイミド、「ｐｐｍ」：百万分率、「ＭＷＣＯ」：分子量カットオフ、「コールド条件」：放射性同位体が存在しない条件、「放射化学収率」：元来存在していた放射能の分率。特記しない限り、すべての試薬用化学薬品は受け入れたままで使用し、すべての水溶液の調製にはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）水を使用した。
【００５６】
実施例１：２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）の製造
【００５７】
【化５】
［18Ｆ］−フッ化物は、濃縮［18Ｏ］Ｈ2Ｏターゲットの１９ＭｅＶプロトン照射による18Ｏ（ｐ，ｎ）18Ｆ核反応を用いてサイクロトロンで生成させた。照射後、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ（登録商標）（５ｍｇ、１３．３μｍｏｌ）、炭酸カリウム（１ｍｇ、７．２μｍｏｌ）及びＭｅＣＮ（１ｍＬ）の混合物を18Ｆ−水（１ｍＬ）に添加した。窒素流（１００ｍＬ／分）下において８０℃で加熱することで溶媒を除去した。その後、ＭｅＣＮ（０．５ｍＬ）を添加し、加熱及び窒素流下で蒸発させた。この操作を２回繰り返した。室温に冷却した後、トルエンスルホン酸２−アジドエチルエステル（１５）を無水ＭｅＣＮ（０．２ｍＬ）に溶解した溶液を添加した。反応混合物を８０℃で１５分間撹拌した。ＭｅＣＮ（０．３ｍＬ）の添加後、２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）を窒素流（１５ｍＬ／分）下において１３０℃で蒸留して、ＭｅＣＮ（０．１ｍＬ）を含むトラッピングバイアル中に捕集した。この化合物（１１）は、（18Ｆ−フッ化物に対し）５４％の崩壊補正放射化学収率及び６３％の蒸留効率で得られた。
【００５８】
図２は、勾配Ｉ及び２１６ｎｍのＵＶを用いた２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）含有反応混合物のＨＰＬＣ分析結果（ａ，放射能チャネル，３：５１分に２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）、ｂ，ＵＶチャネル）並びに蒸留生成物２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）のＨＰＬＣ分析結果（ｃ，放射能チャネル、ｄ，ＵＶチャネル）を示している。
【００５９】
実施例２：小基質の様々な濃度におけるトリアゾール生成を示す濃度試験
【００６０】
【化６】
この濃度試験では、アルキンモデル（１６）（１．２〜０．０１ｍｇ、７．５〜０．２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５０μＬ）に溶解し、硫酸銅（II）（２５μｌ、２．８ｍｇ、１１．２５μｍｏｌ）及びアスコルビン酸ナトリウム（２５μＬ、７．５ｍｇ、３７．５μｍｏｌ）の水溶液と窒素下で混合した。ＭｅＣＮ（１００μｌ）中の［18Ｆ］２−フルオロエチルアジド（１１）を添加して室温で１５分間静置した後、混合物をＨＰＬＣで分析した。次いで、バイアルを加熱し（１５分間、８０℃）、再び分析した。
【００６１】
室温では、３．１４ｍＭ（１００μｇ）の最小アルキンモデル（１６）濃度において、生じたトリアゾール生成物（１７）が定量的収率で得られた。反応混合物を８０℃で加熱した場合には、生じたトリアゾール（１７）を定量的収率で得るための最小アルキンモデル（１６）濃度は１．５７ｍＭ（５０μｇ）であった。
【００６２】
図３は、モデル化合物（１６）及び２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）を用いて様々なアルキン（１６）濃度及び温度で生成されたトリアゾール生成物（１７）の放射化学収率のＨＰＬＣプロットを示している。
【００６３】
実施例３：ペプチド上でのトリアゾール生成
［18Ｆ］（Ｓ）−６−アミノ−２−（２−｛（Ｓ）−２−［２−（（Ｓ）−６−アミノ−２−｛［４−（２−フルオロエチル）−［１，２，３］トリアゾール−１−カルボニル］アミノ｝ヘキサノイルアミノ）アセチルアミノ｝−３−フェニルプロピオニルアミノ｝アセチルアミノヘキサン酸（１９）の製造。
【００６４】
【化７】
硫酸銅（II）五水和物（４．３ｍｇ、１７μｍｏｌ）を水（５０μＬ）に溶解した溶液に、水（５０μＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（３．４ｍｇ、１７μｍｏｌ）を窒素下で添加した。室温で約１分後、アルキンペプチド前駆体（１８）（２ｍｇ、３．４μｍｏｌ）をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、０．５Ｍ、５０μＬ）に溶解した溶液を添加し、次いで２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）（２４〜３２ＭＢｑ）をＭｅＣＮ（５０μＬ）に溶解した溶液を添加した。混合物を室温に１５分間保ち、ＨＰＬＣの移動相Ａ（水、０．１％ＴＦＡ）（０．３ｍＬ）で希釈した。半分取ＨＰＬＣを用いて標識ペプチド（１９）を単離した（２１６ｎｍのＵＶ、Ｒｔ＝６：２４）。
【００６５】
実施例４：Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカー（１）の合成
【００６６】
【化８】
Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（５０ｍｇ、１．２５当量）を１．０ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。３−ブチン−１−アミン塩酸塩（１６ｍｇ、１．０当量）を０．５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び２６μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）に溶解した。エステル溶液を氷浴中に保ちながら、このアミン溶液をスクシンイミドエステルに滴下した。混合物を０℃で１０分間撹拌した。溶液を室温まで放温し、１８時間撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。有機溶液をブライン（３×５ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）を用いて粗物質を精製した。生成物（１）をグリースから精製するため、試料を最小量のＣＨ2Ｃｌ2（約２ｍＬ）に溶解し、次いでヘキサンで３回洗浄した。生成物（１）は綿毛状の白色固体として沈殿した。生成物の特性決定は1Ｈ−ＮＭＲを用いて行った。収量：８．２ｍｇ（２５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ２．０２（ｓ，１）、２．４１（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２）、２．５７（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２）、３．４２（ｔｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２）、３．８８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ）、５．９０（ｂｓ，１）、６．７３（ｓ，２）。
【００６７】
実施例５：２−フルオロエチルトリアゾール−マレイミド（参照化合物（２１））の製造
【００６８】
【化９】
リン酸ナトリウム緩衝液（２０μｌ、２５０ｍＭ、ｐＨ６．０）、ＤＭＦ（５０μｌ）及び銅粉末（１００ｍｇ、−４０メッシュ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ．Ｎｏ．２６，６０８−６）の混合物を窒素ガス（１０ｍｌ／分）で５分間パージした。（Ｇｌａｓｅｒ ａｎｄ Åｒｓｔａｄ ２００７により記載されたようにして製造した）ＤＭＦ（９．２μｌ）中の２−フルオロエチルアジド（２０）（１０μｍｏｌ）及びＤＭＦ（２０μｌ）中の３−（Ｎ−マレイミジル）−Ｎ−（３−プロパルギル）プロビオンアミド（１）（２．１ｍｇ、９．５μｍｏｌ）を添加した後、容器を室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した（１ｍｂａｒ、８０℃）。分取ＨＰＬＣによって精製することで、フルオロエチルトリアゾール化合物（２１）（１．２ｍｇ、４１％）を得た。ＨＲ ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ13Ｈ16Ｎ5Ｏ3Ｆについて（計算値ｍ／ｚ＝３１０．１３１０、実測値ｍ／ｚ＝３１０．１３１４）。
【００６９】
分取ＨＰＬＣによる精製は次のような条件下で行った。勾配：１５分で５〜８０％溶媒Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１５ｍＬ／分、カラム：Ｌｕｎａ ５μｍ Ｃ１８（２）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），７５ｘ３０ｍｍ、検出：ＵＶ ２１６ｎｍ。
【００７０】
実施例６：アフィボディのアルキニル化及びＭａｌ−アルキン二官能性リンカーとの反応
【００７１】
【化１０】
１４ｋＤａのＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（凍結乾燥粉末として１ｍｇ）を４６０μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。溶液のｐＨを７．４に保った。この溶液に、ＰＢＳに溶解したジチオトレイトール（ＤＴＴ）の０．５Ｍ溶液（ｐＨを７．４に保った）４０μＬを添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。還元アフィボディをゲル濾過によって精製した。還元アフィボディのこの純粋画分に、Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカー（１）の溶液（ＤＭＳＯ中０．１５Ｍ）の１２μＬアリコートを添加した。この反応混合物を穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。ゲル濾過、次いで遠心限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ社）、ＭＷＣＯ ５ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて反応混合物を精製することで精製アルキニル化アフィボディ（２２）を得た。
【００７２】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）及びＨＰＬＣ、次いでＬＣ（ＥＳＩ）−ＭＳを用いて、得られた精製アルキニル化アフィボディ（２２）の特性決定を行った。収率（％）：７８、ＭＳ：（ＭＨ+計算値：１４２６０、実測値：１４２６０）。図４は、アルキニル化アフィボディ（２２）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータを示している。
【００７３】
アルキニル化アフィボディ（２２）のＨＰＬＣ分析のための標準条件：Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４カラムをＨＰＬＣ分析のために使用した。溶媒Ａ：１００％Ｈ2Ｏ，０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：１００％ＭｅＣＮ，０．１％ＴＦＡ、検出：ＵＶ ２１６ｎｍ及び２８０ｎｍ、流量：１ｍＬ／分。下記表１中に示すように、溶媒濃度を経時的に変化させた。
【００７４】
【表１】
アルキニル化アフィボディ（２２）に関する典型的な溶出時間は約１１分であった。
【００７５】
実施例７：コールド条件下におけるバイオコンジュゲート上へのトリアゾール生成
【００７６】
【化１１】
アジドＰＥＧ（２３）を用いたアルキニル化アフィボディ（２２）の標識。３６μＬのリン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ８）に、アルキニル化アフィボディ（２２）原液（０．６ｍＭ、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中約８ｍｇ／ｍＬ）の３μＬアリコートを添加した。この溶液に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８で希釈した）１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（アジドＰＥＧ）（２３）の調製したばかりの１８ｍＭ溶液の１μＬアリコートを添加した。次いで、この溶液に（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）アスコルビン酸ナトリウムの調製したばかりの１０ｍＭ（２ｍｇ／ｍＬ）溶液の５μＬアリコートを添加した。最後に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）硫酸銅（II）の調製したばかりの１０ｍＭ（１．６ｍｇ／ｍＬ）懸濁液の５μＬアリコートを反応混合物に添加した。かくして、これらの添加は試薬及び基質に関して下記の最終濃度を与えた。アルキニル化アフィボディ（２２）（３６μＭ）、アジドＰＥＧ（２３）（３６０μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）及びＣｕＳＯ4（１ｍＭ）。
【００７７】
得られた溶液を穏やか撹拌しながら６５℃で０．７５時間混合した。次いで、反応混合物を直ちに純水（ＭｉｌｌｉＱ）で４ｍＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ遠心限外濾過ユニット、ＭＷＣＯ ５ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて＜１００μＬに濃縮した。過剰の試薬を除去するため、この水希釈−濃縮手順をさらに２回繰り返した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び高速液体クロマトグラフィー、次いでＬＣ（ＥＳＩ）−ＭＳを用いて、得られた精製コンジュゲート（２４）の特性決定を行った。収率（％）：４２、ＭＳ：（ＭＨ+計算値：１４４７８、実測値：１４４９２）。
【００７８】
実施例８：Ｃｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）を用いたアルキニル化アフィボディ（２２）の標識
【００７９】
【化１２】
３６μＬのリン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ８）に、アルキニル化アフィボディ（２２）原液（０．６ｍＭ、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中約８ｍｇ／ｍＬ）の３μＬアリコートを添加した。次に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８で希釈した）Ｃｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）の調製したばかりの１８ｍＭ溶液の１μＬアリコートを添加した。次いで、この溶液に（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）アスコルビン酸ナトリウムの調製したばかりの１０ｍＭ（２ｍｇ／ｍＬ）溶液の５μＬアリコートを添加した。最後に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）硫酸銅（II）の調製したばかりの１０ｍＭ（１．６ｍｇ／ｍＬ）懸濁液の５μＬアリコートを反応混合物に添加した。これらの添加は試薬及び基質に関して下記の最終濃度を与えた。アルキニル化アフィボディ（２２）（３６μＭ）、Ｃｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）（３６０μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）及びＣｕＳＯ4（１ｍＭ）。
【００８０】
得られた溶液を穏やか撹拌しながら６５℃で０．７５時間混合した。次いで、反応混合物を直ちに純水（ＭｉｌｌｉＱ）で４ｍＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ遠心限外濾過ユニット、ＭＷＣＯ ５ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて＜１００μＬに濃縮した。過剰の試薬を除去するため、この水希釈−濃縮手順をさらに２回繰り返した。ＨＰＬＣ及び色素の蛍光発光をモニターするＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル（図５）により、得られた精製コンジュゲート（２６）の特性決定を行った。
【００８１】
実施例９：ホット条件下におけるアルキニル化アフィボディ（２２）上へのトリアゾール生成
【００８２】
【化１３】
18ＦによるＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（２２）の標識。硫酸銅（II）の水溶液（５μＬ、０．０２４９ｍｇ、０．１μｍｏｌ）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５μＬ、１００ｍＭ、ｐＨ８．０）中のアスコルビン酸ナトリウム（０．１９８ｍｇ、１μｍｏｌ）及びＰＢＳ（５μＬ）中のアルキニル化アフィボディ（２２）（５０μｇ、３．５７ｎｍｏｌ）と混合した。Ｇｌａｓｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Åｒｓｔａｄ，Ｅ．（２００７），“Ｃｌｉｃｋ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ２−［18Ｆ］ｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌａｚｉｄｅ ｆｏｒ Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１８，９８９−９９３（その記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に記載されたようにして製造した２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）（２６４μＣｉ、９．８ＭＢｑ）をＭｅＣＮ（２０μｌ）に溶解して添加した後、混合物を６０℃で３０分間加熱した。２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）による標識後、反応混合物のＨＰＬＣ分析は、アフィボディ（２７）のＵＶ信号と共溶出する放射能ピークを示した。
【００８３】
分取ＨＰＬＣによる精製は次のような条件下で行った。勾配：１５分で５〜８０％溶媒Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１ｍＬ／分、カラム：Ｌｕｎａ ３μｍ Ｃ１８（２）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），５０ｘ４．６ｍｍ、検出：ＵＶ ２８０ｎｍ。図１は、非最適化系の反応混合物のＨＰＬＣ分析結果であって、18Ｆクリック標識Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（２７）を示している（ａ，放射能チャネル、ｂ，２８０ｎｍでのＵＶチャネル）。
【００８４】
本発明は、その技術思想又は本質的特性から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。したがって、前述の実施形態はすべての点において本明細書中に記載した本発明を限定するのではなく例示的なものと見なすべきである。したがって、本発明の技術的範囲は前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲によって示されており、特許請求の範囲の意味及びそれの同等性の範囲内に含まれるすべての変更がその中に包含されるものとする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子上にフッ素原子を導入するための方法に関する。本発明はまた、二官能性リンカー及びバイオコンジュゲートの組成物及び合成方法並びにフッ素標識生体分子を含む放射性診断剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸残基を含む生体分子上にフッ素原子（特に放射性フッ素原子）を導入するための方法は、大きな関心を集めている。しかし、18Ｆのような放射性フッ素原子は約１１０分という比較的短い寿命を有するので、生体分子上に放射性フッ素を導入するためには時間効率のよい方法が要求される。
【０００３】
放射性フッ素原子をはじめとするフッ素原子を生体分子上に導入するための効率的で部位特異的な方法に対するニーズは今なお存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６７３７６号パンフレット
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、ポリペプチドのような生体分子上にフッ素原子を導入するための方法が開示される。本方法は、（ｉ）チオール反応性末端及びアジド／アルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド／アルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキンとそれぞれ反応させる段階を含んでなり得る。
【０００６】
別の態様では、生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するための方法が提供される。本方法は、（ｉ）Ｎ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミドリンカー（１）のようなＭａｌ−アルキン二官能性リンカーのチオール反応性基を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び（ｉｉ）次いでリンカーのアルキン基をフッ素置換アジドと反応させる段階を含んでなる。
【０００７】
さらに別の態様では、（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなるバイオコンジュゲートが提供される。リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることで製造できる。
【０００８】
さらに別の態様では、上記の方法、リンカー及び生体分子を用いて製造されるバイオコンジュゲートが本発明によって提供される。
【０００９】
別の態様では、リンカーの組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明のこれらの態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で表されている。
【図１】図１は、非最適化系の反応混合物のＨＰＬＣ分析結果であって、18Ｆクリック標識Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（２７）を示している（ａ，放射能チャネル、ｂ，２８０ｎｍでのＵＶチャネル）。
【図２】図２は、勾配Ｉ及び２１６ｎｍのＵＶを用いた２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）含有反応混合物のＨＰＬＣ分析結果を示している（ａ，放射能チャネル，３：５１分に２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）、ｂ，ＵＶチャネル）。蒸留生成物は、２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）の存在のみを示している（ｃ，放射能チャネル、ｄ，ＵＶチャネル）。
【図３】図３は、モデル化合物（１６）及び２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）を用いて様々なアルキン（１６）濃度及び温度で生成されたトリアゾール生成物（１７）の放射化学収率のＨＰＬＣプロットを示している。
【図４】図４は、アルキニル化アフィボディ（２２）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータを示している。
【図５】図５は、アルキニル化アフィボディ（２２）とＣｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）との間のクリックコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルを示している。ＣｕI源及び還元剤の存在下におけるコンジュゲート生成物（２６）の予想分子量でＣｙ５色素の蛍光発光が認められる。これらが存在しない対照実験では、コンジュゲート生成物の存在は認められない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の詳細な説明は例示的なものであり、本願の発明及び該発明の用途を限定するものではない。さらに、先行する発明の背景又は以下の詳細な説明中に示されるいかなる理論によっても限定されるものではない。
【００１２】
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指示するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中に使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。単数形で記載したものであっても、前後関係から明らかでない限り、複数の場合も含めて意味する。
【００１３】
本明細書中で使用する「活性化基」という用語は、求核試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、酸塩化物及び尿素中間体）に対するカルボニル基の反応性を高める任意の基をいう。
【００１４】
本明細書中で使用する「アジド反応性末端」及び／又は「アジド反応性官能基」という用語は、アジド官能基と反応し得る任意の官能基をいう。アジド反応性官能基の若干の例には、特に限定されないが、アルキン、アレン及びホスフィンがある。
【００１５】
本明細書中で使用する「アルキン反応性末端」及び／又は「アルキン反応性官能基」という用語は、アルキン官能基と反応し得る任意の官能基をいう。アルキン反応性官能基の例には、特に限定されないが、ＣｕI源（特に限定されないが、Ｃｕ0、ＣｕI及びＣｕIIを含む）及び還元剤（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）の存在下で反応し得るアジドがある。
【００１６】
本明細書中で使用する「脂肪族ラジカル」又は「脂肪族基」という用語は、一般に、環状でなくかつｓｐ3炭素原子である結合点を有する炭素原子配列をいう。炭素原子配列はさらに、ｓｐ3、ｓｐ2又はｓｐ混成炭素原子の任意の組合せを含み得る。さらに、炭素原子配列は一価、二価又は三価であり得る。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソオクチル、ベンジル、シクロヘキシルメチル、フェネチル及び１’，１’−ジメチルベンジルがある。
【００１７】
本明細書中で使用する「芳香族ラジカル」及び／又は「芳香族基」という用語は、ｓｐ2混成炭素原子及び共役炭素−炭素二重結合の環状配列をいい、環状炭素原子配列の一部をなす芳香族ｓｐ2混成炭素原子の位置に結合点を有する。芳香族基又はラジカルは、１乃至最大許容数の置換基を有し得る。アリール基の例には、フェニル、置換フェニル、トリル、置換トリル、キシリル、メシチル、クロロフェニル、ナフチル、フリル、チエニル及びピロリルがある。
【００１８】
本明細書中で使用する「脂環式ラジカル」又は「脂環式基」という用語は、ｓｐ3混成炭素原子の環状配列をいい、環状炭素原子配列の一部をなす芳香族ｓｐ3混成炭素原子の位置に結合点を有する。炭素原子配列はさらに、ｓｐ3、ｓｐ2又はｓｐ混成炭素原子の任意の組合せを含み得る。さらに、環状炭素原子配列は１乃至最大許容数の置換基で置換されていてもよい。さらに、環状炭素原子配列はＯ、Ｎ又はＳのようなヘテロ原子を含み得る。脂環式基の例には、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、トリメチルシクロヘキシル、フェニルシクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、４−チアシクロヘキシル及びシクロオクチルがある。
【００１９】
「チオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基」という用語は、生体分子のチオール基と反応し得る基をいう。したがって、ジスルフィドはチオール反応性基とみなすことができる。ピリジルジスルフィドはかかるジスルフィドの例である。
【００２０】
本明細書中で使用する「フッ素置換アジド」という用語は、１以上のフッ素置換基を有するアジド含有化合物を意味する。さらに、フッ素置換基は任意の種類の同位体（例えば、18Ｆ及び19Ｆ）であり得る。一実施形態では、フッ素置換基は18Ｆである。アジドは脂肪族アジド、脂環式アジド又は芳香族アジドであり得る。さらに、脂環式アジド及び芳香族アジドは単環式、二環式又は多環式構造を有し得る。
【００２１】
本明細書中で使用する「フッ素置換アルキン」という用語は、１以上のフッ素置換基を有するアルキン含有化合物を意味する。さらに、フッ素置換基は任意の種類の同位体（例えば、18Ｆ及び19Ｆ）であり得る。一実施形態では、フッ素置換基は18Ｆである。アルキンは脂肪族アルキン、脂環式アルキン又は芳香族アルキンであり得る。さらに、脂環式アルキン及び芳香族アルキンは単環式、二環式又は多環式構造を有し得る。
【００２２】
本明細書中で使用する「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）にかかわらず、任意のアミノ酸連鎖を記述するために本明細書中で使用される。したがって、これらの用語は本明細書中ではアミノ酸残基のポリマーを表すため互換的に使用できる。これらの用語はまた、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。したがって、「ポリペプチド」という用語は、完全長の天然タンパク質並びに完全長の天然タンパク質或いは天然タンパク質の特定ドメイン又は部分に相当する組換え又は合成ポリペプチドを包含する。
【００２３】
「アルキル」、「脂肪族」、「脂環式」及び「芳香族」という用語に適用される「ラジカル」及び「基」という用語は、本明細書中では互換的に使用される。
【００２４】
本明細書中で使用する「チオール反応性末端」及び／又は「チオール反応性官能基」という用語は、チオール基又はメルカプタン基（即ち、−ＳＨ基）と反応し得る官能基をいう。チオール反応性官能基の例には、特に限定されないが、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、α，β−不飽和スルホン基、ビニルスルホン基、α，β−不飽和カルボニル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基がある。
【００２５】
好適なマレイミド基には、母体（非置換）基並びに脂肪族基、脂環式基又は芳香族基を置換基として含む誘導体がある。好適なα，β−不飽和カルボニル基には、アクリロイル基を含むものがある。好適なα，β−不飽和カルボニル基には、α，β−不飽和エステル及びα，β−不飽和スルホンがある。ビニルスルホン基はα，β−不飽和スルホン基の具体例である。
【００２６】
特記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲中で使用される成分の量、性質（例えば分子量）、反応条件などを表すすべての数は、あらゆる場合に「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。したがって、そうではないと表記されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲中に示される数値パラメーターは、本発明によって得ることが求められる所望の特性に応じて変動しうる近似値である。最低でも、特許請求の範囲の技術的範囲への等価物の原則の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも報告された有効数字の桁数を考慮しつつ通常の丸め技法を適用して解釈すべきである。
【００２７】
本発明の態様は、生体分子上にフッ素原子を導入するための方法に関する。本方法は、
（ｉ）チオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、
（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに
（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド又はアルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキン基とそれぞれ反応させる段階
を含んでなる。
【００２８】
本発明の別の態様は、１以上のチオール基を含む生体分子及びリンカーから導かれる構造単位を含んでなるバイオコンジュゲート組成物を提供することである。リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造できる。別の態様では、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させることによって製造できる。
【００２９】
生体分子
本明細書中で使用する「生体分子」という用語は、リンカーとの反応のために１以上のチオール基（時には「メルカプト」基ともいう）又はその反応性誘導体を含む天然の分子又は操作された分子をいう。チオール基は、生体分子中に天然に存在するものでもよいし、或いは標準の生物学的方法又は当技術分野で認められている適当な方法を用いて化学的に導入又は操作されたものでもよい。若干の実施形態では、生体分子は特に５０未満のアミノ酸残基を有するものを除外する。
【００３０】
かかる生体分子は、天然の状態で１以上のＳＨ基を有していてもよいし、或いは例えば標準の分子生物学的技法を用いて操作されていてもよい。天然にＳＨ基を有する生体分子の例には、１以上のシステインアミノ酸に結合されたものがある。「その反応性誘導体」という用語は、リンカー化合物との反応のために遊離チオール基を生成するように活性化されたＳＨ基の誘導体を意味する。
【００３１】
天然に１以上のチオール基を有するか又は化学的に操作されたチオール基を有する生体分子の例には、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、脂質、多糖、グリコサミノグリカン及びその修飾形、糖脂質、糖タンパク質、合成ポリマー、細胞応答調節剤（例えば、成長因子、走化性因子又はサイトカイン）、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン及びリボザイムがある。開示される方法はまた、チオール基を含まないが、チオール基を含む分子にコンジュゲートされる分子にも適用できる。生体分子のさらに他の例には、タンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質変異体、骨格系タンパク質、操作タンパク質、ヌクレオチド及び関連分子、核酸、オリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡペプチドコンジュゲート、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体のような抗体、及び抗体系フラグメントがある。したがって、開示される方法は、チオール基を有するポリペプチドのようなチオール含有分子と結合したデオキシリボ核酸（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド、核酸プローブ、プラスミド）及びリボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）をはじめとする核酸をフッ素化するためにも使用できる。
【００３２】
生体分子は、１以上のチオール基を有する任意の天然生体分子又は操作生体分子であり得る。すべての実施形態において、生体分子は天然アミノ酸残基及び／又は非天然アミノ酸残基を含み得る。別の実施形態では、１以上のチオール基を有する生体分子はシステイン残基又は非天然基を含む。「システイン残基」という用語は、システインが生体分子連鎖の一部として含まれた後に生じるチオール基以外の構造フラグメントを意味する。さらに別の実施形態では、リンカーと反応するための生体分子は、操作されたシステイン残基を有するものである。これは、適当な前駆体生体分子を化学的に修飾することにより、チオール基及びシステイン残基を有する所望の生体分子を生成し得ることを意味する。
【００３３】
場合によっては、生体分子を還元剤で処理して反応性チオール基を生成することができる。例えば、ジスルフィド結合を有する生体分子を適当な還元剤で還元することで、チオール基を有する生体分子２当量を生成することができる。有用な還元剤の例には、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）がある。
【００３４】
リンカー
本明細書中で使用する「リンカー」という用語は、チオール反応性末端又はその保護誘導体及びアジド又はアルキン反応性末端又はその保護誘導体を含む二官能性化合物をいう。かかるリンカーは、一端ではチオール反応性末端を介してチオール含有化合物を結合し、他端ではアジド又はアルキン反応性末端を介してアジド又はアルキン（特にフッ素置換アジド又はアルキン）をそれぞれ結合するために使用できる。本明細書中で使用する「Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカー」という用語は、第１の末端にマレイミド基を有し、第２の末端にアルキン基を有するリンカー、例えばＮ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミドリンカー（１）をいい、「Ｍａｌ−アジド二官能性リンカー」という用語は、第１の末端にマレイミド基を有し、第２の末端にアジド基を有するリンカー、例えば化合物（２）をいう。リンカーの若干の非限定的な例を下記構造（１）〜（６）に示す。
【００３５】
【化１】
若干の実施形態では、チオール反応性末端、アジド又はアルキン反応性末端、或いはチオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端の両方を前駆体誘導体で置換することができる。かかるリンカーは、一端ではチオール反応性末端を介してチオール含有化合物を結合するため、及び／又は他端ではアジド又はアルキン反応性末端を介してアジド又はアルキン（特にフッ素置換アジド又はアルキン）をそれぞれ結合するために使用できる。
【００３６】
リンカーの製造
リンカーは、チオール反応性官能基及びアジド又はアルキン反応性官能基の両方を、それぞれ（ｉ）１以上のチオール基を有する生体分子及び（ｉｉ）フッ素置換アジド又はアルキンとの反応のために利用可能にする任意の方法によって製造できる。一実施形態では、リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることで製造される。アジド又はアルキン反応性官能基を有する任意のアミン化合物が使用できる。一実施形態では、アミン化合物は下記構造（７）を有する。
Ｇ−Ｊ−ＮＨＲ1 （７）
式中、Ｇはアジド又はアルキン反応性官能基であり、Ｊは連結単位であり、Ｒ1はＨ、脂肪族基、芳香族基又は脂環式基である。二価連結単位Ｊの性質は、チオール反応性官能基及びアジド又はアルキン反応性官能基の反応性に悪影響を及ぼすことがある立体障害を最小にするように設計できる。本アプローチの利点の１つは、バイオコンジュゲートの最終性質を変更するように連結単位を調整できることである。即ち、リンカーのサイズ、極性、電荷及び化学組成を変化させることにより、溶解性及び薬物動態学／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）性質のような最終コンジュゲートの性質を変更することができる。さらにリンカーは、標的化及び／又は溶解性を向上させる基を結合するための追加の結合手（ｈａｎｄｌｅ）を含むことができる。
【００３７】
他の実施形態では、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させることで製造できる。
【００３８】
カルボン酸又は活性化エステルは、下記構造（８）を有する。
Ｌ−Ｍ−ＣＯＲ2 （８）
式中、Ｌはチオール反応性官能基又はその保護誘導体からなり、Ｍは二価連結単位であり、Ｒ2はＯＨ又は活性化基である。活性化基Ｒ2は、アジド又はアルキン反応性官能基を有するアミン化合物と構造（８）のカルボニル炭素原子との反応を容易にする。
【００３９】
別の実施形態では、下記の式を有するリンカー組成物が提供される。
Ｌ−Ｍ−ＣＯ−ＮＨ（Ｒ1）−Ｊ−Ｇ
式中、
Ｌはチオール反応性官能基であり、
Ｍ及びＪは二官能性単位／連結単位であり、
Ｒ1はＨ、脂肪族基、芳香族基又は脂環式基であり、
Ｇはアジド又はアルキン反応性官能基である。
【００４０】
構造（１）及び（２）を有するリンカーを製造するための例示的な合成アプローチを下記反応スキーム１及び２に示す。
【００４１】
【化２】
反応スキーム１及び２中、ＤＭＦはジメチルホルムアミドを表し、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンを表す。これらの方法を用いて製造できるリンカーの若干の例は、上記構造（１）〜（６）に示されている。
【００４２】
バイオコンジュゲート
リンカーと１以上のチオール基を有する生体分子との反応から得られる生成物をバイオコンジュゲートと呼ぶ。かくして一実施形態では、バイオコンジュゲートは（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなり、リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造される。別の実施形態では、バイオコンジュゲートは（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなり、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造される。別の態様では、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アジド又はアルキン反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させることで製造できる。
【００４３】
バイオコンジュゲートのフッ素化方法
本明細書中に記載される方法は、フッ素標識バイオコンジュゲート、さらに詳しくは放射性フッ素（例えば18Ｆ）標識バイオコンジュゲートの製造を可能にする。これらの方法の利点の１つは、生体分子のチオール基をリンカーのチオール反応性官能基と選択的に反応させ得る非放射性条件下でリンカーを生体分子に選択的に結合し、得られたバイオコンジュゲートを18Ｆ又は通常のフッ素で置換されたアジド又はアルキンとの反応前に精製できることである。別の利点は、放射性フッ素標識を最終段階で選択的に付加することができ、最終バイオコンジュゲートを特にトレーサーレベルで製造する前に時間のかかる追加の精製段階を行う必要性が排除されることである。
【００４４】
本明細書中に記載される、バイオコンジュゲート上にフッ素を導入するための方法は、任意の長さのフッ素化バイオコンジュゲートを生成するために使用できる。かくして、若干の実施形態では、バイオコンジュゲートの生体分子は５０以上のアミノ酸残基又は１００以上のアミノ酸残基を含む。
【００４５】
一態様では、生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するための方法が開示される。本方法は、（ｉ）チオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド又はアルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキンとそれぞれ反応させる段階を含んでなり得る。
【００４６】
ポリペプチドのような生体分子上にフッ素原子を導入するための方法の若干の実施形態では、リンカーのチオール反応性末端は、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、ビニルスルホン基、アクリロイル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基から選択される。
【００４７】
さらに詳しくは、本明細書中に記載される方法は、Ｎ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミド（１）のようなＭａｌ−アルキン二官能性リンカーをリンカーとして用いて生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するために使用できる。かかる方法は、（ｉ）Ｎ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミド（１）のチオール反応性基を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び（ｉｉ）次いで段階（ｉ）から得られた中間生成物のアルキン基をフッ素置換アジドと反応させる段階を含んでなる。別の実施形態では、本方法は化合物（２）のようなＭａｌ−アジド二官能性リンカーをリンカーとして用いて生体分子上に１以上のフッ素原子を導入するために使用できる。かかる方法は、化合物（２）のチオール反応性官能基を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び（ｉｉ）次いで段階（ｉ）から得られた中間生成物のアジド基をフッ素置換アルキンと反応させる段階を含んでなる。
【００４８】
リンカーのアジド又はアルキン反応性末端とフッ素置換アジド又はアルキンとの反応は、温和な酸性条件から温和な塩基性条件にまでわたり得る任意の媒質中で実施できる。一実施形態では、反応は約６〜約９の範囲内のｐＨを有する媒質中で実施でき、別の実施形態では、約７〜約８のｐＨ範囲内で実施できる。反応温度は室温から約７０℃まで変化し得る。反応時間は様々に変化し得るが、一般には約１０〜約６０分であり得る。若干の実施形態では、反応時間は約１０〜約３０分であり得る。しかし、それより長い反応時間も使用できる。反応は、ＣｕI又はその前駆体（特に限定されないが、Ｃｕ0、ＣｕI又はＣｕII塩を含む）及び還元剤（例えば、特に限定されないが、アスコルビン酸ナトリウム）の存在下で実施できる。反応スキーム３及び４は、フッ素標識バイオコンジュゲート（９）及び（１０）を製造するための可能なアプローチを示している。
【００４９】
【化３】
１つのアプローチでは、アルキン又はアジド含有リンカーの前駆体を最初にチオール基を含むポリペプチドと反応させ、得られた中間体を変換して所望のバイオコンジュゲートを得ることができる。別法として、アルキン又はアジド含有リンカーの前駆体を最初に変換してリンカーを得、次いでこれをチオール基を含むポリペプチドと反応させて生成物を得ることができる。
【００５０】
上述の技法を使用すれば、フッ素又は放射性フッ素原子（例えば18Ｆ）を生体分子上に導入することができる。フッ素置換アジド又はアルキンをバイオコンジュゲートと反応させた場合、フッ素置換バイオコンジュゲートが得られる。放射性フッ素置換アジド又はアルキンをバイオコンジュゲートと反応させた場合、放射性フッ素標識バイオコンジュゲートが得られる。好適なフッ素置換アジド／アルキンの非限定的な例を下記構造（１１）〜（１４）に示す。
【００５１】
【化４】
バイオコンジュゲートを製造するためには、１以上のチオール基を有する前述の生体分子（例えば、ポリペプチド）の任意のものが使用できる。１以上のチオール基を有するポリペプチド、ベクター、骨格系タンパク質及び操作結合タンパク質のような生体分子が特に有用であるが、これはかかる物質が潜在的に有用な診断学的及び治療学的価値を有するからである。かくして一実施形態では、アフィボディのような骨格系タンパク質をＮ−（ブト−３−イニル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）プロパンアミドリンカー（１）のようなＭａｌ−アルキン二官能性リンカーと反応させることでバイオコンジュゲートを製造できる。別の実施形態では、アフィボディのような骨格系タンパク質を化合物（２）のようなＭａｌ−アジド二官能性リンカーと反応させることでバイオコンジュゲートを製造できる。さらに、バイオコンジュゲートをフッ素置換アジド又はアルキンと反応させることで有用なフッ素標識バイオコンジュゲートを製造できる。
【００５２】
フッ素標識バイオコンジュゲートは、診断用途において有用な物質である。18Ｆ標識バイオコンジュゲートは、当技術分野で公知のイメージング技法（例えば、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）技法）を用いて可視化できる。
【００５３】
以上、本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明してきたが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想に含まれるこのような修正及び変更のすべてを包含することを理解すべきである。
【実施例】
【００５４】
本発明の実施は、以下の実施例からなお一層完全に理解されよう。これらの実施例は例示のみを目的として本明細書中に示されるものであって、決して本発明を限定するものと解すべきでない。
【００５５】
実施例セクションで使用される略語は、以下に示す通りである。「ｍｇ」：ミリグラム、「ｍＬ」：ミリリットル、「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム／ミリリットル、「ｍｍｏｌ」：ミリモル、「μＬ」：マイクロリットル、「ＫＤａ」：キロダルトン、「ＭＡＬＤＩ−ＭＳ」：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法、「ＨＰＬＣ」：高圧液体クロマトグラフィー、「ＬＣ−ＭＳ」：液体クロマトグラフィー質量分析法、「ＥＳＩ−ＭＳ」：エレクトロスプレーイオン化質量分析法、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ」：マトリックス支援レーザー脱離イオン化−非行時間質量分析法、「ＴＦＡ」：トリフルオロ酢酸、「ＤＭＳＯ」：ジメチルスルホキシド、「ＤＴＴ」：ジチオトリエトール、「ＭｅＣＮ」：アセトニトリル、「ＰＢＳ」：リン酸緩衝食塩水、「Ｍａｌ」：マレイミド、「ｐｐｍ」：百万分率、「ＭＷＣＯ」：分子量カットオフ、「コールド条件」：放射性同位体が存在しない条件、「放射化学収率」：元来存在していた放射能の分率。特記しない限り、すべての試薬用化学薬品は受け入れたままで使用し、すべての水溶液の調製にはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）水を使用した。
【００５６】
実施例１：２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）の製造
【００５７】
【化５】
［18Ｆ］−フッ化物は、濃縮［18Ｏ］Ｈ2Ｏターゲットの１９ＭｅＶプロトン照射による18Ｏ（ｐ，ｎ）18Ｆ核反応を用いてサイクロトロンで生成させた。照射後、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ（登録商標）（５ｍｇ、１３．３μｍｏｌ）、炭酸カリウム（１ｍｇ、７．２μｍｏｌ）及びＭｅＣＮ（１ｍＬ）の混合物を18Ｆ−水（１ｍＬ）に添加した。窒素流（１００ｍＬ／分）下において８０℃で加熱することで溶媒を除去した。その後、ＭｅＣＮ（０．５ｍＬ）を添加し、加熱及び窒素流下で蒸発させた。この操作を２回繰り返した。室温に冷却した後、トルエンスルホン酸２−アジドエチルエステル（１５）を無水ＭｅＣＮ（０．２ｍＬ）に溶解した溶液を添加した。反応混合物を８０℃で１５分間撹拌した。ＭｅＣＮ（０．３ｍＬ）の添加後、２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）を窒素流（１５ｍＬ／分）下において１３０℃で蒸留して、ＭｅＣＮ（０．１ｍＬ）を含むトラッピングバイアル中に捕集した。この化合物（１１）は、（18Ｆ−フッ化物に対し）５４％の崩壊補正放射化学収率及び６３％の蒸留効率で得られた。
【００５８】
図２は、勾配Ｉ及び２１６ｎｍのＵＶを用いた２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）含有反応混合物のＨＰＬＣ分析結果（ａ，放射能チャネル，３：５１分に２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）、ｂ，ＵＶチャネル）並びに蒸留生成物２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）のＨＰＬＣ分析結果（ｃ，放射能チャネル、ｄ，ＵＶチャネル）を示している。
【００５９】
実施例２：小基質の様々な濃度におけるトリアゾール生成を示す濃度試験
【００６０】
【化６】
この濃度試験では、アルキンモデル（１６）（１．２〜０．０１ｍｇ、７．５〜０．２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５０μＬ）に溶解し、硫酸銅（II）（２５μｌ、２．８ｍｇ、１１．２５μｍｏｌ）及びアスコルビン酸ナトリウム（２５μＬ、７．５ｍｇ、３７．５μｍｏｌ）の水溶液と窒素下で混合した。ＭｅＣＮ（１００μｌ）中の［18Ｆ］２−フルオロエチルアジド（１１）を添加して室温で１５分間静置した後、混合物をＨＰＬＣで分析した。次いで、バイアルを加熱し（１５分間、８０℃）、再び分析した。
【００６１】
室温では、３．１４ｍＭ（１００μｇ）の最小アルキンモデル（１６）濃度において、生じたトリアゾール生成物（１７）が定量的収率で得られた。反応混合物を８０℃で加熱した場合には、生じたトリアゾール（１７）を定量的収率で得るための最小アルキンモデル（１６）濃度は１．５７ｍＭ（５０μｇ）であった。
【００６２】
図３は、モデル化合物（１６）及び２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）を用いて様々なアルキン（１６）濃度及び温度で生成されたトリアゾール生成物（１７）の放射化学収率のＨＰＬＣプロットを示している。
【００６３】
実施例３：ペプチド上でのトリアゾール生成
［18Ｆ］（Ｓ）−６−アミノ−２−（２−｛（Ｓ）−２−［２−（（Ｓ）−６−アミノ−２−｛［４−（２−フルオロエチル）−［１，２，３］トリアゾール−１−カルボニル］アミノ｝ヘキサノイルアミノ）アセチルアミノ｝−３−フェニルプロピオニルアミノ｝アセチルアミノヘキサン酸（１９）の製造。
【００６４】
【化７】
硫酸銅（II）五水和物（４．３ｍｇ、１７μｍｏｌ）を水（５０μＬ）に溶解した溶液に、水（５０μＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（３．４ｍｇ、１７μｍｏｌ）を窒素下で添加した。室温で約１分後、アルキンペプチド前駆体（１８）（２ｍｇ、３．４μｍｏｌ）をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、０．５Ｍ、５０μＬ）に溶解した溶液を添加し、次いで２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）（２４〜３２ＭＢｑ）をＭｅＣＮ（５０μＬ）に溶解した溶液を添加した。混合物を室温に１５分間保ち、ＨＰＬＣの移動相Ａ（水、０．１％ＴＦＡ）（０．３ｍＬ）で希釈した。半分取ＨＰＬＣを用いて標識ペプチド（１９）を単離した（２１６ｎｍのＵＶ、Ｒｔ＝６：２４）。
【００６５】
実施例４：Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカー（１）の合成
【００６６】
【化８】
Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（５０ｍｇ、１．２５当量）を１．０ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。３−ブチン−１−アミン塩酸塩（１６ｍｇ、１．０当量）を０．５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び２６μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）に溶解した。エステル溶液を氷浴中に保ちながら、このアミン溶液をスクシンイミドエステルに滴下した。混合物を０℃で１０分間撹拌した。溶液を室温まで放温し、１８時間撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。有機溶液をブライン（３×５ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）を用いて粗物質を精製した。生成物（１）をグリースから精製するため、試料を最小量のＣＨ2Ｃｌ2（約２ｍＬ）に溶解し、次いでヘキサンで３回洗浄した。生成物（１）は綿毛状の白色固体として沈殿した。生成物の特性決定は1Ｈ−ＮＭＲを用いて行った。収量：８．２ｍｇ（２５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ２．０２（ｓ，１）、２．４１（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２）、２．５７（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２）、３．４２（ｔｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２）、３．８８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ）、５．９０（ｂｓ，１）、６．７３（ｓ，２）。
【００６７】
実施例５：２−フルオロエチルトリアゾール−マレイミド（参照化合物（２１））の製造
【００６８】
【化９】
リン酸ナトリウム緩衝液（２０μｌ、２５０ｍＭ、ｐＨ６．０）、ＤＭＦ（５０μｌ）及び銅粉末（１００ｍｇ、−４０メッシュ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ．Ｎｏ．２６，６０８−６）の混合物を窒素ガス（１０ｍｌ／分）で５分間パージした。（Ｇｌａｓｅｒ ａｎｄ Åｒｓｔａｄ ２００７により記載されたようにして製造した）ＤＭＦ（９．２μｌ）中の２−フルオロエチルアジド（２０）（１０μｍｏｌ）及びＤＭＦ（２０μｌ）中の３−（Ｎ−マレイミジル）−Ｎ−（３−プロパルギル）プロビオンアミド（１）（２．１ｍｇ、９．５μｍｏｌ）を添加した後、容器を室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した（１ｍｂａｒ、８０℃）。分取ＨＰＬＣによって精製することで、フルオロエチルトリアゾール化合物（２１）（１．２ｍｇ、４１％）を得た。ＨＲ ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ13Ｈ16Ｎ5Ｏ3Ｆについて（計算値ｍ／ｚ＝３１０．１３１０、実測値ｍ／ｚ＝３１０．１３１４）。
【００６９】
分取ＨＰＬＣによる精製は次のような条件下で行った。勾配：１５分で５〜８０％溶媒Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１５ｍＬ／分、カラム：Ｌｕｎａ ５μｍ Ｃ１８（２）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），７５ｘ３０ｍｍ、検出：ＵＶ ２１６ｎｍ。
【００７０】
実施例６：アフィボディのアルキニル化及びＭａｌ−アルキン二官能性リンカーとの反応
【００７１】
【化１０】
１４ｋＤａのＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（凍結乾燥粉末として１ｍｇ）を４６０μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。溶液のｐＨを７．４に保った。この溶液に、ＰＢＳに溶解したジチオトレイトール（ＤＴＴ）の０．５Ｍ溶液（ｐＨを７．４に保った）４０μＬを添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。還元アフィボディをゲル濾過によって精製した。還元アフィボディのこの純粋画分に、Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカー（１）の溶液（ＤＭＳＯ中０．１５Ｍ）の１２μＬアリコートを添加した。この反応混合物を穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。ゲル濾過、次いで遠心限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ社）、ＭＷＣＯ ５ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて反応混合物を精製することで精製アルキニル化アフィボディ（２２）を得た。
【００７２】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）及びＨＰＬＣ、次いでＬＣ（ＥＳＩ）−ＭＳを用いて、得られた精製アルキニル化アフィボディ（２２）の特性決定を行った。収率（％）：７８、ＭＳ：（ＭＨ+計算値：１４２６０、実測値：１４２６０）。図４は、アルキニル化アフィボディ（２２）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータを示している。
【００７３】
アルキニル化アフィボディ（２２）のＨＰＬＣ分析のための標準条件：Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４カラムをＨＰＬＣ分析のために使用した。溶媒Ａ：１００％Ｈ2Ｏ，０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：１００％ＭｅＣＮ，０．１％ＴＦＡ、検出：ＵＶ ２１６ｎｍ及び２８０ｎｍ、流量：１ｍＬ／分。下記表１中に示すように、溶媒濃度を経時的に変化させた。
【００７４】
【表１】
アルキニル化アフィボディ（２２）に関する典型的な溶出時間は約１１分であった。
【００７５】
実施例７：コールド条件下におけるバイオコンジュゲート上へのトリアゾール生成
【００７６】
【化１１】
アジドＰＥＧ（２３）を用いたアルキニル化アフィボディ（２２）の標識。３６μＬのリン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ８）に、アルキニル化アフィボディ（２２）原液（０．６ｍＭ、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中約８ｍｇ／ｍＬ）の３μＬアリコートを添加した。この溶液に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８で希釈した）１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（アジドＰＥＧ）（２３）の調製したばかりの１８ｍＭ溶液の１μＬアリコートを添加した。次いで、この溶液に（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）アスコルビン酸ナトリウムの調製したばかりの１０ｍＭ（２ｍｇ／ｍＬ）溶液の５μＬアリコートを添加した。最後に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）硫酸銅（II）の調製したばかりの１０ｍＭ（１．６ｍｇ／ｍＬ）懸濁液の５μＬアリコートを反応混合物に添加した。かくして、これらの添加は試薬及び基質に関して下記の最終濃度を与えた。アルキニル化アフィボディ（２２）（３６μＭ）、アジドＰＥＧ（２３）（３６０μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）及びＣｕＳＯ4（１ｍＭ）。
【００７７】
得られた溶液を穏やか撹拌しながら６５℃で０．７５時間混合した。次いで、反応混合物を直ちに純水（ＭｉｌｌｉＱ）で４ｍＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ遠心限外濾過ユニット、ＭＷＣＯ ５ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて＜１００μＬに濃縮した。過剰の試薬を除去するため、この水希釈−濃縮手順をさらに２回繰り返した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び高速液体クロマトグラフィー、次いでＬＣ（ＥＳＩ）−ＭＳを用いて、得られた精製コンジュゲート（２４）の特性決定を行った。収率（％）：４２、ＭＳ：（ＭＨ+計算値：１４４７８、実測値：１４４９２）。
【００７８】
実施例８：Ｃｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）を用いたアルキニル化アフィボディ（２２）の標識
【００７９】
【化１２】
３６μＬのリン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ８）に、アルキニル化アフィボディ（２２）原液（０．６ｍＭ、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中約８ｍｇ／ｍＬ）の３μＬアリコートを添加した。次に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８で希釈した）Ｃｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）の調製したばかりの１８ｍＭ溶液の１μＬアリコートを添加した。次いで、この溶液に（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）アスコルビン酸ナトリウムの調製したばかりの１０ｍＭ（２ｍｇ／ｍＬ）溶液の５μＬアリコートを添加した。最後に、（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８中における）硫酸銅（II）の調製したばかりの１０ｍＭ（１．６ｍｇ／ｍＬ）懸濁液の５μＬアリコートを反応混合物に添加した。これらの添加は試薬及び基質に関して下記の最終濃度を与えた。アルキニル化アフィボディ（２２）（３６μＭ）、Ｃｙ５標識アジドＰＥＧ（２５ａ）（３６０μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）及びＣｕＳＯ4（１ｍＭ）。
【００８０】
得られた溶液を穏やか撹拌しながら６５℃で０．７５時間混合した。次いで、反応混合物を直ちに純水（ＭｉｌｌｉＱ）で４ｍＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ遠心限外濾過ユニット、ＭＷＣＯ ５ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて＜１００μＬに濃縮した。過剰の試薬を除去するため、この水希釈−濃縮手順をさらに２回繰り返した。ＨＰＬＣ及び色素の蛍光発光をモニターするＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル（図５）により、得られた精製コンジュゲート（２６）の特性決定を行った。
【００８１】
実施例９：ホット条件下におけるアルキニル化アフィボディ（２２）上へのトリアゾール生成
【００８２】
【化１３】
18ＦによるＡｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（２２）の標識。硫酸銅（II）の水溶液（５μＬ、０．０２４９ｍｇ、０．１μｍｏｌ）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５μＬ、１００ｍＭ、ｐＨ８．０）中のアスコルビン酸ナトリウム（０．１９８ｍｇ、１μｍｏｌ）及びＰＢＳ（５μＬ）中のアルキニル化アフィボディ（２２）（５０μｇ、３．５７ｎｍｏｌ）と混合した。Ｇｌａｓｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Åｒｓｔａｄ，Ｅ．（２００７），“Ｃｌｉｃｋ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ２−［18Ｆ］ｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌａｚｉｄｅ ｆｏｒ Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ”Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１８，９８９−９９３（その記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に記載されたようにして製造した２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）（２６４μＣｉ、９．８ＭＢｑ）をＭｅＣＮ（２０μｌ）に溶解して添加した後、混合物を６０℃で３０分間加熱した。２−［18Ｆ］フルオロエチルアジド（１１）による標識後、反応混合物のＨＰＬＣ分析は、アフィボディ（２７）のＵＶ信号と共溶出する放射能ピークを示した。
【００８３】
分取ＨＰＬＣによる精製は次のような条件下で行った。勾配：１５分で５〜８０％溶媒Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１ｍＬ／分、カラム：Ｌｕｎａ ３μｍ Ｃ１８（２）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），５０ｘ４．６ｍｍ、検出：ＵＶ ２８０ｎｍ。図１は、非最適化系の反応混合物のＨＰＬＣ分析結果であって、18Ｆクリック標識Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２アフィボディ（２７）を示している（ａ，放射能チャネル、ｂ，２８０ｎｍでのＵＶチャネル）。
【００８４】
本発明は、その技術思想又は本質的特性から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。したがって、前述の実施形態はすべての点において本明細書中に記載した本発明を限定するのではなく例示的なものと見なすべきである。したがって、本発明の技術的範囲は前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲によって示されており、特許請求の範囲の意味及びそれの同等性の範囲内に含まれるすべての変更がその中に包含されるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子上にフッ素原子を導入するための方法であって、
（ｉ）チオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、
（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに
（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド又はアルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキン基と反応させる段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
生体分子が５０を超えるアミノ酸残基を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体分子がアフィボディである、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
チオール反応性末端が、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、ビニルスルホン基、アクリロイル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
１以上のチオール基がシステイン残基又はチオール含有非天然アミノ酸を含む、請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リンカーのチオール反応性末端がマレイミド基である、請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体分子の反応性誘導体が、生体分子を還元剤で処理することで製造される、請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
リンカーが下記のものから選択される、請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の方法。
【化１】
【請求項９】
リンカーが、アミン化合物をカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させてリンカーを生成させることを含んでなる方法であって、アミン化合物がアジド又はアルキン反応性官能基を含みかつカルボン酸又は活性化エステル化合物がチオール反応性官能基を含む方法によって製造される、請求項１乃至請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
フッ素置換アジド又はアルキンが18Ｆ置換アジド又はアルキン或いは19Ｆ置換アジド又はアルキン、好ましくは18Ｆ置換アジド又はアルキンからなる、請求項１乃至請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
生体分子上にフッ素原子を導入するための方法であって、
（ｉ）Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び
（ｉｉ）次いでアルキン基をフッ素置換アジド基と反応させる段階
を含んでなる方法。
【請求項１２】
生体分子上にフッ素原子を導入するための方法であって、
（ｉ）Ｍａｌ−アジド二官能性リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び
（ｉｉ）次いでアジド基をフッ素置換アルキン基と反応させる段階
を含んでなる方法。
【請求項１３】
フッ素置換アジド基が18Ｆ置換アジド基又は19Ｆ置換アジド基、好ましくは18Ｆ置換アジド基からなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
フッ素置換アルキン基が18Ｆ置換アルキン基又は19Ｆ置換アルキン基、好ましくは18Ｆ置換アルキン基からなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなるバイオコンジュゲートであって、リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造される、バイオコンジュゲート。
【請求項１６】
活性化エステルが構造Ｌ−Ｍ−ＣＯＲ2（式中、Ｌはチオール反応性官能基又はその保護誘導体であり、Ｍは二価連結単位であり、Ｒ2はＯＨ又は活性化基である。）を有する、請求項１５記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１７】
アミン化合物が構造Ｇ−Ｊ−Ｒ1（式中、Ｇはアミンであり、Ｊは二価連結単位であり、Ｒ１はアジド又はアルキン反応性官能基である。）を有する、請求項１５記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１８】
生体分子がアフィボディである、請求項１５記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１９】
連結単位が、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させことを含んでなる方法によって製造される、請求項１７記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２０】
式Ｌ−Ｍ−ＣＯ−ＮＨ（Ｒ1）−Ｊ−Ｇを有するリンカー組成物。
（式中、
Ｌはチオール反応性官能基であり、
Ｍ及びＪは二価連結単位であり、
Ｒ1はＨ、脂肪族基、芳香族基又は脂環式基であり、
Ｇはアジド又はアルキン反応性官能基である。）
【請求項２１】
リンカーが下記のものから選択される、請求項２１記載のリンカー組成物。
【化２】
【請求項１】
生体分子上にフッ素原子を導入するための方法であって、
（ｉ）チオール反応性末端及びアジド又はアルキン反応性末端を含むリンカーを用意する段階、
（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含む生体分子と反応させる段階、並びに
（ｉｉｉ）次いでリンカーのアジド又はアルキン反応性末端をフッ素置換アジド又はアルキン基と反応させる段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
生体分子が５０を超えるアミノ酸残基を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体分子がアフィボディである、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
チオール反応性末端が、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、ビニルスルホン基、アクリロイル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
１以上のチオール基がシステイン残基又はチオール含有非天然アミノ酸を含む、請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リンカーのチオール反応性末端がマレイミド基である、請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体分子の反応性誘導体が、生体分子を還元剤で処理することで製造される、請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
リンカーが下記のものから選択される、請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の方法。
【化１】
【請求項９】
リンカーが、アミン化合物をカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させてリンカーを生成させることを含んでなる方法であって、アミン化合物がアジド又はアルキン反応性官能基を含みかつカルボン酸又は活性化エステル化合物がチオール反応性官能基を含む方法によって製造される、請求項１乃至請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
フッ素置換アジド又はアルキンが18Ｆ置換アジド又はアルキン或いは19Ｆ置換アジド又はアルキン、好ましくは18Ｆ置換アジド又はアルキンからなる、請求項１乃至請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
生体分子上にフッ素原子を導入するための方法であって、
（ｉ）Ｍａｌ−アルキン二官能性リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び
（ｉｉ）次いでアルキン基をフッ素置換アジド基と反応させる段階
を含んでなる方法。
【請求項１２】
生体分子上にフッ素原子を導入するための方法であって、
（ｉ）Ｍａｌ−アジド二官能性リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基を含む生体分子と反応させる段階、及び
（ｉｉ）次いでアジド基をフッ素置換アルキン基と反応させる段階
を含んでなる方法。
【請求項１３】
フッ素置換アジド基が18Ｆ置換アジド基又は19Ｆ置換アジド基、好ましくは18Ｆ置換アジド基からなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
フッ素置換アルキン基が18Ｆ置換アルキン基又は19Ｆ置換アルキン基、好ましくは18Ｆ置換アルキン基からなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）１以上のチオール基を含む生体分子及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでなるバイオコンジュゲートであって、リンカーは、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることを含んでなる方法によって製造される、バイオコンジュゲート。
【請求項１６】
活性化エステルが構造Ｌ−Ｍ−ＣＯＲ2（式中、Ｌはチオール反応性官能基又はその保護誘導体であり、Ｍは二価連結単位であり、Ｒ2はＯＨ又は活性化基である。）を有する、請求項１５記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１７】
アミン化合物が構造Ｇ−Ｊ−Ｒ1（式中、Ｇはアミンであり、Ｊは二価連結単位であり、Ｒ１はアジド又はアルキン反応性官能基である。）を有する、請求項１５記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１８】
生体分子がアフィボディである、請求項１５記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１９】
連結単位が、アジド又はアルキン反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させことを含んでなる方法によって製造される、請求項１７記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２０】
式Ｌ−Ｍ−ＣＯ−ＮＨ（Ｒ1）−Ｊ−Ｇを有するリンカー組成物。
（式中、
Ｌはチオール反応性官能基であり、
Ｍ及びＪは二価連結単位であり、
Ｒ1はＨ、脂肪族基、芳香族基又は脂環式基であり、
Ｇはアジド又はアルキン反応性官能基である。）
【請求項２１】
リンカーが下記のものから選択される、請求項２１記載のリンカー組成物。
【化２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５０８１９４（Ｐ２０１１−５０８１９４Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８６０５（Ｐ２０１０−５３８６０５）
【出願日】平成２０年１２月１２日（２００８．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０５６１
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５０４０００５９１）ハマースミス・イメイネット・リミテッド (26)
【氏名又は名称原語表記】Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ Ｉｍａｎｅｔ Ｌｔｄ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１２日（２００８．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０５６１
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５０４０００５９１）ハマースミス・イメイネット・リミテッド (26)
【氏名又は名称原語表記】Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ Ｉｍａｎｅｔ Ｌｔｄ
【Ｆターム（参考）】
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