生体組織補填体の製造装置および製造方法
【課題】簡単な操作で短時間のうちに、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のような細胞ソースを利用して生体組織補填体を効率的に製造する。
【解決手段】赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、該細胞捕捉フィルタ２の入口２ａ側に、第１の切替弁７を介して接続され、細胞ソースＡを収容した細胞ソース容器３および生体組織補填材Ｂを収容した回収容器４と、細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側に、第２の切替弁８を介して接続され、細胞捕捉フィルタ２を透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグ５および回収液Ｃを供給する回収液供給手段６とを備える生体組織補填体の製造装置１を提供する。
【解決手段】赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、該細胞捕捉フィルタ２の入口２ａ側に、第１の切替弁７を介して接続され、細胞ソースＡを収容した細胞ソース容器３および生体組織補填材Ｂを収容した回収容器４と、細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側に、第２の切替弁８を介して接続され、細胞捕捉フィルタ２を透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグ５および回収液Ｃを供給する回収液供給手段６とを備える生体組織補填体の製造装置１を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織補填体の製造装置および製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、赤血球は実質的に捕捉しないが血管新生に有効な細胞は捕捉する細胞捕捉フィルタに血液を流して血管新生に有効な細胞を該細胞捕捉フィルタに捕捉させ、捕捉された細胞を回収する血管新生療法用細胞組成物の製造方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−８２５６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、回収した血管新生に有効な細胞を用いて生体組織補填体を製造する場合に、回収容器から取り出して生体組織補填材に播種する作業を行う必要があり、手続きが煩わしい上に、回収容器からの取り出し、生体組織補填材への播種に際して、細菌等が混入する可能性があり、そのような問題が発生しないように高度の注意を払う必要がある。また、血管新生に有効な細胞を除去した後の体液内にも生体組織補填体の製造に有効な物質が多く含まれており、これを患者の体内に単に戻すのではなく有効利用することも考えられる。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡単な操作で短時間のうちに、末梢血を利用して生体組織補填体を効率的に製造することができる生体組織補填体の製造装置および製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
該細胞捕捉フィルタの入口側に、第１の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および生体組織補填材を収容した回収容器と、前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第２の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段を備える生体組織補填体の製造装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、細胞捕捉フィルタの入口側に接続された第１の切替弁を細胞ソースを収容した細胞ソース容器側に接続し、細胞捕捉フィルタの出口側に接続された第２の切替弁をドレインバッグ側に接続した状態で、重力その他の手段によって細胞ソースを細胞捕捉フィルタに流入させると、該細胞捕捉フィルタにより、血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、赤血球および血小板は細胞捕捉フィルタにより捕捉されることなく通過して、ドレインバッグに流入させられる。
【０００８】
この後に、第１の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替え、第２の切替弁をドレインバッグ側から回収液供給手段側に切り替えるとともに、回収液供給手段の作動により、回収液を供給することによって、細胞捕捉フィルタを回収液により逆洗する。これにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が回収液とともに回収容器に流入し、回収容器内に収容されている生体組織補填材に播種される。すなわち、細胞ソースから回収された血管新生に有効な有核細胞を外気に触れさせることなく、簡易な操作で無菌的に生体組織補填材に播種して生体組織補填体を効率的に製造することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記回収容器が減圧されていることとしてもよい。
このようにすることで、第１の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替えると、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた有核細胞が回収液とともに回収容器内に吸引され易くなり、生体組織補填体をさらに効率的に製造することが可能となる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記回収容器に、カルシウムイオンおよびサイトカイン用の注入口が設けられていることとしてもよい。
細胞捕捉フィルタにより捕捉され、回収容器に回収された血管新生に有効な有核細胞、特に、単核球細胞にカルシウムイオンを作用させることにより、単核球細胞から繊維芽様細胞に変化させることができる。繊維芽様細胞は間葉系幹細胞と同様の性質を有し、所定の条件下において分化し、患者の補填後に早期に生体組織を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。また、サイトカインの作用により、繊維芽様細胞の成長を促進することができる。
この場合に、前記サイトカインがｂ−ＦＧＦであることとしてもよい。
また、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
【００１１】
また、本発明は、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させるステップと、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給するステップと、カルシウムイオンの供給により得られた液体を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させるステップと、該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収するステップと、回収された液体を生体組織補填材に供給するステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明によれば、細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させることにより、細胞ソース中に含まれる血管新生に有効な有核細胞が細胞捕捉フィルタに捕捉され、赤血球および血小板が透過させられる。細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給することにより、赤血球を溶血させて破壊し、内部に含有されている血漿を含む体液を得ることができる。そして、得られた体液を細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させることにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が体液によって逆洗され、回収される。そして、回収された体液を生体組織補填材に供給することにより、血管新生に有効な有核細胞を生体組織補填材に播種し、容易に生体組織補填体を得ることができる。
【００１３】
この場合において、赤血球にカルシウムイオンを供給することにより得られた血漿は、細胞の生着性を向上させる作用を有するので、生体組織補填体における細胞の成長を促進することができる。さらに、体液内に含まれるカルシウムイオンは、単核球細胞を繊維芽様細胞に変化させるので、生体への埋植後に、早期に生体組織を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。
また、この場合に、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、簡単な操作で短時間のうちに、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のような細胞ソースを利用して生体組織補填体を効率的に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係る生体組織補填体の製造装置１および製造方法について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１は、図１に示されるように、一方向に末梢血Ａを流動させることにより、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、該細胞捕捉フィルタ２の入口側に接続される末梢血Ａを収容した血液容器（細胞ソース容器）３および生体組織補填材Ｂを収容した回収容器４と、細胞捕捉フィルタ２の出口側に接続される細胞捕捉フィルタ２を透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグ５および回収液Ｃを供給するシリンジ６からなる回収液供給手段とを備えている。
【００１６】
細胞捕捉フィルタ２と血液容器３および回収容器４との間には、第１の三方弁（切替弁）７が配置され、該第１の三方弁７の切り替えにより、血液容器３または回収容器４のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。図中、符号８はピンチバルブである。
また、前記細胞捕捉フィルタ２と、ドレインバッグ５およびシリンジ６との間には、第２の三方弁（切替弁）９が配置され、該第２の三方弁９の切り替えにより、ドレインバッグ５またはシリンジ６からなる回収液供給手段のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。
【００１７】
前記細胞捕捉フィルタ２としては、ポリエステルあるいはポリプロピレンからなる平均繊維径約０．０１〜１０μｍの不織布フィルタを積層したものが採用される。
また、前記血液容器３、回収容器４およびドレインバッグ５は、いずれも無菌的に細胞捕捉フィルタ２に接続されている。
【００１８】
回収容器４に収容されている生体組織補填材Ｂは、例えば、βリン酸三カルシウム（βＴＣＰ）により構成されている。また、回収容器４は内部が減圧状態にされている。
また、回収容器４には、シリンジ１０（図４参照。）等の供給手段を無菌的に接続可能な接続部４ａが設けられ、該接続部４ａを介して、カルシウムイオンＤあるいはｂ−ＦＧＦをシリンジ１０により供給することができるようになっている。
【００１９】
また、シリンジ６には、回収液Ｃとして、血管新生に有効な細胞の変性が少ない、例えば、生理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）、ハンクス液等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の培地等が収容されている。
また、効率よく回収するために、一定の血液浸透圧を有する回収液Ｃを採用した方がよく、デキストラン等が添加されていてもよい。
【００２０】
また、細胞ソースとしては、末梢血の他、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織を使用してもよい。これらの中で粘性の高いものについては酵素処理などを行い、粘性を低下させて液状化させた後に使用することが望ましい。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１を用いて生体組織補填体を製造するには、第１の三方弁７を血液容器３側に接続し、第２の三方弁９をドレインバッグ５側に接続し、血液容器３を細胞捕捉フィルタ２よりも高位に配置する。
【００２２】
これにより、図２に示されるように、血液容器３内に収容されている末梢血Ａが、重力により配管内を下降する。末梢血Ａとしては、例えば、４０ｃｃ〜２００ｃｃを、２０ｃｃ／ｍｉｎの滴下速度で下降させるのが好ましい。下降する末梢血Ａは、第１の三方弁７を通過して細胞捕捉フィルタ２に入口２ａ側から供給される。そして、細胞捕捉フィルタ２内を流動する際に、末梢血Ａ内に含有されている血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、赤血球および血小板Ｅは細胞捕捉フィルタ２により捕捉されることなく通過して、第２の三方弁９を通過し、配管を介してドレインバッグ５に流入させられる。
【００２３】
そして、血液容器３内の末梢血Ａが十分に細胞捕捉フィルタ２を通過した時点で、第１の三方弁７を回収容器４側に切り替えるとともに、第２の三方弁９をシリンジ６側に切り替えてシリンジ６を加圧する。これにより、シリンジ６内の回収液Ｃを細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側から供給する。
【００２４】
回収容器４内は減圧状態に設定されているので、第１の三方弁７を回収容器４側に切り替えることにより、図３に示されるように、配管を介して細胞捕捉フィルタ２内の液体Ｃが入口２ａ側に吸引される。
すなわち、シリンジ６の作動による出口２ｂ側の加圧と回収容器４による入口２ａ側の減圧とにより、シリンジ６内の回収液Ｃが細胞捕捉フィルタ２内に出口２ｂ側からスムーズに流入し、細胞捕捉フィルタ２を出口２ｂ側から入口２ａ側に向かって流動する。これにより、細胞捕捉フィルタ２は逆洗され、細胞捕捉フィルタ２に捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞Ｆが入口２ａ側から第１の三方弁７を介して回収容器４内に回収液Ｃとともに流入する。
【００２５】
回収容器４内には、生体組織補填材Ｂが収容されているので、流入してきた血管新生に有効な有核細胞Ｆが生体組織補填材Ｂに播種されて付着する。これにより、生体組織補填体が製造されることになる。
【００２６】
この場合において、本実施形態に係る製造装置１によれば、２つの三方弁７，９を切り替えて、回収液供給手段としてのシリンジ６を操作するだけで、生体組織補填体を製造できる。したがって、きわめて簡易に生体組織補填体を製造することができる。さらに、製造工程において末梢血Ａおよび生体組織補填材Ｂが、全て外気に触れることなく容器３，４および配管内に維持されるので、感染のおそれがなく、無菌的に生体組織補填体を製造することができるという利点がある。
【００２７】
また、このようにして製造された生体組織補填体に対し、回収容器４に設けられた接続部４ａにシリンジ１０を刺して、カルシウムイオンＤおよびｂ−ＦＧＦを供給することにより、生体組織補填体に付着した血管新生に有効な有核細胞Ｆ、特に、単核球細胞を繊維芽用細胞に変化させることができる。繊維芽用細胞は、間葉系幹細胞と同様の性質を有するので、生体組織補填材Ｂに生着して成長し、骨芽細胞のような生体組織前駆細胞に分化することができ、生体に埋植された後に早期に生体組織の欠損部を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。
【００２８】
次に、本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図５〜図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、図１に示された第１の実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１と同様の製造装置２０を用いて行われるので、構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。なお、第１の実施形態に係る製造装置１における第２の三方弁９および回収液供給手段としてのシリンジ６は不要である。
【００２９】
本実施形態に係る製造方法は、血液容器３に収容した末梢血Ａを第１の三方弁７を開いて細胞捕捉フィルタ２に供給し、血管新生に有効な有核細胞Ｆを細胞捕捉フィルタ２に捕捉させるステップＳ１と、細胞捕捉フィルタ２を通過してドレインバッグ５に収容された赤血球ＥにカルシウムイオンＧまたは０．３〜０．５％生理食塩水を供給するステップＳ２と、第１の三方弁７を切り替えて、ドレインバッグ５内の液体Ｈを細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側から逆方向に細胞捕捉フィルタ２に透過させるステップＳ３と、細胞捕捉フィルタ２を逆方向に透過した液体Ｆ，Ｈを回収容器４の方向に回収するステップＳ４と、回収された液体Ｆ，Ｈを回収容器４内の生体組織補填材Ｂに供給するステップＳ５とを備えている。
【００３０】
ステップＳ１において血管新生に有効な有核細胞Ｆを分離された残りの赤血球Ｅを多く含む末梢血に、ステップＳ２においてカルシウムイオンＧを供給すると、赤血球Ｅが破壊されて内部の血漿成分Ｈがドレインバッグ５内に残る。そして、ステップＳ３においては、ドレインバッグ５内を加圧して、抽出された血漿成分Ｈを含む体液を細胞捕捉フィルタ２側に向けて逆流させる。
【００３１】
あるいは、ドレインバッグ５を細胞捕捉フィルタ２よりも高位に配置して、重力により血漿成分Ｈを含む体液を細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側から入口２ａ側に向かって流動させる。これにより、血漿成分Ｈを含む体液の流動により、細胞捕捉フィルタ２に捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞Ｆが細胞捕捉フィルタ２から剥離され、血漿成分Ｈを含む体液とともに入口２ａ側から流出する。第１の三方弁７は、回収容器４側に接続するように切り替えられているので、ステップＳ４により、血漿成分Ｈと血管新生に有効な有核細胞Ｆとを含む体液が回収容器４内に回収される。
【００３２】
回収容器４内には生体組織補填材Ｂが収容されているので、血管新生に有効な有核細胞Ｆが血漿成分Ｈとともに生体組織補填材Ｂに播種される。血漿成分Ｈは、有核細胞Ｆの生着性を向上するので、生体組織補填材Ｂ上における有核細胞Ｆの成長が促進される。また、ドレインバッグ５に加えるカルシウムイオンＧの濃度を、回収容器４内に流入した液体Ｆ，Ｈ内にカルシウムイオンＧが残存するように設定しておくことにより、カルシウムイオンＧを単核球細胞に作用させて繊維芽様細胞に変化させることができる。
【００３３】
なお、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、血漿成分Ｈを含む液体で細胞捕捉フィルタ２を逆洗することとしたが、これに代えて、ドレインバッグ５内に得られた血漿成分Ｈを多く含む液体を遠心分離して、多血小板血漿（ＰＲＰ）あるいは貧血小板血漿（ＰＰＰ）を得、これを細胞Ｆに添加することにしてもよい。
【００３４】
なお、本実施形態においては、血管新生に有効な単核球細胞等の細胞Ｆを細胞捕獲フィルタ２により捕獲した後、逆洗により剥離させ、生体組織補填材Ｂに播種することとしたが、単核球細胞Ｆの用途は、骨や軟骨の治療の他、樹状細胞を用いた癌治療にも用いられる。
【００３５】
末梢血から得られた単核球細胞を、貪食白血球機能の亢進作用を持つサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した培地中で培養すると、樹状細胞に分化させることができる。これに癌細胞から抽出したタンパク質を貪食させると、取り込まれた癌抗原タンパク質が細胞内で分断されて異常ペプチドを生じ、抗原として樹状細胞表面に提示される。
【００３６】
この樹状細胞を患者に戻すことにより、体内で癌細胞に対する特異的なＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）が誘導され治療効果が得られる。
このことを応用し、回収容器４には生体組織補填材Ｂではなく、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した培地を入れておき、細胞捕捉フィルタ２で捕捉した有核細胞Ｆを流入させる。これを培養することで樹状細胞を無菌的に得ることができ、患者に戻して癌治療を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の製造装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。
【図３】図１の製造装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに捕捉された有核細胞を回収容器内の生体組織補填材に播種するステップを説明する図である。
【図４】図１の製造装置の作用を説明する図であり、回収容器内の生体組織補填材にカルシウムイオンおよびサイトカインを供給するステップを説明する図である
【図５】本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図６】図５の製造方法において、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。
【図７】図５の製造方法において、ドレインバッグに収容された赤血球を多く含む体液にカルシウムイオンを添加するステップを示す図である。
【図８】図７のドレインバッグを加圧して、体液を細胞捕捉フィルタに逆流させるステップを示す図である。
【図９】図８の細胞捕捉フィルタを逆流した細胞および体液を生体組織補填材に供給するステップを示す図である。
【符号の説明】
【００３８】
Ａ 末梢血
Ｂ 生体組織補填材
Ｃ 回収液
１，２０ 製造装置
２ 細胞捕捉フィルタ
３ 血液容器
４ 回収容器
５ ドレインバッグ
６ シリンジ（回収液供給手段）
７ 第１の切替弁
８ 第２の切替弁
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織補填体の製造装置および製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、赤血球は実質的に捕捉しないが血管新生に有効な細胞は捕捉する細胞捕捉フィルタに血液を流して血管新生に有効な細胞を該細胞捕捉フィルタに捕捉させ、捕捉された細胞を回収する血管新生療法用細胞組成物の製造方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−８２５６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、回収した血管新生に有効な細胞を用いて生体組織補填体を製造する場合に、回収容器から取り出して生体組織補填材に播種する作業を行う必要があり、手続きが煩わしい上に、回収容器からの取り出し、生体組織補填材への播種に際して、細菌等が混入する可能性があり、そのような問題が発生しないように高度の注意を払う必要がある。また、血管新生に有効な細胞を除去した後の体液内にも生体組織補填体の製造に有効な物質が多く含まれており、これを患者の体内に単に戻すのではなく有効利用することも考えられる。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡単な操作で短時間のうちに、末梢血を利用して生体組織補填体を効率的に製造することができる生体組織補填体の製造装置および製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
該細胞捕捉フィルタの入口側に、第１の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および生体組織補填材を収容した回収容器と、前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第２の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段を備える生体組織補填体の製造装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、細胞捕捉フィルタの入口側に接続された第１の切替弁を細胞ソースを収容した細胞ソース容器側に接続し、細胞捕捉フィルタの出口側に接続された第２の切替弁をドレインバッグ側に接続した状態で、重力その他の手段によって細胞ソースを細胞捕捉フィルタに流入させると、該細胞捕捉フィルタにより、血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、赤血球および血小板は細胞捕捉フィルタにより捕捉されることなく通過して、ドレインバッグに流入させられる。
【０００８】
この後に、第１の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替え、第２の切替弁をドレインバッグ側から回収液供給手段側に切り替えるとともに、回収液供給手段の作動により、回収液を供給することによって、細胞捕捉フィルタを回収液により逆洗する。これにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が回収液とともに回収容器に流入し、回収容器内に収容されている生体組織補填材に播種される。すなわち、細胞ソースから回収された血管新生に有効な有核細胞を外気に触れさせることなく、簡易な操作で無菌的に生体組織補填材に播種して生体組織補填体を効率的に製造することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記回収容器が減圧されていることとしてもよい。
このようにすることで、第１の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替えると、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた有核細胞が回収液とともに回収容器内に吸引され易くなり、生体組織補填体をさらに効率的に製造することが可能となる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記回収容器に、カルシウムイオンおよびサイトカイン用の注入口が設けられていることとしてもよい。
細胞捕捉フィルタにより捕捉され、回収容器に回収された血管新生に有効な有核細胞、特に、単核球細胞にカルシウムイオンを作用させることにより、単核球細胞から繊維芽様細胞に変化させることができる。繊維芽様細胞は間葉系幹細胞と同様の性質を有し、所定の条件下において分化し、患者の補填後に早期に生体組織を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。また、サイトカインの作用により、繊維芽様細胞の成長を促進することができる。
この場合に、前記サイトカインがｂ−ＦＧＦであることとしてもよい。
また、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
【００１１】
また、本発明は、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させるステップと、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給するステップと、カルシウムイオンの供給により得られた液体を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させるステップと、該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収するステップと、回収された液体を生体組織補填材に供給するステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明によれば、細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させることにより、細胞ソース中に含まれる血管新生に有効な有核細胞が細胞捕捉フィルタに捕捉され、赤血球および血小板が透過させられる。細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給することにより、赤血球を溶血させて破壊し、内部に含有されている血漿を含む体液を得ることができる。そして、得られた体液を細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させることにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が体液によって逆洗され、回収される。そして、回収された体液を生体組織補填材に供給することにより、血管新生に有効な有核細胞を生体組織補填材に播種し、容易に生体組織補填体を得ることができる。
【００１３】
この場合において、赤血球にカルシウムイオンを供給することにより得られた血漿は、細胞の生着性を向上させる作用を有するので、生体組織補填体における細胞の成長を促進することができる。さらに、体液内に含まれるカルシウムイオンは、単核球細胞を繊維芽様細胞に変化させるので、生体への埋植後に、早期に生体組織を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。
また、この場合に、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、簡単な操作で短時間のうちに、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のような細胞ソースを利用して生体組織補填体を効率的に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係る生体組織補填体の製造装置１および製造方法について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１は、図１に示されるように、一方向に末梢血Ａを流動させることにより、赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、該細胞捕捉フィルタ２の入口側に接続される末梢血Ａを収容した血液容器（細胞ソース容器）３および生体組織補填材Ｂを収容した回収容器４と、細胞捕捉フィルタ２の出口側に接続される細胞捕捉フィルタ２を透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグ５および回収液Ｃを供給するシリンジ６からなる回収液供給手段とを備えている。
【００１６】
細胞捕捉フィルタ２と血液容器３および回収容器４との間には、第１の三方弁（切替弁）７が配置され、該第１の三方弁７の切り替えにより、血液容器３または回収容器４のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。図中、符号８はピンチバルブである。
また、前記細胞捕捉フィルタ２と、ドレインバッグ５およびシリンジ６との間には、第２の三方弁（切替弁）９が配置され、該第２の三方弁９の切り替えにより、ドレインバッグ５またはシリンジ６からなる回収液供給手段のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。
【００１７】
前記細胞捕捉フィルタ２としては、ポリエステルあるいはポリプロピレンからなる平均繊維径約０．０１〜１０μｍの不織布フィルタを積層したものが採用される。
また、前記血液容器３、回収容器４およびドレインバッグ５は、いずれも無菌的に細胞捕捉フィルタ２に接続されている。
【００１８】
回収容器４に収容されている生体組織補填材Ｂは、例えば、βリン酸三カルシウム（βＴＣＰ）により構成されている。また、回収容器４は内部が減圧状態にされている。
また、回収容器４には、シリンジ１０（図４参照。）等の供給手段を無菌的に接続可能な接続部４ａが設けられ、該接続部４ａを介して、カルシウムイオンＤあるいはｂ−ＦＧＦをシリンジ１０により供給することができるようになっている。
【００１９】
また、シリンジ６には、回収液Ｃとして、血管新生に有効な細胞の変性が少ない、例えば、生理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）、ハンクス液等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の培地等が収容されている。
また、効率よく回収するために、一定の血液浸透圧を有する回収液Ｃを採用した方がよく、デキストラン等が添加されていてもよい。
【００２０】
また、細胞ソースとしては、末梢血の他、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織を使用してもよい。これらの中で粘性の高いものについては酵素処理などを行い、粘性を低下させて液状化させた後に使用することが望ましい。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１を用いて生体組織補填体を製造するには、第１の三方弁７を血液容器３側に接続し、第２の三方弁９をドレインバッグ５側に接続し、血液容器３を細胞捕捉フィルタ２よりも高位に配置する。
【００２２】
これにより、図２に示されるように、血液容器３内に収容されている末梢血Ａが、重力により配管内を下降する。末梢血Ａとしては、例えば、４０ｃｃ〜２００ｃｃを、２０ｃｃ／ｍｉｎの滴下速度で下降させるのが好ましい。下降する末梢血Ａは、第１の三方弁７を通過して細胞捕捉フィルタ２に入口２ａ側から供給される。そして、細胞捕捉フィルタ２内を流動する際に、末梢血Ａ内に含有されている血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、赤血球および血小板Ｅは細胞捕捉フィルタ２により捕捉されることなく通過して、第２の三方弁９を通過し、配管を介してドレインバッグ５に流入させられる。
【００２３】
そして、血液容器３内の末梢血Ａが十分に細胞捕捉フィルタ２を通過した時点で、第１の三方弁７を回収容器４側に切り替えるとともに、第２の三方弁９をシリンジ６側に切り替えてシリンジ６を加圧する。これにより、シリンジ６内の回収液Ｃを細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側から供給する。
【００２４】
回収容器４内は減圧状態に設定されているので、第１の三方弁７を回収容器４側に切り替えることにより、図３に示されるように、配管を介して細胞捕捉フィルタ２内の液体Ｃが入口２ａ側に吸引される。
すなわち、シリンジ６の作動による出口２ｂ側の加圧と回収容器４による入口２ａ側の減圧とにより、シリンジ６内の回収液Ｃが細胞捕捉フィルタ２内に出口２ｂ側からスムーズに流入し、細胞捕捉フィルタ２を出口２ｂ側から入口２ａ側に向かって流動する。これにより、細胞捕捉フィルタ２は逆洗され、細胞捕捉フィルタ２に捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞Ｆが入口２ａ側から第１の三方弁７を介して回収容器４内に回収液Ｃとともに流入する。
【００２５】
回収容器４内には、生体組織補填材Ｂが収容されているので、流入してきた血管新生に有効な有核細胞Ｆが生体組織補填材Ｂに播種されて付着する。これにより、生体組織補填体が製造されることになる。
【００２６】
この場合において、本実施形態に係る製造装置１によれば、２つの三方弁７，９を切り替えて、回収液供給手段としてのシリンジ６を操作するだけで、生体組織補填体を製造できる。したがって、きわめて簡易に生体組織補填体を製造することができる。さらに、製造工程において末梢血Ａおよび生体組織補填材Ｂが、全て外気に触れることなく容器３，４および配管内に維持されるので、感染のおそれがなく、無菌的に生体組織補填体を製造することができるという利点がある。
【００２７】
また、このようにして製造された生体組織補填体に対し、回収容器４に設けられた接続部４ａにシリンジ１０を刺して、カルシウムイオンＤおよびｂ−ＦＧＦを供給することにより、生体組織補填体に付着した血管新生に有効な有核細胞Ｆ、特に、単核球細胞を繊維芽用細胞に変化させることができる。繊維芽用細胞は、間葉系幹細胞と同様の性質を有するので、生体組織補填材Ｂに生着して成長し、骨芽細胞のような生体組織前駆細胞に分化することができ、生体に埋植された後に早期に生体組織の欠損部を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。
【００２８】
次に、本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図５〜図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、図１に示された第１の実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１と同様の製造装置２０を用いて行われるので、構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。なお、第１の実施形態に係る製造装置１における第２の三方弁９および回収液供給手段としてのシリンジ６は不要である。
【００２９】
本実施形態に係る製造方法は、血液容器３に収容した末梢血Ａを第１の三方弁７を開いて細胞捕捉フィルタ２に供給し、血管新生に有効な有核細胞Ｆを細胞捕捉フィルタ２に捕捉させるステップＳ１と、細胞捕捉フィルタ２を通過してドレインバッグ５に収容された赤血球ＥにカルシウムイオンＧまたは０．３〜０．５％生理食塩水を供給するステップＳ２と、第１の三方弁７を切り替えて、ドレインバッグ５内の液体Ｈを細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側から逆方向に細胞捕捉フィルタ２に透過させるステップＳ３と、細胞捕捉フィルタ２を逆方向に透過した液体Ｆ，Ｈを回収容器４の方向に回収するステップＳ４と、回収された液体Ｆ，Ｈを回収容器４内の生体組織補填材Ｂに供給するステップＳ５とを備えている。
【００３０】
ステップＳ１において血管新生に有効な有核細胞Ｆを分離された残りの赤血球Ｅを多く含む末梢血に、ステップＳ２においてカルシウムイオンＧを供給すると、赤血球Ｅが破壊されて内部の血漿成分Ｈがドレインバッグ５内に残る。そして、ステップＳ３においては、ドレインバッグ５内を加圧して、抽出された血漿成分Ｈを含む体液を細胞捕捉フィルタ２側に向けて逆流させる。
【００３１】
あるいは、ドレインバッグ５を細胞捕捉フィルタ２よりも高位に配置して、重力により血漿成分Ｈを含む体液を細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側から入口２ａ側に向かって流動させる。これにより、血漿成分Ｈを含む体液の流動により、細胞捕捉フィルタ２に捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞Ｆが細胞捕捉フィルタ２から剥離され、血漿成分Ｈを含む体液とともに入口２ａ側から流出する。第１の三方弁７は、回収容器４側に接続するように切り替えられているので、ステップＳ４により、血漿成分Ｈと血管新生に有効な有核細胞Ｆとを含む体液が回収容器４内に回収される。
【００３２】
回収容器４内には生体組織補填材Ｂが収容されているので、血管新生に有効な有核細胞Ｆが血漿成分Ｈとともに生体組織補填材Ｂに播種される。血漿成分Ｈは、有核細胞Ｆの生着性を向上するので、生体組織補填材Ｂ上における有核細胞Ｆの成長が促進される。また、ドレインバッグ５に加えるカルシウムイオンＧの濃度を、回収容器４内に流入した液体Ｆ，Ｈ内にカルシウムイオンＧが残存するように設定しておくことにより、カルシウムイオンＧを単核球細胞に作用させて繊維芽様細胞に変化させることができる。
【００３３】
なお、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、血漿成分Ｈを含む液体で細胞捕捉フィルタ２を逆洗することとしたが、これに代えて、ドレインバッグ５内に得られた血漿成分Ｈを多く含む液体を遠心分離して、多血小板血漿（ＰＲＰ）あるいは貧血小板血漿（ＰＰＰ）を得、これを細胞Ｆに添加することにしてもよい。
【００３４】
なお、本実施形態においては、血管新生に有効な単核球細胞等の細胞Ｆを細胞捕獲フィルタ２により捕獲した後、逆洗により剥離させ、生体組織補填材Ｂに播種することとしたが、単核球細胞Ｆの用途は、骨や軟骨の治療の他、樹状細胞を用いた癌治療にも用いられる。
【００３５】
末梢血から得られた単核球細胞を、貪食白血球機能の亢進作用を持つサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した培地中で培養すると、樹状細胞に分化させることができる。これに癌細胞から抽出したタンパク質を貪食させると、取り込まれた癌抗原タンパク質が細胞内で分断されて異常ペプチドを生じ、抗原として樹状細胞表面に提示される。
【００３６】
この樹状細胞を患者に戻すことにより、体内で癌細胞に対する特異的なＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）が誘導され治療効果が得られる。
このことを応用し、回収容器４には生体組織補填材Ｂではなく、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した培地を入れておき、細胞捕捉フィルタ２で捕捉した有核細胞Ｆを流入させる。これを培養することで樹状細胞を無菌的に得ることができ、患者に戻して癌治療を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の製造装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。
【図３】図１の製造装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに捕捉された有核細胞を回収容器内の生体組織補填材に播種するステップを説明する図である。
【図４】図１の製造装置の作用を説明する図であり、回収容器内の生体組織補填材にカルシウムイオンおよびサイトカインを供給するステップを説明する図である
【図５】本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図６】図５の製造方法において、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。
【図７】図５の製造方法において、ドレインバッグに収容された赤血球を多く含む体液にカルシウムイオンを添加するステップを示す図である。
【図８】図７のドレインバッグを加圧して、体液を細胞捕捉フィルタに逆流させるステップを示す図である。
【図９】図８の細胞捕捉フィルタを逆流した細胞および体液を生体組織補填材に供給するステップを示す図である。
【符号の説明】
【００３８】
Ａ 末梢血
Ｂ 生体組織補填材
Ｃ 回収液
１，２０ 製造装置
２ 細胞捕捉フィルタ
３ 血液容器
４ 回収容器
５ ドレインバッグ
６ シリンジ（回収液供給手段）
７ 第１の切替弁
８ 第２の切替弁
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
該細胞捕捉フィルタの入口側に、第１の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および生体組織補填材を収容した回収容器と、
前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第２の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段とを備える生体組織補填体の製造装置。
【請求項２】
前記回収容器が減圧されている請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項３】
前記回収容器に、カルシウムイオンおよびサイトカイン用の注入口が設けられている請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項４】
前記サイトカインがｂ−ＦＧＦである請求項３に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項５】
前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項６】
赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させるステップと、
前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給するステップと、
カルシウムイオンの供給により得られた液体を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させるステップと、
該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収するステップと、
回収された液体を生体組織補填材に供給するステップとを備える生体組織補填体の製造方法。
【請求項７】
前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項６に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項１】
赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
該細胞捕捉フィルタの入口側に、第１の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および生体組織補填材を収容した回収容器と、
前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第２の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球および血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段とを備える生体組織補填体の製造装置。
【請求項２】
前記回収容器が減圧されている請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項３】
前記回収容器に、カルシウムイオンおよびサイトカイン用の注入口が設けられている請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項４】
前記サイトカインがｂ−ＦＧＦである請求項３に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項５】
前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項６】
赤血球および血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに細胞ソースを透過させるステップと、
前記細胞捕捉フィルタを透過した赤血球にカルシウムイオンを供給するステップと、
カルシウムイオンの供給により得られた液体を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させるステップと、
該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収するステップと、
回収された液体を生体組織補填材に供給するステップとを備える生体組織補填体の製造方法。
【請求項７】
前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項６に記載の生体組織補填体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−１８９５９４（Ｐ２００８−１８９５９４Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５７８１（Ｐ２００７−２５７８１）
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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