生物材料およびその使用
【課題】ガンでない疾患を治療および／または予防する方法の提供
【解決手段】本発明は、自己免疫疾患またはアレルギー疾患といったガンでない病因の病態の治療において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
または 関係する原核細胞に由来するおよそ６０ｋＤａ ポリペプチド （またはそれをコ
ードする 核酸分子） または機能的に等価な分子またはそのフラグメントの医薬組成物のいずれかを、治療的または予防的に有効である一の用量、または複数の用量を投与することを含む、上記疾患を治療および／または予防する方法に関する。適当な免疫治療用の処置剤／ワクチン製剤用のアジュバントとして、図１のヌクレオチド配列の核酸分子、抗原ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する組成物の使用の方法が提供される。
【解決手段】本発明は、自己免疫疾患またはアレルギー疾患といったガンでない病因の病態の治療において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
または 関係する原核細胞に由来するおよそ６０ｋＤａ ポリペプチド （またはそれをコ
ードする 核酸分子） または機能的に等価な分子またはそのフラグメントの医薬組成物のいずれかを、治療的または予防的に有効である一の用量、または複数の用量を投与することを含む、上記疾患を治療および／または予防する方法に関する。適当な免疫治療用の処置剤／ワクチン製剤用のアジュバントとして、図１のヌクレオチド配列の核酸分子、抗原ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する組成物の使用の方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば自己免疫疾患、骨粗そう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、アレルギー疾患または免疫亢進病態、とりわけ喘息、および／またはＴヘルパー リンパ球２（
Ｔｈ２）−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）に関係する病態といったガンでない病態の治療および予防において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または 関係する原核細胞に由来するおよそ６０ｋＤａ ポリペプチド （またはそれをコードする 核酸分子） または機能的に等価な分子またはそのフラグメントの使用、ならびに免疫応答メディエーター、たとえばサイトカインのインビトロまたはインビボでの産生を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫は、「自己」寛容の喪失を反映し、正常細胞または組織の不適切な破壊に至る。多数の病態で自己抗体が見出されるが、疾患の原因というよりも効果を反映するかも知れない。しかしながら、ある疾患では自己抗体が、最初の主要かつ唯一の検出可能な異常であろう。このことに関係している分子の一つの集団は、高度に免疫原性であるシャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）である。シャペロニンは、分子シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）と呼ばれるタン白質のグループに属する。分子シャペロンは、ネイティブでないタン白質に結合し、このタン白質がＡＴＰ−依存性の触媒プロセスで、機能的タン白質に要求される正確な３次元形態に折りたたまれるように、補助する。
【０００３】
シャペロニンは単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、マクロファージ、線維芽細胞様の細胞、おそらく他のタイプの細胞およびＴ細胞を含め、多くのレベルで免疫（器官）系を同時に刺激すると信じられている。哺乳類における免疫防御は、「自然」および「適応」の防御に分けられる。ファゴサイト（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）、ナチュラルキラー細胞および補体といった既に適所にある細胞は、自然免疫であると見なされる。抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の際には、適応免疫がＢおよび Ｔリンパ球の形態で活性化される。 シャペロニンは、自然防御メカニズム、具体的にはファゴサイトに直接的に作用することが知られている。シャペロニンは、強力な適応免疫の応答を刺激する。すなわち抗体産生、ならびにある場合には防御的であるＴリンパ球の刺激である。特にシャペロニンは、宿主防御に重要と考えられているサイトカイン分泌を誘導する。しかし、ある場合にはシャペロニンの存在が宿主に損害を与えるとも信じられている。
【０００４】
自己免疫疾患におけるシャペロニンの役割は、議論が分れるところである。シャペロニンを含有する生物での感染／免疫は、普遍的であり、健康な人々は、 自己シャペロニン
に対してＴ細胞応答を示すが、シャペロニン特異的抗体の産生を含め、古典的な自己免疫疾患は、極めて稀である。シャペロニンに対する免疫反応の存在は、偶発的であり重要ではないかも知れない。しかしながら分子的模倣の理論は、自己免疫疾患におけるシャペロニンの関わりを示唆し、微生物および哺乳類起源のシャペロニン間で、アミノ酸配列の高いレベルの保存性に依拠する。この理論は、広範囲の微生物との感染の間に、微生物および哺乳類との間で共有されるシャペロニンエピトープは、Ｔ リンパ球を刺激することを
提案する。 この理論によれば、共有されたシャペロニンエピトープによる高レベルのシ
ャペロニン提示が、自己シャペロニンに対する寛容を破壊しおよび自己免疫疾患が発症する。
【０００５】
腫瘍から得られるシャペロニンは、これらの腫瘍に対する壊死的効果となることが判った。これは、腫瘍の抗原が免疫認識を増強することにより起こることが示唆されているが、その機構は知られていない。よって、シャペロニンは、細菌感染およびガンに対し防御
的な適応免疫を誘導するようである。
【０００６】
アレルギー反応、たとえば喘息では、均衡的に不適切である免疫応答か、または対象を誤った免疫応答が関係する。たとえば喘息の蔓延は増大しているが、あらゆるケースを治療する有効な治療法はまだ見出されていない。現在の治療は、往々に免疫抑制のグルココルチコステロイド（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ベータ・アゴニスト、クロモグリケート（ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）、ロイコトリエン調節物質（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）など、多数の副作用を有するものを使用する。
【０００７】
そのようなアレルギー反応においては、ＩｇＥ レベルが高くなり、またＴ ヘルパー
リンパ球−２ （Ｔｈ２） 免疫応答が Ｔｈｌ応答を圧倒し、結果的に炎症性の応答とな
る。Ｔｈｌ 応答は、主に微生物感染に対する防御であると考えられ、サイトカイン、具
体的にはインターロイキン−１２ （ＩＬ−１２）、ＩＬ−２ および インターフェロン
−γによって促進される。対照的に、Ｔｈ２応答は、適当な遺伝的基盤においてアレルギー性の有害な組織損傷に関係している。
【０００８】
しかし、自己免疫疾患、たとえば アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ） 関節炎といった他の病態では、過剰 Ｔｈｌ応答が、疾患の原因であることが示唆されている。したがっ
てＴｈｌ応答のＴｈ２への転換またはＴｈ２応答のＴｈｌへの転換は、上記疾患を治療する上で有用性がある。
【０００９】
Ｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ 、Ｍ． ｂｏｖｉｓ および結核菌といった細菌は、
Ｔｈ２応答を Ｔｈｌ応答に転換することができることが知られているが、この転換を担
う分子は同定されていない。
【００１０】
しかしながら、当業界における示唆は、Ｔｈｌ応答を誘導できる Ｍ． Ｌｅｐｒａｅ
からのヒートショックタン白質、 ｈｓｐ６５を意味している （Ｌｏｗｒｉｅ ら、 １９９９、 Ｎａｔｕｒｅ、４００、ｐ２６９−２７１； Ｂｏｎａｔｏら、１９９８、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６、Ｐ１６９−１７５）。
【００１１】
結核菌に由来する相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）、 ｈｓｐ６５は、前炎症性サイト
カインを産生するようにヒト単球を刺激し、ならびに単球およびヒトの血管系の血管内皮細胞を活性化する能力を有する（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ ら、１９９３、Ｃｌｉｎ． Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１、 ｐ５８６２； Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓら、１９９５、 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３、ｐ３４５４−３４５８； Ｖｅｒｄｅｇａａｌら、１９
９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、ｐ３６９−３７６）。
【００１２】
驚くことに、ヒートショックタン白質またはシャペロニンであるとはまだ知られていない別のタン白質が、一個体の免疫に影響を及ぼすことができ、しかもそれが自己免疫疾患、免疫亢進病態またはアレルギー疾患、とりわけ喘息、および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といったガンではない病態を治療しまたは予防するために用い得ることが今や知られている。
【００１３】
機能が知られていないこのタン白質が結核菌において同定され、配列決定がなされた（Ｋｏｎｇ ら、 １９９３、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、 ９０、 ｐ２６０８−２６１２）。 これに匹敵するタン白質が、Ｍ． ｂｏｖｉｓ および Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａを含む、様々な他の細菌に存在することが知られている。それは、シャペロニン ６０．１（ｃｐｎ ６０．１）と名づけられたが、この命名の採用は、単に他のシャペロニンに対するそのアミノ酸配列同一性に基づくだけである。
【００１４】
シャペロニン６０．２（同一起源から） は、後記するアライメント配列方法を用いる
とｃｐｎ ６０．１に対して、５９．６０％ のアミノ酸配列同一性および ６５．６％ の核酸配列同一性を示す。ｃｐｎ ６０．１と共通してＣｐｎ ６０．２ は、確認されたシ
ャペロニン性質を持たない。シャペロニンは、互いに向き合い、約１０ｋＤａモノマー（ｃｐｎ １０により生成）からなる環ヘプタマーでキャップされた２ 環ヘプタマー（約６０ｋＤａのモノマーからなる）を形成することにより機能すると信じられている。
【００１５】
支援を受ける折りたたみは、標的タン白質が、一旦、中心コア内に入り込んで行なわれ、その後、放出される。したがって、ヘプタマー形成は、目下理解されているシャペロニンの機能には必須であるようである。しかしながら、他の種からのｃｐｎ６０と異なり、結核菌ｃｐｎ ６０．１のヘプタマーを産生することが可能であるとはわかっていない。
さらにＧｒｏＥ シャペロニン 折りたたみ装置とは異なりｃｐｎ ６０．１ 遺伝子もｃｐｎ ６０．２ 遺伝子も、いずれもシャペロニンｃｐｎ １０ 遺伝子とは同一オペロン内にはなく、このため、シャペロニン複合体の形成に必要な構成要素の転写は、同じ制御機構のもとにはない。
【００１６】
ｃｐｎ ６０．１ タン白質は、グリシンおよびメチオニンに富む配列を通常に有する他の種からのｃｐｎ ６０とは異なり、Ｃ−末端で特異なヒスチジンの多い配列を有するこ
とが観察されてきた。６０．２ タン白質は、公知のヒートショックタン白質であり、他
の種のヒートショックタン白質に対し、極めて高い相同性を有する。具体的には、Ｍ．ｌｅｐｒａｅからの同じタン白質に対し、９５％ の同一性を示す。上記の通り、ｃｐｎ ６０．２は、結核菌のゲノム上で ｃｐｎ ６０．１とは離れて位置していて、異なる転写制御を受けている。結果的に、ｃｐｎ ６０．１がヒートショック タン白質またはシャペロニンのいずれかであることを示す証拠はない。これらの事実は、結核菌においてｃｐｎ６０タン白質類が異なる機能的役割を有することを強く示唆するものである。
【発明の開示】
【００１７】
よって、本発明は、自己免疫疾患、免疫亢進病態を含む病態、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない様々な病態を治療しまたは予防において、増強された性質を持つｃｐｎ ６０．１といった分子を提供する。治療および／または予防的応用は、以下に詳
細に説明を加える核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。
【００１８】
かくして 本発明は、最初の面として核酸分子を含む医薬組成物を提供し、 このものは、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える または ９５％の 同一性（後記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図１のヌクレオチド配列によりコードされる配列と機能的に等価なタン白質をコードする配列、または
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント
を含む核酸分子、さらに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００１９】
上述のように、治療および／または予防的効果は、核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。よって、本発明は、次の局面としてポリペプチドを含む医薬組成物を提供し、このものは、
（ｉ） 図１のアミノ酸配列 、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（後記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、または
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列の機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００２０】
本発明による「核酸分子」は、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
機能的に等価なポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列の誘導体は、技術上、周知である通常の方法を用いて得ることができる。
【００２１】
本発明に使用される核酸分子は、図１に由来する配列だけからなるもの（または関連する機能的に等価な配列）であってもよく、あるいは構造上もしくは機能上の配列、具体的には転写および／または発現（特に哺乳類細胞において）を制御する配列、あるいは、たとえば分泌シグナルとして作用する特異的性質を有する融合タン白質を形成する付加的なタン白質部分のための配列を含む、追加の配列などを包含することができる。かくして、たとえば、上記配列は本明細書で記載した核酸分子を含むベクターの形態にあってもよい。好適なベクターとして、プラスミドおよび ウィルスがある。
【００２２】
本明細書でいう「ポリペプチド」には、完全長のタン白質のほか、より短い鎖長のペプチド 配列、たとえば本明細書で記載するタン白質フラグメントのいずれも含まれる。そ
うしたポリペプチドは、任意の便利な手段により調製することができる。たとえば原核生物起源からの単離により、あるいは発現制御配列を作動的に結合させた適当な核酸分子を宿主細胞で発現させるか、またはそのような組換えＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡクローニングベヒクルもしくはベクターを発現させる組換え手段により、あるいは化学的または生化学的な合成 （細胞外）により調製することができる。
【００２３】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書でいう「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、ｐ４６７３− ４６８０）：
ペア方式アライメント・パラメータ−方法：ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 Ｇａｐ ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６；
多重アライメント・パラメーター−マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 ％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｎｅｇａｔ
ｉｖｅ マトリックス： ｎｏ、 Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６、 ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ： ０．５．
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう （Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎら、１９９４、上掲）：
ペア方式アライメント・パラメーター−方法： ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＰＡＭ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １０．００、 Ｇａｐ ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ０．１０；
多重アライメント・パラメーター−マトリックス： ＰＡＭ、Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａ
ｌｔｙ： １０．００、 ％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｐｅｎａｌ
ｉｚｅ ｅｎｄ ｇａｐｓ： ｏｎ、 Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ： ０、 Ｎｅｇａｔｉｖｅ マトリックス： ｎｏ、 Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌ
ｔｙ： ０．２０、 Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：
ｏｎ、 Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ： ｏｎ、 親水性残基： ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。
【００２４】
特定残基における配列同一性は、簡単に誘導された同一残基を含むようにされている。
「機能的に等価な」タン白質またはタン白質フラグメントとは、図１のアミノ酸配列に関係するか、またはそれから誘導されるものであり、そのアミノ酸配列は、単一もしくは複数のアミノ酸 （具体的には １〜５０、たとえば１０〜３０、 好ましくは１〜５塩基
）の置換、付加および／または欠失により修飾されているが、それにもかかわらず該アミノ酸配列は機能的活性を保持している。たとえば、オボアルブミン誘導好酸球増加症（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）を抑制し、具体的には
１０ ％を超える、好ましくは２５％を超える、とくに好ましくは ５０％を超える程度まで 好酸球数を減少させ、および／または特定のサイトカイン、具体的にはインターロイ
キン−１β （ＩＬ−１β）、ＩＬ−２、ＩＬ− ６、ＩＬ−８、 ＩＬ−１０、ＩＬ−１
２、ＩＬ−１２レセプター、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦα）、インターフェロン−γおよび
顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ− ＣＳＦ）の産生を増加させ、たとえば正常レベルの１０倍を超える、好ましくは１００倍を超える増加であり、および／またはＴＨ１応答の刺激である。
【００２５】
サイトカイン刺激は、様々な方法により測定できる。たとえば、バッフィコート血液をＰＢＳ−２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で３倍に希釈する。その３０ ｍｌを１５ ｍｌ の Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ （Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７）上に重層し、室温で３０ 分
間、 ７００ ｇ （１８００ｒｐｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機）で遠心分離する。注意
深く単核細胞の層を吸引してその細胞を２回ＰＢＳで洗浄する。該細胞は、最終的に、２
ｘ １０６ 細胞／ｍｌに懸濁する。ＰＢＭＣは、次に ２ ｘ １０６ 細胞／ウェル濃度
で、２％ ＦＣＳ、グルタミンおよびＰｅｎ／ｓｔｒｅｐを含む ＲＰＭＩ 培地に播種す
る。１時間インキュベートして、単球をプレート表面に付着させる。該プレートは１回ＰＢＳで洗浄する。
【００２６】
Ｔ 細胞を枯渇させたＰＢＭＣは、最初にＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ試薬（Ｓｔｅｍｃｅｌ
ｌ）とともに２０分間、室温でインキュベートすることを除き、同様にして得ることができる。
【００２７】
サイトカインのアッセイは、当業者の知識の範囲内にある。たとえば、ＩＬ６ および ＩＬ８ 産生は、細胞の上清をそれぞれ １／１０ および １／１００に希釈してから測定できる。ペアの抗体および標準抗体は、国立生物標準規格研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）から入手でき、推奨された通り使用する。
【００２８】
サンプル調製は次の通りにしてできる： Ｃｐｎ６０．１ および Ｃｐｎ６０．２は、 Ｌｉｏｎｅｘ （ドイツ）から入手できる。両タン白質は、煮沸またはオートクレーブに
かける前にＰＢＳ中に２００ μｇ／ｍｌ 濃度に希釈する。煮沸サンプルは、１００°Ｃ、 ２０ 分間インキュベーションし、次いで氷上に直接置くことにより得られる。オートクレーブ処理サンプルは、１２０°Ｃで ２０分間、２回オートクレーブにかけることで
得られる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４−２０％ グラジエントゲル （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）上で実施できる。プレ染色タン白質マーカーは、 Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社か
ら得られる Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ
である。ＦＡＣＳ 分析は、ＦａｃｓＣａｎ装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
およびＷｉｎＭＤＩプログラム、バージョン２．８を用いてデータを解析することにより実施できる。
【００２９】
アミノおよび／またはカルボキシル末端融合タン白質またはポリペプチドは、「付加」変異体の意味の中に含まれ、ポリペプチド配列に融合した、付加的なタン白質またはポリペプチドを含む。
【００３０】
とりわけ好ましいのは、生物変異体といった自然界に生じる等価体であり、たとえばアレルの、地理上のまたはアロタイプの変異体および公知の技術を用いて調製される誘導体である。たとえば、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、化学的ペプチド合成、部位特異的突然変異、ランダム突然変異または酵素的開裂および／または核酸の連結といった公知の技術を用いる組換え体の形態のうち、いずれかの方法で調製できる。
【００３１】
本発明は、異なる原核生物からの等価体および関係する分子に向けられる。たとえば細菌の属、種または株から、とりわけＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、具体的には 結核菌
、Ｍ． ｂｏｖｉｓおよび Ｍ． ａｆｒｉｃａｎｕｍを含む結核菌複合体からの等価体で
ある。そうした配列自体も修飾されていてもよく、特に機能を保持して提供される誘導体化である。
【００３２】
タン白質の誘導体は、合成／単離後の修飾あるいはたとえば修飾残基を用いる合成中の修飾、あるいは適切であれば修飾核酸分子の発現により調製できる。
本発明の機能的に等価なフラグメントは、切り詰めによるもの（Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）であってもよく、たとえばＮおよび／またはＣ末端からのペプチドの除去、あるいは適切な活性のあるドメイン領域、たとえば機能を保持しているエピトープ領域の選択による。そのようなフラグメントは、図１の配列から誘導されてもよく、あるいは図１に開示されたものと機能的に等価なタン白質から誘導されてもよい。
【００３３】
機能的フラグメントが選択される場合、それらのフラグメントは、元の分子に帰される機能を必ずしも示す必要はないことは理解されるであろう。したがって、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、関係のある機能的特性を保持するものであり、そのためフラグメントは、本発明による有用性、具体的には上記のように、好酸球増加症の抑制、特定サイトカイン産生の増加および／またはＴｈｌ免疫応答の刺激を保持する。
【００３４】
好ましくは、上記フラグメントは、鎖長６〜４００ 残基、具体的には６〜１００また
は１５〜１００ 残基、 好ましくは ６〜３０、１０〜２５、１５〜５０または１５〜３
０残基である。とくに好ましいフラグメントは以下の残基に由来するか、または以下の残基からなる：
1-8 MSKLIEYD、 (8)
14-21 AMEVGMDK (8)
40-48 AKAFGGPTV、 (9)
64-71 PFEDLGAQ、 (8)
96-105 QALIKGGLRL、 (11)
110-129 VNPIALGVGIGKAADAVSEA、 (20)
132-143 ASATPVSGKTGI、 (12)
144-155 AQVATVSSRDEQ、 (12)
160-175 VGEAMSKVGHDGWSV (16)
179-200 STLGTELEFTEGIGFDKGFLSA、 (22)
195-219 KGFLSAYFVTDFDNQQAVLEDALIL、 (25)
206-219 FDNQQAVLEDALIL、 (14)
221-229 HQDKISSLP、 (9)
264-271 AIRKTLKA、 (8)
276-293 GPYFGDRRKAFLEDLAW、 (18)
299-314 VNPDAGMVLREVGLEV、 (16)
315-326 LGSARRVVVSKD (12)
327-342 DTVIVDGGGTAEAVAN、 (16)
343-353 RAKHLRAEIDK、 (11)
379-391 VGAATETALKERK (13)
392-400 ESVEDAVAA、 (9)
411-433 PGGGASLIHQARKALTELRASLT、 (23)
434-449 GPEVLGVDVFSEALAA、 (16)
450-463 PLFWIAANAGLDGS、 (14)
464-471 VVVNKVSE、 (8)
480-494 VNTLSYGDLAADGVI、 (15)
501-526 RSAVLNASSVARMVLTTETVVVDKPA、 (15)
526-539 KAEDHDHHHGHAH (14)。
図１に掲げられた配列に対し、機能的に等価な核酸の配列／フラグメントは、本発明の組成物にも使用される。これらの配列は、コードする（上記に定義したように）機能的に等価なタン白質／ペプチドに関して明確にされる。
【００３５】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」は、非ストリンジェント条件 （６ ｘ
ＳＳＣ／５０％ ホルムアミド、室温） で結合し、ならびに高ストリンジェンシーな条
件、すなわち ２ ｘ ＳＳＣ、 ６５°Ｃ （ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０． ０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、 ｐＨ７．２）で洗浄される配列である。
【００３６】
本明細書で述べる「製剤的に許容される」は、生理学的に許容される賦形剤のみならず、組成物の他の成分と共存できる成分について言う。
本発明に基づく医薬製剤は、容易に入手できる成分を用いて、従来の方式で処方することができる。したがって活性のある成分（すなわち、核酸分子またはタン白質／ペプチド）を、必要に応じて他の活性物質ならびに１つ以上の通常使用される担体、希釈剤および／または賦形剤と一緒に含有して、錠剤、ピル、 散剤、トローチ剤、小袋剤、カシェ剤
、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、 シロップ剤、エアゾル剤 （固体としてまたは液体媒体中に）、軟膏剤、軟および硬ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射溶液、無菌包装散剤などといった通常のガレヌス（ｇａｌｅｎｉｃ）製剤を形成することができる。
【００３７】
上記のような組成物には前記の核酸分子、ポリペプチドの作用を支援するか、または増強する分子を追加して含んでいてもよい。たとえばサリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）（およびその類縁体）、低用量のシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、 ＬＰＳ、 サイトカイン、 ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ） ＣｐＧ オ
リゴデオキシヌクレオチドおよび他の免疫調節薬および／または抗炎症性剤、たとえばサイトカイン・アンタゴニストまたはグルココルチコステロイドである。
【００３８】
したがってたとえば上記組成物は、特別の免疫治療のために活性のある成分と一緒に使用してもよい。本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドを含む、適当な免疫治療用の処置剤／ワクチン製剤には、サブユニット・ワクチンあるいは細胞特異的抗原、関係した抗原もしくは抗体または抗イディオタイプ・抗体に基づく処置剤または治療またはワクチン接種用の細胞全体の調製物が挙げられる。治療またはワクチン接種に使用される場合、本明細書で記載した核酸分子またはポリペプチドは、抗原に対する特定の免疫応答をもたらす該抗原を提供する（またはコードする）ことができ、および／または一般的で非特異的な免疫応答となるかも知れない。後者の場合、他の活性成分を含む組成物を用いる際、本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドは、アジュバントとして作用し、したがってこの目的に使用できる。
【００３９】
予防用または治療用の製剤は、１つ以上の製剤学的に許容される担体または希釈剤の存在下で１つ以上の好適なアジュバント、たとえば不完全フロインドアジュバント、ＢＣＧ、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、水酸化アルミニウム、サポニン、ｑｕｉｌ Ａ 、またはそれらのさらに精製された形態、ムラミルジペプチド、鉱油または植物油、ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）または非イオン性のブロックコポリマーまたは ＤＥＡＥ デキストラン、を含むように処方してもよい。好適な担体には、生理食塩水溶液といった液体媒体が含まれる。
【００４０】
好適な担体、賦形剤および希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、 リン酸カルシウム、アグ
リネート（ａｇｌｉｎａｔｅｓ）、トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、 セルロース、 水シロップ、 水、 水／エタノール、 水／グリコール、 水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、 メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシ
ベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油または脂肪物質、たとえば硬性脂質またはそれらの適当な混合物などが挙げられる。上記組成物は、付加的に、潤滑剤、保湿剤、乳化剤、 懸濁化剤、 保存剤、 甘味剤、 香味剤などを含んでもよい。本発明の組成物は、患者に投与した後、活性成分の迅速な、持続する、または遅延した放出を与えるように公知の手順を使用することにより処方することができる。上記組成物は、適切な投与形態、たとえば、エマルジョン、またはリポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などとすることができる。
【００４１】
必要なら上記組成物は、活性成分に結合したターゲティング部分を含んでもよい。たとえばリンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮細胞、 上皮細胞、血液細胞、 赤血球、血小板、好酸球、好中球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、脳細胞、心臓細胞、肺細胞、島細胞、 腎臓細胞、ホルモン分泌腺細胞、皮膚、骨、関節、骨髄、胃腸粘膜、リンパ
節、パイエル板、大網および他の免疫組織などへのターゲティングといった特定の細胞型または位置へのターゲティングを可能とする、内因性レセプターに特異的かつ選択的に結合するリガンドである。
【００４２】
上記組成物は、自己免疫疾患、免疫亢進病態、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない病態を治療または予防には有用性がある。
【００４３】
よって、本発明の別の態様として、自己免疫疾患、（たとえば異種の細胞または組織の移植後の拒絶を防止するための）免疫亢進病態、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態といったガンではない病態を治療または予防する際に使用される医薬製剤として、好ましくは免疫抑制剤として、本明細書で記載される医薬組成物が提供される。
【００４４】
別の局面から本発明は、前記の医薬組成物を投与された患者において、自己免疫疾患、免疫亢進病態、アレルギー性応答および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない病態を治療するかまたは予防する方法を提供する。
【００４５】
さらに、本発明は、自己免疫疾患、免疫亢進病態、アレルギー疾患および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない病態を治療するかまたは予防するための医薬製剤を製造する際において、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列 、 または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％ もしくは ７５％、
好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前
記のテストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、 ｐＨ ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図１のヌクレオチド配列によりコードされる配列と機能的に等価なタン白質をコードする配列、または
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子の使用、あるいは
（ｉ） 図１のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列の機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチドの使用を提供する。
【００４６】
本明細書では、「治療」とは治療前の症状に対して、治療対象である１以上の病態症状を低減させ、軽減させ、または除去することをいう。たとえば、罹患する症状には、好酸球増加症、特定のサイトカイン分泌減少、Ｔｈ２に偏倚した免疫応答、アレルギー応答、自己抗体の存在などが挙げられ、これらは機能的に等価なポリペプチドの機能特性について特に規定されたような効果を達成するように治療される。
【００４７】
病態の「予防」とは、前記病態の１以上の症状の発現または程度によって評価されるが、病態の発生を遅らせるか、または予防すること、あるいはその過酷さを軽減することをいう。
【００４８】
治療される、ガンではない病態には、特に自己免疫疾患として、たとえば溶血性貧血（Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎａｅｍｉａ）、血小板減少症（Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅ
ｎｉａ ）、甲状腺炎（Ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ
ａｎａｅｍｉａ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫糖尿
病（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、 重症筋無力症（ｍｙａｅｓｔｈｅｎ
ｉａ ｇｒａｖｉｓ）、 リューマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、アテローム性動脈硬化症 （ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および 自己免疫脳症（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）が挙げられる。
【００４９】
本明細書でいうガンではない免疫亢進の病態には、不適切な活性化、たとえば自己免疫病態が含まれるが、さらに望ましくない（が正常な）活性化、具体的には、外来性の細胞または組織（あるいは改変された内在性の細胞または組織） 、たとえばある器官または
骨髄をある個体の体内に移植することに起因する免疫応答も含まれる。
【００５０】
治療されるまたは予防されるべき、ガンではない病態には、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、
皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔ
ｉｓ）、アレルギー性結膜炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、ア
レルギー性気道疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒ−ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、接触性皮膚炎（
ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、食物アレルギーならびに好酸球気道炎症（ｅ
ｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）および気道過敏症（ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）に代表される呼吸疾患、これ
には、たとえばアレルギー性喘息（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｓｔｈｍａ）、内因性喘息（ｉ
ｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｓｔｈｍａ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ａｌｌｅ
ｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、好酸球性肺炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、アレルギー性気管支炎、気管
支拡張症（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｔａｓｉｓ）、職業性喘息（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ａｓｔｈｍａ）、反応性気道疾患症候群（ｒｅ
ａｃｔｉｖｅ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、間質性肺疾患（ｉｎ
ｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、寄生虫性肺疾患（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）などが挙げられる。
【００５１】
しかしながら上記組成物は、喘息の治療に好ましく使用される。さらに好ましい態様において、該組成物は好酸球増加症がある役割を演じている病態、たとえばアレルギー（上記のように、とりわけ喘息）、アトピー性疾患および肺好酸球増加症を治療するために使用される。
【００５２】
治療される患者として、限定するものでないが哺乳類、とりわけ霊長類、飼育動物および家畜が含まれる。よって、特に好ましい治療の動物として、マウス、ネズミ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマが挙げられ、 とりわけ好ましくは、ヒトで
ある。
【００５３】
すでに述べたように、本発明による方法では核酸分子またはポリペプチドのいずれかが使用される。核酸分子を使用する場合、核酸分子は患者内で発現させる形態で便利に使用され、よって遺伝子治療の形態となる。したがって本明細書で記載された、核酸分子を含む医薬組成物は、遺伝子治療方法において使用することができる。
【００５４】
上記核酸分子は、たとえばリポソーム、ミセルまたは関心が向けられた細胞へのターゲティングを可能とするターゲティング部分を含む、他の適当な搬送ベヒクルで提供されてもよい。
【００５５】
あるいは、上記分子は、ウィルス、プラスミドまたは 細胞 （とりわけトランスフェクトされた種に適合する細胞）などの他の「ベヒクル」に包含されてもよい。これらは、そうした駐在分子の発現をもたらす目的のために当該技術分野ではいずれも周知である。
【００５６】
トランスフェクションのための適切な技術はよく知られており、これには、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、吸着、ウィルス・トランスフェクションおよびプロトプラスト融合などが挙げられる。
【００５７】
本発明の組成物の投与は、従来的な任意の経路で行なわれてもよく、具体的には、吸入によるか、経鼻的に、経口的に、経直腸的にあるいは筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内の注射といった非経口的による。皮膚に組成物、たとえば軟膏を局所投与することによる治療または予防も可能である。
【００５８】
投与は、必要に応じた間隔をおいて行なわれ、たとえば２回またはそれ以上の適用、具体的には毎時間、毎日、週ごとまたは月ごとの間隔で２−４回の適用あるいは１日、３−５日ごとに、または ２週間ごとに、毎月または季ごとの間隔で数回の適用である。
【００５９】
関係する分子ｃｐｎ６０．２について行なわれた研究において、投与経路は生起する免疫応答に影響を及ぼすことが観察されている。たとえば、Ｍｔｃｐｎ ６０．２が鼻腔内
に投与されると、Ｔｈ２からＴｈｌへのシフトが刺激され、腹腔内に投与されると反対の効果が観察された。このため投与経路は、治療または予防する疾患を考慮に入れるべきである。たとえば自己免疫疾患を治療する際は、腹腔内投与が適切であり、他方、特定のアレルギー性疾患の治療または予防には、たとえば鼻腔内投与が適切である。
【００６０】
本発明の予防方法において、投与 （好都合には経口的に、または吸入、あるいは皮下
もしくは筋肉内注射）は、好ましくはもっと長い間隔、具体的には２−１２週の間隔で実施される。治療目的には、投与（好都合には経口的に、または吸入、あるいは静脈内注射） １日にまたは２日にわたって１−４回行なわれる。
【００６１】
本発明の組成物中の活性成分は、処方物重量の約０．０１重量％ 〜約９９重量％含有
される。 好ましくは約０．１〜約５０％、たとえば１０％である。該組成物は好ましく
は投与形態単位で処方され、具体的には各投与単位には約Ｏ．Ｏｌｍｇ〜約ｌｇの活性成分を含有する。たとえば、ヒトに対して０．０５ｍｇ〜０．５ｇで、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００６２】
投与される活性化合物の正確な投与量ならびに治療期間の長さは、たとえば患者の年齢および体重および治療に求められる特別の条件、その重篤度、および投与経路を含む多数の要因にもちろん依存する。しかしながら一般的には、有効用量は、投与する動物、投与形態に応じて、単一の投与として約Ｏ． １μｇ／ｋｇ 〜約１４ｍｇ／ｋｇの範囲内にあり、好ましくは ０．１ 〜ｌｍｇ／ｋｇ、たとえば１日あたり、約１ｍｇ〜ｌｇのポリペプチドである。よってたとえば、成人の１日あたりの適切な用量は、７μｇ〜１ｇ、たとえばｌＯｍｇ〜ｌｇ／日、あるいは２５〜５００ｍｇ／日のポリペプチドである。
【００６３】
本明細書に記載された核酸分子を使用するときは、類似のまたはより少ない用量が用いられてもよく、具体的には約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ （たとえば 約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２ｎｇ／ｋｇまたは約１．５ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ）、成人には約１４ｎｇ〜約１７５ｍｇである。しかし、核酸分子が細胞またはベクターに包含される場合には、非ｃｐｎ コードＤＮＡの規模ならびに発現レベルに影響を及ぼす配列に
よっては、より多いかまたはより低い量が相応に必要となるかも知れない。具体的には５− または １０倍多い量である。たとえばベクターに包含された本明細書に記載の核酸分子では、約１．Ｏｎｇ／ｋｇ〜約１２．５ｍｇ／ｋｇで使用することができる。
【００６４】
上述のように本明細書で規定したポリペプチドのファミリーおよびそれらをコードする核酸分子は、サイトカイン群の産生を刺激する。それゆえこのことは、治療／予防の状況においてそれが生起するか否かにかかわらず、これらのサイトカイン産生を刺激する発現目的のためにこれらの化合物の使用を許容する。
【００６５】
よってさらなる面において、本発明は細胞のサイトカイン産生を刺激する方法を提供する。その方法は、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、
（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図１のヌクレオチド配列によりコードされる配列と機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする、（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子、あるいは
（ｉ） 図１のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（前記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、または
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列の機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド
の上記細胞に対する投与を含む。
【００６６】
そのような方法は、インビトロで、すなわち生体外の細胞、組織または器官について実施することができる。具体的にはこの方法論は、本発明の分子、たとえばｃｐｎ ６０．
１ レセプター分子と反応するか、それに結合するか、あるいはそれにより活性化される
分子もしくは分子群を同定するための研究方法において使用することができる。このような方法に対する１つの帰結として、サイトカイン産生の刺激は、本発明分子の存在を測定するために用いることができる。
【００６７】
したがって、別の面から本発明は、 サンプル中に本発明のポリペプチドまたはペプチ
ドの存在または濃度を評価する方法を提供する。その方法では、上記サンプルが細胞に適用されて、１つ以上のサイトカイン産生が測定され、対照サンプルにおけるそ（れら）のサイトカイン産生のレベルと比較される。ここで対照レベルを超える上昇は、当該サンプルにおいて上記ポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度との関係を与える。
【００６８】
本明細書で用いる「対照」とは、本発明の分子または測定されるサイトカイン（類）の産生を増大させる部分を含まないサンプルを言及するものである。適切であれば、本発明の分子を用いて標準曲線を作成してもよく、これにより該分子の存在または濃度について、定性的評価も可能であるが、定量的評価をなすことを可能とする。この方法は、本発明の分子を同定するためにさらに使用することができる。
【００６９】
しかしながら代わりに、特定サイトカインの産生を増強すべく、インビボでサイトカイン産生を刺激する方法が実施されてもよい。このことは治療上または予防上の効果に利点を有するものである。この場合において本発明は、特定のサイトカインを増加させることにより軽減され、克服されるかまたは防止される病態を治療するために使用される上記の核酸分子およびポリペプチドならびにその目的用の医薬製剤の調製のため、そうした分子の使用に拡張される。
正常レベルより１０倍を超えて、または１００倍を超えて増大させるサイトカインは、好ましくは ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮ
Ｆα、インターフェロン−γおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される。
定義
「自己免疫疾患」 本用語は、自己免疫のプロセスがある疾患の病因に関与することが示され得る場合をカバーすることを意図している。典型的にはそのような病気はＴ ヘルパ
ー リンパ球−１ （Ｔｈ−１） 型免疫応答に関係している。
「アレルギー病態」 本用語は、Ｔ ヘルパー リンパ球−２ （Ｔｈ−２） 型免疫応答に関係する病態をカバーすることを意図している。アレルギー反応において、高いＩｇＥレベルが生起し、Ｔｈ−２ 免疫応答がＴｈ−１応答よりも優勢となり、その結果、炎症性
の応答となる。アレルギー病態の例として、喘息、鼻炎／枯草熱、（ｒｈｉｎｉｔｉｓ／ｈａｙ ｆｅｖｅｒ）、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）およびアナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌ
ａｘｉｓ）が挙げられる。
「アジュバント」 この用語は、抗原と一緒に取り込まれるか、あるいは同時に投与されると免疫応答が増強される物質をいずれもカバーする意図で用いられている。
「ＭＴ６０．１」、「Ｍｔｃｐｎ６０．１」、「ｃｐｎ ６０．１」、「６０．１」は、
図１に示されたアミノ酸配列を言及するため、本明細書中では互いに交換できるように使
用される。
【００７０】
［実施例］
次に実施例を通して本発明をより詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１はサイトカ
インの強力な誘発因子（ｉｎｄｕｃｅｒ）である。
本実験において、精製Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１ 組換えタン白質のサイトカイン誘導活性をＥＬＩＳＡにより調べた。
方法
シャペロニン６０タン白質の発現および精製
Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ １０、６０．１ および ６０．２は、Ｍ． Ｓｉｎｇｈ教授 （ＷＨＯ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ、ドイツ）により通
常のクロマトグラフィーを用いて下記のようにして調製された。
組換えｃｐｎ６０．２の精製
該タン白質は、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．２をコードするプラス
ミドを担持する、加熱誘導（４２°Ｃ）組換えＥ． Ｃｏｌｉ Ｋ１２ 細胞から得られた
。細胞を超音波処理により溶解した。
【００７２】
その上清をアニオン交換クロマトグラフィー カラムでクロマトグラフィーを行なった
。透析後、ｃｐｎ ６０．２を含むフラクションは、２番目の異なるアニオン交換クロマ
トグラフィー カラムでさらに精製を行なった。最終的に、タン白質溶液は、その小分け
および凍結乾燥をする前にｌＯｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に対し透析を行なった。
【００７３】
タン白質各バッチのＬＰＳ汚染について、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（Ｔａｂｏｎａ ら
、 １９９８、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１、ｐ１４１４−１４２１）を用いてチェ
ックすることにより充分な注意を払った。もしＬＰＳ汚染が検出されたならば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）アフィニティカラム上でそれを除去し、ＬＰＳレベル
を再びアッセイした。
【００７４】
低ＬＰＳの組換えシャペロニンはさらに“Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ カラム”上で、汚染するタン白質および ペプチドを除去して精製した（Ｔａｂｏｎａ ら、１９９８、上記）。
【００７５】
ヒトＰＢＭＣにおいて、ｃｐｎ ６０．１ および ｃｐｎ ６０．２による、ＩＬ−１β、ＩＬ− ６、 ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦαおよび ＧＭ−ＣＳＦの産
生へのインビトロ効果を、Ｔａｂｏｎａら（１９９８、上記）に記載されたように２−サイトＥＬＩＳＡを用いて決定した。
結果
結果が図２に示されている。驚くべきことにｃｐｎ ６０．１ タン白質は、よく研究されたｃｐｎ ６０．２ または ｈｓｐ６５よりもさらに強力なサイトカインインデューサ
ーであることがわかった。ｃｐｎ ６０．１ タン白質は、ｃｐｎ ６０．２よりも２の対
数次数分（１０２オーダー）、強力であることに加えて、ヒト単球においてｃｐｎ ６０
．２ またはＬＰＳよりも著しく大きい最大級の応答を亢進する。
【００７６】
興味深いのは、両シャペロニンは、いずれもＩＬ−１２ 産生を刺激するが、抗ミコバ
クテリア性（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）サイトカイン、ＩＦＮ−γの産生を促進できなかった。これに関連して、我々は多数のｃｐｎ ６０−由来ペプチドを調べた。推定さ
れるｃｐｎ ６０．１ Ｔ細胞エピトープ・ペプチド、１９５−２１９が、ＩＦＮ−γの産生も含めて（データは示されていない）サイトカイン産生の強力なインデューサーであることがわかった。Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．２ およびＥ． ｃｏｌ
ｉ ｃｐｎ ６０ タン白質、ｇｒｏＥＬ、における同じペプチドは、サイトカイン誘導活
性を欠いていた。（Ｌｅｗｔｈｗａｉｔｅ、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ およびＣｏａｔｅｓ、
未発表データ）。これらの知見は、単球／マクロファージへのＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１の作用を確認するものであり、したがって、ある病態の治療または予防においてそれらの利用を確認する。
【実施例２】
【００７７】
マウスにおいてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１は喘息を抑制する。
本実施例では、アレルギー性炎症のげっ歯類モデルにおいてＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１ タン白質が、免疫したマウス気道への好酸球の動員を阻害する
ことを初めて示す。
【００７８】
好酸球応答へのｃｐｎ ６０．１の効果は、用量および時期に依存する。これらの結果
から、Ｍｔｃｐｎ ６０．１がマウスの気道炎症を変調させることを示している。よって
、アレルギー疾患の治療および予防について重要な示唆を有する。
方法
炎症のげっ歯類モデル
抗原投与後に、気道における好酸球および Ｔ リンパ球の漸加の定量を可能とするアレルギー性炎症のげっ歯類モデルが開発された。さらに肺モニタリングシステムが使用され、これは気管支収縮剤アゴニストに対する肺の機能における変化をインビボで測定することを可能とする。
免疫化プルトコル
Ｃ５７Ｂ１／６ 野生型 （地域の供給者）の６−８ 週齢マウスは、０日目に、オボア
ルブミンを用いて免疫され （１０μｇ 腹腔内注射； １ ｍｇ 水酸化アルミニウム） 、７日後に繰り返した。１４、 １５ および １６日目に マウス は、プレキシガラス（ｐ
ｌｅｘｉｇｌａｓｓ）容器（１２ Ｌ）に収容して、霧状にしたオボアルブミン溶液（１
０ ｍｇ／ｍｌ； Ｄｅ Ｖｉｌｉｂｉｓｓ Ｕｌｔｒａｎｅｂ ９０）に曝した。シャム免
疫の野生型マウスは、０日および７日目に水酸化アルミニウム１ｍｇ を注射し、１４− １６日目にオボアルブミンで抗原投与した。
【００７９】
エアゾール暴露は、毎日３回１時間の間隔で２０分間暴露させて行ない、気管支肺胞洗浄、免疫組織化学用の肺の採取および肺力学（ｌｕｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）は、最後
のエアゾール投与の後、２４時間して行なった。
【００８０】
オボアルブミンは、喘息患者がよく遭遇する呼吸器系のアレルゲンではないが、炎症げっ歯類モデルで観察されるＴｈ２応答は、ハウスダストのダニで免疫した後に見られるものに類似している。これら２つのアレルゲンにより生起されるＴｈ２ サイトカインのプ
ロフィールは、類似している。このオボアルブミンを用いる利点は、それが容易に入手でき、しかもこのアレルゲンの特異的な活性は、バッチ間で変動せず、そのため我々は、バッチ間で抗原投与量をコントロールできる。
ＢＣＧ処置
オボアルブミン（１０μｇ）で免疫してから６日目に、マウスに経静脈経路により Ｂ
ＣＧ （ｌｏｇ （ＢＣＧ ｖｉａｂｌｅ単位）：−４、−５ および−６）を注入した。
７日目、マウス は、オボアルブミン（１０μｇ）の ブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）注射を受けた。１３日目、マウス は６日目と同じ投与量、同一の投与経路にて２度目のＢＣ
Ｇ投与を受けた。１４日目、マウスは、プレキシガラス容器に収容し、霧状にしたオボア
ルブミン溶液（１％ 溶液）への３０分間暴露を１時間間隔で３回行なった。この操作を
１５および１６日目にも繰返した。最後のオボアルブミン暴露の２４時間後、マウスを麻酔にかけ好酸球を数えるために気管支肺胞洗浄を行なった。
Ｃｐｎ ６０． １／６０． ２ 処置
動物の同じバッチからのマウスをオボアルブミンで免疫し、Ｍｔｃｐｎ ６０．１ （１０μｇ／動物）を気管に直接点滴することにより処置した。マウスはＭｔｃｐｎ ６０．
１で、 ６日目 および１３日目、次いで１４、１５、および１６ 日目の投与プロトコル
の開始の３０分前にも処置した（総数５ 処置）。
結果
図３は、オボアルブミンで免疫した（シャムでない）マウスの気道への好酸球の有意の動員を示す。
【００８１】
図３は、またマウスにおいてＢＣＧが気道炎症を抑制することを示す。オボアルブミン免疫マウスにおいて、オボアルブミン投与は、肺の好酸球増加症を誘導し（５５±１２％、 ｎ ＝ ５、 Ｐ ＜ ０．０５ シャムに対する）、これは抗原の前にＢＣＧ（１０６
ｖｉａｂｌｅ 単位／ｍｌ）で 処置したマウスでは有意に抑制された。
【００８２】
図４は ｃｐｎ６０．１で処置した場合、しなかった場合に得られた結果を示す。オボ
アルブミン免疫マウス （ｏｖａ）における気管支肺胞洗浄液中に見いだされた好酸球の
パーセンテージは３７．７ ± ７．４ ％ （図５）であった。オボアルブミン投与に続く、気道への好酸球動員の有意の抑制が見られた（％ 好酸球 Ｍｔｃｐｎ ６０．１処置マウス； １２．６ ± ３．９ ％ Ｐ＜ ０．０５ 対照に対する）。このことは、 喘息に
おけるＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの保護効果についての強力な証拠を与える。
【００８３】
本出願人はさらに別の実験も行なった。その実験においてマウスは、 Ｍｔｃｐｎ ６０．１で２度の機会 （６ および１３日）だけ処置したが、 好酸球の動員は阻害されない
ことが観察された。これは好酸球の応答へのＭｔｃｐｎ ６０．１の効果が投与量および 時期に依存することを示している。
【００８４】
これらの結果から、喘息のげっ歯類モデルにおいて、Ｍｔｃｐｎ ６０．１ が好酸球性炎症を抑制できることが初めて示された。鼻炎／枯草熱、湿疹、アナフィラキシーといった他のアレルギー病態もまた、喘息と共通の機作（Ｔｈ−２ 細胞の過剰反応）を共有し
ている 。したがって、もし ６０−１が喘息を抑制することができるなら、他のアレルギー病態もまた抑制できるはずである。これは、そのタン白質がマウスの気道炎症を変調させる能力を有しているという仮説を支持するものである。このことは、アレルギー疾患および自己免疫疾患といったガンでない病態の治療および予防に対し重要な手がかりとなるものである。
【００８５】
６０．１の重要な利点は、それがアレルギー病態における急性症状の治療とは区別される予防的な治療を与え得るということである。 換言すれば、６０．１処置はアレルギー
病態の急性症状がさらに進行するのを防止できることである。
【実施例３】
【００８６】
自己免疫疾患： ６０．１はラットの関節炎を抑制する
本実施例では、関節炎のラットモデルにおいて Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐ
ｎ ６０．１ タン白質が、免疫されたラットでは骨粗しょう症、骨侵食および骨膜炎を抑制したことを初めて示す。これらのデータは、Ｍｔｃｐｎ ６０．１がラットにおいて関
節炎を変調させることを支持し、したがって関節炎疾患の治療および予防に重要な手がかりとなるものである。
方法
アジュバント／Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、関節炎患者がよく出会う刺激では
ないけれども、炎症ラットモデルに見られる Ｔｈｌ応答は、リューマチ性関節炎に観察
されるものに類似している。
【００８７】
これら２つのアレルゲンにより生起されるＴｈ１ サイトカインプロフィールは、類似
している。このアジュバントを用いる利点は、それが容易に入手でき、この刺激の特異的な活性は、バッチ間で変動せず、そこで我々は、バッチ間でアジュバント投与量をコントロールできる。
アジュバント関節炎を誘導する一般プロトコル
加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒト株Ｃ、 ＤＴ お
よび ＰＮ （Ｍｔｂ） は、乳鉢で微細に磨り潰し、軽パラフィンオイルに懸濁して最終
濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。
【００８８】
ラットは、上記Ｍｔｂ懸濁液の全１００μｌを尾の基底部で接種された （Ａｎｄｒｅ
ｗｓ ら１９８７）。動物を毎日、体重および臨床スコアを評価しながら、３−４週間観
察した。実験の最後に動物は炭酸ガス中で窒息死させ、血液および組織サンプルを採取した。
臨床スコア
関節炎誘導の日を０日目と設定し、関節炎を次の標準点数評価システムを用いて評価した （Ｃｕｒｒｅｙ および Ｚｉｆｆ、１９６８の評点から改変した）。
０． 炎症なし。
１． 僅かに赤くなり肢は膨張する。
２． 肢が膨張し、腱はもはや見られない。
３． 膨張は踝関節まで伸びる。
４． 大幅な炎症および踝関節の変形。
【００８９】
評価点数は動物ごとに集計し、可能な最大値を１６とする。ついでながら、尾は皮膚結節の有無にもとづき０〜１と評価できる。耳は、赤熱の状態の有無により０〜１と評価できる。尾および耳は、シャペロニン実験では評価されなかった。
引用文献
Ａｎｄｒｅｗｓ ＦＪ、 Ｍｏｒｒｉｓ ＣＪ、Ｋｏｎｄｒａｔｏｗｉｃｚ Ｂ、 Ｂｌａｋ
ｅ ＤＲ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔ
ｏｒｙ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ １９８７ ； ４６：
３２７−３３．
Ｃｕｒｒｅｙ ＨＬＦ、 Ｚｉｆｆ Ｍ． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔ
ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｔｉｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６８； １２７： １８５−
２０３．
実験の詳細
種：ウィスターラット、実験開始時、１６０−２００ｇ
系統（Ｓｔｒａｉｎ）： Ｂａｔｈ−誕生および離乳（ｂｏｒｎ ａｎｄ ｗｅａｎｅｄ）
性：雌
ケージ中の数：６
ヒートショックタン白質（シャペロニン）調製
Ｃｐｎ １０ （ｈｓｐ １０）： ２０ ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｌｍｌ）中、ｌｍｇ／ｍｌで供給
Ｃｐｎ ６０．１ （ｈｓｐ６０．１）： ｌＯｍＭ重炭酸アンモニウム（０．３ｍｌ）中
、 ２．２５ ｍｇ／ｍｌで供給
Ｃｐｎ ６０．２ （ｈｓｐ６５）： ｌＯｍＭ重炭酸アンモニウム（０．４５ｍｌ）中、 ３．３３ ｍｇ／ｍｌで供給
リン酸緩衝化生理食塩水 （ＰＢＳ）
無菌ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ および Ｍｇ ｕｓｅｄ （Ｇｉｂｃｏ）
ＰＢＳ、７２０μｌをＣｐｎ ６０．１調製物に、５７０μｌを Ｃｐｎ ６０．２調製物
に、および １２０μｌをｈｓｐ １０調製物に （容量で） 加えて、最終的にｌｍｇ／ｍｌとする。ｃｐｎ調製物（３２０μｌ）は、エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で小分けし注射時まで冷蔵庫中で保管した。残りは、ＥＬＩＳＡのために−７０°Ｃで再凍結した。
【００９０】
６匹のラットからなる５つのグループを、軽パラフィン油（アジュバント）中に粉砕した加熱殺菌Ｍｔｂ （ｌＯｍｇ／ｍｌ）を含むもの（１００μｌ）で尾から接種した（０
日目）。６ラットの１グループは、処置を受けなかった（ナイーブ（ｎａｉｖｅ））。すべてのラットは体重を測定した。４、５ および６日目に、アジュバントを受けた５グル
ープは、次のように処置した。
群１：処置なし （ＡＡだけ）
群２： 各ラットは、５０μｌのＰＢＳを尾から注入された（ＡＡ＋ベヒクル）。
群３： 各ラットは、５０μｌのｈｓｐ１０を尾から注入された（ＡＡ＋ｈｓｐ１０）。
群４： 各ラットは、５０μｌのｃｐｎ６０．１を尾から注入された（ＡＡ＋ｃｐｎ６０
．１）。
群５：各ラットは、５０μｌのｈｓｐ６５ （ｃｐｎ６０．２）を尾から注入された（Ａ
Ａ＋ｈｓｐ６５）。
群６：免疫なし（ナイーブ）
すべての動物は毎日評点をつけ、０、４、６、８、１１、１３、１５、１８ および２
１日目に体重を測定した。
結果
図６は、シャペロニン処置ラットで著しい抗体産生があり、無処置またはＰＢＳ−処置ラットではなかったことを示す。図６はまた、アジュバント処置ラットをｃｐｎ６０．１で免疫すると、最大量の抗体をもたらすことを示している。これは Ｔｈ２−応答の誘導
を示唆する。
【００９１】
図７は、ｃｐｎ ６０．１、６０．２ または１０を用いる処置をした場合としなかった合の結果を示す。ベヒクルだけの処置は、２１日後に臨床スコア１２を与えた。これは、６０．２により１４まで増加したが、ｃｐｎ １０により９に減少した。
【００９２】
６０．１を用いる処置は、ベヒクルのみの処置とは区別できなかった。このことから炎症性応答が６０．２によって増大し、１０により減少し、他方６０．１は効果がないという証拠を与える。
【００９３】
本出願人は、Ｘ線で関節部を調べた（図５、８、８ （ａ） および ８ （ｂ））。１０は、骨粗しょう症、骨侵食および骨膜炎についてＸ線スコアを上昇させたが、６０．２は、ベヒクルだけの場合と差異はなかった。
【００９４】
これらの結果は、Ｍｔｃｐｎ ６０．１が関節炎ラットモデルにおいて骨粗しょう症、
骨侵食および骨膜炎を抑制できることを初めて示す。このことは、ラットでは本タン白質が関節炎を変調する能力を有することを示すものであり、自己免疫およびアレルギー疾患の治療および予防に重要な手がかりとなる。
【００９５】
関節炎といった自己免疫疾患は、アレルギー性の病態（Ｔｈ−２ 細胞の過剰反応性） とは異なる機作（Ｔｈ−１ 細胞の過剰反応性）で作用していると考えられる。
したがって、６０．１が喘息 （Ｔｈ２） および関節炎（Ｔｈ１））ともに抑制することは驚くべきことである。
【実施例４】
【００９６】
アジュバント活性
正常ラットならびにｃｐｎ ６０．１を含む調製物および ６０．２を含む調製物、ＰＢＳ （緩衝液） のみを尾基底部で、皮下注射により投与したアジュバント 活性 （ＡＡ）ラットおよびｎａｉｖｅラット（免疫化なし）における抗体産生。 実験の詳細は実施例
３で記載されたものと同一である。
【００９７】
図６、９ および１０は、６０．１ および ６０．２処置ラットでは著しい抗体産生が
あり、ＰＢＳ処置動物または「ナイーブ（ ｎａｉｖｅ）」動物ではないことを示す。
よって、６０．１ および ６０．２は、極めて強力なアジュバント活性を有する。さらに、６０．１は、６０．２よりも４倍もの抗体応答を作り出した。したがって、ワクチン組成物において６０．１は、抗原に対し、アジュバントとして作用できる。
【００９８】
とりわけ好ましいワクチン組成物の例は、本発明の化合物を、次の抗原のうち、１つまたはそれ以上の抗原と一緒に含むものである：
炭疽（Ａｎｔｈｒａｘ）、コレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ヘモフィルス・インフルエンザｂ （Ｈｉｂ）（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂ（ＨＩＢ））、 肝炎Ａ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ）、肝炎Ｂ（ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ）、 インフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、日本脳炎（Ｊａｐａｎｅｓｅ
ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、麻疹 （Ｍｅａｓｌｅｓ）、流行性耳下腺炎（ｍｕｍｐｓ）および風疹（ｒｕｂｅｌｌａ （ＭＭＲ））、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ
）、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎双球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）、ポリオ（Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）（ｓａｂｉｎ および ｓａｌｋ ワクチン）、 狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）、三日はしか（ Ｒｕｂｅｌｌａ）、 天然痘（Ｓｍａｌｌｐｏｘ）および種痘症（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）、 ダニ起因性脳炎（Ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、結核（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ
）、チフス（Ｔｙｐｈｏｉｄ）、水痘／ヘルペス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ／Ｈｅｒｐｅｓ）、帯状疱疹（ｚｏｓｔｅｒ）、黄熱病（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ）および 獣医ワクチン用抗原（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）たとえば足および口腔疾患 ウィルス。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１−１】図１−１は結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのｃｐｎ ６０．１のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
【図１−２】図１−２は図１−１の配列の続きを示す。
【図２】図２は Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１ および ６０．２ によるサイトカイン産生へのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）作用を示す； Ａ） ＩＬ−１β 、 Ｂ） ＩＬ−６、 Ｃ） ＩＬ−８、 Ｄ） ＩＬ−１０、 Ｅ） ＩＬ−１２、 Ｆ） ＴＮＦα および Ｇ） ＧＭ−ＣＳＦ、黒丸は、ｃｐｎ ６０．１を 白丸はｃｐｎ ６０．２を表す。
【図３】図３はマウスにおける気道炎症へのＢＣＧの作用を示す。
【図４】図４は、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）で誘導した肺の好酸球増加症のマウスにおいてｃｐｎ ６０．１を５用量、投与した後の好酸球レベルの減少を示す。
【図５】図５は オボアルブミンで免疫したマウス（ｏｖａ）の気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）中に見られた好酸球のパーセンテージは３７．７±７．４％であった。
【図６】図６はシャペロニン処置ラット（すなわち６０．１ および ６０．２で処置した動物）では有意の抗体産生が示され、その処置がないかまたはＰＢＳで処置した動物ではそれがなかったことを表すＥＬＩＳＡの結果である。略語： Ｎａｉｖｅ （免疫しない）； ＥＬＩＳＡで使用した抗原は、ｃｐｎ ６０．２ （”６５”）； ｃｐｎ ６０．１（”ｃｐｎ”） または ｃｐｎ １０ （”１０”）である。たとえば、ｙ軸上で”Ｎａｉｖｅ／６５”は、その動物が免疫されず、ＥＬＩＳＡで使用した抗原は６０．２であることを示す。 同様に ”ｃｐｎ／ｃｐｎ”は６０．１で免疫され、しかもＥＬＩＳＡで使用した抗原は６０．１であることを示す。
【図７】図７はｃｐｎ６０．１、６０．２ または１０による処置をした場合としない場合について、関節炎用の臨床スコアで表す効果を示す。
【図８】図８はｃｐｎ６０．１、６０．２ または１０による処置をした場合としない場合について、関節炎用のＸ線スコアで表す効果を示す。略語：”Ｏｓｔ”＝ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ（骨粗しょう症）；”Ｐｅｒｉ”＝骨膜炎； および”Ｅｒｏ”＝ ｅｒｏｓｉｏｎ（侵食）。図８（ａ）は、アジュバント誘導リューマチ性関節炎のウィスター・ラットをｃｐｎ６０．１で処置した効果を示す。関節炎は、油（アジュバント）中にある加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを、尾からの皮内注射を１回することにより誘導した。誘導後、４、５ および ６日目にＣＰＮ ６０．１ （５０ μｇ リン酸緩衝化生理食塩水中）を注射することにより処置した。疾患の進行は、足の炎症で評価して毎日観察した。関節炎が最大級になったとき（＞９日処置後）、Ｘ線スキャンを行なった。スキャン上部：アジュバントで誘導後、ＣＰＮ ６０．１で処置したラット後肢において骨密度および関節生理が正常ラットと区別できないことを示す。スキャン下部：ラットの後肢は、アジュバント誘導関節炎に典型的なリューマチ様障害：骨の侵食、骨粗しょう症、関節変化および閉塞を示す。これらは図８ｂにおいて注釈を付している。
【図９】図９は６０．１ で免疫したラットおよびＰＢＳで処置したラットにおける抗体産生の相対レベルを示す。
【図１０】図１０は６０．２で免疫したラットおよびＰＢＳで処置したラットにおける抗体産生の相対レベルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば自己免疫疾患、骨粗そう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、アレルギー疾患または免疫亢進病態、とりわけ喘息、および／またはＴヘルパー リンパ球２（
Ｔｈ２）−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）に関係する病態といったガンでない病態の治療および予防において、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または 関係する原核細胞に由来するおよそ６０ｋＤａ ポリペプチド （またはそれをコードする 核酸分子） または機能的に等価な分子またはそのフラグメントの使用、ならびに免疫応答メディエーター、たとえばサイトカインのインビトロまたはインビボでの産生を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫は、「自己」寛容の喪失を反映し、正常細胞または組織の不適切な破壊に至る。多数の病態で自己抗体が見出されるが、疾患の原因というよりも効果を反映するかも知れない。しかしながら、ある疾患では自己抗体が、最初の主要かつ唯一の検出可能な異常であろう。このことに関係している分子の一つの集団は、高度に免疫原性であるシャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）である。シャペロニンは、分子シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）と呼ばれるタン白質のグループに属する。分子シャペロンは、ネイティブでないタン白質に結合し、このタン白質がＡＴＰ−依存性の触媒プロセスで、機能的タン白質に要求される正確な３次元形態に折りたたまれるように、補助する。
【０００３】
シャペロニンは単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、マクロファージ、線維芽細胞様の細胞、おそらく他のタイプの細胞およびＴ細胞を含め、多くのレベルで免疫（器官）系を同時に刺激すると信じられている。哺乳類における免疫防御は、「自然」および「適応」の防御に分けられる。ファゴサイト（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）、ナチュラルキラー細胞および補体といった既に適所にある細胞は、自然免疫であると見なされる。抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の際には、適応免疫がＢおよび Ｔリンパ球の形態で活性化される。 シャペロニンは、自然防御メカニズム、具体的にはファゴサイトに直接的に作用することが知られている。シャペロニンは、強力な適応免疫の応答を刺激する。すなわち抗体産生、ならびにある場合には防御的であるＴリンパ球の刺激である。特にシャペロニンは、宿主防御に重要と考えられているサイトカイン分泌を誘導する。しかし、ある場合にはシャペロニンの存在が宿主に損害を与えるとも信じられている。
【０００４】
自己免疫疾患におけるシャペロニンの役割は、議論が分れるところである。シャペロニンを含有する生物での感染／免疫は、普遍的であり、健康な人々は、 自己シャペロニン
に対してＴ細胞応答を示すが、シャペロニン特異的抗体の産生を含め、古典的な自己免疫疾患は、極めて稀である。シャペロニンに対する免疫反応の存在は、偶発的であり重要ではないかも知れない。しかしながら分子的模倣の理論は、自己免疫疾患におけるシャペロニンの関わりを示唆し、微生物および哺乳類起源のシャペロニン間で、アミノ酸配列の高いレベルの保存性に依拠する。この理論は、広範囲の微生物との感染の間に、微生物および哺乳類との間で共有されるシャペロニンエピトープは、Ｔ リンパ球を刺激することを
提案する。 この理論によれば、共有されたシャペロニンエピトープによる高レベルのシ
ャペロニン提示が、自己シャペロニンに対する寛容を破壊しおよび自己免疫疾患が発症する。
【０００５】
腫瘍から得られるシャペロニンは、これらの腫瘍に対する壊死的効果となることが判った。これは、腫瘍の抗原が免疫認識を増強することにより起こることが示唆されているが、その機構は知られていない。よって、シャペロニンは、細菌感染およびガンに対し防御
的な適応免疫を誘導するようである。
【０００６】
アレルギー反応、たとえば喘息では、均衡的に不適切である免疫応答か、または対象を誤った免疫応答が関係する。たとえば喘息の蔓延は増大しているが、あらゆるケースを治療する有効な治療法はまだ見出されていない。現在の治療は、往々に免疫抑制のグルココルチコステロイド（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ベータ・アゴニスト、クロモグリケート（ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）、ロイコトリエン調節物質（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）など、多数の副作用を有するものを使用する。
【０００７】
そのようなアレルギー反応においては、ＩｇＥ レベルが高くなり、またＴ ヘルパー
リンパ球−２ （Ｔｈ２） 免疫応答が Ｔｈｌ応答を圧倒し、結果的に炎症性の応答とな
る。Ｔｈｌ 応答は、主に微生物感染に対する防御であると考えられ、サイトカイン、具
体的にはインターロイキン−１２ （ＩＬ−１２）、ＩＬ−２ および インターフェロン
−γによって促進される。対照的に、Ｔｈ２応答は、適当な遺伝的基盤においてアレルギー性の有害な組織損傷に関係している。
【０００８】
しかし、自己免疫疾患、たとえば アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ） 関節炎といった他の病態では、過剰 Ｔｈｌ応答が、疾患の原因であることが示唆されている。したがっ
てＴｈｌ応答のＴｈ２への転換またはＴｈ２応答のＴｈｌへの転換は、上記疾患を治療する上で有用性がある。
【０００９】
Ｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ 、Ｍ． ｂｏｖｉｓ および結核菌といった細菌は、
Ｔｈ２応答を Ｔｈｌ応答に転換することができることが知られているが、この転換を担
う分子は同定されていない。
【００１０】
しかしながら、当業界における示唆は、Ｔｈｌ応答を誘導できる Ｍ． Ｌｅｐｒａｅ
からのヒートショックタン白質、 ｈｓｐ６５を意味している （Ｌｏｗｒｉｅ ら、 １９９９、 Ｎａｔｕｒｅ、４００、ｐ２６９−２７１； Ｂｏｎａｔｏら、１９９８、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６、Ｐ１６９−１７５）。
【００１１】
結核菌に由来する相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）、 ｈｓｐ６５は、前炎症性サイト
カインを産生するようにヒト単球を刺激し、ならびに単球およびヒトの血管系の血管内皮細胞を活性化する能力を有する（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ ら、１９９３、Ｃｌｉｎ． Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１、 ｐ５８６２； Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓら、１９９５、 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３、ｐ３４５４−３４５８； Ｖｅｒｄｅｇａａｌら、１９
９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、ｐ３６９−３７６）。
【００１２】
驚くことに、ヒートショックタン白質またはシャペロニンであるとはまだ知られていない別のタン白質が、一個体の免疫に影響を及ぼすことができ、しかもそれが自己免疫疾患、免疫亢進病態またはアレルギー疾患、とりわけ喘息、および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といったガンではない病態を治療しまたは予防するために用い得ることが今や知られている。
【００１３】
機能が知られていないこのタン白質が結核菌において同定され、配列決定がなされた（Ｋｏｎｇ ら、 １９９３、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、 ９０、 ｐ２６０８−２６１２）。 これに匹敵するタン白質が、Ｍ． ｂｏｖｉｓ および Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａを含む、様々な他の細菌に存在することが知られている。それは、シャペロニン ６０．１（ｃｐｎ ６０．１）と名づけられたが、この命名の採用は、単に他のシャペロニンに対するそのアミノ酸配列同一性に基づくだけである。
【００１４】
シャペロニン６０．２（同一起源から） は、後記するアライメント配列方法を用いる
とｃｐｎ ６０．１に対して、５９．６０％ のアミノ酸配列同一性および ６５．６％ の核酸配列同一性を示す。ｃｐｎ ６０．１と共通してＣｐｎ ６０．２ は、確認されたシ
ャペロニン性質を持たない。シャペロニンは、互いに向き合い、約１０ｋＤａモノマー（ｃｐｎ １０により生成）からなる環ヘプタマーでキャップされた２ 環ヘプタマー（約６０ｋＤａのモノマーからなる）を形成することにより機能すると信じられている。
【００１５】
支援を受ける折りたたみは、標的タン白質が、一旦、中心コア内に入り込んで行なわれ、その後、放出される。したがって、ヘプタマー形成は、目下理解されているシャペロニンの機能には必須であるようである。しかしながら、他の種からのｃｐｎ６０と異なり、結核菌ｃｐｎ ６０．１のヘプタマーを産生することが可能であるとはわかっていない。
さらにＧｒｏＥ シャペロニン 折りたたみ装置とは異なりｃｐｎ ６０．１ 遺伝子もｃｐｎ ６０．２ 遺伝子も、いずれもシャペロニンｃｐｎ １０ 遺伝子とは同一オペロン内にはなく、このため、シャペロニン複合体の形成に必要な構成要素の転写は、同じ制御機構のもとにはない。
【００１６】
ｃｐｎ ６０．１ タン白質は、グリシンおよびメチオニンに富む配列を通常に有する他の種からのｃｐｎ ６０とは異なり、Ｃ−末端で特異なヒスチジンの多い配列を有するこ
とが観察されてきた。６０．２ タン白質は、公知のヒートショックタン白質であり、他
の種のヒートショックタン白質に対し、極めて高い相同性を有する。具体的には、Ｍ．ｌｅｐｒａｅからの同じタン白質に対し、９５％ の同一性を示す。上記の通り、ｃｐｎ ６０．２は、結核菌のゲノム上で ｃｐｎ ６０．１とは離れて位置していて、異なる転写制御を受けている。結果的に、ｃｐｎ ６０．１がヒートショック タン白質またはシャペロニンのいずれかであることを示す証拠はない。これらの事実は、結核菌においてｃｐｎ６０タン白質類が異なる機能的役割を有することを強く示唆するものである。
【発明の開示】
【００１７】
よって、本発明は、自己免疫疾患、免疫亢進病態を含む病態、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない様々な病態を治療しまたは予防において、増強された性質を持つｃｐｎ ６０．１といった分子を提供する。治療および／または予防的応用は、以下に詳
細に説明を加える核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。
【００１８】
かくして 本発明は、最初の面として核酸分子を含む医薬組成物を提供し、 このものは、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える または ９５％の 同一性（後記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図１のヌクレオチド配列によりコードされる配列と機能的に等価なタン白質をコードする配列、または
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント
を含む核酸分子、さらに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００１９】
上述のように、治療および／または予防的効果は、核酸分子またはペプチド／タン白質を用いることにより達成することができる。よって、本発明は、次の局面としてポリペプチドを含む医薬組成物を提供し、このものは、
（ｉ） 図１のアミノ酸配列 、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（後記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、または
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列の機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する。
【００２０】
本発明による「核酸分子」は、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
機能的に等価なポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列の誘導体は、技術上、周知である通常の方法を用いて得ることができる。
【００２１】
本発明に使用される核酸分子は、図１に由来する配列だけからなるもの（または関連する機能的に等価な配列）であってもよく、あるいは構造上もしくは機能上の配列、具体的には転写および／または発現（特に哺乳類細胞において）を制御する配列、あるいは、たとえば分泌シグナルとして作用する特異的性質を有する融合タン白質を形成する付加的なタン白質部分のための配列を含む、追加の配列などを包含することができる。かくして、たとえば、上記配列は本明細書で記載した核酸分子を含むベクターの形態にあってもよい。好適なベクターとして、プラスミドおよび ウィルスがある。
【００２２】
本明細書でいう「ポリペプチド」には、完全長のタン白質のほか、より短い鎖長のペプチド 配列、たとえば本明細書で記載するタン白質フラグメントのいずれも含まれる。そ
うしたポリペプチドは、任意の便利な手段により調製することができる。たとえば原核生物起源からの単離により、あるいは発現制御配列を作動的に結合させた適当な核酸分子を宿主細胞で発現させるか、またはそのような組換えＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡクローニングベヒクルもしくはベクターを発現させる組換え手段により、あるいは化学的または生化学的な合成 （細胞外）により調製することができる。
【００２３】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書でいう「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、ｐ４６７３− ４６８０）：
ペア方式アライメント・パラメータ−方法：ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 Ｇａｐ ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６；
多重アライメント・パラメーター−マトリックス： ＩＵＢ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １５．００、 ％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｎｅｇａｔ
ｉｖｅ マトリックス： ｎｏ、 Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ６．６６、 ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ： ０．５．
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」は、クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を用いて、以下のパラメーターとともに評価を行なったときに得られる値をいう （Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎら、１９９４、上掲）：
ペア方式アライメント・パラメーター−方法： ａｃｃｕｒａｔｅ
マトリックス： ＰＡＭ、 Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ： １０．００、 Ｇａｐ ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ： ０．１０；
多重アライメント・パラメーター−マトリックス： ＰＡＭ、Ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａ
ｌｔｙ： １０．００、 ％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌａｙ： ３０、 Ｐｅｎａｌ
ｉｚｅ ｅｎｄ ｇａｐｓ： ｏｎ、 Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ： ０、 Ｎｅｇａｔｉｖｅ マトリックス： ｎｏ、 Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌ
ｔｙ： ０．２０、 Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：
ｏｎ、 Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ： ｏｎ、 親水性残基： ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。
【００２４】
特定残基における配列同一性は、簡単に誘導された同一残基を含むようにされている。
「機能的に等価な」タン白質またはタン白質フラグメントとは、図１のアミノ酸配列に関係するか、またはそれから誘導されるものであり、そのアミノ酸配列は、単一もしくは複数のアミノ酸 （具体的には １〜５０、たとえば１０〜３０、 好ましくは１〜５塩基
）の置換、付加および／または欠失により修飾されているが、それにもかかわらず該アミノ酸配列は機能的活性を保持している。たとえば、オボアルブミン誘導好酸球増加症（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）を抑制し、具体的には
１０ ％を超える、好ましくは２５％を超える、とくに好ましくは ５０％を超える程度まで 好酸球数を減少させ、および／または特定のサイトカイン、具体的にはインターロイ
キン−１β （ＩＬ−１β）、ＩＬ−２、ＩＬ− ６、ＩＬ−８、 ＩＬ−１０、ＩＬ−１
２、ＩＬ−１２レセプター、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦα）、インターフェロン−γおよび
顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ− ＣＳＦ）の産生を増加させ、たとえば正常レベルの１０倍を超える、好ましくは１００倍を超える増加であり、および／またはＴＨ１応答の刺激である。
【００２５】
サイトカイン刺激は、様々な方法により測定できる。たとえば、バッフィコート血液をＰＢＳ−２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で３倍に希釈する。その３０ ｍｌを１５ ｍｌ の Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ （Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７）上に重層し、室温で３０ 分
間、 ７００ ｇ （１８００ｒｐｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機）で遠心分離する。注意
深く単核細胞の層を吸引してその細胞を２回ＰＢＳで洗浄する。該細胞は、最終的に、２
ｘ １０６ 細胞／ｍｌに懸濁する。ＰＢＭＣは、次に ２ ｘ １０６ 細胞／ウェル濃度
で、２％ ＦＣＳ、グルタミンおよびＰｅｎ／ｓｔｒｅｐを含む ＲＰＭＩ 培地に播種す
る。１時間インキュベートして、単球をプレート表面に付着させる。該プレートは１回ＰＢＳで洗浄する。
【００２６】
Ｔ 細胞を枯渇させたＰＢＭＣは、最初にＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ試薬（Ｓｔｅｍｃｅｌ
ｌ）とともに２０分間、室温でインキュベートすることを除き、同様にして得ることができる。
【００２７】
サイトカインのアッセイは、当業者の知識の範囲内にある。たとえば、ＩＬ６ および ＩＬ８ 産生は、細胞の上清をそれぞれ １／１０ および １／１００に希釈してから測定できる。ペアの抗体および標準抗体は、国立生物標準規格研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）から入手でき、推奨された通り使用する。
【００２８】
サンプル調製は次の通りにしてできる： Ｃｐｎ６０．１ および Ｃｐｎ６０．２は、 Ｌｉｏｎｅｘ （ドイツ）から入手できる。両タン白質は、煮沸またはオートクレーブに
かける前にＰＢＳ中に２００ μｇ／ｍｌ 濃度に希釈する。煮沸サンプルは、１００°Ｃ、 ２０ 分間インキュベーションし、次いで氷上に直接置くことにより得られる。オートクレーブ処理サンプルは、１２０°Ｃで ２０分間、２回オートクレーブにかけることで
得られる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４−２０％ グラジエントゲル （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）上で実施できる。プレ染色タン白質マーカーは、 Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社か
ら得られる Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ
である。ＦＡＣＳ 分析は、ＦａｃｓＣａｎ装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
およびＷｉｎＭＤＩプログラム、バージョン２．８を用いてデータを解析することにより実施できる。
【００２９】
アミノおよび／またはカルボキシル末端融合タン白質またはポリペプチドは、「付加」変異体の意味の中に含まれ、ポリペプチド配列に融合した、付加的なタン白質またはポリペプチドを含む。
【００３０】
とりわけ好ましいのは、生物変異体といった自然界に生じる等価体であり、たとえばアレルの、地理上のまたはアロタイプの変異体および公知の技術を用いて調製される誘導体である。たとえば、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、化学的ペプチド合成、部位特異的突然変異、ランダム突然変異または酵素的開裂および／または核酸の連結といった公知の技術を用いる組換え体の形態のうち、いずれかの方法で調製できる。
【００３１】
本発明は、異なる原核生物からの等価体および関係する分子に向けられる。たとえば細菌の属、種または株から、とりわけＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、具体的には 結核菌
、Ｍ． ｂｏｖｉｓおよび Ｍ． ａｆｒｉｃａｎｕｍを含む結核菌複合体からの等価体で
ある。そうした配列自体も修飾されていてもよく、特に機能を保持して提供される誘導体化である。
【００３２】
タン白質の誘導体は、合成／単離後の修飾あるいはたとえば修飾残基を用いる合成中の修飾、あるいは適切であれば修飾核酸分子の発現により調製できる。
本発明の機能的に等価なフラグメントは、切り詰めによるもの（Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）であってもよく、たとえばＮおよび／またはＣ末端からのペプチドの除去、あるいは適切な活性のあるドメイン領域、たとえば機能を保持しているエピトープ領域の選択による。そのようなフラグメントは、図１の配列から誘導されてもよく、あるいは図１に開示されたものと機能的に等価なタン白質から誘導されてもよい。
【００３３】
機能的フラグメントが選択される場合、それらのフラグメントは、元の分子に帰される機能を必ずしも示す必要はないことは理解されるであろう。したがって、機能的に等価なタン白質またはフラグメントは、関係のある機能的特性を保持するものであり、そのためフラグメントは、本発明による有用性、具体的には上記のように、好酸球増加症の抑制、特定サイトカイン産生の増加および／またはＴｈｌ免疫応答の刺激を保持する。
【００３４】
好ましくは、上記フラグメントは、鎖長６〜４００ 残基、具体的には６〜１００また
は１５〜１００ 残基、 好ましくは ６〜３０、１０〜２５、１５〜５０または１５〜３
０残基である。とくに好ましいフラグメントは以下の残基に由来するか、または以下の残基からなる：
1-8 MSKLIEYD、 (8)
14-21 AMEVGMDK (8)
40-48 AKAFGGPTV、 (9)
64-71 PFEDLGAQ、 (8)
96-105 QALIKGGLRL、 (11)
110-129 VNPIALGVGIGKAADAVSEA、 (20)
132-143 ASATPVSGKTGI、 (12)
144-155 AQVATVSSRDEQ、 (12)
160-175 VGEAMSKVGHDGWSV (16)
179-200 STLGTELEFTEGIGFDKGFLSA、 (22)
195-219 KGFLSAYFVTDFDNQQAVLEDALIL、 (25)
206-219 FDNQQAVLEDALIL、 (14)
221-229 HQDKISSLP、 (9)
264-271 AIRKTLKA、 (8)
276-293 GPYFGDRRKAFLEDLAW、 (18)
299-314 VNPDAGMVLREVGLEV、 (16)
315-326 LGSARRVVVSKD (12)
327-342 DTVIVDGGGTAEAVAN、 (16)
343-353 RAKHLRAEIDK、 (11)
379-391 VGAATETALKERK (13)
392-400 ESVEDAVAA、 (9)
411-433 PGGGASLIHQARKALTELRASLT、 (23)
434-449 GPEVLGVDVFSEALAA、 (16)
450-463 PLFWIAANAGLDGS、 (14)
464-471 VVVNKVSE、 (8)
480-494 VNTLSYGDLAADGVI、 (15)
501-526 RSAVLNASSVARMVLTTETVVVDKPA、 (15)
526-539 KAEDHDHHHGHAH (14)。
図１に掲げられた配列に対し、機能的に等価な核酸の配列／フラグメントは、本発明の組成物にも使用される。これらの配列は、コードする（上記に定義したように）機能的に等価なタン白質／ペプチドに関して明確にされる。
【００３５】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」は、非ストリンジェント条件 （６ ｘ
ＳＳＣ／５０％ ホルムアミド、室温） で結合し、ならびに高ストリンジェンシーな条
件、すなわち ２ ｘ ＳＳＣ、 ６５°Ｃ （ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０． ０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、 ｐＨ７．２）で洗浄される配列である。
【００３６】
本明細書で述べる「製剤的に許容される」は、生理学的に許容される賦形剤のみならず、組成物の他の成分と共存できる成分について言う。
本発明に基づく医薬製剤は、容易に入手できる成分を用いて、従来の方式で処方することができる。したがって活性のある成分（すなわち、核酸分子またはタン白質／ペプチド）を、必要に応じて他の活性物質ならびに１つ以上の通常使用される担体、希釈剤および／または賦形剤と一緒に含有して、錠剤、ピル、 散剤、トローチ剤、小袋剤、カシェ剤
、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、 シロップ剤、エアゾル剤 （固体としてまたは液体媒体中に）、軟膏剤、軟および硬ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射溶液、無菌包装散剤などといった通常のガレヌス（ｇａｌｅｎｉｃ）製剤を形成することができる。
【００３７】
上記のような組成物には前記の核酸分子、ポリペプチドの作用を支援するか、または増強する分子を追加して含んでいてもよい。たとえばサリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）（およびその類縁体）、低用量のシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、 ＬＰＳ、 サイトカイン、 ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ） ＣｐＧ オ
リゴデオキシヌクレオチドおよび他の免疫調節薬および／または抗炎症性剤、たとえばサイトカイン・アンタゴニストまたはグルココルチコステロイドである。
【００３８】
したがってたとえば上記組成物は、特別の免疫治療のために活性のある成分と一緒に使用してもよい。本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドを含む、適当な免疫治療用の処置剤／ワクチン製剤には、サブユニット・ワクチンあるいは細胞特異的抗原、関係した抗原もしくは抗体または抗イディオタイプ・抗体に基づく処置剤または治療またはワクチン接種用の細胞全体の調製物が挙げられる。治療またはワクチン接種に使用される場合、本明細書で記載した核酸分子またはポリペプチドは、抗原に対する特定の免疫応答をもたらす該抗原を提供する（またはコードする）ことができ、および／または一般的で非特異的な免疫応答となるかも知れない。後者の場合、他の活性成分を含む組成物を用いる際、本明細書で記載した核酸分子／ポリペプチドは、アジュバントとして作用し、したがってこの目的に使用できる。
【００３９】
予防用または治療用の製剤は、１つ以上の製剤学的に許容される担体または希釈剤の存在下で１つ以上の好適なアジュバント、たとえば不完全フロインドアジュバント、ＢＣＧ、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、水酸化アルミニウム、サポニン、ｑｕｉｌ Ａ 、またはそれらのさらに精製された形態、ムラミルジペプチド、鉱油または植物油、ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）または非イオン性のブロックコポリマーまたは ＤＥＡＥ デキストラン、を含むように処方してもよい。好適な担体には、生理食塩水溶液といった液体媒体が含まれる。
【００４０】
好適な担体、賦形剤および希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、 リン酸カルシウム、アグ
リネート（ａｇｌｉｎａｔｅｓ）、トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、 セルロース、 水シロップ、 水、 水／エタノール、 水／グリコール、 水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、 メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシ
ベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油または脂肪物質、たとえば硬性脂質またはそれらの適当な混合物などが挙げられる。上記組成物は、付加的に、潤滑剤、保湿剤、乳化剤、 懸濁化剤、 保存剤、 甘味剤、 香味剤などを含んでもよい。本発明の組成物は、患者に投与した後、活性成分の迅速な、持続する、または遅延した放出を与えるように公知の手順を使用することにより処方することができる。上記組成物は、適切な投与形態、たとえば、エマルジョン、またはリポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などとすることができる。
【００４１】
必要なら上記組成物は、活性成分に結合したターゲティング部分を含んでもよい。たとえばリンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮細胞、 上皮細胞、血液細胞、 赤血球、血小板、好酸球、好中球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、脳細胞、心臓細胞、肺細胞、島細胞、 腎臓細胞、ホルモン分泌腺細胞、皮膚、骨、関節、骨髄、胃腸粘膜、リンパ
節、パイエル板、大網および他の免疫組織などへのターゲティングといった特定の細胞型または位置へのターゲティングを可能とする、内因性レセプターに特異的かつ選択的に結合するリガンドである。
【００４２】
上記組成物は、自己免疫疾患、免疫亢進病態、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない病態を治療または予防には有用性がある。
【００４３】
よって、本発明の別の態様として、自己免疫疾患、（たとえば異種の細胞または組織の移植後の拒絶を防止するための）免疫亢進病態、アレルギー反応および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態および／または好酸球増加症に関係する病態といったガンではない病態を治療または予防する際に使用される医薬製剤として、好ましくは免疫抑制剤として、本明細書で記載される医薬組成物が提供される。
【００４４】
別の局面から本発明は、前記の医薬組成物を投与された患者において、自己免疫疾患、免疫亢進病態、アレルギー性応答および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない病態を治療するかまたは予防する方法を提供する。
【００４５】
さらに、本発明は、自己免疫疾患、免疫亢進病態、アレルギー疾患および／またはＴｈ２−型免疫応答に代表される病態、および／または好酸球増加症に関係する病態といった、ガンではない病態を治療するかまたは予防するための医薬製剤を製造する際において、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列 、 または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％ もしくは ７５％、
好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前
記のテストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、 ｐＨ ７．２）の条件下で、（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図１のヌクレオチド配列によりコードされる配列と機能的に等価なタン白質をコードする配列、または
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子の使用、あるいは
（ｉ） 図１のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、あるいは
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列の機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチドの使用を提供する。
【００４６】
本明細書では、「治療」とは治療前の症状に対して、治療対象である１以上の病態症状を低減させ、軽減させ、または除去することをいう。たとえば、罹患する症状には、好酸球増加症、特定のサイトカイン分泌減少、Ｔｈ２に偏倚した免疫応答、アレルギー応答、自己抗体の存在などが挙げられ、これらは機能的に等価なポリペプチドの機能特性について特に規定されたような効果を達成するように治療される。
【００４７】
病態の「予防」とは、前記病態の１以上の症状の発現または程度によって評価されるが、病態の発生を遅らせるか、または予防すること、あるいはその過酷さを軽減することをいう。
【００４８】
治療される、ガンではない病態には、特に自己免疫疾患として、たとえば溶血性貧血（Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎａｅｍｉａ）、血小板減少症（Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅ
ｎｉａ ）、甲状腺炎（Ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ
ａｎａｅｍｉａ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫糖尿
病（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、 重症筋無力症（ｍｙａｅｓｔｈｅｎ
ｉａ ｇｒａｖｉｓ）、 リューマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、アテローム性動脈硬化症 （ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および 自己免疫脳症（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）が挙げられる。
【００４９】
本明細書でいうガンではない免疫亢進の病態には、不適切な活性化、たとえば自己免疫病態が含まれるが、さらに望ましくない（が正常な）活性化、具体的には、外来性の細胞または組織（あるいは改変された内在性の細胞または組織） 、たとえばある器官または
骨髄をある個体の体内に移植することに起因する免疫応答も含まれる。
【００５０】
治療されるまたは予防されるべき、ガンではない病態には、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、
皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔ
ｉｓ）、アレルギー性結膜炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、ア
レルギー性気道疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒ−ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、接触性皮膚炎（
ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、食物アレルギーならびに好酸球気道炎症（ｅ
ｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）および気道過敏症（ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）に代表される呼吸疾患、これ
には、たとえばアレルギー性喘息（ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｓｔｈｍａ）、内因性喘息（ｉ
ｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｓｔｈｍａ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ａｌｌｅ
ｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、好酸球性肺炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、アレルギー性気管支炎、気管
支拡張症（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｔａｓｉｓ）、職業性喘息（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ａｓｔｈｍａ）、反応性気道疾患症候群（ｒｅ
ａｃｔｉｖｅ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、間質性肺疾患（ｉｎ
ｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、過好酸球性症候群（ｈｙｐｅｒｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、寄生虫性肺疾患（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）などが挙げられる。
【００５１】
しかしながら上記組成物は、喘息の治療に好ましく使用される。さらに好ましい態様において、該組成物は好酸球増加症がある役割を演じている病態、たとえばアレルギー（上記のように、とりわけ喘息）、アトピー性疾患および肺好酸球増加症を治療するために使用される。
【００５２】
治療される患者として、限定するものでないが哺乳類、とりわけ霊長類、飼育動物および家畜が含まれる。よって、特に好ましい治療の動物として、マウス、ネズミ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマが挙げられ、 とりわけ好ましくは、ヒトで
ある。
【００５３】
すでに述べたように、本発明による方法では核酸分子またはポリペプチドのいずれかが使用される。核酸分子を使用する場合、核酸分子は患者内で発現させる形態で便利に使用され、よって遺伝子治療の形態となる。したがって本明細書で記載された、核酸分子を含む医薬組成物は、遺伝子治療方法において使用することができる。
【００５４】
上記核酸分子は、たとえばリポソーム、ミセルまたは関心が向けられた細胞へのターゲティングを可能とするターゲティング部分を含む、他の適当な搬送ベヒクルで提供されてもよい。
【００５５】
あるいは、上記分子は、ウィルス、プラスミドまたは 細胞 （とりわけトランスフェクトされた種に適合する細胞）などの他の「ベヒクル」に包含されてもよい。これらは、そうした駐在分子の発現をもたらす目的のために当該技術分野ではいずれも周知である。
【００５６】
トランスフェクションのための適切な技術はよく知られており、これには、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、吸着、ウィルス・トランスフェクションおよびプロトプラスト融合などが挙げられる。
【００５７】
本発明の組成物の投与は、従来的な任意の経路で行なわれてもよく、具体的には、吸入によるか、経鼻的に、経口的に、経直腸的にあるいは筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内の注射といった非経口的による。皮膚に組成物、たとえば軟膏を局所投与することによる治療または予防も可能である。
【００５８】
投与は、必要に応じた間隔をおいて行なわれ、たとえば２回またはそれ以上の適用、具体的には毎時間、毎日、週ごとまたは月ごとの間隔で２−４回の適用あるいは１日、３−５日ごとに、または ２週間ごとに、毎月または季ごとの間隔で数回の適用である。
【００５９】
関係する分子ｃｐｎ６０．２について行なわれた研究において、投与経路は生起する免疫応答に影響を及ぼすことが観察されている。たとえば、Ｍｔｃｐｎ ６０．２が鼻腔内
に投与されると、Ｔｈ２からＴｈｌへのシフトが刺激され、腹腔内に投与されると反対の効果が観察された。このため投与経路は、治療または予防する疾患を考慮に入れるべきである。たとえば自己免疫疾患を治療する際は、腹腔内投与が適切であり、他方、特定のアレルギー性疾患の治療または予防には、たとえば鼻腔内投与が適切である。
【００６０】
本発明の予防方法において、投与 （好都合には経口的に、または吸入、あるいは皮下
もしくは筋肉内注射）は、好ましくはもっと長い間隔、具体的には２−１２週の間隔で実施される。治療目的には、投与（好都合には経口的に、または吸入、あるいは静脈内注射） １日にまたは２日にわたって１−４回行なわれる。
【００６１】
本発明の組成物中の活性成分は、処方物重量の約０．０１重量％ 〜約９９重量％含有
される。 好ましくは約０．１〜約５０％、たとえば１０％である。該組成物は好ましく
は投与形態単位で処方され、具体的には各投与単位には約Ｏ．Ｏｌｍｇ〜約ｌｇの活性成分を含有する。たとえば、ヒトに対して０．０５ｍｇ〜０．５ｇで、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００６２】
投与される活性化合物の正確な投与量ならびに治療期間の長さは、たとえば患者の年齢および体重および治療に求められる特別の条件、その重篤度、および投与経路を含む多数の要因にもちろん依存する。しかしながら一般的には、有効用量は、投与する動物、投与形態に応じて、単一の投与として約Ｏ． １μｇ／ｋｇ 〜約１４ｍｇ／ｋｇの範囲内にあり、好ましくは ０．１ 〜ｌｍｇ／ｋｇ、たとえば１日あたり、約１ｍｇ〜ｌｇのポリペプチドである。よってたとえば、成人の１日あたりの適切な用量は、７μｇ〜１ｇ、たとえばｌＯｍｇ〜ｌｇ／日、あるいは２５〜５００ｍｇ／日のポリペプチドである。
【００６３】
本明細書に記載された核酸分子を使用するときは、類似のまたはより少ない用量が用いられてもよく、具体的には約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ （たとえば 約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２ｎｇ／ｋｇまたは約１．５ｎｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ）、成人には約１４ｎｇ〜約１７５ｍｇである。しかし、核酸分子が細胞またはベクターに包含される場合には、非ｃｐｎ コードＤＮＡの規模ならびに発現レベルに影響を及ぼす配列に
よっては、より多いかまたはより低い量が相応に必要となるかも知れない。具体的には５− または １０倍多い量である。たとえばベクターに包含された本明細書に記載の核酸分子では、約１．Ｏｎｇ／ｋｇ〜約１２．５ｍｇ／ｋｇで使用することができる。
【００６４】
上述のように本明細書で規定したポリペプチドのファミリーおよびそれらをコードする核酸分子は、サイトカイン群の産生を刺激する。それゆえこのことは、治療／予防の状況においてそれが生起するか否かにかかわらず、これらのサイトカイン産生を刺激する発現目的のためにこれらの化合物の使用を許容する。
【００６５】
よってさらなる面において、本発明は細胞のサイトカイン産生を刺激する方法を提供する。その方法は、
（ｉ） 図１のヌクレオチド配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６６％を超える、たとえば ７０％もしくは７５％、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の 同一性（前記の
テストによる）を有する配列、あるいは ２ ｘ ＳＳＣ、６５°Ｃ （ここで ＳＳＣ ＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の条件下で、
（ｉ）の配列とハイブリダイズし、図１のヌクレオチド配列によりコードされる配列と機能的に等価なタン白質をコードする配列、あるいは
（ｉｉｉ）機能的に等価なタン白質フラグメントをコードする、（ｉ）または（ｉｉ）配列のフラグメント；
を含む核酸分子、あるいは
（ｉ） 図１のアミノ酸配列、または
（ｉｉ） （ｉ）の配列に対して６０％を超える、たとえば６５％もしくは７０％ 、好ましくは ８０％ を超える、具体的には９０％を超える、または９５％の同一性（前記のテストによる）を有して、機能的に等価なタン白質を与える配列、または
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の配列の機能的に等価なフラグメント
を含むポリペプチド
の上記細胞に対する投与を含む。
【００６６】
そのような方法は、インビトロで、すなわち生体外の細胞、組織または器官について実施することができる。具体的にはこの方法論は、本発明の分子、たとえばｃｐｎ ６０．
１ レセプター分子と反応するか、それに結合するか、あるいはそれにより活性化される
分子もしくは分子群を同定するための研究方法において使用することができる。このような方法に対する１つの帰結として、サイトカイン産生の刺激は、本発明分子の存在を測定するために用いることができる。
【００６７】
したがって、別の面から本発明は、 サンプル中に本発明のポリペプチドまたはペプチ
ドの存在または濃度を評価する方法を提供する。その方法では、上記サンプルが細胞に適用されて、１つ以上のサイトカイン産生が測定され、対照サンプルにおけるそ（れら）のサイトカイン産生のレベルと比較される。ここで対照レベルを超える上昇は、当該サンプルにおいて上記ポリペプチドまたはペプチドの存在または濃度との関係を与える。
【００６８】
本明細書で用いる「対照」とは、本発明の分子または測定されるサイトカイン（類）の産生を増大させる部分を含まないサンプルを言及するものである。適切であれば、本発明の分子を用いて標準曲線を作成してもよく、これにより該分子の存在または濃度について、定性的評価も可能であるが、定量的評価をなすことを可能とする。この方法は、本発明の分子を同定するためにさらに使用することができる。
【００６９】
しかしながら代わりに、特定サイトカインの産生を増強すべく、インビボでサイトカイン産生を刺激する方法が実施されてもよい。このことは治療上または予防上の効果に利点を有するものである。この場合において本発明は、特定のサイトカインを増加させることにより軽減され、克服されるかまたは防止される病態を治療するために使用される上記の核酸分子およびポリペプチドならびにその目的用の医薬製剤の調製のため、そうした分子の使用に拡張される。
正常レベルより１０倍を超えて、または１００倍を超えて増大させるサイトカインは、好ましくは ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮ
Ｆα、インターフェロン−γおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される。
定義
「自己免疫疾患」 本用語は、自己免疫のプロセスがある疾患の病因に関与することが示され得る場合をカバーすることを意図している。典型的にはそのような病気はＴ ヘルパ
ー リンパ球−１ （Ｔｈ−１） 型免疫応答に関係している。
「アレルギー病態」 本用語は、Ｔ ヘルパー リンパ球−２ （Ｔｈ−２） 型免疫応答に関係する病態をカバーすることを意図している。アレルギー反応において、高いＩｇＥレベルが生起し、Ｔｈ−２ 免疫応答がＴｈ−１応答よりも優勢となり、その結果、炎症性
の応答となる。アレルギー病態の例として、喘息、鼻炎／枯草熱、（ｒｈｉｎｉｔｉｓ／ｈａｙ ｆｅｖｅｒ）、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）およびアナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌ
ａｘｉｓ）が挙げられる。
「アジュバント」 この用語は、抗原と一緒に取り込まれるか、あるいは同時に投与されると免疫応答が増強される物質をいずれもカバーする意図で用いられている。
「ＭＴ６０．１」、「Ｍｔｃｐｎ６０．１」、「ｃｐｎ ６０．１」、「６０．１」は、
図１に示されたアミノ酸配列を言及するため、本明細書中では互いに交換できるように使
用される。
【００７０】
［実施例］
次に実施例を通して本発明をより詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１はサイトカ
インの強力な誘発因子（ｉｎｄｕｃｅｒ）である。
本実験において、精製Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１ 組換えタン白質のサイトカイン誘導活性をＥＬＩＳＡにより調べた。
方法
シャペロニン６０タン白質の発現および精製
Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ １０、６０．１ および ６０．２は、Ｍ． Ｓｉｎｇｈ教授 （ＷＨＯ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ、ドイツ）により通
常のクロマトグラフィーを用いて下記のようにして調製された。
組換えｃｐｎ６０．２の精製
該タン白質は、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．２をコードするプラス
ミドを担持する、加熱誘導（４２°Ｃ）組換えＥ． Ｃｏｌｉ Ｋ１２ 細胞から得られた
。細胞を超音波処理により溶解した。
【００７２】
その上清をアニオン交換クロマトグラフィー カラムでクロマトグラフィーを行なった
。透析後、ｃｐｎ ６０．２を含むフラクションは、２番目の異なるアニオン交換クロマ
トグラフィー カラムでさらに精製を行なった。最終的に、タン白質溶液は、その小分け
および凍結乾燥をする前にｌＯｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に対し透析を行なった。
【００７３】
タン白質各バッチのＬＰＳ汚染について、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（Ｔａｂｏｎａ ら
、 １９９８、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１、ｐ１４１４−１４２１）を用いてチェ
ックすることにより充分な注意を払った。もしＬＰＳ汚染が検出されたならば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）アフィニティカラム上でそれを除去し、ＬＰＳレベル
を再びアッセイした。
【００７４】
低ＬＰＳの組換えシャペロニンはさらに“Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ カラム”上で、汚染するタン白質および ペプチドを除去して精製した（Ｔａｂｏｎａ ら、１９９８、上記）。
【００７５】
ヒトＰＢＭＣにおいて、ｃｐｎ ６０．１ および ｃｐｎ ６０．２による、ＩＬ−１β、ＩＬ− ６、 ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦαおよび ＧＭ−ＣＳＦの産
生へのインビトロ効果を、Ｔａｂｏｎａら（１９９８、上記）に記載されたように２−サイトＥＬＩＳＡを用いて決定した。
結果
結果が図２に示されている。驚くべきことにｃｐｎ ６０．１ タン白質は、よく研究されたｃｐｎ ６０．２ または ｈｓｐ６５よりもさらに強力なサイトカインインデューサ
ーであることがわかった。ｃｐｎ ６０．１ タン白質は、ｃｐｎ ６０．２よりも２の対
数次数分（１０２オーダー）、強力であることに加えて、ヒト単球においてｃｐｎ ６０
．２ またはＬＰＳよりも著しく大きい最大級の応答を亢進する。
【００７６】
興味深いのは、両シャペロニンは、いずれもＩＬ−１２ 産生を刺激するが、抗ミコバ
クテリア性（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）サイトカイン、ＩＦＮ−γの産生を促進できなかった。これに関連して、我々は多数のｃｐｎ ６０−由来ペプチドを調べた。推定さ
れるｃｐｎ ６０．１ Ｔ細胞エピトープ・ペプチド、１９５−２１９が、ＩＦＮ−γの産生も含めて（データは示されていない）サイトカイン産生の強力なインデューサーであることがわかった。Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．２ およびＥ． ｃｏｌ
ｉ ｃｐｎ ６０ タン白質、ｇｒｏＥＬ、における同じペプチドは、サイトカイン誘導活
性を欠いていた。（Ｌｅｗｔｈｗａｉｔｅ、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ およびＣｏａｔｅｓ、
未発表データ）。これらの知見は、単球／マクロファージへのＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１の作用を確認するものであり、したがって、ある病態の治療または予防においてそれらの利用を確認する。
【実施例２】
【００７７】
マウスにおいてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１は喘息を抑制する。
本実施例では、アレルギー性炎症のげっ歯類モデルにおいてＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１ タン白質が、免疫したマウス気道への好酸球の動員を阻害する
ことを初めて示す。
【００７８】
好酸球応答へのｃｐｎ ６０．１の効果は、用量および時期に依存する。これらの結果
から、Ｍｔｃｐｎ ６０．１がマウスの気道炎症を変調させることを示している。よって
、アレルギー疾患の治療および予防について重要な示唆を有する。
方法
炎症のげっ歯類モデル
抗原投与後に、気道における好酸球および Ｔ リンパ球の漸加の定量を可能とするアレルギー性炎症のげっ歯類モデルが開発された。さらに肺モニタリングシステムが使用され、これは気管支収縮剤アゴニストに対する肺の機能における変化をインビボで測定することを可能とする。
免疫化プルトコル
Ｃ５７Ｂ１／６ 野生型 （地域の供給者）の６−８ 週齢マウスは、０日目に、オボア
ルブミンを用いて免疫され （１０μｇ 腹腔内注射； １ ｍｇ 水酸化アルミニウム） 、７日後に繰り返した。１４、 １５ および １６日目に マウス は、プレキシガラス（ｐ
ｌｅｘｉｇｌａｓｓ）容器（１２ Ｌ）に収容して、霧状にしたオボアルブミン溶液（１
０ ｍｇ／ｍｌ； Ｄｅ Ｖｉｌｉｂｉｓｓ Ｕｌｔｒａｎｅｂ ９０）に曝した。シャム免
疫の野生型マウスは、０日および７日目に水酸化アルミニウム１ｍｇ を注射し、１４− １６日目にオボアルブミンで抗原投与した。
【００７９】
エアゾール暴露は、毎日３回１時間の間隔で２０分間暴露させて行ない、気管支肺胞洗浄、免疫組織化学用の肺の採取および肺力学（ｌｕｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）は、最後
のエアゾール投与の後、２４時間して行なった。
【００８０】
オボアルブミンは、喘息患者がよく遭遇する呼吸器系のアレルゲンではないが、炎症げっ歯類モデルで観察されるＴｈ２応答は、ハウスダストのダニで免疫した後に見られるものに類似している。これら２つのアレルゲンにより生起されるＴｈ２ サイトカインのプ
ロフィールは、類似している。このオボアルブミンを用いる利点は、それが容易に入手でき、しかもこのアレルゲンの特異的な活性は、バッチ間で変動せず、そのため我々は、バッチ間で抗原投与量をコントロールできる。
ＢＣＧ処置
オボアルブミン（１０μｇ）で免疫してから６日目に、マウスに経静脈経路により Ｂ
ＣＧ （ｌｏｇ （ＢＣＧ ｖｉａｂｌｅ単位）：−４、−５ および−６）を注入した。
７日目、マウス は、オボアルブミン（１０μｇ）の ブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）注射を受けた。１３日目、マウス は６日目と同じ投与量、同一の投与経路にて２度目のＢＣ
Ｇ投与を受けた。１４日目、マウスは、プレキシガラス容器に収容し、霧状にしたオボア
ルブミン溶液（１％ 溶液）への３０分間暴露を１時間間隔で３回行なった。この操作を
１５および１６日目にも繰返した。最後のオボアルブミン暴露の２４時間後、マウスを麻酔にかけ好酸球を数えるために気管支肺胞洗浄を行なった。
Ｃｐｎ ６０． １／６０． ２ 処置
動物の同じバッチからのマウスをオボアルブミンで免疫し、Ｍｔｃｐｎ ６０．１ （１０μｇ／動物）を気管に直接点滴することにより処置した。マウスはＭｔｃｐｎ ６０．
１で、 ６日目 および１３日目、次いで１４、１５、および１６ 日目の投与プロトコル
の開始の３０分前にも処置した（総数５ 処置）。
結果
図３は、オボアルブミンで免疫した（シャムでない）マウスの気道への好酸球の有意の動員を示す。
【００８１】
図３は、またマウスにおいてＢＣＧが気道炎症を抑制することを示す。オボアルブミン免疫マウスにおいて、オボアルブミン投与は、肺の好酸球増加症を誘導し（５５±１２％、 ｎ ＝ ５、 Ｐ ＜ ０．０５ シャムに対する）、これは抗原の前にＢＣＧ（１０６
ｖｉａｂｌｅ 単位／ｍｌ）で 処置したマウスでは有意に抑制された。
【００８２】
図４は ｃｐｎ６０．１で処置した場合、しなかった場合に得られた結果を示す。オボ
アルブミン免疫マウス （ｏｖａ）における気管支肺胞洗浄液中に見いだされた好酸球の
パーセンテージは３７．７ ± ７．４ ％ （図５）であった。オボアルブミン投与に続く、気道への好酸球動員の有意の抑制が見られた（％ 好酸球 Ｍｔｃｐｎ ６０．１処置マウス； １２．６ ± ３．９ ％ Ｐ＜ ０．０５ 対照に対する）。このことは、 喘息に
おけるＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの保護効果についての強力な証拠を与える。
【００８３】
本出願人はさらに別の実験も行なった。その実験においてマウスは、 Ｍｔｃｐｎ ６０．１で２度の機会 （６ および１３日）だけ処置したが、 好酸球の動員は阻害されない
ことが観察された。これは好酸球の応答へのＭｔｃｐｎ ６０．１の効果が投与量および 時期に依存することを示している。
【００８４】
これらの結果から、喘息のげっ歯類モデルにおいて、Ｍｔｃｐｎ ６０．１ が好酸球性炎症を抑制できることが初めて示された。鼻炎／枯草熱、湿疹、アナフィラキシーといった他のアレルギー病態もまた、喘息と共通の機作（Ｔｈ−２ 細胞の過剰反応）を共有し
ている 。したがって、もし ６０−１が喘息を抑制することができるなら、他のアレルギー病態もまた抑制できるはずである。これは、そのタン白質がマウスの気道炎症を変調させる能力を有しているという仮説を支持するものである。このことは、アレルギー疾患および自己免疫疾患といったガンでない病態の治療および予防に対し重要な手がかりとなるものである。
【００８５】
６０．１の重要な利点は、それがアレルギー病態における急性症状の治療とは区別される予防的な治療を与え得るということである。 換言すれば、６０．１処置はアレルギー
病態の急性症状がさらに進行するのを防止できることである。
【実施例３】
【００８６】
自己免疫疾患： ６０．１はラットの関節炎を抑制する
本実施例では、関節炎のラットモデルにおいて Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐ
ｎ ６０．１ タン白質が、免疫されたラットでは骨粗しょう症、骨侵食および骨膜炎を抑制したことを初めて示す。これらのデータは、Ｍｔｃｐｎ ６０．１がラットにおいて関
節炎を変調させることを支持し、したがって関節炎疾患の治療および予防に重要な手がかりとなるものである。
方法
アジュバント／Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、関節炎患者がよく出会う刺激では
ないけれども、炎症ラットモデルに見られる Ｔｈｌ応答は、リューマチ性関節炎に観察
されるものに類似している。
【００８７】
これら２つのアレルゲンにより生起されるＴｈ１ サイトカインプロフィールは、類似
している。このアジュバントを用いる利点は、それが容易に入手でき、この刺激の特異的な活性は、バッチ間で変動せず、そこで我々は、バッチ間でアジュバント投与量をコントロールできる。
アジュバント関節炎を誘導する一般プロトコル
加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒト株Ｃ、 ＤＴ お
よび ＰＮ （Ｍｔｂ） は、乳鉢で微細に磨り潰し、軽パラフィンオイルに懸濁して最終
濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。
【００８８】
ラットは、上記Ｍｔｂ懸濁液の全１００μｌを尾の基底部で接種された （Ａｎｄｒｅ
ｗｓ ら１９８７）。動物を毎日、体重および臨床スコアを評価しながら、３−４週間観
察した。実験の最後に動物は炭酸ガス中で窒息死させ、血液および組織サンプルを採取した。
臨床スコア
関節炎誘導の日を０日目と設定し、関節炎を次の標準点数評価システムを用いて評価した （Ｃｕｒｒｅｙ および Ｚｉｆｆ、１９６８の評点から改変した）。
０． 炎症なし。
１． 僅かに赤くなり肢は膨張する。
２． 肢が膨張し、腱はもはや見られない。
３． 膨張は踝関節まで伸びる。
４． 大幅な炎症および踝関節の変形。
【００８９】
評価点数は動物ごとに集計し、可能な最大値を１６とする。ついでながら、尾は皮膚結節の有無にもとづき０〜１と評価できる。耳は、赤熱の状態の有無により０〜１と評価できる。尾および耳は、シャペロニン実験では評価されなかった。
引用文献
Ａｎｄｒｅｗｓ ＦＪ、 Ｍｏｒｒｉｓ ＣＪ、Ｋｏｎｄｒａｔｏｗｉｃｚ Ｂ、 Ｂｌａｋ
ｅ ＤＲ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔ
ｏｒｙ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ １９８７ ； ４６：
３２７−３３．
Ｃｕｒｒｅｙ ＨＬＦ、 Ｚｉｆｆ Ｍ． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔ
ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｔｉｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６８； １２７： １８５−
２０３．
実験の詳細
種：ウィスターラット、実験開始時、１６０−２００ｇ
系統（Ｓｔｒａｉｎ）： Ｂａｔｈ−誕生および離乳（ｂｏｒｎ ａｎｄ ｗｅａｎｅｄ）
性：雌
ケージ中の数：６
ヒートショックタン白質（シャペロニン）調製
Ｃｐｎ １０ （ｈｓｐ １０）： ２０ ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｌｍｌ）中、ｌｍｇ／ｍｌで供給
Ｃｐｎ ６０．１ （ｈｓｐ６０．１）： ｌＯｍＭ重炭酸アンモニウム（０．３ｍｌ）中
、 ２．２５ ｍｇ／ｍｌで供給
Ｃｐｎ ６０．２ （ｈｓｐ６５）： ｌＯｍＭ重炭酸アンモニウム（０．４５ｍｌ）中、 ３．３３ ｍｇ／ｍｌで供給
リン酸緩衝化生理食塩水 （ＰＢＳ）
無菌ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ および Ｍｇ ｕｓｅｄ （Ｇｉｂｃｏ）
ＰＢＳ、７２０μｌをＣｐｎ ６０．１調製物に、５７０μｌを Ｃｐｎ ６０．２調製物
に、および １２０μｌをｈｓｐ １０調製物に （容量で） 加えて、最終的にｌｍｇ／ｍｌとする。ｃｐｎ調製物（３２０μｌ）は、エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で小分けし注射時まで冷蔵庫中で保管した。残りは、ＥＬＩＳＡのために−７０°Ｃで再凍結した。
【００９０】
６匹のラットからなる５つのグループを、軽パラフィン油（アジュバント）中に粉砕した加熱殺菌Ｍｔｂ （ｌＯｍｇ／ｍｌ）を含むもの（１００μｌ）で尾から接種した（０
日目）。６ラットの１グループは、処置を受けなかった（ナイーブ（ｎａｉｖｅ））。すべてのラットは体重を測定した。４、５ および６日目に、アジュバントを受けた５グル
ープは、次のように処置した。
群１：処置なし （ＡＡだけ）
群２： 各ラットは、５０μｌのＰＢＳを尾から注入された（ＡＡ＋ベヒクル）。
群３： 各ラットは、５０μｌのｈｓｐ１０を尾から注入された（ＡＡ＋ｈｓｐ１０）。
群４： 各ラットは、５０μｌのｃｐｎ６０．１を尾から注入された（ＡＡ＋ｃｐｎ６０
．１）。
群５：各ラットは、５０μｌのｈｓｐ６５ （ｃｐｎ６０．２）を尾から注入された（Ａ
Ａ＋ｈｓｐ６５）。
群６：免疫なし（ナイーブ）
すべての動物は毎日評点をつけ、０、４、６、８、１１、１３、１５、１８ および２
１日目に体重を測定した。
結果
図６は、シャペロニン処置ラットで著しい抗体産生があり、無処置またはＰＢＳ−処置ラットではなかったことを示す。図６はまた、アジュバント処置ラットをｃｐｎ６０．１で免疫すると、最大量の抗体をもたらすことを示している。これは Ｔｈ２−応答の誘導
を示唆する。
【００９１】
図７は、ｃｐｎ ６０．１、６０．２ または１０を用いる処置をした場合としなかった合の結果を示す。ベヒクルだけの処置は、２１日後に臨床スコア１２を与えた。これは、６０．２により１４まで増加したが、ｃｐｎ １０により９に減少した。
【００９２】
６０．１を用いる処置は、ベヒクルのみの処置とは区別できなかった。このことから炎症性応答が６０．２によって増大し、１０により減少し、他方６０．１は効果がないという証拠を与える。
【００９３】
本出願人は、Ｘ線で関節部を調べた（図５、８、８ （ａ） および ８ （ｂ））。１０は、骨粗しょう症、骨侵食および骨膜炎についてＸ線スコアを上昇させたが、６０．２は、ベヒクルだけの場合と差異はなかった。
【００９４】
これらの結果は、Ｍｔｃｐｎ ６０．１が関節炎ラットモデルにおいて骨粗しょう症、
骨侵食および骨膜炎を抑制できることを初めて示す。このことは、ラットでは本タン白質が関節炎を変調する能力を有することを示すものであり、自己免疫およびアレルギー疾患の治療および予防に重要な手がかりとなる。
【００９５】
関節炎といった自己免疫疾患は、アレルギー性の病態（Ｔｈ−２ 細胞の過剰反応性） とは異なる機作（Ｔｈ−１ 細胞の過剰反応性）で作用していると考えられる。
したがって、６０．１が喘息 （Ｔｈ２） および関節炎（Ｔｈ１））ともに抑制することは驚くべきことである。
【実施例４】
【００９６】
アジュバント活性
正常ラットならびにｃｐｎ ６０．１を含む調製物および ６０．２を含む調製物、ＰＢＳ （緩衝液） のみを尾基底部で、皮下注射により投与したアジュバント 活性 （ＡＡ）ラットおよびｎａｉｖｅラット（免疫化なし）における抗体産生。 実験の詳細は実施例
３で記載されたものと同一である。
【００９７】
図６、９ および１０は、６０．１ および ６０．２処置ラットでは著しい抗体産生が
あり、ＰＢＳ処置動物または「ナイーブ（ ｎａｉｖｅ）」動物ではないことを示す。
よって、６０．１ および ６０．２は、極めて強力なアジュバント活性を有する。さらに、６０．１は、６０．２よりも４倍もの抗体応答を作り出した。したがって、ワクチン組成物において６０．１は、抗原に対し、アジュバントとして作用できる。
【００９８】
とりわけ好ましいワクチン組成物の例は、本発明の化合物を、次の抗原のうち、１つまたはそれ以上の抗原と一緒に含むものである：
炭疽（Ａｎｔｈｒａｘ）、コレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ヘモフィルス・インフルエンザｂ （Ｈｉｂ）（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂ（ＨＩＢ））、 肝炎Ａ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ）、肝炎Ｂ（ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ）、 インフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、日本脳炎（Ｊａｐａｎｅｓｅ
ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、麻疹 （Ｍｅａｓｌｅｓ）、流行性耳下腺炎（ｍｕｍｐｓ）および風疹（ｒｕｂｅｌｌａ （ＭＭＲ））、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ
）、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎双球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）、ポリオ（Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）（ｓａｂｉｎ および ｓａｌｋ ワクチン）、 狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）、三日はしか（ Ｒｕｂｅｌｌａ）、 天然痘（Ｓｍａｌｌｐｏｘ）および種痘症（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）、 ダニ起因性脳炎（Ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、結核（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ
）、チフス（Ｔｙｐｈｏｉｄ）、水痘／ヘルペス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ／Ｈｅｒｐｅｓ）、帯状疱疹（ｚｏｓｔｅｒ）、黄熱病（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ）および 獣医ワクチン用抗原（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）たとえば足および口腔疾患 ウィルス。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１−１】図１−１は結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのｃｐｎ ６０．１のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
【図１−２】図１−２は図１−１の配列の続きを示す。
【図２】図２は Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｐｎ ６０．１ および ６０．２ によるサイトカイン産生へのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）作用を示す； Ａ） ＩＬ−１β 、 Ｂ） ＩＬ−６、 Ｃ） ＩＬ−８、 Ｄ） ＩＬ−１０、 Ｅ） ＩＬ−１２、 Ｆ） ＴＮＦα および Ｇ） ＧＭ−ＣＳＦ、黒丸は、ｃｐｎ ６０．１を 白丸はｃｐｎ ６０．２を表す。
【図３】図３はマウスにおける気道炎症へのＢＣＧの作用を示す。
【図４】図４は、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）で誘導した肺の好酸球増加症のマウスにおいてｃｐｎ ６０．１を５用量、投与した後の好酸球レベルの減少を示す。
【図５】図５は オボアルブミンで免疫したマウス（ｏｖａ）の気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）中に見られた好酸球のパーセンテージは３７．７±７．４％であった。
【図６】図６はシャペロニン処置ラット（すなわち６０．１ および ６０．２で処置した動物）では有意の抗体産生が示され、その処置がないかまたはＰＢＳで処置した動物ではそれがなかったことを表すＥＬＩＳＡの結果である。略語： Ｎａｉｖｅ （免疫しない）； ＥＬＩＳＡで使用した抗原は、ｃｐｎ ６０．２ （”６５”）； ｃｐｎ ６０．１（”ｃｐｎ”） または ｃｐｎ １０ （”１０”）である。たとえば、ｙ軸上で”Ｎａｉｖｅ／６５”は、その動物が免疫されず、ＥＬＩＳＡで使用した抗原は６０．２であることを示す。 同様に ”ｃｐｎ／ｃｐｎ”は６０．１で免疫され、しかもＥＬＩＳＡで使用した抗原は６０．１であることを示す。
【図７】図７はｃｐｎ６０．１、６０．２ または１０による処置をした場合としない場合について、関節炎用の臨床スコアで表す効果を示す。
【図８】図８はｃｐｎ６０．１、６０．２ または１０による処置をした場合としない場合について、関節炎用のＸ線スコアで表す効果を示す。略語：”Ｏｓｔ”＝ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ（骨粗しょう症）；”Ｐｅｒｉ”＝骨膜炎； および”Ｅｒｏ”＝ ｅｒｏｓｉｏｎ（侵食）。図８（ａ）は、アジュバント誘導リューマチ性関節炎のウィスター・ラットをｃｐｎ６０．１で処置した効果を示す。関節炎は、油（アジュバント）中にある加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを、尾からの皮内注射を１回することにより誘導した。誘導後、４、５ および ６日目にＣＰＮ ６０．１ （５０ μｇ リン酸緩衝化生理食塩水中）を注射することにより処置した。疾患の進行は、足の炎症で評価して毎日観察した。関節炎が最大級になったとき（＞９日処置後）、Ｘ線スキャンを行なった。スキャン上部：アジュバントで誘導後、ＣＰＮ ６０．１で処置したラット後肢において骨密度および関節生理が正常ラットと区別できないことを示す。スキャン下部：ラットの後肢は、アジュバント誘導関節炎に典型的なリューマチ様障害：骨の侵食、骨粗しょう症、関節変化および閉塞を示す。これらは図８ｂにおいて注釈を付している。
【図９】図９は６０．１ で免疫したラットおよびＰＢＳで処置したラットにおける抗体産生の相対レベルを示す。
【図１０】図１０は６０．２で免疫したラットおよびＰＢＳで処置したラットにおける抗体産生の相対レベルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントとして、図１のヌクレオチド配列の核酸分子、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する組成物の使用の方法。
【請求項２】
（i）図１のヌクレオチド配列の核酸分子、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈
剤または担体を含有する組成物および
（ii）抗原
を含むアジュバント・システム。
【請求項３】
前記抗原が以下のものから、少なくとも１つ選択されることを特徴とする、請求項２に記載のアジュバント・システム：
炭疽、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス・インフルエンザb (Hib)、肝炎A、肝炎B、イ
ンフルエンザ、日本脳炎、麻疹、流行性耳下腺炎および風疹(MMR)、髄膜炎菌、百日咳、
肺炎双球菌、ポリオ、狂犬病、三日はしか、天然痘および種痘症,破傷風、ダニ起因性脳
炎、結核、チフス、 水痘/ヘルペス帯状疱疹、黄熱病および獣医ワクチン用抗原。
【請求項１】
アジュバントとして、図１のヌクレオチド配列の核酸分子、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈剤または担体を含有する組成物の使用の方法。
【請求項２】
（i）図１のヌクレオチド配列の核酸分子、ならびに製剤的に許容される賦型剤、希釈
剤または担体を含有する組成物および
（ii）抗原
を含むアジュバント・システム。
【請求項３】
前記抗原が以下のものから、少なくとも１つ選択されることを特徴とする、請求項２に記載のアジュバント・システム：
炭疽、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス・インフルエンザb (Hib)、肝炎A、肝炎B、イ
ンフルエンザ、日本脳炎、麻疹、流行性耳下腺炎および風疹(MMR)、髄膜炎菌、百日咳、
肺炎双球菌、ポリオ、狂犬病、三日はしか、天然痘および種痘症,破傷風、ダニ起因性脳
炎、結核、チフス、 水痘/ヘルペス帯状疱疹、黄熱病および獣医ワクチン用抗原。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図８】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図８】
【公開番号】特開２００８−１７４５６５（Ｐ２００８−１７４５６５Ａ）
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３７２９０（Ｐ２００８−３７２９０）
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【分割の表示】特願２００２−５４２４０９（Ｐ２００２−５４２４０９）の分割
【原出願日】平成１３年１１月１６日（２００１．１１．１６）
【出願人】（５０３１７９１７１）ヘルパーバイ セラピューティクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【分割の表示】特願２００２−５４２４０９（Ｐ２００２−５４２４０９）の分割
【原出願日】平成１３年１１月１６日（２００１．１１．１６）
【出願人】（５０３１７９１７１）ヘルパーバイ セラピューティクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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