生物剤を送達する中空かつ多孔質の整形外科用または歯科用のインプラント
中空かつ多孔質の生体適合性媒体の中に含まれる増殖因子および／または幹細胞などの封入された生物剤であって、放出制御によって送達される生物剤、例えば、ヒトなどの宿主動物の体内に置かれたチタン製インプラントから生体内で新たな歯または骨が生じる。中空の中心部、側壁に多孔をもち、カプセル封入された生物剤または化学剤を中空の中心部に担持させて含む生体適合性材料を含む、歯または骨のインプラントであって、該生物剤または化学剤が、制御放出技術によって時間的および空間的に放出され、歯または骨の治癒を促進するインプラントが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
整形外科用および歯科用のインプラントを媒体として用いて、生物剤が開発される。中空かつ多孔質の整形外科用または歯科用のインプラントは、その内部に、特定の移植部位で制御放出するために生物剤を担持する媒体として機能する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、毎年約２０億ドルが整形外科用および歯科用のインプラントに費やされている。これは、１年間だけで約７００，０００例の整形外科用インプラント処置が行われていることと相関する。歯科インプラント処置に関しては、３５〜４４歳の成人の約６９パーセントが少なくとも１本の永久歯を失っているため、歯科インプラントの希望者といえる。
【０００３】
インプラントは、通常、歯科用であっても、整形外科用またはそれ以外のためであっても、チタンのように生体適合性を有する材料であり、体内に外科的に挿入されて、骨または歯などの欠陥構造物の代わりをする。このようなインプラントは一般的になりつつあるが、短期的にも長期的にも、骨接合の領域に未だ問題が残っている。ほとんどのインプラントの手順は、骨の再生に関してあまり考慮がされておらず、主に機械的な修復にその焦点があてられている。最初は適切に骨接合がされている股関節などの骨置換が、骨とインプラントの接触面における骨溶解により、数年後に劣化することが示されている。
【０００４】
インプラントの寿命を延ばし、骨治癒過程を促進するために、ある研究では、インプラントの初期固定を改善すること、およびインプラント界面に対する骨の強度を維持することに焦点を置いている。しかし、これら現在の研究法はいずれも満足できるものではない。
【０００５】
トランスフォーミング増殖因子β３は、細胞伝達物質のスーパーファミリーの一員であり、細胞の増殖および分化の調節において基本的な役割を果たす。創傷治癒において、ＴＧＦβ３は、Ｉ型コラーゲン合成を減衰させて、瘢痕組織形成を減少させることが報告されている。ＴＧＦβ３は、新生児約２，５００人に１人の割合で発症する先天性疾患であって、頭蓋骨奇形、盲目、知能障害、および致死を示す頭蓋骨癒合症における頭蓋縫合の線維組織の骨化を調節することが報告されている。発達過程で、ＴＧＦβ３は、上皮細胞の接着と、その後の２つの口蓋棚が融合するのを調節するが、それに失敗すると口蓋裂が生じる。臍帯の発達段階で、ＴＧＦβ３が下方制御されると、臍帯形成段階で母子が死亡する主な原因となっている、臍帯においてよく見られる子癇前症の異常な構造および力学的特性を生じさせる。ＴＧＦβ３は、ＴＧＦ−２など、その他の内生因子を活性化させて、角膜実質線維芽細胞の増殖を媒介する。緑内障手術後に起こる線維症の機構は、ＴＧＦβ３、およびその作用が結膜下線維芽細胞に及ぶことによって媒介される。
【０００６】
広範な細胞および組織の発達におけるＴＧＦβ３の基本的な役割によって、これを組織修復法に採用することが推進されてきた。ゲルにしてＴＧＦβ３を局所塗布すると、プラセボゲルと比較して、２．５μｇ／ｃｍ２の用量で患者の創傷治癒を改善することが報告された。骨化しつつある頭蓋縫合にＴＧＦβ３を含んだコラーゲンゲルを送達すると、早期癒合を遅延させることが報告されている。ＰＬＡの微細な溝を有する表面から放出された生物活性ＴＧＦβ３は最大限２４時間、肺上皮細胞の増殖を阻害することが報告されている。サイトカインを徐放するための従来の試みには、脂質ナノ粒子、キトサンまたはゼラチンを主原料とする微粒子、コラーゲンセラミックス、多孔質ガラスなどがある。ＴＧＦβ３の短期的な生物活性が研究されているが、創傷治癒および組織再生の過程で細胞活性を長期間調節するという広範な需要に対しては、マイクロカプセル化による持続放出について調査することが必要である。
【０００７】
ＴＧＦβ３の治療上の可能性を調査する努力が既に為されてきたにもかかわらず、その有効な用途は、例えば、半減期の短さ、インビボでの不安定性、および送達系が比較的不正確であるなど、いくつかのありふれた欠点によって制約されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
中空かつ多孔質のインプラントには、例えば、幹細胞および増殖因子など、生物、薬品、薬草または化学物質に由来する生物活性剤を担持させる。これらは、例えば、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）の中に封入することができる。中空かつ多孔質の歯科用または整形外科用のインプラントは、インプラント処置後、インプラント中またはインプラント上で歯または骨の治癒を促進する、１つ以上の封入生物剤を担持する。封入された生物剤がインプラントの中に含まれ、さらには、それらがインプラントの外部に、宿主組織に対して放出されて、インプラント上およびインプラント内部で増殖することができるように注意しつつ、当技術分野において既知の方法によって担持させる。マイクロスフェアを生体適合性材料の中に担持させる方法の一つは、真空による方法である。増殖因子を封入している幹細胞および／またはＰＬＧＡマイクロスフェアを、例えば、コラーゲンスポンジなどの足場に挿入する。次に、このスポンジをインプラントの中空部に詰め込む。そして、この生体適合性材料をインプラントの中空の中心部に詰め込む。中空かつ多孔質のインプラントは、欠損した骨または歯に耐荷重性機能を付加する生体適合性の固体材料でできており、中空かつ多孔質であるため、インプラントの機械的強度を低下させて、骨に対する応力遮蔽効果を減少させる。この中空かつ多孔質のインプラントに適した材料には、チタンなどの金属が含まれる。骨芽細胞はチタンに付着して、新しい骨を産生することができる。中空かつ多孔質のインプラントは、任意で、金属の上にコーティングを有することも可能である。インプラントの断面は、円筒形か正方形か長方形か、あるいは不規則な形であってよい。選択する形状は、修復すべき歯または骨の解剖学的部位および配置に依存する。
【０００９】
カプセル封入された生物剤は中空かつ多孔質のインプラントの中に担持されて、新しい骨または歯の構造体の成長を促進する。多孔性と制御放出技術を組み合わせることによって、骨成長および骨結合（例えば、チタンを宿主の骨または歯の中に組み込むこと）を促進する、新たな歯科用および／または整形外科用のインプラント系が生み出される。制御放出技術により、予定された用量の増殖因子、および／またはその他の化学的および／または薬理学的な物質を、予め決められた時間的かつ空間的な態様で送達して、骨の増殖および結合を促進する。細孔および中空円筒という理学的徴候を変更して、骨成長および／または骨結合を最適化することができる。適当な薬剤は、新しい骨または歯の成長または治癒に特異的な増殖因子および培養液を含む。成人または胎児の幹細胞を添加することができる。生物剤はインプラント領域、通常はその隣接領域において作用する。具体的な増殖因子には、ＢＭＰファミリー（２、７、８、９）、ＴＧＦ〜ファミリー（１、２、３）、〜ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、および増殖因子と化学物質の混合物などがある。幹細胞は、存在する場合、内生的な成人の間葉系幹細胞を含む。適当な生体適合性担体はチタンであり、適当な封入材はポリ乳酸−グリコール酸共重合体である。
【００１０】
創傷治癒および組織再生における役割が報告されていながら、ＴＧＦβ３の長期間の制御放出については実証されていない。制御放出に適した組成物は、マイクロスフェアに封入されているポリｄ−ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）中のＴＧＦβ３である。ＰＬＡ：ＰＧＡの比が５０：５０および７５：２５であるＰＬＧＡカプセル中に封入されたＴＧＦβ３の放出プロファイルは、生物活性の解析全体を通して異なっていた。マイクロスフェアを無菌化する方法を比較するために、５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェアにｂＦＧＦを封入して、エチレンオキシド（ＥＯ）ガス、高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）、または紫外（ＵＶ）線に曝露した。ｂＦＧＦの放出は、紫外線によって顕著に弱まったが、ＥＯまたはＲＦＧＤによっては顕著には変わらなかった。その生物活性を確認するために、ＴＧＦβ３（１．３５ｎｇ／ｍｌ）を、骨原性分化を誘導されているヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）培養液に制御放出した。アルカリホスファターゼによる染色強度は、ｈＭＳＣ由来の骨原性細胞をＴＧＦβ３に暴露してから１週間後には著しく減少していた。このことは、５．８±０．９ｍＵ／ｍｌ／ｎｇ ＤＮＡ（ｐ＜０．０５）であった対照（ＴＧＦβ３を含まない）よりもアルカリホスファターゼ活性が低くなった（２．２５±０．５７ｍＵ／ｍｌ／ｎｇＤＮＡ）ことから確認された。さらに、制御放出されたＴＧＦβ３の生物活性は、１．３５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３を細胞培養液に直接添加しても、アルカリホスファターゼに有意な差異が見られなかった（ｐ＞０．０５）ことによっても確認された。マイクロカプセルに封入されたＴＧＦβ３は、創傷治癒や再生医療を応用する際に有用である。
【００１１】
ＴＧＦβ３をＰＬＧＡマイクロスフェアの中に封入して、その放出動態を測定し、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨原性分化に対する、制御放出されたＴＧＦβ３の生物活性を調べた。ＰＬＧＡマイクロスフェアの形態、および封入された増殖因子の放出動態に対する、いくつかの一般的に使用されている無菌化法の影響を測定した。それらは、紫外線法、エチレンオキシドガス法、および高周波グロー放電法を含み、さまざまな増殖因子を封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを用いるその後のインビボ実験において無菌化法を選択するのに役に立つよう設計されていた。
【００１２】
中空かつ多孔質のインプラントは、増殖細胞および／または成人間葉系幹細胞を取り込むことができる限り、どのような形状および大きさになるよう生物学的に操作してもよい。患者自身の骨髄に由来する造骨細胞を使用することによって、免疫拒絶反応の問題は最小限になる。
【００１３】
新しい骨は、生物学的に行われる治癒過程として、患者自身の組織と一体化する。インプラントを設置するための整形外科的方法は、当技術分野において知られており、別個にヒト被験者の承認手続きを必要とせずに利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
当業者に知られている方法によって、中空かつ多孔質の整形外科用または歯科用のインプラントに、人体の内部またはその上で放出させるためにカプセル封入された生物剤を１つ以上担持させる。このカプセル封入生物剤は中空のコアに担持されて、移植後、インプラントに隣接したところで歯または骨の治癒を促進する。この生物剤は拡散するか、さもなければ、封入細胞膜を通過することができるか、または封入構造が破断して生物剤を放出するか、あるいは、両方が起きて、生物剤が多孔質のインプラントを横断して周囲の組織に入り込む。
【００１５】
カプセル封入された生物剤を含む中空かつ多孔質のインプラントは、単独、または胎児もしくは成人の幹細胞、例えば、成人の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に加えて提供することができる増殖因子を含む。ＭＳＣは、骨髄細胞、または、それ以外の由来源、例えば、脂肪組織または末梢血などから調製することができる。内在性細胞を使用すると、免疫拒絶反応の危険が最小限になる。
【００１６】
増殖因子の例には、ＢＭＰファミリー、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９と名付けられた（ＢＭＰ２、７、８、および９とも呼ばれる）因子など、ＴＧＦ〜−１、ＴＧＦ〜−２およびＴＧＦ〜−３と呼ばれる（ＴＧＦ〜１，２、および３とも呼ばれる）分子を含むＴＧＦ〜ファミリー、〜ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、その他の増殖因子、および上記またはそれら以外の増殖因子を２種類以上混合した物などがある。
【００１７】
胎児または成人に由来する幹細胞などの幹細胞は、増殖因子を含み、増殖因子を封入する細胞膜に取り囲まれている。これらの細胞は、骨髄、脂肪組織および末梢血、ならびに別の由来源から採取することができる。成人の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胎児の幹細胞、またはその他の成人幹細胞を使用することができる。成人の間葉系幹細胞は、骨細胞に分化することができる骨髄細胞に由来する。
【００１８】
成人のＭＳＣは、軟骨組織、骨組織、および脂肪組織など、全ての結合組織形成細胞系列に分化する能力をもつ。ＭＳＣは、骨髄、または体内のその他の結合組織から低侵襲的な方法で得ることができ、培養液の中で非常に増殖させやすく、十分に確立している誘導補助剤に曝露して容易に分化誘導することができる。さらに、成人の幹細胞の使用は、倫理上の理由から、胚性幹細胞を使用するよりも有利である。
【００１９】
中空かつ多孔質のインプラントは、例えば、１種類以上の金属、例えば、ステンレススチール、チタンなどでできている、生体適合性を有する固体材料から構築される（図１）。
【００２０】
中空かつ多孔質のインプラントの形状は、必要に応じてプログラムする。インプラントの形状は、骨に似るかもしれないし、円筒形や、必要に応じてその他の形状にすることができる。インプラントは多孔性または有孔性である（インプラントの壁を貫通して、細胞、タンパク質、および低分子がインプラントの内側から外側に移動すること、およびその逆を可能にする１つ以上の穴を有する）。すなわち、インプラントの表面には、中空かつ多孔質のインプラントの内外に液体およびタンパク質が出入りすることを可能にする空間が画定されている。中空かつ多孔質のインプラントは金網に似ているかもしれない。壁貫通孔はインプラントをまっすぐに貫通する必要はなく、蛇行していてもよい。
【００２１】
中空かつ多孔質のインプラントは、内部に第２の生体適合性材料を含んでいてもよく、また、例えば、ヒドロゲル重合体など、第２の生体適合性材料でコーティングされていてもよい。ヒドロゲル重合体は、造骨細胞に、体の中の細胞外マトリックスに類似した環境を提供する。
【００２２】
ヒドロゲル重合体は、その独特の３次元構造を維持しつつ、大量の水または生体液を吸収する、親水性で３次元の網目構造体である。コーティングは光分極性（ｐｈｏｔｏｐｏｌａｒｉｚａｂｌｅ）ヒドロゲル重合体、または水和ポリ乳酸・グリコール酸共重合体であってもよい。
【００２３】
ポリ乳酸・グリコール酸共重合体を主成分とするヒドロゲル重合体は、生体適合性が証明されており、かつ、ＭＳＣが骨などの多数の系列に増殖および分化するのを助けることができることが明らかになっているため、生物学的に応用するための一定の利点を有する。これらの重合体は、インプラントの内部にマイクロスフェアを保持するのに役立つ。また、最小限の侵襲的処置（注射）で皮下に細胞−重合体系を投与すること、および、これらのヒドロゲルが経皮的に光重合を行うことができることは生体系において有益である。
【００２４】
中空かつ多孔質のインプラントに、例えば、胚性または成人の間葉系幹細胞など、１つ以上の生物剤、および／またはヒドロゲル重合体の中にカプセル封入された１つ以上の増殖因子、あるいはこれら両方を担持させる。封入するヒドロゲルは、一般的には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物である物質であろう。好ましくは、ヒドロゲルは、紫外線、および、例えば、２−ヒドロキシ−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンなどの光開始剤の作用によって重合されているポリ乳酸・グリコール酸共重合体を含む。
【００２５】
制御放出による長期間にわたる送達によって、例えば、コラーゲンの足場に入れてＴＧＦβ３を即時適用することに伴う従来の制限を回避する方法が提供される。制御放出するための一つのアプローチ法は、マイクロスフェアにペプチドおよびタンパク質を封入することによる方法である（図２）。ポリｄ−ｌ−乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）は、加水分解によって分解されて、乳酸およびグリコール酸のモノマーなど、生体適合性を有する副産物になる。乳酸およびグリコール酸は、最小限の免疫反応を誘発しながら、クレブス回路を経て、ＣＯ２およびＨ２Ｏとして生体内で除去される。ＰＬＧＡマイクロスフェアは、小球の直径および分解速度の調節を可能にする二重エマルジョン溶媒抽出技術を用いて、カプセル封入された増殖因子の安定性と生物活性を維持しつつ製造される。例えば、ＢＭＰ、ＴＧＦβ１および２、神経栄養性成長因子、ＶＥＧＦ、およびＩＧＦなどの増殖因子のいくつかを封入および放出する動態が報告されている。しかし、ＴＧＦβ３のマイクロカプセル封入およびその放出の動態は知られていない。他の２つの哺乳動物アイソフォームであるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、頭蓋縫合癒合および骨形成を促進する。ＴＧＦβ１は、ポリ（フマル酸ポリプロピレン）基質の上で培養した骨髄間質細胞の増殖および骨芽細胞分化を促進することが示されている。ＴＧＦβ１および２は、ネズミの前頭鼻骨縫合閉塞症を起している間、持続的に存在する。それに対して、ＴＧＦβ３は、ネズミ冠状縫合を非骨状態に維持することに関係している。
【００２６】
カプセル封入された生物剤は、アルギン酸、海綿、キトサン、サンゴ、アガロース、フィブリン、コラーゲン、骨、シリコーン、軟骨、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、およびこれらの混合物からなる天然材料を含むことができる生体マトリックスの内部に存在する。コラーゲンスポンジを用いて、中空かつ多孔質のインプラント内部にカプセル封入された増殖因子または幹細胞またはその両方を運ぶことができる（図３）。また、ヒドロゲル重合体を生体マトリックスとして用いることもできる。
【００２７】
さらに、該生体マトリックスは骨形成剤、例えば、デキサメタゾンを含むことができる。骨形成剤のさらなる例は、骨形態形成タンパク質ファミリー、トランスフォーミング増殖因子タンパク質ファミリー、および血管内皮増殖因子タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバー、ならびにそのような骨形成剤の混合物などである。さらに、生体マトリックスは栄養培地を含むこともできる。
【００２８】
組成物を、チタン媒体、生体マトリックス、骨形成剤、栄養培地、すくなくとも１種類の抗生物質、および成人の間葉系幹細胞の中で、骨の一部または全体の形にすることができるが、チタン媒体は、骨形成剤、培地、抗生物質、および細胞を保持している生体マトリックスを支える固形支持体を提供する。
【００２９】
組成物は、チタン媒体；ポリ乳酸・グリコール酸共重合体および２−ヒドロキシ−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンを含むヒドロゲル；デキサメタゾンおよびトランスフォーミング増殖因子β１などの骨形成剤；βグリセロリン酸およびアスコルビン酸−２−リン酸を含む栄養培地；ペニシリン；ストレプトマイシン；およびヒト骨髄由来の成人間葉系幹細胞からなり、円筒形、または一部もしくは全部を骨の形にすることができる。ここでチタン媒体は、骨形成剤、培地、抗生物質、および細胞を保持しているヒドロゲルを支える固形支持体としての機能をはたす。
【００３０】
骨軟骨構造体を作成する方法は、骨髄から成人の間葉系幹細胞などの成人または胚性の幹細胞を提供する工程、骨原性培地で該細胞を処理して骨芽細胞への分化を誘導する工程、および、チタン製メッシュおよびヒドロゲルマトリックスからなる生体適合性媒体上に該骨芽細胞を担持させる工程を含む。適当な骨原性培地は、当技術分野において骨増殖を開始させるか促進するために使用されるものである。内生性骨髄は拒絶反応を最小限にする。
【００３１】
生物学的に操作された一部または全体の骨をインビボで産生する方法は、ヒドロゲルコーティングを有する生体適合性チタン媒体の組成物、および例えば、成人の間葉系幹細胞などの成人または胚性の幹細胞の試料を宿主動物に移植することを含む。具体的な宿主動物の例は、例えば、ラット、マウス、およびウサギなどの実験動物、例えば、イヌまたはネコなどの愛玩動物、例えば、馬（ウマ）、牛（ウシ）、羊（ヒツジ）、または山羊（ヤギ）などの家畜動物、またはサル、類人猿（チンパンジー、オランウータン、またはゴリラ）、または人類（ヒト）などの霊長類などである。
【００３２】
インプラント部位で新しい骨または歯の増殖を誘導する方法は、以下の工程を含む：（ａ）骨細胞と混合した生体マトリックスを含む、中空かつ多孔質の生体適合性媒体からなるインプラントを提供する工程、（ｂ）そのインプラントを宿主動物（例えば、患者）に移植する工程、および（ｃ）骨または歯が成長するのに十分な期間、該動物（例えば、患者）を管理する工程。具体的には、成人の間葉系幹細胞などの幹細胞を回収する。それらの細胞を骨原性培地で処理して骨細胞に分化させる。このようにして調製した骨細胞を、ヒドロゲルマトリックスを有する、中空かつ多孔質の穿孔チタン媒体の中に担持させて、該マトリックスとの混合物を形成させる。該インプラントを患者に移植する。新しい細胞が増殖するのに充分な時間、患者を医学的（歯科的）に適切な状態に維持する。
【００３３】
「１つの（ａ）」または「１個の（ａｎ）」という冠詞は、１つまたは複数を含むものとする。
【００３４】
実施例
実施例１：ＰＬＧＡマイクロスフェアからのＴＧＦβ３の徐放、およびヒト間葉系幹細胞の初期骨原性分化に対するその効果
ＰＬＧＡマイクロスフェアの調製およびＴＧＦβ３のカプセル封入
ＰＬＡ：ＰＧＡ比が５０：５０および７５：２５（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のポリ（ＤＬ−乳酸・グリコール酸）（ＰＬＧＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のマイクロスフェアを、二重エマルジョン技術（（水中油）中水型）を用いて調製した（Ｌｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，２００１；Ｗｅｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ，２００４；Ｒｕａｎ，Ｇ，ｅｔ ａｌ，２００２）。総量２５０ｍｇのＰＬＧＡを１ｍｌのジクロロメタンに溶かした。分子量２５ｋＤａの組換えヒトＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を全部で２．５μｇ、製造業者のプロトコルに従って、５０μｌの再構成溶液に希釈し、ＰＬＧＡ溶液に加えて、１分間乳化した（水中油）混合物（初期エマルジョン）を形成させた。次に、この初期エマルジョンを、２ｍｌの１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、分子量３０，０００〜７０，０００）に加えてから、１分間混合した（（水中油）中水）。１００ｍｌのＰＶＡ溶液を加えたところで、該混合物を１分間攪拌した。総量１００ｍｌの２％イソプロパノールを最終エマルジョンに加えてから、ドラフト下で２時間、持続的に攪拌して溶媒を除去した。ＴＧＦβ３溶液の代わりに蒸留水５０μｌを使う以外は同じ手順を用いて、（空でＴＧＦβ３を含まない）対照マイクロスフェアを作った。（Ｃｌｅｅｋ ＲＬ，ｅｔ ａｌ，１９９７）。水だけを対照として含む空のマイクロスフェアは、ＰＬＧＡ単独の分解副産物による影響となりうるものを引き算するために実施された。ＴＧＦβ３または蒸留水を含むＰＬＧＡマイクロスフェアを、濾過（２μｍの濾紙）を用いて単離し、蒸留水で洗浄した。マイクロスフェアを液体窒素の中で３０分間凍結させてから、４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥したＰＬＧＡマイクロスフェアは、使用直前まで−２０℃で貯蔵した。
【００３５】
ＰＬＧＡマイクロスフェアの滅菌
創傷治癒および再生医療にインビボで使用する前にマイクロスフェアを滅菌した。一般的に用いられているいくつか滅菌技術の有効性を測定するために、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、本明細書に記載した技術と同じ技術を用いて、ＰＬＡ：ＰＧＡ比５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェアにカプセル封入した。ＴＧＦβ３の代わりにｂＦＧＦを使用する合理的な理由は、ｂＦＧＦがＴＧＦβ３より安価であり、かつ、同じ構造的特性を有しているからである。ただし、ｂＦＧＦの溶解特性は、ＴＧＦβ３とは異なる可能性があり、異なった封入効率および放出動態をもたらす可能性もあるが、滅菌後の重合体の構造変化に対する滅菌の影響は比較することができよう。作成したｂＦＧＦ封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを無作為に以下の３つの群に分けた：１）３０分間紫外線（ＵＶ）下に置く群（ｎ＝３）、２）２４時間エチレンオキシドガス（ＥＯ）に曝露する群（ｎ＝３）、または３）１００Ｗで４分間高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）に曝露する群（ｎ＝３）。３種類の滅菌法を行った４時間後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、ｂＦＧＦ封入ＰＬＧＡマイクロスフェアの表面形態を測定した。さらに、３種類の滅菌法全部の直後に、１０ｍｇのｂＦＧＦ封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを別々に量り取り、ｂＦＧＦ放出動態を測定するためにウォーターバス中６０ｒｐｍ、３７℃で、１ｍｌの１％ＢＳＡ溶液に浸した。７日、１４日、２１日、および２８日目に上清を５０００ｒｐｍで１０分間遠心して完全に回収した。それぞれを回収した後、新鮮な１％ＢＳＡ溶液１ｍｌをマイクロスフェアに加えた。放出動態は、ｂＦＧＦ酵素結合免疫吸着測定キット（ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。
【００３６】
インビトロにおけるＴＧＦβ３の放出動態
凍結乾燥後、ＰＬＧＡマイクロスフェアを１ｍｇ単位にした１ｍｌ当たりのカプセル封入されたＴＧＦβ３の実際の量を、溶解したＰＬＧＡマイクロスフェアの親水性抽出液に酵素結合免疫吸着測定キット（ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて検出した。総量で１０ｍｇのＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを、１ｍｌの１％ＢＳＡ溶液中に分散させ、６０ｒｐｍおよび３７℃のウォーターバスの中で持続的に攪拌した（ｎ＝３）。定期的に上清の全量を回収してから、各試料について、ＴＧＦβ３ ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＴＧＦβ３の量を定量的に測定した。ＴＧＦβ３の放出速度を、ＰＬＧＡマイクロスフェア１ｍｇ当たりの全ＴＧＦβ３の割合（パーセント）として表した。１ｍｌのクロロホルムに１０ｍｇのＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを溶解させてから、１ｍｌの１％ＢＳＡ溶液を加えて、封入の収率を測定した（ｎ＝３）。混合物を６時間静置し、ＥＬＩＳＡを用いて、カプセル封入された量を定量するために、ＴＧＦβ３を多く含む溶液を回収した。ＴＧＦβ３を封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを、水溶液に曝露してから４日目にＳＥＭで画像化して表面の形態を観察した。
【００３７】
ヒト間葉系幹細胞の培養および骨原性分化
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、匿名の健常なドナーの骨髄（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から単離して、６穴プレートの中で３０，０００細胞／ウエルの密度に培養増幅した。（Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，２００４；Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，ａｎｄ Ｍａｏ，２００４）。単層ｈＭＳＣ培養物は、３７℃、湿度９５％、および５％ＣＯ２下で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、および１％の抗生物質および抗真菌剤（１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリン（ベース）、１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ベース）、２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−ｃ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて維持した（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）。３日か４日毎に培地を交換した。１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、および１００ｍＭβ−グリセロリン酸を含む骨形成補助剤によって、ヒトＭＳＣを骨原性細胞に分化させた。骨形成補助剤で処理されたＭＳＣは、多数の骨芽細胞マーカーを発現した骨芽細胞様細胞に分化し始める。ｈＭＳＣ由来細胞の初期骨形成能を、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色法、および酵素試薬を用いる定量法によって評価した（Ａｌｈｄｌａｑ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，２００４；Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，ａｎｄ Ｍａｏ，２００４；Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，Ｍａｏ，Ｊ．Ｊ．，２００３）。
【００３８】
ヒト間葉系幹細胞の骨原性分化に対する、制御放出されたＴＧＦβ３の生物活性
エチレンオキシドガスで滅菌された５０：５０共重合体比のＴＧＦβ３カプセル封入ＰＬＧＡマイクロスフェア（６２．５ｍｇ、放出動態から見積もると、７日間で培地２ｍｌあたり１．３５ｎｇのＴＧＦβ３が得られる、図７）をトランスウエルインサート（孔径０．４μｍ）の中に置いた（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）（Ｌｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２００１）。マイクロスフェアを含むトランスウエルインサートを、未分化ｈＭＳＣの単層培養から上方約０．９ｍｍのところに細胞培養用ウエルの中に置いて、細胞をＰＬＧＡマイクロスフェアと直接接触させることなしに、放出されたＴＧＦβ３に曝露した。このとき、骨形成剤を添加したＤＭＥＭ培地を加えた（ｎ＝３）。対照群では、０または１．３５ｎｇ／ｍｌのマイクロスフェア封入されていないＴＧＦβ３の溶液を、骨形成剤を添加したＤＭＥＭ培地とともにｈＭＳＣの単層培養に加えた（ｎ＝３）。３日目に骨形成剤添加培地を交換した。対照群には、溶液に入った新鮮なＴＧＦβ３を培地交換の際に加えた。溶液中の（マイクロスフェア封入されていない）ＴＧＦβ３に曝露したｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＡＬＰ活性を７日後に測定して、ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出された同一用量のＴＧＦβ３（１．３５ｎｇ／ｍｌ）に曝露したｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＡＬＰ活性と比較した（ｎ＝３）。上記で得られたＴＧＦβ３放出量を、６２．５ｍｇのＰＬＧＡマイクロスフェアから最初の７日間に放出されたＴＧＦβ３の量から推定した。アルカリホスファターゼ活性をＡＬＰ試薬（Ｒａｉｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて測定し、ｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＤＮＡ含有量に対して標準化した。ＤＮＡ含有量は、蛍光ＤＮＡ定量キット（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した（Ａｌｈｄｌａｑ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，２００４）。
【００３９】
統計解析
スチューデントのＴ検定およびＡＮＯＶＡを用いて、さまざまな滅菌法を行った後の、ｂＦＧＦをカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアの放出速度、ＰＬＡ：ＰＧＡ比が５０：５０のときと７５：２５のときのＴＧＦβ３の放出速度、および対照群（ＴＧＦβ３を含まない）と２つの実験群（ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されるか、細胞培養培地に直接添加する場合）における、ｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＡＬＰ活性を比較した。すべての統計解析は、Ｍｉｎｉｔａｂ１４ソフトウエア（Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）を用いて、０．０５のαレベルで行った。
【００４０】
ＰＬＧＡマイクロスフェアに封入されたＴＧＦβ３
二重エマルジョン溶媒抽出技術によって調製された、ＴＧＦβ３をカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアは、２種類のＰＬＧＡ組成物について円形で滑らかな表面を示した（図４Ａ）。ＴＧＦβ３をカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアの平均直径は１０８±６２μｍであった（図４Ａ）。水溶液の中に出現してから４日間たつと、ＰＬＧＡマイクロスフェアでは明らかに表面の分解が始まった（図４Ｂ）。
【００４１】
ＰＬＧＡマイクロスフェアの安定化とｂＦＧＦの放出動態
ＰＬＧＡマイクロスフェアのさまざまな滅菌法が、ＳＥＭによると、表面の分解に対してさまざまな影響を与えた。ＵＶ光で滅菌したＰＬＧＡマイクロスフェアは、未滅菌のＰＬＧＡマイクロスフェアに較べると表面に対して顕著な有害作用を示した（図５Ａ）。これに対して、エチレンオキシド（ＥＯ）ガス、および高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）は、ＰＬＧＡマイクロスフェアの表面分解に対する最小限の形態変化しか誘導しないようであった（図５Ｃおよび５Ｄ）。
【００４２】
ＵＶ光滅菌した後、ｂＦＧＦの放出速度は、未滅菌のＰＬＧＡマイクロスフェア、ＥＯ滅菌法またはＲＦＧＤ滅菌法のどれと比較しても顕著に低下した（図６）。このＵＶ処理したときのｂＦＧＦ放出速度の低下は、ＵＶ滅菌した後のＰＬＧＡマイクロスフェアの表面構造の分解をＳＥＭで観察した結果によって確認された（図５Ｂ）。ＥＯ滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェアまたはＲＦＧＤ滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェアのいずれのｂＦＧＦ放出速度も、未滅菌の対照と統計的に有意な差は見られなかった（図６）。その結果、低コストでマイクロスフェアの形態にも損傷を与えにくいことから、エチレンオキシドガスを、その後の実験で、ＴＧＦβ３をカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを滅菌する技術として選択した。
【００４３】
ＴＧＦβ３の放出動態
ＰＬＡ：ＰＧＡの共重合比が５０：５０および７５：２５のどちらについても、それぞれ、試験された３６日目および４２日目まで、ＴＧＦβ３がＰＬＧＡマイクロスフェアからインビトロで放出された（図７）。ＴＧＦβ３の封入率は、７５：２５のＰＬＧＡマイクロスフェア１ｍｇあたり０．６８ｎｇ／ｍｌであり、５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェア１ｍｇあたり０．２４ｎｇ／ｍｌであった。最初の１週間には、５０：５０または７５：２５いずれの共重合比のＰＬＧＡマイクロスフェアについても、バースト様放出が起き、その後、７５：２５の共重合比のものについて、より段階的に放出速度が増加するのが観察された（図７）。おそらく、５０：５０のＰＬＧＡの分解速度の方が速いせいで、７５：２５のＰＬＡ：ＰＧＡ比よりも、５０：５０のＰＬＡ：ＰＧＡの共重合比でより急速なＴＧＦβ３放出が得られた（図７）。封入されたＴＧＦβ３の約８％が、７５：２５のＰＬＧＡによって、最初の１週間以内に放出されたが、これに対し、同じ期間内に、５０：５０のＰＬＧＡからは、ほぼ１６％のＴＧＦβ３が放出された。３５日後、約１４％および３４％のＴＧＦβ３が、それぞれ７５：２５および５０：５０という共重合比のＰＬＧＡから放出された。
【００４４】
ｈＭＳＣの骨原性分化の阻害
ＡＬＰ染色、および酵素試薬を用いた定量によって明らかされたように、ヒトＭＳＣは、骨形成剤添加培地におけるインビトロでの培養７日目まで、比較的高い平均のアルカリホスファターゼ量を発現した（図８Ａおよび８Ｃ）。ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３（１．３５ｎｇ／ｍｌ）に曝露されたｈＭＳＣ細胞の、骨形成剤添加培地における培養７日目までのＡＬＰ活性は、ＡＬＰ染色の低下（図８Ｂ）だけでなく、ＡＬＰの定量（図８Ｃ）によっても明らかなように有意に阻害された。同じ用量（１．３５ｎｇ／ｍｌ）のＴＧＦβ３を、ｈＭＳＣの培養培地に直接（マイクロカプセル封入せずに）加えても、外から送達されたＴＧＦβ３に曝露されなかったｈＭＳＣよりは有意に低いＡＬＰ活性が得られた（図８Ｃ）。さらに、細胞培養培地に添加されたＴＧＦβ３と、ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出された同一用量のＴＧＦβ３との間でＡＬＰ減少に統計的に有意な差異がなかったこと（図８Ｃ）は、マイクロカプセルに封入した後、ＥＯ滅菌に引き続いて、生物活性のあるＴＧＦβ３がＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたことを示している。
【００４５】
先行研究では、ＴＧＦβ３が、本明細書で報告した濃度（１．３５ｎｇ／ｍｌ）よりもずっと高い濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）で、間葉系幹細胞の軟骨形成分化を誘導することが示されている。最大１．３５ｎｇ／ｍｌという本発明のＴＧＦβ３用量による軟骨形成がないことを確認するために、ＴＧＦβ３を担持したＰＬＧＡマイクロスフェアとともに培養されたｈＭＳＣ単層のサフラニン−Ｏによるネガティブ染色を観察した。
考察
ＰＬＧＡマイクロスフェアの中のＴＧＦβ３を徐放させるという発見は、創傷治癒および組織再生に応用することが可能である。制御放出法によるＴＧＦβ３の長期にわたる送達によって、細胞の動員、増殖、および分化が調節される。ＴＧＦβ３は、遺伝子の転写を標的とするＳｍａｄ経路によって細胞代謝に作用する。Ｉ型およびＩＩ型の二量体ＴＧＦβレセプターが、細胞表面でＴＧＦβ３を捕捉して、Ｓｍａｄに関連した事象のカスケードを活性化させ、シグナルを細胞核まで中継する。徐放させることにより、注射またはサイトカインを生体材料に浸すことに伴う拡散、不活性化、および生物活性の喪失とは対照的に、長期間のサイトカイン送達が可能になる。現在確認されている、５０：５０および７５：２５のＰＬＡ：ＰＧＡ比を用いたＰＬＧＡマイクロスフェアからのＴＧＦβ３の徐放プロファイルは、ＰＬＧＡマイクロスフェアからＴＧＦβ３が放出される速度は、ＰＬＡ：ＰＧＡの比率を変えることによって、簡単に、具体的な分解の必要性に合わせることができることを示している。ＰＬＡ内のメチル基が、その疎水的でゆっくりとした分解に関与している。ＰＧＡは結晶であり、分解時間を延長させる。したがって、さまざまな比率のＰＧＡおよびＰＬＡによって、増殖因子の特定の放出速度に適合させることができる。初期のバースト放出量は、予想されたよりは少なかったが、ＰＬＧＡマイクロスフェアの調製法には、このバーストを防ぐ技術が含まれていなかった。ＴＧＦβ３をＰＬＧＡマイクロスフェアに封入するのは新規のアプローチであり、比較的初期バースト放出量が少ないのは、特異的な増殖因子−重合体の相互作用のせいであるかもしれない。このＰＬＧＡマイクロスフェアによるＴＧＦβ３の系は、徐放性の長期放出を行うためのメカニズムを提供する。
【００４６】
ＰＬＧＡマイクロスフェアを薬剤送達および再生医療に応用するには、適切な滅菌技術を含む、適正な調製法が必要である。最適な滅菌技術は、生物活性と、封入される増殖因子の所定の放出動態を維持するものでなければならない。紫外線が、エチレンオキシドガスおよび高周波グロー放電のどちらよりも、ｂＦＧＦを封入したＰＬＧＡマイクロスフェアの有意に大きな表面損傷を誘導し、増殖因子の放出速度を低下させたことをここで実証したことは、ＰＬＧＡマイクロスフェアの滅菌にＵＶ光を使用することに対して警告を発する。放出速度が低下したのは、滅菌過程で重合体の表面および／またはバルクが分解され、その結果、ｂＦＧＦの量が減少したせいかもしれない。また、光によって増殖因子が直接分解されることも、ＵＶ滅菌したＰＬＧＡマイクロスフェアからのｂＦＧＦの放出速度の低下したことの説明になるかもしれない。表面の分解は、水性環境でインキュベートした後に見られ、重合体構造が加水分解されることを示唆している。
【００４７】
エチレンオキシドガスおよび高周波グロー放電はいずれも、ＰＬＧＡマイクロスフェアからのｂＦＧＦ放出動態を有意に変えない。ガンマ線照射を用いる滅菌法が十分に記録されているが、ほとんどの研究室では、ガンマ線照射滅菌を行うための装置を広く利用することができない。したがって、エチレンオキシドが、増殖因子を封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを滅菌するための論理的な選択結果である。
【００４８】
マイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３と、細胞培養液に直接添加されたものと同じ用量のＴＧＦβ３との間には、ヒト間葉系幹細胞に由来する骨形成細胞のＡＬＰ活性に統計的に有意な差が存在しないことによって、ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３の生物活性を確認することができる。
【００４９】
ヒト間葉系幹細胞の骨原性分化に対するＴＧＦβ３の阻害作用は、いくつかの再生医療モデルで役に立つ。例えば、間葉系幹細胞から組織再生されたウサギの腱修復の約２８％で望ましくない異所性骨形成が起きる。ＰＬＧＡマイクロスフェアからＴＧＦβ３が徐放されると、異所性骨形成の発生を抑えるのに役立つかもしれない。間葉系幹細胞の予期せぬ骨原性分化が、関節軟骨の組織再生で起きることがあるが、マイクロスフェア中のＴＧＦβ３を送達することにより対処することができる。ＴＧＦβ３またはＴＧＦβ１は高用量（一般的には１０ｎｇ／ｍｌ）で、間葉系幹細胞の軟骨形成性分化を誘導する。
【００５０】
ＴＧＦβ３の徐放の別の組織再生上の用途は、骨芽細胞活性を阻害すること、および、頭蓋変形、発作、および失明として発症する頭蓋骨癒合症をもたらす病理状態である、頭蓋縫合の早期骨化を予防することである。組織再生された頭蓋縫合を、頭蓋骨癒合症モデルに適用すれば、病理的に癒合した頭蓋骨縫合と同じ早期骨化の運命に耐えなければならないかもしれない。封入された増殖因子をより長期間作用させ、かつ正確に制御することを可能にする徐放法によって、ＴＧＦβ３を送達する既存の方法をさらに改良することができる。初期の骨形成において、ＴＧＦβ３は、封入されていてもいなくても、ヒト間葉系幹細胞のインビボにおける分化を阻害することができる。明らかな頭蓋縫合部の間葉組織としての性質によって、間葉系幹細胞は、早期縫合部骨化において極めて重要な役割を果たしている可能性が高い。
【００５１】
実施例２：チタン製インプラント
シカゴのイリノイ大学にある医療装置店で、滑らかで工業的に純粋なチタン製インプラントが特注によって製造された。インプラントは、寸法が４ｍｍ×２ｍｍ×６ｍｍ（外径×内径×長さ）の中空かつ円筒形のチタン棒であった。これらのインプラントは、直径が１ｍｍのクロスホールを４個含んでいた。インプラントの寸法は、現在市販されている通常の歯科用インプラントの寸法を反映していた。これらのインプラントは、歯科用インプラントから成形されたものであるが、この技術を整形外科に応用することができる。
【００５２】
材料と方法
ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）は、増殖因子などの大きな生体分子を制御送達する上で有効であることが分かっている、ＦＤＡが認可した共重合体である。正確に処理すれば、ＰＬＧＡに、生体分子を封入するマイクロスフェアを形成させることができる。直径が平均６４±μｍで、ＴＧＦ−β１を封入しているＰＬＧＡマイクロスフェアを研究室で作製した。また、ＰＬＧＡマイクロスフェアは、封入された分子の放出速度を変えるために、さまざまなＰＬＡ：ＰＧＡの比率を用いて作製することもできる。ＴＧＦ−β１を封入した５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェアのインビトロにおける放出実験によって、ＴＧＦ−β１は、速やかにバーストして３日間で約０．２±０．０５ｎｇが放出され、最大４週間まで放出が持続されることが示された。
【００５３】
【化１】
【００５４】
【化２】
【００５５】
【化３】
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】チタン製インプラントを具体的に示す、３枚組の写真（図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃ）である。これらのインプラントは、直径１ｍｍのクロスホールを４個含む、４ｍｍ×２ｍｍ×６ｍｍ（外径×内径×長さ）の滑らかで中空かつ多孔質の円筒形のチタン製ロッドである。Ａ：商標Ｓｔｅｒｉ−Ｏｓｓという名称でＮｏｂｅｌＢｉｏＣａｒｅから市販されている歯科用インプラント。Ｂ：商標ＩＴＩという名称でＳｔｒａｕｍａｎｎから市販されている歯科用インプラント。Ｃ：市販されているインプラントの寸法を模倣して特注した中空かつ多孔質のチタン製インプラント。
【図２】油−水−油二重エマルジョン技術を用いて研究室で製造されたポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアとその使用法を図示する写真（図２Ａ）およびグラフ（図２Ｂ）である。図２Ａ：直径が約６４〜１６ｐｍであって、ＴＧＦ−〜Ｉを封入しているＰＬＧＡマイクロスフェア。写真中の棒の長さは約１００ｐである。図２Ｂ：ＴＧＦ−〜Ｉを担持するマイクロスフェアのインビトロでの放出プロファイルを示すグラフ。ＴＧＦ−〜Ｉは、３日間で約０．２ ０．０５ｎｇが速やかにバーストして放出され、最大限４週間まで放出が持続する。
【図３】ＰＬＧＡマイクロスフェア、およびそれらを使用した結果を示す写真（図３Ａ）およびグラフ（図３Ｂ）である。図３Ａ：インビトロでの研究に備えて、ＰＬＧＡマイクロスフェアをコラーゲンスポンジに注入した。図３Ｂ：インビトロでの研究によって、３週目にはコラーゲンスポンジ中のＤＮＡ含量が増加することが示され、マイクロスフェアを担持するインプラントの中に移動する細胞の数が増加したことを示唆している。
【図４】ＰＬＧＡマイクロスフェアの製造および分解に関する。Ａ：ＰＬＡ：ＰＧＡの比率が５０：５０であるポリｄ−ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）から製造された、カプセル封入ＴＧＦβ３をもつマイクロスフェアの代表的なＳＥＭ画像、ＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアの平均直径は１０８±６２μｍであった。Ｂ：４日後にＰＢＳ溶液の中で、予想通りに分解したＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアの代表的なＳＥＭ画像。
【図５】ＳＥＭ下での無菌ＰＬＧＡマイクロスフェアの形態変化を示す。Ａ：未滅菌ＰＬＧＡマイクロスフェア。Ｂ：紫外線（ＵＶ）滅菌の極めて有害な影響を示す、紫外線滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェア（３０分）。Ｃ：２４時間エチレンオキシド（ＥＯ）ガスによって滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェア。Ｄ：高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）によって滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェア（４分、１００Ｗ）。ＵＶ光によって誘起された激しい表面分解による変化とは対照的に、ＥＯガスおよびＲＦＧＤは、ＰＬＧＡマイクロスフェアの顕著な表面分解をもたらさなかった。
【図６】ＰＬＧＡマイクロスフェアからのｂＦＧＦの放出動態を図示する。紫外線（ＵＶ）は、２１日目までＰＬＧＡマイクロスフェアからｂＦＧＦが放出される速度を有意に変化させた（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。エチレンオキシド（ＥＯ）ガスまたは高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）で滅菌した後には、放出動態の顕著な変化は見られなかった。エチレンオキシドが、サイトカイン封入ＰＬＧＡマイクロスフェアにとって最も経済的に効率的で安全な方法である。
【図７】１％ＢＳＡ溶液中におけるＰＬＧＡマイクロスフェアからのＴＧＦβ３の放出動態を示す。ＥＬＩＳＡによって検出したところ、５０：５０または７５：２５の共重合率のＰＬＧＡマイクロスフェアから、ＴＧＦβ３が、それぞれ最大限３６日目および４２日目まで持続的に放出され、どちらの共重合率でも、初期バースト様の放出が見られたが、７５：２５のＰＬＡ：ＰＧＡ比よりも５０：５０のＰＬＡ：ＰＧＡ比の方が急速な放出速度をもたらした。
【図８】骨形成剤添加培地で７日間培養した、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。Ａ：ＴＧＦβ３を含まないＰＬＧＡマイクロスフェアに曝露したときのＡＬＰ染色。Ｂ：ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３に曝露したときのＡＬＰ染色。染色は、白い矢印で示した隔離された領域に限定されている。Ｃ：骨形成剤添加培地で培養したｈＭＳＣのＡＬＰ活性をＡＬＰ試薬によって定量した結果。ＰＬＧＡマイクロスフェアによって送達されたＴＧＦβ３において、骨形成剤添加培地で培養されたｈＭＳＣで有意な染色の低下が見られ、ＴＧＦβ３は、１．３５ｎｇ／ｍｌでインビトロにおいてｈＭＳＣの初期骨形成分化を阻害することを示唆した（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。１０倍の倍率。
【技術分野】
【０００１】
整形外科用および歯科用のインプラントを媒体として用いて、生物剤が開発される。中空かつ多孔質の整形外科用または歯科用のインプラントは、その内部に、特定の移植部位で制御放出するために生物剤を担持する媒体として機能する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、毎年約２０億ドルが整形外科用および歯科用のインプラントに費やされている。これは、１年間だけで約７００，０００例の整形外科用インプラント処置が行われていることと相関する。歯科インプラント処置に関しては、３５〜４４歳の成人の約６９パーセントが少なくとも１本の永久歯を失っているため、歯科インプラントの希望者といえる。
【０００３】
インプラントは、通常、歯科用であっても、整形外科用またはそれ以外のためであっても、チタンのように生体適合性を有する材料であり、体内に外科的に挿入されて、骨または歯などの欠陥構造物の代わりをする。このようなインプラントは一般的になりつつあるが、短期的にも長期的にも、骨接合の領域に未だ問題が残っている。ほとんどのインプラントの手順は、骨の再生に関してあまり考慮がされておらず、主に機械的な修復にその焦点があてられている。最初は適切に骨接合がされている股関節などの骨置換が、骨とインプラントの接触面における骨溶解により、数年後に劣化することが示されている。
【０００４】
インプラントの寿命を延ばし、骨治癒過程を促進するために、ある研究では、インプラントの初期固定を改善すること、およびインプラント界面に対する骨の強度を維持することに焦点を置いている。しかし、これら現在の研究法はいずれも満足できるものではない。
【０００５】
トランスフォーミング増殖因子β３は、細胞伝達物質のスーパーファミリーの一員であり、細胞の増殖および分化の調節において基本的な役割を果たす。創傷治癒において、ＴＧＦβ３は、Ｉ型コラーゲン合成を減衰させて、瘢痕組織形成を減少させることが報告されている。ＴＧＦβ３は、新生児約２，５００人に１人の割合で発症する先天性疾患であって、頭蓋骨奇形、盲目、知能障害、および致死を示す頭蓋骨癒合症における頭蓋縫合の線維組織の骨化を調節することが報告されている。発達過程で、ＴＧＦβ３は、上皮細胞の接着と、その後の２つの口蓋棚が融合するのを調節するが、それに失敗すると口蓋裂が生じる。臍帯の発達段階で、ＴＧＦβ３が下方制御されると、臍帯形成段階で母子が死亡する主な原因となっている、臍帯においてよく見られる子癇前症の異常な構造および力学的特性を生じさせる。ＴＧＦβ３は、ＴＧＦ−２など、その他の内生因子を活性化させて、角膜実質線維芽細胞の増殖を媒介する。緑内障手術後に起こる線維症の機構は、ＴＧＦβ３、およびその作用が結膜下線維芽細胞に及ぶことによって媒介される。
【０００６】
広範な細胞および組織の発達におけるＴＧＦβ３の基本的な役割によって、これを組織修復法に採用することが推進されてきた。ゲルにしてＴＧＦβ３を局所塗布すると、プラセボゲルと比較して、２．５μｇ／ｃｍ２の用量で患者の創傷治癒を改善することが報告された。骨化しつつある頭蓋縫合にＴＧＦβ３を含んだコラーゲンゲルを送達すると、早期癒合を遅延させることが報告されている。ＰＬＡの微細な溝を有する表面から放出された生物活性ＴＧＦβ３は最大限２４時間、肺上皮細胞の増殖を阻害することが報告されている。サイトカインを徐放するための従来の試みには、脂質ナノ粒子、キトサンまたはゼラチンを主原料とする微粒子、コラーゲンセラミックス、多孔質ガラスなどがある。ＴＧＦβ３の短期的な生物活性が研究されているが、創傷治癒および組織再生の過程で細胞活性を長期間調節するという広範な需要に対しては、マイクロカプセル化による持続放出について調査することが必要である。
【０００７】
ＴＧＦβ３の治療上の可能性を調査する努力が既に為されてきたにもかかわらず、その有効な用途は、例えば、半減期の短さ、インビボでの不安定性、および送達系が比較的不正確であるなど、いくつかのありふれた欠点によって制約されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
中空かつ多孔質のインプラントには、例えば、幹細胞および増殖因子など、生物、薬品、薬草または化学物質に由来する生物活性剤を担持させる。これらは、例えば、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）の中に封入することができる。中空かつ多孔質の歯科用または整形外科用のインプラントは、インプラント処置後、インプラント中またはインプラント上で歯または骨の治癒を促進する、１つ以上の封入生物剤を担持する。封入された生物剤がインプラントの中に含まれ、さらには、それらがインプラントの外部に、宿主組織に対して放出されて、インプラント上およびインプラント内部で増殖することができるように注意しつつ、当技術分野において既知の方法によって担持させる。マイクロスフェアを生体適合性材料の中に担持させる方法の一つは、真空による方法である。増殖因子を封入している幹細胞および／またはＰＬＧＡマイクロスフェアを、例えば、コラーゲンスポンジなどの足場に挿入する。次に、このスポンジをインプラントの中空部に詰め込む。そして、この生体適合性材料をインプラントの中空の中心部に詰め込む。中空かつ多孔質のインプラントは、欠損した骨または歯に耐荷重性機能を付加する生体適合性の固体材料でできており、中空かつ多孔質であるため、インプラントの機械的強度を低下させて、骨に対する応力遮蔽効果を減少させる。この中空かつ多孔質のインプラントに適した材料には、チタンなどの金属が含まれる。骨芽細胞はチタンに付着して、新しい骨を産生することができる。中空かつ多孔質のインプラントは、任意で、金属の上にコーティングを有することも可能である。インプラントの断面は、円筒形か正方形か長方形か、あるいは不規則な形であってよい。選択する形状は、修復すべき歯または骨の解剖学的部位および配置に依存する。
【０００９】
カプセル封入された生物剤は中空かつ多孔質のインプラントの中に担持されて、新しい骨または歯の構造体の成長を促進する。多孔性と制御放出技術を組み合わせることによって、骨成長および骨結合（例えば、チタンを宿主の骨または歯の中に組み込むこと）を促進する、新たな歯科用および／または整形外科用のインプラント系が生み出される。制御放出技術により、予定された用量の増殖因子、および／またはその他の化学的および／または薬理学的な物質を、予め決められた時間的かつ空間的な態様で送達して、骨の増殖および結合を促進する。細孔および中空円筒という理学的徴候を変更して、骨成長および／または骨結合を最適化することができる。適当な薬剤は、新しい骨または歯の成長または治癒に特異的な増殖因子および培養液を含む。成人または胎児の幹細胞を添加することができる。生物剤はインプラント領域、通常はその隣接領域において作用する。具体的な増殖因子には、ＢＭＰファミリー（２、７、８、９）、ＴＧＦ〜ファミリー（１、２、３）、〜ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、および増殖因子と化学物質の混合物などがある。幹細胞は、存在する場合、内生的な成人の間葉系幹細胞を含む。適当な生体適合性担体はチタンであり、適当な封入材はポリ乳酸−グリコール酸共重合体である。
【００１０】
創傷治癒および組織再生における役割が報告されていながら、ＴＧＦβ３の長期間の制御放出については実証されていない。制御放出に適した組成物は、マイクロスフェアに封入されているポリｄ−ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）中のＴＧＦβ３である。ＰＬＡ：ＰＧＡの比が５０：５０および７５：２５であるＰＬＧＡカプセル中に封入されたＴＧＦβ３の放出プロファイルは、生物活性の解析全体を通して異なっていた。マイクロスフェアを無菌化する方法を比較するために、５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェアにｂＦＧＦを封入して、エチレンオキシド（ＥＯ）ガス、高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）、または紫外（ＵＶ）線に曝露した。ｂＦＧＦの放出は、紫外線によって顕著に弱まったが、ＥＯまたはＲＦＧＤによっては顕著には変わらなかった。その生物活性を確認するために、ＴＧＦβ３（１．３５ｎｇ／ｍｌ）を、骨原性分化を誘導されているヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）培養液に制御放出した。アルカリホスファターゼによる染色強度は、ｈＭＳＣ由来の骨原性細胞をＴＧＦβ３に暴露してから１週間後には著しく減少していた。このことは、５．８±０．９ｍＵ／ｍｌ／ｎｇ ＤＮＡ（ｐ＜０．０５）であった対照（ＴＧＦβ３を含まない）よりもアルカリホスファターゼ活性が低くなった（２．２５±０．５７ｍＵ／ｍｌ／ｎｇＤＮＡ）ことから確認された。さらに、制御放出されたＴＧＦβ３の生物活性は、１．３５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３を細胞培養液に直接添加しても、アルカリホスファターゼに有意な差異が見られなかった（ｐ＞０．０５）ことによっても確認された。マイクロカプセルに封入されたＴＧＦβ３は、創傷治癒や再生医療を応用する際に有用である。
【００１１】
ＴＧＦβ３をＰＬＧＡマイクロスフェアの中に封入して、その放出動態を測定し、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨原性分化に対する、制御放出されたＴＧＦβ３の生物活性を調べた。ＰＬＧＡマイクロスフェアの形態、および封入された増殖因子の放出動態に対する、いくつかの一般的に使用されている無菌化法の影響を測定した。それらは、紫外線法、エチレンオキシドガス法、および高周波グロー放電法を含み、さまざまな増殖因子を封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを用いるその後のインビボ実験において無菌化法を選択するのに役に立つよう設計されていた。
【００１２】
中空かつ多孔質のインプラントは、増殖細胞および／または成人間葉系幹細胞を取り込むことができる限り、どのような形状および大きさになるよう生物学的に操作してもよい。患者自身の骨髄に由来する造骨細胞を使用することによって、免疫拒絶反応の問題は最小限になる。
【００１３】
新しい骨は、生物学的に行われる治癒過程として、患者自身の組織と一体化する。インプラントを設置するための整形外科的方法は、当技術分野において知られており、別個にヒト被験者の承認手続きを必要とせずに利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
当業者に知られている方法によって、中空かつ多孔質の整形外科用または歯科用のインプラントに、人体の内部またはその上で放出させるためにカプセル封入された生物剤を１つ以上担持させる。このカプセル封入生物剤は中空のコアに担持されて、移植後、インプラントに隣接したところで歯または骨の治癒を促進する。この生物剤は拡散するか、さもなければ、封入細胞膜を通過することができるか、または封入構造が破断して生物剤を放出するか、あるいは、両方が起きて、生物剤が多孔質のインプラントを横断して周囲の組織に入り込む。
【００１５】
カプセル封入された生物剤を含む中空かつ多孔質のインプラントは、単独、または胎児もしくは成人の幹細胞、例えば、成人の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に加えて提供することができる増殖因子を含む。ＭＳＣは、骨髄細胞、または、それ以外の由来源、例えば、脂肪組織または末梢血などから調製することができる。内在性細胞を使用すると、免疫拒絶反応の危険が最小限になる。
【００１６】
増殖因子の例には、ＢＭＰファミリー、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９と名付けられた（ＢＭＰ２、７、８、および９とも呼ばれる）因子など、ＴＧＦ〜−１、ＴＧＦ〜−２およびＴＧＦ〜−３と呼ばれる（ＴＧＦ〜１，２、および３とも呼ばれる）分子を含むＴＧＦ〜ファミリー、〜ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、その他の増殖因子、および上記またはそれら以外の増殖因子を２種類以上混合した物などがある。
【００１７】
胎児または成人に由来する幹細胞などの幹細胞は、増殖因子を含み、増殖因子を封入する細胞膜に取り囲まれている。これらの細胞は、骨髄、脂肪組織および末梢血、ならびに別の由来源から採取することができる。成人の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胎児の幹細胞、またはその他の成人幹細胞を使用することができる。成人の間葉系幹細胞は、骨細胞に分化することができる骨髄細胞に由来する。
【００１８】
成人のＭＳＣは、軟骨組織、骨組織、および脂肪組織など、全ての結合組織形成細胞系列に分化する能力をもつ。ＭＳＣは、骨髄、または体内のその他の結合組織から低侵襲的な方法で得ることができ、培養液の中で非常に増殖させやすく、十分に確立している誘導補助剤に曝露して容易に分化誘導することができる。さらに、成人の幹細胞の使用は、倫理上の理由から、胚性幹細胞を使用するよりも有利である。
【００１９】
中空かつ多孔質のインプラントは、例えば、１種類以上の金属、例えば、ステンレススチール、チタンなどでできている、生体適合性を有する固体材料から構築される（図１）。
【００２０】
中空かつ多孔質のインプラントの形状は、必要に応じてプログラムする。インプラントの形状は、骨に似るかもしれないし、円筒形や、必要に応じてその他の形状にすることができる。インプラントは多孔性または有孔性である（インプラントの壁を貫通して、細胞、タンパク質、および低分子がインプラントの内側から外側に移動すること、およびその逆を可能にする１つ以上の穴を有する）。すなわち、インプラントの表面には、中空かつ多孔質のインプラントの内外に液体およびタンパク質が出入りすることを可能にする空間が画定されている。中空かつ多孔質のインプラントは金網に似ているかもしれない。壁貫通孔はインプラントをまっすぐに貫通する必要はなく、蛇行していてもよい。
【００２１】
中空かつ多孔質のインプラントは、内部に第２の生体適合性材料を含んでいてもよく、また、例えば、ヒドロゲル重合体など、第２の生体適合性材料でコーティングされていてもよい。ヒドロゲル重合体は、造骨細胞に、体の中の細胞外マトリックスに類似した環境を提供する。
【００２２】
ヒドロゲル重合体は、その独特の３次元構造を維持しつつ、大量の水または生体液を吸収する、親水性で３次元の網目構造体である。コーティングは光分極性（ｐｈｏｔｏｐｏｌａｒｉｚａｂｌｅ）ヒドロゲル重合体、または水和ポリ乳酸・グリコール酸共重合体であってもよい。
【００２３】
ポリ乳酸・グリコール酸共重合体を主成分とするヒドロゲル重合体は、生体適合性が証明されており、かつ、ＭＳＣが骨などの多数の系列に増殖および分化するのを助けることができることが明らかになっているため、生物学的に応用するための一定の利点を有する。これらの重合体は、インプラントの内部にマイクロスフェアを保持するのに役立つ。また、最小限の侵襲的処置（注射）で皮下に細胞−重合体系を投与すること、および、これらのヒドロゲルが経皮的に光重合を行うことができることは生体系において有益である。
【００２４】
中空かつ多孔質のインプラントに、例えば、胚性または成人の間葉系幹細胞など、１つ以上の生物剤、および／またはヒドロゲル重合体の中にカプセル封入された１つ以上の増殖因子、あるいはこれら両方を担持させる。封入するヒドロゲルは、一般的には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物である物質であろう。好ましくは、ヒドロゲルは、紫外線、および、例えば、２−ヒドロキシ−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンなどの光開始剤の作用によって重合されているポリ乳酸・グリコール酸共重合体を含む。
【００２５】
制御放出による長期間にわたる送達によって、例えば、コラーゲンの足場に入れてＴＧＦβ３を即時適用することに伴う従来の制限を回避する方法が提供される。制御放出するための一つのアプローチ法は、マイクロスフェアにペプチドおよびタンパク質を封入することによる方法である（図２）。ポリｄ−ｌ−乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）は、加水分解によって分解されて、乳酸およびグリコール酸のモノマーなど、生体適合性を有する副産物になる。乳酸およびグリコール酸は、最小限の免疫反応を誘発しながら、クレブス回路を経て、ＣＯ２およびＨ２Ｏとして生体内で除去される。ＰＬＧＡマイクロスフェアは、小球の直径および分解速度の調節を可能にする二重エマルジョン溶媒抽出技術を用いて、カプセル封入された増殖因子の安定性と生物活性を維持しつつ製造される。例えば、ＢＭＰ、ＴＧＦβ１および２、神経栄養性成長因子、ＶＥＧＦ、およびＩＧＦなどの増殖因子のいくつかを封入および放出する動態が報告されている。しかし、ＴＧＦβ３のマイクロカプセル封入およびその放出の動態は知られていない。他の２つの哺乳動物アイソフォームであるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、頭蓋縫合癒合および骨形成を促進する。ＴＧＦβ１は、ポリ（フマル酸ポリプロピレン）基質の上で培養した骨髄間質細胞の増殖および骨芽細胞分化を促進することが示されている。ＴＧＦβ１および２は、ネズミの前頭鼻骨縫合閉塞症を起している間、持続的に存在する。それに対して、ＴＧＦβ３は、ネズミ冠状縫合を非骨状態に維持することに関係している。
【００２６】
カプセル封入された生物剤は、アルギン酸、海綿、キトサン、サンゴ、アガロース、フィブリン、コラーゲン、骨、シリコーン、軟骨、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、およびこれらの混合物からなる天然材料を含むことができる生体マトリックスの内部に存在する。コラーゲンスポンジを用いて、中空かつ多孔質のインプラント内部にカプセル封入された増殖因子または幹細胞またはその両方を運ぶことができる（図３）。また、ヒドロゲル重合体を生体マトリックスとして用いることもできる。
【００２７】
さらに、該生体マトリックスは骨形成剤、例えば、デキサメタゾンを含むことができる。骨形成剤のさらなる例は、骨形態形成タンパク質ファミリー、トランスフォーミング増殖因子タンパク質ファミリー、および血管内皮増殖因子タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバー、ならびにそのような骨形成剤の混合物などである。さらに、生体マトリックスは栄養培地を含むこともできる。
【００２８】
組成物を、チタン媒体、生体マトリックス、骨形成剤、栄養培地、すくなくとも１種類の抗生物質、および成人の間葉系幹細胞の中で、骨の一部または全体の形にすることができるが、チタン媒体は、骨形成剤、培地、抗生物質、および細胞を保持している生体マトリックスを支える固形支持体を提供する。
【００２９】
組成物は、チタン媒体；ポリ乳酸・グリコール酸共重合体および２−ヒドロキシ−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンを含むヒドロゲル；デキサメタゾンおよびトランスフォーミング増殖因子β１などの骨形成剤；βグリセロリン酸およびアスコルビン酸−２−リン酸を含む栄養培地；ペニシリン；ストレプトマイシン；およびヒト骨髄由来の成人間葉系幹細胞からなり、円筒形、または一部もしくは全部を骨の形にすることができる。ここでチタン媒体は、骨形成剤、培地、抗生物質、および細胞を保持しているヒドロゲルを支える固形支持体としての機能をはたす。
【００３０】
骨軟骨構造体を作成する方法は、骨髄から成人の間葉系幹細胞などの成人または胚性の幹細胞を提供する工程、骨原性培地で該細胞を処理して骨芽細胞への分化を誘導する工程、および、チタン製メッシュおよびヒドロゲルマトリックスからなる生体適合性媒体上に該骨芽細胞を担持させる工程を含む。適当な骨原性培地は、当技術分野において骨増殖を開始させるか促進するために使用されるものである。内生性骨髄は拒絶反応を最小限にする。
【００３１】
生物学的に操作された一部または全体の骨をインビボで産生する方法は、ヒドロゲルコーティングを有する生体適合性チタン媒体の組成物、および例えば、成人の間葉系幹細胞などの成人または胚性の幹細胞の試料を宿主動物に移植することを含む。具体的な宿主動物の例は、例えば、ラット、マウス、およびウサギなどの実験動物、例えば、イヌまたはネコなどの愛玩動物、例えば、馬（ウマ）、牛（ウシ）、羊（ヒツジ）、または山羊（ヤギ）などの家畜動物、またはサル、類人猿（チンパンジー、オランウータン、またはゴリラ）、または人類（ヒト）などの霊長類などである。
【００３２】
インプラント部位で新しい骨または歯の増殖を誘導する方法は、以下の工程を含む：（ａ）骨細胞と混合した生体マトリックスを含む、中空かつ多孔質の生体適合性媒体からなるインプラントを提供する工程、（ｂ）そのインプラントを宿主動物（例えば、患者）に移植する工程、および（ｃ）骨または歯が成長するのに十分な期間、該動物（例えば、患者）を管理する工程。具体的には、成人の間葉系幹細胞などの幹細胞を回収する。それらの細胞を骨原性培地で処理して骨細胞に分化させる。このようにして調製した骨細胞を、ヒドロゲルマトリックスを有する、中空かつ多孔質の穿孔チタン媒体の中に担持させて、該マトリックスとの混合物を形成させる。該インプラントを患者に移植する。新しい細胞が増殖するのに充分な時間、患者を医学的（歯科的）に適切な状態に維持する。
【００３３】
「１つの（ａ）」または「１個の（ａｎ）」という冠詞は、１つまたは複数を含むものとする。
【００３４】
実施例
実施例１：ＰＬＧＡマイクロスフェアからのＴＧＦβ３の徐放、およびヒト間葉系幹細胞の初期骨原性分化に対するその効果
ＰＬＧＡマイクロスフェアの調製およびＴＧＦβ３のカプセル封入
ＰＬＡ：ＰＧＡ比が５０：５０および７５：２５（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のポリ（ＤＬ−乳酸・グリコール酸）（ＰＬＧＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のマイクロスフェアを、二重エマルジョン技術（（水中油）中水型）を用いて調製した（Ｌｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，２００１；Ｗｅｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ，２００４；Ｒｕａｎ，Ｇ，ｅｔ ａｌ，２００２）。総量２５０ｍｇのＰＬＧＡを１ｍｌのジクロロメタンに溶かした。分子量２５ｋＤａの組換えヒトＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を全部で２．５μｇ、製造業者のプロトコルに従って、５０μｌの再構成溶液に希釈し、ＰＬＧＡ溶液に加えて、１分間乳化した（水中油）混合物（初期エマルジョン）を形成させた。次に、この初期エマルジョンを、２ｍｌの１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、分子量３０，０００〜７０，０００）に加えてから、１分間混合した（（水中油）中水）。１００ｍｌのＰＶＡ溶液を加えたところで、該混合物を１分間攪拌した。総量１００ｍｌの２％イソプロパノールを最終エマルジョンに加えてから、ドラフト下で２時間、持続的に攪拌して溶媒を除去した。ＴＧＦβ３溶液の代わりに蒸留水５０μｌを使う以外は同じ手順を用いて、（空でＴＧＦβ３を含まない）対照マイクロスフェアを作った。（Ｃｌｅｅｋ ＲＬ，ｅｔ ａｌ，１９９７）。水だけを対照として含む空のマイクロスフェアは、ＰＬＧＡ単独の分解副産物による影響となりうるものを引き算するために実施された。ＴＧＦβ３または蒸留水を含むＰＬＧＡマイクロスフェアを、濾過（２μｍの濾紙）を用いて単離し、蒸留水で洗浄した。マイクロスフェアを液体窒素の中で３０分間凍結させてから、４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥したＰＬＧＡマイクロスフェアは、使用直前まで−２０℃で貯蔵した。
【００３５】
ＰＬＧＡマイクロスフェアの滅菌
創傷治癒および再生医療にインビボで使用する前にマイクロスフェアを滅菌した。一般的に用いられているいくつか滅菌技術の有効性を測定するために、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、本明細書に記載した技術と同じ技術を用いて、ＰＬＡ：ＰＧＡ比５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェアにカプセル封入した。ＴＧＦβ３の代わりにｂＦＧＦを使用する合理的な理由は、ｂＦＧＦがＴＧＦβ３より安価であり、かつ、同じ構造的特性を有しているからである。ただし、ｂＦＧＦの溶解特性は、ＴＧＦβ３とは異なる可能性があり、異なった封入効率および放出動態をもたらす可能性もあるが、滅菌後の重合体の構造変化に対する滅菌の影響は比較することができよう。作成したｂＦＧＦ封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを無作為に以下の３つの群に分けた：１）３０分間紫外線（ＵＶ）下に置く群（ｎ＝３）、２）２４時間エチレンオキシドガス（ＥＯ）に曝露する群（ｎ＝３）、または３）１００Ｗで４分間高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）に曝露する群（ｎ＝３）。３種類の滅菌法を行った４時間後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、ｂＦＧＦ封入ＰＬＧＡマイクロスフェアの表面形態を測定した。さらに、３種類の滅菌法全部の直後に、１０ｍｇのｂＦＧＦ封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを別々に量り取り、ｂＦＧＦ放出動態を測定するためにウォーターバス中６０ｒｐｍ、３７℃で、１ｍｌの１％ＢＳＡ溶液に浸した。７日、１４日、２１日、および２８日目に上清を５０００ｒｐｍで１０分間遠心して完全に回収した。それぞれを回収した後、新鮮な１％ＢＳＡ溶液１ｍｌをマイクロスフェアに加えた。放出動態は、ｂＦＧＦ酵素結合免疫吸着測定キット（ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。
【００３６】
インビトロにおけるＴＧＦβ３の放出動態
凍結乾燥後、ＰＬＧＡマイクロスフェアを１ｍｇ単位にした１ｍｌ当たりのカプセル封入されたＴＧＦβ３の実際の量を、溶解したＰＬＧＡマイクロスフェアの親水性抽出液に酵素結合免疫吸着測定キット（ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて検出した。総量で１０ｍｇのＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを、１ｍｌの１％ＢＳＡ溶液中に分散させ、６０ｒｐｍおよび３７℃のウォーターバスの中で持続的に攪拌した（ｎ＝３）。定期的に上清の全量を回収してから、各試料について、ＴＧＦβ３ ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＴＧＦβ３の量を定量的に測定した。ＴＧＦβ３の放出速度を、ＰＬＧＡマイクロスフェア１ｍｇ当たりの全ＴＧＦβ３の割合（パーセント）として表した。１ｍｌのクロロホルムに１０ｍｇのＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアを溶解させてから、１ｍｌの１％ＢＳＡ溶液を加えて、封入の収率を測定した（ｎ＝３）。混合物を６時間静置し、ＥＬＩＳＡを用いて、カプセル封入された量を定量するために、ＴＧＦβ３を多く含む溶液を回収した。ＴＧＦβ３を封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを、水溶液に曝露してから４日目にＳＥＭで画像化して表面の形態を観察した。
【００３７】
ヒト間葉系幹細胞の培養および骨原性分化
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、匿名の健常なドナーの骨髄（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から単離して、６穴プレートの中で３０，０００細胞／ウエルの密度に培養増幅した。（Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，２００４；Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，ａｎｄ Ｍａｏ，２００４）。単層ｈＭＳＣ培養物は、３７℃、湿度９５％、および５％ＣＯ２下で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、および１％の抗生物質および抗真菌剤（１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリン（ベース）、１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ベース）、２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−ｃ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて維持した（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）。３日か４日毎に培地を交換した。１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、および１００ｍＭβ−グリセロリン酸を含む骨形成補助剤によって、ヒトＭＳＣを骨原性細胞に分化させた。骨形成補助剤で処理されたＭＳＣは、多数の骨芽細胞マーカーを発現した骨芽細胞様細胞に分化し始める。ｈＭＳＣ由来細胞の初期骨形成能を、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色法、および酵素試薬を用いる定量法によって評価した（Ａｌｈｄｌａｑ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，２００４；Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，ａｎｄ Ｍａｏ，２００４；Ａｌｈａｄｌａｑ，Ａ．，Ｍａｏ，Ｊ．Ｊ．，２００３）。
【００３８】
ヒト間葉系幹細胞の骨原性分化に対する、制御放出されたＴＧＦβ３の生物活性
エチレンオキシドガスで滅菌された５０：５０共重合体比のＴＧＦβ３カプセル封入ＰＬＧＡマイクロスフェア（６２．５ｍｇ、放出動態から見積もると、７日間で培地２ｍｌあたり１．３５ｎｇのＴＧＦβ３が得られる、図７）をトランスウエルインサート（孔径０．４μｍ）の中に置いた（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）（Ｌｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２００１）。マイクロスフェアを含むトランスウエルインサートを、未分化ｈＭＳＣの単層培養から上方約０．９ｍｍのところに細胞培養用ウエルの中に置いて、細胞をＰＬＧＡマイクロスフェアと直接接触させることなしに、放出されたＴＧＦβ３に曝露した。このとき、骨形成剤を添加したＤＭＥＭ培地を加えた（ｎ＝３）。対照群では、０または１．３５ｎｇ／ｍｌのマイクロスフェア封入されていないＴＧＦβ３の溶液を、骨形成剤を添加したＤＭＥＭ培地とともにｈＭＳＣの単層培養に加えた（ｎ＝３）。３日目に骨形成剤添加培地を交換した。対照群には、溶液に入った新鮮なＴＧＦβ３を培地交換の際に加えた。溶液中の（マイクロスフェア封入されていない）ＴＧＦβ３に曝露したｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＡＬＰ活性を７日後に測定して、ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出された同一用量のＴＧＦβ３（１．３５ｎｇ／ｍｌ）に曝露したｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＡＬＰ活性と比較した（ｎ＝３）。上記で得られたＴＧＦβ３放出量を、６２．５ｍｇのＰＬＧＡマイクロスフェアから最初の７日間に放出されたＴＧＦβ３の量から推定した。アルカリホスファターゼ活性をＡＬＰ試薬（Ｒａｉｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて測定し、ｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＤＮＡ含有量に対して標準化した。ＤＮＡ含有量は、蛍光ＤＮＡ定量キット（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した（Ａｌｈｄｌａｑ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，２００４）。
【００３９】
統計解析
スチューデントのＴ検定およびＡＮＯＶＡを用いて、さまざまな滅菌法を行った後の、ｂＦＧＦをカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアの放出速度、ＰＬＡ：ＰＧＡ比が５０：５０のときと７５：２５のときのＴＧＦβ３の放出速度、および対照群（ＴＧＦβ３を含まない）と２つの実験群（ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されるか、細胞培養培地に直接添加する場合）における、ｈＭＳＣ由来の骨形成原細胞のＡＬＰ活性を比較した。すべての統計解析は、Ｍｉｎｉｔａｂ１４ソフトウエア（Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）を用いて、０．０５のαレベルで行った。
【００４０】
ＰＬＧＡマイクロスフェアに封入されたＴＧＦβ３
二重エマルジョン溶媒抽出技術によって調製された、ＴＧＦβ３をカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアは、２種類のＰＬＧＡ組成物について円形で滑らかな表面を示した（図４Ａ）。ＴＧＦβ３をカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアの平均直径は１０８±６２μｍであった（図４Ａ）。水溶液の中に出現してから４日間たつと、ＰＬＧＡマイクロスフェアでは明らかに表面の分解が始まった（図４Ｂ）。
【００４１】
ＰＬＧＡマイクロスフェアの安定化とｂＦＧＦの放出動態
ＰＬＧＡマイクロスフェアのさまざまな滅菌法が、ＳＥＭによると、表面の分解に対してさまざまな影響を与えた。ＵＶ光で滅菌したＰＬＧＡマイクロスフェアは、未滅菌のＰＬＧＡマイクロスフェアに較べると表面に対して顕著な有害作用を示した（図５Ａ）。これに対して、エチレンオキシド（ＥＯ）ガス、および高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）は、ＰＬＧＡマイクロスフェアの表面分解に対する最小限の形態変化しか誘導しないようであった（図５Ｃおよび５Ｄ）。
【００４２】
ＵＶ光滅菌した後、ｂＦＧＦの放出速度は、未滅菌のＰＬＧＡマイクロスフェア、ＥＯ滅菌法またはＲＦＧＤ滅菌法のどれと比較しても顕著に低下した（図６）。このＵＶ処理したときのｂＦＧＦ放出速度の低下は、ＵＶ滅菌した後のＰＬＧＡマイクロスフェアの表面構造の分解をＳＥＭで観察した結果によって確認された（図５Ｂ）。ＥＯ滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェアまたはＲＦＧＤ滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェアのいずれのｂＦＧＦ放出速度も、未滅菌の対照と統計的に有意な差は見られなかった（図６）。その結果、低コストでマイクロスフェアの形態にも損傷を与えにくいことから、エチレンオキシドガスを、その後の実験で、ＴＧＦβ３をカプセル封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを滅菌する技術として選択した。
【００４３】
ＴＧＦβ３の放出動態
ＰＬＡ：ＰＧＡの共重合比が５０：５０および７５：２５のどちらについても、それぞれ、試験された３６日目および４２日目まで、ＴＧＦβ３がＰＬＧＡマイクロスフェアからインビトロで放出された（図７）。ＴＧＦβ３の封入率は、７５：２５のＰＬＧＡマイクロスフェア１ｍｇあたり０．６８ｎｇ／ｍｌであり、５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェア１ｍｇあたり０．２４ｎｇ／ｍｌであった。最初の１週間には、５０：５０または７５：２５いずれの共重合比のＰＬＧＡマイクロスフェアについても、バースト様放出が起き、その後、７５：２５の共重合比のものについて、より段階的に放出速度が増加するのが観察された（図７）。おそらく、５０：５０のＰＬＧＡの分解速度の方が速いせいで、７５：２５のＰＬＡ：ＰＧＡ比よりも、５０：５０のＰＬＡ：ＰＧＡの共重合比でより急速なＴＧＦβ３放出が得られた（図７）。封入されたＴＧＦβ３の約８％が、７５：２５のＰＬＧＡによって、最初の１週間以内に放出されたが、これに対し、同じ期間内に、５０：５０のＰＬＧＡからは、ほぼ１６％のＴＧＦβ３が放出された。３５日後、約１４％および３４％のＴＧＦβ３が、それぞれ７５：２５および５０：５０という共重合比のＰＬＧＡから放出された。
【００４４】
ｈＭＳＣの骨原性分化の阻害
ＡＬＰ染色、および酵素試薬を用いた定量によって明らかされたように、ヒトＭＳＣは、骨形成剤添加培地におけるインビトロでの培養７日目まで、比較的高い平均のアルカリホスファターゼ量を発現した（図８Ａおよび８Ｃ）。ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３（１．３５ｎｇ／ｍｌ）に曝露されたｈＭＳＣ細胞の、骨形成剤添加培地における培養７日目までのＡＬＰ活性は、ＡＬＰ染色の低下（図８Ｂ）だけでなく、ＡＬＰの定量（図８Ｃ）によっても明らかなように有意に阻害された。同じ用量（１．３５ｎｇ／ｍｌ）のＴＧＦβ３を、ｈＭＳＣの培養培地に直接（マイクロカプセル封入せずに）加えても、外から送達されたＴＧＦβ３に曝露されなかったｈＭＳＣよりは有意に低いＡＬＰ活性が得られた（図８Ｃ）。さらに、細胞培養培地に添加されたＴＧＦβ３と、ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出された同一用量のＴＧＦβ３との間でＡＬＰ減少に統計的に有意な差異がなかったこと（図８Ｃ）は、マイクロカプセルに封入した後、ＥＯ滅菌に引き続いて、生物活性のあるＴＧＦβ３がＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたことを示している。
【００４５】
先行研究では、ＴＧＦβ３が、本明細書で報告した濃度（１．３５ｎｇ／ｍｌ）よりもずっと高い濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）で、間葉系幹細胞の軟骨形成分化を誘導することが示されている。最大１．３５ｎｇ／ｍｌという本発明のＴＧＦβ３用量による軟骨形成がないことを確認するために、ＴＧＦβ３を担持したＰＬＧＡマイクロスフェアとともに培養されたｈＭＳＣ単層のサフラニン−Ｏによるネガティブ染色を観察した。
考察
ＰＬＧＡマイクロスフェアの中のＴＧＦβ３を徐放させるという発見は、創傷治癒および組織再生に応用することが可能である。制御放出法によるＴＧＦβ３の長期にわたる送達によって、細胞の動員、増殖、および分化が調節される。ＴＧＦβ３は、遺伝子の転写を標的とするＳｍａｄ経路によって細胞代謝に作用する。Ｉ型およびＩＩ型の二量体ＴＧＦβレセプターが、細胞表面でＴＧＦβ３を捕捉して、Ｓｍａｄに関連した事象のカスケードを活性化させ、シグナルを細胞核まで中継する。徐放させることにより、注射またはサイトカインを生体材料に浸すことに伴う拡散、不活性化、および生物活性の喪失とは対照的に、長期間のサイトカイン送達が可能になる。現在確認されている、５０：５０および７５：２５のＰＬＡ：ＰＧＡ比を用いたＰＬＧＡマイクロスフェアからのＴＧＦβ３の徐放プロファイルは、ＰＬＧＡマイクロスフェアからＴＧＦβ３が放出される速度は、ＰＬＡ：ＰＧＡの比率を変えることによって、簡単に、具体的な分解の必要性に合わせることができることを示している。ＰＬＡ内のメチル基が、その疎水的でゆっくりとした分解に関与している。ＰＧＡは結晶であり、分解時間を延長させる。したがって、さまざまな比率のＰＧＡおよびＰＬＡによって、増殖因子の特定の放出速度に適合させることができる。初期のバースト放出量は、予想されたよりは少なかったが、ＰＬＧＡマイクロスフェアの調製法には、このバーストを防ぐ技術が含まれていなかった。ＴＧＦβ３をＰＬＧＡマイクロスフェアに封入するのは新規のアプローチであり、比較的初期バースト放出量が少ないのは、特異的な増殖因子−重合体の相互作用のせいであるかもしれない。このＰＬＧＡマイクロスフェアによるＴＧＦβ３の系は、徐放性の長期放出を行うためのメカニズムを提供する。
【００４６】
ＰＬＧＡマイクロスフェアを薬剤送達および再生医療に応用するには、適切な滅菌技術を含む、適正な調製法が必要である。最適な滅菌技術は、生物活性と、封入される増殖因子の所定の放出動態を維持するものでなければならない。紫外線が、エチレンオキシドガスおよび高周波グロー放電のどちらよりも、ｂＦＧＦを封入したＰＬＧＡマイクロスフェアの有意に大きな表面損傷を誘導し、増殖因子の放出速度を低下させたことをここで実証したことは、ＰＬＧＡマイクロスフェアの滅菌にＵＶ光を使用することに対して警告を発する。放出速度が低下したのは、滅菌過程で重合体の表面および／またはバルクが分解され、その結果、ｂＦＧＦの量が減少したせいかもしれない。また、光によって増殖因子が直接分解されることも、ＵＶ滅菌したＰＬＧＡマイクロスフェアからのｂＦＧＦの放出速度の低下したことの説明になるかもしれない。表面の分解は、水性環境でインキュベートした後に見られ、重合体構造が加水分解されることを示唆している。
【００４７】
エチレンオキシドガスおよび高周波グロー放電はいずれも、ＰＬＧＡマイクロスフェアからのｂＦＧＦ放出動態を有意に変えない。ガンマ線照射を用いる滅菌法が十分に記録されているが、ほとんどの研究室では、ガンマ線照射滅菌を行うための装置を広く利用することができない。したがって、エチレンオキシドが、増殖因子を封入したＰＬＧＡマイクロスフェアを滅菌するための論理的な選択結果である。
【００４８】
マイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３と、細胞培養液に直接添加されたものと同じ用量のＴＧＦβ３との間には、ヒト間葉系幹細胞に由来する骨形成細胞のＡＬＰ活性に統計的に有意な差が存在しないことによって、ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３の生物活性を確認することができる。
【００４９】
ヒト間葉系幹細胞の骨原性分化に対するＴＧＦβ３の阻害作用は、いくつかの再生医療モデルで役に立つ。例えば、間葉系幹細胞から組織再生されたウサギの腱修復の約２８％で望ましくない異所性骨形成が起きる。ＰＬＧＡマイクロスフェアからＴＧＦβ３が徐放されると、異所性骨形成の発生を抑えるのに役立つかもしれない。間葉系幹細胞の予期せぬ骨原性分化が、関節軟骨の組織再生で起きることがあるが、マイクロスフェア中のＴＧＦβ３を送達することにより対処することができる。ＴＧＦβ３またはＴＧＦβ１は高用量（一般的には１０ｎｇ／ｍｌ）で、間葉系幹細胞の軟骨形成性分化を誘導する。
【００５０】
ＴＧＦβ３の徐放の別の組織再生上の用途は、骨芽細胞活性を阻害すること、および、頭蓋変形、発作、および失明として発症する頭蓋骨癒合症をもたらす病理状態である、頭蓋縫合の早期骨化を予防することである。組織再生された頭蓋縫合を、頭蓋骨癒合症モデルに適用すれば、病理的に癒合した頭蓋骨縫合と同じ早期骨化の運命に耐えなければならないかもしれない。封入された増殖因子をより長期間作用させ、かつ正確に制御することを可能にする徐放法によって、ＴＧＦβ３を送達する既存の方法をさらに改良することができる。初期の骨形成において、ＴＧＦβ３は、封入されていてもいなくても、ヒト間葉系幹細胞のインビボにおける分化を阻害することができる。明らかな頭蓋縫合部の間葉組織としての性質によって、間葉系幹細胞は、早期縫合部骨化において極めて重要な役割を果たしている可能性が高い。
【００５１】
実施例２：チタン製インプラント
シカゴのイリノイ大学にある医療装置店で、滑らかで工業的に純粋なチタン製インプラントが特注によって製造された。インプラントは、寸法が４ｍｍ×２ｍｍ×６ｍｍ（外径×内径×長さ）の中空かつ円筒形のチタン棒であった。これらのインプラントは、直径が１ｍｍのクロスホールを４個含んでいた。インプラントの寸法は、現在市販されている通常の歯科用インプラントの寸法を反映していた。これらのインプラントは、歯科用インプラントから成形されたものであるが、この技術を整形外科に応用することができる。
【００５２】
材料と方法
ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）は、増殖因子などの大きな生体分子を制御送達する上で有効であることが分かっている、ＦＤＡが認可した共重合体である。正確に処理すれば、ＰＬＧＡに、生体分子を封入するマイクロスフェアを形成させることができる。直径が平均６４±μｍで、ＴＧＦ−β１を封入しているＰＬＧＡマイクロスフェアを研究室で作製した。また、ＰＬＧＡマイクロスフェアは、封入された分子の放出速度を変えるために、さまざまなＰＬＡ：ＰＧＡの比率を用いて作製することもできる。ＴＧＦ−β１を封入した５０：５０のＰＬＧＡマイクロスフェアのインビトロにおける放出実験によって、ＴＧＦ−β１は、速やかにバーストして３日間で約０．２±０．０５ｎｇが放出され、最大４週間まで放出が持続されることが示された。
【００５３】
【化１】
【００５４】
【化２】
【００５５】
【化３】
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】チタン製インプラントを具体的に示す、３枚組の写真（図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃ）である。これらのインプラントは、直径１ｍｍのクロスホールを４個含む、４ｍｍ×２ｍｍ×６ｍｍ（外径×内径×長さ）の滑らかで中空かつ多孔質の円筒形のチタン製ロッドである。Ａ：商標Ｓｔｅｒｉ−Ｏｓｓという名称でＮｏｂｅｌＢｉｏＣａｒｅから市販されている歯科用インプラント。Ｂ：商標ＩＴＩという名称でＳｔｒａｕｍａｎｎから市販されている歯科用インプラント。Ｃ：市販されているインプラントの寸法を模倣して特注した中空かつ多孔質のチタン製インプラント。
【図２】油−水−油二重エマルジョン技術を用いて研究室で製造されたポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアとその使用法を図示する写真（図２Ａ）およびグラフ（図２Ｂ）である。図２Ａ：直径が約６４〜１６ｐｍであって、ＴＧＦ−〜Ｉを封入しているＰＬＧＡマイクロスフェア。写真中の棒の長さは約１００ｐである。図２Ｂ：ＴＧＦ−〜Ｉを担持するマイクロスフェアのインビトロでの放出プロファイルを示すグラフ。ＴＧＦ−〜Ｉは、３日間で約０．２ ０．０５ｎｇが速やかにバーストして放出され、最大限４週間まで放出が持続する。
【図３】ＰＬＧＡマイクロスフェア、およびそれらを使用した結果を示す写真（図３Ａ）およびグラフ（図３Ｂ）である。図３Ａ：インビトロでの研究に備えて、ＰＬＧＡマイクロスフェアをコラーゲンスポンジに注入した。図３Ｂ：インビトロでの研究によって、３週目にはコラーゲンスポンジ中のＤＮＡ含量が増加することが示され、マイクロスフェアを担持するインプラントの中に移動する細胞の数が増加したことを示唆している。
【図４】ＰＬＧＡマイクロスフェアの製造および分解に関する。Ａ：ＰＬＡ：ＰＧＡの比率が５０：５０であるポリｄ−ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）から製造された、カプセル封入ＴＧＦβ３をもつマイクロスフェアの代表的なＳＥＭ画像、ＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアの平均直径は１０８±６２μｍであった。Ｂ：４日後にＰＢＳ溶液の中で、予想通りに分解したＴＧＦβ３封入ＰＬＧＡマイクロスフェアの代表的なＳＥＭ画像。
【図５】ＳＥＭ下での無菌ＰＬＧＡマイクロスフェアの形態変化を示す。Ａ：未滅菌ＰＬＧＡマイクロスフェア。Ｂ：紫外線（ＵＶ）滅菌の極めて有害な影響を示す、紫外線滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェア（３０分）。Ｃ：２４時間エチレンオキシド（ＥＯ）ガスによって滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェア。Ｄ：高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）によって滅菌されたＰＬＧＡマイクロスフェア（４分、１００Ｗ）。ＵＶ光によって誘起された激しい表面分解による変化とは対照的に、ＥＯガスおよびＲＦＧＤは、ＰＬＧＡマイクロスフェアの顕著な表面分解をもたらさなかった。
【図６】ＰＬＧＡマイクロスフェアからのｂＦＧＦの放出動態を図示する。紫外線（ＵＶ）は、２１日目までＰＬＧＡマイクロスフェアからｂＦＧＦが放出される速度を有意に変化させた（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。エチレンオキシド（ＥＯ）ガスまたは高周波グロー放電（ＲＦＧＤ）で滅菌した後には、放出動態の顕著な変化は見られなかった。エチレンオキシドが、サイトカイン封入ＰＬＧＡマイクロスフェアにとって最も経済的に効率的で安全な方法である。
【図７】１％ＢＳＡ溶液中におけるＰＬＧＡマイクロスフェアからのＴＧＦβ３の放出動態を示す。ＥＬＩＳＡによって検出したところ、５０：５０または７５：２５の共重合率のＰＬＧＡマイクロスフェアから、ＴＧＦβ３が、それぞれ最大限３６日目および４２日目まで持続的に放出され、どちらの共重合率でも、初期バースト様の放出が見られたが、７５：２５のＰＬＡ：ＰＧＡ比よりも５０：５０のＰＬＡ：ＰＧＡ比の方が急速な放出速度をもたらした。
【図８】骨形成剤添加培地で７日間培養した、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。Ａ：ＴＧＦβ３を含まないＰＬＧＡマイクロスフェアに曝露したときのＡＬＰ染色。Ｂ：ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出されたＴＧＦβ３に曝露したときのＡＬＰ染色。染色は、白い矢印で示した隔離された領域に限定されている。Ｃ：骨形成剤添加培地で培養したｈＭＳＣのＡＬＰ活性をＡＬＰ試薬によって定量した結果。ＰＬＧＡマイクロスフェアによって送達されたＴＧＦβ３において、骨形成剤添加培地で培養されたｈＭＳＣで有意な染色の低下が見られ、ＴＧＦβ３は、１．３５ｎｇ／ｍｌでインビトロにおいてｈＭＳＣの初期骨形成分化を阻害することを示唆した（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。１０倍の倍率。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空の中心部、側壁に多孔をもち、カプセル封入された生物剤または化学剤を中空の中心部に担持させて含む生体適合性材料を含む、歯または骨のインプラントであって、該生物剤または化学剤が、制御放出技術によって時間的および空間的に放出され、歯または骨の治癒を促進するインプラント。
【請求項２】
封入された生物剤が、生体マトリックスまたは足場の中に存在する、請求項１記載のインプラント。
【請求項３】
生体適合性材料が単量体または重合体からなる、請求項１記載のインプラント。
【請求項４】
生体適合性材料が、ステンレス鋼、チタン、および金属合金からなる群から選択される、１つ以上の金属である、請求項１記載のインプラント。
【請求項５】
さらに、歯または骨の解剖学的位置に応じて、断面が円筒形、正方形、長方形、または不規則な形であると定義される、請求項１記載のインプラント。
【請求項６】
側壁に複数の孔を有する、請求項６記載のインプラント。
【請求項７】
生体適合性材料が、内部表面、外部表面、または両面に第２の生体適合性材料のコーティングを有する、請求項１記載のインプラント。
【請求項８】
生体適合性材料が、コートされた縁をもつ複数の孔を有するとさらに規定される、請求項７記載のインプラント。
【請求項９】
第２の生体適合性材料が化学的な単量体または重合体である、請求項７記載のインプラント。
【請求項１０】
薬剤が、コラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコール、またはこれらの混合物からなる群から選択される化学的な重合体または単量体によってカプセル封入されている、請求項１記載のインプラント。
【請求項１１】
カプセル封入された生物剤が、増殖因子、薬理作用物質、薬草物質、または化学物質である、請求項１記載のインプラント。
【請求項１２】
生体マトリックスが、アルギン酸、キトサン、サンゴ、アガロース、フィブリン、コラーゲン、骨、シリコーン、軟骨、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、およびこれらの混合物からなる群から選択される天然材料を含む、請求項２記載のインプラント。
【請求項１３】
生体マトリックスが、骨形成剤、骨誘導剤、骨伝導剤、および骨形成促進剤をさらに含む、請求項１２記載のインプラント。
【請求項１４】
骨形成剤が、デキサメタゾン、骨形態形成ファミリーのタンパク質、トランスフォーミング増殖因子ファミリーのタンパク質、および血管内皮増殖因子ファミリーのタンパク質、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３記載のインプラント。
【請求項１５】
生体マトリックスが栄養培地をさらに含む、請求項１２記載のインプラント。
【請求項１６】
中空かつ多孔質の生体適合性媒体を含む整形外科用または歯科用のインプラントであって、該媒体が、
（ｉ）生体マトリックス；
（ｉｉ）骨形成剤、薬理作用因子、薬草因子、化学因子、もしくは増殖因子、またはそれらの混合物；
（ｉｉｉ）栄養培地；および
（ｉｖ）幹細胞
を含み、
骨形成剤、薬理作用因子、薬草因子、化学因子、もしくは増殖因子、培地、および幹細胞を保持する、生体マトリックス用の固体支持体を提供するインプラント。
【請求項１７】
中空かつ多孔質の媒体が有孔金属である、請求項１６記載の整形外科用または歯科用のインプラント。
【請求項１８】
骨形成剤がデキサメタゾンである、請求項１６記載の整形外科用または歯科用のインプラント。
【請求項１９】
請求項１または１６に記載されたインプラントを宿主動物の中に移植することを含む、生物学的に操作された一部または全体の骨または歯を生体内で産生させる方法。
【請求項２０】
以下の工程を含む、動物の体内において、インプラント部位で新しい骨または歯の増殖を誘導する方法：
（ａ）動物にインプラントを移植する工程；および
（ｂ）該動物を骨または歯が成長するのに十分な期間管理する工程。
【請求項１】
中空の中心部、側壁に多孔をもち、カプセル封入された生物剤または化学剤を中空の中心部に担持させて含む生体適合性材料を含む、歯または骨のインプラントであって、該生物剤または化学剤が、制御放出技術によって時間的および空間的に放出され、歯または骨の治癒を促進するインプラント。
【請求項２】
封入された生物剤が、生体マトリックスまたは足場の中に存在する、請求項１記載のインプラント。
【請求項３】
生体適合性材料が単量体または重合体からなる、請求項１記載のインプラント。
【請求項４】
生体適合性材料が、ステンレス鋼、チタン、および金属合金からなる群から選択される、１つ以上の金属である、請求項１記載のインプラント。
【請求項５】
さらに、歯または骨の解剖学的位置に応じて、断面が円筒形、正方形、長方形、または不規則な形であると定義される、請求項１記載のインプラント。
【請求項６】
側壁に複数の孔を有する、請求項６記載のインプラント。
【請求項７】
生体適合性材料が、内部表面、外部表面、または両面に第２の生体適合性材料のコーティングを有する、請求項１記載のインプラント。
【請求項８】
生体適合性材料が、コートされた縁をもつ複数の孔を有するとさらに規定される、請求項７記載のインプラント。
【請求項９】
第２の生体適合性材料が化学的な単量体または重合体である、請求項７記載のインプラント。
【請求項１０】
薬剤が、コラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコール、またはこれらの混合物からなる群から選択される化学的な重合体または単量体によってカプセル封入されている、請求項１記載のインプラント。
【請求項１１】
カプセル封入された生物剤が、増殖因子、薬理作用物質、薬草物質、または化学物質である、請求項１記載のインプラント。
【請求項１２】
生体マトリックスが、アルギン酸、キトサン、サンゴ、アガロース、フィブリン、コラーゲン、骨、シリコーン、軟骨、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、およびこれらの混合物からなる群から選択される天然材料を含む、請求項２記載のインプラント。
【請求項１３】
生体マトリックスが、骨形成剤、骨誘導剤、骨伝導剤、および骨形成促進剤をさらに含む、請求項１２記載のインプラント。
【請求項１４】
骨形成剤が、デキサメタゾン、骨形態形成ファミリーのタンパク質、トランスフォーミング増殖因子ファミリーのタンパク質、および血管内皮増殖因子ファミリーのタンパク質、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３記載のインプラント。
【請求項１５】
生体マトリックスが栄養培地をさらに含む、請求項１２記載のインプラント。
【請求項１６】
中空かつ多孔質の生体適合性媒体を含む整形外科用または歯科用のインプラントであって、該媒体が、
（ｉ）生体マトリックス；
（ｉｉ）骨形成剤、薬理作用因子、薬草因子、化学因子、もしくは増殖因子、またはそれらの混合物；
（ｉｉｉ）栄養培地；および
（ｉｖ）幹細胞
を含み、
骨形成剤、薬理作用因子、薬草因子、化学因子、もしくは増殖因子、培地、および幹細胞を保持する、生体マトリックス用の固体支持体を提供するインプラント。
【請求項１７】
中空かつ多孔質の媒体が有孔金属である、請求項１６記載の整形外科用または歯科用のインプラント。
【請求項１８】
骨形成剤がデキサメタゾンである、請求項１６記載の整形外科用または歯科用のインプラント。
【請求項１９】
請求項１または１６に記載されたインプラントを宿主動物の中に移植することを含む、生物学的に操作された一部または全体の骨または歯を生体内で産生させる方法。
【請求項２０】
以下の工程を含む、動物の体内において、インプラント部位で新しい骨または歯の増殖を誘導する方法：
（ａ）動物にインプラントを移植する工程；および
（ｂ）該動物を骨または歯が成長するのに十分な期間管理する工程。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５１７６６０（Ｐ２００８−５１７６６０Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３８０７６（Ｐ２００７−５３８０７６）
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３７９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４７３１０
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０３０６０５２５）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ イリノイ (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３７９４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４７３１０
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０３０６０５２５）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ イリノイ (25)
【Ｆターム（参考）】
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