生物検査装置
【課題】本発明の課題は、検体に含まれる生物を測定するために該生物の染色、検体の濃縮、および含有生物の情報取得を簡単な工程で行い、安定した検体中の生物の測定を行い得る生物検査装置を提供することにある。
【解決手段】本発明に関わる生物検査装置は、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物５２ａ1、５２ａ2を染色する染色部２０、６２、８２と、染色が施された検体を流しつつ生物５２ａ1、５２ａ2の濃度を高めるように濃縮する濃縮部３０と、濃縮された検体中の生物５２ａ1、５２ａ2を含む個体５２の画像情報を取得する個体計測部５０と、個体計測部５０より出力された個体５２の画像情報より生物５２ａ1、５２ａ2の測定を行う制御手段９０とを備えている。
【解決手段】本発明に関わる生物検査装置は、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物５２ａ1、５２ａ2を染色する染色部２０、６２、８２と、染色が施された検体を流しつつ生物５２ａ1、５２ａ2の濃度を高めるように濃縮する濃縮部３０と、濃縮された検体中の生物５２ａ1、５２ａ2を含む個体５２の画像情報を取得する個体計測部５０と、個体計測部５０より出力された個体５２の画像情報より生物５２ａ1、５２ａ2の測定を行う制御手段９０とを備えている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラスト水中などに含まれる生物の計測を行う生物検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バラスト水とは、船舶が空荷の時に安全確保のための重しとして積載する海水であり、この海水は到着した港で排水されるものである。
近年、国際航路を運行する船舶のバラスト水の国際間の移動に伴い、バラスト水中に含まれる外来生物の移動が，従来の生態系の破壊や海洋汚染を引き起こすとして環境問題になっている。例えば、豪州では、有毒プランクトンによる養殖貝の毒化等が報告されている。
こうした問題に対処するため，２００４年２月に、ＩＭＯ (Ｉnternational Ｍaritime Ｏrganization；国際海事機関)において「船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約」(バラスト水管理条約)が採択された。同条約により、段階的にバラスト水を使用する全ての船舶は同条約のバラスト水排出基準を満たすことが義務付けられた。
【０００３】
バラスト水排出基準とは、１トンのバラスト水に含まれる最低形状寸法が５０μｍ以上の生細胞をもつ生物が１０匹以下であることである。
例えば、図８(ａ)に示すプランクトンＰ１の最低形状寸法(最低直径サイズ)とは、胴体部分の最低長さ寸法ｓ１を指し、図８(ｂ)に示す足をもつプランクトンＰ２の最低形状寸法(最低直径サイズ)とは、同様に、胴体部分の最低長さ寸法ｓ２を指すものである。なお、図８(ａ)、(ｂ)は、プランクトンの形状寸法を示した図である。
排出するバラスト水が基準を満たしていることを確認する方法であるが、現状では，バラスト水を適当な濃度に濃縮した後、顕微鏡による目視によりプランクトンの形状や生死を判断する手法が一般的である。この手法は高額な検査費用と長時間の検査時間を要する上、検査者の技量によって結果の信頼性が左右される問題があり、さらに、最低直径サイズが５０μｍ以上の生細胞をもつプランクトンについては、最低１ｍ３のバラスト水を検査する必要があることから実現性の薄い方法であった。
【０００４】
現在まで、液体中の微生物計測の迅速化および簡便化を目的としたさまざまな簡便迅速測定法を実施する計測装置が開発されている。その中でも特に、液体中の微生物を迅速に直接計測する手法として、尿中や血液中に含まれる細胞などの対象粒子の形状情報を取得するために使用されていたイメージングフローサイトメトリ法への注目が高い。
イメージングフローサイトメトリ法は、対象粒子を含む検査液体の流径を細くし、対象粒子を一個ずつ流し画像計測する粒子計測方法である。この方法を用いた微生物測定装置は、1分あたり数ミリリットルの検査液体中に含まれる微生物一個あたりの種別、形状、大きさなどの情報を取得することができる。
【非特許文献１】株式会社アムコ 科学機器部、ＦlowＣＡＭイメージング・フローサイトメータ、［online］、［平成１９年６月２０日検索］、インターネット<ＵＲＬ：http://www.amco.co.jp/kagaku/I_flowcam.htm>
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、上述のイメージングフローサイトメトリ法は、単位時間当たりの検査液量がもっとも多い粒子計測方法のひとつであるが、最低１ｍ３以上の検査液量が必要になるバラスト水中の微生物検査など、大量の液体中の含有生物検査に使用する場合、処理時間を短縮するために濃縮を検査の前に行うことが必須になることは自明である。濃縮の工程において、検査液体中の生物は物理的ダメージをうける可能性が高い。
画像計測を用いた検査工程において、体の部位に欠損が無いことが生物の生死の判断基準のひとつであるため、濃縮工程において生物が物理的ダメージを受けることは，生死に関しての情報の信頼性を低下させる。生物にダメージを与えない濃縮方法を採用するか、もしくは濃縮工程での物理的ダメージによる体の部位の欠損が生死の判断に影響しない方法を採用することが課題の解決に有効である。
【０００６】
例えば、生細胞のみを染色する染色剤にて生物を染色する工程を濃縮工程の前に行い、検査において染色の有無を生死の判断基準にすることが考えられる。この方法では、濃縮工程にて生物の体に欠損が生じても、染色の有無によって生死を判断することができる。
濃縮の前に、染色を行うことは生物の検査方法としては一般的に行われている手法であるが、本手法をバラスト水検査装置に適用するにあたり、 １ｍ３以上の検査液量が要求されるため、大量の液体を濃縮や検査を行うための時間が長くなることに由来する特殊な課題がある。
１ｍ３の処理済バラスト水を濃縮率１０００倍で濃縮し、１リットルまで液量を低減しても、続く検査工程における検査が完了する時間は、イメージングフローサイトメトリ法の処理液量が数ミリリットル／ｍｉｎであるため数時間におよぶ。そのため、バラスト水の一部は濃縮後、検査工程に移るまでに数時間の待機時間が必要になる。
【０００７】
一方、染色後に濃縮工程でダメージを受け死んだ生物は、生細胞が死細胞になり、生物の細胞中に選択的に取り込まれた色素は検査時間中に細胞膜上の細孔から細胞外へ拡散する。生物の染色に使用される色素の分子直径は０．数ｎｍ〜数ｎｍ程度であることから，色素の平均二乗変位は，数十μm/secとなるため，細胞の細孔の大きさや数によるが，次の工程に進むまでの待機時間中に，色素が細胞外へ拡散することにより、染色状態が劣化する可能性が高いため、生死に関しての情報を染色の有無で判断することが困難になる。
本発明は上記実状に鑑み、バラスト水中などの検体に含まれる生物を測定するために該生物の染色、検体の濃縮、および含有生物の情報取得を簡単な工程で行い、安定した検体中の生物の測定を行い得る生物検査装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく、本発明に関わる生物検査装置は、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、染色が施された検体を流しつつ生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、濃縮された検体中の生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、個体計測部より出力された個体の画像情報より生物の測定を行う制御手段とを備えている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、検体の液体中の生物の染色工程、液体中の生物の濃縮工程、液体中の生物の情報取得の工程等をフロー方式で行えるため、各方式をバッチ方式で行う手法と比べ、ひとつの工程を終えた検体の一部が次の工程に進むまでの待機時間を大幅に短縮、または０とでき、待機時間での染色の状態の劣化を防ぐことが可能で、安定した生物の生死の情報を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。
本発明を適用した実施形態の生物検査装置１は、プランクトン等の生物を含む１ｍ３以上の液体検体について、生細胞を持つ最低直径サイズ５０μｍ以上を有する生物の個数計測等を行う装置である。なお、生細胞を持つ生物の最低直径サイズとは、該生物の胴体部の最も短い寸法をいう。
以下、この生物検査装置１による生細胞をもつ生物の個数計測等の測定について詳細に説明する。
【００１１】
＜＜生物検査装置１の構成＞＞
図１は、本発明を適用した生物検査装置１の基本システム図である。
図１に示すように、生物検査装置１は、各工程での処理を行う主要部として、検体とこの検体中の生細胞を持つ生物を染色する染色液とを流しながら混合し染色を行うための流れ式染色装置２０と、検体を流しながら一定範囲の大きさをもつ生物を含む検体の濃縮を行うための流れ式濃縮装置３０と、検体を流しながら一定範囲の大きさ以外の生物を除去するための流れ式精製手段４０と、検体を流しながら検体中の粒子の画像情報を取得するための流れ式粒子計測手段５０とを具備している。
この生物検査装置１における各工程での処理は、待ち時間がなく進行するフロー処理で行われ、検体用水槽８１に貯留される計測対象の検体は、検体用水槽８１から矢印ａ１、ａ２、ａ３、ａ４に示すように、流れ式染色装置２０、流れ式濃縮装置３０、流れ式精製手段４０、流れ式粒子計測手段５０の順に流動し、所定の測定が行われる。
【００１２】
上述の処理前の染色液等の生物検査装置１で使用する液体を貯留するための水槽として、生物検査装置１は、検査前の検体を貯留するための検体用水槽８１と、流れ式染色装置２０で使用する染色液を貯めるための染色液用水槽８２と、流れ式精製手段４０にて精製に使用される精製液体を貯留するための精製液体用水槽８３とを備えている。
一方、処理後に廃棄される液体を貯留するための廃棄水槽として、流れ式濃縮装置３０にて廃棄される液体を貯留するための濃縮後廃棄水槽８６と、流れ式精製手段４０にて除去された生物を含む粒子を含有する液体を貯留するための精製後廃棄水槽８７と、流れ式粒子計測手段５０による粒子計測が終了した検体の廃液を貯留するための計測後廃棄水槽８８とを備えている。
【００１３】
また、検体、染色液、精製液体などの送液をそれぞれ連続的に行うための連続供給手段として、生物検査装置１は、検体用水槽８１から流れ式染色装置２０へ検体を連続的に供給する検体連続供給手段６１と、染色液用水槽８２から流れ式染色装置２０へ染色液を連続的に供給する染色液連続供給手段６２と、精製液体用水槽８３から流れ式精製手段４０へ精製液体を連続的に供給する精製液体連続供給手段６３とを具えている。なお、連続供給手段６１、６２、６３として、本実施形態ではポンプを用いているが、送液を行えるものであれば、ポンプ以外の機械を用いてもよい。
また、検体や染色液などの送液の流量を制御するためのバルブとして、生物検査装置１は、図１に示すように、流れ式濃縮装置３０と流れ式精製手段４０を連結する管の通過液量を制御するための濃縮装置−精製手段間バルブ７１と、流れ式濃縮装置３０と濃縮後廃棄水槽８６を連結する管の通過液量を制御するための濃縮装置−濃縮廃棄水槽間バルブ７２と、流れ式精製手段４０と流れ式粒子計測手段５０を連結する管の通過液量を制御するための精製手段−粒子計測手段間バルブ７３と、流れ式精製手段４０と精製後廃棄水槽８７を連結する管の通過液量を制御するための精製手段−精製廃棄水槽間バルブ７４とを有している。
【００１４】
前記した構成の生物検査装置１は、制御手段として制御装置９０を有しており、該制御装置９０は、各装置２０、３０および手段４０、５０、連続供給手段６１、６２、６３、およびバルブ７１、７２、７３、７４に制御信号等を出力し制御するとともに、流れ式粒子計測手段５０により得られた粒子情報の解析を行っている。また、この制御装置９０の解析結果を出力するために、液晶ディスプレイ、プリンタ等の出力装置９１を備えている。
なお、生物検査装置１は、濃縮後廃棄水槽８６および精製後廃棄水槽８７に廃棄された廃液から使用済みの染色液を精製し再利用する染色液精製部８９を有しており、逆浸透膜（ＲＯ膜(Ｒeverse Ｏsmosis Ｍembrane)）により廃液中に溶け込んだ染色液を精製後、染色液用水槽８２に戻し、再利用している。
なお、染色液精製部８９は、濃縮後廃棄水槽８６に廃棄された廃液から使用済みの染色液を精製し再利用する第１の染色液精製部と、精製後廃棄水槽８７に廃棄された廃液から使用済みの染色液を精製し再利用する第２の染色液精製部とに分けて構成することも可能である。
【００１５】
＜＜生物検査装置１の各工程での処理＞＞
次に、生物検査装置１の各工程での処理について説明する。
図２(ａ)は、流れ式染色装置２０の内部構造を示す平面概念図であり、図２(ｂ)は、図２(ａ)の流れ式染色装置２０のＡ−Ａ線断面図である。
図１に示すように、計測対象の検体用水槽８１に貯留される検体は、検体用水槽８１から検体連続供給手段６１を用いて、矢印ａ１のように、流れ式染色装置２０へ流され、図２に示すように、検体流入口２２より、矢印ａ20のように染色槽２６内に流入する。
一方、生細胞をもつ生物を染色するための染色液は、図１に示す染色液用水槽８２から、染色液連続供給手段６２を用いて流れ式染色装置２０に供給され、図２(ｂ)に示す染色液流入口２３より、矢印ａ21のように流れ式染色装置２０内に流入する。
【００１６】
図２(ｂ)に示すように、染色液流入口２３より流れ式染色装置２０内に流入した染色液は、複数の染色液噴出し口２１、２１、…を矢印ａ22のように染色槽２６内に通流し、染色槽２６内の検体と混合する。こうして、検体と染色液とが、染色槽２６内で混合した後、図２(ａ)に示すように、混合流路管２４を矢印ａ23のように流れる間に、検体中の生細胞をもつ生物は染色液により染色される。
この検体中の生細胞をもつ生物の染色時間は、油圧シリンダ等の混合流路管駆動装置２５により、混合流路管２４の一部を移動し混合流路管２４の全長を変更し、隣接する下流の流れ式濃縮装置３０(図１参照)までの流動時間を変更することにより、適宜調整することが可能である。
ここで、混合流路管駆動装置２５は、例示した油圧シリンダ以外にモータの駆動力を減速機構を用いて混合流路管２４を移動する機構でもよく、混合流路管２４の一部を移動し、その全長を変更できる機構であれば、種々の機構を採用し得ることは言うまでもない。
【００１７】
本実施形態では、検体と染色液の混合比を、検体１０００リットルに対して染色液５ｇ、言い換えれば、染色液１ｇを検体２００，０００ミリリットルに混ぜ、混合時間を５分としているが、この混合時間は、検体の状態に応じて制御装置９０により自動的に決定し制御される。例えば、測定対象の検体中に既知の生細胞をもつ生物を入れて流し、その染色度合いを流れ式粒子計測手段５０の画像情報から得て、混合時間を制御装置９０により自動的に決定し制御してもよい。
ここで、染色液としては、ニュートラルレッドやメチルブルーなどの生細胞に選択的に取り込まれる色素、すなわち生細胞のみを染色する色素を使用する。
【００１８】
上述の如く、図２(ａ)の矢印ａ23のように、混合流路管２４を通過して、染色が行われた流れ式染色装置２０内の染色された検体を含む二液の混合液は、図１の矢印ａ２に示すように、下流に続く流れ式濃縮装置３０へ流入する。
図３は、流れ式濃縮装置３０の内部構造を示す断面概念図である。
図３に示すように、流れ式染色装置２０で染色された検体は、流れ式濃縮装置流入口３１より、矢印ａ30のように流れ式濃縮装置３０内に流入し，濃縮装置−精製手段間バルブ７１(図１参照)と流れ式濃縮装置−濃縮後廃棄水槽間バルブ７２(図１参照)の通過液量の比に従って分流され、濃縮液流出口３４と濾過液流出口３５とに分かれ流出する。
【００１９】
流れ式濃縮装置流入口３１と濾過液流出口３５の間には、孔径５０μｍのフィルタ３２が設けられ、流れ式濃縮装置３０内に流入した５０μｍより大きい寸法をもつ粒子は、フィルタ３２に阻まれ、矢印ａ31のように濃縮液流出口３４に流動する一方、流れ式濃縮装置３０内に流入した５０μｍより小さい寸法をもつ粒子は、矢印ａ32のようにフィルタ３２を通過して濾過液流出口３５に流動する。
流れ式濃縮装置３０における検体の濃縮率は、濃縮装置−精製手段間バルブ７１と濃縮装置−濃縮廃棄水槽間バルブ７２の通過水量の比で決定する。
【００２０】
なお、本実施形態では，濃縮率を１０００倍に設定するが、検体の状態により、制御装置９０によりフィードバックがかけられ、最適な濃縮率に自動的に決定される。何故なら、検体であるバラスト水の状態で染色度合いが変わるので、例えば、染まり過ぎると死んでいる生物までも染めてしまうので、このようなフィードバックが行われる。なお、このフィードバックは、流れ式粒子計測手段５０により画像情報を取得し、該画像情報から制御装置９０により染色度合いを判断して行なうことができる。
ここで、濃縮率を１０００倍に設定するためには、例えば、濃縮装置−精製手段間バルブ７１(図１参照)と流れ式濃縮装置−濃縮後廃棄水槽間バルブ７２(図１参照)の通過液量の比を、１：１０とした図３に示す流れ式濃縮装置３０を１０段階設けることにより、実現できる。
【００２１】
また、本実施形態では孔径５０μｍのフィルタ３２を備えた流れ式濃縮装置３０を利用しているが、孔径が異なる流れ式濃縮装置を生物検査装置１に並列に複数設け、検体の状態に応じ切り替える構成を採用してもよい。
図３に示すように、流れ式濃縮装置３０内を流れる粒子の一部は、フィルタ３２上に吸着するが、フィルタ３２のろ過面の方向に生じている矢印ａ31で示す流れ、すなわちフィルタ３２のろ過面の方向に沿った流れがフィルタ３２上に吸着した粒子をはがす効果があるため、粒子のフィルタ３２への吸着による粒子数の減少を抑えることができる。
ここで、検体の流れ式濃縮装置３０への流入量が減少した場合、フィルタ３２のろ過面方向(矢印ａ31方向)の流速が弱まり，フィルタ３２上に吸着した粒子をはがす力が弱まる。
しかし、油圧シリンダ等の可変壁駆動装置３７により、矢印ａ39のように容量可変壁３６を動かし、流れ式濃縮装置３０の容量を減少させることにより、検体の流速を一定に保つことが可能である。
【００２２】
なお、可変壁駆動装置３７は、例示した油圧シリンダ以外にモータの駆動力を減速機構を用いて容量可変壁３６を移動する機構でもよく、容量可変壁３６を移動し、流れ式濃縮装置３０の容量を変更できる機構であれば、種々の機構を採用し得ることは勿論である。
一方、流れ式濃縮装置３０におけるフィルタ３２によるろ過後の図３の矢印ａ32に示す濾液は、濃縮装置−濃縮廃棄水槽間バルブ７２を介して、濃縮後廃棄水槽８６(図１参照)に廃棄される。
続いて、図１に示すように、流れ式濃縮装置３０を通過した５０μｍより大きい寸法をもつ粒子を含む検体が、矢印ａ3のように、濃縮装置−精製手段間バルブ７１を介して、流れ式精製手段４０に流入する。この流れ式精製手段４０は、流れ式濃縮装置３０と同様の構造を有している(図３参照)。
【００２３】
この流れ式精製手段４０において、流れ式濃縮装置３０を通過した５０μｍより大きい寸法をもつ粒子を含む検体に、精製液体用水槽８３から粒子を含まない精製液体を供給し全粒子の濃度を、一旦低下させ、再度、フィルタで余分なゴミ、粒子等を除き濃縮を行うことで相対的に上記フィルタ３２の孔径より大きい粒子の割合を増加させる。すなわち、検体中の５０μｍより大きい寸法をもつ粒子の純度を高め、検体の精製を行う。
一方、流れ式精製手段４０におけるフィルタによりろ過された濾液は、図１に示すように、精製手段−精製廃棄水槽間バルブ７４を介して、精製後廃棄水槽８７に廃棄される。
こうして、流れ式精製手段４０において精製された検体は、図１の矢印ａ4に示すように、流れ式精製手段４０から流出し、精製手段−粒子計測手段間バルブ７３を介して、流れ式粒子計測手段５０内に流入する。
【００２４】
図４は、流れ式粒子計測手段５０の構成を示した断面概念図である。
図４に示すように、流れ式粒子計測手段５０は、検体中の粒子に当てるレーザ光５４を出力するレーザ装置５３と、検体中の粒子に当ったレーザ光５４を受光する散乱光受光装置５５と、撮影範囲５６に流れた該粒子を撮影する撮影装置５７とを有している。
図１に示す流れ式精製手段４０を通過した検体は、図４の矢印ａ4に示すように、流れ式粒子計測手段５０に流入し、計測流路５１を矢印ａ50のように流動し、この流動する間に検体に対する計測が、下記のように行われる。
まず、レーザ装置５３と散乱光受光装置５５とを用いて、粒子５２が撮影範囲５６へ流入することを、予め検知する。すなわち、粒子５２がレーザ装置５３から出力されるレーザ光５４を横切るときに粒子５２から発生する散乱光を散乱光受光装置５５が検知し、粒子５２の通過を検知する。
【００２５】
ここで、レーザ光５４の位置から撮影範囲５６(図４中に破線で示す)まで流動する時間ｔは、検体の流速により決まるので、流速より求めた時間ｔ後に撮影範囲５６の画像を取得することにより、撮影範囲５６に入った粒子５２の画像情報を撮影装置５７により撮影し取得できる。なお、粒子５２の通過を検知する方法は、コールターカウンタのような電気的手法であってもよい。
ここで、粒子５２がレーザ光５４を通過する時間は，粒子５２全体がレーザ光５４を通過することから粒子５２の大きさに比例するため、通過時間に応じ撮影範囲の大きさを調整するオートズーム機構を、撮影装置５７は備えている。
なお、粒子５２が長形のものである場合、粒子５２は検体の流れにより力を受けるため、流れに沿う態様、すなわち、流れ方向と粒子５２の長手方向が同方向を向いて流れることになる。
【００２６】
そのため、検体中の粒子５２がレーザ光５４を通過する情報を含む信号を散乱光受光装置５５から制御装置９０(図１参照)が入力し、該制御装置９０において、粒子５２がレーザ光５４を通過する時間情報から粒子５２の最大長を解析することができる。
そして、制御装置９０により、粒子５２の通過時間、すなわち粒子５２の最大長に応じて、撮影装置５７における撮影範囲５６の大きさ、すなわち視野の大きさを自動的に調整するオートズーム機構を稼動制御することにより、測定対象に応じた撮影が可能となっている。
こうして、粒子５２の通過を検知した時刻から撮影範囲５６に流入する算出した時間ｔ後、計測流路５１を流れる検体中の粒子５２が撮影範囲５６に流入した際に撮影装置５７によって撮影を行い、粒子５２の画像情報を取得する。
続いて、取得した画像情報は、撮影装置５７から画像情報信号として制御装置９０に出力され、この制御装置９０にて取得された画像情報から、染色の有無によって粒子５２の一つである生物の生死、該生物のサイズ等が測定される。
【００２７】
図５は、粒子５２の一つである生物のプランクトン５２ａ1、５２ａ2、５２ａ3の生死判定を行うための判定データを示した図である。
例えば、画像情報における粒子の一つであるプランクトンが、図５(ａ)に示す染色(胴体部の点で示す)されたプランクトン５２ａ1に該当する場合、または図５(ｂ)に示す染色(胴体部の点で示す)されたプランクトン５２ａ2に該当する場合には、生と判定される。一方、図５(ｃ)に示す染色されない(胴体部の点無し)プランクトン５２ａ3に該当する場合には、死と判定される。
なお、図５(ｂ)に示すプランクトン５２ａ2の二点鎖線で示す足５２ａ21の欠損は、流れ式濃縮装置３０または流れ式精製手段４０における濃縮時に起きたものである。
【００２８】
＜＜測定を終了するときの制御方法＞＞
次に、生物検査装置１において、測定を終了するときの制御装置９０による(図１参照)制御方法を、図６を用いて説明する。なお、図６は、測定を終了するときの制御装置９０の制御方法を示す流れ図である。
まず、図６のＳ１において、総処理液量ＶN、例えばバラスト水の総処理液量を表す変数ＶNに０を設定し、また、生細胞をもつとともに特定範囲の大きさの粒子５２の数を表す変数ｎNに０を設定する。なお、特定範囲とは、最低直径サイズ５０μｍ以上の生物をいうが、この特定範囲は任意に定め得ることは勿論である。
同時に、制御装置９０において、単位時間当たりの連続供給手段６１の供給液量に基づいて総処理液量ＶNを算出する総処理液量ＶNの計測を開始する。
なお、総処理液量ＶNの計測は、検体用水槽８１と連続供給手段６１間の配管に流量センサ(図示せず)を設け、この流量センサにより総処理液量ＶN、例えばバラスト水の総処理液量の計測を開始してもよい。
【００２９】
続いて、図６のＳ２において、図４に示すように、流れ式粒子計測手段５０を用いて検体中の粒子５２の画像情報を取得する。
続いて、図６のＳ３において、流れ式粒子計測手段５０からの粒子５２の画像情報に基づいて、制御装置９０において、粒子５２の一つである生物の生死が判定される。なお、粒子５２の一つである生物の生死の判定は、例えば、前記の図５に図示した方法によって判定される。
続いて、図６のＳ４において、取得した画像情報の粒子の一つである生物が生きているか否か、すなわち、該生物が生細胞を持っているか否かが判断される。
取得した画像情報の粒子５２の一つである生物が生きていない、すなわち、該生物が生細胞を持っていない場合(図６のＳ４においてＮo)、該生物の測定は停止され、図６のＳ２に移行する。
【００３０】
取得した画像情報の粒子５２の一つである生物が生きている、すなわち、該生物が生細胞を持っている場合(図６のＳ４においてＹes)、図６のＳ５において、流れ式粒子計測手段５０からの粒子５２の画像情報に基づいて、制御装置９０において、粒子５２の一つである生物の最低直径サイズが計測される。
なお、粒子５２の一つである生物の最低直径サイズとは、該生物の外形状の胴体部分の最も短い長さの部分の長さ寸法をいう。
例えば、図５(ａ)に示すプランクトン５２ａ１の最低直径サイズとは、プランクトン５２ａ１の外形状の胴体部分ｄ１の最も短い長さの部分の長さ寸法をいい、また、図５(ｂ)に示すプランクトン５２ａ2の最低直径サイズとは、プランクトン５２ａ2の外形状の胴体部分ｄ１の最も短い長さの部分の長さ寸法をいう。
【００３１】
ここで、図５(ａ)に示す胴体部分ｄ1の最も短い長さの部分の長さ寸法とは、胴体部分ｄ1の図５(ａ)の紙面に垂直な方向の寸法等の場合がある。同様に、図５(ｂ)に示す胴体部分ｄ2の最も短い長さの部分の長さ寸法とは、胴体部分ｄ2の図５(ｂ)の紙面に垂直な方向の寸法等の場合がある。
図８(ａ)に示すプランクトンＰ１の最低直径サイズとは、胴体部分の最も短い長さの部分の最低長さ寸法ｓ１を指し、図８(ｂ)に示す足をもつプランクトンＰ２の最低直径サイズとは、胴体部分の最も短い長さの部分の最低長さ寸法ｓ２を指すものである。
続いて、図６のＳ６において、粒子５２のうちの生きた生物の最低直径サイズが５０μｍ以上か否か判断される。
【００３２】
粒子５２のうちの生きた生物の最低直径サイズが５０μｍ未満の場合(図６のＳ６においてＮo)、該生物の測定は停止され、図６のＳ２に移行する。
一方、粒子５２のうちの生きた生物の最低直径サイズが５０μｍ以上の場合(図６のＳ６においてＹes)、図６のＳ７において、生細胞をもつとともに特定範囲の大きさの粒子の数ｎN＝ｎN＋１の演算を行い、生細胞をもつとともに特定範囲の大きさの粒子の数ｎNをカウントする。
【００３３】
続いて、図６のＳ２に移行し、図６のＳ２からＳ７までの処理を繰り返す。
同時に、図６のＳ８において、ｎNが規定数以上か、または、それまでの総処理液量ＶNが規定液量以上か判断される。なお、規定数は、例えば、１０個の場合であり、総処理液量ＶNは、例えば、１トンのバラスト水の場合である。
ｎNが規定数未満であり、かつ、それまでの総処理液量ＶNが規定液量未満の場合(図６のＳ８でＮo)、図６のＳ２に移行し測定が続行され、Ｓ２〜Ｓ７を経て図６のＳ８の判断が繰り返される。
一方、ｎNが規定数以上か、または、それまでの総処理液量ＶNが規定液量以上の場合(図６のＳ８でＹes)、図６のＳ９において、制御装置９０は検査終了と判断し、検体連続供給手段６１、染色液連続供給手段６２等に停止指示を送信し測定を終了する。
また、図６のＳ２に移行し測定が続行され図６のＳ８の判断が繰り返された場合も、図６のＳ８でＹesと判断された場合、図６のＳ９に移行し、制御装置９０は検査終了と判断し、検体連続供給手段６１、染色液連続供給手段６２等に停止指示を送信し測定を終了する。
【００３４】
＜＜濃縮率の制御方法＞＞
次に、生物検査装置１における制御装置９０による濃縮率の制御方法について、図７を用いて説明する。なお、図７は、濃縮率の制御方法の制御フロー示す図である。
まず、図７のＳ１において、Ｎ番目の粒子５２をカウントする変数、すなわち画像情報の取得回数を表す変数Ｉに０を設定する。なお、Ｎとはヒストグラム(度数分布図)を作成するための任意の正の整数であって、任意に設定可能である。
続いて、図７のＳ２において、流れ式粒子計測手段５０が粒子５２の画像情報を取得し、かつ、画像情報の取得の度に画像情報の取得回数ＩをカウントするＩ＝Ｉ＋１の演算を行う。なお、粒子５２の取得した画像情報から、粒子５２の大きさ等で選別して上記演算を行ってもよい。
【００３５】
続いて、図７のＳ３において、流れ式粒子計測手段５０がＮ番目以上の粒子５２を計測したか否か、判断される。
流れ式粒子計測手段５０が計測した粒子５２がＮ番目未満の場合(図７のＳ３でＮo)、図７のＳ２に移行する。
一方、流れ式粒子計測手段５０が計測した粒子５２がＮ番目に達した場合(図７のＳ３でＹes)、図７のＳ４において、Ｎ−ａ番目の粒子５２からＮ番目の粒子５２を計測するまでの通過液量ｖと各粒子５２の最低直径サイズの情報から単位液量あたりの粒子５２の最低直径サイズのヒストグラム(度数分布図)を求める。なお、ａは、Ｎより小さい正の整数であってＮ−aで表される度数が有効なヒストグラムを作成できるような任意の正の整数である。また、粒子５２の最低直径サイズとは、前述したように、粒子５２の外形状の胴部分の最も短い長さの部分の長さ寸法である。
【００３６】
ここで、通過液量ｖは、流れ式粒子計測手段５０の直前に流量センサ(図示せず)を設けて測定してもよいし、或いは、制御装置９０において、単位時間当たりの連続供給手段６１、６２、６３の供給液量とバルブ７２、７３、７４の通過液量とを用いて算出してもよい。
続いて、図７のＳ５において、求めたヒストグラムから、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子５２の濃度ＣＲと特定範囲外の最低直径サイズをもつ粒子５２の濃度Ｃｒを算出する。なお、特定範囲とは、本実施形態の場合、最低直径サイズ５０μｍ以上としているが、この特定範囲が任意に定め得ることは言うまでもない。
続いて、図７のＳ２に移行し、Ｓ２からＳ５の処理が繰り返される。
同時に、図７のＳ６において、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下か否か判断される。
【００３７】
特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度未満または最高規定濃度を超える場合、すなわち、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが所定の測定条件範囲内から外れた場合には(図７のＳ６でＮo)、図７のＳ７において、制御装置９０(図１参照)は、ＣＲを所定の範囲内にするために、連続供給手段６１、６２、６３(図１参照)に供給液量の指示を出し、バルブ７１、７２、７３、７４(図１参照)に通過液量の指示を出し、また、流れ式濃縮装置３０(図１、図３参照)に濃縮率の変更指示を出すとともに、流れ式精製手段４０に精製率の変更指示を出す。
例えば、粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度未満の場合には、連続供給手段６１、６２、６３に供給液量の増量の指示を出し、また、バルブ７１、７２、７３、７４に通過液量の増量の指示を出し、また、図３に示す流れ式濃縮装置３０において可変壁駆動装置３７によって濃縮装置室３９の容量を小さくする、また、流れ式精製手段４０において精製率を上げる等して濃縮率を上げる調整を行う。
【００３８】
逆に、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最高規定濃度を超える場合には、連続供給手段６１、６２、６３に供給液量の減量の指示を出し、また、バルブ７１、７２、７３、７４に通過水量の減量の指示を出し、また、図３に示す流れ式濃縮装置３０において可変壁駆動装置３７によって濃縮装置室３９の容量を大きくする、また、流れ式精製手段４０において精製率を下げる等して濃縮率を下げる調整を行う。
続いて、この図７のＳ７の処理を行った後、図７のＳ６に移行する。
一方、図７のＳ６において、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下の場合、すなわち、ＣＲが所定の測定条件の範囲内の場合は(図７のＳ６でＹes)、図７のＳ８に移行し、特定範囲外の最低直径サイズをもつ粒子の濃度Ｃｒが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下か否か判断される。
なお、特定範囲とは、本実施形態の場合、前記したように、最低直径サイズ５０μｍ以上としている。
【００３９】
特定範囲外の最低直径サイズをもつ粒子の濃度Ｃｒが最低規定濃度未満または最高規定濃度を超える場合、すなわち、Ｃｒが所定の測定条件の範囲内から外れたときには(図７のＳ８でＮo)、図７のＳ９に移行し、制御装置９０(図１参照)は、Ｃｒを所定の範囲内にするために連続供給手段６１、６２、６３(図１参照)に供給液量の指示を出し、また、バルブ７１、７２、７３、７４(図１参照)に通過液量の指示を出し、また、流れ式精製手段４０(図１、図３参照)に精製率の変更指示を出し、また、流れ式精製手段４０に精製率の変更指示を出す。そして、図７のＳ８に移行し、Ｓ８の判断を繰り返す。
一方、図７のＳ８において、特定範囲外の最低直径サイズをもつ微粒子の濃度Ｃｒが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下の場合、すなわち、Ｃｒが所定の測定条件の範囲内の場合には(図７のＳ８でＹes)、図７のＳ１０に移行し、測定を続行する。
【００４０】
以上が、生物検査装置１における濃縮率の制御方法である。
前記構成によれば、液体検体中の生物を含む生物の染色工程，濃縮工程，生物の情報取得の各工程を自動化したため，検査者の作業負担が軽減され、測定結果への検査者の技量の影響を小さくすることができ、また、安定した測定結果を得ることが可能である。
さらに、各工程をフロー方式で一貫して行うため，各方式をバッチ方式で行う従来の手法と比べ，ひとつの工程を終えたバラスト水の一部が次の工程に進むまでの待機時間を０(ゼロ)、すなわち無くすことができる。そのため、待ち時間での染色された生物の染色の劣化を防ぐことができ、安定した生死の情報を取得可能である。
【００４１】
なお、本実施形態では、検体中に含まれる粒子として、生物のプランクトン、非生物の物等を例示して説明を行ったが、特許請求の範囲に記載した個体に相当するものとして、検体中に含まれる粒子以外の更に大きなサイズの個体である生物、非生物等の物体を広く含み適用されるものである。例えば、この生物としては、例示したプランクトン以外に、カニの幼虫、ちりめんじゃこなどの魚類、タコなどの水生の軟体動物等の大きなサイズの生物が広く含まれ、プランクトンに限定されるものではない。
なお、本実施形態では、流れ式精製手段４０を設ける場合を例示して説明したが、流れ式精製手段４０は、測定対象の生物の濃度を高めるためのものであるから、流れ式精製手段４０を設けず構成してもよい。
【００４２】
また、測定対象が大きなもの、例えば、カニの幼虫を対象に測定する場合には、流れ式濃縮装置３０のフィルタ３２の目および流れ式精製手段４０のフィルタの目を大きくするとともに、前記したように、撮影装置５７のオートズーム機構を用いてレンズの視野範囲を拡大して撮影が可能である。
なお、撮影装置５７におけるオートズーム機構に代えて、視野範囲の異なるレンズを複数設け、測定対象の大きさに応じて、適切なレンズに切り替える構成とすることもでき、また、撮影装置５７において、視野範囲の異なる複数のレンズとオートズーム機構を組み合わせて構成し、よりフレキシブルな撮影装置とすることも可能である。
また、本実施形態では、生物の測定として、生物の最低直径サイズの計測および生物の生死の判定を行う場合を例示して説明を行ったが、これ以外の生物のサイズの計測等、生物の最低直径サイズおよび生物の生死の判定以外の測定を行うことも可能である。
【００４３】
＜＜種々の実施形態＞＞
ところで、以下の構成が可能である。
第１の生物検査装置は、少なくとも、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、染色が施された検体を流しつつ生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、濃縮された検体中の生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、個体計測部より出力された個体の画像情報より生物の測定を行う制御手段とを備えている。
第１の生物検査装置の構成によれば、生細胞を持つ生物を死滅させることなく、フロー処理で該生物の測定が行え、待ち時間での染色の劣化を防ぎ、安定した生物の幅広い測定を行える。
【００４４】
第２の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、上記生物の測定は、生物の形状の計測と生物の染色状態の有無からの該生物の生死の判定とできる。
第２の生物検査装置の構成によれば、バラスト水の国際条約に適合するかの測定等が可能である。
【００４５】
第３の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、濃縮部と個体計測部間に濃縮部から送られた検体を流しつつ生物を含まない精製液体を供給した後に濃縮を行い生物の濃度を更に高める精製部を備えている。
第３の生物検査装置の構成によれば、精製部を備えるので、測定対象の生物の濃度を高めることが可能である。
【００４６】
第４の生物検査装置は、第１の構成において、染色部、濃縮部、個体計測部の順番に検体を搬送する検体搬送手段と、該検体搬送手段による検体の搬送およびその停止を制御する搬送制御手段とを、備えている。
第４の生物検査装置の構成によれば、検体の搬送および搬送の停止が適宜可能である。
【００４７】
第５の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、濃縮部から精製部への検体の流量を制御する濃縮部−精製部間流量制御手段と、該濃縮部−精製部間流量制御手段を制御する第１流量制御手段とを備えている。
第５の生物検査装置の構成によれば、濃縮部から精製部への流量の制御を行える。
【００４８】
第６の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、精製部から個体計測部への流量を制御する精製部−個体計測部間流量制御手段と、該精製部−個体計測部間流量制御手段を制御する第２流量制御手段とを備えている。
第６の生物検査装置の構成によれば、精製部から個体計測部への流量の制御を行える。
【００４９】
第７の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、濃縮部は、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物を濃縮する。
第７の生物検査装置の構成によれば、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物を濃縮して、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物の測定を行える。
【００５０】
第８の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、精製部は、最大直径サイズが５０μｍ未満の生物を取り除いている。
第８の生物検査装置の構成によれば、精製部は、最大直径サイズが５０μｍ未満の生物を取り除き、最大直径サイズが５０μｍ以上の生物の濃度を高めることが可能である。
【００５１】
第９の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、検体の量は、１ｍ３以上としている。
第９の生物検査装置の構成によれば、例えば、１トン以上のバラスト水を１０００倍に濃縮して、検体の量を１ｍ３以上として生物の測定を行える。
【００５２】
第１０の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、制御手段が、生細胞をもつ最低直径サイズ５０μｍ以上の生物の数を計測し、流動量取得手段により取得した検体の流動量が１ｍ３に達するまでに１０個計測した場合、測定を終了している。
第１０の生物検査装置の構成によれば、１トンの検体、例えば、バラスト水を１０００倍に濃縮して、１トンの検体中に生細胞をもつ最低直径サイズ５０μｍ以上の生物が１０個いるか否か、測定できる。
【００５３】
第１１の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、制御手段は、流動量取得手段で取得した単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から濃縮部の濃縮率を決定している。
第１１の生物検査装置の構成によれば、検体の単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から濃縮部の濃縮率を決定するので、検体の単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数に応じて濃縮率を決定し、生物の測定を行える。
【００５４】
第１２の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、制御手段は、流動量取得手段で取得した単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から精製部の精製率を決定している。
第１２の生物検査装置の構成によれば、流動量取得手段で取得した単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から前記精製部の精製率を決定するので、検体の単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数に応じて、検体の濃度を高め、測定を行える。
【００５５】
第１３の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、濃縮部より廃棄された液体中から染色部より検体に供給された染色液を回収する第１染色液精製部を備えている。
第１３の生物検査装置の構成によれば、第１染色液精製部によって濃縮部より廃棄された液体中の染色液を回収するので、染色液を有効に利用することができる。
【００５６】
第１４の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、精製部より廃棄された液体中から染色部より検体に供給された染色液を回収する第２染色液精製部を備えている。
第１４の生物検査装置の構成によれば、第２染色液精製部によって精製部より廃棄された液体中の染色液を回収するので、染色液を有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明に関わる実施形態の生物検査装置の基本システムを示す図である。
【図２】(ａ)および(ｂ)は、生物検査装置における流れ式染色装置の内部構造を示す平面概念図、および(ａ)図の流れ式染色装置のＡ−Ａ線断面図である。
【図３】生物検査装置における流れ式濃縮装置の内部構造を示す断面概念図である。
【図４】生物検査装置における流れ式粒子計測手段の構成を示した断面概念図である。
【図５】(ａ)、(ｂ)、および(ｃ)は、粒子の一つであるプランクトンの生死判定を行うための判定データを示した図である。
【図６】生物検査装置による測定を終了するときの制御装置の制御方法を示す流れ図である。
【図７】生物検査装置における濃縮率の制御方法を表す流れ図である。
【図８】(ａ)および(ｂ)は、プランクトンの形状寸法を示した図である。
【符号の説明】
【００５８】
１…生物検査装置、
２０…流れ式染色装置(染色部)、
３０…流れ式濃縮装置(濃縮部)、
４０…流れ式精製手段(精製部)、
５０…流れ式粒子計測手段(粒子計測部)、
５２…粒子(個体)、
５２ａ1、５２ａ2…プランクトン(生物)、
６１…検体連続供給手段(検体搬送手段)、
６２…連続供給手段 (染色部)、
６３…連続供給手段 (精製部)、
７１…濃縮装置−精製手段間バルブ(検体搬送手段、濃縮部−精製部間流量制御手段)、
７３…精製手段−粒子計測手段間バルブ(検体搬送手段、精製部−粒子計測部間流量制御手段)、
８２…染色液用水槽 (染色部)、
８３…精製液体用水槽 (精製部)、
８９…染色液精製部(第１染色液精製部、第２染色液精製部)、
９０…制御装置(制御手段、搬送制御手段、第１流量制御手段、第２流量制御手段)、
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラスト水中などに含まれる生物の計測を行う生物検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バラスト水とは、船舶が空荷の時に安全確保のための重しとして積載する海水であり、この海水は到着した港で排水されるものである。
近年、国際航路を運行する船舶のバラスト水の国際間の移動に伴い、バラスト水中に含まれる外来生物の移動が，従来の生態系の破壊や海洋汚染を引き起こすとして環境問題になっている。例えば、豪州では、有毒プランクトンによる養殖貝の毒化等が報告されている。
こうした問題に対処するため，２００４年２月に、ＩＭＯ (Ｉnternational Ｍaritime Ｏrganization；国際海事機関)において「船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約」(バラスト水管理条約)が採択された。同条約により、段階的にバラスト水を使用する全ての船舶は同条約のバラスト水排出基準を満たすことが義務付けられた。
【０００３】
バラスト水排出基準とは、１トンのバラスト水に含まれる最低形状寸法が５０μｍ以上の生細胞をもつ生物が１０匹以下であることである。
例えば、図８(ａ)に示すプランクトンＰ１の最低形状寸法(最低直径サイズ)とは、胴体部分の最低長さ寸法ｓ１を指し、図８(ｂ)に示す足をもつプランクトンＰ２の最低形状寸法(最低直径サイズ)とは、同様に、胴体部分の最低長さ寸法ｓ２を指すものである。なお、図８(ａ)、(ｂ)は、プランクトンの形状寸法を示した図である。
排出するバラスト水が基準を満たしていることを確認する方法であるが、現状では，バラスト水を適当な濃度に濃縮した後、顕微鏡による目視によりプランクトンの形状や生死を判断する手法が一般的である。この手法は高額な検査費用と長時間の検査時間を要する上、検査者の技量によって結果の信頼性が左右される問題があり、さらに、最低直径サイズが５０μｍ以上の生細胞をもつプランクトンについては、最低１ｍ３のバラスト水を検査する必要があることから実現性の薄い方法であった。
【０００４】
現在まで、液体中の微生物計測の迅速化および簡便化を目的としたさまざまな簡便迅速測定法を実施する計測装置が開発されている。その中でも特に、液体中の微生物を迅速に直接計測する手法として、尿中や血液中に含まれる細胞などの対象粒子の形状情報を取得するために使用されていたイメージングフローサイトメトリ法への注目が高い。
イメージングフローサイトメトリ法は、対象粒子を含む検査液体の流径を細くし、対象粒子を一個ずつ流し画像計測する粒子計測方法である。この方法を用いた微生物測定装置は、1分あたり数ミリリットルの検査液体中に含まれる微生物一個あたりの種別、形状、大きさなどの情報を取得することができる。
【非特許文献１】株式会社アムコ 科学機器部、ＦlowＣＡＭイメージング・フローサイトメータ、［online］、［平成１９年６月２０日検索］、インターネット<ＵＲＬ：http://www.amco.co.jp/kagaku/I_flowcam.htm>
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、上述のイメージングフローサイトメトリ法は、単位時間当たりの検査液量がもっとも多い粒子計測方法のひとつであるが、最低１ｍ３以上の検査液量が必要になるバラスト水中の微生物検査など、大量の液体中の含有生物検査に使用する場合、処理時間を短縮するために濃縮を検査の前に行うことが必須になることは自明である。濃縮の工程において、検査液体中の生物は物理的ダメージをうける可能性が高い。
画像計測を用いた検査工程において、体の部位に欠損が無いことが生物の生死の判断基準のひとつであるため、濃縮工程において生物が物理的ダメージを受けることは，生死に関しての情報の信頼性を低下させる。生物にダメージを与えない濃縮方法を採用するか、もしくは濃縮工程での物理的ダメージによる体の部位の欠損が生死の判断に影響しない方法を採用することが課題の解決に有効である。
【０００６】
例えば、生細胞のみを染色する染色剤にて生物を染色する工程を濃縮工程の前に行い、検査において染色の有無を生死の判断基準にすることが考えられる。この方法では、濃縮工程にて生物の体に欠損が生じても、染色の有無によって生死を判断することができる。
濃縮の前に、染色を行うことは生物の検査方法としては一般的に行われている手法であるが、本手法をバラスト水検査装置に適用するにあたり、 １ｍ３以上の検査液量が要求されるため、大量の液体を濃縮や検査を行うための時間が長くなることに由来する特殊な課題がある。
１ｍ３の処理済バラスト水を濃縮率１０００倍で濃縮し、１リットルまで液量を低減しても、続く検査工程における検査が完了する時間は、イメージングフローサイトメトリ法の処理液量が数ミリリットル／ｍｉｎであるため数時間におよぶ。そのため、バラスト水の一部は濃縮後、検査工程に移るまでに数時間の待機時間が必要になる。
【０００７】
一方、染色後に濃縮工程でダメージを受け死んだ生物は、生細胞が死細胞になり、生物の細胞中に選択的に取り込まれた色素は検査時間中に細胞膜上の細孔から細胞外へ拡散する。生物の染色に使用される色素の分子直径は０．数ｎｍ〜数ｎｍ程度であることから，色素の平均二乗変位は，数十μm/secとなるため，細胞の細孔の大きさや数によるが，次の工程に進むまでの待機時間中に，色素が細胞外へ拡散することにより、染色状態が劣化する可能性が高いため、生死に関しての情報を染色の有無で判断することが困難になる。
本発明は上記実状に鑑み、バラスト水中などの検体に含まれる生物を測定するために該生物の染色、検体の濃縮、および含有生物の情報取得を簡単な工程で行い、安定した検体中の生物の測定を行い得る生物検査装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく、本発明に関わる生物検査装置は、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、染色が施された検体を流しつつ生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、濃縮された検体中の生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、個体計測部より出力された個体の画像情報より生物の測定を行う制御手段とを備えている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、検体の液体中の生物の染色工程、液体中の生物の濃縮工程、液体中の生物の情報取得の工程等をフロー方式で行えるため、各方式をバッチ方式で行う手法と比べ、ひとつの工程を終えた検体の一部が次の工程に進むまでの待機時間を大幅に短縮、または０とでき、待機時間での染色の状態の劣化を防ぐことが可能で、安定した生物の生死の情報を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。
本発明を適用した実施形態の生物検査装置１は、プランクトン等の生物を含む１ｍ３以上の液体検体について、生細胞を持つ最低直径サイズ５０μｍ以上を有する生物の個数計測等を行う装置である。なお、生細胞を持つ生物の最低直径サイズとは、該生物の胴体部の最も短い寸法をいう。
以下、この生物検査装置１による生細胞をもつ生物の個数計測等の測定について詳細に説明する。
【００１１】
＜＜生物検査装置１の構成＞＞
図１は、本発明を適用した生物検査装置１の基本システム図である。
図１に示すように、生物検査装置１は、各工程での処理を行う主要部として、検体とこの検体中の生細胞を持つ生物を染色する染色液とを流しながら混合し染色を行うための流れ式染色装置２０と、検体を流しながら一定範囲の大きさをもつ生物を含む検体の濃縮を行うための流れ式濃縮装置３０と、検体を流しながら一定範囲の大きさ以外の生物を除去するための流れ式精製手段４０と、検体を流しながら検体中の粒子の画像情報を取得するための流れ式粒子計測手段５０とを具備している。
この生物検査装置１における各工程での処理は、待ち時間がなく進行するフロー処理で行われ、検体用水槽８１に貯留される計測対象の検体は、検体用水槽８１から矢印ａ１、ａ２、ａ３、ａ４に示すように、流れ式染色装置２０、流れ式濃縮装置３０、流れ式精製手段４０、流れ式粒子計測手段５０の順に流動し、所定の測定が行われる。
【００１２】
上述の処理前の染色液等の生物検査装置１で使用する液体を貯留するための水槽として、生物検査装置１は、検査前の検体を貯留するための検体用水槽８１と、流れ式染色装置２０で使用する染色液を貯めるための染色液用水槽８２と、流れ式精製手段４０にて精製に使用される精製液体を貯留するための精製液体用水槽８３とを備えている。
一方、処理後に廃棄される液体を貯留するための廃棄水槽として、流れ式濃縮装置３０にて廃棄される液体を貯留するための濃縮後廃棄水槽８６と、流れ式精製手段４０にて除去された生物を含む粒子を含有する液体を貯留するための精製後廃棄水槽８７と、流れ式粒子計測手段５０による粒子計測が終了した検体の廃液を貯留するための計測後廃棄水槽８８とを備えている。
【００１３】
また、検体、染色液、精製液体などの送液をそれぞれ連続的に行うための連続供給手段として、生物検査装置１は、検体用水槽８１から流れ式染色装置２０へ検体を連続的に供給する検体連続供給手段６１と、染色液用水槽８２から流れ式染色装置２０へ染色液を連続的に供給する染色液連続供給手段６２と、精製液体用水槽８３から流れ式精製手段４０へ精製液体を連続的に供給する精製液体連続供給手段６３とを具えている。なお、連続供給手段６１、６２、６３として、本実施形態ではポンプを用いているが、送液を行えるものであれば、ポンプ以外の機械を用いてもよい。
また、検体や染色液などの送液の流量を制御するためのバルブとして、生物検査装置１は、図１に示すように、流れ式濃縮装置３０と流れ式精製手段４０を連結する管の通過液量を制御するための濃縮装置−精製手段間バルブ７１と、流れ式濃縮装置３０と濃縮後廃棄水槽８６を連結する管の通過液量を制御するための濃縮装置−濃縮廃棄水槽間バルブ７２と、流れ式精製手段４０と流れ式粒子計測手段５０を連結する管の通過液量を制御するための精製手段−粒子計測手段間バルブ７３と、流れ式精製手段４０と精製後廃棄水槽８７を連結する管の通過液量を制御するための精製手段−精製廃棄水槽間バルブ７４とを有している。
【００１４】
前記した構成の生物検査装置１は、制御手段として制御装置９０を有しており、該制御装置９０は、各装置２０、３０および手段４０、５０、連続供給手段６１、６２、６３、およびバルブ７１、７２、７３、７４に制御信号等を出力し制御するとともに、流れ式粒子計測手段５０により得られた粒子情報の解析を行っている。また、この制御装置９０の解析結果を出力するために、液晶ディスプレイ、プリンタ等の出力装置９１を備えている。
なお、生物検査装置１は、濃縮後廃棄水槽８６および精製後廃棄水槽８７に廃棄された廃液から使用済みの染色液を精製し再利用する染色液精製部８９を有しており、逆浸透膜（ＲＯ膜(Ｒeverse Ｏsmosis Ｍembrane)）により廃液中に溶け込んだ染色液を精製後、染色液用水槽８２に戻し、再利用している。
なお、染色液精製部８９は、濃縮後廃棄水槽８６に廃棄された廃液から使用済みの染色液を精製し再利用する第１の染色液精製部と、精製後廃棄水槽８７に廃棄された廃液から使用済みの染色液を精製し再利用する第２の染色液精製部とに分けて構成することも可能である。
【００１５】
＜＜生物検査装置１の各工程での処理＞＞
次に、生物検査装置１の各工程での処理について説明する。
図２(ａ)は、流れ式染色装置２０の内部構造を示す平面概念図であり、図２(ｂ)は、図２(ａ)の流れ式染色装置２０のＡ−Ａ線断面図である。
図１に示すように、計測対象の検体用水槽８１に貯留される検体は、検体用水槽８１から検体連続供給手段６１を用いて、矢印ａ１のように、流れ式染色装置２０へ流され、図２に示すように、検体流入口２２より、矢印ａ20のように染色槽２６内に流入する。
一方、生細胞をもつ生物を染色するための染色液は、図１に示す染色液用水槽８２から、染色液連続供給手段６２を用いて流れ式染色装置２０に供給され、図２(ｂ)に示す染色液流入口２３より、矢印ａ21のように流れ式染色装置２０内に流入する。
【００１６】
図２(ｂ)に示すように、染色液流入口２３より流れ式染色装置２０内に流入した染色液は、複数の染色液噴出し口２１、２１、…を矢印ａ22のように染色槽２６内に通流し、染色槽２６内の検体と混合する。こうして、検体と染色液とが、染色槽２６内で混合した後、図２(ａ)に示すように、混合流路管２４を矢印ａ23のように流れる間に、検体中の生細胞をもつ生物は染色液により染色される。
この検体中の生細胞をもつ生物の染色時間は、油圧シリンダ等の混合流路管駆動装置２５により、混合流路管２４の一部を移動し混合流路管２４の全長を変更し、隣接する下流の流れ式濃縮装置３０(図１参照)までの流動時間を変更することにより、適宜調整することが可能である。
ここで、混合流路管駆動装置２５は、例示した油圧シリンダ以外にモータの駆動力を減速機構を用いて混合流路管２４を移動する機構でもよく、混合流路管２４の一部を移動し、その全長を変更できる機構であれば、種々の機構を採用し得ることは言うまでもない。
【００１７】
本実施形態では、検体と染色液の混合比を、検体１０００リットルに対して染色液５ｇ、言い換えれば、染色液１ｇを検体２００，０００ミリリットルに混ぜ、混合時間を５分としているが、この混合時間は、検体の状態に応じて制御装置９０により自動的に決定し制御される。例えば、測定対象の検体中に既知の生細胞をもつ生物を入れて流し、その染色度合いを流れ式粒子計測手段５０の画像情報から得て、混合時間を制御装置９０により自動的に決定し制御してもよい。
ここで、染色液としては、ニュートラルレッドやメチルブルーなどの生細胞に選択的に取り込まれる色素、すなわち生細胞のみを染色する色素を使用する。
【００１８】
上述の如く、図２(ａ)の矢印ａ23のように、混合流路管２４を通過して、染色が行われた流れ式染色装置２０内の染色された検体を含む二液の混合液は、図１の矢印ａ２に示すように、下流に続く流れ式濃縮装置３０へ流入する。
図３は、流れ式濃縮装置３０の内部構造を示す断面概念図である。
図３に示すように、流れ式染色装置２０で染色された検体は、流れ式濃縮装置流入口３１より、矢印ａ30のように流れ式濃縮装置３０内に流入し，濃縮装置−精製手段間バルブ７１(図１参照)と流れ式濃縮装置−濃縮後廃棄水槽間バルブ７２(図１参照)の通過液量の比に従って分流され、濃縮液流出口３４と濾過液流出口３５とに分かれ流出する。
【００１９】
流れ式濃縮装置流入口３１と濾過液流出口３５の間には、孔径５０μｍのフィルタ３２が設けられ、流れ式濃縮装置３０内に流入した５０μｍより大きい寸法をもつ粒子は、フィルタ３２に阻まれ、矢印ａ31のように濃縮液流出口３４に流動する一方、流れ式濃縮装置３０内に流入した５０μｍより小さい寸法をもつ粒子は、矢印ａ32のようにフィルタ３２を通過して濾過液流出口３５に流動する。
流れ式濃縮装置３０における検体の濃縮率は、濃縮装置−精製手段間バルブ７１と濃縮装置−濃縮廃棄水槽間バルブ７２の通過水量の比で決定する。
【００２０】
なお、本実施形態では，濃縮率を１０００倍に設定するが、検体の状態により、制御装置９０によりフィードバックがかけられ、最適な濃縮率に自動的に決定される。何故なら、検体であるバラスト水の状態で染色度合いが変わるので、例えば、染まり過ぎると死んでいる生物までも染めてしまうので、このようなフィードバックが行われる。なお、このフィードバックは、流れ式粒子計測手段５０により画像情報を取得し、該画像情報から制御装置９０により染色度合いを判断して行なうことができる。
ここで、濃縮率を１０００倍に設定するためには、例えば、濃縮装置−精製手段間バルブ７１(図１参照)と流れ式濃縮装置−濃縮後廃棄水槽間バルブ７２(図１参照)の通過液量の比を、１：１０とした図３に示す流れ式濃縮装置３０を１０段階設けることにより、実現できる。
【００２１】
また、本実施形態では孔径５０μｍのフィルタ３２を備えた流れ式濃縮装置３０を利用しているが、孔径が異なる流れ式濃縮装置を生物検査装置１に並列に複数設け、検体の状態に応じ切り替える構成を採用してもよい。
図３に示すように、流れ式濃縮装置３０内を流れる粒子の一部は、フィルタ３２上に吸着するが、フィルタ３２のろ過面の方向に生じている矢印ａ31で示す流れ、すなわちフィルタ３２のろ過面の方向に沿った流れがフィルタ３２上に吸着した粒子をはがす効果があるため、粒子のフィルタ３２への吸着による粒子数の減少を抑えることができる。
ここで、検体の流れ式濃縮装置３０への流入量が減少した場合、フィルタ３２のろ過面方向(矢印ａ31方向)の流速が弱まり，フィルタ３２上に吸着した粒子をはがす力が弱まる。
しかし、油圧シリンダ等の可変壁駆動装置３７により、矢印ａ39のように容量可変壁３６を動かし、流れ式濃縮装置３０の容量を減少させることにより、検体の流速を一定に保つことが可能である。
【００２２】
なお、可変壁駆動装置３７は、例示した油圧シリンダ以外にモータの駆動力を減速機構を用いて容量可変壁３６を移動する機構でもよく、容量可変壁３６を移動し、流れ式濃縮装置３０の容量を変更できる機構であれば、種々の機構を採用し得ることは勿論である。
一方、流れ式濃縮装置３０におけるフィルタ３２によるろ過後の図３の矢印ａ32に示す濾液は、濃縮装置−濃縮廃棄水槽間バルブ７２を介して、濃縮後廃棄水槽８６(図１参照)に廃棄される。
続いて、図１に示すように、流れ式濃縮装置３０を通過した５０μｍより大きい寸法をもつ粒子を含む検体が、矢印ａ3のように、濃縮装置−精製手段間バルブ７１を介して、流れ式精製手段４０に流入する。この流れ式精製手段４０は、流れ式濃縮装置３０と同様の構造を有している(図３参照)。
【００２３】
この流れ式精製手段４０において、流れ式濃縮装置３０を通過した５０μｍより大きい寸法をもつ粒子を含む検体に、精製液体用水槽８３から粒子を含まない精製液体を供給し全粒子の濃度を、一旦低下させ、再度、フィルタで余分なゴミ、粒子等を除き濃縮を行うことで相対的に上記フィルタ３２の孔径より大きい粒子の割合を増加させる。すなわち、検体中の５０μｍより大きい寸法をもつ粒子の純度を高め、検体の精製を行う。
一方、流れ式精製手段４０におけるフィルタによりろ過された濾液は、図１に示すように、精製手段−精製廃棄水槽間バルブ７４を介して、精製後廃棄水槽８７に廃棄される。
こうして、流れ式精製手段４０において精製された検体は、図１の矢印ａ4に示すように、流れ式精製手段４０から流出し、精製手段−粒子計測手段間バルブ７３を介して、流れ式粒子計測手段５０内に流入する。
【００２４】
図４は、流れ式粒子計測手段５０の構成を示した断面概念図である。
図４に示すように、流れ式粒子計測手段５０は、検体中の粒子に当てるレーザ光５４を出力するレーザ装置５３と、検体中の粒子に当ったレーザ光５４を受光する散乱光受光装置５５と、撮影範囲５６に流れた該粒子を撮影する撮影装置５７とを有している。
図１に示す流れ式精製手段４０を通過した検体は、図４の矢印ａ4に示すように、流れ式粒子計測手段５０に流入し、計測流路５１を矢印ａ50のように流動し、この流動する間に検体に対する計測が、下記のように行われる。
まず、レーザ装置５３と散乱光受光装置５５とを用いて、粒子５２が撮影範囲５６へ流入することを、予め検知する。すなわち、粒子５２がレーザ装置５３から出力されるレーザ光５４を横切るときに粒子５２から発生する散乱光を散乱光受光装置５５が検知し、粒子５２の通過を検知する。
【００２５】
ここで、レーザ光５４の位置から撮影範囲５６(図４中に破線で示す)まで流動する時間ｔは、検体の流速により決まるので、流速より求めた時間ｔ後に撮影範囲５６の画像を取得することにより、撮影範囲５６に入った粒子５２の画像情報を撮影装置５７により撮影し取得できる。なお、粒子５２の通過を検知する方法は、コールターカウンタのような電気的手法であってもよい。
ここで、粒子５２がレーザ光５４を通過する時間は，粒子５２全体がレーザ光５４を通過することから粒子５２の大きさに比例するため、通過時間に応じ撮影範囲の大きさを調整するオートズーム機構を、撮影装置５７は備えている。
なお、粒子５２が長形のものである場合、粒子５２は検体の流れにより力を受けるため、流れに沿う態様、すなわち、流れ方向と粒子５２の長手方向が同方向を向いて流れることになる。
【００２６】
そのため、検体中の粒子５２がレーザ光５４を通過する情報を含む信号を散乱光受光装置５５から制御装置９０(図１参照)が入力し、該制御装置９０において、粒子５２がレーザ光５４を通過する時間情報から粒子５２の最大長を解析することができる。
そして、制御装置９０により、粒子５２の通過時間、すなわち粒子５２の最大長に応じて、撮影装置５７における撮影範囲５６の大きさ、すなわち視野の大きさを自動的に調整するオートズーム機構を稼動制御することにより、測定対象に応じた撮影が可能となっている。
こうして、粒子５２の通過を検知した時刻から撮影範囲５６に流入する算出した時間ｔ後、計測流路５１を流れる検体中の粒子５２が撮影範囲５６に流入した際に撮影装置５７によって撮影を行い、粒子５２の画像情報を取得する。
続いて、取得した画像情報は、撮影装置５７から画像情報信号として制御装置９０に出力され、この制御装置９０にて取得された画像情報から、染色の有無によって粒子５２の一つである生物の生死、該生物のサイズ等が測定される。
【００２７】
図５は、粒子５２の一つである生物のプランクトン５２ａ1、５２ａ2、５２ａ3の生死判定を行うための判定データを示した図である。
例えば、画像情報における粒子の一つであるプランクトンが、図５(ａ)に示す染色(胴体部の点で示す)されたプランクトン５２ａ1に該当する場合、または図５(ｂ)に示す染色(胴体部の点で示す)されたプランクトン５２ａ2に該当する場合には、生と判定される。一方、図５(ｃ)に示す染色されない(胴体部の点無し)プランクトン５２ａ3に該当する場合には、死と判定される。
なお、図５(ｂ)に示すプランクトン５２ａ2の二点鎖線で示す足５２ａ21の欠損は、流れ式濃縮装置３０または流れ式精製手段４０における濃縮時に起きたものである。
【００２８】
＜＜測定を終了するときの制御方法＞＞
次に、生物検査装置１において、測定を終了するときの制御装置９０による(図１参照)制御方法を、図６を用いて説明する。なお、図６は、測定を終了するときの制御装置９０の制御方法を示す流れ図である。
まず、図６のＳ１において、総処理液量ＶN、例えばバラスト水の総処理液量を表す変数ＶNに０を設定し、また、生細胞をもつとともに特定範囲の大きさの粒子５２の数を表す変数ｎNに０を設定する。なお、特定範囲とは、最低直径サイズ５０μｍ以上の生物をいうが、この特定範囲は任意に定め得ることは勿論である。
同時に、制御装置９０において、単位時間当たりの連続供給手段６１の供給液量に基づいて総処理液量ＶNを算出する総処理液量ＶNの計測を開始する。
なお、総処理液量ＶNの計測は、検体用水槽８１と連続供給手段６１間の配管に流量センサ(図示せず)を設け、この流量センサにより総処理液量ＶN、例えばバラスト水の総処理液量の計測を開始してもよい。
【００２９】
続いて、図６のＳ２において、図４に示すように、流れ式粒子計測手段５０を用いて検体中の粒子５２の画像情報を取得する。
続いて、図６のＳ３において、流れ式粒子計測手段５０からの粒子５２の画像情報に基づいて、制御装置９０において、粒子５２の一つである生物の生死が判定される。なお、粒子５２の一つである生物の生死の判定は、例えば、前記の図５に図示した方法によって判定される。
続いて、図６のＳ４において、取得した画像情報の粒子の一つである生物が生きているか否か、すなわち、該生物が生細胞を持っているか否かが判断される。
取得した画像情報の粒子５２の一つである生物が生きていない、すなわち、該生物が生細胞を持っていない場合(図６のＳ４においてＮo)、該生物の測定は停止され、図６のＳ２に移行する。
【００３０】
取得した画像情報の粒子５２の一つである生物が生きている、すなわち、該生物が生細胞を持っている場合(図６のＳ４においてＹes)、図６のＳ５において、流れ式粒子計測手段５０からの粒子５２の画像情報に基づいて、制御装置９０において、粒子５２の一つである生物の最低直径サイズが計測される。
なお、粒子５２の一つである生物の最低直径サイズとは、該生物の外形状の胴体部分の最も短い長さの部分の長さ寸法をいう。
例えば、図５(ａ)に示すプランクトン５２ａ１の最低直径サイズとは、プランクトン５２ａ１の外形状の胴体部分ｄ１の最も短い長さの部分の長さ寸法をいい、また、図５(ｂ)に示すプランクトン５２ａ2の最低直径サイズとは、プランクトン５２ａ2の外形状の胴体部分ｄ１の最も短い長さの部分の長さ寸法をいう。
【００３１】
ここで、図５(ａ)に示す胴体部分ｄ1の最も短い長さの部分の長さ寸法とは、胴体部分ｄ1の図５(ａ)の紙面に垂直な方向の寸法等の場合がある。同様に、図５(ｂ)に示す胴体部分ｄ2の最も短い長さの部分の長さ寸法とは、胴体部分ｄ2の図５(ｂ)の紙面に垂直な方向の寸法等の場合がある。
図８(ａ)に示すプランクトンＰ１の最低直径サイズとは、胴体部分の最も短い長さの部分の最低長さ寸法ｓ１を指し、図８(ｂ)に示す足をもつプランクトンＰ２の最低直径サイズとは、胴体部分の最も短い長さの部分の最低長さ寸法ｓ２を指すものである。
続いて、図６のＳ６において、粒子５２のうちの生きた生物の最低直径サイズが５０μｍ以上か否か判断される。
【００３２】
粒子５２のうちの生きた生物の最低直径サイズが５０μｍ未満の場合(図６のＳ６においてＮo)、該生物の測定は停止され、図６のＳ２に移行する。
一方、粒子５２のうちの生きた生物の最低直径サイズが５０μｍ以上の場合(図６のＳ６においてＹes)、図６のＳ７において、生細胞をもつとともに特定範囲の大きさの粒子の数ｎN＝ｎN＋１の演算を行い、生細胞をもつとともに特定範囲の大きさの粒子の数ｎNをカウントする。
【００３３】
続いて、図６のＳ２に移行し、図６のＳ２からＳ７までの処理を繰り返す。
同時に、図６のＳ８において、ｎNが規定数以上か、または、それまでの総処理液量ＶNが規定液量以上か判断される。なお、規定数は、例えば、１０個の場合であり、総処理液量ＶNは、例えば、１トンのバラスト水の場合である。
ｎNが規定数未満であり、かつ、それまでの総処理液量ＶNが規定液量未満の場合(図６のＳ８でＮo)、図６のＳ２に移行し測定が続行され、Ｓ２〜Ｓ７を経て図６のＳ８の判断が繰り返される。
一方、ｎNが規定数以上か、または、それまでの総処理液量ＶNが規定液量以上の場合(図６のＳ８でＹes)、図６のＳ９において、制御装置９０は検査終了と判断し、検体連続供給手段６１、染色液連続供給手段６２等に停止指示を送信し測定を終了する。
また、図６のＳ２に移行し測定が続行され図６のＳ８の判断が繰り返された場合も、図６のＳ８でＹesと判断された場合、図６のＳ９に移行し、制御装置９０は検査終了と判断し、検体連続供給手段６１、染色液連続供給手段６２等に停止指示を送信し測定を終了する。
【００３４】
＜＜濃縮率の制御方法＞＞
次に、生物検査装置１における制御装置９０による濃縮率の制御方法について、図７を用いて説明する。なお、図７は、濃縮率の制御方法の制御フロー示す図である。
まず、図７のＳ１において、Ｎ番目の粒子５２をカウントする変数、すなわち画像情報の取得回数を表す変数Ｉに０を設定する。なお、Ｎとはヒストグラム(度数分布図)を作成するための任意の正の整数であって、任意に設定可能である。
続いて、図７のＳ２において、流れ式粒子計測手段５０が粒子５２の画像情報を取得し、かつ、画像情報の取得の度に画像情報の取得回数ＩをカウントするＩ＝Ｉ＋１の演算を行う。なお、粒子５２の取得した画像情報から、粒子５２の大きさ等で選別して上記演算を行ってもよい。
【００３５】
続いて、図７のＳ３において、流れ式粒子計測手段５０がＮ番目以上の粒子５２を計測したか否か、判断される。
流れ式粒子計測手段５０が計測した粒子５２がＮ番目未満の場合(図７のＳ３でＮo)、図７のＳ２に移行する。
一方、流れ式粒子計測手段５０が計測した粒子５２がＮ番目に達した場合(図７のＳ３でＹes)、図７のＳ４において、Ｎ−ａ番目の粒子５２からＮ番目の粒子５２を計測するまでの通過液量ｖと各粒子５２の最低直径サイズの情報から単位液量あたりの粒子５２の最低直径サイズのヒストグラム(度数分布図)を求める。なお、ａは、Ｎより小さい正の整数であってＮ−aで表される度数が有効なヒストグラムを作成できるような任意の正の整数である。また、粒子５２の最低直径サイズとは、前述したように、粒子５２の外形状の胴部分の最も短い長さの部分の長さ寸法である。
【００３６】
ここで、通過液量ｖは、流れ式粒子計測手段５０の直前に流量センサ(図示せず)を設けて測定してもよいし、或いは、制御装置９０において、単位時間当たりの連続供給手段６１、６２、６３の供給液量とバルブ７２、７３、７４の通過液量とを用いて算出してもよい。
続いて、図７のＳ５において、求めたヒストグラムから、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子５２の濃度ＣＲと特定範囲外の最低直径サイズをもつ粒子５２の濃度Ｃｒを算出する。なお、特定範囲とは、本実施形態の場合、最低直径サイズ５０μｍ以上としているが、この特定範囲が任意に定め得ることは言うまでもない。
続いて、図７のＳ２に移行し、Ｓ２からＳ５の処理が繰り返される。
同時に、図７のＳ６において、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下か否か判断される。
【００３７】
特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度未満または最高規定濃度を超える場合、すなわち、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが所定の測定条件範囲内から外れた場合には(図７のＳ６でＮo)、図７のＳ７において、制御装置９０(図１参照)は、ＣＲを所定の範囲内にするために、連続供給手段６１、６２、６３(図１参照)に供給液量の指示を出し、バルブ７１、７２、７３、７４(図１参照)に通過液量の指示を出し、また、流れ式濃縮装置３０(図１、図３参照)に濃縮率の変更指示を出すとともに、流れ式精製手段４０に精製率の変更指示を出す。
例えば、粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度未満の場合には、連続供給手段６１、６２、６３に供給液量の増量の指示を出し、また、バルブ７１、７２、７３、７４に通過液量の増量の指示を出し、また、図３に示す流れ式濃縮装置３０において可変壁駆動装置３７によって濃縮装置室３９の容量を小さくする、また、流れ式精製手段４０において精製率を上げる等して濃縮率を上げる調整を行う。
【００３８】
逆に、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最高規定濃度を超える場合には、連続供給手段６１、６２、６３に供給液量の減量の指示を出し、また、バルブ７１、７２、７３、７４に通過水量の減量の指示を出し、また、図３に示す流れ式濃縮装置３０において可変壁駆動装置３７によって濃縮装置室３９の容量を大きくする、また、流れ式精製手段４０において精製率を下げる等して濃縮率を下げる調整を行う。
続いて、この図７のＳ７の処理を行った後、図７のＳ６に移行する。
一方、図７のＳ６において、特定範囲の最低直径サイズをもつ粒子の濃度ＣＲが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下の場合、すなわち、ＣＲが所定の測定条件の範囲内の場合は(図７のＳ６でＹes)、図７のＳ８に移行し、特定範囲外の最低直径サイズをもつ粒子の濃度Ｃｒが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下か否か判断される。
なお、特定範囲とは、本実施形態の場合、前記したように、最低直径サイズ５０μｍ以上としている。
【００３９】
特定範囲外の最低直径サイズをもつ粒子の濃度Ｃｒが最低規定濃度未満または最高規定濃度を超える場合、すなわち、Ｃｒが所定の測定条件の範囲内から外れたときには(図７のＳ８でＮo)、図７のＳ９に移行し、制御装置９０(図１参照)は、Ｃｒを所定の範囲内にするために連続供給手段６１、６２、６３(図１参照)に供給液量の指示を出し、また、バルブ７１、７２、７３、７４(図１参照)に通過液量の指示を出し、また、流れ式精製手段４０(図１、図３参照)に精製率の変更指示を出し、また、流れ式精製手段４０に精製率の変更指示を出す。そして、図７のＳ８に移行し、Ｓ８の判断を繰り返す。
一方、図７のＳ８において、特定範囲外の最低直径サイズをもつ微粒子の濃度Ｃｒが最低規定濃度以上かつ最高規定濃度以下の場合、すなわち、Ｃｒが所定の測定条件の範囲内の場合には(図７のＳ８でＹes)、図７のＳ１０に移行し、測定を続行する。
【００４０】
以上が、生物検査装置１における濃縮率の制御方法である。
前記構成によれば、液体検体中の生物を含む生物の染色工程，濃縮工程，生物の情報取得の各工程を自動化したため，検査者の作業負担が軽減され、測定結果への検査者の技量の影響を小さくすることができ、また、安定した測定結果を得ることが可能である。
さらに、各工程をフロー方式で一貫して行うため，各方式をバッチ方式で行う従来の手法と比べ，ひとつの工程を終えたバラスト水の一部が次の工程に進むまでの待機時間を０(ゼロ)、すなわち無くすことができる。そのため、待ち時間での染色された生物の染色の劣化を防ぐことができ、安定した生死の情報を取得可能である。
【００４１】
なお、本実施形態では、検体中に含まれる粒子として、生物のプランクトン、非生物の物等を例示して説明を行ったが、特許請求の範囲に記載した個体に相当するものとして、検体中に含まれる粒子以外の更に大きなサイズの個体である生物、非生物等の物体を広く含み適用されるものである。例えば、この生物としては、例示したプランクトン以外に、カニの幼虫、ちりめんじゃこなどの魚類、タコなどの水生の軟体動物等の大きなサイズの生物が広く含まれ、プランクトンに限定されるものではない。
なお、本実施形態では、流れ式精製手段４０を設ける場合を例示して説明したが、流れ式精製手段４０は、測定対象の生物の濃度を高めるためのものであるから、流れ式精製手段４０を設けず構成してもよい。
【００４２】
また、測定対象が大きなもの、例えば、カニの幼虫を対象に測定する場合には、流れ式濃縮装置３０のフィルタ３２の目および流れ式精製手段４０のフィルタの目を大きくするとともに、前記したように、撮影装置５７のオートズーム機構を用いてレンズの視野範囲を拡大して撮影が可能である。
なお、撮影装置５７におけるオートズーム機構に代えて、視野範囲の異なるレンズを複数設け、測定対象の大きさに応じて、適切なレンズに切り替える構成とすることもでき、また、撮影装置５７において、視野範囲の異なる複数のレンズとオートズーム機構を組み合わせて構成し、よりフレキシブルな撮影装置とすることも可能である。
また、本実施形態では、生物の測定として、生物の最低直径サイズの計測および生物の生死の判定を行う場合を例示して説明を行ったが、これ以外の生物のサイズの計測等、生物の最低直径サイズおよび生物の生死の判定以外の測定を行うことも可能である。
【００４３】
＜＜種々の実施形態＞＞
ところで、以下の構成が可能である。
第１の生物検査装置は、少なくとも、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、染色が施された検体を流しつつ生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、濃縮された検体中の生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、個体計測部より出力された個体の画像情報より生物の測定を行う制御手段とを備えている。
第１の生物検査装置の構成によれば、生細胞を持つ生物を死滅させることなく、フロー処理で該生物の測定が行え、待ち時間での染色の劣化を防ぎ、安定した生物の幅広い測定を行える。
【００４４】
第２の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、上記生物の測定は、生物の形状の計測と生物の染色状態の有無からの該生物の生死の判定とできる。
第２の生物検査装置の構成によれば、バラスト水の国際条約に適合するかの測定等が可能である。
【００４５】
第３の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、濃縮部と個体計測部間に濃縮部から送られた検体を流しつつ生物を含まない精製液体を供給した後に濃縮を行い生物の濃度を更に高める精製部を備えている。
第３の生物検査装置の構成によれば、精製部を備えるので、測定対象の生物の濃度を高めることが可能である。
【００４６】
第４の生物検査装置は、第１の構成において、染色部、濃縮部、個体計測部の順番に検体を搬送する検体搬送手段と、該検体搬送手段による検体の搬送およびその停止を制御する搬送制御手段とを、備えている。
第４の生物検査装置の構成によれば、検体の搬送および搬送の停止が適宜可能である。
【００４７】
第５の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、濃縮部から精製部への検体の流量を制御する濃縮部−精製部間流量制御手段と、該濃縮部−精製部間流量制御手段を制御する第１流量制御手段とを備えている。
第５の生物検査装置の構成によれば、濃縮部から精製部への流量の制御を行える。
【００４８】
第６の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、精製部から個体計測部への流量を制御する精製部−個体計測部間流量制御手段と、該精製部−個体計測部間流量制御手段を制御する第２流量制御手段とを備えている。
第６の生物検査装置の構成によれば、精製部から個体計測部への流量の制御を行える。
【００４９】
第７の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、濃縮部は、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物を濃縮する。
第７の生物検査装置の構成によれば、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物を濃縮して、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物の測定を行える。
【００５０】
第８の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、精製部は、最大直径サイズが５０μｍ未満の生物を取り除いている。
第８の生物検査装置の構成によれば、精製部は、最大直径サイズが５０μｍ未満の生物を取り除き、最大直径サイズが５０μｍ以上の生物の濃度を高めることが可能である。
【００５１】
第９の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、検体の量は、１ｍ３以上としている。
第９の生物検査装置の構成によれば、例えば、１トン以上のバラスト水を１０００倍に濃縮して、検体の量を１ｍ３以上として生物の測定を行える。
【００５２】
第１０の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、制御手段が、生細胞をもつ最低直径サイズ５０μｍ以上の生物の数を計測し、流動量取得手段により取得した検体の流動量が１ｍ３に達するまでに１０個計測した場合、測定を終了している。
第１０の生物検査装置の構成によれば、１トンの検体、例えば、バラスト水を１０００倍に濃縮して、１トンの検体中に生細胞をもつ最低直径サイズ５０μｍ以上の生物が１０個いるか否か、測定できる。
【００５３】
第１１の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、制御手段は、流動量取得手段で取得した単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から濃縮部の濃縮率を決定している。
第１１の生物検査装置の構成によれば、検体の単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から濃縮部の濃縮率を決定するので、検体の単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数に応じて濃縮率を決定し、生物の測定を行える。
【００５４】
第１２の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、制御手段は、流動量取得手段で取得した単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から精製部の精製率を決定している。
第１２の生物検査装置の構成によれば、流動量取得手段で取得した単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から前記精製部の精製率を決定するので、検体の単位液量あたりの個体の最低直径サイズについての度数に応じて、検体の濃度を高め、測定を行える。
【００５５】
第１３の生物検査装置は、第１の生物検査装置において、濃縮部より廃棄された液体中から染色部より検体に供給された染色液を回収する第１染色液精製部を備えている。
第１３の生物検査装置の構成によれば、第１染色液精製部によって濃縮部より廃棄された液体中の染色液を回収するので、染色液を有効に利用することができる。
【００５６】
第１４の生物検査装置は、第３の生物検査装置において、精製部より廃棄された液体中から染色部より検体に供給された染色液を回収する第２染色液精製部を備えている。
第１４の生物検査装置の構成によれば、第２染色液精製部によって精製部より廃棄された液体中の染色液を回収するので、染色液を有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明に関わる実施形態の生物検査装置の基本システムを示す図である。
【図２】(ａ)および(ｂ)は、生物検査装置における流れ式染色装置の内部構造を示す平面概念図、および(ａ)図の流れ式染色装置のＡ−Ａ線断面図である。
【図３】生物検査装置における流れ式濃縮装置の内部構造を示す断面概念図である。
【図４】生物検査装置における流れ式粒子計測手段の構成を示した断面概念図である。
【図５】(ａ)、(ｂ)、および(ｃ)は、粒子の一つであるプランクトンの生死判定を行うための判定データを示した図である。
【図６】生物検査装置による測定を終了するときの制御装置の制御方法を示す流れ図である。
【図７】生物検査装置における濃縮率の制御方法を表す流れ図である。
【図８】(ａ)および(ｂ)は、プランクトンの形状寸法を示した図である。
【符号の説明】
【００５８】
１…生物検査装置、
２０…流れ式染色装置(染色部)、
３０…流れ式濃縮装置(濃縮部)、
４０…流れ式精製手段(精製部)、
５０…流れ式粒子計測手段(粒子計測部)、
５２…粒子(個体)、
５２ａ1、５２ａ2…プランクトン(生物)、
６１…検体連続供給手段(検体搬送手段)、
６２…連続供給手段 (染色部)、
６３…連続供給手段 (精製部)、
７１…濃縮装置−精製手段間バルブ(検体搬送手段、濃縮部−精製部間流量制御手段)、
７３…精製手段−粒子計測手段間バルブ(検体搬送手段、精製部−粒子計測部間流量制御手段)、
８２…染色液用水槽 (染色部)、
８３…精製液体用水槽 (精製部)、
８９…染色液精製部(第１染色液精製部、第２染色液精製部)、
９０…制御装置(制御手段、搬送制御手段、第１流量制御手段、第２流量制御手段)、
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、
前記染色が施された検体を流しつつ前記生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、
前記濃縮された検体中の前記生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、
前記個体計測部より出力された前記個体の画像情報より前記生物の測定を行う制御手段とを
備えたことを特徴とする生物検査装置。
【請求項２】
前記制御手段における生物の測定は、前記生物の形状の計測と前記生物の染色状態の有無からの該生物の生死の判定である
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項３】
前記濃縮部と前記個体計測部間に前記濃縮部から送られた前記検体を流しつつ前記生物を含まない精製液体を供給した後に濃縮を行い前記生物の濃度を更に高める精製部を備える
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項４】
前記染色部、前記濃縮部、前記個体計測部の順番に前記検体を搬送する検体搬送手段と、
該検体搬送手段による前記検体の搬送およびその停止を制御する搬送制御手段とを、
備えることを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項５】
前記濃縮部から前記精製部への前記検体の流量を制御する濃縮部−精製部間流量制御手段と、
該濃縮部−精製部間流量制御手段を制御する第１流量制御手段とを、
備えることを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項６】
前記精製部から前記個体計測部への流量を制御する精製部−個体計測部間流量制御手段と、
該精製部−個体計測部間流量制御手段を制御する第２流量制御手段とを、
備えることを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項７】
前記濃縮部は、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物を濃縮する
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項８】
前記精製部は、最大直径サイズが５０μｍ未満の生物を取り除く
ことを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項９】
前記検体の量は、１ｍ３以上である
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１０】
前記検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、
前記制御手段は、生細胞をもつ最低直径サイズ５０μｍ以上の生物の数を計測し、前記流動量取得手段により取得した前記検体の流動量が１ｍ３に達するまでに前記数を１０個計測した場合、測定を終了する
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１１】
前記検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、
前記制御手段は、前記流動量取得手段で取得した単位液量あたりの前記個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から前記濃縮部の濃縮率を決定する
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１２】
前記検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、
前記制御手段は、前記流動量取得手段で取得した単位液量あたりの前記個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から前記精製部の精製率を決定する
ことを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項１３】
前記濃縮部より廃棄された液体中から前記染色部により前記検体に供給された前記染色液を回収する第１染色液精製部を備えた
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１４】
前記精製部より廃棄された液体中から前記染色部により前記検体に供給された前記染色液を回収する第２染色液精製部を備えた
ことを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項１】
液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、
前記染色が施された検体を流しつつ前記生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、
前記濃縮された検体中の前記生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、
前記個体計測部より出力された前記個体の画像情報より前記生物の測定を行う制御手段とを
備えたことを特徴とする生物検査装置。
【請求項２】
前記制御手段における生物の測定は、前記生物の形状の計測と前記生物の染色状態の有無からの該生物の生死の判定である
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項３】
前記濃縮部と前記個体計測部間に前記濃縮部から送られた前記検体を流しつつ前記生物を含まない精製液体を供給した後に濃縮を行い前記生物の濃度を更に高める精製部を備える
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項４】
前記染色部、前記濃縮部、前記個体計測部の順番に前記検体を搬送する検体搬送手段と、
該検体搬送手段による前記検体の搬送およびその停止を制御する搬送制御手段とを、
備えることを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項５】
前記濃縮部から前記精製部への前記検体の流量を制御する濃縮部−精製部間流量制御手段と、
該濃縮部−精製部間流量制御手段を制御する第１流量制御手段とを、
備えることを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項６】
前記精製部から前記個体計測部への流量を制御する精製部−個体計測部間流量制御手段と、
該精製部−個体計測部間流量制御手段を制御する第２流量制御手段とを、
備えることを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項７】
前記濃縮部は、最低直径サイズが５０μｍ以上の生物を濃縮する
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項８】
前記精製部は、最大直径サイズが５０μｍ未満の生物を取り除く
ことを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項９】
前記検体の量は、１ｍ３以上である
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１０】
前記検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、
前記制御手段は、生細胞をもつ最低直径サイズ５０μｍ以上の生物の数を計測し、前記流動量取得手段により取得した前記検体の流動量が１ｍ３に達するまでに前記数を１０個計測した場合、測定を終了する
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１１】
前記検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、
前記制御手段は、前記流動量取得手段で取得した単位液量あたりの前記個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から前記濃縮部の濃縮率を決定する
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１２】
前記検体の流動量を求める流動量取得手段を備え、
前記制御手段は、前記流動量取得手段で取得した単位液量あたりの前記個体の最低直径サイズについての度数を計測し、該度数から前記精製部の精製率を決定する
ことを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【請求項１３】
前記濃縮部より廃棄された液体中から前記染色部により前記検体に供給された前記染色液を回収する第１染色液精製部を備えた
ことを特徴とする請求項１に記載の生物検査装置。
【請求項１４】
前記精製部より廃棄された液体中から前記染色部により前記検体に供給された前記染色液を回収する第２染色液精製部を備えた
ことを特徴とする請求項３に記載の生物検査装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−８５８９８（Ｐ２００９−８５８９８Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５９３３０（Ｐ２００７−２５９３３０）
【出願日】平成１９年１０月３日（２００７．１０．３）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月３日（２００７．１０．３）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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