生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法
【課題】経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たし、従来法でなし得なかった紫外吸光検出器のみによる簡便なグアニジノ化合物の高感度検出法。
【解決手段】弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用い、溶離液としてリン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用し、生体試料中の、特にクレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれるアミンを紫外吸光検出器を用いて測定する方法。および、前記測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
【解決手段】弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用い、溶離液としてリン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用し、生体試料中の、特にクレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれるアミンを紫外吸光検出器を用いて測定する方法。および、前記測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法、およびその方法を用いる疾患を有する患者のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
精神遅滞は人口の２〜３％に認める非常に頻度の高い病態であるが、根本的治療法がないため、その療育における社会的あるいは経済的負担は小さくない。精神遅滞の原因には先天性・後天性の両方があり様々であるが、最近の分子遺伝学的解析により、先天的な遺伝子異常に起因するものが比較的多いことが分かってきた。中でもクレアチンの生合成・代謝に関わるいくつかの遺伝子の欠損が注目されている。原因遺伝子を特定できれば、先天性の精神遅滞については、より効果的な治療法の開発が可能となる。
【０００３】
例えば、脳内クレアチン欠乏症は、重度の精神遅滞を主要症状とし、てんかん、自閉症、重度の言語障害などの様々な臨床症状を有する疾患である。その先天的な原因として、クレアチン生合成に関わるグアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、およびクレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）の遺伝子の欠損が知られている（非特許文献１）。
【０００４】
脳内クレアチン欠乏症は、臨床症状を有する患者の脳を磁気共鳴スペクトル装置（ＭＲＳ）で調べて脳内クレアチン値の低下を確認することにより診断されるが、原因遺伝子を特定する手掛かりを得るには、尿や血液中のクレアチン関連化合物（特にグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比）を測定する必要がある。しかし逆に、クレアチン関連化合物の測定法が充分に簡便なものになれば、例えば新生児に対するスクリーニングに加えることによって、発症前から診断し早期に治療を開始できる可能性もかなり高まるはずである。
【０００５】
一方、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）欠損症患者の尿中グアニジノ酪酸／クレアチニン比が高くなるという報告もある（非特許文献２）。
以上のような背景から、生体試料中のアミン（特に部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物）を簡便に定量できる汎用的なスクリーニング手法の開発が強く望まれている。
部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含むグアニジノ化合物のうち、クレアチンとクレアチニンについては、古くから知られている酵素法、または逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（非特許文献３〜８）を用いれば測定できる。
一方、グアニジノ酢酸については、逆相カラムによるクレアチンおよびクレアチニンとの完全分離が困難なことから、ＬＣ−ＭＳ法（非特許文献９）、ＬＣ−ＭＳＭＳ法（非特許文献１０〜１２）、ＧＣ−ＭＳ法（非特許文献１３）、酵素法（非特許文献１４〜１６）が主に検討されている。しかし、質量分析計（ＭＳ）を併用する方法は、高感度であるが高価な装置を必要とする。また酵素法は、簡便かつ高感度であるが、特殊な酵素の入手が難しい。よって、いずれも限られた施設でしか実施できないため、汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
【０００６】
カーボンカラムによるイオンペアクロマトグラフィー法で、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンを完全分離した例はある（非特許文献３，７）が、溶離液としてイオンペア試薬（界面活性剤）を添加したクエン酸緩衝液／アセトニトリルを用いるため、ポストカラム誘導体化と蛍光検出の組み合わせという煩雑な手法を必要とするばかりか、溶離液の発泡によるトラブルも発生しやすい。逆相カラムでもグアニジノ酢酸を分離定量できる条件を見つけた例はある（非特許文献１７，１８）が、ベンゾインによるプレカラム誘導体化と蛍光検出の組み合わせ、およびグラジエント溶出という煩雑な手法を必要とし、しかもクレアチンとクレアチニンが重なってしまうため、クレアチン／クレアチニン比の測定には使えない。また、逆相カラムとカーボンカラムを組み合わせた二次元高速液体クロマトグラフィー（２Ｄ−ＨＰＬＣ）法を用いるグアニジノ化合物の測定法も報告されている（特許文献１）が、２種類のカラム、ポンプ２台、蛍光検出器２台、流路切替バルブ、および反応槽を伴う大掛かりな装置を必要とし、さらに溶離液へのイオンペア試薬（界面活性剤）の添加が必須であるため、溶離液の発泡によるトラブルが発生しやすい。よって、これらの方法も汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
【０００７】
陽イオンクロマトグラフィーを用いるグアニジノ化合物の測定法も複数報告されているが、いずれも強酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる方法である（特許文献２〜５、非特許文献１７，１８）。強酸性陽イオン交換体はスルホ基のような強酸性官能基を有するので、弱酸であるリン酸の水溶液や緩衝液は溶出力が弱すぎて溶離液として適用できない。よく用いられる硝酸、硫酸、メタンスルホン酸などの強酸の水溶液は紫外（ＵＶ）吸光のバックグランドが高いため、最も汎用的な紫外吸光検出器の利用は困難であり、充分な感度を得るにはプレカラム（またはポストカラム）誘導体化と蛍光検出の組み合わせという煩雑な手法が必要となる（特許文献２〜５）。４種類のクエン酸緩衝液と水酸化ナトリウム水溶液を用いた段階的ｐＨグラジエント法も報告されているが、１〜２時間程度の溶出時間と誘導体化・蛍光検出を必要としている（非特許文献１９，２０）。したがって、これらの方法も汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
【０００８】
一方、生体試料中のアミンをＬＣ−ＭＳ法やＨＰＬＣ法で測定する際は、機器の保護や感度改善などの目的で、あらかじめ除タンパク処理を行なうのが好ましく、沈澱法、限外ろ過法、固相抽出法など種々の方法がある。最近ではミックスモードの固相抽出カートリッジを利用した例もある（非特許文献２１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃ．Ｊａｋｏｂｓら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００５年，第３６１巻，ｐ．１−９
【非特許文献２】Ｅ．Ｅ．Ｗ．Ｊａｎｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２００６年，第１７６２巻，ｐ．４９４−４９８
【非特許文献３】Ｔ．Ｓｍｉｔｈ−Ｐａｌｍｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００２年，第７８１巻，ｐ．９３−１０６
【非特許文献４】Ｇ．Ｗｅｒｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９９０年，第５２５巻，第２号，ｐ．２６５−２７５
【非特許文献５】Ｍ．Ｄｕｎｎｅｔｔら，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９１年，第５１巻，第２号，ｐ．１３７−１４１
【非特許文献６】Ｈ．Ｍｕｒａｋｉｔａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８８年，第４３１巻，第２号，ｐ．４７１−４７３
【非特許文献７】Ｙ．Ｉｎａｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，１９９８年，第７０７巻，ｐ．１１１−１２０
【非特許文献８】Ｔ．Ｓｈｉｒａｉら，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７年，第６３巻，第５号，ｐ．７６９−７７１
【非特許文献９】Ｍ．Ｙａｓｕｄａら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，第２５３巻，ｐ．２３１−２３５
【非特許文献１０】Ｏ．Ｂｏｄａｍｅｒら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００１年，第３０８巻，ｐ．１７３−１７８
【非特許文献１１】Ｓ．Ｃｏｇｎａｔら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４年，第５０巻，第８号，ｐ．１４５９−１４６１
【非特許文献１２】Ｒ．Ｓ．Ｃａｒｌｉｎｇら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８年，第４５巻，ｐ．５７５−５８４
【非特許文献１３】Ｄ．Ｈｕｎｎｅｍａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，１９９７年，第２０巻，ｐ．４５０−４５２
【非特許文献１４】Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７年，第３３巻，第３号，ｐ．３９４−３９７
【非特許文献１５】Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９９１年，第２０２巻，ｐ．２２７−２３６
【非特許文献１６】Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１年，第３７巻，第３号，ｐ．４７８−４７９
【非特許文献１７】Ｃ．Ｃａｒｄｕｃｃｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００１年，第７５５巻，ｐ．３４３−３４８
【非特許文献１８】Ｃ．Ｃａｒｄｕｃｃｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年，第４８巻，第１０号，ｐ．１７７２−１７７８
【非特許文献１９】Ｓ．Ｎａｔｅｌｓｏｎ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４年，第３０巻，第２号，ｐ．２５２−２５８
【非特許文献２０】Ｇ．Ｐｅｒｅｚら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６年，第２２巻，第２号，ｐ．２４０−２４２
【非特許文献２１】Ｙ．Ｏｈｍａｅら，鑑識科学，２００４年，第９巻，第１号，ｐ．７１−７８
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−９７１２号公報
【特許文献２】特開２００２−１０７３５０号公報
【特許文献３】特開平５−１１９０３８号公報
【特許文献４】特開平４−１６１８５４号公報
【特許文献５】特開２００１−１７４４５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
尿や血液中のグアニジノ化合物（例えば、グアニジノ酢酸）を測定する方法としては、背景技術の項で述べたように種々の方法が知られているが、経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たすものがないため、いずれも臨床検査の場で採用されていないのが現状である。本発明が解決しようとする課題は、従来技術の難点を克服し、経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たすグアニジノ化合物の測定方法を提供すること、中でも、従来法でなし得なかった紫外吸光検出器のみによる極めて簡便な高感度検出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは鋭意検討の結果、弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いれば、生体試料中のグアニジノ化合物の測定をはるかに安価・簡便な方法で、しかも迅速に実施できることを見出した。特に、リン酸水溶液、ギ酸水溶液を溶離液に使えるため、紫外吸光検出器のみによる高感度検出が可能となった。カラムに負荷をかけないための除タンパク法として、沈澱法、限外ろ過法、固相抽出法などを組み合わせれば、より実用的な測定方法となる。
【００１３】
本発明は以下の項目からなる。
［１］弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法。
［２］弱酸性陽イオン交換体が、カルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子である前記［１］に記載の測定方法。
［３］溶離液として、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用する前記［１］または［２］に記載の測定方法。
［４］アミンが、紫外吸光法で検出可能なアミンである前記［１］に記載の測定方法。
［５］アミンが、部分構造としてＨ2ＮＣ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物である前記［１］または［４］に記載の測定方法。
［６］アミンが、クレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれる前記［１］、［４］、または［５］に記載の測定方法。
［７］紫外吸光検出器を用いる前記［４］〜［６］のいずれかに記載の測定方法。
［８］生体試料が、ヒトの尿である前記［１］に記載の測定方法。
［９］生体試料が、除タンパク処理されたものである前記［１］または［８］に記載の測定方法。
［１０］前記［１］〜［９］のいずれかに記載の測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
［１１］疾患が、精神・神経疾患である前記［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］精神・神経疾患が、精神遅滞、自閉症および／またはてんかんである前記［１１］に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の測定方法を利用することにより、例えば、精神遅滞などの臨床症状を有する患者の尿中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、グアニジノ酪酸／クレアチニン比を測定し、原因遺伝子を精査すべき患者のスクリーニングが可能となる。また、スクリーニングから得られた情報をもとにグアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、クレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）のいずれかの欠損症に対する遺伝子解析を行ない、それぞれの原因遺伝子欠損症に応じた有効な治療を開始することが期待できる。さらに、新生児の尿を用いたスクリーニング検査を行なうことで、発症前から診断し、早期に治療を開始できる可能性もある。
【００１５】
本発明の測定方法による有意点は、最も汎用的な液体クロマトグラフィー用装置である紫外吸光検出器付きＨＰＬＣ装置に市販の弱酸性陽イオンクロマトグラフィー用カラムを取り付けるだけでも実施可能であり、また、有機溶媒を用いなくても測定可能である点である。特別な廃液処理を必要とせず環境にも優しく、機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも安価で容易に導入できる画期的な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：２ｍＭリン酸水溶液）。
【図２】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：５ｍＭリン酸水溶液）。
【図３】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：１０ｍＭリン酸水溶液）。
【図４】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチン、グアニジノ酢酸、溶離液：リン酸水溶液）。
【図５】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチニン、溶離液：リン酸水溶液）。
【図６】健常人の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：２ｍＭリン酸水溶液）。
【図７】ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：２ｍＭリン酸水溶液）。
【図８】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０３％ギ酸水溶液）。
【図９】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０５％ギ酸水溶液）。
【図１０】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：０.１％ギ酸水溶液）。
【図１１】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチン、グアニジノ酢酸、溶離液：ギ酸水溶液）。
【図１２】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチニン、溶離液：ギ酸水溶液）。
【図１３】健常人の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０３％ギ酸水溶液）。
【図１４】ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０３％ギ酸水溶液）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明で用いる弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムは、特に限定されないが、例えばカルボキシル基を有する基材、好ましくはカルボキシル基を有するポリマー粒子、より好ましくはカルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子が充填されたカラムであり、その形状は円柱状のものに限らず、キャピラリーカラムのようなものでもよい。また、カラム内重合法で製造され必要に応じて修飾されるモノリスカラムなども含まれる。好ましい市販カラムとしては、例えばＳｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）などが挙げられる。
【００１８】
本発明でいう生体試料とは、特に限定されないが、例えば尿、血液、脳脊髄液であり、好ましくはヒトの尿である。また、除タンパク処理されたものが好ましく、アセトニトリルの添加による沈澱法で除タンパク処理されたものがより好ましい。
【００１９】
本発明でいうアミンは、脂肪族アミンでも芳香族アミンでもよく、１級、２級、３級のアミノ基またはアンモニウム基、あるいは４級アンモニウム基のいずれかを含むものであれば特に限定されないが、好ましくは紫外吸光法で検出可能なアミン、より好ましくは部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物、さらに好ましくはクレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、グアニジノ酪酸からなる群から選ばれる化合物である。
【００２０】
本発明で用いる溶離液は、特に限定されないが、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒が、紫外（ＵＶ）吸光のバックグランドが低いので好ましい。環境に配慮して、有機溶媒を使用しない溶離液を選択することもできる。場合によっては純水を使用できる可能性もある。溶離液のｐＨは２以上７以下が好ましい。
【００２１】
本発明で用いる検出器は、特に限定されないが、例えば紫外吸光検出器、紫外可視吸光検出器、示差屈折検出器、蛍光検出器、化学発光検出器などが挙げられる。高価な質量分析計を併用しないでアミンそのものを検出するのが簡便で好ましいが、感度を上げるためにポストカラム法などで誘導体化したものを検出してもよい。機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも容易に導入できるという観点からは、紫外吸光検出器のみでアミンそのものを検出する方法が最も好ましい。検出波長は特に限定されないが、例えば２００〜３００ｎｍ、好ましくは２０５〜２８０ｎｍ、より好ましくは２１０〜２６０ｎｍである。
【００２２】
本発明の測定方法を用いるスクリーニング方法の対象となる疾患は、特に限定されないが、例えば精神・神経疾患、腎疾患、悪性腫瘍などが挙げられる。これらの疾患の中でも、精神遅滞、自閉症、てんかんなどの精神・神経疾患が好ましく、特に精神遅滞が好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は下記の例により何等限定されるものではない。
【００２４】
実施例１：標準試料の測定
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図１に示す。上記条件のうち溶離液のみを２ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３．５）から５ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３）、１０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約２）に換えて測定したクロマトグラムを各々図２、図３に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図４（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図５（クレアチニン）に示す。
【００２５】
実施例２：尿の測定１
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例１と同様の条件で測定した。
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図６に示す。
【００２６】
実施例３：尿の測定２
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例２と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図７に示す。
【００２７】
実施例４：標準試料の測定
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図８に示す。上記条件のうち溶離液のみを０．０３％ギ酸水溶液から０．０５％ギ酸水溶液、０．１％ギ酸水溶液に換えて測定したクロマトグラムを各々図９、図１０に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図１１（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図１２（クレアチニン）に示す。
【００２８】
実施例５：尿の測定３
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例４と同様の条件で測定した。
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図１３に示す。
【００２９】
実施例６：尿の測定４
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例５と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図１４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明の測定方法を利用することにより、例えば、精神遅滞などの臨床症状を有する患者の尿中のグアニジノ酢酸、クレアチン／クレアチニン比を測定し、原因遺伝子を精査すべき患者のスクリーニングが可能となる。また、スクリーニングから得られた情報をもとに遺伝子解析を行ない、グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、およびクレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）のいずれかの欠損症を特定できた場合、それぞれの原因遺伝子欠損症に応じた有効な治療を開始できる。さらに、新生児の尿検査を行なうことで、早期に治療を開始できる可能性もある。本発明の測定方法は、最も汎用的な液体クロマトグラフィー用装置である紫外吸光検出器付きＨＰＬＣ装置に、市販の弱酸性陽イオンクロマトグラフィー用カラムを取り付けるだけでも実施可能であるため、機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも容易に導入できる。また、有機溶媒を用いなくても測定可能なので、特別な廃液処理を必要とせず環境にも優しい。
さらに、溶離液としてギ酸水溶液を用いた場合、質量分析計（ＭＳ）との併用も可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法、およびその方法を用いる疾患を有する患者のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
精神遅滞は人口の２〜３％に認める非常に頻度の高い病態であるが、根本的治療法がないため、その療育における社会的あるいは経済的負担は小さくない。精神遅滞の原因には先天性・後天性の両方があり様々であるが、最近の分子遺伝学的解析により、先天的な遺伝子異常に起因するものが比較的多いことが分かってきた。中でもクレアチンの生合成・代謝に関わるいくつかの遺伝子の欠損が注目されている。原因遺伝子を特定できれば、先天性の精神遅滞については、より効果的な治療法の開発が可能となる。
【０００３】
例えば、脳内クレアチン欠乏症は、重度の精神遅滞を主要症状とし、てんかん、自閉症、重度の言語障害などの様々な臨床症状を有する疾患である。その先天的な原因として、クレアチン生合成に関わるグアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、およびクレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）の遺伝子の欠損が知られている（非特許文献１）。
【０００４】
脳内クレアチン欠乏症は、臨床症状を有する患者の脳を磁気共鳴スペクトル装置（ＭＲＳ）で調べて脳内クレアチン値の低下を確認することにより診断されるが、原因遺伝子を特定する手掛かりを得るには、尿や血液中のクレアチン関連化合物（特にグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比）を測定する必要がある。しかし逆に、クレアチン関連化合物の測定法が充分に簡便なものになれば、例えば新生児に対するスクリーニングに加えることによって、発症前から診断し早期に治療を開始できる可能性もかなり高まるはずである。
【０００５】
一方、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）欠損症患者の尿中グアニジノ酪酸／クレアチニン比が高くなるという報告もある（非特許文献２）。
以上のような背景から、生体試料中のアミン（特に部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物）を簡便に定量できる汎用的なスクリーニング手法の開発が強く望まれている。
部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含むグアニジノ化合物のうち、クレアチンとクレアチニンについては、古くから知られている酵素法、または逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（非特許文献３〜８）を用いれば測定できる。
一方、グアニジノ酢酸については、逆相カラムによるクレアチンおよびクレアチニンとの完全分離が困難なことから、ＬＣ−ＭＳ法（非特許文献９）、ＬＣ−ＭＳＭＳ法（非特許文献１０〜１２）、ＧＣ−ＭＳ法（非特許文献１３）、酵素法（非特許文献１４〜１６）が主に検討されている。しかし、質量分析計（ＭＳ）を併用する方法は、高感度であるが高価な装置を必要とする。また酵素法は、簡便かつ高感度であるが、特殊な酵素の入手が難しい。よって、いずれも限られた施設でしか実施できないため、汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
【０００６】
カーボンカラムによるイオンペアクロマトグラフィー法で、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンを完全分離した例はある（非特許文献３，７）が、溶離液としてイオンペア試薬（界面活性剤）を添加したクエン酸緩衝液／アセトニトリルを用いるため、ポストカラム誘導体化と蛍光検出の組み合わせという煩雑な手法を必要とするばかりか、溶離液の発泡によるトラブルも発生しやすい。逆相カラムでもグアニジノ酢酸を分離定量できる条件を見つけた例はある（非特許文献１７，１８）が、ベンゾインによるプレカラム誘導体化と蛍光検出の組み合わせ、およびグラジエント溶出という煩雑な手法を必要とし、しかもクレアチンとクレアチニンが重なってしまうため、クレアチン／クレアチニン比の測定には使えない。また、逆相カラムとカーボンカラムを組み合わせた二次元高速液体クロマトグラフィー（２Ｄ−ＨＰＬＣ）法を用いるグアニジノ化合物の測定法も報告されている（特許文献１）が、２種類のカラム、ポンプ２台、蛍光検出器２台、流路切替バルブ、および反応槽を伴う大掛かりな装置を必要とし、さらに溶離液へのイオンペア試薬（界面活性剤）の添加が必須であるため、溶離液の発泡によるトラブルが発生しやすい。よって、これらの方法も汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
【０００７】
陽イオンクロマトグラフィーを用いるグアニジノ化合物の測定法も複数報告されているが、いずれも強酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる方法である（特許文献２〜５、非特許文献１７，１８）。強酸性陽イオン交換体はスルホ基のような強酸性官能基を有するので、弱酸であるリン酸の水溶液や緩衝液は溶出力が弱すぎて溶離液として適用できない。よく用いられる硝酸、硫酸、メタンスルホン酸などの強酸の水溶液は紫外（ＵＶ）吸光のバックグランドが高いため、最も汎用的な紫外吸光検出器の利用は困難であり、充分な感度を得るにはプレカラム（またはポストカラム）誘導体化と蛍光検出の組み合わせという煩雑な手法が必要となる（特許文献２〜５）。４種類のクエン酸緩衝液と水酸化ナトリウム水溶液を用いた段階的ｐＨグラジエント法も報告されているが、１〜２時間程度の溶出時間と誘導体化・蛍光検出を必要としている（非特許文献１９，２０）。したがって、これらの方法も汎用的なスクリーニング手法にはなり得ない。
【０００８】
一方、生体試料中のアミンをＬＣ−ＭＳ法やＨＰＬＣ法で測定する際は、機器の保護や感度改善などの目的で、あらかじめ除タンパク処理を行なうのが好ましく、沈澱法、限外ろ過法、固相抽出法など種々の方法がある。最近ではミックスモードの固相抽出カートリッジを利用した例もある（非特許文献２１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃ．Ｊａｋｏｂｓら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００５年，第３６１巻，ｐ．１−９
【非特許文献２】Ｅ．Ｅ．Ｗ．Ｊａｎｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２００６年，第１７６２巻，ｐ．４９４−４９８
【非特許文献３】Ｔ．Ｓｍｉｔｈ−Ｐａｌｍｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００２年，第７８１巻，ｐ．９３−１０６
【非特許文献４】Ｇ．Ｗｅｒｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９９０年，第５２５巻，第２号，ｐ．２６５−２７５
【非特許文献５】Ｍ．Ｄｕｎｎｅｔｔら，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９１年，第５１巻，第２号，ｐ．１３７−１４１
【非特許文献６】Ｈ．Ｍｕｒａｋｉｔａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８８年，第４３１巻，第２号，ｐ．４７１−４７３
【非特許文献７】Ｙ．Ｉｎａｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，１９９８年，第７０７巻，ｐ．１１１−１２０
【非特許文献８】Ｔ．Ｓｈｉｒａｉら，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７年，第６３巻，第５号，ｐ．７６９−７７１
【非特許文献９】Ｍ．Ｙａｓｕｄａら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，第２５３巻，ｐ．２３１−２３５
【非特許文献１０】Ｏ．Ｂｏｄａｍｅｒら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００１年，第３０８巻，ｐ．１７３−１７８
【非特許文献１１】Ｓ．Ｃｏｇｎａｔら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４年，第５０巻，第８号，ｐ．１４５９−１４６１
【非特許文献１２】Ｒ．Ｓ．Ｃａｒｌｉｎｇら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８年，第４５巻，ｐ．５７５−５８４
【非特許文献１３】Ｄ．Ｈｕｎｎｅｍａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，１９９７年，第２０巻，ｐ．４５０−４５２
【非特許文献１４】Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７年，第３３巻，第３号，ｐ．３９４−３９７
【非特許文献１５】Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９９１年，第２０２巻，ｐ．２２７−２３６
【非特許文献１６】Ｙ．Ｓｈｉｒｏｋａｎｅら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１年，第３７巻，第３号，ｐ．４７８−４７９
【非特許文献１７】Ｃ．Ｃａｒｄｕｃｃｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００１年，第７５５巻，ｐ．３４３−３４８
【非特許文献１８】Ｃ．Ｃａｒｄｕｃｃｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年，第４８巻，第１０号，ｐ．１７７２−１７７８
【非特許文献１９】Ｓ．Ｎａｔｅｌｓｏｎ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４年，第３０巻，第２号，ｐ．２５２−２５８
【非特許文献２０】Ｇ．Ｐｅｒｅｚら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６年，第２２巻，第２号，ｐ．２４０−２４２
【非特許文献２１】Ｙ．Ｏｈｍａｅら，鑑識科学，２００４年，第９巻，第１号，ｐ．７１−７８
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−９７１２号公報
【特許文献２】特開２００２−１０７３５０号公報
【特許文献３】特開平５−１１９０３８号公報
【特許文献４】特開平４−１６１８５４号公報
【特許文献５】特開２００１−１７４４５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
尿や血液中のグアニジノ化合物（例えば、グアニジノ酢酸）を測定する方法としては、背景技術の項で述べたように種々の方法が知られているが、経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たすものがないため、いずれも臨床検査の場で採用されていないのが現状である。本発明が解決しようとする課題は、従来技術の難点を克服し、経済性、簡便性、および迅速性を同時に満たすグアニジノ化合物の測定方法を提供すること、中でも、従来法でなし得なかった紫外吸光検出器のみによる極めて簡便な高感度検出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは鋭意検討の結果、弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いれば、生体試料中のグアニジノ化合物の測定をはるかに安価・簡便な方法で、しかも迅速に実施できることを見出した。特に、リン酸水溶液、ギ酸水溶液を溶離液に使えるため、紫外吸光検出器のみによる高感度検出が可能となった。カラムに負荷をかけないための除タンパク法として、沈澱法、限外ろ過法、固相抽出法などを組み合わせれば、より実用的な測定方法となる。
【００１３】
本発明は以下の項目からなる。
［１］弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法。
［２］弱酸性陽イオン交換体が、カルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子である前記［１］に記載の測定方法。
［３］溶離液として、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用する前記［１］または［２］に記載の測定方法。
［４］アミンが、紫外吸光法で検出可能なアミンである前記［１］に記載の測定方法。
［５］アミンが、部分構造としてＨ2ＮＣ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物である前記［１］または［４］に記載の測定方法。
［６］アミンが、クレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれる前記［１］、［４］、または［５］に記載の測定方法。
［７］紫外吸光検出器を用いる前記［４］〜［６］のいずれかに記載の測定方法。
［８］生体試料が、ヒトの尿である前記［１］に記載の測定方法。
［９］生体試料が、除タンパク処理されたものである前記［１］または［８］に記載の測定方法。
［１０］前記［１］〜［９］のいずれかに記載の測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
［１１］疾患が、精神・神経疾患である前記［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］精神・神経疾患が、精神遅滞、自閉症および／またはてんかんである前記［１１］に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の測定方法を利用することにより、例えば、精神遅滞などの臨床症状を有する患者の尿中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、グアニジノ酪酸／クレアチニン比を測定し、原因遺伝子を精査すべき患者のスクリーニングが可能となる。また、スクリーニングから得られた情報をもとにグアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、クレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）のいずれかの欠損症に対する遺伝子解析を行ない、それぞれの原因遺伝子欠損症に応じた有効な治療を開始することが期待できる。さらに、新生児の尿を用いたスクリーニング検査を行なうことで、発症前から診断し、早期に治療を開始できる可能性もある。
【００１５】
本発明の測定方法による有意点は、最も汎用的な液体クロマトグラフィー用装置である紫外吸光検出器付きＨＰＬＣ装置に市販の弱酸性陽イオンクロマトグラフィー用カラムを取り付けるだけでも実施可能であり、また、有機溶媒を用いなくても測定可能である点である。特別な廃液処理を必要とせず環境にも優しく、機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも安価で容易に導入できる画期的な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：２ｍＭリン酸水溶液）。
【図２】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：５ｍＭリン酸水溶液）。
【図３】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：１０ｍＭリン酸水溶液）。
【図４】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチン、グアニジノ酢酸、溶離液：リン酸水溶液）。
【図５】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチニン、溶離液：リン酸水溶液）。
【図６】健常人の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：２ｍＭリン酸水溶液）。
【図７】ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：２ｍＭリン酸水溶液）。
【図８】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０３％ギ酸水溶液）。
【図９】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０５％ギ酸水溶液）。
【図１０】標準試料を測定したクロマトグラム（溶離液：０.１％ギ酸水溶液）。
【図１１】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチン、グアニジノ酢酸、溶離液：ギ酸水溶液）。
【図１２】溶離液濃度と保持時間の関係（クレアチニン、溶離液：ギ酸水溶液）。
【図１３】健常人の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０３％ギ酸水溶液）。
【図１４】ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿を測定したクロマトグラム（溶離液：０.０３％ギ酸水溶液）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明で用いる弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムは、特に限定されないが、例えばカルボキシル基を有する基材、好ましくはカルボキシル基を有するポリマー粒子、より好ましくはカルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子が充填されたカラムであり、その形状は円柱状のものに限らず、キャピラリーカラムのようなものでもよい。また、カラム内重合法で製造され必要に応じて修飾されるモノリスカラムなども含まれる。好ましい市販カラムとしては、例えばＳｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）などが挙げられる。
【００１８】
本発明でいう生体試料とは、特に限定されないが、例えば尿、血液、脳脊髄液であり、好ましくはヒトの尿である。また、除タンパク処理されたものが好ましく、アセトニトリルの添加による沈澱法で除タンパク処理されたものがより好ましい。
【００１９】
本発明でいうアミンは、脂肪族アミンでも芳香族アミンでもよく、１級、２級、３級のアミノ基またはアンモニウム基、あるいは４級アンモニウム基のいずれかを含むものであれば特に限定されないが、好ましくは紫外吸光法で検出可能なアミン、より好ましくは部分構造としてＨ2Ｎ−Ｃ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物、さらに好ましくはクレアチン、グアニジノ酢酸（別名：グリコシアミン）、クレアチニン、グアニジノ酪酸からなる群から選ばれる化合物である。
【００２０】
本発明で用いる溶離液は、特に限定されないが、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒が、紫外（ＵＶ）吸光のバックグランドが低いので好ましい。環境に配慮して、有機溶媒を使用しない溶離液を選択することもできる。場合によっては純水を使用できる可能性もある。溶離液のｐＨは２以上７以下が好ましい。
【００２１】
本発明で用いる検出器は、特に限定されないが、例えば紫外吸光検出器、紫外可視吸光検出器、示差屈折検出器、蛍光検出器、化学発光検出器などが挙げられる。高価な質量分析計を併用しないでアミンそのものを検出するのが簡便で好ましいが、感度を上げるためにポストカラム法などで誘導体化したものを検出してもよい。機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも容易に導入できるという観点からは、紫外吸光検出器のみでアミンそのものを検出する方法が最も好ましい。検出波長は特に限定されないが、例えば２００〜３００ｎｍ、好ましくは２０５〜２８０ｎｍ、より好ましくは２１０〜２６０ｎｍである。
【００２２】
本発明の測定方法を用いるスクリーニング方法の対象となる疾患は、特に限定されないが、例えば精神・神経疾患、腎疾患、悪性腫瘍などが挙げられる。これらの疾患の中でも、精神遅滞、自閉症、てんかんなどの精神・神経疾患が好ましく、特に精神遅滞が好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は下記の例により何等限定されるものではない。
【００２４】
実施例１：標準試料の測定
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図１に示す。上記条件のうち溶離液のみを２ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３．５）から５ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約３）、１０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ約２）に換えて測定したクロマトグラムを各々図２、図３に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図４（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図５（クレアチニン）に示す。
【００２５】
実施例２：尿の測定１
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例１と同様の条件で測定した。
溶離液：２ｍＭリン酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図６に示す。
【００２６】
実施例３：尿の測定２
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに２ｍＭリン酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例２と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図７に示す。
【００２７】
実施例４：標準試料の測定
ＨＰＬＣ装置を用いて、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニンの測定を行なった。測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＩＣ ＹＳ−５０（４．６ｍｍＩＤ＊１２５ｍｍ）（昭和電工（株）製）、
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
記録計：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋ ＣＲ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ（（株）島津製作所製）、
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液、
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、
温度 ：室温（２５℃）、
試料と注入量：１０ｐｐｍ クレアチン ２５μｌ、
５０ｐｐｍ グアニジノ酢酸 ２５μｌ、
１０ｐｐｍ クレアチニン ２５μｌ、
（以上３種を混合注入）。
上記条件で測定したクロマトグラムを図８に示す。上記条件のうち溶離液のみを０．０３％ギ酸水溶液から０．０５％ギ酸水溶液、０．１％ギ酸水溶液に換えて測定したクロマトグラムを各々図９、図１０に示す。これらの結果から得られたリン酸水溶液濃度と保持時間の関係を図１１（クレアチン、グアニジノ酢酸）、図１２（クレアチニン）に示す。
【００２８】
実施例５：尿の測定３
健常人の尿５００μｌにアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例４と同様の条件で測定した。
溶離液：０．０３％ギ酸水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ：室温（２５℃）
注入量：２５μｌ
得られたクロマトグラムを図１３に示す。
【００２９】
実施例６：尿の測定４
ＳＬＣ６Ａ８欠損症患者の尿にアセトニトリル５００μｌを加えて混合し、１０分間静置後に１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をメンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過し、ろ液１００μｌに０．０３％ギ酸水溶液を４００μｌ加えて混合したものを試料とし、実施例５と同様の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図１４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明の測定方法を利用することにより、例えば、精神遅滞などの臨床症状を有する患者の尿中のグアニジノ酢酸、クレアチン／クレアチニン比を測定し、原因遺伝子を精査すべき患者のスクリーニングが可能となる。また、スクリーニングから得られた情報をもとに遺伝子解析を行ない、グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）、アルギニン・グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）、およびクレアチントランスポーター（ＳＬＣ６Ａ８）のいずれかの欠損症を特定できた場合、それぞれの原因遺伝子欠損症に応じた有効な治療を開始できる。さらに、新生児の尿検査を行なうことで、早期に治療を開始できる可能性もある。本発明の測定方法は、最も汎用的な液体クロマトグラフィー用装置である紫外吸光検出器付きＨＰＬＣ装置に、市販の弱酸性陽イオンクロマトグラフィー用カラムを取り付けるだけでも実施可能であるため、機器分析の専門家がいない多くの医療施設でも容易に導入できる。また、有機溶媒を用いなくても測定可能なので、特別な廃液処理を必要とせず環境にも優しい。
さらに、溶離液としてギ酸水溶液を用いた場合、質量分析計（ＭＳ）との併用も可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法。
【請求項２】
弱酸性陽イオン交換体が、カルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
溶離液として、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用する請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
アミンが、紫外吸光法で検出可能なアミンである請求項１に記載の測定方法。
【請求項５】
アミンが、部分構造としてＨ2ＮＣ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物である請求項１または４に記載の測定方法。
【請求項６】
アミンが、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれる請求項１、４または５に記載の測定方法。
【請求項７】
紫外吸光検出器を用いる請求項４〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
生体試料が、ヒトの尿である請求項１に記載の測定方法。
【請求項９】
生体試料が、除タンパク処理されたものである請求項１または８に記載の測定方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
【請求項１１】
疾患が、精神・神経疾患である請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
精神・神経疾患が、精神遅滞、自閉症および／またはてんかんである請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
弱酸性陽イオン交換体が充填された陽イオンクロマトグラフィー用カラムを用いる生体試料中のアミンの測定方法。
【請求項２】
弱酸性陽イオン交換体が、カルボキシル基を有する親水性ポリマー粒子である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
溶離液として、リン酸水溶液、リン酸緩衝液、ギ酸水溶液、ギ酸緩衝液またはそのいずれかとアセトニトリルまたはメタノールとの混合溶媒を使用する請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
アミンが、紫外吸光法で検出可能なアミンである請求項１に記載の測定方法。
【請求項５】
アミンが、部分構造としてＨ2ＮＣ（＝Ｎ）−Ｎを含む化合物である請求項１または４に記載の測定方法。
【請求項６】
アミンが、クレアチン、グアニジノ酢酸、クレアチニン、およびグアニジノ酪酸からなる群から選ばれる請求項１、４または５に記載の測定方法。
【請求項７】
紫外吸光検出器を用いる請求項４〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
生体試料が、ヒトの尿である請求項１に記載の測定方法。
【請求項９】
生体試料が、除タンパク処理されたものである請求項１または８に記載の測定方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の測定方法による患者の生体試料中のグアニジノ酢酸／クレアチニン比、クレアチン／クレアチニン比、および／またはグアニジノ酪酸／クレアチニン比の値に基づいて原因遺伝子を精査すべき疾患を有する患者を選別するスクリーニング方法。
【請求項１１】
疾患が、精神・神経疾患である請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
精神・神経疾患が、精神遅滞、自閉症および／またはてんかんである請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１８０１３０（Ｐ２０１１−１８０１３０Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９５６１（Ｐ２０１１−１９５６１）
【出願日】平成２３年２月１日（２０１１．２．１）
【出願人】（５１０１２６３７９）地方独立行政法人神奈川県立病院機構 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１日（２０１１．２．１）
【出願人】（５１０１２６３７９）地方独立行政法人神奈川県立病院機構 (2)
【Ｆターム（参考）】
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