生物活性ナトリウム利尿ペプチドを測定するための、およびその治療可能性を向上させるための方法および組成物
【課題】サンプル中の生物活性ナトリウム利尿ペプチド、またはその断片の存在または量を調べるよう設計された組成物および方法を提供する。
【解決手段】生物活性ナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の生物学的不活性断片からのシグナルは少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法、ならびにナトリウム利尿ペプチドの分解のこれまでには未知であった経路を阻害する組成物を提供する。
【解決手段】生物活性ナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の生物学的不活性断片からのシグナルは少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法、ならびにナトリウム利尿ペプチドの分解のこれまでには未知であった経路を阻害する組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを測定するための、およびその治療可能性を向上させるための方法および組成物と題された、２００３年８月２０日に出願された米国特許出願第１０／６４５，８７４号の一部継続出願であり、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを測定するための、およびその治療可能性を向上させるための方法および組成物と題された、２００４年２月４日に出願された米国仮特許出願第６０／６４２，０８６号の優先権を主張し、それらの各々から優先権が主張されており、それらの各々は参照により、すべての表、図および特許請求の範囲を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、医療診断および治療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景についての以下の議論は、単に読者が本発明を理解するのを補助するために提供するものであって、本発明の先行技術を説明または構成するよう承認されるものではない。
【０００４】
ナトリウム利尿ペプチドは、身体においてレニン−アンギオテンシン系の活性に対抗するよう作用する天然に生じる物質群である。３つの主要なナトリウム利尿ペプチド：心房で合成される、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、心室で合成される、脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、脳で合成される、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）がある。
【０００５】
成熟ヒトＡ型ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（心房性ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）は、心房拡張、アンギオテンシンＩＩ刺激、エンドセリン、および交感神経刺激（β−アドレナリン受容体媒介性）に応じて心房筋細胞によって合成され、保存され、放出される、生物学的に活性な２８アミノ酸ペプチドである。成熟ＡＮＰは、１２８アミノ酸前駆体分子（プロ−ＡＮＰ）のタンパク質分解切断によって生じ、プロ−ＡＮＰ分子のアミノ酸９９〜１２６（ＡＮＰ99〜126）に相当する生物学的に活性な２８アミノ酸ペプチドが生じる。Ｎ末端プロホルモンセグメントに由来する線状ペプチド断片も生物活性を有すると報告されている。
【０００６】
成熟ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）（脳型ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）は、血圧および体液平衡を調節するナトリウム利尿系に関与する、３２アミノ酸、４ｋＤａの生物学的に活性なペプチドである（ボノー（Ｂｏｎｏｗ）、Ｒ．Ｏ．、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、９３、１９４６〜１９５０頁、１９９６）。成熟ＢＮＰホルモンは、本明細書では「プロ−ＢＮＰ」と呼ぶ１０８アミノ酸前駆体分子のタンパク質分解切断によって生じる。切断によって、「ＮＴプロＢＮＰ」と呼ばれる７６アミノ酸Ｎ末端ペプチド（アミノ酸１〜７６）と、ＢＮＰまたはＢＮＰ３２と呼ばれる３２アミノ酸成熟ホルモン（アミノ酸７７〜１０８）が生じる。これらの種の各々−ＮＴプロ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−３２およびプレ−プロ−ＢＮＰは、ヒト血漿中を循環し得ることが示唆されている（タテヤマら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）１８５、７６０〜７頁、１９９２）、ハント（Ｈｕｎｔ）ら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション、２１４、１１７５〜８３頁、１９９５）。
【０００７】
ヒト脳における主要な活性ナトリウム利尿ペプチドである、成熟ヒトＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）２２アミノ酸ペプチド；ＣＮＰはまた、一酸化窒素（ＮＯ）と同様に作用する、内皮由来弛緩因子であると考えられている（ダビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）ら、サーキュレーション９３、１１５５〜９頁、１９９６）。ＣＮＰは、Ａ型ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）と構造的に関連しているが、ＡＮＰとＢＮＰは主に心筋で合成されるのに対し、ＣＮＰは血管内皮で前駆体（プロ−ＣＮＰ）として合成される（プリケット（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ）ら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション、２８６、５１３〜７頁、２００１）。ＣＮＰは動脈と静脈の双方に対して血管拡張作用を有すると考えられており、血管平滑筋細胞において細胞内ｃＧＭＰ濃度を高めることによって主に静脈に対して作用すると報告されている。
【０００８】
ＡＮＰおよびＢＮＰはそれぞれ、心房および心室伸展に応じて放出され、血管緊張低下、副腎皮質におけるアルドステロン分泌の阻害、腎臓におけるレニン分泌の阻害を引き起こす。ＡＮＰとＢＮＰの双方ともナトリウム利尿および血管内容量の減少、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）の拮抗作用によって増幅される作用をもたらす。ＣＮＰの生理学的作用はＡＮＰおよびＢＮＰのものとは異なり、ＣＮＰは降圧効果を有するが、有意な利尿またはナトリウム利尿作用はない。特定の疾病状態では、ナトリウム利尿ペプチドの血管レベルの増加が見出されており、このことは、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＰ）、心虚血、全身性高血圧、および急性心筋梗塞をはじめとする疾病の病態生理学における役割を示唆する。例えば、各々、すべての表、図および特許請求の範囲を含むその全文が本明細書に組み入れられる、ＷＯ０２／０８９６５７、ＷＯ０２／０８３９１３およびＷＯ０３／０１６９１０を参照。当業者には、ナトリウム利尿ペプチドの多数の非ヒト相同体が知られている。
【０００９】
ナトリウム利尿ペプチドは、単独で、集団的に、および／またはさらなるタンパク質とともに、種々の循環器症状において疾病マーカーおよび予後の指標として利用できる。例えば、心室で合成されるＢＮＰは、左心室圧、呼吸困難の量、および神経ホルモン調節の状態と相関があるため、このペプチドが心疾患の第１の潜在マーカーとなっている。血漿ＢＮＰの濃度の測定は、病因論およびＬＶ収縮機能障害の程度にかかわらず、明らかな心不全を発症する可能性があり得る、および心血管系イベントの危険の高い、種々の心臓異常を有する患者を同定するための、極めて効果的かつ費用効率の高い集団検診技術として発達している。ＣＨＦ患者の診断および管理を補助する簡単な血液試験を見出すことが、この疾病にかかる驚異的な費用に対して好影響をもたらすことは明確である。
【００１０】
循環からのナトリウム利尿ペプチドの除去は、主に、循環におけるクリアランス受容体との結合および酵素分解によって影響を受ける。例えば、チョー（Ｃｈｏ）ら、ハート・ディジーズ（Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）１、３０５〜２８頁、１９９９、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）１６７、２３９〜４６頁、２０００参照。さらに、ヒトプロ−ＢＮＰは、血清中でプロセシングされ、その結果、循環プレ−プロ−ＢＮＰが無傷の１０８アミノ酸型である可能性は低いと報告されている。ハント（Ｈｕｎｔ）ら、ペプチデス（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）１８、１４７５〜８１頁、１９９７。ナトリウム利尿ペプチドの分解は中性エンドペプチダーゼによって媒介されると考えられている。例えば、ノーマン（Ｎｏｒｍａｎ）ら（バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション２８、１７５、２２〜３０頁、１９９１）は、中性エンドペプチダーゼはヒトＢＮＰを残基２と３の間、残基４と５の間、および残基１７と１８の間で切断できると報告している。同様に、リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）およびアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）（レギュラトリー・ペプチデス（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）４７、５３〜６３頁、１９９３）は、ヒトＡＮＰは残基３と４の間および残基１４と１５の間で切断されると報告している。この加水分解産物の生物活性は、無傷のＡＮＰよりも約５００倍低かった。さらに、クネヒト（Ｋｎｅｃｈｔ）ら、（ライフ・サイエンシズ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）７１、２７０１〜１２頁、２００２）は、心不全では腎臓の中性エンドペプチダーゼがアップレギュレートされ、ナトリウム利尿ペプチドレベルが増加している状態と報告している。このため、中性エンドペプチダーゼは循環器疾患の治療における阻害の標的となってきた。例えば、コルチ（Ｃｏｒｔｉ）ら、サーキュレーション１０４、１８５６〜６２頁、２００１参照。
【００１１】
ナトリウム利尿ペプチドの、特に、血液由来サンプル（例えば、血清、血漿、全血）中での安定性に関する混乱が報告されている。ＡＮＰは、ＢＮＰよりも中性エンドペプチダーゼのよりよい基質であると報告されている。同様に、シミズら、（クリニカ・ケミカ・アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ）３０５、１８１〜６頁、２００１）、ゴビネ−ジョージ（Ｇｏｂｉｎｅｔ−Ｇｅｏｒｇｅｓ）ら（クリニカル・ケミストリー・アンド・ラボラトリー・メディシン（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）３８、５１９〜２３頁、２０００）およびマードック（Ｍｕｒｄｏｃｈ）ら（ハート（Ｈｅａｒｔ）７８、５９４〜７頁、１９９７）は、ＢＮＰは特定の血液由来サンプル中では、または血液が特定の条件下で採取される場合には安定であると報告している。シミズらによるより最近の報告（クリニカ・ケミカ・アクタ３１６、１２９〜３５頁、２００２）では、全血中のＢＮＰの９４％が、２アミノ末端残基が除去されている消化型であったこと、および血漿中のＢＮＰはいくつかの未同定の型に分解されていたことが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は幾分かは、サンプル中の生物活性ナトリウム利尿ペプチド、またはその断片の存在または量を調べるよう設計された組成物および方法に関する。ナトリウム利尿ペプチドの分解は、特に、ナトリウム利尿ペプチドの組織への放出の誘引となるイベントの発生とサンプルを得るか分析する時間との間の経過時間、存在するタンパク質分解酵素の量などの関数であり得る進行中のプロセスである。この分解によって、生物学的機能が低下したか、これを失ったナトリウム利尿ペプチドの循環量が生じ得る（本明細書では、便宜上、ナトリウム利尿ペプチドの「不活性断片」と呼ぶ）。
【００１３】
１種以上のナトリウム利尿ペプチドのアッセイを設計する際に、この分解を考慮しないと、注目するナトリウム利尿ペプチドの生物活性型とナトリウム利尿ペプチドの不活性断片の双方を検出するアッセイとなる場合もある。これによって、実際、注目するナトリウム利尿ペプチドが実際には不活性断片に分解されており、アッセイ結果が目的とする分析物をサンプル中に最初に存在する不活性断片のプールと区別できないことによって混乱している場合に、アッセイが特に良好な安定性を示す（すなわち、注目する分析物がサンプル貯蔵の間アッセイに対して失われない）という結論を導くことがある。生物活性型は被験体の生理学的状態とより相関がある場合があるため、また疾病を患っている被験体においてアップレギュレートされたタンパク質分解酵素が、非常に注目される可能性のある被験体において不活性断片の特に大きなプールをもたらす場合があるために、本明細書に記載された組成物および方法は、当業者に対し、生物活性型に特異的でないアッセイと比較して改善された診断および予後情報を提供できる。
【００１４】
本明細書に記載した方法および組成物は、当技術分野における、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および／または急性心筋梗塞をはじめとする種々の循環器疾患の診断および識別に用いるための、迅速で、感受性のある、特異的な診断アッセイの必要性を満たし得る。さらにまた、本発明の方法および組成物を用いて患者の治療を容易にし、さらなる診断および／または予後指標および指標パネルを開発できる。
【００１５】
その結果、第一の態様では、本発明は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の生物学的不活性断片からのシグナルは少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。生物学的不活性断片としては、生物活性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されたループが切断されているものが挙げられる。このような生物学的不活性断片は、例えば、生物活性ナトリウム利尿ペプチド中の１以上のペプチド結合を切断することによって形成され得る。
【００１６】
関連態様では、本発明は、無傷のナトリウム利尿ペプチドを検出するが、無傷のナトリウム利尿ペプチドのある部分、好ましくは、少なくともＮ末端部分が除去されると生じる等モル量のペプチドからのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。
【００１７】
種々の実施形態では、本発明は、ＢＮＰ77〜108を検出するが、等モル量のＢＮＰ94〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ90〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ81〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出する
が、ＢＮＰ79〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ77〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、および／またはＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ79〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００１８】
種々のさらなる実施形態では、本発明は、ＢＮＰ1〜76を検出するが、等モル量のＢＮＰ38〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ24〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ12〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ3〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ1〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、および／またはＢＮＰ1〜76検出するが、ＢＮＰ3〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００１９】
さらにその他のさらなる実施形態では、本発明は、ＡＮＰ99〜126を検出するが、等モル量のＡＮＰ113〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ105〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ102〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ99〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、および／またはＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ102〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＡＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００２０】
以下に説明するように、このようなアッセイは、当業者に公知の種々の方法で設計できる。好ましいアッセイはイムノアッセイであるが、他の方法も当業者に周知である（例えば、バイオセンサーの使用、または当技術分野で公知のナトリウム利尿ペプチドの天然受容体の使用）。適していれば、どんなイムノアッセイを利用してもよい。例えば、分析物結合を直接検出する（例えば、エリプソメーターによる検出によって）アッセイ、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイ、サンドイッチイムノアッセイなど。抗体と１種以上のナトリウム利尿ペプチド断片との特異的免疫学的結合は、直接的に検出しても間接的に検出してもよい。直接標識としては、抗体に付けた、蛍光または発光タグ、金属、色素、放射性核種などが挙げられる。間接標識としては、当技術分野で周知の種々の酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどが挙げられる。第２の分子、例えば、検出可能な標識に付着させた抗体を、本明細書では、「抗体コンジュゲート」と呼ぶ。また、当業者ならば、ナトリウム利尿ペプチドの天然受容体が存在すること、およびこれらの受容体もまた、結合アッセイの提供において、抗体と類似の方法で使用できることは理解されよう。
【００２１】
無傷のナトリウム利尿ペプチドと比較して、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片からは部分的にまたは完全に失われているエピトープと結合するよう選択された１種以上の抗体を用いるイムノアッセイを構築することができる。例えば、サンドイッチアッセイでは、固相に結合される抗体を、分子のＮ末端部分と優先的に結合するよう選択し、標識される抗体を、分子のＣ末端部分と結合するよう選択すれば、アッセイで分子のＮおよびＣ末端部分の双方を含む分子のみが検出される。あるいは、固相と標識した抗体の双方を、分子のＮ末端部分と結合するよう選択してもよい。
【００２２】
当業者ならば、ナトリウム利尿ペプチドの切断によって、抗体が結合するエピトープのすべてを除去することもできるということは理解されよう（例えば、抗体はＮ末端領域だけに結合する）。あるいは、エピトープは、分子の線状配列中では連続していないが、溶液中の３次元空間においては関連しているナトリウム利尿ペプチドの部分から形成される場合もあり、その結果、エピトープは、記載したアミノ酸残基よりも多くを含んでなるが、記載したアミノ酸残基の領域の除去の結果、抗体の結合が減少し、ひいてはアッセイにおいてシグナルが喪失する。
【００２３】
特定の実施形態では、抗体を、１種以上のナトリウム利尿ペプチドに対する個々の親和性に基づいてではなく、イムノアッセイなどの結合アッセイにおいて得られるシグナルに基づいて選択する。当業者ならば、種々の結合アッセイ形式が当技術分野で公知であること、および１種以上の標的分子に対する抗体の個々の親和性よりも重要である適当なアッセイを構築するための抗体の使用はよくあることであることは認識されよう。例えば、競合結合アッセイは、固体表面に結合している受容体（例えば、抗体）を含んでなる場合がある。試験サンプル中の注目する分析物は、同様に受容体と結合する標識された分子との結合と競合する。受容体と結合している標識された分子の量（したがって、アッセイシグナル）は、試験サンプル中の注目する分析物の量と反比例する。この場合には、固相に付着している単一抗体を用いる。あるいは、サンドイッチイムノアッセイでは、通常、固体表面と結合している一次抗体、および通常、検出可能な標識とコンジュゲートしている二次抗体の各々が、試験サンプル中の注目する分析物と結合する。受容体と結合している標識された分子の量（したがって、アッセイシグナル）は、試験サンプル中の注目する分析物の量と正比例する。
【００２４】
本発明のイムノアッセイは、生物活性ナトリウム利尿ペプチドと生物学的不活性ナトリウム利尿ペプチドを、および／または無傷のナトリウム利尿ペプチドとナトリウム利尿ペプチド断片とを識別するよう設計することが好ましい。例えば、好ましいイムノアッセイは、無傷のＮ末端領域を含んでなるナトリウム利尿ペプチドとＮ末端領域が失われているナトリウム利尿ペプチドの断片を識別する。イムノアッセイは、同一アッセイ条件下で第２群のポリペプチドの同数の分子から得られるシグナルより少なくとも５倍大きい、第１群のポリペプチドの結合に関連するシグナルをイムノアッセイが提供する場合に、第１群のポリペプチドと第２群のポリペプチド間を「識別する」と考えられており、アッセイを２度までしか実施しない場合には、第１群のポリペプチドの量は最大シグナルを得ることが必要である。このようなアッセイ条件下では、シグナルが少なくとも１０倍大きいことがより好ましく、少なくとも２０倍大きいことがさらにより好ましく、少なくとも５０倍大きいこと、少なくとも１００倍大きいこと、またはそれ以上が最も好ましい。そのようなアッセイ条件下で、第１群のポリペプチドの結合に関するシグナルが得られるが、第２群のポリペプチドの同数の分子からバックグラウンドを上回るシグナルが得られない場合、アッセイは第２群のポリペプチドを「感知できるほどに検出しない」。
【００２５】
もう１つの態様では、本発明は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。前記で論じたように、生物学的不活性断片としては、無傷のナトリウム利尿ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されるループが切断されているものが挙げられる。好ましい実施形態では、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端部分が除去されるとナトリウム利尿ペプチドから生じるペプチドとは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わる条件下でアッセイを実施する。
【００２６】
関連態様では、本発明は、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのある部分、好ましくは、少なくともＮ末端部分が除去されると生じるナトリウム利尿ペプチドの断片とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。
【００２７】
種々の実施形態では、本発明は、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ94〜106とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ90〜108とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ81〜108とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜108とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ77〜106とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、および／またはＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜106とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００２８】
種々のさらなる実施形態では、本発明は、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ38〜76とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ24〜76とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ12〜76とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜76とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ1〜73とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、および／またはＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜73とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００２９】
その他のさらなる実施形態では、本発明は、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ113〜126とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイ、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ105〜126とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ102〜126とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ99〜124とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、および／またはＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ102〜124とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＡＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００３０】
イムノアッセイからのシグナルは、抗体がシグナルが生じるのに必要な複合体の形成に関与する場合には、「抗体との結合に応じて変わる」と考えられている。例えば、固相抗体および二次抗体コンジュゲートを用いて構築されるサンドイッチイムノアッセイでは、その各々が分析物と結合してサンドイッチを形成しなくてはならず、固相抗体と二次抗体の各々がシグナルが生じるのに必要な複合体の形成に関与している。単一抗体を用い、分析物が分析物コンジュゲートと結合について競合する競合イムノアッセイでは、単一抗体がシグナルが生じるのに必要な複合体の形成に関与している。当業者ならば、多数のさらなるイムノアッセイの構築を提供できることを理解されよう。
【００３１】
本明細書に記載したアッセイ法はまた、１種以上のナトリウム利尿ペプチドに対するアッセイに先立ってサンプルを一定期間保存するステップを含んでなる。ナトリウム利尿ペプチドの分解は、保存中も進行するプロセスであり得るため、保存考慮は、分子のＮ末端部分の喪失を減少させるよう選択しなくてはならない。したがって、保存条件は、ナトリウム利尿ペプチド分解の１種以上の阻害剤の添加を含み得る。以下に論じるように、保存条件は中性エンドペプチダーゼの１種以上の阻害剤および／またはプロリル特異的ジペプチジルペプチダーゼの１種以上の阻害剤を含み得る。このような阻害剤は当技術分野では周知である。例えば、コルチら、サーキュレーション１０４、１８５６〜６２頁、２００１、センテン（Ｓｅｎｔｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・コンビナトリー・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５、３３６〜４４頁、２００３、センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）１２、２８２５〜８頁、２００２参照。代替法では、またはこのような阻害剤と併用して、保存条件は、低温での、好ましくは、サンプルの氷点よりも低い温度での保存を含み得る。
【００３２】
もう１つの態様では、本発明は、記載したアッセイを実施するために設定および準備されたアッセイ装置に関する。本明細書に記載したアッセイを実施するための装置は、複数の、個別の、独立した、アドレス可能な場所、すなわち、その各々が注目する個々の分析物または分析物のセットと関連し、そのうちの１種以上がナトリウム利尿ペプチドである「診断ゾーン」を含むことが好ましい。例えば、複数の個別のゾーンの各々が、異なる分析物を結合するための受容体（例えば、抗体）を含み得る。サンプルを装置で反応させた後、診断ゾーンからシグナルが生じ、結果、これは注目するペプチドの存在または量と相関し得る。
【００３３】
さらにもう１つの態様では、本明細書に記載した方法によって測定した、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を、疾病の有無、または疾病予後（例えば、疾病に関連する将来の有害転帰の可能性）と関連付けることができる。好ましい疾病としては、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および／または急性心筋梗塞をはじめとする種々の循環器疾患および脳血管疾患が挙げられる。これらの方法は、本明細書に記載した方法によって１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べることと、存在または量を注目する疾病または予後と関連付けることとを含んでなることが好ましい。
【００３４】
特定の実施形態では、アッセイから得られるシグナルを、１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量と関連付ける必要はなく、むしろ、シグナルを疾病の有無または疾病と関連する将来の有害転帰の可能性と直接関連付けることができる。例えば、シグナルｘのレベルは、ｙ ｐｇ／ｍＬのナトリウム利尿ペプチドがサンプル中に存在することを示し得る。次いで、そのナトリウム利尿ペプチドのｙ ｐｇ／ｍＬがうっ血性心不全を示すことが表から示され得る。どの程度のナトリウム利尿ペプチドが存在するかを決定せずに、シグナルｘのレベルをうっ血性心不全と直接的に単に関連付けることは、同等に有効であり得る。このようなシグナルは本発明の抗体を用いるイムノアッセイから得ることが好ましいが、当業者にはその他の方法も周知である。
【００３５】
さらにもう１つの態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドのアッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。これらの方法は、アッセイに用いると、注目する生物活性ナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない抗体を選択することを含んでなる。前述のように、生物学的不活性断片としては、無傷のナトリウム利尿ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されるループが切断されているものが挙げられる。
【００３６】
関連態様では、本発明は、アッセイに用いると、注目する無傷のナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドのある部分、好ましくは、Ｎ末端部分が除去されるとナトリウム利尿ペプチドから生じる同モル量のペプチドからのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、、好ましくは、これを感知できるほど検出しない抗体を選択することを含んでなる、アッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。
【００３７】
種々の実施形態では、本方法は、アッセイに用いるとＢＮＰ77〜108を検出するが、同モル量のＢＮＰ94〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ90〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ81〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ79〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ77〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ79〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００３８】
種々のさらなる実施形態では、本方法は、アッセイに用いるとＢＮＰ1〜76を検出するが、同モル量のＢＮＰ38〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ24〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ12〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ3〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ1〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ3〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００３９】
その他のさらなる実施形態では、本方法は、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ113〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ105〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ101〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ99〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはアッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ101〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４０】
その他の関連態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドのアッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。本方法は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。前記で論じたように、生物学的不活性断片としては、無傷のナトリウム利尿ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、もしくは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されたループが切断されているものが挙げられる。好ましい実施形態では、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端部分が除去されるとナトリウム利尿ペプチドから生じるペプチドとは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わる条件下でアッセイを実施する。
【００４１】
さらにその他の関連態様では、本発明は、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端部分が除去されると生じるナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片とは特異的に結合しない抗体を選択することを含んでなる、アッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。
【００４２】
種々の実施形態では、本方法は、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ94〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ90〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ81〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ77〜106とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜106とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４３】
種々のさらなる実施形態では、本方法は、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ38〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ24〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ12〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ1〜73とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜73とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４４】
その他のさらなる実施形態では、本方法は、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ113〜126とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ105〜126とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ101〜126とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ99〜124とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ101〜124とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４５】
もう１つの態様では、本発明の１種以上の抗体および／または抗体コンジュゲートを、ナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べるキットとして提供することもできる。これらのキットは、本明細書に記載したような少なくとも１種のアッセイを試験サンプルで実施するための装置および試薬を含んでなることが好ましい。このようなキットは、１種以上のこのような測定を実施するのに十分な試薬、および／または食品医薬品局（ＦＤＡ）承認表示を含むことが好ましい。
【００４６】
さらにもう１つの態様では、本発明は、患者に用いる治療計画を決定する方法に関する。この方法は、本明細書に記載した方法によって１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べることと、存在または量を疾病または予後状態と関連付けることとを含んでなることが好ましい。本明細書に論じたように、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、急性冠症候群、および／または急性心筋梗塞をはじめとする種々の循環器疾患および脳血管疾患の診断および識別は、ＡＮＰ、ＢＮＰ、および／またはＣＮＰレベルと関連付けることができる。診断または予後が得られると、治療計画がその診断と一致するよう選択される。
【００４７】
本発明のもう１つの目的は、ナトリウム利尿ペプチドを安定化する組成物および方法を提供することである。このような方法によって、特に循環器疾患の治療のための、ナトリウム利尿ペプチドの治療可能性が向上し得る。数種のナトリウム利尿ペプチド、例えば、プロ−ＢＮＰ、成熟ＢＮＰ、およびプロ−ＡＮＰは、最後から２番目のプロリン残基を含んでなり、プロリル特異的ジペプチジルジペプチダーゼ（「ＤＰＰ」）に適した基質である。したがって、成熟ＢＮＰは、ＡＮＰと比べ、中性エンドペプチダーゼによる分解に対して耐性を示すと報告されているが、ＤＰＰは、成熟ＢＮＰ分子の、ならびにプロ−ＢＮＰおよびプロ−ＡＮＰの、これまで認識されていない分解経路に相当し得る。さらに、プロリン含有ジペプチドの除去により、種々のナトリウム利尿ペプチドが、その他のペプチダーゼによるさらなる分解に対して開放される可能性がある。ナトリウム利尿ペプチド濃度の上昇によって利益を得ることができる被験体は、単独または中性エンドペプチダーゼ阻害剤と組み合わせた１種以上のＤＰＰの阻害剤で治療でき、かつ／またはナトリウム利尿ペプチドおよび／またはＤＰＰ安定性の上昇を示すナトリウム利尿ペプチド類似体で治療できる。さらに、被験体から採取したサンプル中のＢＮＰを、保存の間、これらの同様の阻害剤を用いて安定化することもできる。
【００４８】
したがって、一態様では、本発明は、１種以上のナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害する方法に関する。この方法は、１種以上のプロリル特異的ＤＰＰの阻害剤を、ナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害するのに十分な量で投与することを含んでなる。
【００４９】
もう１つの態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド機能の上昇を必要とする被験体、好ましくは、心不全を患っている被験体を治療する方法に関する。この方法は、１種以上のプロリル特異的ＤＰＰの阻害剤を被験体に、好ましくはナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害するのに十分な量で投与することを含んでなる。
【００５０】
特定の実施形態では、プロリル特異的ＤＰＰの阻害剤（類）は、プロ−ＢＮＰ、成熟ＢＮＰ、および／またはプロ−ＡＮＰが基質である１種以上のＤＰＰに対して選択性である。特異的ＤＰＰ阻害剤を設計および選択する方法は当技術分野では周知である。例えば、レイティング（ｌｅｉｔｉｎｇ）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）３７１、５２５〜３２頁、２００３、セド（Ｓｅｄｏ）ら、フィジオロジカル・リサーチ（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）５２、３６７〜７２頁、２００３、ビルハウアー（ｖｉｌｌｈａｕｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４６、２７７４〜８９頁、２００３、センテン（Ｓｅｎｔｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・コンビナトリー・ケミストリー５、３３６〜４４頁、２００３、センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ１２、２８２５〜８頁、２００２、ボルロー（Ｂｏｒｌｏｏ）およびメーステル（Ｍｅｅｓｔｅｒ）、フェアハンドリンゲン−コニンクリーエ・アカデミー・フォア・ゲネースクンデ・ファン・ベルギーエ（Ｖｅｒｈａｎｄｅｌｉｎｇｅｎ−Ｋｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ａｃａｄｅｍｉｅ ｖｏｏｒ Ｇｅｎｅｅｓｋｕｎｄｅ ｖａｎ Ｂｅｌｇｉｅ）５６、５７〜８８頁、１９９４参照。さらに、ＤＰＰは、アンチセンスまたはＲＮＡｉ構築物によってなど、当業者に公知の方法によって発現レベルで阻害できる。ＤＰＰはまた、結合タンパク質、例えば、１種以上のＤＰＰと特異的に結合し、ナトリウム利尿ペプチド基質に対するその活性を妨げる抗体またはその断片の使用によっても阻害できる。
【００５１】
本明細書に記載した方法は、１種以上のプロリル特異的ＤＰＰ阻害剤単独での使用を含んでなる場合もあるし、このような阻害剤を、１種以上の中性エンドペプチダーゼの阻害剤および／またはその他のプロテアーゼ阻害剤と、ならびに／あるいはプロリル特異的ＤＰＰ阻害剤の不在下での中性エンドペプチダーゼの阻害剤の使用および／または外因的に加えたナトリウム利尿ペプチドと比較してナトリウムペプチド機能の上昇を増強するよう、被験体に外因的に加えた１種以上のナトリウム利尿ペプチドと組みあせてもよい。これらの化合物は薬剤組成物の一部として提供できることが好都合である。
【００５２】
好ましい実施形態では、本明細書に記載した治療法を受ける被験体は、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および／または急性心筋梗塞からなる群から選択される疾病を患っている。特に好ましい実施形態では、本明細書に記載した治療法を受ける被験体は、ＢＮＰレベルに基づいて選択される。例えば、被験体は、少なくとも約８０ｐｇ／ｍＬという治療を受ける前の血漿ＢＮＰレベルに基づいて選択でき、少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬが好ましく、少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬがさらにより好ましく、少なくとも約５００ｐｇ／ｍＬがいっそうより好ましく、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬが最も好ましい。
【００５３】
さらにもう１つの態様では、本発明は、プロリル特異的ＤＰＰの存在下で安定性の上昇をもたらす（例えば、被験体の血中の注目するナトリウム利尿ペプチドのｔ1/2の増加によって測定されるような）ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の類似体を投与することを含んでなる、ナトリウム利尿ペプチド機能の上昇を必要とする被験体を治療する方法に関する。
【００５４】
本発明のさらにもう１つの目的は、グリコシル化されている、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べる方法および組成物を提供することである。グリコシル化されたナトリウム利尿ペプチド中の共有結合している糖鎖残基は、種々のアッセイ法のこのようなペプチドを検出する能力に対して実質的な影響を及ぼし得る。アッセイ条件を注意深く選択することによって、このような影響を軽減することができ、その結果、サンプル中の注目するナトリウム利尿ペプチドの存在または量を表すアッセイ結果が得られる。
【００５５】
したがって、もう１つの態様では、本発明は、共有結合している糖鎖残基を含んでなる、サンプル中の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。これらの方法は、１種以上の注目する前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去することと、サンプルを注目するナトリウム利尿ペプチドについてアッセイすることとを含んでなる。したがって、アッセイ結果は、前記サンプル中の注目する前記ナトリウム利尿ペプチドの存在または量に関する。種々の実施形態では、１種以上のナトリウム利尿ペプチドから、ペプチドの酵素処理によって、ペプチドの非酵素的化学処理によって、またはこれらの方法の組合せによって共有結合している糖鎖残基を除去できる。
【００５６】
ＮおよびＯ−結合型糖鎖残基を除去する有効な酵素的方法は、当技術分野では周知であり、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−グリコシダーゼとしても知られる）、エンドグリコシダーゼＨ、エンドグリコシダーゼＡ、Ｏ−グリカナーゼ（エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとしても知られる）、α２−（３，６，８，９）−ノイリミニダーゼ（ｎｅｕｒｉｍｉｎｉｄａｓｅ）、β（１，４）−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、および／またはエンドグリコシダーゼＦ3などの酵素を用いる。この羅列は限定しようとするものではない。
【００５７】
共有結合している糖鎖残基をペプチドから除去するための非酵素的化学処理の場合には、非還元Ｏ−およびＮ−結合型オリゴ糖の放出にヒドラジン加水分解が有効であるとわかっている。約６０℃でのＯ−結合型オリゴ糖の最初の穏やかなヒドラジン分解と、それに続く約９５℃でのＮ−結合型オリゴ糖のヒドラジン分解によって、オリゴ糖の選択的および順次的放出を達成できる。例えば、パテール（Ｐａｔｅｌ）およびラレク（Ｒａｒｅｋｈ）、メソッヅ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ）２３０、５８〜６６頁、１９９４参照。しかしながら、このような処理の結果、ポリペプチドが破壊されることもある。穏やかな塩基環境においてアルカリ性水素化ホウ素ナトリウムを利用する、Ｏ−結合型オリゴ糖のアルカリ−β−脱離が好ましい場合がある。例えば、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）：ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、フクダ，Ｍおよびコバタ，Ａ編、２９１〜３２８頁、ＩＲＬ／オックスフォード大学出版、オックスフォード、１９９３参照。さらに、トリフルオロメタンスルホン酸加水分解を用いてもよい。この方法は通常、無傷のポリペプチドを残すが、グリカンの破壊をもたらす。例えば、エッジ（Ｅｄｇｅ）、バイオケミカル・ジャーナル３７６、３３９〜５０頁、２００３参照。
【００５８】
ペプチドからの糖除去についての前述の方法は、天然（非変性）ポリペプチドで、および／またはポリペプチドの変性後に使用できる。酵素的処理であろうと、非酵素的処理であろうと、または双方の処理であろうと、処理を用いてナトリウム利尿ペプチドから共有結合している糖鎖残基を除去し、この処理によって注目する１種以上の、好ましくはすべてのグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドから、少なくとも約５０％の糖鎖残基が除去されることが好ましく、少なくとも約６０％がより好ましく、少なくとも約７０％がいっそうより好ましくは、少なくとも約８０％がさらにより好ましく、少なくとも約９０％〜約１００％が最も好ましい。ポリペプチドのグリコシル化度は、ポリペプチドの見かけの質量をポリペプチドのアミノ酸成分の質量と比較し、見かけの質量の差し引き分がグリコシル化によるものであると仮定することによって求めることができる。その他の修飾（例えば、酸化、ニトロ化、リン酸化）が起こっていることがわかっている事象では、これら他の修飾による質量も見かけの質量から差し引くことができる。その結果、脱グリコシル化処理後のポリペプチドの見かけの質量を測定することによって、糖鎖残基の除去度をモニターすることができる。ポリペプチドの見かけの質量を測定する方法（例えば、ＳＤＳゲル電気泳動、分析用遠心、ゲル浸透クロマトグラフィー、質量分析など）は、当業者には周知である。
【００５９】
このようなグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドを含むサンプルが、その用語が本明細書で定義される試験サンプルであり得る。このようなサンプル中に存在するグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドは、患者から得たサンプル中など、天然に存在するものである場合もあるし、標準サンプルである場合もある。このような標準を構築するのに用いるナトリウム利尿ペプチドは、活性なグリコシル化機能を含む哺乳類組織培養系における組換えによって発現されることが多い。
【００６０】
脱グリコシル化ステップ後、本明細書に記載した方法では、当技術分野で公知のどんなアッセイ法も用いることができる。このようなアッセイ法では、アフィニティー分離、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、液体クロマトグラフィー、および／またはＨＰＬＣなどの分離法を用いて注目する分析物を検出に向けて分離することができる。好ましい実施形態では、種々のサンドイッチ、競合、または非競合アッセイ形式のアフィニティー分離にイムノアッセイ装置および方法を用い、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量と関連のあるシグナルを生じさせることが多い。さらに、特定の方法および装置、例えば、バイオセンサーおよび光学的免疫測定法を用いて、標識された分子を必要とすることなく、分析物の存在または量を調べることもできる。
【００６１】
さらに、アッセイ法の一部として質量分析法を用いることも有利であり得る。本明細書において、用語「質量分析」または「ＭＳ」とは、イオンをその質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づいて、選別、検出および測定する方法を指す。一般に、注目する１種以上の分子をイオン化し、続いてそのイオンを質量分析機器に導入し、そこで磁場と電場の組合せによって、イオンが質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に応じて変わる空間中の経路をたどる。例えば、「マス・スペクトロメトリー・フロム・サーフェシズ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」と題された米国特許第６，２０４，５００号、「メソッヅ・アンド・アパラタス・フォー・タンデム・マス・スペクトロメトリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」と題された同６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ・ダイグノスティクス・ベースド・オン・マス・スペクトロメトリー（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｍｅｔｒｙ）」と題された同６，２６８，１４４号、「サーフェス−エンハンスド・フォトラバイル・アタッチメント・アンド・リリース・フォー・デソープション・アンド・デテクション・オブ・アナリテス（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ）」と題された同６，１２４，１３７号、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、「プロテインチップ・サーフェス・エンハンサー・レーザー・デソープション／イオニゼーション（ＳＥＬＤＩ）マス・スペクトロメトリー：ア・ノベル・プロテイン・バイオチップ・テクノロジー・フォー・デテクション・オブ・プロステート・キャンサー・バイオマーカーズ・イン・コンプレックス・プロテイン・ミクスチャー（Ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ （ＳＥＬＤＩ） ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ）」、プロステート・キャンサー・アンド・プロスタティック・ディジーズ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）２、２６４〜７６頁（１９９９）およびマーチャント（Ｍａｒｃｈａｎｔ）およびワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）、「リーセント・アドバンスメント・イン・サーフェス−エンハンスド・レーザー・デソープション／イオニゼーション−タイム・オブ・フライト−マス・スペクトロメトリー（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」、エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）２１、１１６４〜６７頁（２０００）参照、なおその各々は参照により、すべての表、図および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。試験サンプル中の分子（例えば、ペプチド）は、当業者に公知のいずれの方法でイオン化してもよい。これらの方法としては、それだけには限らないが、電子イオン化、化学イオン化、高速原子衝撃、電界脱離、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）、表面増強レーザー脱離イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）、光子電離、エレクトロスプレー、および誘導結合プラズマが挙げられる。
【００６２】
特定の実施形態では、前記で論じたＭＳ法を、アフィニティー精製ステップ、例えば、注目する１種以上のポリペプチドと特異的に結合する抗体との結合と組み合わせることが好ましい。例えば、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）６７、１１５３頁、１９９５、タブス（Ｔｕｂｂｓ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８９、２６頁、２００１、ニーダーコフラー（Ｎｉｅｄｅｒｋｏｆｌｅｒ）ら、アナリティカル・ケミストリー７３、３２９４頁、２００１参照。
【００６３】
糖タンパク質の一特徴として、特有のグリカンの不均一性がある。所与の糖タンパク質の個々の分子が、ポリペプチド鎖中の同じ付着部位に異なる糖鎖を有することは極めて一般的なことである。糖鎖残基中の構造変化はいずれも、グリコフォームと呼ばれる個別の分子サブセットの形成をもたらす。種々の分離法の場合には、このような不均一性が、注目する種々のポリペプチドの電荷および質量の差、および／または注目する種々のポリペプチドの結合マトリックス（例えば、抗体）との結合の差により分析を実施的に困難にする場合がある。さらに、糖鎖は、容易にプロトン化され得るタンパク質などの化合物と同程度には効率よくイオン化されず、また効率よく気相に運ばれないと思われる。
【００６４】
したがって、好ましい実施形態では、本明細書に記載した方法は、同一のアッセイステップを、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去せずに実施することと比較して、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの検出の増加を提供する。本明細書において、用語「検出の増加」とは、注目する１種以上の特定のナトリウム利尿ペプチドのアッセイ法から得られるシグナルの増加を指す。このようなシグナルの増加は、注目するすべてのナトリウム利尿ペプチドを検出する能力の上昇を表すものであり得る。例えば、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの特定のグリコシル化型とは結合できない抗体は、そういったナトリウム利尿ペプチドの濃度を過小評価するアッセイシグナルをもたらし、あるいは、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの特定のグリコシル化型の効率の悪いイオン化が、そういったナトリウム利尿ペプチドの濃度を過小評価するＭＳによるアッセイシグナルをもたらす。脱グリコシル化は、アッセイシグナルの増加をもたらし得る。このようなシグナルの増加はまた、注目するナトリウム利尿ペプチドの１種以上の具体的な型を検出する能力の上昇を表すものであり得る。例えば、グリカンの不均一性は、分離法（例えば、質量および／または電荷に基づくもの）において単一ポリペプチドの複数の異なる画分への分離をもたらし得る。脱グリコシル化は、そのような異なる画分の単一画分への併合をもたらし、その結果、その画分のアッセイシグナルの向上を提供し得る。
【００６５】
種々の実施形態では、同一アッセイステップを、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去しないで実施することと比べて、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチド検出の増加を、少なくとも約５％、より好ましくは、少なくとも約１０％、いっそうより好ましくは、少なくとも約２０％、さらにより好ましくは、少なくとも約５０％、いっそうより好ましくは、少なくとも１００％、最も好ましくは、少なくとも約２００％以上増加するアッセイシグナルによって測定する。
【００６６】
特に好ましい実施形態では、注目するナトリウム利尿ペプチドはＢＮＰおよび／または１種以上のその関連断片である。用語「関連断片」は、以下に定義する。好ましいＢＮＰ関連断片は、プロ−ＢＮＰ（ＢＮＰ1〜108）、ＮＴ−プロＢＮＰ（ＢＮＰ1〜76）、ＢＮＰ3〜108、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ79〜108からなる群から選択されるものを含んでなる。この羅列は限定しようとするものではない。
【００６７】
関連態様では、本発明は、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドに共有結合している糖鎖残基の存在（または不在）に感受性があるか、感受性がないのいずれかである抗体を選択および使用する方法に関する。抗体は、注目する１種以上のグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドと結合する能力についてスクリーニングでき、その結合を、１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと結合する能力と比較することができる。この基準によって実質的に同一の結合を提供する抗体は、「感受性がない」抗体に相当する。この基準によって、グリコシル化型または脱グリコシル化型について実質的に同一でない結合を提供する抗体は、「感受性のある」抗体に相当する。このような抗体を、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドを検出するためのアッセイ法に用いるために選択すればよい。
【００６８】
これに関連して、用語「１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去」は、必ずしも、ポリペプチドから既存の糖鎖残基を除去するための酵素的または非酵素的化学処理の使用を指すものではない。そうではなく、１種以上の共有結合している糖鎖残基を欠くポリペプチドを作製する方法であれば、どんな方法も包含することを意味する。例えば、固相合成法を用いて、このような抗体スクリーニング法に用いるために、すべての糖鎖残基を含まないポリペプチドを作製することもできる。本明細書に記載したスクリーニング法において用いるためには、少なくとも約５０％の糖鎖残基が、注目する１種以上の、好ましくはすべてのグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドから除去されることが好ましく、少なくとも約６０％がより好ましく、少なくとも約７０％がいっそうより好ましく、少なくとも約８０％がさらにより好ましくは、少なくとも約９０％〜約１００％が最も好ましい。
【００６９】
用語「実質的に同一の結合」とは、アッセイに用いると、前記のスクリーニング比較において、互いに約２倍以内であるシグナルを提供する抗体を指す。１倍はシグナルが同等であることを示し、シグナルが２倍以内であることは一方のシグナルが他方のシグナル×２以下であることを示す。実質的に同一の結合を示す抗体は、約１．７５倍以内であるシグナルを提供することが好ましく、約１．５倍以内がより好ましく、約１．２５倍以内がいっそうより好ましく、約１．１〜１倍以内であることが最も好ましい。
【００７０】
このような抗体はまた、注目する１種以上のグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドに対して、１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと比較して「実質的に同一の親和性」を有し得る。１倍とは親和性が等しいことを示し、親和性が２倍以内であるということは、一方の親和性が他方のシグナル×２以下であることを示す。実質的に同一の結合を示す抗体は、約１．７５倍以内である親和性を提供することが好ましく、約１．５倍以内がより好ましく、約１．２５倍以内がいっそうより好ましく、約１．１〜１倍以内が最も好ましい。
【００７１】
前述した本発明の要旨は限定するものではなく、本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ジペプチジルぺプチダーゼの阻害剤の不在下（パネルＡおよびＣ）、および存在下（パネルＢおおよびＤ）での、ヒト血清中のＢＮＰおよびその分解産物のマススペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、幾分か、生物活性（例えば、全長）ナトリウム利尿ペプチドを、そのナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性型と識別する方法に関する。本明細書に記載したように、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを選択的に認識する抗体を作製し、サンプル中の不活性なナトリウム利尿ペプチド断片の存在によって引き起こされる不正確さを低下させたアッセイに用いることができる。
【００７４】
本明細書において、用語「ナトリウム利尿ペプチド」とは、身体においてレニン−アンギオテンシン系の活性に対抗するよう作用する天然に生じるポリペプチドホルモン群のメンバー、およびその生合成前駆体および生物活性断片を指す。３つの主要なヒトナトリウム利尿ペプチドがある：心房で合成される、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、心室で合成される、脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、および脳で合成される、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）。
【００７５】
本明細書において、用語「無傷のナトリウム利尿ペプチド」とは、全長プレ−プロ−ナトリウム利尿ペプチド、全長プロ−ナトリウム利尿ペプチド、全長成熟ナトリウム利尿ペプチド、および／または生合成の間のプレ−プロ−またはプロ−ナトリウム利尿ペプチドのプロセシングの際に除去される全長部分を指す。例えば、ＢＮＰの場合には、用語「無傷のナトリウム利尿ペプチド」は、全長３２アミノ酸成熟ＢＮＰホルモン、全長１３４アミノ酸プレ−プロ−ＢＮＰ分子、全長１０８アミノ酸プロ−ＢＮＰ分子、全長７６アミノ酸ＮＴ−プロＢＮＰ分子、および／または全長２６アミノ酸「プレ」ペプチドを包含する。
【００７６】
ヒト１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体プロ−ＢＮＰ（ＢＮＰ1〜108）の配列を配列番号１として示す。成熟、全長ＢＮＰ（ＢＮＰ77〜108）には下線が引かれている。
【化１】
（配列番号１）
【００７７】
ヒトＢＮＰ1〜108は、配列番号２として示される配列を有する大きな前駆体プレ−プロ−ＢＮＰとして合成される（「プレ」配列は太字で示されている）：
【化２】
（配列番号２）
【００７８】
１２６アミノ酸ヒトＡＮＰ前駆体プロ−ＡＮＰ（ＡＮＰ1〜126）の配列を配列番号３として示す。成熟、全長ＡＮＰ（ＡＮＰ99〜126）には下線が引いてある：
【化３】
（配列番号３）
【００７９】
ヒトＡＮＰ1〜126は、配列番号４で示される配列を有する大きな前駆体プレ−プロ−ＡＮＰとして合成される（「プレ」配列は太字で示されている）：
【化４】
（配列番号４）
【００８０】
１２６アミノ酸ヒトＣＮＰ前駆体プロ−ＣＮＰ（ＣＮＰ1〜126）の配列を配列番号５として示す。全長成熟ＣＮＰ型ＣＮＰ−５３（ＣＮＰ74〜126）は斜体字で示し、全長成熟
ＣＮＰ型ＣＮＰ−２２（ＣＮＰ105〜126）には下線が引いてある：
【化５】
（配列番号５）
【００８１】
本明細書において、用語「断片」とは、断片が由来するポリペプチドの少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるが、完全な親ポリペプチドよりも小さいポリペプチドを指す。したがって、プロ−ＢＮＰ（ＢＮＰ1〜108）の断片とは、ＢＮＰ1〜108の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、成熟ＢＮＰの断片とは、ＢＮＰ77〜108の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＢＮＰの成熟ＢＮＰへの切断によって生じるポリペプチドの断片とは、ＢＮＰ1〜76の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指す。同様に、プロ−ＡＮＰ（ＡＮＰ1〜126）の断片とは、ＡＮＰ1〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、成熟ＡＮＰの断片とは、ＡＮＰ99〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＡＮＰの成熟ＡＮＰへの切断によって生じるポリペプチドの断片とは、ＡＮＰ1〜98の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＣＮＰ（ＣＮＰ1〜126）の断片とは、ＣＮＰ1〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、成熟ＣＮＰの断片とは、ＣＮＰ74〜126またはＣＮＰ105〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＣＮＰの成熟ＣＮＰへの切断によって生じるポリペプチドの断片とは、ＣＮＰ1〜73またはＣＮＰ1〜104の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、断片とは、断片が由来するポリペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸、断片が由来するポリペプチドの少なくとも１５個の連続するアミノ酸、または断片が由来するポリペプチドの少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指す。
【００８２】
本明細書において、用語「関連断片」とは、個々のポリペプチドのまたはその生合成親の１種以上の断片であって、ポリペプチド自体の代理として、または独立マーカーとして検出できるものを指す。例えば、ヒトＢＮＰは、以下、ＢＮＰ1〜108と呼ぶ、１０８アミノ酸前駆体分子のタンパク質分解によって得られる。成熟ＢＮＰまたは「ＢＮＰナトリウム利尿ペプチド」または「ＢＮＰ−３２」は、この前駆体のアミノ酸７７〜１０８に相当する３２アミノ酸分子であり、これはＢＮＰ77〜108と呼ぶことができる。残りの残基１〜７６は、以下、ＢＮＰ1〜76と呼ぶ。ＢＮＰ1〜108およびＢＮＰ1〜76は「ＢＮＰ関連断片」の例である。
【００８３】
本明細書において、用語「Ｎ末端部分の除去によって形成される断片」とは、ナトリウム利尿ペプチド断片に関しては、無傷のペプチドのアミノ末端からの１個以上のアミノ酸の除去によって形成される無傷のナトリウム利尿ペプチドの断片を指す。好ましい実施形態では、このような断片は、無傷のペプチドのアミノ末端からの、少なくとも２、３、４、５、７、１０、１５、２０個、またはそれより多いアミノ酸の除去によって形成される。
【００８４】
本明細書において、用語「生物活性」とは、ナトリウム利尿ペプチドおよびその断片に関しては、全長成熟ナトリウム利尿ペプチド、またはロペスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２７２、２３０６４〜２３０６８頁、１９９７に記載されたように測定される、単離し前収縮させたマウス大動脈輪において全長成熟ナトリウム利尿ペプチドによって示される血管緊張低下作用の少なくとも５０％を示す、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドまたはその前駆体分子に由来するポリペプチドを指す。生物活性ナトリウム利尿ペプチドとしては、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドの断片、またはその前駆体型もしくは断片が挙げられる。
【００８５】
本明細書において、用語「生物学的不活性」とは、ナトリウム利尿ペプチド断片に関しては、前述の「生物活性」でない、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドまたはその前駆体に由来するポリペプチドを指す。本明細書において、用語「生物学的不活性」は、必ずしも、すべての生物活性の完全な喪失を指すものではない。むしろ「生物学的不活性」ナトリウム利尿ペプチド断片は、無傷のナトリウム利尿ペプチドの１以上の生物学的機能の５０％未満を示すことが好ましく、２５％未満が好ましく、１０％未満がより好ましく、１％未満が最も好ましい。この生物学的機能とは、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドによって示されるものと比較される、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｒｉｎｏｌｏｇｙ）１６７、２３９〜４６頁、２０００に記載されたように測定できる受容体結合、シメカケら、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）３０９、１８５〜９頁、１９９２に記載されたように測定できる培養ラット大動脈平滑筋細胞におけるｃＧＭＰ産生、および／またはロペスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２７２、２３０６４〜２３０６８頁、１９９７に記載されたように測定される、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドによって示される単離し前収縮させたマウス大動脈輪における血管緊張低下作用であり得る。
【００８６】
本明細書において、用語「グリコシル化」とは、ポリペプチドに関しては、共有結合している糖ユニットを、多くの場合グリカン鎖の形で含んでなるポリペプチドを指す。個々の糖ユニットは本明細書では、「共有結合している糖鎖残基」と呼ぶ。真核生物では、ポリペプチドのグリコシル化は、主としてアスパラギン側鎖とのグリコシド結合を介して（「Ｎ−結合型」）、セリンまたはスレオニン側鎖グリコシド結合を介して（「Ｏ−結合型」）起こり、または、糖鎖橋を介してポリペプチドがホスファチジルイノシトール脂質のアンカーと結合する場合もある（ＧＰＩ−結合型）。
【００８７】
本明細書において、用語「脱グリコシル化」とは、ポリペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去する方法を指す。すべての共有結合している糖鎖残基の除去が好ましいが、ポリペプチドは、いずれかの共有結合している糖鎖残基が除去されれば脱グリコシル化されたと考えられる。酵素処理、非酵素的処理、または２種の組合せを用いて、ポリペプチドから共有結合している糖鎖残基を除去することができる。ポリペプチドから少なくとも約５０％の糖鎖残基が除去されるのが好ましく、少なくとも約６０％がより好ましく、少なくとも約７０％がいっそうより好ましく、少なくとも８０％がさらにより好ましく、少なくとも約９０％〜約１００％が最も好ましい。
【００８８】
本明細書において、用語「精製された」とは、ポリペプチドに関しては、完全な純度を必要とするものではない。そうではなく、注目するポリペプチドが、その他のタンパク質と比較して多量のもの（質量ベースで）が生体サンプル中よりも多い、個別の環境中にあることを示すものに相当する。「個別の環境」とは、単一媒体、例えば、単一溶液、単一ゲル、単一沈殿物などを意味する。精製されたポリペプチドは、例えば、実験室合成、クロマトグラフィー、分取電気泳動、遠心分離、沈殿、アフィニティー精製などをはじめとするいくつかの方法によって獲得できる。注目する１種以上の「精製された」ポリペプチドは、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも１０％であることが好ましい。１種以上の「実質的に精製された」ポリペプチドは、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも５０％であり、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも７５％がより好ましく、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも９５％が最も好ましい。タンパク質含量は、ハートリー（Ｈａｒｔｒｅｅ）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４８、４２２〜４２７頁（１９７２）に記載された、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として用いるローリー（Ｌｏｗｒｙ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー１９３、２６５頁、１９５１の方法の改変を用いて求める。
【００８９】
本明細書において、用語「抗体」とは、抗原またはエピトープと特異的に結合できる免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子類またはその断片に由来する、それらをモデルとする、またはそれらによって実質的にコードされるペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、ファンダメンタル・イムノロジー（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３版、Ｗ．Ｅ．ポール（Ｐａｕｌ）ら、ラベン・プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ．Ｙ．（１９９３）、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、（１９９４）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）１７５、２６７〜２７３頁、ヤームッシュ（Ｙａｒｍｕｓｈ）（１９９２）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル・メソッヅ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）２５、８５〜９７頁参照。用語抗体は、抗原と結合する能力を保持する抗原結合性部分、すなわち、「抗原結合性部位」（例えば、断片、配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ，ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合している２つのＦａｂ断片を含んでなる二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（ワード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４１、５４４〜５４６頁）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。単鎖抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および分子生物学的技術によって（例えば、ファージディスプレイ法によって）得られる抗体も、参照により用語「抗体」に含まれる。好ましい抗体は「オムニクローナル」抗体である。これは、各抗体が標的抗原と１０9Ｍ-1〜１０10Ｍ-1という最小親和性で特異的に結合する、ファージディスプレイライブラリーから選択された種々の抗体分子の混合物を意味する。
【００９０】
用語「特異的に結合する」は、抗体が目的とする標的のみと結合することを示すことを意図するものではない。むしろ、抗体は、その目的とする標的に対するその親和性が、非標的分子に対するその親和性と比較して約５倍大きい場合に「特異的に結合する」。標的分子に対する抗体の親和性が、非標的分子に対するその親和性よりも少なくとも約５倍大きいことが好ましく、１０倍が好ましく、２５倍がより好ましく、５０倍がいっそうより好ましく、１００倍以上が最も好ましい。好ましい実施形態では、抗体またはその他の結合因子と抗原との間の特異的結合とは、少なくとも１０6Ｍ-1の結合親和性を意味する。少なくとも約１０7Ｍ-1の親和性で結合する抗体が好ましく、約１０8Ｍ-1〜約１０9Ｍ-1、約１０9Ｍ-1〜１０10Ｍ-1または約１０10Ｍ-1〜約１０11Ｍ-1の間が好ましい。
【００９１】
親和性は、Ｋd＝ｋoff／ｋonとして算出する（Ｋoffは解離速度定数、ｋonは会合速度定数であり、Ｋdは平衡定数である）。親和性は、平衡時に種々の濃度（ｃ）で標識したリガンドの結合している画分（ｒ）を測定することによって求めることができる。データはスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）方程式：ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）を用いてグラフ化する：
式中、
ｒ＝平衡時の結合しているリガンドのモル／受容体のモル、
ｃ＝平衡時の遊離リガンド濃度、
Ｋ＝平衡会合定数、および
ｎ＝受容体分子当たりのリガンド結合部位の数。
図解法によってｒ／ｃをＹ軸にｒをＸ軸にプロットし、このようにしてスカッチャードプロットを得る。線の負の傾斜が親和性となる。ｋoffは、結合している標識されたリガンドを標識されていない過剰のリガンドと競合させることによって求めることができる（例えば、米国特許第６，３１６，４０９号参照）。ターゲッティング因子の、その標的分子に対する親和性は、少なくとも約１×１０-6モル／リットルであることが好ましく、少なくとも約１×１０-7モル／リットルであることがより好ましく、少なくとも約１×１０-8モル／リットルであることがいっそうより好ましく、少なくとも約１×１０-9モル／リットルであることがさらにいっそうより好ましく、少なくとも１×１０-10モル／リットルであることが最も好ましい。スカッチャード分析による抗体親和性測定は当技術分野では周知である。例えば、ヴァン・エルプ（ｖａｎ Ｅｒｐ）ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）１２、４２５〜４３頁、１９９１、ネルソン（Ｎｅｌｏｓｏｎ）およびグリズウォルド（Ｇｒｉｓｗｏｌｄ）、コンピュータ・メソッヅ・アンド・プログラムス・イン・バイオメディシン（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）２７、６５〜８頁、１９８８参照。
【００９２】
本明細書において、用語「個別の」とは、連続していない表面の領域を指す。すなわち、いずれかの領域の一部ではない境界線が２つの領域の各々を完全に取り囲む場合に、２つの領域は互いに個別である。本明細書において、用語「独立してアドレス可能である」とは、特異的シグナルが得られる表面の個別の領域を指す。当業者ならば、抗体ゾーンも互いに独立であり得るが、表面で互いに接触している場合もあることは理解するであろう。
【００９３】
本明細書において、用語「試験サンプル」とは、注目する１種以上の分析物の存在または量が未知であり、アッセイ、好ましくは、イムノアッセイにおいて調べられようとするサンプルを指す。試験サンプルは、被験体、例えば、患者の、診断、予後診断、または評価目的で得られた体液であることが好ましい。特定の実施形態では、このようなサンプルは、進行中の症状の結果または症状に対する治療計画の作用を調べる目的で得る場合がある。好ましい試験サンプルとしては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿および唾液が挙げられる。さらに、当業者であれば、試験サンプルの中には分画または精製手順、例えば、全血の血清または血漿成分への分離の後により容易に解析できるものもあるということは理解されよう。好ましいサンプルは細菌、ウイルスおよび動物、例えば、イヌおよびネコから得ることができる。特に好ましいサンプルはヒトから得られる。対照目的で、「標準サンプル」とは、注目する１種以上の分析物の存在または量が、１種以上の分析物をアッセイする前に既知であるサンプルを指す。
【００９４】
本明細書において、用語「疾病サンプル」とは、所与の疾病を患っていると調べられている被験体から得た組織サンプルを指す。臨床診断の方法は当業者には周知である。例えば、ケリーズ・テキストブック・オブ・インターナル・メディシン（Ｋｅｌｌｙ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第４版、リッピンコット・ウィリアムス＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ペンシルバニア州、フィラデルフィア、２０００、ザ・メルク・マニュアル・オブ・ダイアグノシス・アンド・セラピー（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１７版、メルク・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）編、ニュージャージー州、ホワイトハウス・ステーション（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ）、１９９９参照。
【００９５】
用語「プロリル特異的ジペプチジルペプチダーゼ」または「プロリル特異的ＤＰＰ」とは、基質ポリペプチドのＮ末端からジペプチドを切断し、２番目の位置のプロリン（すなわち、ＮＨ２−Ｘ−ｐｒｏ−ペプチド−ＣＯＯＨ、ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｐｒｏと残りのペプチドの間の結合が切断される）に優先傾向を示すセリンプロテアーゼを指す。このようなプロテアーゼは通常、Ｅ．Ｃ．３．４．１４．Ｘ下、例えば、Ｅ．Ｃ．３．４．１４．５および３．４．１４．１１に分類される。ＤＰＰは、ＤＰＰ−ＩＩおよびＤＰＰ−ＩＶなどの種類に分類されることが多い。
【００９６】
本明細書において、用語「阻害剤」とは、酵素的（タンパク質分解性）活性に影響を及ぼす分子に関しては、必ずしも全酵素活性の完全な喪失を指さない。むしろ、「阻害剤」は酵素活性を、阻害剤の不在下で示される酵素活性の少なくとも１０％減少させ、少なくとも２５％がより好ましく、少なくとも５０％がいっそうより好ましく、少なくとも７５％がさらにより好ましく、少なくとも９０％が最も好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、当業者に周知の方法によって酵素活性を直接測定することによって阻害剤の活性を測定することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでも、阻害剤の活性を、酵素基質に対する酵素活性を直接測定することによって測定することができ、または分解酵素の場合には、基質の１／２が被験体（例えば、実験動物）の身体から排除される時間（Ｔ1/2）を求めることによって測定することができる。後者の場合には、「阻害剤」は、阻害剤の不在下で示されるＴ1/2と比較して、Ｔ1/2を少なくとも１０％延長し、少なくとも２５％がより好ましく、少なくとも５０％がいっそうより好ましく、少なくとも７５％がさらにより好ましく、少なくとも９０％が最も好ましい。
【００９７】
好ましい阻害剤は、プロテアーゼの特定のクラスに選択的である（例えば、ジペプチジルペプチダーゼに、またはジペプチジルペプチダーゼの特定のサブセットに選択的）。阻害剤は、プロテアーゼの特定のクラスを非標的プロテアーゼより少なくとも１０倍より多く阻害する場合に、そのクラスに「選択的」であると考えられており、少なくとも１００倍より多くがより好ましく、少なくとも１０００倍より多くが最も好ましい。種々のＤＰＰ種の選択的阻害剤が知られている。例えば、Ｈ−Ｄａｂ−Ｐｉｐは、ＤＰＰ ＩＶ（ＩＣ50＞１ｍＭ）（ＤＰＰ ＩＶ；ＥＣ３．４．１４．５．）を上回ってジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＤＰＰ ＩＩ；ＥＣ３．４．１４．２．）に選択的（＞７，６００倍）であると報告されている。センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ１２、２８２５頁、２００２。同様に１−［［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジンは、ＤＰＰ ＩＶの選択的、経口活性阻害剤であると報告されている。アーレン（Ａｈｒｅｎ）ら、ダイアベーツ・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）２５、８６９〜７５頁、２００２。
【００９８】
本明細書において、用語「約」は、所与の数の＋／−１０％を指す。
【００９９】
ナトリウム利尿ペプチド断片の、予後および診断マーカーとしての使用
【０１００】
前述のように、特定の疾病状態においてナトリウム利尿ペプチドの血中レベルの上昇が見られており、このことは、例えば、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および急性心筋梗塞などといった疾病の病態生理における役割を示唆するものである。例えば、ＷＯ０２／０８９６５７、ＷＯ０２／０８３９１３、ＷＯ０３／０１６９１０、ハントら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション２１４、１７７５〜８３頁、１９９５、ベヌゴパール（ｖｅｎｕｇｏｐａｌ）、ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマシー・アンド・セラピューティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）２６、１５〜３１頁、２００１、およびカーラ（Ｋａｌｒａ）ら、サーキュレーション１０７、５７１〜３頁、２００３参照、なお、それらの各々は、すべての表、図および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。ナトリウム利尿ペプチドは、単独で、集合的に、および／またはさらなるタンパク質とともに、種々の心血管の状態の疾病マーカーおよび予後の指標としても利用できる。
【０１０１】
循環からのナトリウム利尿ペプチドの除去は分解経路と関連していると報告されている。実際、特定の状況下でナトリウム利尿ペプチドを切断する中性エンドペプチダーゼの阻害剤が特定の循環器疾患の治療において期待できると示唆されている。例えば、トリンダージ（Ｔｒｉｎｄａｄｅ）およびルーロー（Ｒｏｕｌｅａｕ）、ハート・フェイリヤー・モニター（Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ）２、２〜７頁、２００１参照。しかし、臨床サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの測定は、通常、分子の分解状態を考慮しないで、ＢＮＰ、ＡＮＰおよび／またはＣＮＰ、それらの前駆体分子（すわなち、プロ−ＢＮＰ、プロ−ＡＮＰ、およびプロ−ＣＮＰ）、および成熟ナトリウム利尿ペプチドを提供するためのプロ型の切断に起因する断片の測定に焦点を当ててきた。また、ナトリウム利尿ペプチド中のメチオニン残基の酸化によって、還元型と比較して生物活性が低下すると報告されている。コヤマら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０３、４２５〜３２頁。本明細書に記載した目的には、メチオニン酸化型を分解産物と考えることができる。
【０１０２】
本発明は、ナトリウム利尿ペプチドの分解経路およびこの分解の際に形成される産物の理解をもって設計されていないアッセイは、サンプル中の個々のナトリウムペプチドの生物活性型を正確に測定しない場合があることを初めて記載する。注目する生物活性ナトリウム利尿ペプチドとナトリウム利尿ペプチドに由来する不活性断片双方の意図しない測定の結果、サンプル中の生物活性ナトリウム利尿ペプチド濃度を多く見積もる可能性がある。以下、主にＢＮＰ関連断片に関して記載するが、当業者ならば、本明細書に記載した一般概念をＡＮＰおよびＣＮＰ関連断片に等しく当てはまることは理解するであろう。
【０１０３】
１種以上のナトリウム利尿ペプチドの測定時に、臨床サンプル中に存在し得る種々のナトリウム利尿ペプチドおよびその断片の活性を考慮できないと、いずれかの診断または予後法の精度に重大な結果をもたらす可能性がある。例えば、サンドイッチイムノアッセイをＢＮＰに対して提供し、存在していた生物活性ＢＮＰの相当量（例えば、５０％）が今や不活性型に分解されている単純な場合を考えてみる。生物活性ＢＮＰと不活性断片に共通する領域と結合する抗体を用いて構築されたイムノアッセイでは、サンプル中に存在する生物活性ＢＮＰの量が２倍まで多く見積もられ、「偽陽性」結果をもたらす可能性がある。この不正確さは重篤な心不全の場合には特に関連があるが、これは中性エンドペプチダーゼ発現がこれらの患者において高まっていると報告されているためである。クネヒト（Ｋｎｅｃｈｔ）ら、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）７１、２７０１〜１２頁、２００２。ナトリウム利尿ペプチド分解の原因と考えられている酵素の発現増加は、これらの患者において不活性断片プールを増加させると予測できる。
【０１０４】
サンプルのナトリウム利尿ペプチド濃度を多く見積もることはまた、患者管理にも重大な結果をもたらし得る。例えば、ＢＮＰ濃度を用いて、うっ血性心不全の治療が有効であるかどうかを調べることができる（例えば、ＢＮＰをモニターして治療で上昇したレベルが正常に戻っているかどうかを確かめることによって）。前記で論じた、同様の「偽陽性」ＢＮＰ結果は、現治療が有効でないという誤った印象のために医師が治療を継続、増加または改変するよう（例えば、利尿効果のある、ＡＣＢ阻害剤、ジゴキシン、β−ブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、および／または血管拡張薬の投与量を増加するよう、または外科的介入を考慮するようにさえ）導く可能性がある。
【０１０５】
同様に、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドのグリコシル化状態を理解して設計されていなかったアッセイは、サンプル中の個々のナトリウム利尿ペプチドの型を同様に正確に測定しない可能性がることを記載する。ｉｎ ｖｉｖｏで見られる天然グリコシル化プロフィールを欠く、合成ペプチドまたは発現されたペプチドの使用を介してアッセイに用いる抗体を作製することが多い。例えば、ＢＮＰについてサンドイッチイムノアッセイを提供し、存在するＢＮＰの相当量（例えば、５０％）が、抗体結合を干渉するグリコシル化がなされている単純な場合を考えてみる。このような抗体を用いて構築されたイムノアッセイではサンプル中に存在するＢＮＰの量が２倍低く見積もられ、「偽陰性」結果をもたらす可能性がある。
【０１０６】
ナトリウム利尿ペプチド間のグリコシル化の相違はまた、個々のナトリウム利尿ペプチドのグリコシル化状態によるナトリウム利尿ペプチド受容体での活性の相違を介してか、生物半減期の相違のいずれかを介して、生物活性の相違をもたらす可能性がある。したがって、本明細書の方法を用いて、特定のグリコシル化状態に特異的なアッセイを作製して、再度このようなアッセイの診断および治療実用性の精度を向上させることができる。
【０１０７】
当業者ならば、本明細書に記載した方法をポリペプチドに広く適用できること、および本明細書に詳細に記載したナトリウム利尿ペプチドの分析は単に例示的なものであるということを理解されよう。同様の分析の対象となり得るその他の適したポリペプチドとしては、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、バソプレッシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ウロジラチン（ｕｒｏｄｉｌａｔｉｎ）、ウロテンシンＩＩ、遊離心臓トロポニンＩ、遊離心臓トロポニンＴ、トロポニンＴおよびトロポニンＣの一方または双方を含んでなる複合体中の心臓トロポニンＩ、トロポニンＩおよびトロポニンＣの一方または双方を含んでなる複合体中の心臓トロポニンＴ、総心臓トロポニンＩ、総心臓トロポニンＴ、肺サーファクタントタンパク質Ｄ、Ｄ−二量体、アネキシンＶ、エノラーゼ、クレアチンキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、心臓型脂肪酸結合タンパク質、ホスホグリセリン酸ムターゼ、Ｓ−１００、Ｓ−１００ａｏ、プラスミン−α２−アンチプラスミン複合体、β−トロンボグロブリン、血小板因子４、フィブリノペプチドＡ、血小板由来成長因子、プロトロンビン断片１＋２、Ｐ−セレクチン、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体、フォン・ウィルブランド因子、組織因子、血栓前駆体タンパク質、ヒト中性エラスターゼ、誘導可能一酸化窒素シンターゼ、リゾホスファチジン酸、マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、Ｃ−反応性タンパク質、インターロイキン−１β、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子α、可溶性細胞間接着分子−１、血管細胞接着分子、単球走化性タンパク質−１、カスパーゼ−３、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤシンターゼ、肥満細胞トリプターゼ、好酸球カチオン性タンパク質、ＫＬ−６、プロカルシトニン、ハプトグロビン、ｓ−ＣＤ４０リガンド、Ｓ−ＦＡＳリガンド、α２アクチン、塩基性カルポニン１、ＣＳＲＰ２エラスチン、ＬＴＢＰ４、平滑筋ミオシン、平滑筋ミオシン重鎖、トランスゲリン（ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）、アルドステロン、アンギオテンシンＩＩＩ、ブラジキニン、エンドセリン１、エンドセリン２、エンドセリン３、レニン、ＡＰＯ Ｂ４８、膵臓エラスターゼ１、膵臓リパーゼ、ｓＰＬＡ２、トリプシノーゲン活性化ペプチド、αエノラーゼ、ＬＡＭＰ３、ホスホリパーゼＤ、ＰＬＡ２Ｇ５、タンパク質Ｄ、ＳＦＴＰＣ、デフェンシンＨＢＤ１、デフェンシンＨＢＤ２、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−３、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、プロカルシトニン、タンパク質Ｃ、血清アミロイドＡ、ｓ−グルタチオン、ｓ−ＴＮＦ Ｐ５５、ｓ−ＴＮＦ Ｐ７５、ＴＡＦ１、ＴＧＦβ、ＭＭＰ−１１、脳脂肪酸結合タンパク質、ＣＡ１１、ＣＡＢＰ１、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＢＬＮ１、ＣＨＮ２、切断されたタウ、ＣＲＨＲ１、ＤＲＰＬＡ、ＥＧＦ、ＧＰＭ６Ｂ、ＧＰＲ７、ＧＰＲ８、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＭ７、ＨＡＰＩＰ、ＨＩＦ１α、ＨＩＰ２ＫＣＮＫ４、ＫＣＮＫ９、ＫＣＮＱ５、ＭＡＰＫ１０、ｎ−アセチルアスパルテート、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＲＧ２、ＰＡＣＥ４、ホスホグリセレートムターゼ、ＰＫＣγ、プロスタグランジンＥ２、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＲＺ１、ＲＧＳ９、ＳＣＡ７、セクレタゴギン（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｉｎ）、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＯＲＬ１、ＳＲＥＢ３、ＳＴＡＣ、ＳＴＸ１Ａ、ＳＴＸＢＰ１、ＢＤＮＦ、シスタチンＣ、ニューロキニンＡ、サブスタンスＰ、インターロイキン−１、インターロイキン−１１、インターロイキン−１３、インターロイキン−１８、インターロイキン−４、およびインターロイキン−１０が挙げられる。
【０１０８】
ナトリウム利尿ペプチドのグリコシル化
【０１０９】
グリコシル化ポリペプチドは通常、１個以上のアスパラギン残基のアミノ基と結合しているＮ−結合型糖、１個以上のセリンおよび／またはスレオニン残基のヒドロキシル基と結合しているＯ−結合型糖またはＮ−およびＯ−結合型糖の組合せを含んでなる。本発明はナトリウム利尿ペプチドがグリコシル化されることを初めて証明する。さらに、本発明は、グリコシル化が、特定の方法のサンプル中のナトリウム利尿ペプチドを検出する能力に重大な影響を及ぼし得ることを実証する。
【０１１０】
いくつかのアプローチを用れば、グリコシル化によって検出スキームにもたらされる可能性のある困難を取り除くことができる。まず、グリコシル化の存在が正確な検出を混乱させている場合には、化学的処理または酵素処理を用いてポリペプチドから糖鎖残基を除去し、それによって注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドを「検出可能な」状態に切り替えることができる。第２に、グリコシル化による干渉を受けない、注目するナトリウム利尿ペプチドの１以上の領域と結合する抗体を注意深く選択して、個々のグリコシル化状態に「非感受性」である抗体を提供することができる。第３に、グリコシル化されているが、脱グリコシル化状態で結合の低下を示す、注目するナトリウム利尿ペプチドの１以上の領域と結合する抗体を注意深く選択して、個々のグリコシル化状態に「感受性」である抗体を提供することができる。第４に、グリコシル化されているが、脱グリコシル化状態で結合の増加を示す、注目するナトリウム利尿ペプチドの１以上の領域と結合する抗体を注意深く選択して、個々のグリコシル化状態に「感受性」である抗体を提供することができる。また、これらのアプローチを必要に応じてまたは所望により組み合わせることもできる。
【０１１１】
Ｎ−およびＯ−結合型糖鎖残基を除去するための有効な酵素法は、当技術分野では周知であり、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−グリコシダーゼとしても知られる）、エンドグリコシダーゼＨ、エンドグリコシダーゼＡ、Ｏ−グリカナーゼ（エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとしても知られる）、α２−（３，６，８，９）−ノイリミニダーゼ（ｎｅｕｒｉｍｉｎｉｄａｓｅ）、β（１，４）−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、および／またはエンドグリコシダーゼＦ3などの酵素を用いる。この羅列は限定しようとするものではない。このような、ペプチドからの糖除去の酵素法は、天然（非変性）ペプチドに用いることができる。しかし、このような酵素法では、糖ペプチドの変性を用いることができ、これでは脱グリコシル化度を高めることが多い。一般的な変性条件は、ほぼ中性ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．５と約ｐＨ８の間）のバッファー溶液中、約０．０１％〜約１％のドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）、および場合によっては、約５ｍＭ〜約５００ｍＭのβ−メルカプトエタノールの添加を含んでなる。このような方法は、いくつかの脱グリコシル化酵素の安定化に役立ち得る、約０．２％〜約２％のＮＰ−４０をさらに含んでなる場合もある。このような変性条件とともに、高温（例えば、約０．５時間〜約４８時間の間、約３７℃）を用いることもできる。
【０１１２】
ペプチドから共有結合している糖鎖残基を除去するための非酵素的化学処理の場合には、非還元Ｏ−およびＮ−結合型オリゴ糖の放出においてヒドラジン加水分解が有効であるとわかっている。約６０℃でのＯ−結合型オリゴ糖の最初の穏やかなヒドラジン分解と、それに続く約９５℃でのＮ−結合型オリゴ糖のヒドラジン分解によって、オリゴ糖の選択的および順次的放出を達成できる。例えば、パテールおよびラレク、メソッヅ・イン・エンジモロジー２３０、５８〜６６頁、１９９４参照。しかしながら、このような処理の結果、ポリペプチドが破壊されることもある。穏やかな塩基環境においてアルカリ性水素化ホウ素ナトリウムを利用する、Ｏ−結合型オリゴ糖のアルカリ−β−脱離が好ましい場合がある。例えば、グリコバイオロジー：ア・プラクティカル・アプローチ、フクダ，Ｍおよびコバタ，Ａ編、２９１〜３２８頁、ＩＲＬ／オックスフォード大学出版、オックスフォード、１９９３参照。さらに、トリフルオロメタンスルホン酸加水分解を用いてもよい。糖間のグリシル結合はトリフルオロメタンスルホン酸による切断に感受性であるが、ペプチド結合は長期の処理に対してでさえ安定であるため、この方法は通常、無傷のポリペプチドを残すが、グリカンの破壊をもたらす。例えば、エッジ、バイオケミカル・ジャーナル３７６、３３９〜５０頁、２００３参照。
【０１１３】
重要なことに、グリコシル化以外の翻訳後修飾はこのような酵素的またはトリフルオロメタンスルホン酸処理に対して安定であると考えられるので、このような処理後にペプチドにおいて観察される質量の変化は糖残基の除去によるものと見なすことができる。これにより注目するポリペプチド上の抗原性エピトープに対する糖鎖およびグリコシル化部位の相対的寄与率をより理解することが可能となる。また、糖残基の除去によって、観察される質量の相違がアミノ酸含量ではなく糖含量の相違によるものであるかどうかについて疑問がいずれも取り除かれるので、脱グリコシル化によって、ポリペプチド質量（例えば、当業者に周知の方法によって配列と関連付けることができる、サンプル中に存在する注目するナトリウム利尿ペプチドおよびその断片の質量）の相違をより理解することが可能となる。
【０１１４】
抗体の選択
【０１１５】
無傷のナトリウム利尿ペプチド断片を選択的に認識し、かつ／またはグリコシル化状態に感受性もしくは非感受性である抗体の作製および選択はいくつかの方法で達成することができる。例えば、一方法としては、断片を精製すること、または例えば、当技術分野で周知の固相ペプチド合成法を用いて注目する断片を合成することがある。例えば、ガイド・トゥー・プロテイン・プリフィケーション（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、マリーＰ．ドッチャー（Ｍｕｒｒａｙ Ｐ． Ｄｅｕｔｃｈｅｒ）編、メソッヅ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１８２巻（１９９０）、ソリッド・フェーズ・ペプチド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、グレッグＢ．フィールズ（Ｇｒｅｇ Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ）編、メソッヅ・イン・エンジモロジー第２８９巻（１９９７）、キソら、ケミカル・ファーマシー・ブレチン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）（東京）３８、１１９２〜９９頁、１９９０、モスタファビ（Ｍｏｓｔａｆａｖｉ）ら、バイオメディカル・ペプチデス、プロテインズ、アンド・ヌクレイック・アシッヅ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）１、２５５〜６０頁、１９９５、フジワラら、ケミカル・ファーマシー・ブレチン（東京）４４、１３２６〜３１頁、１９９６参照。次いで、選択したポリペプチドを、例えば、マウスまたはウサギに注射してポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製することができる。当業者ならば、抗体の作製には、例えば、アンチボディーズ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびデヴィッド・レーン（Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８）、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙに記載されるような多数の手順を利用できることは認識されよう。また、当業者ならば、種々の手順による遺伝情報から、抗体を模倣する結合断片またはＦａｂ断片も調製できるということは理解されよう（アンチボディー・エンジニアリング（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）：ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ボレベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）Ｃ．編）１９９５、オックスフォード大学出版、オックスフォード、ジャーナルオブ・イムノロジー１４９、３９１４〜３９２０頁、（１９９２））。
【０１１６】
さらに、多数の出版物によって、選択した標的との結合について、ポリペプチドのライブラリーを作製し、スクリーニングするためのファージディスプレイ技術の使用が報告されている。例えば、クウィルラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｉｉｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）８７、６３７８〜８２頁、１９９０、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９、４０４〜６頁、１９９０、スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、サイエンス、２４９、３８６〜８８頁、１９９０、およびラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、米国特許第５，５７１，６９８号参照。ファージディスプレイ法の基本概念は、スクリーニングされるポリペプチドをコードするＤＮＡとポリペプチドの間の物理的関係の確立である。この物理的結合はポリペプチドを、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入しているキャプシドの一部として提示するファージ粒子によって提供される。ポリペプチドとその遺伝物質間の物理的関係の確立により、種々のポリペプチドを保持する極めて多数のファージの同時マススクリーニングが可能となる。標的に対して親和性のあるポリペプチドを提示するファージは標的と結合し、これらのファージは標的に対するアフィニティースクリーニングによって濃縮される。これらのファージから提示されるポリペプチドの正体は、それらのそれぞれのゲノムから決定することができる。次いで、これらの方法を用いて、所望の標的に対して結合親和性を有すると同定されたポリペプチドを、従来法を用いて大量に合成することができる。例えば、すべての表、図および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる、米国特許第６，０５７，０９８号参照。
【０１１７】
次いで、これらの方法によって作製される抗体を、精製された無傷の注目するナトリウム利尿ペプチドとの親和性および特異性についての一次スクリーニング、および必要に応じて、抗体の、結合から除外されることが望まれるナトリウム利尿ペプチド断片との親和性および特異性についての結果を比較することによって選択することができる。スクリーニング手順は、精製されたナトリウム利尿ペプチド断片のマイクロタイタープレートの別個のウェルへの固定化を含み得る。次いで、可能性ある抗体または抗体群を含有する溶液をそれぞれのマイクロタイターウェルに入れ、約３０分間〜２時間インキュベートする。次いで、マイクロタイターウェルを洗浄し、ウェルに標識した二次抗体（例えば、産生された抗体がマウス抗体である場合には、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた抗マウス抗体）を加え、約３０分間インキュベートし、次いで洗浄する。ウェルに基質を加えると、固定化されたナトリウム利尿ペプチドおよび断片に対する抗体が存在する場合には呈色反応が現れる。同様のアプローチを用いてグリコシル化−非感受性抗体をスクリーニングすることができる。この場合には、１種以上の糖鎖残基を含むか、これを欠いている精製ナトリウム利尿ペプチド断片を用いてスクリーニングを行うことができる。
【０１１８】
次いで、このように同定した抗体を、選択したアッセイ設計で注目するナトリウム利尿ペプチドに対する親和性および特異性についてさらに分析することができる。標的タンパク質についてのイムノアッセイの開発では、精製した標的タンパク質が、選択されている抗体を用いるイムノアッセイの感度および特異性を判断する標準の役割を果たす。種々の抗体の結合親和性は異なり得るので、特定の抗体ペア（例えば、サンドイッチアッセイにおける）は互いに立体障害などによって干渉する可能性があり、抗体の分析性能は、抗体の絶対的な親和性および特異性より重要な尺度であり得る。
【０１１９】
当業者ならば、抗体または結合断片を作製し、種々のナトリウム利尿ペプチドに対する親和性および特異性についてスクリーニングおよび選択するのに多数のアプローチを取ることができるが、これらのアプローチは本発明の範囲を変更するものではないということは認識されよう。
【０１２０】
マーカーパネルにおけるナトリウム利尿ペプチドの使用
【０１２１】
疾病の診断のための、特に識別診断のための１種以上のマーカーを同定するための方法およびシステムはこれまでに記載されている。疾病状態の診断に有用なマーカーを同定するのに適した方法は、２００２年１２月２７日に出願された、メソッヅ・アンド・システム・フォー・ディジーズ・ディテクション・ユージング・マーカー・コンビネーションズ（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＤＩＳＥＡＳＥ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＵＳＩＮＧ ＭＡＲＫＥＲ ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮＳ）と題された米国特許出願第１０／３３１，１２７号（代理人整理番号０７１９４９−６８０２）に詳細に記載されている。なおこれは参照により、すべての表、図、および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。当業者ならばまた、マーカーの単変量解析を実施でき、複数のマーカーの単変量解析から得たデータを合わせて、異なる疾病状態を識別するマーカーのパネルを形成することができるということも認識されるであろう。
【０１２２】
診断に有用なマーカーのパネルの開発では、特定のマーカーの存在またはレベルについて調べることによって、いくつかの可能性あるマーカーのデータを被験体群から得ることができる。被験体の群を２セットに分けるが、第１のセットと第２のセットは各々ほぼ同数の被験体を含むことが好ましい。第１のセットは、疾病を患っているか、またはより広くは、第１の状況状態にあると確認されている被験体を含む。例えば、この第１のセットの患者は最近疾病を発生したものであってもよいし、具体的な種類の疾病を患っているものであってもよい。状況状態の確認は、より正確かつ／または費用のかかる試験、例えば、ＭＲＩまたはＣＴによって行うことができる。以下、第１のセットの被験体は「罹患」と呼ぶ。
【０１２３】
被験体の第２のセットは、単に第１のセットに入らないものである。この第２のセットの被験体は「非罹患」、すなわち、正常な被験体であり得る。あるいは、この第２のセット被験体は、「罹患」被験体によって示される症状を模倣する、１つの症状または一連の症状を示すよう選択することもできる。さらにもう１つの代替法では、この第２のセットが、疾病の発生からの異なる時点のものに相当する場合もある。
【０１２４】
これらのセットの被験体から得られるデータとしては、本発明の目的上は、個々にまたは群として測定される、ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の断片をはじめとする、複数のマーカーのレベルが挙げられる。同一セットのマーカーのデータを各患者に利用できることが好ましい。このマーカーのセットには、個々の疾病または状態の検出に関連があると思われるすべての候補マーカーを含めることができる。実際の既知の関連性は必要ではない。本明細書に記載された方法およびシステムの実施形態を用いて、どの候補マーカーが疾病または状態の診断と最も関連があるかを調べることができる。２セットの被験体における各マーカーのレベルは、ガウス分布のように広範囲にわたって分布する場合がある。しかし、分布の一致は必要ではない。
【０１２５】
単一マーカーでは、患者を罹患であるか非罹患のいずれであるか決定的に同定することができないことが多い。例えば、患者が重複領域内に入るマーカーレベルを有すると測定される場合、試験結果は患者の診断に役に立たないものとなる。人為的なカットオフを用いて、疾病または状態の検出の陽性と陰性の試験結果間を区別することもできる。カットオフをどこに選択しようと、単一マーカーの診断ツールとしての有効性は影響を受けない。カットオフを変更することは、単に単一マーカーの使用に起因する偽陽性の数と偽陰性の数の間を交換するだけのことである。このような重複を含む試験の有効性は、ＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を用いて表されることが多い。ＲＯＣ曲線は当業者には周知である。
【０１２６】
ＲＯＣ曲線の水平軸は、偽陽性率とともに高まる（１−特異度）を表す。曲線の垂直軸は、真の陽性率とともに高まる感度を表す。したがって、選択した個々のカットオフについて、（１−特異度）の値を求めることができ、また対応する感度も得ることができる。ＲＯＣ曲線下面積は測定したマーカーレベルが疾病または状態の正確な同定を可能にする可能性の尺度である。したがって、ＲＯＣ曲線下面積を用いて試験の有効性を調べることもできる。
【０１２７】
前記で論じたように、単一マーカーのレベルの測定は限定された有用性しかない場合がある。さらなるマーカーの測定によってさらなる情報が得られるが、２つの無関係である可能性のある測定値のレベルを適切に組み合わせることには、困難がある。本発明の実施形態にしたがう方法およびシステムでは、罹患および非罹患患者のセットの種々のマーカーのレベルに関するデータを用いて、有用なパネル応答を得るためのマーカーのパネルを開発することができる。データはデータベース、例えば、マイクロソフトアクセス、オラクル、その他のＳＱＬデータベースで、または単純にデータファイルで提供することができる。データベースまたはデータファイルには、例えば、患者識別子、例えば、名前または番号など、存在する種々のマーカーのレベル、および患者が罹患であるか非罹患であるかを含めることができる。
【０１２８】
次いで、各マーカーの人為的カットオフ領域をまず選択することができる。カットオフ領域の位置は最初にどの点にでも選択することができるが、この選択は以下に記載する最適化プロセスに影響を及ぼす場合がある。この点に関しては、最適位置の候補近くの選択は、オプティマイザの高速収束を促進し得る。好ましい方法では、カットオフ領域を、２セットの患者の重複領域のほぼ中心を最初に中心とする。一実施形態では、カットオフ領域は単にカットオフ点であり得る。その他の実施形態では、カットオフ領域はゼロより大きい長さを有し得る。これに関しては、カットオフ領域を中心値と長さの大きさによって定義することができる。実際、カットオフ領域の限界の初期選択は、被験体の各セットの予め選択したパーセンタイルにしたがって決定することができる。例えば、それより上で罹患患者の予め選択したパーセンタイルが測定される点を、カットオフ範囲の右（上）端として用いることができる。
【０１２９】
次いで、各患者の各マーカー値を、指標に対してマッピングすることができる。指標には、カットオフ領域より下の１つの値と、カットオフ領域より上の別の値を割り当てる。例えば、マーカーが通常、非罹患患者に対してより低い値を、罹患患者に対してより高い値を有する場合には、ゼロ指標を個々のマーカーに対して低い値に割り当てるが、このことは陽性診断の可能性が低くなる可能性を示す。その他の実施形態では、指標は多項式に基づいて算出することができる。多項式の係数は、罹患と非罹患被験体間のマーカー値の分布に基づいて求めることができる。
【０１３０】
種々のマーカーの相対的な重要性は重み係数によって示され得る。重み係数は、まず、各マーカーの係数として割り当てることができる。カットオフ領域と同様、重み係数の初期選択は、許容範囲にあるどんな値にでも選択することができるが、この選択は最適化プロセスに影響を及ぼす可能性がある。この点に関しては、最適位置の候補近くの選択は、オプティマイザの高速収束を促進し得る。好ましい方法では、許容範囲の重み係数はゼロと１の間に及び、各マーカーの初期重み係数は０．５として割り当てることができる。好ましい実施形態では、各マーカーの初期重み係数はそのマーカー自身の有効性と関連があり得る。例えば、ＲＯＣ曲線は単一マーカーについて作製することができ、ＲＯＣ曲線下面積をそのマーカーの初期重み係数として用いることができる。
【０１３１】
次いで、２セットの各々において各被験体のパネル応答を算出することができる。パネル応答は、それに対して各マーカーレベルがマッピングされる指標と各マーカーの重み係数の関数である。好ましい実施形態では、各被験体（ｊ）のパネル応答（Ｒ）は以下のように表される：
Ｒj＝ΣｗiＩi,j,
式中、ｉはマーカー指数であり、ｊは被験体指数であり、ｗiはマーカーｉの重み係数であり、Ｉは被験体ｊの、それに対してマーカーのマーカーレベルがマッピングされる指標値であり、Σはすべての候補マーカーｉにわたる合計である。
【０１３２】
マーカー値ではなく指標値を用いることの利点の１つは、特別に高いまたは低いマーカーレベルが、その個々のマーカーについて罹患または非罹患の診断の可能性を変更しないということである。通常、特定のレベルを上回るマーカー値は、概ね特定の状況状態を示す。そのレベルを上回るマーカー値は、同じ確かさで状況状態を示す。したがって、特別に高いマーカー値がその状況状態の特別に高い可能性を示すわけではない場合がある。カットオフ領域の片側で一定である指標の使用により、この懸念が排除される。
【０１３３】
パネル応答はまた、マーカーレベルおよびその他の因子、例えば、患者の家系および性別をはじめとするいくつかのパラメータの全般的な関数であり得る。パネル応答に寄与するその他の因子としては、個々のマーカーの値の経時的な傾斜が挙げられる。例えば、まず病院に到着した時点で、個々のマーカーについて患者を測定することができる。同じマーカーを、１時間後再度測定することができ、変化レベルをパネル応答に反映させることができる。さらに、さらなるマーカーをその他のマーカーから導くことができ、これはパネル応答の値に寄与し得る。例えば、２種のマーカーの値の比率がパネル応答を算出する際の因子となり得る。
【０１３４】
被験体の各セットにおける各被験体についてパネル応答を得、そこで各セットのパネル応答の分布を解析することができる。目的関数は有効なパネルの選択を容易にするよう定義できる。通常、目的関数は、例えば、罹患セットの被験体のパネル応答と非罹患セットの被験体のパネル応答の重複によって表され得るような、パネルの有効性の指標となるものではければならない。このように、例えば、重複を最小化することによって、目的関数を最適化してパネルの有効性を最大化することができる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、２セットの被験体のパネル応答を表すＲＯＣ曲線を用いて目的関数を定義することができる。例えば、目的関数はＲＯＣ曲線下面積を反映し得る。曲線下面積を最大にすることによって、マーカーのパネルの有効性を最大にすることができる。その他の実施形態では、ＲＯＣ曲線のその他の特徴を用いて目的関数を定義できる。例えば、ＲＯＣ曲線の傾斜が１に等しい点は有用な特徴であり得る。その他の実施形態では、「ひざ」と呼ばれることもある、感度と特異度の積が最大である点を使用してもよい。一実施形態では、ひざでの感度を最大にすることができる。さらなる実施形態では、所定の特異度レベルの感度を用いて目的関数を定義することができる。その他の実施形態では、所定の感度レベルの特異度を用いることができる。さらにその他の実施形態では、これらＲＯＣ曲線の特徴の２以上の組合せを用いることができる。
【０１３６】
パネルのマーカーの１つが、診断されている疾病または状態に特異的であることがあり得る。このようなマーカーが特定の基準値より上または下に存在する場合には、パネル応答を「陽性」試験結果に戻すよう設定することができる。しかし、基準値を満たさない場合であっても、マーカーのレベルを目的関数に寄与する可能性のあるものとして用いることができる。
【０１３７】
最適化アルゴリズムを用いて目的関数を最大または最小にすることができる。最適化アルゴリズムは当業者に周知であり、これとしてはシンプレックス法およびその他の条件付き最適化技術をはじめとするいくつかの一般に入手可能な最小化または最大化関数が挙げられる。当業者ならば、最小化関数の中には、局所的極小ではなく大域的極小の検索において、その他のものよりも良好であるものがあることは理解されよう。最適化プロセスでは、各マーカーのカットオフ領域の位置および大きさを、マーカー当たり少なくとも２の自由度を提供するよう変更することが可能である。このような可変パラメータは本明細書では独立変数と呼ぶ。好ましい実施形態では、各マーカーの重み係数も、最適化アルゴリズムの反復にわたって変更することができる。種々の実施形態では、これらのパラメータの順列はいずれも、独立変数として使用することができる。
【０１３８】
前記のパラメータに加えて、各マーカーの意味も独立変数として用いることができる。例えば、多くの場合、特定のマーカーの高レベルが一般的に罹患状態を示すものであるのか非罹患状態を示すものであるのかどうかが知られていない場合がある。このような場合には、最適化プロセスを両側で検索できることが有用であり得る。実際、これはいくつかの方法で実施できる。例えば、一実施形態では、意味が、最適化プロセスによって陽性と陰性の間で反転され得る、真に別個の独立変数であり得る。あるいは、重み係数が負であることを可能にすることによって意味が提供され得る。
【０１３９】
同様に、最適化アルゴリズムは特定の制限付で提供され得る。例えば、得られたＲＯＣ曲線は、特定の値よりも大きい曲線下面積を提供するよう制限できる。曲線下面積が０．５であるＲＯＣ曲線は、完全な乱数度を示し、曲線下面積が１．０は２セットの完全分離を反映する。したがって、特に目的関数が曲線下面積を組み込んでいない場合には、最小許容範囲値、例えば、０．７５を制限として用いることができる。その他の制限としては、個々のマーカーの重み係数に対する制限を挙げることができる。さらなる制限によって、すべての重み係数の合計を、特定の値、例えば１．０に制限することができる。
【０１４０】
最適化アルゴリズムの反復は、通常、目的関数を最小化または最大化しながら、独立パラメータを制限を満たすよう変更する。最適化プロセスにおける反復数は制限することができる。さらに、２つの連続反復間の目的関数の相違が所定の基準値より小さい場合には最適化プロセスを終了することができ、それによって、最適化アルゴリズムが局所性最小または最大の領域に達したことが示される。
【０１４１】
したがって、最適化プロセスにより、各マーカーの重み係数およびマーカー値を指標に対してマッピングするためのカットオフ領域を含むマーカーのパネルが提供され得る。より少ないマーカーレベルの測定しか必要としない低コストのパネルを開発するために、特定のマーカーをパネルから排除することができる。これに関しては、パネルにおける各マーカーの有効な寄与を求めて、マーカーの相対的重要度を同定することができる。一実施形態では、最適化プロセスに起因する重み係数を用いて、各マーカーの相対的重要度を決定することができる。寄与の最も低いマーカーを排除してもよい。
【０１４２】
特定の場合では、より小さい重み係数が低い重要度を示すものでない場合がある。同様に、より大きい重み係数が高い重要度を示すものではない場合がある。例えば、最適化プロセスは、関連マーカーが診断と無関係である場合に高い係数をもたらし得る。この場合には、係数を低下させる利点は全くない。この係数を変更することは、目的関数の値に影響を及ぼし得ない。
【０１４３】
治療計画を決定するためのナトリウム利尿ペプチドの使用
【０１４４】
ナトリウム利尿ペプチドなどの有用な診断または予後指標は、臨床医が択一的な治療計画の間で選択を行う手助けとなり得る。例えば、急性冠症候群後に心臓トロポニンＴまたはＩが上昇している患者は、強力な抗血小板物質・抗血栓治療および早期の血管再開通術を含む早期の積極的な戦略から具体的な利益を得るようである。ハム（Ｈａｍｍ）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）３４０、１６２３〜９頁（１９９９）、モロー（Ｍｏｒｒｏｗ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・カレッジ・オブ・カルディオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）３６、１８１２〜７頁（２０００）、キャノン（Ｃａｎｎｏｎ）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・カルディオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）８２、７３１〜６頁（１９９８）。さらに、心筋梗塞後Ｃ−反応性タンパク質が上昇している患者は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤治療から特定の利益を得るようである。リドカー（Ｒｉｄｋｅｒ）ら、サーキュレーション９８、８３９〜４４頁（１９９８）。うっ血性心不全の患者の中では、試験的研究によって、ＡＣＥ阻害剤がＢＮＰレベルを用量依存的に低下させ得るということが示唆されている。バン・ベルドヒュイゼン（Ｖａｎ Ｖｅｌｄｈｕｉｓｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・オブ・カルディオロジー３２、１８１１〜８頁（１９９８）。
【０１４５】
同様に、利尿薬および血管拡張薬治療を、生物活性ナトリウム利尿ペプチドレベルに基づいて「調整すること」によって転帰が改善され得る。例えば、トラウトン（Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３５５、１１２６〜３０頁（２０００）参照。最後に、１６人の患者からなる単一の試験的研究において、Ｑ波梗塞後のプラセボではなくＡＣＥ阻害剤に対するランダム化が、その後の６ヶ月間にわたるＢＮＰレベルの低下と関連があるということがわかった。モトワニ（Ｍｏｔｗａｎｉ）ら、ランセット３４１、１１０９〜１３頁（１９９３）。ＢＮＰは、有益な心臓および腎臓への作用を有する対抗−調節ホルモンであるので、ＢＮＰ濃度の変化は心室機能の向上および心室壁張力の低下を反映すると思われる。最近の論文により、ＮＴプロ−ＢＮＰとＢＮＰアッセイの相互関係が実証されている（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４７、５９１〜５９４頁（２００１））。本発明のさらなる目的は、個別にか、マーカーの群のいずれかで考えられる、ナトリウム利尿ペプチドの濃度を用いて、患者の予後を向上するよう利尿薬および血管拡張薬治療を導くことができることである。さらに、患者の予後指標として用いるための、個別にか、マーカーの群で考えられる、ナトリウム利尿ペプチドの測定は本発明の範囲内にある。
【０１４６】
うっ血性心不全で入院している患者における最近の研究により、連続するＢＮＰ測定は、単一の測定と比較して増加した予後情報を提供できるということが示唆されている。すなわち、アッセイにより、ＢＮＰが治療後に低下した場合には、引き続き上昇しているままである場合よりも、予後が向上することを実証することができる。チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・オブ・カルディオロジー３７、３８６〜９１頁、（２００１）。したがって、本発明のナトリウム利尿ペプチドの連続測定は、患者におけるマーカーの予後価値および／または診断価値を高めることができ、したがって、本発明の範囲内にある。
【０１４７】
アッセイ測定戦略
【０１４８】
試験サンプル中のポリペプチドまたはタンパク質を検出および解析するための多数の方法および装置が当業者には周知である。好ましい実施形態では、多くはイムノアッセイ装置および方法を用いる。例えば、米国特許第６，１４３，５７６号、同６，１１３，８５５号、同６，０１９，９４４号、同５，９８５，５７９号、同５，９４７，１２４号、同５，９３９，２７２号、同５，９２２，６１５号、同５，８８５，５２７号、同５，８５１，７７６号、同５，８２４，７９９号、同５，６７９，５２６号、同５，５２５，５２４号および同５，４８０，７９２号参照。なお、それらの各々は参照により、すべての表、図、および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。これらの装置および方法は、種々のサンドイッチ、競合または非競合アッセイ形式において標識した分子を利用して、注目する分析物の存在または量と関連のあるシグナルを生じさせることができる。さらに、特定の方法および装置、例えば、バイオセンサーおよび光学的免疫測定法を用いて、標識した分子を必要とすることなく分析物の存在または量を調べることもできる。例えば、米国特許第５，６３１，１７１号および同５，９５５，３７７号参照。なお、それらの各々は参照により、すべての表、図、および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。また、当業者ならば、それだけには限らないが、ベックマン・アクセス（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｃｃｅｓｓ）、アボット・アキシム（Ａｂｂｏｔｔ ＡｘＳｙｍ）、ロシェ・エレクシス（Ｒｏｃｈｅ ＥｌｅｃＳｙｓ）、デイド・ベーリング・ストレイタス・システムス（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｓｔａｔｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）をはじめとするロボット機器が、本明細書に教示したイムノアッセイを実施できるイムノアッセイ分析器に入っていることは承知している。抗体の、マーカーとの特異的な免疫学的結合は直接的に検出することも間接的に検出することもできる。直接標識としては、抗体に付けた、蛍光または発光タグ、金属、色素、放射性核種などが挙げられる。間接標識としては、当技術分野で周知の種々の酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【０１４９】
１種以上のポリペプチドに特異的な固定化抗体の使用も本発明によって考慮される。抗体は種々の固体支持体、例えば、磁性またはクロマトグラフィーのマトリックス粒子、アッセイ場所（例えば、マイクロタイタープレート）の表面、一片の固体基板物質またはメンブラン（例えば、プラスチック、ナイロン、紙）などに固定化することができる。抗体または複数の抗体類を固体支持体上のアレイにコーティングすることによってアッセイストリップを調製することができる。次いで、このストリップを試験サンプル中に浸漬し、次いで、洗浄および検出ステップによって迅速に処理して測定可能なシグナル、例えば、呈色スポットを生じさせる。
【０１５０】
複数のポリペプチドの解析を、一試験サンプルを用いて別々にまたは同時に実施できる。別個のまたは連続アッセイに適した装置としては、エレクシス（ＥｌｅｃＳｙｓ）（ロシュ）、アクスシム（ＡｘＳｙｍ）（アボット）、アクセス（ベックマン）、アドビア（ＡＤＶＩＡ）（登録商標）センタウル（ＣＥＮＴＡＵＲ）（登録商標）（バイエル）イムノアッセイシステム、ニコスル・アドバンテージ（ＮＩＣＨＯＬ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ）（登録商標）（ニコルス社（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））イムノアッセイシステムなどの臨床検査室分析器が挙げられる。好ましい装置またはタンパク質チップとしては、単一の表面で複数のポリペプチドの同時アッセイを実施するものがある。特に有用な物理的形式としては、複数の異なる分析物の検出のための複数の個別のアドレス可能な位置を含む表面を含んでなるものがある。このような形式としては、タンパク質マイクロアレイまたは「プロテインチップ」（例えば、ング（Ｎｇ）およびイラグ（Ｉｌａｇ）、ジャーナル・オブ・セルラー・アンド・モレキュラー・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）６、３２９〜３４０頁、（２００２０）参照）および特定のキャピラリー装置（例えば、米国特許第６，０１９，９４４号参照）が挙げられる。これらの実施形態では、各々個別の表面位置が、各々の位置で検出するために１種以上の分析物を固定化するための抗体を含み得る（例えば、本発明の１種以上のポリペプチド）。あるいは、表面が、表面の個別の位置に固定化された１種以上の個別の粒子（例えば、微小粒子またはナノ粒子）を含んでなる場合もあり、ここで検出のために微小粒子が抗体を含んでなり、１種の分析物（例えば、本発明の１種以上のポリペプチド）を固定化する。
【０１５１】
さらに、当業者ならば、同一個体から（例えば、連続する時点で）得た複数のサンプルを試験することの価値を承知しているであろう。このように連続するサンプルを試験することによって、ポリペプチドレベルの経時変化を同定することが可能となる。ポリペプチドレベルの増加または減少、ならびにこのようなレベルの変化がないことは、それだけには限らないが、イベントの発生からのおよその時間、救済可能な組織の存在および量、薬物治療の妥当性、再灌流または症状の回復によって示されるような種々の治療の有効性を同定すること、同様の症状を有する種々の種類の疾病の識別、イベントの重篤度の同定、疾病重症度の同定、および患者の予後、例えば、将来のイベントの危険性の同定をはじめとする疾病状態についての有用な情報を提供する。
【０１５２】
前述のポリペプチドからなり、場合によっては、疾病の診断、予後診断または識別に有用なその他のタンパク質マーカーを含むパネルを、種々の診断に関連する関連情報を提供するよう構築することができる。このようなパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれより多い個々の分析物、例えば、本発明の１種以上のポリペプチドを検出するよう構築することができる。当業者ならば、種々の臨床設定において臨床的感度または特異度を最適にするよう、単一分析物または分析物のサブセットの分析を実施できる。これらとしては、それだけには限らないが、外来、応急手当、救命救急診療、集中治療、モニタユニット、入院患者、通院患者、診療室、診療所、および健康診断設定が挙げられる。さらに、当業者ならば、前記の設定の各々において単一の分析物または分析物のサブセットを、臨床的感度および特異度を最適化するよう診断基準点の調節と組み合わせて使用できる。アッセイの臨床的感度は、アッセイが正しく予測する疾病を有するもののパーセンテージとして定義され、アッセイの特異度は、アッセイが正しく予測する疾病を有さないもののパーセンテージとして定義される（ティーツェ・テキストブック・オブ・クリニカル・ケミストリー（Ｔｉｅｔｚ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版、カール・バーティス（Ｃａｒｌ Ｂｕｒｔｉｓ）およびエドワード・アシュッド（Ｅｄｗａｒｄ Ａｓｈｗｏｏｄ）編、Ｗ．Ｂ．サウンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）他、４９６頁）。
【０１５３】
分析物の分析は、同様に種々の物理的形式で実施できる。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の使用を用いることで多数の試験サンプルの処理が容易になる。あるいは、単一サンプル形式を開発することで、例えば、外来搬送または救急外来設定において時期を逸することのない迅速な治療および診断が容易になる。
【０１５４】
前記で論じたように、サンプルが、ひと度サンプルを獲得しても、ナトリウム利尿ペプチドまたはその断片を分解し続ける場合がある。したがって、アッセイに先立って１種以上のプロテアーゼ阻害剤をサンプルに加えることが有利であり得る。当業者には多数のプロテアーゼ阻害剤が知られており、例示的阻害剤は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｃｈｅ−ａｐｐｌｉｅｄ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｆｓｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ？／ｐｒｏｄ＿ｉｎｆ／ｍａｎｕａｌｓ／ｐｒｏｔｅａｓｅ／ｐｒｏｔ＿ｔｏｃ．ｈｔｍのザ・コンプリート・ガイド・フォー・プロテアーゼ・インヒビション（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、ロシェ・モレキュラー・バイオケミカルス（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１９９９年６月３日更新およびヨーロッパ特許出願０３０１３７９２．１（ＥＰ１３７８２４２Ａ１として公開）に見ることができる。なお、この各々はその全文を本明細書に組み入れる。種々のメタロプロテアーゼおよびカルシウム依存性プロテアーゼが血液由来サンプル中に存在することが知られているので、ＥＧＴＡおよび／またはＥＤＴＡなどのキレート剤もプロテアーゼ阻害剤として作用する。さらに、またはあるいは、中性エンドペプチダーゼおよび／またはＤＰＰの阻害剤も使用できる。
【０１５５】
プロリル特異的ＤＰＰによるナトリウム利尿ペプチド分解の阻害
【０１５６】
ナトリウム利尿ペプチドが一部をなす神経液性調節系は、心血管調節の複雑な系に相当する。うっ血性心不全などの疾病は、本質的に、寿命を延長することはできるが基礎疾患は決して治癒しない命にかかわる疾病である。したがって、依然として、基礎疾患を管理するための新規治療的アプローチが必要とされており、この複雑な系における複数の点が臨床医学者によって重要な標的と考えられている。疾病管理におけるアンギオテンシン変換酵素（「ＡＣＥ」）阻害剤の臨床上の成功により、血管作用性ホルモンに作用する酵素に影響を及ぼすことによって循環器疾患の経過に間接的に影響を及ぼすさらなるアプローチが探求されることとなった。
【０１５７】
ナトリウム利尿ホルモンの場合には、ホルモンレベルの上昇が患者において治療可能性を有することがわかっている。例えば、チェコウラ（Ｔｓｅｋｏｕｒａ）ら、ヘレニック・ジャーナル・オブ・カルディオロジー（Ｈｅｌｌｅｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）４４、２６６〜７０頁、２００３参照。中性エンドペプチダーゼ（「ＮＥＰ」）は重要な分解媒介物であると考えられている。予想通り、ＮＥＰの阻害剤は、高血圧、アテローム性動脈硬化および心不全などの疾病を患う患者の治療において用途が見出されている。例えば、コーチ（Ｃｏｒｔｉ）ら、サーキュレーション１０４、１８５６〜６２頁、２００１参照。ＢＮＰおよびＮＥＰ阻害剤双方を用いる併用療法は、心拍出量、血管抵抗性の低下および心臓の負荷軽減に対して相乗効果を生み出すと報告されている。チェン（Ｃｈｅｎ）ら、サーキュレーション、１０５、９９９〜１００３頁、２００２。ＮＥＰを標的とすることは制限を受け得るが、ＮＥＰは広範な生物活性ペプチドを代謝する。例えば、ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら、カレント・オピニオン・イン・ネフロロジー・アンド・ハイパーテンション（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）６、４６８〜７３頁、１９９７参照。
【０１５８】
本発明は循環器疾患、詳しくは、心不全を治療するための新規アプローチを記載する。いくつかのナトリウム利尿ペプチド、例えば、プロ−ＢＮＰ、成熟ＢＮＰ、およびプロ−ＡＮＰのヒト型は、最後から２番目のプロリン残基を含んでなり、これによってペプチドがプロリル特異的ジペプチジルジペプチダーゼ（「ＤＰＰ」）の適した基質となっている。ＤＰＰの阻害剤は、ＤＰＰ ＩＶによるグルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド分解の阻害によって媒介される糖尿病の管理において有用性があると記載されている。例えば、ゴー（Ｇａｕｌｔ）ら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション、２２、２０７〜１３頁、２００３参照。しかしながら、循環器疾患の治療におけるその使用はこれまでに報告されていない。
【０１５９】
選択的ＤＰＰ阻害剤を調製および同定する方法は当技術分野では周知である。ＤＰＰ阻害剤としては、ジペプチド類似体Ｘａａ−ボロＰｒｏ（ｂｏｒｏＰｒｏ）、例えば、Ｐｒｏ−ボロＰｒｏ、Ａｌａ−ボロＰｒｏ、Ｖａｌ−ボロＰｒｏおよびＬｙｓ−ボロＰｒｏ、およびｄａｂ−ｐｉｐが挙げられる。例えば、センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ、１２、２８２５〜２８頁、２００２、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ブラッド、プレパブリッシュド・オンライン（Ｂｌｏｏｄ， ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ）２００３年５月８日、ＤＯＩ１０．１１８２参照。ＤＰＰの多数のさらなるジペプチド類似体阻害剤を、迅速に合成し、スクリーニングするためにコンビナトリアル・ケミストリー法が用いられている。例えば、レイティングら、バイオケミカル・ジャーナル３７１、５２５〜３２頁、２００３、セドら、フィジオロジカル・リサーチ５２、３６７〜７２頁、２００３、ビルハウアーら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー４６、２７７４〜８９頁、２００３、センテンら、ジャーナル・オブ・コンビナトリー・ケミストリー５、３３６〜４４頁、２００３、および米国特許第５，６０２，１０２号、同６，５７３，２８７号、同６，５４８，４８１号、同６，４３２，９６９号、および同６，３５５，６１４号参照。これらの出版物に記載された化合物は、本明細書に記載した方法において使用するためのさらなるＤＰＰ阻害剤の同定においてリード化合物として用いることができる。小さな有機分子のコンビナトリアルライブラリーを作製するために当技術分野では種々の技術が利用できる。一般的には、ブロンデル（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ）ら、トレンヅ・イン・アナリティカル・ケミストリー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１４、８３頁、１９９５、米国特許第５，３５９，１１５号、同５，３６２，８９９号、同５，２８８，５１４号、および同５，７２１，０９９号、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、ＪＡＣＳ１１６、２６６１頁、１９９４、カー（Ｋｅｒｒ）ら、ＪＡＣＳ１１５、２５２頁、１９９３、Ｗ０９２／１００９２、Ｗ０９３／０９６６８、ＷＯ９４／０８０５１、Ｗ０９３／２０２４２およびＷ０９１／０７０８７参照。約１６〜１，０００，０００またはそれよりも多いオーダーのディヴァーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）で種々のライブラリーを合成し、本発明に記載した方法を用いて個々の活性または性質についてスクリーニングすることができる。
【０１６０】
本発明に用いられる阻害剤は小分子であることが好ましく、これは約１０００ダルトンより小さい分子量であることを意味する。このような阻害剤は当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｗ００４／０７４６８およびＷ００４／５００２２、ならびに米国特許第６，７１０，０４０号、同６，６９９，８７１号、同６，４３２，９６９号、同６，３０３，６６１号、同６，１６６，０６３号、同６，１２４，３０５号、同６，１１０，９４９号、および同６，１０７，３１７号参照。なお、それらの各々は参照によりその全文を本明細書に組み入れる。好ましい小分子阻害剤は経口で有効である。ＤＰＰ阻害性抗体または抗体断片も本明細書に記載した方法に使用できる。この場合には、ＤＰＰに対する抗体を作製し、（例えば、本明細書に記載したファージディスプレイ法を用いて）スクリーニングし、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドに対するＤＰＰ活性を阻害する抗体を同定することができる。
【０１６１】
化合物は、酵素の供給源として単離したＤＰＰ酵素、細胞抽出物、または血液由来サンプル、および基質として単離したナトリウム利尿ペプチドを用いて阻害活性についてスクリーニングすることができる。標的ナトリウム利尿ペプチドからの最後から２番目のプロリン残基の喪失を阻害する条件の選択は、検討中の水性媒質の種類に応じて変わり得る（例えば、血液サンプルにおける阻害は、生物の循環における阻害とは異なる条件を必要とし得る）。このような条件を選択することは当業者の技術の範囲内である。また試験化合物およびその対応する製薬上許容される酸付加塩のＤＰＰを阻害する能力も、クボタら、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８９、１９２〜７頁、１９９２に記載されたアッセイの改訂版を用いることによって証明することができる。最後から２番目のプロリン残基の有無の確認は、分子のこのＮ部分の喪失に感受性であるよう選択したイムノアッセイを用いて、または質量分析の使用によって実施できる。
【０１６２】
次のステップに進む前に、培養細胞においてＤＰＰ活性を調節する候補化合物を、注目する疾病状態と関連している動物モデルで試験することができる。これらの方法では、標識したナトリウム利尿ペプチドを、試験動物に注射し、ナトリウム利尿ペプチドの循環からのクリアランスのＴ1/2を、阻害剤の存在下および不在下で測定すればよい。ＤＰＰ依存性ナトリウム利尿ペプチド分解の好ましい動物モデルとしては、ラット、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコおよびブタが挙げられる。
【０１６３】
前記で論じたように、ＤＰＰ阻害剤とＮＥＰ阻害剤および／またはナトリウム利尿ペプチドを用いる併用療法が本発明によって考慮される。さらに、または代替法として、ゴー（Ｇｏｕｌｔ）ら、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）５２、６７９〜８７頁、２００３に、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドについて記載されたように、ナトリウム利尿ペプチドを、ＤＰＰ活性に対して安定化されている類似体として提供することができる。好ましい実施形態では、１個以上の置換、欠失、付加または修飾されたアミノ酸を含むナトリウム利尿ペプチド類似体のライブラリーを、ＤＰＰ分解に対する安定性の向上についてスクリーニングすることができる。このような類似体は、親ナトリウム利尿ペプチドのナトリウム利尿活性の５０％以上を保持することが好ましい。
【０１６４】
投与する場合には、本発明の製薬製剤を製薬上許容される量で製薬上許容される組成物で適用する。このような製剤は通常、塩、緩衝剤、保存料、適合担体、および場合によってはその他の治療薬を含み得る。医薬に用いる場合には、塩は製薬上許容されるものでなくてはならないが、好都合なことに、製薬上許容されない塩を用いてその製薬上許容される塩を調製することができ、これは本発明の範囲から排除されない。このような薬理学的および製薬上許容される塩としては、それだけには限らないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、製薬上許容される塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩、例えばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩としても調製できる。製薬組成物はまた、適した保存料、例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサルを場合によって含んでもよい。経口、皮下、静脈、筋肉内投与などに適した担体製剤は、レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルバニア州、イーストンに見出すことができる。
【０１６５】
被験体を治療するためには種々の投与経路が利用できる。選択される個々の送達様式は、選択された個々の化合物、治療される状態の重篤度および治療効力のために必要とされる投与量に応じて変わる。本発明の方法は、一般的に言えば、医学上許容される投与様式であればいずれを用いて実施してもよく、これは、臨床上許容できない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物が得られるいずれかの様式を意味する。このような投与様式としては、経口、直腸、局所、経鼻、皮内、静脈内、または非経口経路が挙げられる。このような投与様式はまた、患者からＴ細胞または骨髄細胞、幹細胞または初期系統前駆細胞を獲得し、単離した細胞を本発明の化合物とｅｘ ｖｉｖｏで接触させ、次いで処理細胞を患者に再導入することも含む。処理した細胞は、生存細胞を投与するための当技術分野で公知のいずれかの方法で患者に再導入すればよい。
【０１６６】
経口投与は特に好ましい。経口投与に適した組成物は、各々所定量の本発明の化合物を含有する個別単位、例えば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤として提供することができる。その他の組成物としては、水性液体または非水性液体中の懸濁液、例えば、シロップ、エリキシルまたはエマルションが挙げられる。経口製剤は腸溶性皮膜を含まないことが好ましいが、これは本発明の環状化合物を消化管の酸性ｐＨ条件に曝露して環状分子をその線状対応物に変換することが望ましいからである。
【０１６７】
その他の送達システムとしては、徐放性、遅延放出性または持続放出送達システムが挙げられる。このようなシステムによって、前述の化合物の反復投与が避けられ、被験体および医師に対する利便性が高まる。多数の種類の放出送達システムが、当業者に利用でき、知られている。それらとしては、ポリマーベースのシステム、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリアンヒドリドが挙げられる。薬剤を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルが、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムとしてはまた、ステロール、例えば、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸またはモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマーシステム、ヒドロゲル放出システム、サイラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）システム、ペプチドベースのシステム、ワックス皮膜、従来の結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠、部分融合インプラントなどが挙げられる。具体例としては、それだけには限らないが、（ａ）化合物がマトリックス内の形態に含まれる浸食システム、例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、同４，６６７，０１４，号、同４，７４８，０３４号および同５，２３９，６６０号に記載されたもの、ならびに（ｂ）有効成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散システム、例えば、米国特許第３，８３２，２５３号および同３，８５４，４８０号に記載されたものが挙げられる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを用いることもでき、これらの中には移植に適応するものもある。
【０１６８】
長期の持続放出性インプラントの使用は、慢性症状の治療に特に適し得る。本明細書において、長期の放出とは、インプラントが治療レベルの有効成分を少なくとも１０日、好ましくは６０日間送達するよう構成され配置されていることを意味する。長期の持続放出性インプラントは当業者には周知であり、これには前述の放出システムのいくつかが含まれる。
【０１６９】
選択した化合物は有効量で投与する。有効量とは、医薬上望ましい結果を提供するのに十分な化合物の投与量である。有効量は、治療されている個々の症状、治療されている被験体の年齢および健康状態、症状の重篤度、治療期間、（あるとすれば）併用療法の性質、具体的な投与経路および保険医の知識と力量の範囲内の同様の因子に応じて変わる。一般に、有効化合物の用量は１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１日あたり１０００ｍｇ／ｋｇとなる。０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲が適していると思われ、経口で１日あたり１回または数回の投与が好ましい。他の投与形態、例えば、静脈内投与によってはより少ない用量となる。初回量を適用して、被験体における応答が十分でない場合は、患者の耐容性が許す範囲内までで、より高用量（または異なる、より限局性の送達経路による事実上、より高用量）を用いることができる。化合物の適当な全身レベルを達成するためには１日あたり複数回の投与を考慮する。
【０１７０】
その他の実施形態は以下の特許請求の範囲内に示される。
【実施例】
【０１７１】
実施例
以下の実施例は本発明を例示するものである。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１７２】
血液サンプリング
血液は、指先穿刺、足底面穿刺、耳たぶ穿刺なども小容量には十分であり得るが、２０ゲージのマルチ−サンプルニードルおよび真空管を用いて静脈穿刺によって採取することが好ましい。全血採取用には、血液検体を訓練された研究員によってＥＤＴＡ含有血液採取チューブに採取する。血清採取用には、血液検体を訓練された研究員によってトロンビン含有血液採取チューブに採取する。血液を５〜１０分間凝固させ、遠心分離によって血清を不溶性物質から分離する。血漿採取用には、血液検体を訓練された研究員によってクエン酸塩含有血液採取チューブに採取し、≧１２分間遠心分離する。サンプルは使用まで４℃で維持するか、長期間の保存には−２０℃以下で凍結させればよい。全血は凍結しないことが好ましい。
【実施例２】
【０１７３】
組換え抗体調製
抗原でのマウスの免疫化とマウス脾臓由来ＲＮＡの精製
マウスを、抗体をコードするｍＲＮＡの最適な回収のための脾臓採取のタイミングの経験に基づいて、以下の方法によって免疫化する。２種のマウスを用いる：Ｂａｌｂ／ｃ（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マサチューセッツ州、ウィルミントン）およびＡ／Ｊ（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、メイン州、バー・ハーバー）。１０個体のマウス各々を、フロイントの完全アジュバント中の５０μｇタンパク質を用いる抗原で、０日目および２８日目に腹腔内免疫化する。後眼窩洞の穿刺によってマウスの試験出血を採取する。ストレプトアビジンによって固定化されるビオチン化抗原を用いるＥＬＩＳＡによって力価を試験することによって、高いと思われる場合は、マウスを５０μｇのタンパク質で、７０、７１および７２日目にブーストし、続いて、７７日目に屠殺し、脾臓を摘出する。抗体の力価が十分でないと考えられる場合は、マウスを５０μｇの抗原で５６日目にブーストし、６３日目に試験出血を採取する。十分な力価が得られる場合には、動物を５０μｇの抗原で９８、９９および１００日目にブーストし、１０５日目に脾臓を採取する。通常、１：３２００以上の試験出血希釈で、十分であると考えられる、最大半量のＥＬＩＳＡ応答が得られる。
【０１７４】
脾臓は層流フード内で採取し、ペトリ皿に移し、脂肪および結合組織を切り取り、廃棄する。迅速に作業し、脾臓を溶液Ｄ（２５．０ｇチオシアン酸グアニジン（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナ州、インディアナポリス）、２９．３ｍｌ滅菌水、１．７６ｍｌ ０．７５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２．６４ｍｌ １０％サルコシル（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、０．３６ｍｌ ２−メルカプトエタノール（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ））１．０ｍｌの存在下、滅菌５ｃｃシリンジのプランジャで柔らかくする。脾臓懸濁液を１８ゲージのニードルによって、粘性になり、すべての細胞が溶解するまで吸い上げ、次いで、微量遠心管に移す。ペトリ皿を１００μｌの溶液Ｄで洗浄して残存する脾臓をいずれも回収し、これを管に移す。次いで、懸濁液をさらに５〜１０回２２ゲージのニードルによって吸い上げる。サンプルを２つの微量遠心管に等分に分け、以下のものを、各々添加後に反転して混合しながら、順に加える：１００μｌ ２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、１．０ｍｌ 水で飽和したフェノール（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、２００μｌクロロホルム／イソアミルアルコール４９：１（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）。この溶液を１０秒間ボルテックス処理し、氷上で１５分間インキュベートする。２〜８℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、水相を新しい管に移す、等容積の水で飽和したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０：４９：１）を加え、管を１０秒間ボルテックス処理する。氷上で１５分インキュベートした後、サンプルを２〜８℃で２０分間遠心分離し、水相を新しい管に移し、等容量のイソプロパノールを用い、−２０℃で最低３０分間沈殿させる。４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、管を短時間回転させ、液体を残らず除去する。ＲＮＡペレットを３００μｌの溶液Ｄに各々溶解し、合わせ、等容量のイソプロパノールを用いて−２０℃で最低３０分間沈殿させる。サンプルを４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を前述のように吸引し、サンプルを１００μｌの氷冷７０％エタノールでリンスする。サンプルを４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離し、７０％エタノール溶液を吸引し、ＲＮＡペレットを真空乾燥させる。ペレットを１００μｌの滅菌蒸留水に再懸濁する。４０μｇ／ｍｌの濃度に対して吸光度１．０を用いてＡ２６０によって濃度を測定する。ＲＮＡは−８０℃で保存する。
【０１７５】
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製
前記のように精製した全ＲＮＡを、ｃＤＮＡの調製のための鋳型として直接用いる。ＲＮＡ（５０μｇ）を滅菌水で１００μＬに希釈し、１０μＬ−１３０ｎｇ／ｍＬオリゴｄＴ12を加える。サンプルを７０℃で１０分間加熱し、次いで、氷上で冷却する。４０μＬ ５×第一鎖バッファー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）、２０μＬ ０．１Ｍジチオスレイトール（ギブコ／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）、１０μＬ ２０ｍＭデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、および１０μＬの水を氷上で加える。次いで、サンプルを３７℃で２分間インキュベートする。１０μＬの逆転写酵素（スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＴＭ ＩＩ、ギブコ／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を加え、３７℃で１時間インキュベーションを続ける。ｃＤＮＡ産物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に直接用いる。
【０１７６】
ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲを用いて実質的にすべてのＨおよびＬ鎖遺伝子を増幅するために、実質的にすべての公開配列に対応するプライマーを選択する。ＨおよびＬのアミノ末端のヌクレオチド配列は相当な多様性を含むため、米国２００３０１０４４７７に記載されたように、３３種のオリゴヌクレオチドを合成し、Ｈ鎖の５’プライマーとして用い、２９種のオリゴヌクレオチドを合成し、κＬ鎖の５’プライマーとして用いる。５’プライマーは、以下の基準にしたがって作製する。第１に、Ｌ鎖の２番目および４番目のアミノ酸ならびに重鎖の２番目のアミノ酸を保存する。抗体のアミノ酸配列を変更するミスマッチは他のどの位置でも可能とする。第２に、各プライマーの５’側にＭ１３ウラシル鋳型に相補的な２０ヌクレオチドの配列を合成する。この配列はＨおよびＬ鎖プライマー間で異なり、Ｌ鎖プライマーについてはｐｅｌＢシグナル配列、Ｈ鎖プライマーについてはアルカリホスファターゼシグナル配列の３’側の２０ヌクレオチドに対応している。定常領域ヌクレオチド配列には、Ｈ鎖およびκＬ鎖各々に対し、１種の３’プライマーしか必要でない（図２）。各５’および３’プライマーの各対に対し、別個にＰＣＲによる増幅を実施した。各プライマー対に対し、５０ｐｍｏｌの５’プライマー、５０ｐｍｏｌの３’プライマー、０．２５μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μＬ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、３μＬのｃＤＮＡ（実施例２に記載）、５μＬ ２ｍＭ ｄＮＴＰ、５μＬ ＭｇＣｌ2を含む１０×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、および５０μＬまでのＨ2Ｏを含む５０μＬの反応を実施する。増幅はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９６００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、カリフォルニア州、フォスター・シティー）を用い、以下のプログラムを用いて行う：９４℃で１時間、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒の３０サイクル、７２℃で６分間、４℃。
【０１７７】
次いで、ＰＣＲプロセスのｄｓＤＮＡ産物を、３’プライマーのみを用いる非対称ＰＣＲに付し、実質的に標的遺伝子のアンチセンス鎖のみを作製する。各ｄｓＤＮＡ産物に対して、２００ｐｍｏｌの３’プライマー、２μＬのｄｓＤＮＡ産物、０．５μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１０μＬ ２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μＬ ＭｇＣｌ2を含む１０×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、および１００μＬまでのＨ2Ｏを含む１００μＬの反応を行う。前述したものと同一のＰＣＲプログラムを用いて一本鎖（ｓｓ）−ＤＮＡを増幅する。
【０１７８】
高速液体クロマトグラフィーによるｓｓ−ＤＮＡの精製およびｓｓ−ＤＮＡのキナーゼ処理
【０１７９】
Ｈ鎖ｓｓ−ＰＣＲ産物およびＬ鎖ｓｓ−ＰＣＲ産物を、２．５容量のエタノールおよび０．２容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、−２０℃で少なくとも３０分間インキュベートすることによってエタノール沈殿させる。２〜８℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間のエッペンドルフ遠心機での遠心分離によってＤＮＡをペレットにする。上清を注意深く吸引し、管を短時間２回目の回転をさせる。上清の最後の一滴までピペットで除去する。ＤＮＡを中程度加熱して１０分間真空乾燥させる。Ｈ鎖産物を２１０μＬの水中にプールし、Ｌ鎖産物を別の２１０μＬの水中にプールする。ｓｓ−ＤＮＡを、オーブン温度６０℃で、ヒューレット・パッカード１０９０ＨＰＬＣおよびＧｅｎ−Ｐａｋ（商標）ＦＡＸ陰イオン交換カラム（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）、マサチューセッツ州、ミルフォード）を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する。吸光度を２６０ｎｍでモニターする。ＨＰＬＣから溶出されるｓｓ−ＤＮＡを０．５分画分で回収する。ｓｓ−ＤＮＡを含有する画分を、前述のようにエタノール沈殿させ、ペレットにし、乾燥させる。乾燥ＤＮＡペレットを２００μＬの滅菌水中にプールする。
【０１８０】
必要に応じて、ｓｓ−ＤＮＡを突然変異誘発のための調製において５’でキナーゼ処理する。各サンプルに、２４μＬ １０×キナーゼバッファー（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、オハイオ州、クリーブランド）、１０．４μＬ １０ｍＭアデノシン−５’−三リン酸（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州・インディアナポリス）、および２μＬポリヌクレオチドキナーゼ（３０ユニット／μＬ、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル、オハイオ州、クリーブランド）を加え、管を３７℃で１時間インキュベートする。管を７０℃で１０分間インキュベートすることによって反応を停止させる。ＤＮＡを平衡化フェノール（ｐＨ＞８．０、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル、オハイオ州、クリーブランド）−クロロホルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）で１回抽出することで精製する。抽出後、前述のように、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ペレットにする。このＤＮＡペレットを乾燥させ、次いで、５０μＬの滅菌水に溶解する。ＤＮＡのアリコートの２６０ｎｍでの吸光度を測定し、吸光度１．０に対して３３μｇ／ｍＬを用いることによって濃度を決定する。サンプルは−２０℃で保存する。
【０１８１】
抗体ファージディスプレイベクター
【０１８２】
抗体をクローニングする抗体ファージディスプレイベクターを、６６８−４と呼ばれる、イクシス（Ｉｘｓｙｓ）から供給されるＭ１３ベクターから導く。ベクター６６８−４は、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）、ＷＯ９２／０６０２４によって記載された、ベクターに挿入されたマウスモノクローナルＦａｂ断片の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含んでいた。ベクターは、マウス抗体のＬ鎖可変領域の５’側に融合しているＬａｃプロモーター、ｐｅｌＢシグナル配列、マウス抗体の全κ鎖、マウス抗体のＨ鎖可変領域の５’末端にアルカリホスファターゼシグナル配列、全可変領域およびＨ鎖の第１定常領域、ならびにＩｇＧ１ Ｈ鎖のヒンジ領域の５つのコドンを含んでいる。デカペプチド配列はＨ鎖ヒンジ領域の３’末端にあり、アンバー停止コドンがデカペプチド配列を偽遺伝子ＶＩＩＩ配列から隔てている。アンバー停止によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）サプレッサー株、例えば、ＸＬ１ブルー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州、サン・ディエゴ）における遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を含むＨ鎖融合タンパク質の発現が可能となるが、非サプレッサー細胞株、例えば、ＭＫ３０（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）では発現されない（図３Ａ参照）。
【０１８３】
第１の誘導クローニングベクターを作製するために、ウラシル鋳型のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によってＨ鎖およびＬ鎖の可変領域内に欠失を作製する（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ８２、４８８頁（１９８５）、クンケルら、メソッヅ・エンジモロジー、１５４、３６７頁（１９８７））。これらの突然変異によって、ＣＤＲ１の５’末端からＣＤＲ３の３’末端の各鎖の領域が欠失し、突然変異によって、そこでタンパク質翻訳が停止するＤＮＡ配列が加わる（突然変異オリゴヌクレオチドについては図４参照）。これによって、挿入断片を含まないクローンにおけるＨまたはＬ鎖定常領域の発現が妨げられ、それによってプラークを挿入断片の存在についてスクリーニングすることが可能となる。得られたクローニングベクターをＢＳ１１と呼ぶ。
【０１８４】
ＢＳ１１に対して多数の変更を行って、本スクリーニング法に用いるクローニングベクターを作製する。重鎖と偽遺伝子ＶＩＩＩ配列の間のアンバー停止コドンを除去し、どの重鎖も遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を含む融合タンパク質として発現されるようにする。これによって、ＢＳ１１に対して、ファージでの抗体のコピー数が増加する。Ｌ鎖の３’末端とアルカリホスファターゼシグナル配列の５’末端の間の配列中のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を欠失させ、抗体をｐＢＲ３２２誘導体にサブクローニングできるようにする。ＬおよびＨ鎖のカルボキシル末端の鎖間システイン残基をセリン残基に変更する。これによって、抗体安定性に影響を及ぼすことなく、抗体の発現レベルおよびファージでの抗体のコピー数が増加する。ｌａｃプロモーターの５’側および偽遺伝子ＶＩＩＩ配列の３’側の非必須ＤＮＡ配列を欠失させ、Ｍ１３ベクターの大きさおよび再編成の可能性を小さくする。翻訳停止に加え、転写停止ＤＮＡ配列をベクターに、Ｌ鎖クローニング部位で加え、パニングの際に非特異的に結合する可能性がある、その表面に重鎖タンパク質しか有さないファージが作製されないようにする。最後に、種々のベクターにタンパク質タグのＤＮＡ配列を加え、金属キレートクロマトグラフィー（ポリヒスチジン配列）による、またはデカペプチドタグおよびデカペプチドタグと結合する固定化抗体を含む磁性ラテックスを用いるアフィニティー精製による多価ファージの濃縮を可能にする。ベクターＢＳ３９はポリヒスチジン配列を、κ鎖の３’末端に含み、重鎖の末端にはタグを含まない。他方、ＢＳ４５はポリヒスチジン配列を、重鎖定常領域の末端と偽遺伝子ＶＩＩＩ配列の間に、デカペプチド配列を、κ鎖定常領域の３’末端に含む。
【０１８５】
脾臓抗体ファージライブラリーの作製に用いるウラシル鋳型の調製
【０１８６】
２５０ｍＬのバッフル付振盪フラスコに入れた５０ｍｌ ２×ＹＴに、１ｍＬの大腸菌ＣＪ２３６（バイオラッド（ＢｉｏＲＡＤ）、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）一晩培養物を加える。この培養物を３７℃でＯＤ600＝０．６に増殖させ、１０μｌのベクターファージ保存液の１／１００希釈液を用いて播種し、増殖を６時間継続する。約４０ｍＬの培養物を４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清（３０ｍＬ）を新しい遠心管に移し、１０ｍｇ／ｍｌ ＲｎアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）１５μｌを添加した後、室温で１５分間インキュベートする。７．５ｍｌの２０％ポリエチレングリコール８０００（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）／３．５Ｍ酢酸アンモニウム（シグマ・ケミカル社、ミズーリ州、セント・ルイス）を加えることによってファージを沈殿させ、氷上で３０分間インキュベートする。サンプルを２〜８℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清を注意深く廃棄し、管を短時間回転させ、上清を残らず除去する。ペレットを４００μｌの高塩バッファー（３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、１．５ｍＬの試験管に移す。等容量の平衡化フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４９：１）を用い、白色の界面の痕跡が見えなくなるまで、ファージ保存液を反復して抽出し、次いで、等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を用いて抽出する。２．５容量のエタノールおよび１／５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを用いてＤＮＡを沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートする。ＤＮＡを４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを冷７０％エタノールで１回洗浄し、真空乾燥させる。ウラシル鋳型ＤＮＡを３０μｌの滅菌水に溶解し、濃度４０μｇ／ｍｌに対して吸光度１．０を用いてＡ２６０によって濃度を求める。鋳型を滅菌水で２５０ｎｇ／μｌに希釈し、分注し、−２０℃で保存する。
【０１８７】
抗体ファージライブラリーを作製するための、ｓｓ−ＤＮＡおよび大腸菌へのエレクトロポレーションを用いるウラシル鋳型の突然変異誘発
【０１８８】
単鎖重鎖および軽鎖遺伝子をファージディスプレイベクターウラシル鋳型に同時に導入することによって、抗体ファージディスプレイライブラリーを作製する。通常の突然変異誘発は２μｇスケールで、０．２ｍＬ ＰＣＲ反応管中で以下のものを混合することによって実施する：８μｌの（２５０ｎｇ／ｍｌ）ウラシル鋳型（実施例５および６）、８μｌの１０×アニーリングバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＮａＣｌ）、３．３３μｌのキナーゼ処理した単鎖重鎖挿入断片（１００ｎｇ／μｌ）、３．１μｌのキナーゼ処理した単鎖軽鎖挿入断片（１００ｎｇ／μｌ）、および８０μｌまでの滅菌水。ＤＮＡをＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９６００サーマルサイクラーで以下の温度プロフィールを用いてアニーリングする：９４℃で２０秒、８５℃で６０秒、３０分かけて８５℃〜５５℃の傾斜、５５℃で１５分間維持。プログラムが終了した後ＤＮＡを氷に移す。伸長／ライゲーションは、８μｌの１０×合成バッファー（５ｍＭ 各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＤＴＴ）、８μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、８μｌ希釈したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ、ニューイングランド・バイオラブス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、マサチューセッツ州）を加え、３７℃で３０分間インキュベートすることによって実施する。反応を３００μｌの突然変異誘発停止バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で停止させる。突然変異誘発ＤＮＡを平衡化フェノール（ｐＨ＞８）：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）で１回抽出し、ＤＮＡを−２０℃で少なくとも３０分間エタノール沈殿させる。前述のように、ＤＮＡをペレットにし、上清を注意深く除去する。サンプルを再度短時間回転させ、ピペットマンを用いてエタノールを残らず除去する。ペレットを真空乾燥させる。ＤＮＡを４μｌの滅菌水に再懸濁する。
【０１８９】
１μｌの突然変異誘発ＤＮＡ（５００ｎｇ）を、４０μｌの電気的コンピテント大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ギブコ／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）にトランスファーする。形質転換された細胞を１．０ｍＬ ２×ＹＴブロスと混合し、１５ｍＬの滅菌培養管に移す。培養物を２３℃、３００ｒｐｍで一晩振盪することによって第１ラウンドの抗体ファージを作製する。エレクトロポレーションの効率は、培養物の１０-3および１０-4希釈液１０μｌをＬＢアガープレート上にプレーティングすることによって測定する。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートする。効率は、１０-3希釈液プレート上のプラークの数に１０5を掛けることによって、または１０-4希釈液プレート上のプラーク数に１０6を掛けることによって求める。エレクトロポレーションから一晩培養したものを、１．５ｍｌの管に移し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞をペレットにする。次いで、第１ラウンドの抗体ファージである上清を、１５ｍＬのプラグシールキャップ付滅菌遠心管移す。
【０１９０】
エレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換
【０１９１】
電気的コンピテントな大腸菌細胞を氷上で解凍する。気泡が入らないよう注意しながら、細胞を上下に２〜３回穏やかにピペッティングすることによってＤＮＡを２０〜４０μＬの電気的コンピテントな細胞と混合する。細胞を、再度、移す際に気泡が入らないように注意しながら、氷上で冷却しておいたジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）キュベット（０．２ｃｍギャップ、バイオラッド、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）に移す。このキュベットを大腸菌パルサー（バイオラッド、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）に入れ、製造業者の推奨に従い１．８８ｋＶに設定した電圧でエレクトロポレーションを行う。形質転換されたサンプルを、２×ＹＴブロスで１ｍｌに直ちに希釈し、手順の指示通り処理する。
【０１９２】
ビオチン化抗原および抗体の調製
【０１９３】
タンパク質抗原または抗体を、最低１００容積の２０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８（ＢＢＳ）に対して、２〜８℃で少なくとも４時間透析する。ビオチン化の前にバッファーを少なくとも１回を交換する。タンパク質抗原または抗体を、ビオチン−ＸＸ−ＮＨＳエステル（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州、ユージーン、ジメチルホルムアミド中４０ｍＭの保存溶液）と、最終濃度１ｍＭで、室温で１時間反応させる。１時間後、タンパク質抗原または抗体をＢＢＳに十分に透析して未反応の小分子を除去する。
【０１９４】
アルカリホスファターゼ抗原コンジュゲートの調製
【０１９５】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ、カルザイム・ラボラトリーズ（Ｃａｌｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州、サン・ルイス・オビスポ）を、２〜８℃で少なくとも４時間、最低１００容積のカラムバッファー（５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、ｐＨ７．０）に対する透析に付す。ＡＰを使用する前に少なくとも２回バッファーを交換する。ＡＰを透析から回収し、室温にし、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対して吸光度０．７７を用いて２８０ｎｍの吸光度によって濃度を求める。ＡＰをカラムバッファーで５ｍｇ／ｍＬに希釈する。ＡＰとスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ピエルス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．）、イリノイ州、ロックフォード）の反応を、２０：１の割合のＳＭＣＣ：ＡＰを用いて実施する。ＳＭＣＣをアセトニトリルに２０ｍｇ／ｍＬで溶解し、ボルテックス処理または迅速に攪拌しながらＡＰに加える際に８４倍に希釈する。溶液を室温で９０分間静置させ、次いで、カラムバッファーで平衡化したカラムにおけるゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇ５０Ｆｉｎｅ、ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いて未反応のＳＭＣＣおよび低分子量反応産物をＡＰから分離する。
【０１９６】
タンパク質抗原を最低１００容積の２０ｍＭリン酸カリウム、４ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して、２〜８℃で少なくとも４時間透析する。抗原を使用する前に少なくとも２回バッファーを交換する。２８０ｎｍの吸光度によって、またはローリー法によって抗原の量を定量する。抗原とＮ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ、ピエルス・ケミカル社、イリノイ州、ロックフォード）の反応を、２０：１モル比のＳＰＤＰ：抗原を用いて実施する。ＳＰＤＰをジメチルホルムアミドに４０ｍＭで溶解し、ボルテックス処理しながら抗原溶液に入れて希釈する。この溶液を室温で９０分間静置させ、その時点で、タウリン（アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）を最終濃度２０ｍＭに５分間加えることによって反応をクエンチする。タンパク質にジチオスレイトール（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）を最終濃度１ｍＭで３０分間加える。５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、ｐＨ７．０で平衡化したカラムにおけるゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、低分子量反応産物を抗原から分離する。
【０１９７】
ＡＰおよび抗原を、等モル比でともに混合する。反応物を２時間室温に置く。このコンジュゲートを、１％ウシ血清アルブミン（３０％ＢＳＡ、バイエル、イリノイ州、カンカキーから作製）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2、０．１％ポリビニルアルコール（８０％加水分解、アルドリッチ・ケミカル社、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）、ｐＨ８．０を含有するブロックで０．１ｍｇ／ｍＬに希釈する。
【０１９８】
アビジン磁性ラテックスの調製
【０１９９】
磁性ラテックス（エスタポール（Ｅｓｔａｐｏｒ）、１０％固体、バングス・ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インディアナ州、フィッシャー）を十分に再懸濁し、１５ｍｌの円錐管に２ｍｌ分注する。磁性ラテックスを１２ｍｌの蒸留水に懸濁し、磁石を用いて溶液から１０分間分離する。依然磁石中にありながら、１０ｍＬの滅菌ピペットを用いて液体を注意深く除去する。この洗浄プロセスをさらに３回反復する。最後に洗浄した後、ラテックスを２ｍｌの蒸留水に再懸濁する。別個の５０ｍｌ円錐管中で、１０ｍｇのアビジン−ＨＳ（ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）、ピエルス、イリノイ州、ロックフォード）を１８ｍｌの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）に溶解する。ボルテックス処理しながら、希釈したアビジン−ＨＳに洗浄した磁性ラテックス２ｍｌを加え、混合物をさらに３０秒間ボルテックス処理する。この混合物を、３０分毎に振盪しながら、４５℃で２時間インキュベートする。磁石を用いてアビジン磁性ラテックスを溶液から分離し、前述したように、２０ｍｌ ＢＢＳで３回洗浄する。最後に洗浄した後、ラテックスを１０ｍｌ ＢＢＳに再懸濁し、４℃で保存する。
【０２００】
使用する直前に、アビジン磁性ラテックスをパニングバッファー（４０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、ｐＨ７．５）中で平衡化する。滅菌１５ｍｌ遠心管にパニング実験に必要なアビジン磁性ラテックス（２００μｌ／サンプル）を加え、パニングバッファーで１０ｍｌにする。この管を磁石上に１０分間置き、ラテックスを分離する。前述したように、１０ｍＬ滅菌ピペットで溶液を注意深く除去する。磁性ラテックスを１０ｍＬのパニングバッファーに再懸濁し、２回目の洗浄を開始する。磁性ラテックスをパニングバッファーで全３回洗浄する。最後に洗浄した後、ラテックスをパニングバッファーに再懸濁し、初期アリコート容量とする。
【０２０１】
Ｍ１３ファージまたは抗体ファージディスプレイベクター突然変異誘発反応で形質転換された細胞のプレーティング
【０２０２】
１００ｍｍ ＬＢアガープレートにプレーティングする場合は２００μＬの大腸菌ＸＬ１−ブルーの一晩培養物に、または、滅菌１５ｍｌ培養管中の１５０ｍｍプレートにプレーティングする場合は６００μＬの一晩細胞に、ファージサンプルを加える。ＬＢトップアガー（１００ｍｍプレートに対して３ｍＬ、または１５０ｍｍプレートに対して９ｍＬ、５５℃で保存されたトップアガー、付録Ａ１、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリーズ・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｅｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、（１９８９）サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ）を加えた後、混合物を、アガー表面の過剰な水分を除去するよう予熱しておいた（３７℃〜５５℃）ＬＢアガープレート上に等分に分配する。プレートを、トップアガーが固化するまで室温で冷却する。指示通り、プレートを反転させ、３７℃でインキュベートする。
【０２０３】
アルカリホスファターゼコンジュゲートを含むニトロセルロースフィルターの現像
【０２０４】
ニトロセルロースフィルターをＬＢアガープレート上で一晩インキュベートした後、メンブランピンセットを用いてプレートからフィルターを注意深く回収し、抗原−ＡＰコンジュゲートを用いる場合は、カゼインブロック（１％カゼイン（ハマーステン（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｎ）等級、リサーチ・オーガニックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、オハイオ州、クリーブランド）を含むブロック）、またはヤギ抗マウスκ−ＡＰ（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ）、アラバマ州、バーミンガム）を用いる場合はブロック中のいずれかで、２時間インキュベートする。２時間後、フィルターをＡＰコンジュゲートとともに２〜４時間インキュベートする。抗原−ＡＰコンジュゲートをカゼインブロックに最終濃度１μｇ／ｍＬで希釈し、ヤギ抗−マウスκ−ＡＰコンジュゲートをブロックに最終濃度１μｇ／ｍＬで希釈する。フィルターを４０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）（フィッシャー・ケミカル、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）で各５分間３回洗浄する。最後の洗浄の後、フィルターを、０．２Ｍ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＪＢＬサイエンティフィック（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州、サン・ルイス・オビスポ）、０．５Ｍ ＴＲＩＳ、０．３３ｍｇ／ｍＬニトロブルーテトラゾリウム（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）および０．１６６ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート、ｐ−トルイジン塩を含有する溶液中で現像する。
【０２０５】
重鎖上のタグ、およびκ鎖上のポリヒスチジン配列を用いないＢＮＰペプチドに対するポリクローナルファージの濃縮
【０２０６】
この実施例では、ＢＮＰペプチドに対するファージライブラリーの複数ラウンドのスクリーニングを記載する。何ラウンドかのスクリーニングを、抗体の多重コピーをファージが提示するための濃縮のラウンドと入れ替える。ファージがいずれかの軽鎖を提示するパーセンテージと注目するＢＮＰペプチドに対して特異的な親和性を有するＦａｂ断片（以下、「抗原」と呼ぶ）をファージが提示するパーセンテージを、スクリーニングの各ラウンドの後に測定する。
【０２０７】
第１ラウンド抗体ファージは、前述したようにＢＳ３９ウラシル鋳型を用いて調製する。突然変異誘発ＤＮＡの２回のエレクトロポレーションの効率は９．７×１０7ＰＦＵおよび８．３×１０7ＰＦＵであった。両エレクトロポレーションから得たファージを合わせ、パニングバッファーで３．２ｍｌに希釈する。ファージを、１５ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管に２〜１ｍＬのアリコートに分注する。各ファージアリコートに抗原−ビオチン（１０μＬ、１０-6Ｍ保存濃度）を加える。ファージサンプルを２〜８℃で一晩インキュベートする。
【０２０８】
インキュベートした後、ファージサンプルをアビジン磁性ラテックスを用いて取り出す。サンプルあたり、平衡化したアビジン磁性ラテックス（実施例１１参照）、２００μＬラテックスをファージとともに室温で１０分間インキュベートする。１０分後、各ファージサンプルに約９ｍＬのパニングバッファーを加え、磁石を用いて磁性ラテックスを溶液から分離する。磁石中で１０分後、結合していないファージを、１０ｍＬ滅菌ピペットで注意深く除去する。次いで、磁性ラテックスを１０ｍＬのパニングバッファーに再懸濁し、２回目の洗浄を開始する。ラテックスを前述したように全５回洗浄する。各洗浄について、管を磁石中に１０分間置き、結合していないファージを磁性ラテックスから分離する。５回目の洗浄の後、磁性ラテックスを１ｍＬ ＴＢＳに再懸濁し、１．５ｍＬの管に移す。この時点でラテックスのアリコートを取り、前述したように、１００ｍｍ ＬＢアガープレート上にプレーティングする。磁性ラテックスの大部分（９９％）を２００μＬ ２×ＹＴに再懸濁し、実施例１２に記載したように１５０ｍｍ ＬＢアガープレート上にプレーティングする。１００ｍｍ ＬＢアガープレートを３７℃で６〜７時間インキュベートし、次いで、プレートを室温に移し、ニトロセルロースフィルター（孔サイズ０．４５μｍ、ＢＡ８５プロトラン（Ｐｒｏｔｒａｎ）、シュライシャー・アンド・シュール（Ｓｃｈｌｉｅｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ニューハンプシャー州、キーン）をプラーク上にかぶせる。ニトロセルロースフィルターを付けたプレートを室温で一晩インキュベートする。１５０ｍｍプレートを用いて、磁性ラテックスと結合しているファージを増幅し抗体ファージの次のラウンドを作製する。これらのプレートを３７℃で４時間、次いで２０℃で一晩インキュベートする。
【０２０９】
一晩インキュベートした後、抗体ファージを１５０ｍｍプレートから溶出し、前述したように、アルカリホスファターゼ−抗原を用いてフィルターを発現させる。８ｍＬ ２ＹＴ培地を菌叢上にピペットで加え、室温で２０分間穏やかに振盪することによって１５０ｍｍプレートから抗体ファージを溶出する。ファージを１５ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管に移し、ＬＢプレートに由来する細片を、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによってペレットにする。次いで、第２ラウンド抗体ファージを新しい管に移す。
【０２１０】
パニングの第２ラウンドを開始するために、ファージの１０-7および１０-8希釈液１０μＬを１００ｍｍＬＢアガープレートにプレーティングすることによって抗体ファージを滴定する。このプレートを３７℃で６〜７時間インキュベートし、次いで、プレート上のプラーク数を計数する。また、抗体ファージにおけるκ陽性のパーセンテージをモニターするために、ニトロセルロースフィルターをプレート上にかぶせ、室温で一晩インキュベートする。κ陽性のパーセンテージは無傷のＦａｂ断片を提示するファージの割合の尺度である。
【０２１１】
両第２ラウンド抗体ファージサンプルを、各サンプルをパニングバッファーに最終濃度５×１０9ＰＦＵ／ｍＬで希釈し、最終容量を１ｍＬにすることによってプールする（抗
体ファージの力価は約２×１０12ＰＦＵ／ｍＬおよび１．７×１０12である）。ファージに抗原−ビオチン（１０μＬ、１０-6Ｍ保存濃度）を加え、２〜８℃で一晩ファージをインキュベートする。抗体ファージ力価プレート上のニトロセルロースフィルターを、前述したように、ヤギ抗−マウスκＡＰを用いて発現させる。第２ラウンド抗体ファージを、前述したようにアビジン磁性ラテックスを用いて取り出す。ラテックスをパニングバッファーで洗浄した後、ラテックスを１ｍＬ ＴＢＳに再懸濁し、１．５ｍＬの管に移す。ラテックスのアリコートを、前述したように、１００ｍｍ ＬＢアガープレートにプレーティングし、機能的陽性を調べ、ラテックスの残りを１５０ｍｍ ＬＢアガープレートにプレーティングして第３ラウンド抗体ファージを作製する。抗体ファージを滴定し、ファージをパニングバッファーに希釈し、抗原−ビオチンを加え、ファージを２〜８℃で少なくとも１６時間インキュベートし、ファージをアビジン磁性ラテックスで取り出し、磁性ラテックスをプレーティングするというこの基本手順を、１０ラウンドのパニング継続する。前述したものからの変更は、結合している抗体のアフィニティーを高めるために抗原−ビオチン濃度がより低いということ、および取り出されるファージの数が１０10と１０8の間であるということだけである。
【０２１２】
抗原−ビオチンに対するパニングの１０回目のラウンドの後、抗体ファージを多価ディスプレイのための濃縮のラウンドに付す。濃縮は、提示された軽鎖に融合されているヘキサヒスチジンタグのＮｉ ＮＴＡアガロース（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州、チャッツワース）への結合によって達成される。１１回目のラウンドの抗体ファージ（２．５ｍＬ）を、プラグシールキャップ付１５ｍＬのディスポーザブル滅菌遠心管中で２．５ｍＬパニングバッファーに希釈する。以下の手順を用いてＮｉ ＮＴＡをパニングバッファーに平衡化する。樹脂（ファージサンプルあたり１ｍＬ）を、５０ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管中で、パニングバッファーで５０ｍＬに希釈し、次いで、ＩＥＣ遠心分離機で、５００ｒｐｍで１分間ペレットにする。上清を５０ｍＬのディスポーザブルピピットを用いて注意深く除去し、２回目の洗浄のために樹脂をパニングバッファーで５０ｍＬに再度希釈する。樹脂をパニングバッファー中で平衡化するために、このように樹脂を全４回洗浄する。次いで、平衡化した樹脂をパニングバッファーでその最初の容積に再懸濁する。次いで、平衡化した樹脂（１ｍＬ）をファージに加え、管を１５分間穏やかに揺り動かす。１５分後、ＩＥＣ遠心分離機で、５００ｒｐｍで１分間樹脂をペレットにする。上清を１０ｍＬディスポーザブルピペットで穏やかに除去し、樹脂を最初の洗浄のために１０ｍＬパニングバッファーに再懸濁する。前述したように、樹脂をペレットにし、上清を除去し、樹脂を１０ｍＬのパニングバッファーに２回目の再懸濁をする。この手順を全５回のパニングバッファー洗浄のために反復する。５回目の洗浄液を除去した後、樹脂を１ｍＬの溶出バッファー（５０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）に再懸濁し、１．５ｍＬの管に移す。樹脂を１時間穏やかに揺り動かし、抗体ファージを溶出する。１時間後、樹脂をペレットにし（エッペンドルフ遠心分離機で１４，０００ｒｐｍ、５分）、樹脂を少しも移さないよう注意しながら、ファージを回収する。ファージ溶液のｐＨを８に調整するために、１ｍＬのファージサンプルに５０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３および４６μＬの１Ｍ ＮａＯＨを加える。また、１０１Ｌの３００ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（バイエル、イリノイ州、カンカキー）をファージサンプルに加える。前述のように、抗原−ビオチンを用いるパニングの１１回目のラウンドのために、得られたファージ溶液（１ｍＬ）を１５ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管に移す。
【０２１３】
パニングの１２回目〜１４回目のラウンドを前述のように行い、ここで抗体ファージをＮｉ ＮＴＡに結合させ、溶出し、溶出したファージを抗原−ビオチンを用いて取り出す。しかし、ラウンド１３において、Ｎｉ ＮＴＡから溶出したファージに標識していないＣ末端ＢＮＰペプチドを抗原−ビオチンに対して１００倍モル過剰で加え、Ｃ末端ＢＮＰペプチド結合せず、抗原と特異的に結合する抗体を選択する。
【実施例３】
【０２１４】
生化学的解析
標準的なイムノアッセイ技術を用いてＢＮＰを測定する。これらの技術は、タンパク質標的と特異的に結合する抗体の使用を含む。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を抗体あたり約５のＮＨＳ−ビオチン成分の割合で用いて、ＢＮＰに対する抗体をビオチン化する。次いで、標準アビジン３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルにビオチン化した抗体を加え、プレートに結合していないビオチン化抗体を除去する。これによって、マイクロタイタープレートに抗−ＢＮＰ固相が形成される。別の抗ＢＮＰ抗体を、標準技術を用い、ＳＭＣＣおよびＳＰＤＰ（ピエルス、イリノイ州、ロックフォード）を用いてアルカリホスファターゼにコンジュゲートする。イムノアッセイをＴＥＣＡＮジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）ＲＳＰ２００／８ワークステーションで実施する。試験サンプル（１０μｌ）をピペットでマイクロタイタープレートのウェルに入れ、６０分間インキュベートする。次いで、このサンプルを除去し、ウェルを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２０ｍＭホウ酸塩（ｐＨ７．４２）からなる洗浄バッファーで洗浄する。次いで、ウェルにアルカリホスファターゼ−抗体コンジュゲートを加え、さらに６０分間インキュベートし、その後、抗体コンジュゲートを除去し、洗浄バッファーでウェルを洗浄する。ウェルに基質（アットフォス（ＡｔｔｏＰｈｏｓ）（登録商標）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州、マディソン）を加え、蛍光産物の形成度を試験サンプル中のＢＮＰの濃度と関連付ける。
【実施例４】
【０２１５】
ＤＰＰ阻害剤の合成
【０２１６】
ペプチドカップリング化学を用いて線状ボロＰｒｏ化合物を調製することが好ましい。本発明に用いるペプチドカップリング化学法および手順は容易に入手できる。これらの方法を用いる教本の例としては、それだけには限らないが、以下の、参照により本明細書に組み込まれる引用文が挙げられる：Ｐ．Ｄ．ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）、「アン・イントロダクション・トゥー・ペプチド・ケミストリー（Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ジョン・ウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９０；ミクロス・ボダンスキー（Ｍｉｋｌｏｓ Ｂｏｄａｎｓｋｙ）、「ペプチド・ケミストリー・ア・プラクティカル・テキストブック（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ）」、スプリンガー−ベルラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、１９８８；ミクロス・ボダンスキー、「プリンシプルズ・オブ・ペプチド・シンセシス、リアクティビティー・アンド・ストラクチャー・コンセプツ・イン・オーガニック・ケミストリー（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第１６巻、スプリンガー−ベルラグ、１９８４；およびミクロス・ボダンスキー、「プリンシプルズ・オブ・ペプチド・シンセシス、リアクティビティー・アンド・ストラクチャー・コンセプツ・イン・オーガニック・ケミストリー」第２１巻、スプリンガー−ベルラグ、１９８４。
【０２１７】
本発明の化合物は、ＷＯ９８／００４３９に開示されたようにＨ−ボロＰｒｏの合成で開始することができる。Ｈ−ボロＰｒｏの使用は単に例示目的のためであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。ＷＯ９８／００４３９に従い、Ｈ−ボロＰｒｏを、従前に開発され、記載された（Ｇ．Ｒ．フレンケ（ｆｌｅｎｔｋｅ）ら、「インヒビション・オブ・ジペプチジル・アミノペプチダーゼＩＶ（ＤＰ−ＩＶ）バイ・Ｘａａ−ボロＰｒｏジペプチド・アンド・ユース・オブ・ジーズ・インヒビターズ・トゥー・エクザミン・ザ・ロール・オブ・ＤＰ−ＩＶ・イン・Ｔ−セル・ファンクション（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ （ＤＰ−ＩＶ） ｂｙ Ｘａａ−ｂｏｒｏＰｒｏ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＤＰ−ＩＶ ｉｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」）ＰＮＡＳ（米国）８８、１５５６〜１５５９頁（１９９１）、また、米国特許第５，４６２，９２８号にも記載されている）合成経路によって調製することができる。あるいは、Ｈ−ボロＰｒｏは新規手順によって製造することもできる（ケリー（Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．Ａ．ら、「ザ・エフィシャント・シンセシス・アンド・シンプル・レゾルーション・オブ・ア・プロリン・ボロネート・エステル・スータブル・フォー・エンザイム・インヒビション・スタディーズ（Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ ａ ｐｒｏｌｉｎｅ ｂｏｒｏｎａｔｅ ｅｓｔｅｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ）」、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）４９、１００９〜１０１６頁、（１９９３））。報告によれば、これら両合成経路ともラセミ化合物のＨ−ボロＰｒｏピナンジオールが生成する。
【０２１８】
ＷＯ９８／００４３９によれば、まず、ラセミ化合物のＨ−ボロＰｒｏを、光学活性ブロッキング保護基（（１Ｓ、２Ｓ、３Ｒ、５Ｓ）−＋−ピナンジオール異性体）を用いて結晶化によって分割し、次いで、同位体的に純粋なＬ−ボロＰｒｏおよびＤ−ボロＰｒｏをリジンの立体化学的に純粋なＬ異性体とカップリングすることによって、Ｚ−Ｌｙｓ−ボロＰｒｏの立体化学的に純粋なＬ、ＬおよびＬ，Ｄジアステレオマーを調製する（米国特許第５，４６２，９２８号参照）。あるいは、ラセミ化合物のＨ−ボロＰｒｏをＬ−Ｌｙｓによってカップリングし、ジアステレオマーのＰｒｏ−ボロＰｒｏについて従前に記載されているように（Ｗ．Ｇ．グートハイル（Ｇｕｔｈｅｉｌ）およびＷ．Ｗ．バコブチン（ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ）、「セパレーション・オブ・Ｌ−Ｐｒｏ−ＤＬ−ボロＰｒｏ・イントゥー・イッツ・コンポーネント・ジアステレオマーズ・アンド・カイネティック・アナリシス・オブ・ゼア・インヒビション・オブ・ジペプチジル・ペプチダーゼ・ＩＶ．ア・ニュー・メソッド・フォー・ザ・アナリシス・オブ・スロー、タイト−バインディング・インヒビション（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−Ｐｒｏ− ＤＬ−ｂｏｒｏＰｒｏ ｉｎｔｏ Ｉｔｓ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ． Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｌｏｗ， Ｔｉｇｈｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３２、８７２３〜８７３１頁、（１９９３））、逆相ＨＰＬＣを用いて得られたジアステレオマーのＺ−Ｌｙｓ−ボロＰｒｏ−ジエステルをその成分Ｌ，ＤとＬ、Ｌジアステレオマーに分離することによって、Ｌｙｓ−ボロＰｒｏのＬ，ＬおよびＬ，Ｄジアステレオマーを高い光学純度で調製する。
【実施例５】
【０２１９】
ジペプチジルペプチダーゼの精製
【０２２０】
以下の実施例はジペプチジルペプチダーゼＩＶについての例示的なものである：ジペプチジルペプチダーゼＩＩは、米国特許第６，４８５，９５５号の方法と同様に単離し、用いることができる。
【０２２１】
ブタ酵素を、いくつかの改変を加えながらも、従前に記載されたように（１）精製する。１５〜２０個体の動物から腎臓を獲得し、皮質を切り取り、−８０℃で凍結する。凍結組織（２０００〜２５００ｇ）を、ワーリングブレンダー中、１２Ｌの０．２５Ｍスクロース中でホモジェナイズする。ホモジェネートを３７℃に１８時間静置し、ＤＰＰ４の細胞膜からの切断を促す。切断ステップの後、ホモジェネートを４℃、７０００×ｇで２０分間遠心分離することによって清澄化し、上清を回収する。固体硫酸アンモニウムを６０％飽和まで加え、１０，０００×ｇで遠心分離することによって沈殿物を回収し、廃棄する。上清にさらなる硫酸アンモニウムを８０％飽和まで加え、８０％ペレットを回収し、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４に溶解する。
【０２２２】
２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４に対して透析した後、１０，０００×ｇで遠心分離することによって調製物を清澄化する。次いで、清澄化した調製物を、同バッファー中で平衡化したＣｏｎＡセファロース３００ｍｌにアプライする。一定のＡ２８０までバッファーで洗浄した後、カラムを５％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチルα−Ｄ−マンノピラノシドで溶出する。活性画分をプールし濃縮し、５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に対して透析する。透析した物質を同バッファー中で平衡化したファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）・リソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）Ｓカラム１００ｍｌに流す。フロースルー物質を回収すると、酵素活性のほとんどが含まれている。再度、活性物質を濃縮し、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４中で透析する。最後に、濃縮した酵素をファルマシアＳ−２００ゲル濾過カラムでのクロマトグラフィーに付し、低分子量夾雑物を除去する。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってカラム画分の純度を分析し、最も純度の高い画分をプールし、濃縮する。精製した酵素を−８０℃で２０％グリセロール中に保存する。
【実施例６】
【０２２３】
ジペプチジルペプチダーゼのアッセイ
【０２２４】
酵素は、ナガツら、アナリティカル・バイオケミストリー、７４、４６６〜７６頁、１９７６に従前に記載されたように、定常状態条件下で、基質としてＢＮＰを用い、以下の改変を加えてアッセイする。反応液は、１００μＬの最終容量中、１００ｍＭ ＡＣＥＳ、５２ｍＭ ＴＲＩＳ、５２ｍＭエタノールアミン、５００μＭ 基質、０．２％ ＤＭＳＯ、および４．５ｎＭ酵素、２５℃、ｐＨ７．４を含む。陽性化合物の解析には、基質と阻害剤濃度双方の関数として定常状態動力学的阻害定数を求める。完全阻害実験は、１１の基質濃度および７の阻害剤濃度を含め、３連の測定を行う。Ｋｉが２０ｎＭ未満である強力結合阻害剤については、酵素濃度を０．５ｎＭに下げ、反応時間を１２０分に増加する。３枚のプレートからプールしたデータセットを競合的、非競合的、不競合的阻害のいずれかに適当な方程式に当てはめる。
【実施例７】
【０２２５】
ナトリウム利尿ペプチドの化学的脱グリコシル化
【０２２６】
Ｎ2で飽和したガラス管において、５０μｇのタンパク質を、１００μｌのトリフルオロメタンスルホン酸／アニソール（２：１、ｖ／ｖ）試薬とともに暗黒下、４℃で２時間インキュベートする。−２０℃の６０％（ｖ／ｖ）ピリジンを添加することによって反応を停止する。タンパク質を、２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０に対して十分に透析する。
【実施例８】
【０２２７】
ナトリウム利尿ペプチドの酵素的脱グリコシル化
【０２２８】
４０μＬのサンプルに２μＬの２５×プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｐ２７１４）、１μＬのＯ−グリカナーゼ（プロザイム（ｐｒｏｚｙｍｅ）、カタログ番号ＧＫ８００９０）、３μＬのシアリダーゼＡ（プロザイム、カタログ番号ＧＫ８００４０）および８μＬの２００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０を加える。この混合物を穏やかにボルテックス処理し、２０℃で４時間インキュベートする。
【実施例９】
【０２２９】
質量分析によるナトリウム利尿ペプチドの解析
【０２３０】
抗体捕獲表面の調製
３μＬの抗体溶液（ホウ酸緩衝生理食塩水ｐＨ８．０（「ＢＢＳ」）中、０．２５ｍｇ／ｍＬの抗ＢＮＰモノクローナル抗体）を、ＰＳ１０プロテインチップアレイ（サイファージェン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）、カタログ番号Ｃ５５３−００４４）の適当なスポットにアプライし、このチップを加湿チャンバー中に入れ、２０℃で３時間穏やかに攪拌する。抗体溶液を除去し、アレイスポットを３μＬの１．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で２回洗浄する。２回目の洗浄で、チップを加湿チャンバー中に、攪拌せずに２０℃で３時間入れる。この洗浄の後、アレイを５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中に浸漬し、過剰のバッファーを除去する。
【０２３１】
ＢＮＰの捕獲
ＢＩＯＭＥＣロボットピペッティングステーション（ベックマン・インストルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて、アレイを１５０μＬのＢＢＳ中、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間、１５０μＬのＢＢＳ中、１０％ＰＥＧ３００／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間、および１５０μＬのＢＢＳ中、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で各５分間を３回にて、洗浄する。４０μＬのＢＢＳ中、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および４０μＬの脱グリコシル化サンプル（または対照サンプル）をアプライし、穏やかに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートする。
【０２３２】
エネルギー吸収マトリックスおよびＭＳ解析の適用
このインキュベーションの後、アレイを１５０μＬの１Ｍ尿素／０．１％ＣＨＡＰＳ／０．３Ｍ ＫＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５で各１分間、３回洗浄し、３００μＬの５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５で各３秒間、３回洗浄する。過剰のバッファーを除去し、光沢が全く見えなくなるまでアレイを風乾させる。低分子量の解析には（Ｍ／Ｚ＜６０００）、エネルギー吸収マトリックス（「ＥＡＭ」）のように適当なスポットに１μＬの、０．５％トリフルオロ酢酸（ピエルス、カタログ番号２８９０４）／５０％アセトニトリル（ピエルス、カタログ番号２００６２）中、２０％α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ、サイファージェン、カタログ番号Ｃ３００−０００１）をアプライする。高分子量解析には（Ｍ／Ｚ≧６０００）、ＥＡＭのように適当なスポットに、１μＬの、０．５％トリフルオロ酢酸／５０％アセトニトリル中、５０％シナピン酸（ＳＰＡ、サイファージェン、カタログ番号Ｃ３００−０００２）をアプライする。スポットを風乾させ、適当なＥＡＭの２回目の１μＬの液滴をアプライする。
【０２３３】
サイファージェン・プロテインチップ・リーダー・モデルＰＢＳ ＩＩＣを用いてＭＳスペクトルを獲得する。低分子量解析には、以下の機器パラメータを用いる：ハイマスは７０ｋＤａ、２ｋＤａ〜１５ｋＤａで最適に設定する；出発レーザー強度を１６５に設定する；出発検出感度は９に設定する；質量偏向器は１ｋＤａに設定する；獲得方法はＳＥＬＤＩ定量に設定する；ＳＥＬＤＩ獲得パラメータ＝２６、デルタ＝１０、トランシエント・パー（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ ｐｅｒ）＝１８、エンディング・ポジション（ｅｎｄｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）＝７６、および強度で５ショットを含むウォーミング・ポジション（ｗａｒｍｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）＝１７５。高分子量解析には、以下の機器パラメータを用いる：ハイマスは７０ｋＤａ、３ｋＤａ〜３０ｋＤａで最適に設定する；出発レーザー強度を２００に設定する；出発検出感度は９に設定する；質量偏向器は２ｋＤａに設定する；獲得方法はＳＥＬＤＩ定量に設定する；ＳＥＬＤＩ獲得パラメータ＝２４、デルタ＝１０、トランシエント・パー＝１３、エンディング・ポジション＝７４、および強度で３ショットを含むウォーミング・ポジション＝２１０。
【実施例１０】
【０２３４】
ＢＮＰ分解の阻害
【０２３５】
２種のヒト血漿サンプルを個々に２つの管に分け、その一方に可逆的ＤＰＰ阻害剤ジプロチンＡ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）を、１ｍＭの濃度まで加えた。各サンプルをヒトＢＮＰ77〜108でスパイクし、この混合物を４℃で一晩維持した。各サンプルを、前述したように、抗体捕獲ＳＥＬＤＩ質量分析に付した。結果を図１に示す。パネルＡ（添加なし）およびＢ（ジプロチンＡ）が一方の血漿サンプルに相当し、パネルＣ（添加なし）およびＤ（ジプロチンＡ）が２番目の血漿サンプルに相当する。捕獲はヒトＢＮＰを認識する抗体を用いて実施した。
【０２３６】
全長ＢＮＰ77〜108は約３４６６Ｄａの分子量（長い矢じり）に、ＢＮＰ79〜108（最後から２番目のプロリンで切断が生じている）は約３２８２Ｄａ（短い矢じり）に現れると予想される。パネルＡとＢおよびＣとＤを比較すると、ＤＰＰ阻害剤によってＢＮＰ77〜108のＢＮＰ79〜108への切断が阻害されている。約２９８８Ｄａの分子量でＢＮＰ79〜106であると推定される第２の切断産物も、ジプロチンＡ処理によって阻害され、約３１７３Ｄａの分子量でＢＮＰ77〜106であると推定される切断産物が相応して増加している。したがって、アミノ末端ｓｅｒ−ｐｒｏジペプチドの除去は、ＤＰＰ阻害剤の存在に対して感受性であり、第２のカルボキシル末端ジペプチド切断はそうではない。
【０２３７】
本発明を、当業者がこれを作製し使用するのに十分なほど詳細に説明および例示してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の代替、改変および改良は明らかであるはずである。
【０２３８】
当業者ならば、本発明は記載した目的を実施し、記載した結果および利点、ならびにそれらに内在するものを得るのに十分に適応していることを容易に理解するであろう。本明細書に提供した実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではない。当業者にとっては、その改変およびその他の用途も生じるであろう。これらの改変は本発明の趣旨内に包含され、特許請求の範囲によって画定されている。
【０２３９】
当業者ならば、本明細書に開示された本発明に、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、さまざまな置換、改変をなすことがで可能であることは容易に理解できるであろう。
【０２４０】
本明細書に記載したすべての特許および出版物は、本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示すものである。すべての特許および出版物は、各個々の出版物を具体的、かつ、個別に参照により組み入れるよう示すのと同程度に、参照により本明細書に組み入れる。
【０２４１】
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、いずれかの要素または要素類、制限または制限類がなくとも、適切に実施できる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、用語「含んでなっている」、「本質的にからなる」、および「からなる」のいずれかを、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いてきた用語および表現は、説明用語として用いるものであって制限するものではなく、このような用語および表現の使用には、示され、説明される特徴またはその一部の何らかの等価物を排除する意図は全くなく、特許請求される本発明の範囲内で種々の改変が可能であるということは理解されよう。したがって、本発明が、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されていたとしても、当業者によって、本明細書に開示された考え方の改変および変法をとることができるということ、ならびにこのような改変および変法は、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内にあると考えられるということは理解されなくてはならない。
【技術分野】
【０００１】
本願は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを測定するための、およびその治療可能性を向上させるための方法および組成物と題された、２００３年８月２０日に出願された米国特許出願第１０／６４５，８７４号の一部継続出願であり、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを測定するための、およびその治療可能性を向上させるための方法および組成物と題された、２００４年２月４日に出願された米国仮特許出願第６０／６４２，０８６号の優先権を主張し、それらの各々から優先権が主張されており、それらの各々は参照により、すべての表、図および特許請求の範囲を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、医療診断および治療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景についての以下の議論は、単に読者が本発明を理解するのを補助するために提供するものであって、本発明の先行技術を説明または構成するよう承認されるものではない。
【０００４】
ナトリウム利尿ペプチドは、身体においてレニン−アンギオテンシン系の活性に対抗するよう作用する天然に生じる物質群である。３つの主要なナトリウム利尿ペプチド：心房で合成される、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、心室で合成される、脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、脳で合成される、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）がある。
【０００５】
成熟ヒトＡ型ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（心房性ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）は、心房拡張、アンギオテンシンＩＩ刺激、エンドセリン、および交感神経刺激（β−アドレナリン受容体媒介性）に応じて心房筋細胞によって合成され、保存され、放出される、生物学的に活性な２８アミノ酸ペプチドである。成熟ＡＮＰは、１２８アミノ酸前駆体分子（プロ−ＡＮＰ）のタンパク質分解切断によって生じ、プロ−ＡＮＰ分子のアミノ酸９９〜１２６（ＡＮＰ99〜126）に相当する生物学的に活性な２８アミノ酸ペプチドが生じる。Ｎ末端プロホルモンセグメントに由来する線状ペプチド断片も生物活性を有すると報告されている。
【０００６】
成熟ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）（脳型ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）は、血圧および体液平衡を調節するナトリウム利尿系に関与する、３２アミノ酸、４ｋＤａの生物学的に活性なペプチドである（ボノー（Ｂｏｎｏｗ）、Ｒ．Ｏ．、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、９３、１９４６〜１９５０頁、１９９６）。成熟ＢＮＰホルモンは、本明細書では「プロ−ＢＮＰ」と呼ぶ１０８アミノ酸前駆体分子のタンパク質分解切断によって生じる。切断によって、「ＮＴプロＢＮＰ」と呼ばれる７６アミノ酸Ｎ末端ペプチド（アミノ酸１〜７６）と、ＢＮＰまたはＢＮＰ３２と呼ばれる３２アミノ酸成熟ホルモン（アミノ酸７７〜１０８）が生じる。これらの種の各々−ＮＴプロ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−３２およびプレ−プロ−ＢＮＰは、ヒト血漿中を循環し得ることが示唆されている（タテヤマら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）１８５、７６０〜７頁、１９９２）、ハント（Ｈｕｎｔ）ら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション、２１４、１１７５〜８３頁、１９９５）。
【０００７】
ヒト脳における主要な活性ナトリウム利尿ペプチドである、成熟ヒトＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）２２アミノ酸ペプチド；ＣＮＰはまた、一酸化窒素（ＮＯ）と同様に作用する、内皮由来弛緩因子であると考えられている（ダビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）ら、サーキュレーション９３、１１５５〜９頁、１９９６）。ＣＮＰは、Ａ型ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）と構造的に関連しているが、ＡＮＰとＢＮＰは主に心筋で合成されるのに対し、ＣＮＰは血管内皮で前駆体（プロ−ＣＮＰ）として合成される（プリケット（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ）ら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション、２８６、５１３〜７頁、２００１）。ＣＮＰは動脈と静脈の双方に対して血管拡張作用を有すると考えられており、血管平滑筋細胞において細胞内ｃＧＭＰ濃度を高めることによって主に静脈に対して作用すると報告されている。
【０００８】
ＡＮＰおよびＢＮＰはそれぞれ、心房および心室伸展に応じて放出され、血管緊張低下、副腎皮質におけるアルドステロン分泌の阻害、腎臓におけるレニン分泌の阻害を引き起こす。ＡＮＰとＢＮＰの双方ともナトリウム利尿および血管内容量の減少、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）の拮抗作用によって増幅される作用をもたらす。ＣＮＰの生理学的作用はＡＮＰおよびＢＮＰのものとは異なり、ＣＮＰは降圧効果を有するが、有意な利尿またはナトリウム利尿作用はない。特定の疾病状態では、ナトリウム利尿ペプチドの血管レベルの増加が見出されており、このことは、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＰ）、心虚血、全身性高血圧、および急性心筋梗塞をはじめとする疾病の病態生理学における役割を示唆する。例えば、各々、すべての表、図および特許請求の範囲を含むその全文が本明細書に組み入れられる、ＷＯ０２／０８９６５７、ＷＯ０２／０８３９１３およびＷＯ０３／０１６９１０を参照。当業者には、ナトリウム利尿ペプチドの多数の非ヒト相同体が知られている。
【０００９】
ナトリウム利尿ペプチドは、単独で、集団的に、および／またはさらなるタンパク質とともに、種々の循環器症状において疾病マーカーおよび予後の指標として利用できる。例えば、心室で合成されるＢＮＰは、左心室圧、呼吸困難の量、および神経ホルモン調節の状態と相関があるため、このペプチドが心疾患の第１の潜在マーカーとなっている。血漿ＢＮＰの濃度の測定は、病因論およびＬＶ収縮機能障害の程度にかかわらず、明らかな心不全を発症する可能性があり得る、および心血管系イベントの危険の高い、種々の心臓異常を有する患者を同定するための、極めて効果的かつ費用効率の高い集団検診技術として発達している。ＣＨＦ患者の診断および管理を補助する簡単な血液試験を見出すことが、この疾病にかかる驚異的な費用に対して好影響をもたらすことは明確である。
【００１０】
循環からのナトリウム利尿ペプチドの除去は、主に、循環におけるクリアランス受容体との結合および酵素分解によって影響を受ける。例えば、チョー（Ｃｈｏ）ら、ハート・ディジーズ（Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）１、３０５〜２８頁、１９９９、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）１６７、２３９〜４６頁、２０００参照。さらに、ヒトプロ−ＢＮＰは、血清中でプロセシングされ、その結果、循環プレ−プロ−ＢＮＰが無傷の１０８アミノ酸型である可能性は低いと報告されている。ハント（Ｈｕｎｔ）ら、ペプチデス（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）１８、１４７５〜８１頁、１９９７。ナトリウム利尿ペプチドの分解は中性エンドペプチダーゼによって媒介されると考えられている。例えば、ノーマン（Ｎｏｒｍａｎ）ら（バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション２８、１７５、２２〜３０頁、１９９１）は、中性エンドペプチダーゼはヒトＢＮＰを残基２と３の間、残基４と５の間、および残基１７と１８の間で切断できると報告している。同様に、リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）およびアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）（レギュラトリー・ペプチデス（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）４７、５３〜６３頁、１９９３）は、ヒトＡＮＰは残基３と４の間および残基１４と１５の間で切断されると報告している。この加水分解産物の生物活性は、無傷のＡＮＰよりも約５００倍低かった。さらに、クネヒト（Ｋｎｅｃｈｔ）ら、（ライフ・サイエンシズ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）７１、２７０１〜１２頁、２００２）は、心不全では腎臓の中性エンドペプチダーゼがアップレギュレートされ、ナトリウム利尿ペプチドレベルが増加している状態と報告している。このため、中性エンドペプチダーゼは循環器疾患の治療における阻害の標的となってきた。例えば、コルチ（Ｃｏｒｔｉ）ら、サーキュレーション１０４、１８５６〜６２頁、２００１参照。
【００１１】
ナトリウム利尿ペプチドの、特に、血液由来サンプル（例えば、血清、血漿、全血）中での安定性に関する混乱が報告されている。ＡＮＰは、ＢＮＰよりも中性エンドペプチダーゼのよりよい基質であると報告されている。同様に、シミズら、（クリニカ・ケミカ・アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ）３０５、１８１〜６頁、２００１）、ゴビネ−ジョージ（Ｇｏｂｉｎｅｔ−Ｇｅｏｒｇｅｓ）ら（クリニカル・ケミストリー・アンド・ラボラトリー・メディシン（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）３８、５１９〜２３頁、２０００）およびマードック（Ｍｕｒｄｏｃｈ）ら（ハート（Ｈｅａｒｔ）７８、５９４〜７頁、１９９７）は、ＢＮＰは特定の血液由来サンプル中では、または血液が特定の条件下で採取される場合には安定であると報告している。シミズらによるより最近の報告（クリニカ・ケミカ・アクタ３１６、１２９〜３５頁、２００２）では、全血中のＢＮＰの９４％が、２アミノ末端残基が除去されている消化型であったこと、および血漿中のＢＮＰはいくつかの未同定の型に分解されていたことが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は幾分かは、サンプル中の生物活性ナトリウム利尿ペプチド、またはその断片の存在または量を調べるよう設計された組成物および方法に関する。ナトリウム利尿ペプチドの分解は、特に、ナトリウム利尿ペプチドの組織への放出の誘引となるイベントの発生とサンプルを得るか分析する時間との間の経過時間、存在するタンパク質分解酵素の量などの関数であり得る進行中のプロセスである。この分解によって、生物学的機能が低下したか、これを失ったナトリウム利尿ペプチドの循環量が生じ得る（本明細書では、便宜上、ナトリウム利尿ペプチドの「不活性断片」と呼ぶ）。
【００１３】
１種以上のナトリウム利尿ペプチドのアッセイを設計する際に、この分解を考慮しないと、注目するナトリウム利尿ペプチドの生物活性型とナトリウム利尿ペプチドの不活性断片の双方を検出するアッセイとなる場合もある。これによって、実際、注目するナトリウム利尿ペプチドが実際には不活性断片に分解されており、アッセイ結果が目的とする分析物をサンプル中に最初に存在する不活性断片のプールと区別できないことによって混乱している場合に、アッセイが特に良好な安定性を示す（すなわち、注目する分析物がサンプル貯蔵の間アッセイに対して失われない）という結論を導くことがある。生物活性型は被験体の生理学的状態とより相関がある場合があるため、また疾病を患っている被験体においてアップレギュレートされたタンパク質分解酵素が、非常に注目される可能性のある被験体において不活性断片の特に大きなプールをもたらす場合があるために、本明細書に記載された組成物および方法は、当業者に対し、生物活性型に特異的でないアッセイと比較して改善された診断および予後情報を提供できる。
【００１４】
本明細書に記載した方法および組成物は、当技術分野における、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および／または急性心筋梗塞をはじめとする種々の循環器疾患の診断および識別に用いるための、迅速で、感受性のある、特異的な診断アッセイの必要性を満たし得る。さらにまた、本発明の方法および組成物を用いて患者の治療を容易にし、さらなる診断および／または予後指標および指標パネルを開発できる。
【００１５】
その結果、第一の態様では、本発明は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の生物学的不活性断片からのシグナルは少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。生物学的不活性断片としては、生物活性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されたループが切断されているものが挙げられる。このような生物学的不活性断片は、例えば、生物活性ナトリウム利尿ペプチド中の１以上のペプチド結合を切断することによって形成され得る。
【００１６】
関連態様では、本発明は、無傷のナトリウム利尿ペプチドを検出するが、無傷のナトリウム利尿ペプチドのある部分、好ましくは、少なくともＮ末端部分が除去されると生じる等モル量のペプチドからのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。
【００１７】
種々の実施形態では、本発明は、ＢＮＰ77〜108を検出するが、等モル量のＢＮＰ94〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ90〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ81〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出する
が、ＢＮＰ79〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ77〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、および／またはＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ79〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００１８】
種々のさらなる実施形態では、本発明は、ＢＮＰ1〜76を検出するが、等モル量のＢＮＰ38〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ24〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ12〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ3〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ1〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、および／またはＢＮＰ1〜76検出するが、ＢＮＰ3〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００１９】
さらにその他のさらなる実施形態では、本発明は、ＡＮＰ99〜126を検出するが、等モル量のＡＮＰ113〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ105〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ102〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、ＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ99〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイ、および／またはＡＮＰ99〜126を検出するが、ＡＮＰ102〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しないアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＡＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００２０】
以下に説明するように、このようなアッセイは、当業者に公知の種々の方法で設計できる。好ましいアッセイはイムノアッセイであるが、他の方法も当業者に周知である（例えば、バイオセンサーの使用、または当技術分野で公知のナトリウム利尿ペプチドの天然受容体の使用）。適していれば、どんなイムノアッセイを利用してもよい。例えば、分析物結合を直接検出する（例えば、エリプソメーターによる検出によって）アッセイ、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイ、サンドイッチイムノアッセイなど。抗体と１種以上のナトリウム利尿ペプチド断片との特異的免疫学的結合は、直接的に検出しても間接的に検出してもよい。直接標識としては、抗体に付けた、蛍光または発光タグ、金属、色素、放射性核種などが挙げられる。間接標識としては、当技術分野で周知の種々の酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどが挙げられる。第２の分子、例えば、検出可能な標識に付着させた抗体を、本明細書では、「抗体コンジュゲート」と呼ぶ。また、当業者ならば、ナトリウム利尿ペプチドの天然受容体が存在すること、およびこれらの受容体もまた、結合アッセイの提供において、抗体と類似の方法で使用できることは理解されよう。
【００２１】
無傷のナトリウム利尿ペプチドと比較して、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片からは部分的にまたは完全に失われているエピトープと結合するよう選択された１種以上の抗体を用いるイムノアッセイを構築することができる。例えば、サンドイッチアッセイでは、固相に結合される抗体を、分子のＮ末端部分と優先的に結合するよう選択し、標識される抗体を、分子のＣ末端部分と結合するよう選択すれば、アッセイで分子のＮおよびＣ末端部分の双方を含む分子のみが検出される。あるいは、固相と標識した抗体の双方を、分子のＮ末端部分と結合するよう選択してもよい。
【００２２】
当業者ならば、ナトリウム利尿ペプチドの切断によって、抗体が結合するエピトープのすべてを除去することもできるということは理解されよう（例えば、抗体はＮ末端領域だけに結合する）。あるいは、エピトープは、分子の線状配列中では連続していないが、溶液中の３次元空間においては関連しているナトリウム利尿ペプチドの部分から形成される場合もあり、その結果、エピトープは、記載したアミノ酸残基よりも多くを含んでなるが、記載したアミノ酸残基の領域の除去の結果、抗体の結合が減少し、ひいてはアッセイにおいてシグナルが喪失する。
【００２３】
特定の実施形態では、抗体を、１種以上のナトリウム利尿ペプチドに対する個々の親和性に基づいてではなく、イムノアッセイなどの結合アッセイにおいて得られるシグナルに基づいて選択する。当業者ならば、種々の結合アッセイ形式が当技術分野で公知であること、および１種以上の標的分子に対する抗体の個々の親和性よりも重要である適当なアッセイを構築するための抗体の使用はよくあることであることは認識されよう。例えば、競合結合アッセイは、固体表面に結合している受容体（例えば、抗体）を含んでなる場合がある。試験サンプル中の注目する分析物は、同様に受容体と結合する標識された分子との結合と競合する。受容体と結合している標識された分子の量（したがって、アッセイシグナル）は、試験サンプル中の注目する分析物の量と反比例する。この場合には、固相に付着している単一抗体を用いる。あるいは、サンドイッチイムノアッセイでは、通常、固体表面と結合している一次抗体、および通常、検出可能な標識とコンジュゲートしている二次抗体の各々が、試験サンプル中の注目する分析物と結合する。受容体と結合している標識された分子の量（したがって、アッセイシグナル）は、試験サンプル中の注目する分析物の量と正比例する。
【００２４】
本発明のイムノアッセイは、生物活性ナトリウム利尿ペプチドと生物学的不活性ナトリウム利尿ペプチドを、および／または無傷のナトリウム利尿ペプチドとナトリウム利尿ペプチド断片とを識別するよう設計することが好ましい。例えば、好ましいイムノアッセイは、無傷のＮ末端領域を含んでなるナトリウム利尿ペプチドとＮ末端領域が失われているナトリウム利尿ペプチドの断片を識別する。イムノアッセイは、同一アッセイ条件下で第２群のポリペプチドの同数の分子から得られるシグナルより少なくとも５倍大きい、第１群のポリペプチドの結合に関連するシグナルをイムノアッセイが提供する場合に、第１群のポリペプチドと第２群のポリペプチド間を「識別する」と考えられており、アッセイを２度までしか実施しない場合には、第１群のポリペプチドの量は最大シグナルを得ることが必要である。このようなアッセイ条件下では、シグナルが少なくとも１０倍大きいことがより好ましく、少なくとも２０倍大きいことがさらにより好ましく、少なくとも５０倍大きいこと、少なくとも１００倍大きいこと、またはそれ以上が最も好ましい。そのようなアッセイ条件下で、第１群のポリペプチドの結合に関するシグナルが得られるが、第２群のポリペプチドの同数の分子からバックグラウンドを上回るシグナルが得られない場合、アッセイは第２群のポリペプチドを「感知できるほどに検出しない」。
【００２５】
もう１つの態様では、本発明は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。前記で論じたように、生物学的不活性断片としては、無傷のナトリウム利尿ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されるループが切断されているものが挙げられる。好ましい実施形態では、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端部分が除去されるとナトリウム利尿ペプチドから生じるペプチドとは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わる条件下でアッセイを実施する。
【００２６】
関連態様では、本発明は、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのある部分、好ましくは、少なくともＮ末端部分が除去されると生じるナトリウム利尿ペプチドの断片とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。
【００２７】
種々の実施形態では、本発明は、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ94〜106とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ90〜108とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ81〜108とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜108とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ77〜106とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、および／またはＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜106とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００２８】
種々のさらなる実施形態では、本発明は、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ38〜76とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ24〜76とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ12〜76とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜76とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ1〜73とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、および／またはＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜73とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＢＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００２９】
その他のさらなる実施形態では、本発明は、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ113〜126とは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わるアッセイ、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ105〜126とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ102〜126とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ99〜124とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイ、および／またはＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ102〜124とは特異的に結合しない抗体に応じて変わるアッセイを実施することを含んでなる、サンプル中のＡＮＰの存在または量を検出する方法に関する。
【００３０】
イムノアッセイからのシグナルは、抗体がシグナルが生じるのに必要な複合体の形成に関与する場合には、「抗体との結合に応じて変わる」と考えられている。例えば、固相抗体および二次抗体コンジュゲートを用いて構築されるサンドイッチイムノアッセイでは、その各々が分析物と結合してサンドイッチを形成しなくてはならず、固相抗体と二次抗体の各々がシグナルが生じるのに必要な複合体の形成に関与している。単一抗体を用い、分析物が分析物コンジュゲートと結合について競合する競合イムノアッセイでは、単一抗体がシグナルが生じるのに必要な複合体の形成に関与している。当業者ならば、多数のさらなるイムノアッセイの構築を提供できることを理解されよう。
【００３１】
本明細書に記載したアッセイ法はまた、１種以上のナトリウム利尿ペプチドに対するアッセイに先立ってサンプルを一定期間保存するステップを含んでなる。ナトリウム利尿ペプチドの分解は、保存中も進行するプロセスであり得るため、保存考慮は、分子のＮ末端部分の喪失を減少させるよう選択しなくてはならない。したがって、保存条件は、ナトリウム利尿ペプチド分解の１種以上の阻害剤の添加を含み得る。以下に論じるように、保存条件は中性エンドペプチダーゼの１種以上の阻害剤および／またはプロリル特異的ジペプチジルペプチダーゼの１種以上の阻害剤を含み得る。このような阻害剤は当技術分野では周知である。例えば、コルチら、サーキュレーション１０４、１８５６〜６２頁、２００１、センテン（Ｓｅｎｔｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・コンビナトリー・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５、３３６〜４４頁、２００３、センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）１２、２８２５〜８頁、２００２参照。代替法では、またはこのような阻害剤と併用して、保存条件は、低温での、好ましくは、サンプルの氷点よりも低い温度での保存を含み得る。
【００３２】
もう１つの態様では、本発明は、記載したアッセイを実施するために設定および準備されたアッセイ装置に関する。本明細書に記載したアッセイを実施するための装置は、複数の、個別の、独立した、アドレス可能な場所、すなわち、その各々が注目する個々の分析物または分析物のセットと関連し、そのうちの１種以上がナトリウム利尿ペプチドである「診断ゾーン」を含むことが好ましい。例えば、複数の個別のゾーンの各々が、異なる分析物を結合するための受容体（例えば、抗体）を含み得る。サンプルを装置で反応させた後、診断ゾーンからシグナルが生じ、結果、これは注目するペプチドの存在または量と相関し得る。
【００３３】
さらにもう１つの態様では、本明細書に記載した方法によって測定した、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を、疾病の有無、または疾病予後（例えば、疾病に関連する将来の有害転帰の可能性）と関連付けることができる。好ましい疾病としては、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および／または急性心筋梗塞をはじめとする種々の循環器疾患および脳血管疾患が挙げられる。これらの方法は、本明細書に記載した方法によって１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べることと、存在または量を注目する疾病または予後と関連付けることとを含んでなることが好ましい。
【００３４】
特定の実施形態では、アッセイから得られるシグナルを、１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量と関連付ける必要はなく、むしろ、シグナルを疾病の有無または疾病と関連する将来の有害転帰の可能性と直接関連付けることができる。例えば、シグナルｘのレベルは、ｙ ｐｇ／ｍＬのナトリウム利尿ペプチドがサンプル中に存在することを示し得る。次いで、そのナトリウム利尿ペプチドのｙ ｐｇ／ｍＬがうっ血性心不全を示すことが表から示され得る。どの程度のナトリウム利尿ペプチドが存在するかを決定せずに、シグナルｘのレベルをうっ血性心不全と直接的に単に関連付けることは、同等に有効であり得る。このようなシグナルは本発明の抗体を用いるイムノアッセイから得ることが好ましいが、当業者にはその他の方法も周知である。
【００３５】
さらにもう１つの態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドのアッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。これらの方法は、アッセイに用いると、注目する生物活性ナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない抗体を選択することを含んでなる。前述のように、生物学的不活性断片としては、無傷のナトリウム利尿ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されるループが切断されているものが挙げられる。
【００３６】
関連態様では、本発明は、アッセイに用いると、注目する無傷のナトリウム利尿ペプチドを検出するが、ナトリウム利尿ペプチドのある部分、好ましくは、Ｎ末端部分が除去されるとナトリウム利尿ペプチドから生じる同モル量のペプチドからのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、、好ましくは、これを感知できるほど検出しない抗体を選択することを含んでなる、アッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。
【００３７】
種々の実施形態では、本方法は、アッセイに用いるとＢＮＰ77〜108を検出するが、同モル量のＢＮＰ94〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ90〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ81〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ79〜108からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ77〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ77〜108を検出するが、ＢＮＰ79〜106からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほど検出しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００３８】
種々のさらなる実施形態では、本方法は、アッセイに用いるとＢＮＰ1〜76を検出するが、同モル量のＢＮＰ38〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ24〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ12〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ3〜76からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ1〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ1〜76を検出するが、ＢＮＰ3〜73からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００３９】
その他のさらなる実施形態では、本方法は、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ113〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ105〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ101〜126からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、アッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ99〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはアッセイに用いるとＡＮＰ99〜126を検出するが、同モル量のＡＮＰ101〜124からのシグナルが少なくとも５分の１に低下し、好ましくは、これを感知できるほどに検出しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４０】
その他の関連態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドのアッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。本方法は、生物活性ナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。前記で論じたように、生物学的不活性断片としては、無傷のナトリウム利尿ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、もしくは双方から残基が除去されているもの、および／またはナトリウム利尿ペプチドの分子内ジスルフィド結合によって形成されたループが切断されているものが挙げられる。好ましい実施形態では、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端部分が除去されるとナトリウム利尿ペプチドから生じるペプチドとは特異的に結合しない抗体に応じてシグナルが変わる条件下でアッセイを実施する。
【００４１】
さらにその他の関連態様では、本発明は、無傷のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するが、ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端部分が除去されると生じるナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性断片とは特異的に結合しない抗体を選択することを含んでなる、アッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法に関する。
【００４２】
種々の実施形態では、本方法は、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ94〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ90〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ81〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜108とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ77〜106とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ77〜108と特異的に結合するが、ＢＮＰ79〜106とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４３】
種々のさらなる実施形態では、本方法は、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ38〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ24〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ12〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜76とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ1〜73とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＢＮＰ1〜76と特異的に結合するが、ＢＮＰ3〜73とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４４】
その他のさらなる実施形態では、本方法は、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ113〜126とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ105〜126とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ101〜126とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、ＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ99〜124とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択すること、および／またはＡＮＰ99〜126と特異的に結合するが、ＡＮＰ101〜124とは特異的に結合しない１種以上の抗体を選択することを含んでなる。
【００４５】
もう１つの態様では、本発明の１種以上の抗体および／または抗体コンジュゲートを、ナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べるキットとして提供することもできる。これらのキットは、本明細書に記載したような少なくとも１種のアッセイを試験サンプルで実施するための装置および試薬を含んでなることが好ましい。このようなキットは、１種以上のこのような測定を実施するのに十分な試薬、および／または食品医薬品局（ＦＤＡ）承認表示を含むことが好ましい。
【００４６】
さらにもう１つの態様では、本発明は、患者に用いる治療計画を決定する方法に関する。この方法は、本明細書に記載した方法によって１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べることと、存在または量を疾病または予後状態と関連付けることとを含んでなることが好ましい。本明細書に論じたように、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、急性冠症候群、および／または急性心筋梗塞をはじめとする種々の循環器疾患および脳血管疾患の診断および識別は、ＡＮＰ、ＢＮＰ、および／またはＣＮＰレベルと関連付けることができる。診断または予後が得られると、治療計画がその診断と一致するよう選択される。
【００４７】
本発明のもう１つの目的は、ナトリウム利尿ペプチドを安定化する組成物および方法を提供することである。このような方法によって、特に循環器疾患の治療のための、ナトリウム利尿ペプチドの治療可能性が向上し得る。数種のナトリウム利尿ペプチド、例えば、プロ−ＢＮＰ、成熟ＢＮＰ、およびプロ−ＡＮＰは、最後から２番目のプロリン残基を含んでなり、プロリル特異的ジペプチジルジペプチダーゼ（「ＤＰＰ」）に適した基質である。したがって、成熟ＢＮＰは、ＡＮＰと比べ、中性エンドペプチダーゼによる分解に対して耐性を示すと報告されているが、ＤＰＰは、成熟ＢＮＰ分子の、ならびにプロ−ＢＮＰおよびプロ−ＡＮＰの、これまで認識されていない分解経路に相当し得る。さらに、プロリン含有ジペプチドの除去により、種々のナトリウム利尿ペプチドが、その他のペプチダーゼによるさらなる分解に対して開放される可能性がある。ナトリウム利尿ペプチド濃度の上昇によって利益を得ることができる被験体は、単独または中性エンドペプチダーゼ阻害剤と組み合わせた１種以上のＤＰＰの阻害剤で治療でき、かつ／またはナトリウム利尿ペプチドおよび／またはＤＰＰ安定性の上昇を示すナトリウム利尿ペプチド類似体で治療できる。さらに、被験体から採取したサンプル中のＢＮＰを、保存の間、これらの同様の阻害剤を用いて安定化することもできる。
【００４８】
したがって、一態様では、本発明は、１種以上のナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害する方法に関する。この方法は、１種以上のプロリル特異的ＤＰＰの阻害剤を、ナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害するのに十分な量で投与することを含んでなる。
【００４９】
もう１つの態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド機能の上昇を必要とする被験体、好ましくは、心不全を患っている被験体を治療する方法に関する。この方法は、１種以上のプロリル特異的ＤＰＰの阻害剤を被験体に、好ましくはナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害するのに十分な量で投与することを含んでなる。
【００５０】
特定の実施形態では、プロリル特異的ＤＰＰの阻害剤（類）は、プロ−ＢＮＰ、成熟ＢＮＰ、および／またはプロ−ＡＮＰが基質である１種以上のＤＰＰに対して選択性である。特異的ＤＰＰ阻害剤を設計および選択する方法は当技術分野では周知である。例えば、レイティング（ｌｅｉｔｉｎｇ）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）３７１、５２５〜３２頁、２００３、セド（Ｓｅｄｏ）ら、フィジオロジカル・リサーチ（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）５２、３６７〜７２頁、２００３、ビルハウアー（ｖｉｌｌｈａｕｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４６、２７７４〜８９頁、２００３、センテン（Ｓｅｎｔｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・コンビナトリー・ケミストリー５、３３６〜４４頁、２００３、センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ１２、２８２５〜８頁、２００２、ボルロー（Ｂｏｒｌｏｏ）およびメーステル（Ｍｅｅｓｔｅｒ）、フェアハンドリンゲン−コニンクリーエ・アカデミー・フォア・ゲネースクンデ・ファン・ベルギーエ（Ｖｅｒｈａｎｄｅｌｉｎｇｅｎ−Ｋｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ａｃａｄｅｍｉｅ ｖｏｏｒ Ｇｅｎｅｅｓｋｕｎｄｅ ｖａｎ Ｂｅｌｇｉｅ）５６、５７〜８８頁、１９９４参照。さらに、ＤＰＰは、アンチセンスまたはＲＮＡｉ構築物によってなど、当業者に公知の方法によって発現レベルで阻害できる。ＤＰＰはまた、結合タンパク質、例えば、１種以上のＤＰＰと特異的に結合し、ナトリウム利尿ペプチド基質に対するその活性を妨げる抗体またはその断片の使用によっても阻害できる。
【００５１】
本明細書に記載した方法は、１種以上のプロリル特異的ＤＰＰ阻害剤単独での使用を含んでなる場合もあるし、このような阻害剤を、１種以上の中性エンドペプチダーゼの阻害剤および／またはその他のプロテアーゼ阻害剤と、ならびに／あるいはプロリル特異的ＤＰＰ阻害剤の不在下での中性エンドペプチダーゼの阻害剤の使用および／または外因的に加えたナトリウム利尿ペプチドと比較してナトリウムペプチド機能の上昇を増強するよう、被験体に外因的に加えた１種以上のナトリウム利尿ペプチドと組みあせてもよい。これらの化合物は薬剤組成物の一部として提供できることが好都合である。
【００５２】
好ましい実施形態では、本明細書に記載した治療法を受ける被験体は、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および／または急性心筋梗塞からなる群から選択される疾病を患っている。特に好ましい実施形態では、本明細書に記載した治療法を受ける被験体は、ＢＮＰレベルに基づいて選択される。例えば、被験体は、少なくとも約８０ｐｇ／ｍＬという治療を受ける前の血漿ＢＮＰレベルに基づいて選択でき、少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬが好ましく、少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬがさらにより好ましく、少なくとも約５００ｐｇ／ｍＬがいっそうより好ましく、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬが最も好ましい。
【００５３】
さらにもう１つの態様では、本発明は、プロリル特異的ＤＰＰの存在下で安定性の上昇をもたらす（例えば、被験体の血中の注目するナトリウム利尿ペプチドのｔ1/2の増加によって測定されるような）ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の類似体を投与することを含んでなる、ナトリウム利尿ペプチド機能の上昇を必要とする被験体を治療する方法に関する。
【００５４】
本発明のさらにもう１つの目的は、グリコシル化されている、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を調べる方法および組成物を提供することである。グリコシル化されたナトリウム利尿ペプチド中の共有結合している糖鎖残基は、種々のアッセイ法のこのようなペプチドを検出する能力に対して実質的な影響を及ぼし得る。アッセイ条件を注意深く選択することによって、このような影響を軽減することができ、その結果、サンプル中の注目するナトリウム利尿ペプチドの存在または量を表すアッセイ結果が得られる。
【００５５】
したがって、もう１つの態様では、本発明は、共有結合している糖鎖残基を含んでなる、サンプル中の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法に関する。これらの方法は、１種以上の注目する前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去することと、サンプルを注目するナトリウム利尿ペプチドについてアッセイすることとを含んでなる。したがって、アッセイ結果は、前記サンプル中の注目する前記ナトリウム利尿ペプチドの存在または量に関する。種々の実施形態では、１種以上のナトリウム利尿ペプチドから、ペプチドの酵素処理によって、ペプチドの非酵素的化学処理によって、またはこれらの方法の組合せによって共有結合している糖鎖残基を除去できる。
【００５６】
ＮおよびＯ−結合型糖鎖残基を除去する有効な酵素的方法は、当技術分野では周知であり、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−グリコシダーゼとしても知られる）、エンドグリコシダーゼＨ、エンドグリコシダーゼＡ、Ｏ−グリカナーゼ（エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとしても知られる）、α２−（３，６，８，９）−ノイリミニダーゼ（ｎｅｕｒｉｍｉｎｉｄａｓｅ）、β（１，４）−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、および／またはエンドグリコシダーゼＦ3などの酵素を用いる。この羅列は限定しようとするものではない。
【００５７】
共有結合している糖鎖残基をペプチドから除去するための非酵素的化学処理の場合には、非還元Ｏ−およびＮ−結合型オリゴ糖の放出にヒドラジン加水分解が有効であるとわかっている。約６０℃でのＯ−結合型オリゴ糖の最初の穏やかなヒドラジン分解と、それに続く約９５℃でのＮ−結合型オリゴ糖のヒドラジン分解によって、オリゴ糖の選択的および順次的放出を達成できる。例えば、パテール（Ｐａｔｅｌ）およびラレク（Ｒａｒｅｋｈ）、メソッヅ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ）２３０、５８〜６６頁、１９９４参照。しかしながら、このような処理の結果、ポリペプチドが破壊されることもある。穏やかな塩基環境においてアルカリ性水素化ホウ素ナトリウムを利用する、Ｏ−結合型オリゴ糖のアルカリ−β−脱離が好ましい場合がある。例えば、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）：ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、フクダ，Ｍおよびコバタ，Ａ編、２９１〜３２８頁、ＩＲＬ／オックスフォード大学出版、オックスフォード、１９９３参照。さらに、トリフルオロメタンスルホン酸加水分解を用いてもよい。この方法は通常、無傷のポリペプチドを残すが、グリカンの破壊をもたらす。例えば、エッジ（Ｅｄｇｅ）、バイオケミカル・ジャーナル３７６、３３９〜５０頁、２００３参照。
【００５８】
ペプチドからの糖除去についての前述の方法は、天然（非変性）ポリペプチドで、および／またはポリペプチドの変性後に使用できる。酵素的処理であろうと、非酵素的処理であろうと、または双方の処理であろうと、処理を用いてナトリウム利尿ペプチドから共有結合している糖鎖残基を除去し、この処理によって注目する１種以上の、好ましくはすべてのグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドから、少なくとも約５０％の糖鎖残基が除去されることが好ましく、少なくとも約６０％がより好ましく、少なくとも約７０％がいっそうより好ましくは、少なくとも約８０％がさらにより好ましく、少なくとも約９０％〜約１００％が最も好ましい。ポリペプチドのグリコシル化度は、ポリペプチドの見かけの質量をポリペプチドのアミノ酸成分の質量と比較し、見かけの質量の差し引き分がグリコシル化によるものであると仮定することによって求めることができる。その他の修飾（例えば、酸化、ニトロ化、リン酸化）が起こっていることがわかっている事象では、これら他の修飾による質量も見かけの質量から差し引くことができる。その結果、脱グリコシル化処理後のポリペプチドの見かけの質量を測定することによって、糖鎖残基の除去度をモニターすることができる。ポリペプチドの見かけの質量を測定する方法（例えば、ＳＤＳゲル電気泳動、分析用遠心、ゲル浸透クロマトグラフィー、質量分析など）は、当業者には周知である。
【００５９】
このようなグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドを含むサンプルが、その用語が本明細書で定義される試験サンプルであり得る。このようなサンプル中に存在するグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドは、患者から得たサンプル中など、天然に存在するものである場合もあるし、標準サンプルである場合もある。このような標準を構築するのに用いるナトリウム利尿ペプチドは、活性なグリコシル化機能を含む哺乳類組織培養系における組換えによって発現されることが多い。
【００６０】
脱グリコシル化ステップ後、本明細書に記載した方法では、当技術分野で公知のどんなアッセイ法も用いることができる。このようなアッセイ法では、アフィニティー分離、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、液体クロマトグラフィー、および／またはＨＰＬＣなどの分離法を用いて注目する分析物を検出に向けて分離することができる。好ましい実施形態では、種々のサンドイッチ、競合、または非競合アッセイ形式のアフィニティー分離にイムノアッセイ装置および方法を用い、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量と関連のあるシグナルを生じさせることが多い。さらに、特定の方法および装置、例えば、バイオセンサーおよび光学的免疫測定法を用いて、標識された分子を必要とすることなく、分析物の存在または量を調べることもできる。
【００６１】
さらに、アッセイ法の一部として質量分析法を用いることも有利であり得る。本明細書において、用語「質量分析」または「ＭＳ」とは、イオンをその質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づいて、選別、検出および測定する方法を指す。一般に、注目する１種以上の分子をイオン化し、続いてそのイオンを質量分析機器に導入し、そこで磁場と電場の組合せによって、イオンが質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に応じて変わる空間中の経路をたどる。例えば、「マス・スペクトロメトリー・フロム・サーフェシズ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」と題された米国特許第６，２０４，５００号、「メソッヅ・アンド・アパラタス・フォー・タンデム・マス・スペクトロメトリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」と題された同６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ・ダイグノスティクス・ベースド・オン・マス・スペクトロメトリー（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｍｅｔｒｙ）」と題された同６，２６８，１４４号、「サーフェス−エンハンスド・フォトラバイル・アタッチメント・アンド・リリース・フォー・デソープション・アンド・デテクション・オブ・アナリテス（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ）」と題された同６，１２４，１３７号、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、「プロテインチップ・サーフェス・エンハンサー・レーザー・デソープション／イオニゼーション（ＳＥＬＤＩ）マス・スペクトロメトリー：ア・ノベル・プロテイン・バイオチップ・テクノロジー・フォー・デテクション・オブ・プロステート・キャンサー・バイオマーカーズ・イン・コンプレックス・プロテイン・ミクスチャー（Ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ （ＳＥＬＤＩ） ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ）」、プロステート・キャンサー・アンド・プロスタティック・ディジーズ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）２、２６４〜７６頁（１９９９）およびマーチャント（Ｍａｒｃｈａｎｔ）およびワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）、「リーセント・アドバンスメント・イン・サーフェス−エンハンスド・レーザー・デソープション／イオニゼーション−タイム・オブ・フライト−マス・スペクトロメトリー（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」、エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）２１、１１６４〜６７頁（２０００）参照、なおその各々は参照により、すべての表、図および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。試験サンプル中の分子（例えば、ペプチド）は、当業者に公知のいずれの方法でイオン化してもよい。これらの方法としては、それだけには限らないが、電子イオン化、化学イオン化、高速原子衝撃、電界脱離、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）、表面増強レーザー脱離イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）、光子電離、エレクトロスプレー、および誘導結合プラズマが挙げられる。
【００６２】
特定の実施形態では、前記で論じたＭＳ法を、アフィニティー精製ステップ、例えば、注目する１種以上のポリペプチドと特異的に結合する抗体との結合と組み合わせることが好ましい。例えば、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）６７、１１５３頁、１９９５、タブス（Ｔｕｂｂｓ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８９、２６頁、２００１、ニーダーコフラー（Ｎｉｅｄｅｒｋｏｆｌｅｒ）ら、アナリティカル・ケミストリー７３、３２９４頁、２００１参照。
【００６３】
糖タンパク質の一特徴として、特有のグリカンの不均一性がある。所与の糖タンパク質の個々の分子が、ポリペプチド鎖中の同じ付着部位に異なる糖鎖を有することは極めて一般的なことである。糖鎖残基中の構造変化はいずれも、グリコフォームと呼ばれる個別の分子サブセットの形成をもたらす。種々の分離法の場合には、このような不均一性が、注目する種々のポリペプチドの電荷および質量の差、および／または注目する種々のポリペプチドの結合マトリックス（例えば、抗体）との結合の差により分析を実施的に困難にする場合がある。さらに、糖鎖は、容易にプロトン化され得るタンパク質などの化合物と同程度には効率よくイオン化されず、また効率よく気相に運ばれないと思われる。
【００６４】
したがって、好ましい実施形態では、本明細書に記載した方法は、同一のアッセイステップを、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去せずに実施することと比較して、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの検出の増加を提供する。本明細書において、用語「検出の増加」とは、注目する１種以上の特定のナトリウム利尿ペプチドのアッセイ法から得られるシグナルの増加を指す。このようなシグナルの増加は、注目するすべてのナトリウム利尿ペプチドを検出する能力の上昇を表すものであり得る。例えば、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの特定のグリコシル化型とは結合できない抗体は、そういったナトリウム利尿ペプチドの濃度を過小評価するアッセイシグナルをもたらし、あるいは、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの特定のグリコシル化型の効率の悪いイオン化が、そういったナトリウム利尿ペプチドの濃度を過小評価するＭＳによるアッセイシグナルをもたらす。脱グリコシル化は、アッセイシグナルの増加をもたらし得る。このようなシグナルの増加はまた、注目するナトリウム利尿ペプチドの１種以上の具体的な型を検出する能力の上昇を表すものであり得る。例えば、グリカンの不均一性は、分離法（例えば、質量および／または電荷に基づくもの）において単一ポリペプチドの複数の異なる画分への分離をもたらし得る。脱グリコシル化は、そのような異なる画分の単一画分への併合をもたらし、その結果、その画分のアッセイシグナルの向上を提供し得る。
【００６５】
種々の実施形態では、同一アッセイステップを、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去しないで実施することと比べて、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチド検出の増加を、少なくとも約５％、より好ましくは、少なくとも約１０％、いっそうより好ましくは、少なくとも約２０％、さらにより好ましくは、少なくとも約５０％、いっそうより好ましくは、少なくとも１００％、最も好ましくは、少なくとも約２００％以上増加するアッセイシグナルによって測定する。
【００６６】
特に好ましい実施形態では、注目するナトリウム利尿ペプチドはＢＮＰおよび／または１種以上のその関連断片である。用語「関連断片」は、以下に定義する。好ましいＢＮＰ関連断片は、プロ−ＢＮＰ（ＢＮＰ1〜108）、ＮＴ−プロＢＮＰ（ＢＮＰ1〜76）、ＢＮＰ3〜108、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ79〜108からなる群から選択されるものを含んでなる。この羅列は限定しようとするものではない。
【００６７】
関連態様では、本発明は、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドに共有結合している糖鎖残基の存在（または不在）に感受性があるか、感受性がないのいずれかである抗体を選択および使用する方法に関する。抗体は、注目する１種以上のグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドと結合する能力についてスクリーニングでき、その結合を、１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと結合する能力と比較することができる。この基準によって実質的に同一の結合を提供する抗体は、「感受性がない」抗体に相当する。この基準によって、グリコシル化型または脱グリコシル化型について実質的に同一でない結合を提供する抗体は、「感受性のある」抗体に相当する。このような抗体を、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドを検出するためのアッセイ法に用いるために選択すればよい。
【００６８】
これに関連して、用語「１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去」は、必ずしも、ポリペプチドから既存の糖鎖残基を除去するための酵素的または非酵素的化学処理の使用を指すものではない。そうではなく、１種以上の共有結合している糖鎖残基を欠くポリペプチドを作製する方法であれば、どんな方法も包含することを意味する。例えば、固相合成法を用いて、このような抗体スクリーニング法に用いるために、すべての糖鎖残基を含まないポリペプチドを作製することもできる。本明細書に記載したスクリーニング法において用いるためには、少なくとも約５０％の糖鎖残基が、注目する１種以上の、好ましくはすべてのグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドから除去されることが好ましく、少なくとも約６０％がより好ましく、少なくとも約７０％がいっそうより好ましく、少なくとも約８０％がさらにより好ましくは、少なくとも約９０％〜約１００％が最も好ましい。
【００６９】
用語「実質的に同一の結合」とは、アッセイに用いると、前記のスクリーニング比較において、互いに約２倍以内であるシグナルを提供する抗体を指す。１倍はシグナルが同等であることを示し、シグナルが２倍以内であることは一方のシグナルが他方のシグナル×２以下であることを示す。実質的に同一の結合を示す抗体は、約１．７５倍以内であるシグナルを提供することが好ましく、約１．５倍以内がより好ましく、約１．２５倍以内がいっそうより好ましく、約１．１〜１倍以内であることが最も好ましい。
【００７０】
このような抗体はまた、注目する１種以上のグリコシル化ナトリウム利尿ペプチドに対して、１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと比較して「実質的に同一の親和性」を有し得る。１倍とは親和性が等しいことを示し、親和性が２倍以内であるということは、一方の親和性が他方のシグナル×２以下であることを示す。実質的に同一の結合を示す抗体は、約１．７５倍以内である親和性を提供することが好ましく、約１．５倍以内がより好ましく、約１．２５倍以内がいっそうより好ましく、約１．１〜１倍以内が最も好ましい。
【００７１】
前述した本発明の要旨は限定するものではなく、本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ジペプチジルぺプチダーゼの阻害剤の不在下（パネルＡおよびＣ）、および存在下（パネルＢおおよびＤ）での、ヒト血清中のＢＮＰおよびその分解産物のマススペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、幾分か、生物活性（例えば、全長）ナトリウム利尿ペプチドを、そのナトリウム利尿ペプチドの生物学的不活性型と識別する方法に関する。本明細書に記載したように、生物活性ナトリウム利尿ペプチドを選択的に認識する抗体を作製し、サンプル中の不活性なナトリウム利尿ペプチド断片の存在によって引き起こされる不正確さを低下させたアッセイに用いることができる。
【００７４】
本明細書において、用語「ナトリウム利尿ペプチド」とは、身体においてレニン−アンギオテンシン系の活性に対抗するよう作用する天然に生じるポリペプチドホルモン群のメンバー、およびその生合成前駆体および生物活性断片を指す。３つの主要なヒトナトリウム利尿ペプチドがある：心房で合成される、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、心室で合成される、脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、および脳で合成される、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）。
【００７５】
本明細書において、用語「無傷のナトリウム利尿ペプチド」とは、全長プレ−プロ−ナトリウム利尿ペプチド、全長プロ−ナトリウム利尿ペプチド、全長成熟ナトリウム利尿ペプチド、および／または生合成の間のプレ−プロ−またはプロ−ナトリウム利尿ペプチドのプロセシングの際に除去される全長部分を指す。例えば、ＢＮＰの場合には、用語「無傷のナトリウム利尿ペプチド」は、全長３２アミノ酸成熟ＢＮＰホルモン、全長１３４アミノ酸プレ−プロ−ＢＮＰ分子、全長１０８アミノ酸プロ−ＢＮＰ分子、全長７６アミノ酸ＮＴ−プロＢＮＰ分子、および／または全長２６アミノ酸「プレ」ペプチドを包含する。
【００７６】
ヒト１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体プロ−ＢＮＰ（ＢＮＰ1〜108）の配列を配列番号１として示す。成熟、全長ＢＮＰ（ＢＮＰ77〜108）には下線が引かれている。
【化１】
（配列番号１）
【００７７】
ヒトＢＮＰ1〜108は、配列番号２として示される配列を有する大きな前駆体プレ−プロ−ＢＮＰとして合成される（「プレ」配列は太字で示されている）：
【化２】
（配列番号２）
【００７８】
１２６アミノ酸ヒトＡＮＰ前駆体プロ−ＡＮＰ（ＡＮＰ1〜126）の配列を配列番号３として示す。成熟、全長ＡＮＰ（ＡＮＰ99〜126）には下線が引いてある：
【化３】
（配列番号３）
【００７９】
ヒトＡＮＰ1〜126は、配列番号４で示される配列を有する大きな前駆体プレ−プロ−ＡＮＰとして合成される（「プレ」配列は太字で示されている）：
【化４】
（配列番号４）
【００８０】
１２６アミノ酸ヒトＣＮＰ前駆体プロ−ＣＮＰ（ＣＮＰ1〜126）の配列を配列番号５として示す。全長成熟ＣＮＰ型ＣＮＰ−５３（ＣＮＰ74〜126）は斜体字で示し、全長成熟
ＣＮＰ型ＣＮＰ−２２（ＣＮＰ105〜126）には下線が引いてある：
【化５】
（配列番号５）
【００８１】
本明細書において、用語「断片」とは、断片が由来するポリペプチドの少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるが、完全な親ポリペプチドよりも小さいポリペプチドを指す。したがって、プロ−ＢＮＰ（ＢＮＰ1〜108）の断片とは、ＢＮＰ1〜108の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、成熟ＢＮＰの断片とは、ＢＮＰ77〜108の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＢＮＰの成熟ＢＮＰへの切断によって生じるポリペプチドの断片とは、ＢＮＰ1〜76の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指す。同様に、プロ−ＡＮＰ（ＡＮＰ1〜126）の断片とは、ＡＮＰ1〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、成熟ＡＮＰの断片とは、ＡＮＰ99〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＡＮＰの成熟ＡＮＰへの切断によって生じるポリペプチドの断片とは、ＡＮＰ1〜98の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＣＮＰ（ＣＮＰ1〜126）の断片とは、ＣＮＰ1〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、成熟ＣＮＰの断片とは、ＣＮＰ74〜126またはＣＮＰ105〜126の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指し、プロ−ＣＮＰの成熟ＣＮＰへの切断によって生じるポリペプチドの断片とは、ＣＮＰ1〜73またはＣＮＰ1〜104の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、断片とは、断片が由来するポリペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸、断片が由来するポリペプチドの少なくとも１５個の連続するアミノ酸、または断片が由来するポリペプチドの少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドを指す。
【００８２】
本明細書において、用語「関連断片」とは、個々のポリペプチドのまたはその生合成親の１種以上の断片であって、ポリペプチド自体の代理として、または独立マーカーとして検出できるものを指す。例えば、ヒトＢＮＰは、以下、ＢＮＰ1〜108と呼ぶ、１０８アミノ酸前駆体分子のタンパク質分解によって得られる。成熟ＢＮＰまたは「ＢＮＰナトリウム利尿ペプチド」または「ＢＮＰ−３２」は、この前駆体のアミノ酸７７〜１０８に相当する３２アミノ酸分子であり、これはＢＮＰ77〜108と呼ぶことができる。残りの残基１〜７６は、以下、ＢＮＰ1〜76と呼ぶ。ＢＮＰ1〜108およびＢＮＰ1〜76は「ＢＮＰ関連断片」の例である。
【００８３】
本明細書において、用語「Ｎ末端部分の除去によって形成される断片」とは、ナトリウム利尿ペプチド断片に関しては、無傷のペプチドのアミノ末端からの１個以上のアミノ酸の除去によって形成される無傷のナトリウム利尿ペプチドの断片を指す。好ましい実施形態では、このような断片は、無傷のペプチドのアミノ末端からの、少なくとも２、３、４、５、７、１０、１５、２０個、またはそれより多いアミノ酸の除去によって形成される。
【００８４】
本明細書において、用語「生物活性」とは、ナトリウム利尿ペプチドおよびその断片に関しては、全長成熟ナトリウム利尿ペプチド、またはロペスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２７２、２３０６４〜２３０６８頁、１９９７に記載されたように測定される、単離し前収縮させたマウス大動脈輪において全長成熟ナトリウム利尿ペプチドによって示される血管緊張低下作用の少なくとも５０％を示す、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドまたはその前駆体分子に由来するポリペプチドを指す。生物活性ナトリウム利尿ペプチドとしては、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドの断片、またはその前駆体型もしくは断片が挙げられる。
【００８５】
本明細書において、用語「生物学的不活性」とは、ナトリウム利尿ペプチド断片に関しては、前述の「生物活性」でない、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドまたはその前駆体に由来するポリペプチドを指す。本明細書において、用語「生物学的不活性」は、必ずしも、すべての生物活性の完全な喪失を指すものではない。むしろ「生物学的不活性」ナトリウム利尿ペプチド断片は、無傷のナトリウム利尿ペプチドの１以上の生物学的機能の５０％未満を示すことが好ましく、２５％未満が好ましく、１０％未満がより好ましく、１％未満が最も好ましい。この生物学的機能とは、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドによって示されるものと比較される、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｒｉｎｏｌｏｇｙ）１６７、２３９〜４６頁、２０００に記載されたように測定できる受容体結合、シメカケら、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）３０９、１８５〜９頁、１９９２に記載されたように測定できる培養ラット大動脈平滑筋細胞におけるｃＧＭＰ産生、および／またはロペスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２７２、２３０６４〜２３０６８頁、１９９７に記載されたように測定される、全長成熟ナトリウム利尿ペプチドによって示される単離し前収縮させたマウス大動脈輪における血管緊張低下作用であり得る。
【００８６】
本明細書において、用語「グリコシル化」とは、ポリペプチドに関しては、共有結合している糖ユニットを、多くの場合グリカン鎖の形で含んでなるポリペプチドを指す。個々の糖ユニットは本明細書では、「共有結合している糖鎖残基」と呼ぶ。真核生物では、ポリペプチドのグリコシル化は、主としてアスパラギン側鎖とのグリコシド結合を介して（「Ｎ−結合型」）、セリンまたはスレオニン側鎖グリコシド結合を介して（「Ｏ−結合型」）起こり、または、糖鎖橋を介してポリペプチドがホスファチジルイノシトール脂質のアンカーと結合する場合もある（ＧＰＩ−結合型）。
【００８７】
本明細書において、用語「脱グリコシル化」とは、ポリペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去する方法を指す。すべての共有結合している糖鎖残基の除去が好ましいが、ポリペプチドは、いずれかの共有結合している糖鎖残基が除去されれば脱グリコシル化されたと考えられる。酵素処理、非酵素的処理、または２種の組合せを用いて、ポリペプチドから共有結合している糖鎖残基を除去することができる。ポリペプチドから少なくとも約５０％の糖鎖残基が除去されるのが好ましく、少なくとも約６０％がより好ましく、少なくとも約７０％がいっそうより好ましく、少なくとも８０％がさらにより好ましく、少なくとも約９０％〜約１００％が最も好ましい。
【００８８】
本明細書において、用語「精製された」とは、ポリペプチドに関しては、完全な純度を必要とするものではない。そうではなく、注目するポリペプチドが、その他のタンパク質と比較して多量のもの（質量ベースで）が生体サンプル中よりも多い、個別の環境中にあることを示すものに相当する。「個別の環境」とは、単一媒体、例えば、単一溶液、単一ゲル、単一沈殿物などを意味する。精製されたポリペプチドは、例えば、実験室合成、クロマトグラフィー、分取電気泳動、遠心分離、沈殿、アフィニティー精製などをはじめとするいくつかの方法によって獲得できる。注目する１種以上の「精製された」ポリペプチドは、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも１０％であることが好ましい。１種以上の「実質的に精製された」ポリペプチドは、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも５０％であり、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも７５％がより好ましく、個別の環境のタンパク質含量の少なくとも９５％が最も好ましい。タンパク質含量は、ハートリー（Ｈａｒｔｒｅｅ）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４８、４２２〜４２７頁（１９７２）に記載された、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として用いるローリー（Ｌｏｗｒｙ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー１９３、２６５頁、１９５１の方法の改変を用いて求める。
【００８９】
本明細書において、用語「抗体」とは、抗原またはエピトープと特異的に結合できる免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子類またはその断片に由来する、それらをモデルとする、またはそれらによって実質的にコードされるペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、ファンダメンタル・イムノロジー（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３版、Ｗ．Ｅ．ポール（Ｐａｕｌ）ら、ラベン・プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ．Ｙ．（１９９３）、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、（１９９４）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）１７５、２６７〜２７３頁、ヤームッシュ（Ｙａｒｍｕｓｈ）（１９９２）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル・メソッヅ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）２５、８５〜９７頁参照。用語抗体は、抗原と結合する能力を保持する抗原結合性部分、すなわち、「抗原結合性部位」（例えば、断片、配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ，ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合している２つのＦａｂ断片を含んでなる二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（ワード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４１、５４４〜５４６頁）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。単鎖抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および分子生物学的技術によって（例えば、ファージディスプレイ法によって）得られる抗体も、参照により用語「抗体」に含まれる。好ましい抗体は「オムニクローナル」抗体である。これは、各抗体が標的抗原と１０9Ｍ-1〜１０10Ｍ-1という最小親和性で特異的に結合する、ファージディスプレイライブラリーから選択された種々の抗体分子の混合物を意味する。
【００９０】
用語「特異的に結合する」は、抗体が目的とする標的のみと結合することを示すことを意図するものではない。むしろ、抗体は、その目的とする標的に対するその親和性が、非標的分子に対するその親和性と比較して約５倍大きい場合に「特異的に結合する」。標的分子に対する抗体の親和性が、非標的分子に対するその親和性よりも少なくとも約５倍大きいことが好ましく、１０倍が好ましく、２５倍がより好ましく、５０倍がいっそうより好ましく、１００倍以上が最も好ましい。好ましい実施形態では、抗体またはその他の結合因子と抗原との間の特異的結合とは、少なくとも１０6Ｍ-1の結合親和性を意味する。少なくとも約１０7Ｍ-1の親和性で結合する抗体が好ましく、約１０8Ｍ-1〜約１０9Ｍ-1、約１０9Ｍ-1〜１０10Ｍ-1または約１０10Ｍ-1〜約１０11Ｍ-1の間が好ましい。
【００９１】
親和性は、Ｋd＝ｋoff／ｋonとして算出する（Ｋoffは解離速度定数、ｋonは会合速度定数であり、Ｋdは平衡定数である）。親和性は、平衡時に種々の濃度（ｃ）で標識したリガンドの結合している画分（ｒ）を測定することによって求めることができる。データはスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）方程式：ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）を用いてグラフ化する：
式中、
ｒ＝平衡時の結合しているリガンドのモル／受容体のモル、
ｃ＝平衡時の遊離リガンド濃度、
Ｋ＝平衡会合定数、および
ｎ＝受容体分子当たりのリガンド結合部位の数。
図解法によってｒ／ｃをＹ軸にｒをＸ軸にプロットし、このようにしてスカッチャードプロットを得る。線の負の傾斜が親和性となる。ｋoffは、結合している標識されたリガンドを標識されていない過剰のリガンドと競合させることによって求めることができる（例えば、米国特許第６，３１６，４０９号参照）。ターゲッティング因子の、その標的分子に対する親和性は、少なくとも約１×１０-6モル／リットルであることが好ましく、少なくとも約１×１０-7モル／リットルであることがより好ましく、少なくとも約１×１０-8モル／リットルであることがいっそうより好ましく、少なくとも約１×１０-9モル／リットルであることがさらにいっそうより好ましく、少なくとも１×１０-10モル／リットルであることが最も好ましい。スカッチャード分析による抗体親和性測定は当技術分野では周知である。例えば、ヴァン・エルプ（ｖａｎ Ｅｒｐ）ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）１２、４２５〜４３頁、１９９１、ネルソン（Ｎｅｌｏｓｏｎ）およびグリズウォルド（Ｇｒｉｓｗｏｌｄ）、コンピュータ・メソッヅ・アンド・プログラムス・イン・バイオメディシン（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）２７、６５〜８頁、１９８８参照。
【００９２】
本明細書において、用語「個別の」とは、連続していない表面の領域を指す。すなわち、いずれかの領域の一部ではない境界線が２つの領域の各々を完全に取り囲む場合に、２つの領域は互いに個別である。本明細書において、用語「独立してアドレス可能である」とは、特異的シグナルが得られる表面の個別の領域を指す。当業者ならば、抗体ゾーンも互いに独立であり得るが、表面で互いに接触している場合もあることは理解するであろう。
【００９３】
本明細書において、用語「試験サンプル」とは、注目する１種以上の分析物の存在または量が未知であり、アッセイ、好ましくは、イムノアッセイにおいて調べられようとするサンプルを指す。試験サンプルは、被験体、例えば、患者の、診断、予後診断、または評価目的で得られた体液であることが好ましい。特定の実施形態では、このようなサンプルは、進行中の症状の結果または症状に対する治療計画の作用を調べる目的で得る場合がある。好ましい試験サンプルとしては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿および唾液が挙げられる。さらに、当業者であれば、試験サンプルの中には分画または精製手順、例えば、全血の血清または血漿成分への分離の後により容易に解析できるものもあるということは理解されよう。好ましいサンプルは細菌、ウイルスおよび動物、例えば、イヌおよびネコから得ることができる。特に好ましいサンプルはヒトから得られる。対照目的で、「標準サンプル」とは、注目する１種以上の分析物の存在または量が、１種以上の分析物をアッセイする前に既知であるサンプルを指す。
【００９４】
本明細書において、用語「疾病サンプル」とは、所与の疾病を患っていると調べられている被験体から得た組織サンプルを指す。臨床診断の方法は当業者には周知である。例えば、ケリーズ・テキストブック・オブ・インターナル・メディシン（Ｋｅｌｌｙ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第４版、リッピンコット・ウィリアムス＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ペンシルバニア州、フィラデルフィア、２０００、ザ・メルク・マニュアル・オブ・ダイアグノシス・アンド・セラピー（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１７版、メルク・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）編、ニュージャージー州、ホワイトハウス・ステーション（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ）、１９９９参照。
【００９５】
用語「プロリル特異的ジペプチジルペプチダーゼ」または「プロリル特異的ＤＰＰ」とは、基質ポリペプチドのＮ末端からジペプチドを切断し、２番目の位置のプロリン（すなわち、ＮＨ２−Ｘ−ｐｒｏ−ペプチド−ＣＯＯＨ、ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｐｒｏと残りのペプチドの間の結合が切断される）に優先傾向を示すセリンプロテアーゼを指す。このようなプロテアーゼは通常、Ｅ．Ｃ．３．４．１４．Ｘ下、例えば、Ｅ．Ｃ．３．４．１４．５および３．４．１４．１１に分類される。ＤＰＰは、ＤＰＰ−ＩＩおよびＤＰＰ−ＩＶなどの種類に分類されることが多い。
【００９６】
本明細書において、用語「阻害剤」とは、酵素的（タンパク質分解性）活性に影響を及ぼす分子に関しては、必ずしも全酵素活性の完全な喪失を指さない。むしろ、「阻害剤」は酵素活性を、阻害剤の不在下で示される酵素活性の少なくとも１０％減少させ、少なくとも２５％がより好ましく、少なくとも５０％がいっそうより好ましく、少なくとも７５％がさらにより好ましく、少なくとも９０％が最も好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、当業者に周知の方法によって酵素活性を直接測定することによって阻害剤の活性を測定することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでも、阻害剤の活性を、酵素基質に対する酵素活性を直接測定することによって測定することができ、または分解酵素の場合には、基質の１／２が被験体（例えば、実験動物）の身体から排除される時間（Ｔ1/2）を求めることによって測定することができる。後者の場合には、「阻害剤」は、阻害剤の不在下で示されるＴ1/2と比較して、Ｔ1/2を少なくとも１０％延長し、少なくとも２５％がより好ましく、少なくとも５０％がいっそうより好ましく、少なくとも７５％がさらにより好ましく、少なくとも９０％が最も好ましい。
【００９７】
好ましい阻害剤は、プロテアーゼの特定のクラスに選択的である（例えば、ジペプチジルペプチダーゼに、またはジペプチジルペプチダーゼの特定のサブセットに選択的）。阻害剤は、プロテアーゼの特定のクラスを非標的プロテアーゼより少なくとも１０倍より多く阻害する場合に、そのクラスに「選択的」であると考えられており、少なくとも１００倍より多くがより好ましく、少なくとも１０００倍より多くが最も好ましい。種々のＤＰＰ種の選択的阻害剤が知られている。例えば、Ｈ−Ｄａｂ−Ｐｉｐは、ＤＰＰ ＩＶ（ＩＣ50＞１ｍＭ）（ＤＰＰ ＩＶ；ＥＣ３．４．１４．５．）を上回ってジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＤＰＰ ＩＩ；ＥＣ３．４．１４．２．）に選択的（＞７，６００倍）であると報告されている。センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ１２、２８２５頁、２００２。同様に１−［［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジンは、ＤＰＰ ＩＶの選択的、経口活性阻害剤であると報告されている。アーレン（Ａｈｒｅｎ）ら、ダイアベーツ・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）２５、８６９〜７５頁、２００２。
【００９８】
本明細書において、用語「約」は、所与の数の＋／−１０％を指す。
【００９９】
ナトリウム利尿ペプチド断片の、予後および診断マーカーとしての使用
【０１００】
前述のように、特定の疾病状態においてナトリウム利尿ペプチドの血中レベルの上昇が見られており、このことは、例えば、脳卒中、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心虚血、全身性高血圧、および急性心筋梗塞などといった疾病の病態生理における役割を示唆するものである。例えば、ＷＯ０２／０８９６５７、ＷＯ０２／０８３９１３、ＷＯ０３／０１６９１０、ハントら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション２１４、１７７５〜８３頁、１９９５、ベヌゴパール（ｖｅｎｕｇｏｐａｌ）、ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマシー・アンド・セラピューティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）２６、１５〜３１頁、２００１、およびカーラ（Ｋａｌｒａ）ら、サーキュレーション１０７、５７１〜３頁、２００３参照、なお、それらの各々は、すべての表、図および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。ナトリウム利尿ペプチドは、単独で、集合的に、および／またはさらなるタンパク質とともに、種々の心血管の状態の疾病マーカーおよび予後の指標としても利用できる。
【０１０１】
循環からのナトリウム利尿ペプチドの除去は分解経路と関連していると報告されている。実際、特定の状況下でナトリウム利尿ペプチドを切断する中性エンドペプチダーゼの阻害剤が特定の循環器疾患の治療において期待できると示唆されている。例えば、トリンダージ（Ｔｒｉｎｄａｄｅ）およびルーロー（Ｒｏｕｌｅａｕ）、ハート・フェイリヤー・モニター（Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ）２、２〜７頁、２００１参照。しかし、臨床サンプル中のナトリウム利尿ペプチドの測定は、通常、分子の分解状態を考慮しないで、ＢＮＰ、ＡＮＰおよび／またはＣＮＰ、それらの前駆体分子（すわなち、プロ−ＢＮＰ、プロ−ＡＮＰ、およびプロ−ＣＮＰ）、および成熟ナトリウム利尿ペプチドを提供するためのプロ型の切断に起因する断片の測定に焦点を当ててきた。また、ナトリウム利尿ペプチド中のメチオニン残基の酸化によって、還元型と比較して生物活性が低下すると報告されている。コヤマら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０３、４２５〜３２頁。本明細書に記載した目的には、メチオニン酸化型を分解産物と考えることができる。
【０１０２】
本発明は、ナトリウム利尿ペプチドの分解経路およびこの分解の際に形成される産物の理解をもって設計されていないアッセイは、サンプル中の個々のナトリウムペプチドの生物活性型を正確に測定しない場合があることを初めて記載する。注目する生物活性ナトリウム利尿ペプチドとナトリウム利尿ペプチドに由来する不活性断片双方の意図しない測定の結果、サンプル中の生物活性ナトリウム利尿ペプチド濃度を多く見積もる可能性がある。以下、主にＢＮＰ関連断片に関して記載するが、当業者ならば、本明細書に記載した一般概念をＡＮＰおよびＣＮＰ関連断片に等しく当てはまることは理解するであろう。
【０１０３】
１種以上のナトリウム利尿ペプチドの測定時に、臨床サンプル中に存在し得る種々のナトリウム利尿ペプチドおよびその断片の活性を考慮できないと、いずれかの診断または予後法の精度に重大な結果をもたらす可能性がある。例えば、サンドイッチイムノアッセイをＢＮＰに対して提供し、存在していた生物活性ＢＮＰの相当量（例えば、５０％）が今や不活性型に分解されている単純な場合を考えてみる。生物活性ＢＮＰと不活性断片に共通する領域と結合する抗体を用いて構築されたイムノアッセイでは、サンプル中に存在する生物活性ＢＮＰの量が２倍まで多く見積もられ、「偽陽性」結果をもたらす可能性がある。この不正確さは重篤な心不全の場合には特に関連があるが、これは中性エンドペプチダーゼ発現がこれらの患者において高まっていると報告されているためである。クネヒト（Ｋｎｅｃｈｔ）ら、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）７１、２７０１〜１２頁、２００２。ナトリウム利尿ペプチド分解の原因と考えられている酵素の発現増加は、これらの患者において不活性断片プールを増加させると予測できる。
【０１０４】
サンプルのナトリウム利尿ペプチド濃度を多く見積もることはまた、患者管理にも重大な結果をもたらし得る。例えば、ＢＮＰ濃度を用いて、うっ血性心不全の治療が有効であるかどうかを調べることができる（例えば、ＢＮＰをモニターして治療で上昇したレベルが正常に戻っているかどうかを確かめることによって）。前記で論じた、同様の「偽陽性」ＢＮＰ結果は、現治療が有効でないという誤った印象のために医師が治療を継続、増加または改変するよう（例えば、利尿効果のある、ＡＣＢ阻害剤、ジゴキシン、β−ブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、および／または血管拡張薬の投与量を増加するよう、または外科的介入を考慮するようにさえ）導く可能性がある。
【０１０５】
同様に、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドのグリコシル化状態を理解して設計されていなかったアッセイは、サンプル中の個々のナトリウム利尿ペプチドの型を同様に正確に測定しない可能性がることを記載する。ｉｎ ｖｉｖｏで見られる天然グリコシル化プロフィールを欠く、合成ペプチドまたは発現されたペプチドの使用を介してアッセイに用いる抗体を作製することが多い。例えば、ＢＮＰについてサンドイッチイムノアッセイを提供し、存在するＢＮＰの相当量（例えば、５０％）が、抗体結合を干渉するグリコシル化がなされている単純な場合を考えてみる。このような抗体を用いて構築されたイムノアッセイではサンプル中に存在するＢＮＰの量が２倍低く見積もられ、「偽陰性」結果をもたらす可能性がある。
【０１０６】
ナトリウム利尿ペプチド間のグリコシル化の相違はまた、個々のナトリウム利尿ペプチドのグリコシル化状態によるナトリウム利尿ペプチド受容体での活性の相違を介してか、生物半減期の相違のいずれかを介して、生物活性の相違をもたらす可能性がある。したがって、本明細書の方法を用いて、特定のグリコシル化状態に特異的なアッセイを作製して、再度このようなアッセイの診断および治療実用性の精度を向上させることができる。
【０１０７】
当業者ならば、本明細書に記載した方法をポリペプチドに広く適用できること、および本明細書に詳細に記載したナトリウム利尿ペプチドの分析は単に例示的なものであるということを理解されよう。同様の分析の対象となり得るその他の適したポリペプチドとしては、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、バソプレッシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ウロジラチン（ｕｒｏｄｉｌａｔｉｎ）、ウロテンシンＩＩ、遊離心臓トロポニンＩ、遊離心臓トロポニンＴ、トロポニンＴおよびトロポニンＣの一方または双方を含んでなる複合体中の心臓トロポニンＩ、トロポニンＩおよびトロポニンＣの一方または双方を含んでなる複合体中の心臓トロポニンＴ、総心臓トロポニンＩ、総心臓トロポニンＴ、肺サーファクタントタンパク質Ｄ、Ｄ−二量体、アネキシンＶ、エノラーゼ、クレアチンキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、心臓型脂肪酸結合タンパク質、ホスホグリセリン酸ムターゼ、Ｓ−１００、Ｓ−１００ａｏ、プラスミン−α２−アンチプラスミン複合体、β−トロンボグロブリン、血小板因子４、フィブリノペプチドＡ、血小板由来成長因子、プロトロンビン断片１＋２、Ｐ−セレクチン、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体、フォン・ウィルブランド因子、組織因子、血栓前駆体タンパク質、ヒト中性エラスターゼ、誘導可能一酸化窒素シンターゼ、リゾホスファチジン酸、マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、Ｃ−反応性タンパク質、インターロイキン−１β、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子α、可溶性細胞間接着分子−１、血管細胞接着分子、単球走化性タンパク質−１、カスパーゼ−３、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤシンターゼ、肥満細胞トリプターゼ、好酸球カチオン性タンパク質、ＫＬ−６、プロカルシトニン、ハプトグロビン、ｓ−ＣＤ４０リガンド、Ｓ−ＦＡＳリガンド、α２アクチン、塩基性カルポニン１、ＣＳＲＰ２エラスチン、ＬＴＢＰ４、平滑筋ミオシン、平滑筋ミオシン重鎖、トランスゲリン（ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）、アルドステロン、アンギオテンシンＩＩＩ、ブラジキニン、エンドセリン１、エンドセリン２、エンドセリン３、レニン、ＡＰＯ Ｂ４８、膵臓エラスターゼ１、膵臓リパーゼ、ｓＰＬＡ２、トリプシノーゲン活性化ペプチド、αエノラーゼ、ＬＡＭＰ３、ホスホリパーゼＤ、ＰＬＡ２Ｇ５、タンパク質Ｄ、ＳＦＴＰＣ、デフェンシンＨＢＤ１、デフェンシンＨＢＤ２、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−３、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、プロカルシトニン、タンパク質Ｃ、血清アミロイドＡ、ｓ−グルタチオン、ｓ−ＴＮＦ Ｐ５５、ｓ−ＴＮＦ Ｐ７５、ＴＡＦ１、ＴＧＦβ、ＭＭＰ−１１、脳脂肪酸結合タンパク質、ＣＡ１１、ＣＡＢＰ１、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＢＬＮ１、ＣＨＮ２、切断されたタウ、ＣＲＨＲ１、ＤＲＰＬＡ、ＥＧＦ、ＧＰＭ６Ｂ、ＧＰＲ７、ＧＰＲ８、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＭ７、ＨＡＰＩＰ、ＨＩＦ１α、ＨＩＰ２ＫＣＮＫ４、ＫＣＮＫ９、ＫＣＮＱ５、ＭＡＰＫ１０、ｎ−アセチルアスパルテート、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＲＧ２、ＰＡＣＥ４、ホスホグリセレートムターゼ、ＰＫＣγ、プロスタグランジンＥ２、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＲＺ１、ＲＧＳ９、ＳＣＡ７、セクレタゴギン（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｉｎ）、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＯＲＬ１、ＳＲＥＢ３、ＳＴＡＣ、ＳＴＸ１Ａ、ＳＴＸＢＰ１、ＢＤＮＦ、シスタチンＣ、ニューロキニンＡ、サブスタンスＰ、インターロイキン−１、インターロイキン−１１、インターロイキン−１３、インターロイキン−１８、インターロイキン−４、およびインターロイキン−１０が挙げられる。
【０１０８】
ナトリウム利尿ペプチドのグリコシル化
【０１０９】
グリコシル化ポリペプチドは通常、１個以上のアスパラギン残基のアミノ基と結合しているＮ−結合型糖、１個以上のセリンおよび／またはスレオニン残基のヒドロキシル基と結合しているＯ−結合型糖またはＮ−およびＯ−結合型糖の組合せを含んでなる。本発明はナトリウム利尿ペプチドがグリコシル化されることを初めて証明する。さらに、本発明は、グリコシル化が、特定の方法のサンプル中のナトリウム利尿ペプチドを検出する能力に重大な影響を及ぼし得ることを実証する。
【０１１０】
いくつかのアプローチを用れば、グリコシル化によって検出スキームにもたらされる可能性のある困難を取り除くことができる。まず、グリコシル化の存在が正確な検出を混乱させている場合には、化学的処理または酵素処理を用いてポリペプチドから糖鎖残基を除去し、それによって注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドを「検出可能な」状態に切り替えることができる。第２に、グリコシル化による干渉を受けない、注目するナトリウム利尿ペプチドの１以上の領域と結合する抗体を注意深く選択して、個々のグリコシル化状態に「非感受性」である抗体を提供することができる。第３に、グリコシル化されているが、脱グリコシル化状態で結合の低下を示す、注目するナトリウム利尿ペプチドの１以上の領域と結合する抗体を注意深く選択して、個々のグリコシル化状態に「感受性」である抗体を提供することができる。第４に、グリコシル化されているが、脱グリコシル化状態で結合の増加を示す、注目するナトリウム利尿ペプチドの１以上の領域と結合する抗体を注意深く選択して、個々のグリコシル化状態に「感受性」である抗体を提供することができる。また、これらのアプローチを必要に応じてまたは所望により組み合わせることもできる。
【０１１１】
Ｎ−およびＯ−結合型糖鎖残基を除去するための有効な酵素法は、当技術分野では周知であり、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−グリコシダーゼとしても知られる）、エンドグリコシダーゼＨ、エンドグリコシダーゼＡ、Ｏ−グリカナーゼ（エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとしても知られる）、α２−（３，６，８，９）−ノイリミニダーゼ（ｎｅｕｒｉｍｉｎｉｄａｓｅ）、β（１，４）−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、および／またはエンドグリコシダーゼＦ3などの酵素を用いる。この羅列は限定しようとするものではない。このような、ペプチドからの糖除去の酵素法は、天然（非変性）ペプチドに用いることができる。しかし、このような酵素法では、糖ペプチドの変性を用いることができ、これでは脱グリコシル化度を高めることが多い。一般的な変性条件は、ほぼ中性ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．５と約ｐＨ８の間）のバッファー溶液中、約０．０１％〜約１％のドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）、および場合によっては、約５ｍＭ〜約５００ｍＭのβ−メルカプトエタノールの添加を含んでなる。このような方法は、いくつかの脱グリコシル化酵素の安定化に役立ち得る、約０．２％〜約２％のＮＰ−４０をさらに含んでなる場合もある。このような変性条件とともに、高温（例えば、約０．５時間〜約４８時間の間、約３７℃）を用いることもできる。
【０１１２】
ペプチドから共有結合している糖鎖残基を除去するための非酵素的化学処理の場合には、非還元Ｏ−およびＮ−結合型オリゴ糖の放出においてヒドラジン加水分解が有効であるとわかっている。約６０℃でのＯ−結合型オリゴ糖の最初の穏やかなヒドラジン分解と、それに続く約９５℃でのＮ−結合型オリゴ糖のヒドラジン分解によって、オリゴ糖の選択的および順次的放出を達成できる。例えば、パテールおよびラレク、メソッヅ・イン・エンジモロジー２３０、５８〜６６頁、１９９４参照。しかしながら、このような処理の結果、ポリペプチドが破壊されることもある。穏やかな塩基環境においてアルカリ性水素化ホウ素ナトリウムを利用する、Ｏ−結合型オリゴ糖のアルカリ−β−脱離が好ましい場合がある。例えば、グリコバイオロジー：ア・プラクティカル・アプローチ、フクダ，Ｍおよびコバタ，Ａ編、２９１〜３２８頁、ＩＲＬ／オックスフォード大学出版、オックスフォード、１９９３参照。さらに、トリフルオロメタンスルホン酸加水分解を用いてもよい。糖間のグリシル結合はトリフルオロメタンスルホン酸による切断に感受性であるが、ペプチド結合は長期の処理に対してでさえ安定であるため、この方法は通常、無傷のポリペプチドを残すが、グリカンの破壊をもたらす。例えば、エッジ、バイオケミカル・ジャーナル３７６、３３９〜５０頁、２００３参照。
【０１１３】
重要なことに、グリコシル化以外の翻訳後修飾はこのような酵素的またはトリフルオロメタンスルホン酸処理に対して安定であると考えられるので、このような処理後にペプチドにおいて観察される質量の変化は糖残基の除去によるものと見なすことができる。これにより注目するポリペプチド上の抗原性エピトープに対する糖鎖およびグリコシル化部位の相対的寄与率をより理解することが可能となる。また、糖残基の除去によって、観察される質量の相違がアミノ酸含量ではなく糖含量の相違によるものであるかどうかについて疑問がいずれも取り除かれるので、脱グリコシル化によって、ポリペプチド質量（例えば、当業者に周知の方法によって配列と関連付けることができる、サンプル中に存在する注目するナトリウム利尿ペプチドおよびその断片の質量）の相違をより理解することが可能となる。
【０１１４】
抗体の選択
【０１１５】
無傷のナトリウム利尿ペプチド断片を選択的に認識し、かつ／またはグリコシル化状態に感受性もしくは非感受性である抗体の作製および選択はいくつかの方法で達成することができる。例えば、一方法としては、断片を精製すること、または例えば、当技術分野で周知の固相ペプチド合成法を用いて注目する断片を合成することがある。例えば、ガイド・トゥー・プロテイン・プリフィケーション（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、マリーＰ．ドッチャー（Ｍｕｒｒａｙ Ｐ． Ｄｅｕｔｃｈｅｒ）編、メソッヅ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１８２巻（１９９０）、ソリッド・フェーズ・ペプチド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、グレッグＢ．フィールズ（Ｇｒｅｇ Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ）編、メソッヅ・イン・エンジモロジー第２８９巻（１９９７）、キソら、ケミカル・ファーマシー・ブレチン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）（東京）３８、１１９２〜９９頁、１９９０、モスタファビ（Ｍｏｓｔａｆａｖｉ）ら、バイオメディカル・ペプチデス、プロテインズ、アンド・ヌクレイック・アシッヅ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）１、２５５〜６０頁、１９９５、フジワラら、ケミカル・ファーマシー・ブレチン（東京）４４、１３２６〜３１頁、１９９６参照。次いで、選択したポリペプチドを、例えば、マウスまたはウサギに注射してポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製することができる。当業者ならば、抗体の作製には、例えば、アンチボディーズ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびデヴィッド・レーン（Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８）、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙに記載されるような多数の手順を利用できることは認識されよう。また、当業者ならば、種々の手順による遺伝情報から、抗体を模倣する結合断片またはＦａｂ断片も調製できるということは理解されよう（アンチボディー・エンジニアリング（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）：ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ボレベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）Ｃ．編）１９９５、オックスフォード大学出版、オックスフォード、ジャーナルオブ・イムノロジー１４９、３９１４〜３９２０頁、（１９９２））。
【０１１６】
さらに、多数の出版物によって、選択した標的との結合について、ポリペプチドのライブラリーを作製し、スクリーニングするためのファージディスプレイ技術の使用が報告されている。例えば、クウィルラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｉｉｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）８７、６３７８〜８２頁、１９９０、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９、４０４〜６頁、１９９０、スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、サイエンス、２４９、３８６〜８８頁、１９９０、およびラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、米国特許第５，５７１，６９８号参照。ファージディスプレイ法の基本概念は、スクリーニングされるポリペプチドをコードするＤＮＡとポリペプチドの間の物理的関係の確立である。この物理的結合はポリペプチドを、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入しているキャプシドの一部として提示するファージ粒子によって提供される。ポリペプチドとその遺伝物質間の物理的関係の確立により、種々のポリペプチドを保持する極めて多数のファージの同時マススクリーニングが可能となる。標的に対して親和性のあるポリペプチドを提示するファージは標的と結合し、これらのファージは標的に対するアフィニティースクリーニングによって濃縮される。これらのファージから提示されるポリペプチドの正体は、それらのそれぞれのゲノムから決定することができる。次いで、これらの方法を用いて、所望の標的に対して結合親和性を有すると同定されたポリペプチドを、従来法を用いて大量に合成することができる。例えば、すべての表、図および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる、米国特許第６，０５７，０９８号参照。
【０１１７】
次いで、これらの方法によって作製される抗体を、精製された無傷の注目するナトリウム利尿ペプチドとの親和性および特異性についての一次スクリーニング、および必要に応じて、抗体の、結合から除外されることが望まれるナトリウム利尿ペプチド断片との親和性および特異性についての結果を比較することによって選択することができる。スクリーニング手順は、精製されたナトリウム利尿ペプチド断片のマイクロタイタープレートの別個のウェルへの固定化を含み得る。次いで、可能性ある抗体または抗体群を含有する溶液をそれぞれのマイクロタイターウェルに入れ、約３０分間〜２時間インキュベートする。次いで、マイクロタイターウェルを洗浄し、ウェルに標識した二次抗体（例えば、産生された抗体がマウス抗体である場合には、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた抗マウス抗体）を加え、約３０分間インキュベートし、次いで洗浄する。ウェルに基質を加えると、固定化されたナトリウム利尿ペプチドおよび断片に対する抗体が存在する場合には呈色反応が現れる。同様のアプローチを用いてグリコシル化−非感受性抗体をスクリーニングすることができる。この場合には、１種以上の糖鎖残基を含むか、これを欠いている精製ナトリウム利尿ペプチド断片を用いてスクリーニングを行うことができる。
【０１１８】
次いで、このように同定した抗体を、選択したアッセイ設計で注目するナトリウム利尿ペプチドに対する親和性および特異性についてさらに分析することができる。標的タンパク質についてのイムノアッセイの開発では、精製した標的タンパク質が、選択されている抗体を用いるイムノアッセイの感度および特異性を判断する標準の役割を果たす。種々の抗体の結合親和性は異なり得るので、特定の抗体ペア（例えば、サンドイッチアッセイにおける）は互いに立体障害などによって干渉する可能性があり、抗体の分析性能は、抗体の絶対的な親和性および特異性より重要な尺度であり得る。
【０１１９】
当業者ならば、抗体または結合断片を作製し、種々のナトリウム利尿ペプチドに対する親和性および特異性についてスクリーニングおよび選択するのに多数のアプローチを取ることができるが、これらのアプローチは本発明の範囲を変更するものではないということは認識されよう。
【０１２０】
マーカーパネルにおけるナトリウム利尿ペプチドの使用
【０１２１】
疾病の診断のための、特に識別診断のための１種以上のマーカーを同定するための方法およびシステムはこれまでに記載されている。疾病状態の診断に有用なマーカーを同定するのに適した方法は、２００２年１２月２７日に出願された、メソッヅ・アンド・システム・フォー・ディジーズ・ディテクション・ユージング・マーカー・コンビネーションズ（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＤＩＳＥＡＳＥ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＵＳＩＮＧ ＭＡＲＫＥＲ ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮＳ）と題された米国特許出願第１０／３３１，１２７号（代理人整理番号０７１９４９−６８０２）に詳細に記載されている。なおこれは参照により、すべての表、図、および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。当業者ならばまた、マーカーの単変量解析を実施でき、複数のマーカーの単変量解析から得たデータを合わせて、異なる疾病状態を識別するマーカーのパネルを形成することができるということも認識されるであろう。
【０１２２】
診断に有用なマーカーのパネルの開発では、特定のマーカーの存在またはレベルについて調べることによって、いくつかの可能性あるマーカーのデータを被験体群から得ることができる。被験体の群を２セットに分けるが、第１のセットと第２のセットは各々ほぼ同数の被験体を含むことが好ましい。第１のセットは、疾病を患っているか、またはより広くは、第１の状況状態にあると確認されている被験体を含む。例えば、この第１のセットの患者は最近疾病を発生したものであってもよいし、具体的な種類の疾病を患っているものであってもよい。状況状態の確認は、より正確かつ／または費用のかかる試験、例えば、ＭＲＩまたはＣＴによって行うことができる。以下、第１のセットの被験体は「罹患」と呼ぶ。
【０１２３】
被験体の第２のセットは、単に第１のセットに入らないものである。この第２のセットの被験体は「非罹患」、すなわち、正常な被験体であり得る。あるいは、この第２のセット被験体は、「罹患」被験体によって示される症状を模倣する、１つの症状または一連の症状を示すよう選択することもできる。さらにもう１つの代替法では、この第２のセットが、疾病の発生からの異なる時点のものに相当する場合もある。
【０１２４】
これらのセットの被験体から得られるデータとしては、本発明の目的上は、個々にまたは群として測定される、ナトリウム利尿ペプチドの１種以上の断片をはじめとする、複数のマーカーのレベルが挙げられる。同一セットのマーカーのデータを各患者に利用できることが好ましい。このマーカーのセットには、個々の疾病または状態の検出に関連があると思われるすべての候補マーカーを含めることができる。実際の既知の関連性は必要ではない。本明細書に記載された方法およびシステムの実施形態を用いて、どの候補マーカーが疾病または状態の診断と最も関連があるかを調べることができる。２セットの被験体における各マーカーのレベルは、ガウス分布のように広範囲にわたって分布する場合がある。しかし、分布の一致は必要ではない。
【０１２５】
単一マーカーでは、患者を罹患であるか非罹患のいずれであるか決定的に同定することができないことが多い。例えば、患者が重複領域内に入るマーカーレベルを有すると測定される場合、試験結果は患者の診断に役に立たないものとなる。人為的なカットオフを用いて、疾病または状態の検出の陽性と陰性の試験結果間を区別することもできる。カットオフをどこに選択しようと、単一マーカーの診断ツールとしての有効性は影響を受けない。カットオフを変更することは、単に単一マーカーの使用に起因する偽陽性の数と偽陰性の数の間を交換するだけのことである。このような重複を含む試験の有効性は、ＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を用いて表されることが多い。ＲＯＣ曲線は当業者には周知である。
【０１２６】
ＲＯＣ曲線の水平軸は、偽陽性率とともに高まる（１−特異度）を表す。曲線の垂直軸は、真の陽性率とともに高まる感度を表す。したがって、選択した個々のカットオフについて、（１−特異度）の値を求めることができ、また対応する感度も得ることができる。ＲＯＣ曲線下面積は測定したマーカーレベルが疾病または状態の正確な同定を可能にする可能性の尺度である。したがって、ＲＯＣ曲線下面積を用いて試験の有効性を調べることもできる。
【０１２７】
前記で論じたように、単一マーカーのレベルの測定は限定された有用性しかない場合がある。さらなるマーカーの測定によってさらなる情報が得られるが、２つの無関係である可能性のある測定値のレベルを適切に組み合わせることには、困難がある。本発明の実施形態にしたがう方法およびシステムでは、罹患および非罹患患者のセットの種々のマーカーのレベルに関するデータを用いて、有用なパネル応答を得るためのマーカーのパネルを開発することができる。データはデータベース、例えば、マイクロソフトアクセス、オラクル、その他のＳＱＬデータベースで、または単純にデータファイルで提供することができる。データベースまたはデータファイルには、例えば、患者識別子、例えば、名前または番号など、存在する種々のマーカーのレベル、および患者が罹患であるか非罹患であるかを含めることができる。
【０１２８】
次いで、各マーカーの人為的カットオフ領域をまず選択することができる。カットオフ領域の位置は最初にどの点にでも選択することができるが、この選択は以下に記載する最適化プロセスに影響を及ぼす場合がある。この点に関しては、最適位置の候補近くの選択は、オプティマイザの高速収束を促進し得る。好ましい方法では、カットオフ領域を、２セットの患者の重複領域のほぼ中心を最初に中心とする。一実施形態では、カットオフ領域は単にカットオフ点であり得る。その他の実施形態では、カットオフ領域はゼロより大きい長さを有し得る。これに関しては、カットオフ領域を中心値と長さの大きさによって定義することができる。実際、カットオフ領域の限界の初期選択は、被験体の各セットの予め選択したパーセンタイルにしたがって決定することができる。例えば、それより上で罹患患者の予め選択したパーセンタイルが測定される点を、カットオフ範囲の右（上）端として用いることができる。
【０１２９】
次いで、各患者の各マーカー値を、指標に対してマッピングすることができる。指標には、カットオフ領域より下の１つの値と、カットオフ領域より上の別の値を割り当てる。例えば、マーカーが通常、非罹患患者に対してより低い値を、罹患患者に対してより高い値を有する場合には、ゼロ指標を個々のマーカーに対して低い値に割り当てるが、このことは陽性診断の可能性が低くなる可能性を示す。その他の実施形態では、指標は多項式に基づいて算出することができる。多項式の係数は、罹患と非罹患被験体間のマーカー値の分布に基づいて求めることができる。
【０１３０】
種々のマーカーの相対的な重要性は重み係数によって示され得る。重み係数は、まず、各マーカーの係数として割り当てることができる。カットオフ領域と同様、重み係数の初期選択は、許容範囲にあるどんな値にでも選択することができるが、この選択は最適化プロセスに影響を及ぼす可能性がある。この点に関しては、最適位置の候補近くの選択は、オプティマイザの高速収束を促進し得る。好ましい方法では、許容範囲の重み係数はゼロと１の間に及び、各マーカーの初期重み係数は０．５として割り当てることができる。好ましい実施形態では、各マーカーの初期重み係数はそのマーカー自身の有効性と関連があり得る。例えば、ＲＯＣ曲線は単一マーカーについて作製することができ、ＲＯＣ曲線下面積をそのマーカーの初期重み係数として用いることができる。
【０１３１】
次いで、２セットの各々において各被験体のパネル応答を算出することができる。パネル応答は、それに対して各マーカーレベルがマッピングされる指標と各マーカーの重み係数の関数である。好ましい実施形態では、各被験体（ｊ）のパネル応答（Ｒ）は以下のように表される：
Ｒj＝ΣｗiＩi,j,
式中、ｉはマーカー指数であり、ｊは被験体指数であり、ｗiはマーカーｉの重み係数であり、Ｉは被験体ｊの、それに対してマーカーのマーカーレベルがマッピングされる指標値であり、Σはすべての候補マーカーｉにわたる合計である。
【０１３２】
マーカー値ではなく指標値を用いることの利点の１つは、特別に高いまたは低いマーカーレベルが、その個々のマーカーについて罹患または非罹患の診断の可能性を変更しないということである。通常、特定のレベルを上回るマーカー値は、概ね特定の状況状態を示す。そのレベルを上回るマーカー値は、同じ確かさで状況状態を示す。したがって、特別に高いマーカー値がその状況状態の特別に高い可能性を示すわけではない場合がある。カットオフ領域の片側で一定である指標の使用により、この懸念が排除される。
【０１３３】
パネル応答はまた、マーカーレベルおよびその他の因子、例えば、患者の家系および性別をはじめとするいくつかのパラメータの全般的な関数であり得る。パネル応答に寄与するその他の因子としては、個々のマーカーの値の経時的な傾斜が挙げられる。例えば、まず病院に到着した時点で、個々のマーカーについて患者を測定することができる。同じマーカーを、１時間後再度測定することができ、変化レベルをパネル応答に反映させることができる。さらに、さらなるマーカーをその他のマーカーから導くことができ、これはパネル応答の値に寄与し得る。例えば、２種のマーカーの値の比率がパネル応答を算出する際の因子となり得る。
【０１３４】
被験体の各セットにおける各被験体についてパネル応答を得、そこで各セットのパネル応答の分布を解析することができる。目的関数は有効なパネルの選択を容易にするよう定義できる。通常、目的関数は、例えば、罹患セットの被験体のパネル応答と非罹患セットの被験体のパネル応答の重複によって表され得るような、パネルの有効性の指標となるものではければならない。このように、例えば、重複を最小化することによって、目的関数を最適化してパネルの有効性を最大化することができる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、２セットの被験体のパネル応答を表すＲＯＣ曲線を用いて目的関数を定義することができる。例えば、目的関数はＲＯＣ曲線下面積を反映し得る。曲線下面積を最大にすることによって、マーカーのパネルの有効性を最大にすることができる。その他の実施形態では、ＲＯＣ曲線のその他の特徴を用いて目的関数を定義できる。例えば、ＲＯＣ曲線の傾斜が１に等しい点は有用な特徴であり得る。その他の実施形態では、「ひざ」と呼ばれることもある、感度と特異度の積が最大である点を使用してもよい。一実施形態では、ひざでの感度を最大にすることができる。さらなる実施形態では、所定の特異度レベルの感度を用いて目的関数を定義することができる。その他の実施形態では、所定の感度レベルの特異度を用いることができる。さらにその他の実施形態では、これらＲＯＣ曲線の特徴の２以上の組合せを用いることができる。
【０１３６】
パネルのマーカーの１つが、診断されている疾病または状態に特異的であることがあり得る。このようなマーカーが特定の基準値より上または下に存在する場合には、パネル応答を「陽性」試験結果に戻すよう設定することができる。しかし、基準値を満たさない場合であっても、マーカーのレベルを目的関数に寄与する可能性のあるものとして用いることができる。
【０１３７】
最適化アルゴリズムを用いて目的関数を最大または最小にすることができる。最適化アルゴリズムは当業者に周知であり、これとしてはシンプレックス法およびその他の条件付き最適化技術をはじめとするいくつかの一般に入手可能な最小化または最大化関数が挙げられる。当業者ならば、最小化関数の中には、局所的極小ではなく大域的極小の検索において、その他のものよりも良好であるものがあることは理解されよう。最適化プロセスでは、各マーカーのカットオフ領域の位置および大きさを、マーカー当たり少なくとも２の自由度を提供するよう変更することが可能である。このような可変パラメータは本明細書では独立変数と呼ぶ。好ましい実施形態では、各マーカーの重み係数も、最適化アルゴリズムの反復にわたって変更することができる。種々の実施形態では、これらのパラメータの順列はいずれも、独立変数として使用することができる。
【０１３８】
前記のパラメータに加えて、各マーカーの意味も独立変数として用いることができる。例えば、多くの場合、特定のマーカーの高レベルが一般的に罹患状態を示すものであるのか非罹患状態を示すものであるのかどうかが知られていない場合がある。このような場合には、最適化プロセスを両側で検索できることが有用であり得る。実際、これはいくつかの方法で実施できる。例えば、一実施形態では、意味が、最適化プロセスによって陽性と陰性の間で反転され得る、真に別個の独立変数であり得る。あるいは、重み係数が負であることを可能にすることによって意味が提供され得る。
【０１３９】
同様に、最適化アルゴリズムは特定の制限付で提供され得る。例えば、得られたＲＯＣ曲線は、特定の値よりも大きい曲線下面積を提供するよう制限できる。曲線下面積が０．５であるＲＯＣ曲線は、完全な乱数度を示し、曲線下面積が１．０は２セットの完全分離を反映する。したがって、特に目的関数が曲線下面積を組み込んでいない場合には、最小許容範囲値、例えば、０．７５を制限として用いることができる。その他の制限としては、個々のマーカーの重み係数に対する制限を挙げることができる。さらなる制限によって、すべての重み係数の合計を、特定の値、例えば１．０に制限することができる。
【０１４０】
最適化アルゴリズムの反復は、通常、目的関数を最小化または最大化しながら、独立パラメータを制限を満たすよう変更する。最適化プロセスにおける反復数は制限することができる。さらに、２つの連続反復間の目的関数の相違が所定の基準値より小さい場合には最適化プロセスを終了することができ、それによって、最適化アルゴリズムが局所性最小または最大の領域に達したことが示される。
【０１４１】
したがって、最適化プロセスにより、各マーカーの重み係数およびマーカー値を指標に対してマッピングするためのカットオフ領域を含むマーカーのパネルが提供され得る。より少ないマーカーレベルの測定しか必要としない低コストのパネルを開発するために、特定のマーカーをパネルから排除することができる。これに関しては、パネルにおける各マーカーの有効な寄与を求めて、マーカーの相対的重要度を同定することができる。一実施形態では、最適化プロセスに起因する重み係数を用いて、各マーカーの相対的重要度を決定することができる。寄与の最も低いマーカーを排除してもよい。
【０１４２】
特定の場合では、より小さい重み係数が低い重要度を示すものでない場合がある。同様に、より大きい重み係数が高い重要度を示すものではない場合がある。例えば、最適化プロセスは、関連マーカーが診断と無関係である場合に高い係数をもたらし得る。この場合には、係数を低下させる利点は全くない。この係数を変更することは、目的関数の値に影響を及ぼし得ない。
【０１４３】
治療計画を決定するためのナトリウム利尿ペプチドの使用
【０１４４】
ナトリウム利尿ペプチドなどの有用な診断または予後指標は、臨床医が択一的な治療計画の間で選択を行う手助けとなり得る。例えば、急性冠症候群後に心臓トロポニンＴまたはＩが上昇している患者は、強力な抗血小板物質・抗血栓治療および早期の血管再開通術を含む早期の積極的な戦略から具体的な利益を得るようである。ハム（Ｈａｍｍ）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）３４０、１６２３〜９頁（１９９９）、モロー（Ｍｏｒｒｏｗ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・カレッジ・オブ・カルディオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）３６、１８１２〜７頁（２０００）、キャノン（Ｃａｎｎｏｎ）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・カルディオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）８２、７３１〜６頁（１９９８）。さらに、心筋梗塞後Ｃ−反応性タンパク質が上昇している患者は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤治療から特定の利益を得るようである。リドカー（Ｒｉｄｋｅｒ）ら、サーキュレーション９８、８３９〜４４頁（１９９８）。うっ血性心不全の患者の中では、試験的研究によって、ＡＣＥ阻害剤がＢＮＰレベルを用量依存的に低下させ得るということが示唆されている。バン・ベルドヒュイゼン（Ｖａｎ Ｖｅｌｄｈｕｉｓｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・オブ・カルディオロジー３２、１８１１〜８頁（１９９８）。
【０１４５】
同様に、利尿薬および血管拡張薬治療を、生物活性ナトリウム利尿ペプチドレベルに基づいて「調整すること」によって転帰が改善され得る。例えば、トラウトン（Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３５５、１１２６〜３０頁（２０００）参照。最後に、１６人の患者からなる単一の試験的研究において、Ｑ波梗塞後のプラセボではなくＡＣＥ阻害剤に対するランダム化が、その後の６ヶ月間にわたるＢＮＰレベルの低下と関連があるということがわかった。モトワニ（Ｍｏｔｗａｎｉ）ら、ランセット３４１、１１０９〜１３頁（１９９３）。ＢＮＰは、有益な心臓および腎臓への作用を有する対抗−調節ホルモンであるので、ＢＮＰ濃度の変化は心室機能の向上および心室壁張力の低下を反映すると思われる。最近の論文により、ＮＴプロ−ＢＮＰとＢＮＰアッセイの相互関係が実証されている（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４７、５９１〜５９４頁（２００１））。本発明のさらなる目的は、個別にか、マーカーの群のいずれかで考えられる、ナトリウム利尿ペプチドの濃度を用いて、患者の予後を向上するよう利尿薬および血管拡張薬治療を導くことができることである。さらに、患者の予後指標として用いるための、個別にか、マーカーの群で考えられる、ナトリウム利尿ペプチドの測定は本発明の範囲内にある。
【０１４６】
うっ血性心不全で入院している患者における最近の研究により、連続するＢＮＰ測定は、単一の測定と比較して増加した予後情報を提供できるということが示唆されている。すなわち、アッセイにより、ＢＮＰが治療後に低下した場合には、引き続き上昇しているままである場合よりも、予後が向上することを実証することができる。チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・オブ・カルディオロジー３７、３８６〜９１頁、（２００１）。したがって、本発明のナトリウム利尿ペプチドの連続測定は、患者におけるマーカーの予後価値および／または診断価値を高めることができ、したがって、本発明の範囲内にある。
【０１４７】
アッセイ測定戦略
【０１４８】
試験サンプル中のポリペプチドまたはタンパク質を検出および解析するための多数の方法および装置が当業者には周知である。好ましい実施形態では、多くはイムノアッセイ装置および方法を用いる。例えば、米国特許第６，１４３，５７６号、同６，１１３，８５５号、同６，０１９，９４４号、同５，９８５，５７９号、同５，９４７，１２４号、同５，９３９，２７２号、同５，９２２，６１５号、同５，８８５，５２７号、同５，８５１，７７６号、同５，８２４，７９９号、同５，６７９，５２６号、同５，５２５，５２４号および同５，４８０，７９２号参照。なお、それらの各々は参照により、すべての表、図、および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。これらの装置および方法は、種々のサンドイッチ、競合または非競合アッセイ形式において標識した分子を利用して、注目する分析物の存在または量と関連のあるシグナルを生じさせることができる。さらに、特定の方法および装置、例えば、バイオセンサーおよび光学的免疫測定法を用いて、標識した分子を必要とすることなく分析物の存在または量を調べることもできる。例えば、米国特許第５，６３１，１７１号および同５，９５５，３７７号参照。なお、それらの各々は参照により、すべての表、図、および特許請求の範囲をはじめとするその全文を本明細書に組み入れる。また、当業者ならば、それだけには限らないが、ベックマン・アクセス（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｃｃｅｓｓ）、アボット・アキシム（Ａｂｂｏｔｔ ＡｘＳｙｍ）、ロシェ・エレクシス（Ｒｏｃｈｅ ＥｌｅｃＳｙｓ）、デイド・ベーリング・ストレイタス・システムス（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｓｔａｔｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）をはじめとするロボット機器が、本明細書に教示したイムノアッセイを実施できるイムノアッセイ分析器に入っていることは承知している。抗体の、マーカーとの特異的な免疫学的結合は直接的に検出することも間接的に検出することもできる。直接標識としては、抗体に付けた、蛍光または発光タグ、金属、色素、放射性核種などが挙げられる。間接標識としては、当技術分野で周知の種々の酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【０１４９】
１種以上のポリペプチドに特異的な固定化抗体の使用も本発明によって考慮される。抗体は種々の固体支持体、例えば、磁性またはクロマトグラフィーのマトリックス粒子、アッセイ場所（例えば、マイクロタイタープレート）の表面、一片の固体基板物質またはメンブラン（例えば、プラスチック、ナイロン、紙）などに固定化することができる。抗体または複数の抗体類を固体支持体上のアレイにコーティングすることによってアッセイストリップを調製することができる。次いで、このストリップを試験サンプル中に浸漬し、次いで、洗浄および検出ステップによって迅速に処理して測定可能なシグナル、例えば、呈色スポットを生じさせる。
【０１５０】
複数のポリペプチドの解析を、一試験サンプルを用いて別々にまたは同時に実施できる。別個のまたは連続アッセイに適した装置としては、エレクシス（ＥｌｅｃＳｙｓ）（ロシュ）、アクスシム（ＡｘＳｙｍ）（アボット）、アクセス（ベックマン）、アドビア（ＡＤＶＩＡ）（登録商標）センタウル（ＣＥＮＴＡＵＲ）（登録商標）（バイエル）イムノアッセイシステム、ニコスル・アドバンテージ（ＮＩＣＨＯＬ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ）（登録商標）（ニコルス社（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））イムノアッセイシステムなどの臨床検査室分析器が挙げられる。好ましい装置またはタンパク質チップとしては、単一の表面で複数のポリペプチドの同時アッセイを実施するものがある。特に有用な物理的形式としては、複数の異なる分析物の検出のための複数の個別のアドレス可能な位置を含む表面を含んでなるものがある。このような形式としては、タンパク質マイクロアレイまたは「プロテインチップ」（例えば、ング（Ｎｇ）およびイラグ（Ｉｌａｇ）、ジャーナル・オブ・セルラー・アンド・モレキュラー・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）６、３２９〜３４０頁、（２００２０）参照）および特定のキャピラリー装置（例えば、米国特許第６，０１９，９４４号参照）が挙げられる。これらの実施形態では、各々個別の表面位置が、各々の位置で検出するために１種以上の分析物を固定化するための抗体を含み得る（例えば、本発明の１種以上のポリペプチド）。あるいは、表面が、表面の個別の位置に固定化された１種以上の個別の粒子（例えば、微小粒子またはナノ粒子）を含んでなる場合もあり、ここで検出のために微小粒子が抗体を含んでなり、１種の分析物（例えば、本発明の１種以上のポリペプチド）を固定化する。
【０１５１】
さらに、当業者ならば、同一個体から（例えば、連続する時点で）得た複数のサンプルを試験することの価値を承知しているであろう。このように連続するサンプルを試験することによって、ポリペプチドレベルの経時変化を同定することが可能となる。ポリペプチドレベルの増加または減少、ならびにこのようなレベルの変化がないことは、それだけには限らないが、イベントの発生からのおよその時間、救済可能な組織の存在および量、薬物治療の妥当性、再灌流または症状の回復によって示されるような種々の治療の有効性を同定すること、同様の症状を有する種々の種類の疾病の識別、イベントの重篤度の同定、疾病重症度の同定、および患者の予後、例えば、将来のイベントの危険性の同定をはじめとする疾病状態についての有用な情報を提供する。
【０１５２】
前述のポリペプチドからなり、場合によっては、疾病の診断、予後診断または識別に有用なその他のタンパク質マーカーを含むパネルを、種々の診断に関連する関連情報を提供するよう構築することができる。このようなパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれより多い個々の分析物、例えば、本発明の１種以上のポリペプチドを検出するよう構築することができる。当業者ならば、種々の臨床設定において臨床的感度または特異度を最適にするよう、単一分析物または分析物のサブセットの分析を実施できる。これらとしては、それだけには限らないが、外来、応急手当、救命救急診療、集中治療、モニタユニット、入院患者、通院患者、診療室、診療所、および健康診断設定が挙げられる。さらに、当業者ならば、前記の設定の各々において単一の分析物または分析物のサブセットを、臨床的感度および特異度を最適化するよう診断基準点の調節と組み合わせて使用できる。アッセイの臨床的感度は、アッセイが正しく予測する疾病を有するもののパーセンテージとして定義され、アッセイの特異度は、アッセイが正しく予測する疾病を有さないもののパーセンテージとして定義される（ティーツェ・テキストブック・オブ・クリニカル・ケミストリー（Ｔｉｅｔｚ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版、カール・バーティス（Ｃａｒｌ Ｂｕｒｔｉｓ）およびエドワード・アシュッド（Ｅｄｗａｒｄ Ａｓｈｗｏｏｄ）編、Ｗ．Ｂ．サウンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）他、４９６頁）。
【０１５３】
分析物の分析は、同様に種々の物理的形式で実施できる。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の使用を用いることで多数の試験サンプルの処理が容易になる。あるいは、単一サンプル形式を開発することで、例えば、外来搬送または救急外来設定において時期を逸することのない迅速な治療および診断が容易になる。
【０１５４】
前記で論じたように、サンプルが、ひと度サンプルを獲得しても、ナトリウム利尿ペプチドまたはその断片を分解し続ける場合がある。したがって、アッセイに先立って１種以上のプロテアーゼ阻害剤をサンプルに加えることが有利であり得る。当業者には多数のプロテアーゼ阻害剤が知られており、例示的阻害剤は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｃｈｅ−ａｐｐｌｉｅｄ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｆｓｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ？／ｐｒｏｄ＿ｉｎｆ／ｍａｎｕａｌｓ／ｐｒｏｔｅａｓｅ／ｐｒｏｔ＿ｔｏｃ．ｈｔｍのザ・コンプリート・ガイド・フォー・プロテアーゼ・インヒビション（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、ロシェ・モレキュラー・バイオケミカルス（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１９９９年６月３日更新およびヨーロッパ特許出願０３０１３７９２．１（ＥＰ１３７８２４２Ａ１として公開）に見ることができる。なお、この各々はその全文を本明細書に組み入れる。種々のメタロプロテアーゼおよびカルシウム依存性プロテアーゼが血液由来サンプル中に存在することが知られているので、ＥＧＴＡおよび／またはＥＤＴＡなどのキレート剤もプロテアーゼ阻害剤として作用する。さらに、またはあるいは、中性エンドペプチダーゼおよび／またはＤＰＰの阻害剤も使用できる。
【０１５５】
プロリル特異的ＤＰＰによるナトリウム利尿ペプチド分解の阻害
【０１５６】
ナトリウム利尿ペプチドが一部をなす神経液性調節系は、心血管調節の複雑な系に相当する。うっ血性心不全などの疾病は、本質的に、寿命を延長することはできるが基礎疾患は決して治癒しない命にかかわる疾病である。したがって、依然として、基礎疾患を管理するための新規治療的アプローチが必要とされており、この複雑な系における複数の点が臨床医学者によって重要な標的と考えられている。疾病管理におけるアンギオテンシン変換酵素（「ＡＣＥ」）阻害剤の臨床上の成功により、血管作用性ホルモンに作用する酵素に影響を及ぼすことによって循環器疾患の経過に間接的に影響を及ぼすさらなるアプローチが探求されることとなった。
【０１５７】
ナトリウム利尿ホルモンの場合には、ホルモンレベルの上昇が患者において治療可能性を有することがわかっている。例えば、チェコウラ（Ｔｓｅｋｏｕｒａ）ら、ヘレニック・ジャーナル・オブ・カルディオロジー（Ｈｅｌｌｅｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）４４、２６６〜７０頁、２００３参照。中性エンドペプチダーゼ（「ＮＥＰ」）は重要な分解媒介物であると考えられている。予想通り、ＮＥＰの阻害剤は、高血圧、アテローム性動脈硬化および心不全などの疾病を患う患者の治療において用途が見出されている。例えば、コーチ（Ｃｏｒｔｉ）ら、サーキュレーション１０４、１８５６〜６２頁、２００１参照。ＢＮＰおよびＮＥＰ阻害剤双方を用いる併用療法は、心拍出量、血管抵抗性の低下および心臓の負荷軽減に対して相乗効果を生み出すと報告されている。チェン（Ｃｈｅｎ）ら、サーキュレーション、１０５、９９９〜１００３頁、２００２。ＮＥＰを標的とすることは制限を受け得るが、ＮＥＰは広範な生物活性ペプチドを代謝する。例えば、ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら、カレント・オピニオン・イン・ネフロロジー・アンド・ハイパーテンション（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）６、４６８〜７３頁、１９９７参照。
【０１５８】
本発明は循環器疾患、詳しくは、心不全を治療するための新規アプローチを記載する。いくつかのナトリウム利尿ペプチド、例えば、プロ−ＢＮＰ、成熟ＢＮＰ、およびプロ−ＡＮＰのヒト型は、最後から２番目のプロリン残基を含んでなり、これによってペプチドがプロリル特異的ジペプチジルジペプチダーゼ（「ＤＰＰ」）の適した基質となっている。ＤＰＰの阻害剤は、ＤＰＰ ＩＶによるグルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド分解の阻害によって媒介される糖尿病の管理において有用性があると記載されている。例えば、ゴー（Ｇａｕｌｔ）ら、バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション、２２、２０７〜１３頁、２００３参照。しかしながら、循環器疾患の治療におけるその使用はこれまでに報告されていない。
【０１５９】
選択的ＤＰＰ阻害剤を調製および同定する方法は当技術分野では周知である。ＤＰＰ阻害剤としては、ジペプチド類似体Ｘａａ−ボロＰｒｏ（ｂｏｒｏＰｒｏ）、例えば、Ｐｒｏ−ボロＰｒｏ、Ａｌａ−ボロＰｒｏ、Ｖａｌ−ボロＰｒｏおよびＬｙｓ−ボロＰｒｏ、およびｄａｂ−ｐｉｐが挙げられる。例えば、センテンら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ、１２、２８２５〜２８頁、２００２、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ブラッド、プレパブリッシュド・オンライン（Ｂｌｏｏｄ， ｐｒｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ）２００３年５月８日、ＤＯＩ１０．１１８２参照。ＤＰＰの多数のさらなるジペプチド類似体阻害剤を、迅速に合成し、スクリーニングするためにコンビナトリアル・ケミストリー法が用いられている。例えば、レイティングら、バイオケミカル・ジャーナル３７１、５２５〜３２頁、２００３、セドら、フィジオロジカル・リサーチ５２、３６７〜７２頁、２００３、ビルハウアーら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー４６、２７７４〜８９頁、２００３、センテンら、ジャーナル・オブ・コンビナトリー・ケミストリー５、３３６〜４４頁、２００３、および米国特許第５，６０２，１０２号、同６，５７３，２８７号、同６，５４８，４８１号、同６，４３２，９６９号、および同６，３５５，６１４号参照。これらの出版物に記載された化合物は、本明細書に記載した方法において使用するためのさらなるＤＰＰ阻害剤の同定においてリード化合物として用いることができる。小さな有機分子のコンビナトリアルライブラリーを作製するために当技術分野では種々の技術が利用できる。一般的には、ブロンデル（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ）ら、トレンヅ・イン・アナリティカル・ケミストリー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１４、８３頁、１９９５、米国特許第５，３５９，１１５号、同５，３６２，８９９号、同５，２８８，５１４号、および同５，７２１，０９９号、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、ＪＡＣＳ１１６、２６６１頁、１９９４、カー（Ｋｅｒｒ）ら、ＪＡＣＳ１１５、２５２頁、１９９３、Ｗ０９２／１００９２、Ｗ０９３／０９６６８、ＷＯ９４／０８０５１、Ｗ０９３／２０２４２およびＷ０９１／０７０８７参照。約１６〜１，０００，０００またはそれよりも多いオーダーのディヴァーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）で種々のライブラリーを合成し、本発明に記載した方法を用いて個々の活性または性質についてスクリーニングすることができる。
【０１６０】
本発明に用いられる阻害剤は小分子であることが好ましく、これは約１０００ダルトンより小さい分子量であることを意味する。このような阻害剤は当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｗ００４／０７４６８およびＷ００４／５００２２、ならびに米国特許第６，７１０，０４０号、同６，６９９，８７１号、同６，４３２，９６９号、同６，３０３，６６１号、同６，１６６，０６３号、同６，１２４，３０５号、同６，１１０，９４９号、および同６，１０７，３１７号参照。なお、それらの各々は参照によりその全文を本明細書に組み入れる。好ましい小分子阻害剤は経口で有効である。ＤＰＰ阻害性抗体または抗体断片も本明細書に記載した方法に使用できる。この場合には、ＤＰＰに対する抗体を作製し、（例えば、本明細書に記載したファージディスプレイ法を用いて）スクリーニングし、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドに対するＤＰＰ活性を阻害する抗体を同定することができる。
【０１６１】
化合物は、酵素の供給源として単離したＤＰＰ酵素、細胞抽出物、または血液由来サンプル、および基質として単離したナトリウム利尿ペプチドを用いて阻害活性についてスクリーニングすることができる。標的ナトリウム利尿ペプチドからの最後から２番目のプロリン残基の喪失を阻害する条件の選択は、検討中の水性媒質の種類に応じて変わり得る（例えば、血液サンプルにおける阻害は、生物の循環における阻害とは異なる条件を必要とし得る）。このような条件を選択することは当業者の技術の範囲内である。また試験化合物およびその対応する製薬上許容される酸付加塩のＤＰＰを阻害する能力も、クボタら、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８９、１９２〜７頁、１９９２に記載されたアッセイの改訂版を用いることによって証明することができる。最後から２番目のプロリン残基の有無の確認は、分子のこのＮ部分の喪失に感受性であるよう選択したイムノアッセイを用いて、または質量分析の使用によって実施できる。
【０１６２】
次のステップに進む前に、培養細胞においてＤＰＰ活性を調節する候補化合物を、注目する疾病状態と関連している動物モデルで試験することができる。これらの方法では、標識したナトリウム利尿ペプチドを、試験動物に注射し、ナトリウム利尿ペプチドの循環からのクリアランスのＴ1/2を、阻害剤の存在下および不在下で測定すればよい。ＤＰＰ依存性ナトリウム利尿ペプチド分解の好ましい動物モデルとしては、ラット、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコおよびブタが挙げられる。
【０１６３】
前記で論じたように、ＤＰＰ阻害剤とＮＥＰ阻害剤および／またはナトリウム利尿ペプチドを用いる併用療法が本発明によって考慮される。さらに、または代替法として、ゴー（Ｇｏｕｌｔ）ら、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）５２、６７９〜８７頁、２００３に、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドについて記載されたように、ナトリウム利尿ペプチドを、ＤＰＰ活性に対して安定化されている類似体として提供することができる。好ましい実施形態では、１個以上の置換、欠失、付加または修飾されたアミノ酸を含むナトリウム利尿ペプチド類似体のライブラリーを、ＤＰＰ分解に対する安定性の向上についてスクリーニングすることができる。このような類似体は、親ナトリウム利尿ペプチドのナトリウム利尿活性の５０％以上を保持することが好ましい。
【０１６４】
投与する場合には、本発明の製薬製剤を製薬上許容される量で製薬上許容される組成物で適用する。このような製剤は通常、塩、緩衝剤、保存料、適合担体、および場合によってはその他の治療薬を含み得る。医薬に用いる場合には、塩は製薬上許容されるものでなくてはならないが、好都合なことに、製薬上許容されない塩を用いてその製薬上許容される塩を調製することができ、これは本発明の範囲から排除されない。このような薬理学的および製薬上許容される塩としては、それだけには限らないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、製薬上許容される塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩、例えばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩としても調製できる。製薬組成物はまた、適した保存料、例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサルを場合によって含んでもよい。経口、皮下、静脈、筋肉内投与などに適した担体製剤は、レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルバニア州、イーストンに見出すことができる。
【０１６５】
被験体を治療するためには種々の投与経路が利用できる。選択される個々の送達様式は、選択された個々の化合物、治療される状態の重篤度および治療効力のために必要とされる投与量に応じて変わる。本発明の方法は、一般的に言えば、医学上許容される投与様式であればいずれを用いて実施してもよく、これは、臨床上許容できない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物が得られるいずれかの様式を意味する。このような投与様式としては、経口、直腸、局所、経鼻、皮内、静脈内、または非経口経路が挙げられる。このような投与様式はまた、患者からＴ細胞または骨髄細胞、幹細胞または初期系統前駆細胞を獲得し、単離した細胞を本発明の化合物とｅｘ ｖｉｖｏで接触させ、次いで処理細胞を患者に再導入することも含む。処理した細胞は、生存細胞を投与するための当技術分野で公知のいずれかの方法で患者に再導入すればよい。
【０１６６】
経口投与は特に好ましい。経口投与に適した組成物は、各々所定量の本発明の化合物を含有する個別単位、例えば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤として提供することができる。その他の組成物としては、水性液体または非水性液体中の懸濁液、例えば、シロップ、エリキシルまたはエマルションが挙げられる。経口製剤は腸溶性皮膜を含まないことが好ましいが、これは本発明の環状化合物を消化管の酸性ｐＨ条件に曝露して環状分子をその線状対応物に変換することが望ましいからである。
【０１６７】
その他の送達システムとしては、徐放性、遅延放出性または持続放出送達システムが挙げられる。このようなシステムによって、前述の化合物の反復投与が避けられ、被験体および医師に対する利便性が高まる。多数の種類の放出送達システムが、当業者に利用でき、知られている。それらとしては、ポリマーベースのシステム、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリアンヒドリドが挙げられる。薬剤を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルが、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムとしてはまた、ステロール、例えば、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸またはモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマーシステム、ヒドロゲル放出システム、サイラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）システム、ペプチドベースのシステム、ワックス皮膜、従来の結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠、部分融合インプラントなどが挙げられる。具体例としては、それだけには限らないが、（ａ）化合物がマトリックス内の形態に含まれる浸食システム、例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、同４，６６７，０１４，号、同４，７４８，０３４号および同５，２３９，６６０号に記載されたもの、ならびに（ｂ）有効成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散システム、例えば、米国特許第３，８３２，２５３号および同３，８５４，４８０号に記載されたものが挙げられる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを用いることもでき、これらの中には移植に適応するものもある。
【０１６８】
長期の持続放出性インプラントの使用は、慢性症状の治療に特に適し得る。本明細書において、長期の放出とは、インプラントが治療レベルの有効成分を少なくとも１０日、好ましくは６０日間送達するよう構成され配置されていることを意味する。長期の持続放出性インプラントは当業者には周知であり、これには前述の放出システムのいくつかが含まれる。
【０１６９】
選択した化合物は有効量で投与する。有効量とは、医薬上望ましい結果を提供するのに十分な化合物の投与量である。有効量は、治療されている個々の症状、治療されている被験体の年齢および健康状態、症状の重篤度、治療期間、（あるとすれば）併用療法の性質、具体的な投与経路および保険医の知識と力量の範囲内の同様の因子に応じて変わる。一般に、有効化合物の用量は１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１日あたり１０００ｍｇ／ｋｇとなる。０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲が適していると思われ、経口で１日あたり１回または数回の投与が好ましい。他の投与形態、例えば、静脈内投与によってはより少ない用量となる。初回量を適用して、被験体における応答が十分でない場合は、患者の耐容性が許す範囲内までで、より高用量（または異なる、より限局性の送達経路による事実上、より高用量）を用いることができる。化合物の適当な全身レベルを達成するためには１日あたり複数回の投与を考慮する。
【０１７０】
その他の実施形態は以下の特許請求の範囲内に示される。
【実施例】
【０１７１】
実施例
以下の実施例は本発明を例示するものである。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１７２】
血液サンプリング
血液は、指先穿刺、足底面穿刺、耳たぶ穿刺なども小容量には十分であり得るが、２０ゲージのマルチ−サンプルニードルおよび真空管を用いて静脈穿刺によって採取することが好ましい。全血採取用には、血液検体を訓練された研究員によってＥＤＴＡ含有血液採取チューブに採取する。血清採取用には、血液検体を訓練された研究員によってトロンビン含有血液採取チューブに採取する。血液を５〜１０分間凝固させ、遠心分離によって血清を不溶性物質から分離する。血漿採取用には、血液検体を訓練された研究員によってクエン酸塩含有血液採取チューブに採取し、≧１２分間遠心分離する。サンプルは使用まで４℃で維持するか、長期間の保存には−２０℃以下で凍結させればよい。全血は凍結しないことが好ましい。
【実施例２】
【０１７３】
組換え抗体調製
抗原でのマウスの免疫化とマウス脾臓由来ＲＮＡの精製
マウスを、抗体をコードするｍＲＮＡの最適な回収のための脾臓採取のタイミングの経験に基づいて、以下の方法によって免疫化する。２種のマウスを用いる：Ｂａｌｂ／ｃ（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マサチューセッツ州、ウィルミントン）およびＡ／Ｊ（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、メイン州、バー・ハーバー）。１０個体のマウス各々を、フロイントの完全アジュバント中の５０μｇタンパク質を用いる抗原で、０日目および２８日目に腹腔内免疫化する。後眼窩洞の穿刺によってマウスの試験出血を採取する。ストレプトアビジンによって固定化されるビオチン化抗原を用いるＥＬＩＳＡによって力価を試験することによって、高いと思われる場合は、マウスを５０μｇのタンパク質で、７０、７１および７２日目にブーストし、続いて、７７日目に屠殺し、脾臓を摘出する。抗体の力価が十分でないと考えられる場合は、マウスを５０μｇの抗原で５６日目にブーストし、６３日目に試験出血を採取する。十分な力価が得られる場合には、動物を５０μｇの抗原で９８、９９および１００日目にブーストし、１０５日目に脾臓を採取する。通常、１：３２００以上の試験出血希釈で、十分であると考えられる、最大半量のＥＬＩＳＡ応答が得られる。
【０１７４】
脾臓は層流フード内で採取し、ペトリ皿に移し、脂肪および結合組織を切り取り、廃棄する。迅速に作業し、脾臓を溶液Ｄ（２５．０ｇチオシアン酸グアニジン（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナ州、インディアナポリス）、２９．３ｍｌ滅菌水、１．７６ｍｌ ０．７５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２．６４ｍｌ １０％サルコシル（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、０．３６ｍｌ ２−メルカプトエタノール（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ））１．０ｍｌの存在下、滅菌５ｃｃシリンジのプランジャで柔らかくする。脾臓懸濁液を１８ゲージのニードルによって、粘性になり、すべての細胞が溶解するまで吸い上げ、次いで、微量遠心管に移す。ペトリ皿を１００μｌの溶液Ｄで洗浄して残存する脾臓をいずれも回収し、これを管に移す。次いで、懸濁液をさらに５〜１０回２２ゲージのニードルによって吸い上げる。サンプルを２つの微量遠心管に等分に分け、以下のものを、各々添加後に反転して混合しながら、順に加える：１００μｌ ２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、１．０ｍｌ 水で飽和したフェノール（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、２００μｌクロロホルム／イソアミルアルコール４９：１（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）。この溶液を１０秒間ボルテックス処理し、氷上で１５分間インキュベートする。２〜８℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、水相を新しい管に移す、等容積の水で飽和したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０：４９：１）を加え、管を１０秒間ボルテックス処理する。氷上で１５分インキュベートした後、サンプルを２〜８℃で２０分間遠心分離し、水相を新しい管に移し、等容量のイソプロパノールを用い、−２０℃で最低３０分間沈殿させる。４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、管を短時間回転させ、液体を残らず除去する。ＲＮＡペレットを３００μｌの溶液Ｄに各々溶解し、合わせ、等容量のイソプロパノールを用いて−２０℃で最低３０分間沈殿させる。サンプルを４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を前述のように吸引し、サンプルを１００μｌの氷冷７０％エタノールでリンスする。サンプルを４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離し、７０％エタノール溶液を吸引し、ＲＮＡペレットを真空乾燥させる。ペレットを１００μｌの滅菌蒸留水に再懸濁する。４０μｇ／ｍｌの濃度に対して吸光度１．０を用いてＡ２６０によって濃度を測定する。ＲＮＡは−８０℃で保存する。
【０１７５】
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製
前記のように精製した全ＲＮＡを、ｃＤＮＡの調製のための鋳型として直接用いる。ＲＮＡ（５０μｇ）を滅菌水で１００μＬに希釈し、１０μＬ−１３０ｎｇ／ｍＬオリゴｄＴ12を加える。サンプルを７０℃で１０分間加熱し、次いで、氷上で冷却する。４０μＬ ５×第一鎖バッファー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）、２０μＬ ０．１Ｍジチオスレイトール（ギブコ／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）、１０μＬ ２０ｍＭデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、および１０μＬの水を氷上で加える。次いで、サンプルを３７℃で２分間インキュベートする。１０μＬの逆転写酵素（スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＴＭ ＩＩ、ギブコ／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を加え、３７℃で１時間インキュベーションを続ける。ｃＤＮＡ産物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に直接用いる。
【０１７６】
ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲを用いて実質的にすべてのＨおよびＬ鎖遺伝子を増幅するために、実質的にすべての公開配列に対応するプライマーを選択する。ＨおよびＬのアミノ末端のヌクレオチド配列は相当な多様性を含むため、米国２００３０１０４４７７に記載されたように、３３種のオリゴヌクレオチドを合成し、Ｈ鎖の５’プライマーとして用い、２９種のオリゴヌクレオチドを合成し、κＬ鎖の５’プライマーとして用いる。５’プライマーは、以下の基準にしたがって作製する。第１に、Ｌ鎖の２番目および４番目のアミノ酸ならびに重鎖の２番目のアミノ酸を保存する。抗体のアミノ酸配列を変更するミスマッチは他のどの位置でも可能とする。第２に、各プライマーの５’側にＭ１３ウラシル鋳型に相補的な２０ヌクレオチドの配列を合成する。この配列はＨおよびＬ鎖プライマー間で異なり、Ｌ鎖プライマーについてはｐｅｌＢシグナル配列、Ｈ鎖プライマーについてはアルカリホスファターゼシグナル配列の３’側の２０ヌクレオチドに対応している。定常領域ヌクレオチド配列には、Ｈ鎖およびκＬ鎖各々に対し、１種の３’プライマーしか必要でない（図２）。各５’および３’プライマーの各対に対し、別個にＰＣＲによる増幅を実施した。各プライマー対に対し、５０ｐｍｏｌの５’プライマー、５０ｐｍｏｌの３’プライマー、０．２５μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μＬ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、３μＬのｃＤＮＡ（実施例２に記載）、５μＬ ２ｍＭ ｄＮＴＰ、５μＬ ＭｇＣｌ2を含む１０×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、および５０μＬまでのＨ2Ｏを含む５０μＬの反応を実施する。増幅はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９６００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、カリフォルニア州、フォスター・シティー）を用い、以下のプログラムを用いて行う：９４℃で１時間、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒の３０サイクル、７２℃で６分間、４℃。
【０１７７】
次いで、ＰＣＲプロセスのｄｓＤＮＡ産物を、３’プライマーのみを用いる非対称ＰＣＲに付し、実質的に標的遺伝子のアンチセンス鎖のみを作製する。各ｄｓＤＮＡ産物に対して、２００ｐｍｏｌの３’プライマー、２μＬのｄｓＤＮＡ産物、０．５μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１０μＬ ２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μＬ ＭｇＣｌ2を含む１０×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、および１００μＬまでのＨ2Ｏを含む１００μＬの反応を行う。前述したものと同一のＰＣＲプログラムを用いて一本鎖（ｓｓ）−ＤＮＡを増幅する。
【０１７８】
高速液体クロマトグラフィーによるｓｓ−ＤＮＡの精製およびｓｓ−ＤＮＡのキナーゼ処理
【０１７９】
Ｈ鎖ｓｓ−ＰＣＲ産物およびＬ鎖ｓｓ−ＰＣＲ産物を、２．５容量のエタノールおよび０．２容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、−２０℃で少なくとも３０分間インキュベートすることによってエタノール沈殿させる。２〜８℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間のエッペンドルフ遠心機での遠心分離によってＤＮＡをペレットにする。上清を注意深く吸引し、管を短時間２回目の回転をさせる。上清の最後の一滴までピペットで除去する。ＤＮＡを中程度加熱して１０分間真空乾燥させる。Ｈ鎖産物を２１０μＬの水中にプールし、Ｌ鎖産物を別の２１０μＬの水中にプールする。ｓｓ−ＤＮＡを、オーブン温度６０℃で、ヒューレット・パッカード１０９０ＨＰＬＣおよびＧｅｎ−Ｐａｋ（商標）ＦＡＸ陰イオン交換カラム（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）、マサチューセッツ州、ミルフォード）を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する。吸光度を２６０ｎｍでモニターする。ＨＰＬＣから溶出されるｓｓ−ＤＮＡを０．５分画分で回収する。ｓｓ−ＤＮＡを含有する画分を、前述のようにエタノール沈殿させ、ペレットにし、乾燥させる。乾燥ＤＮＡペレットを２００μＬの滅菌水中にプールする。
【０１８０】
必要に応じて、ｓｓ−ＤＮＡを突然変異誘発のための調製において５’でキナーゼ処理する。各サンプルに、２４μＬ １０×キナーゼバッファー（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、オハイオ州、クリーブランド）、１０．４μＬ １０ｍＭアデノシン−５’−三リン酸（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州・インディアナポリス）、および２μＬポリヌクレオチドキナーゼ（３０ユニット／μＬ、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル、オハイオ州、クリーブランド）を加え、管を３７℃で１時間インキュベートする。管を７０℃で１０分間インキュベートすることによって反応を停止させる。ＤＮＡを平衡化フェノール（ｐＨ＞８．０、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル、オハイオ州、クリーブランド）−クロロホルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）で１回抽出することで精製する。抽出後、前述のように、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ペレットにする。このＤＮＡペレットを乾燥させ、次いで、５０μＬの滅菌水に溶解する。ＤＮＡのアリコートの２６０ｎｍでの吸光度を測定し、吸光度１．０に対して３３μｇ／ｍＬを用いることによって濃度を決定する。サンプルは−２０℃で保存する。
【０１８１】
抗体ファージディスプレイベクター
【０１８２】
抗体をクローニングする抗体ファージディスプレイベクターを、６６８−４と呼ばれる、イクシス（Ｉｘｓｙｓ）から供給されるＭ１３ベクターから導く。ベクター６６８−４は、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）、ＷＯ９２／０６０２４によって記載された、ベクターに挿入されたマウスモノクローナルＦａｂ断片の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含んでいた。ベクターは、マウス抗体のＬ鎖可変領域の５’側に融合しているＬａｃプロモーター、ｐｅｌＢシグナル配列、マウス抗体の全κ鎖、マウス抗体のＨ鎖可変領域の５’末端にアルカリホスファターゼシグナル配列、全可変領域およびＨ鎖の第１定常領域、ならびにＩｇＧ１ Ｈ鎖のヒンジ領域の５つのコドンを含んでいる。デカペプチド配列はＨ鎖ヒンジ領域の３’末端にあり、アンバー停止コドンがデカペプチド配列を偽遺伝子ＶＩＩＩ配列から隔てている。アンバー停止によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）サプレッサー株、例えば、ＸＬ１ブルー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州、サン・ディエゴ）における遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を含むＨ鎖融合タンパク質の発現が可能となるが、非サプレッサー細胞株、例えば、ＭＫ３０（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）では発現されない（図３Ａ参照）。
【０１８３】
第１の誘導クローニングベクターを作製するために、ウラシル鋳型のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によってＨ鎖およびＬ鎖の可変領域内に欠失を作製する（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ８２、４８８頁（１９８５）、クンケルら、メソッヅ・エンジモロジー、１５４、３６７頁（１９８７））。これらの突然変異によって、ＣＤＲ１の５’末端からＣＤＲ３の３’末端の各鎖の領域が欠失し、突然変異によって、そこでタンパク質翻訳が停止するＤＮＡ配列が加わる（突然変異オリゴヌクレオチドについては図４参照）。これによって、挿入断片を含まないクローンにおけるＨまたはＬ鎖定常領域の発現が妨げられ、それによってプラークを挿入断片の存在についてスクリーニングすることが可能となる。得られたクローニングベクターをＢＳ１１と呼ぶ。
【０１８４】
ＢＳ１１に対して多数の変更を行って、本スクリーニング法に用いるクローニングベクターを作製する。重鎖と偽遺伝子ＶＩＩＩ配列の間のアンバー停止コドンを除去し、どの重鎖も遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を含む融合タンパク質として発現されるようにする。これによって、ＢＳ１１に対して、ファージでの抗体のコピー数が増加する。Ｌ鎖の３’末端とアルカリホスファターゼシグナル配列の５’末端の間の配列中のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を欠失させ、抗体をｐＢＲ３２２誘導体にサブクローニングできるようにする。ＬおよびＨ鎖のカルボキシル末端の鎖間システイン残基をセリン残基に変更する。これによって、抗体安定性に影響を及ぼすことなく、抗体の発現レベルおよびファージでの抗体のコピー数が増加する。ｌａｃプロモーターの５’側および偽遺伝子ＶＩＩＩ配列の３’側の非必須ＤＮＡ配列を欠失させ、Ｍ１３ベクターの大きさおよび再編成の可能性を小さくする。翻訳停止に加え、転写停止ＤＮＡ配列をベクターに、Ｌ鎖クローニング部位で加え、パニングの際に非特異的に結合する可能性がある、その表面に重鎖タンパク質しか有さないファージが作製されないようにする。最後に、種々のベクターにタンパク質タグのＤＮＡ配列を加え、金属キレートクロマトグラフィー（ポリヒスチジン配列）による、またはデカペプチドタグおよびデカペプチドタグと結合する固定化抗体を含む磁性ラテックスを用いるアフィニティー精製による多価ファージの濃縮を可能にする。ベクターＢＳ３９はポリヒスチジン配列を、κ鎖の３’末端に含み、重鎖の末端にはタグを含まない。他方、ＢＳ４５はポリヒスチジン配列を、重鎖定常領域の末端と偽遺伝子ＶＩＩＩ配列の間に、デカペプチド配列を、κ鎖定常領域の３’末端に含む。
【０１８５】
脾臓抗体ファージライブラリーの作製に用いるウラシル鋳型の調製
【０１８６】
２５０ｍＬのバッフル付振盪フラスコに入れた５０ｍｌ ２×ＹＴに、１ｍＬの大腸菌ＣＪ２３６（バイオラッド（ＢｉｏＲＡＤ）、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）一晩培養物を加える。この培養物を３７℃でＯＤ600＝０．６に増殖させ、１０μｌのベクターファージ保存液の１／１００希釈液を用いて播種し、増殖を６時間継続する。約４０ｍＬの培養物を４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清（３０ｍＬ）を新しい遠心管に移し、１０ｍｇ／ｍｌ ＲｎアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）１５μｌを添加した後、室温で１５分間インキュベートする。７．５ｍｌの２０％ポリエチレングリコール８０００（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）／３．５Ｍ酢酸アンモニウム（シグマ・ケミカル社、ミズーリ州、セント・ルイス）を加えることによってファージを沈殿させ、氷上で３０分間インキュベートする。サンプルを２〜８℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清を注意深く廃棄し、管を短時間回転させ、上清を残らず除去する。ペレットを４００μｌの高塩バッファー（３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、１．５ｍＬの試験管に移す。等容量の平衡化フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４９：１）を用い、白色の界面の痕跡が見えなくなるまで、ファージ保存液を反復して抽出し、次いで、等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を用いて抽出する。２．５容量のエタノールおよび１／５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを用いてＤＮＡを沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートする。ＤＮＡを４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを冷７０％エタノールで１回洗浄し、真空乾燥させる。ウラシル鋳型ＤＮＡを３０μｌの滅菌水に溶解し、濃度４０μｇ／ｍｌに対して吸光度１．０を用いてＡ２６０によって濃度を求める。鋳型を滅菌水で２５０ｎｇ／μｌに希釈し、分注し、−２０℃で保存する。
【０１８７】
抗体ファージライブラリーを作製するための、ｓｓ−ＤＮＡおよび大腸菌へのエレクトロポレーションを用いるウラシル鋳型の突然変異誘発
【０１８８】
単鎖重鎖および軽鎖遺伝子をファージディスプレイベクターウラシル鋳型に同時に導入することによって、抗体ファージディスプレイライブラリーを作製する。通常の突然変異誘発は２μｇスケールで、０．２ｍＬ ＰＣＲ反応管中で以下のものを混合することによって実施する：８μｌの（２５０ｎｇ／ｍｌ）ウラシル鋳型（実施例５および６）、８μｌの１０×アニーリングバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＮａＣｌ）、３．３３μｌのキナーゼ処理した単鎖重鎖挿入断片（１００ｎｇ／μｌ）、３．１μｌのキナーゼ処理した単鎖軽鎖挿入断片（１００ｎｇ／μｌ）、および８０μｌまでの滅菌水。ＤＮＡをＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９６００サーマルサイクラーで以下の温度プロフィールを用いてアニーリングする：９４℃で２０秒、８５℃で６０秒、３０分かけて８５℃〜５５℃の傾斜、５５℃で１５分間維持。プログラムが終了した後ＤＮＡを氷に移す。伸長／ライゲーションは、８μｌの１０×合成バッファー（５ｍＭ 各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＤＴＴ）、８μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州、インディアナポリス）、８μｌ希釈したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ、ニューイングランド・バイオラブス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、マサチューセッツ州）を加え、３７℃で３０分間インキュベートすることによって実施する。反応を３００μｌの突然変異誘発停止バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で停止させる。突然変異誘発ＤＮＡを平衡化フェノール（ｐＨ＞８）：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）で１回抽出し、ＤＮＡを−２０℃で少なくとも３０分間エタノール沈殿させる。前述のように、ＤＮＡをペレットにし、上清を注意深く除去する。サンプルを再度短時間回転させ、ピペットマンを用いてエタノールを残らず除去する。ペレットを真空乾燥させる。ＤＮＡを４μｌの滅菌水に再懸濁する。
【０１８９】
１μｌの突然変異誘発ＤＮＡ（５００ｎｇ）を、４０μｌの電気的コンピテント大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ギブコ／ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）にトランスファーする。形質転換された細胞を１．０ｍＬ ２×ＹＴブロスと混合し、１５ｍＬの滅菌培養管に移す。培養物を２３℃、３００ｒｐｍで一晩振盪することによって第１ラウンドの抗体ファージを作製する。エレクトロポレーションの効率は、培養物の１０-3および１０-4希釈液１０μｌをＬＢアガープレート上にプレーティングすることによって測定する。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートする。効率は、１０-3希釈液プレート上のプラークの数に１０5を掛けることによって、または１０-4希釈液プレート上のプラーク数に１０6を掛けることによって求める。エレクトロポレーションから一晩培養したものを、１．５ｍｌの管に移し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞をペレットにする。次いで、第１ラウンドの抗体ファージである上清を、１５ｍＬのプラグシールキャップ付滅菌遠心管移す。
【０１９０】
エレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換
【０１９１】
電気的コンピテントな大腸菌細胞を氷上で解凍する。気泡が入らないよう注意しながら、細胞を上下に２〜３回穏やかにピペッティングすることによってＤＮＡを２０〜４０μＬの電気的コンピテントな細胞と混合する。細胞を、再度、移す際に気泡が入らないように注意しながら、氷上で冷却しておいたジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）キュベット（０．２ｃｍギャップ、バイオラッド、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）に移す。このキュベットを大腸菌パルサー（バイオラッド、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）に入れ、製造業者の推奨に従い１．８８ｋＶに設定した電圧でエレクトロポレーションを行う。形質転換されたサンプルを、２×ＹＴブロスで１ｍｌに直ちに希釈し、手順の指示通り処理する。
【０１９２】
ビオチン化抗原および抗体の調製
【０１９３】
タンパク質抗原または抗体を、最低１００容積の２０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８（ＢＢＳ）に対して、２〜８℃で少なくとも４時間透析する。ビオチン化の前にバッファーを少なくとも１回を交換する。タンパク質抗原または抗体を、ビオチン−ＸＸ−ＮＨＳエステル（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州、ユージーン、ジメチルホルムアミド中４０ｍＭの保存溶液）と、最終濃度１ｍＭで、室温で１時間反応させる。１時間後、タンパク質抗原または抗体をＢＢＳに十分に透析して未反応の小分子を除去する。
【０１９４】
アルカリホスファターゼ抗原コンジュゲートの調製
【０１９５】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ、カルザイム・ラボラトリーズ（Ｃａｌｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州、サン・ルイス・オビスポ）を、２〜８℃で少なくとも４時間、最低１００容積のカラムバッファー（５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、ｐＨ７．０）に対する透析に付す。ＡＰを使用する前に少なくとも２回バッファーを交換する。ＡＰを透析から回収し、室温にし、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対して吸光度０．７７を用いて２８０ｎｍの吸光度によって濃度を求める。ＡＰをカラムバッファーで５ｍｇ／ｍＬに希釈する。ＡＰとスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ピエルス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．）、イリノイ州、ロックフォード）の反応を、２０：１の割合のＳＭＣＣ：ＡＰを用いて実施する。ＳＭＣＣをアセトニトリルに２０ｍｇ／ｍＬで溶解し、ボルテックス処理または迅速に攪拌しながらＡＰに加える際に８４倍に希釈する。溶液を室温で９０分間静置させ、次いで、カラムバッファーで平衡化したカラムにおけるゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇ５０Ｆｉｎｅ、ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いて未反応のＳＭＣＣおよび低分子量反応産物をＡＰから分離する。
【０１９６】
タンパク質抗原を最低１００容積の２０ｍＭリン酸カリウム、４ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して、２〜８℃で少なくとも４時間透析する。抗原を使用する前に少なくとも２回バッファーを交換する。２８０ｎｍの吸光度によって、またはローリー法によって抗原の量を定量する。抗原とＮ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ、ピエルス・ケミカル社、イリノイ州、ロックフォード）の反応を、２０：１モル比のＳＰＤＰ：抗原を用いて実施する。ＳＰＤＰをジメチルホルムアミドに４０ｍＭで溶解し、ボルテックス処理しながら抗原溶液に入れて希釈する。この溶液を室温で９０分間静置させ、その時点で、タウリン（アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）を最終濃度２０ｍＭに５分間加えることによって反応をクエンチする。タンパク質にジチオスレイトール（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）を最終濃度１ｍＭで３０分間加える。５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、ｐＨ７．０で平衡化したカラムにおけるゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、低分子量反応産物を抗原から分離する。
【０１９７】
ＡＰおよび抗原を、等モル比でともに混合する。反応物を２時間室温に置く。このコンジュゲートを、１％ウシ血清アルブミン（３０％ＢＳＡ、バイエル、イリノイ州、カンカキーから作製）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2、０．１％ポリビニルアルコール（８０％加水分解、アルドリッチ・ケミカル社、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）、ｐＨ８．０を含有するブロックで０．１ｍｇ／ｍＬに希釈する。
【０１９８】
アビジン磁性ラテックスの調製
【０１９９】
磁性ラテックス（エスタポール（Ｅｓｔａｐｏｒ）、１０％固体、バングス・ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インディアナ州、フィッシャー）を十分に再懸濁し、１５ｍｌの円錐管に２ｍｌ分注する。磁性ラテックスを１２ｍｌの蒸留水に懸濁し、磁石を用いて溶液から１０分間分離する。依然磁石中にありながら、１０ｍＬの滅菌ピペットを用いて液体を注意深く除去する。この洗浄プロセスをさらに３回反復する。最後に洗浄した後、ラテックスを２ｍｌの蒸留水に再懸濁する。別個の５０ｍｌ円錐管中で、１０ｍｇのアビジン−ＨＳ（ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）、ピエルス、イリノイ州、ロックフォード）を１８ｍｌの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）に溶解する。ボルテックス処理しながら、希釈したアビジン−ＨＳに洗浄した磁性ラテックス２ｍｌを加え、混合物をさらに３０秒間ボルテックス処理する。この混合物を、３０分毎に振盪しながら、４５℃で２時間インキュベートする。磁石を用いてアビジン磁性ラテックスを溶液から分離し、前述したように、２０ｍｌ ＢＢＳで３回洗浄する。最後に洗浄した後、ラテックスを１０ｍｌ ＢＢＳに再懸濁し、４℃で保存する。
【０２００】
使用する直前に、アビジン磁性ラテックスをパニングバッファー（４０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）、ｐＨ７．５）中で平衡化する。滅菌１５ｍｌ遠心管にパニング実験に必要なアビジン磁性ラテックス（２００μｌ／サンプル）を加え、パニングバッファーで１０ｍｌにする。この管を磁石上に１０分間置き、ラテックスを分離する。前述したように、１０ｍＬ滅菌ピペットで溶液を注意深く除去する。磁性ラテックスを１０ｍＬのパニングバッファーに再懸濁し、２回目の洗浄を開始する。磁性ラテックスをパニングバッファーで全３回洗浄する。最後に洗浄した後、ラテックスをパニングバッファーに再懸濁し、初期アリコート容量とする。
【０２０１】
Ｍ１３ファージまたは抗体ファージディスプレイベクター突然変異誘発反応で形質転換された細胞のプレーティング
【０２０２】
１００ｍｍ ＬＢアガープレートにプレーティングする場合は２００μＬの大腸菌ＸＬ１−ブルーの一晩培養物に、または、滅菌１５ｍｌ培養管中の１５０ｍｍプレートにプレーティングする場合は６００μＬの一晩細胞に、ファージサンプルを加える。ＬＢトップアガー（１００ｍｍプレートに対して３ｍＬ、または１５０ｍｍプレートに対して９ｍＬ、５５℃で保存されたトップアガー、付録Ａ１、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリーズ・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｅｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、（１９８９）サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ）を加えた後、混合物を、アガー表面の過剰な水分を除去するよう予熱しておいた（３７℃〜５５℃）ＬＢアガープレート上に等分に分配する。プレートを、トップアガーが固化するまで室温で冷却する。指示通り、プレートを反転させ、３７℃でインキュベートする。
【０２０３】
アルカリホスファターゼコンジュゲートを含むニトロセルロースフィルターの現像
【０２０４】
ニトロセルロースフィルターをＬＢアガープレート上で一晩インキュベートした後、メンブランピンセットを用いてプレートからフィルターを注意深く回収し、抗原−ＡＰコンジュゲートを用いる場合は、カゼインブロック（１％カゼイン（ハマーステン（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｎ）等級、リサーチ・オーガニックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、オハイオ州、クリーブランド）を含むブロック）、またはヤギ抗マウスκ−ＡＰ（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ）、アラバマ州、バーミンガム）を用いる場合はブロック中のいずれかで、２時間インキュベートする。２時間後、フィルターをＡＰコンジュゲートとともに２〜４時間インキュベートする。抗原−ＡＰコンジュゲートをカゼインブロックに最終濃度１μｇ／ｍＬで希釈し、ヤギ抗−マウスκ−ＡＰコンジュゲートをブロックに最終濃度１μｇ／ｍＬで希釈する。フィルターを４０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）（フィッシャー・ケミカル、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）で各５分間３回洗浄する。最後の洗浄の後、フィルターを、０．２Ｍ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＪＢＬサイエンティフィック（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州、サン・ルイス・オビスポ）、０．５Ｍ ＴＲＩＳ、０．３３ｍｇ／ｍＬニトロブルーテトラゾリウム（フィッシャー・サイエンティフィック、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）および０．１６６ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート、ｐ−トルイジン塩を含有する溶液中で現像する。
【０２０５】
重鎖上のタグ、およびκ鎖上のポリヒスチジン配列を用いないＢＮＰペプチドに対するポリクローナルファージの濃縮
【０２０６】
この実施例では、ＢＮＰペプチドに対するファージライブラリーの複数ラウンドのスクリーニングを記載する。何ラウンドかのスクリーニングを、抗体の多重コピーをファージが提示するための濃縮のラウンドと入れ替える。ファージがいずれかの軽鎖を提示するパーセンテージと注目するＢＮＰペプチドに対して特異的な親和性を有するＦａｂ断片（以下、「抗原」と呼ぶ）をファージが提示するパーセンテージを、スクリーニングの各ラウンドの後に測定する。
【０２０７】
第１ラウンド抗体ファージは、前述したようにＢＳ３９ウラシル鋳型を用いて調製する。突然変異誘発ＤＮＡの２回のエレクトロポレーションの効率は９．７×１０7ＰＦＵおよび８．３×１０7ＰＦＵであった。両エレクトロポレーションから得たファージを合わせ、パニングバッファーで３．２ｍｌに希釈する。ファージを、１５ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管に２〜１ｍＬのアリコートに分注する。各ファージアリコートに抗原−ビオチン（１０μＬ、１０-6Ｍ保存濃度）を加える。ファージサンプルを２〜８℃で一晩インキュベートする。
【０２０８】
インキュベートした後、ファージサンプルをアビジン磁性ラテックスを用いて取り出す。サンプルあたり、平衡化したアビジン磁性ラテックス（実施例１１参照）、２００μＬラテックスをファージとともに室温で１０分間インキュベートする。１０分後、各ファージサンプルに約９ｍＬのパニングバッファーを加え、磁石を用いて磁性ラテックスを溶液から分離する。磁石中で１０分後、結合していないファージを、１０ｍＬ滅菌ピペットで注意深く除去する。次いで、磁性ラテックスを１０ｍＬのパニングバッファーに再懸濁し、２回目の洗浄を開始する。ラテックスを前述したように全５回洗浄する。各洗浄について、管を磁石中に１０分間置き、結合していないファージを磁性ラテックスから分離する。５回目の洗浄の後、磁性ラテックスを１ｍＬ ＴＢＳに再懸濁し、１．５ｍＬの管に移す。この時点でラテックスのアリコートを取り、前述したように、１００ｍｍ ＬＢアガープレート上にプレーティングする。磁性ラテックスの大部分（９９％）を２００μＬ ２×ＹＴに再懸濁し、実施例１２に記載したように１５０ｍｍ ＬＢアガープレート上にプレーティングする。１００ｍｍ ＬＢアガープレートを３７℃で６〜７時間インキュベートし、次いで、プレートを室温に移し、ニトロセルロースフィルター（孔サイズ０．４５μｍ、ＢＡ８５プロトラン（Ｐｒｏｔｒａｎ）、シュライシャー・アンド・シュール（Ｓｃｈｌｉｅｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ニューハンプシャー州、キーン）をプラーク上にかぶせる。ニトロセルロースフィルターを付けたプレートを室温で一晩インキュベートする。１５０ｍｍプレートを用いて、磁性ラテックスと結合しているファージを増幅し抗体ファージの次のラウンドを作製する。これらのプレートを３７℃で４時間、次いで２０℃で一晩インキュベートする。
【０２０９】
一晩インキュベートした後、抗体ファージを１５０ｍｍプレートから溶出し、前述したように、アルカリホスファターゼ−抗原を用いてフィルターを発現させる。８ｍＬ ２ＹＴ培地を菌叢上にピペットで加え、室温で２０分間穏やかに振盪することによって１５０ｍｍプレートから抗体ファージを溶出する。ファージを１５ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管に移し、ＬＢプレートに由来する細片を、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによってペレットにする。次いで、第２ラウンド抗体ファージを新しい管に移す。
【０２１０】
パニングの第２ラウンドを開始するために、ファージの１０-7および１０-8希釈液１０μＬを１００ｍｍＬＢアガープレートにプレーティングすることによって抗体ファージを滴定する。このプレートを３７℃で６〜７時間インキュベートし、次いで、プレート上のプラーク数を計数する。また、抗体ファージにおけるκ陽性のパーセンテージをモニターするために、ニトロセルロースフィルターをプレート上にかぶせ、室温で一晩インキュベートする。κ陽性のパーセンテージは無傷のＦａｂ断片を提示するファージの割合の尺度である。
【０２１１】
両第２ラウンド抗体ファージサンプルを、各サンプルをパニングバッファーに最終濃度５×１０9ＰＦＵ／ｍＬで希釈し、最終容量を１ｍＬにすることによってプールする（抗
体ファージの力価は約２×１０12ＰＦＵ／ｍＬおよび１．７×１０12である）。ファージに抗原−ビオチン（１０μＬ、１０-6Ｍ保存濃度）を加え、２〜８℃で一晩ファージをインキュベートする。抗体ファージ力価プレート上のニトロセルロースフィルターを、前述したように、ヤギ抗−マウスκＡＰを用いて発現させる。第２ラウンド抗体ファージを、前述したようにアビジン磁性ラテックスを用いて取り出す。ラテックスをパニングバッファーで洗浄した後、ラテックスを１ｍＬ ＴＢＳに再懸濁し、１．５ｍＬの管に移す。ラテックスのアリコートを、前述したように、１００ｍｍ ＬＢアガープレートにプレーティングし、機能的陽性を調べ、ラテックスの残りを１５０ｍｍ ＬＢアガープレートにプレーティングして第３ラウンド抗体ファージを作製する。抗体ファージを滴定し、ファージをパニングバッファーに希釈し、抗原−ビオチンを加え、ファージを２〜８℃で少なくとも１６時間インキュベートし、ファージをアビジン磁性ラテックスで取り出し、磁性ラテックスをプレーティングするというこの基本手順を、１０ラウンドのパニング継続する。前述したものからの変更は、結合している抗体のアフィニティーを高めるために抗原−ビオチン濃度がより低いということ、および取り出されるファージの数が１０10と１０8の間であるということだけである。
【０２１２】
抗原−ビオチンに対するパニングの１０回目のラウンドの後、抗体ファージを多価ディスプレイのための濃縮のラウンドに付す。濃縮は、提示された軽鎖に融合されているヘキサヒスチジンタグのＮｉ ＮＴＡアガロース（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州、チャッツワース）への結合によって達成される。１１回目のラウンドの抗体ファージ（２．５ｍＬ）を、プラグシールキャップ付１５ｍＬのディスポーザブル滅菌遠心管中で２．５ｍＬパニングバッファーに希釈する。以下の手順を用いてＮｉ ＮＴＡをパニングバッファーに平衡化する。樹脂（ファージサンプルあたり１ｍＬ）を、５０ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管中で、パニングバッファーで５０ｍＬに希釈し、次いで、ＩＥＣ遠心分離機で、５００ｒｐｍで１分間ペレットにする。上清を５０ｍＬのディスポーザブルピピットを用いて注意深く除去し、２回目の洗浄のために樹脂をパニングバッファーで５０ｍＬに再度希釈する。樹脂をパニングバッファー中で平衡化するために、このように樹脂を全４回洗浄する。次いで、平衡化した樹脂をパニングバッファーでその最初の容積に再懸濁する。次いで、平衡化した樹脂（１ｍＬ）をファージに加え、管を１５分間穏やかに揺り動かす。１５分後、ＩＥＣ遠心分離機で、５００ｒｐｍで１分間樹脂をペレットにする。上清を１０ｍＬディスポーザブルピペットで穏やかに除去し、樹脂を最初の洗浄のために１０ｍＬパニングバッファーに再懸濁する。前述したように、樹脂をペレットにし、上清を除去し、樹脂を１０ｍＬのパニングバッファーに２回目の再懸濁をする。この手順を全５回のパニングバッファー洗浄のために反復する。５回目の洗浄液を除去した後、樹脂を１ｍＬの溶出バッファー（５０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）に再懸濁し、１．５ｍＬの管に移す。樹脂を１時間穏やかに揺り動かし、抗体ファージを溶出する。１時間後、樹脂をペレットにし（エッペンドルフ遠心分離機で１４，０００ｒｐｍ、５分）、樹脂を少しも移さないよう注意しながら、ファージを回収する。ファージ溶液のｐＨを８に調整するために、１ｍＬのファージサンプルに５０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３および４６μＬの１Ｍ ＮａＯＨを加える。また、１０１Ｌの３００ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（バイエル、イリノイ州、カンカキー）をファージサンプルに加える。前述のように、抗原−ビオチンを用いるパニングの１１回目のラウンドのために、得られたファージ溶液（１ｍＬ）を１５ｍＬのプラグシールキャップ付ディスポーザブル滅菌遠心管に移す。
【０２１３】
パニングの１２回目〜１４回目のラウンドを前述のように行い、ここで抗体ファージをＮｉ ＮＴＡに結合させ、溶出し、溶出したファージを抗原−ビオチンを用いて取り出す。しかし、ラウンド１３において、Ｎｉ ＮＴＡから溶出したファージに標識していないＣ末端ＢＮＰペプチドを抗原−ビオチンに対して１００倍モル過剰で加え、Ｃ末端ＢＮＰペプチド結合せず、抗原と特異的に結合する抗体を選択する。
【実施例３】
【０２１４】
生化学的解析
標準的なイムノアッセイ技術を用いてＢＮＰを測定する。これらの技術は、タンパク質標的と特異的に結合する抗体の使用を含む。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を抗体あたり約５のＮＨＳ−ビオチン成分の割合で用いて、ＢＮＰに対する抗体をビオチン化する。次いで、標準アビジン３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルにビオチン化した抗体を加え、プレートに結合していないビオチン化抗体を除去する。これによって、マイクロタイタープレートに抗−ＢＮＰ固相が形成される。別の抗ＢＮＰ抗体を、標準技術を用い、ＳＭＣＣおよびＳＰＤＰ（ピエルス、イリノイ州、ロックフォード）を用いてアルカリホスファターゼにコンジュゲートする。イムノアッセイをＴＥＣＡＮジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）ＲＳＰ２００／８ワークステーションで実施する。試験サンプル（１０μｌ）をピペットでマイクロタイタープレートのウェルに入れ、６０分間インキュベートする。次いで、このサンプルを除去し、ウェルを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２０ｍＭホウ酸塩（ｐＨ７．４２）からなる洗浄バッファーで洗浄する。次いで、ウェルにアルカリホスファターゼ−抗体コンジュゲートを加え、さらに６０分間インキュベートし、その後、抗体コンジュゲートを除去し、洗浄バッファーでウェルを洗浄する。ウェルに基質（アットフォス（ＡｔｔｏＰｈｏｓ）（登録商標）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州、マディソン）を加え、蛍光産物の形成度を試験サンプル中のＢＮＰの濃度と関連付ける。
【実施例４】
【０２１５】
ＤＰＰ阻害剤の合成
【０２１６】
ペプチドカップリング化学を用いて線状ボロＰｒｏ化合物を調製することが好ましい。本発明に用いるペプチドカップリング化学法および手順は容易に入手できる。これらの方法を用いる教本の例としては、それだけには限らないが、以下の、参照により本明細書に組み込まれる引用文が挙げられる：Ｐ．Ｄ．ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）、「アン・イントロダクション・トゥー・ペプチド・ケミストリー（Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ジョン・ウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９０；ミクロス・ボダンスキー（Ｍｉｋｌｏｓ Ｂｏｄａｎｓｋｙ）、「ペプチド・ケミストリー・ア・プラクティカル・テキストブック（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ）」、スプリンガー−ベルラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、１９８８；ミクロス・ボダンスキー、「プリンシプルズ・オブ・ペプチド・シンセシス、リアクティビティー・アンド・ストラクチャー・コンセプツ・イン・オーガニック・ケミストリー（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第１６巻、スプリンガー−ベルラグ、１９８４；およびミクロス・ボダンスキー、「プリンシプルズ・オブ・ペプチド・シンセシス、リアクティビティー・アンド・ストラクチャー・コンセプツ・イン・オーガニック・ケミストリー」第２１巻、スプリンガー−ベルラグ、１９８４。
【０２１７】
本発明の化合物は、ＷＯ９８／００４３９に開示されたようにＨ−ボロＰｒｏの合成で開始することができる。Ｈ−ボロＰｒｏの使用は単に例示目的のためであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。ＷＯ９８／００４３９に従い、Ｈ−ボロＰｒｏを、従前に開発され、記載された（Ｇ．Ｒ．フレンケ（ｆｌｅｎｔｋｅ）ら、「インヒビション・オブ・ジペプチジル・アミノペプチダーゼＩＶ（ＤＰ−ＩＶ）バイ・Ｘａａ−ボロＰｒｏジペプチド・アンド・ユース・オブ・ジーズ・インヒビターズ・トゥー・エクザミン・ザ・ロール・オブ・ＤＰ−ＩＶ・イン・Ｔ−セル・ファンクション（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ （ＤＰ−ＩＶ） ｂｙ Ｘａａ−ｂｏｒｏＰｒｏ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＤＰ−ＩＶ ｉｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」）ＰＮＡＳ（米国）８８、１５５６〜１５５９頁（１９９１）、また、米国特許第５，４６２，９２８号にも記載されている）合成経路によって調製することができる。あるいは、Ｈ−ボロＰｒｏは新規手順によって製造することもできる（ケリー（Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．Ａ．ら、「ザ・エフィシャント・シンセシス・アンド・シンプル・レゾルーション・オブ・ア・プロリン・ボロネート・エステル・スータブル・フォー・エンザイム・インヒビション・スタディーズ（Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ ａ ｐｒｏｌｉｎｅ ｂｏｒｏｎａｔｅ ｅｓｔｅｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ）」、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）４９、１００９〜１０１６頁、（１９９３））。報告によれば、これら両合成経路ともラセミ化合物のＨ−ボロＰｒｏピナンジオールが生成する。
【０２１８】
ＷＯ９８／００４３９によれば、まず、ラセミ化合物のＨ−ボロＰｒｏを、光学活性ブロッキング保護基（（１Ｓ、２Ｓ、３Ｒ、５Ｓ）−＋−ピナンジオール異性体）を用いて結晶化によって分割し、次いで、同位体的に純粋なＬ−ボロＰｒｏおよびＤ−ボロＰｒｏをリジンの立体化学的に純粋なＬ異性体とカップリングすることによって、Ｚ−Ｌｙｓ−ボロＰｒｏの立体化学的に純粋なＬ、ＬおよびＬ，Ｄジアステレオマーを調製する（米国特許第５，４６２，９２８号参照）。あるいは、ラセミ化合物のＨ−ボロＰｒｏをＬ−Ｌｙｓによってカップリングし、ジアステレオマーのＰｒｏ−ボロＰｒｏについて従前に記載されているように（Ｗ．Ｇ．グートハイル（Ｇｕｔｈｅｉｌ）およびＷ．Ｗ．バコブチン（ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ）、「セパレーション・オブ・Ｌ−Ｐｒｏ−ＤＬ−ボロＰｒｏ・イントゥー・イッツ・コンポーネント・ジアステレオマーズ・アンド・カイネティック・アナリシス・オブ・ゼア・インヒビション・オブ・ジペプチジル・ペプチダーゼ・ＩＶ．ア・ニュー・メソッド・フォー・ザ・アナリシス・オブ・スロー、タイト−バインディング・インヒビション（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−Ｐｒｏ− ＤＬ−ｂｏｒｏＰｒｏ ｉｎｔｏ Ｉｔｓ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ． Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｌｏｗ， Ｔｉｇｈｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３２、８７２３〜８７３１頁、（１９９３））、逆相ＨＰＬＣを用いて得られたジアステレオマーのＺ−Ｌｙｓ−ボロＰｒｏ−ジエステルをその成分Ｌ，ＤとＬ、Ｌジアステレオマーに分離することによって、Ｌｙｓ−ボロＰｒｏのＬ，ＬおよびＬ，Ｄジアステレオマーを高い光学純度で調製する。
【実施例５】
【０２１９】
ジペプチジルペプチダーゼの精製
【０２２０】
以下の実施例はジペプチジルペプチダーゼＩＶについての例示的なものである：ジペプチジルペプチダーゼＩＩは、米国特許第６，４８５，９５５号の方法と同様に単離し、用いることができる。
【０２２１】
ブタ酵素を、いくつかの改変を加えながらも、従前に記載されたように（１）精製する。１５〜２０個体の動物から腎臓を獲得し、皮質を切り取り、−８０℃で凍結する。凍結組織（２０００〜２５００ｇ）を、ワーリングブレンダー中、１２Ｌの０．２５Ｍスクロース中でホモジェナイズする。ホモジェネートを３７℃に１８時間静置し、ＤＰＰ４の細胞膜からの切断を促す。切断ステップの後、ホモジェネートを４℃、７０００×ｇで２０分間遠心分離することによって清澄化し、上清を回収する。固体硫酸アンモニウムを６０％飽和まで加え、１０，０００×ｇで遠心分離することによって沈殿物を回収し、廃棄する。上清にさらなる硫酸アンモニウムを８０％飽和まで加え、８０％ペレットを回収し、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４に溶解する。
【０２２２】
２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４に対して透析した後、１０，０００×ｇで遠心分離することによって調製物を清澄化する。次いで、清澄化した調製物を、同バッファー中で平衡化したＣｏｎＡセファロース３００ｍｌにアプライする。一定のＡ２８０までバッファーで洗浄した後、カラムを５％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチルα−Ｄ−マンノピラノシドで溶出する。活性画分をプールし濃縮し、５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に対して透析する。透析した物質を同バッファー中で平衡化したファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）・リソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）Ｓカラム１００ｍｌに流す。フロースルー物質を回収すると、酵素活性のほとんどが含まれている。再度、活性物質を濃縮し、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４中で透析する。最後に、濃縮した酵素をファルマシアＳ−２００ゲル濾過カラムでのクロマトグラフィーに付し、低分子量夾雑物を除去する。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってカラム画分の純度を分析し、最も純度の高い画分をプールし、濃縮する。精製した酵素を−８０℃で２０％グリセロール中に保存する。
【実施例６】
【０２２３】
ジペプチジルペプチダーゼのアッセイ
【０２２４】
酵素は、ナガツら、アナリティカル・バイオケミストリー、７４、４６６〜７６頁、１９７６に従前に記載されたように、定常状態条件下で、基質としてＢＮＰを用い、以下の改変を加えてアッセイする。反応液は、１００μＬの最終容量中、１００ｍＭ ＡＣＥＳ、５２ｍＭ ＴＲＩＳ、５２ｍＭエタノールアミン、５００μＭ 基質、０．２％ ＤＭＳＯ、および４．５ｎＭ酵素、２５℃、ｐＨ７．４を含む。陽性化合物の解析には、基質と阻害剤濃度双方の関数として定常状態動力学的阻害定数を求める。完全阻害実験は、１１の基質濃度および７の阻害剤濃度を含め、３連の測定を行う。Ｋｉが２０ｎＭ未満である強力結合阻害剤については、酵素濃度を０．５ｎＭに下げ、反応時間を１２０分に増加する。３枚のプレートからプールしたデータセットを競合的、非競合的、不競合的阻害のいずれかに適当な方程式に当てはめる。
【実施例７】
【０２２５】
ナトリウム利尿ペプチドの化学的脱グリコシル化
【０２２６】
Ｎ2で飽和したガラス管において、５０μｇのタンパク質を、１００μｌのトリフルオロメタンスルホン酸／アニソール（２：１、ｖ／ｖ）試薬とともに暗黒下、４℃で２時間インキュベートする。−２０℃の６０％（ｖ／ｖ）ピリジンを添加することによって反応を停止する。タンパク質を、２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０に対して十分に透析する。
【実施例８】
【０２２７】
ナトリウム利尿ペプチドの酵素的脱グリコシル化
【０２２８】
４０μＬのサンプルに２μＬの２５×プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｐ２７１４）、１μＬのＯ−グリカナーゼ（プロザイム（ｐｒｏｚｙｍｅ）、カタログ番号ＧＫ８００９０）、３μＬのシアリダーゼＡ（プロザイム、カタログ番号ＧＫ８００４０）および８μＬの２００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０を加える。この混合物を穏やかにボルテックス処理し、２０℃で４時間インキュベートする。
【実施例９】
【０２２９】
質量分析によるナトリウム利尿ペプチドの解析
【０２３０】
抗体捕獲表面の調製
３μＬの抗体溶液（ホウ酸緩衝生理食塩水ｐＨ８．０（「ＢＢＳ」）中、０．２５ｍｇ／ｍＬの抗ＢＮＰモノクローナル抗体）を、ＰＳ１０プロテインチップアレイ（サイファージェン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）、カタログ番号Ｃ５５３−００４４）の適当なスポットにアプライし、このチップを加湿チャンバー中に入れ、２０℃で３時間穏やかに攪拌する。抗体溶液を除去し、アレイスポットを３μＬの１．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で２回洗浄する。２回目の洗浄で、チップを加湿チャンバー中に、攪拌せずに２０℃で３時間入れる。この洗浄の後、アレイを５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中に浸漬し、過剰のバッファーを除去する。
【０２３１】
ＢＮＰの捕獲
ＢＩＯＭＥＣロボットピペッティングステーション（ベックマン・インストルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて、アレイを１５０μＬのＢＢＳ中、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間、１５０μＬのＢＢＳ中、１０％ＰＥＧ３００／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間、および１５０μＬのＢＢＳ中、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で各５分間を３回にて、洗浄する。４０μＬのＢＢＳ中、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および４０μＬの脱グリコシル化サンプル（または対照サンプル）をアプライし、穏やかに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートする。
【０２３２】
エネルギー吸収マトリックスおよびＭＳ解析の適用
このインキュベーションの後、アレイを１５０μＬの１Ｍ尿素／０．１％ＣＨＡＰＳ／０．３Ｍ ＫＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５で各１分間、３回洗浄し、３００μＬの５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５で各３秒間、３回洗浄する。過剰のバッファーを除去し、光沢が全く見えなくなるまでアレイを風乾させる。低分子量の解析には（Ｍ／Ｚ＜６０００）、エネルギー吸収マトリックス（「ＥＡＭ」）のように適当なスポットに１μＬの、０．５％トリフルオロ酢酸（ピエルス、カタログ番号２８９０４）／５０％アセトニトリル（ピエルス、カタログ番号２００６２）中、２０％α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ、サイファージェン、カタログ番号Ｃ３００−０００１）をアプライする。高分子量解析には（Ｍ／Ｚ≧６０００）、ＥＡＭのように適当なスポットに、１μＬの、０．５％トリフルオロ酢酸／５０％アセトニトリル中、５０％シナピン酸（ＳＰＡ、サイファージェン、カタログ番号Ｃ３００−０００２）をアプライする。スポットを風乾させ、適当なＥＡＭの２回目の１μＬの液滴をアプライする。
【０２３３】
サイファージェン・プロテインチップ・リーダー・モデルＰＢＳ ＩＩＣを用いてＭＳスペクトルを獲得する。低分子量解析には、以下の機器パラメータを用いる：ハイマスは７０ｋＤａ、２ｋＤａ〜１５ｋＤａで最適に設定する；出発レーザー強度を１６５に設定する；出発検出感度は９に設定する；質量偏向器は１ｋＤａに設定する；獲得方法はＳＥＬＤＩ定量に設定する；ＳＥＬＤＩ獲得パラメータ＝２６、デルタ＝１０、トランシエント・パー（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ ｐｅｒ）＝１８、エンディング・ポジション（ｅｎｄｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）＝７６、および強度で５ショットを含むウォーミング・ポジション（ｗａｒｍｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）＝１７５。高分子量解析には、以下の機器パラメータを用いる：ハイマスは７０ｋＤａ、３ｋＤａ〜３０ｋＤａで最適に設定する；出発レーザー強度を２００に設定する；出発検出感度は９に設定する；質量偏向器は２ｋＤａに設定する；獲得方法はＳＥＬＤＩ定量に設定する；ＳＥＬＤＩ獲得パラメータ＝２４、デルタ＝１０、トランシエント・パー＝１３、エンディング・ポジション＝７４、および強度で３ショットを含むウォーミング・ポジション＝２１０。
【実施例１０】
【０２３４】
ＢＮＰ分解の阻害
【０２３５】
２種のヒト血漿サンプルを個々に２つの管に分け、その一方に可逆的ＤＰＰ阻害剤ジプロチンＡ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）を、１ｍＭの濃度まで加えた。各サンプルをヒトＢＮＰ77〜108でスパイクし、この混合物を４℃で一晩維持した。各サンプルを、前述したように、抗体捕獲ＳＥＬＤＩ質量分析に付した。結果を図１に示す。パネルＡ（添加なし）およびＢ（ジプロチンＡ）が一方の血漿サンプルに相当し、パネルＣ（添加なし）およびＤ（ジプロチンＡ）が２番目の血漿サンプルに相当する。捕獲はヒトＢＮＰを認識する抗体を用いて実施した。
【０２３６】
全長ＢＮＰ77〜108は約３４６６Ｄａの分子量（長い矢じり）に、ＢＮＰ79〜108（最後から２番目のプロリンで切断が生じている）は約３２８２Ｄａ（短い矢じり）に現れると予想される。パネルＡとＢおよびＣとＤを比較すると、ＤＰＰ阻害剤によってＢＮＰ77〜108のＢＮＰ79〜108への切断が阻害されている。約２９８８Ｄａの分子量でＢＮＰ79〜106であると推定される第２の切断産物も、ジプロチンＡ処理によって阻害され、約３１７３Ｄａの分子量でＢＮＰ77〜106であると推定される切断産物が相応して増加している。したがって、アミノ末端ｓｅｒ−ｐｒｏジペプチドの除去は、ＤＰＰ阻害剤の存在に対して感受性であり、第２のカルボキシル末端ジペプチド切断はそうではない。
【０２３７】
本発明を、当業者がこれを作製し使用するのに十分なほど詳細に説明および例示してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の代替、改変および改良は明らかであるはずである。
【０２３８】
当業者ならば、本発明は記載した目的を実施し、記載した結果および利点、ならびにそれらに内在するものを得るのに十分に適応していることを容易に理解するであろう。本明細書に提供した実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではない。当業者にとっては、その改変およびその他の用途も生じるであろう。これらの改変は本発明の趣旨内に包含され、特許請求の範囲によって画定されている。
【０２３９】
当業者ならば、本明細書に開示された本発明に、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、さまざまな置換、改変をなすことがで可能であることは容易に理解できるであろう。
【０２４０】
本明細書に記載したすべての特許および出版物は、本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示すものである。すべての特許および出版物は、各個々の出版物を具体的、かつ、個別に参照により組み入れるよう示すのと同程度に、参照により本明細書に組み入れる。
【０２４１】
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、いずれかの要素または要素類、制限または制限類がなくとも、適切に実施できる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、用語「含んでなっている」、「本質的にからなる」、および「からなる」のいずれかを、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いてきた用語および表現は、説明用語として用いるものであって制限するものではなく、このような用語および表現の使用には、示され、説明される特徴またはその一部の何らかの等価物を排除する意図は全くなく、特許請求される本発明の範囲内で種々の改変が可能であるということは理解されよう。したがって、本発明が、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されていたとしても、当業者によって、本明細書に開示された考え方の改変および変法をとることができるということ、ならびにこのような改変および変法は、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内にあると考えられるということは理解されなくてはならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から得たサンプル中の、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法であって、１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドが共有結合している糖鎖残基を含んでなり、
注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去することと、
前記サンプルをアッセイして前記サンプル中の注目する前記ナトリウム利尿ペプチドの存在または量と関連するアッセイ結果を得ること
とを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記の１種以上の共有結合している糖鎖残基を酵素処理によって除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素処理が、Ｎ−結合型糖鎖残基を除去する１種以上の酵素での処理を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素処理が、Ｏ−結合型糖鎖残基を除去する１種以上の酵素での処理を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素処理が、Ｎ−結合型とＯ−結合型糖鎖残基の双方を除去する１種以上の酵素での処理を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記の１種以上の共有結合している糖鎖残基を非酵素的化学処理によって除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから糖鎖残基の少なくとも８０％が除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アッセイステップが、前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドを、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するよう選択された抗体と接触させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アッセイステップがイムノアッセイを実施することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイステップが質量分析を実施することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイステップが質量分析を実施することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドが、ＢＮＰ、１種以上のＢＮＰ関連断片、またはＢＮＰと１種以上のＢＮＰ関連断片の双方を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の１種以上のＢＮＰ関連断片がＢＮＰl〜76、ＢＮＰ1〜108、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ3〜108からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記除去ステップの不在下で前記アッセイステップを実施することと比較して、前記方法が注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドの検出を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法であって、１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドが共有結合している糖鎖残基を含んでなり、
注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後に得られるアッセイ結果の約２倍以内である、前記の、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドからのアッセイ結果が得られるよう選択された１種以上の抗体を用いて前記サンプルでイムノアッセイを実施すること
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、質量分析による注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドの検出が増加する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから糖鎖残基の少なくとも８０％が除去される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルがヒト由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルが血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドがＢＮＰ、１種以上のＢＮＰ関連断片、またはＢＮＰと１種以上のＢＮＰ関連断片の双方を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記の１種以上のＢＮＰ関連断片が、ＢＮＰl〜76、ＢＮＰ1〜l08、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ3〜108からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法であって、
共有結合している糖鎖残基を含んでなる注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから得られた第１のアッセイ結果を、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後に前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから得られる第２のアッセイ結果と比較することによって、前記の１種以上の抗体をスクリーニングすることと、
ここで、前記第１および第２のアッセイ結果は、前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと、スクリーニングされる前記の１種以上の抗体との結合に応じて変わり、
前記の第２のアッセイ結果の約２倍以内である前記の第１のアッセイ結果が得られる１種以上の抗体を選択すること
とを含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記の選択された抗体を用いる前記のアッセイを構築することをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が抗体発現ライブラリーから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、質量分析による注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドの検出が増加する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから、糖鎖残基の少なくとも８０％が除去される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドが、ＢＮＰ、１種以上のＢＮＰ関連断片、またはＢＮＰと１種以上のＢＮＰ関連断片の双方を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記の１種以上のＢＮＰ関連断片が、ＢＮＰl〜76、ＢＮＰl〜l08、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ3〜l08からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
水性媒質中の、最後から２番目のアミノ末端プロリン残基を含んでなる１種以上のナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害する方法であって、
前記サンプル中に存在する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの前記プロリン残基の喪失を阻害するよう選択された条件下で、前記水性媒質を、１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項３２】
前記接触ステップが、ＢＮＰからの最後から２番目のアミノ末端プロリン残基の喪失を阻害する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１種以上の前記のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が小分子阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
１種以上の前記のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記水性媒質が血液、血清または血漿である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記水性媒質のすべてまたは一部に存在する１種以上のナトリウム利尿ペプチドについてアッセイを実施することをさらに含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
被験体において循環ＢＮＰの半減期を延長する方法であって、
循環ＢＮＰの半減期を延長するよう選択された条件下で、前記被験体に１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤を投与することを含んでなる、方法。
【請求項３８】
１種以上の前記ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が小分子阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１種以上の前記ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体が、脳卒中、うっ血性心不全、心虚血、全身性高血圧、および急性心筋梗塞からなる群から選択される診断に基づいて、前記の１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤を投与されるよう選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体が、前記投与ステップの前に少なくとも８０ｐｇ／ｍＬの血漿ＢＮＰレベルを有することに基づいて、前記の１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤を投与されるよう選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体にＢＮＰまたはその類似体を投与することをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記被験体に中性エンドペプチダーゼの阻害剤を投与することをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体にＢＮＰまたはその類似体と中性エンドペプチダーゼの阻害剤とを投与することをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤とナトリウム利尿ペプチドとを含んでなる薬剤組成物。
【請求項１】
被験体から得たサンプル中の、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法であって、１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドが共有結合している糖鎖残基を含んでなり、
注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去することと、
前記サンプルをアッセイして前記サンプル中の注目する前記ナトリウム利尿ペプチドの存在または量と関連するアッセイ結果を得ること
とを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記の１種以上の共有結合している糖鎖残基を酵素処理によって除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素処理が、Ｎ−結合型糖鎖残基を除去する１種以上の酵素での処理を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素処理が、Ｏ−結合型糖鎖残基を除去する１種以上の酵素での処理を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素処理が、Ｎ−結合型とＯ−結合型糖鎖残基の双方を除去する１種以上の酵素での処理を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記の１種以上の共有結合している糖鎖残基を非酵素的化学処理によって除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから糖鎖残基の少なくとも８０％が除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アッセイステップが、前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドを、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと特異的に結合するよう選択された抗体と接触させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アッセイステップがイムノアッセイを実施することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイステップが質量分析を実施することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイステップが質量分析を実施することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドが、ＢＮＰ、１種以上のＢＮＰ関連断片、またはＢＮＰと１種以上のＢＮＰ関連断片の双方を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の１種以上のＢＮＰ関連断片がＢＮＰl〜76、ＢＮＰ1〜108、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ3〜108からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記除去ステップの不在下で前記アッセイステップを実施することと比較して、前記方法が注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドの検出を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドの存在または量を検出する方法であって、１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドが共有結合している糖鎖残基を含んでなり、
注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後に得られるアッセイ結果の約２倍以内である、前記の、注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドからのアッセイ結果が得られるよう選択された１種以上の抗体を用いて前記サンプルでイムノアッセイを実施すること
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、質量分析による注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドの検出が増加する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから糖鎖残基の少なくとも８０％が除去される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルがヒト由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルが血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドがＢＮＰ、１種以上のＢＮＰ関連断片、またはＢＮＰと１種以上のＢＮＰ関連断片の双方を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記の１種以上のＢＮＰ関連断片が、ＢＮＰl〜76、ＢＮＰ1〜l08、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ3〜108からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイに用いる１種以上の抗体を選択する方法であって、
共有結合している糖鎖残基を含んでなる注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから得られた第１のアッセイ結果を、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから１種以上の共有結合している糖鎖残基を除去した後に前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドから得られる第２のアッセイ結果と比較することによって、前記の１種以上の抗体をスクリーニングすることと、
ここで、前記第１および第２のアッセイ結果は、前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドと、スクリーニングされる前記の１種以上の抗体との結合に応じて変わり、
前記の第２のアッセイ結果の約２倍以内である前記の第１のアッセイ結果が得られる１種以上の抗体を選択すること
とを含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記の選択された抗体を用いる前記のアッセイを構築することをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が抗体発現ライブラリーから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、質量分析による注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドの検出が増加する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記の、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの１種以上の共有結合している糖鎖残基の除去によって、注目する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドから、糖鎖残基の少なくとも８０％が除去される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記の注目する１種以上のナトリウム利尿ペプチドが、ＢＮＰ、１種以上のＢＮＰ関連断片、またはＢＮＰと１種以上のＢＮＰ関連断片の双方を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記の１種以上のＢＮＰ関連断片が、ＢＮＰl〜76、ＢＮＰl〜l08、ＢＮＰ3〜76、およびＢＮＰ3〜l08からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
水性媒質中の、最後から２番目のアミノ末端プロリン残基を含んでなる１種以上のナトリウム利尿ペプチドの分解を阻害する方法であって、
前記サンプル中に存在する１種以上の前記ナトリウム利尿ペプチドからの前記プロリン残基の喪失を阻害するよう選択された条件下で、前記水性媒質を、１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項３２】
前記接触ステップが、ＢＮＰからの最後から２番目のアミノ末端プロリン残基の喪失を阻害する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１種以上の前記のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が小分子阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
１種以上の前記のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記水性媒質が血液、血清または血漿である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記水性媒質のすべてまたは一部に存在する１種以上のナトリウム利尿ペプチドについてアッセイを実施することをさらに含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
被験体において循環ＢＮＰの半減期を延長する方法であって、
循環ＢＮＰの半減期を延長するよう選択された条件下で、前記被験体に１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤を投与することを含んでなる、方法。
【請求項３８】
１種以上の前記ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が小分子阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１種以上の前記ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤が抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体が、脳卒中、うっ血性心不全、心虚血、全身性高血圧、および急性心筋梗塞からなる群から選択される診断に基づいて、前記の１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤を投与されるよう選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体が、前記投与ステップの前に少なくとも８０ｐｇ／ｍＬの血漿ＢＮＰレベルを有することに基づいて、前記の１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤を投与されるよう選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体にＢＮＰまたはその類似体を投与することをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記被験体に中性エンドペプチダーゼの阻害剤を投与することをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体にＢＮＰまたはその類似体と中性エンドペプチダーゼの阻害剤とを投与することをさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
１種以上のジペプチジルペプチダーゼの阻害剤とナトリウム利尿ペプチドとを含んでなる薬剤組成物。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２５７４０７（Ｐ２０１１−２５７４０７Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４０４１８（Ｐ２０１１−１４０４１８）
【出願日】平成２３年６月２４日（２０１１．６．２４）
【分割の表示】特願２００６−５２４０５４（Ｐ２００６−５２４０５４）の分割
【原出願日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【出願人】（５００２０４５７７）バイオサイト インコーポレイテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２４日（２０１１．６．２４）
【分割の表示】特願２００６−５２４０５４（Ｐ２００６−５２４０５４）の分割
【原出願日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【出願人】（５００２０４５７７）バイオサイト インコーポレイテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
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