生体画像取得装置
【課題】試料の体温を低下させることなく試料の観察を多方向から同時に短時間に行なうことができる生体イメージング装置を提供する。
【解決手段】透明材質からなる試料ホルダー１１の下面に試料ホルダー１１を加熱するための透明導電膜１１ａが蒸着されている。通電制御部２６は試料ホルダー１１上面の温度を温度センサ２４を介してモニタし、試料ホルダー１１上面の温度が所定の温度となるように電源装置２２を介して透明導電膜１１ａへの通電量を制御する。
【解決手段】透明材質からなる試料ホルダー１１の下面に試料ホルダー１１を加熱するための透明導電膜１１ａが蒸着されている。通電制御部２６は試料ホルダー１１上面の温度を温度センサ２４を介してモニタし、試料ホルダー１１上面の温度が所定の温度となるように電源装置２２を介して透明導電膜１１ａへの通電量を制御する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小動物などの生体試料を対象とする光バイオイメージング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の分子種がどのように分布しているかを画像化する手法は、医学、生物学の重要な研究方法である。これまで細胞レベルでは顕微鏡を使い、蛍光色素を付着した分子プローブや、化学発光を用いる分子プローブを用いて、分子種を画像化する方法がひろく行われて来た。今後は細胞レベルからより大きな臓器やさらに個体に対して、注目している分子種が分布している様子を生きたまま観察する装置が要求されている。例えばマウスなど小動物の個体におけるガン細胞に蛍光プローブが結合するようにして、注目するガン細胞の増殖の様子を画像化し、毎日とか毎週とかの経時変化として観測する技術である。従来の細胞レベル用の測定装置で動物個体内部のガン細胞の増殖を見るためには、動物を殺して所定の部分を染色したり、蛍光体を付けたりして観察することになるが、それでは１つの個体に対する長期間にわたる細胞の増殖を見ることができない。この理由で小動物個体の内部情報の分子種を、個体が生きたままの状態で観察できる装置の開発が望まれている。
【０００３】
近赤外光は、生体内部における光の透過率が比較的良いため、６５０ｎｍ〜９００ｎｍ程度の波長を用いる小動物の観察装置が使われている。しかしながら、従来技術の観察法では同時に多方向の観察ができない。例えば、特定の方向からマウスを観察したとき癌が見えなくても反対側から観察すると癌が検出されるといった場合である。一方向しか観測できない装置を用いるとき、オペレータは止むをえず、マウスを体軸を中心として少しずつ回転した像を撮影することで、近似的に多方向の観察をするような操作で対処するしかない。しかしこの方法では再現性の有るデータは得られず、各方向を同時に検出することができない。
【０００４】
多方向の画像を得る他の方法としては、回転反射鏡を用いて、時分割で多数の角度の画像を順次取得する方法が知られている（特許文献１参照。）。この手法は、試料自身の平行移動はあるものの、試料を回転させることなく、また２次元検出器も回転させることもなく、途中のミラーの回転と試料の位置の変化によって多方向の観察を行う。しかし、回転反射鏡を用いる特許文献１の方法の欠点は、各方向の測定が時分割であるために同時測定ができず、測定に時間を要することに加えて、構造が複雑であることである。そこで、簡便な構造で、かつ多方向の観察を同時に短時間に測定できる生体イメージング装置が提案されている（特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開２００５０２０１６１４
【特許文献２】国際公開２００８／０５９５７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のようなイメージング装置で生体試料の観察を行なう際、試料であるマウスやラットなどの小動物は麻酔状態とされる場合がある。この際、小動物の体温が低下すると、生体内の挙動が本来観察すべき状況における挙動と異なってしまう場合や、小動物を死に至らしめてしまい、同一固体に対する継続的な観察ができなくなる場合がある。そこで、生体試料の近傍にヒータを設けて小動物の体温低下を防ぐことが好ましい。試料を上面のみから観察する生体イメージング装置であれば、試料を載置する試料台にヒータを取り付けるだけですむ。
【０００７】
しかし、試料を多方向から観察する生体イメージング装置では、試料の近傍に金属やセラミック製のヒータを配置したり、試料を載置する試料ホルダーを金属やセラミック製のヒータにしたりすると、試料へ照射する励起光がヒータで遮られたり試料からの蛍光がヒータで遮られて検出器に入射しなかったりするなどの問題が発生する。
【０００８】
そこで本発明は、上記問題に鑑み、試料の体温を低下させることなく試料の観察を多方向から同時に短時間に行なうことができる生体イメージング装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の生体画像取得装置（生体イメージング装置）は、生体試料が載置される試料ホルダーと、試料ホルダー上の試料から放出される光の像を撮影する１つの２次元検出器と、２次元検出器が撮影した画像を表示する画像表示装置と、試料ホルダー上の試料を複数の方向から観測するとともに、試料から放出される各方向の光の画像を２次元検出器に導く導光光学系と、２次元検出器と導光光学系との間に配置され、導光光学系により導かれた複数の画像を２次元検出器上に結像する１つの主結像レンズとを備え、多方向から同時に試料の観察を行なうものである。試料ホルダーは透明の材質であり、試料ホルダーには生体試料を載置するための試料載置面を均一に加熱するための透明導電膜が設けられている。さらに、試料ホルダーの試料載置面又は生体試料の温度を計測する温度センサと、透明導電膜への通電を行なう電源装置が設けられており、電源装置による透明導電膜への通電量は、通電制御部によって試料載置面の温度が所定温度になるように温度センサの計測値に基づいて制御される。
【００１０】
試料から放出される光の一例は、試料に光が照射されたときその光により励起されて試料から放出される蛍光などの光である。試料から放出される光の他の例は、試料に光が照射されなくても試料自身が発光する化学発光や生物発光などの光である。
【００１１】
この生体画像取得装置を試料から放出される光の画像として蛍光画像を取得するものとする場合には、導光光学系の光路間の隙間には蛍光発生のために試料に励起光を照射する励起光学系が配置されているものとすることができる。その励起光学系は励起光源として、レーザダイオード又は発光ダイオードからなる発光素子を備えていることが好ましい。その場合には発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射方向を切り替えることができる。さらに、励起光学系の各励起光源は異なる波長を発生する複数の発光素子とそれぞれの励起光源が付随的に含む不要な波長成分を除去する干渉フィルタとを励起光源ごとに備えたものとすることができる。この場合には、発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射波長も切り替えることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体画像取得装置では、試料ホルダーにその試料載置面を均一に加熱するための透明電極膜を設けるとともに、装置に透明導電膜を通電するための電源装置と試料載置面又は生体試料の温度を計測する温度センサを備え、電源装置による透明導電膜への通電量は試料載置面の温度が所定温度になるように通電制御部が温度センサの計測値に基づいて制御する。これにより、試料ホルダーに載置された生体試料の温度を観測に適した温度に保つことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】一実施例を示す概略斜視図である。
【図２】同実施例において２次元検出器上に結像した画像を示す平面図である。
【図３】同実施例を試料の軸方向からみた状態で示す正面図である。
【図４】同実施例における１つの励起光源を示す斜視図である。
【図５】２次元検出器上の画像から表示装置に変換表示する操作を示す画像の平面図である。
【図６】他の実施例を試料の軸方向からみた状態で示す正面図である。
【図７】同実施例において２次元検出器上に結像した画像を示す平面図である。
【図８】さらに他の実施例において２次元検出器上に結像した画像を示す平面図である。
【図９】さらに他の実施例を示す斜視図である。
【図１０】同実施例において反射鏡に映った試料の画像を結像レンズ側からみて示す展開図である。
【符号の説明】
【００１４】
１０ 生体試料
１１ 試料ホルダー
１１ａ 透明導電膜
１４ ２次元検出器
２０ 光源取付けベース
２２ 電源装置
２４ 温度センサ
２６ 通電制御部
Ｍ２〜Ｍ５，Ｍ２'，Ｒ１〜Ｒ８ 反射鏡
Ｌ 主結像レンズ
Ｌ０〜Ｌ５ 補助結像レンズ
Ｓ１〜Ｓ５ 励起光源
ＦEM 蛍光側フィルタ
ＬＤλ１Ａ，ＬＤλ１Ｂ，ＬＤλ２Ａ，ＬＤλ２Ｂ レーザダイオード
Ｆｅｘλ１Ａ，Ｆｅｘλ１Ｂ，Ｆｅｘλ２Ａ，Ｆｅｘλ２Ｂ 励起光用フィルタ
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（第１の実施例）
(５つの方向の同時観測方法の説明)
５つの方向から同時観測する場合を例として、図１と図３を用いて説明する。まず、化学発光又は生物発光モードの場合を取りあげる。
【００１６】
図１は一実施例の構成を概略的に示したものであり、試料のまわりの５方向を等分割して測定する実施例である。生体試料１０として小動物のマウスを取りあげるが、これに限定されるものではない。試料１０は試料ホルダー１１上に載置されている。試料ホルダー１１上の試料１０から放出される光の像を撮影するために１つの２次元検出器１４が配置されている。２次元検出器１４としては、ＣＣＤ撮像素子やＭＯＳ型イメージセンサなどを使用することができる。２次元検出器１４が撮影した画像を表示するために画像表示装置が接続されているが、図示は省略している。試料ホルダー１１上の試料１０を複数の方向から観測するとともに、試料１０から放出される各方向の光の画像を２次元検出器１４に導くために、反射鏡Ｍ２〜Ｍ５からなる多面反射鏡を含む導光光学系が設けられている。２次元検出器１４と導光光学系との間には導光光学系により導かれた複数の画像を２次元検出器１４上に結像する１つの主結像レンズＬとしてカメラレンズが配置されている。
【００１７】
主結像レンズＬと２次元検出器１４は、試料ホルダー１１上に載置され試料１０の軸（小動物試料の場合は頭から尾に至る体軸）方向に垂直となる１つの方向に配置され、導光光学系の反射鏡Ｍ２〜Ｍ５は試料１０のまわりの５方向を等分割した位置に、試料１０の軸方向と平行な直線を含む面を反射面としてもつように配置されている。
【００１８】
導光光学系が反射鏡Ｍ２〜Ｍ５を含んでいることにより導光光学系は試料１０から主結像レンズＬに至る光路長の異なる光路を含んでいる。そのため主結像レンズＬと導光光学系との間には導光光学系の少なくとも１つの光路上に主結像レンズＬによる２次元検出器１４上での結像を光路長差に応じて補正するための補助結像レンズＬ１〜Ｌ５が配置されている。補助結像レンズＬ１〜Ｌ５は導光光学系のそれぞれの光路の光路長に応じたレンズからなる視野別モザイクレンズである。
【００１９】
試料ホルダー１１は、下面に透明導電膜１１ａ（図３参照）が蒸着されたガラス基板からなり、上面が試料載置面となっている。透明導電膜１１ａは、ＩＴＯ（酸化インジウム・スズ）、酸化亜鉛、酸化スズなどの金属酸化物半導体からなる薄膜であり、可視領域から近赤外領域の波長の光に対して光学的に透明でありながら導電性をもつものである。透明導電膜１１ａは適当な電気抵抗値をもつように帯状のパターンが蛇行した形状や渦巻き状の形状などに形成されている。透明導電膜１１ａは通電することにより発熱し、試料ホルダー１１の温度を高めることができる。透明導電膜１１ａには電源装置２２が接続されている。
【００２０】
試料ホルダー１１の上面温度は通電制御部２６が温度センサ２４を介してモニタし、試料ホルダー１１の上面温度が一定温度（例えば３０℃〜４０℃）を維持するように電源装置２２を介して透明導電膜１１ａへの通電量を制御する。なお、温度センサ２４は、例えば赤外線サーモグラフィカメラなど遠隔的な温度計測が可能なものであってもよく、そのような温度センサで生体試料１０の温度を計測するようにしてもよい。このように試料ホルダー１１の温度を一定温度に維持することで、麻酔下にある生体試料１０の体温低下を防止し、観察すべき条件での細胞の挙動を観察できる。
【００２１】
図３を用いてさらに説明すると、中央に配置した試料１０（Ａ）からの０°方向以外の観測角度７２°，１４４°，２１６°，２８８°の光線は、それぞれ反射鏡Ｍ２〜Ｍ５で反射される結果、反射鏡Ｍ２〜Ｍ５による試料１０の虚像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’ができるから、これらを上部にある結像レンズＬによって共通の２次元検出器１４の上に結像させる。試料１０は例えば小動物のマウスであるが、図３では簡略化のために試料１０を円筒形状の物品として記載している。
【００２２】
結像レンズＬから下方を見るなら、５つの方向の像Ａ，Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’が見えるが、Ａは実像で、その他の４つの像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’は虚像である。それぞれの像Ａ，Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’迄の距離は図３から判るように像Ａ３’，Ａ４’が最も遠く，像Ａ２’，Ａ５’が中間の距離、正面の実像Ａが最も近い。したがって、図３の例では、結像レンズＬの焦点を像Ａ３’，Ａ４’に合わせておくと、そのままでは像Ａ１，Ａ２’，Ａ５’の焦点はぼけるので、補助レンズ（凸レンズ）Ｌ２とＬ５で像Ａ２’とＡ５’の結像を補正し、補助レンズ（凸レンズ）Ｌ１で像Ａの結像を補正する。
【００２３】
２次元検出器１４上には、図２のような像の順番に結像する。即ち右端から、７２°，１４４°，０°（中央），２１６°，２８８°の像の順番になる。２次元検出器１４上にできるこれらの像は、像Ａ，Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’からレンズＬ迄の距離に応じて前述のように角度毎に倍率の相違があり、かつ像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’の像は左右が反転した像になる。この結果、図２のような像ができていることがわかる。
【００２４】
結像レンズＬの典型的な焦点距離が１５〜２０ｍｍ程度（一例として、結像レンズＬから試料１０の虚像Ａ３’までの距離を３００ｍｍとし、試料１０が２次元検出器１４に結像する倍率を１５分の１とすれば、結像レンズＬの中心と２次元検出器１４との距離は３００ｍｍに倍率１５分の１を掛けた２０ｍｍとなるから、レンズＬの焦点距離も２０ｍｍ弱となる）である。これに対し、補助レンズＬ１，Ｌ２，Ｌ５の典型的な焦点距離を計算すると５００ｍｍから１５００ｍｍ程度となる。なぜなら、補助レンズＬ１は、試料１０の位置（例えばレンズＬからの距離が２００ｍｍ：この距離をａとする）から出る光を虚像Ａ３’の距離３００ｍｍ（この距離をｂとする）から出るように変換すればよいので、補助レンズＬ１の焦点距離をｆとするとき、簡単な結像の式、（１／ｆ）＝（１／ａ）−（１／ｂ）よりｆが求まり、ｆ＝６００ｍｍとなる。一方Ｌ２，Ｌ５は虚像Ａ２’の位置約２５０ｍｍを虚像Ａ３’の距離３００ｍｍから出るように変換するので、焦点距離はいっそう長くなり、同様に計算すると、１５００ｍｍとなる。このようにＬ１，Ｌ２，Ｌ５はレンズＬに比べれば長い焦点距離、即ち極端に弱い曲率のレンズで十分に機能する。
【００２５】
なおこの実施例では、最も遠い像Ａ３’とＡ４’にレンズＬの焦点を合わせたので、像Ａ３’とＡ４’に対する補助レンズは不要である。あるいは補助レンズの位置に補助レンズに替えて単に平行平面ガラス板を配置してもよい。
【００２６】
また、結像レンズＬの焦点を、中間の像Ａ２’とＡ５’付近に合わせておき、像Ａ３’、Ａ４’に対し焦点距離が１０００ｍｍ位と長い弱い凹レンズ、正面の実像Ａに対しては焦点距離が１０００ｍｍ位の弱い凸レンズを使うように変形することも可能である。
【００２７】
このように簡単な構造で可動部分なしに、異なる角度からの観測像を一度に共通の２次元検出器１４上に結像することができる。
【００２８】
（蛍光測定についての実施例の説明）
上述の説明は、化学発光又は生物発光モードの場合であって、試料中の分子プローブ自身が発光するときに該当する。次に分子プローブが励起光を受けたとき蛍光を生じることで発光する系、即ち蛍光モードへの利用法について説明する。
【００２９】
蛍光モードの場合、本発明の多面鏡の方法は以下のように蛍光用励起光源のを配置する場所が簡単に確保できる利点を有する。この効果を再び図３を用いて説明する。図３は立面図で図１では省略している蛍光用励起光源Ｓ１〜Ｓ５を記載してある。これら５つの光源により試料１０の周囲５つの角度から試料を照らしている。この際に好都合な点は、反射鏡Ｍ２〜Ｍ５の隙間にちょうど励起光源Ｓ１〜Ｓ５を配置する位置が確保できることである。
【００３０】
この５方向等分割測定の例では、試料１０の実像Ａ又はその虚像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’が７２°毎にできており、試料から直接又は反射鏡Ｍ２〜Ｍ５の中心（又は正面にレンズＬ１〜Ｌ５がある場合のそれらのレンズの中心）に向かう主光線に対して、試料１０を照射する励起光の向きは、プラス３６°又はマイナス３６°の斜めの方向になっている。６等分の場合この角度はプラス・マイナス３０°、７等分にすれば、プラス・マイナスス２５．７１４°になり、いずれも蛍光を測定するのに適当な照射角度になる。
【００３１】
通常、蛍光測定では、検出したい分子種とか腫瘍特異性を有する蛍光プローブの吸収波長にあわせて、励起光Ｓ１〜Ｓ５の波長を選択する。結像レンズＬの直前に蛍光側フィルタＦEMが配置されており、励起光によって試料１０から発光する蛍光波長成分のうち、蛍光側フィルタＦEMの透過域に入るものだけを検出するようになっている。励起光の波長成分のうち、波長が変わることなくそのまま散乱される成分が漏れて検出されるとバックグランド光となって測定の障害になるから、励起光の波長成分を全く透過しないように励起光源Ｓ１〜Ｓ５からの波長と蛍光側フィルタＦEMの透過特性を選ぶことが重要である。
【００３２】
励起光源Ｓ１〜Ｓ５として例えば半導体レーザを使うなら、それぞれの電源回路のオン・オフの切替えにより必要な光源だけを自由に点灯したり消灯したりすることができる。
【００３３】
ここで、蛍光励起を行いながら全周を複数の角度から観測するには、励起光の点灯／消灯についていくつかの選択が可能である。以下、元に戻って５方向観察の例で説明する。
【００３４】
第１の選択は、励起光源Ｓ１〜Ｓ５のすべてを同時に点灯させるものである。即ち試料１０を全周から常時照射した状態で、図２のように２次元検出器１４上に現れる５つの画像を撮影して記録するものである。
【００３５】
第２の選択は、励起光源Ｓ１〜Ｓ５のうち、角度的に隣り合う２つの光源（Ｓ１，Ｓ２）を点灯し残りの３つを消灯して２次元検出器１４により５つの画像を撮影し、次に他の隣り合う２つの光源（Ｓ２，Ｓ３）を点灯し残りの３つを消灯して５つの画像を撮影というように、順次ずらし、最後に隣り合う２つの光源（Ｓ５，Ｓ１）を点灯し残りの３つを消灯して５つの画像を撮影する。こうして５枚の画像を撮影すると、試料から見るとき、前から励起光を照らすときの蛍光画像だけでなく、後ろからだけとか、横からだけ照らすときの画像が得られるから、動物からの５方向の画像それぞれに対して各５つの励起方向の画像を得るから合計２５枚の画像を５回の露光で得ることができる。
【００３６】
そして、２５枚の画像から動物の体内の浅い位置に発光源があるか、深い位置に発光原があるかを推定できる。即ち浅い位置の発光源なら、２５枚のどれかの画像中の被写体の小さい部分が強く光ることが推測されるのに対し、深い位置の発光源ならば２５枚のどの画像にも拡散した発光分布しか写らないことが推測されるからである。また、適当なアルゴリズムを使うことで、逆演算によって元の蛍光物質の分布を画像化することも可能となる。
【００３７】
第３の選択は、励起光源Ｓ１〜Ｓ５のうち、１つを点灯し残りを消灯して５つの画像を撮影する操作を順次切り替えていって５回の露光を行う方法も可能である。これは第２の選択に近いが、重ね合わせが成り立てば第３の選択と第２の選択が等価になる。この場合は第２の選択の方が励起光が強いのでＳＮ的には有利である。反対に第３の選択と第２の選択が等価でなければ、第３の選択と第２の選択のすべてを実施し、１０回のデータ５０枚から計算することもできる。この他にも必要に応じた多数の点灯の組合わせが考えられる。
【００３８】
重要なポイントは、本発明の蛍光励起方法は可動部分がなくて単に励起光の点滅だけで、試料の前横又は後ろから励起する励起方法を自在に設定できることである。こうして蛍光モードの場合でも、試料の全周にわたる多方向から励起した観測画像を簡単に得られることである。
【００３９】
（蛍光励起用光源の実施例のさらに詳細な説明）
図３において、光源Ｓ１〜Ｓ５として示した蛍光励起用光源のさらに具体的な実施例を図４によって説明する。
【００４０】
励起光源の要件は、（１）目的とする蛍光色素を励起する適切な波長の光を発生できること、（２）蛍光を検出するフィルタ（図１のフィルタＦEM）の透過波長域の光を全く含まないこと（すなわち、波長としては励起側と蛍光側が完全に遮断していること）、（３）試料の小動物の全体を極力均一に照射できること、かつ（４）必要な光源の位置と波長の選択を自在に行えることの４点である。
【００４１】
図４は、図３に示されている光源Ｓ１〜Ｓ５の内のどれか１つの構成例であって、光源取付けベース２０に４つのレーザダイオードＬＤλ１Ａ，ＬＤλ２Ａ，ＬＤλ１Ｂ，ＬＤλ２Ｂが配置されている。光源取付けベース２０は小動物の体軸に平行な方向に長く伸びた板状のホルダーで、これら４つのレーザダイオードは小動物の体軸の方向に並んでいる。この実施例では４つのレーザダイオードの内、２つＬＤλ１Ａ，ＬＤλ１Ｂは同じ波長（例えば７８０ｎｍ）を発振する。また残り２つのレーザダイオードＬＤλ２Ａ、ＬＤλ２Ｂは別の波長（例えば６９０ｎｍ）を発振する。同じ波長を発振するレーザダイオードどおしは互いに離れて配置されている。
【００４２】
さらに４つのレーザダイオードそれぞれに励起光用のフィルタＦｅｘλ１Ａ，Ｆｅｘλ２Ａ，Ｆｅｘλ１Ｂ，Ｆｅｘλ２Ｂが重ねて取り付けてあり、レーザダイオードとフィルタのそれぞれの対（ＬＤλ１ＡとＦｅｘλ１Ａ），（ＬＤλ２ＡとＦｅｘλ２Ａ），（ＬＤλ１ＢとＦｅｘλ１Ｂ），（ＬＤλ２ＢとＦｅｘλ２Ｂ）がそれぞれの励起光を試料に向けて照射する。通常半導体レーザは１つの固定波長を発振するので、単独に使うだけでも励起機能を十分有すると考えられがちであるが、詳細にみると発振波長の傍に弱いすそ野の発光波長をもつことが多く、すそ野の発光が漏れ光となる。そこでレーザダイオード単体にそれぞれに対応する干渉フィルタをさらに組み合わせることで、励起光中に含まれる蛍光と重なる漏れ光の成分を極めて微少なレベルに軽減する効果が有ることが判った。この構造を有する光源５組を試料の周囲に配置しておき、５つの組の各４つのレーザダイオードの必要なものを単に電気的な選択で点灯することで、光源Ｓ１からＳ５の励起位置の選択と励起波長の選択を自在に行うことができる。
【００４３】
なおこの例では各光源Ｓ１〜Ｓ５が２つの波長を備えている例を示したが、スペースが許す範囲で、もっと多数の波長のレーザダイオードを並べても良いのは当然である。またレーザダイオードと励起光用のフィルタは互いに固定されているから、レーザダイオードの発光が必ずフィルタを通過し、フィルタ以外の隙間をすり抜ける漏れ光を生じないよう、図には示さないが適当な光遮断部品で覆うことができる。
【００４４】
励起側を上記のように構成しておけば、励起側と蛍光側の波長選択の方法は次のようになる。５つの励起光源のどの組合わせを使うかの選択と波長の選択を電気的な点灯方式で決定するとともに、図１に示す蛍光側フィルタＦEMの選択は、複数のフィルタＦEMを回転円板に取り付けておいて、切り替えることで行う。このようにして、蛍光側フィルタＦEMの円板の切替え機構だけが機械的な可動部として残るけれども、その他はすべて可動部分がなく、多方向の蛍光励起・検出方法としては極めて簡単な切替え方法を実現できる。
【００４５】
（２次元検出器の画像から表示装置の画像への変換）
共通の２次元検出器１４上にできる、異なる角度からの観測像は、倍率が異なっていること、ミラーによる反転の有るものと無いものが混在していること、角度の順番がとびとびになっていること、の問題がある。しかし、図５のように簡単な変換によって最終の表示画面では倍率、反転、順序の入れ替えをすませた自然な表示にすることが可能である。
【００４６】
また、生物発光、蛍光情報による分子種画像とは別に、同じ２次元検出器１４を用いて外形写真を写しておき、外形写真に分子種イメージングを重ねて表示することが行われている。このための外形写真も同じ倍率、反転、順序の入れ替えが起こっているから、図５と同様の手順の変換を実施することで、多方向から見た外形写真と分子種イメージングを重ねたものを自然な順序で表示することができる。
【００４７】
（第１の実施例についての変形実施例の説明）
等分割５方向測定の例について上記によって説明した。次に等分割４面測定について、図６、図７、図８を用いて説明する。等分割４面測定では、正面（０°）、左面（９０°）、裏面（１８０°）、右面（２７０°）というように観測方向をイメージしやすいので、人間の感覚に合いやすい利点がある。
【００４８】
図６は等分割４面測定の一実施例で、正面（０°）の横にミラーＭ１とミラーＭ３を配置し、左面（９０°）と右面（２７０°）用に用いている。残りの裏面（１８０°）に対しては、ミラーＭ２’とミラーＭ２によって合計２回反射させた像を、左面（９０°）の横に作っている。したがって２次元検出器１４上の像の様子は図７のようになっている。即ち正面（０°）の横に少し小さく右面（２７０°）と左面（９０°）が並び、右端にかなり小さい裏面（１８０°）が配列している。
【００４９】
図６に戻って補助レンズを説明する。この例では左面（９０°）と右面（２７０°）に対してレンズＬの焦点を合わせ（補助レンズ不要）、それより近い正面（０°）用には凸レンズＬ０を、最も遠い裏面（１８０°）に対しては凹レンズを使っている。蛍光用励起光源はミラーの配置との関連で必ずしも９０°間隔（測定方向のプラス・マイナス４５°）でなく、正面と裏面がプラス・マイナス４０°、左面（９０°）と右面（２７０°）がプラス・マイナス５０°程度になっている。また、励起光源と試料１０との距離は、光源Ｓ２，Ｓ３が、光源Ｓ１，Ｓ４より近くに配置されている。これらは必ずしも等しい必要はなく、ミラーなどの部品の配置に応じて変形した配置が可能である。
【００５０】
図８はさらに異なる４面測定の実施例である。ここでは２次元検出器１４上の画像に対して、裏面１８０°の像を「０°、９０°、２７０°の列」とは別の列になるように、ミラーＭ２’の曲げ方を変えている。即ち、ミラーＭ２’を、０°，９０°，２７０°の光線が作る面とは垂直の方向に曲げる向きに配置し、Ｍ２はそこからレンズの方に向ければよい。こうすれば、図８のように０°，９０°，２７０°とは垂直にずれた位置に、１つだけ１８０°の像ができる。２次元検出器１４の形が正方形に近ければ、実用上図８のように２次元検出器１４を使っても大きな不都合はなく、蛍光光源の配置などの自由度が増す利点がある。
【００５１】
以上、図６、図７、図８によって、導光光学系はミラーが１枚だけでなくても色々な変形が可能であって、最終的に２次元検出器１４の上に試料の像を沢山導くことができればよいこと、それによって光路長が変わっても、補助レンズを適宜挿入し結像条件の補正が容易にできることを示した。
【００５２】
（第２の実施例）
第２の実施例を図９（鳥瞰図）と図１０とを用いて説明する。前述の第１の実施例では結像レンズＬを試料１０の小動物の「体軸方向に垂直な１つの方向」においたが、この第２の実施例では、図９のように小動物の「体軸方向」に結像レンズＬと２次元検出器１０を配する。そして、体軸方向を中心とする傘のように反射鏡を配置している。この図では、８枚の反射鏡Ｒ１〜Ｒ８を傘のように配置したので、４５°ずつ異なる８つの方向からの撮影を同時に行うことができる。
【００５３】
図１０はレンズＬから見たときに反射鏡Ｒ１〜Ｒ８に映る試料１０の小動物の像の概念を表すものである。放射状の画像が２次元検出器１４から読みとれるから、データ変換によって８つの像を並べ直し、観察しやすいように図を配置することができる。この実施例ではレンズからの距離が各方向に対して等しいので、焦点補正に使う補助レンズは不要である。ただ、この方法では第１の実施例に比べて試料１０の像の面積が２次元検出器１４の面積に占める割合が小さくなりやすい反面、焦点補正レンズが要らないという利点を有する。
【００５４】
第１、第２の実施例につての発明の効果を纏めると以下のようになる。
１）１つの２次元検出器を用いて、同時多方向の観察ができる。
２）簡単に多方向の観察ができるので、小動物の裏側に癌ができているような場合でも見落とすことがない。
３）蛍光測定の場合に、励起光源を配置する場所が、多方向測定用の反射鏡の隙間に矛盾無く確保できている。即ち蛍光の場合でも多方向の観察が容易にできる。
４）蛍光測定の場合に、励起光源を半導体レーザ又はＬＥＤとフィルタの組み合わせたもので構成することで、光源の点滅によって可動機構なしに励起光源の照射方向と波長を選択できる。
５）蛍光測定で励起光の位置を切り変えながら、多方向の同時画像取得ができるので、生体内蛍光イメージング再構成の基礎データを得ることができる。すなわち、例えば正面（０°方向）の画像でも照射を前側、横、後と、図の例では５つの方向に変えたものが得られる。
【００５５】
（第３の実施例）
第３の実施例は試料と検出系の相対関係を少しずつ傾けて、連続角に近い角度毎のデータを得る手法である。専用の図は省略し、図３を参照して説明する。
【００５６】
図３において、中心の試料（小動物）１０を１つのホルダーに、それ以外のミラーや光源、検出器、レンズをホルダーとは別の保持機構に一体として取り付け、試料１０に対して保持機構を相対的に回転できるようにする。例えば５等分の場合、試料１０と保持機構を相対回転を全周の５分の１（７２°）の範囲にわたって行えるようにする。その７２°の範囲を、例えば１２°毎に測定するようにすれば、６回の測定を行うことにより５等分をさらに６等分した全周の３０等分の画像を得ることができる。相対回転は全周回転させる必要がなく、僅かの角度の相対回転ですむ。試料を１８０°とか３６０°回転することは動物に大きな負担を与える上に、ホルダーに保持するのさえ難しい。また保持機構を３６０°回転することはケーブルの処理とか機械構造が複雑になる。これに対し、例えば試料１０を載置したホルダーを１／５回転（７２°）静かに回すのは、動物にとって大きな障害にならないし、反対に保持機構の方を７２°回すのも容易である。こうして測定方向の分割ピッチをミラー分割数の何分の１といった、より小さいピッチで行う実施例３の方法は比較的容易に実現でき、かつ有用であることがわかる。
【００５７】
第３の実施例の効果として次のものをあげることができる。
１）同時に５枚などの撮影をするので、時分割ではあっても同時測定数の倍数（たとえは５倍）高速である。
２）試料（又は検出器は）の回転は高々１回転の５分の１といった、小さい角度でよいので、構造が簡単である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小動物などの生体試料を対象とする光バイオイメージング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の分子種がどのように分布しているかを画像化する手法は、医学、生物学の重要な研究方法である。これまで細胞レベルでは顕微鏡を使い、蛍光色素を付着した分子プローブや、化学発光を用いる分子プローブを用いて、分子種を画像化する方法がひろく行われて来た。今後は細胞レベルからより大きな臓器やさらに個体に対して、注目している分子種が分布している様子を生きたまま観察する装置が要求されている。例えばマウスなど小動物の個体におけるガン細胞に蛍光プローブが結合するようにして、注目するガン細胞の増殖の様子を画像化し、毎日とか毎週とかの経時変化として観測する技術である。従来の細胞レベル用の測定装置で動物個体内部のガン細胞の増殖を見るためには、動物を殺して所定の部分を染色したり、蛍光体を付けたりして観察することになるが、それでは１つの個体に対する長期間にわたる細胞の増殖を見ることができない。この理由で小動物個体の内部情報の分子種を、個体が生きたままの状態で観察できる装置の開発が望まれている。
【０００３】
近赤外光は、生体内部における光の透過率が比較的良いため、６５０ｎｍ〜９００ｎｍ程度の波長を用いる小動物の観察装置が使われている。しかしながら、従来技術の観察法では同時に多方向の観察ができない。例えば、特定の方向からマウスを観察したとき癌が見えなくても反対側から観察すると癌が検出されるといった場合である。一方向しか観測できない装置を用いるとき、オペレータは止むをえず、マウスを体軸を中心として少しずつ回転した像を撮影することで、近似的に多方向の観察をするような操作で対処するしかない。しかしこの方法では再現性の有るデータは得られず、各方向を同時に検出することができない。
【０００４】
多方向の画像を得る他の方法としては、回転反射鏡を用いて、時分割で多数の角度の画像を順次取得する方法が知られている（特許文献１参照。）。この手法は、試料自身の平行移動はあるものの、試料を回転させることなく、また２次元検出器も回転させることもなく、途中のミラーの回転と試料の位置の変化によって多方向の観察を行う。しかし、回転反射鏡を用いる特許文献１の方法の欠点は、各方向の測定が時分割であるために同時測定ができず、測定に時間を要することに加えて、構造が複雑であることである。そこで、簡便な構造で、かつ多方向の観察を同時に短時間に測定できる生体イメージング装置が提案されている（特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開２００５０２０１６１４
【特許文献２】国際公開２００８／０５９５７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のようなイメージング装置で生体試料の観察を行なう際、試料であるマウスやラットなどの小動物は麻酔状態とされる場合がある。この際、小動物の体温が低下すると、生体内の挙動が本来観察すべき状況における挙動と異なってしまう場合や、小動物を死に至らしめてしまい、同一固体に対する継続的な観察ができなくなる場合がある。そこで、生体試料の近傍にヒータを設けて小動物の体温低下を防ぐことが好ましい。試料を上面のみから観察する生体イメージング装置であれば、試料を載置する試料台にヒータを取り付けるだけですむ。
【０００７】
しかし、試料を多方向から観察する生体イメージング装置では、試料の近傍に金属やセラミック製のヒータを配置したり、試料を載置する試料ホルダーを金属やセラミック製のヒータにしたりすると、試料へ照射する励起光がヒータで遮られたり試料からの蛍光がヒータで遮られて検出器に入射しなかったりするなどの問題が発生する。
【０００８】
そこで本発明は、上記問題に鑑み、試料の体温を低下させることなく試料の観察を多方向から同時に短時間に行なうことができる生体イメージング装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の生体画像取得装置（生体イメージング装置）は、生体試料が載置される試料ホルダーと、試料ホルダー上の試料から放出される光の像を撮影する１つの２次元検出器と、２次元検出器が撮影した画像を表示する画像表示装置と、試料ホルダー上の試料を複数の方向から観測するとともに、試料から放出される各方向の光の画像を２次元検出器に導く導光光学系と、２次元検出器と導光光学系との間に配置され、導光光学系により導かれた複数の画像を２次元検出器上に結像する１つの主結像レンズとを備え、多方向から同時に試料の観察を行なうものである。試料ホルダーは透明の材質であり、試料ホルダーには生体試料を載置するための試料載置面を均一に加熱するための透明導電膜が設けられている。さらに、試料ホルダーの試料載置面又は生体試料の温度を計測する温度センサと、透明導電膜への通電を行なう電源装置が設けられており、電源装置による透明導電膜への通電量は、通電制御部によって試料載置面の温度が所定温度になるように温度センサの計測値に基づいて制御される。
【００１０】
試料から放出される光の一例は、試料に光が照射されたときその光により励起されて試料から放出される蛍光などの光である。試料から放出される光の他の例は、試料に光が照射されなくても試料自身が発光する化学発光や生物発光などの光である。
【００１１】
この生体画像取得装置を試料から放出される光の画像として蛍光画像を取得するものとする場合には、導光光学系の光路間の隙間には蛍光発生のために試料に励起光を照射する励起光学系が配置されているものとすることができる。その励起光学系は励起光源として、レーザダイオード又は発光ダイオードからなる発光素子を備えていることが好ましい。その場合には発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射方向を切り替えることができる。さらに、励起光学系の各励起光源は異なる波長を発生する複数の発光素子とそれぞれの励起光源が付随的に含む不要な波長成分を除去する干渉フィルタとを励起光源ごとに備えたものとすることができる。この場合には、発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射波長も切り替えることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体画像取得装置では、試料ホルダーにその試料載置面を均一に加熱するための透明電極膜を設けるとともに、装置に透明導電膜を通電するための電源装置と試料載置面又は生体試料の温度を計測する温度センサを備え、電源装置による透明導電膜への通電量は試料載置面の温度が所定温度になるように通電制御部が温度センサの計測値に基づいて制御する。これにより、試料ホルダーに載置された生体試料の温度を観測に適した温度に保つことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】一実施例を示す概略斜視図である。
【図２】同実施例において２次元検出器上に結像した画像を示す平面図である。
【図３】同実施例を試料の軸方向からみた状態で示す正面図である。
【図４】同実施例における１つの励起光源を示す斜視図である。
【図５】２次元検出器上の画像から表示装置に変換表示する操作を示す画像の平面図である。
【図６】他の実施例を試料の軸方向からみた状態で示す正面図である。
【図７】同実施例において２次元検出器上に結像した画像を示す平面図である。
【図８】さらに他の実施例において２次元検出器上に結像した画像を示す平面図である。
【図９】さらに他の実施例を示す斜視図である。
【図１０】同実施例において反射鏡に映った試料の画像を結像レンズ側からみて示す展開図である。
【符号の説明】
【００１４】
１０ 生体試料
１１ 試料ホルダー
１１ａ 透明導電膜
１４ ２次元検出器
２０ 光源取付けベース
２２ 電源装置
２４ 温度センサ
２６ 通電制御部
Ｍ２〜Ｍ５，Ｍ２'，Ｒ１〜Ｒ８ 反射鏡
Ｌ 主結像レンズ
Ｌ０〜Ｌ５ 補助結像レンズ
Ｓ１〜Ｓ５ 励起光源
ＦEM 蛍光側フィルタ
ＬＤλ１Ａ，ＬＤλ１Ｂ，ＬＤλ２Ａ，ＬＤλ２Ｂ レーザダイオード
Ｆｅｘλ１Ａ，Ｆｅｘλ１Ｂ，Ｆｅｘλ２Ａ，Ｆｅｘλ２Ｂ 励起光用フィルタ
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（第１の実施例）
(５つの方向の同時観測方法の説明)
５つの方向から同時観測する場合を例として、図１と図３を用いて説明する。まず、化学発光又は生物発光モードの場合を取りあげる。
【００１６】
図１は一実施例の構成を概略的に示したものであり、試料のまわりの５方向を等分割して測定する実施例である。生体試料１０として小動物のマウスを取りあげるが、これに限定されるものではない。試料１０は試料ホルダー１１上に載置されている。試料ホルダー１１上の試料１０から放出される光の像を撮影するために１つの２次元検出器１４が配置されている。２次元検出器１４としては、ＣＣＤ撮像素子やＭＯＳ型イメージセンサなどを使用することができる。２次元検出器１４が撮影した画像を表示するために画像表示装置が接続されているが、図示は省略している。試料ホルダー１１上の試料１０を複数の方向から観測するとともに、試料１０から放出される各方向の光の画像を２次元検出器１４に導くために、反射鏡Ｍ２〜Ｍ５からなる多面反射鏡を含む導光光学系が設けられている。２次元検出器１４と導光光学系との間には導光光学系により導かれた複数の画像を２次元検出器１４上に結像する１つの主結像レンズＬとしてカメラレンズが配置されている。
【００１７】
主結像レンズＬと２次元検出器１４は、試料ホルダー１１上に載置され試料１０の軸（小動物試料の場合は頭から尾に至る体軸）方向に垂直となる１つの方向に配置され、導光光学系の反射鏡Ｍ２〜Ｍ５は試料１０のまわりの５方向を等分割した位置に、試料１０の軸方向と平行な直線を含む面を反射面としてもつように配置されている。
【００１８】
導光光学系が反射鏡Ｍ２〜Ｍ５を含んでいることにより導光光学系は試料１０から主結像レンズＬに至る光路長の異なる光路を含んでいる。そのため主結像レンズＬと導光光学系との間には導光光学系の少なくとも１つの光路上に主結像レンズＬによる２次元検出器１４上での結像を光路長差に応じて補正するための補助結像レンズＬ１〜Ｌ５が配置されている。補助結像レンズＬ１〜Ｌ５は導光光学系のそれぞれの光路の光路長に応じたレンズからなる視野別モザイクレンズである。
【００１９】
試料ホルダー１１は、下面に透明導電膜１１ａ（図３参照）が蒸着されたガラス基板からなり、上面が試料載置面となっている。透明導電膜１１ａは、ＩＴＯ（酸化インジウム・スズ）、酸化亜鉛、酸化スズなどの金属酸化物半導体からなる薄膜であり、可視領域から近赤外領域の波長の光に対して光学的に透明でありながら導電性をもつものである。透明導電膜１１ａは適当な電気抵抗値をもつように帯状のパターンが蛇行した形状や渦巻き状の形状などに形成されている。透明導電膜１１ａは通電することにより発熱し、試料ホルダー１１の温度を高めることができる。透明導電膜１１ａには電源装置２２が接続されている。
【００２０】
試料ホルダー１１の上面温度は通電制御部２６が温度センサ２４を介してモニタし、試料ホルダー１１の上面温度が一定温度（例えば３０℃〜４０℃）を維持するように電源装置２２を介して透明導電膜１１ａへの通電量を制御する。なお、温度センサ２４は、例えば赤外線サーモグラフィカメラなど遠隔的な温度計測が可能なものであってもよく、そのような温度センサで生体試料１０の温度を計測するようにしてもよい。このように試料ホルダー１１の温度を一定温度に維持することで、麻酔下にある生体試料１０の体温低下を防止し、観察すべき条件での細胞の挙動を観察できる。
【００２１】
図３を用いてさらに説明すると、中央に配置した試料１０（Ａ）からの０°方向以外の観測角度７２°，１４４°，２１６°，２８８°の光線は、それぞれ反射鏡Ｍ２〜Ｍ５で反射される結果、反射鏡Ｍ２〜Ｍ５による試料１０の虚像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’ができるから、これらを上部にある結像レンズＬによって共通の２次元検出器１４の上に結像させる。試料１０は例えば小動物のマウスであるが、図３では簡略化のために試料１０を円筒形状の物品として記載している。
【００２２】
結像レンズＬから下方を見るなら、５つの方向の像Ａ，Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’が見えるが、Ａは実像で、その他の４つの像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’は虚像である。それぞれの像Ａ，Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’迄の距離は図３から判るように像Ａ３’，Ａ４’が最も遠く，像Ａ２’，Ａ５’が中間の距離、正面の実像Ａが最も近い。したがって、図３の例では、結像レンズＬの焦点を像Ａ３’，Ａ４’に合わせておくと、そのままでは像Ａ１，Ａ２’，Ａ５’の焦点はぼけるので、補助レンズ（凸レンズ）Ｌ２とＬ５で像Ａ２’とＡ５’の結像を補正し、補助レンズ（凸レンズ）Ｌ１で像Ａの結像を補正する。
【００２３】
２次元検出器１４上には、図２のような像の順番に結像する。即ち右端から、７２°，１４４°，０°（中央），２１６°，２８８°の像の順番になる。２次元検出器１４上にできるこれらの像は、像Ａ，Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’からレンズＬ迄の距離に応じて前述のように角度毎に倍率の相違があり、かつ像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’の像は左右が反転した像になる。この結果、図２のような像ができていることがわかる。
【００２４】
結像レンズＬの典型的な焦点距離が１５〜２０ｍｍ程度（一例として、結像レンズＬから試料１０の虚像Ａ３’までの距離を３００ｍｍとし、試料１０が２次元検出器１４に結像する倍率を１５分の１とすれば、結像レンズＬの中心と２次元検出器１４との距離は３００ｍｍに倍率１５分の１を掛けた２０ｍｍとなるから、レンズＬの焦点距離も２０ｍｍ弱となる）である。これに対し、補助レンズＬ１，Ｌ２，Ｌ５の典型的な焦点距離を計算すると５００ｍｍから１５００ｍｍ程度となる。なぜなら、補助レンズＬ１は、試料１０の位置（例えばレンズＬからの距離が２００ｍｍ：この距離をａとする）から出る光を虚像Ａ３’の距離３００ｍｍ（この距離をｂとする）から出るように変換すればよいので、補助レンズＬ１の焦点距離をｆとするとき、簡単な結像の式、（１／ｆ）＝（１／ａ）−（１／ｂ）よりｆが求まり、ｆ＝６００ｍｍとなる。一方Ｌ２，Ｌ５は虚像Ａ２’の位置約２５０ｍｍを虚像Ａ３’の距離３００ｍｍから出るように変換するので、焦点距離はいっそう長くなり、同様に計算すると、１５００ｍｍとなる。このようにＬ１，Ｌ２，Ｌ５はレンズＬに比べれば長い焦点距離、即ち極端に弱い曲率のレンズで十分に機能する。
【００２５】
なおこの実施例では、最も遠い像Ａ３’とＡ４’にレンズＬの焦点を合わせたので、像Ａ３’とＡ４’に対する補助レンズは不要である。あるいは補助レンズの位置に補助レンズに替えて単に平行平面ガラス板を配置してもよい。
【００２６】
また、結像レンズＬの焦点を、中間の像Ａ２’とＡ５’付近に合わせておき、像Ａ３’、Ａ４’に対し焦点距離が１０００ｍｍ位と長い弱い凹レンズ、正面の実像Ａに対しては焦点距離が１０００ｍｍ位の弱い凸レンズを使うように変形することも可能である。
【００２７】
このように簡単な構造で可動部分なしに、異なる角度からの観測像を一度に共通の２次元検出器１４上に結像することができる。
【００２８】
（蛍光測定についての実施例の説明）
上述の説明は、化学発光又は生物発光モードの場合であって、試料中の分子プローブ自身が発光するときに該当する。次に分子プローブが励起光を受けたとき蛍光を生じることで発光する系、即ち蛍光モードへの利用法について説明する。
【００２９】
蛍光モードの場合、本発明の多面鏡の方法は以下のように蛍光用励起光源のを配置する場所が簡単に確保できる利点を有する。この効果を再び図３を用いて説明する。図３は立面図で図１では省略している蛍光用励起光源Ｓ１〜Ｓ５を記載してある。これら５つの光源により試料１０の周囲５つの角度から試料を照らしている。この際に好都合な点は、反射鏡Ｍ２〜Ｍ５の隙間にちょうど励起光源Ｓ１〜Ｓ５を配置する位置が確保できることである。
【００３０】
この５方向等分割測定の例では、試料１０の実像Ａ又はその虚像Ａ２’，Ａ３’，Ａ４’，Ａ５’が７２°毎にできており、試料から直接又は反射鏡Ｍ２〜Ｍ５の中心（又は正面にレンズＬ１〜Ｌ５がある場合のそれらのレンズの中心）に向かう主光線に対して、試料１０を照射する励起光の向きは、プラス３６°又はマイナス３６°の斜めの方向になっている。６等分の場合この角度はプラス・マイナス３０°、７等分にすれば、プラス・マイナスス２５．７１４°になり、いずれも蛍光を測定するのに適当な照射角度になる。
【００３１】
通常、蛍光測定では、検出したい分子種とか腫瘍特異性を有する蛍光プローブの吸収波長にあわせて、励起光Ｓ１〜Ｓ５の波長を選択する。結像レンズＬの直前に蛍光側フィルタＦEMが配置されており、励起光によって試料１０から発光する蛍光波長成分のうち、蛍光側フィルタＦEMの透過域に入るものだけを検出するようになっている。励起光の波長成分のうち、波長が変わることなくそのまま散乱される成分が漏れて検出されるとバックグランド光となって測定の障害になるから、励起光の波長成分を全く透過しないように励起光源Ｓ１〜Ｓ５からの波長と蛍光側フィルタＦEMの透過特性を選ぶことが重要である。
【００３２】
励起光源Ｓ１〜Ｓ５として例えば半導体レーザを使うなら、それぞれの電源回路のオン・オフの切替えにより必要な光源だけを自由に点灯したり消灯したりすることができる。
【００３３】
ここで、蛍光励起を行いながら全周を複数の角度から観測するには、励起光の点灯／消灯についていくつかの選択が可能である。以下、元に戻って５方向観察の例で説明する。
【００３４】
第１の選択は、励起光源Ｓ１〜Ｓ５のすべてを同時に点灯させるものである。即ち試料１０を全周から常時照射した状態で、図２のように２次元検出器１４上に現れる５つの画像を撮影して記録するものである。
【００３５】
第２の選択は、励起光源Ｓ１〜Ｓ５のうち、角度的に隣り合う２つの光源（Ｓ１，Ｓ２）を点灯し残りの３つを消灯して２次元検出器１４により５つの画像を撮影し、次に他の隣り合う２つの光源（Ｓ２，Ｓ３）を点灯し残りの３つを消灯して５つの画像を撮影というように、順次ずらし、最後に隣り合う２つの光源（Ｓ５，Ｓ１）を点灯し残りの３つを消灯して５つの画像を撮影する。こうして５枚の画像を撮影すると、試料から見るとき、前から励起光を照らすときの蛍光画像だけでなく、後ろからだけとか、横からだけ照らすときの画像が得られるから、動物からの５方向の画像それぞれに対して各５つの励起方向の画像を得るから合計２５枚の画像を５回の露光で得ることができる。
【００３６】
そして、２５枚の画像から動物の体内の浅い位置に発光源があるか、深い位置に発光原があるかを推定できる。即ち浅い位置の発光源なら、２５枚のどれかの画像中の被写体の小さい部分が強く光ることが推測されるのに対し、深い位置の発光源ならば２５枚のどの画像にも拡散した発光分布しか写らないことが推測されるからである。また、適当なアルゴリズムを使うことで、逆演算によって元の蛍光物質の分布を画像化することも可能となる。
【００３７】
第３の選択は、励起光源Ｓ１〜Ｓ５のうち、１つを点灯し残りを消灯して５つの画像を撮影する操作を順次切り替えていって５回の露光を行う方法も可能である。これは第２の選択に近いが、重ね合わせが成り立てば第３の選択と第２の選択が等価になる。この場合は第２の選択の方が励起光が強いのでＳＮ的には有利である。反対に第３の選択と第２の選択が等価でなければ、第３の選択と第２の選択のすべてを実施し、１０回のデータ５０枚から計算することもできる。この他にも必要に応じた多数の点灯の組合わせが考えられる。
【００３８】
重要なポイントは、本発明の蛍光励起方法は可動部分がなくて単に励起光の点滅だけで、試料の前横又は後ろから励起する励起方法を自在に設定できることである。こうして蛍光モードの場合でも、試料の全周にわたる多方向から励起した観測画像を簡単に得られることである。
【００３９】
（蛍光励起用光源の実施例のさらに詳細な説明）
図３において、光源Ｓ１〜Ｓ５として示した蛍光励起用光源のさらに具体的な実施例を図４によって説明する。
【００４０】
励起光源の要件は、（１）目的とする蛍光色素を励起する適切な波長の光を発生できること、（２）蛍光を検出するフィルタ（図１のフィルタＦEM）の透過波長域の光を全く含まないこと（すなわち、波長としては励起側と蛍光側が完全に遮断していること）、（３）試料の小動物の全体を極力均一に照射できること、かつ（４）必要な光源の位置と波長の選択を自在に行えることの４点である。
【００４１】
図４は、図３に示されている光源Ｓ１〜Ｓ５の内のどれか１つの構成例であって、光源取付けベース２０に４つのレーザダイオードＬＤλ１Ａ，ＬＤλ２Ａ，ＬＤλ１Ｂ，ＬＤλ２Ｂが配置されている。光源取付けベース２０は小動物の体軸に平行な方向に長く伸びた板状のホルダーで、これら４つのレーザダイオードは小動物の体軸の方向に並んでいる。この実施例では４つのレーザダイオードの内、２つＬＤλ１Ａ，ＬＤλ１Ｂは同じ波長（例えば７８０ｎｍ）を発振する。また残り２つのレーザダイオードＬＤλ２Ａ、ＬＤλ２Ｂは別の波長（例えば６９０ｎｍ）を発振する。同じ波長を発振するレーザダイオードどおしは互いに離れて配置されている。
【００４２】
さらに４つのレーザダイオードそれぞれに励起光用のフィルタＦｅｘλ１Ａ，Ｆｅｘλ２Ａ，Ｆｅｘλ１Ｂ，Ｆｅｘλ２Ｂが重ねて取り付けてあり、レーザダイオードとフィルタのそれぞれの対（ＬＤλ１ＡとＦｅｘλ１Ａ），（ＬＤλ２ＡとＦｅｘλ２Ａ），（ＬＤλ１ＢとＦｅｘλ１Ｂ），（ＬＤλ２ＢとＦｅｘλ２Ｂ）がそれぞれの励起光を試料に向けて照射する。通常半導体レーザは１つの固定波長を発振するので、単独に使うだけでも励起機能を十分有すると考えられがちであるが、詳細にみると発振波長の傍に弱いすそ野の発光波長をもつことが多く、すそ野の発光が漏れ光となる。そこでレーザダイオード単体にそれぞれに対応する干渉フィルタをさらに組み合わせることで、励起光中に含まれる蛍光と重なる漏れ光の成分を極めて微少なレベルに軽減する効果が有ることが判った。この構造を有する光源５組を試料の周囲に配置しておき、５つの組の各４つのレーザダイオードの必要なものを単に電気的な選択で点灯することで、光源Ｓ１からＳ５の励起位置の選択と励起波長の選択を自在に行うことができる。
【００４３】
なおこの例では各光源Ｓ１〜Ｓ５が２つの波長を備えている例を示したが、スペースが許す範囲で、もっと多数の波長のレーザダイオードを並べても良いのは当然である。またレーザダイオードと励起光用のフィルタは互いに固定されているから、レーザダイオードの発光が必ずフィルタを通過し、フィルタ以外の隙間をすり抜ける漏れ光を生じないよう、図には示さないが適当な光遮断部品で覆うことができる。
【００４４】
励起側を上記のように構成しておけば、励起側と蛍光側の波長選択の方法は次のようになる。５つの励起光源のどの組合わせを使うかの選択と波長の選択を電気的な点灯方式で決定するとともに、図１に示す蛍光側フィルタＦEMの選択は、複数のフィルタＦEMを回転円板に取り付けておいて、切り替えることで行う。このようにして、蛍光側フィルタＦEMの円板の切替え機構だけが機械的な可動部として残るけれども、その他はすべて可動部分がなく、多方向の蛍光励起・検出方法としては極めて簡単な切替え方法を実現できる。
【００４５】
（２次元検出器の画像から表示装置の画像への変換）
共通の２次元検出器１４上にできる、異なる角度からの観測像は、倍率が異なっていること、ミラーによる反転の有るものと無いものが混在していること、角度の順番がとびとびになっていること、の問題がある。しかし、図５のように簡単な変換によって最終の表示画面では倍率、反転、順序の入れ替えをすませた自然な表示にすることが可能である。
【００４６】
また、生物発光、蛍光情報による分子種画像とは別に、同じ２次元検出器１４を用いて外形写真を写しておき、外形写真に分子種イメージングを重ねて表示することが行われている。このための外形写真も同じ倍率、反転、順序の入れ替えが起こっているから、図５と同様の手順の変換を実施することで、多方向から見た外形写真と分子種イメージングを重ねたものを自然な順序で表示することができる。
【００４７】
（第１の実施例についての変形実施例の説明）
等分割５方向測定の例について上記によって説明した。次に等分割４面測定について、図６、図７、図８を用いて説明する。等分割４面測定では、正面（０°）、左面（９０°）、裏面（１８０°）、右面（２７０°）というように観測方向をイメージしやすいので、人間の感覚に合いやすい利点がある。
【００４８】
図６は等分割４面測定の一実施例で、正面（０°）の横にミラーＭ１とミラーＭ３を配置し、左面（９０°）と右面（２７０°）用に用いている。残りの裏面（１８０°）に対しては、ミラーＭ２’とミラーＭ２によって合計２回反射させた像を、左面（９０°）の横に作っている。したがって２次元検出器１４上の像の様子は図７のようになっている。即ち正面（０°）の横に少し小さく右面（２７０°）と左面（９０°）が並び、右端にかなり小さい裏面（１８０°）が配列している。
【００４９】
図６に戻って補助レンズを説明する。この例では左面（９０°）と右面（２７０°）に対してレンズＬの焦点を合わせ（補助レンズ不要）、それより近い正面（０°）用には凸レンズＬ０を、最も遠い裏面（１８０°）に対しては凹レンズを使っている。蛍光用励起光源はミラーの配置との関連で必ずしも９０°間隔（測定方向のプラス・マイナス４５°）でなく、正面と裏面がプラス・マイナス４０°、左面（９０°）と右面（２７０°）がプラス・マイナス５０°程度になっている。また、励起光源と試料１０との距離は、光源Ｓ２，Ｓ３が、光源Ｓ１，Ｓ４より近くに配置されている。これらは必ずしも等しい必要はなく、ミラーなどの部品の配置に応じて変形した配置が可能である。
【００５０】
図８はさらに異なる４面測定の実施例である。ここでは２次元検出器１４上の画像に対して、裏面１８０°の像を「０°、９０°、２７０°の列」とは別の列になるように、ミラーＭ２’の曲げ方を変えている。即ち、ミラーＭ２’を、０°，９０°，２７０°の光線が作る面とは垂直の方向に曲げる向きに配置し、Ｍ２はそこからレンズの方に向ければよい。こうすれば、図８のように０°，９０°，２７０°とは垂直にずれた位置に、１つだけ１８０°の像ができる。２次元検出器１４の形が正方形に近ければ、実用上図８のように２次元検出器１４を使っても大きな不都合はなく、蛍光光源の配置などの自由度が増す利点がある。
【００５１】
以上、図６、図７、図８によって、導光光学系はミラーが１枚だけでなくても色々な変形が可能であって、最終的に２次元検出器１４の上に試料の像を沢山導くことができればよいこと、それによって光路長が変わっても、補助レンズを適宜挿入し結像条件の補正が容易にできることを示した。
【００５２】
（第２の実施例）
第２の実施例を図９（鳥瞰図）と図１０とを用いて説明する。前述の第１の実施例では結像レンズＬを試料１０の小動物の「体軸方向に垂直な１つの方向」においたが、この第２の実施例では、図９のように小動物の「体軸方向」に結像レンズＬと２次元検出器１０を配する。そして、体軸方向を中心とする傘のように反射鏡を配置している。この図では、８枚の反射鏡Ｒ１〜Ｒ８を傘のように配置したので、４５°ずつ異なる８つの方向からの撮影を同時に行うことができる。
【００５３】
図１０はレンズＬから見たときに反射鏡Ｒ１〜Ｒ８に映る試料１０の小動物の像の概念を表すものである。放射状の画像が２次元検出器１４から読みとれるから、データ変換によって８つの像を並べ直し、観察しやすいように図を配置することができる。この実施例ではレンズからの距離が各方向に対して等しいので、焦点補正に使う補助レンズは不要である。ただ、この方法では第１の実施例に比べて試料１０の像の面積が２次元検出器１４の面積に占める割合が小さくなりやすい反面、焦点補正レンズが要らないという利点を有する。
【００５４】
第１、第２の実施例につての発明の効果を纏めると以下のようになる。
１）１つの２次元検出器を用いて、同時多方向の観察ができる。
２）簡単に多方向の観察ができるので、小動物の裏側に癌ができているような場合でも見落とすことがない。
３）蛍光測定の場合に、励起光源を配置する場所が、多方向測定用の反射鏡の隙間に矛盾無く確保できている。即ち蛍光の場合でも多方向の観察が容易にできる。
４）蛍光測定の場合に、励起光源を半導体レーザ又はＬＥＤとフィルタの組み合わせたもので構成することで、光源の点滅によって可動機構なしに励起光源の照射方向と波長を選択できる。
５）蛍光測定で励起光の位置を切り変えながら、多方向の同時画像取得ができるので、生体内蛍光イメージング再構成の基礎データを得ることができる。すなわち、例えば正面（０°方向）の画像でも照射を前側、横、後と、図の例では５つの方向に変えたものが得られる。
【００５５】
（第３の実施例）
第３の実施例は試料と検出系の相対関係を少しずつ傾けて、連続角に近い角度毎のデータを得る手法である。専用の図は省略し、図３を参照して説明する。
【００５６】
図３において、中心の試料（小動物）１０を１つのホルダーに、それ以外のミラーや光源、検出器、レンズをホルダーとは別の保持機構に一体として取り付け、試料１０に対して保持機構を相対的に回転できるようにする。例えば５等分の場合、試料１０と保持機構を相対回転を全周の５分の１（７２°）の範囲にわたって行えるようにする。その７２°の範囲を、例えば１２°毎に測定するようにすれば、６回の測定を行うことにより５等分をさらに６等分した全周の３０等分の画像を得ることができる。相対回転は全周回転させる必要がなく、僅かの角度の相対回転ですむ。試料を１８０°とか３６０°回転することは動物に大きな負担を与える上に、ホルダーに保持するのさえ難しい。また保持機構を３６０°回転することはケーブルの処理とか機械構造が複雑になる。これに対し、例えば試料１０を載置したホルダーを１／５回転（７２°）静かに回すのは、動物にとって大きな障害にならないし、反対に保持機構の方を７２°回すのも容易である。こうして測定方向の分割ピッチをミラー分割数の何分の１といった、より小さいピッチで行う実施例３の方法は比較的容易に実現でき、かつ有用であることがわかる。
【００５７】
第３の実施例の効果として次のものをあげることができる。
１）同時に５枚などの撮影をするので、時分割ではあっても同時測定数の倍数（たとえは５倍）高速である。
２）試料（又は検出器は）の回転は高々１回転の５分の１といった、小さい角度でよいので、構造が簡単である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を載置するための試料載置面を備えるとともにその試料載置面を均一に加熱するための透明導電膜が設けられた透明材質の試料ホルダーと、
前記試料載置面又は試料載置面に載置された生体試料の温度を計測する温度センサと、
前記透明導電膜への通電を行なう電源装置と、
前記温度センサの計測値に基づいて前記試料載置面の温度が所定温度になるように前記電源装置による通電量を制御する通電制御部と、
前記試料ホルダー上の試料から放出される光の像を撮影する１つの２次元検出器と、
前記２次元検出器が撮影した画像を表示する画像表示装置と、
前記試料ホルダー上の試料を複数の方向から観測するとともに、試料から放出される各方向の光の画像を前記２次元検出器に導く導光光学系と、
前記２次元検出器と導光光学系との間に配置され、前記導光光学系により導かれた複数の画像を前記２次元検出器上に結像する１つの主結像レンズと、を備えた生体画像取得装置。
【請求項２】
試料から放出される前記光は試料に光が照射されたときその光により励起されて試料から放出される光又は光が照射されなくても試料自身が発光する光である請求項１に記載の生体画像取得装置。
【請求項３】
該生体画像取得装置は試料から放出される前記光の画像として蛍光画像を取得するものであり、
前記導光光学系の光路間の隙間には蛍光発生のために試料に励起光を照射する励起光学系が配置されている請求項１又は２に記載の生体画像取得装置。
【請求項４】
前記励起光学系は励起光源として、レーザダイオード又は発光ダイオードからなる発光素子を備え、前記発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射方向を切り替える請求項３に記載の生体画像取得装置。
【請求項５】
前記励起光学系の各励起光源は異なる波長を発生する複数の発光素子とそれぞれの波長に応じた不要な波長成分を除去する干渉フィルタとを備えたものであり、前記発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射波長も切り替える請求項４に記載の生体画像取得装置。
【請求項１】
生体試料を載置するための試料載置面を備えるとともにその試料載置面を均一に加熱するための透明導電膜が設けられた透明材質の試料ホルダーと、
前記試料載置面又は試料載置面に載置された生体試料の温度を計測する温度センサと、
前記透明導電膜への通電を行なう電源装置と、
前記温度センサの計測値に基づいて前記試料載置面の温度が所定温度になるように前記電源装置による通電量を制御する通電制御部と、
前記試料ホルダー上の試料から放出される光の像を撮影する１つの２次元検出器と、
前記２次元検出器が撮影した画像を表示する画像表示装置と、
前記試料ホルダー上の試料を複数の方向から観測するとともに、試料から放出される各方向の光の画像を前記２次元検出器に導く導光光学系と、
前記２次元検出器と導光光学系との間に配置され、前記導光光学系により導かれた複数の画像を前記２次元検出器上に結像する１つの主結像レンズと、を備えた生体画像取得装置。
【請求項２】
試料から放出される前記光は試料に光が照射されたときその光により励起されて試料から放出される光又は光が照射されなくても試料自身が発光する光である請求項１に記載の生体画像取得装置。
【請求項３】
該生体画像取得装置は試料から放出される前記光の画像として蛍光画像を取得するものであり、
前記導光光学系の光路間の隙間には蛍光発生のために試料に励起光を照射する励起光学系が配置されている請求項１又は２に記載の生体画像取得装置。
【請求項４】
前記励起光学系は励起光源として、レーザダイオード又は発光ダイオードからなる発光素子を備え、前記発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射方向を切り替える請求項３に記載の生体画像取得装置。
【請求項５】
前記励起光学系の各励起光源は異なる波長を発生する複数の発光素子とそれぞれの波長に応じた不要な波長成分を除去する干渉フィルタとを備えたものであり、前記発光素子の点灯の切替えによって励起光の照射波長も切り替える請求項４に記載の生体画像取得装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−２２０８７（Ｐ２０１１−２２０８７Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６９３１３（Ｐ２００９−１６９３１３）
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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