生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置
【課題】攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させる。
【解決手段】ＡＬと生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集を検出する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を混和液に添加することで、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因しない蛋白質の凝集またはゲル化を抑制する。
【解決手段】ＡＬと生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集を検出する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を混和液に添加することで、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因しない蛋白質の凝集またはゲル化を抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなど、ＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料中の該生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。一方で、敗血症患者血液中のエンドトキシンを測定することにより、重篤なエンドトキシンショックの予防や治療に寄与することもある。
【０００３】
注射薬などのエンドトキシン汚染を検出するための半定量的試験法として、従前は以下のような方法がとられることがあった。すなわち、体重１．５ｋｇ以上の健康なウサギの耳静脈に、３７℃に加温した試料を注射し、注射後３時間まで３０分以下の間隔で体温を測定する。注射の４０分前から注射までの間に３０分間隔で２回測定したウサギの体温の平均値を対象体温とし、対象体温と最高体温との差を体温上昇とする。
【０００４】
３匹のウサギを用いて上記の体温上昇を測定し、３匹の体温上昇の合計によって次のような判定が行われる。まず、３匹の体温上昇の合計が１．３℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、２．５℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。そして、３匹の体温上昇の合計が１．３℃より大きく２．５℃未満である場合にはさらに３匹による試験を追加し、計６匹の体温上昇の合計が３．０℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、４．２℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。その際の温度上昇の合計が３．０℃より大きく４．２℃未満である場合には、さらに３匹による試験を追加し、計９匹の体温上昇が５．０℃未満であれば発熱性物質陰性とし、５．０℃以上であれば発熱性物質陽性とする。
【０００５】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することによりカンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
【０００６】
ところで、カブトガニの血球抽出物（以下、「ＡＬ :Amoebocyte lysate」ともいう。
）の中には、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＡＬとエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンとが反応する際には、それらの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＡＬの特性を用いて、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能である。近年、このことを利用して、エンドトキシンなどの検出または濃度測定にＡＬを用いる方法が考案されている。
【０００７】
このエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの、ＡＬによって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定を行う方法としては、所定生理活性物質の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）をすべき試料とＡＬを元に製造された試薬（ＡＬ試薬）とを混和した混和液を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無によりゲル化したかど
うかを判定し、試料に一定濃度以上のエンドトキシンが含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。
【０００８】
あるいは、所定生理活性物質の測定をすべき試料とＡＬとを混和した混和液を３７℃が維持された状態で静置し、ＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法がある。この比濁法においては、測定開始後、透過率がある一定値以下に低下した時点をゲル化時間とする。定量は，ゲル化時間が検体中のエンドトキシン量と相関があることを利用する。すなわち、予め既知量のエンドトキシンが混入している複数の標準試料を測定して作成した検量線と、測定によって得られたゲル化時間とから、検体中のエンドトキシン量を算出する。
【０００９】
上記の比濁法によって所定生理活性物質の測定を行う場合には、乾熱滅菌処理されたガラス製測定セルに測定試料とＡＬとの混和液を生成させる。そして、混和液を静置してそのゲル化を外部から光学的に測定する。これに対し、ＡＬ試薬と混和した検体を攪拌しながら上記比濁法で測定する攪拌比濁法もある。この攪拌比濁法では、ガラス製測定セル内に入っている攪拌子を回転させることによって測定中も試料が攪拌される。そして、上記比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。攪拌比濁法では、測定中に試料を攪拌することによって上記の比濁法よりも迅速かつ安定に測定が可能である。
【００１０】
また、測定試料とＡＬと共に、表面にＡＬが結合した微粒子（以下、ＡＬ結合ビーズともいう。）を含んだ混和液を生成させ、上記攪拌比濁法で測定するＡＬ結合ビーズ法もある。このＡＬ結合ビーズ法では、試料とＡＬ及びＡＬ結合ビーズの反応によって生じるＡＬ結合ビーズの凝集に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する。このＡＬ結合ビーズ法においては、測定開始後、透過率がある一定値以上に上昇した時点をゲル化時間とする。そして、上記攪拌比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。ＡＬ結合ビーズ法は、上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速に測定をすることができる。これは主にＡＬ結合ビーズ法では、コアギュリンより１０から１００倍以上大きいＡＬ結合ビーズが凝集するため、透過率の変化が鋭敏となるためである。
【００１１】
さらに、測定試料とＡＬとの混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル微粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光の強度から、試料中の所定生理活性物質の存在を短時間で測定できるレーザー光散乱粒子計測法（以下、単に光散乱法ともいう。）も提案されている。試料とＡＬとの反応によってゲル粒子が生成され、反応が進行してそれらが互いに凝集すると、散乱光においてスパイク状のピーク信号が検出される。光散乱法においては、これらのピーク信号がある一定の頻度以上で検出した時点を凝集開始時間とする。上記ゲル化時間と同様、凝集開始時間は検体中のエンドトキシン量と相関があるので、これを利用して検量線法によって検体中のエンドトキシン量を算出する。
【００１２】
光散乱法でも，ガラス製試料セル内に入っている攪拌子を回転させることによって，測定中も試料が攪拌されるが、攪拌の目的が攪拌比濁法とは異なる。上記ピーク信号は，ゲル粒子が検体に入射したレーザー光を横切ったときに検出される。ゲル粒子がレーザー光を横切ることができるように攪拌によってゲル粒子を移動させるのである。光散乱法は，上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速，高感度に測定をすることができる。これは主に光散乱法が、ゲル化の初期段階、すなわち、小さなゲル粒子が生成された時点でこれを検出することができることが要因である。
【００１３】
一方、試薬中に添加した凝固酵素に対する合成基質を予め入れておき、凝固酵素によって分解された合成基質が発色、あるいは、蛍光、さらには発光する現象を測定する方法が
あり、発色を利用した方法は比色法と呼ばれ、所定生理活性物質の重要な測定法の一つとして広く利用されている。比色法には、所定生理活性物質の濃度と、一定反応時間後における発色基の遊離量との間に相関関係があることを利用するエンドポイント−比色法や、所定生理活性物質の濃度と、混和液の収光度あるいは透過率がある一定の値に達するのに要する時間，または発色の経時変化率との間に相関関係があることを利用するカイネティック−比色法がある。
【００１４】
ここで、上記した攪拌比濁法や光散乱法のように、ガラス製試料セル内でＡＬ試薬と試料の混和液を攪拌子によって攪拌する場合、反応曲線（時間に対する透過率／吸光度（攪拌比濁法）、あるいはゲル粒子数（光散乱法））の形状が変化してしまい、測定によって得られるゲル化時間、あるいは凝集開始時間の精度が低下してしまうことが問題となっている（例えば、非特許文献１を参照。）。これらの問題を回避するため、各測定法では、ゲル化時間、あるいは凝集開始時間を決定するアルゴリズムに工夫をこらし，多少の反応曲線の変化が生じても，測定結果に影響が及ばないようにしている（例えば、特許文献１を参照。）。
【００１５】
しかしながら、特に希薄な血漿製剤中のエンドトキシンや注射用水そのものを測定する場合などでは、上記の回避策が完全に機能せず、誤った結果が得られる場合があった。攪拌によって反応曲線の形状が変化する原因が特定できておらず，直接的な対策がされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１０−２１６８７８号公報
【特許文献２】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献３】特開平１０−２９３１２９号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号パンフレット
【特許文献５】特開２００９−１５０７２３号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】高橋学、柴田繁啓、鈴木泰、小鹿雅博、松本尚也、小豆嶋立頼、稲田捷也、遠藤重厚、「エンドトキシン散乱測光法を用いたエンドトキシン測定法の臨床応用における課題」、エンドトキシン血症救命治療研究会誌、第１４巻、第１号ｐ．１１１−１１９、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的とするところは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する凝集あるいはゲル化を光学的に測定する、生物由来の生理活性物質の測定法において、より高い測定精度を得るための技術を提供することである。
【００１９】
より詳しくは、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、ＡＬ試薬と試料の混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＡＬ試薬と生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を混和液に添加すること
で、該混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することを最大の特徴とする。
【００２１】
より詳しくは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする。
【００２２】
ここで、混和液の攪拌によって試料とＡＬ試薬との反応曲線が変化する現象の原因が以下のものであることが明確になってきた。すなわち、生物由来の生理活性物質の含有量が非常に少ない試料を測定する場合は、攪拌によって、（１）ＡＬ試薬および/または試料
中に含まれる蛋白質同士が凝集し、あるいは、（２）攪拌に伴うずり応力（物理的刺激）によってプロクロッティング・エンザイムが切断・活性化され、クロッティング・エンザイムに変化し、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集物が生成されることが見出された。
【００２３】
この生物由来の生理活性物質に由来しない凝集は、攪拌比濁法及び光散乱法の両方の方法においてゲル粒子の発生と同様の信号として検出されてしまうため、反応曲線（タイムコース）の形状に影響を及ぼし、測定精度が低下し、誤計測をもたらす危険性があった。これに対し、発明者らの鋭意研究により、試料とＡＬ試薬の混和時に、予め熱処理した所定の蛋白質を添加することで上記の生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが見出された。さらに、この熱処理した所定の蛋白質を試料に添加しても、生物由来の生理活性物質に由来する凝集またはゲル化の測定に影響がないことが実験によって確認された。
【００２４】
本発明によれば、特に生物由来の生理活性物質の含有量の少ない試料とＡＬ試薬との混和液における凝集またはゲル化を攪拌しつつ測定する場合に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。その結果、生物由来の生理活性物質の測定における精度を向上させることができる。
【００２５】
また、本発明においては、前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種としてもよい。これらの蛋白質は、試料とＡＬ試薬の混和時に添加されることにより、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが確認されているため、より確実に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。なお、本発明に用いることのできる蛋白質として、例えば、ヒト血漿中に存在する蛋白質、動植物、あるいは昆虫の蛋白質など多数種類を用いることができると考えられる。説明の都合上、本文書ではアルブミンを中心に記述することにする。
【００２６】
また、本発明においては、前記予め熱処理を施した所定の蛋白質がアルブミンの場合は、前記混和液に添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下としてもよい。これによって、より効果的に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。なお、上記最終濃度は、望ましくは、０．０３％以上５％以下がよい。さらに望ましくは、０．０５％以上０．５％以下がよい。
【００２７】
また、本発明においては、所定の蛋白質に予め施す熱処理の温度は７０℃以上が望まし
い。また、上記熱処理の時間は１０分以上が望ましい。また、所定の蛋白質に予め施す熱処理としては、オートクレーブ滅菌処理を行ってもよいし、アルミブロックヒーターなどの機器を用いた加熱処理を行ってもよい。これらの熱処理によって、熱処理を施さない蛋白質を添加した場合よりも、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化をより確実に抑制することができる。
【００２８】
なお、上記オートクレーブ滅菌処理の温度は一般に１２０℃以上である。この温度範囲とすることで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。より詳しくは、オートクレーブ滅菌処理の温度は１２０℃以上３００℃以下が望ましく、１２０℃以上２６０℃以下がより望ましい。
【００２９】
また、上記オートクレーブ滅菌処理で熱処理を行った場合、熱処理の時間は１０分以上とするとよい。この時間範囲とすることで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。より詳しくは、１０分以上１２０分以下とすることが望ましい。この時間範囲とすることで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができるとともに、蛋白質を汚染している生物由来の生理活性物質をより確実に不活化することができる。
【００３０】
また、アルミブロックヒーターを用いて、１２０℃よりも低温の９５℃での加熱を施した場合でも、１０分以上加熱することで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制する効果が確認されている。従って、アルミブロックヒーターを用いて加熱処理を行った場合、熱処理の温度は、９５℃以上とするとよい。より詳しくは９５℃以上２６０℃以下としてもよい。また、加熱処理における加熱時間は１０分以上とするとよい。より詳しくは１０分以上１２０分以下としてもよい。以上のような熱処理条件を採用することで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００３１】
しかしながら本発明においては、より効果的に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる蛋白質濃度や加熱温度、加熱時間であれば上記の条件にはこだわらない。例えば、９０℃３時間等という条件で、より低い温度であっても長い時間オートクレーブ滅菌処理を行うことで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制するとともに、蛋白質を汚染している生物由来の生理活性物質を充分に失活させることが可能である。
【００３２】
また、本発明においては、前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであってもよい。
【００３３】
そうすれば、最も代表的な発熱性物質であるエンドトキシンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入り、副作用が惹起されることを抑制できる。同様に、β−Ｄ−グルカンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、カンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングをより正確に行なうことが可能となる。
【００３４】
また、本発明は、カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、予め熱処理を施した所定の蛋白質が添加され、前記混和液における前記生理
活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬であってもよい。また、その場合は、前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種としてもよい。
【００３５】
また、本発明は、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を前記混和液に添加する蛋白質添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置であってもよい。
【００３６】
この装置によれば、試料とＡＬ試薬との混和液を攪拌する際に、自動的に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を前記混和液に添加することができ、より簡単に、該混和液における前記生理活性物質に由来しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００３７】
この装置においても、蛋白質添加手段によって添加される蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種としてもよい。また、添加される蛋白質がアルブミンの場合は、混和液に添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下とするとよい。また、添加される蛋白質に予め施す熱処理として、例えばオートクレーブ滅菌処理を行ってもよい。その場合、オートクレーブ滅菌処理の温度は１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間は１０分以上としてもよい。また、添加される蛋白質に予め施す熱処理として、例えばアルミブロックヒーターなどの機器を用いた加熱処理を行ってもよい。その場合、熱処理の温度は、９５℃以上とするとよい。また、加熱処理における加熱時間は１０分以上とするとよい。さらに、生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンとしてもよい。
【００３８】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明にあっては、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施例１における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図２】従来の、試料中のエンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係と、検量線とを示すグラフである。
【図３】試料とＡＬ試薬との混和液に添加するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の濃度と、ゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図４】ＨＳＡを添加した場合と、ＨＳＡ未添加の場合の検量線及び相関係数を示す図である。
【図５】攪拌回転数とゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例１における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図７】本発明の実施例２における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の実施例２における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図９】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
＜実施例１＞
ＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程（以下、リムルス反応ともいう。）はよく調べられている。すなわち、図９に示すように、エンドトキシンがＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となり、活性型Ｃ因子はＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００４２】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００４３】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＡＬを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
【００４４】
エンドトキシンならびにβ―Ｄ−グルカンを定量するための試薬としては、カブトガニの血球抽出物（ＡＬ:Amoebocyte lysate）を原料としたリムルス試薬、ならびに、リムルス試薬に凝固酵素により加水分解され着色強度、蛍光強度、または化学発光強度のいずれかが増加する合成基質を添加した試薬が使用される。また、リムルス試薬中のＣ因子の組換え体（リコンビナントＣ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などが使用される場合もある。さらに、リムルス試薬中のＧ因子の組換え体（リコンビナントＧ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などを使用することも可能である。
【００４５】
エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの所定生理活性物質とＡＬとの反応に起因して変化する物理量は、試薬の種類に応じて選択すればよい。試料の光透過率または、濁度、散乱光強度、光散乱粒子数、吸光度、蛍光強度、化学発光強度などの光学的な物理量の変化を検出するか、試料のゲル化に伴う試料の粘性、電気伝導度などの物理量の変化を検出すればよい。これらの物理量の検出には、濁度計、吸光光度計、光散乱光度計、レーザー光散乱粒子計測計、蛍光光度計、フォトンカウンターなどの光学機器、ならびに、これらを応用した専用の測定装置を使用することができる。また、粘度計、電気伝導率計やこれらを応用した専用の測定装置を使用しても構わない。
【００４６】
所定生理活性物質を定量する測定法としては前述のように攪拌比濁法ならびに光散乱法が挙げられる。図９に示すように、これらの測定法はＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子の数として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００４７】
次に、本実施例において散乱光を取得するために使用した光散乱粒子計測装置について説明する。なお、以下の説明においては、所定生理活性物質としてエンドトキシンを例にとって説明するが、以下の説明はβ−Ｄ−グルカンなど他の生理活性物質にも適用可能である。図１には、本実施例におけるエンドトキシンの測定装置としての光散乱粒子計測装置１の概略構成を示す。光散乱粒子計測装置１に使用される光源２にはレーザー光源が用いられているが、他に、超高輝度ＬＥＤなどを用いてもよい。光源２から照射された光は、入射光学系３で絞られ、試料セル４に入射する。この試料セル４にはエンドトキシンの測定をすべき試料とＡＬ試薬の混和液が保持されている。試料セル４に入射した光は、混和液中の粒子（コアギュロゲンモノマー、ならびに、コアギュロゲンオリゴマーなどの測定対象）で散乱される。
【００４８】
試料セル４の、入射光軸の側方には出射光学系５が配置されている。また、出射光学系５の光軸の延長上には、試料セル４内の混和液中の粒子で散乱され出射光学系５で絞られた散乱光を受光し電気信号に変換する受光素子６が配置されている。受光素子６には、受光素子６で光電変換された電気信号を増幅する増幅回路７、増幅回路７によって増幅された電気信号からノイズを除去するためのフィルタ８、ノイズが除去された後の電気信号のピーク数からゲル粒子数を演算し、さらにゲル化検出時間を判定してエンドトキシンの濃度を導出する演算装置９及び、結果を表示する表示器１０が電気的に接続されている。
【００４９】
また、試料セル４には、外部から電磁力を及ぼすことで回転し、試料としての混和液を攪拌する攪拌子１１が備えられており、試料セル４の外部には、攪拌器１２が備えられている。これらにより、攪拌の有無及び攪拌速度の調整が可能となっている。
【００５０】
ここで、試料セル４は本実施例の混和液保持手段に相当する。光源２及び入射光学系３は光入射手段に相当する。攪拌子１１及び攪拌器１２は攪拌手段に相当する。出射光学系５及び受光素子６は受光手段に相当する。演算装置９は判定手段及び導出手段に相当する。
【００５１】
上記の光散乱粒子計測装置１においては、リムルス反応の最終段階であるコアギュリンゲル粒子の出現時間（ゲル化検出時間＝ゲル化時間）を測定し、エンドトキシン濃度とゲル化検出時間の間に成立する検量関係を用いて検体中のエンドトキシン濃度を算出する。例えば、０．０１、０．００１及び０．０００１ＥＵ／ｍＬ（１ＥＵ／ｍＬ≒１００〜２００ｐｇ／ｍＬ）のエンドトキシン溶液を測定したときのゲル化検出時間は（ＡＬ試薬の種類やロットによるが）２０〜３０、４０〜６０及び８０〜１５０分程度となり、両対数グラフ上で直線の検量線が得られる。
【００５２】
しかしながら、実際には図２に示すように、０．０００１ＥＵ／ｍＬよりもさらに低濃度に調製したエンドトキシン溶液または注射用水を測定した場合にも、８０〜１５０分程度でゲル化が検出され、低濃度の領域において測定結果が検量線から外れる傾向があった。従って、上記の検量線を用いてそのまま判定を行うと、エンドトキシン濃度の測定値は本来の濃度よりも高めとなり、偽陽性判定が生じるおそれがあった。なお、図２の測定に用いたＡＬ試薬はＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（和光純薬製）である。
【００５３】
これは、（１）攪拌子１１及び攪拌器１２による攪拌の刺激によって蛋白質が変性し不
溶性の凝集体が生成する、（２）攪拌の刺激によって凝固酵素が活性化しコアギュリンゲルが生成する、といったエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）の生成に起因することが発明者らの検討によって明らかになってきた。従って、０．０００１ＥＵ／ｍＬ以下の低濃度のエンドトキシンを正確に測定し、偽陽性判定を防止するには、上記のエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する必要がある。
【００５４】
これに対し、発明者らの鋭意研究により、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加によってエンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが分かった。本実施例においては、エンドトキシンフリーのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（オートクレーブ滅菌済み）であるエンドトキシン検出用抽出液（Ｗａｋｏ２９３−５１６０１：和光純薬製）を使用し、これによるエンドトキシンに由来しない凝集の抑制効果を調べた。また、本測定においてもＡＬ試薬としてはＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（和光純薬製）を用いた。なお、上記においてオートクレーブ滅菌処理は、予め行われる熱処理に相当する。
【００５５】
上記測定の結果を図３に示す。図３の横軸は混和液中のＨＳＡ濃度であり、縦軸はゲル化検出時間である。図３から分かるように、ＨＳＡが含まれる場合は、ＨＳＡが含まれない場合と比較してゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。そして、特にＨＳＡの濃度が０．１２５％〜０．２５％であるときに、ゲル化検出時間が顕著に遅くなった。これにより、ＨＳＡを適量、例えばＨＳＡ濃度が０．０１５％以上１０％以下となるように添加すれば、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが示唆された。
【００５６】
上記のように、ＨＳＡを混和液に添加することによりエンドトキシンに由来しない凝集が抑制されることが認められたことを受け、ＨＳＡが添加された状態でエンドトキシン溶液のゲル化検出時間を測定し、検量線を作成した。ＨＳＡを添加した場合と、ＨＳＡ未添加の場合の検量線を図４に示す。図４（ａ）はＨＳＡを添加した場合の検量線、図４（ｂ）ＨＳＡを未添加の場合の検量線を示す。なお、本測定においてもＡＬ試薬としてはＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（和光純薬製）を用いた。また、図４（ａ）における測定では、ＡＬ試薬に、各濃度のエンドトキシン溶液２００μＬとともに、エンドトキシン検出用抽出液（Ｗａｋｏ２９３−５１６０１：和光純薬製）を１０μＬ添加し、混和液中のＨＳＡ濃度を０．２４％とした。
【００５７】
図４より判るように、まず、ＨＳＡを添加した場合にはエンドトキシン濃度が０．０１〜０．０００１ＥＵ／ｍＬの範囲で、ＨＳＡ添加時のゲル化検出時間が未添加時より遅くなることはなかった。これは、ＨＳＡがリムルス反応を阻害することはないことを示している。また、ＨＳＡを添加した場合は、１〜０．００００１ＥＵ／ｍＬの範囲で相関係数０．９９２という、良好な直線性を有する検量線を得ることができた。これは、ＨＳＡ添加によりエンドトキシンに由来しない凝集が抑制された効果と考えられる。なお、上記においてはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（オートクレーブ滅菌済み）をエンドトキシン検出用抽出液として使用し、これによるエンドトキシンに由来しない凝集の抑制効果を調べたが、治療用のヒト血清アルブミン製剤（アルブミナー、ＣＳＬベーリング社）を加熱することによっても同様の効果が確認された。また、グロブリンあるいはリゾチウムは、アルブミンと類似した特性を有する蛋白質であるので、これらを使用した場合にも、上記と同様の効果があると考えられる。
【００５８】
次に、上記のエンドトキシンに由来しない凝集が、攪拌子１１及び攪拌器１２による混和液の攪拌によって引き起こされていると考えられることから、混和液に対する攪拌の回転数を低減することを検討した。通常１０００ｒｐｍの攪拌回転数を６００〜１２００ｒｐｍの間で変化させつつ注射用水のゲル化検出時間の測定を行った。測定結果を図５に示す。図５において横軸は攪拌子１１の攪拌回転数である。また、縦軸はゲル化検出時間である。図から判るように、攪拌子１１の攪拌回転数を変えてもゲル化検出時間が有意に遅
くなることはなかった。これにより、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制する策として、攪拌回転数の低減は効果が期待できないことが判った。
【００５９】
上記の実施例においては、本発明を、光散乱粒子計測装置１を用いた光散乱法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用した例について説明したが、本発明が適用されるのは、光散乱法による場合だけでないことはもちろんである。例えば、攪拌比濁法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用してもよい。以下に、攪拌比濁法に用いられる比濁計測装置について説明する。
【００６０】
図６には、本実施例のエンドトキシンの測定装置の別の例としての比濁計測装置２１の概略構成を示す。この比濁計測装置２１では、攪拌比濁法によってエンドトキシンの測定を行う。比濁計測装置２１においても、調製した希釈系列のエンドトキシンを含んだ試料を混和液保持手段としての測定用ガラス容器（以下、キュベット）２２に移注する。キュベット２２の周囲を囲うように保温器２５が設けられている。この保温器２５の内部には図示しない電熱線が備えられており、この電熱線に通電されることにより、キュベット２２を約３７℃に保温するようになっている。このキュベット２２の中にはステンレス製の攪拌子２３が備えられている。この攪拌子２３は、キュベット２２の下部に設置された攪拌器２４の作用によってキュベット２２の中で回転する。すなわち、攪拌器２４はモータ２４ａとモータ２４ａの出力軸に設けられた永久磁石２４ｂとからなっている。そして、モータ２４ａに通電されることで永久磁石２４ｂが回転する。この永久磁石２４ｂからの磁界が回転するために、ステンレス製の攪拌子２３が回転磁界の作用で回転する。この攪拌子２３と攪拌器２４とは攪拌手段に相当する。
【００６１】
なお、比濁計測装置２１には光入射手段としての光源２６と受光手段としての受光素子２９が設置されている。光源２６から出射した光はアパーチャ２７を通過した後、保温器２５に設けられた入射孔２５ａを通過してキュベット２２中の試料に入射される。キュベット２２中の試料を透過した光は保温器２５に設けられた出射孔２５ｂから出射され、アパーチャ２８を通過して受光素子２９に照射される。受光素子２９では、受光した光の強度に応じた光電信号を出力する。この光電信号の出力は、判定手段及び導出手段としての演算装置３０に入力される。演算装置３０においては、予め格納されたプログラム（アルゴリズム）に従い、反応開始時刻の判定及び、エンドトキシン濃度の導出が行われる。なお、この他に導出されたエンドトキシン濃度を表示する表示装置を含めて比濁計測装置２１としてもよい。
【００６２】
なお、表１には、試料とＡＬ試薬の混和液に、非加熱のＨＳＡを添加した場合と、オートクレーブ滅菌処理（１２０℃、１５〜１２０分）にて予め熱処理を施したＨＳＡを添加した場合のゲル化検出時間を示す。なお、混和液中のＨＳＡ濃度は、いずれの場合も０．２５％である。表１より判るように、予め熱処理を施したＨＳＡを添加した方が、非加熱のＨＳＡを添加した場合よりも、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。これによって、予め熱処理を施したＨＳＡを添加することで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化をより確実に抑制できることが示された。
【００６３】
【表１】
【００６４】
また、表２には、試料とＡＬ試薬の混和液に、非加熱のヒト血清アルブミン製剤（アルブミナー）を添加した場合と、アルミブロックヒーターによる加熱処理（９５℃、５〜３
０分）にて予め熱処理を施したアルブミナーを添加した場合のゲル化検出時間を示す。この場合も、混和液中のアルブミン濃度は、いずれの場合も０．２５％である。表２より判るように、この場合も、予め熱処理を施したアルブミナーを添加した方が、非加熱のアルブミナーを添加した場合よりも、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。これによって、予め熱処理を施したアルブミナーを添加することで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化をより確実に抑制できることが示された。
【００６５】
【表２】
【００６６】
＜実施例２＞
上記の実施例１においては、一般的な光散乱粒子計測装置１及び、比濁計測装置２１を用いて、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＨＳＡを添加する例について説明したが、本発明を実施するために、試料とＡＬ試薬の混和液に対して自動的にＨＳＡを添加する特別な光散乱粒子計測装置及び、比濁計測装置を用いることとしてもよい。
【００６７】
図７には、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＨＳＡなどの蛋白質を自動的に添加する蛋白質添加装置１３を備えた光散乱粒子計測装置３１について示す。図１で説明した光散乱粒子計測装置１との相違点は、蛋白質貯留部１３ａと、蛋白質添加管１３ｂを有している点である。この蛋白質貯留部１３ａには、測定に先立ち、熱処理されたＨＳＡ溶液を精密に測定された量だけ貯留しておく。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定位置にセットされた際に、図示しないスイッチがＯＮされ、例えば小型ポンプ１３ｃによって、蛋白質貯留部１３ａに空気圧が作用する。そして、蛋白質貯留部１３ａに貯留されたＨＳＡ溶液が、蛋白質添加管１３ｂを介してキュベット内に添加される。
【００６８】
本実施例によれば、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。上記の蛋白質添加装置１３は蛋白質添加手段に相当する。
【００６９】
なお、本実施例における蛋白質添加装置１３は、上記の構成によるものに限定されないことは当然である。例えば、精密に吐出量を制御可能な液体吐出装置によって、オートクレーブ滅菌処理されたＨＳＡ溶液を、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定位置にセットされた際に、吐出するようにしてもよい。あるいは、オートクレーブ滅菌処理されたＨＳＡ溶液を必要量吸い上げたスポイトをセットしておき、スポイトの可撓性のポンプ部を圧縮することで、ＨＳＡ溶液を、ガラス製試料セル４内の混和液に添加するようにしてもよい。
【００７０】
なお、熱処理されたＨＳＡ溶液を試料とＡＬ試薬の混和液に添加するタイミングは、攪拌子１１による攪拌が開始する前であることが望ましい。これによって、より確実に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制することができる。しかしながら、攪拌子１１による攪拌の開始と同時あるいは、攪拌が開始した後であっても、熱処理されたＨＳＡ溶液を試料とＡＬ試薬の混和液に添加することで、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制する効果は得ることができる。
【００７１】
図８には、同様に、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＨＳＡなどの蛋白質を自動的に添加する蛋白質添加装置３３を備えた比濁計測装置４１について示す。図６で説明した比濁計測装置２１との相違点は、シリンジ３３ａ、ピストン３３ｂ及びピストン押圧部３３ｃからなる蛋白質添加装置３３を有している点である。ここでは、シリンジ３３ａには、オ
ートクレーブ滅菌処理されたＨＳＡ溶液が必要量吸い上げられている。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液を保持するキュベット２２が測定位置にセットされた際に、図示しないスイッチがＯＮされ、ピストン押圧部３３ｃがピストン３３ｂを押圧し、シリンジ３３ａ内のＨＳＡ溶液が、キュベット２２内に添加される。このような比濁計測装置４１によっても、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。
【００７２】
なお、本実施例における蛋白質添加装置３３も、上記の構成によるものに限定されないことは当然であり、同等の機能を有するものであれば、いかなる装置を使用してもよい。
【符号の説明】
【００７３】
１・・・光散乱粒子計測装置
２・・・光源
３・・・入射光学系
４・・・試料セル
５・・・出射光学系
６・・・受光素子
７・・・増幅回路
８・・・ノイズ除去フィルタ
９・・・演算装置
１０・・・表示器
１１・・・攪拌子
１２・・・攪拌器
１３・・・蛋白質添加装置
２１・・・比濁計測装置
２２・・・ガラス容器（キュベット）
２３・・・攪拌子
２４・・・攪拌器
２４ａ・・・モータ
２４ｂ・・・磁石
２５・・・保温器
２５ａ・・・入射孔
２５ｂ・・・出射孔
２６・・・光源
２７・・・アパーチャ
２８・・・アパーチャ
２９・・・受光素子
３０・・・演算装置
３１・・・蛋白質添加装置を備えた光散乱粒子計測装置
３３・・・蛋白質添加装置
４１・・・蛋白質添加装置を備えた比濁計測装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなど、ＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料中の該生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。一方で、敗血症患者血液中のエンドトキシンを測定することにより、重篤なエンドトキシンショックの予防や治療に寄与することもある。
【０００３】
注射薬などのエンドトキシン汚染を検出するための半定量的試験法として、従前は以下のような方法がとられることがあった。すなわち、体重１．５ｋｇ以上の健康なウサギの耳静脈に、３７℃に加温した試料を注射し、注射後３時間まで３０分以下の間隔で体温を測定する。注射の４０分前から注射までの間に３０分間隔で２回測定したウサギの体温の平均値を対象体温とし、対象体温と最高体温との差を体温上昇とする。
【０００４】
３匹のウサギを用いて上記の体温上昇を測定し、３匹の体温上昇の合計によって次のような判定が行われる。まず、３匹の体温上昇の合計が１．３℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、２．５℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。そして、３匹の体温上昇の合計が１．３℃より大きく２．５℃未満である場合にはさらに３匹による試験を追加し、計６匹の体温上昇の合計が３．０℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、４．２℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。その際の温度上昇の合計が３．０℃より大きく４．２℃未満である場合には、さらに３匹による試験を追加し、計９匹の体温上昇が５．０℃未満であれば発熱性物質陰性とし、５．０℃以上であれば発熱性物質陽性とする。
【０００５】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することによりカンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
【０００６】
ところで、カブトガニの血球抽出物（以下、「ＡＬ :Amoebocyte lysate」ともいう。
）の中には、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＡＬとエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンとが反応する際には、それらの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＡＬの特性を用いて、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能である。近年、このことを利用して、エンドトキシンなどの検出または濃度測定にＡＬを用いる方法が考案されている。
【０００７】
このエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの、ＡＬによって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定を行う方法としては、所定生理活性物質の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）をすべき試料とＡＬを元に製造された試薬（ＡＬ試薬）とを混和した混和液を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無によりゲル化したかど
うかを判定し、試料に一定濃度以上のエンドトキシンが含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。
【０００８】
あるいは、所定生理活性物質の測定をすべき試料とＡＬとを混和した混和液を３７℃が維持された状態で静置し、ＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法がある。この比濁法においては、測定開始後、透過率がある一定値以下に低下した時点をゲル化時間とする。定量は，ゲル化時間が検体中のエンドトキシン量と相関があることを利用する。すなわち、予め既知量のエンドトキシンが混入している複数の標準試料を測定して作成した検量線と、測定によって得られたゲル化時間とから、検体中のエンドトキシン量を算出する。
【０００９】
上記の比濁法によって所定生理活性物質の測定を行う場合には、乾熱滅菌処理されたガラス製測定セルに測定試料とＡＬとの混和液を生成させる。そして、混和液を静置してそのゲル化を外部から光学的に測定する。これに対し、ＡＬ試薬と混和した検体を攪拌しながら上記比濁法で測定する攪拌比濁法もある。この攪拌比濁法では、ガラス製測定セル内に入っている攪拌子を回転させることによって測定中も試料が攪拌される。そして、上記比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。攪拌比濁法では、測定中に試料を攪拌することによって上記の比濁法よりも迅速かつ安定に測定が可能である。
【００１０】
また、測定試料とＡＬと共に、表面にＡＬが結合した微粒子（以下、ＡＬ結合ビーズともいう。）を含んだ混和液を生成させ、上記攪拌比濁法で測定するＡＬ結合ビーズ法もある。このＡＬ結合ビーズ法では、試料とＡＬ及びＡＬ結合ビーズの反応によって生じるＡＬ結合ビーズの凝集に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する。このＡＬ結合ビーズ法においては、測定開始後、透過率がある一定値以上に上昇した時点をゲル化時間とする。そして、上記攪拌比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。ＡＬ結合ビーズ法は、上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速に測定をすることができる。これは主にＡＬ結合ビーズ法では、コアギュリンより１０から１００倍以上大きいＡＬ結合ビーズが凝集するため、透過率の変化が鋭敏となるためである。
【００１１】
さらに、測定試料とＡＬとの混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル微粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光の強度から、試料中の所定生理活性物質の存在を短時間で測定できるレーザー光散乱粒子計測法（以下、単に光散乱法ともいう。）も提案されている。試料とＡＬとの反応によってゲル粒子が生成され、反応が進行してそれらが互いに凝集すると、散乱光においてスパイク状のピーク信号が検出される。光散乱法においては、これらのピーク信号がある一定の頻度以上で検出した時点を凝集開始時間とする。上記ゲル化時間と同様、凝集開始時間は検体中のエンドトキシン量と相関があるので、これを利用して検量線法によって検体中のエンドトキシン量を算出する。
【００１２】
光散乱法でも，ガラス製試料セル内に入っている攪拌子を回転させることによって，測定中も試料が攪拌されるが、攪拌の目的が攪拌比濁法とは異なる。上記ピーク信号は，ゲル粒子が検体に入射したレーザー光を横切ったときに検出される。ゲル粒子がレーザー光を横切ることができるように攪拌によってゲル粒子を移動させるのである。光散乱法は，上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速，高感度に測定をすることができる。これは主に光散乱法が、ゲル化の初期段階、すなわち、小さなゲル粒子が生成された時点でこれを検出することができることが要因である。
【００１３】
一方、試薬中に添加した凝固酵素に対する合成基質を予め入れておき、凝固酵素によって分解された合成基質が発色、あるいは、蛍光、さらには発光する現象を測定する方法が
あり、発色を利用した方法は比色法と呼ばれ、所定生理活性物質の重要な測定法の一つとして広く利用されている。比色法には、所定生理活性物質の濃度と、一定反応時間後における発色基の遊離量との間に相関関係があることを利用するエンドポイント−比色法や、所定生理活性物質の濃度と、混和液の収光度あるいは透過率がある一定の値に達するのに要する時間，または発色の経時変化率との間に相関関係があることを利用するカイネティック−比色法がある。
【００１４】
ここで、上記した攪拌比濁法や光散乱法のように、ガラス製試料セル内でＡＬ試薬と試料の混和液を攪拌子によって攪拌する場合、反応曲線（時間に対する透過率／吸光度（攪拌比濁法）、あるいはゲル粒子数（光散乱法））の形状が変化してしまい、測定によって得られるゲル化時間、あるいは凝集開始時間の精度が低下してしまうことが問題となっている（例えば、非特許文献１を参照。）。これらの問題を回避するため、各測定法では、ゲル化時間、あるいは凝集開始時間を決定するアルゴリズムに工夫をこらし，多少の反応曲線の変化が生じても，測定結果に影響が及ばないようにしている（例えば、特許文献１を参照。）。
【００１５】
しかしながら、特に希薄な血漿製剤中のエンドトキシンや注射用水そのものを測定する場合などでは、上記の回避策が完全に機能せず、誤った結果が得られる場合があった。攪拌によって反応曲線の形状が変化する原因が特定できておらず，直接的な対策がされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１０−２１６８７８号公報
【特許文献２】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献３】特開平１０−２９３１２９号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号パンフレット
【特許文献５】特開２００９−１５０７２３号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】高橋学、柴田繁啓、鈴木泰、小鹿雅博、松本尚也、小豆嶋立頼、稲田捷也、遠藤重厚、「エンドトキシン散乱測光法を用いたエンドトキシン測定法の臨床応用における課題」、エンドトキシン血症救命治療研究会誌、第１４巻、第１号ｐ．１１１−１１９、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的とするところは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する凝集あるいはゲル化を光学的に測定する、生物由来の生理活性物質の測定法において、より高い測定精度を得るための技術を提供することである。
【００１９】
より詳しくは、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、ＡＬ試薬と試料の混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＡＬ試薬と生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を混和液に添加すること
で、該混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することを最大の特徴とする。
【００２１】
より詳しくは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする。
【００２２】
ここで、混和液の攪拌によって試料とＡＬ試薬との反応曲線が変化する現象の原因が以下のものであることが明確になってきた。すなわち、生物由来の生理活性物質の含有量が非常に少ない試料を測定する場合は、攪拌によって、（１）ＡＬ試薬および/または試料
中に含まれる蛋白質同士が凝集し、あるいは、（２）攪拌に伴うずり応力（物理的刺激）によってプロクロッティング・エンザイムが切断・活性化され、クロッティング・エンザイムに変化し、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集物が生成されることが見出された。
【００２３】
この生物由来の生理活性物質に由来しない凝集は、攪拌比濁法及び光散乱法の両方の方法においてゲル粒子の発生と同様の信号として検出されてしまうため、反応曲線（タイムコース）の形状に影響を及ぼし、測定精度が低下し、誤計測をもたらす危険性があった。これに対し、発明者らの鋭意研究により、試料とＡＬ試薬の混和時に、予め熱処理した所定の蛋白質を添加することで上記の生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが見出された。さらに、この熱処理した所定の蛋白質を試料に添加しても、生物由来の生理活性物質に由来する凝集またはゲル化の測定に影響がないことが実験によって確認された。
【００２４】
本発明によれば、特に生物由来の生理活性物質の含有量の少ない試料とＡＬ試薬との混和液における凝集またはゲル化を攪拌しつつ測定する場合に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。その結果、生物由来の生理活性物質の測定における精度を向上させることができる。
【００２５】
また、本発明においては、前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種としてもよい。これらの蛋白質は、試料とＡＬ試薬の混和時に添加されることにより、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが確認されているため、より確実に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。なお、本発明に用いることのできる蛋白質として、例えば、ヒト血漿中に存在する蛋白質、動植物、あるいは昆虫の蛋白質など多数種類を用いることができると考えられる。説明の都合上、本文書ではアルブミンを中心に記述することにする。
【００２６】
また、本発明においては、前記予め熱処理を施した所定の蛋白質がアルブミンの場合は、前記混和液に添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下としてもよい。これによって、より効果的に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。なお、上記最終濃度は、望ましくは、０．０３％以上５％以下がよい。さらに望ましくは、０．０５％以上０．５％以下がよい。
【００２７】
また、本発明においては、所定の蛋白質に予め施す熱処理の温度は７０℃以上が望まし
い。また、上記熱処理の時間は１０分以上が望ましい。また、所定の蛋白質に予め施す熱処理としては、オートクレーブ滅菌処理を行ってもよいし、アルミブロックヒーターなどの機器を用いた加熱処理を行ってもよい。これらの熱処理によって、熱処理を施さない蛋白質を添加した場合よりも、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化をより確実に抑制することができる。
【００２８】
なお、上記オートクレーブ滅菌処理の温度は一般に１２０℃以上である。この温度範囲とすることで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。より詳しくは、オートクレーブ滅菌処理の温度は１２０℃以上３００℃以下が望ましく、１２０℃以上２６０℃以下がより望ましい。
【００２９】
また、上記オートクレーブ滅菌処理で熱処理を行った場合、熱処理の時間は１０分以上とするとよい。この時間範囲とすることで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。より詳しくは、１０分以上１２０分以下とすることが望ましい。この時間範囲とすることで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができるとともに、蛋白質を汚染している生物由来の生理活性物質をより確実に不活化することができる。
【００３０】
また、アルミブロックヒーターを用いて、１２０℃よりも低温の９５℃での加熱を施した場合でも、１０分以上加熱することで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制する効果が確認されている。従って、アルミブロックヒーターを用いて加熱処理を行った場合、熱処理の温度は、９５℃以上とするとよい。より詳しくは９５℃以上２６０℃以下としてもよい。また、加熱処理における加熱時間は１０分以上とするとよい。より詳しくは１０分以上１２０分以下としてもよい。以上のような熱処理条件を採用することで、より確実に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００３１】
しかしながら本発明においては、より効果的に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる蛋白質濃度や加熱温度、加熱時間であれば上記の条件にはこだわらない。例えば、９０℃３時間等という条件で、より低い温度であっても長い時間オートクレーブ滅菌処理を行うことで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制するとともに、蛋白質を汚染している生物由来の生理活性物質を充分に失活させることが可能である。
【００３２】
また、本発明においては、前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであってもよい。
【００３３】
そうすれば、最も代表的な発熱性物質であるエンドトキシンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入り、副作用が惹起されることを抑制できる。同様に、β−Ｄ−グルカンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、カンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングをより正確に行なうことが可能となる。
【００３４】
また、本発明は、カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、予め熱処理を施した所定の蛋白質が添加され、前記混和液における前記生理
活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬であってもよい。また、その場合は、前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種としてもよい。
【００３５】
また、本発明は、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を前記混和液に添加する蛋白質添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置であってもよい。
【００３６】
この装置によれば、試料とＡＬ試薬との混和液を攪拌する際に、自動的に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を前記混和液に添加することができ、より簡単に、該混和液における前記生理活性物質に由来しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００３７】
この装置においても、蛋白質添加手段によって添加される蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種としてもよい。また、添加される蛋白質がアルブミンの場合は、混和液に添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下とするとよい。また、添加される蛋白質に予め施す熱処理として、例えばオートクレーブ滅菌処理を行ってもよい。その場合、オートクレーブ滅菌処理の温度は１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間は１０分以上としてもよい。また、添加される蛋白質に予め施す熱処理として、例えばアルミブロックヒーターなどの機器を用いた加熱処理を行ってもよい。その場合、熱処理の温度は、９５℃以上とするとよい。また、加熱処理における加熱時間は１０分以上とするとよい。さらに、生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンとしてもよい。
【００３８】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明にあっては、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施例１における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図２】従来の、試料中のエンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係と、検量線とを示すグラフである。
【図３】試料とＡＬ試薬との混和液に添加するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の濃度と、ゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図４】ＨＳＡを添加した場合と、ＨＳＡ未添加の場合の検量線及び相関係数を示す図である。
【図５】攪拌回転数とゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例１における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図７】本発明の実施例２における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の実施例２における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図９】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
＜実施例１＞
ＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程（以下、リムルス反応ともいう。）はよく調べられている。すなわち、図９に示すように、エンドトキシンがＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となり、活性型Ｃ因子はＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００４２】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００４３】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＡＬを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
【００４４】
エンドトキシンならびにβ―Ｄ−グルカンを定量するための試薬としては、カブトガニの血球抽出物（ＡＬ:Amoebocyte lysate）を原料としたリムルス試薬、ならびに、リムルス試薬に凝固酵素により加水分解され着色強度、蛍光強度、または化学発光強度のいずれかが増加する合成基質を添加した試薬が使用される。また、リムルス試薬中のＣ因子の組換え体（リコンビナントＣ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などが使用される場合もある。さらに、リムルス試薬中のＧ因子の組換え体（リコンビナントＧ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などを使用することも可能である。
【００４５】
エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの所定生理活性物質とＡＬとの反応に起因して変化する物理量は、試薬の種類に応じて選択すればよい。試料の光透過率または、濁度、散乱光強度、光散乱粒子数、吸光度、蛍光強度、化学発光強度などの光学的な物理量の変化を検出するか、試料のゲル化に伴う試料の粘性、電気伝導度などの物理量の変化を検出すればよい。これらの物理量の検出には、濁度計、吸光光度計、光散乱光度計、レーザー光散乱粒子計測計、蛍光光度計、フォトンカウンターなどの光学機器、ならびに、これらを応用した専用の測定装置を使用することができる。また、粘度計、電気伝導率計やこれらを応用した専用の測定装置を使用しても構わない。
【００４６】
所定生理活性物質を定量する測定法としては前述のように攪拌比濁法ならびに光散乱法が挙げられる。図９に示すように、これらの測定法はＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子の数として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００４７】
次に、本実施例において散乱光を取得するために使用した光散乱粒子計測装置について説明する。なお、以下の説明においては、所定生理活性物質としてエンドトキシンを例にとって説明するが、以下の説明はβ−Ｄ−グルカンなど他の生理活性物質にも適用可能である。図１には、本実施例におけるエンドトキシンの測定装置としての光散乱粒子計測装置１の概略構成を示す。光散乱粒子計測装置１に使用される光源２にはレーザー光源が用いられているが、他に、超高輝度ＬＥＤなどを用いてもよい。光源２から照射された光は、入射光学系３で絞られ、試料セル４に入射する。この試料セル４にはエンドトキシンの測定をすべき試料とＡＬ試薬の混和液が保持されている。試料セル４に入射した光は、混和液中の粒子（コアギュロゲンモノマー、ならびに、コアギュロゲンオリゴマーなどの測定対象）で散乱される。
【００４８】
試料セル４の、入射光軸の側方には出射光学系５が配置されている。また、出射光学系５の光軸の延長上には、試料セル４内の混和液中の粒子で散乱され出射光学系５で絞られた散乱光を受光し電気信号に変換する受光素子６が配置されている。受光素子６には、受光素子６で光電変換された電気信号を増幅する増幅回路７、増幅回路７によって増幅された電気信号からノイズを除去するためのフィルタ８、ノイズが除去された後の電気信号のピーク数からゲル粒子数を演算し、さらにゲル化検出時間を判定してエンドトキシンの濃度を導出する演算装置９及び、結果を表示する表示器１０が電気的に接続されている。
【００４９】
また、試料セル４には、外部から電磁力を及ぼすことで回転し、試料としての混和液を攪拌する攪拌子１１が備えられており、試料セル４の外部には、攪拌器１２が備えられている。これらにより、攪拌の有無及び攪拌速度の調整が可能となっている。
【００５０】
ここで、試料セル４は本実施例の混和液保持手段に相当する。光源２及び入射光学系３は光入射手段に相当する。攪拌子１１及び攪拌器１２は攪拌手段に相当する。出射光学系５及び受光素子６は受光手段に相当する。演算装置９は判定手段及び導出手段に相当する。
【００５１】
上記の光散乱粒子計測装置１においては、リムルス反応の最終段階であるコアギュリンゲル粒子の出現時間（ゲル化検出時間＝ゲル化時間）を測定し、エンドトキシン濃度とゲル化検出時間の間に成立する検量関係を用いて検体中のエンドトキシン濃度を算出する。例えば、０．０１、０．００１及び０．０００１ＥＵ／ｍＬ（１ＥＵ／ｍＬ≒１００〜２００ｐｇ／ｍＬ）のエンドトキシン溶液を測定したときのゲル化検出時間は（ＡＬ試薬の種類やロットによるが）２０〜３０、４０〜６０及び８０〜１５０分程度となり、両対数グラフ上で直線の検量線が得られる。
【００５２】
しかしながら、実際には図２に示すように、０．０００１ＥＵ／ｍＬよりもさらに低濃度に調製したエンドトキシン溶液または注射用水を測定した場合にも、８０〜１５０分程度でゲル化が検出され、低濃度の領域において測定結果が検量線から外れる傾向があった。従って、上記の検量線を用いてそのまま判定を行うと、エンドトキシン濃度の測定値は本来の濃度よりも高めとなり、偽陽性判定が生じるおそれがあった。なお、図２の測定に用いたＡＬ試薬はＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（和光純薬製）である。
【００５３】
これは、（１）攪拌子１１及び攪拌器１２による攪拌の刺激によって蛋白質が変性し不
溶性の凝集体が生成する、（２）攪拌の刺激によって凝固酵素が活性化しコアギュリンゲルが生成する、といったエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）の生成に起因することが発明者らの検討によって明らかになってきた。従って、０．０００１ＥＵ／ｍＬ以下の低濃度のエンドトキシンを正確に測定し、偽陽性判定を防止するには、上記のエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する必要がある。
【００５４】
これに対し、発明者らの鋭意研究により、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加によってエンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが分かった。本実施例においては、エンドトキシンフリーのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（オートクレーブ滅菌済み）であるエンドトキシン検出用抽出液（Ｗａｋｏ２９３−５１６０１：和光純薬製）を使用し、これによるエンドトキシンに由来しない凝集の抑制効果を調べた。また、本測定においてもＡＬ試薬としてはＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（和光純薬製）を用いた。なお、上記においてオートクレーブ滅菌処理は、予め行われる熱処理に相当する。
【００５５】
上記測定の結果を図３に示す。図３の横軸は混和液中のＨＳＡ濃度であり、縦軸はゲル化検出時間である。図３から分かるように、ＨＳＡが含まれる場合は、ＨＳＡが含まれない場合と比較してゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。そして、特にＨＳＡの濃度が０．１２５％〜０．２５％であるときに、ゲル化検出時間が顕著に遅くなった。これにより、ＨＳＡを適量、例えばＨＳＡ濃度が０．０１５％以上１０％以下となるように添加すれば、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが示唆された。
【００５６】
上記のように、ＨＳＡを混和液に添加することによりエンドトキシンに由来しない凝集が抑制されることが認められたことを受け、ＨＳＡが添加された状態でエンドトキシン溶液のゲル化検出時間を測定し、検量線を作成した。ＨＳＡを添加した場合と、ＨＳＡ未添加の場合の検量線を図４に示す。図４（ａ）はＨＳＡを添加した場合の検量線、図４（ｂ）ＨＳＡを未添加の場合の検量線を示す。なお、本測定においてもＡＬ試薬としてはＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（和光純薬製）を用いた。また、図４（ａ）における測定では、ＡＬ試薬に、各濃度のエンドトキシン溶液２００μＬとともに、エンドトキシン検出用抽出液（Ｗａｋｏ２９３−５１６０１：和光純薬製）を１０μＬ添加し、混和液中のＨＳＡ濃度を０．２４％とした。
【００５７】
図４より判るように、まず、ＨＳＡを添加した場合にはエンドトキシン濃度が０．０１〜０．０００１ＥＵ／ｍＬの範囲で、ＨＳＡ添加時のゲル化検出時間が未添加時より遅くなることはなかった。これは、ＨＳＡがリムルス反応を阻害することはないことを示している。また、ＨＳＡを添加した場合は、１〜０．００００１ＥＵ／ｍＬの範囲で相関係数０．９９２という、良好な直線性を有する検量線を得ることができた。これは、ＨＳＡ添加によりエンドトキシンに由来しない凝集が抑制された効果と考えられる。なお、上記においてはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（オートクレーブ滅菌済み）をエンドトキシン検出用抽出液として使用し、これによるエンドトキシンに由来しない凝集の抑制効果を調べたが、治療用のヒト血清アルブミン製剤（アルブミナー、ＣＳＬベーリング社）を加熱することによっても同様の効果が確認された。また、グロブリンあるいはリゾチウムは、アルブミンと類似した特性を有する蛋白質であるので、これらを使用した場合にも、上記と同様の効果があると考えられる。
【００５８】
次に、上記のエンドトキシンに由来しない凝集が、攪拌子１１及び攪拌器１２による混和液の攪拌によって引き起こされていると考えられることから、混和液に対する攪拌の回転数を低減することを検討した。通常１０００ｒｐｍの攪拌回転数を６００〜１２００ｒｐｍの間で変化させつつ注射用水のゲル化検出時間の測定を行った。測定結果を図５に示す。図５において横軸は攪拌子１１の攪拌回転数である。また、縦軸はゲル化検出時間である。図から判るように、攪拌子１１の攪拌回転数を変えてもゲル化検出時間が有意に遅
くなることはなかった。これにより、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制する策として、攪拌回転数の低減は効果が期待できないことが判った。
【００５９】
上記の実施例においては、本発明を、光散乱粒子計測装置１を用いた光散乱法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用した例について説明したが、本発明が適用されるのは、光散乱法による場合だけでないことはもちろんである。例えば、攪拌比濁法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用してもよい。以下に、攪拌比濁法に用いられる比濁計測装置について説明する。
【００６０】
図６には、本実施例のエンドトキシンの測定装置の別の例としての比濁計測装置２１の概略構成を示す。この比濁計測装置２１では、攪拌比濁法によってエンドトキシンの測定を行う。比濁計測装置２１においても、調製した希釈系列のエンドトキシンを含んだ試料を混和液保持手段としての測定用ガラス容器（以下、キュベット）２２に移注する。キュベット２２の周囲を囲うように保温器２５が設けられている。この保温器２５の内部には図示しない電熱線が備えられており、この電熱線に通電されることにより、キュベット２２を約３７℃に保温するようになっている。このキュベット２２の中にはステンレス製の攪拌子２３が備えられている。この攪拌子２３は、キュベット２２の下部に設置された攪拌器２４の作用によってキュベット２２の中で回転する。すなわち、攪拌器２４はモータ２４ａとモータ２４ａの出力軸に設けられた永久磁石２４ｂとからなっている。そして、モータ２４ａに通電されることで永久磁石２４ｂが回転する。この永久磁石２４ｂからの磁界が回転するために、ステンレス製の攪拌子２３が回転磁界の作用で回転する。この攪拌子２３と攪拌器２４とは攪拌手段に相当する。
【００６１】
なお、比濁計測装置２１には光入射手段としての光源２６と受光手段としての受光素子２９が設置されている。光源２６から出射した光はアパーチャ２７を通過した後、保温器２５に設けられた入射孔２５ａを通過してキュベット２２中の試料に入射される。キュベット２２中の試料を透過した光は保温器２５に設けられた出射孔２５ｂから出射され、アパーチャ２８を通過して受光素子２９に照射される。受光素子２９では、受光した光の強度に応じた光電信号を出力する。この光電信号の出力は、判定手段及び導出手段としての演算装置３０に入力される。演算装置３０においては、予め格納されたプログラム（アルゴリズム）に従い、反応開始時刻の判定及び、エンドトキシン濃度の導出が行われる。なお、この他に導出されたエンドトキシン濃度を表示する表示装置を含めて比濁計測装置２１としてもよい。
【００６２】
なお、表１には、試料とＡＬ試薬の混和液に、非加熱のＨＳＡを添加した場合と、オートクレーブ滅菌処理（１２０℃、１５〜１２０分）にて予め熱処理を施したＨＳＡを添加した場合のゲル化検出時間を示す。なお、混和液中のＨＳＡ濃度は、いずれの場合も０．２５％である。表１より判るように、予め熱処理を施したＨＳＡを添加した方が、非加熱のＨＳＡを添加した場合よりも、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。これによって、予め熱処理を施したＨＳＡを添加することで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化をより確実に抑制できることが示された。
【００６３】
【表１】
【００６４】
また、表２には、試料とＡＬ試薬の混和液に、非加熱のヒト血清アルブミン製剤（アルブミナー）を添加した場合と、アルミブロックヒーターによる加熱処理（９５℃、５〜３
０分）にて予め熱処理を施したアルブミナーを添加した場合のゲル化検出時間を示す。この場合も、混和液中のアルブミン濃度は、いずれの場合も０．２５％である。表２より判るように、この場合も、予め熱処理を施したアルブミナーを添加した方が、非加熱のアルブミナーを添加した場合よりも、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。これによって、予め熱処理を施したアルブミナーを添加することで、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化をより確実に抑制できることが示された。
【００６５】
【表２】
【００６６】
＜実施例２＞
上記の実施例１においては、一般的な光散乱粒子計測装置１及び、比濁計測装置２１を用いて、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＨＳＡを添加する例について説明したが、本発明を実施するために、試料とＡＬ試薬の混和液に対して自動的にＨＳＡを添加する特別な光散乱粒子計測装置及び、比濁計測装置を用いることとしてもよい。
【００６７】
図７には、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＨＳＡなどの蛋白質を自動的に添加する蛋白質添加装置１３を備えた光散乱粒子計測装置３１について示す。図１で説明した光散乱粒子計測装置１との相違点は、蛋白質貯留部１３ａと、蛋白質添加管１３ｂを有している点である。この蛋白質貯留部１３ａには、測定に先立ち、熱処理されたＨＳＡ溶液を精密に測定された量だけ貯留しておく。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定位置にセットされた際に、図示しないスイッチがＯＮされ、例えば小型ポンプ１３ｃによって、蛋白質貯留部１３ａに空気圧が作用する。そして、蛋白質貯留部１３ａに貯留されたＨＳＡ溶液が、蛋白質添加管１３ｂを介してキュベット内に添加される。
【００６８】
本実施例によれば、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。上記の蛋白質添加装置１３は蛋白質添加手段に相当する。
【００６９】
なお、本実施例における蛋白質添加装置１３は、上記の構成によるものに限定されないことは当然である。例えば、精密に吐出量を制御可能な液体吐出装置によって、オートクレーブ滅菌処理されたＨＳＡ溶液を、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定位置にセットされた際に、吐出するようにしてもよい。あるいは、オートクレーブ滅菌処理されたＨＳＡ溶液を必要量吸い上げたスポイトをセットしておき、スポイトの可撓性のポンプ部を圧縮することで、ＨＳＡ溶液を、ガラス製試料セル４内の混和液に添加するようにしてもよい。
【００７０】
なお、熱処理されたＨＳＡ溶液を試料とＡＬ試薬の混和液に添加するタイミングは、攪拌子１１による攪拌が開始する前であることが望ましい。これによって、より確実に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制することができる。しかしながら、攪拌子１１による攪拌の開始と同時あるいは、攪拌が開始した後であっても、熱処理されたＨＳＡ溶液を試料とＡＬ試薬の混和液に添加することで、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制する効果は得ることができる。
【００７１】
図８には、同様に、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＨＳＡなどの蛋白質を自動的に添加する蛋白質添加装置３３を備えた比濁計測装置４１について示す。図６で説明した比濁計測装置２１との相違点は、シリンジ３３ａ、ピストン３３ｂ及びピストン押圧部３３ｃからなる蛋白質添加装置３３を有している点である。ここでは、シリンジ３３ａには、オ
ートクレーブ滅菌処理されたＨＳＡ溶液が必要量吸い上げられている。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液を保持するキュベット２２が測定位置にセットされた際に、図示しないスイッチがＯＮされ、ピストン押圧部３３ｃがピストン３３ｂを押圧し、シリンジ３３ａ内のＨＳＡ溶液が、キュベット２２内に添加される。このような比濁計測装置４１によっても、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。
【００７２】
なお、本実施例における蛋白質添加装置３３も、上記の構成によるものに限定されないことは当然であり、同等の機能を有するものであれば、いかなる装置を使用してもよい。
【符号の説明】
【００７３】
１・・・光散乱粒子計測装置
２・・・光源
３・・・入射光学系
４・・・試料セル
５・・・出射光学系
６・・・受光素子
７・・・増幅回路
８・・・ノイズ除去フィルタ
９・・・演算装置
１０・・・表示器
１１・・・攪拌子
１２・・・攪拌器
１３・・・蛋白質添加装置
２１・・・比濁計測装置
２２・・・ガラス容器（キュベット）
２３・・・攪拌子
２４・・・攪拌器
２４ａ・・・モータ
２４ｂ・・・磁石
２５・・・保温器
２５ａ・・・入射孔
２５ｂ・・・出射孔
２６・・・光源
２７・・・アパーチャ
２８・・・アパーチャ
２９・・・受光素子
３０・・・演算装置
３１・・・蛋白質添加装置を備えた光散乱粒子計測装置
３３・・・蛋白質添加装置
４１・・・蛋白質添加装置を備えた比濁計測装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項２】
前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種であることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項３】
前記予め熱処理を施した所定の蛋白質はアルブミンであり、
前記混和液に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項４】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理温度が９５℃以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項５】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項６】
前記熱処理は、オートクレーブ滅菌処理であり、該オートクレーブ滅菌処理の処理温度が１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項７】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項８】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、
予め熱処理を施した所定の蛋白質が添加され、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項９】
前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種であることを特徴とする請求項８に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１０】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理温度が９５℃以上であることを特徴とする請求項８または９に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１１】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理時間が１０分以上であることを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１２】
前記熱処理は、オートクレーブ滅菌処理であり、該オートクレーブ滅菌処理の処理温度が１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間が１０分以上であることを特徴とする請求項８または９に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１３】
所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を前記混和液に添加する蛋白質添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１４】
前記蛋白質添加手段によって添加される蛋白質は、アルブミン、グロブリン，リゾチウムのうちの少なくとも一種であることを特徴とする請求項１３に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１５】
前記蛋白質添加手段によって添加される蛋白質は、アルブミンであり、前記蛋白質添加手段によって、前記混和液に予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１６】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理温度が９５℃以上であることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１７】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１８】
前記熱処理は、オートクレーブ滅菌処理であり、該オートクレーブ滅菌処理の処理温度が１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１９】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１３から１８のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項２】
前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種であることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項３】
前記予め熱処理を施した所定の蛋白質はアルブミンであり、
前記混和液に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項４】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理温度が９５℃以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項５】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項６】
前記熱処理は、オートクレーブ滅菌処理であり、該オートクレーブ滅菌処理の処理温度が１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項７】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項８】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、
予め熱処理を施した所定の蛋白質が添加され、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項９】
前記予め熱処理を施した所定の蛋白質は、アルブミン、グロブリン、リゾチウムのうちの少なくとも一種であることを特徴とする請求項８に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１０】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理温度が９５℃以上であることを特徴とする請求項８または９に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１１】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理時間が１０分以上であることを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１２】
前記熱処理は、オートクレーブ滅菌処理であり、該オートクレーブ滅菌処理の処理温度が１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間が１０分以上であることを特徴とする請求項８または９に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項１３】
所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、予め熱処理を施した所定の蛋白質を前記混和液に添加する蛋白質添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１４】
前記蛋白質添加手段によって添加される蛋白質は、アルブミン、グロブリン，リゾチウムのうちの少なくとも一種であることを特徴とする請求項１３に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１５】
前記蛋白質添加手段によって添加される蛋白質は、アルブミンであり、前記蛋白質添加手段によって、前記混和液に予め熱処理を施した所定の蛋白質を添加する際の最終濃度は、０．０１５％以上１０％以下であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１６】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理温度が９５℃以上であることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１７】
前記熱処理は、加熱処理であり、その処理時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１８】
前記熱処理は、オートクレーブ滅菌処理であり、該オートクレーブ滅菌処理の処理温度が１２０℃以上で、オートクレーブ滅菌処理の時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１９】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１３から１８のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１５４８１５（Ｐ２０１２−１５４８１５Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４５７４（Ｐ２０１１−１４５７４）
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【出願人】（５０７１４８４５６）学校法人 岩手医科大学 (19)
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【出願人】（５０７１４８４５６）学校法人 岩手医科大学 (19)
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
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