生体物質解析チップ、生体物質解析キットおよびこれらを用いる生体物質解析法
【課題】親和性プローブを基板表面により均一な密度で固定することで微小な領域で、定量測定を行うことのできる生体物質解析チップとこれを用いる生体物質解析キットおよびこれらを用いる生体物質解析法を提供すること。
【解決手段】２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層でできた重合生成薄膜を有するものを作成することとする。これは、前記ポリマー層が重合用の第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に親和性プローブ結合残基を持つ構造とする。
【解決手段】２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層でできた重合生成薄膜を有するものを作成することとする。これは、前記ポリマー層が重合用の第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に親和性プローブ結合残基を持つ構造とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞ないし細胞集合体である組織で発現している遺伝子産物であるｍＲＮＡないしタンパク質を定量的に計測するための生体物質解析チップ、生体物質解析キットおよび方生体物質解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。遺伝子の発現状況を調べるには遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを調べる方法とｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を調べる方法がある。ｍＲＮＡを調べる有力な方法として、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、あるいはＤＮＡプローブチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）がある。ＤＮＡプローブアレーを用いるｍＲＮＡ検査では、予め十分多量な細胞検体からＲＮＡ成分を抽出し、リバーストランスクリプターゼによる逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅やｃＲＮＡ合成により増幅を行う。また相補鎖合成時に標識ｄＮＴＰを取り込ませて多量の標識ＤＮＡ鎖を得る。最近ではアミノアリルｄＮＴＰを取り込ませて、その後にアミノ基に蛍光色素を反応させて蛍光標識ＤＮＡ鎖を得る方法が主流となっている。このようにして得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖をいわゆるＤＮＡプローブアレーとハイブリダイズさせて各種発現遺伝子の解析を行う。ＤＮＡプローブアレー上には通常数十から１５０μｍφの微小スポット状に高密度にＤＮＡプローブを固定して標的ｃＤＮＡ捕捉速度を高め、高感度検出ができるようにしている。
【０００３】
ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基ずつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)）、あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)）などがある。
【０００４】
これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面上に多数のプローブをアレイ状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。検出には、ＤＮＡチップの類では標識物に蛍光色素を用いるケースが圧倒的に多いが、電気化学発光を用いるケースやDedox（酸化還元）反応を用いて電気信号として検出する方法も実用化している。
【０００５】
ＤＮＡプローブのかわりに抗体や抗原を基板上にアレイ状に固定したプロテインチップの概念も実用化されている。基板上にアレルギーを起こす数十から数百の抗原（アレルゲン）を固定したデバイスに検体血清を反応させ、各抗原と抗原抗体反応を起こす血清中に存在するＩｇＭを特異的に捕捉し、ＩｇＭに結合する酵素標識２次抗体を反応させ、酵素活性を化学発光と組み合わせることで測定して、アレルゲンを検出するアレルゲン検査用のシステムが医療検査用に実用化されている。プロテインチップにおいても、高感度検出を行うために固体表面に抗体や抗原を高密度に固定することで測定対象物質の捕捉速度を高めている。
【０００６】
プロテインチップ上に捕捉した測定対象物質の検出には、酵素標識物を用いて化学発光ないし生物発光の系で検出するケースが多い。そのほか、蛍光標識検出や、電気化学発光検出、質量分析器による分析を行うケースと多様な方法が実用化されている。
【０００７】
電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。
【０００８】
本発明に関連するところでは、生体物質検出法の一つでプロテインチップと類似の技術であるサンドイッチイムノアッセイ法において、標識物に粒子を用いて測定対象物質を分子計数する方法が報告されている（非特許文献４：Analytical Biochemistry 202，120−125 (1992)）。
【０００９】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【非特許文献３】Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)
【非特許文献４】Analytical Biochemistry 202，120−125 (1992）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記従来技術では、ＤＮＡプローブチップあるいはプロテインチップを用いる遺伝子転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の識別や検出法に関してはよく検討されており、何らかの方法で溶液状の試料が準備できていればそれなりに測定ができる。また、出願人の一人により特許出願されている特願２００４−２２６３６１、特願２００４−２９７１９４あるいは特願２００４−３１８７７０に開示されているように、ｍＲＮＡやＤＮＡマイクロアレイの分野においてもナノ粒子を用いて解析する方法が提案されている。
【００１１】
しかしながら、生体物質を基板上に捕捉するための親和性プローブ（以下生体物質に結合して何らかの情報を得るために使われる物質の総称を親和性プローブと呼ぶことにする）はＤＮＡプローブや抗体などの生体有機物であるので、これらの固定にはガラスやシリコンの基板と生体有機物を固定する上で下記の問題がある。すなわち、
１）親和性プローブを基板上に固定するために物理的な吸着や共有結合形成を用いるが、吸着反応と共有結合反応のいずれも基板表面の状態に依存するために均一な固定が困難であるケースが多い。
２）親和性プローブの基板上への固定の立体方向の制御ができない。すなわち、溶液中の測定対象生体物質を捕捉するための親和性部位を測定対象生体物質と反応する方角に向けて固定することが難しい。このため、親和性プローブ自身の立体障害で測定対象の捕捉量が低下する。
３）親和性プローブの密度がコントロールできない。一般的に、固定時の親和性プローブ濃度や固定時間をコントロールすることで任意の密度の親和性プローブを固定した基板が得られると思われがちであるが、実際には制御が難しいことが多い。非特許文献４では、親和性プローブの固定時にこれとは異なる生体物質を共存させて実際の親和性プローブ固定密度をコントロールしている。親和性プローブを希薄状態で基板表面に固定しようとすると、島状に密度の高いところと周りの密度の薄いところができてしまう。
４）あるいは、上記１）から３）の問題に関連するが、親和性プローブの固定エリアが狭くなると各エリアで親和性プローブの固定量が異なるようになり、定量的な測定に害を及ぼす可能性がある。さらに、親和性プローブの固定エリアが狭くなると蛍光法のように親和性プローブエリア全体の蛍光強度を測定し、その蛍光強度を基に試料中の目的生体物質の量を定量解析することができなくなる。このために、上記非特許文献４あるいは特許出願発明のように基板上に捕捉した目的生体物質にナノ粒子を結合させてこれを計数する方法を取るわけであるが、親和性プローブが均一についていないと、部位ごとに結合するナノ粒子の数が異なることになり、計数による定量検出精度が当然低下することになる。
【００１２】
基板に固定する親和性プローブ密度には最適条件が存在する。このために、親和性プローブ密度を任意にコントロールする必要性が出てくる。
【００１３】
従来のプローブ固定法ではシランカップリング反応を用いて無機質であるガラスやシリコンウエハー表面に官能性残基を導入し、この官能性残基に親和性プローブを固定する方法が多用されている。しかしながらシランカップリング反応は、基板の表面状態に依存し、必ずしも均一に親和性プローブを固定する方法として最適なものではない。
【００１４】
本発明の目的は、親和性プローブを基板表面により均一な密度で固定することで微小な領域で、定量測定を行うことのできる生体物質解析チップとこれを用いる生体物質解析キットおよびこれらを用いる生体物質解析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、ガラスやシリコン基板表面のＳｉ−ＯＨないしＳｉ＝Ｏあるいは、金属表面のＭｅ−ＯＨやＭｅ＝Ｏ（Ｍｅ：金属原子）のような残基に直接反応するようなシランカップリングを用いることはしない。このような表面に存在する−ＯＨや＝Ｏ残基は表面状態により存在する量が異なるので、本質的に均一な活性基を導入することが困難と考えたからである。そこで、基板表面の状態に依存せずに親和性プローブを固定する残基を導入する必要がある。これには、基板表面状態にかかわらず、ポリマー層を基板表面に導入し、このポリマー層が一定間隔で親和性プローブを固定するための官能基を持つように設計すればよい。このとき重要なのは、いかにして親和性プローブを固定するための官能基の間隔をそろえるかである。
【００１６】
すなわち、２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層でできた重合生成薄膜を有するものを作成することとする。これは、前記ポリマー層が重合用の第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に親和性プローブ結合残基を持つ構造をしている。具体的には、基板に第１のモノマーとしてジイソシアナート類と第２のモノマーとしてジアミン類を等モル比で反応させ重合させる。このケースでは、第１の官能基はイソシアナート基、第２の官能基はアミノ基ということになる。ジイソシアナートとしてはたとえばアルキルジイソシアナートやフェニレンジイソシアナート類を用いることができる。また、親和性プローブ結合用にはジイソシアナート類かジアミン類の側鎖に官能基を導入したモノマーを用いればよい。
【００１７】
例えば、ジアミン類の側鎖にカルボキシル基を導入したモノマーを用いる。これを基板表面で重合させると、ジイソシアナート類とジアミン類が交互に結合したポリマーが得られる。よってカルボキシル基はジイソシアナート類とジアミン類からなる周期のジアミン部分の側鎖に存在することになる。このため、ポリマー上に一定間隔で親和性プローブを固定することが可能となる。このときの重合生成薄膜はポリ尿素ということになる。重合上条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができるジイソシアナート類とジアミン類の主鎖の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも自在に官能基を持つ薄膜を形成することができる。
【００１８】
基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の１，４−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に５’末端にアミノ基を有するＤＮＡプローブ（スペーサー部：５’末端側１０塩基プラスターゲットのｃＤＮＡと反応する部分：平均３２塩基長）を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でＤＮＡプローブが約９ｎｍ間隔で固定された基板が得られる。
【００１９】
カルボキシル基をもつポリ尿素を基板上に形成する例のほか、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであればいずれも利用することができる。たとえば、２種のモノマーの組み合わせがＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２やＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ３（Ｒ１〜Ｒ３は任意の残基）の構造を有する酸無水物とＮＨ２−Ｒ５−ＮＨ２（Ｒ５は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーで、Ｒ５にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。
【００２０】
このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえば長カルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは１，１０−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. Ｊ. Appl. Phys. 33, L1721-L1724（1994）やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992)記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、細胞内発現しているｍＲＮＡやタンパク質を分子レベルで検出できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（実施例１）
図１は本発明を実行するに好適な生体物質解析チップの１例を示す図である。図１（Ａ）は実施例の生体物質解析チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【００２３】
この生体物質解析チップ１００は、ガラス基板１の上面に親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層２１を作成する。ポリマー層２１の上にはテフロン（登録商標）層２２がプリントされている。したがって表面に出ているポリマー層２１は図の２３のような区画となっている。この区画は５０×５０μｍで細胞１個を収納できる。ポリマー薄膜層２１の上には親和性プローブとしてポリＴ（Ｔ３０）を固定し、ｍＲＮＡを網羅的に捕捉するようにすることができる。あるいは、上記「課題を解決するための手段」に記載したＤＮＡプローブ（スペーサー部：５’末端側１０塩基＋ターゲットのｍＲＮＡないしｃＤＮＡと反応する部分：平均３２塩基長）を固定することで特定のｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡを捕捉するようなチップを得ることができる。もちろん通常のＤＮＡチップのように複数のＤＮＡプローブをスポットした構造とする。区画２１の集合の周りには溶液を保持するための仕切り５が存在する。
【００２４】
まず、基板１の上面に形成する親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層について説明する。ポリマー薄膜層２１は第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させる。すなわちポリマー薄膜としては尿素樹脂薄膜ということになる。アルキルジイソシアナートとしては、例えば、ヘキサメチレンジイソシアナートを用いることができる。また、生体物質捕捉用残基は第２のモノマーであるジアミノフェニル酢酸のカルボキシル基ということになる。重合条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができる。
【００２５】
このようにして基板上に形成したポリ尿素薄膜２１はアルキルジイソシアナートとジアミノフェニル酢酸モノマーが交互に反応して形成する構造のため、側鎖のカルボン酸基が比較的そろった間隔で存在することになる。アルキル基の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも官能基を持つ薄膜を形成することができる。基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。
【００２６】
次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の１，４−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に５’末端にアミノ基を有するポリＴ（Ｔ３０）を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でポリＴが約９ｎｍ間隔で固定された基板が得られる。
【００２７】
実施例では、カルボキシル基をもつポリ尿素を基板１上に形成して用いたが、このほかにも、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであれば利用することができる。たとえば、２種のモノマーの組み合わせがＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ４の構造を有する酸無水物（Ｒ１〜Ｒ４は任意の残基）とＮＨ２−Ｒ５−ＮＨ２の構造を有するジアミンモノマー（Ｒ５は任意の残基）で、Ｒ５にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、４,４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえばカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは１，１０−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. Ｊ. Appl. Phys. 33, L1721-L1724（1994）やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992)記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。
【００２８】
なお、図１において、５は樹脂製の壁であり、ポリ尿素薄膜２１の周辺に設け、試料溶液の周辺への流出を防止するためのものである。必ず必要と言うものではない。
【００２９】
図２（Ａ）は、基板１の上面に蒸着重合で形成された第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させたポリマー薄膜層２１の断面構造を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、ポリマー薄膜層２１の平面構造を示す模式図である。
【００３０】
ポリマー薄膜層２１は、第１のモノマー部分２２と第２のモノマー部分２３が、第１のモノマー部分２２の第１の官能基２４と第２のモノマー部分２３の第２の官能基２５とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造となっている。第２のモノマー部分２３には側鎖として第３の官能基２６が存在する。ポリマー層薄膜２１は基板表面との間での弱い結合２７と、基板１のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子がごく一部分で共有結合した状態２８でアンカリングしていると推定される。図２（Ｂ）を参照して分かるように、第１のモノマー部分２２の第１の官能基２４と第２のモノマー部分２３の第２の官能基２５とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造は、全てが、平行に整然と並ぶわけではないので、第三の官能基２６が、均等に、整然と配列されるわけではない。すなわち、図２（Ｂ）に示すように、反転したもの、傾いたものが混在する。しかし、第三の官能基２６を有する第２のモノマー部分２３は、第１のモノマー部分２２を介在させて配列されることになるので、第三の官能基２６が、むやみに集まったり、閑散と分布してしまったりすることは防止できる。
【００３１】
図３は、基板１の表面に形成されたポリマー薄膜層２１の第三の官能基２６とＤＮＡプローブ３１の５’末端部分３２の官能基３３とが結合する様子を模式的に示す図である。ここで、ポリマー薄膜層２１は、第１のモノマー２２と第２のモノマー２３が交互に重合しているので、分子レベルで見ると第２のモノマー２３の側鎖である第３の官能基２６の間隔はほぼ一定となり、したがって第３の官能基２６に結合するＤＮＡプローブ３１もほぼ一定間隔となる。もちろんポリマー鎖同士の２次元的な広がりも考える必要があるが、側鎖のカルボキシル基（図２（Ａ）では第３の官能基２６に相当）のマイナス荷電の反発力により、図２（B）に示すように、異なる鎖の間隔もほぼ一定となることが期待できる。
【００３２】
図４は、図１−３に示す基板を用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。図４（Ａ）は基板１の上面のポリマー薄膜層２１の上面に、例えば、細胞を破砕して得られた試料溶液４１を配し、試料溶液４１中にはｍＲＮＡ４３やタンパク質４５が分散した様子を模視的に示す断面図である。溶液４１はいわゆるＰＢＳでＥＤＴＡは含まないものを使用する。基板１の上面のポリマー薄膜層２１の表面にプローブ３１が固定されている。ここではプローブ３１はポリＴからなるものを使用する。ｍＲＮＡが測定対象であるので液滴中に細胞浸透性のＲＮａｓｅインヒビターを予め入れておき、ｍＲＮＡの分解を極力防ぐ。
【００３３】
図４（Ｂ）は、図４（Ａ）の状態から時間が経過した状態を模視的に示す図である。時間が経過するのに応じて、ｍＲＮＡ４３は基板上のポリＴプローブ３１にハイブリダイズする。ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションによる基板表面のポリＡプローブへの捕捉には４時間程度を要する。
【００３４】
図４（Ｃ）は、基板１の上面のポリマー薄膜層２１の上面のポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡ群４３を識別する方法を説明する図である。まず、図４（Ｂ）に示すポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡ群を有する基板１を０．５％ＳＤＳと０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で洗浄し、基板１上のポリＴプローブ３１にハイブリダイズしなかった物を除去する。次いで、ポリＴプローブ３１にハイブリダイズしたｍＲＮＡ群４３は、種々の異なったものがあるので、これを識別するための標識プローブの混合溶液５１を添加する。ここでは、標識プローブとしては異なる粒子径の金ナノ粒子に異なるＤＮＡ配列を持つＤＮＡプローブを結合させたものを用いる。図では模式的に５ｎｍの金ナノ粒子５３で標識したＤＮＡプローブ６３、１０ｎｍの金ナノ粒子５４で標識したＤＮＡプローブ６４、１５ｎｍの金ナノ粒子５５で標識したＤＮＡプローブ６５の３種を含む溶液５１を基板上に加えた状態を表す。金ナノ粒子標識ＤＮＡプローブの非特異的な吸着を防ぐために、溶液５１は０．５％ＳＤＳと０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４の組成としている。
【００３５】
１時間４５℃でインキュベーションした後、同一の緩衝液で洗浄後、さらに１０ｍＭのＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液ｐＨ７で洗浄する。この状態で基板上には、ポリＴプローブ３１にハイブリダイズしたｍＲＮＡ群とポリＴプローブ３１に捕捉された各ｍＲＮＡにハイブリダイズした標識プローブ６３，６４，６５が３体結合した状態になっている。標識プローブ６３，６４，６５には、走査型電子顕微鏡や操作型原子間力顕微鏡で容易に識別できる粒子径の異なる金ナノ粒子標識物５３、５４、５５が結合している。したがって、金ナノ粒子５３、５４、５５を、粒子径を区別しながらカウントすることで、基板１上のポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡの種類と量を測定することができる。
【００３６】
区画２１は５×５μｍと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとのプローブ固定量を一定に保とうとすると、基板表面の状態に固定量が依存するような方法は取ることができない。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ９ｎｍに保つことができる。このため５×５μｍ程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のＣＶ＝３０％程度から本発明によりＣＶ＝７％程度まで少なくすることができる。
（実施例２）
ここで、実施例による識別能力について評価すると以下のようである。
【００３７】
基板１の上面のポリマー薄膜層２１の表面にプローブ３１が固定されるが、プローブ３１としてポリＴを用いることとし、通常のＤＮＡチップの様に複数の配列のＤＮＡプローブをポリマー薄膜層２１の表面にスポットして用いる例を考える。すなわち、上述したようにして調製したイソチオシアナート残基がほぼ一定間隔になるように配された表面にインクジェット装置を用いて各プローブをスポットする。スポットの大きさは１μｍφとし、各スポットが２μｍピッチで並んでいるとする。
【００３８】
また、各スポットに３種類の捕捉用ＤＮＡプローブをミクスチャーとして固定し、各々捕捉用プローブに対応する検出用のＤＮＡプローブに上述のように３種類の異なる粒子径のナノ粒子を標識したものを用いるとする。
【００３９】
図５（Ａ）に本発明を用いる３種類のＤＮＡプローブを同一スポット位置に固定し、スポットごとに異なるＤＮＡプローブを固定したＤＮＡマイクロアレイの例を断面図で示す。基板１の上には蒸着重合で作成した反応性残基がほぼ等間隔で並んだ層２１の活性基を利用して３種のプローブ９２−１，９２−２，９２−３のグループと、これらとは異なる３種のプローブ９３−１，９３−２，９３−３がスポットエリア９２と９３に別個に固定されている。試料混合液９１を添加して２時間５０℃でインキュベーションする。試料混合液９１は１本鎖状態のｃＤＮＡ混合物で、たとえば白血球由来のｍＲＮＡ混合物を逆転写して得たものである。溶媒は０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）である。反応終了後、０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。
【００４０】
図５（Ｂ）に基板上の層２１の表面のプローブにｃＤＮＡが捕捉された状態を（示す。異なるｃＤＮＡ１０２−１，１０２−２，１０２−３がスポットエリア９２の対応するＤＮＡプローブにハイブリダイズ、ｃＤＮ１０３−２，１０３−３がスポットエリア９３の対応するプローブにハイブリダイズしている。スポット９３のプローブ９３−１に対応しているｃＤＮＡは試料中に存在しないケースで、このためいずれのスポットエリアにもハイブリダイズした痕跡は見られない。
【００４１】
図５（Ｃ）に、基板上の層２１の表面のプローブに捕捉されたｃＤＮＡが３種の異なる粒子径５、１０、１５μｍの金ナノ粒子を標識した第２のＤＮＡプローブ１１２−１，１１２−２，１１２−３、１１３−１、１１３−２、１１２−３と反応させるためにリン酸緩衝液９５を添加した状態を示す。第２のＤＮＡプローブはそれぞれ１本鎖ｃＤＮＡ１０２−１，１０２−２，１０２−３，１０３−１，１０３−２，１０３−３に相補な配列を有する（ｃＤＮＡ１０３−１は試料中に含まれないので図には描かれていない）。反応は０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）９５中で、５５℃で３０分間行う。金ナノ粒子標識ＤＮＡプローブの混合液は予め９０℃５秒加熱し、５５℃に冷却して直ちに基板上に滴下する。０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。
【００４２】
図５（Ｄ）に、基板上の各スポットエリアにｃＤＮＡ配列に従い金ナノ粒子１１２−１，１１２−２，１１２−３，１１３−２，１１３−３で標識したＤＮＡプローブがハイブリダイズした状態を示す。操作型電子顕微鏡か原子間力顕微鏡で基板表面をスキャンして、各スポットエリアに結合している金ナノ粒子を粒径別にカウントする。
【００４３】
区画２１は５×５μｍと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとに３種類のプローブを固定しようとすると更に固定量のばらつき変動が大きくなる。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ９ｎｍに保つことができる。３種類のプローブを固定すると、５×５μｍ程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のＣＶ＝４０％程度から本発明によりＣＶ＝１０％程度まで少なくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明を実行するに好適な生体物質解析チップの１例を示す図であり、（Ａ）は実施例の生体物質解析チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図２】（Ａ）は、基板１の上面に蒸着重合で形成された第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させたポリマー薄膜層２１の断面構造を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、ポリマー薄膜層２１の平面構造を示す模式図である。
【図３】基板１の表面に形成されたポリマー薄膜層２１の第三の官能基２６とＤＮＡプローブ３１の５’末端部分３２の官能基３３とが結合する様子を模式的に示す図である。
【図４】（Ａ）−（Ｄ）は、図１−３に示す基板を用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。
【図５】（Ａ）−（Ｄ）は、複数のＤＮＡプローブを同一スポット位置に固定し、各スポット位置でＤＮＡプローブを異なるものとしたＤＮＡマイクロアレイを用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。
【符号の説明】
【００４５】
１００…生体物質解析チップ、１…ガラス基板、５…樹脂製の壁、２１…ポリマー薄膜層、２２…第１のモノマー部分、２３…第２のモノマー部分、２４…第１のモノマー部分の第１の官能基、２５…第２のモノマー部分の第２の官能基、２６…第２のモノマー部分の側鎖としての第３の官能基、２７…ポリマー層薄膜と基板表面との間の弱い結合、２８…基板のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子の共有結合した状態、３１，９２，９３…ＤＮＡプローブ、３２…ＤＮＡプローブの５’末端部分、３３…ＤＮＡプローブの５’末端部分の官能基、４１…細胞を破砕して得られた試料溶液、４３…ｍＲＮＡ、４５…タンパク質、５３，５４，５５，１１２，１１３…金ナノ粒子、６３，６４，６５…金ナノ粒子で標識したＤＮＡプローブ、１０２，１０３…ｃＤＮＡ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞ないし細胞集合体である組織で発現している遺伝子産物であるｍＲＮＡないしタンパク質を定量的に計測するための生体物質解析チップ、生体物質解析キットおよび方生体物質解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。遺伝子の発現状況を調べるには遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを調べる方法とｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を調べる方法がある。ｍＲＮＡを調べる有力な方法として、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、あるいはＤＮＡプローブチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）がある。ＤＮＡプローブアレーを用いるｍＲＮＡ検査では、予め十分多量な細胞検体からＲＮＡ成分を抽出し、リバーストランスクリプターゼによる逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅やｃＲＮＡ合成により増幅を行う。また相補鎖合成時に標識ｄＮＴＰを取り込ませて多量の標識ＤＮＡ鎖を得る。最近ではアミノアリルｄＮＴＰを取り込ませて、その後にアミノ基に蛍光色素を反応させて蛍光標識ＤＮＡ鎖を得る方法が主流となっている。このようにして得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖をいわゆるＤＮＡプローブアレーとハイブリダイズさせて各種発現遺伝子の解析を行う。ＤＮＡプローブアレー上には通常数十から１５０μｍφの微小スポット状に高密度にＤＮＡプローブを固定して標的ｃＤＮＡ捕捉速度を高め、高感度検出ができるようにしている。
【０００３】
ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基ずつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)）、あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)）などがある。
【０００４】
これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面上に多数のプローブをアレイ状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。検出には、ＤＮＡチップの類では標識物に蛍光色素を用いるケースが圧倒的に多いが、電気化学発光を用いるケースやDedox（酸化還元）反応を用いて電気信号として検出する方法も実用化している。
【０００５】
ＤＮＡプローブのかわりに抗体や抗原を基板上にアレイ状に固定したプロテインチップの概念も実用化されている。基板上にアレルギーを起こす数十から数百の抗原（アレルゲン）を固定したデバイスに検体血清を反応させ、各抗原と抗原抗体反応を起こす血清中に存在するＩｇＭを特異的に捕捉し、ＩｇＭに結合する酵素標識２次抗体を反応させ、酵素活性を化学発光と組み合わせることで測定して、アレルゲンを検出するアレルゲン検査用のシステムが医療検査用に実用化されている。プロテインチップにおいても、高感度検出を行うために固体表面に抗体や抗原を高密度に固定することで測定対象物質の捕捉速度を高めている。
【０００６】
プロテインチップ上に捕捉した測定対象物質の検出には、酵素標識物を用いて化学発光ないし生物発光の系で検出するケースが多い。そのほか、蛍光標識検出や、電気化学発光検出、質量分析器による分析を行うケースと多様な方法が実用化されている。
【０００７】
電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。
【０００８】
本発明に関連するところでは、生体物質検出法の一つでプロテインチップと類似の技術であるサンドイッチイムノアッセイ法において、標識物に粒子を用いて測定対象物質を分子計数する方法が報告されている（非特許文献４：Analytical Biochemistry 202，120−125 (1992)）。
【０００９】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【非特許文献３】Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)
【非特許文献４】Analytical Biochemistry 202，120−125 (1992）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記従来技術では、ＤＮＡプローブチップあるいはプロテインチップを用いる遺伝子転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の識別や検出法に関してはよく検討されており、何らかの方法で溶液状の試料が準備できていればそれなりに測定ができる。また、出願人の一人により特許出願されている特願２００４−２２６３６１、特願２００４−２９７１９４あるいは特願２００４−３１８７７０に開示されているように、ｍＲＮＡやＤＮＡマイクロアレイの分野においてもナノ粒子を用いて解析する方法が提案されている。
【００１１】
しかしながら、生体物質を基板上に捕捉するための親和性プローブ（以下生体物質に結合して何らかの情報を得るために使われる物質の総称を親和性プローブと呼ぶことにする）はＤＮＡプローブや抗体などの生体有機物であるので、これらの固定にはガラスやシリコンの基板と生体有機物を固定する上で下記の問題がある。すなわち、
１）親和性プローブを基板上に固定するために物理的な吸着や共有結合形成を用いるが、吸着反応と共有結合反応のいずれも基板表面の状態に依存するために均一な固定が困難であるケースが多い。
２）親和性プローブの基板上への固定の立体方向の制御ができない。すなわち、溶液中の測定対象生体物質を捕捉するための親和性部位を測定対象生体物質と反応する方角に向けて固定することが難しい。このため、親和性プローブ自身の立体障害で測定対象の捕捉量が低下する。
３）親和性プローブの密度がコントロールできない。一般的に、固定時の親和性プローブ濃度や固定時間をコントロールすることで任意の密度の親和性プローブを固定した基板が得られると思われがちであるが、実際には制御が難しいことが多い。非特許文献４では、親和性プローブの固定時にこれとは異なる生体物質を共存させて実際の親和性プローブ固定密度をコントロールしている。親和性プローブを希薄状態で基板表面に固定しようとすると、島状に密度の高いところと周りの密度の薄いところができてしまう。
４）あるいは、上記１）から３）の問題に関連するが、親和性プローブの固定エリアが狭くなると各エリアで親和性プローブの固定量が異なるようになり、定量的な測定に害を及ぼす可能性がある。さらに、親和性プローブの固定エリアが狭くなると蛍光法のように親和性プローブエリア全体の蛍光強度を測定し、その蛍光強度を基に試料中の目的生体物質の量を定量解析することができなくなる。このために、上記非特許文献４あるいは特許出願発明のように基板上に捕捉した目的生体物質にナノ粒子を結合させてこれを計数する方法を取るわけであるが、親和性プローブが均一についていないと、部位ごとに結合するナノ粒子の数が異なることになり、計数による定量検出精度が当然低下することになる。
【００１２】
基板に固定する親和性プローブ密度には最適条件が存在する。このために、親和性プローブ密度を任意にコントロールする必要性が出てくる。
【００１３】
従来のプローブ固定法ではシランカップリング反応を用いて無機質であるガラスやシリコンウエハー表面に官能性残基を導入し、この官能性残基に親和性プローブを固定する方法が多用されている。しかしながらシランカップリング反応は、基板の表面状態に依存し、必ずしも均一に親和性プローブを固定する方法として最適なものではない。
【００１４】
本発明の目的は、親和性プローブを基板表面により均一な密度で固定することで微小な領域で、定量測定を行うことのできる生体物質解析チップとこれを用いる生体物質解析キットおよびこれらを用いる生体物質解析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、ガラスやシリコン基板表面のＳｉ−ＯＨないしＳｉ＝Ｏあるいは、金属表面のＭｅ−ＯＨやＭｅ＝Ｏ（Ｍｅ：金属原子）のような残基に直接反応するようなシランカップリングを用いることはしない。このような表面に存在する−ＯＨや＝Ｏ残基は表面状態により存在する量が異なるので、本質的に均一な活性基を導入することが困難と考えたからである。そこで、基板表面の状態に依存せずに親和性プローブを固定する残基を導入する必要がある。これには、基板表面状態にかかわらず、ポリマー層を基板表面に導入し、このポリマー層が一定間隔で親和性プローブを固定するための官能基を持つように設計すればよい。このとき重要なのは、いかにして親和性プローブを固定するための官能基の間隔をそろえるかである。
【００１６】
すなわち、２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層でできた重合生成薄膜を有するものを作成することとする。これは、前記ポリマー層が重合用の第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に親和性プローブ結合残基を持つ構造をしている。具体的には、基板に第１のモノマーとしてジイソシアナート類と第２のモノマーとしてジアミン類を等モル比で反応させ重合させる。このケースでは、第１の官能基はイソシアナート基、第２の官能基はアミノ基ということになる。ジイソシアナートとしてはたとえばアルキルジイソシアナートやフェニレンジイソシアナート類を用いることができる。また、親和性プローブ結合用にはジイソシアナート類かジアミン類の側鎖に官能基を導入したモノマーを用いればよい。
【００１７】
例えば、ジアミン類の側鎖にカルボキシル基を導入したモノマーを用いる。これを基板表面で重合させると、ジイソシアナート類とジアミン類が交互に結合したポリマーが得られる。よってカルボキシル基はジイソシアナート類とジアミン類からなる周期のジアミン部分の側鎖に存在することになる。このため、ポリマー上に一定間隔で親和性プローブを固定することが可能となる。このときの重合生成薄膜はポリ尿素ということになる。重合上条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができるジイソシアナート類とジアミン類の主鎖の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも自在に官能基を持つ薄膜を形成することができる。
【００１８】
基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の１，４−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に５’末端にアミノ基を有するＤＮＡプローブ（スペーサー部：５’末端側１０塩基プラスターゲットのｃＤＮＡと反応する部分：平均３２塩基長）を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でＤＮＡプローブが約９ｎｍ間隔で固定された基板が得られる。
【００１９】
カルボキシル基をもつポリ尿素を基板上に形成する例のほか、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであればいずれも利用することができる。たとえば、２種のモノマーの組み合わせがＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２やＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ３（Ｒ１〜Ｒ３は任意の残基）の構造を有する酸無水物とＮＨ２−Ｒ５−ＮＨ２（Ｒ５は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーで、Ｒ５にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。
【００２０】
このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえば長カルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは１，１０−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. Ｊ. Appl. Phys. 33, L1721-L1724（1994）やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992)記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、細胞内発現しているｍＲＮＡやタンパク質を分子レベルで検出できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（実施例１）
図１は本発明を実行するに好適な生体物質解析チップの１例を示す図である。図１（Ａ）は実施例の生体物質解析チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【００２３】
この生体物質解析チップ１００は、ガラス基板１の上面に親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層２１を作成する。ポリマー層２１の上にはテフロン（登録商標）層２２がプリントされている。したがって表面に出ているポリマー層２１は図の２３のような区画となっている。この区画は５０×５０μｍで細胞１個を収納できる。ポリマー薄膜層２１の上には親和性プローブとしてポリＴ（Ｔ３０）を固定し、ｍＲＮＡを網羅的に捕捉するようにすることができる。あるいは、上記「課題を解決するための手段」に記載したＤＮＡプローブ（スペーサー部：５’末端側１０塩基＋ターゲットのｍＲＮＡないしｃＤＮＡと反応する部分：平均３２塩基長）を固定することで特定のｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡを捕捉するようなチップを得ることができる。もちろん通常のＤＮＡチップのように複数のＤＮＡプローブをスポットした構造とする。区画２１の集合の周りには溶液を保持するための仕切り５が存在する。
【００２４】
まず、基板１の上面に形成する親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層について説明する。ポリマー薄膜層２１は第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させる。すなわちポリマー薄膜としては尿素樹脂薄膜ということになる。アルキルジイソシアナートとしては、例えば、ヘキサメチレンジイソシアナートを用いることができる。また、生体物質捕捉用残基は第２のモノマーであるジアミノフェニル酢酸のカルボキシル基ということになる。重合条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができる。
【００２５】
このようにして基板上に形成したポリ尿素薄膜２１はアルキルジイソシアナートとジアミノフェニル酢酸モノマーが交互に反応して形成する構造のため、側鎖のカルボン酸基が比較的そろった間隔で存在することになる。アルキル基の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも官能基を持つ薄膜を形成することができる。基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。
【００２６】
次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の１，４−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に５’末端にアミノ基を有するポリＴ（Ｔ３０）を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でポリＴが約９ｎｍ間隔で固定された基板が得られる。
【００２７】
実施例では、カルボキシル基をもつポリ尿素を基板１上に形成して用いたが、このほかにも、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであれば利用することができる。たとえば、２種のモノマーの組み合わせがＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ４の構造を有する酸無水物（Ｒ１〜Ｒ４は任意の残基）とＮＨ２−Ｒ５−ＮＨ２の構造を有するジアミンモノマー（Ｒ５は任意の残基）で、Ｒ５にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、４,４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえばカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは１，１０−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. Ｊ. Appl. Phys. 33, L1721-L1724（1994）やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992)記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。
【００２８】
なお、図１において、５は樹脂製の壁であり、ポリ尿素薄膜２１の周辺に設け、試料溶液の周辺への流出を防止するためのものである。必ず必要と言うものではない。
【００２９】
図２（Ａ）は、基板１の上面に蒸着重合で形成された第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させたポリマー薄膜層２１の断面構造を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、ポリマー薄膜層２１の平面構造を示す模式図である。
【００３０】
ポリマー薄膜層２１は、第１のモノマー部分２２と第２のモノマー部分２３が、第１のモノマー部分２２の第１の官能基２４と第２のモノマー部分２３の第２の官能基２５とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造となっている。第２のモノマー部分２３には側鎖として第３の官能基２６が存在する。ポリマー層薄膜２１は基板表面との間での弱い結合２７と、基板１のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子がごく一部分で共有結合した状態２８でアンカリングしていると推定される。図２（Ｂ）を参照して分かるように、第１のモノマー部分２２の第１の官能基２４と第２のモノマー部分２３の第２の官能基２５とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造は、全てが、平行に整然と並ぶわけではないので、第三の官能基２６が、均等に、整然と配列されるわけではない。すなわち、図２（Ｂ）に示すように、反転したもの、傾いたものが混在する。しかし、第三の官能基２６を有する第２のモノマー部分２３は、第１のモノマー部分２２を介在させて配列されることになるので、第三の官能基２６が、むやみに集まったり、閑散と分布してしまったりすることは防止できる。
【００３１】
図３は、基板１の表面に形成されたポリマー薄膜層２１の第三の官能基２６とＤＮＡプローブ３１の５’末端部分３２の官能基３３とが結合する様子を模式的に示す図である。ここで、ポリマー薄膜層２１は、第１のモノマー２２と第２のモノマー２３が交互に重合しているので、分子レベルで見ると第２のモノマー２３の側鎖である第３の官能基２６の間隔はほぼ一定となり、したがって第３の官能基２６に結合するＤＮＡプローブ３１もほぼ一定間隔となる。もちろんポリマー鎖同士の２次元的な広がりも考える必要があるが、側鎖のカルボキシル基（図２（Ａ）では第３の官能基２６に相当）のマイナス荷電の反発力により、図２（B）に示すように、異なる鎖の間隔もほぼ一定となることが期待できる。
【００３２】
図４は、図１−３に示す基板を用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。図４（Ａ）は基板１の上面のポリマー薄膜層２１の上面に、例えば、細胞を破砕して得られた試料溶液４１を配し、試料溶液４１中にはｍＲＮＡ４３やタンパク質４５が分散した様子を模視的に示す断面図である。溶液４１はいわゆるＰＢＳでＥＤＴＡは含まないものを使用する。基板１の上面のポリマー薄膜層２１の表面にプローブ３１が固定されている。ここではプローブ３１はポリＴからなるものを使用する。ｍＲＮＡが測定対象であるので液滴中に細胞浸透性のＲＮａｓｅインヒビターを予め入れておき、ｍＲＮＡの分解を極力防ぐ。
【００３３】
図４（Ｂ）は、図４（Ａ）の状態から時間が経過した状態を模視的に示す図である。時間が経過するのに応じて、ｍＲＮＡ４３は基板上のポリＴプローブ３１にハイブリダイズする。ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションによる基板表面のポリＡプローブへの捕捉には４時間程度を要する。
【００３４】
図４（Ｃ）は、基板１の上面のポリマー薄膜層２１の上面のポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡ群４３を識別する方法を説明する図である。まず、図４（Ｂ）に示すポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡ群を有する基板１を０．５％ＳＤＳと０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で洗浄し、基板１上のポリＴプローブ３１にハイブリダイズしなかった物を除去する。次いで、ポリＴプローブ３１にハイブリダイズしたｍＲＮＡ群４３は、種々の異なったものがあるので、これを識別するための標識プローブの混合溶液５１を添加する。ここでは、標識プローブとしては異なる粒子径の金ナノ粒子に異なるＤＮＡ配列を持つＤＮＡプローブを結合させたものを用いる。図では模式的に５ｎｍの金ナノ粒子５３で標識したＤＮＡプローブ６３、１０ｎｍの金ナノ粒子５４で標識したＤＮＡプローブ６４、１５ｎｍの金ナノ粒子５５で標識したＤＮＡプローブ６５の３種を含む溶液５１を基板上に加えた状態を表す。金ナノ粒子標識ＤＮＡプローブの非特異的な吸着を防ぐために、溶液５１は０．５％ＳＤＳと０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４の組成としている。
【００３５】
１時間４５℃でインキュベーションした後、同一の緩衝液で洗浄後、さらに１０ｍＭのＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液ｐＨ７で洗浄する。この状態で基板上には、ポリＴプローブ３１にハイブリダイズしたｍＲＮＡ群とポリＴプローブ３１に捕捉された各ｍＲＮＡにハイブリダイズした標識プローブ６３，６４，６５が３体結合した状態になっている。標識プローブ６３，６４，６５には、走査型電子顕微鏡や操作型原子間力顕微鏡で容易に識別できる粒子径の異なる金ナノ粒子標識物５３、５４、５５が結合している。したがって、金ナノ粒子５３、５４、５５を、粒子径を区別しながらカウントすることで、基板１上のポリＴプローブ３１に捕捉されたｍＲＮＡの種類と量を測定することができる。
【００３６】
区画２１は５×５μｍと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとのプローブ固定量を一定に保とうとすると、基板表面の状態に固定量が依存するような方法は取ることができない。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ９ｎｍに保つことができる。このため５×５μｍ程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のＣＶ＝３０％程度から本発明によりＣＶ＝７％程度まで少なくすることができる。
（実施例２）
ここで、実施例による識別能力について評価すると以下のようである。
【００３７】
基板１の上面のポリマー薄膜層２１の表面にプローブ３１が固定されるが、プローブ３１としてポリＴを用いることとし、通常のＤＮＡチップの様に複数の配列のＤＮＡプローブをポリマー薄膜層２１の表面にスポットして用いる例を考える。すなわち、上述したようにして調製したイソチオシアナート残基がほぼ一定間隔になるように配された表面にインクジェット装置を用いて各プローブをスポットする。スポットの大きさは１μｍφとし、各スポットが２μｍピッチで並んでいるとする。
【００３８】
また、各スポットに３種類の捕捉用ＤＮＡプローブをミクスチャーとして固定し、各々捕捉用プローブに対応する検出用のＤＮＡプローブに上述のように３種類の異なる粒子径のナノ粒子を標識したものを用いるとする。
【００３９】
図５（Ａ）に本発明を用いる３種類のＤＮＡプローブを同一スポット位置に固定し、スポットごとに異なるＤＮＡプローブを固定したＤＮＡマイクロアレイの例を断面図で示す。基板１の上には蒸着重合で作成した反応性残基がほぼ等間隔で並んだ層２１の活性基を利用して３種のプローブ９２−１，９２−２，９２−３のグループと、これらとは異なる３種のプローブ９３−１，９３−２，９３−３がスポットエリア９２と９３に別個に固定されている。試料混合液９１を添加して２時間５０℃でインキュベーションする。試料混合液９１は１本鎖状態のｃＤＮＡ混合物で、たとえば白血球由来のｍＲＮＡ混合物を逆転写して得たものである。溶媒は０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）である。反応終了後、０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。
【００４０】
図５（Ｂ）に基板上の層２１の表面のプローブにｃＤＮＡが捕捉された状態を（示す。異なるｃＤＮＡ１０２−１，１０２−２，１０２−３がスポットエリア９２の対応するＤＮＡプローブにハイブリダイズ、ｃＤＮ１０３−２，１０３−３がスポットエリア９３の対応するプローブにハイブリダイズしている。スポット９３のプローブ９３−１に対応しているｃＤＮＡは試料中に存在しないケースで、このためいずれのスポットエリアにもハイブリダイズした痕跡は見られない。
【００４１】
図５（Ｃ）に、基板上の層２１の表面のプローブに捕捉されたｃＤＮＡが３種の異なる粒子径５、１０、１５μｍの金ナノ粒子を標識した第２のＤＮＡプローブ１１２−１，１１２−２，１１２−３、１１３−１、１１３−２、１１２−３と反応させるためにリン酸緩衝液９５を添加した状態を示す。第２のＤＮＡプローブはそれぞれ１本鎖ｃＤＮＡ１０２−１，１０２−２，１０２−３，１０３−１，１０３−２，１０３−３に相補な配列を有する（ｃＤＮＡ１０３−１は試料中に含まれないので図には描かれていない）。反応は０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）９５中で、５５℃で３０分間行う。金ナノ粒子標識ＤＮＡプローブの混合液は予め９０℃５秒加熱し、５５℃に冷却して直ちに基板上に滴下する。０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。
【００４２】
図５（Ｄ）に、基板上の各スポットエリアにｃＤＮＡ配列に従い金ナノ粒子１１２−１，１１２−２，１１２−３，１１３−２，１１３−３で標識したＤＮＡプローブがハイブリダイズした状態を示す。操作型電子顕微鏡か原子間力顕微鏡で基板表面をスキャンして、各スポットエリアに結合している金ナノ粒子を粒径別にカウントする。
【００４３】
区画２１は５×５μｍと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとに３種類のプローブを固定しようとすると更に固定量のばらつき変動が大きくなる。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ９ｎｍに保つことができる。３種類のプローブを固定すると、５×５μｍ程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のＣＶ＝４０％程度から本発明によりＣＶ＝１０％程度まで少なくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明を実行するに好適な生体物質解析チップの１例を示す図であり、（Ａ）は実施例の生体物質解析チップを示す平面図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図２】（Ａ）は、基板１の上面に蒸着重合で形成された第１のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第２のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させたポリマー薄膜層２１の断面構造を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、ポリマー薄膜層２１の平面構造を示す模式図である。
【図３】基板１の表面に形成されたポリマー薄膜層２１の第三の官能基２６とＤＮＡプローブ３１の５’末端部分３２の官能基３３とが結合する様子を模式的に示す図である。
【図４】（Ａ）−（Ｄ）は、図１−３に示す基板を用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。
【図５】（Ａ）−（Ｄ）は、複数のＤＮＡプローブを同一スポット位置に固定し、各スポット位置でＤＮＡプローブを異なるものとしたＤＮＡマイクロアレイを用いて、ｍＲＮＡを検出する工程を示す図である。
【符号の説明】
【００４５】
１００…生体物質解析チップ、１…ガラス基板、５…樹脂製の壁、２１…ポリマー薄膜層、２２…第１のモノマー部分、２３…第２のモノマー部分、２４…第１のモノマー部分の第１の官能基、２５…第２のモノマー部分の第２の官能基、２６…第２のモノマー部分の側鎖としての第３の官能基、２７…ポリマー層薄膜と基板表面との間の弱い結合、２８…基板のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子の共有結合した状態、３１，９２，９３…ＤＮＡプローブ、３２…ＤＮＡプローブの５’末端部分、３３…ＤＮＡプローブの５’末端部分の官能基、４１…細胞を破砕して得られた試料溶液、４３…ｍＲＮＡ、４５…タンパク質、５３，５４，５５，１１２，１１３…金ナノ粒子、６３，６４，６５…金ナノ粒子で標識したＤＮＡプローブ、１０２，１０３…ｃＤＮＡ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板の一つの表面に所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップであり、前記基板の一つの表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、前記ポリマー層の内、第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に生体物質捕捉用残基を持つ構造であることを特徴とする生体物質解析チップ。
【請求項２】
前記第１のモノマーと第２のモノマーの組み合わせがＮＣＳ−Ｒ１−ＮＣＳ（Ｒ１は任意の残基）の構造を有するジイソシアナートモノマーとＮＨ２−Ｒ２−ＮＨ２（Ｒ２は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーでポリマー層とがポリ尿素ある請求項１記載の生体物質解析チップ。
【請求項３】
前記第１のモノマーと第２のモノマーの組み合わせがＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２あるいはＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ３（Ｒ１〜Ｒ３は任意の残基）の構造を有する酸無水物とＮＨ２−Ｒ５−ＮＨ２（Ｒ５は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーで、ポリマー層がポリアミドないしポリイミドある請求項１または請求項２記載の生体物質解析チップ。
【請求項４】
前記生体物質捕捉用残基がカルボキシル基である請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の細胞構成物質分取チップ。
【請求項５】
前記カルボキシル基にイソチオシアン酸が導入された構造である請求項４記載の細胞構成物質分取チップ。
【請求項６】
前記カルボキシル基にジアミン類を反応させて固体チップ表面にアミンを導入し、前記固体表面に導入したアミンにヂイソチオシアナート類を反応させて固体チップ表面にイソチオシアナート残基を導入した構造の請求項４または請求項５記載の細胞構成物質分取チップ。
【請求項７】
所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップが、前記固体チップ表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、少なくても前記ポリマー層が重合用の前記２つのモノマーの内第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記２つのモノマーの内少なくとも１種のモノマーに生体物質捕捉用残基を持つ構造で、前記生体物質捕捉用残基に所定の生体物質を捕捉するための分子が共有結合で固定した細胞構成物質解析チップと、前記生体物質捕捉用残基に固定した分子に捕捉された所定の生体物質に結合し該所定の生体物質を特定するための標識物を含む生体物質とを有することを特徴とする生体物質解析キット。
【請求項８】
前記標識物が５から３００ｎｍのナノ粒子からなる請求項７記載の生体物質解析キット。
【請求項９】
所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップが、前記固体チップ表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、少なくても前記ポリマー層が重合用の前記２つのモノマーの内第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記２つのモノマーの内少なくとも１種のモノマーに生体物質捕捉用残基を持つ構造で、前記生体物質捕捉用残基に所定の生体物質を捕捉するための分子が共有結合で固定した細胞構成物質解析チップの表面上の空間に生体物質を含む緩衝液を添加する工程、前記細胞構成物質解析チップ表面に存在し共有結合で固定された生体物質を捕捉するための分子で所定の生体物質を捕捉する工程、該所定の生体物質と結合し該所定の生体物質を特定するためのナノ粒子で標識された生体物質を結合する工程、細胞構成物質解析チップの表面に固定されるナノ粒子を計数する工程、からなることを特徴とする生体物質解析法。
【請求項１】
基板と、該基板の一つの表面に所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップであり、前記基板の一つの表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、前記ポリマー層の内、第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーの片方に生体物質捕捉用残基を持つ構造であることを特徴とする生体物質解析チップ。
【請求項２】
前記第１のモノマーと第２のモノマーの組み合わせがＮＣＳ−Ｒ１−ＮＣＳ（Ｒ１は任意の残基）の構造を有するジイソシアナートモノマーとＮＨ２−Ｒ２−ＮＨ２（Ｒ２は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーでポリマー層とがポリ尿素ある請求項１記載の生体物質解析チップ。
【請求項３】
前記第１のモノマーと第２のモノマーの組み合わせがＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２あるいはＲ１−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ２−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−Ｏ＝Ｃ−Ｒ３（Ｒ１〜Ｒ３は任意の残基）の構造を有する酸無水物とＮＨ２−Ｒ５−ＮＨ２（Ｒ５は任意の残基）の構造を有するジアミンモノマーで、ポリマー層がポリアミドないしポリイミドある請求項１または請求項２記載の生体物質解析チップ。
【請求項４】
前記生体物質捕捉用残基がカルボキシル基である請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の細胞構成物質分取チップ。
【請求項５】
前記カルボキシル基にイソチオシアン酸が導入された構造である請求項４記載の細胞構成物質分取チップ。
【請求項６】
前記カルボキシル基にジアミン類を反応させて固体チップ表面にアミンを導入し、前記固体表面に導入したアミンにヂイソチオシアナート類を反応させて固体チップ表面にイソチオシアナート残基を導入した構造の請求項４または請求項５記載の細胞構成物質分取チップ。
【請求項７】
所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップが、前記固体チップ表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、少なくても前記ポリマー層が重合用の前記２つのモノマーの内第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記２つのモノマーの内少なくとも１種のモノマーに生体物質捕捉用残基を持つ構造で、前記生体物質捕捉用残基に所定の生体物質を捕捉するための分子が共有結合で固定した細胞構成物質解析チップと、前記生体物質捕捉用残基に固定した分子に捕捉された所定の生体物質に結合し該所定の生体物質を特定するための標識物を含む生体物質とを有することを特徴とする生体物質解析キット。
【請求項８】
前記標識物が５から３００ｎｍのナノ粒子からなる請求項７記載の生体物質解析キット。
【請求項９】
所定の生体物質の捕捉用残基を有する固体チップが、前記固体チップ表面に２種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層を有し、少なくても前記ポリマー層が重合用の前記２つのモノマーの内第１の官能基を２箇所に有する第１のモノマーと重合用の第２の官能基を２箇所に有する第２のモノマーを実質的に交互に配するように重合した構造で、前記２つのモノマーの内少なくとも１種のモノマーに生体物質捕捉用残基を持つ構造で、前記生体物質捕捉用残基に所定の生体物質を捕捉するための分子が共有結合で固定した細胞構成物質解析チップの表面上の空間に生体物質を含む緩衝液を添加する工程、前記細胞構成物質解析チップ表面に存在し共有結合で固定された生体物質を捕捉するための分子で所定の生体物質を捕捉する工程、該所定の生体物質と結合し該所定の生体物質を特定するためのナノ粒子で標識された生体物質を結合する工程、細胞構成物質解析チップの表面に固定されるナノ粒子を計数する工程、からなることを特徴とする生体物質解析法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−７８５５３（Ｐ２００７−７８５５３Ａ）
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２６８０９２（Ｐ２００５−２６８０９２）
【出願日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【出願人】（０００２３１４６４）株式会社アルバック (1,740)
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【出願人】（０００２３１４６４）株式会社アルバック (1,740)
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