生体試料標本の作製方法
【課題】簡便な操作で、多数の抗原を標的とする免疫反応を行うことができ、しかも、同時実験で結果を比較することができる生体試料標本の作製方法を提供すること。
【解決手段】パラフィンブロック２に通孔４形成する工程、該パラフィンブロック２の通孔４内に筒状のセパレータ３を配置する工程、セパレータ３内に組織を充填すると共に、該組織の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該パラフィンブロック２にて組織が包埋された固形試料１０を切断刃によって薄切し、該組織８の周囲にセパレータ３およびパラフィンが配置された薄切片１２を得る工程、薄切片１２を水で処理することにより該組織周囲のパラフィンを破断して該組織から該パラフィンを分離する工程、複数の該組織をスライドガラス２４上に乗せる工程、および該組織を染色する工程、を包含する生体試料標本の作製方法である。
【解決手段】パラフィンブロック２に通孔４形成する工程、該パラフィンブロック２の通孔４内に筒状のセパレータ３を配置する工程、セパレータ３内に組織を充填すると共に、該組織の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該パラフィンブロック２にて組織が包埋された固形試料１０を切断刃によって薄切し、該組織８の周囲にセパレータ３およびパラフィンが配置された薄切片１２を得る工程、薄切片１２を水で処理することにより該組織周囲のパラフィンを破断して該組織から該パラフィンを分離する工程、複数の該組織をスライドガラス２４上に乗せる工程、および該組織を染色する工程、を包含する生体試料標本の作製方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織、細胞などの生体試料標本の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料（例えば組織切片、タッチスメア、細胞等）に存在する特定の標的物質（例えば抗原）の存在を判別する手法として、該標的物質をシグナルとして可視化し検出する免疫染色法が従来から用いられている。例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法および放射性同位元素標識抗体法がある。
【０００３】
蛍光抗体法は、標的抗原に対する抗体、通常はモノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、組織切片上の抗原の分布を判別する手法で、直説法と間接法の２つの二重染色法に分類することができる。前者では、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、後者では、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させ、いわば間接的に標的抗原を可視化する。
【０００４】
酵素抗体法は、同様に抗原−抗体反応という特異反応を利用する手法である。抗体を酵素で標識し、抗原−抗体反応後に該酵素によって発色基質の沈着を生じさせて抗体の局在を示す点に特徴がある。標識酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ；ＧＯ）等が代表的である。
【０００５】
酵素抗体法には、酵素標識抗体法である直説法、間接法およびアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ）法と、非標識抗体法としてのペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ）法とがあり、卵白の塩基性蛋白質であるアビジンに代わり、中性に荷電した、即ち中性化処理が不要なストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を用いるストレプトアビジン・ビオチン化抗体（Ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＡＢまたはＬＳＡＢ）法が主流となっている。
【０００６】
対象生体試料を上記免疫染色法に供する場合、通常、凍結切片やパラフィン切片として固相のマトリクス上に固定したものを調製して反応に付する。
【０００７】
このように免疫的染色法を用いることにより、組織または細胞に存在する種々ペプチド性抗原（組織抗原、腫瘍抗原、免疫担当細胞亜型抗原、酵素、ホルモン等）、非ペプチド性の抗原、その他組織に沈着する免疫複合体等の検出が可能であり、各種疾患の診断マーカーの分布を判別することによる病理診断（例えば腫瘍マーカーの判別による腫瘍診断）も行われている。
【０００８】
しかしながら、従来の免疫染色法では、作成した組織標本または細胞標本一つにつき、一種類の免疫反応しか行えないため、コントロールを含めた免疫反応を行う場合にはそれに応じた数の標本を調製する必要があり、資源と手間が要求される。それゆえ、適切なコントロールを用いて実験することが資源と手間の関係上困難であり、実際の病理学的試験においても、適切なコントロールを欠く試験が行われているのが現状である。
【０００９】
特表２０００−５０５４３１号公報には、固形のパラフィンブロックに複数の穴を形成し（段落００５０）、その穴内にドナー腫瘍ブロックから採取した組織生検を配列し、そのブロックから組織標本用切片を得ることが記載されている（段落００５１−００５３）。
【００１０】
特開２００４−２５８０１７号公報には、臓器の目的とする部分から複数の組織を切り抜き、これをパラフィンに包埋してアレイブロックを作製する方法が提案されている。
【００１１】
しかし、これらに記載の方法では、組織間のばらつきもあり、必ずしも、適切なコントロールが提供できるわけではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０００−５０５４３１号公報
【特許文献２】特開２００４−２５８０１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、簡便な操作で、適切なコントロールを伴う免疫反応を行うことができ、しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で結果を比較することができる生体試料標本の作製方法を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明の他の目的は、複数のタンパク質の検出において、全ての試料に対して、適切なコントロールを提供する生体試料標本の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の生体試料標本の作製方法は、パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に組織を充填すると共に、該組織の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にセパレータおよびパラフィンが配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該組織周囲のパラフィンを破断して該組織から該パラフィンを分離する工程、複数の該組織をスライドガラス上に乗せる工程、および該組織を染色する工程、を包含し、そのことにより上記目的が達成される。
【００１６】
一つの実施形態では、前記一次抗体と反応し得る層が、羊膜である。別の実施形態では、前記一次抗体と反応し得る層が、患者（１人または複数）由来の疾患関連抗原を発現する組織である。複数の患者由来の組織を用いる場合、前記一次抗体と反応し得る層が、多様な抗体に対する陽性コントロールとして機能する。他に一次抗体と反応し得る層として、細胞株を生やしたシート状のゼラチンなどの膜や、薄切された、パラフィンブロックの組織片などが陽性コントロールとして機能する。
【００１７】
一つの実施形態では、前記セパレータが、吸水により体積膨張し得る材料よりなる。別の実施形態では、前記セパレータが、熱により体積膨張し得る材料よりなる。好ましくは、前記セパレータの、吸水、および／または、熱による体積膨張率は、パラフィンブロックの体積膨張率よりも大きい。
【００１８】
一つの実施形態では、前記セパレータが寒天、または、ゼリーである。
【００１９】
本発明の疾患の病理診断方法は、上記方法を用いることを含む。
【００２０】
また、本発明の他の生体試料標本の作製方法は、ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に生体試料を充填すると共に、該生体試料の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲にセパレータおよび包埋剤が配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該生体試料の周囲のパラフィンを破断して該生体試料から包埋剤を分離する工程、複数の該生体試料をスライドガラス上に乗せる工程、および該生体試料を染色する工程、を包含する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得、複数の該薄切片をスライドガラス上に乗せることにより、一度の操作で標的分析物質−特異的結合物質の結合反応を多数同時に行え、多数の標的物質（抗原）の同時染色が可能になる。また、標的分析物質に対する特異的結合物質の所要量も従来法に比べて微量で済む。しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で結果を比較することができる。
【００２２】
さらに、ブロックに形成した通孔と組織との間に一次抗体と反応し得る層を形成することにより、薄切片における組織の周囲には該一次抗体と反応し得る層が形成される。そのため一次抗体を加えて反応させることによって、一次抗体と標本との反応のポジティブコントロールが提供されることから、追加のコントロール試料を提供することなしに、各標本での免疫染色が確実に行われたことを確認することが可能となり、それゆえ、時間と労力とを節約した効率よい病理学的試験が可能となる。
【００２３】
さらに、組織の周囲にセパレータおよびパラフィンが配置された薄切片を得、この薄切片を水で処理することにより組織周囲のパラフィンを破断して組織から該パラフィンを分離する。従って、パラフィンを除去する手段によって組織から分離する必要がない。そのため、処理工程が簡略化できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明に係わる生体試料標本の作製方法に使用するパラフィンブロックの通孔内にセパレータを配置した状態の斜視図である。
【図２】図２は、本発明に係わる生体試料標本の作製方法に使用するパラフィンブロックの通孔に組織を充填した状態の斜視図である。
【図３】図３は、セパレータの作成方法を示す断面図である。
【図４】図４は、セパレータの作用説明図である。
【図５】図５は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置する状態の分解斜視図である。
【図６】図６は、ガラス基板上に弾性層を設けた状態の断面図である。
【図７】図７は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置する状態の断面である。
【図８】図８は、本発明の生体試料標本の作製方法の他の実施形態の作用説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明にかかる方法には、当該技術分野における当業者によって従来から通常用いられる各種染色法の原理を適用することができ、通常はこれらの各種染色法を用いることで検出可能なシグナルを生成させ、標的とする分析物質を判別することができる。
【００２６】
例として、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法等の原理の適用が可能である他、核酸分子を特異的結合物質として用い、核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することも可能である（例えばＦＩＳＨ法：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）。また、前記各種抗体法は、目的に応じて直説法、即ち、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、検出する手法でも、間接法、即ち、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させて、間接的に標的抗原を可視化し、検出する手法でもよい。特異的結合物質を標識するための標識物質・標識の仕方は適宜選択される。
【００２７】
本発明において用いる「被検生体試料」とは、主に生物の組織検体、生物の液状検体または細胞の検体を含んだ試料を意味する。生物種は特に限定されず哺乳動物、両生類、爬虫類等いずれの種であってもよいが、標的分析物質に対応する抗体蛋白質や核酸分子が最もよく知られている種である哺乳動物が好適であり、より好適なのはヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ウマ、サル等で、更に好適なのはヒト、マウス、ラットで、最も好適なのはヒトである。用いられる組織、生物の液状検体、細胞は、通常、組織であれば切片またはタッチスメアとして調製し使用することができ、液状検体であればスメア標本として調製し使用することができ、また、細胞であればやはりスメア標本にして使用することができる。
【００２８】
前記標本は自体公知の方法により容易に調整することができる。用いられる組織、液状検体、細胞は特に限定されずいずれの種類であっても使用可能で、（１）組織の例としては脳組織、肺、胃、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管組織（小腸、大腸、直腸、結腸など）、皮膚組織、神経組織、血管組織、骨格筋（筋肉）・軟骨組織等があげられ、（２）液状検体の例としては胸水、腹水、尿、等があげられ、（３）細胞としては、接着性で塊を形成している細胞、浮遊性の細胞、等限定されず、例えば、前記組織を構成する細胞（脳細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、軟骨細胞等）、血球系細胞（赤血球、血小板細胞、各種白血球・リンパ球（たとえば単球、好中球、好塩基球、好酸球、貪食細胞、肥満細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞））、体腔液（胸腔液、腹腔液、心膜腔液）中の細胞（マクロファージ、リンパ球（例えばＴ細胞、Ｂ細胞等）、好中球、好酸球、中皮細胞、等）があげられる。
【００２９】
標的分析物質としては、生物の組織、細胞等に存在する物質のうち、抗原性を示す物質であれば特に限定されず、いかなる物質であっても本発明により染色可能である。抗原性を示す物質の例としては、蛋白質、核酸分子、その他各種非ペプチド性物質があげられる。（１）蛋白質としては、各種膜蛋白質、各種可溶性蛋白質があり、組織や細胞等に特異的に発現する蛋白質（例えばマーカー蛋白質）、酵素、受容体や、中間フィラメント、間質成分、その他の組織・細胞特異抗原、その他各種の疾患のマーカーとなる蛋白質（例えば癌細胞・腫瘍に特異的な腫瘍マーカー、等）ならどれでも分析可能である。例えば、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ：副腎皮質刺激ホルモン）、Ａｃｔｉｎ、α−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ａｎｄｒｏｇｅｎ受容体、ｂｃｌ−２、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、各種ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：癌胎児性抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ、コラーゲン、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ抗原、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、エストロゲン受容体、ＦＳＨ（Ｆｏｃａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ ｈｙａｌｉｎｏｓｉｓ：巣状分節状硝子化）、γ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｇａｓｔｒｉｎ、ＧＣＤＦＰ−１５（Ｇｒｏｓｓｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１５）、Ｇｒｏｓｓｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄｐ ｒｏｔｅｉｎ１５、成長ホルモン、ＧＡＦＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ、Ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、インスリン、κ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｋｉ−６７抗原、λ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌｅｗｉｓ抗原、Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、メラノーマ抗原、μ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ、神経特異的エノラーゼ、ｐ５３、胎盤アルカリホスファターゼ、プロゲステロン受容体、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ（網膜芽細胞腫遺伝子産物）、Ｓ１００ｐｒｏｔｅｉｎ、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；甲状腺刺激ホルモン）、Ｖｉｌｌｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：血管作動性小腸ペプチド）、ステロイド受容体、インテグリン、カルレティキュリン、各種サイトカイン受容体、をその一例としてあげることができる。（２）核酸分子にはＤＮＡ、ＲＮＡおよびｍＲＮＡが含まれる。（３）非ペプチド性物質としては、例えば脂質（中性脂質、チン脂質、等）、糖鎖、金属（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等内因性のものや、Ｃｄ、Ｈｇ等外因性のもの）等があげられる。
【００３０】
本願明細書において用いる「結合反応」とは、前記標的分析物質とそれに対する特異的結合物質との結合反応（例えば抗原−抗体反応、核酸分子どうしのハイブリダイゼーション反応、等）を意味する。
【００３１】
また、本願明細書において用いる「１次抗体」とは、前記標的分析物質に特異的な抗体を意味し、「２次抗体」とは、該１次抗体に特異的に結合する抗体を意味する。
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００３３】
図１および図２に示すように、パラフィンブロック２に通孔４を形成し、該パラフィンブロック２の通孔４内にセパレータ３を配置する。
【００３４】
パラフィンブロック２は、通常は直方体状である。パラフィンブロック２に、通孔４を１個形成するのがよく、その断面形状は限定されるものではないが、円形、矩形などであり得る。好ましくは円筒状の通孔４である。該通孔４は、機械加工によって、例えば、パンチなどによってパラフィンブロック２に形成することができる。
【００３５】
セパレータ３は、通孔４の内面に沿うように通孔４内に配置される。この実施形態では円筒状のセパレータ３が通孔４内に挿入される。
【００３６】
セパレータ３は、パラフィンブロック２を構成するパラフィンと比較して、相変化による体積膨張率の大きい材料から形成される。例えば、水を吸収した際の体積膨張率の大きい寒天ゼリーなどによってセパレータ３を形成することができる。あるいは、パラフィンと比較して熱膨張率の大きい材料によってセパレータを形成してもよい。典型的には、セパレータ３は、図３に示すように、基板２９上に寒天ゼリーなどのセパレータ構成材料を流して層３４を形成した後、この層３４を筒状に巻いて形成される。この層３４は必要に応じて乾燥される。
【００３７】
他方、生体試料（以下、組織ともいう）に円筒状の針部材を刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出す。
【００３８】
次に、この組織の周囲に、一次抗体と反応し得る層（コントロールともいう）９を形成する。例えば、組織を一次抗体と反応し得る試薬の溶液中に浸漬することにより、組織の周囲に一次抗体と反応し得る層９を形成することができる。
【００３９】
この一次抗体と反応し得る試薬としては、羊膜、および、患者（１人または複数）由来の疾患関連抗原を発現する組織があげられる。
【００４０】
他に一次抗体と反応し得る層として、細胞株を生やしたシート状のゼラチンなどの膜や、薄切された、パラフィンブロックの組織片などが陽性コントロールとして機能する。
【００４１】
次に、周囲に一次抗体と反応し得る層９が形成された組織８を、上記パラフィンブロック２の通孔４内に充填して固形試料１０が作製される。
【００４２】
具体的には、腫瘍などの生体試料標本から針部材などを用いて小型の細長い組織試料を採取する。組織試料は、生体試料標本の関心対象の領域から採取することができる。試料は円筒形の試料がよく、円筒形の試料は長さ約1〜4mmで、直径約0.1〜4mmとすることができる。採取した試料は、例えば、核酸の分析を妨害しないように（エタノール固定などの方法で）保存することができる。この試料の周囲に一次抗体と反応し得る層９を付着させる。
【００４３】
このようにして、パラフィンブロック２およびセパレータ３にて組織８が包埋された固形試料１０が得られる。
【００４４】
次に、この固形試料１０を切断刃によって薄切する。
【００４５】
この切断工程は、従来より使用されているミクロトームを使用することができる。固形試料１０をミクロトームにかけて薄切を行い、通常、２〜４μｍの厚さの薄切片１２が得られる。図３に示すように、薄切片１２は、パラフィン片のほぼ中央に薄い組織８が配置され、その組織８の周囲に一次抗体と反応し得る層９が配置され、その外側にセパレータ３が配置された状態である。
【００４６】
次に、薄切片１２を水で処理することにより、図４に示すように、組織８の周囲のパラフィン片１３を破断して該組織８から該パラフィン片１３を分離する。
【００４７】
この工程においては、薄切片１２を水槽に入れた湯（３０℃〜５０℃）の中に入れたり、湯に浸漬すればよい。セパレータ３が水を吸収して体積膨張し、周囲のパラフィン片１３を押し広げて破断させる。その結果、パラフィン片１３が除去された組織８が得られる。
【００４８】
次に、この組織８を第５図に示すようにスライドガラス２４上に乗せる。典型的には、組織８を水槽の水面上からピンセットなどを用いてスライドガラス２４上に乗せるようにする。
【００４９】
図６に示すように、スライドガラス２４の表面には、予めシリコンゴムなどの弾性層２６を形成しておくのが好ましい。あるいは、基板２７の下にシリコンゴムなどの弾性層があっても良い。
【００５０】
次に、この複数の組織８が配置されたスライドガラス２４上に抗体投入用器具２８を配置する。この器具２８は、図５および図７に示すように、矩形状の基板２７に、各組織８に対応する位置に通孔３０を設けて構成されている。基板２７の両側部には留め具３１が回動可能に取り付けられており、スライドガラス２４上に器具２８を配置した後、留め具３１を回動してスライドガラス２４に固定することで、器具２８の各通孔３０によってスライドガラス２４上に凹部３２が形成される。この凹部３２内に各種の抗体溶液が投入され組織８の反応に供される。
【００５１】
スライドガラス２４上もしくは、器具２８の下には上記したように弾性層２６が形成されているので、各凹部３２内の抗体溶液が漏れ出したり、隣接する凹部３２内の抗体溶液が混合することがない。
【００５２】
なお必要に応じて脱パラフィン工程を行ってもよい。
【００５３】
すなわち、キシレン，アルコール，水の入った槽に、組織８が付着したスライドガラス２４を順次浸漬し、脱パラフィンが行われる。その後、所定の染色液で染色を行い、封入剤を滴下した後、カバーガラスをかぶせる封入工程を経て、組織観察用の薄切片試料が作製される。
【００５４】
次に、定法に従って、組織８を染色する（染色工程）。
【００５５】
ここで、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させ、いわば間接的に標的抗原を可視化するのが良い。
【００５６】
このようにして、染色後に顕微鏡などを用いて、標的分析物質を決定することにより、それに対する特異的結合物質も決定される。
【００５７】
なお、図８は、他の実施形態を示したものである。
【００５８】
上記実施形態では、針部材を組織に刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出すようにしたが、図８に示すように薄切りした組織をロール状に巻いて、このロール状の組織をパラフィンブロックの通孔に充填してもよい。
【００５９】
すなわち、パラフィンブロックに通孔を形成し、その通孔内に組織を充填してパラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料４０を作成する。次に、この固形試料４０を切断刃４４によって薄切し該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片４１を得る。この薄切片４１をロール状に巻き、この長尺なロール４２を適宜寸法に切断して所定寸法の組織の筒状体４５が得られる。
【００６０】
この組織の筒状体４５を、上記したようにパラフィンブロック２の通孔４内に挿入、配置する。この実施形態では、パラフィンブロック２に複数の通孔４が形成されている。その後、上記のようにスライスして組織観察用薄切片が作成される。
【００６１】
なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００６２】
スライドガラス２４上には、組織８との付着性を高めるために、シランコート又はリジンコートが施されていても良い。
【００６３】
また、本発明で使用する固相マトリクスは、標的分析物質とそれの特異的結合物質との結合反応が起きるマトリクスであり、且つ、生成したシグナルを検出する際の基板となるものであり、前記結合反応及びシグナル検出を阻害しない限りにおいてマトリクス素材は特に限定されないが、好適には顕微鏡のスライドグラスである。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、次のような特異的結合物質に対して、組織、細胞などの生体試料を染色するための生体試料標本を提供できる。
【００６５】
例えば、（１）標的分析物質が蛋白質（各種細胞蛋白質、酵素、受容体、疾患マーカー等）である場合、該蛋白質に結合性を有する各種Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ・リガンド（例えば該蛋白質を抗原とする抗体、小分子）が用いられるが、好適には抗体であり、最も好適なのはその特異性と抗体価が確認されたモノクローナル抗体である。
【００６６】
（２）標的分析物質が核酸である場合、それに対する特異的結合物質として相補的核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、抗体等が用いられるが、好適には相補的核酸分子であり、かかる核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することが可能である（例えばＦＩＳＨ法）。
【００６７】
（３）標的分析物質が非ペプチド性物質（例えば脂質、糖鎖、金属等）である場合、該物質に対する特異的結合物質としては該物質に対する特異的抗体を用いるのが好適である。また、糖鎖の検出においては、例えばレクチンを特異的結合物質として使用すれば検出が容易である。
【符号の説明】
【００６８】
２ バラフィンブロック
３ セパレータ
４ 通孔
８ 組織
９ 一次抗体と反応し得る層
１０ 固形試料
１２ 薄切片
２４ スライドガラス
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織、細胞などの生体試料標本の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料（例えば組織切片、タッチスメア、細胞等）に存在する特定の標的物質（例えば抗原）の存在を判別する手法として、該標的物質をシグナルとして可視化し検出する免疫染色法が従来から用いられている。例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法および放射性同位元素標識抗体法がある。
【０００３】
蛍光抗体法は、標的抗原に対する抗体、通常はモノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、組織切片上の抗原の分布を判別する手法で、直説法と間接法の２つの二重染色法に分類することができる。前者では、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、後者では、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させ、いわば間接的に標的抗原を可視化する。
【０００４】
酵素抗体法は、同様に抗原−抗体反応という特異反応を利用する手法である。抗体を酵素で標識し、抗原−抗体反応後に該酵素によって発色基質の沈着を生じさせて抗体の局在を示す点に特徴がある。標識酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ；ＧＯ）等が代表的である。
【０００５】
酵素抗体法には、酵素標識抗体法である直説法、間接法およびアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ）法と、非標識抗体法としてのペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ）法とがあり、卵白の塩基性蛋白質であるアビジンに代わり、中性に荷電した、即ち中性化処理が不要なストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を用いるストレプトアビジン・ビオチン化抗体（Ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＡＢまたはＬＳＡＢ）法が主流となっている。
【０００６】
対象生体試料を上記免疫染色法に供する場合、通常、凍結切片やパラフィン切片として固相のマトリクス上に固定したものを調製して反応に付する。
【０００７】
このように免疫的染色法を用いることにより、組織または細胞に存在する種々ペプチド性抗原（組織抗原、腫瘍抗原、免疫担当細胞亜型抗原、酵素、ホルモン等）、非ペプチド性の抗原、その他組織に沈着する免疫複合体等の検出が可能であり、各種疾患の診断マーカーの分布を判別することによる病理診断（例えば腫瘍マーカーの判別による腫瘍診断）も行われている。
【０００８】
しかしながら、従来の免疫染色法では、作成した組織標本または細胞標本一つにつき、一種類の免疫反応しか行えないため、コントロールを含めた免疫反応を行う場合にはそれに応じた数の標本を調製する必要があり、資源と手間が要求される。それゆえ、適切なコントロールを用いて実験することが資源と手間の関係上困難であり、実際の病理学的試験においても、適切なコントロールを欠く試験が行われているのが現状である。
【０００９】
特表２０００−５０５４３１号公報には、固形のパラフィンブロックに複数の穴を形成し（段落００５０）、その穴内にドナー腫瘍ブロックから採取した組織生検を配列し、そのブロックから組織標本用切片を得ることが記載されている（段落００５１−００５３）。
【００１０】
特開２００４−２５８０１７号公報には、臓器の目的とする部分から複数の組織を切り抜き、これをパラフィンに包埋してアレイブロックを作製する方法が提案されている。
【００１１】
しかし、これらに記載の方法では、組織間のばらつきもあり、必ずしも、適切なコントロールが提供できるわけではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０００−５０５４３１号公報
【特許文献２】特開２００４−２５８０１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、簡便な操作で、適切なコントロールを伴う免疫反応を行うことができ、しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で結果を比較することができる生体試料標本の作製方法を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明の他の目的は、複数のタンパク質の検出において、全ての試料に対して、適切なコントロールを提供する生体試料標本の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の生体試料標本の作製方法は、パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に組織を充填すると共に、該組織の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にセパレータおよびパラフィンが配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該組織周囲のパラフィンを破断して該組織から該パラフィンを分離する工程、複数の該組織をスライドガラス上に乗せる工程、および該組織を染色する工程、を包含し、そのことにより上記目的が達成される。
【００１６】
一つの実施形態では、前記一次抗体と反応し得る層が、羊膜である。別の実施形態では、前記一次抗体と反応し得る層が、患者（１人または複数）由来の疾患関連抗原を発現する組織である。複数の患者由来の組織を用いる場合、前記一次抗体と反応し得る層が、多様な抗体に対する陽性コントロールとして機能する。他に一次抗体と反応し得る層として、細胞株を生やしたシート状のゼラチンなどの膜や、薄切された、パラフィンブロックの組織片などが陽性コントロールとして機能する。
【００１７】
一つの実施形態では、前記セパレータが、吸水により体積膨張し得る材料よりなる。別の実施形態では、前記セパレータが、熱により体積膨張し得る材料よりなる。好ましくは、前記セパレータの、吸水、および／または、熱による体積膨張率は、パラフィンブロックの体積膨張率よりも大きい。
【００１８】
一つの実施形態では、前記セパレータが寒天、または、ゼリーである。
【００１９】
本発明の疾患の病理診断方法は、上記方法を用いることを含む。
【００２０】
また、本発明の他の生体試料標本の作製方法は、ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に生体試料を充填すると共に、該生体試料の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲にセパレータおよび包埋剤が配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該生体試料の周囲のパラフィンを破断して該生体試料から包埋剤を分離する工程、複数の該生体試料をスライドガラス上に乗せる工程、および該生体試料を染色する工程、を包含する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得、複数の該薄切片をスライドガラス上に乗せることにより、一度の操作で標的分析物質−特異的結合物質の結合反応を多数同時に行え、多数の標的物質（抗原）の同時染色が可能になる。また、標的分析物質に対する特異的結合物質の所要量も従来法に比べて微量で済む。しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で結果を比較することができる。
【００２２】
さらに、ブロックに形成した通孔と組織との間に一次抗体と反応し得る層を形成することにより、薄切片における組織の周囲には該一次抗体と反応し得る層が形成される。そのため一次抗体を加えて反応させることによって、一次抗体と標本との反応のポジティブコントロールが提供されることから、追加のコントロール試料を提供することなしに、各標本での免疫染色が確実に行われたことを確認することが可能となり、それゆえ、時間と労力とを節約した効率よい病理学的試験が可能となる。
【００２３】
さらに、組織の周囲にセパレータおよびパラフィンが配置された薄切片を得、この薄切片を水で処理することにより組織周囲のパラフィンを破断して組織から該パラフィンを分離する。従って、パラフィンを除去する手段によって組織から分離する必要がない。そのため、処理工程が簡略化できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明に係わる生体試料標本の作製方法に使用するパラフィンブロックの通孔内にセパレータを配置した状態の斜視図である。
【図２】図２は、本発明に係わる生体試料標本の作製方法に使用するパラフィンブロックの通孔に組織を充填した状態の斜視図である。
【図３】図３は、セパレータの作成方法を示す断面図である。
【図４】図４は、セパレータの作用説明図である。
【図５】図５は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置する状態の分解斜視図である。
【図６】図６は、ガラス基板上に弾性層を設けた状態の断面図である。
【図７】図７は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置する状態の断面である。
【図８】図８は、本発明の生体試料標本の作製方法の他の実施形態の作用説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明にかかる方法には、当該技術分野における当業者によって従来から通常用いられる各種染色法の原理を適用することができ、通常はこれらの各種染色法を用いることで検出可能なシグナルを生成させ、標的とする分析物質を判別することができる。
【００２６】
例として、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法等の原理の適用が可能である他、核酸分子を特異的結合物質として用い、核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することも可能である（例えばＦＩＳＨ法：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）。また、前記各種抗体法は、目的に応じて直説法、即ち、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、検出する手法でも、間接法、即ち、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させて、間接的に標的抗原を可視化し、検出する手法でもよい。特異的結合物質を標識するための標識物質・標識の仕方は適宜選択される。
【００２７】
本発明において用いる「被検生体試料」とは、主に生物の組織検体、生物の液状検体または細胞の検体を含んだ試料を意味する。生物種は特に限定されず哺乳動物、両生類、爬虫類等いずれの種であってもよいが、標的分析物質に対応する抗体蛋白質や核酸分子が最もよく知られている種である哺乳動物が好適であり、より好適なのはヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ウマ、サル等で、更に好適なのはヒト、マウス、ラットで、最も好適なのはヒトである。用いられる組織、生物の液状検体、細胞は、通常、組織であれば切片またはタッチスメアとして調製し使用することができ、液状検体であればスメア標本として調製し使用することができ、また、細胞であればやはりスメア標本にして使用することができる。
【００２８】
前記標本は自体公知の方法により容易に調整することができる。用いられる組織、液状検体、細胞は特に限定されずいずれの種類であっても使用可能で、（１）組織の例としては脳組織、肺、胃、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管組織（小腸、大腸、直腸、結腸など）、皮膚組織、神経組織、血管組織、骨格筋（筋肉）・軟骨組織等があげられ、（２）液状検体の例としては胸水、腹水、尿、等があげられ、（３）細胞としては、接着性で塊を形成している細胞、浮遊性の細胞、等限定されず、例えば、前記組織を構成する細胞（脳細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、軟骨細胞等）、血球系細胞（赤血球、血小板細胞、各種白血球・リンパ球（たとえば単球、好中球、好塩基球、好酸球、貪食細胞、肥満細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞））、体腔液（胸腔液、腹腔液、心膜腔液）中の細胞（マクロファージ、リンパ球（例えばＴ細胞、Ｂ細胞等）、好中球、好酸球、中皮細胞、等）があげられる。
【００２９】
標的分析物質としては、生物の組織、細胞等に存在する物質のうち、抗原性を示す物質であれば特に限定されず、いかなる物質であっても本発明により染色可能である。抗原性を示す物質の例としては、蛋白質、核酸分子、その他各種非ペプチド性物質があげられる。（１）蛋白質としては、各種膜蛋白質、各種可溶性蛋白質があり、組織や細胞等に特異的に発現する蛋白質（例えばマーカー蛋白質）、酵素、受容体や、中間フィラメント、間質成分、その他の組織・細胞特異抗原、その他各種の疾患のマーカーとなる蛋白質（例えば癌細胞・腫瘍に特異的な腫瘍マーカー、等）ならどれでも分析可能である。例えば、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ：副腎皮質刺激ホルモン）、Ａｃｔｉｎ、α−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ａｎｄｒｏｇｅｎ受容体、ｂｃｌ−２、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、各種ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：癌胎児性抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ、コラーゲン、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ抗原、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、エストロゲン受容体、ＦＳＨ（Ｆｏｃａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ ｈｙａｌｉｎｏｓｉｓ：巣状分節状硝子化）、γ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｇａｓｔｒｉｎ、ＧＣＤＦＰ−１５（Ｇｒｏｓｓｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１５）、Ｇｒｏｓｓｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄｐ ｒｏｔｅｉｎ１５、成長ホルモン、ＧＡＦＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ、Ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、インスリン、κ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｋｉ−６７抗原、λ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌｅｗｉｓ抗原、Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、メラノーマ抗原、μ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ、神経特異的エノラーゼ、ｐ５３、胎盤アルカリホスファターゼ、プロゲステロン受容体、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ（網膜芽細胞腫遺伝子産物）、Ｓ１００ｐｒｏｔｅｉｎ、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；甲状腺刺激ホルモン）、Ｖｉｌｌｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：血管作動性小腸ペプチド）、ステロイド受容体、インテグリン、カルレティキュリン、各種サイトカイン受容体、をその一例としてあげることができる。（２）核酸分子にはＤＮＡ、ＲＮＡおよびｍＲＮＡが含まれる。（３）非ペプチド性物質としては、例えば脂質（中性脂質、チン脂質、等）、糖鎖、金属（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等内因性のものや、Ｃｄ、Ｈｇ等外因性のもの）等があげられる。
【００３０】
本願明細書において用いる「結合反応」とは、前記標的分析物質とそれに対する特異的結合物質との結合反応（例えば抗原−抗体反応、核酸分子どうしのハイブリダイゼーション反応、等）を意味する。
【００３１】
また、本願明細書において用いる「１次抗体」とは、前記標的分析物質に特異的な抗体を意味し、「２次抗体」とは、該１次抗体に特異的に結合する抗体を意味する。
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００３３】
図１および図２に示すように、パラフィンブロック２に通孔４を形成し、該パラフィンブロック２の通孔４内にセパレータ３を配置する。
【００３４】
パラフィンブロック２は、通常は直方体状である。パラフィンブロック２に、通孔４を１個形成するのがよく、その断面形状は限定されるものではないが、円形、矩形などであり得る。好ましくは円筒状の通孔４である。該通孔４は、機械加工によって、例えば、パンチなどによってパラフィンブロック２に形成することができる。
【００３５】
セパレータ３は、通孔４の内面に沿うように通孔４内に配置される。この実施形態では円筒状のセパレータ３が通孔４内に挿入される。
【００３６】
セパレータ３は、パラフィンブロック２を構成するパラフィンと比較して、相変化による体積膨張率の大きい材料から形成される。例えば、水を吸収した際の体積膨張率の大きい寒天ゼリーなどによってセパレータ３を形成することができる。あるいは、パラフィンと比較して熱膨張率の大きい材料によってセパレータを形成してもよい。典型的には、セパレータ３は、図３に示すように、基板２９上に寒天ゼリーなどのセパレータ構成材料を流して層３４を形成した後、この層３４を筒状に巻いて形成される。この層３４は必要に応じて乾燥される。
【００３７】
他方、生体試料（以下、組織ともいう）に円筒状の針部材を刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出す。
【００３８】
次に、この組織の周囲に、一次抗体と反応し得る層（コントロールともいう）９を形成する。例えば、組織を一次抗体と反応し得る試薬の溶液中に浸漬することにより、組織の周囲に一次抗体と反応し得る層９を形成することができる。
【００３９】
この一次抗体と反応し得る試薬としては、羊膜、および、患者（１人または複数）由来の疾患関連抗原を発現する組織があげられる。
【００４０】
他に一次抗体と反応し得る層として、細胞株を生やしたシート状のゼラチンなどの膜や、薄切された、パラフィンブロックの組織片などが陽性コントロールとして機能する。
【００４１】
次に、周囲に一次抗体と反応し得る層９が形成された組織８を、上記パラフィンブロック２の通孔４内に充填して固形試料１０が作製される。
【００４２】
具体的には、腫瘍などの生体試料標本から針部材などを用いて小型の細長い組織試料を採取する。組織試料は、生体試料標本の関心対象の領域から採取することができる。試料は円筒形の試料がよく、円筒形の試料は長さ約1〜4mmで、直径約0.1〜4mmとすることができる。採取した試料は、例えば、核酸の分析を妨害しないように（エタノール固定などの方法で）保存することができる。この試料の周囲に一次抗体と反応し得る層９を付着させる。
【００４３】
このようにして、パラフィンブロック２およびセパレータ３にて組織８が包埋された固形試料１０が得られる。
【００４４】
次に、この固形試料１０を切断刃によって薄切する。
【００４５】
この切断工程は、従来より使用されているミクロトームを使用することができる。固形試料１０をミクロトームにかけて薄切を行い、通常、２〜４μｍの厚さの薄切片１２が得られる。図３に示すように、薄切片１２は、パラフィン片のほぼ中央に薄い組織８が配置され、その組織８の周囲に一次抗体と反応し得る層９が配置され、その外側にセパレータ３が配置された状態である。
【００４６】
次に、薄切片１２を水で処理することにより、図４に示すように、組織８の周囲のパラフィン片１３を破断して該組織８から該パラフィン片１３を分離する。
【００４７】
この工程においては、薄切片１２を水槽に入れた湯（３０℃〜５０℃）の中に入れたり、湯に浸漬すればよい。セパレータ３が水を吸収して体積膨張し、周囲のパラフィン片１３を押し広げて破断させる。その結果、パラフィン片１３が除去された組織８が得られる。
【００４８】
次に、この組織８を第５図に示すようにスライドガラス２４上に乗せる。典型的には、組織８を水槽の水面上からピンセットなどを用いてスライドガラス２４上に乗せるようにする。
【００４９】
図６に示すように、スライドガラス２４の表面には、予めシリコンゴムなどの弾性層２６を形成しておくのが好ましい。あるいは、基板２７の下にシリコンゴムなどの弾性層があっても良い。
【００５０】
次に、この複数の組織８が配置されたスライドガラス２４上に抗体投入用器具２８を配置する。この器具２８は、図５および図７に示すように、矩形状の基板２７に、各組織８に対応する位置に通孔３０を設けて構成されている。基板２７の両側部には留め具３１が回動可能に取り付けられており、スライドガラス２４上に器具２８を配置した後、留め具３１を回動してスライドガラス２４に固定することで、器具２８の各通孔３０によってスライドガラス２４上に凹部３２が形成される。この凹部３２内に各種の抗体溶液が投入され組織８の反応に供される。
【００５１】
スライドガラス２４上もしくは、器具２８の下には上記したように弾性層２６が形成されているので、各凹部３２内の抗体溶液が漏れ出したり、隣接する凹部３２内の抗体溶液が混合することがない。
【００５２】
なお必要に応じて脱パラフィン工程を行ってもよい。
【００５３】
すなわち、キシレン，アルコール，水の入った槽に、組織８が付着したスライドガラス２４を順次浸漬し、脱パラフィンが行われる。その後、所定の染色液で染色を行い、封入剤を滴下した後、カバーガラスをかぶせる封入工程を経て、組織観察用の薄切片試料が作製される。
【００５４】
次に、定法に従って、組織８を染色する（染色工程）。
【００５５】
ここで、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させ、いわば間接的に標的抗原を可視化するのが良い。
【００５６】
このようにして、染色後に顕微鏡などを用いて、標的分析物質を決定することにより、それに対する特異的結合物質も決定される。
【００５７】
なお、図８は、他の実施形態を示したものである。
【００５８】
上記実施形態では、針部材を組織に刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出すようにしたが、図８に示すように薄切りした組織をロール状に巻いて、このロール状の組織をパラフィンブロックの通孔に充填してもよい。
【００５９】
すなわち、パラフィンブロックに通孔を形成し、その通孔内に組織を充填してパラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料４０を作成する。次に、この固形試料４０を切断刃４４によって薄切し該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片４１を得る。この薄切片４１をロール状に巻き、この長尺なロール４２を適宜寸法に切断して所定寸法の組織の筒状体４５が得られる。
【００６０】
この組織の筒状体４５を、上記したようにパラフィンブロック２の通孔４内に挿入、配置する。この実施形態では、パラフィンブロック２に複数の通孔４が形成されている。その後、上記のようにスライスして組織観察用薄切片が作成される。
【００６１】
なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００６２】
スライドガラス２４上には、組織８との付着性を高めるために、シランコート又はリジンコートが施されていても良い。
【００６３】
また、本発明で使用する固相マトリクスは、標的分析物質とそれの特異的結合物質との結合反応が起きるマトリクスであり、且つ、生成したシグナルを検出する際の基板となるものであり、前記結合反応及びシグナル検出を阻害しない限りにおいてマトリクス素材は特に限定されないが、好適には顕微鏡のスライドグラスである。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、次のような特異的結合物質に対して、組織、細胞などの生体試料を染色するための生体試料標本を提供できる。
【００６５】
例えば、（１）標的分析物質が蛋白質（各種細胞蛋白質、酵素、受容体、疾患マーカー等）である場合、該蛋白質に結合性を有する各種Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ・リガンド（例えば該蛋白質を抗原とする抗体、小分子）が用いられるが、好適には抗体であり、最も好適なのはその特異性と抗体価が確認されたモノクローナル抗体である。
【００６６】
（２）標的分析物質が核酸である場合、それに対する特異的結合物質として相補的核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、抗体等が用いられるが、好適には相補的核酸分子であり、かかる核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することが可能である（例えばＦＩＳＨ法）。
【００６７】
（３）標的分析物質が非ペプチド性物質（例えば脂質、糖鎖、金属等）である場合、該物質に対する特異的結合物質としては該物質に対する特異的抗体を用いるのが好適である。また、糖鎖の検出においては、例えばレクチンを特異的結合物質として使用すれば検出が容易である。
【符号の説明】
【００６８】
２ バラフィンブロック
３ セパレータ
４ 通孔
８ 組織
９ 一次抗体と反応し得る層
１０ 固形試料
１２ 薄切片
２４ スライドガラス
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に組織を充填すると共に、該組織の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にセパレータおよびパラフィンが配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該組織周囲のパラフィンを破断して該組織から該パラフィンを分離する工程、複数の該組織をスライドガラス上に乗せる工程、および該組織を染色する工程、を包含する組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項２】
さらに、前記組織を染色する工程を包含する、請求項１に記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項３】
前記一次抗体と反応し得る層が、羊膜である請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項４】
前記セパレータが、吸水により体積膨張し得る材料よりなる請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項５】
前記セパレータが、熱により体積膨張し得る材料よりなる請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項６】
吸水および／または熱による前記セパレータの体積膨張率が、パラフィンブロックの体積膨張率よりも高い、請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項７】
前記セパレータが、寒天、または、ゼリー、あるいは、これらの混合物である請求項３記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法を用いることを含む、疾患の病理診断方法。
【請求項９】
ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に生体試料を充填すると共に、該生体試料の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲にセパレータおよび包埋剤が配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該生体試料の周囲の包埋剤を破断して該生体試料から包埋剤を分離する工程、複数の該生体試料をスライドガラス上に乗せる工程、および該生体試料を染色する工程、を包含する生体試料標本の作製方法。
【請求項１０】
生体試料標本の作製方法に使用され、生体試料から包埋剤を分離するために使用するセパレータであって、
相変化によって体積が膨張する材料からなり、吸水および／または熱による包埋剤の体積膨張率より大きい体積膨張率を有するセパレータ。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法によって作製された、組織観察用薄切片。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって作製された、生体試料標本。
【請求項１】
パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に組織を充填すると共に、該組織の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にセパレータおよびパラフィンが配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該組織周囲のパラフィンを破断して該組織から該パラフィンを分離する工程、複数の該組織をスライドガラス上に乗せる工程、および該組織を染色する工程、を包含する組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項２】
さらに、前記組織を染色する工程を包含する、請求項１に記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項３】
前記一次抗体と反応し得る層が、羊膜である請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項４】
前記セパレータが、吸水により体積膨張し得る材料よりなる請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項５】
前記セパレータが、熱により体積膨張し得る材料よりなる請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項６】
吸水および／または熱による前記セパレータの体積膨張率が、パラフィンブロックの体積膨張率よりも高い、請求項１記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項７】
前記セパレータが、寒天、または、ゼリー、あるいは、これらの混合物である請求項３記載の組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法を用いることを含む、疾患の病理診断方法。
【請求項９】
ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に筒状のセパレータを配置する工程、該セパレータ内に生体試料を充填すると共に、該生体試料の周囲に一次抗体と反応し得る層を形成する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲にセパレータおよび包埋剤が配置された薄切片を得る工程、該薄切片を水で処理することにより該生体試料の周囲の包埋剤を破断して該生体試料から包埋剤を分離する工程、複数の該生体試料をスライドガラス上に乗せる工程、および該生体試料を染色する工程、を包含する生体試料標本の作製方法。
【請求項１０】
生体試料標本の作製方法に使用され、生体試料から包埋剤を分離するために使用するセパレータであって、
相変化によって体積が膨張する材料からなり、吸水および／または熱による包埋剤の体積膨張率より大きい体積膨張率を有するセパレータ。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法によって作製された、組織観察用薄切片。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって作製された、生体試料標本。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１３０５１（Ｐ２０１１−１３０５１Ａ）
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５６３４３（Ｐ２００９−１５６３４３）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（３０７０４８７５６）株式会社パソロジー研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（３０７０４８７５６）株式会社パソロジー研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
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