生物材料中の核酸を安定化および／または単離するための新規な組成物
【課題】生物由来の材料中の核酸を単離および／または安定化するための新規な組成物を提供する。
【解決手段】一般式：Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基および／またはＣ６〜Ｃ２０アリール基ならびにＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を示すことができ、Ｘ−は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオン示すことが可能である）で示される必須成分としてのカチオン化合物を含む組成物。
【解決手段】一般式：Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基および／またはＣ６〜Ｃ２０アリール基ならびにＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を示すことができ、Ｘ−は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオン示すことが可能である）で示される必須成分としてのカチオン化合物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来の材料中の核酸を単離および／安定化するための新規な組成物に関する。その組成物は、
一般式：
【化１】
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基および／またはＣ６〜Ｃ２０アリール基ならびにＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を示すことができ、
Ｘ−は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示すことが可能である）で示されるカチオン化合物と、添加剤としての少なくとも１種類のプロトン供与体と、を必須成分として含有する。
【０００２】
好ましい組成物は、そのカチオン化合物がアンモニウム塩からなる組成物である（式中、Ｒ１が、高級アルキル基を示し、好ましくは炭素原子１２個、１４個または１６個を有する高級アルキル基を示し、いずれの場合も、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がメチル基を示す）。
【０００３】
式中、Ｒ１が、アルキル基、好ましくはベンジル基を示し、Ｒ２が、好ましくは炭素原子１２個、１４個または１６個を有する高級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ４がメチル基を示す組成物もまた好ましい。
【０００４】
臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩がアニオンとして好ましい。
【０００５】
Ｃ１〜Ｃ６アルキルは一般に、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい、炭素原子１〜６個を有する分枝もしくは非分枝炭化水素基を示す。以下の炭化水素基：
メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピルおよび１−エチル−２−メチル−プロピルが例として挙げられる。
【０００６】
高級アルキル基という用語は、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい分枝もしくは非分枝Ｃ７〜Ｃ２０アルキル基を表す。以下の炭化水素基：分枝もしくは非分枝ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、ドデカデシルおよびエイコシルが例として挙げられる。
【０００７】
Ｃ３〜Ｃ６アルケニルは一般に、炭素原子３〜６個を有し、１つまたは可能ならば複数の二重結合を有する、分枝または非分枝炭化水素基であって、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい炭化水素を示す。以下の炭化水素基：
２−プロペニル（アリル）、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル２−プロペニル、１，２−ジメチル２−プロペニル、１−エチル−２−プロペニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−メチル−２−ペンテニル、４−メチル−２−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、３−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、３−メチル−４−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、１，１−ジメチル２−ブテニル、１，１−ジメチル２−ブテニル、１，１−ジメチル３−ブテニル、１，２−ジメチル２−ブテニル、１，２−ジメチル３−ブテニル、１，３−ジメチル２−ブテニル、１，３−ジメチル３−ブテニル、２，２−ジメチル３−ブテニル、２，３−ジメチル２−ブテニル、２，３−ジメチル３−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、２−エチル−１−ブテニル、２−エチル−２−ブテニル、２−エチル−３−ブテニル、１，１，２−トリメチル２−プロペニル、１−エチル−１−メチル−２−プロペニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロペニルが例として挙げられる。
【０００８】
Ｃ３〜Ｃ６アルキニルは一般に、炭素原子３〜６個を有し、１つまたは可能ならば複数の三重結合を有する、分枝または非分枝炭化水素基であって、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい炭化水素を示す。以下の炭化水素基：
２−プロピニル（プロパルギル）、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、２−メチル−２−プロピニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−メチル−２−ブチニル、２−メチル−２−ブチニル、３−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、３−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル２−プロピニル、１，２−ジメチル２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−メチル−２−ペンチニル、２−メチル−２−ペンチニル、３−メチル−２−ペンチニル、４−メチル−２−ペンチニル、１−メチル−３−ペンチニル、２−メチル−３−ペンチニル、３−メチル−３−ペンチニル、４−メチル−３−ペンチニル、１−メチル−４−ペンチニル、３−メチル−４−ペンチニル、４−メチル−４−ペンチニル、１，１−ジメチル２−ブチニル、１，１−ジメチル２−ブチニル、１，１−ジメチル３−ブチニル、１，２−ジメチル２−ブチニル、１，２−ジメチル３−ブチニル、１，３−ジメチル２−ブチニル、１，３−ジメチル３−ブチニル、２，２−ジメチル３−ブチニル、２，３−ジメチル２−ブチニル、２，３−ジメチル３−ブチニル、１−エチル−２−ブチニル、１−エチル−３−ブチニル、２−エチル−１−ブチニル、２−エチル−２−ブチニル、２−エチル−３−ブチニル、１，１，２−トリメチル２−プロピニル、１−エチル−１−メチル−２−プロピニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロピニルが例として挙げられる。
【０００９】
別段の指定がない限り、アリールは、ヘテロ原子１個または２個を任意に含有することができ、炭素原子４〜２２個を有する芳香族単核基または多核基を示す。その例には：ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、好ましくはフッ素によって、またはアルキル基によって、互いに独立して任意に一置換または多置換することができる、フェニル、ナフチル、アントラシルまたはピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジンまたはピラジンが含まれる。
【００１０】
上記に定義されたように、アラルキルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ３〜Ｃ６アルケニレンもしくはＣ３〜Ｃ６アルキニレン架橋を介してカチオン部分構造に結合する、単核または多核アリール基を示し、そのＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニルおよびＣ３〜Ｃ６アルキニル基は上記で定義したとおりである。本発明の目的には、ベンジル基が好ましい。
【００１１】
適切な対イオンＸ−には、ハロゲン化水素酸のすべてのアニオン、または酢酸塩もしくはシュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩もしくはクエン酸塩などの、一塩基または二塩基有機酸のアニオンが含まれることが好ましい。
【００１２】
本発明の目的のための適切なプロトン供与体は主に、無機酸またはその塩の他に、単独でまたは組み合わせて、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸またはケトジカルボン酸ならびにアミノ酸である。上述のすべての有機酸を未置換状態で、または置換誘導体として使用することができ、別段の指定がない限り、未置換誘導体またはヒドロキシル基によって一置換もしくは多置換された誘導体であることが好ましい。
【００１３】
本発明の目的のための飽和脂肪族モノカルボン酸という用語には、ギ酸の他に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボン酸が含まれることが好ましく、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸（２−メチル−酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、およびｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）が好ましい。さらに、上述の酸から誘導されるケトカルボン酸もまた使用することができる。
【００１４】
本発明の目的に使用される不飽和アルケニル−カルボン酸の例には、例えばアクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸ならびにビニル酢酸が含まれる。
【００１５】
本発明に従って、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸もしくはアジピン酸などの飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸が好ましく、シュウ酸およびコハク酸が特に好ましい。
【００１６】
本発明に従って問題を解決するためには、脂肪族ヒドロキシ−ジ−およびトリ−カルボン酸を使用することが特に好ましく、タルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）−もしくはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸が最も特に好ましい。
【００１７】
マレイン酸もしくはフマル酸などの不飽和ジカルボン酸または、例えばアコニット酸などの不飽和トリカルボン酸もまた、本発明の問題の解決策として適している。
【００１８】
しかしながら、本発明の目的のために、例えばメソシュウ酸およびオキサロ酢酸などの脂肪族ケトジカルボン酸も添加剤として使用することができ、オキサロ酢酸が特に最も特に好ましい。
【００１９】
さらに、本発明に従って、アミノ酸を使用することもでき、例えばアミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸（イソロイシン）などのα−アミノ酸が好ましい。グリシンを使用するのが最も好ましい。
【００２０】
上述のプロトン供与体は、個々の物質として、または純粋な立体異性体の形態で、および混合物の状態でも、使用することができる。
【００２１】
無機酸およびその塩を、本発明に従って、更なる添加剤として使用することもできる。アルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩と、リン酸もしくは硫酸などの無機酸との塩を使用することが好ましい。リン酸および硫酸アンモニウムを使用することが最も好ましい。
【００２２】
本発明の目的における核酸という用語は、より広い意味での核酸を意味し、したがって、例えば、二本鎖、一本鎖、環状および直鎖、分枝などの、すべての長さまたは立体配置のリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸、およびそのすべての可能なサブユニット、例えばヌクレオチドモノマー、オリゴマー、プラスミド、細菌ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに動物および植物細胞由来のゲノムおよび非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ、プロセシングされた形態のｍＲＮＡ、プロセシングされていない形態のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ，ｃＤＮＡならびに考えられる他のすべての核酸が含まれる。
【００２３】
使用される、核酸を有する生物サンプルは、例えば参照により本明細書に組み込まれる欧州特許出願第９５９０９６８４．３号に開示されているように、無細胞サンプル材料、血漿、血液、血清、細胞、白血球画分、クルスタ・フロジスティカ（ｃｒｕｓｔａ ｐｈｌｏｇｉｓｔｉｃａ）、痰、尿、精液、糞便、スメア、吸引液などの体液、生検材料、例えば組織および器官の一部など、すべての種類の組織サンプル、本発明に従って考えられる、遊離もしくは結合核酸または核酸を含有する細胞を含む食物サンプル、例えば生物体（単細胞または多細胞生物；昆虫等）、植物および植物の器官、細菌、ウイルス、酵母および他の菌類または真核生物および原核生物等、あるいは遊離核酸であることができる。
【００２４】
本発明の技術的背景に関して：
その核酸を研究することによって、細胞の遺伝的起源および機能活性を決定かつ検討することができることは、従来技術から十分によく知られている。核酸およびタンパク質の分析によって、細胞活性の原因への直接的なアクセスが得られる。このように、それらは潜在的に、例えば代謝産物の検出など、間接的な従来の方法より優れている。したがって、分子生物学的分析は、多くの分野、例えば医学および臨床診断において、医薬組成物の開発および評価を行う製薬分野において、食品分析において、食品製造のモニタリングにおいても、作物および家畜を育てる農業において、ならびに環境分析および多くの研究分野において既に用いられている。
【００２５】
ＲＮＡ、特に細胞中のｍＲＡＮを分析することによって、遺伝子の活性を直接決定することが可能である。分子生物学の最新方法、例えば実時間逆転写酵素ＰＣＲまたは遺伝子発現チップ分析による、細胞における転写パターン（ｍＲＮＡパターン）の定量分析によって、例えば異常に発現した遺伝子を検出し、それによって、代謝異常、感染、または癌の発生を検出することが可能となる。例えば、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＮＰもしくはシークエンシングなどの分子生物学的方法による、細胞からのＤＮＡの分析によって、例えば遺伝的欠陥を検出すること、またはＨＬＡタイプおよび他の遺伝標識を決定することが可能となる。
【００２６】
ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの分析もまた、ウイルス、細菌等の感染性病原体を直接検出するのに用いられる。
【００２７】
その自然環境から生物サンプルを採取した直後に核酸およびタンパク質を安定化することは、核酸の分析に絶対に必須である。これは、生物サンプルを採取した後、非常に急速に分解し得るＤＮＡ、特にＲＮＡに当てはまる。一方、生物サンプルを一旦採取すると、ストレス遺伝子の誘導によって、新たなｍＲＮＡ分子が合成され、その結果例えば、細胞の転写パターンが変化する可能性がある。これによって、その後の分析が不正確となる可能性がある。特に医学分野では、核酸を含有するサンプルを採取し、次いで、それらを最初にしばらくの間保存し、実験室に輸送されるまで、さらに研究されないのが実際に一般的であるため、核酸を安定化することは必須である。
【００２８】
一方、サンプル中に含有される核酸は、変化するか、または完全に分解さえし得る。これは当然、続いて行われる試験の結果に多大な影響を及ぼすか、またはそれらを完全に不可能とする。かかる試験は、例えばノーザンおよびサザンブロット分析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳｕｎＲｉｓｅ、ＬＣＲ、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、ＳＤＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡチップおよび遺伝子発現アレイおよび突然変異分析、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＮＰ分析、ｃＤＮＡ合成、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）またはＴａｑｍａｎ技術および他の実時間の定量法など、分子生物学的技術を用いて行われる。一方、インタクトな高精製核酸−ＤＮＡまたはＲＮＡの使用は、上記の試験の使用または実施に対する基本的な適合性の基準となる。さらに、核酸を含有するサンプルの単離およびアッセイもまた、時間のかかる作業である。さらに、例えば試験が失敗した場合に生じるような、分子生物学分野で使用される研究実験室の汚染が、試験結果のエラーをまねく可能性がある。
【００２９】
従来技術に関して
数多くの出版物では、例えば組織などの適切なサンプルから核酸を続いて単離するための、固定液としてのエタノールおよびアセトンをベースとする混合物の使用が提案されている。この文献を研究した後、この種のエタノール／アセトン混合物は、ＲＮＡの安全な回収に課せられる必要条件をすべて満たすわけではないことが明らかである。このように、この種の混合物は、分解からＲＮＡを保護することができない。さらに、さらに広範な細胞凝集魂から構成される固体サンプル中でＲＮＡが保護される保証はない。さらに、提案された混合物は高い引火性または爆発性であり、実験室で作業する際にかなり危険性がある。
【００３０】
それに加えて、さらに周辺の関連する従来技術は、固定化または保存された組織サンプルからのＲＮＡの回収に関係する。これは特に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション中に達成されるシグナル強度を最大にする、組織標本の適合性に関する。換言すれば、この種の実験は、それを保存するよりもむしろ、ＲＮＡを検出することを意図するものである（米国特許第５１９６１８２号および５２６００４８号）。
【００３１】
他のレポートは、このようにして得られた断片をＰＣＲによる制限分子分析にかけることを可能にするために、固定組織から断片化ＲＮＡまたはＤＮＡを回収することに関する。この種の断片化ＤＮＡまたはＲＮＡを得るために、構造組織成分を分解することを可能にするため、対応するサンプルを従来法によりプロテイナーゼＫで処理する；次いで、単に、グアニジウム塩を含有する溶液でＲＮＡを抽出する。しかしながら、この方法によって固定組織から得られたＲＮＡは、品質が低く、大きさがわずか約２００塩基である。従来技術に従って、特に固定化中の細胞内基質内のＤＮＡまたはＲＮＡの内因性かつ架橋反応の負の影響を含む一定数の特定因子に、これを抑えることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡが大部分の場合で少なくとも一部分解するという事実に基づくと、このようにして得られたＤＮＡまたはＲＮＡは、もはやノーザン分析に上手く使用することはできない。このように単離されたＲＮＡは、比較的小さな断片を増幅するためにのみであるが、せいぜい多少の成功の見込みを持って、ＲＴ−ＰＣＲ反応に使用することができる程度である。
【００３２】
従来技術では、凝固点を超える温度でＲＮＡを保存するための、硫酸アンモニウムの使用もまた記述されている［ＷＯ００／０６７８０］。この種の組成物は、ＲＮＡｌａｔｅｒの名称で従来技術に従って使用されている。しかしながら、この種の硫酸アンモニウム水溶液は、血液、血漿または血清中のＲＡＮを安定化するのには適していない。上記のサンプルは高いタンパク質濃度を有するため、この種のアンモニウム塩溶液と接触するとすぐに、限られた溶解度の沈殿物が形成する［Ｍｅｓｓｒｓ Ａｍｂｉｏｎ（アメリカ、テキサス州オースティン）からのＲＮＡｌａｔｅｒ製品の情報］。
【００３３】
さらに、生物サンプルから核酸を単離するために、この種のカチオン化合物を使用することは、従来技術から知られている。かかる用途は、例えば米国特許第５，０１０，１８３号および同第５，３００，６３５号および欧州特許：ＥＰ０４４２０２６に記載されている。これらの出版物では、サンプル調製に通常用いられるインキュペーション時間、つまり約数分の間、生物サンプルをカチオン化合物と共にインキュベートし；次いで、その核酸を再度精製する。
【００３４】
従来技術から公知の化合物の研究によって、従来技術で言及されているカチオン化合物、特に米国特許に開示されているテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムは、例えば血液が長期間保存される場合に、それら自体で細胞ＲＮＡの適切な安定化を保証するものではないことが示されている。
【００３５】
実を言えば、例えば数日間血液中のウイルスを安定化することに着手している実験は従来技術から知られているが、これらの知見では、インタクトなままのＲＮＡについて何らの言及もされていない。このように、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）およびマクファーレン（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ）［Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４７，（１９９５） １５３］は、Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４（登録商標）による血液中のＣ型肝炎ウイルスの周囲温度で７日間の安定化について記述している。そのウイルスは、ＨＣＶゲノムの長さ２５０ｂｐの断片をＲＴ−ＰＣＲにより増幅することによって検出された。しかしながら、開示されたその結果からは、小さな断片のみが増幅されたため、ＲＮＡがインタクトである十分な証拠は得られなかった。さらに、その実験は、不定のウイルスサンプルを添加して行われ、そのため、保存中のウイルスＲＮＡの分解に関して判断を下すことは不可能であった。
【００３６】
さらに、国際特許出願：ＷＯ９９／２９９０４には、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、塩化リチウム、塩化マンガン、サルコシル、ＳＤＳ、過塩素酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムおよびチオシアン酸ナトリウムと共にＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはＢＡＰＴＡを用いた体液中のＤＮＡの安定化が記載されている。さらに、例えばＴｒｉｚｏｌ（登録商標）などのフェノールを含有する試薬を使用して、保存中にＲＮＡを安定化することができることは従来技術から知られている。しかしながら、これらの試薬はすべて、健康に非常に有害であり、したがって、常用するのには適していない。
【００３７】
そこで、本発明の目的は、組織または血液、血漿または血清の存在下にてＲＡＮを安定化する組成物を提供することである。
【００３８】
本発明はさらに、安定化溶液の形で組成物を提供することにも言及しており、その組成物の成分は健康に有害ではなく、したがって、サンプルを入手した場所から実験室へ移動する間、例えば生物サンプル材料を安定化するために、サンプルを扱うスタッフの健康を脅かす危険性なく使用することも可能である。
【００３９】
本発明の他の目的は、安定化試薬それ自体もまた溶液中で安定なままである必要性を満たし、かつ例えば限られた溶解度の沈殿物の溶解など、使用者による前処理が必要ない安定化溶液の形で組成物を提供することである。この種の前処理は常に、安定化効率の変動のリスクを含む。
【００４０】
本発明の他の目的は、多用途である、つまり幅広い生物サンプルに使用することができる組成物を提供することである。
【００４１】
驚くべきことに、特に米国特許第５ ０１０ １８３号および同第５ ３００ ６４５号に開示されており、かつ本発明に従って上述の１種または複数種の添加剤と組み合わせられる化合物などのカチオン化合物と、生物サンプルの核酸を接触させた場合に、長時間にわたり核酸を安定化することができることが現在見出されている。本発明に従って問題を解決するのに適切な好ましい添加剤を表１に示す：
【００４２】
【表１】
【００４３】
添加剤は、様々な濃度で安定化試薬中に存在することができる；例えば、添加剤は、安定化溶液と血液との混合物中に、容積比１：１、好ましくは３：１、濃度５０ｍＭ〜飽和、好ましくは１００〜１Ｍ、最も好ましくは２００〜５００ｍＭで存在することができる。添加剤の性質に応じて、他の濃度範囲が有利であることが証明される。異なる添加剤の組み合わせを使用することも可能である。
【００４４】
組成物水溶液中のカチオン化合物濃度は、０．０１重量％〜飽和、好ましくは０．１重量％〜飽和、さらに好ましくは０．５〜１５重量％、最も好ましくは２〜１０重量％の範囲である。
【００４５】
当然、カチオン化合物と添加剤との溶液を添加する場合には、最適な濃度は、生物サンプルのそれぞれの容積、および安定化溶液と生物サンプルとの容積比によって決定される。
【００４６】
一般にカチオン化合物と添加剤との混合物のｐＨを、広いｐＨ範囲（ｐＨ２〜１２）にわたりサンプルの関数として変化させることができ、ｐＨ２〜ｐＨ１０の範囲であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ３〜ｐＨ８の範囲である。好ましいｐＨ範囲は、使用する生物サンプルに依存する。血液、血漿および血清の場合には、ｐＨ２〜ｐＨ６の範囲、特にｐＨ３〜ｐＨ４のｐＨ値が好ましい。
【００４７】
血液、血漿および血清は別にして他の細胞体液、または例えば細菌、吸引液、細胞、組織、および上述のサンプルなど、他の生物サンプルの場合、カチオン化合物および添加剤からなる安定化溶液のｐＨ値は、好ましくはｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲、さらに好ましくはｐＨ４〜ｐＨ８の範囲である。
【００４８】
生物サンプル中の核酸を安定化するために、カチオン化合物（１種または複数種）および添加剤を含有する溶液とサンプルを混合することができる。生物サンプルを０．１〜１０，０００容積添加することができ；範囲１〜１０００の容積を添加することが好ましく、範囲１〜１００の容積を添加することが最も好ましい。しかしながら、例えば細い針による針生検または低細胞数の培養から得たサンプルなど、サンプルの性質に応じて、場合によってはかなり高い容積もまた用いることができる。
【００４９】
同様に、生物サンプル自体が固体を溶解する液体（例えば、細胞含有体液、培養液中の細胞、尿など）を含有する場合、または液体、例えば水をそれに添加して、固体を溶解する場合、上述のカチオン化合物および添加剤を固体状で添加することもできる。固体を添加する利点は、固体が通常、化学的に安定であり、固体はサンプルに添加するのが容易である場合が多いことである。
【００５０】
さらに、組織などの非常に緻密な生物サンプルの場合は特に、例えば、核酸もしくは個々の細胞もしくは細胞の凝集塊の開放を補助するために、安定化溶液中でまたは安定化溶液と混合する前に、例えばサンプルに対する機械的、化学的、物理的もしくは酵素的作用により緻密なサンプルを破壊することによって、サンプルを粉砕またはホモジナイズすることが可能である。機械的作用は、電気メス、ビーズミルを用いて、または例えばシリンジで押しつぶすことによって行うことができ、サンプルに対して作用する適切な酵素は、例えば加水分解酵素、プロテアーゼまたはリパーゼである。
【００５１】
さらに、そのサンプルは、純粋な物理的手段、例えば超音波によって前処理してもよい。
【００５２】
前処理は、化学的に、単独でまたは純粋な物理的方法と共に、実行することもできる。溶解を補助する手段には、例えば、脂肪族アルコール、特にイソプロパノール、またはアルデヒドまたはジアルデヒド、例えばグリオキサール、またはフェノールまたはフェノール誘導体、例えば２−ビフェニロール、またはイオン、双性イオンおよび非イオン化合物、例えばメルカプト、または還元剤、例えばジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノール、またはリン酸誘導体、例えばリン酸トリブチル、またはカオトロピック試薬、例えば尿素、チオシアン酸グアニジウムまたは塩酸グアニジウム、または塩を個々にまたは組み合わせて使用することが含まれる。
【００５３】
機械的、化学的、物理的または酵素的にサンプルに作用する他の可能な方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に含まれることを意図する。
【００５４】
特定の必要条件に応じて、サンプル材料をかなり長い期間、例えば室温で１日〜１４日以上保存してもよいが、例えば４０℃以上の高温、および例えば４℃または−２０℃以下などの低温でも保存してもよい。
【００５５】
上述の化合物の溶液中での生物サンプルの保存に続いて、直接核酸を分析する技術を用いるか、または核酸をサンプルから精製してもよい。
【００５６】
例えば、ブロット法、生体分子を分離するゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー法によって、核酸を直接検出／分離してもよい。
【００５７】
生物サンプルから核酸を精製するために、遊離核酸または核酸を含有する細胞もしくは粒子を、例えば遠心分離または濾過によって溶液の残りから分離し、米国特許第５，０１０，１８３号、同第５，３００，６４５号および欧州特許出願第９９１０３４５７．０号に記載されているように、少量で有利に行うことができる更なる精製にかける。
【００５８】
保存容器中で核酸または核酸を含有する細胞もしくは粒子を直接分離することによって、精製のために他の容器にサンプルを移す他の段階が不要となり、そのため、サンプルの損失が減少し、サンプルから採取された核酸による互いの混同および汚染のリスクもまた極力抑えられる。このように、これらの安定化試薬を使用することによって、生物サンプル中の核酸を安定化し、直接単離する一段階方法が導かれ、その方法では、代わりに生物サンプルからＲＮＡおよびＤＮＡを単離すること、または１つのサンプルから並行してＲＮＡおよびＤＮＡを単離することができる。
【００５９】
１種または複数種のカチオン化合物および１種または複数種の添加剤を含有する、本発明による組成物を用いて核酸を安定化することによって、サンプル中の核酸は、長期の保存中でさえ、または輸送中に変化しないことが確かなものになる。したがって、その後の試験の精度が著しく向上する。ある特定の場合、例えばサンプル材料を長距離間輸送するか、または長期間保存しなければならない場合では、本発明による方法によって、これらの試験をかかる期間の後に行うことが初めて可能となる。
【００６０】
本発明の利点は特に、例えば、サンプリング直後に固定化しなければならない転写物レベルを分析する研究分野、および例えば、分析の準備が整うまで保存および輸送中に患者のサンプルも安定化しなくてはならない、分子診断などの臨床分析分野において見出されている。特に、核酸の単離および安定化は、腫瘍の診断において、遺伝性疾患の診断ならびにウイルスの診断およびモニタリングにおいて、他の感染性病原体の診断およびモニタリングにおいて、遺伝子発現パターンの分析において使用される。
【００６１】
本発明の適用分野は、医学または動物学分野に及ぶだけではなく、植物、真菌および原核生物系の分析も含む。培養および自然環境から得た、植物および植物器官、藻類、真菌および細菌からの核酸の安定化および単離は、例えば転写物レベルおよび遺伝子発現パターンを分析する研究、および土壌サンプル中の細菌等の複合個体群における種を同定かつ定量する研究において使用される。
【００６２】
可能性のある用途には、例えば食物分析などの他の分析分野も含まれる。
【００６３】
本発明を以下の実施例および図によって説明する。記述および実施例において、以下の略語が使用される：
ＡＦＬＰ 増幅断片長多型
Ａ．ｄｅｓｔ． 蒸留水
ＢＡＰＴＡ１ ２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’， Ｎ’−テトラ酢酸
ＥｃｏＲＩ 制限酵素大腸菌株Ｒ
Ｅ２６０／Ｅ２８０ ２６０および２８０ｎｍでの吸光度の商
ＥＤＴＡ エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸
ＥＧＴＡ ［エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］テトラ酢酸
ＧＡＰＤＨ グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 制限酵素インフルエンザ菌
ｈｕｇｌ 巨大な幼虫のヒトホモローグ
ＩＦＮ−γ インターフェロンガンマ
ＬＭ 長さのマーカー
ＭＯＰＳ ３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸
ｎｂ 決定されず
ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０ ｉｍｂｅｎｔｉｎ−Ｎ／５２；オクチルフェニルポリエチレングリコール
ＯＤ 光学密度
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＦＬＰ 制限酵素断片長多型
ｒｐｍ 毎分回転数
ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ
ｒＲＮＡ リボソームＲＮＡ
ＲＴ 室温
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写酵素 ＰＣＲ
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＮＰ 一塩基多型
ＳＳＣ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液
ＴＢＥ トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー
Ｔｒｉｓ ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール
Ｕ ユニット
【００６４】
例えば時間に対してｈなど、ここに列挙していない略語は、当業者にはよく知られているか、あるいは従来技術におけるそれらの使用から十分によく知られているだろう。
それらが基づく図および実験の説明
図１は、異なるｐＨレベルを有する様々なカルボン酸バッファー中のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム（ＴＴＡＯｘ）による、血液中のＲＮＡの安定化を示す。
図２は、様々な濃度の酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図３は、２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子（Ａ）およびＩＦＮ−γ遺伝子（Ｂ）のｍＲＮＡの放射標識プローブとのノーザンハイブリダイゼーションの結果として、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図５は、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血液中のＤＮＡの安定化を示す。
細胞ＲＮＡの他に、白血球由来のゲノムＤＮＡもまた、ここで開発された方法によって安定化し、次いでシリカ膜に結合させることによって単離することができる。図５は、７２時間保存した後でさえ、高分子ＤＡＮ（長さ＞２０ｋＢ）が単離されることを示している。
図６は、ゲノムＤＮＡを酵素反応に使用した場合の結果を示す。２４時間または７２時間保存した後に単離したＤＮＡ（実施例５を参照のこと）を様々な酵素反応に使用する。
Ａ．制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｅ）またはＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）６Ｕを使用して、ＤＮＡ２μｇを３７℃にて３時間切断し、次いで０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。いずれの場合も対照として、未切断のＤＡＮを適用する。
Ｂ．ゲノムＤＮＡのアリコート１５０ｎｇおよび３００ｎｇをＰＣＲ反応に使用する（総容積５０μｌ）。その反応では、ｈｕｇｌ（巨大な幼虫のヒトホモローグ）遺伝子の長さ１．１ｋＢ断片を増幅する。そのＰＣＲ産物を１．２％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。
図７は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表２に示す。
図８は、酒石酸またはタルトロン酸と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの様々な期間にわたる安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表３に示す。
図９は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿１ｍｌ中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表４に示す。
図１０は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによるＬｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルは、二重測定で調製し、サンプル１４、４０、６６および９２は一重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表５に示す。
図１１は、異なる量のＨｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表７に示す。
図１２は、マクロファージ中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表９に示す。
図１３は、培養液を除去しない、Ｈｅｌａ付着細胞中のＲＮＡの安定化を示す。溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表１３に示す。
図１４は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる腎組織中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表１２に示す。
図１５は、ＲＮＡの安定化および単離と同様な、ＤＮＡの安定化および単離を示す。溶出液のアリコート４０μｌを０．８％アガロース−ＴＢＥゲルで分離する。問題のサンプルは実施例１５に記述する。
【００６５】
実施例
実施例１：
異なるｐＨレベルの様々なカルボン酸バッファー中のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム（ＴＴＡＯｘ）による血液中のＲＮＡの安定化
様々な鎖長のカルボン酸を添加剤として使用する。さらに、モノ、ジおよびトリカルボン酸、ヒドロキシル化および非ヒドロキシル化カルボン酸を試験する。そのすべての物質は、カチオン化合物テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと共に安定化に使用される。その物質のｐＨおよび濃度のどちらも変化する。
【００６６】
図１に、その試験の結果を示す。どの場合でも、インタクトなＲＮＡを２４および４８時間後でさえ単離することができる。場合によっては少量であるＲＮＡの量は、処理される血液が少量であること、および様々な血液サンプル中のＲＮＡ含有量が異なることに対応するものである。この実験では、いくらかのゲノムＤＮＡもまた、ＲＮＡ画分中で得られた。
【００６７】
各濃度２００ｍＭの、かつ問題のカルボン酸に対して様々なｐＨレベルの様々なカルボン酸で緩衝された１０％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムからなるバッファー５００μｌで、血液５００μｌを室温で２４時間および４８時間保存する。ＲＮＡを単離するために、カチオン化合物および核酸からなる複合体を遠心分離する；そのペレットを水で１回洗浄し、再度遠心分離し、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＬＴバッファーなど、標準市販の溶解バッファー３００μｌ中に溶解する。サンプルを水３６０μｌで希釈し、プロテイナーゼＫ４０μｌで５５℃にて１０分間処理する。次いで、そのサンプルを遠心分離し、エタノールを上清に添加し、シリカ膜を含むスピンカラムにそれを添加する。遠心することによって、サンプルを膜に通す。スピンカラムは、市販のイソチオシアン酸グアニジニウム含有洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で１回洗浄し、ＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥなどの標準市販のアルコール含有洗浄バッファーで２回洗浄し、次いで、遠心することによって膜にも通されるＲＮａｓｅ非含有水６０μｌ中にＲＮＡを溶出し、その溶出液のアリコート３０μｌを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離する。
【００６８】
実施例２
テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび様々な濃度の酒石酸（緩衝）ｐＨ３を用いた、全血中のＲＮＡの安定化
１０％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび５０〜５００ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）からなるバッファー５００μｌで、血液５００μｌを室温で２．５時間、２４時間および４８時間保存する。さらに、ＱＩＡＧＥＮ社製「ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅセット」でサンプルをＤＮａｓｅで処理することによって、ゲノムＤＮＡを除去することを除いては、図１に示すようにＲＮＡを単離する。ＲＮａｓｅ非含有水８０μｌでＲＮＡを溶出する。その溶出液３０μｌを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離する。
【００６９】
実施例３
２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）で緩衝されたテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、全血中のＲＮＡの安定化
ＲＮＡの完全性、収量および純度を決定する：
カルボン酸バッファー、例えば２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．０）で緩衝されたテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム溶液中で分解または収量の減少を生じることなく、血液中でＲＮＡは少なくとも７２時間安定化される（図３を参照のこと）。
【００７０】
１０％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．０）からなるバッファー２ｍｌと血液２ｍｌとを混合し、室温で２４〜７２時間保存する。例えばＱｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ社製バッファーＥＬなどの標準市販の赤血球溶解バッファーを、カチオン化合物および核酸からなる複合体を遠心分離する前にサンプルに添加し、次いでその混合物を氷上で１０分間インキュベートすることを除いては、実施例２に記載のように、ＲＮＡを単離する。ＲＮａｓｅ非含有水８０μｌでＲＮＡを溶出する。その溶出液３０μｌを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離するか、または分光光度計で測定する。水で希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収を光度測定することによって、単離した全ＲＮＡの量を決定する。このように、波長２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を測光により決定することによって、得られたＲＮＡの純度を測定する。
【００７１】
実施例４：
酒石酸（ｐＨ４）で緩衝された、異なる濃度のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化
ノーザンブロット分析
４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．７）からなるバッファー６．９ｍｌと血液２．５ｍｌとを混合し、室温で１時間、２４時間、４８時間および７２時間保存する。ＲＮＡを単離するために、カチオン化合物と核酸との複合体を遠心分離する。そのペレットを水で１回洗浄し、次いで例えばＱｉａｇｅｎ社製バッファーＲＬＴなどの溶解バッファー３００μｌ中に溶解する。サンプル調製の残りの作業を、図２に記載のように行う。次いで、全ＲＮＡのアリコート２．５μｇを１．２％変性アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離する。次いで、そのＲＮＡをナイロン膜に移し、リン酸ナトリウム／ＳＤＳバッファー中で６８℃にて、ＧＡＰＤＨ遺伝子（図４Ａ）、またはＩＦＮ−γ遺伝子（図４Ｂ）の放射標識アンチセンスＲＮＡプローブと約１２時間にわたりハイブリダイズする。減少する塩濃度２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ〜０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄バッファーで温度６８℃にて、その膜を洗浄する。次いで、ナイロン膜をＸ線フィルム上で暴露する。ＧＡＰＤＨおよびＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡのシグナルはどちらも、７２時間を超える保存期間にわたり一定のままである。
【００７２】
実施例５：
酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝されたテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血液中のゲノムＤＮＡの安定化
細胞ＲＮＡの他に、全血からのゲノムＤＮＡもまた、本発明において開発された方法によって安定化することができ、次いでシリカ膜に結合させることによって単離することができる。図５から、室温で７２時間保存した後でさえ、高分子ＤＮＡ（長さ＞２０ｋＢ）が単離されることが示されている。
【００７３】
４％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．７）からなる溶液６．９ｍｌと血液２．５ｍｌとを混合し、室温で２４時間または７２時間保存する。ＤＮＡを単離するために、カチオン化合物とＤＮＡとの複合体を遠心分離する。塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡを含有するバッファー３００μｌにそのペレットを溶解し、次いで、例えばＱｉａｇｅｎ社製バッファーＡＬなどの市販の塩酸グアニジウムバッファー３６０μｌ中に溶解し、ならびにプロテイナーゼＫ２０μｌを添加する。そのサンプルを６５℃で１０分間インキュベートし、次いで、エタノール４２０μｌを添加し、シリカ膜を含むスピンカラムにサンプルを適用する。そのサンプルを、遠心分離によって膜を通過させる。例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＡＷ１など、標準市販のエタノール含有塩酸グアニジウムバッファーでシリカ膜を洗浄し、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＡＷ２などのエタノール含有洗浄バッファーで１回洗浄する。ＤＮＡをＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８）３００μｌで希釈する。溶出液のアリコート５μｌを０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。
【００７４】
実施例６：
酵素反応におけるゲノムＤＮＡの使用。
図６から、実施例５に従って単離されたＤＮＡを様々な酵素反応（制限増幅およびＰＣＲ増幅）に使用することができることが分かる。
【００７５】
２４または２７時間の保存後に単離されたＤＮＡ（実施例５参照）は様々な酵素反応に使用される。これは、単離したＤＮＡの純度が高く、品質が良いことの証拠である。
【００７６】
Ａ）制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｅ）およびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｈ）６Ｕで３７℃にて３時間、ＤＮＡのアリコート２μｇを切断し、次いで０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。対照として、未切断のＤＮＡを適用する。
Ｂ）ゲノムＤＮＡのアリコート１５０ｎｇおよび３００ｎｇをＰＣＲ反応（総容積５０μｌ）に使用する。その反応では、長さ１．１ｋＢ断片のｈｕｇｌ遺伝子が増幅される。そのＰＣＲ産物を１．２％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。
【００７７】
実施例７
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、カルボン酸および他の添加剤をテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムに添加することによって、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを単独で用いた場合のＲＮＡの安定化と比較して、血漿中の遊離ＲＮＡの安定化が著しく改善されることが実証される。
【００７８】
この実験で使用する溶液を調製するために、３０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸、クエン酸、タルトロン酸、コハク酸、硫酸アンモニウムまたはリン酸の原液と混合して、２％または４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、および２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。添加剤を全く含有しない５％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム溶液を対照として使用する。
【００７９】
このように調製したすべての溶液のアリコート０．５ｍｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。例えば、市販のＲＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社によりＲＮＡ単離キットとして市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉ−Ｋｉｔｓ）により予め単離された、ＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ１５μｇをエッペンドルフ容器の蓋にピペッティングする。ヒト血漿０．５ｍｌをその溶液に添加し、容器の蓋を閉め、容器を迅速に５回反転して液体を混合する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で１日保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【００８０】
ＲＮＡを単離するために、サンプルを２５０００×ｇで３分間にわたり遠心分離する。上清を除去し、グアニジウム塩酸塩およびＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（ｐＨ７．０）を含有する、６０℃に調節されたバッファー０．５ｍｌおよびプロテイナーゼＫも、ペレットに添加する。そのペレットをボルテックスすることによって溶解し、５０℃で１５分間インキュベートする。次いで、エタノール−ｎｏｎｉｄｅｔＰ４０溶液０．５ｍｌを添加し、サンプルを約５秒間ボルテックスすることによって混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡ ａｍｐカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラム中にそのサンプルを入れ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、アルコール含有洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＡＷ２で２回洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。アルコール含有洗浄バッファーで洗浄した後、バッファーを添加することなく、遠心することによって（最大３分の回転数、この場合では２５０００×ｇ）膜を乾燥させる。溶出液については、ＲＮａｓｅを含有しない水３０μｌを膜上にピペッティングして、膜から精製ＲＮＡを引き離す。その溶出液は、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出プロセスを完了する。
【００８１】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート３０μｌを使用する。その結果を図７に示す。ゲルレーンのローディングを表２に示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
個々のサンプルのＲＮＡ品質を比較するために、レーン４５は、これらの実験に使用するＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ３．７５μｇを含む。
【００８４】
この実験で使用されるＨｅＬａ全ＲＮＡのゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後にインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡが示される。視認できるｒＲＮＡバンド（２８ＳｒＲＮＡ）の一番上のバンドは、それより下のｒＲＮＡバンド（１８ＳｒＲＮＡ）よりも明らかに濃く、かつ太く、それはインタクトな分解されていないＲＮＡの一般的な特徴である。添加剤を添加することなく、５％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合した血漿中で１日保存したＨｅＬａ全ＲＮＡを、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび様々な添加剤と混合した血漿中で１日保存した後に単離したＲＮＡと比較すると、ＲＮＡの安定化が添加剤を使用することによって改善されていることが明白に示されている。安定化化合物を含まない血漿にＲＮＡを添加した場合、これによって、よく知られているように数分以内にＲＮＡ全体の分解が引き起こされる。
【００８５】
実施例８
酒石酸またはタルトロン酸と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、様々な時間にわたる血漿中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、血漿中でＲＮＡが少なくとも１４日まで安定化されることが示されている。
【００８６】
この実験に使用する溶液を調製するために、３０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸（ｐＨ３）またはタルトロン酸（ｐＨ３）の原液と混合して、６％または８％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。
【００８７】
このように調製したすべての溶液のアリコート０．５ｍｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。例えば、市販のＲＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社によりＲＮＡ単離キットとして市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉ−Ｋｉｔｓ）により予め単離された、ＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ１５μｇをエッペンドルフ容器の蓋にピペッティングする。ヒト血漿０．５ｍｌをその溶液に添加し、容器の蓋を閉め、容器を迅速に５回反転して液体を混合する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で３、７、１０および１４日保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【００８８】
ＲＮＡの単離は実施例７に記載のように行う。
【００８９】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート３０μｌを使用する。その結果を図８に示す。ゲルレーンのローディングを表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
個々のサンプルのＲＮＡ品質を比較するために、レーン「Ｋ」は、これらの実験に使用するＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ３．７５μｇを含む。
【００９２】
ゲル電気泳動による分離から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび酒石酸またはタルトロン酸（ｐＨ３）と混合した血漿でＨｅＬａ全ＲＮＡを１４日まで保存した後でさえ、臭化エチジウムで染色した後に、インタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。
【００９３】
実施例９：
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、血漿中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物により、多量の血漿中でさえ、ＲＮＡを安定化することができることが示される。
【００９４】
このように調製したすべての溶液のアリコート１ｍｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。例えば、市販のＲＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社によりＲＮＡ単離キットとして市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉ−Ｋｉｔｓ）を用いて予め単離された、ＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ１５μｇをエッペンドルフチューブの蓋にピペッティングする。ヒト血漿１ｍｌをその溶液に添加し、チューブの蓋を閉め、チューブを迅速に５回反転して液体を混合する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で３日間保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【００９５】
ＲＮＡの単離は実施例７に記載のように行う。
【００９６】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％ホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート３０μｌを使用する。その結果を図９に示す。ゲルレーンのローディングを表４に示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
個々のサンプルのＲＮＡ品質を比較するために、レーン１３は、これらの実験に使用するＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ３．７５μｇを含む。
【００９９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、インタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。このように、多量の血漿中でさえ、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、ＲＮＡは安定化される。
【０１００】
実施例１０：
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、ＨｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと様々な添加剤との混合物によって、ＨｅＬａ細胞中のＲＮＡを、室温で１４日までの保存期間にわたって安定化することができることが示される。
【０１０１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％または３０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸、クエン酸、タルトロン酸、硫酸アンモニウムまたはリン酸の原液と混合して、２％または４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、および２００ｍＭ添加剤の最終濃度をとする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。
【０１０２】
予め細胞培養から収集し、ＰＢＳで直ちに洗浄した１×１０６個のＨｅｌａ細胞を遠心分離（１２０×ｇで１分）によってペレットにし、上清を除去する。表４に示す溶液のアリコート３００μｌを細胞に添加し、ボルテックスによってサンプルを混合し、細胞を再懸濁する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で３、７、１０および１４日間保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【０１０３】
ＲＮＡを単離するために、１２００×ｇで３分間遠心分離することによって、細胞をペレットにし、上清を除去する。繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約１０秒以上の間にわたりボルテックスすることによって、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＴＬバッファーなどの標準市販のイソチオシアン酸グアニジウムバッファー６００μｌ中に、ペレットを再懸濁する。次いで、エタノール１容積（６００μｌ）を添加し、繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約５秒間にわたりボルテックスすることによって、成分を混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムにライセートを適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、標準市販のイソチオシアン酸グアニジウム含有第１洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で洗浄し、次いでアルコール含有第２洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥで洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。第２アルコール含有洗浄バッファーでの洗浄を少量で繰り返し、遠心することによって（最大２分の回転数、この場合では２００００×ｇ）膜を同時に乾燥させる。溶出液については、膜から精製ＲＮＡを引き離すために、ＲＮａｓｅを含有しない水４０μｌを膜上にピペッティングする。その溶出液は、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出プロセスを完了する。
【０１０４】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１０に示す。サンプルを表５にまとめる。サンプル１４、４０、６６および９２を１回試験し、結果を示すことを除いては、すべてのサンプルを２回試験し、結果を示す。
【０１０５】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【０１０６】
サンプル「Ｋ」は、予め保存されることなく、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓなどの単離キットによって、１×１０６個のＨｅｌａ細胞（＝ポジティブコントロール）から単離された全ＲＮＡを示す。サンプル「ａ」、「ｂ」、「ｃ」および「ｄ」は、上述のように添加剤を含まないＰＢＳ中で１×１０６個のＨｅｌａ細胞を３、７、１０または１４日間保存した後に単離された全ＲＮＡを示す。
【０１０７】
単離された全ＲＮＡの量は、水に希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収の光度測定によって決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を測光により決定することによって測定する。単離の結果を以下の表６に示す。いずれの場合も、２つの測定値の平均を示す。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後、正の対照においてインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。ｒＲＮＡバンド（２８ＳｒＲＮＡ）の一番上のバンドは、それより下のｒＲＮＡバンド（１８ＳｒＲＮＡ）よりも明らかに濃く、かつ太く、それはインタクトな分解されていないＲＮＡの一般的な特徴である。
ＰＢＳ中で細胞を３日間保存した後には、２つのｒＲＮＡバンドが同一強度を示し、極めて少ないＲＮＡが視認できることから、ＲＮＡは一部分解している。７日間以上保存した後には、ＲＮＡはもはや視認できない。これに対して、Ｈｅｌａ細胞中のＲＮＡは、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによって１４日間まで安定化される。これは、特異的ＲＮＡの収量および純度をＯＤ測定することによって確認される。安定化は、ｐＨにより影響を受ける。混合物において、つまりテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤とを混合した後、４を超えるｐＨ値が好ましい。
【０１１０】
実施例１１
異なる量のＨｅｌａ細胞におけるＲＮＡの安定化
これらの実験から、使用する細胞の数にかかわらず、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、ＨｅＬａ細胞中のＲＮＡを安定化することができることが示される。
【０１１１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、ｐＨ６の０．５Ｍ酒石酸の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。
【０１１２】
予め細胞培養から収集し、ＰＢＳで直ちに洗浄した１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個および５×１０６個のＨｅｌａ細胞を、遠心分離（１２０×ｇで１分）によってペレットにし、上清を除去する。４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ酒石酸を含有する溶液のアリコート３００μｌを細胞に添加し、ボルテックスによってサンプルを混合し、細胞を再懸濁する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で１５分間または１日保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【０１１３】
実施例１０に記載のようにＲＮＡを単離する。
【０１１４】
使用する対照は、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ酒石酸で前処理されておらず、かつ上述のようにＲＮＡを単離するために保存されていない１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個および５×１０６個のＨｅｌａ細胞である。
【０１１５】
単離したＲＮＡを、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１１に示す。サンプルを表７にまとめ、すべてのサンプルを２回試験し、結果を示す。
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
単離した全ＲＮＡの量は、水に希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収の光度測定によって決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を測光により決定することによって測定する。単離の結果を以下の表８に示す。いずれの場合も、２つの測定値の平均を示す。
【０１１８】
【表１１】
【０１１９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、保存された対照サンプルにおいて、保存されていない対照サンプルにおいてもインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。保存されていない対照と保存されたサンプルとの間に明らかな相違はない。同様に、ＯＤ測定によって決定されたＲＮＡ収量および純度から、ＲＮＡの収量または純度を低減することなく、ＲＮＡの安定化は、異なる量の細胞中で同程度に行われることが確認される。細胞数が増加するに従って減少する商Ｅ２６０／Ｅ２８０は、測定は水中で行われ、緩衝系では行われないという事実に起因し得る。
【０１２０】
実施例１２：
マクロファージ中のＲＮＡの安定化
これらの実験によって、様々な種類の細胞におけるＲＮＡを使用できることが実証される。この実験で使用するマクロファージは、前に使用したＨｅｌａ細胞よりも多量のＲＮａｓｅを含有し、このため、細胞中のＲＮＡが余儀なく分解される。
【０１２１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸（ｐＨ５）、０．５Ｍタルトロン酸（ｐＨ５）または０．５Ｍリン酸（ｐＨ５）の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度にする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。
【０１２２】
予め細胞培養から収集し、ＰＢＳで直ちに洗浄した１×１０６個のＨｅｌａ細胞を遠心分離（１２０×ｇで１分）によってペレットにし、上清を除去する。４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭの添加剤を含有する溶液のアリコート３００μｌを細胞に添加し、その細胞を再懸濁する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で２日間、６日間、９日間および１４日間保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【０１２３】
そのＲＮＡを実施例１０に記載のように単離する。
【０１２４】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１２に示す。サンプルを表９にまとめる。すべてのサンプルを２回試験し、結果を示す。
【０１２５】
【表１２】
【０１２６】
レーン２５および２６は、マクロファージを予め保存することなく、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓなどの市販の単離キットを用いて、１×１０６個のマクロファージ（ポジティブコントロール）から単離した全ＲＮＡを示す。
【０１２７】
水で希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収を光度測定することによって、単離した全ＲＮＡの量を決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、波長２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を光度測定することによって決定する。単離の結果を以下の表１０に示す。いずれの場合も、２つの測定値の平均を示す。
【０１２８】
【表１３】
【０１２９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、保存された対照サンプルにおいて、および保存されていない対照サンプルにおいてもインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れ、２４日間保存した後でさえ、ＲＮＡ分解の兆候はない。同様に、光度測定によって決定されたＲＮＡの収量および純度は、保存中に未変化のままである。
【０１３０】
実施例１３
培地の除去を行わない、Ｈｅｌａ付着細胞中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、付着細胞中でさえ、ＲＮＡを安定化することができることが示される。代わりにテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物を培地に添加しても、細胞を含有する培地を除去しない場合でさえ、安定化は依然として行われる。培地中の細胞は、体液中の細胞のモデルとして見なすことができる。
【０１３１】
この実験で使用する溶液を調製するために、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび特定の添加剤、酒石酸または硫酸アンモニウムを計量して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭの添加剤の最終濃度とし、水に溶解する。４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ酒石酸の場合には水酸化ナトリウムを用いて、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ硫酸アンモニウムの場合には硫酸を用いて、溶液のｐＨをｐＨ５に調節する。
【０１３２】
６ウェルプレートにおいて培地２ｍｌ中でＨｅｌａ細胞を培養する。その細胞は付着して成長する、つまりウェルの底面に細胞が付着する。細胞中のＲＮＡを安定化するために、１０ｍｌの４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ酒石酸（ｐＨ５）または４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ５）を各ウェルに添加し、そのシャーレを室温で４日間保存する。ネガティブコントロールとして、培地を含むが、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと２００ｍＭの添加剤との混合物を添加していないウェルを室温で４日間保存する。
【０１３３】
ポジティブコントロールとして、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓなどの標準市販の単離キットを用いて、予め保存することなく、１つのウェルからＨｅｌａ細胞のＲＮＡを単離する。これを行うために、培地を細胞から完全に除去し、溶解バッファーＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔの成分）３５０μｌと混合する。細胞をウェルの底面からスパチュラで掻き取り、いわゆる破砕機、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒなどに、ライセートを移す。１４０００ｒｐｍで２分間遠心することによって、そのライセートを破砕機に通し、このようにして、サンプルをホモジナイズする。その生成物を７０％エタノールと混合し、実施例１０に記載のようにＲＮＡを単離する。
【０１３４】
４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭの添加剤と混合した培地中で、細胞を４日間保存した後、その時点で引き離されている細胞を上清と共に収集し、３０００×ｇで５分間遠心分離する。その上清を除去し、細胞ペレットを用いて、実施例１０に記載のようにＲＮＡを単離する。
【０１３５】
４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭの添加剤を含まない（＝ネガティブコントロール）培地中で細胞を４日間保存した後、ポジティブコントロールについて上述のように、ＲＮＡを単離する。
【０１３６】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１３に示す。レーン１は、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ酒石酸（ｐＨ５）と混合した培地中で細胞を保存した後に単離された全ＲＮＡを含む。レーン２は、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ５）と混合した培地中で細胞を保存した後に単離された全ＲＮＡを示す。レーン３は、培地単独で細胞を保存した後に単離された全ＲＮＡを示し、レーン４は、予め保存することなく、ポジティブコントロールとして単離された全ＲＮＡを示す。
【０１３７】
水で希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収を光度測定することによって、単離した全ＲＮＡの量を決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、波長２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を光度測定することによって測定する。単離の結果を以下の表１１に示す。
【０１３８】
【表１４】
【０１３９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、保存していないサンプルにおいて、およびテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物で保存したサンプルにおいてもインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。これに対して、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび添加剤を添加していない培地中でほぞんした細胞中のＲＮＡは、ほぼ完全に分解される。同様に、ＯＤ測定によって決定されたＲＮＡの収量および純度から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび添加剤を添加していない培地中で保存されたサンプル中のＲＮＡの収量および純度が著しく低下するのに対して、保存されていないサンプルおよび安定化されたサンプルとの間の相違がないことが確認される。
【０１４０】
実施例１４：
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる、組織中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムもまた、組織由来のＲＮＡを安定化するのに適していることが分かる。
【０１４１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸、クエン酸、タルトロン酸、硫酸アンモニウムまたはリン酸カリウム、シュウ酸またはリン酸の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液または硫酸（もしくは硫酸アンモニウム）または水酸化カリウム溶液または燐酸（もしくはリン酸カリウム）で指定のｐＨに調節する。
【０１４２】
取り除いた直後に液体窒素で凍結し、次いで−７０℃で保存しておいたマウスの腎組織をこれらの実験に使用する。その組織を７０〜９０ｍｇ凍結し、表１２に指定するバッファー５００μｌを組織各１０ｍｇに対して添加し、例えばＭｅｓｓｒｓ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製のＰｏｌｙｔｒｏｎなどのローター・ステーターホモジナイザーを用いて、その混合物を即座に３０〜６０秒間ホモジナイズする。溶液のアリコート５００μｌを、組織１０ｍｇに相当するホモジナイズしたプレパラートから取る。サンプルを室温で１日保存する。
【０１４３】
保存後、サンプルを１００００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去する。例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＴＬバッファーなどの標準市販のイソチオシアン酸グアニジウムバッファー６００μｌ中に、ボルテックスすることによってペレットを溶解する。次いで、７０％エタノール１容積（６００μｌ）を添加し、繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約５秒間にわたりボルテックスすることによって、成分を混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムにライセートを適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、標準市販のイソチオシアン酸グアニジウム含有第１洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で洗浄し、次いでアルコール含有第２洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥで洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。アルコール含有第２洗浄バッファーでの洗浄を少量で繰り返し、遠心することによって（最大２分の回転数、この場合では２００００×ｇ）膜を同時に乾燥させる。溶出液については、膜から精製ＲＮＡを引き離すために、ＲＮａｓｅを含有しない水４０μｌを膜上にピペッティングする。その溶出液は、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出を完了する。
【０１４４】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１４に示す。サンプルを表１２にまとめる。すべてのサンプルを２回実験し、その結果を示す。
【０１４５】
【表１５】
【０１４６】
サンプル「Ｋ」は、予め保存することなく、単離キット（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ製ＲＮｅａｓｙ）を用いて、凍結された腎組織から単離した全ＲＮＡを示す（＝ポジティブコントロール）。レーン「Ｎ」は、溶媒を添加していない、つまり乾燥している腎組織１０ｍｇを１日保存した後に、ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて単離した全ＲＮＡを示す（＝ネガティブコントロール）。
【０１４７】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、ポジティブコントロールにおいてインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡが表れる。安定化溶液なしで保存した腎組織を含むネガティブコントロールは、完全に分解されたＲＮＡを示す。これに対して、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム中でサンプルを保存した後に、インタクトなｒＲＮＡバンドがポジティブコントロールとして視認することができる。安定化はｐＨにより影響を受ける。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと指定のｐＨの添加剤とを混合した後、組織中のＲＮＡを安定化するために、安定化溶液の最終ｐＨは４を超えるｐＨであることが好ましい。
【０１４８】
実施例１５：
ＲＮＡの安定化および単離と並行したＤＮＡの安定化および単離
これらの実験から、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いて、組織中のＲＮＡのみならずＤＮＡも安定化されることが分かる。サンプルからＲＮＡを単離することに加えて、それと並行してＤＮＡを単離することも可能である。
【０１４９】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍクエン酸（ｐＨ５）の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度となるように水酸化ナトリウムで調節する。
【０１５０】
取り除いた直後に液体窒素で凍結し、次いで−７０℃で保存しておいたマウスの腎組織をこれらの実験に使用する。その組織を約８０ｍｇ凍結し、４．２ｍｌの４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭクエン酸（ｐＨ５）を組織各１０ｍｇに対して添加し、例えばＭｅｓｓｒｓ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製のＰｏｌｙｔｒｏｎなどのローター・ステーターホモジナイザーを用いて、その混合物をすぐに３０〜６０秒間ホモジナイズする。溶液のアリコート５００μｌを、組織１０ｍｇに相当するホモジナイズしたプレパラートから取る。そのサンプルを室温で１日保存する。
【０１５１】
保存後、サンプルを１００００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去する。例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＴＬバッファーなどの標準市販のイソチオシアン酸グアニジウムバッファー６００μｌ中に、ボルテックスすることによってペレットを溶解する。次いで、７０％エタノール１容積（６００μｌ）を添加し、繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約５秒間にわたりボルテックスすることによって、成分を混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムにライセートを適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、実施例１４に記載のように単離することができる。スルーフロー（ｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗ）（約１２００μｌ）を回収し、１００％エタノール２００μｌと合わせて、ボルテックスすることによって混合する。これらのサンプルを再度、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡａｍｐカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムに適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＤＮＡは膜に結合した状態であり、次いで、標準市販のイソチオシアン酸グアニジウム含有第１洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で洗浄し、次いでアルコール含有第２洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥで洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。アルコール含有第２洗浄バッファーでの洗浄を少量で繰り返し、遠心することによって（最大２分の回転数、この場合では２００００×ｇ）膜を同時に乾燥させる。溶出液については、膜から精製ＲＮＡを引き離すために、水２００μｌを膜上にピペッティングし、室温で１分間インキュベートする。その溶出液を、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出を完了する。
【０１５２】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、０．８％アガロース−ＴＢＥゲルを調製する。サンプル１〜４のアリコート４０μｌを使用し、サンプル５〜９のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１５に示す。
【０１５３】
レーン１および２は、実施例１５に従って単離した全ＲＮＡを表す。レーン３および４は、参照としての全ＲＮＡ０．１μｇおよび０．５μｇをそれぞれ表し、使用したアガロースゲルにおいてインタクトなゲノムＤＮＡの流れ特性を示している。レーン５は、予め保存することなく、市販の単離キット（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨのＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ）を用いて、凍結ラット腎臓１０ｍｇから単離した全ＤＮＡを表している（＝ポジティブコントロール）。使用したネガティブコントロールは、１日保存した後、溶媒を添加していない、つまり乾いた腎臓組織、または蒸留水中の腎臓組織１０ｍｇから、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓを用いて単離された全ＤＡＮであった。このＤＮＡは、レーン６および７（乾燥保存）において、かつレーン８および９（Ａ．ｄｅｓｔ中で保存）において示される。
【０１５４】
ゲル電気泳動による分離によって、参照ＤＮＡを示すレーンおよび保存していないポジティブコントロールのＤＮＡを含有するレーンのどちらにも、分解されていない高分子ＤＮＡが示される。組織を乾燥保存または水中で保存することによって、ＤＮＡの完全な分解が引き起こされる。これに対して、実施例１５と同様に処理したサンプルはインタクトなままであり、保存期間全体を通して分解されない。したがって、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物は生物サンプル中のＤＮＡを安定化するのにも適しており、サンプルからＲＮＡおよびＤＮＡを並行して単離することもまた可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】異なるｐＨレベルを有する様々なカルボン酸バッファー中のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム（ＴＴＡＯｘ）による、血液中のＲＮＡの安定化を示す。
【図２】様々な濃度の酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
【図３】２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
【図４】ＧＡＰＤＨ遺伝子（Ａ）およびＩＦＮ−γ遺伝子（Ｂ）のｍＲＮＡの放射標識プローブとのノーザンハイブリダイゼーションの結果として、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
【図５】酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血液中のＤＮＡの安定化を示す。
【図６】ゲノムＤＮＡを酵素反応に使用した場合の結果を示す。
【図７】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの安定化を示す。
【図８】酒石酸またはタルトロン酸と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの様々な期間にわたる安定化を示す。
【図９】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿１ｍｌ中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１０】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによるＬｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１１】異なる量のＨｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１２】マクロファージ中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１３】培養液を除去しない、Ｈｅｌａ付着細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１４】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる腎組織中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１５】ＲＮＡの安定化および単離と同様な、ＤＮＡの安定化および単離を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来の材料中の核酸を単離および／安定化するための新規な組成物に関する。その組成物は、
一般式：
【化１】
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基および／またはＣ６〜Ｃ２０アリール基ならびにＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を示すことができ、
Ｘ−は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示すことが可能である）で示されるカチオン化合物と、添加剤としての少なくとも１種類のプロトン供与体と、を必須成分として含有する。
【０００２】
好ましい組成物は、そのカチオン化合物がアンモニウム塩からなる組成物である（式中、Ｒ１が、高級アルキル基を示し、好ましくは炭素原子１２個、１４個または１６個を有する高級アルキル基を示し、いずれの場合も、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がメチル基を示す）。
【０００３】
式中、Ｒ１が、アルキル基、好ましくはベンジル基を示し、Ｒ２が、好ましくは炭素原子１２個、１４個または１６個を有する高級アルキル基を示し、Ｒ３およびＲ４がメチル基を示す組成物もまた好ましい。
【０００４】
臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩がアニオンとして好ましい。
【０００５】
Ｃ１〜Ｃ６アルキルは一般に、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい、炭素原子１〜６個を有する分枝もしくは非分枝炭化水素基を示す。以下の炭化水素基：
メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピルおよび１−エチル−２−メチル−プロピルが例として挙げられる。
【０００６】
高級アルキル基という用語は、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい分枝もしくは非分枝Ｃ７〜Ｃ２０アルキル基を表す。以下の炭化水素基：分枝もしくは非分枝ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、ドデカデシルおよびエイコシルが例として挙げられる。
【０００７】
Ｃ３〜Ｃ６アルケニルは一般に、炭素原子３〜６個を有し、１つまたは可能ならば複数の二重結合を有する、分枝または非分枝炭化水素基であって、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい炭化水素を示す。以下の炭化水素基：
２−プロペニル（アリル）、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル２−プロペニル、１，２−ジメチル２−プロペニル、１−エチル−２−プロペニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−メチル−２−ペンテニル、４−メチル−２−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、３−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、３−メチル−４−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、１，１−ジメチル２−ブテニル、１，１−ジメチル２−ブテニル、１，１−ジメチル３−ブテニル、１，２−ジメチル２−ブテニル、１，２−ジメチル３−ブテニル、１，３−ジメチル２−ブテニル、１，３−ジメチル３−ブテニル、２，２−ジメチル３−ブテニル、２，３−ジメチル２−ブテニル、２，３−ジメチル３−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、２−エチル−１−ブテニル、２−エチル−２−ブテニル、２−エチル−３−ブテニル、１，１，２−トリメチル２−プロペニル、１−エチル−１−メチル−２−プロペニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロペニルが例として挙げられる。
【０００８】
Ｃ３〜Ｃ６アルキニルは一般に、炭素原子３〜６個を有し、１つまたは可能ならば複数の三重結合を有する、分枝または非分枝炭化水素基であって、互いに同一または異なる１個または複数のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換されてもよい炭化水素を示す。以下の炭化水素基：
２−プロピニル（プロパルギル）、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、２−メチル−２−プロピニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−メチル−２−ブチニル、２−メチル−２−ブチニル、３−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、３−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル２−プロピニル、１，２−ジメチル２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−メチル−２−ペンチニル、２−メチル−２−ペンチニル、３−メチル−２−ペンチニル、４−メチル−２−ペンチニル、１−メチル−３−ペンチニル、２−メチル−３−ペンチニル、３−メチル−３−ペンチニル、４−メチル−３−ペンチニル、１−メチル−４−ペンチニル、３−メチル−４−ペンチニル、４−メチル−４−ペンチニル、１，１−ジメチル２−ブチニル、１，１−ジメチル２−ブチニル、１，１−ジメチル３−ブチニル、１，２−ジメチル２−ブチニル、１，２−ジメチル３−ブチニル、１，３−ジメチル２−ブチニル、１，３−ジメチル３−ブチニル、２，２−ジメチル３−ブチニル、２，３−ジメチル２−ブチニル、２，３−ジメチル３−ブチニル、１−エチル−２−ブチニル、１−エチル−３−ブチニル、２−エチル−１−ブチニル、２−エチル−２−ブチニル、２−エチル−３−ブチニル、１，１，２−トリメチル２−プロピニル、１−エチル−１−メチル−２−プロピニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロピニルが例として挙げられる。
【０００９】
別段の指定がない限り、アリールは、ヘテロ原子１個または２個を任意に含有することができ、炭素原子４〜２２個を有する芳香族単核基または多核基を示す。その例には：ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、好ましくはフッ素によって、またはアルキル基によって、互いに独立して任意に一置換または多置換することができる、フェニル、ナフチル、アントラシルまたはピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジンまたはピラジンが含まれる。
【００１０】
上記に定義されたように、アラルキルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ３〜Ｃ６アルケニレンもしくはＣ３〜Ｃ６アルキニレン架橋を介してカチオン部分構造に結合する、単核または多核アリール基を示し、そのＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニルおよびＣ３〜Ｃ６アルキニル基は上記で定義したとおりである。本発明の目的には、ベンジル基が好ましい。
【００１１】
適切な対イオンＸ−には、ハロゲン化水素酸のすべてのアニオン、または酢酸塩もしくはシュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩もしくはクエン酸塩などの、一塩基または二塩基有機酸のアニオンが含まれることが好ましい。
【００１２】
本発明の目的のための適切なプロトン供与体は主に、無機酸またはその塩の他に、単独でまたは組み合わせて、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸またはケトジカルボン酸ならびにアミノ酸である。上述のすべての有機酸を未置換状態で、または置換誘導体として使用することができ、別段の指定がない限り、未置換誘導体またはヒドロキシル基によって一置換もしくは多置換された誘導体であることが好ましい。
【００１３】
本発明の目的のための飽和脂肪族モノカルボン酸という用語には、ギ酸の他に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボン酸が含まれることが好ましく、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸（２−メチル−酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、およびｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）が好ましい。さらに、上述の酸から誘導されるケトカルボン酸もまた使用することができる。
【００１４】
本発明の目的に使用される不飽和アルケニル−カルボン酸の例には、例えばアクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸ならびにビニル酢酸が含まれる。
【００１５】
本発明に従って、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸もしくはアジピン酸などの飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸が好ましく、シュウ酸およびコハク酸が特に好ましい。
【００１６】
本発明に従って問題を解決するためには、脂肪族ヒドロキシ−ジ−およびトリ−カルボン酸を使用することが特に好ましく、タルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）−もしくはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸が最も特に好ましい。
【００１７】
マレイン酸もしくはフマル酸などの不飽和ジカルボン酸または、例えばアコニット酸などの不飽和トリカルボン酸もまた、本発明の問題の解決策として適している。
【００１８】
しかしながら、本発明の目的のために、例えばメソシュウ酸およびオキサロ酢酸などの脂肪族ケトジカルボン酸も添加剤として使用することができ、オキサロ酢酸が特に最も特に好ましい。
【００１９】
さらに、本発明に従って、アミノ酸を使用することもでき、例えばアミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸（イソロイシン）などのα−アミノ酸が好ましい。グリシンを使用するのが最も好ましい。
【００２０】
上述のプロトン供与体は、個々の物質として、または純粋な立体異性体の形態で、および混合物の状態でも、使用することができる。
【００２１】
無機酸およびその塩を、本発明に従って、更なる添加剤として使用することもできる。アルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩と、リン酸もしくは硫酸などの無機酸との塩を使用することが好ましい。リン酸および硫酸アンモニウムを使用することが最も好ましい。
【００２２】
本発明の目的における核酸という用語は、より広い意味での核酸を意味し、したがって、例えば、二本鎖、一本鎖、環状および直鎖、分枝などの、すべての長さまたは立体配置のリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸、およびそのすべての可能なサブユニット、例えばヌクレオチドモノマー、オリゴマー、プラスミド、細菌ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに動物および植物細胞由来のゲノムおよび非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ、プロセシングされた形態のｍＲＮＡ、プロセシングされていない形態のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ，ｃＤＮＡならびに考えられる他のすべての核酸が含まれる。
【００２３】
使用される、核酸を有する生物サンプルは、例えば参照により本明細書に組み込まれる欧州特許出願第９５９０９６８４．３号に開示されているように、無細胞サンプル材料、血漿、血液、血清、細胞、白血球画分、クルスタ・フロジスティカ（ｃｒｕｓｔａ ｐｈｌｏｇｉｓｔｉｃａ）、痰、尿、精液、糞便、スメア、吸引液などの体液、生検材料、例えば組織および器官の一部など、すべての種類の組織サンプル、本発明に従って考えられる、遊離もしくは結合核酸または核酸を含有する細胞を含む食物サンプル、例えば生物体（単細胞または多細胞生物；昆虫等）、植物および植物の器官、細菌、ウイルス、酵母および他の菌類または真核生物および原核生物等、あるいは遊離核酸であることができる。
【００２４】
本発明の技術的背景に関して：
その核酸を研究することによって、細胞の遺伝的起源および機能活性を決定かつ検討することができることは、従来技術から十分によく知られている。核酸およびタンパク質の分析によって、細胞活性の原因への直接的なアクセスが得られる。このように、それらは潜在的に、例えば代謝産物の検出など、間接的な従来の方法より優れている。したがって、分子生物学的分析は、多くの分野、例えば医学および臨床診断において、医薬組成物の開発および評価を行う製薬分野において、食品分析において、食品製造のモニタリングにおいても、作物および家畜を育てる農業において、ならびに環境分析および多くの研究分野において既に用いられている。
【００２５】
ＲＮＡ、特に細胞中のｍＲＡＮを分析することによって、遺伝子の活性を直接決定することが可能である。分子生物学の最新方法、例えば実時間逆転写酵素ＰＣＲまたは遺伝子発現チップ分析による、細胞における転写パターン（ｍＲＮＡパターン）の定量分析によって、例えば異常に発現した遺伝子を検出し、それによって、代謝異常、感染、または癌の発生を検出することが可能となる。例えば、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＮＰもしくはシークエンシングなどの分子生物学的方法による、細胞からのＤＮＡの分析によって、例えば遺伝的欠陥を検出すること、またはＨＬＡタイプおよび他の遺伝標識を決定することが可能となる。
【００２６】
ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの分析もまた、ウイルス、細菌等の感染性病原体を直接検出するのに用いられる。
【００２７】
その自然環境から生物サンプルを採取した直後に核酸およびタンパク質を安定化することは、核酸の分析に絶対に必須である。これは、生物サンプルを採取した後、非常に急速に分解し得るＤＮＡ、特にＲＮＡに当てはまる。一方、生物サンプルを一旦採取すると、ストレス遺伝子の誘導によって、新たなｍＲＮＡ分子が合成され、その結果例えば、細胞の転写パターンが変化する可能性がある。これによって、その後の分析が不正確となる可能性がある。特に医学分野では、核酸を含有するサンプルを採取し、次いで、それらを最初にしばらくの間保存し、実験室に輸送されるまで、さらに研究されないのが実際に一般的であるため、核酸を安定化することは必須である。
【００２８】
一方、サンプル中に含有される核酸は、変化するか、または完全に分解さえし得る。これは当然、続いて行われる試験の結果に多大な影響を及ぼすか、またはそれらを完全に不可能とする。かかる試験は、例えばノーザンおよびサザンブロット分析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳｕｎＲｉｓｅ、ＬＣＲ、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、ＳＤＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡチップおよび遺伝子発現アレイおよび突然変異分析、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＮＰ分析、ｃＤＮＡ合成、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）またはＴａｑｍａｎ技術および他の実時間の定量法など、分子生物学的技術を用いて行われる。一方、インタクトな高精製核酸−ＤＮＡまたはＲＮＡの使用は、上記の試験の使用または実施に対する基本的な適合性の基準となる。さらに、核酸を含有するサンプルの単離およびアッセイもまた、時間のかかる作業である。さらに、例えば試験が失敗した場合に生じるような、分子生物学分野で使用される研究実験室の汚染が、試験結果のエラーをまねく可能性がある。
【００２９】
従来技術に関して
数多くの出版物では、例えば組織などの適切なサンプルから核酸を続いて単離するための、固定液としてのエタノールおよびアセトンをベースとする混合物の使用が提案されている。この文献を研究した後、この種のエタノール／アセトン混合物は、ＲＮＡの安全な回収に課せられる必要条件をすべて満たすわけではないことが明らかである。このように、この種の混合物は、分解からＲＮＡを保護することができない。さらに、さらに広範な細胞凝集魂から構成される固体サンプル中でＲＮＡが保護される保証はない。さらに、提案された混合物は高い引火性または爆発性であり、実験室で作業する際にかなり危険性がある。
【００３０】
それに加えて、さらに周辺の関連する従来技術は、固定化または保存された組織サンプルからのＲＮＡの回収に関係する。これは特に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション中に達成されるシグナル強度を最大にする、組織標本の適合性に関する。換言すれば、この種の実験は、それを保存するよりもむしろ、ＲＮＡを検出することを意図するものである（米国特許第５１９６１８２号および５２６００４８号）。
【００３１】
他のレポートは、このようにして得られた断片をＰＣＲによる制限分子分析にかけることを可能にするために、固定組織から断片化ＲＮＡまたはＤＮＡを回収することに関する。この種の断片化ＤＮＡまたはＲＮＡを得るために、構造組織成分を分解することを可能にするため、対応するサンプルを従来法によりプロテイナーゼＫで処理する；次いで、単に、グアニジウム塩を含有する溶液でＲＮＡを抽出する。しかしながら、この方法によって固定組織から得られたＲＮＡは、品質が低く、大きさがわずか約２００塩基である。従来技術に従って、特に固定化中の細胞内基質内のＤＮＡまたはＲＮＡの内因性かつ架橋反応の負の影響を含む一定数の特定因子に、これを抑えることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡが大部分の場合で少なくとも一部分解するという事実に基づくと、このようにして得られたＤＮＡまたはＲＮＡは、もはやノーザン分析に上手く使用することはできない。このように単離されたＲＮＡは、比較的小さな断片を増幅するためにのみであるが、せいぜい多少の成功の見込みを持って、ＲＴ−ＰＣＲ反応に使用することができる程度である。
【００３２】
従来技術では、凝固点を超える温度でＲＮＡを保存するための、硫酸アンモニウムの使用もまた記述されている［ＷＯ００／０６７８０］。この種の組成物は、ＲＮＡｌａｔｅｒの名称で従来技術に従って使用されている。しかしながら、この種の硫酸アンモニウム水溶液は、血液、血漿または血清中のＲＡＮを安定化するのには適していない。上記のサンプルは高いタンパク質濃度を有するため、この種のアンモニウム塩溶液と接触するとすぐに、限られた溶解度の沈殿物が形成する［Ｍｅｓｓｒｓ Ａｍｂｉｏｎ（アメリカ、テキサス州オースティン）からのＲＮＡｌａｔｅｒ製品の情報］。
【００３３】
さらに、生物サンプルから核酸を単離するために、この種のカチオン化合物を使用することは、従来技術から知られている。かかる用途は、例えば米国特許第５，０１０，１８３号および同第５，３００，６３５号および欧州特許：ＥＰ０４４２０２６に記載されている。これらの出版物では、サンプル調製に通常用いられるインキュペーション時間、つまり約数分の間、生物サンプルをカチオン化合物と共にインキュベートし；次いで、その核酸を再度精製する。
【００３４】
従来技術から公知の化合物の研究によって、従来技術で言及されているカチオン化合物、特に米国特許に開示されているテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムは、例えば血液が長期間保存される場合に、それら自体で細胞ＲＮＡの適切な安定化を保証するものではないことが示されている。
【００３５】
実を言えば、例えば数日間血液中のウイルスを安定化することに着手している実験は従来技術から知られているが、これらの知見では、インタクトなままのＲＮＡについて何らの言及もされていない。このように、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）およびマクファーレン（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ）［Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４７，（１９９５） １５３］は、Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４（登録商標）による血液中のＣ型肝炎ウイルスの周囲温度で７日間の安定化について記述している。そのウイルスは、ＨＣＶゲノムの長さ２５０ｂｐの断片をＲＴ−ＰＣＲにより増幅することによって検出された。しかしながら、開示されたその結果からは、小さな断片のみが増幅されたため、ＲＮＡがインタクトである十分な証拠は得られなかった。さらに、その実験は、不定のウイルスサンプルを添加して行われ、そのため、保存中のウイルスＲＮＡの分解に関して判断を下すことは不可能であった。
【００３６】
さらに、国際特許出願：ＷＯ９９／２９９０４には、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、塩化リチウム、塩化マンガン、サルコシル、ＳＤＳ、過塩素酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムおよびチオシアン酸ナトリウムと共にＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはＢＡＰＴＡを用いた体液中のＤＮＡの安定化が記載されている。さらに、例えばＴｒｉｚｏｌ（登録商標）などのフェノールを含有する試薬を使用して、保存中にＲＮＡを安定化することができることは従来技術から知られている。しかしながら、これらの試薬はすべて、健康に非常に有害であり、したがって、常用するのには適していない。
【００３７】
そこで、本発明の目的は、組織または血液、血漿または血清の存在下にてＲＡＮを安定化する組成物を提供することである。
【００３８】
本発明はさらに、安定化溶液の形で組成物を提供することにも言及しており、その組成物の成分は健康に有害ではなく、したがって、サンプルを入手した場所から実験室へ移動する間、例えば生物サンプル材料を安定化するために、サンプルを扱うスタッフの健康を脅かす危険性なく使用することも可能である。
【００３９】
本発明の他の目的は、安定化試薬それ自体もまた溶液中で安定なままである必要性を満たし、かつ例えば限られた溶解度の沈殿物の溶解など、使用者による前処理が必要ない安定化溶液の形で組成物を提供することである。この種の前処理は常に、安定化効率の変動のリスクを含む。
【００４０】
本発明の他の目的は、多用途である、つまり幅広い生物サンプルに使用することができる組成物を提供することである。
【００４１】
驚くべきことに、特に米国特許第５ ０１０ １８３号および同第５ ３００ ６４５号に開示されており、かつ本発明に従って上述の１種または複数種の添加剤と組み合わせられる化合物などのカチオン化合物と、生物サンプルの核酸を接触させた場合に、長時間にわたり核酸を安定化することができることが現在見出されている。本発明に従って問題を解決するのに適切な好ましい添加剤を表１に示す：
【００４２】
【表１】
【００４３】
添加剤は、様々な濃度で安定化試薬中に存在することができる；例えば、添加剤は、安定化溶液と血液との混合物中に、容積比１：１、好ましくは３：１、濃度５０ｍＭ〜飽和、好ましくは１００〜１Ｍ、最も好ましくは２００〜５００ｍＭで存在することができる。添加剤の性質に応じて、他の濃度範囲が有利であることが証明される。異なる添加剤の組み合わせを使用することも可能である。
【００４４】
組成物水溶液中のカチオン化合物濃度は、０．０１重量％〜飽和、好ましくは０．１重量％〜飽和、さらに好ましくは０．５〜１５重量％、最も好ましくは２〜１０重量％の範囲である。
【００４５】
当然、カチオン化合物と添加剤との溶液を添加する場合には、最適な濃度は、生物サンプルのそれぞれの容積、および安定化溶液と生物サンプルとの容積比によって決定される。
【００４６】
一般にカチオン化合物と添加剤との混合物のｐＨを、広いｐＨ範囲（ｐＨ２〜１２）にわたりサンプルの関数として変化させることができ、ｐＨ２〜ｐＨ１０の範囲であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ３〜ｐＨ８の範囲である。好ましいｐＨ範囲は、使用する生物サンプルに依存する。血液、血漿および血清の場合には、ｐＨ２〜ｐＨ６の範囲、特にｐＨ３〜ｐＨ４のｐＨ値が好ましい。
【００４７】
血液、血漿および血清は別にして他の細胞体液、または例えば細菌、吸引液、細胞、組織、および上述のサンプルなど、他の生物サンプルの場合、カチオン化合物および添加剤からなる安定化溶液のｐＨ値は、好ましくはｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲、さらに好ましくはｐＨ４〜ｐＨ８の範囲である。
【００４８】
生物サンプル中の核酸を安定化するために、カチオン化合物（１種または複数種）および添加剤を含有する溶液とサンプルを混合することができる。生物サンプルを０．１〜１０，０００容積添加することができ；範囲１〜１０００の容積を添加することが好ましく、範囲１〜１００の容積を添加することが最も好ましい。しかしながら、例えば細い針による針生検または低細胞数の培養から得たサンプルなど、サンプルの性質に応じて、場合によってはかなり高い容積もまた用いることができる。
【００４９】
同様に、生物サンプル自体が固体を溶解する液体（例えば、細胞含有体液、培養液中の細胞、尿など）を含有する場合、または液体、例えば水をそれに添加して、固体を溶解する場合、上述のカチオン化合物および添加剤を固体状で添加することもできる。固体を添加する利点は、固体が通常、化学的に安定であり、固体はサンプルに添加するのが容易である場合が多いことである。
【００５０】
さらに、組織などの非常に緻密な生物サンプルの場合は特に、例えば、核酸もしくは個々の細胞もしくは細胞の凝集塊の開放を補助するために、安定化溶液中でまたは安定化溶液と混合する前に、例えばサンプルに対する機械的、化学的、物理的もしくは酵素的作用により緻密なサンプルを破壊することによって、サンプルを粉砕またはホモジナイズすることが可能である。機械的作用は、電気メス、ビーズミルを用いて、または例えばシリンジで押しつぶすことによって行うことができ、サンプルに対して作用する適切な酵素は、例えば加水分解酵素、プロテアーゼまたはリパーゼである。
【００５１】
さらに、そのサンプルは、純粋な物理的手段、例えば超音波によって前処理してもよい。
【００５２】
前処理は、化学的に、単独でまたは純粋な物理的方法と共に、実行することもできる。溶解を補助する手段には、例えば、脂肪族アルコール、特にイソプロパノール、またはアルデヒドまたはジアルデヒド、例えばグリオキサール、またはフェノールまたはフェノール誘導体、例えば２−ビフェニロール、またはイオン、双性イオンおよび非イオン化合物、例えばメルカプト、または還元剤、例えばジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノール、またはリン酸誘導体、例えばリン酸トリブチル、またはカオトロピック試薬、例えば尿素、チオシアン酸グアニジウムまたは塩酸グアニジウム、または塩を個々にまたは組み合わせて使用することが含まれる。
【００５３】
機械的、化学的、物理的または酵素的にサンプルに作用する他の可能な方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に含まれることを意図する。
【００５４】
特定の必要条件に応じて、サンプル材料をかなり長い期間、例えば室温で１日〜１４日以上保存してもよいが、例えば４０℃以上の高温、および例えば４℃または−２０℃以下などの低温でも保存してもよい。
【００５５】
上述の化合物の溶液中での生物サンプルの保存に続いて、直接核酸を分析する技術を用いるか、または核酸をサンプルから精製してもよい。
【００５６】
例えば、ブロット法、生体分子を分離するゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー法によって、核酸を直接検出／分離してもよい。
【００５７】
生物サンプルから核酸を精製するために、遊離核酸または核酸を含有する細胞もしくは粒子を、例えば遠心分離または濾過によって溶液の残りから分離し、米国特許第５，０１０，１８３号、同第５，３００，６４５号および欧州特許出願第９９１０３４５７．０号に記載されているように、少量で有利に行うことができる更なる精製にかける。
【００５８】
保存容器中で核酸または核酸を含有する細胞もしくは粒子を直接分離することによって、精製のために他の容器にサンプルを移す他の段階が不要となり、そのため、サンプルの損失が減少し、サンプルから採取された核酸による互いの混同および汚染のリスクもまた極力抑えられる。このように、これらの安定化試薬を使用することによって、生物サンプル中の核酸を安定化し、直接単離する一段階方法が導かれ、その方法では、代わりに生物サンプルからＲＮＡおよびＤＮＡを単離すること、または１つのサンプルから並行してＲＮＡおよびＤＮＡを単離することができる。
【００５９】
１種または複数種のカチオン化合物および１種または複数種の添加剤を含有する、本発明による組成物を用いて核酸を安定化することによって、サンプル中の核酸は、長期の保存中でさえ、または輸送中に変化しないことが確かなものになる。したがって、その後の試験の精度が著しく向上する。ある特定の場合、例えばサンプル材料を長距離間輸送するか、または長期間保存しなければならない場合では、本発明による方法によって、これらの試験をかかる期間の後に行うことが初めて可能となる。
【００６０】
本発明の利点は特に、例えば、サンプリング直後に固定化しなければならない転写物レベルを分析する研究分野、および例えば、分析の準備が整うまで保存および輸送中に患者のサンプルも安定化しなくてはならない、分子診断などの臨床分析分野において見出されている。特に、核酸の単離および安定化は、腫瘍の診断において、遺伝性疾患の診断ならびにウイルスの診断およびモニタリングにおいて、他の感染性病原体の診断およびモニタリングにおいて、遺伝子発現パターンの分析において使用される。
【００６１】
本発明の適用分野は、医学または動物学分野に及ぶだけではなく、植物、真菌および原核生物系の分析も含む。培養および自然環境から得た、植物および植物器官、藻類、真菌および細菌からの核酸の安定化および単離は、例えば転写物レベルおよび遺伝子発現パターンを分析する研究、および土壌サンプル中の細菌等の複合個体群における種を同定かつ定量する研究において使用される。
【００６２】
可能性のある用途には、例えば食物分析などの他の分析分野も含まれる。
【００６３】
本発明を以下の実施例および図によって説明する。記述および実施例において、以下の略語が使用される：
ＡＦＬＰ 増幅断片長多型
Ａ．ｄｅｓｔ． 蒸留水
ＢＡＰＴＡ１ ２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’， Ｎ’−テトラ酢酸
ＥｃｏＲＩ 制限酵素大腸菌株Ｒ
Ｅ２６０／Ｅ２８０ ２６０および２８０ｎｍでの吸光度の商
ＥＤＴＡ エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸
ＥＧＴＡ ［エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］テトラ酢酸
ＧＡＰＤＨ グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 制限酵素インフルエンザ菌
ｈｕｇｌ 巨大な幼虫のヒトホモローグ
ＩＦＮ−γ インターフェロンガンマ
ＬＭ 長さのマーカー
ＭＯＰＳ ３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸
ｎｂ 決定されず
ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０ ｉｍｂｅｎｔｉｎ−Ｎ／５２；オクチルフェニルポリエチレングリコール
ＯＤ 光学密度
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＦＬＰ 制限酵素断片長多型
ｒｐｍ 毎分回転数
ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ
ｒＲＮＡ リボソームＲＮＡ
ＲＴ 室温
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写酵素 ＰＣＲ
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＮＰ 一塩基多型
ＳＳＣ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液
ＴＢＥ トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー
Ｔｒｉｓ ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール
Ｕ ユニット
【００６４】
例えば時間に対してｈなど、ここに列挙していない略語は、当業者にはよく知られているか、あるいは従来技術におけるそれらの使用から十分によく知られているだろう。
それらが基づく図および実験の説明
図１は、異なるｐＨレベルを有する様々なカルボン酸バッファー中のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム（ＴＴＡＯｘ）による、血液中のＲＮＡの安定化を示す。
図２は、様々な濃度の酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図３は、２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子（Ａ）およびＩＦＮ−γ遺伝子（Ｂ）のｍＲＮＡの放射標識プローブとのノーザンハイブリダイゼーションの結果として、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図５は、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血液中のＤＮＡの安定化を示す。
細胞ＲＮＡの他に、白血球由来のゲノムＤＮＡもまた、ここで開発された方法によって安定化し、次いでシリカ膜に結合させることによって単離することができる。図５は、７２時間保存した後でさえ、高分子ＤＡＮ（長さ＞２０ｋＢ）が単離されることを示している。
図６は、ゲノムＤＮＡを酵素反応に使用した場合の結果を示す。２４時間または７２時間保存した後に単離したＤＮＡ（実施例５を参照のこと）を様々な酵素反応に使用する。
Ａ．制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｅ）またはＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）６Ｕを使用して、ＤＮＡ２μｇを３７℃にて３時間切断し、次いで０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。いずれの場合も対照として、未切断のＤＡＮを適用する。
Ｂ．ゲノムＤＮＡのアリコート１５０ｎｇおよび３００ｎｇをＰＣＲ反応に使用する（総容積５０μｌ）。その反応では、ｈｕｇｌ（巨大な幼虫のヒトホモローグ）遺伝子の長さ１．１ｋＢ断片を増幅する。そのＰＣＲ産物を１．２％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。
図７は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表２に示す。
図８は、酒石酸またはタルトロン酸と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの様々な期間にわたる安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表３に示す。
図９は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿１ｍｌ中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表４に示す。
図１０は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによるＬｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルは、二重測定で調製し、サンプル１４、４０、６６および９２は一重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表５に示す。
図１１は、異なる量のＨｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表７に示す。
図１２は、マクロファージ中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表９に示す。
図１３は、培養液を除去しない、Ｈｅｌａ付着細胞中のＲＮＡの安定化を示す。溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表１３に示す。
図１４は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる腎組織中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表１２に示す。
図１５は、ＲＮＡの安定化および単離と同様な、ＤＮＡの安定化および単離を示す。溶出液のアリコート４０μｌを０．８％アガロース−ＴＢＥゲルで分離する。問題のサンプルは実施例１５に記述する。
【００６５】
実施例
実施例１：
異なるｐＨレベルの様々なカルボン酸バッファー中のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム（ＴＴＡＯｘ）による血液中のＲＮＡの安定化
様々な鎖長のカルボン酸を添加剤として使用する。さらに、モノ、ジおよびトリカルボン酸、ヒドロキシル化および非ヒドロキシル化カルボン酸を試験する。そのすべての物質は、カチオン化合物テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと共に安定化に使用される。その物質のｐＨおよび濃度のどちらも変化する。
【００６６】
図１に、その試験の結果を示す。どの場合でも、インタクトなＲＮＡを２４および４８時間後でさえ単離することができる。場合によっては少量であるＲＮＡの量は、処理される血液が少量であること、および様々な血液サンプル中のＲＮＡ含有量が異なることに対応するものである。この実験では、いくらかのゲノムＤＮＡもまた、ＲＮＡ画分中で得られた。
【００６７】
各濃度２００ｍＭの、かつ問題のカルボン酸に対して様々なｐＨレベルの様々なカルボン酸で緩衝された１０％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムからなるバッファー５００μｌで、血液５００μｌを室温で２４時間および４８時間保存する。ＲＮＡを単離するために、カチオン化合物および核酸からなる複合体を遠心分離する；そのペレットを水で１回洗浄し、再度遠心分離し、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＬＴバッファーなど、標準市販の溶解バッファー３００μｌ中に溶解する。サンプルを水３６０μｌで希釈し、プロテイナーゼＫ４０μｌで５５℃にて１０分間処理する。次いで、そのサンプルを遠心分離し、エタノールを上清に添加し、シリカ膜を含むスピンカラムにそれを添加する。遠心することによって、サンプルを膜に通す。スピンカラムは、市販のイソチオシアン酸グアニジニウム含有洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で１回洗浄し、ＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥなどの標準市販のアルコール含有洗浄バッファーで２回洗浄し、次いで、遠心することによって膜にも通されるＲＮａｓｅ非含有水６０μｌ中にＲＮＡを溶出し、その溶出液のアリコート３０μｌを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離する。
【００６８】
実施例２
テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび様々な濃度の酒石酸（緩衝）ｐＨ３を用いた、全血中のＲＮＡの安定化
１０％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび５０〜５００ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）からなるバッファー５００μｌで、血液５００μｌを室温で２．５時間、２４時間および４８時間保存する。さらに、ＱＩＡＧＥＮ社製「ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅセット」でサンプルをＤＮａｓｅで処理することによって、ゲノムＤＮＡを除去することを除いては、図１に示すようにＲＮＡを単離する。ＲＮａｓｅ非含有水８０μｌでＲＮＡを溶出する。その溶出液３０μｌを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離する。
【００６９】
実施例３
２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）で緩衝されたテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、全血中のＲＮＡの安定化
ＲＮＡの完全性、収量および純度を決定する：
カルボン酸バッファー、例えば２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．０）で緩衝されたテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム溶液中で分解または収量の減少を生じることなく、血液中でＲＮＡは少なくとも７２時間安定化される（図３を参照のこと）。
【００７０】
１０％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．０）からなるバッファー２ｍｌと血液２ｍｌとを混合し、室温で２４〜７２時間保存する。例えばＱｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ社製バッファーＥＬなどの標準市販の赤血球溶解バッファーを、カチオン化合物および核酸からなる複合体を遠心分離する前にサンプルに添加し、次いでその混合物を氷上で１０分間インキュベートすることを除いては、実施例２に記載のように、ＲＮＡを単離する。ＲＮａｓｅ非含有水８０μｌでＲＮＡを溶出する。その溶出液３０μｌを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離するか、または分光光度計で測定する。水で希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収を光度測定することによって、単離した全ＲＮＡの量を決定する。このように、波長２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を測光により決定することによって、得られたＲＮＡの純度を測定する。
【００７１】
実施例４：
酒石酸（ｐＨ４）で緩衝された、異なる濃度のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化
ノーザンブロット分析
４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．７）からなるバッファー６．９ｍｌと血液２．５ｍｌとを混合し、室温で１時間、２４時間、４８時間および７２時間保存する。ＲＮＡを単離するために、カチオン化合物と核酸との複合体を遠心分離する。そのペレットを水で１回洗浄し、次いで例えばＱｉａｇｅｎ社製バッファーＲＬＴなどの溶解バッファー３００μｌ中に溶解する。サンプル調製の残りの作業を、図２に記載のように行う。次いで、全ＲＮＡのアリコート２．５μｇを１．２％変性アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離する。次いで、そのＲＮＡをナイロン膜に移し、リン酸ナトリウム／ＳＤＳバッファー中で６８℃にて、ＧＡＰＤＨ遺伝子（図４Ａ）、またはＩＦＮ−γ遺伝子（図４Ｂ）の放射標識アンチセンスＲＮＡプローブと約１２時間にわたりハイブリダイズする。減少する塩濃度２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ〜０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄バッファーで温度６８℃にて、その膜を洗浄する。次いで、ナイロン膜をＸ線フィルム上で暴露する。ＧＡＰＤＨおよびＩＦＮ−γ−ｍＲＮＡのシグナルはどちらも、７２時間を超える保存期間にわたり一定のままである。
【００７２】
実施例５：
酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝されたテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血液中のゲノムＤＮＡの安定化
細胞ＲＮＡの他に、全血からのゲノムＤＮＡもまた、本発明において開発された方法によって安定化することができ、次いでシリカ膜に結合させることによって単離することができる。図５から、室温で７２時間保存した後でさえ、高分子ＤＮＡ（長さ＞２０ｋＢ）が単離されることが示されている。
【００７３】
４％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ酒石酸（ｐＨ３．７）からなる溶液６．９ｍｌと血液２．５ｍｌとを混合し、室温で２４時間または７２時間保存する。ＤＮＡを単離するために、カチオン化合物とＤＮＡとの複合体を遠心分離する。塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡを含有するバッファー３００μｌにそのペレットを溶解し、次いで、例えばＱｉａｇｅｎ社製バッファーＡＬなどの市販の塩酸グアニジウムバッファー３６０μｌ中に溶解し、ならびにプロテイナーゼＫ２０μｌを添加する。そのサンプルを６５℃で１０分間インキュベートし、次いで、エタノール４２０μｌを添加し、シリカ膜を含むスピンカラムにサンプルを適用する。そのサンプルを、遠心分離によって膜を通過させる。例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＡＷ１など、標準市販のエタノール含有塩酸グアニジウムバッファーでシリカ膜を洗浄し、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＡＷ２などのエタノール含有洗浄バッファーで１回洗浄する。ＤＮＡをＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８）３００μｌで希釈する。溶出液のアリコート５μｌを０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。
【００７４】
実施例６：
酵素反応におけるゲノムＤＮＡの使用。
図６から、実施例５に従って単離されたＤＮＡを様々な酵素反応（制限増幅およびＰＣＲ増幅）に使用することができることが分かる。
【００７５】
２４または２７時間の保存後に単離されたＤＮＡ（実施例５参照）は様々な酵素反応に使用される。これは、単離したＤＮＡの純度が高く、品質が良いことの証拠である。
【００７６】
Ａ）制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｅ）およびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｈ）６Ｕで３７℃にて３時間、ＤＮＡのアリコート２μｇを切断し、次いで０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。対照として、未切断のＤＮＡを適用する。
Ｂ）ゲノムＤＮＡのアリコート１５０ｎｇおよび３００ｎｇをＰＣＲ反応（総容積５０μｌ）に使用する。その反応では、長さ１．１ｋＢ断片のｈｕｇｌ遺伝子が増幅される。そのＰＣＲ産物を１．２％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。
【００７７】
実施例７
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、カルボン酸および他の添加剤をテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムに添加することによって、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを単独で用いた場合のＲＮＡの安定化と比較して、血漿中の遊離ＲＮＡの安定化が著しく改善されることが実証される。
【００７８】
この実験で使用する溶液を調製するために、３０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸、クエン酸、タルトロン酸、コハク酸、硫酸アンモニウムまたはリン酸の原液と混合して、２％または４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、および２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。添加剤を全く含有しない５％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム溶液を対照として使用する。
【００７９】
このように調製したすべての溶液のアリコート０．５ｍｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。例えば、市販のＲＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社によりＲＮＡ単離キットとして市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉ−Ｋｉｔｓ）により予め単離された、ＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ１５μｇをエッペンドルフ容器の蓋にピペッティングする。ヒト血漿０．５ｍｌをその溶液に添加し、容器の蓋を閉め、容器を迅速に５回反転して液体を混合する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で１日保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【００８０】
ＲＮＡを単離するために、サンプルを２５０００×ｇで３分間にわたり遠心分離する。上清を除去し、グアニジウム塩酸塩およびＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（ｐＨ７．０）を含有する、６０℃に調節されたバッファー０．５ｍｌおよびプロテイナーゼＫも、ペレットに添加する。そのペレットをボルテックスすることによって溶解し、５０℃で１５分間インキュベートする。次いで、エタノール−ｎｏｎｉｄｅｔＰ４０溶液０．５ｍｌを添加し、サンプルを約５秒間ボルテックスすることによって混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡ ａｍｐカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラム中にそのサンプルを入れ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、アルコール含有洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＡＷ２で２回洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。アルコール含有洗浄バッファーで洗浄した後、バッファーを添加することなく、遠心することによって（最大３分の回転数、この場合では２５０００×ｇ）膜を乾燥させる。溶出液については、ＲＮａｓｅを含有しない水３０μｌを膜上にピペッティングして、膜から精製ＲＮＡを引き離す。その溶出液は、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出プロセスを完了する。
【００８１】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート３０μｌを使用する。その結果を図７に示す。ゲルレーンのローディングを表２に示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
個々のサンプルのＲＮＡ品質を比較するために、レーン４５は、これらの実験に使用するＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ３．７５μｇを含む。
【００８４】
この実験で使用されるＨｅＬａ全ＲＮＡのゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後にインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡが示される。視認できるｒＲＮＡバンド（２８ＳｒＲＮＡ）の一番上のバンドは、それより下のｒＲＮＡバンド（１８ＳｒＲＮＡ）よりも明らかに濃く、かつ太く、それはインタクトな分解されていないＲＮＡの一般的な特徴である。添加剤を添加することなく、５％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合した血漿中で１日保存したＨｅＬａ全ＲＮＡを、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび様々な添加剤と混合した血漿中で１日保存した後に単離したＲＮＡと比較すると、ＲＮＡの安定化が添加剤を使用することによって改善されていることが明白に示されている。安定化化合物を含まない血漿にＲＮＡを添加した場合、これによって、よく知られているように数分以内にＲＮＡ全体の分解が引き起こされる。
【００８５】
実施例８
酒石酸またはタルトロン酸と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、様々な時間にわたる血漿中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、血漿中でＲＮＡが少なくとも１４日まで安定化されることが示されている。
【００８６】
この実験に使用する溶液を調製するために、３０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸（ｐＨ３）またはタルトロン酸（ｐＨ３）の原液と混合して、６％または８％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。
【００８７】
このように調製したすべての溶液のアリコート０．５ｍｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。例えば、市販のＲＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社によりＲＮＡ単離キットとして市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉ−Ｋｉｔｓ）により予め単離された、ＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ１５μｇをエッペンドルフ容器の蓋にピペッティングする。ヒト血漿０．５ｍｌをその溶液に添加し、容器の蓋を閉め、容器を迅速に５回反転して液体を混合する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で３、７、１０および１４日保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【００８８】
ＲＮＡの単離は実施例７に記載のように行う。
【００８９】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート３０μｌを使用する。その結果を図８に示す。ゲルレーンのローディングを表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
個々のサンプルのＲＮＡ品質を比較するために、レーン「Ｋ」は、これらの実験に使用するＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ３．７５μｇを含む。
【００９２】
ゲル電気泳動による分離から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび酒石酸またはタルトロン酸（ｐＨ３）と混合した血漿でＨｅＬａ全ＲＮＡを１４日まで保存した後でさえ、臭化エチジウムで染色した後に、インタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。
【００９３】
実施例９：
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、血漿中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物により、多量の血漿中でさえ、ＲＮＡを安定化することができることが示される。
【００９４】
このように調製したすべての溶液のアリコート１ｍｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。例えば、市販のＲＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社によりＲＮＡ単離キットとして市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉ−Ｋｉｔｓ）を用いて予め単離された、ＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ１５μｇをエッペンドルフチューブの蓋にピペッティングする。ヒト血漿１ｍｌをその溶液に添加し、チューブの蓋を閉め、チューブを迅速に５回反転して液体を混合する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で３日間保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【００９５】
ＲＮＡの単離は実施例７に記載のように行う。
【００９６】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％ホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート３０μｌを使用する。その結果を図９に示す。ゲルレーンのローディングを表４に示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
個々のサンプルのＲＮＡ品質を比較するために、レーン１３は、これらの実験に使用するＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ３．７５μｇを含む。
【００９９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、インタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。このように、多量の血漿中でさえ、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、ＲＮＡは安定化される。
【０１００】
実施例１０：
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いた、ＨｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと様々な添加剤との混合物によって、ＨｅＬａ細胞中のＲＮＡを、室温で１４日までの保存期間にわたって安定化することができることが示される。
【０１０１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％または３０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸、クエン酸、タルトロン酸、硫酸アンモニウムまたはリン酸の原液と混合して、２％または４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、および２００ｍＭ添加剤の最終濃度をとする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。
【０１０２】
予め細胞培養から収集し、ＰＢＳで直ちに洗浄した１×１０６個のＨｅｌａ細胞を遠心分離（１２０×ｇで１分）によってペレットにし、上清を除去する。表４に示す溶液のアリコート３００μｌを細胞に添加し、ボルテックスによってサンプルを混合し、細胞を再懸濁する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で３、７、１０および１４日間保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【０１０３】
ＲＮＡを単離するために、１２００×ｇで３分間遠心分離することによって、細胞をペレットにし、上清を除去する。繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約１０秒以上の間にわたりボルテックスすることによって、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＴＬバッファーなどの標準市販のイソチオシアン酸グアニジウムバッファー６００μｌ中に、ペレットを再懸濁する。次いで、エタノール１容積（６００μｌ）を添加し、繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約５秒間にわたりボルテックスすることによって、成分を混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムにライセートを適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、標準市販のイソチオシアン酸グアニジウム含有第１洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で洗浄し、次いでアルコール含有第２洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥで洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。第２アルコール含有洗浄バッファーでの洗浄を少量で繰り返し、遠心することによって（最大２分の回転数、この場合では２００００×ｇ）膜を同時に乾燥させる。溶出液については、膜から精製ＲＮＡを引き離すために、ＲＮａｓｅを含有しない水４０μｌを膜上にピペッティングする。その溶出液は、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出プロセスを完了する。
【０１０４】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１０に示す。サンプルを表５にまとめる。サンプル１４、４０、６６および９２を１回試験し、結果を示すことを除いては、すべてのサンプルを２回試験し、結果を示す。
【０１０５】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【０１０６】
サンプル「Ｋ」は、予め保存されることなく、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓなどの単離キットによって、１×１０６個のＨｅｌａ細胞（＝ポジティブコントロール）から単離された全ＲＮＡを示す。サンプル「ａ」、「ｂ」、「ｃ」および「ｄ」は、上述のように添加剤を含まないＰＢＳ中で１×１０６個のＨｅｌａ細胞を３、７、１０または１４日間保存した後に単離された全ＲＮＡを示す。
【０１０７】
単離された全ＲＮＡの量は、水に希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収の光度測定によって決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を測光により決定することによって測定する。単離の結果を以下の表６に示す。いずれの場合も、２つの測定値の平均を示す。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後、正の対照においてインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。ｒＲＮＡバンド（２８ＳｒＲＮＡ）の一番上のバンドは、それより下のｒＲＮＡバンド（１８ＳｒＲＮＡ）よりも明らかに濃く、かつ太く、それはインタクトな分解されていないＲＮＡの一般的な特徴である。
ＰＢＳ中で細胞を３日間保存した後には、２つのｒＲＮＡバンドが同一強度を示し、極めて少ないＲＮＡが視認できることから、ＲＮＡは一部分解している。７日間以上保存した後には、ＲＮＡはもはや視認できない。これに対して、Ｈｅｌａ細胞中のＲＮＡは、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによって１４日間まで安定化される。これは、特異的ＲＮＡの収量および純度をＯＤ測定することによって確認される。安定化は、ｐＨにより影響を受ける。混合物において、つまりテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤とを混合した後、４を超えるｐＨ値が好ましい。
【０１１０】
実施例１１
異なる量のＨｅｌａ細胞におけるＲＮＡの安定化
これらの実験から、使用する細胞の数にかかわらず、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、ＨｅＬａ細胞中のＲＮＡを安定化することができることが示される。
【０１１１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、ｐＨ６の０．５Ｍ酒石酸の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。
【０１１２】
予め細胞培養から収集し、ＰＢＳで直ちに洗浄した１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個および５×１０６個のＨｅｌａ細胞を、遠心分離（１２０×ｇで１分）によってペレットにし、上清を除去する。４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ酒石酸を含有する溶液のアリコート３００μｌを細胞に添加し、ボルテックスによってサンプルを混合し、細胞を再懸濁する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で１５分間または１日保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【０１１３】
実施例１０に記載のようにＲＮＡを単離する。
【０１１４】
使用する対照は、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ酒石酸で前処理されておらず、かつ上述のようにＲＮＡを単離するために保存されていない１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個および５×１０６個のＨｅｌａ細胞である。
【０１１５】
単離したＲＮＡを、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１１に示す。サンプルを表７にまとめ、すべてのサンプルを２回試験し、結果を示す。
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
単離した全ＲＮＡの量は、水に希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収の光度測定によって決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を測光により決定することによって測定する。単離の結果を以下の表８に示す。いずれの場合も、２つの測定値の平均を示す。
【０１１８】
【表１１】
【０１１９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、保存された対照サンプルにおいて、保存されていない対照サンプルにおいてもインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。保存されていない対照と保存されたサンプルとの間に明らかな相違はない。同様に、ＯＤ測定によって決定されたＲＮＡ収量および純度から、ＲＮＡの収量または純度を低減することなく、ＲＮＡの安定化は、異なる量の細胞中で同程度に行われることが確認される。細胞数が増加するに従って減少する商Ｅ２６０／Ｅ２８０は、測定は水中で行われ、緩衝系では行われないという事実に起因し得る。
【０１２０】
実施例１２：
マクロファージ中のＲＮＡの安定化
これらの実験によって、様々な種類の細胞におけるＲＮＡを使用できることが実証される。この実験で使用するマクロファージは、前に使用したＨｅｌａ細胞よりも多量のＲＮａｓｅを含有し、このため、細胞中のＲＮＡが余儀なく分解される。
【０１２１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸（ｐＨ５）、０．５Ｍタルトロン酸（ｐＨ５）または０．５Ｍリン酸（ｐＨ５）の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度にする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を水酸化ナトリウム溶液で指定のｐＨに調節する。
【０１２２】
予め細胞培養から収集し、ＰＢＳで直ちに洗浄した１×１０６個のＨｅｌａ細胞を遠心分離（１２０×ｇで１分）によってペレットにし、上清を除去する。４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭの添加剤を含有する溶液のアリコート３００μｌを細胞に添加し、その細胞を再懸濁する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で２日間、６日間、９日間および１４日間保存する。すべての実験を二重測定で行う。
【０１２３】
そのＲＮＡを実施例１０に記載のように単離する。
【０１２４】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１２に示す。サンプルを表９にまとめる。すべてのサンプルを２回試験し、結果を示す。
【０１２５】
【表１２】
【０１２６】
レーン２５および２６は、マクロファージを予め保存することなく、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓなどの市販の単離キットを用いて、１×１０６個のマクロファージ（ポジティブコントロール）から単離した全ＲＮＡを示す。
【０１２７】
水で希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収を光度測定することによって、単離した全ＲＮＡの量を決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、波長２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を光度測定することによって決定する。単離の結果を以下の表１０に示す。いずれの場合も、２つの測定値の平均を示す。
【０１２８】
【表１３】
【０１２９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、保存された対照サンプルにおいて、および保存されていない対照サンプルにおいてもインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れ、２４日間保存した後でさえ、ＲＮＡ分解の兆候はない。同様に、光度測定によって決定されたＲＮＡの収量および純度は、保存中に未変化のままである。
【０１３０】
実施例１３
培地の除去を行わない、Ｈｅｌａ付着細胞中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物によって、付着細胞中でさえ、ＲＮＡを安定化することができることが示される。代わりにテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物を培地に添加しても、細胞を含有する培地を除去しない場合でさえ、安定化は依然として行われる。培地中の細胞は、体液中の細胞のモデルとして見なすことができる。
【０１３１】
この実験で使用する溶液を調製するために、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび特定の添加剤、酒石酸または硫酸アンモニウムを計量して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭの添加剤の最終濃度とし、水に溶解する。４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ酒石酸の場合には水酸化ナトリウムを用いて、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ硫酸アンモニウムの場合には硫酸を用いて、溶液のｐＨをｐＨ５に調節する。
【０１３２】
６ウェルプレートにおいて培地２ｍｌ中でＨｅｌａ細胞を培養する。その細胞は付着して成長する、つまりウェルの底面に細胞が付着する。細胞中のＲＮＡを安定化するために、１０ｍｌの４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ酒石酸（ｐＨ５）または４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ５）を各ウェルに添加し、そのシャーレを室温で４日間保存する。ネガティブコントロールとして、培地を含むが、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと２００ｍＭの添加剤との混合物を添加していないウェルを室温で４日間保存する。
【０１３３】
ポジティブコントロールとして、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓなどの標準市販の単離キットを用いて、予め保存することなく、１つのウェルからＨｅｌａ細胞のＲＮＡを単離する。これを行うために、培地を細胞から完全に除去し、溶解バッファーＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔの成分）３５０μｌと混合する。細胞をウェルの底面からスパチュラで掻き取り、いわゆる破砕機、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒなどに、ライセートを移す。１４０００ｒｐｍで２分間遠心することによって、そのライセートを破砕機に通し、このようにして、サンプルをホモジナイズする。その生成物を７０％エタノールと混合し、実施例１０に記載のようにＲＮＡを単離する。
【０１３４】
４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭの添加剤と混合した培地中で、細胞を４日間保存した後、その時点で引き離されている細胞を上清と共に収集し、３０００×ｇで５分間遠心分離する。その上清を除去し、細胞ペレットを用いて、実施例１０に記載のようにＲＮＡを単離する。
【０１３５】
４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭの添加剤を含まない（＝ネガティブコントロール）培地中で細胞を４日間保存した後、ポジティブコントロールについて上述のように、ＲＮＡを単離する。
【０１３６】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１３に示す。レーン１は、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ酒石酸（ｐＨ５）と混合した培地中で細胞を保存した後に単離された全ＲＮＡを含む。レーン２は、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ５）と混合した培地中で細胞を保存した後に単離された全ＲＮＡを示す。レーン３は、培地単独で細胞を保存した後に単離された全ＲＮＡを示し、レーン４は、予め保存することなく、ポジティブコントロールとして単離された全ＲＮＡを示す。
【０１３７】
水で希釈した後に、波長２６０ｎｍでの光吸収を光度測定することによって、単離した全ＲＮＡの量を決定する。このようにして得られたＲＮＡの純度を、波長２６０ｎｍでの光吸収に対する２８０ｎｍでの光吸収の比を光度測定することによって測定する。単離の結果を以下の表１１に示す。
【０１３８】
【表１４】
【０１３９】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、保存していないサンプルにおいて、およびテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物で保存したサンプルにおいてもインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡバンドが表れる。これに対して、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび添加剤を添加していない培地中でほぞんした細胞中のＲＮＡは、ほぼ完全に分解される。同様に、ＯＤ測定によって決定されたＲＮＡの収量および純度から、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび添加剤を添加していない培地中で保存されたサンプル中のＲＮＡの収量および純度が著しく低下するのに対して、保存されていないサンプルおよび安定化されたサンプルとの間の相違がないことが確認される。
【０１４０】
実施例１４：
様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる、組織中のＲＮＡの安定化
これらの実験から、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムもまた、組織由来のＲＮＡを安定化するのに適していることが分かる。
【０１４１】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸、クエン酸、タルトロン酸、硫酸アンモニウムまたはリン酸カリウム、シュウ酸またはリン酸の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと混合する前に、添加剤の原液を、水酸化ナトリウム溶液または硫酸（もしくは硫酸アンモニウム）または水酸化カリウム溶液または燐酸（もしくはリン酸カリウム）で指定のｐＨに調節する。
【０１４２】
取り除いた直後に液体窒素で凍結し、次いで−７０℃で保存しておいたマウスの腎組織をこれらの実験に使用する。その組織を７０〜９０ｍｇ凍結し、表１２に指定するバッファー５００μｌを組織各１０ｍｇに対して添加し、例えばＭｅｓｓｒｓ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製のＰｏｌｙｔｒｏｎなどのローター・ステーターホモジナイザーを用いて、その混合物を即座に３０〜６０秒間ホモジナイズする。溶液のアリコート５００μｌを、組織１０ｍｇに相当するホモジナイズしたプレパラートから取る。サンプルを室温で１日保存する。
【０１４３】
保存後、サンプルを１００００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去する。例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＴＬバッファーなどの標準市販のイソチオシアン酸グアニジウムバッファー６００μｌ中に、ボルテックスすることによってペレットを溶解する。次いで、７０％エタノール１容積（６００μｌ）を添加し、繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約５秒間にわたりボルテックスすることによって、成分を混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムにライセートを適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、標準市販のイソチオシアン酸グアニジウム含有第１洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で洗浄し、次いでアルコール含有第２洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥで洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。アルコール含有第２洗浄バッファーでの洗浄を少量で繰り返し、遠心することによって（最大２分の回転数、この場合では２００００×ｇ）膜を同時に乾燥させる。溶出液については、膜から精製ＲＮＡを引き離すために、ＲＮａｓｅを含有しない水４０μｌを膜上にピペッティングする。その溶出液は、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出を完了する。
【０１４４】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、１．０％のホルムアルデヒド−アガロース−ＭＯＰＳゲルを調製する。溶出液のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１４に示す。サンプルを表１２にまとめる。すべてのサンプルを２回実験し、その結果を示す。
【０１４５】
【表１５】
【０１４６】
サンプル「Ｋ」は、予め保存することなく、単離キット（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ製ＲＮｅａｓｙ）を用いて、凍結された腎組織から単離した全ＲＮＡを示す（＝ポジティブコントロール）。レーン「Ｎ」は、溶媒を添加していない、つまり乾燥している腎組織１０ｍｇを１日保存した後に、ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて単離した全ＲＮＡを示す（＝ネガティブコントロール）。
【０１４７】
ゲル電気泳動による分離によって、臭化エチジウムで染色した後に、ポジティブコントロールにおいてインタクトな２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡが表れる。安定化溶液なしで保存した腎組織を含むネガティブコントロールは、完全に分解されたＲＮＡを示す。これに対して、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム中でサンプルを保存した後に、インタクトなｒＲＮＡバンドがポジティブコントロールとして視認することができる。安定化はｐＨにより影響を受ける。テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと指定のｐＨの添加剤とを混合した後、組織中のＲＮＡを安定化するために、安定化溶液の最終ｐＨは４を超えるｐＨであることが好ましい。
【０１４８】
実施例１５：
ＲＮＡの安定化および単離と並行したＤＮＡの安定化および単離
これらの実験から、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムを用いて、組織中のＲＮＡのみならずＤＮＡも安定化されることが分かる。サンプルからＲＮＡを単離することに加えて、それと並行してＤＮＡを単離することも可能である。
【０１４９】
この実験で使用する溶液を調製するために、２０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍクエン酸（ｐＨ５）の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度となるように水酸化ナトリウムで調節する。
【０１５０】
取り除いた直後に液体窒素で凍結し、次いで−７０℃で保存しておいたマウスの腎組織をこれらの実験に使用する。その組織を約８０ｍｇ凍結し、４．２ｍｌの４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム、２００ｍＭクエン酸（ｐＨ５）を組織各１０ｍｇに対して添加し、例えばＭｅｓｓｒｓ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製のＰｏｌｙｔｒｏｎなどのローター・ステーターホモジナイザーを用いて、その混合物をすぐに３０〜６０秒間ホモジナイズする。溶液のアリコート５００μｌを、組織１０ｍｇに相当するホモジナイズしたプレパラートから取る。そのサンプルを室温で１日保存する。
【０１５１】
保存後、サンプルを１００００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去する。例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＴＬバッファーなどの標準市販のイソチオシアン酸グアニジウムバッファー６００μｌ中に、ボルテックスすることによってペレットを溶解する。次いで、７０％エタノール１容積（６００μｌ）を添加し、繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約５秒間にわたりボルテックスすることによって、成分を混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムにライセートを適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、実施例１４に記載のように単離することができる。スルーフロー（ｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗ）（約１２００μｌ）を回収し、１００％エタノール２００μｌと合わせて、ボルテックスすることによって混合する。これらのサンプルを再度、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡａｍｐカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムに適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＤＮＡは膜に結合した状態であり、次いで、標準市販のイソチオシアン酸グアニジウム含有第１洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で洗浄し、次いでアルコール含有第２洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥで洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。アルコール含有第２洗浄バッファーでの洗浄を少量で繰り返し、遠心することによって（最大２分の回転数、この場合では２００００×ｇ）膜を同時に乾燥させる。溶出液については、膜から精製ＲＮＡを引き離すために、水２００μｌを膜上にピペッティングし、室温で１分間インキュベートする。その溶出液を、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出を完了する。
【０１５２】
単離されたＲＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、０．８％アガロース−ＴＢＥゲルを調製する。サンプル１〜４のアリコート４０μｌを使用し、サンプル５〜９のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１５に示す。
【０１５３】
レーン１および２は、実施例１５に従って単離した全ＲＮＡを表す。レーン３および４は、参照としての全ＲＮＡ０．１μｇおよび０．５μｇをそれぞれ表し、使用したアガロースゲルにおいてインタクトなゲノムＤＮＡの流れ特性を示している。レーン５は、予め保存することなく、市販の単離キット（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨのＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ）を用いて、凍結ラット腎臓１０ｍｇから単離した全ＤＮＡを表している（＝ポジティブコントロール）。使用したネガティブコントロールは、１日保存した後、溶媒を添加していない、つまり乾いた腎臓組織、または蒸留水中の腎臓組織１０ｍｇから、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓを用いて単離された全ＤＡＮであった。このＤＮＡは、レーン６および７（乾燥保存）において、かつレーン８および９（Ａ．ｄｅｓｔ中で保存）において示される。
【０１５４】
ゲル電気泳動による分離によって、参照ＤＮＡを示すレーンおよび保存していないポジティブコントロールのＤＮＡを含有するレーンのどちらにも、分解されていない高分子ＤＮＡが示される。組織を乾燥保存または水中で保存することによって、ＤＮＡの完全な分解が引き起こされる。これに対して、実施例１５と同様に処理したサンプルはインタクトなままであり、保存期間全体を通して分解されない。したがって、テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムと添加剤との混合物は生物サンプル中のＤＮＡを安定化するのにも適しており、サンプルからＲＮＡおよびＤＮＡを並行して単離することもまた可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】異なるｐＨレベルを有する様々なカルボン酸バッファー中のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム（ＴＴＡＯｘ）による、血液中のＲＮＡの安定化を示す。
【図２】様々な濃度の酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
【図３】２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
【図４】ＧＡＰＤＨ遺伝子（Ａ）およびＩＦＮ−γ遺伝子（Ｂ）のｍＲＮＡの放射標識プローブとのノーザンハイブリダイゼーションの結果として、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
【図５】酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血液中のＤＮＡの安定化を示す。
【図６】ゲノムＤＮＡを酵素反応に使用した場合の結果を示す。
【図７】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの安定化を示す。
【図８】酒石酸またはタルトロン酸と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの様々な期間にわたる安定化を示す。
【図９】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿１ｍｌ中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１０】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによるＬｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１１】異なる量のＨｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１２】マクロファージ中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１３】培養液を除去しない、Ｈｅｌａ付着細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１４】様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる腎組織中のＲＮＡの安定化を示す。
【図１５】ＲＮＡの安定化および単離と同様な、ＤＮＡの安定化および単離を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基および／またはＣ６〜Ｃ２０アリール基ならびにＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を示すことができ、
Ｘ−は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオン示すことができる）で示されるカチオン化合物と、少なくとも１種類のプロトン供与体と、を成分として含有する組成物。
【請求項２】
Ｙが窒素を示すことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１が、好ましくは炭素原子１２個、１４個、もしくは１６個を有する高級アルキル基を示し、かつＲ２、Ｒ３およびＲ４がいずれの場合も、メチル基を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
アニオンＸ−が、ハロゲン化水素酸のアニオンまたは一塩基もしくは二塩基有機酸のアニオンから選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記アニオンＸ−が、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩またはクエン酸塩を含む群のアニオンから選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記プロトン供与体が、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸または無機酸またはその塩の中から、単独でまたは組み合わせて選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸、好ましくは酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸（２−メチル−酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、またはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）または前述の酸の混合物が、前記脂肪族モノカルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸およびビニル酢酸または前述の酸の混合物が、脂肪族アルケニル−カルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸またはアジピン酸または前述の酸の混合物の中から選択されるジカルボン酸が、飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
脂肪族ジカルボン酸、好ましくはシュウ酸またはコハク酸または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
脂肪族ヒドロキシ−ジ−およびトリ−カルボン酸、好ましくはタルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）−またはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
不飽和ジカルボン酸、好ましくはマレイン酸および／またはフマル酸または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
不飽和トリカルボン酸、好ましくはアコニット酸、またはこれらの酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
脂肪族ケトジカルボン酸、好ましくはメソシュウ酸またはオキサロ酢酸、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
アミノ酸、好ましくはアミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸（イソロイシン）、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
それが水溶液中に存在することを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カチオン化合物が、０．０１重量％から飽和の範囲、好ましくは０．１重量％から飽和の範囲、最も好ましくは０．５〜１５重量％の範囲、特に最も好ましくは２〜１０重量％の範囲の濃度であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記の個々の成分が任意に、水溶液中で合わされ、かつ混合されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物のうちの１種類を調製する方法。
【請求項１９】
核酸を単離かつ／または安定化するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
核酸として、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が安定化されることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
核酸として、ヌクレオチドモノマー、オリゴマー、プラスミドの形で、ウイルスおよび／または細菌ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに動物および植物細胞または他の真核生物由来のゲノムおよび非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの形で、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が安定化されることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
核酸として、処理および未処理状態のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｃＤＮＡが安定化されることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含有する診断用組成物。
【請求項２４】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含む、核酸を安定化するためのキット。
【請求項２５】
任意に他の賦形剤と共に、核酸を含む生物サンプルと、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物とを含有する混合物。
【請求項２６】
前記混合物のｐＨが、２〜１２、好ましくは２〜１０の範囲、最も好ましくは３〜８の範囲であることを特徴とする、請求項２５に記載の混合物。
【請求項２７】
ウイルスまたは細菌を含んでもよい前記生物サンプルが、血液、血漿または血清であることを特徴とする、請求項２５に記載の混合物。
【請求項２８】
前記混合物のｐＨが、２〜６、好ましくは３〜４の範囲であることを特徴とする、請求項２７に記載の混合物。
【請求項２９】
ウイルスまたは細菌を含んでもよい前記生物サンプルが、吸引液、細胞、組織または細菌の形をとることを特徴とする、請求項２５に記載の混合物。
【請求項３０】
前記混合物のｐＨが、３〜１０、好ましくは４〜８の範囲であることを特徴とする、請求項２９に記載の混合物。
【請求項１】
一般式：
【化１】
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基および／またはＣ６〜Ｃ２０アリール基ならびにＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を示すことができ、
Ｘ−は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオン示すことができる）で示されるカチオン化合物と、少なくとも１種類のプロトン供与体と、を成分として含有する組成物。
【請求項２】
Ｙが窒素を示すことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１が、好ましくは炭素原子１２個、１４個、もしくは１６個を有する高級アルキル基を示し、かつＲ２、Ｒ３およびＲ４がいずれの場合も、メチル基を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
アニオンＸ−が、ハロゲン化水素酸のアニオンまたは一塩基もしくは二塩基有機酸のアニオンから選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記アニオンＸ−が、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩またはクエン酸塩を含む群のアニオンから選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記プロトン供与体が、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸または無機酸またはその塩の中から、単独でまたは組み合わせて選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸、好ましくは酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸（２−メチル−酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、またはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）または前述の酸の混合物が、前記脂肪族モノカルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸およびビニル酢酸または前述の酸の混合物が、脂肪族アルケニル−カルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸またはアジピン酸または前述の酸の混合物の中から選択されるジカルボン酸が、飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
脂肪族ジカルボン酸、好ましくはシュウ酸またはコハク酸または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
脂肪族ヒドロキシ−ジ−およびトリ−カルボン酸、好ましくはタルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）−またはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
不飽和ジカルボン酸、好ましくはマレイン酸および／またはフマル酸または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
不飽和トリカルボン酸、好ましくはアコニット酸、またはこれらの酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
脂肪族ケトジカルボン酸、好ましくはメソシュウ酸またはオキサロ酢酸、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
アミノ酸、好ましくはアミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸（イソロイシン）、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
それが水溶液中に存在することを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カチオン化合物が、０．０１重量％から飽和の範囲、好ましくは０．１重量％から飽和の範囲、最も好ましくは０．５〜１５重量％の範囲、特に最も好ましくは２〜１０重量％の範囲の濃度であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記の個々の成分が任意に、水溶液中で合わされ、かつ混合されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物のうちの１種類を調製する方法。
【請求項１９】
核酸を単離かつ／または安定化するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
核酸として、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が安定化されることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
核酸として、ヌクレオチドモノマー、オリゴマー、プラスミドの形で、ウイルスおよび／または細菌ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに動物および植物細胞または他の真核生物由来のゲノムおよび非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの形で、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が安定化されることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
核酸として、処理および未処理状態のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｃＤＮＡが安定化されることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含有する診断用組成物。
【請求項２４】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含む、核酸を安定化するためのキット。
【請求項２５】
任意に他の賦形剤と共に、核酸を含む生物サンプルと、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物とを含有する混合物。
【請求項２６】
前記混合物のｐＨが、２〜１２、好ましくは２〜１０の範囲、最も好ましくは３〜８の範囲であることを特徴とする、請求項２５に記載の混合物。
【請求項２７】
ウイルスまたは細菌を含んでもよい前記生物サンプルが、血液、血漿または血清であることを特徴とする、請求項２５に記載の混合物。
【請求項２８】
前記混合物のｐＨが、２〜６、好ましくは３〜４の範囲であることを特徴とする、請求項２７に記載の混合物。
【請求項２９】
ウイルスまたは細菌を含んでもよい前記生物サンプルが、吸引液、細胞、組織または細菌の形をとることを特徴とする、請求項２５に記載の混合物。
【請求項３０】
前記混合物のｐＨが、３〜１０、好ましくは４〜８の範囲であることを特徴とする、請求項２９に記載の混合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−１３５３１７（Ｐ２０１２−１３５３１７Ａ）
【公開日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−３８４８７（Ｐ２０１２−３８４８７）
【出願日】平成２４年２月２４日（２０１２．２．２４）
【分割の表示】特願２００２−５０５３４９（Ｐ２００２−５０５３４９）の分割
【原出願日】平成１３年５月２２日（２００１．５．２２）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−３８４８７（Ｐ２０１２−３８４８７）
【出願日】平成２４年２月２４日（２０１２．２．２４）
【分割の表示】特願２００２−５０５３４９（Ｐ２００２−５０５３４９）の分割
【原出願日】平成１３年５月２２日（２００１．５．２２）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
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