生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置
【課題】攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させる。
【解決手段】ＡＬと生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集を検出する際に、所定の界面活性剤を混和液に添加することで、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因しない蛋白質の凝集またはゲル化を抑制する。
【解決手段】ＡＬと生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集を検出する際に、所定の界面活性剤を混和液に添加することで、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因しない蛋白質の凝集またはゲル化を抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなど、ＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料中の該生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。一方で、敗血症患者血液中のエンドトキシンを測定することにより、重篤なエンドトキシンショックの予防や治療に寄与することもある。
【０００３】
注射薬などのエンドトキシン汚染を検出するための半定量的試験法として、従前は以下のような方法がとられることがあった。すなわち、体重１．５ｋｇ以上の健康なウサギの耳静脈に、３７℃に加温した試料を注射し、注射後３時間まで３０分以下の間隔で体温を測定する。注射の４０分前から注射までの間に３０分間隔で２回測定したウサギの体温の平均値を対象体温とし、対象体温と最高体温との差を体温上昇とする。
【０００４】
３匹のウサギを用いて上記の体温上昇を測定し、３匹の体温上昇の合計によって次のような判定が行われる。まず、３匹の体温上昇の合計が１．３℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、２．５℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。そして、３匹の体温上昇の合計が１．３℃より大きく２．５℃未満である場合にはさらに３匹による試験を追加し、計６匹の体温上昇の合計が３．０℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、４．２℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。その際の温度上昇の合計が３．０℃より大きく４．２℃未満である場合には、さらに３匹による試験を追加し、計９匹の体温上昇が５．０℃未満であれば発熱性物質陰性とし、５．０℃以上であれば発熱性物質陽性とする。
【０００５】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することによりカンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
【０００６】
ところで、カブトガニの血球抽出物（以下、「ＡＬ :Amoebocyte lysate」ともいう。
）の中には、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＡＬとエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンとが反応する際には、それらの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＡＬの特性を用いて、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能である。近年、このことを利用して、エンドトキシンなどの検出または濃度測定にＡＬを用いる方法が考案されている。
【０００７】
このエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの、ＡＬによって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定を行う方法としては、所定生理活性物質の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）をすべき試料とＡＬを元に製造された試薬（ＡＬ試薬）とを混和した混和液を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無によりゲル化したかど
うかを判定し、試料に一定濃度以上のエンドトキシンが含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。
【０００８】
あるいは、所定生理活性物質の測定をすべき試料とＡＬとを混和した混和液を３７℃が維持された状態で静置し、ＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法がある。この比濁法においては、測定開始後、透過率がある一定値以下に低下した時点をゲル化時間とする。定量は，ゲル化時間が検体中のエンドトキシン量と相関があることを利用する。すなわち、予め既知量のエンドトキシンが混入している複数の標準試料を測定して作成した検量線と、測定によって得られたゲル化時間とから、検体中のエンドトキシン量を算出する。
【０００９】
上記の比濁法によって所定生理活性物質の測定を行う場合には、乾熱滅菌処理されたガラス製測定セルに測定試料とＡＬとの混和液を生成させる。そして、混和液を静置してそのゲル化を外部から光学的に測定する。これに対し、ＡＬ試薬と混和した検体を攪拌しながら上記比濁法で測定する攪拌比濁法もある。この攪拌比濁法では、ガラス製測定セル内に入っている攪拌子を回転させることによって測定中も試料が攪拌される。そして、上記比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。攪拌比濁法では、測定中に試料を攪拌することによって上記の比濁法よりも迅速かつ安定に測定が可能である。
【００１０】
また、測定試料とＡＬと共に、表面にＡＬが結合した微粒子（以下、ＡＬ結合ビーズともいう。）を含んだ混和液を生成させ、上記攪拌比濁法で測定するＡＬ結合ビーズ法もある。このＡＬ結合ビーズ法では、試料とＡＬ及びＡＬ結合ビーズの反応によって生じるＡＬ結合ビーズの凝集に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する。このＡＬ結合ビーズ法においては、測定開始後、透過率がある一定値以上に上昇した時点をゲル化時間とする。そして、上記攪拌比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。ＡＬ結合ビーズ法は、上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速に測定をすることができる。これは主にＡＬ結合ビーズ法では、コアギュリンより１０から１００倍以上大きいＡＬ結合ビーズが凝集するため、透過率の変化が鋭敏となるためである。
【００１１】
さらに、測定試料とＡＬとの混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル微粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光の強度から、試料中の所定生理活性物質の存在を短時間で測定できるレーザー光散乱粒子計測法（以下、単に光散乱法ともいう。）も提案されている。試料とＡＬとの反応によってゲル粒子が生成され、反応が進行してそれらが互いに凝集すると、散乱光においてスパイク状のピーク信号が検出される。光散乱法においては、これらのピーク信号がある一定の頻度以上で検出した時点を凝集開始時間とする。上記ゲル化時間と同様、凝集開始時間は検体中のエンドトキシン量と相関があるので、これを利用して検量線法によって検体中のエンドトキシン量を算出する。
【００１２】
光散乱法でも、ガラス製試料セル内に入っている攪拌子を回転させることによって、測定中も試料が攪拌されるが、攪拌の目的が攪拌比濁法とは異なる。上記ピーク信号は、ゲル粒子が検体に入射したレーザー光を横切ったときに検出される。ゲル粒子がレーザー光を横切ることができるように攪拌によってゲル粒子を移動させるのである。光散乱法は，上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速、高感度に測定をすることができる。これは主に光散乱法が、ゲル化の初期段階、すなわち、小さなゲル粒子が生成された時点でこれを検出することができることが要因である。
【００１３】
一方、試薬中に添加した凝固酵素に対する合成基質を予め入れておき、凝固酵素によって分解された合成基質が発色、あるいは、蛍光、さらには発光する現象を測定する方法が
あり、発色を利用した方法は比色法と呼ばれ、所定生理活性物質の重要な測定法の一つとして広く利用されている。比色法には、所定生理活性物質の濃度と、一定反応時間後における発色基の遊離量との間に相関関係があることを利用するエンドポイント−比色法や、所定生理活性物質の濃度と、混和液の収光度あるいは透過率がある一定の値に達するのに要する時間，または発色の経時変化率との間に相関関係があることを利用するカイネティック−比色法がある。
【００１４】
ここで、上記した攪拌比濁法や光散乱法のように、ガラス製試料セル内でＡＬ試薬と試料の混和液を攪拌子によって攪拌する場合、反応曲線（時間に対する透過率／吸光度（攪拌比濁法）、あるいはゲル粒子数（光散乱法））の形状が変化してしまい、測定によって得られるゲル化時間、あるいは凝集開始時間の精度が低下してしまうことが問題となっている（例えば、非特許文献１を参照。）。これらの問題を回避するため、各測定法では、ゲル化時間、あるいは凝集開始時間を決定するアルゴリズムに工夫をこらし，多少の反応曲線の変化が生じても，測定結果に影響が及ばないようにしている（例えば、特許文献１を参照。）。また、ＡＬ試薬と試料の混和液に熱処理済みアルブミンを添加することでエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する方法もある。これは主に、攪拌の刺激による凝固酵素の活性化を、熱処理済みアルブミンが抑制することを利用している。
【００１５】
しかしながら、特に希薄な血漿製剤中のエンドトキシンや注射用水そのものを、ＡＬ試薬の種類やメーカーおよびロットが異なる様々な条件で測定する場合などでは、上記の回避策が充分に機能しない場合があった。これは、攪拌によって反応曲線の形状が変化する原因が、攪拌刺激による凝固酵素の活性化だけではなく多岐に渡ることに起因すると考えられており、さらなる対策が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１０−２１６８７８号公報
【特許文献２】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献３】特開平１０−２９３１２９号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号パンフレット
【特許文献５】特開２００９−１５０７２３号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】高橋学、柴田繁啓、鈴木泰、小鹿雅博、松本尚也、小豆嶋立頼、稲田捷也、遠藤重厚、「エンドトキシン散乱測光法を用いたエンドトキシン測定法の臨床応用における課題」、エンドトキシン血症救命治療研究会誌、第１４巻、第１号ｐ．１１１−１１９、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的とするところは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する凝集あるいはゲル化を光学的に測定する、生物由来の生理活性物質の測定法において、より高い測定精度を得るための技術を提供することである。
【００１９】
より詳しくは、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、ＡＬ試薬と試料の混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＡＬ試薬と生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出する際に、界面活性剤を混和液に添加することで、該混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することを最大の特徴とする。
【００２１】
より詳しくは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、所定の界面活性剤を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする。
【００２２】
ここで、混和液の攪拌によって試料とＡＬ試薬との反応曲線が変化する現象の原因が以下のものであることが明確になってきた。すなわち、生物由来の生理活性物質の含有量が非常に少ない試料を測定する場合は、攪拌によって、（１）ＡＬ試薬および/または試料
中に含まれる蛋白質同士が凝集し、あるいは、（２）攪拌に伴うずり応力（物理的刺激）によってプロクロッティング・エンザイムが切断・活性化され、クロッティング・エンザイムに変化し、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集物が生成されることが見出された。
【００２３】
この生物由来の生理活性物質に由来しない凝集は、攪拌比濁法及び光散乱法の両方の方法においてゲル粒子の発生と同様の信号として検出されてしまうため、反応曲線（タイムコース）の形状に影響を及ぼし、測定精度が低下し、誤計測をもたらす危険性があった。これに対し、発明者らの鋭意研究により、試料とＡＬ試薬の混和時に、界面活性剤を添加することで上記の生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが見出された。特に、この界面活性剤の添加により、ＡＬ試薬および/または試
料中に含まれる蛋白質同士の凝集を抑制できることが見出された。さらに、この界面活性剤を試料に添加しても、生物由来の生理活性物質に由来する凝集またはゲル化の測定に影響がないことが実験によって確認された。
【００２４】
本発明によれば、特に生物由来の生理活性物質の含有量の少ない試料とＡＬ試薬との混和液における凝集またはゲル化を攪拌しつつ測定する場合に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。特に、界面活性剤によってＡＬ試薬および/または試料中に含まれる蛋白質同士の凝集を抑制できることから
、熱処理済みアルブミンでは効果が期待できない場合でも、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。その結果、生物由来の生理活性物質の測定における精度を向上させることができる。
【００２５】
また、本発明においては、前記界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムでもよい。また、非イオン系界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレ
ン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでもよい。また、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤でもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドでもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩でもよい。これらの界面活性剤は、試料とＡＬ試薬の混和時に添加されることにより、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが確認されているため、より確実に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００２６】
また、本発明においては、前記混和液に、所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下としてもよい。これによって、より効果的に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。なお、上記最終濃度は、望ましくは、０．０００５％以上５％以下がよい。さらに望ましくは、０．００５％以上０．５％以下がよい。
【００２７】
なお、本発明においては、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制するために、本発明である界面活性剤の添加と合わせて、熱処理済みアルブミンの添加を併用してもよい。
【００２８】
また、本発明においては、前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであってもよい。
【００２９】
そうすれば、最も代表的な発熱性物質であるエンドトキシンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入り、副作用が惹起されることを抑制できる。同様に、β−Ｄ−グルカンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングをより正確に行なうことが可能となる。
【００３０】
また、本発明は、カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、所定の界面活性剤が添加され、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬であってもよい。また、その場合は、前記所定の界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムでもよい。また、非イオン系界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでもよい。また、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤でもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドでもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩でもよい。
【００３１】
また、本発明は、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、所定の界面活性剤を前記混和液に添加する界面活性剤添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置であってもよい。
【００３２】
この装置によれば、試料とＡＬ試薬との混和液を攪拌する際に、自動的に、所定の界面活性剤を前記混和液に添加することができ、より簡単に、該混和液における前記生理活性物質に由来しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００３３】
この装置においても、界面活性剤添加手段によって添加される界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムでもよい。また、非イオン系界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでもよい。また、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤でもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドでもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩でもよい。また、混和液に、所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下とするとよい。望ましくは、０．０００５％以上５％以下がよい。さらに望ましくは、０．００５％以上０．５％以下がよい。さらに、生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンとしてもよい。
【００３４】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明にあっては、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【図２】本発明の実施例１における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図３】従来（界面活性剤未添加）のＡＬ試薬を用いた場合の、試料中のエンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係と、検量線とを示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１においてＴｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例１における試料とＡＬ試薬との混和液に添加するＴｗｅｅｎ２０の濃度と、ゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例１においてＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例１における試料とＡＬ試薬の混和液に添加するＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００の濃度と、ゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例１においてＴｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、試料中のエンドトキシン濃度とゲルが検出時間との関係と、検量線とを示すグラフである。
【図９】ＡＰＢ、Ｔｗｅｅｎ２０及び、ＡＰＢとＴｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図１０】ＡＰＢ及び、Ｔｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例１における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図１２】本発明の実施例２における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図１３】本発明の実施例２における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
＜実施例１＞
ＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程（以下、リムルス反応ともいう。）はよく調べられている。すなわち、図１に示すように、エンドトキシンがＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となり、活性型Ｃ因子はＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００３８】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００３９】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＡＬを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
【００４０】
エンドトキシンならびにβ―Ｄ−グルカンを定量するための試薬としては、カブトガニの血球抽出物（ＡＬ:Amoebocyte lysate）を原料としたリムルス試薬、ならびに、リムルス試薬に凝固酵素により加水分解され着色強度、蛍光強度、または化学発光強度のいずれかが増加する合成基質を添加した試薬が使用される。また、リムルス試薬中のＣ因子の組換え体（リコンビナントＣ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などが使用される場合もある。さらに、リムルス試薬中のＧ因子の組換え体（リコンビナントＧ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などを使用することも可能である。
【００４１】
エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの所定生理活性物質とＡＬとの反応に起因して変化する物理量は、試薬の種類に応じて選択すればよい。試料の光透過率または、濁度、散乱光強度、光散乱粒子数、吸光度、蛍光強度、化学発光強度などの光学的な物理量の変化を検出するか、試料のゲル化に伴う試料の粘性、電気伝導度などの物理量の変化を検出すればよい。これらの物理量の検出には、濁度計、吸光光度計、光散乱光度計、レーザー光散乱粒子計測計、蛍光光度計、フォトンカウンターなどの光学機器、ならびに、これらを応用した専用の測定装置を使用することができる。また、粘度計、電気伝導率計やこれらを応用した専用の測定装置を使用しても構わない。
【００４２】
所定生理活性物質を定量する測定法としては前述のように攪拌比濁法ならびに光散乱法が挙げられる。図１に示すように、これらの測定法はＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子の数として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００４３】
次に、本実施例において散乱光を取得するために使用した光散乱粒子計測装置について説明する。なお、以下の説明においては、所定生理活性物質としてエンドトキシンを例にとって説明するが、以下の説明はβ−Ｄ−グルカンなど他の生理活性物質にも適用可能である。図２には、本実施例におけるエンドトキシンの測定装置としての光散乱粒子計測装置１の概略構成を示す。光散乱粒子計測装置１に使用される光源２にはレーザー光源が用いられているが、他に、超高輝度ＬＥＤなどを用いてもよい。光源２から照射された光は、入射光学系３で絞られ、試料セル４に入射する。この試料セル４にはエンドトキシンの測定をすべき試料とＡＬ試薬の混和液が保持されている。試料セル４に入射した光は、混和液中の粒子（コアギュロゲンモノマー、ならびに、コアギュロゲンオリゴマーなどの測定対象）で散乱される。
【００４４】
試料セル４の、入射光軸の側方には出射光学系５が配置されている。また、出射光学系５の光軸の延長上には、試料セル４内の混和液中の粒子で散乱され出射光学系５で絞られた散乱光を受光し電気信号に変換する受光素子６が配置されている。受光素子６には、受光素子６で光電変換された電気信号を増幅する増幅回路７、増幅回路７によって増幅された電気信号からノイズを除去するためのフィルタ８、ノイズが除去された後の電気信号のピーク数からゲル粒子数を演算し、さらにゲル化検出時間を判定してエンドトキシンの濃度を導出する演算装置９及び、結果を表示する表示器１０が電気的に接続されている。
【００４５】
また、試料セル４には、外部から電磁力を及ぼすことで回転し、試料としての混和液を
攪拌する攪拌子１１が備えられており、試料セル４の外部には、攪拌器１２が備えられている。これらにより、攪拌の有無及び攪拌速度の調整が可能となっている。
【００４６】
ここで、試料セル４は本実施例の混和液保持手段に相当する。光源２及び入射光学系３は光入射手段に相当する。攪拌子１１及び攪拌器１２は攪拌手段に相当する。出射光学系５及び受光素子６は受光手段に相当する。演算装置９は判定手段及び導出手段に相当する。
【００４７】
上記の光散乱粒子計測装置１においては、リムルス反応の最終段階であるコアギュリンゲル粒子の出現時間（ゲル化検出時間＝ゲル化時間）を測定し、エンドトキシン濃度とゲル化検出時間の間に成立する検量関係を用いて検体中のエンドトキシン濃度を算出する。
【００４８】
図３に、エンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係及び検量線を示す。なお、図３においては、ＡＬ試薬１００μＬと１０〜０．０００１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを含む試料１００μＬを混和した混和液を測定に用いた。試料中のエンドトキシン濃度が１０〜０．０１ＥＵ／ｍＬのとき、試料中のエンドトキシン濃度が低い程、ゲル化検出時間が明確に長くなる検量関係を示したが、０．０１ＥＵ／ｍＬ以下では、エンドトキシン濃度によらず、ゲル化検出時間が１４〜３０分以内に観測された。結果として、０．０１ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシンを正確に測定することが困難であった。また検量線の直線性は、相関係数が０．９７４となり充分とは言えなかった。
【００４９】
これは、攪拌子１１及び攪拌器１２による攪拌の刺激によって蛋白質が変性し不溶性の凝集体が生成し、このエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）が生成したためである。従って、０．０１ＥＵ／ｍＬ以下の低濃度のエンドトキシンを正確に測定するには、上記のエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する必要がある。これに対し、発明者らの鋭意研究により、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤の添加によってエンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが分かった。本実施例においては、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を使用し、これによるエンドトキシンに由来しない凝集の抑制効果を調べた。なお、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００は、いずれもエンドトキシン含有量が少なく、そのまま用いることができたが、エンドトキシンを多く含む場合は予めオートクレーブ滅菌処理により、エンドトキシンを不活化させておけばよい。
【００５０】
上記の測定の結果を以下に説明する。ＡＬ試薬１００μＬとＴｗｅｅｎ２０（０％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％）１００μLを混和した混和液（すなわちＴｗ
ｅｅｎ２０の最終濃度は０％、０．０００５％、０．００５％、０．０５％、０．５％となる）を測定に供したときの反応曲線を図４に示す。図４の横軸は反応時間、縦軸はゲル粒子数である。Ｔｗｅｅｎ２０が０％（すなわち未添加）および０．０００５％のとき、ゲル粒子数は反応開始直後から時間の経過とともに急峻に増加し、８０分〜１００分程度をピークとして再び減少している。これは、反応直後から、攪拌子１１及び攪拌器１２による攪拌の刺激によって蛋白質が変性し不溶性の凝集体が生成し、このエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）を計測しているためと考えられる。
【００５１】
これに対し、Ｔｗｅｅｎ２０が０．００５％以上含まれるとき、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制され、測定されるゲル粒子数は安定的に増加していることが分かる。上記より、界面活性剤がＴｗｅｅｎまたは同等品であるときは、最終濃度が０．００５％以上０．５％以下であれば、確実に、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。エンドトキシンに由来しない凝集物の生成が、ＡＬ試薬の種類やメーカーおよびロットによって異なることを考慮すると、一般的には、界面活性剤が０．０００１％以上１０％以下であれば、程度の差はあるとしても、反応開始直後のゲル粒
子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。
【００５２】
次に、上記の測定の結果として得られたゲル化検出時間を図５に示す。Ｔｗｅｅｎ２０が０．００５％以上含まれるとき、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。これにより、Ｔｗｅｅｎ２０を適量添加すれば、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが示された。
【００５３】
同様に、Ｔｗｅｅｎ２０に代わって界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を用いたときの反応曲線を図６に示す。図６の横軸は反応時間、縦軸はゲル粒子数である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００が０％（すなわち未添加）および０．０００５％のとき、上記のエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）の生成により、ゲル粒子数は反応開始直後から時間の経過とともに急峻に増加した。これに対し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００が０．００５％以上含まれるとき、ゲル粒子数の反応開始直後の急峻な増加は抑制された。結果として得られたゲル化検出時間を図７に示す。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００が０．００５％以上含まれるとき、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。
【００５４】
これにより、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を適量添加することによっても、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが示された。上記より、界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ
Ｘまたは同等品であるときは、最終濃度が０．００５％以上０．５％以下であれば、確実に、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。エンドトキシンに由来しない凝集物の生成が、ＡＬ試薬の種類やメーカーおよびロットによって異なることを考慮すると、一般的には、界面活性剤が０．０００１％以上１０％以下であれば、程度の差はあるとしても、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。
【００５５】
上記のように、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００といった界面活性剤を混和液に添加することにより、エンドトキシンに由来しない凝集が抑制されることが認められたことを受け、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０１％含むＡＬ試薬を調製した。このＡＬ試薬１００μＬと１０〜０．０００１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを含む試料１００μＬを混和した混和液（すなわちＴｗｅｅｎ２０の終濃度は０．００５％）を測定に供した。得られたエンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係及び、検量線を図８に示す。
【００５６】
図３に示したＴｗｅｅｎ２０が未添加の場合の検量線と図８とを比較して判るように、まず、Ｔｗｅｅｎ２０を添加した場合には試料中のエンドトキシン濃度が１０〜０．０１ＥＵ／ｍＬの範囲で、Ｔｗｅｅｎ２０添加時のゲル化検出時間が未添加時より遅くなることはなかった。これは、Ｔｗｅｅｎ２０がリムルス反応を阻害することはないことを示している。また、Ｔｗｅｅｎ２０を添加した場合は、１０〜０．０００１ＥＵ／ｍＬの範囲で相関係数０．９９３という、良好な直線性を有する検量線を得ることができた。これは、Ｔｗｅｅｎ２０添加によりエンドトキシンに由来しない凝集が抑制された効果と考えられる。
【００５７】
さらに、Ｔｗｅｅｎがエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する作用機序を調べるため、安息香酸アミジノフェニル（以下、ＡＰＢと記すことがある）の添加実験を行った。ＡＰＢは、プロテアーゼ阻害剤の一つであり、リムルス反応の凝固酵素の活性を阻害する。別のＡＬ試薬を用い、ＡＬ試薬１００μＬと０．１ｍＭのＡＰＢ１００μＬを混和した混和液、および、ＡＬ試薬１００μＬと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を１００μＬ混和した混和液を測定に用いた場合の反応曲線を図９に示す。また、予め０．１ｍＭのＡＰＢを含むＡＬ試薬１００μＬと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を１００μＬ混和した混和液を測定に供したときの反応曲線も図９に示した。
【００５８】
図９から判るように、まず、ＡＰＢを未添加の場合は、測定開始初期から、エンドトキシンに由来しない粒子数の急峻な増加が観察された。図４および図６と比べて粒子数の増加の程度が大きいのは、ＡＬ試薬が異なるためである。また、ＡＰＢを添加した場合でも、上記のゲル粒子数の増加は抑制されることはなかった。これは、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の急峻な増加は、攪拌の刺激による凝固酵素の活性化によるものではなく、蛋白質同士が凝集して生成した凝集体を計測していることを示している。そして、Ｔｗｅｅｎ２０のみ、および、ＡＰＢとＴｗｅｅｎ２０の両方を添加した場合では、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の単調な増加は著しく抑制された。すなわちＴｗｅｅｎ２０が、蛋白質同士の凝集に対して大きな抑制効果を発揮していることが示された。
【００５９】
また別のＡＬ試薬を用い、ＡＬ試薬１００μＬと０．１ｍＭのＡＰＢ１００μＬを混和した混和液、および、ＡＬ試薬１００μＬと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を１００μＬ混和した混和液を測定に用いた場合の反応曲線を図１０に示す。図１０から判るように、このＡＬ試薬を用いて、ＡＰＢを未添加の場合は、測定開始初期から粒子数の急峻な増加は観察されず、約１００分以降で、エンドトキシンに由来しない粒子数の増加が観察された。図４、図６および図９と比べて粒子数の増加の仕方が異なるのは、ＡＬ試薬が異なるためである。そして、ＡＰＢを添加した場合、上記のゲル粒子数の増加は明確に抑制された。これは、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の増加は、攪拌の刺激による凝固酵素の活性化によるものであることを示している。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ２０を添加しても、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の増加は抑制されなかった。すなわちＴｗｅｅｎ２０は、熱処理済みアルブミンとは異なり、攪拌刺激による凝固酵素の活性化に対しては抑制効果を有していないことが示された。
【００６０】
このようにＴｗｅｅｎは、主に攪拌の刺激による凝固酵素の活性化を抑制すると考えられている熱処理済みアルブミンとは作用機序が異なり、攪拌の刺激による蛋白質同士の凝集を抑制する。従って、熱処理済みアルブミンでは効果が期待できないようなＡＬ試薬に対してもエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する効果が期待できる。また、Ｔｗｅｅｎは、天然物のアルブミンとは異なり、化学的な合成が可能であるため、初期過程におけるエンドトキシンの混入を排除することが容易である。実際、Ｔｗｅｅｎはリムルス反応を阻害せず（図８）、Ｔｗｅｅｎの添加によりゲル化検出時間が遅くなったこと（図４および図５）は、本実施例で使用したＴｗｅｅｎのエンドトキシン含有量が十分に低いことを示している。
【００６１】
上記の実施例においては、本発明を、光散乱粒子計測装置１を用いた光散乱法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用した例について説明したが、本発明が適用されるのは、光散乱法による場合だけでないことはもちろんである。例えば、攪拌比濁法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用してもよい。以下に、攪拌比濁法に用いられる比濁計測装置について説明する。
【００６２】
図１１には、本実施例のエンドトキシンの測定装置の別の例としての比濁計測装置２１の概略構成を示す。この比濁計測装置２１では、攪拌比濁法によってエンドトキシンの測定を行う。比濁計測装置２１においても、調製した希釈系列のエンドトキシンを含んだ試料を混和液保持手段としての測定用ガラス容器（以下、キュベット）２２に移注する。キュベット２２の周囲を囲うように保温器２５が設けられている。この保温器２５の内部には図示しない電熱線が備えられており、この電熱線に通電されることにより、キュベット２２を約３７℃に保温するようになっている。このキュベット２２の中にはステンレス製の攪拌子２３が備えられている。この攪拌子２３は、キュベット２２の下部に設置された攪拌器２４の作用によってキュベット２２の中で回転する。すなわち、攪拌器２４はモータ２４ａとモータ２４ａの出力軸に設けられた永久磁石２４ｂとからなっている。そして
、モータ２４ａに通電されることで永久磁石２４ｂが回転する。この永久磁石２４ｂからの磁界が回転するために、ステンレス製の攪拌子２３が回転磁界の作用で回転する。この攪拌子２３と攪拌器２４とは攪拌手段に相当する。
【００６３】
なお、比濁計測装置２１には光入射手段としての光源２６と受光手段としての受光素子２９が設置されている。光源２６から出射した光はアパーチャ２７を通過した後、保温器２５に設けられた入射孔２５ａを通過してキュベット２２中の試料に入射される。キュベット２２中の試料を透過した光は保温器２５に設けられた出射孔２５ｂから出射され、アパーチャ２８を通過して受光素子２９に照射される。受光素子２９では、受光した光の強度に応じた光電信号を出力する。この光電信号の出力は、判定手段及び導出手段としての演算装置３０に入力される。演算装置３０においては、予め格納されたプログラム（アルゴリズム）に従い、反応開始時刻の判定及び、エンドトキシン濃度の導出が行われる。なお、この他に導出されたエンドトキシン濃度を表示する表示装置を含めて比濁計測装置２１としてもよい。
【００６４】
なお、上記の実施例では、混和液に添加する界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を用いる例について説明したが、界面活性剤としては、商品名が異なっていたとしてもポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、などを使用してもよい。また、他の非イオン系界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを用いても、同等の効果を期待することができる。また、界面活性剤であれば、非イオン系のものでなくとも蛋白質同士の凝集を抑制する効果が得られると考えられるので、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤を使用してもよい。また、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムを使用してもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドを使用してもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩を使用してもよい。また、上記した各種の界面活性剤を混合して使用してもよい。
【００６５】
＜実施例２＞
上記の実施例１においては、一般的な光散乱粒子計測装置１及び、比濁計測装置２１を用いて、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＴｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００などの界面活性剤を添加する例について説明したが、本発明を実施するために、試料とＡＬ試薬の混和液に対して自動的にＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を添加する
特別な光散乱粒子計測装置及び、比濁計測装置を用いることとしてもよい。
【００６６】
図１２には、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界
面活性剤を自動的に添加する界面活性剤添加装置１３を備えた光散乱粒子計測装置３１について示す。図２で説明した光散乱粒子計測装置１との相違点は、界面活性剤貯留部１３ａと、界面活性剤添加管１３ｂを有している点である。この界面活性剤貯留部１３ａには、測定に先立ち、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を精密に測定された量
だけ貯留しておく。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定位置にセットされた
際に、図示しないスイッチがＯＮされ、例えば小型ポンプ１３ｃによって、界面活性剤貯留部１３ａに空気圧が作用する。そして、界面活性剤貯留部１３ａに貯留されたＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤が、界面活性剤添加管１３ｂを介してキュベット
内に添加される。
【００６７】
本実施例によれば、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。上記の界面活性剤添加装置１３は界面活性剤添加手段に相当する。
【００６８】
なお、本実施例における界面活性剤添加装置１３は、上記の構成によるものに限定されないことは当然である。例えば、精密に吐出量を制御可能な液体吐出装置によって、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定
位置にセットされた際に、吐出するようにしてもよい。あるいは、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を必要量吸い上げたスポイト、あるいはピペットをセットして
おき、それらの可撓性のポンプ部を圧縮することで、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなど
の界面活性剤を、ガラス製試料セル４内の混和液に添加するようにしてもよい。
【００６９】
なお、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を試料とＡＬ試薬の混和液に添
加するタイミングは、攪拌子１１による攪拌が開始する前であることが望ましい。これによって、より確実に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制することができる。しかしながら、攪拌子１１による攪拌の開始と同時あるいは、攪拌が開始した後であっても、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を試料と
ＡＬ試薬の混和液に添加することで、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制する効果は得ることができる。
【００７０】
図１３には、同様に、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘ
などの界面活性剤を自動的に添加する界面活性剤添加装置３３を備えた比濁計測装置４１について示す。図１１で説明した比濁計測装置２１との相違点は、シリンジ３３ａ、ピストン３３ｂ及びピストン押圧部３３ｃからなる界面活性剤添加装置３３を有している点である。ここでは、シリンジ３３ａには、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤
が必要量吸い上げられている。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液を保持するキュベット２２が測定位置にセットされた際に、図示しないスイッチがＯＮされ、ピストン押圧部３３ｃがピストン３３ｂを押圧し、シリンジ３３ａ内のＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ
Ｘなどの界面活性剤が、キュベット２２内に添加される。このような比濁計測装置４１によっても、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。
【００７１】
なお、本実施例における界面活性剤添加装置３３も、上記の構成によるものに限定されないことは当然であり、同等の機能を有するものであれば、いかなる装置を使用してもよい。
【符号の説明】
【００７２】
１・・・光散乱粒子計測装置
２・・・光源
３・・・入射光学系
４・・・試料セル
５・・・出射光学系
６・・・受光素子
７・・・増幅回路
８・・・ノイズ除去フィルタ
９・・・演算装置
１０・・・表示器
１１・・・攪拌子
１２・・・攪拌器
１３・・・界面活性剤添加装置
２１・・・比濁計測装置
２２・・・ガラス容器（キュベット）
２３・・・攪拌子
２４・・・攪拌器
２４ａ・・・モータ
２４ｂ・・・磁石
２５・・・保温器
２５ａ・・・入射孔
２５ｂ・・・出射孔
２６・・・光源
２７・・・アパーチャ
２８・・・アパーチャ
２９・・・受光素子
３０・・・演算装置
３１・・・界面活性剤添加装置を備えた光散乱粒子計測装置
３３・・・界面活性剤添加装置
４１・・・界面活性剤添加装置を備えた比濁計測装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなど、ＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料中の該生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。一方で、敗血症患者血液中のエンドトキシンを測定することにより、重篤なエンドトキシンショックの予防や治療に寄与することもある。
【０００３】
注射薬などのエンドトキシン汚染を検出するための半定量的試験法として、従前は以下のような方法がとられることがあった。すなわち、体重１．５ｋｇ以上の健康なウサギの耳静脈に、３７℃に加温した試料を注射し、注射後３時間まで３０分以下の間隔で体温を測定する。注射の４０分前から注射までの間に３０分間隔で２回測定したウサギの体温の平均値を対象体温とし、対象体温と最高体温との差を体温上昇とする。
【０００４】
３匹のウサギを用いて上記の体温上昇を測定し、３匹の体温上昇の合計によって次のような判定が行われる。まず、３匹の体温上昇の合計が１．３℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、２．５℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。そして、３匹の体温上昇の合計が１．３℃より大きく２．５℃未満である場合にはさらに３匹による試験を追加し、計６匹の体温上昇の合計が３．０℃以下の場合は発熱性物質陰性とし、４．２℃以上の場合は発熱性物質陽性とする。その際の温度上昇の合計が３．０℃より大きく４．２℃未満である場合には、さらに３匹による試験を追加し、計９匹の体温上昇が５．０℃未満であれば発熱性物質陰性とし、５．０℃以上であれば発熱性物質陽性とする。
【０００５】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することによりカンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
【０００６】
ところで、カブトガニの血球抽出物（以下、「ＡＬ :Amoebocyte lysate」ともいう。
）の中には、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＡＬとエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンとが反応する際には、それらの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＡＬの特性を用いて、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能である。近年、このことを利用して、エンドトキシンなどの検出または濃度測定にＡＬを用いる方法が考案されている。
【０００７】
このエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの、ＡＬによって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定を行う方法としては、所定生理活性物質の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）をすべき試料とＡＬを元に製造された試薬（ＡＬ試薬）とを混和した混和液を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無によりゲル化したかど
うかを判定し、試料に一定濃度以上のエンドトキシンが含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。
【０００８】
あるいは、所定生理活性物質の測定をすべき試料とＡＬとを混和した混和液を３７℃が維持された状態で静置し、ＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法がある。この比濁法においては、測定開始後、透過率がある一定値以下に低下した時点をゲル化時間とする。定量は，ゲル化時間が検体中のエンドトキシン量と相関があることを利用する。すなわち、予め既知量のエンドトキシンが混入している複数の標準試料を測定して作成した検量線と、測定によって得られたゲル化時間とから、検体中のエンドトキシン量を算出する。
【０００９】
上記の比濁法によって所定生理活性物質の測定を行う場合には、乾熱滅菌処理されたガラス製測定セルに測定試料とＡＬとの混和液を生成させる。そして、混和液を静置してそのゲル化を外部から光学的に測定する。これに対し、ＡＬ試薬と混和した検体を攪拌しながら上記比濁法で測定する攪拌比濁法もある。この攪拌比濁法では、ガラス製測定セル内に入っている攪拌子を回転させることによって測定中も試料が攪拌される。そして、上記比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。攪拌比濁法では、測定中に試料を攪拌することによって上記の比濁法よりも迅速かつ安定に測定が可能である。
【００１０】
また、測定試料とＡＬと共に、表面にＡＬが結合した微粒子（以下、ＡＬ結合ビーズともいう。）を含んだ混和液を生成させ、上記攪拌比濁法で測定するＡＬ結合ビーズ法もある。このＡＬ結合ビーズ法では、試料とＡＬ及びＡＬ結合ビーズの反応によって生じるＡＬ結合ビーズの凝集に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する。このＡＬ結合ビーズ法においては、測定開始後、透過率がある一定値以上に上昇した時点をゲル化時間とする。そして、上記攪拌比濁法と同様、検量線法によって検体中のエンドトキシン量が算出される。ＡＬ結合ビーズ法は、上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速に測定をすることができる。これは主にＡＬ結合ビーズ法では、コアギュリンより１０から１００倍以上大きいＡＬ結合ビーズが凝集するため、透過率の変化が鋭敏となるためである。
【００１１】
さらに、測定試料とＡＬとの混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル微粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光の強度から、試料中の所定生理活性物質の存在を短時間で測定できるレーザー光散乱粒子計測法（以下、単に光散乱法ともいう。）も提案されている。試料とＡＬとの反応によってゲル粒子が生成され、反応が進行してそれらが互いに凝集すると、散乱光においてスパイク状のピーク信号が検出される。光散乱法においては、これらのピーク信号がある一定の頻度以上で検出した時点を凝集開始時間とする。上記ゲル化時間と同様、凝集開始時間は検体中のエンドトキシン量と相関があるので、これを利用して検量線法によって検体中のエンドトキシン量を算出する。
【００１２】
光散乱法でも、ガラス製試料セル内に入っている攪拌子を回転させることによって、測定中も試料が攪拌されるが、攪拌の目的が攪拌比濁法とは異なる。上記ピーク信号は、ゲル粒子が検体に入射したレーザー光を横切ったときに検出される。ゲル粒子がレーザー光を横切ることができるように攪拌によってゲル粒子を移動させるのである。光散乱法は，上記の比濁法や攪拌比濁法よりも迅速、高感度に測定をすることができる。これは主に光散乱法が、ゲル化の初期段階、すなわち、小さなゲル粒子が生成された時点でこれを検出することができることが要因である。
【００１３】
一方、試薬中に添加した凝固酵素に対する合成基質を予め入れておき、凝固酵素によって分解された合成基質が発色、あるいは、蛍光、さらには発光する現象を測定する方法が
あり、発色を利用した方法は比色法と呼ばれ、所定生理活性物質の重要な測定法の一つとして広く利用されている。比色法には、所定生理活性物質の濃度と、一定反応時間後における発色基の遊離量との間に相関関係があることを利用するエンドポイント−比色法や、所定生理活性物質の濃度と、混和液の収光度あるいは透過率がある一定の値に達するのに要する時間，または発色の経時変化率との間に相関関係があることを利用するカイネティック−比色法がある。
【００１４】
ここで、上記した攪拌比濁法や光散乱法のように、ガラス製試料セル内でＡＬ試薬と試料の混和液を攪拌子によって攪拌する場合、反応曲線（時間に対する透過率／吸光度（攪拌比濁法）、あるいはゲル粒子数（光散乱法））の形状が変化してしまい、測定によって得られるゲル化時間、あるいは凝集開始時間の精度が低下してしまうことが問題となっている（例えば、非特許文献１を参照。）。これらの問題を回避するため、各測定法では、ゲル化時間、あるいは凝集開始時間を決定するアルゴリズムに工夫をこらし，多少の反応曲線の変化が生じても，測定結果に影響が及ばないようにしている（例えば、特許文献１を参照。）。また、ＡＬ試薬と試料の混和液に熱処理済みアルブミンを添加することでエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する方法もある。これは主に、攪拌の刺激による凝固酵素の活性化を、熱処理済みアルブミンが抑制することを利用している。
【００１５】
しかしながら、特に希薄な血漿製剤中のエンドトキシンや注射用水そのものを、ＡＬ試薬の種類やメーカーおよびロットが異なる様々な条件で測定する場合などでは、上記の回避策が充分に機能しない場合があった。これは、攪拌によって反応曲線の形状が変化する原因が、攪拌刺激による凝固酵素の活性化だけではなく多岐に渡ることに起因すると考えられており、さらなる対策が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１０−２１６８７８号公報
【特許文献２】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献３】特開平１０−２９３１２９号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号パンフレット
【特許文献５】特開２００９−１５０７２３号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】高橋学、柴田繁啓、鈴木泰、小鹿雅博、松本尚也、小豆嶋立頼、稲田捷也、遠藤重厚、「エンドトキシン散乱測光法を用いたエンドトキシン測定法の臨床応用における課題」、エンドトキシン血症救命治療研究会誌、第１４巻、第１号ｐ．１１１−１１９、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的とするところは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する凝集あるいはゲル化を光学的に測定する、生物由来の生理活性物質の測定法において、より高い測定精度を得るための技術を提供することである。
【００１９】
より詳しくは、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、ＡＬ試薬と試料の混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＡＬ試薬と生物由来の生理活性物質を含む試料とを混和させ、混和液を攪拌しつつ、混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出する際に、界面活性剤を混和液に添加することで、該混和液におけるＡＬと生物由来の生理活性物質との反応に起因しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することを最大の特徴とする。
【００２１】
より詳しくは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、所定の界面活性剤を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする。
【００２２】
ここで、混和液の攪拌によって試料とＡＬ試薬との反応曲線が変化する現象の原因が以下のものであることが明確になってきた。すなわち、生物由来の生理活性物質の含有量が非常に少ない試料を測定する場合は、攪拌によって、（１）ＡＬ試薬および/または試料
中に含まれる蛋白質同士が凝集し、あるいは、（２）攪拌に伴うずり応力（物理的刺激）によってプロクロッティング・エンザイムが切断・活性化され、クロッティング・エンザイムに変化し、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集物が生成されることが見出された。
【００２３】
この生物由来の生理活性物質に由来しない凝集は、攪拌比濁法及び光散乱法の両方の方法においてゲル粒子の発生と同様の信号として検出されてしまうため、反応曲線（タイムコース）の形状に影響を及ぼし、測定精度が低下し、誤計測をもたらす危険性があった。これに対し、発明者らの鋭意研究により、試料とＡＬ試薬の混和時に、界面活性剤を添加することで上記の生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが見出された。特に、この界面活性剤の添加により、ＡＬ試薬および/または試
料中に含まれる蛋白質同士の凝集を抑制できることが見出された。さらに、この界面活性剤を試料に添加しても、生物由来の生理活性物質に由来する凝集またはゲル化の測定に影響がないことが実験によって確認された。
【００２４】
本発明によれば、特に生物由来の生理活性物質の含有量の少ない試料とＡＬ試薬との混和液における凝集またはゲル化を攪拌しつつ測定する場合に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。特に、界面活性剤によってＡＬ試薬および/または試料中に含まれる蛋白質同士の凝集を抑制できることから
、熱処理済みアルブミンでは効果が期待できない場合でも、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。その結果、生物由来の生理活性物質の測定における精度を向上させることができる。
【００２５】
また、本発明においては、前記界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムでもよい。また、非イオン系界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレ
ン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでもよい。また、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤でもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドでもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩でもよい。これらの界面活性剤は、試料とＡＬ試薬の混和時に添加されることにより、生物由来の生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化の誘発を抑制できることが確認されているため、より確実に、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００２６】
また、本発明においては、前記混和液に、所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下としてもよい。これによって、より効果的に、攪拌による生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制することができる。なお、上記最終濃度は、望ましくは、０．０００５％以上５％以下がよい。さらに望ましくは、０．００５％以上０．５％以下がよい。
【００２７】
なお、本発明においては、攪拌による、生物由来の生理活性物質に起因しない凝集またはゲル化を抑制するために、本発明である界面活性剤の添加と合わせて、熱処理済みアルブミンの添加を併用してもよい。
【００２８】
また、本発明においては、前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであってもよい。
【００２９】
そうすれば、最も代表的な発熱性物質であるエンドトキシンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入り、副作用が惹起されることを抑制できる。同様に、β−Ｄ−グルカンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングをより正確に行なうことが可能となる。
【００３０】
また、本発明は、カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、所定の界面活性剤が添加され、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬であってもよい。また、その場合は、前記所定の界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムでもよい。また、非イオン系界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでもよい。また、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤でもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドでもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩でもよい。
【００３１】
また、本発明は、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、所定の界面活性剤を前記混和液に添加する界面活性剤添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置であってもよい。
【００３２】
この装置によれば、試料とＡＬ試薬との混和液を攪拌する際に、自動的に、所定の界面活性剤を前記混和液に添加することができ、より簡単に、該混和液における前記生理活性物質に由来しない、蛋白質の凝集またはゲル化を抑制することができる。
【００３３】
この装置においても、界面活性剤添加手段によって添加される界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムでもよい。また、非イオン系界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでもよい。また、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤でもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドでもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩でもよい。また、混和液に、所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下とするとよい。望ましくは、０．０００５％以上５％以下がよい。さらに望ましくは、０．００５％以上０．５％以下がよい。さらに、生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンとしてもよい。
【００３４】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明にあっては、攪拌比濁法、光散乱法、あるいはＡＬ結合ビーズ法によって試料中の生物由来の生理活性物質の濃度を測定する場合に、混和液の攪拌に起因して生じる、前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することによって、上記測定の測定精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【図２】本発明の実施例１における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図３】従来（界面活性剤未添加）のＡＬ試薬を用いた場合の、試料中のエンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係と、検量線とを示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１においてＴｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例１における試料とＡＬ試薬との混和液に添加するＴｗｅｅｎ２０の濃度と、ゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例１においてＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例１における試料とＡＬ試薬の混和液に添加するＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００の濃度と、ゲル化検出時間との関係を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例１においてＴｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、試料中のエンドトキシン濃度とゲルが検出時間との関係と、検量線とを示すグラフである。
【図９】ＡＰＢ、Ｔｗｅｅｎ２０及び、ＡＰＢとＴｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図１０】ＡＰＢ及び、Ｔｗｅｅｎ２０を混和液に添加した場合の、反応曲線を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例１における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図１２】本発明の実施例２における光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図１３】本発明の実施例２における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
＜実施例１＞
ＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程（以下、リムルス反応ともいう。）はよく調べられている。すなわち、図１に示すように、エンドトキシンがＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となり、活性型Ｃ因子はＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００３８】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００３９】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＡＬを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
【００４０】
エンドトキシンならびにβ―Ｄ−グルカンを定量するための試薬としては、カブトガニの血球抽出物（ＡＬ:Amoebocyte lysate）を原料としたリムルス試薬、ならびに、リムルス試薬に凝固酵素により加水分解され着色強度、蛍光強度、または化学発光強度のいずれかが増加する合成基質を添加した試薬が使用される。また、リムルス試薬中のＣ因子の組換え体（リコンビナントＣ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などが使用される場合もある。さらに、リムルス試薬中のＧ因子の組換え体（リコンビナントＧ因子）とその合成基質（着色、蛍光、化学発光かの手段は問わない）の混合試薬などを使用することも可能である。
【００４１】
エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの所定生理活性物質とＡＬとの反応に起因して変化する物理量は、試薬の種類に応じて選択すればよい。試料の光透過率または、濁度、散乱光強度、光散乱粒子数、吸光度、蛍光強度、化学発光強度などの光学的な物理量の変化を検出するか、試料のゲル化に伴う試料の粘性、電気伝導度などの物理量の変化を検出すればよい。これらの物理量の検出には、濁度計、吸光光度計、光散乱光度計、レーザー光散乱粒子計測計、蛍光光度計、フォトンカウンターなどの光学機器、ならびに、これらを応用した専用の測定装置を使用することができる。また、粘度計、電気伝導率計やこれらを応用した専用の測定装置を使用しても構わない。
【００４２】
所定生理活性物質を定量する測定法としては前述のように攪拌比濁法ならびに光散乱法が挙げられる。図１に示すように、これらの測定法はＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子の数として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００４３】
次に、本実施例において散乱光を取得するために使用した光散乱粒子計測装置について説明する。なお、以下の説明においては、所定生理活性物質としてエンドトキシンを例にとって説明するが、以下の説明はβ−Ｄ−グルカンなど他の生理活性物質にも適用可能である。図２には、本実施例におけるエンドトキシンの測定装置としての光散乱粒子計測装置１の概略構成を示す。光散乱粒子計測装置１に使用される光源２にはレーザー光源が用いられているが、他に、超高輝度ＬＥＤなどを用いてもよい。光源２から照射された光は、入射光学系３で絞られ、試料セル４に入射する。この試料セル４にはエンドトキシンの測定をすべき試料とＡＬ試薬の混和液が保持されている。試料セル４に入射した光は、混和液中の粒子（コアギュロゲンモノマー、ならびに、コアギュロゲンオリゴマーなどの測定対象）で散乱される。
【００４４】
試料セル４の、入射光軸の側方には出射光学系５が配置されている。また、出射光学系５の光軸の延長上には、試料セル４内の混和液中の粒子で散乱され出射光学系５で絞られた散乱光を受光し電気信号に変換する受光素子６が配置されている。受光素子６には、受光素子６で光電変換された電気信号を増幅する増幅回路７、増幅回路７によって増幅された電気信号からノイズを除去するためのフィルタ８、ノイズが除去された後の電気信号のピーク数からゲル粒子数を演算し、さらにゲル化検出時間を判定してエンドトキシンの濃度を導出する演算装置９及び、結果を表示する表示器１０が電気的に接続されている。
【００４５】
また、試料セル４には、外部から電磁力を及ぼすことで回転し、試料としての混和液を
攪拌する攪拌子１１が備えられており、試料セル４の外部には、攪拌器１２が備えられている。これらにより、攪拌の有無及び攪拌速度の調整が可能となっている。
【００４６】
ここで、試料セル４は本実施例の混和液保持手段に相当する。光源２及び入射光学系３は光入射手段に相当する。攪拌子１１及び攪拌器１２は攪拌手段に相当する。出射光学系５及び受光素子６は受光手段に相当する。演算装置９は判定手段及び導出手段に相当する。
【００４７】
上記の光散乱粒子計測装置１においては、リムルス反応の最終段階であるコアギュリンゲル粒子の出現時間（ゲル化検出時間＝ゲル化時間）を測定し、エンドトキシン濃度とゲル化検出時間の間に成立する検量関係を用いて検体中のエンドトキシン濃度を算出する。
【００４８】
図３に、エンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係及び検量線を示す。なお、図３においては、ＡＬ試薬１００μＬと１０〜０．０００１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを含む試料１００μＬを混和した混和液を測定に用いた。試料中のエンドトキシン濃度が１０〜０．０１ＥＵ／ｍＬのとき、試料中のエンドトキシン濃度が低い程、ゲル化検出時間が明確に長くなる検量関係を示したが、０．０１ＥＵ／ｍＬ以下では、エンドトキシン濃度によらず、ゲル化検出時間が１４〜３０分以内に観測された。結果として、０．０１ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシンを正確に測定することが困難であった。また検量線の直線性は、相関係数が０．９７４となり充分とは言えなかった。
【００４９】
これは、攪拌子１１及び攪拌器１２による攪拌の刺激によって蛋白質が変性し不溶性の凝集体が生成し、このエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）が生成したためである。従って、０．０１ＥＵ／ｍＬ以下の低濃度のエンドトキシンを正確に測定するには、上記のエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する必要がある。これに対し、発明者らの鋭意研究により、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤の添加によってエンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが分かった。本実施例においては、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を使用し、これによるエンドトキシンに由来しない凝集の抑制効果を調べた。なお、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００は、いずれもエンドトキシン含有量が少なく、そのまま用いることができたが、エンドトキシンを多く含む場合は予めオートクレーブ滅菌処理により、エンドトキシンを不活化させておけばよい。
【００５０】
上記の測定の結果を以下に説明する。ＡＬ試薬１００μＬとＴｗｅｅｎ２０（０％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％）１００μLを混和した混和液（すなわちＴｗ
ｅｅｎ２０の最終濃度は０％、０．０００５％、０．００５％、０．０５％、０．５％となる）を測定に供したときの反応曲線を図４に示す。図４の横軸は反応時間、縦軸はゲル粒子数である。Ｔｗｅｅｎ２０が０％（すなわち未添加）および０．０００５％のとき、ゲル粒子数は反応開始直後から時間の経過とともに急峻に増加し、８０分〜１００分程度をピークとして再び減少している。これは、反応直後から、攪拌子１１及び攪拌器１２による攪拌の刺激によって蛋白質が変性し不溶性の凝集体が生成し、このエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）を計測しているためと考えられる。
【００５１】
これに対し、Ｔｗｅｅｎ２０が０．００５％以上含まれるとき、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制され、測定されるゲル粒子数は安定的に増加していることが分かる。上記より、界面活性剤がＴｗｅｅｎまたは同等品であるときは、最終濃度が０．００５％以上０．５％以下であれば、確実に、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。エンドトキシンに由来しない凝集物の生成が、ＡＬ試薬の種類やメーカーおよびロットによって異なることを考慮すると、一般的には、界面活性剤が０．０００１％以上１０％以下であれば、程度の差はあるとしても、反応開始直後のゲル粒
子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。
【００５２】
次に、上記の測定の結果として得られたゲル化検出時間を図５に示す。Ｔｗｅｅｎ２０が０．００５％以上含まれるとき、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。これにより、Ｔｗｅｅｎ２０を適量添加すれば、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが示された。
【００５３】
同様に、Ｔｗｅｅｎ２０に代わって界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を用いたときの反応曲線を図６に示す。図６の横軸は反応時間、縦軸はゲル粒子数である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００が０％（すなわち未添加）および０．０００５％のとき、上記のエンドトキシンに由来しない凝集物（ゲル粒子）の生成により、ゲル粒子数は反応開始直後から時間の経過とともに急峻に増加した。これに対し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００が０．００５％以上含まれるとき、ゲル粒子数の反応開始直後の急峻な増加は抑制された。結果として得られたゲル化検出時間を図７に示す。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００が０．００５％以上含まれるとき、ゲル化検出時間が遅くなる傾向があった。
【００５４】
これにより、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を適量添加することによっても、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制できることが示された。上記より、界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ
Ｘまたは同等品であるときは、最終濃度が０．００５％以上０．５％以下であれば、確実に、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。エンドトキシンに由来しない凝集物の生成が、ＡＬ試薬の種類やメーカーおよびロットによって異なることを考慮すると、一般的には、界面活性剤が０．０００１％以上１０％以下であれば、程度の差はあるとしても、反応開始直後のゲル粒子数の急峻な増加が抑制される効果が期待できる。
【００５５】
上記のように、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００といった界面活性剤を混和液に添加することにより、エンドトキシンに由来しない凝集が抑制されることが認められたことを受け、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０１％含むＡＬ試薬を調製した。このＡＬ試薬１００μＬと１０〜０．０００１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを含む試料１００μＬを混和した混和液（すなわちＴｗｅｅｎ２０の終濃度は０．００５％）を測定に供した。得られたエンドトキシン濃度とゲル化検出時間との関係及び、検量線を図８に示す。
【００５６】
図３に示したＴｗｅｅｎ２０が未添加の場合の検量線と図８とを比較して判るように、まず、Ｔｗｅｅｎ２０を添加した場合には試料中のエンドトキシン濃度が１０〜０．０１ＥＵ／ｍＬの範囲で、Ｔｗｅｅｎ２０添加時のゲル化検出時間が未添加時より遅くなることはなかった。これは、Ｔｗｅｅｎ２０がリムルス反応を阻害することはないことを示している。また、Ｔｗｅｅｎ２０を添加した場合は、１０〜０．０００１ＥＵ／ｍＬの範囲で相関係数０．９９３という、良好な直線性を有する検量線を得ることができた。これは、Ｔｗｅｅｎ２０添加によりエンドトキシンに由来しない凝集が抑制された効果と考えられる。
【００５７】
さらに、Ｔｗｅｅｎがエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する作用機序を調べるため、安息香酸アミジノフェニル（以下、ＡＰＢと記すことがある）の添加実験を行った。ＡＰＢは、プロテアーゼ阻害剤の一つであり、リムルス反応の凝固酵素の活性を阻害する。別のＡＬ試薬を用い、ＡＬ試薬１００μＬと０．１ｍＭのＡＰＢ１００μＬを混和した混和液、および、ＡＬ試薬１００μＬと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を１００μＬ混和した混和液を測定に用いた場合の反応曲線を図９に示す。また、予め０．１ｍＭのＡＰＢを含むＡＬ試薬１００μＬと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を１００μＬ混和した混和液を測定に供したときの反応曲線も図９に示した。
【００５８】
図９から判るように、まず、ＡＰＢを未添加の場合は、測定開始初期から、エンドトキシンに由来しない粒子数の急峻な増加が観察された。図４および図６と比べて粒子数の増加の程度が大きいのは、ＡＬ試薬が異なるためである。また、ＡＰＢを添加した場合でも、上記のゲル粒子数の増加は抑制されることはなかった。これは、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の急峻な増加は、攪拌の刺激による凝固酵素の活性化によるものではなく、蛋白質同士が凝集して生成した凝集体を計測していることを示している。そして、Ｔｗｅｅｎ２０のみ、および、ＡＰＢとＴｗｅｅｎ２０の両方を添加した場合では、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の単調な増加は著しく抑制された。すなわちＴｗｅｅｎ２０が、蛋白質同士の凝集に対して大きな抑制効果を発揮していることが示された。
【００５９】
また別のＡＬ試薬を用い、ＡＬ試薬１００μＬと０．１ｍＭのＡＰＢ１００μＬを混和した混和液、および、ＡＬ試薬１００μＬと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を１００μＬ混和した混和液を測定に用いた場合の反応曲線を図１０に示す。図１０から判るように、このＡＬ試薬を用いて、ＡＰＢを未添加の場合は、測定開始初期から粒子数の急峻な増加は観察されず、約１００分以降で、エンドトキシンに由来しない粒子数の増加が観察された。図４、図６および図９と比べて粒子数の増加の仕方が異なるのは、ＡＬ試薬が異なるためである。そして、ＡＰＢを添加した場合、上記のゲル粒子数の増加は明確に抑制された。これは、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の増加は、攪拌の刺激による凝固酵素の活性化によるものであることを示している。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ２０を添加しても、上記のエンドトキシンに由来しないゲル粒子数の増加は抑制されなかった。すなわちＴｗｅｅｎ２０は、熱処理済みアルブミンとは異なり、攪拌刺激による凝固酵素の活性化に対しては抑制効果を有していないことが示された。
【００６０】
このようにＴｗｅｅｎは、主に攪拌の刺激による凝固酵素の活性化を抑制すると考えられている熱処理済みアルブミンとは作用機序が異なり、攪拌の刺激による蛋白質同士の凝集を抑制する。従って、熱処理済みアルブミンでは効果が期待できないようなＡＬ試薬に対してもエンドトキシンに由来しない凝集を抑制する効果が期待できる。また、Ｔｗｅｅｎは、天然物のアルブミンとは異なり、化学的な合成が可能であるため、初期過程におけるエンドトキシンの混入を排除することが容易である。実際、Ｔｗｅｅｎはリムルス反応を阻害せず（図８）、Ｔｗｅｅｎの添加によりゲル化検出時間が遅くなったこと（図４および図５）は、本実施例で使用したＴｗｅｅｎのエンドトキシン含有量が十分に低いことを示している。
【００６１】
上記の実施例においては、本発明を、光散乱粒子計測装置１を用いた光散乱法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用した例について説明したが、本発明が適用されるのは、光散乱法による場合だけでないことはもちろんである。例えば、攪拌比濁法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用してもよい。以下に、攪拌比濁法に用いられる比濁計測装置について説明する。
【００６２】
図１１には、本実施例のエンドトキシンの測定装置の別の例としての比濁計測装置２１の概略構成を示す。この比濁計測装置２１では、攪拌比濁法によってエンドトキシンの測定を行う。比濁計測装置２１においても、調製した希釈系列のエンドトキシンを含んだ試料を混和液保持手段としての測定用ガラス容器（以下、キュベット）２２に移注する。キュベット２２の周囲を囲うように保温器２５が設けられている。この保温器２５の内部には図示しない電熱線が備えられており、この電熱線に通電されることにより、キュベット２２を約３７℃に保温するようになっている。このキュベット２２の中にはステンレス製の攪拌子２３が備えられている。この攪拌子２３は、キュベット２２の下部に設置された攪拌器２４の作用によってキュベット２２の中で回転する。すなわち、攪拌器２４はモータ２４ａとモータ２４ａの出力軸に設けられた永久磁石２４ｂとからなっている。そして
、モータ２４ａに通電されることで永久磁石２４ｂが回転する。この永久磁石２４ｂからの磁界が回転するために、ステンレス製の攪拌子２３が回転磁界の作用で回転する。この攪拌子２３と攪拌器２４とは攪拌手段に相当する。
【００６３】
なお、比濁計測装置２１には光入射手段としての光源２６と受光手段としての受光素子２９が設置されている。光源２６から出射した光はアパーチャ２７を通過した後、保温器２５に設けられた入射孔２５ａを通過してキュベット２２中の試料に入射される。キュベット２２中の試料を透過した光は保温器２５に設けられた出射孔２５ｂから出射され、アパーチャ２８を通過して受光素子２９に照射される。受光素子２９では、受光した光の強度に応じた光電信号を出力する。この光電信号の出力は、判定手段及び導出手段としての演算装置３０に入力される。演算装置３０においては、予め格納されたプログラム（アルゴリズム）に従い、反応開始時刻の判定及び、エンドトキシン濃度の導出が行われる。なお、この他に導出されたエンドトキシン濃度を表示する表示装置を含めて比濁計測装置２１としてもよい。
【００６４】
なお、上記の実施例では、混和液に添加する界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を用いる例について説明したが、界面活性剤としては、商品名が異なっていたとしてもポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、などを使用してもよい。また、他の非イオン系界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを用いても、同等の効果を期待することができる。また、界面活性剤であれば、非イオン系のものでなくとも蛋白質同士の凝集を抑制する効果が得られると考えられるので、非イオン系界面活性剤に、シリコーンオイルや植物油を乳化したエマルジョン型消泡剤を使用してもよい。また、陰イオン系界面活性剤、例えば、純石けん分（脂肪酸ナトリウム）、純石けん分（脂肪酸カリウム）、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムを使用してもよい。また、両性イオン系界面活性剤、例えば、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドを使用してもよい。また、陽イオン系界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルトリメチルアンモニウム塩を使用してもよい。また、上記した各種の界面活性剤を混合して使用してもよい。
【００６５】
＜実施例２＞
上記の実施例１においては、一般的な光散乱粒子計測装置１及び、比濁計測装置２１を用いて、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＴｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００などの界面活性剤を添加する例について説明したが、本発明を実施するために、試料とＡＬ試薬の混和液に対して自動的にＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を添加する
特別な光散乱粒子計測装置及び、比濁計測装置を用いることとしてもよい。
【００６６】
図１２には、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界
面活性剤を自動的に添加する界面活性剤添加装置１３を備えた光散乱粒子計測装置３１について示す。図２で説明した光散乱粒子計測装置１との相違点は、界面活性剤貯留部１３ａと、界面活性剤添加管１３ｂを有している点である。この界面活性剤貯留部１３ａには、測定に先立ち、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を精密に測定された量
だけ貯留しておく。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定位置にセットされた
際に、図示しないスイッチがＯＮされ、例えば小型ポンプ１３ｃによって、界面活性剤貯留部１３ａに空気圧が作用する。そして、界面活性剤貯留部１３ａに貯留されたＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤が、界面活性剤添加管１３ｂを介してキュベット
内に添加される。
【００６７】
本実施例によれば、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。上記の界面活性剤添加装置１３は界面活性剤添加手段に相当する。
【００６８】
なお、本実施例における界面活性剤添加装置１３は、上記の構成によるものに限定されないことは当然である。例えば、精密に吐出量を制御可能な液体吐出装置によって、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液が測定
位置にセットされた際に、吐出するようにしてもよい。あるいは、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を必要量吸い上げたスポイト、あるいはピペットをセットして
おき、それらの可撓性のポンプ部を圧縮することで、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなど
の界面活性剤を、ガラス製試料セル４内の混和液に添加するようにしてもよい。
【００６９】
なお、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を試料とＡＬ試薬の混和液に添
加するタイミングは、攪拌子１１による攪拌が開始する前であることが望ましい。これによって、より確実に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制することができる。しかしながら、攪拌子１１による攪拌の開始と同時あるいは、攪拌が開始した後であっても、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤を試料と
ＡＬ試薬の混和液に添加することで、エンドトキシンに由来しない凝集を抑制する効果は得ることができる。
【００７０】
図１３には、同様に、試料とＡＬ試薬の混和液に対してＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘ
などの界面活性剤を自動的に添加する界面活性剤添加装置３３を備えた比濁計測装置４１について示す。図１１で説明した比濁計測装置２１との相違点は、シリンジ３３ａ、ピストン３３ｂ及びピストン押圧部３３ｃからなる界面活性剤添加装置３３を有している点である。ここでは、シリンジ３３ａには、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの界面活性剤
が必要量吸い上げられている。そして、測定時に試料とＡＬ試薬の混和液を保持するキュベット２２が測定位置にセットされた際に、図示しないスイッチがＯＮされ、ピストン押圧部３３ｃがピストン３３ｂを押圧し、シリンジ３３ａ内のＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ
Ｘなどの界面活性剤が、キュベット２２内に添加される。このような比濁計測装置４１によっても、より簡単に、混和液を攪拌する場合に生じる、エンドトキシンに由来しない凝集を低減することができ、エンドトキシン測定の測定精度を向上することができる。
【００７１】
なお、本実施例における界面活性剤添加装置３３も、上記の構成によるものに限定されないことは当然であり、同等の機能を有するものであれば、いかなる装置を使用してもよい。
【符号の説明】
【００７２】
１・・・光散乱粒子計測装置
２・・・光源
３・・・入射光学系
４・・・試料セル
５・・・出射光学系
６・・・受光素子
７・・・増幅回路
８・・・ノイズ除去フィルタ
９・・・演算装置
１０・・・表示器
１１・・・攪拌子
１２・・・攪拌器
１３・・・界面活性剤添加装置
２１・・・比濁計測装置
２２・・・ガラス容器（キュベット）
２３・・・攪拌子
２４・・・攪拌器
２４ａ・・・モータ
２４ｂ・・・磁石
２５・・・保温器
２５ａ・・・入射孔
２５ｂ・・・出射孔
２６・・・光源
２７・・・アパーチャ
２８・・・アパーチャ
２９・・・受光素子
３０・・・演算装置
３１・・・界面活性剤添加装置を備えた光散乱粒子計測装置
３３・・・界面活性剤添加装置
４１・・・界面活性剤添加装置を備えた比濁計測装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、所定の界面活性剤を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項２】
前記所定の界面活性剤は、非イオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項３】
前記所定の界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルのうちの一種、あるいは二種以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項４】
前記混和液に、所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項５】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項６】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、
所定の界面活性剤が添加され、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項７】
前記所定の界面活性剤は、非イオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項６に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項８】
前記所定の界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルのうちの一種、あるいは二種以上を含むことを特徴とする請求項６に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項９】
所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、所定の界面活性剤を前記混和液に添加する界面活性剤添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１０】
前記界面活性剤添加手段によって添加される界面活性剤は、非イオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項９に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１１】
前記界面活性剤添加手段によって添加される界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルのうちの一種、あるいは二種以上を含むことを特徴とする請求項９に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１２】
前記界面活性剤添加手段によって、前記混和液に所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下であることを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１３】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項９から１２のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬと所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記攪拌をする際には、前記混和液に、所定の界面活性剤を添加することで、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項２】
前記所定の界面活性剤は、非イオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項３】
前記所定の界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルのうちの一種、あるいは二種以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項４】
前記混和液に、所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項５】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項６】
カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含み、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料との混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、前記生理活性物質に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定するための、生物由来の生理活性物質の測定用試薬であって、
所定の界面活性剤が添加され、前記混和液における前記生理活性物質に由来しない凝集またはゲル化を抑制可能としたこと特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項７】
前記所定の界面活性剤は、非イオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項６に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項８】
前記所定の界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルのうちの一種、あるいは二種以上を含むことを特徴とする請求項６に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬。
【請求項９】
所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとの混和液を光の入射が可能な状態に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備える生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記攪拌手段によって、前記混和液を攪拌する際に、所定の界面活性剤を前記混和液に添加する界面活性剤添加手段をさらに備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１０】
前記界面活性剤添加手段によって添加される界面活性剤は、非イオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項９に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１１】
前記界面活性剤添加手段によって添加される界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックポリマー、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルのうちの一種、あるいは二種以上を含むことを特徴とする請求項９に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１２】
前記界面活性剤添加手段によって、前記混和液に所定の界面活性剤を添加する際の最終濃度は、０．０００１％以上１０％以下であることを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項１３】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項９から１２のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−２１５４６１（Ｐ２０１２−２１５４６１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８０７１４（Ｐ２０１１−８０７１４）
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
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