生物学的に活性な分子の投与系としての、キトサンとポリエチレングリコールとのナノ粒子
本発明は、生物学的に活性な分子を放出するための、キトサン重合体またはその誘導体を含んでなり、ポリエチレングリコールで化学的に変性され、架橋剤で架橋したナノ粒子系に関する。この系は、薬剤組成物、ワクチン、および化粧品処方物に特に好適である。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子系に関する。本発明は、とりわけ、生物学的に活性な分子を配置できる、イオン的に架橋したキトサン−ポリエチレングリコール共役物により形成されたナノ粒子系、およびその製造方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
生物学的に活性な薬剤を放出する系は、常に発展している研究分野である。活性成分を種々の投与経路によって動物または人間の体に投与することが困難であることは、公知である。ペプチド、タンパク質および多糖を包含するある種の薬物は、上皮バリヤーの浸透性に限界があるため、粘膜表面を通して効果的に吸収されない。例えば、現在、皮下投与（それは患者にとっては好ましくないものである）されているインスリンは、鼻または腸粘膜バリヤー等の粘膜バリヤーを通過する能力が乏しい活性成分の一つであり、皮下投与に代わる経路を見出し、この活性分子をより効果的に吸収できる投与系を開発する必要がある。
【０００３】
近年提案されている、薬物に対する生物学的バリヤーを克服する可能性として、活性成分を小さな粒子に取り入れることが注目されている。この粒子と粘膜との相互作用は、とりわけ、粒子の大きさにより影響を受け、粒子径の低下と共に相互作用が増大する。
【０００４】
米国特許出願第２００４１３８０９５号には、インスリンを放出する水性ナノ粒子懸濁液、とりわけ、３ブロックのポリエチレングリコール／親水性ポリアミノ酸／疎水性ポリアミノ酸共重合体を基剤とする水性ナノ粒子懸濁液、が記載されている。一方、米国特許第５，６４１，５１５号公報には、生物分解性ポリシアノアクリレート中にインスリンを閉じこめて複合体を形成したナノ粒子を含んでなる、インスリンを制御しながら放出するための薬剤処方物が記載されている。
【０００５】
薬物放出系としての用途として、疎水性重合体を基剤とするナノ粒子系も開発されており、当該技術分野において多数の文献が示されている。天然由来の巨大分子、例えばアルブミンナノ粒子（W. Linら, Pharm. Res., 11, 1994）やゼラチン（H.J. Watzkeら, Adv. Colloid Interface Sci., 50, 1-14, 1994）を基剤とする親水性ナノ粒子、および、アルジネート等の多糖を基剤とする親水性ナノ粒子（M. Rajaonarivonvyら, J. Pharm. Sci., 82, 912-7, 1993）を基剤とする親水性ナノ粒子を製造するための方法に関する研究が発表されている。しかしながら、これらの方法の多くは、有機溶剤、油および高温を使用する必要があり、これらの系の開発を著しく制限している。これらの提案された方法の中で最も無害であるのが、カルシウムの存在下でのイオン性ゲル化、およびそれに続く陽イオン系高分子電解質ポリ−Ｌ−リシンの存在下での硬化、に基づく、アルジネートナノ粒子の製造方法である。しかし、このナノ粒子には、全身系(systemic)毒性およびポリ−Ｌ−リシンの高コストに関する欠点がある。
【０００６】
これらの系に替わる方法がキトサンナノ粒子の開発であり、先行技術文献には、活性成分の投与に関する有用性、およびその製造方法が記載されている（J. Appl. Polym. Sci. 1997, 63, 125-132、Pharm. Res. 14, 1997b, 1431-6、Pharm. Res. 16, 1991a, 1576-81、S.T.P. Pharm. Sci. 9, 1999b, 429-36、Pharm. Res. 16, 1999, 1830-5、J. Control Release 74, 2001, 317-23、および米国特許第５，８４３，５０９号公報）。これらのナノ粒子の欠点は、特定のｐＨおよびイオン強度条件において、ナノ粒子の安定性が制限されることである。
【０００７】
国際公開ＷＯ−Ａ−０１／３２７５１号パンフレットには、キトサンまたはその誘導体を水性媒体中に溶解させ、次いで表面変性剤の存在下において、ｐＨを、キトサンが沈殿する程度に上昇させることからなる、ナノ粒子の形態にあるキトサンまたはキトサン誘導体の製造方法に関する記載がある。
【０００８】
国際公開ＷＯ−Ａ−９９／４７１３０号パンフレットには、少なくとも一種のポリ陽イオン（キトサンでよい）と、少なくとも一種のポリ陰イオンと、活性成分とから得られる、生物相容性および生物分解性の高分子電解質複合体を有するナノ粒子に関する記載があり、このナノ粒子は、高分子電解質複合体の形成の際またはその後に、少なくとも一種の架橋剤（グリオキサール、ＴＳＴＵまたはＥＤＡＰ）でさらに処理することにより、得られる。
【０００９】
ポリオキシエチレンと組み合わせたキトサンナノ粒子の製造方法も公知であり（スペイン特許公報２０９８１８８号公報および同２１１４５０２公報）、さらに、活性成分は、治療用または抗原性巨大分子でよいことも公知である。これらのナノ粒子は、トリポリリン酸塩等の塩基性試薬の添加により引き起こされる、キトサンおよび重合体したナノ凝集物の形態にある活性巨大分子の共沈殿工程によって、形成される。
【００１０】
さらに、キトサンは、ＰＥＧ化と呼ばれるアミノ官能基を通したポリエチレングリコールとの共有結合によって、変性することができる。欧州特許第１３０４３４６号および米国特許第６，７３０，７３５号には、粘膜を通して薬物を投与するための、キトサンとＰＥＧ共役物とがキトサンアミノ基を介して共有結合した組成物が記載されている。
【００１１】
米国特許出願第２００４／０１５６９０４号には、キトサン−ＰＥＧ、および、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）等の水に不溶の重合体、を含む組成物から調製されたマトリックスに、活性薬剤が配合された薬剤放出系が記載されている。
【００１２】
国際公開ＷＯ０１／３２７５１号パンフレットには、界面活性剤の存在下において、ポリエチレングリコールを含むキトサンナノ粒子の溶液のｐＨを増加させると、ポリエチレングリコールを含むキトサンナノ粒子が沈殿し、キトサンナノ粒子が得られることが記載されている。しかしながら、ＰＥＧはキトサンに共有結合していない。
【００１３】
薬物放出系の開発を目的とする多くの文献があるにもかかわらず、生物学的に活性な分子を会合させて、かつ規定速度でその活性分子を放出することができる類のナノ粒子系を提供することが依然として希求されている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、キトサンの架橋を引き起こす試薬の存在下で、イオン性ゲル化工程により得られるＰＥＧ−変性されたキトサンナノ粒子により形成される系が、生物学的に活性な分子を効果的に会合させると共に、次いで、それらの分子を好適な生物学的環境中に放出することができることを見出した。ＰＥＧ−変性されたキトサンナノ粒子は、ＰＥＧ化されていないキトサンナノ粒子と比較して、例えば鼻内インスリン投与または鼻内ジフテリアトキソイド投与に応答する免疫遺伝において著しい特性を有する。
【００１５】
従って、本発明の目的は、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、
前記ナノ粒子が、
ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、および
ｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる
共役物を含んでなり、
前記両成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする、系を意図したものである。
【００１６】
「生物学的に活性な分子」の表現は、広い意味を有し、低分子量薬物、多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチド、および核酸、ならびにそれらの組合せを含んでなる。本発明の一変形においては、生物学的に活性な分子の機能は、病気を阻止する、和らげる、治癒させる、または診断することである。本発明の別の変形においては、生物学的に活性な分子は化粧品機能を有する。
【００１７】
本発明の第二の態様は、上に規定するナノ粒子を含んでなる薬剤組成物またはワクチンに関する。好ましい態様においては、薬剤組成物またはワクチンは、粘膜投与に使用される。
【００１８】
本発明の別の態様においては、本発明の目的は、上記に規定したナノ粒子を含んでなる化粧品組成物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、内側に一種以上の生物学的に活性な分子、例えば薬物、ワクチンまたは遺伝学的材料を保持できる、キトサン−ＰＥＧナノ粒子を含んでなる組成物に関する。それ自体は生物学的に活性な分子とは考えられないが、投与系の効率に貢献し得る、ペプチド、タンパク質、または多糖もナノ構造中に閉じ込めることができる。
【００２０】
本発明の最後の態様は、上記生物学的に活性な分子を制御放出するための系を得る方法であって、
ａ）キトサン−ＰＥＧ共役物水溶液を調製すること、
ｂ）架橋剤水溶液を調製すること、および
ｃ）前記工程ａ）およびｂ）の溶液を攪拌しながら混合して、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧナノ粒子が自発的に形成され、次いで沈殿すること、
を含んでなる、方法である。
【００２１】
本発明による方法の一変形においては、活性成分をキトサン水溶液または架橋剤水溶液に配合してから、両方の相を混合する。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本発明の系は、ナノ粒子を含んでなり、その構造は、架橋したキトサンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）共役物を含んでなり、その中に活性成分を取り入れることができる。
【００２３】
用語「ナノ粒子」は、キトサンとＰＥＧとの間のキトサンアミノ基を通した共有結合の結果である共役物を含んでなる構造として理解され、その共役物は、陰イオン系架橋剤の作用によるイオン性ゲル化により、さらに架橋している。共有結合の形成およびそれに続く系のイオン性架橋により、独立した、識別可能な、特徴的な物理的存在が生じ、その平均的なサイズは、１μｍ未満である、すなわち平均サイズは１〜９９９ｎｍである。
【００２４】
「平均サイズ」とは、ナノ粒子が形成された水性媒体中で一緒に動くナノ粒子の集団の平均直径として理解される。これらの系の平均サイズは、当業者には公知の、例えば下記の実験項で説明する、標準的な方法により測定することができる。
【００２５】
系のナノ粒子の特徴は、平均粒子径が１μｍ未満であり、好ましくは平均サイズが１〜９９９ｎｍ、好ましくは５０〜８００ｎｍ、さらに好ましくは５０〜５００ｎｍである。平均粒子径は、ＰＥＧに対するキトサンの比により、キトサンの脱アセチル化度により、および粒子形成条件（キトサン−ＰＥＧ濃度、架橋剤濃度および両者の比）によっても影響を受ける。ＰＥＧの存在により、ＰＥＧ化されていないキトサンにより形成される系と比較して、平均粒子径が減少する。
【００２６】
さらに、ナノ粒子は、電荷（Ｚ電位により測定）を有することができ、その強度は、上記の変数および特にＰＥＧによるキトサンの官能化度に応じて、＋０．１〜＋５０ｍＶ、好ましくは＋１〜＋４０ｍＶになることがある。ナノ粒子の正電荷は、ナノ粒子と粘膜表面との相互作用を強化するのに重要であることがある。しかし、ナノ粒子の非経口投与には、中性電荷がより重要である。
【００２７】
上記の生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系は、共役物中のキトサン含有量が５０重量％を超え、好ましくは７５重量％を超える。共役物中のＰＥＧ含有量は５０％未満、好ましくは２５％未満である。
【００２８】
キトサンは、キチン（ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）に由来する天然重合体であり、その際、Ｎのアセチル基の重要な部分が加水分解により除去されている。脱アセチル化度は、一般的に３０〜９５％、好ましくは６０〜９５％であり、これは、アミノ基の５〜４０％がアセチル化されることを示唆する。従って、キトサンは、アミノ多糖構造および陽イオン系特性を有する。キトサンは、式(I)
【化１】
で表され、ｎが整数である、単量体単位の反復、およびアミノ基がアセチル化されているｍ単位をさらに含んでなる。ｎ＋ｍの合計は、重合度、すなわちキトサン鎖中の単量体単位の数、を表する。
【００２９】
本発明のキトサン−ＰＥＧ共役物を形成するのに使用するキトサンは、分子量が５〜２０００ｋＤａ、好ましくは１０〜５００ｋＤａ、より好ましくは１０〜１００ｋＤａである。使用可能な市販されているキトサンの例は、NovaMatrix, Drammen、ノルウェイから市販されているUPG 113、UP CL 213およびUP CL113である。
【００３０】
キトサン−ＰＥＧ共役物の形成に使用するキトサンを構成する単量体単位の数は、３０〜３０００単量体、好ましくは６０〜６００である。
【００３１】
キトサンの替わりに、キトサンの溶解度を高めるために、またはキトサンの粘膜密着性を増加するために、一個以上の水酸基および／または一個以上のアミノ基が変性されているキトサン誘導体を使用することもできる。これらの誘導体としては、特に、Roberts Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166に記載されているような、アセチル化された、アルキル化された、またはスルホン化されたキトサン、チオール化された誘導体がある。誘導体を使用する場合、好ましくはＯ−アルキルエーテル、Ｏ−アシルエステル、トリメチルキトサン、ポリエチレングリコールで変性されたキトサン、等から選択する。他の可能な誘導体は、塩、例えばクエン酸塩、硝酸塩、乳酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、等である。いずれの場合も、当業者は、最終処方物の商業的な実行性および安定性を損なわずにキトサンに対して行うことができる変性を決定できる。
【００３２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その最も通常の形態で、式(II)
【化２】
の重合体である（式中、ｐは、ＰＥＧの重合度を表す整数である）。本発明においては、ＰＥＧの重合度は、５０〜５００であり、これは分子量２〜２０ｋＤａ、好ましくは５〜１０ｋＤａに相当する。
【００３３】
１または２個の末端水酸基が変性されている変性ＰＥＧを、キトサン−ＰＥＧ共役物の形成に使用する。キトサン−ＰＥＧ共役物の形成に使用できる変性ＰＥＧとしては、式(III)
【化３】
を有する物質があり（式中、Ｘ１は、その後に続く反応のためにＯＨ官能基をブロックするヒドロキシルラジカル保護基である）、ヒドロキシル保護基は、この分野で良く知られており、代表的な保護基（保護すべき酸素をすでに包含する）は、シリルエーテル、例えばトリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ジエチルイソプロピルシリルエーテル、ヘキシルジメチルシリルエーテル、トリフェニルシリルエーテル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルシリルエーテル、アルキルエーテル、例えばメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、アリルエーテル、アルコキシメチルエーテル、例えばメトキシメチルエーテル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチルエーテル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテルおよび関連するエーテル、メチルチオメチルエーテル、エステル、例えばアセテートエステル、ベンゾエートエステル、ピバレートエステル、メトキシアセテートエステル、クロロアセテートエステル、レブリネートエステル、カーボネートエステル、例えばベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、ｔｅｒｔ−ブチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、アリルカーボネートである。ヒドロキシル保護基の他の例は、参考書、例えばGreene and Wutsによる「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999、に記載されている。好ましい実施態様においては、保護基は、アルキルエーテルであり、より好ましくはメチルエーテルである。
【００３４】
Ｘ２は、水素またはキトサンアミノ基に固定できるブリッジ基でよい。使用するブリッジ分子の中で、好ましい形態は、スクシンイミドまたはその誘導体であるが、これらに限定するものではない。
【００３５】
あるいは、Ｘ１は、アミノ基以外の基で固定することができる基でもよい。例えば、マレイミドをブリッジ分子として使用し、ＳＨ基と結合させる。
【００３６】
ＰＥＧと反応するキトサンアミノ基、言い換えると、ＰＥＧ化と呼ばれる、キトサンアミノ基のＰＥＧによる官能化の数は、０．１〜５％、好ましくは０．２〜２％、より好ましくは０．５〜１％である。
【００３７】
得られるキトサン−ＰＥＧ共役物は、分子量が５〜３０００ｋＤａ、好ましくは１０〜５００ｋＤａである。
【００３８】
本発明のナノ粒子系は、キトサン−ＰＥＧ共役物のイオン性架橋により形成されているのが特徴である。架橋剤は、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧ共役物を架橋させ、ナノ粒子の自然な形成を促進する陰イオン系塩である。本発明では、架橋剤はポリリン酸塩であり、トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）の使用が好ましい。ナノ粒子系を与える架橋は、簡単であり、発明の背景に記載したように当業者には公知である。
【００３９】
本発明の第二の態様は、上記のナノ粒子を含んでなる薬剤組成物である。薬剤組成物の例としては、組成物を経口、バッカルまたは舌下投与もしくは局所投与するための全ての液体組成物（ナノ粒子の水中懸濁液、または添加剤、例えば粘性付与剤、ｐＨ緩衝剤、等を含む水中懸濁液）もしくは固体組成物（ナノ粒子を凍結乾燥または噴霧させ、顆粒、錠剤またはカプセルを調製するのに使用できる粉末を形成）、あるいは組成物を経皮、眼、鼻、膣または非経口投与するための液体または半固体形態がある。非経口投与以外の(non-parenteral)経路の場合、上記の負に帯電した表面との相互作用を強化する大量の正電荷を粒子に与えることにより、ナノ粒子と皮膚または粘膜との接触を改良することができる。非経口投与経路の場合、より詳しくは、静脈内投与には、これらの系は、そこに会合する薬物または分子の生体内配分を調整する可能性を提供する。
【００４０】
好ましい態様では、処方物の投与は、粘膜投与である。キトサン−ＰＥＧ共役物の正電荷は、それらの粘膜との相互作用により粘膜表面における、および負に帯電した上皮細胞の表面における薬物の吸収を改善する。
【００４１】
キトサン−ＰＥＧナノ粒子は、生物活性分子に対する高い会合能力を有する系である。この会合能力は、配合する分子の種類ならびに上記の処方物パラメータによって異なる。従って、本発明の別の態様は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子、例えば上記のナノ粒子、および少なくとも一種の生物学的に活性な分子を含んでなる組成物により形成される。
【００４２】
用語「生物学的に活性な分子」は、病気の処置、治癒、防止または診断に使用される、あるいは人または動物の物理的および精神的な健康状態を改善するのに使用される全ての物質に関連する。これらの生物学的に活性な分子は、低分子量薬物から多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチドおよび核酸およびそれらを組合せた種類の分子を包含する。これらのナノ粒子に会合する分子の例としては、タンパク質、例えば破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイド、多糖、例えばヘパリン、ペプチド、例えばインスリン、ならびに幾つかのタンパク質をコード化するプラスミドがある。
【００４３】
好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はインスリンである。別の好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はジフテリアまたは破傷風トキソイドである。別の好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はヘパリンである。別の好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はＤＮＡプラスミドである。
【００４４】
本発明のナノ粒子系は、治療的効果はないが、化粧品組成物を形成する他の活性分子を配合することもできる。これらの化粧品組成物としては、活性分子を局所投与するための全ての液体組成物（ナノ粒子懸濁液）またはエマルションがある。ナノ粒子に配合できる活性分子としては、特に、抗ニキビ剤、抗真菌剤、酸化防止剤、脱臭剤、制汗薬、ふけ防止剤、皮膚白色化(skin whitening)剤、タンニン酸処理剤(tanning agents)、紫外光吸収剤、酵素、化粧品用殺菌剤がある。
【００４５】
本発明の別の態様は、上記のナノ粒子および抗原を含んでなるワクチンである。ナノ粒子から形成された系を使用して抗原を投与することにより、免疫応答を達成することができる。ワクチンは、タンパク質、多糖を含んでなるか、またはＤＮＡワクチンでよい。厳密に言うと、ＤＮＡワクチンは、免疫応答を与える抗原の発現をコード化するＤＮＡ分子である。好ましい実施態様では、この抗原は、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドである。
【００４６】
本発明の別の態様は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子、例えば上記のナノ粒子、の製造方法であって、
ａ）キトサン−ＰＥＧ共役物水溶液を調製すること、
ｂ）架橋剤水溶液を調製すること、および
ｃ）前記工程ａ）およびｂ）の溶液を攪拌しながら混合して、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧナノ粒子が自発的に形成され、次いで沈殿すること、
を含んでなる方法に関する。
【００４７】
最初のキトサン−ＰＥＧ共役物溶液のｐＨは、両方の溶液を混合する前に、水酸化ナトリウムを加えることにより、４．５〜６．５の値に達するまで調整する。
【００４８】
この方法の変形では、得られるキトサン−ＰＥＧ／架橋剤の比が２／１〜８／１であり、３／１比が好ましく、この比により、多分散度が比較的低い処方物が得られる。しかし、より高いキトサン−ＰＥＧ／架橋剤比、ならびに酸性がより高い媒体中で粒子を調製することも可能である。
【００４９】
架橋剤の存在により、網目構造が形成されるように、キトサン−ＰＥＧ共役物を架橋させ、その網目構造の中に生物学的に活性な分子を挿入し、後の段階で放出することができる。架橋剤は、ナノ粒子にサイズ、電位、および構造的特徴をさらに与え、生物学的に活性な分子を投与するための系として適した粒子を形成することができる。
【００５０】
生物学的に活性な分子は、生物学的に活性な分子を含むキトサン−ＰＥＧナノ粒子がイオン性ゲル化により自然に形成され、続いて沈殿するように、工程ａ）またはｂ）の溶液に直接配合するか、または水相または有機相中に前もって溶解させることができる。
【００５１】
従って、生物学的に活性な分子は、下記の方法により配合することができる。
ａ）活性分子を架橋剤またはキトサン−ＰＥＧの溶液に直接溶解させるか、
ｂ）活性分子を酸性または塩基性水溶液中に溶解させてから、架橋剤またはキトサン−ＰＥＧの溶液に配合するか、または
ｃ）活性分子を水と混和し得る、極性の有機溶剤中に溶解させてから、架橋剤またはキトサン−ＰＥＧの溶液に配合する。
【００５２】
キトサン−ＰＥＧナノ粒子の製造方法は、該ナノ粒子を凍結乾燥させる追加工程をさらに含むことができる。薬学的観点からは、貯蔵中の安定性が改良されるので、ナノ粒子を凍結乾燥させた形態にすることが重要である。キトサン−ＰＥＧナノ粒子（様々なＰＥＧ化度にある）を、５％濃度の低温保護剤、例えばグルコース、の存在下で凍結乾燥させることができる。他の通常の添加剤も存在できる。実際、凍結乾燥の前後における粒子径の測定は、大きく変動しない。言い換えると、ナノ粒子は、それらの中に変化を引き起こさずに、凍結乾燥および再懸濁させることができる（表Ｉ）。
【表１】
【００５３】
以下に、本発明の特徴および優位性を示す幾つかの例を記載するが、これらの例は、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００５４】
例１
キトサン−ＰＥＧナノ粒子の製造における最適化
キトサンに関して第ＷＯ９８０４２４４号に記載されているイオン性ゲル化技術により、キトサン−ＰＥＧナノ粒子ナノ粒子を製造した。具体的には、ＰＥＧ化度（ＰＥＧで官能化されるアミノ基の百分率）０．５％または１％のキトサンを先ず超純水に濃度１ｍｇ／ｍＬで溶解させた。ナノ粒子の形成に対するその可能な効果を研究するために、粒子径を製造する前に、ＮａＯＨを加えることにより、キトサン−ＰＥＧ溶液の初期ｐＨを４．５〜６．５に調整した。トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）を様々な濃度で溶解させ、２／１、３／１および４／１のキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比を得た。磁気攪拌しながら、ある決められた体積のＴＰＰ溶液（０．６ｍＬ）をある決められた体積のキトサン−ＰＥＧ溶液（１．５ｍＬ）に加えた後、ナノ粒子が自然に形成された。
【００５５】
キトサンＰＥＧ化度、重合体溶液のｐＨおよびキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比の、ナノ粒子サイズおよび多分散度に対する効果を図１Ａおよび１Ｂに示す。得られた結果から、ＰＥＧ化度０．５〜１％のキトサン−ＰＥＧナノ粒子が、広範囲な実験条件で容易に調製でき、ｐＨが、ナノ粒子サイズに対して最も大きな影響を及ぼすパラメータであると結論付けることができる。その上、ｐＨの影響は、ＰＥＧ化度が０．５から１％に増加した時に、より明らかである。
【００５６】
さらに、ナノ粒子サイズ分布も、キトサンのＰＥＧ化度により、ならびにキトサン−ＰＥＧ溶液のｐＨにより、影響を受ける。比較的低い多分散度を有する処方物を得るための最適キトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比は、明らかに３／１である。
【００５７】
ナノ粒子サイズは、その目的にZetasizer III (Malvern Instruments, Malvern, UK)を使用し、光子相関分光法より測定する。キトサン−ＰＥＧナノ粒子サイズは７０〜３１０ｎｍの範囲内であった。
【００５８】
例２
キトサンナノ粒子とキトサン−ＰＥＧナノ粒子の比較
表IIから分かるように、ＰＥＧ化によりキトサンの溶解度が変化する。これはナノ粒子の形成に影響する。典型的には６／１〜４／１にある最適キトサン／ＴＰＰ比が、キトサン−ＰＥＧの場合、典型的には４／１〜２／１の、より低い値にシフトする。これらの差は、恐らく、キトサンの化学的変性によるものであり、相互作用に利用できる基の変化を受け、イオノトロピー的ゲル化条件を変えることができる。
【表２】
【００５９】
ナノ粒子に関して、ＰＥＧ化されたキトサンから製造されたナノ粒子は、純粋なキトサンにより形成されたナノ粒子とは大きく異なっていることが観察できる。これを、キトサン、ＰＥＧ化度０．５％および１％（初期ｐＨ値における、その最適重合体比）のキトサン−ＰＥＧにより形成されたナノ粒子の特性を示す表IIIに示す。
【００６０】
ＰＥＧ化は、ナノ粒子サイズおよび表面電荷の著しい低下を引き起こす。後者の場合、ＰＥＧ化度が０．５％から１％に増加すると、表面電荷がさらに低下するので、ＰＥＧ化度も強い影響を及ぼす。
【表３】
【００６１】
例３
種々のＰＥＧ化度を有するＤＮＡ装填したキトサンの形成および特性試験
カプセル封入するために、ナノ粒子を形成する前にＴＰＰ溶液にプラスミドＤＮＡを配合した。次いで、このＤＮＡを含むＴＰＰ溶液をキトサン−ＰＥＧ溶液に加え、磁気攪拌しながら保持した。理論的ＤＮＡ装填量は、ナノ粒子の調製に使用したキトサン−ＰＥＧの総量（１ｍｇ）に対して５、１０または２０％であった。プラスミドＤＮＡのカプセル封入効率は、蛍光(Pico Green dsDNA染料）およびアガロースゲル電気泳動検定により、常に９０％を超えることが確認された。
【００６２】
表IV、ＶおよびVIは、様々なキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子の特性を示す。未装填ナノ粒子と同様に、ＰＥＧを含むＤＮＡ装填した処方物は、ＰＥＧを含まない処方物よりも、はるかに小さく、正の表面電荷が少ない。
【００６３】
すべての場合で、ＤＮＡの存在は、特に高ＤＮＡ百分率で、キャリヤーの特性を変化させ、その際、表面電荷が一般的に低下する。ナノ粒子サイズに関して、大きなＤＮＡ装填量は、より高度に架橋した構造を誘発し、粒子径の低下を引き起こす。これは、ＰＥＧ化されていないキャリヤーの場合に観察され、そこではサイズが約２７０〜３００ｎｍから２２０ｎｍに低下している。
【００６４】
しかし、ＰＥＧ化されたキャリヤーのサイズは、特にＰＥＧ化度０．５％のキトサン−ＰＥＧを使用する場合に、ＤＮＡ装填量と共に増加する。
【表４】
【表５】
【表６】
【００６５】
例４
インビトロプラスミドＤＮＡ放出
プラスミドＤＮＡは、キトサンおよびキトサン−ＰＥＧ粒子径と効果的に会合した。図２Ａおよび２Ｂに示すように、プラスミドＤＮＡを装填したナノ粒子を、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４、ｐＨ７．４）および精製水（ＭＱ）の両方で１ヶ月以上培養した時、プラスミドＤＮＡの放出は検出されない。
【００６６】
例５
酵素の存在下におけるインビトロプラスミドＤＮＡ放出
電気泳動分析（図３）から観察されるように、プラスミドＤＮＡを装填したナノ粒子を、キトサナーゼ（０．６ｍｇ／ｍＬ）の存在下、酢酸塩緩衝液ｐＨ６中で培養した時、プラスミドＤＮＡをキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子から放出させることができる。
【００６７】
これらの結果は、プラスミドＤＮＡがナノ粒子に効果的に会合しているが、重合体状キャリヤーが酵素により分解した時は放出されるので、プラスミドＤＮＡはナノ粒子に不可逆的に結合しているのではないことを示している。
【００６８】
例６
キトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合した（ＧＦＰ）プラスミドＤＮＡのトランスフェクションにおける効率
キトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子によるトランスフェクションの効率を、HEK 293細胞ラインモデルでＧＦＰプラスミドのコード化に関して評価した。
【００６９】
図４は、２０％プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）装填量を含む高分子量キトサンナノ粒子（１２５ｋＤａ、HMW CS NP）のトランスフェクションにおける効率に対する、キトサンＰＥＧ化度（０．５％および１％）により引き起こされる効果を示す。ウェルあたりのプラスミド投与量は１μｇであった。これらの結果は、０．５％ＰＥＧ化度が、これらのナノ粒子のトランスフェクション能力に対して好ましい効果を有することを示唆している。このＰＥＧ化度を、その後の実験に選択した。図４ｂに示す結果は、トランスフェクションの効果が、ナノ粒子のｐＤＮＡ装填量と共に増加することを特徴とする示している。この観察は、プラスミド投与量が一定（１μｇ）であり、従って、ｐＤＮＡ装填量が増加するにつれてナノ粒子投与量が低下するので、重要である。
【００７０】
トランスフェクションの効率に対するプラスミド装填量の影響は、低分子量キトサン−ＰＥＧナノ粒子（１０ｋＤａ、LMW CS-PEG NP）に対しても評価した。この場合、少ない装填量（５％）に対して高い発現レベルが観察された（図５ａ）。さらに、この少ない装填量（５％）に対して、ＰＥＧ化がトランスフェクションの効率に対して好ましくない効果を有することが観察された（図５ｂ）。
【００７１】
これらの実験の主な結論は、キトサンＰＥＧ化が、キトサンの分子量に応じて、好ましい（HMW CS-PEG NP）または好ましくない（LMW CS-PEG NP）効果を有するということである。
【００７２】
例７
カプセル封入したインスリンおよび遊離インスリンの、濃度１０Ｕ／ｋｇにおける鼻内投与の生物学的効果
インスリンをキトサンナノ粒子中にカプセル封入するために、インスリン２．４ｍｇをＮａＯＨ溶液中に予め溶解させ、次いでこれにＴＰＰ１．２ｍＬを加えた。この混合物をキトサン３ｍＬに加えた。磁気攪拌しながら５分後、この製剤を１０，０００ｇで４０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、沈殿物を緩衝液中に溶解させた。同じ処理をキトサン−ＰＥＧナノ粒子の調製にも行ったが、１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ４００をキトサン２ｍｇ／ｍＬに加えた。
【００７３】
光子相関分光分析により測定したキトサンナノ粒子の最終サイズは、６０５±１５ｎｍであるのに対し、キトサン−ＰＥＧナノ粒子の最終サイズは５９０±６ｎｍであった。
【００７４】
先ず、雄のWistarラット、体重２００〜２２０ｇ、に、クエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．５中のstreptozotocin注射（６５ｍｇ／ｋｇ i.v.）により、糖尿病を誘発させた。これらのラットは、３週間のstreptozotocinによる処理後、血糖濃度が４００ｍｇ／ｄｌを超えた時に糖尿病と見なされた。
【００７５】
給餌していないラットを使用して、この実験を行った。ラットを、ラットに投与する処方物に応じて異なったグループに分けた。様々な処方物は、比較用溶液（酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．３）、酢酸塩緩衝液に溶解させたインスリン、キトサン溶液に溶解させたインスリンおよびキトサンナノ粒子に会合したインスリンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合したインスリンからなり、インスリン濃度は体重１ｋｇあたり１０Ｕである。処方物は、ラットに仰臥位置でエーテルで麻酔をかけ、Eppendorfピペットを使用し、各鼻オリフィスに少量（１０〜２０μｌ）を入れることにより、投与した。次いで、麻酔が血中グルコースレベルに及ぼす恐れのある影響を防止するために、これらのラットを実験全体にわたって醒めた状態に維持した。
【００７６】
血中グルコースレベルを測定するために、血液試料を尾の静脈から、鼻内投与の前および１５分毎に、９０分間が過ぎるまで採取した。続いて、試料を、１時間毎に２〜７時間、および最後に鼻内投与から２４時間後に採取した。血中グルコースレベルは、グルコース分析装置(Chronolyss製のPrestige)を使用して直ちに測定した。実験中、ラットには給餌しなかった。
【００７７】
図６に示すように、酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．３、の鼻内投与により、血糖値が時間と共に徐々に、漸進的に減少し、比較値に対する最大の減少は投与後６時間であった。酢酸塩緩衝液中１０Ｕ／ｋｇインスリンの鼻内投与は、前の結果を大きく変えなかった。しかし、インスリンをキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合させた場合、血糖レベルは投与後僅か１５分間以内で１８％（ｐ＜０．０１）減少し、該投与から４５分間で最大減少４５〜５０％（それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）に達した。この減少は、鼻内投与から少なくとも７時間が経過した後も維持されることを強調しなければならない。血糖レベルの明らかな低下は、キトサンナノ粒子に会合したインスリンを鼻内投与した後にも観察された。この場合、血糖は、３０分から大きく低下し始め、特に１６％（ｐ＜０．０１）低下し、最大減少は、鼻内投与から２時間後に観察された３２％（ｐ＜０．００１）であった。血糖は、インスリンをキトサン溶液に溶解させた場合にも減少するが、その程度は、インスリンをキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合させた場合よりも、はるかに小さかった。
【００７８】
例８
インスリンを含むナノ粒子の、経口グルコース投与への血糖応答に対する効果
一晩給餌しなかった糖尿病ラットを使用し、この実験を行った。例７に記載した製剤のそれぞれをこれらのラットに鼻内投与した。１時間後、各グループのラットに、体重１ｋｇあたり２ｇのグルコースを経口投与した。グルコース投与の前および１０、２０、３０、６０、９０および１２０分後に尾の静脈から採取した試料の血液で血糖を測定した。
【００７９】
図７は、インスリンを含むナノ粒子の、経口グルコース投与への血糖応答に対する効果を示す。酢酸塩緩衝液を与えた比較用ラットでは、経口グルコース投与に続いて血糖が増加し、３０分後にその最大値１０５％（ｐ＜０．００１）に達した。続いて血糖は２時間にわたって徐々に低下した。酢酸塩緩衝液に溶解させたインスリン（１０Ｕ／ｋｇ）は、この結果を大きく変えなかった。
【００８０】
しかし、同じ量のキトサン溶液中インスリンは、グルコースに対する血糖応答を１８９％（ｐ＜０．０５）増加したのに対し、キトサンまたはキトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合したインスリンは、血糖応答をそれぞれ１９３％（ｐ＜０．０１）および２２５％（ｐ＜０．０１）増加した。
【００８１】
従って、分析した様々な処方物に基づくＡ．Ｕ．Ｃ．（曲線下の面積）を比較すると、最も効果的な製剤は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合したインスリンに対応する製剤であり、キトサンナノ粒子に会合したインスリンがその次であり、最後がキトサン溶液中のインスリン対応する製剤である。
【００８２】
これらの結果は、本発明に記載するキトサン−ＰＥＧナノ粒子の使用により、糖尿病ラットにおけるインスリン吸収が増加することを示している。実験結果は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合しているインスリン（１０Ｕ／体重ｋｇ）が、鼻内放出後１５分から出発して少なくとも７時間まで血糖を著しく下げ、経口グルコース負荷が起きた時に血糖応答を改良することを示す。該ナノ粒子に会合しているインスリンが４Ｕ／ｋｇでは、それ程顕著な効果は見られない。
【００８３】
インスリンが、キトサンのみによって形成されたナノ粒子に会合している場合、あるいはインスリンがキトサンの溶液中にある場合、その効率は、インスリンがキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合している場合より低いのに対し、遊離のインスリンは、糖尿病ラットにおけるその鼻内放出の後、生物学的パラメータに対する重大な効果を発揮しない。
【００８４】
例９
ジフテリアトキソイド装填されたナノ粒子により引き起こされる免疫応答の生体内評価
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）をＴＰＰ溶液に配合することにより、ＤＴをキトサンまたはキトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合させる（ＤＴ３００μｇ）。異なった量のＴＰＰ水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をキトサンまたはキトサン−ＰＥＧ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に磁気攪拌しながら加えることにより、ナノ粒子が自然に形成される。ＴＰＰ溶液の量は、キトサン：ＴＰＰ比８：１および２：１を達成するように計算した。キトサンは、その塩酸塩、脱アセチル化度８６％のProtosan C1（登録商標） 113およびProtosan C1（登録商標） 213として市販されている。５℃、１０，０００ｇで４０分間遠心分離することにより、キトサンナノ粒子を単離する。キトサン−ＰＥＧの場合、遠心分離ウルトラフィルター（Amicon（登録商標）ultra-4 100000 NMWL, Millipore）上に３８００ｇで３０分間かけてナノ粒子を集める。上澄み液を除去し、ナノ粒子をリン酸塩緩衝液を加えた食塩水、ｐＨ７．４、中に再懸濁させ、マウスに投与する。
【００８５】
キトサンおよびキトサン−ＰＥＧ処方物の免疫原性試験は、鼻内免疫法により行った。生後６週間の雄BALB/cマウスを使用した。マウスを５つのグループに分けた。２グループは、ＤＴ装填したキトサンナノ粒子（CS-113 C1、CS-213 C1）で処理し、１グループはＤＴ装填したキトサン−ＰＥＧナノ粒子で処理した。使用した投与量は、ナノ粒子１００μｇに配合したＤＴ１０μｇであり、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液１０μｌに取り、５μｌを各鼻オリフィスに投与する。もう一つのグループは、リン酸塩緩衝液を加えた食塩水、ｐＨ７．４中の遊離トキソイドで処理した。さらに、比較用として、１グループは、リン酸アルミニウム中に吸着させたＤＴＰ（ジフテリア、破傷風および百日咳）ワクチン（１０μｇ／マウス）を腹腔内投与した。この投与量を、意識があるラットに０、７および１４日に投与した。
【００８６】
血液試料をマウスの尾から、第一投与量の投与後１４、２８、４２、５６および７０日目に採取し、生体内免疫応答検定を行った。さらに、腸、気管支肺胞および唾液の洗浄試料(wash sample)も７０日目に採取した。唾液分泌は、ピロカルピン（５０μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射により誘発した。各マウスの初期唾液流の１００μＬアリコートを集めた。次いで、マウスを、ペントバルビタールで麻酔にかけ、殺した。気管支肺胞洗浄液は、静脈内カニューレを使用して洗浄媒体５ｍＬを気管の中に注入して肺を膨脹させ、吸入により得た。さらに、腸部分（十二指腸、空腸、回腸）を無菌的に取り出し、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭヨード酢酸および１０ｍＭ ＥＤＴＡの溶液４ｍＬ中に均質化した。これらの試料を遠心分離により清澄化し、アジ化ナトリウム、ＰＭＳＦおよびウシ血清を保存剤として加えた。抗体濃縮検定を行うまで、全試料を−２０℃で保存した。
【００８７】
血清および粘膜組織における抗体の応答評価は、ELISA試験により行った。マイクロプレート(DYNEX, immulon（登録商標）)を先ずｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液０．０５Ｍ中のＤＴ（４μｇ／ウェル）１００μＬで被覆した。工程間で、ウェルはｐＨ７．４のＰＢＳＴ（０．０１Ｍ ＰＢＳ、または５％ｖ／ｖのTween（登録商標）20を含むリン酸塩緩衝液）で３回洗浄した。非特異的反応を最少に抑えるために、ＰＢＳＴＭ（スキムミルク粉末５％ｖ／ｖおよび保存剤としてアジ化ナトリウム０．１％ｖ／ｖを含むＰＢＳＴ）を全てのウェルに加え、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳＴで洗浄した後、試料を２工程で連続的にＰＢＳＴＭで希釈し、プレートを３７℃でさらに２時間培養した。続いて、ヤギ抗−マウスＩｇＧ免疫グロブリンペルオキシダーゼ共役物１００μＬをＰＢＳＴＭ中１：２０００に希釈し、ウェルに加え、３７℃で２時間培養した。プレートを洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩５０μＬ（０．４５ｍｇ／ｍＬ）を基質としてｐＨ５．０のクエン酸塩リン酸塩緩衝液０．０５Ｍに加えた。発色（３７℃で３０分間）に続いて、プレートをマイクロプレートリーダー(3350-UV, Biorad)上、４５０ｎｍで読み取った。
【００８８】
鼻内免疫法に従って、ＤＴ装填したナノ粒子および比較用ＤＴ溶液により引き起こされた抗−ジフテリアＩｇＧレベルを図８に示す。この図は、腹腔内投与した市販の処方物（リン酸アルミニウムに吸収させたＤＴ）に対応する結果も示す。一般的に、これらの結果は、最初の１箇月の後、ＤＴ装填したナノ粒子に対して観察されたＩｇＧレベルは、流体ワクチンに対応する結果よりも著しく優れていることを示している（ｐ＜０．０５）。実際、これらの値は、非経口投与された、アジュバントとして使用された処方物（リン酸アルミニウムに吸収されたＤＴ）で得られた値に匹敵する。従って、これらの結果は、ナノ粒子を含む処方物のアジュバント効果を明らかに示している。もう一つの注目すべき観察は、増加し、長時間持続する免疫応答である。最後に、ナノ粒子組成物の影響に関して、キトサンの分子量は、キトサンナノ粒子により得られる免疫応答に何の影響も及ぼさないが、キトサンのＰＥＧ化は、ナノ粒子の効率に明らかな結果をもたらすことは重要である。実際、１箇月後、ＩｇＧレベルは、キトサン−ＰＥＧナノ粒子が、キトサンナノ粒子よりもはるかに大きい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１Ａは、ナノ粒子径に対する、キトサンＰＥＧ化度、重合体溶液のｐＨ、およびキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比の影響を示し、図１Ｂは、ナノ粒子径の多分散性に対する、キトサンＰＥＧ化度、重合体溶液のｐＨ、およびキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比の影響を示す。
【図２】図２Ａは、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４および７．４）および純水（ＭＱ）中で１日培養した後の、キトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合するプラズマＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示し、図２Ｂは、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４および７．４）および純水（ＭＱ）中で４週間培養した後の、キトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合するプラズマＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。
【図３】キトサナーゼの存在下でキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合するプラズマＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。
【図４】図４Ａは、高分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するＰＥＧ化度の影響を示し、図４Ｂは、高分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するｐＤＮＡの影響を示す。
【図５】図５Ａは、低分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するｐＤＮＡの影響を示し、図５Ｂは、低分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するＰＥＧ化度の影響を示す。
【図６】種々の処方物または酢酸塩緩衝液（比較）中に含まれるインスリン１０Ｕ／ｋｇを鼻内投与した後の血糖を示す。血糖は、基底線値に対する％で、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示す。下記の値は、様々な投与の前の基底線値である。酢酸塩緩衝剤（黒四角）４２３±１６ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７）、インスリン（□）４３０±１５ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７）、キトサン溶液中のインスリン（●）４３９±１２ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝８）、キトサンナノ粒子（◆）４６９±１４ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７）、キトサン−ＰＥＧナノ粒子（○）４５８±２１ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝８）。
【図７】インスリンまたは酢酸塩緩衝液を含む処方物を、一晩給餌しなかった糖尿病のラットに鼻内投与した後の、グルコース耐性を示す。グルコース（体重１ｋｇあたり２ｇ）は、鼻内投与した後０および１時間後に胃内投与した。酢酸塩緩衝剤（黒四角）（ｎ＝１０）、インスリン（□）（ｎ＝６）、キトサン溶液中のインスリン（●）（ｎ＝６）、キトサンナノ粒子（◆）（ｎ＝６）、キトサン−ＰＥＧナノ粒子（○）（ｎ＝６）。
【図８】種々のキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子処方物中に配合したＴＤ１０μｇを鼻内投与した後、０、７および１４日後の、マウスの血清中のＩｇＧ抗ＴＤの最終タイターを示す（ｎ＝６）。ＩＮは鼻内、ＩＰは腹腔内を表す。＊ 統計的に重大な差（α＜０．５）
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子系に関する。本発明は、とりわけ、生物学的に活性な分子を配置できる、イオン的に架橋したキトサン−ポリエチレングリコール共役物により形成されたナノ粒子系、およびその製造方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
生物学的に活性な薬剤を放出する系は、常に発展している研究分野である。活性成分を種々の投与経路によって動物または人間の体に投与することが困難であることは、公知である。ペプチド、タンパク質および多糖を包含するある種の薬物は、上皮バリヤーの浸透性に限界があるため、粘膜表面を通して効果的に吸収されない。例えば、現在、皮下投与（それは患者にとっては好ましくないものである）されているインスリンは、鼻または腸粘膜バリヤー等の粘膜バリヤーを通過する能力が乏しい活性成分の一つであり、皮下投与に代わる経路を見出し、この活性分子をより効果的に吸収できる投与系を開発する必要がある。
【０００３】
近年提案されている、薬物に対する生物学的バリヤーを克服する可能性として、活性成分を小さな粒子に取り入れることが注目されている。この粒子と粘膜との相互作用は、とりわけ、粒子の大きさにより影響を受け、粒子径の低下と共に相互作用が増大する。
【０００４】
米国特許出願第２００４１３８０９５号には、インスリンを放出する水性ナノ粒子懸濁液、とりわけ、３ブロックのポリエチレングリコール／親水性ポリアミノ酸／疎水性ポリアミノ酸共重合体を基剤とする水性ナノ粒子懸濁液、が記載されている。一方、米国特許第５，６４１，５１５号公報には、生物分解性ポリシアノアクリレート中にインスリンを閉じこめて複合体を形成したナノ粒子を含んでなる、インスリンを制御しながら放出するための薬剤処方物が記載されている。
【０００５】
薬物放出系としての用途として、疎水性重合体を基剤とするナノ粒子系も開発されており、当該技術分野において多数の文献が示されている。天然由来の巨大分子、例えばアルブミンナノ粒子（W. Linら, Pharm. Res., 11, 1994）やゼラチン（H.J. Watzkeら, Adv. Colloid Interface Sci., 50, 1-14, 1994）を基剤とする親水性ナノ粒子、および、アルジネート等の多糖を基剤とする親水性ナノ粒子（M. Rajaonarivonvyら, J. Pharm. Sci., 82, 912-7, 1993）を基剤とする親水性ナノ粒子を製造するための方法に関する研究が発表されている。しかしながら、これらの方法の多くは、有機溶剤、油および高温を使用する必要があり、これらの系の開発を著しく制限している。これらの提案された方法の中で最も無害であるのが、カルシウムの存在下でのイオン性ゲル化、およびそれに続く陽イオン系高分子電解質ポリ−Ｌ−リシンの存在下での硬化、に基づく、アルジネートナノ粒子の製造方法である。しかし、このナノ粒子には、全身系(systemic)毒性およびポリ−Ｌ−リシンの高コストに関する欠点がある。
【０００６】
これらの系に替わる方法がキトサンナノ粒子の開発であり、先行技術文献には、活性成分の投与に関する有用性、およびその製造方法が記載されている（J. Appl. Polym. Sci. 1997, 63, 125-132、Pharm. Res. 14, 1997b, 1431-6、Pharm. Res. 16, 1991a, 1576-81、S.T.P. Pharm. Sci. 9, 1999b, 429-36、Pharm. Res. 16, 1999, 1830-5、J. Control Release 74, 2001, 317-23、および米国特許第５，８４３，５０９号公報）。これらのナノ粒子の欠点は、特定のｐＨおよびイオン強度条件において、ナノ粒子の安定性が制限されることである。
【０００７】
国際公開ＷＯ−Ａ−０１／３２７５１号パンフレットには、キトサンまたはその誘導体を水性媒体中に溶解させ、次いで表面変性剤の存在下において、ｐＨを、キトサンが沈殿する程度に上昇させることからなる、ナノ粒子の形態にあるキトサンまたはキトサン誘導体の製造方法に関する記載がある。
【０００８】
国際公開ＷＯ−Ａ−９９／４７１３０号パンフレットには、少なくとも一種のポリ陽イオン（キトサンでよい）と、少なくとも一種のポリ陰イオンと、活性成分とから得られる、生物相容性および生物分解性の高分子電解質複合体を有するナノ粒子に関する記載があり、このナノ粒子は、高分子電解質複合体の形成の際またはその後に、少なくとも一種の架橋剤（グリオキサール、ＴＳＴＵまたはＥＤＡＰ）でさらに処理することにより、得られる。
【０００９】
ポリオキシエチレンと組み合わせたキトサンナノ粒子の製造方法も公知であり（スペイン特許公報２０９８１８８号公報および同２１１４５０２公報）、さらに、活性成分は、治療用または抗原性巨大分子でよいことも公知である。これらのナノ粒子は、トリポリリン酸塩等の塩基性試薬の添加により引き起こされる、キトサンおよび重合体したナノ凝集物の形態にある活性巨大分子の共沈殿工程によって、形成される。
【００１０】
さらに、キトサンは、ＰＥＧ化と呼ばれるアミノ官能基を通したポリエチレングリコールとの共有結合によって、変性することができる。欧州特許第１３０４３４６号および米国特許第６，７３０，７３５号には、粘膜を通して薬物を投与するための、キトサンとＰＥＧ共役物とがキトサンアミノ基を介して共有結合した組成物が記載されている。
【００１１】
米国特許出願第２００４／０１５６９０４号には、キトサン−ＰＥＧ、および、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）等の水に不溶の重合体、を含む組成物から調製されたマトリックスに、活性薬剤が配合された薬剤放出系が記載されている。
【００１２】
国際公開ＷＯ０１／３２７５１号パンフレットには、界面活性剤の存在下において、ポリエチレングリコールを含むキトサンナノ粒子の溶液のｐＨを増加させると、ポリエチレングリコールを含むキトサンナノ粒子が沈殿し、キトサンナノ粒子が得られることが記載されている。しかしながら、ＰＥＧはキトサンに共有結合していない。
【００１３】
薬物放出系の開発を目的とする多くの文献があるにもかかわらず、生物学的に活性な分子を会合させて、かつ規定速度でその活性分子を放出することができる類のナノ粒子系を提供することが依然として希求されている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、キトサンの架橋を引き起こす試薬の存在下で、イオン性ゲル化工程により得られるＰＥＧ−変性されたキトサンナノ粒子により形成される系が、生物学的に活性な分子を効果的に会合させると共に、次いで、それらの分子を好適な生物学的環境中に放出することができることを見出した。ＰＥＧ−変性されたキトサンナノ粒子は、ＰＥＧ化されていないキトサンナノ粒子と比較して、例えば鼻内インスリン投与または鼻内ジフテリアトキソイド投与に応答する免疫遺伝において著しい特性を有する。
【００１５】
従って、本発明の目的は、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、
前記ナノ粒子が、
ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、および
ｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる
共役物を含んでなり、
前記両成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする、系を意図したものである。
【００１６】
「生物学的に活性な分子」の表現は、広い意味を有し、低分子量薬物、多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチド、および核酸、ならびにそれらの組合せを含んでなる。本発明の一変形においては、生物学的に活性な分子の機能は、病気を阻止する、和らげる、治癒させる、または診断することである。本発明の別の変形においては、生物学的に活性な分子は化粧品機能を有する。
【００１７】
本発明の第二の態様は、上に規定するナノ粒子を含んでなる薬剤組成物またはワクチンに関する。好ましい態様においては、薬剤組成物またはワクチンは、粘膜投与に使用される。
【００１８】
本発明の別の態様においては、本発明の目的は、上記に規定したナノ粒子を含んでなる化粧品組成物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、内側に一種以上の生物学的に活性な分子、例えば薬物、ワクチンまたは遺伝学的材料を保持できる、キトサン−ＰＥＧナノ粒子を含んでなる組成物に関する。それ自体は生物学的に活性な分子とは考えられないが、投与系の効率に貢献し得る、ペプチド、タンパク質、または多糖もナノ構造中に閉じ込めることができる。
【００２０】
本発明の最後の態様は、上記生物学的に活性な分子を制御放出するための系を得る方法であって、
ａ）キトサン−ＰＥＧ共役物水溶液を調製すること、
ｂ）架橋剤水溶液を調製すること、および
ｃ）前記工程ａ）およびｂ）の溶液を攪拌しながら混合して、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧナノ粒子が自発的に形成され、次いで沈殿すること、
を含んでなる、方法である。
【００２１】
本発明による方法の一変形においては、活性成分をキトサン水溶液または架橋剤水溶液に配合してから、両方の相を混合する。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本発明の系は、ナノ粒子を含んでなり、その構造は、架橋したキトサンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）共役物を含んでなり、その中に活性成分を取り入れることができる。
【００２３】
用語「ナノ粒子」は、キトサンとＰＥＧとの間のキトサンアミノ基を通した共有結合の結果である共役物を含んでなる構造として理解され、その共役物は、陰イオン系架橋剤の作用によるイオン性ゲル化により、さらに架橋している。共有結合の形成およびそれに続く系のイオン性架橋により、独立した、識別可能な、特徴的な物理的存在が生じ、その平均的なサイズは、１μｍ未満である、すなわち平均サイズは１〜９９９ｎｍである。
【００２４】
「平均サイズ」とは、ナノ粒子が形成された水性媒体中で一緒に動くナノ粒子の集団の平均直径として理解される。これらの系の平均サイズは、当業者には公知の、例えば下記の実験項で説明する、標準的な方法により測定することができる。
【００２５】
系のナノ粒子の特徴は、平均粒子径が１μｍ未満であり、好ましくは平均サイズが１〜９９９ｎｍ、好ましくは５０〜８００ｎｍ、さらに好ましくは５０〜５００ｎｍである。平均粒子径は、ＰＥＧに対するキトサンの比により、キトサンの脱アセチル化度により、および粒子形成条件（キトサン−ＰＥＧ濃度、架橋剤濃度および両者の比）によっても影響を受ける。ＰＥＧの存在により、ＰＥＧ化されていないキトサンにより形成される系と比較して、平均粒子径が減少する。
【００２６】
さらに、ナノ粒子は、電荷（Ｚ電位により測定）を有することができ、その強度は、上記の変数および特にＰＥＧによるキトサンの官能化度に応じて、＋０．１〜＋５０ｍＶ、好ましくは＋１〜＋４０ｍＶになることがある。ナノ粒子の正電荷は、ナノ粒子と粘膜表面との相互作用を強化するのに重要であることがある。しかし、ナノ粒子の非経口投与には、中性電荷がより重要である。
【００２７】
上記の生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系は、共役物中のキトサン含有量が５０重量％を超え、好ましくは７５重量％を超える。共役物中のＰＥＧ含有量は５０％未満、好ましくは２５％未満である。
【００２８】
キトサンは、キチン（ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）に由来する天然重合体であり、その際、Ｎのアセチル基の重要な部分が加水分解により除去されている。脱アセチル化度は、一般的に３０〜９５％、好ましくは６０〜９５％であり、これは、アミノ基の５〜４０％がアセチル化されることを示唆する。従って、キトサンは、アミノ多糖構造および陽イオン系特性を有する。キトサンは、式(I)
【化１】
で表され、ｎが整数である、単量体単位の反復、およびアミノ基がアセチル化されているｍ単位をさらに含んでなる。ｎ＋ｍの合計は、重合度、すなわちキトサン鎖中の単量体単位の数、を表する。
【００２９】
本発明のキトサン−ＰＥＧ共役物を形成するのに使用するキトサンは、分子量が５〜２０００ｋＤａ、好ましくは１０〜５００ｋＤａ、より好ましくは１０〜１００ｋＤａである。使用可能な市販されているキトサンの例は、NovaMatrix, Drammen、ノルウェイから市販されているUPG 113、UP CL 213およびUP CL113である。
【００３０】
キトサン−ＰＥＧ共役物の形成に使用するキトサンを構成する単量体単位の数は、３０〜３０００単量体、好ましくは６０〜６００である。
【００３１】
キトサンの替わりに、キトサンの溶解度を高めるために、またはキトサンの粘膜密着性を増加するために、一個以上の水酸基および／または一個以上のアミノ基が変性されているキトサン誘導体を使用することもできる。これらの誘導体としては、特に、Roberts Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166に記載されているような、アセチル化された、アルキル化された、またはスルホン化されたキトサン、チオール化された誘導体がある。誘導体を使用する場合、好ましくはＯ−アルキルエーテル、Ｏ−アシルエステル、トリメチルキトサン、ポリエチレングリコールで変性されたキトサン、等から選択する。他の可能な誘導体は、塩、例えばクエン酸塩、硝酸塩、乳酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、等である。いずれの場合も、当業者は、最終処方物の商業的な実行性および安定性を損なわずにキトサンに対して行うことができる変性を決定できる。
【００３２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その最も通常の形態で、式(II)
【化２】
の重合体である（式中、ｐは、ＰＥＧの重合度を表す整数である）。本発明においては、ＰＥＧの重合度は、５０〜５００であり、これは分子量２〜２０ｋＤａ、好ましくは５〜１０ｋＤａに相当する。
【００３３】
１または２個の末端水酸基が変性されている変性ＰＥＧを、キトサン−ＰＥＧ共役物の形成に使用する。キトサン−ＰＥＧ共役物の形成に使用できる変性ＰＥＧとしては、式(III)
【化３】
を有する物質があり（式中、Ｘ１は、その後に続く反応のためにＯＨ官能基をブロックするヒドロキシルラジカル保護基である）、ヒドロキシル保護基は、この分野で良く知られており、代表的な保護基（保護すべき酸素をすでに包含する）は、シリルエーテル、例えばトリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ジエチルイソプロピルシリルエーテル、ヘキシルジメチルシリルエーテル、トリフェニルシリルエーテル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルシリルエーテル、アルキルエーテル、例えばメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、アリルエーテル、アルコキシメチルエーテル、例えばメトキシメチルエーテル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチルエーテル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテルおよび関連するエーテル、メチルチオメチルエーテル、エステル、例えばアセテートエステル、ベンゾエートエステル、ピバレートエステル、メトキシアセテートエステル、クロロアセテートエステル、レブリネートエステル、カーボネートエステル、例えばベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、ｔｅｒｔ−ブチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、アリルカーボネートである。ヒドロキシル保護基の他の例は、参考書、例えばGreene and Wutsによる「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999、に記載されている。好ましい実施態様においては、保護基は、アルキルエーテルであり、より好ましくはメチルエーテルである。
【００３４】
Ｘ２は、水素またはキトサンアミノ基に固定できるブリッジ基でよい。使用するブリッジ分子の中で、好ましい形態は、スクシンイミドまたはその誘導体であるが、これらに限定するものではない。
【００３５】
あるいは、Ｘ１は、アミノ基以外の基で固定することができる基でもよい。例えば、マレイミドをブリッジ分子として使用し、ＳＨ基と結合させる。
【００３６】
ＰＥＧと反応するキトサンアミノ基、言い換えると、ＰＥＧ化と呼ばれる、キトサンアミノ基のＰＥＧによる官能化の数は、０．１〜５％、好ましくは０．２〜２％、より好ましくは０．５〜１％である。
【００３７】
得られるキトサン−ＰＥＧ共役物は、分子量が５〜３０００ｋＤａ、好ましくは１０〜５００ｋＤａである。
【００３８】
本発明のナノ粒子系は、キトサン−ＰＥＧ共役物のイオン性架橋により形成されているのが特徴である。架橋剤は、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧ共役物を架橋させ、ナノ粒子の自然な形成を促進する陰イオン系塩である。本発明では、架橋剤はポリリン酸塩であり、トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）の使用が好ましい。ナノ粒子系を与える架橋は、簡単であり、発明の背景に記載したように当業者には公知である。
【００３９】
本発明の第二の態様は、上記のナノ粒子を含んでなる薬剤組成物である。薬剤組成物の例としては、組成物を経口、バッカルまたは舌下投与もしくは局所投与するための全ての液体組成物（ナノ粒子の水中懸濁液、または添加剤、例えば粘性付与剤、ｐＨ緩衝剤、等を含む水中懸濁液）もしくは固体組成物（ナノ粒子を凍結乾燥または噴霧させ、顆粒、錠剤またはカプセルを調製するのに使用できる粉末を形成）、あるいは組成物を経皮、眼、鼻、膣または非経口投与するための液体または半固体形態がある。非経口投与以外の(non-parenteral)経路の場合、上記の負に帯電した表面との相互作用を強化する大量の正電荷を粒子に与えることにより、ナノ粒子と皮膚または粘膜との接触を改良することができる。非経口投与経路の場合、より詳しくは、静脈内投与には、これらの系は、そこに会合する薬物または分子の生体内配分を調整する可能性を提供する。
【００４０】
好ましい態様では、処方物の投与は、粘膜投与である。キトサン−ＰＥＧ共役物の正電荷は、それらの粘膜との相互作用により粘膜表面における、および負に帯電した上皮細胞の表面における薬物の吸収を改善する。
【００４１】
キトサン−ＰＥＧナノ粒子は、生物活性分子に対する高い会合能力を有する系である。この会合能力は、配合する分子の種類ならびに上記の処方物パラメータによって異なる。従って、本発明の別の態様は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子、例えば上記のナノ粒子、および少なくとも一種の生物学的に活性な分子を含んでなる組成物により形成される。
【００４２】
用語「生物学的に活性な分子」は、病気の処置、治癒、防止または診断に使用される、あるいは人または動物の物理的および精神的な健康状態を改善するのに使用される全ての物質に関連する。これらの生物学的に活性な分子は、低分子量薬物から多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチドおよび核酸およびそれらを組合せた種類の分子を包含する。これらのナノ粒子に会合する分子の例としては、タンパク質、例えば破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイド、多糖、例えばヘパリン、ペプチド、例えばインスリン、ならびに幾つかのタンパク質をコード化するプラスミドがある。
【００４３】
好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はインスリンである。別の好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はジフテリアまたは破傷風トキソイドである。別の好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はヘパリンである。別の好ましい実施態様では、生物学的に活性な分子はＤＮＡプラスミドである。
【００４４】
本発明のナノ粒子系は、治療的効果はないが、化粧品組成物を形成する他の活性分子を配合することもできる。これらの化粧品組成物としては、活性分子を局所投与するための全ての液体組成物（ナノ粒子懸濁液）またはエマルションがある。ナノ粒子に配合できる活性分子としては、特に、抗ニキビ剤、抗真菌剤、酸化防止剤、脱臭剤、制汗薬、ふけ防止剤、皮膚白色化(skin whitening)剤、タンニン酸処理剤(tanning agents)、紫外光吸収剤、酵素、化粧品用殺菌剤がある。
【００４５】
本発明の別の態様は、上記のナノ粒子および抗原を含んでなるワクチンである。ナノ粒子から形成された系を使用して抗原を投与することにより、免疫応答を達成することができる。ワクチンは、タンパク質、多糖を含んでなるか、またはＤＮＡワクチンでよい。厳密に言うと、ＤＮＡワクチンは、免疫応答を与える抗原の発現をコード化するＤＮＡ分子である。好ましい実施態様では、この抗原は、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドである。
【００４６】
本発明の別の態様は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子、例えば上記のナノ粒子、の製造方法であって、
ａ）キトサン−ＰＥＧ共役物水溶液を調製すること、
ｂ）架橋剤水溶液を調製すること、および
ｃ）前記工程ａ）およびｂ）の溶液を攪拌しながら混合して、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧナノ粒子が自発的に形成され、次いで沈殿すること、
を含んでなる方法に関する。
【００４７】
最初のキトサン−ＰＥＧ共役物溶液のｐＨは、両方の溶液を混合する前に、水酸化ナトリウムを加えることにより、４．５〜６．５の値に達するまで調整する。
【００４８】
この方法の変形では、得られるキトサン−ＰＥＧ／架橋剤の比が２／１〜８／１であり、３／１比が好ましく、この比により、多分散度が比較的低い処方物が得られる。しかし、より高いキトサン−ＰＥＧ／架橋剤比、ならびに酸性がより高い媒体中で粒子を調製することも可能である。
【００４９】
架橋剤の存在により、網目構造が形成されるように、キトサン−ＰＥＧ共役物を架橋させ、その網目構造の中に生物学的に活性な分子を挿入し、後の段階で放出することができる。架橋剤は、ナノ粒子にサイズ、電位、および構造的特徴をさらに与え、生物学的に活性な分子を投与するための系として適した粒子を形成することができる。
【００５０】
生物学的に活性な分子は、生物学的に活性な分子を含むキトサン−ＰＥＧナノ粒子がイオン性ゲル化により自然に形成され、続いて沈殿するように、工程ａ）またはｂ）の溶液に直接配合するか、または水相または有機相中に前もって溶解させることができる。
【００５１】
従って、生物学的に活性な分子は、下記の方法により配合することができる。
ａ）活性分子を架橋剤またはキトサン−ＰＥＧの溶液に直接溶解させるか、
ｂ）活性分子を酸性または塩基性水溶液中に溶解させてから、架橋剤またはキトサン−ＰＥＧの溶液に配合するか、または
ｃ）活性分子を水と混和し得る、極性の有機溶剤中に溶解させてから、架橋剤またはキトサン−ＰＥＧの溶液に配合する。
【００５２】
キトサン−ＰＥＧナノ粒子の製造方法は、該ナノ粒子を凍結乾燥させる追加工程をさらに含むことができる。薬学的観点からは、貯蔵中の安定性が改良されるので、ナノ粒子を凍結乾燥させた形態にすることが重要である。キトサン−ＰＥＧナノ粒子（様々なＰＥＧ化度にある）を、５％濃度の低温保護剤、例えばグルコース、の存在下で凍結乾燥させることができる。他の通常の添加剤も存在できる。実際、凍結乾燥の前後における粒子径の測定は、大きく変動しない。言い換えると、ナノ粒子は、それらの中に変化を引き起こさずに、凍結乾燥および再懸濁させることができる（表Ｉ）。
【表１】
【００５３】
以下に、本発明の特徴および優位性を示す幾つかの例を記載するが、これらの例は、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００５４】
例１
キトサン−ＰＥＧナノ粒子の製造における最適化
キトサンに関して第ＷＯ９８０４２４４号に記載されているイオン性ゲル化技術により、キトサン−ＰＥＧナノ粒子ナノ粒子を製造した。具体的には、ＰＥＧ化度（ＰＥＧで官能化されるアミノ基の百分率）０．５％または１％のキトサンを先ず超純水に濃度１ｍｇ／ｍＬで溶解させた。ナノ粒子の形成に対するその可能な効果を研究するために、粒子径を製造する前に、ＮａＯＨを加えることにより、キトサン−ＰＥＧ溶液の初期ｐＨを４．５〜６．５に調整した。トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）を様々な濃度で溶解させ、２／１、３／１および４／１のキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比を得た。磁気攪拌しながら、ある決められた体積のＴＰＰ溶液（０．６ｍＬ）をある決められた体積のキトサン−ＰＥＧ溶液（１．５ｍＬ）に加えた後、ナノ粒子が自然に形成された。
【００５５】
キトサンＰＥＧ化度、重合体溶液のｐＨおよびキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比の、ナノ粒子サイズおよび多分散度に対する効果を図１Ａおよび１Ｂに示す。得られた結果から、ＰＥＧ化度０．５〜１％のキトサン−ＰＥＧナノ粒子が、広範囲な実験条件で容易に調製でき、ｐＨが、ナノ粒子サイズに対して最も大きな影響を及ぼすパラメータであると結論付けることができる。その上、ｐＨの影響は、ＰＥＧ化度が０．５から１％に増加した時に、より明らかである。
【００５６】
さらに、ナノ粒子サイズ分布も、キトサンのＰＥＧ化度により、ならびにキトサン−ＰＥＧ溶液のｐＨにより、影響を受ける。比較的低い多分散度を有する処方物を得るための最適キトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比は、明らかに３／１である。
【００５７】
ナノ粒子サイズは、その目的にZetasizer III (Malvern Instruments, Malvern, UK)を使用し、光子相関分光法より測定する。キトサン−ＰＥＧナノ粒子サイズは７０〜３１０ｎｍの範囲内であった。
【００５８】
例２
キトサンナノ粒子とキトサン−ＰＥＧナノ粒子の比較
表IIから分かるように、ＰＥＧ化によりキトサンの溶解度が変化する。これはナノ粒子の形成に影響する。典型的には６／１〜４／１にある最適キトサン／ＴＰＰ比が、キトサン−ＰＥＧの場合、典型的には４／１〜２／１の、より低い値にシフトする。これらの差は、恐らく、キトサンの化学的変性によるものであり、相互作用に利用できる基の変化を受け、イオノトロピー的ゲル化条件を変えることができる。
【表２】
【００５９】
ナノ粒子に関して、ＰＥＧ化されたキトサンから製造されたナノ粒子は、純粋なキトサンにより形成されたナノ粒子とは大きく異なっていることが観察できる。これを、キトサン、ＰＥＧ化度０．５％および１％（初期ｐＨ値における、その最適重合体比）のキトサン−ＰＥＧにより形成されたナノ粒子の特性を示す表IIIに示す。
【００６０】
ＰＥＧ化は、ナノ粒子サイズおよび表面電荷の著しい低下を引き起こす。後者の場合、ＰＥＧ化度が０．５％から１％に増加すると、表面電荷がさらに低下するので、ＰＥＧ化度も強い影響を及ぼす。
【表３】
【００６１】
例３
種々のＰＥＧ化度を有するＤＮＡ装填したキトサンの形成および特性試験
カプセル封入するために、ナノ粒子を形成する前にＴＰＰ溶液にプラスミドＤＮＡを配合した。次いで、このＤＮＡを含むＴＰＰ溶液をキトサン−ＰＥＧ溶液に加え、磁気攪拌しながら保持した。理論的ＤＮＡ装填量は、ナノ粒子の調製に使用したキトサン−ＰＥＧの総量（１ｍｇ）に対して５、１０または２０％であった。プラスミドＤＮＡのカプセル封入効率は、蛍光(Pico Green dsDNA染料）およびアガロースゲル電気泳動検定により、常に９０％を超えることが確認された。
【００６２】
表IV、ＶおよびVIは、様々なキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子の特性を示す。未装填ナノ粒子と同様に、ＰＥＧを含むＤＮＡ装填した処方物は、ＰＥＧを含まない処方物よりも、はるかに小さく、正の表面電荷が少ない。
【００６３】
すべての場合で、ＤＮＡの存在は、特に高ＤＮＡ百分率で、キャリヤーの特性を変化させ、その際、表面電荷が一般的に低下する。ナノ粒子サイズに関して、大きなＤＮＡ装填量は、より高度に架橋した構造を誘発し、粒子径の低下を引き起こす。これは、ＰＥＧ化されていないキャリヤーの場合に観察され、そこではサイズが約２７０〜３００ｎｍから２２０ｎｍに低下している。
【００６４】
しかし、ＰＥＧ化されたキャリヤーのサイズは、特にＰＥＧ化度０．５％のキトサン−ＰＥＧを使用する場合に、ＤＮＡ装填量と共に増加する。
【表４】
【表５】
【表６】
【００６５】
例４
インビトロプラスミドＤＮＡ放出
プラスミドＤＮＡは、キトサンおよびキトサン−ＰＥＧ粒子径と効果的に会合した。図２Ａおよび２Ｂに示すように、プラスミドＤＮＡを装填したナノ粒子を、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４、ｐＨ７．４）および精製水（ＭＱ）の両方で１ヶ月以上培養した時、プラスミドＤＮＡの放出は検出されない。
【００６６】
例５
酵素の存在下におけるインビトロプラスミドＤＮＡ放出
電気泳動分析（図３）から観察されるように、プラスミドＤＮＡを装填したナノ粒子を、キトサナーゼ（０．６ｍｇ／ｍＬ）の存在下、酢酸塩緩衝液ｐＨ６中で培養した時、プラスミドＤＮＡをキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子から放出させることができる。
【００６７】
これらの結果は、プラスミドＤＮＡがナノ粒子に効果的に会合しているが、重合体状キャリヤーが酵素により分解した時は放出されるので、プラスミドＤＮＡはナノ粒子に不可逆的に結合しているのではないことを示している。
【００６８】
例６
キトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合した（ＧＦＰ）プラスミドＤＮＡのトランスフェクションにおける効率
キトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子によるトランスフェクションの効率を、HEK 293細胞ラインモデルでＧＦＰプラスミドのコード化に関して評価した。
【００６９】
図４は、２０％プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）装填量を含む高分子量キトサンナノ粒子（１２５ｋＤａ、HMW CS NP）のトランスフェクションにおける効率に対する、キトサンＰＥＧ化度（０．５％および１％）により引き起こされる効果を示す。ウェルあたりのプラスミド投与量は１μｇであった。これらの結果は、０．５％ＰＥＧ化度が、これらのナノ粒子のトランスフェクション能力に対して好ましい効果を有することを示唆している。このＰＥＧ化度を、その後の実験に選択した。図４ｂに示す結果は、トランスフェクションの効果が、ナノ粒子のｐＤＮＡ装填量と共に増加することを特徴とする示している。この観察は、プラスミド投与量が一定（１μｇ）であり、従って、ｐＤＮＡ装填量が増加するにつれてナノ粒子投与量が低下するので、重要である。
【００７０】
トランスフェクションの効率に対するプラスミド装填量の影響は、低分子量キトサン−ＰＥＧナノ粒子（１０ｋＤａ、LMW CS-PEG NP）に対しても評価した。この場合、少ない装填量（５％）に対して高い発現レベルが観察された（図５ａ）。さらに、この少ない装填量（５％）に対して、ＰＥＧ化がトランスフェクションの効率に対して好ましくない効果を有することが観察された（図５ｂ）。
【００７１】
これらの実験の主な結論は、キトサンＰＥＧ化が、キトサンの分子量に応じて、好ましい（HMW CS-PEG NP）または好ましくない（LMW CS-PEG NP）効果を有するということである。
【００７２】
例７
カプセル封入したインスリンおよび遊離インスリンの、濃度１０Ｕ／ｋｇにおける鼻内投与の生物学的効果
インスリンをキトサンナノ粒子中にカプセル封入するために、インスリン２．４ｍｇをＮａＯＨ溶液中に予め溶解させ、次いでこれにＴＰＰ１．２ｍＬを加えた。この混合物をキトサン３ｍＬに加えた。磁気攪拌しながら５分後、この製剤を１０，０００ｇで４０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、沈殿物を緩衝液中に溶解させた。同じ処理をキトサン−ＰＥＧナノ粒子の調製にも行ったが、１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ４００をキトサン２ｍｇ／ｍＬに加えた。
【００７３】
光子相関分光分析により測定したキトサンナノ粒子の最終サイズは、６０５±１５ｎｍであるのに対し、キトサン−ＰＥＧナノ粒子の最終サイズは５９０±６ｎｍであった。
【００７４】
先ず、雄のWistarラット、体重２００〜２２０ｇ、に、クエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．５中のstreptozotocin注射（６５ｍｇ／ｋｇ i.v.）により、糖尿病を誘発させた。これらのラットは、３週間のstreptozotocinによる処理後、血糖濃度が４００ｍｇ／ｄｌを超えた時に糖尿病と見なされた。
【００７５】
給餌していないラットを使用して、この実験を行った。ラットを、ラットに投与する処方物に応じて異なったグループに分けた。様々な処方物は、比較用溶液（酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．３）、酢酸塩緩衝液に溶解させたインスリン、キトサン溶液に溶解させたインスリンおよびキトサンナノ粒子に会合したインスリンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合したインスリンからなり、インスリン濃度は体重１ｋｇあたり１０Ｕである。処方物は、ラットに仰臥位置でエーテルで麻酔をかけ、Eppendorfピペットを使用し、各鼻オリフィスに少量（１０〜２０μｌ）を入れることにより、投与した。次いで、麻酔が血中グルコースレベルに及ぼす恐れのある影響を防止するために、これらのラットを実験全体にわたって醒めた状態に維持した。
【００７６】
血中グルコースレベルを測定するために、血液試料を尾の静脈から、鼻内投与の前および１５分毎に、９０分間が過ぎるまで採取した。続いて、試料を、１時間毎に２〜７時間、および最後に鼻内投与から２４時間後に採取した。血中グルコースレベルは、グルコース分析装置(Chronolyss製のPrestige)を使用して直ちに測定した。実験中、ラットには給餌しなかった。
【００７７】
図６に示すように、酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．３、の鼻内投与により、血糖値が時間と共に徐々に、漸進的に減少し、比較値に対する最大の減少は投与後６時間であった。酢酸塩緩衝液中１０Ｕ／ｋｇインスリンの鼻内投与は、前の結果を大きく変えなかった。しかし、インスリンをキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合させた場合、血糖レベルは投与後僅か１５分間以内で１８％（ｐ＜０．０１）減少し、該投与から４５分間で最大減少４５〜５０％（それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）に達した。この減少は、鼻内投与から少なくとも７時間が経過した後も維持されることを強調しなければならない。血糖レベルの明らかな低下は、キトサンナノ粒子に会合したインスリンを鼻内投与した後にも観察された。この場合、血糖は、３０分から大きく低下し始め、特に１６％（ｐ＜０．０１）低下し、最大減少は、鼻内投与から２時間後に観察された３２％（ｐ＜０．００１）であった。血糖は、インスリンをキトサン溶液に溶解させた場合にも減少するが、その程度は、インスリンをキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合させた場合よりも、はるかに小さかった。
【００７８】
例８
インスリンを含むナノ粒子の、経口グルコース投与への血糖応答に対する効果
一晩給餌しなかった糖尿病ラットを使用し、この実験を行った。例７に記載した製剤のそれぞれをこれらのラットに鼻内投与した。１時間後、各グループのラットに、体重１ｋｇあたり２ｇのグルコースを経口投与した。グルコース投与の前および１０、２０、３０、６０、９０および１２０分後に尾の静脈から採取した試料の血液で血糖を測定した。
【００７９】
図７は、インスリンを含むナノ粒子の、経口グルコース投与への血糖応答に対する効果を示す。酢酸塩緩衝液を与えた比較用ラットでは、経口グルコース投与に続いて血糖が増加し、３０分後にその最大値１０５％（ｐ＜０．００１）に達した。続いて血糖は２時間にわたって徐々に低下した。酢酸塩緩衝液に溶解させたインスリン（１０Ｕ／ｋｇ）は、この結果を大きく変えなかった。
【００８０】
しかし、同じ量のキトサン溶液中インスリンは、グルコースに対する血糖応答を１８９％（ｐ＜０．０５）増加したのに対し、キトサンまたはキトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合したインスリンは、血糖応答をそれぞれ１９３％（ｐ＜０．０１）および２２５％（ｐ＜０．０１）増加した。
【００８１】
従って、分析した様々な処方物に基づくＡ．Ｕ．Ｃ．（曲線下の面積）を比較すると、最も効果的な製剤は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合したインスリンに対応する製剤であり、キトサンナノ粒子に会合したインスリンがその次であり、最後がキトサン溶液中のインスリン対応する製剤である。
【００８２】
これらの結果は、本発明に記載するキトサン−ＰＥＧナノ粒子の使用により、糖尿病ラットにおけるインスリン吸収が増加することを示している。実験結果は、キトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合しているインスリン（１０Ｕ／体重ｋｇ）が、鼻内放出後１５分から出発して少なくとも７時間まで血糖を著しく下げ、経口グルコース負荷が起きた時に血糖応答を改良することを示す。該ナノ粒子に会合しているインスリンが４Ｕ／ｋｇでは、それ程顕著な効果は見られない。
【００８３】
インスリンが、キトサンのみによって形成されたナノ粒子に会合している場合、あるいはインスリンがキトサンの溶液中にある場合、その効率は、インスリンがキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合している場合より低いのに対し、遊離のインスリンは、糖尿病ラットにおけるその鼻内放出の後、生物学的パラメータに対する重大な効果を発揮しない。
【００８４】
例９
ジフテリアトキソイド装填されたナノ粒子により引き起こされる免疫応答の生体内評価
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）をＴＰＰ溶液に配合することにより、ＤＴをキトサンまたはキトサン−ＰＥＧナノ粒子に会合させる（ＤＴ３００μｇ）。異なった量のＴＰＰ水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をキトサンまたはキトサン−ＰＥＧ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に磁気攪拌しながら加えることにより、ナノ粒子が自然に形成される。ＴＰＰ溶液の量は、キトサン：ＴＰＰ比８：１および２：１を達成するように計算した。キトサンは、その塩酸塩、脱アセチル化度８６％のProtosan C1（登録商標） 113およびProtosan C1（登録商標） 213として市販されている。５℃、１０，０００ｇで４０分間遠心分離することにより、キトサンナノ粒子を単離する。キトサン−ＰＥＧの場合、遠心分離ウルトラフィルター（Amicon（登録商標）ultra-4 100000 NMWL, Millipore）上に３８００ｇで３０分間かけてナノ粒子を集める。上澄み液を除去し、ナノ粒子をリン酸塩緩衝液を加えた食塩水、ｐＨ７．４、中に再懸濁させ、マウスに投与する。
【００８５】
キトサンおよびキトサン−ＰＥＧ処方物の免疫原性試験は、鼻内免疫法により行った。生後６週間の雄BALB/cマウスを使用した。マウスを５つのグループに分けた。２グループは、ＤＴ装填したキトサンナノ粒子（CS-113 C1、CS-213 C1）で処理し、１グループはＤＴ装填したキトサン−ＰＥＧナノ粒子で処理した。使用した投与量は、ナノ粒子１００μｇに配合したＤＴ１０μｇであり、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液１０μｌに取り、５μｌを各鼻オリフィスに投与する。もう一つのグループは、リン酸塩緩衝液を加えた食塩水、ｐＨ７．４中の遊離トキソイドで処理した。さらに、比較用として、１グループは、リン酸アルミニウム中に吸着させたＤＴＰ（ジフテリア、破傷風および百日咳）ワクチン（１０μｇ／マウス）を腹腔内投与した。この投与量を、意識があるラットに０、７および１４日に投与した。
【００８６】
血液試料をマウスの尾から、第一投与量の投与後１４、２８、４２、５６および７０日目に採取し、生体内免疫応答検定を行った。さらに、腸、気管支肺胞および唾液の洗浄試料(wash sample)も７０日目に採取した。唾液分泌は、ピロカルピン（５０μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射により誘発した。各マウスの初期唾液流の１００μＬアリコートを集めた。次いで、マウスを、ペントバルビタールで麻酔にかけ、殺した。気管支肺胞洗浄液は、静脈内カニューレを使用して洗浄媒体５ｍＬを気管の中に注入して肺を膨脹させ、吸入により得た。さらに、腸部分（十二指腸、空腸、回腸）を無菌的に取り出し、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭヨード酢酸および１０ｍＭ ＥＤＴＡの溶液４ｍＬ中に均質化した。これらの試料を遠心分離により清澄化し、アジ化ナトリウム、ＰＭＳＦおよびウシ血清を保存剤として加えた。抗体濃縮検定を行うまで、全試料を−２０℃で保存した。
【００８７】
血清および粘膜組織における抗体の応答評価は、ELISA試験により行った。マイクロプレート(DYNEX, immulon（登録商標）)を先ずｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液０．０５Ｍ中のＤＴ（４μｇ／ウェル）１００μＬで被覆した。工程間で、ウェルはｐＨ７．４のＰＢＳＴ（０．０１Ｍ ＰＢＳ、または５％ｖ／ｖのTween（登録商標）20を含むリン酸塩緩衝液）で３回洗浄した。非特異的反応を最少に抑えるために、ＰＢＳＴＭ（スキムミルク粉末５％ｖ／ｖおよび保存剤としてアジ化ナトリウム０．１％ｖ／ｖを含むＰＢＳＴ）を全てのウェルに加え、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳＴで洗浄した後、試料を２工程で連続的にＰＢＳＴＭで希釈し、プレートを３７℃でさらに２時間培養した。続いて、ヤギ抗−マウスＩｇＧ免疫グロブリンペルオキシダーゼ共役物１００μＬをＰＢＳＴＭ中１：２０００に希釈し、ウェルに加え、３７℃で２時間培養した。プレートを洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩５０μＬ（０．４５ｍｇ／ｍＬ）を基質としてｐＨ５．０のクエン酸塩リン酸塩緩衝液０．０５Ｍに加えた。発色（３７℃で３０分間）に続いて、プレートをマイクロプレートリーダー(3350-UV, Biorad)上、４５０ｎｍで読み取った。
【００８８】
鼻内免疫法に従って、ＤＴ装填したナノ粒子および比較用ＤＴ溶液により引き起こされた抗−ジフテリアＩｇＧレベルを図８に示す。この図は、腹腔内投与した市販の処方物（リン酸アルミニウムに吸収させたＤＴ）に対応する結果も示す。一般的に、これらの結果は、最初の１箇月の後、ＤＴ装填したナノ粒子に対して観察されたＩｇＧレベルは、流体ワクチンに対応する結果よりも著しく優れていることを示している（ｐ＜０．０５）。実際、これらの値は、非経口投与された、アジュバントとして使用された処方物（リン酸アルミニウムに吸収されたＤＴ）で得られた値に匹敵する。従って、これらの結果は、ナノ粒子を含む処方物のアジュバント効果を明らかに示している。もう一つの注目すべき観察は、増加し、長時間持続する免疫応答である。最後に、ナノ粒子組成物の影響に関して、キトサンの分子量は、キトサンナノ粒子により得られる免疫応答に何の影響も及ぼさないが、キトサンのＰＥＧ化は、ナノ粒子の効率に明らかな結果をもたらすことは重要である。実際、１箇月後、ＩｇＧレベルは、キトサン−ＰＥＧナノ粒子が、キトサンナノ粒子よりもはるかに大きい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１Ａは、ナノ粒子径に対する、キトサンＰＥＧ化度、重合体溶液のｐＨ、およびキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比の影響を示し、図１Ｂは、ナノ粒子径の多分散性に対する、キトサンＰＥＧ化度、重合体溶液のｐＨ、およびキトサン−ＰＥＧ／ＴＰＰ比の影響を示す。
【図２】図２Ａは、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４および７．４）および純水（ＭＱ）中で１日培養した後の、キトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合するプラズマＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示し、図２Ｂは、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４および７．４）および純水（ＭＱ）中で４週間培養した後の、キトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合するプラズマＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。
【図３】キトサナーゼの存在下でキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子と会合するプラズマＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。
【図４】図４Ａは、高分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するＰＥＧ化度の影響を示し、図４Ｂは、高分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するｐＤＮＡの影響を示す。
【図５】図５Ａは、低分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するｐＤＮＡの影響を示し、図５Ｂは、低分子量キトサン（ＣＳ）ナノ粒子のトランスフェクションにおける効率に対するＰＥＧ化度の影響を示す。
【図６】種々の処方物または酢酸塩緩衝液（比較）中に含まれるインスリン１０Ｕ／ｋｇを鼻内投与した後の血糖を示す。血糖は、基底線値に対する％で、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示す。下記の値は、様々な投与の前の基底線値である。酢酸塩緩衝剤（黒四角）４２３±１６ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７）、インスリン（□）４３０±１５ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７）、キトサン溶液中のインスリン（●）４３９±１２ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝８）、キトサンナノ粒子（◆）４６９±１４ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７）、キトサン−ＰＥＧナノ粒子（○）４５８±２１ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝８）。
【図７】インスリンまたは酢酸塩緩衝液を含む処方物を、一晩給餌しなかった糖尿病のラットに鼻内投与した後の、グルコース耐性を示す。グルコース（体重１ｋｇあたり２ｇ）は、鼻内投与した後０および１時間後に胃内投与した。酢酸塩緩衝剤（黒四角）（ｎ＝１０）、インスリン（□）（ｎ＝６）、キトサン溶液中のインスリン（●）（ｎ＝６）、キトサンナノ粒子（◆）（ｎ＝６）、キトサン−ＰＥＧナノ粒子（○）（ｎ＝６）。
【図８】種々のキトサンおよびキトサン−ＰＥＧナノ粒子処方物中に配合したＴＤ１０μｇを鼻内投与した後、０、７および１４日後の、マウスの血清中のＩｇＧ抗ＴＤの最終タイターを示す（ｎ＝６）。ＩＮは鼻内、ＩＰは腹腔内を表す。＊ 統計的に重大な差（α＜０．５）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、
前記ナノ粒子が、
ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、および
ｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる
共役物を含んでなり、
前記両成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする、系。
【請求項２】
前記キトサンまたはキトサン誘導体のポリエチレングリコールに対する比率が、好ましくは７５重量％を超える、請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールの比率が、好ましくは２５重量％未満である、請求項１に記載の系。
【請求項４】
前記キトサンの重合度、またはキトサン若しくはキトサン誘導体を構成する単量体単位の数が、３０〜３０００、好ましくは６０〜６００である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の系。
【請求項５】
前記キトサンまたはキトサン誘導体の分子量が、５〜２０００ｋＤａ、好ましくは１０〜５００ｋＤａ、より好ましくは１０〜１００ｋＤａである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の系。
【請求項６】
前記キトサンまたはキトサン誘導体の脱アセチル化度が、３０〜９５％、好ましくは６０〜９５％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の系。
【請求項７】
前記ＰＥＧが、下記式(III)：
【化１】
（式中、Ｘ１はヒドロキシルラジカル保護基であり、Ｘ２は、水素または前記キトサンアミノ基に固定できるブリッジ基であり、ｐは重合度である。）
を有する変性されたＰＥＧである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の系。
【請求項８】
Ｘ１がアルキル基、好ましくはメチルである、請求項７に記載の系。
【請求項９】
前記ＰＥＧの重合度が５０〜５００である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の系。
【請求項１０】
前記ＰＥＧの分子量が２〜２０ｋＤａ、好ましくは５〜１０ｋＤａである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の系。
【請求項１１】
前記キトサンアミノ基またはキトサン誘導体のアミノ基のＰＥＧによる官能化が、０．１〜５％、好ましくは０．５〜１％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の系。
【請求項１２】
低分子量薬物、多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチド、および核酸、ならびにそれらの組合せからなる群から選択された、生物学的に活性な分子をさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の系。
【請求項１３】
前記架橋剤が、ポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウムである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の系。
【請求項１４】
前記ナノ粒子の平均粒子径が、１〜９９９ナノメートル、好ましくは５０〜８００ｎｍである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の系。
【請求項１５】
電荷（Ｚ電位）が、＋０．１〜＋５０ｍＶ、好ましくは＋１〜＋４０ｍＶである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の系。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系と、病気を予防、緩和または治癒させることができる生物学的に活性な分子とを含んでなる、薬剤組成物。
【請求項１７】
経口、バッカル、舌下、局所、経皮、眼内、鼻内、膣内、または非経口投与するための、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記生物学的に活性な分子が、多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチド、核酸、およびそれらの組合せから選択されるものである、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記生物学的に活性な分子が、インスリン、ヘパリン、タンパク質、抗原、またはＤＮＡプラスミドである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系のような、生物学的に活性な分子を放出するための系を含んでなる、化粧品組成物。
【請求項２１】
前記活性分子が、抗ニキビ剤、抗真菌剤、酸化防止剤、脱臭剤、制汗薬、ふけ防止剤、皮膚白色化剤、タンニン酸処理剤、ＵＶ光吸収剤、酵素および化粧品用殺菌剤から選択されるものである、請求項２０に記載の化粧品組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系のような、生物学的に活性な分子を放出するための系と抗原とを含んでなる、ワクチン。
【請求項２３】
前記抗原が、タンパク質、多糖、およびＤＮＡ分子から選択されるものである、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記抗原が、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドである、請求項２２または２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の、生物学的に活性な分子を制御放出するための系を製造する方法であって、
ａ）キトサン−ＰＥＧ共役物水溶液を調製すること、
ｂ）架橋剤水溶液を調製すること、および
ｃ）前記工程ａ）およびｂ）の溶液を攪拌しながら混合して、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧナノ粒子が自発的に形成され、次いで沈殿すること、
を含んでなる、方法。
【請求項２６】
前記架橋剤が、トリポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウムである、請求項２５に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項２７】
前記生物学的に活性な分子が、前記ａ）またはｂ）において予め溶解されているか、若しくは前記ａ）またはｂ）に添加される別の水相または有機相に予め溶解されている、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的に活性な分子が、インスリン、ヘパリン、ＤＮＡプラスミド、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドから選択されるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項１】
生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、
前記ナノ粒子が、
ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、および
ｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる
共役物を含んでなり、
前記両成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする、系。
【請求項２】
前記キトサンまたはキトサン誘導体のポリエチレングリコールに対する比率が、好ましくは７５重量％を超える、請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールの比率が、好ましくは２５重量％未満である、請求項１に記載の系。
【請求項４】
前記キトサンの重合度、またはキトサン若しくはキトサン誘導体を構成する単量体単位の数が、３０〜３０００、好ましくは６０〜６００である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の系。
【請求項５】
前記キトサンまたはキトサン誘導体の分子量が、５〜２０００ｋＤａ、好ましくは１０〜５００ｋＤａ、より好ましくは１０〜１００ｋＤａである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の系。
【請求項６】
前記キトサンまたはキトサン誘導体の脱アセチル化度が、３０〜９５％、好ましくは６０〜９５％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の系。
【請求項７】
前記ＰＥＧが、下記式(III)：
【化１】
（式中、Ｘ１はヒドロキシルラジカル保護基であり、Ｘ２は、水素または前記キトサンアミノ基に固定できるブリッジ基であり、ｐは重合度である。）
を有する変性されたＰＥＧである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の系。
【請求項８】
Ｘ１がアルキル基、好ましくはメチルである、請求項７に記載の系。
【請求項９】
前記ＰＥＧの重合度が５０〜５００である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の系。
【請求項１０】
前記ＰＥＧの分子量が２〜２０ｋＤａ、好ましくは５〜１０ｋＤａである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の系。
【請求項１１】
前記キトサンアミノ基またはキトサン誘導体のアミノ基のＰＥＧによる官能化が、０．１〜５％、好ましくは０．５〜１％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の系。
【請求項１２】
低分子量薬物、多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチド、および核酸、ならびにそれらの組合せからなる群から選択された、生物学的に活性な分子をさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の系。
【請求項１３】
前記架橋剤が、ポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウムである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の系。
【請求項１４】
前記ナノ粒子の平均粒子径が、１〜９９９ナノメートル、好ましくは５０〜８００ｎｍである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の系。
【請求項１５】
電荷（Ｚ電位）が、＋０．１〜＋５０ｍＶ、好ましくは＋１〜＋４０ｍＶである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の系。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系と、病気を予防、緩和または治癒させることができる生物学的に活性な分子とを含んでなる、薬剤組成物。
【請求項１７】
経口、バッカル、舌下、局所、経皮、眼内、鼻内、膣内、または非経口投与するための、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記生物学的に活性な分子が、多糖、タンパク質、ペプチド、リピド、オリゴヌクレオチド、核酸、およびそれらの組合せから選択されるものである、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記生物学的に活性な分子が、インスリン、ヘパリン、タンパク質、抗原、またはＤＮＡプラスミドである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系のような、生物学的に活性な分子を放出するための系を含んでなる、化粧品組成物。
【請求項２１】
前記活性分子が、抗ニキビ剤、抗真菌剤、酸化防止剤、脱臭剤、制汗薬、ふけ防止剤、皮膚白色化剤、タンニン酸処理剤、ＵＶ光吸収剤、酵素および化粧品用殺菌剤から選択されるものである、請求項２０に記載の化粧品組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系のような、生物学的に活性な分子を放出するための系と抗原とを含んでなる、ワクチン。
【請求項２３】
前記抗原が、タンパク質、多糖、およびＤＮＡ分子から選択されるものである、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記抗原が、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドである、請求項２２または２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の、生物学的に活性な分子を制御放出するための系を製造する方法であって、
ａ）キトサン−ＰＥＧ共役物水溶液を調製すること、
ｂ）架橋剤水溶液を調製すること、および
ｃ）前記工程ａ）およびｂ）の溶液を攪拌しながら混合して、イオン性ゲル化によりキトサン−ＰＥＧナノ粒子が自発的に形成され、次いで沈殿すること、
を含んでなる、方法。
【請求項２６】
前記架橋剤が、トリポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウムである、請求項２５に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項２７】
前記生物学的に活性な分子が、前記ａ）またはｂ）において予め溶解されているか、若しくは前記ａ）またはｂ）に添加される別の水相または有機相に予め溶解されている、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的に活性な分子が、インスリン、ヘパリン、ＤＮＡプラスミド、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドから選択されるものである、請求項２７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５３３１０８（Ｐ２００８−５３３１０８Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０１３３８（Ｐ２００８−５０１３３８）
【出願日】平成１８年３月１４日（２００６．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９７５５８
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０４３５５７８９）アドバンスド、イン、ビートロウ、セル、テクノロジーズ、ソシエダッド、リミターダ (9)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１４日（２００６．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９７５５８
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０４３５５７８９）アドバンスド、イン、ビートロウ、セル、テクノロジーズ、ソシエダッド、リミターダ (9)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
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