生細胞の検出方法
【課題】 試料中の生細胞を、迅速、簡便かつ正確に検出、測定することができ、更には、試薬の安全性、保存安定性、コスト性等に優れた生細胞の検出方法を提供する。
【解決手段】 （１）試料に蛍光染料を添加・接触させて細胞を蛍光染色し、（２）前記蛍光染料で染色した試料に、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で添加し、若しくは接触させ、（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出することにより生細胞の検出を行う。
【解決手段】 （１）試料に蛍光染料を添加・接触させて細胞を蛍光染色し、（２）前記蛍光染料で染色した試料に、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で添加し、若しくは接触させ、（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出することにより生細胞の検出を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の生細胞を検出する方法に関し、詳細には、試料を蛍光染料及び消光染料を用いて染色することにより、生細胞とゴミ等の夾雑物との判別が容易に可能で、正確に生細胞を検出できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬、農薬、食品衛生管理等の分野や医学、薬学、生物学等の研究分野においては、品質管理、安全性や薬効の評価等のために、試料に含まれる生細胞を検出、測定することが多い。
【０００３】
そのため、より迅速かつ簡便に生細胞を検出、測定する方法として、染色試薬を用いて生細胞を染色して検出する方法が提案されている。
【０００４】
例えば、下記特許文献１には、菌類を染色する蛍光染料としてフルオレセインジアセテートとヨウ化プロピジウムを用い、菌類をこれらの蛍光染料で二重染色し、染色した菌類に対して励起光を照射することにより、フルオレセインジアセテートで染色された生菌細胞が発する特定波長の蛍光発光と、ヨウ化プロピジウムで染色された死菌細胞が発する特定波長の蛍光発光とを検出して、蛍光発光の数から生菌細胞と死菌細胞の数を計測する方法が記載されている。
【０００５】
下記特許文献２には、死菌細胞のみを蛍光発光させる蛍光試薬で検体となる菌類全体を染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第１のステップと、前記検体となる菌類全体に殺菌処理を施した上で、当該殺菌処理した菌類全体を前記蛍光試薬で再度染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第２ステップで計測した数とを比較することにより、生菌細胞数及び死菌細胞数を計測することを特徴とする微生物計測方法が開示されている。
【０００６】
下記特許文献３には、死細胞のみを染色する核酸蛍光染色剤を作用させた測定試料が発する蛍光の強度と、該核酸蛍光染色剤を作用させる処理及び細胞膜を損傷させる処理を施した測定試料が発する蛍光の強度とを各々測定し、両強度を対比することを特徴とする生存細胞数及び／又は細胞生存率の測定方法が開示されている。
【０００７】
下記特許文献４には、細胞を含む試料に色素又は蛍光性酵素基質を添加して色素又は蛍光を検出又は測定することを含む生細胞の検出方法において、細胞膜を透過できず、且つ上記色素又は蛍光性酵素基質の発光を吸収する吸収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴とする方法が開示されている。そして、蛍光性酵素基質として、５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、カルセインアセトキシメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレセイン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群から選択される化合物を用いること、また、色素として、アクリジンオレンジ、ビスベンズイミドフルオロクロム三塩酸塩、４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール、「ＳＹＴＯ９」、「ＳＹＴＯ１０」、「ＳＹＴＯ１１」、「ＳＹＴＯ１２」、「ＳＹＴＯ１３」、「ＳＹＴＯ１４」、「ＳＹＴＯ１５」、「ＳＹＴＯ１６」、「ＳＹＴＯ１７」、「ＳＹＴＯ２０」、「ＳＹＴＯ２１」、「ＳＹＴＯ２２」、「ＳＹＴＯ２３」、「ＳＹＴＯ２４」、「ＳＹＴＯ２５」（上記カッコ内はいずれも商品名、Molecular Probes社製）、ヘキシジウムイオダイド及びジヒドロエチジウムよりなる群から選択される化合物を用い、また、吸収体として、チトクロームＣ、ヘモグロビン及びブルーデキストランよりなる群から選択される化合物を用いることが記載されている。
【０００８】
下記特許文献５には、蛍光染料として生細胞のみに蓄積される染料を用い、消光染料として前記蛍光染料を消光でき、且つ死細胞に浸透できるが生細胞には排除される染料を用いて生細胞を含む試料を染色し、該試料の蛍光強度を計測することで相対的な生細胞数を計測する方法が開示されている。そして、蛍光染料としてフルオレセインジアセテート、消光染料としてeosin Yを組み合わせて用いること、あるいは蛍光染料としてcalcein−AM、消光染料としてトリパンブルーを組み合わせて用いることが記載されている。
【０００９】
下記非特許文献１には、生細胞を蛍光発光させる試薬としてカルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）を用い、生細胞から漏れるＣＦＤＡ蛍光を消光するためにヘモグロビンを用いて試料を二重染色し、染色した試料に励起光を照射することにより、CFDAで染色された生細胞が発する蛍光発光を蛍光顕微鏡に接続したフォトマルチプライヤーで検出して、蛍光発光強度から生細胞数を計測する方法が記載されている。
【特許文献１】特許２９７９３８３号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９６９５号公報
【特許文献３】特開平１０−９９０９６号公報
【特許文献４】特開２００２−３４５９４号公報
【特許文献５】米国特許公報６,４５９,８０５号
【非特許文献１】Y. Hansson et al. ; Journal of Immunological Methods, 100 (1987) pp.261-267
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記特許文献１に記載された方法は、フルオレセインジアセテートが分解されやすく、生菌以外の夾雑物も染色されてしまうため、試料に生菌と死菌と菌以外の夾雑物とが一緒に含まれる場合は、正確な生菌数を測定できないという欠点があった。
【００１１】
また、上記特許文献２に記載された方法は、殺菌処理が必要なため煩雑であるだけでなく、殺菌条件が測定に影響を与えやすく、殺菌条件を十分に検討する必要がある等の欠点があった。
【００１２】
また、上記特許文献３に記載された方法も同様に、細胞膜を損傷させる処理が必要なため煩雑である、その処理条件を検討する必要がある、細胞壁を有する細胞は測定できないなど測定対象が限定されてしまう、トリパンブルーは有害物であり、取り扱いに注意を要するといった欠点があった。
【００１３】
また、上記特許文献４や上記非特許文献１に記載された方法は、色素又は蛍光性酵素基質の発光を吸収する吸収体としてチトクロームＣ、ヘモグロビン等のタンパク質を用いるため、試薬の冷蔵保存が必要であり、品質が安定し難く、また、ブルーデキストランは高価であるといった欠点があった。
【００１４】
また、上記特許文献５に記載された方法は、試料を蛍光染料で染色するために比較的時間（３０分）かかり、測定の迅速性に問題があった。また、消光染料として用いられるeosin Yが、カルボキシフルオレセインジアセテートの蛍光波長である５５０〜６５０ｎｍ部分を吸収できないため、eosin Yがフルオレセインジアセテートの蛍光を十分に消光できないという欠点があった。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、試料中の生細胞を、迅速、簡便かつ正確に検出、測定することができ、更には、試薬の安全性、保存安定性、コスト性等に優れた生細胞の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の生細胞の検出方法は、（１）試料に蛍光染料を添加し、若しくは接触させて細胞を蛍光染色する工程と、（２）前記蛍光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を添加し、若しくは接触させる工程と、（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程とを有する生細胞の検出方法であって、前記工程（２）において、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で添加し、若しくは接触させ、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下に保つことを特徴とする。
【００１７】
本発明の生細胞の検出方法によれば、試料を、蛍光染料と、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料とを用いて二重染色し、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下に保つことにより、前記蛍光染料によって染色された夾雑物に由来する蛍光を前記消光染料が吸収・消光するので、夾雑物の影響を排除することができ、試料中の生細胞を、迅速、簡便かつ正確に検出、測定することができる。
【００１８】
本発明の生細胞の検出方法においては、前記蛍光染料として、おもに生細胞を染色できる蛍光染料を使用することが好ましい。この態様によれによれば、夾雑物の影響を更に排除することができる。
【００１９】
また、前記蛍光染料として、核酸を蛍光標識する物質、又は酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質を用いることが好ましい。この態様によれば、試料中の生細胞を迅速かつ簡便に染色することができる。
【００２０】
また、前記消光染料は、前記蛍光染料の蛍光波長を吸収する共役二重結合を有する化合物であることが好ましく、そのような化合物として、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物、少なくとも１つの縮合芳香族環を有する芳香族化合物、不飽和炭化水素構造を有する化合物がより好ましく、具体的には、下記構造式（I）〜（IX）に示されるいずれかの化合物又はアントシアン類が好ましい。
【００２１】
【化１】
【００２２】
【化２】
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
【００２６】
【化６】
【００２７】
上記構造式（I）〜（III）及び（V）中のＲ１〜Ｒ１１は、水素原子、メチル基、炭素原子が少なくとも２個以上からなる脂肪鎖又は脂肪酸エステル、ヨウ素、臭素を示し、同一若しくは異なっていてもよい。
【００２８】
【化７】
【００２９】
上記構造式（VII）中のＭｅは、鉄、銅又はマグネシウムを示し、Ｒ１〜Ｒ７は炭化水
素基、Ｒ８〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００３０】
【化８】
【００３１】
上記構造式（VIII）中のＲ１〜Ｒ８は炭化水素基、Ｒ９〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００３２】
【化９】
【００３３】
上記構造式（IX）中のＲ１〜Ｒ４は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示し、ｎは１〜１１の整数である。
【００３４】
これらの消光染料は、蛍光染料で非特異的に染色される夾雑物を効果的に消光することができる。また、従来用いられていた消光染料に比べて、安全性、保存安定性、コスト性等の点において同等若しくは優れている。
【００３５】
更に、本発明の生細胞の検出方法においては、前記工程（２）において、アルカリ性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料をアルカリ性条件下に保つ、あるいは前記工程（２）において、酸性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を酸性条件下に保つことが好ましい。
【００３６】
更にまた、本発明の生細胞の検出方法においては、前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光のうち、前記蛍光染料の蛍光波長の光のみを捕集し、その蛍光像を取り込むことが好ましい。この態様によれば、蛍光染料で染色された生細胞が発する蛍光は撮影されるが、蛍光染料で染色された夾雑物の蛍光は消光染料によって消光され、更に、蛍光染料の蛍光を吸収することで受け取ったエネルギーにより消光染料が発する蛍光は撮影されないので、生細胞のみの蛍光を検出できる。
【００３７】
また、前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光を捕集し、捕集した蛍光をカラー画像として取り込み、前記蛍光染料に由来する蛍光と、それ以外の蛍光とを区別することが好ましい。この態様によれば、生細胞は蛍光染料の蛍光像として撮影され、夾雑物は消光染料の蛍光像（蛍光染料の蛍光より長波長の蛍光を発する）として撮影されるので、撮影した画像に対して蛍光染料の蛍光輝点を測定し、それ以外の輝点を測定しないようにすることで、生細胞のみの蛍光を検出できる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、生細胞及び夾雑物を含む様々な試料、特に食品等に含まれる細菌等を検出する際に、生菌等と共に蛍光染料で染まってしまう夾雑物による測定妨害を低減できるので、正確、簡便、かつ短時間に生菌を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明でいう細胞とは、特に限定されず、例えば、大腸菌、ブドウ球菌、シュードモナス、バチルス、セラチア等の細菌、酵母等の真菌のみならず、動物細胞や植物細胞等も含む意味である。また、生細胞とは、上記細菌や真菌の生菌や生きた細胞等を意味する。
【００４０】
本発明で用いられる蛍光染料は、細胞を蛍光染色できるものであれば特に制限はないが、好ましくは核酸を蛍光標識する物質、酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質等が例示できる。
【００４１】
核酸を蛍光標識する物質としては、細胞膜を透過してDNAと結合する物質であればよく、DAPI（4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride）等が例示できる（文献：シグマ総合カタログ，2004-2005年版，p631）。
【００４２】
また、酵素分解されると蛍光性をもつようになる酵素基質としては、Carboxy fluorescein diacetate（ＣＦＤＡ）、Calcein−AM、carboxyfluorescein diacetate succinimidyl esters、CMFDA、PFB−FDA、5−(and−6)−chloromethyl SNARF−1 acetate、2’,7’−dichlorodihydrofluoresceindiacetate acetate ester、CM−H2DＣＦＤＡ、carboxyeosin diacetate succinimidyl ester等が例示できる（文献：「Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (Ninth Edition)」インビトロジェン株式会社，2002年）。
【００４３】
本発明においては、発ガン性等の安全性やおもに生細胞を染色できる点から、酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質が特に好ましく用いられる。
【００４４】
一方、本発明で用いられる消光染料は、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有するものであれば特に制限されないが、前記蛍光染料の蛍光波長を吸収する共役二重結合を有する化合物が好ましく、そのような化合物として、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物、少なくとも１つの縮合芳香族環を有する芳香族化合物、不飽和炭化水素構造を有する化合物がより好ましく、具体的には、下記構造式（I）〜（IX）に示されるいずれかの化合物又はアントシアン類が好ましく例示できる。
【００４５】
【化１０】
【００４６】
【化１１】
【００４７】
【化１２】
【００４８】
【化１３】
【００４９】
【化１４】
【００５０】
【化１５】
【００５１】
上記構造式（I）〜（III）及び（V）中のＲ１〜Ｒ１１は、水素原子、メチル基、炭素原子が少なくとも２個以上からなる脂肪鎖又は脂肪酸エステル、ヨウ素を示し、同一若しくは異なっていてもよい。
【００５２】
【化１６】
【００５３】
上記構造式（VII）中のＭｅは、鉄、銅又はマグネシウムを示し、Ｒ１〜Ｒ７は炭化水素基、Ｒ８〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００５４】
【化１７】
【００５５】
上記構造式（VIII）中のＲ１〜Ｒ８は炭化水素基、Ｒ９〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００５６】
【化１８】
【００５７】
上記構造式（IX）中のＲ１〜Ｒ４は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示し、ｎは１〜１１の整数である。
【００５８】
上記構造式（I）に示される化合物としては、3’,3’’,5’,5’’−Tetraiodophenolsulfonphthalein、Phenol Red、Cresol Red、m−Cresol Purple、Thymol Blue、Bromothymol Blue、p−Xylenol Blue等が例示できる。
【００５９】
また、上記構造式（II）に示される化合物としてはo−Cresolphthalein、Phenolphthalein等が例示できる。
【００６０】
上記構造式（III）に示される化合物としては、Aurin等が例示できる。
【００６１】
上記構造式（IV）に示される化合物としては、p−Naphtholbenzein等が例示できる。
【００６２】
上記構造式（V）に示される化合物としては、3’,3’’,5’,5’’−Tetraiodophenolsulfonphthalein sodium salt、Phenol Red sodium salt、Cresol Red sodium salt、m−Cresol Purple sodium salt、Thymol Blue sodium salt、Bromothymol Blue sodium salt、p−Xylenol Blue sodium salt等が例示できる。
【００６３】
上記構造式（VI）に示される化合物としては、α−Naphtholphthalein等が例示できる。
【００６４】
上記構造式（VII）、（VIII）に示される化合物としては、ポルフィリン系化合物が例示でき、より具体的には例えば、プロトヘム、プロトクロロフィル、プロトポルフィリン等が例示できる。
【００６５】
上記構造式（IX）に示される化合物としては、不飽和炭化水素構造を有する化合物が挙げられ、より具体的には、β−カロチン、Curcuminが例示でき、また、上記構造式（IX）に示される化合物のうち、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物として、Curcumin、Bis（2,4−dinitrophenyl）acetic Acid Ethyl ester等が例示できる。
【００６６】
さらに、アントシアン類としては、植物由来色素であるペラルゴニン、カリステフィン、フラガリン、シアニン、クリサンテミン、シソニン、ケラシアニン、デルフィニン、ナスニン、ヒアシン、エニン等が例示できる。
【００６７】
上記の消光染料は、生細胞内のｐＨ（通常ｐＨ６．８〜７．４、以下同じ。文献：「Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (Ninth Edition)」、インビトロジェン株式会社、2000年、p829）では、前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、生細胞内のｐＨより弱酸性（約ｐＨ５〜ｐＨ６．８）もしくは弱アルカリ性（約ｐＨ７．４〜９）において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する。
【００６８】
上記の消光染料は、使用する蛍光染料に応じて適宜選択して用いられ、例えば、ＣＦＤＡのような緑色の蛍光を発する蛍光染料や、ＤＡＰＩのような青色の蛍光を発する蛍光染料を用いる場合は、消光染料としてPhenol Red及び／又はCresol Redを用いることが好ましい。
【００６９】
本発明において、上記消光染料が蛍光染料を消光する機構は、その吸収波長域が蛍光染料の発する蛍光の波長域とオーバーラップするようなものを消光染料として用いることにより、夾雑物に由来する蛍光染料の蛍光を吸収・消光するものである。
【００７０】
一般に、同一分子内に電磁エネルギーを吸収する官能基と蛍光を発する官能基が存在する物質の中には前記２つの官能基間で共鳴エネルギー移動が起こる場合があることが知られており、また、２分子間に分かれて前記官能基がある場合においても分子間の共鳴エネルギー移動が起こる場合があることが知られている（文献：「現代化学」，東京化学同人，2002年，p.22）。
【００７１】
そして、ある官能基が、可視−紫外領域の電磁エネルギーを吸収するには、一般に二重結合のπ成分だけが関係していることが知られており、具体例としては、共役二重結合をもつ芳香族環等が挙げられる。一般則として、電子の非局在化される程度が大きいほど電子状態の間隔は密になり、可視−紫外領域の電磁エネルギー吸収帯の波長が長くなることが知られている（文献：「バーロー生命科学のための物理化学 第２版」，東京化学同人，1983年，p.300−312）。
【００７２】
このような芳香族分子は１個又は数個の水素イオンを受け取ったり失ったりしうるため電荷が変化する。そして、その電荷変化は可視−紫外領域の電磁エネルギー吸収帯の波長として観測され、正電荷が増すと分子は電子を強く結合するようになるため、電磁エネルギー吸収帯は短波長の方にシフトし、一方、正電荷が減るか負電荷が増すと長波長の方へシフトすることが知られている。したがって、上記のような消光染料は、ｐＨの違いによって電磁エネルギー吸収帯の波長シフトが起こる。
【００７３】
そこで、蛍光染料で染色した試料を、上記のような消光染料で染色し、細胞の内外でｐＨの違いが生じるような条件下（例えば、細胞を細胞内とは異なるｐＨの溶液に接触させる）においた場合、生細胞内のｐＨは外界のｐＨの影響が緩和されて一定に保たれていると考えられているので（文献：「ブラック微生物」，丸善株式会社，2003年，p152）、生細胞は外部のｐＨの影響を受けにくく、生細胞は蛍光染料の発する蛍光を発する。一方、生細胞以外の夾雑物は外部のｐＨの影響を受けやすいため、上記消光染料が蛍光染料の蛍光を吸収・消光し（実際は、蛍光染料の蛍光より長波長の蛍光を発する）、生細胞とそれ以外の夾雑物を区別することができる。
【００７４】
例えば、図１には、ＣＦＤＡの励起波長及び蛍光波長のスペクトル特性と、ｐＨ８．６におけるフェノールレッド及びクレゾールレッドの吸収波長のスペクトル特性が示されている。図１に示すように、ＣＦＤＡは４７０ｎｍの光を照射すると４８０ｎｍ〜６５０ｎｍの蛍光を発するが、フェノールレッドの吸収波長は上記ＣＦＤＡの蛍光波長とオーバーラップしており、フェノールレッドはＣＦＤＡの蛍光を吸収・消光し、５５０ｎｍ〜８００ｎｍの赤色を発する。
【００７５】
以下、本発明の生細胞の検出方法について説明する。
【００７６】
（１）試料に蛍光染料を添加し、若しくは接触させて細胞を蛍光染色する工程
本発明においては、試料に直接蛍光染料溶液を添加することにより細胞を染色することもできるが、以下の（i）〜（iii）に示すように、試料中の細胞をフィルタや粘着シート等に固定した後、蛍光染料で染色することもできる。
【００７７】
（i）試料中の細胞を採取するために、適量の液体状の試料をフィルタで濾過する。これにより、フィルタの濾過面上に、試料中の細胞等（生きた細胞、死んだ細胞やゴミ等の夾雑物）がトラップされる。上記フィルタとしては、ポリカーボネイト、ポリエステル等の材質からなる孔径０．２〜０．６μｍの黒色若しくは透明のメンブレンフィルタを用いることができる。このようなメンブレンフィルタとしては、例えば、商品名「Nuclepore Track-Etch Membrane」（Whatman製）、商品名「Isopore Membrane Filters」（MILLIPORE製）、商品名「MEMBRANE FILTERS POLYCARBONATE」（東洋濾紙株式会社製）等の市販のものを用いることができる。
【００７８】
なお、試料の種類によっては、脱脂、除タンパク、濾過、遠心分離等の前処理を行ってから用いることが好ましく、液体状でない試料を用いる場合は、ミキサーやストマッカー等の破砕分散装置により細胞を液体に抽出してから用いればよい。
【００７９】
（ii）採取した細胞の転写
上記（i）で得られたフィルタ上にトラップされた細胞をそのまま蛍光染色することもできるが、上記フィルタの濾過面全体に粘着シートを貼り付け、粘着シートの粘着層にフィルタ上にトラップされた細胞を転写してから蛍光染色してもよい。
【００８０】
粘着シートとしては、上記フィルタ上にトラップされた細胞を捕捉するのに十分な粘着性を有すると共に平滑な表面構造を有する粘着層が基材上に積層された構造からなるものを用いることができる。
【００８１】
また、粘着層としては、上記フィルタ上にトラップされた細胞を捕捉するのに十分な粘着性を有していれば特に限定されないが、細胞の染色に用いる蛍光染料が粘着層に含浸しにくいこと及び粘着層が溶けて捕捉した細胞が移動しにくいことなどから、例えば、アクリル系粘着剤やゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の非水溶性粘着材を用いることが好ましい。
【００８２】
アクリル系粘着剤としては、具体的には、モノマーとして（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステルを主成分として少なくとも１種類以上用い、これに共重合性モノマーとして（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸エトキシエチル、（メタ）アクリル酸ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸エチレングリコール等の親水性モノマーを１種若しくは２種以上共重合させたものを用いることができる。なお、上記のような粘着剤からなる粘着層は、その粘着特性をより良好にするためにイソシアネート化合物、有機過酸化物、エポキシ基含有化合物、金属キレート化合物等の熱架橋剤による処理を行ったり、保形性を良好にするために紫外線、γ線、電子線等の放射線照射による処理を行って架橋を施すことが好ましい。
【００８３】
ゴム系粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリイソプレン、ポリブテン、スチレン−イソプレン系ブロック共重合体、スチレン−ブタジエン系ブロック共重合体等の主ポリマーに、粘着性付与樹脂としてロジン系樹脂やテルペン系樹脂、クロマン−インデン系樹脂、テルペン−フェノール系樹脂、石油系樹脂を配合したものを用いることができる。
【００８４】
シリコーン系粘着剤としては、ジメチルポリシロキサンを主成分とする粘着剤が例示できる。
【００８５】
本発明においては、蛍光画像取得に際して光学特性に影響が少ないという点から、透明性の高いアクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤がより好ましく用いられる。
【００８６】
粘着層の厚みは、フィルタへの接着性や追従性、細胞の捕捉性の点から５〜１００μｍとすることが好ましい。また、捕捉した細胞の蛍光画像の取得に際して蛍光画像取得手段の焦点の合致範囲が広くなり、より正確な画像処理を可能とするために、粘着層表面の平滑度（凹凸差）は２０μｍ以下であることが好ましい。平滑度は、表面粗さ針や電子顕微鏡等で粘着シートの断面を観察し、粘着剤表面の凸部の頂点から凹部の最低点までの平均高さを測定して求めることができる。
【００８７】
また、粘着シートの基材は、粘着層表面に大きな凹凸を形成させず、また、曲面や狭所表面にも自在に圧着し得る柔軟な材質であれば特に限定されず、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、織布、不織布、紙、ポリエチレンラミネート紙等を用いることができ、中でも平滑性の高いポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタンが好ましく用いられる。
【００８８】
また、基材の厚さは、支持体として十分な強度があればよく、５〜２００μｍ程度が好ましい。
【００８９】
粘着シートは、上記粘着剤からなる粘着層を公知の方法によって上記基材上に形成することにより製造することができ、その使用に際しては任意の形状に裁断して用いることができる。
【００９０】
（iii）蛍光染色
上記（i）で得られたフィルタ上にトラップされた細胞あるいは上記（ii）で得られた粘着シートに転写された細胞を蛍光染料で染色する。
【００９１】
例えば、蛍光染料としてＣＦＤＡを用いる場合は、緩衝液（ｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７．６〜８．６のリン酸緩衝液）に、ＣＦＤＡを好ましくは３００〜３，０００μｇ／ｍＬとなるように溶解した蛍光染料溶液を用いる。また、蛍光染料としてＤＡＰＩを用いる場合は、緩衝液（ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８のリン酸緩衝液）に、ＤＡＰＩを好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した蛍光染料溶液を用いる。蛍光染料の濃度が薄すぎると細胞を十分に染色することができず、蛍光染料の濃度が濃すぎるとゴミ等の夾雑物が強く染色されてしまい、消光染料によって消光しにくくなるため好ましくない。
【００９２】
蛍光染料溶液は、雑菌の混入を防ぐために０．２μｍのフィルタで濾過しておく。また、長期保存する際には、必要に応じてアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加でき、例えば、アジ化ナトリウムの最終濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍＬ程度になるよう添加すればよい。
【００９３】
蛍光染料による細胞の染色は、上記のフィルタの濾過面あるいは上記の粘着シートの粘着層（集菌面）上に適量の蛍光染料溶液を滴下して広げる、又は該フィルタや粘着シートを蛍光染料溶液に浸漬し、２〜４０℃で３０秒〜３分間放置した後、余分な蛍光染料溶液を洗浄液で洗い流せばよい。
【００９４】
上記洗浄液は、使用した蛍光染料の発色に適したｐＨの緩衝液が好ましく、例えば、蛍光染料としてＣＦＤＡを用いた場合は、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ７．６〜８．６のリン酸緩衝液が好ましい。この緩衝液は、０．２μｍのフィルタで濾過してから用いる。
【００９５】
（２）前記蛍光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を添加し、若しくは接触させる工程
消光染料は、用いる染料に応じて適当なｐＨ（生細胞内のｐＨより弱酸性（約ｐＨ５〜６．８）もしくは弱アルカリ性（約ｐＨ７．４〜９）であって、且つ生細胞内のｐＨと異なるｐＨ）の緩衝液に溶解して用いられる。消光染料溶液のｐＨが極端に酸性やアルカリ性であると、蛍光染料の蛍光を十分に吸収・消光できなかったり、生細胞が死ぬおそれがあるため好ましくない。
【００９６】
例えば、消光染料としてフェノールレッドを用いる場合は、緩衝液（好ましくはｐＨ８〜９、より好ましくはｐＨ８．６のリン酸緩衝液）に、フェノールレッドを好ましくは１〜３０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した消光染料溶液を用いる。
【００９７】
図２にフェノールレッド（0.01mg/mL）の各ｐＨでの吸収スペクトル特性を示す。図２から、ｐＨが低下するほど５５０ｎｍ付近の吸収が低下し、ｐＨ７以下では最大吸収波長が５５０ｎｍ付近から４４０ｎｍ付近に変わっていることが分かる。したがって、生細胞内外におけるｐＨの相違に応じて消光染料の吸収強度の違いがあれば、生細胞とそれ以外の夾雑物を区別できることとなる。そこで、フェノールレッドを消光染料に用いた場合は、５５０ｎｍ付近の吸収強度に違いが生じるｐＨの条件（好ましくはｐＨ８〜９、より好ましくはｐＨ８．６）で染色処理を行う。なお、後述する実施例２の図５において、消光の程度は弱いが、ｐＨ６やｐＨ７でも夾雑物の消光ができているように見えるのは、夾雑物より生細胞のＣＦＤＡの蛍光が強かったこと、そして、フェノールレッドの５５０ｎｍ付近の吸収強度がｐＨ６やｐＨ７でも完全に無くなっていないため、夾雑物のＣＦＤＡの蛍光をフェノールレッドが若干消光したためである。
【００９８】
また、クレゾールレッドを用いる場合は、上記と同様の緩衝液に、クレゾールレッドを好ましくは０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜２．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した消光染料溶液を用いる。消光染料の濃度が薄過ぎると、夾雑物に由来する蛍光染料の蛍光を十分に消光できなくなり、検出の誤差が大きくなる。一方、消光染料の濃度が濃過ぎると、例えば、フェノールレッドを用いた場合には生細胞の蛍光が弱くなり、クレゾールレッドを用いた場合には視野全体が緑に発色してしまい、生細胞を検出しにくくなる。
【００９９】
消光染料溶液は、雑菌の混入を防ぐために０．２μｍのフィルタで濾過しておく。また、長期保存する際には、必要に応じてアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加でき、例えば、アジ化ナトリウムの最終濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍＬ程度になるよう添加すればよい。
【０１００】
消光染料による染色は、上記のフィルタの濾過面あるいは上記の粘着シートの粘着層（集菌面）上に適量の消光染料溶液を滴下して広げる、又は該フィルタや粘着シートを消光染料溶液に浸漬し、２〜４０℃で１〜１０秒間放置した後、余分な消光染料溶液をブロワで吹き飛ばせばよい。
【０１０１】
なお、試料と蛍光染料溶液と消光染料溶液とを混合して染色後、フィルターで濾過した後、適宜、上記粘着シートに転写してもよい。
（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程
上記のようにして、蛍光染料と消光染料で染色したフィルタあるいは粘着シートに、蛍光染料の励起光（例えば、ＣＦＤＡの場合は波長４００〜４９５ｎｍ）を照射し、フィルタの濾過面あるいは粘着シートの粘着層表面上の蛍光の画像をＣＣＤカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等によって取り込む。
【０１０２】
本発明においては、蛍光の画像を取り込む際に、蛍光染料の蛍光波長の光のみを透過させる光学フィルタ等を介して生細胞の発する蛍光染料の蛍光のみを画像として取り込むことが好ましい。例えば、蛍光染料としてＣＦＤＡを用いた場合は、上記光学フィルタとして、波長５１０〜５５０ｎｍの光を透過するが波長５５０ｎｍより大きい光は透過しないフィルタが好ましく用いられる。
【０１０３】
上記のようにして取り込まれた画像では、蛍光染料で染色された夾雑物の蛍光は消光染料によって吸収・消光され、更に、蛍光染料の蛍光を吸収することで受け取ったエネルギーにより消光染料が発する蛍光は撮影されないので、蛍光染料に由来する蛍光を発する生細胞が輝点として検出できる。この輝点（生細胞）の検出は、目視で行ってもよいが、例えば、商品名「Optimas」（MEDIA CYBERNETICS社製）等の市販の画像解析ソフトを用いて行うこともできる。
【０１０４】
なお、検数のノイズとなりうる微弱な発光に対しては、減光光学フィルタを介して蛍光画像を取り込んでノイズを削除する、あるいは画像処理で閾値を設定して電気的に処理することが好ましい。このような画像処理は、例えば以下のようにして行うことができる。
【０１０５】
・バックグラウンドノイズを除くために所定値（スレッショルド値）以下の画素は黒色にする。なお、スレッショルド値は使用者が設定する。
【０１０６】
・背景除去処理（ＣＣＤカメラの不良による輝点、ステージの傾きによる輝度の違いを補正）
・エッジの検出（ソーベル、プレヴィット等の画像処理フィルタで処理）
・２値化処理
・各輝点のナンバリングと面積計算
を行った後、使用者が設定した所定のサイズに合致する輝点を検出する。
【０１０７】
また、本発明においては、蛍光染料に由来する蛍光と消光染料に由来する蛍光をカラー画像として取り込むこともできる。
【０１０８】
上記のようにして取り込まれた画像では、生細胞は蛍光染料に由来する蛍光を発する輝点として撮影され、夾雑物は消光染料に由来する蛍光（蛍光染料の蛍光より長波長の蛍光を発する）を発する輝点として撮影されるので、蛍光染料に由来する蛍光を発する輝点（生細胞）を、目視、あるいは上記のような市販の画像解析ソフトを用いて検出する。なお、上記の場合と同様に、検数のノイズとなりうる微弱な発光に対しては、減光光学フィルタを介して蛍光画像を取り込んでノイズを削除してもよく、画像処理で閾値を設定して電気的に処理してもよい。
【０１０９】
なお、本発明においては、蛍光画像を取り込む際に、検出する細胞のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるように、レンズ等の光学素子を用いて拡大してから取り込むことが好ましい。拡大倍率は、検出する細胞のサイズに応じて適宜選択すればよいが、通常、１０〜１０００倍で十分である。
【０１１０】
そして、上記のようにして検出された輝点（生細胞）の数から、試料中に含まれる生細胞数を以下のようにして算出することができる。例えば、「食品衛生管理指針（微生物版）」（厚生省生活衛生局監修、社団法人日本食品衛生協会）の総菌数測定方法に記載されているように、１６視野以上観察し、観察した視野の輝点（生細胞）数の合計（Ａ）を求める。そして、測定に供した液体試料の体積（Ｖ）と、フィルタの濾過面積（Ｓｍ）と、観察視野総面積（Ｓｐ）とから下記式に基づいて試料の生細胞数（Ｃ）を算出すればよい。
Ｃ＝Ａ×Ｓｍ／（Ｓｐ×Ｖ）
図３には、本発明の生細胞の検出方法において好適に用いられる検出装置の一実施形態が示されている。
【０１１１】
この検出装置１０は、固定台２、鏡筒３、レンズ４、バンドパスフィルタ５、画像取り込み手段６、励起光源７、バンドパスフィルタ８、ダイクロイックミラー９とから構成されており、固定台２上に固定されたサンプル１（フィルタ上に固定、あるいは粘着シート上に転写され、蛍光染料及び消光染料で染色された試料）に、励起光源７、バンドパスフィルタ８、鏡筒３、ダイクロックミラー９、レンズ４から構成される励起光を照射する光学的手段によって、蛍光染料の励起光が照射されるようになっている。
【０１１２】
そして、前記サンプル１が発する蛍光の画像は、レンズ４、ダイクロックミラー９、鏡筒３、バンドパスフィルタ５から構成される蛍光を捕集する光学的手段を介して、画像取り込み手段６に取り込まれるようになっている。すなわち、前記サンプル１が発する蛍光の画像は、検出する細胞のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるようにレンズ４で拡大されると共に、蛍光染料の蛍光波長の光は透過するが、消光染料の発する波長の光は透過しないバンドパスフィルタ５を介することにより、生細胞から発せられる蛍光染料の蛍光のみが画像取り込み手段６に取り込まれるようになっている。
【０１１３】
前記画像取り込み手段としては、例えば、ＣＣＤカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等を用いることができ、前記バンドパスフィルタ５を使用しない場合は、前記画像取り込み手段としてカラーカメラを用いて、蛍光染料に由来する蛍光と消光染料に由来する蛍光をカラー画像として取り込めばよい。
【０１１４】
なお、上記検出装置１０は、更に、前記画像取り込み手段６に取り込まれた蛍光画像を、蛍光染料による蛍光の発光を捕らえて画像処理する手段と、前記処理した画像から輝点の数をカウントする手段を備えていてもよい。
【０１１５】
前記画像処理する手段及び前記輝点の数を検出する手段としては、コンピュータを用いることができ、例えば、上記（３）で説明したような画像処理プログラム及び画像解析プログラムを有するコンピュータを用いることができる。
【０１１６】
以下に、蛍光染料としてＣＦＤＡ、消光染料としてフェノールレッド又はクレゾールレッドを使用し、検出装置１０を用いて生細胞を検出する場合について説明する。
【０１１７】
励起光源７から出た光は、波長４００ｎｍ〜４９５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルタ８を通り、次いで、波長５００ｎｍ以下の光は反射して５００ｎｍ以上の光は透過するダイクロイックミラー９で反射され、波長４００〜４９５ｎｍの励起光がサンプル１に照射される。
【０１１８】
図１に示したように、ＣＦＤＡの蛍光波長と、フェノールレッド又はクレゾールレッドの吸収波長がオーバーラップするのでフェノールレッド又はクレゾールレッドはＣＦＤＡの蛍光を吸収・消光し、消光染料で染色された夾雑物は５５０〜８００ｎｍの赤色を発する。
【０１１９】
したがって、この蛍光画像を、波長５１０〜５５０ｎｍの光は透過するが５５０ｎｍより波長の大きい光は透過しないバンドパスフィルタ５を介して画像取り込み手段６に取り込んだ場合は、ｐＨの影響を受け難い生細胞に由来するＣＦＤＡの緑色光（波長５１０〜５５０ｎｍ）は撮影されるが、ｐＨの影響を受ける生細胞以外の夾雑物の発する赤色光（５５０ｎｍより波長の大きい光）は撮影されず、ＣＦＤＡで蛍光染色された生細胞のみが輝点として検出される。
【０１２０】
一方、この蛍光画像を、画像取り込み手段６としてカラーカメラを用い、前記バンドパスフィルタ５を介さずに取り込んだ場合は、生細胞はＣＦＤＡに由来する緑色光として、生細胞以外の夾雑物はフェノールレッド又はクレゾールレッドに由来する赤色光として撮影される。
【実施例１】
【０１２１】
以下の試薬を調製して用いた。
【０１２２】
・界面活性剤溶液：１０％トリトンＸ−１００水溶液を無菌濾過したもの
・タンパク質分解酵素溶液：２％トリプシン溶液（溶媒は生理食塩水）を無菌濾過したもの
・蛍光染料溶液：ＣＦＤＡを３００μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・消光染料溶液：フェノールレッドを１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・洗浄液：リン酸緩衝液（ｐＨ８．６）
試料である生乳１ｍＬと、上記界面活性剤溶液２０μＬと、上記タンパク質分解酵素溶液２５０μＬとを、マイクロチューブ（トレフ社製１．５ｍＬ微量遠心チューブ、型番No.96.7246.9.01をオートクレーブ滅菌して使用）に入れて、試験管ミキサーで１０秒混合した。そして、４２℃の恒温水槽に上記マイクロチューブを浮かべ、１０分間保温した後、室温（約２５℃）で３分間遠心分離（７３００×ｇ）した。
【０１２３】
マイクロチューブを逆さまにして上澄みを捨て、乳脂肪を滅菌済み綿棒で拭いて除いた後、マイクロチューブにＰＢＳを１００μＬ入れ、ピペットで吸引と吐出を繰返して沈殿を懸濁した後、更にＰＢＳを１ｍＬ入れて菌体を分散させた。
【０１２４】
孔径０．４μｍのメンブレンフィルタ（商品名「Nuclepore Track-Etch Membrane」、Whatman製、直径２５ｍｍ）をセットした濾過器に、生理食塩水１０ｍＬを入れた後、上記試料を加えて濾過した（ファンネルの内径８ｍｍ、濾過面積２０１ｍｍ２）。
【０１２５】
濾過器のファンネル部分を外してメンブレンフィルタを取り出し、該メンブレンフィルタの濾過面にセロファンテープ状の無蛍光な粘着シート（日東電工株式会社製）を貼り付けて、メンブレンフィルタ上の菌体等を粘着シートの粘着面に転写した。
【０１２６】
そして、菌体等を転写した粘着シートの粘着面に、ＣＦＤＡ溶液を３００μＬ滴下して広げ、２５℃で１分間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄し、余分なＣＦＤＡを洗い流した。
【０１２７】
次いで、粘着シートの粘着面に消光染料溶液を３００μＬ滴下して広げ、２５℃で１０秒間静置し、粘着シートの粘着面の水分をブロワで吹き飛ばした後、図３に示す装置で輝点（生菌）の検出を行った（画像取り込み手段６としてカラーカメラを用い、バンドパスフィルタ５を介さずに撮影）。なお、ＣＦＤＡのみで染色したものを用いて同様にして輝点（生菌）の検出を行った。それらの結果を図４に示す。
【０１２８】
図４に示すように、試料をＣＦＤＡで染色後、フェノールレッドで染色した場合（ａ）は、試料をＣＦＤＡのみで染色した場合（ｂ）に比べて、生菌を示す輝点が明瞭に検出できることが分かる。
【実施例２】
【０１２９】
大腸菌を添加した固形食品（ほうれん草のナムル）を用いて、生菌の検出を行った。なお、固形食品中の生菌を液体に抽出する処理は、「食品衛生検査指針 微生物編」（社団法人 日本食品衛生協会，1990年）を参考にした。
【０１３０】
すなわち、大腸菌（約１０７個程度）を添加した固形食品（ほうれん草のナムル）１０ｇをストマック袋（ポリエチレンのような柔軟性のあるプラスチックフィルムで作られており、放射線による滅菌処理が施されている。また、内部には不織布や直径０．２８ｍｍ程の穴のあけたプラスチックフィルムで仕切られた部分があり、そこから大きな固形物を除いた液部を採取することができるようになっている。）に量り取り、滅菌リン酸緩衝液９０ｍＬを加え、ストマッカーにかけ、この固形食品を粉砕分散した。なお、ストマッカーとは、固定された板とパドルの間に食品を入れたストマック袋を置き、パドルを前後させることで袋ごと食品を圧縮して食品を粉砕分散し、食品中の生菌を液体に抽出する装置である。
【０１３１】
そして、ストマック袋から液部を回収し、これを用いて実施例１とほぼ同様の手順で生菌を検出した。その結果を図５、６に示す。
【０１３２】
図５は、蛍光染料として用いたＣＦＤＡ溶液と消光染料として用いたフェノールレッド溶液のｐＨを変えた場合（各溶液のｐＨは同じ）における生菌の検出効果を示す図である。図５に示すように、ｐＨ６〜８．６のＣＦＤＡ溶液とフェノールレッド溶液を用いた場合、夾雑物は消光され、生菌を示す輝点が明瞭に検出できることが分かる。一方、ｐＨ５のＣＦＤＡ溶液とフェノールレッド溶液を用いた場合は、生菌が蛍光染色されておらず、不適であることが分かる。
【０１３３】
また、図６（ａ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートを何も染色せずにそのまま蛍光顕微鏡で撮影した蛍光像、（ｂ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートをフェノールレッド溶液（ｐＨ７）だけで染色して蛍光顕微鏡で撮影した蛍光像である。図６（ａ）には生菌を示す輝点が観察されないが、（ｂ）では、生菌を示す輝点が多数観察され、フェノールレッドが生菌内に入り込んでいることが分かる。
【０１３４】
以上の結果から、消光染料として用いたフェノールレッドは、生菌内では蛍光染料の蛍光を吸収して消光することはなく、生菌以外の夾雑物等に由来する蛍光染料の蛍光のみを吸収して消光していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明の生細胞の検出方法は、医薬、農薬、食品衛生管理等の分野や医学、薬学、生物学等の研究分野において、生細胞の検出、測定に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＣＦＤＡの励起波長及び蛍光波長のスペクトル特性と、フェノールレッド及びクレゾールレッドの吸収波長のスペクトル特性を示す図である。
【図２】フェノールレッド（0.01mg/mL）の各ｐＨでの吸収スペクトル特性を示す図である。
【図３】本発明で用いられる生細胞の検出装置の一実施形態を示す模式図である。
【図４】本発明の方法により生乳中の菌を検出した結果を示す図であり、（ａ）はＣＦＤＡで染色後、フェノールレッドで染色し、蛍光顕微鏡で観察した場合の結果を示す図であり、（ｂ）はＣＦＤＡのみで染色し、蛍光顕微鏡で観察した場合の結果を示す図である。
【図５】ＣＦＤＡ溶液とフェノールレッド溶液のｐＨを変えた場合における生菌の検出効果を示す図である。
【図６】大腸菌の中に消光染料であるフェノールレッドが入り込み、染色されていることを示す図であり、（ａ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートを何も染色せずにそのまま蛍光顕微鏡で撮影した結果を示す図、（ｂ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートをフェノールレッド溶液（ｐＨ７）だけで染色して蛍光顕微鏡で撮影した結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１３７】
１．サンプル
２．固定台
３．鏡筒
４．レンズ
５、８．バンドパスフィルタ
６．画像取り込み手段
７．励起光源
９．ダイクロイックミラー
１０．生細胞の検出装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の生細胞を検出する方法に関し、詳細には、試料を蛍光染料及び消光染料を用いて染色することにより、生細胞とゴミ等の夾雑物との判別が容易に可能で、正確に生細胞を検出できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬、農薬、食品衛生管理等の分野や医学、薬学、生物学等の研究分野においては、品質管理、安全性や薬効の評価等のために、試料に含まれる生細胞を検出、測定することが多い。
【０００３】
そのため、より迅速かつ簡便に生細胞を検出、測定する方法として、染色試薬を用いて生細胞を染色して検出する方法が提案されている。
【０００４】
例えば、下記特許文献１には、菌類を染色する蛍光染料としてフルオレセインジアセテートとヨウ化プロピジウムを用い、菌類をこれらの蛍光染料で二重染色し、染色した菌類に対して励起光を照射することにより、フルオレセインジアセテートで染色された生菌細胞が発する特定波長の蛍光発光と、ヨウ化プロピジウムで染色された死菌細胞が発する特定波長の蛍光発光とを検出して、蛍光発光の数から生菌細胞と死菌細胞の数を計測する方法が記載されている。
【０００５】
下記特許文献２には、死菌細胞のみを蛍光発光させる蛍光試薬で検体となる菌類全体を染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第１のステップと、前記検体となる菌類全体に殺菌処理を施した上で、当該殺菌処理した菌類全体を前記蛍光試薬で再度染色して、蛍光発光した死菌細胞数を計測する第２ステップで計測した数とを比較することにより、生菌細胞数及び死菌細胞数を計測することを特徴とする微生物計測方法が開示されている。
【０００６】
下記特許文献３には、死細胞のみを染色する核酸蛍光染色剤を作用させた測定試料が発する蛍光の強度と、該核酸蛍光染色剤を作用させる処理及び細胞膜を損傷させる処理を施した測定試料が発する蛍光の強度とを各々測定し、両強度を対比することを特徴とする生存細胞数及び／又は細胞生存率の測定方法が開示されている。
【０００７】
下記特許文献４には、細胞を含む試料に色素又は蛍光性酵素基質を添加して色素又は蛍光を検出又は測定することを含む生細胞の検出方法において、細胞膜を透過できず、且つ上記色素又は蛍光性酵素基質の発光を吸収する吸収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴とする方法が開示されている。そして、蛍光性酵素基質として、５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、カルセインアセトキシメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレセイン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群から選択される化合物を用いること、また、色素として、アクリジンオレンジ、ビスベンズイミドフルオロクロム三塩酸塩、４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール、「ＳＹＴＯ９」、「ＳＹＴＯ１０」、「ＳＹＴＯ１１」、「ＳＹＴＯ１２」、「ＳＹＴＯ１３」、「ＳＹＴＯ１４」、「ＳＹＴＯ１５」、「ＳＹＴＯ１６」、「ＳＹＴＯ１７」、「ＳＹＴＯ２０」、「ＳＹＴＯ２１」、「ＳＹＴＯ２２」、「ＳＹＴＯ２３」、「ＳＹＴＯ２４」、「ＳＹＴＯ２５」（上記カッコ内はいずれも商品名、Molecular Probes社製）、ヘキシジウムイオダイド及びジヒドロエチジウムよりなる群から選択される化合物を用い、また、吸収体として、チトクロームＣ、ヘモグロビン及びブルーデキストランよりなる群から選択される化合物を用いることが記載されている。
【０００８】
下記特許文献５には、蛍光染料として生細胞のみに蓄積される染料を用い、消光染料として前記蛍光染料を消光でき、且つ死細胞に浸透できるが生細胞には排除される染料を用いて生細胞を含む試料を染色し、該試料の蛍光強度を計測することで相対的な生細胞数を計測する方法が開示されている。そして、蛍光染料としてフルオレセインジアセテート、消光染料としてeosin Yを組み合わせて用いること、あるいは蛍光染料としてcalcein−AM、消光染料としてトリパンブルーを組み合わせて用いることが記載されている。
【０００９】
下記非特許文献１には、生細胞を蛍光発光させる試薬としてカルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）を用い、生細胞から漏れるＣＦＤＡ蛍光を消光するためにヘモグロビンを用いて試料を二重染色し、染色した試料に励起光を照射することにより、CFDAで染色された生細胞が発する蛍光発光を蛍光顕微鏡に接続したフォトマルチプライヤーで検出して、蛍光発光強度から生細胞数を計測する方法が記載されている。
【特許文献１】特許２９７９３８３号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９６９５号公報
【特許文献３】特開平１０−９９０９６号公報
【特許文献４】特開２００２−３４５９４号公報
【特許文献５】米国特許公報６,４５９,８０５号
【非特許文献１】Y. Hansson et al. ; Journal of Immunological Methods, 100 (1987) pp.261-267
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記特許文献１に記載された方法は、フルオレセインジアセテートが分解されやすく、生菌以外の夾雑物も染色されてしまうため、試料に生菌と死菌と菌以外の夾雑物とが一緒に含まれる場合は、正確な生菌数を測定できないという欠点があった。
【００１１】
また、上記特許文献２に記載された方法は、殺菌処理が必要なため煩雑であるだけでなく、殺菌条件が測定に影響を与えやすく、殺菌条件を十分に検討する必要がある等の欠点があった。
【００１２】
また、上記特許文献３に記載された方法も同様に、細胞膜を損傷させる処理が必要なため煩雑である、その処理条件を検討する必要がある、細胞壁を有する細胞は測定できないなど測定対象が限定されてしまう、トリパンブルーは有害物であり、取り扱いに注意を要するといった欠点があった。
【００１３】
また、上記特許文献４や上記非特許文献１に記載された方法は、色素又は蛍光性酵素基質の発光を吸収する吸収体としてチトクロームＣ、ヘモグロビン等のタンパク質を用いるため、試薬の冷蔵保存が必要であり、品質が安定し難く、また、ブルーデキストランは高価であるといった欠点があった。
【００１４】
また、上記特許文献５に記載された方法は、試料を蛍光染料で染色するために比較的時間（３０分）かかり、測定の迅速性に問題があった。また、消光染料として用いられるeosin Yが、カルボキシフルオレセインジアセテートの蛍光波長である５５０〜６５０ｎｍ部分を吸収できないため、eosin Yがフルオレセインジアセテートの蛍光を十分に消光できないという欠点があった。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、試料中の生細胞を、迅速、簡便かつ正確に検出、測定することができ、更には、試薬の安全性、保存安定性、コスト性等に優れた生細胞の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の生細胞の検出方法は、（１）試料に蛍光染料を添加し、若しくは接触させて細胞を蛍光染色する工程と、（２）前記蛍光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を添加し、若しくは接触させる工程と、（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程とを有する生細胞の検出方法であって、前記工程（２）において、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で添加し、若しくは接触させ、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下に保つことを特徴とする。
【００１７】
本発明の生細胞の検出方法によれば、試料を、蛍光染料と、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料とを用いて二重染色し、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下に保つことにより、前記蛍光染料によって染色された夾雑物に由来する蛍光を前記消光染料が吸収・消光するので、夾雑物の影響を排除することができ、試料中の生細胞を、迅速、簡便かつ正確に検出、測定することができる。
【００１８】
本発明の生細胞の検出方法においては、前記蛍光染料として、おもに生細胞を染色できる蛍光染料を使用することが好ましい。この態様によれによれば、夾雑物の影響を更に排除することができる。
【００１９】
また、前記蛍光染料として、核酸を蛍光標識する物質、又は酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質を用いることが好ましい。この態様によれば、試料中の生細胞を迅速かつ簡便に染色することができる。
【００２０】
また、前記消光染料は、前記蛍光染料の蛍光波長を吸収する共役二重結合を有する化合物であることが好ましく、そのような化合物として、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物、少なくとも１つの縮合芳香族環を有する芳香族化合物、不飽和炭化水素構造を有する化合物がより好ましく、具体的には、下記構造式（I）〜（IX）に示されるいずれかの化合物又はアントシアン類が好ましい。
【００２１】
【化１】
【００２２】
【化２】
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
【００２６】
【化６】
【００２７】
上記構造式（I）〜（III）及び（V）中のＲ１〜Ｒ１１は、水素原子、メチル基、炭素原子が少なくとも２個以上からなる脂肪鎖又は脂肪酸エステル、ヨウ素、臭素を示し、同一若しくは異なっていてもよい。
【００２８】
【化７】
【００２９】
上記構造式（VII）中のＭｅは、鉄、銅又はマグネシウムを示し、Ｒ１〜Ｒ７は炭化水
素基、Ｒ８〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００３０】
【化８】
【００３１】
上記構造式（VIII）中のＲ１〜Ｒ８は炭化水素基、Ｒ９〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００３２】
【化９】
【００３３】
上記構造式（IX）中のＲ１〜Ｒ４は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示し、ｎは１〜１１の整数である。
【００３４】
これらの消光染料は、蛍光染料で非特異的に染色される夾雑物を効果的に消光することができる。また、従来用いられていた消光染料に比べて、安全性、保存安定性、コスト性等の点において同等若しくは優れている。
【００３５】
更に、本発明の生細胞の検出方法においては、前記工程（２）において、アルカリ性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料をアルカリ性条件下に保つ、あるいは前記工程（２）において、酸性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を酸性条件下に保つことが好ましい。
【００３６】
更にまた、本発明の生細胞の検出方法においては、前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光のうち、前記蛍光染料の蛍光波長の光のみを捕集し、その蛍光像を取り込むことが好ましい。この態様によれば、蛍光染料で染色された生細胞が発する蛍光は撮影されるが、蛍光染料で染色された夾雑物の蛍光は消光染料によって消光され、更に、蛍光染料の蛍光を吸収することで受け取ったエネルギーにより消光染料が発する蛍光は撮影されないので、生細胞のみの蛍光を検出できる。
【００３７】
また、前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光を捕集し、捕集した蛍光をカラー画像として取り込み、前記蛍光染料に由来する蛍光と、それ以外の蛍光とを区別することが好ましい。この態様によれば、生細胞は蛍光染料の蛍光像として撮影され、夾雑物は消光染料の蛍光像（蛍光染料の蛍光より長波長の蛍光を発する）として撮影されるので、撮影した画像に対して蛍光染料の蛍光輝点を測定し、それ以外の輝点を測定しないようにすることで、生細胞のみの蛍光を検出できる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、生細胞及び夾雑物を含む様々な試料、特に食品等に含まれる細菌等を検出する際に、生菌等と共に蛍光染料で染まってしまう夾雑物による測定妨害を低減できるので、正確、簡便、かつ短時間に生菌を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明でいう細胞とは、特に限定されず、例えば、大腸菌、ブドウ球菌、シュードモナス、バチルス、セラチア等の細菌、酵母等の真菌のみならず、動物細胞や植物細胞等も含む意味である。また、生細胞とは、上記細菌や真菌の生菌や生きた細胞等を意味する。
【００４０】
本発明で用いられる蛍光染料は、細胞を蛍光染色できるものであれば特に制限はないが、好ましくは核酸を蛍光標識する物質、酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質等が例示できる。
【００４１】
核酸を蛍光標識する物質としては、細胞膜を透過してDNAと結合する物質であればよく、DAPI（4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride）等が例示できる（文献：シグマ総合カタログ，2004-2005年版，p631）。
【００４２】
また、酵素分解されると蛍光性をもつようになる酵素基質としては、Carboxy fluorescein diacetate（ＣＦＤＡ）、Calcein−AM、carboxyfluorescein diacetate succinimidyl esters、CMFDA、PFB−FDA、5−(and−6)−chloromethyl SNARF−1 acetate、2’,7’−dichlorodihydrofluoresceindiacetate acetate ester、CM−H2DＣＦＤＡ、carboxyeosin diacetate succinimidyl ester等が例示できる（文献：「Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (Ninth Edition)」インビトロジェン株式会社，2002年）。
【００４３】
本発明においては、発ガン性等の安全性やおもに生細胞を染色できる点から、酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質が特に好ましく用いられる。
【００４４】
一方、本発明で用いられる消光染料は、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有するものであれば特に制限されないが、前記蛍光染料の蛍光波長を吸収する共役二重結合を有する化合物が好ましく、そのような化合物として、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物、少なくとも１つの縮合芳香族環を有する芳香族化合物、不飽和炭化水素構造を有する化合物がより好ましく、具体的には、下記構造式（I）〜（IX）に示されるいずれかの化合物又はアントシアン類が好ましく例示できる。
【００４５】
【化１０】
【００４６】
【化１１】
【００４７】
【化１２】
【００４８】
【化１３】
【００４９】
【化１４】
【００５０】
【化１５】
【００５１】
上記構造式（I）〜（III）及び（V）中のＲ１〜Ｒ１１は、水素原子、メチル基、炭素原子が少なくとも２個以上からなる脂肪鎖又は脂肪酸エステル、ヨウ素を示し、同一若しくは異なっていてもよい。
【００５２】
【化１６】
【００５３】
上記構造式（VII）中のＭｅは、鉄、銅又はマグネシウムを示し、Ｒ１〜Ｒ７は炭化水素基、Ｒ８〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００５４】
【化１７】
【００５５】
上記構造式（VIII）中のＲ１〜Ｒ８は炭化水素基、Ｒ９〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【００５６】
【化１８】
【００５７】
上記構造式（IX）中のＲ１〜Ｒ４は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示し、ｎは１〜１１の整数である。
【００５８】
上記構造式（I）に示される化合物としては、3’,3’’,5’,5’’−Tetraiodophenolsulfonphthalein、Phenol Red、Cresol Red、m−Cresol Purple、Thymol Blue、Bromothymol Blue、p−Xylenol Blue等が例示できる。
【００５９】
また、上記構造式（II）に示される化合物としてはo−Cresolphthalein、Phenolphthalein等が例示できる。
【００６０】
上記構造式（III）に示される化合物としては、Aurin等が例示できる。
【００６１】
上記構造式（IV）に示される化合物としては、p−Naphtholbenzein等が例示できる。
【００６２】
上記構造式（V）に示される化合物としては、3’,3’’,5’,5’’−Tetraiodophenolsulfonphthalein sodium salt、Phenol Red sodium salt、Cresol Red sodium salt、m−Cresol Purple sodium salt、Thymol Blue sodium salt、Bromothymol Blue sodium salt、p−Xylenol Blue sodium salt等が例示できる。
【００６３】
上記構造式（VI）に示される化合物としては、α−Naphtholphthalein等が例示できる。
【００６４】
上記構造式（VII）、（VIII）に示される化合物としては、ポルフィリン系化合物が例示でき、より具体的には例えば、プロトヘム、プロトクロロフィル、プロトポルフィリン等が例示できる。
【００６５】
上記構造式（IX）に示される化合物としては、不飽和炭化水素構造を有する化合物が挙げられ、より具体的には、β−カロチン、Curcuminが例示でき、また、上記構造式（IX）に示される化合物のうち、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物として、Curcumin、Bis（2,4−dinitrophenyl）acetic Acid Ethyl ester等が例示できる。
【００６６】
さらに、アントシアン類としては、植物由来色素であるペラルゴニン、カリステフィン、フラガリン、シアニン、クリサンテミン、シソニン、ケラシアニン、デルフィニン、ナスニン、ヒアシン、エニン等が例示できる。
【００６７】
上記の消光染料は、生細胞内のｐＨ（通常ｐＨ６．８〜７．４、以下同じ。文献：「Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (Ninth Edition)」、インビトロジェン株式会社、2000年、p829）では、前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、生細胞内のｐＨより弱酸性（約ｐＨ５〜ｐＨ６．８）もしくは弱アルカリ性（約ｐＨ７．４〜９）において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する。
【００６８】
上記の消光染料は、使用する蛍光染料に応じて適宜選択して用いられ、例えば、ＣＦＤＡのような緑色の蛍光を発する蛍光染料や、ＤＡＰＩのような青色の蛍光を発する蛍光染料を用いる場合は、消光染料としてPhenol Red及び／又はCresol Redを用いることが好ましい。
【００６９】
本発明において、上記消光染料が蛍光染料を消光する機構は、その吸収波長域が蛍光染料の発する蛍光の波長域とオーバーラップするようなものを消光染料として用いることにより、夾雑物に由来する蛍光染料の蛍光を吸収・消光するものである。
【００７０】
一般に、同一分子内に電磁エネルギーを吸収する官能基と蛍光を発する官能基が存在する物質の中には前記２つの官能基間で共鳴エネルギー移動が起こる場合があることが知られており、また、２分子間に分かれて前記官能基がある場合においても分子間の共鳴エネルギー移動が起こる場合があることが知られている（文献：「現代化学」，東京化学同人，2002年，p.22）。
【００７１】
そして、ある官能基が、可視−紫外領域の電磁エネルギーを吸収するには、一般に二重結合のπ成分だけが関係していることが知られており、具体例としては、共役二重結合をもつ芳香族環等が挙げられる。一般則として、電子の非局在化される程度が大きいほど電子状態の間隔は密になり、可視−紫外領域の電磁エネルギー吸収帯の波長が長くなることが知られている（文献：「バーロー生命科学のための物理化学 第２版」，東京化学同人，1983年，p.300−312）。
【００７２】
このような芳香族分子は１個又は数個の水素イオンを受け取ったり失ったりしうるため電荷が変化する。そして、その電荷変化は可視−紫外領域の電磁エネルギー吸収帯の波長として観測され、正電荷が増すと分子は電子を強く結合するようになるため、電磁エネルギー吸収帯は短波長の方にシフトし、一方、正電荷が減るか負電荷が増すと長波長の方へシフトすることが知られている。したがって、上記のような消光染料は、ｐＨの違いによって電磁エネルギー吸収帯の波長シフトが起こる。
【００７３】
そこで、蛍光染料で染色した試料を、上記のような消光染料で染色し、細胞の内外でｐＨの違いが生じるような条件下（例えば、細胞を細胞内とは異なるｐＨの溶液に接触させる）においた場合、生細胞内のｐＨは外界のｐＨの影響が緩和されて一定に保たれていると考えられているので（文献：「ブラック微生物」，丸善株式会社，2003年，p152）、生細胞は外部のｐＨの影響を受けにくく、生細胞は蛍光染料の発する蛍光を発する。一方、生細胞以外の夾雑物は外部のｐＨの影響を受けやすいため、上記消光染料が蛍光染料の蛍光を吸収・消光し（実際は、蛍光染料の蛍光より長波長の蛍光を発する）、生細胞とそれ以外の夾雑物を区別することができる。
【００７４】
例えば、図１には、ＣＦＤＡの励起波長及び蛍光波長のスペクトル特性と、ｐＨ８．６におけるフェノールレッド及びクレゾールレッドの吸収波長のスペクトル特性が示されている。図１に示すように、ＣＦＤＡは４７０ｎｍの光を照射すると４８０ｎｍ〜６５０ｎｍの蛍光を発するが、フェノールレッドの吸収波長は上記ＣＦＤＡの蛍光波長とオーバーラップしており、フェノールレッドはＣＦＤＡの蛍光を吸収・消光し、５５０ｎｍ〜８００ｎｍの赤色を発する。
【００７５】
以下、本発明の生細胞の検出方法について説明する。
【００７６】
（１）試料に蛍光染料を添加し、若しくは接触させて細胞を蛍光染色する工程
本発明においては、試料に直接蛍光染料溶液を添加することにより細胞を染色することもできるが、以下の（i）〜（iii）に示すように、試料中の細胞をフィルタや粘着シート等に固定した後、蛍光染料で染色することもできる。
【００７７】
（i）試料中の細胞を採取するために、適量の液体状の試料をフィルタで濾過する。これにより、フィルタの濾過面上に、試料中の細胞等（生きた細胞、死んだ細胞やゴミ等の夾雑物）がトラップされる。上記フィルタとしては、ポリカーボネイト、ポリエステル等の材質からなる孔径０．２〜０．６μｍの黒色若しくは透明のメンブレンフィルタを用いることができる。このようなメンブレンフィルタとしては、例えば、商品名「Nuclepore Track-Etch Membrane」（Whatman製）、商品名「Isopore Membrane Filters」（MILLIPORE製）、商品名「MEMBRANE FILTERS POLYCARBONATE」（東洋濾紙株式会社製）等の市販のものを用いることができる。
【００７８】
なお、試料の種類によっては、脱脂、除タンパク、濾過、遠心分離等の前処理を行ってから用いることが好ましく、液体状でない試料を用いる場合は、ミキサーやストマッカー等の破砕分散装置により細胞を液体に抽出してから用いればよい。
【００７９】
（ii）採取した細胞の転写
上記（i）で得られたフィルタ上にトラップされた細胞をそのまま蛍光染色することもできるが、上記フィルタの濾過面全体に粘着シートを貼り付け、粘着シートの粘着層にフィルタ上にトラップされた細胞を転写してから蛍光染色してもよい。
【００８０】
粘着シートとしては、上記フィルタ上にトラップされた細胞を捕捉するのに十分な粘着性を有すると共に平滑な表面構造を有する粘着層が基材上に積層された構造からなるものを用いることができる。
【００８１】
また、粘着層としては、上記フィルタ上にトラップされた細胞を捕捉するのに十分な粘着性を有していれば特に限定されないが、細胞の染色に用いる蛍光染料が粘着層に含浸しにくいこと及び粘着層が溶けて捕捉した細胞が移動しにくいことなどから、例えば、アクリル系粘着剤やゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の非水溶性粘着材を用いることが好ましい。
【００８２】
アクリル系粘着剤としては、具体的には、モノマーとして（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステルを主成分として少なくとも１種類以上用い、これに共重合性モノマーとして（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸エトキシエチル、（メタ）アクリル酸ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸エチレングリコール等の親水性モノマーを１種若しくは２種以上共重合させたものを用いることができる。なお、上記のような粘着剤からなる粘着層は、その粘着特性をより良好にするためにイソシアネート化合物、有機過酸化物、エポキシ基含有化合物、金属キレート化合物等の熱架橋剤による処理を行ったり、保形性を良好にするために紫外線、γ線、電子線等の放射線照射による処理を行って架橋を施すことが好ましい。
【００８３】
ゴム系粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリイソプレン、ポリブテン、スチレン−イソプレン系ブロック共重合体、スチレン−ブタジエン系ブロック共重合体等の主ポリマーに、粘着性付与樹脂としてロジン系樹脂やテルペン系樹脂、クロマン−インデン系樹脂、テルペン−フェノール系樹脂、石油系樹脂を配合したものを用いることができる。
【００８４】
シリコーン系粘着剤としては、ジメチルポリシロキサンを主成分とする粘着剤が例示できる。
【００８５】
本発明においては、蛍光画像取得に際して光学特性に影響が少ないという点から、透明性の高いアクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤がより好ましく用いられる。
【００８６】
粘着層の厚みは、フィルタへの接着性や追従性、細胞の捕捉性の点から５〜１００μｍとすることが好ましい。また、捕捉した細胞の蛍光画像の取得に際して蛍光画像取得手段の焦点の合致範囲が広くなり、より正確な画像処理を可能とするために、粘着層表面の平滑度（凹凸差）は２０μｍ以下であることが好ましい。平滑度は、表面粗さ針や電子顕微鏡等で粘着シートの断面を観察し、粘着剤表面の凸部の頂点から凹部の最低点までの平均高さを測定して求めることができる。
【００８７】
また、粘着シートの基材は、粘着層表面に大きな凹凸を形成させず、また、曲面や狭所表面にも自在に圧着し得る柔軟な材質であれば特に限定されず、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、織布、不織布、紙、ポリエチレンラミネート紙等を用いることができ、中でも平滑性の高いポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタンが好ましく用いられる。
【００８８】
また、基材の厚さは、支持体として十分な強度があればよく、５〜２００μｍ程度が好ましい。
【００８９】
粘着シートは、上記粘着剤からなる粘着層を公知の方法によって上記基材上に形成することにより製造することができ、その使用に際しては任意の形状に裁断して用いることができる。
【００９０】
（iii）蛍光染色
上記（i）で得られたフィルタ上にトラップされた細胞あるいは上記（ii）で得られた粘着シートに転写された細胞を蛍光染料で染色する。
【００９１】
例えば、蛍光染料としてＣＦＤＡを用いる場合は、緩衝液（ｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７．６〜８．６のリン酸緩衝液）に、ＣＦＤＡを好ましくは３００〜３，０００μｇ／ｍＬとなるように溶解した蛍光染料溶液を用いる。また、蛍光染料としてＤＡＰＩを用いる場合は、緩衝液（ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８のリン酸緩衝液）に、ＤＡＰＩを好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した蛍光染料溶液を用いる。蛍光染料の濃度が薄すぎると細胞を十分に染色することができず、蛍光染料の濃度が濃すぎるとゴミ等の夾雑物が強く染色されてしまい、消光染料によって消光しにくくなるため好ましくない。
【００９２】
蛍光染料溶液は、雑菌の混入を防ぐために０．２μｍのフィルタで濾過しておく。また、長期保存する際には、必要に応じてアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加でき、例えば、アジ化ナトリウムの最終濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍＬ程度になるよう添加すればよい。
【００９３】
蛍光染料による細胞の染色は、上記のフィルタの濾過面あるいは上記の粘着シートの粘着層（集菌面）上に適量の蛍光染料溶液を滴下して広げる、又は該フィルタや粘着シートを蛍光染料溶液に浸漬し、２〜４０℃で３０秒〜３分間放置した後、余分な蛍光染料溶液を洗浄液で洗い流せばよい。
【００９４】
上記洗浄液は、使用した蛍光染料の発色に適したｐＨの緩衝液が好ましく、例えば、蛍光染料としてＣＦＤＡを用いた場合は、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ７．６〜８．６のリン酸緩衝液が好ましい。この緩衝液は、０．２μｍのフィルタで濾過してから用いる。
【００９５】
（２）前記蛍光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を添加し、若しくは接触させる工程
消光染料は、用いる染料に応じて適当なｐＨ（生細胞内のｐＨより弱酸性（約ｐＨ５〜６．８）もしくは弱アルカリ性（約ｐＨ７．４〜９）であって、且つ生細胞内のｐＨと異なるｐＨ）の緩衝液に溶解して用いられる。消光染料溶液のｐＨが極端に酸性やアルカリ性であると、蛍光染料の蛍光を十分に吸収・消光できなかったり、生細胞が死ぬおそれがあるため好ましくない。
【００９６】
例えば、消光染料としてフェノールレッドを用いる場合は、緩衝液（好ましくはｐＨ８〜９、より好ましくはｐＨ８．６のリン酸緩衝液）に、フェノールレッドを好ましくは１〜３０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した消光染料溶液を用いる。
【００９７】
図２にフェノールレッド（0.01mg/mL）の各ｐＨでの吸収スペクトル特性を示す。図２から、ｐＨが低下するほど５５０ｎｍ付近の吸収が低下し、ｐＨ７以下では最大吸収波長が５５０ｎｍ付近から４４０ｎｍ付近に変わっていることが分かる。したがって、生細胞内外におけるｐＨの相違に応じて消光染料の吸収強度の違いがあれば、生細胞とそれ以外の夾雑物を区別できることとなる。そこで、フェノールレッドを消光染料に用いた場合は、５５０ｎｍ付近の吸収強度に違いが生じるｐＨの条件（好ましくはｐＨ８〜９、より好ましくはｐＨ８．６）で染色処理を行う。なお、後述する実施例２の図５において、消光の程度は弱いが、ｐＨ６やｐＨ７でも夾雑物の消光ができているように見えるのは、夾雑物より生細胞のＣＦＤＡの蛍光が強かったこと、そして、フェノールレッドの５５０ｎｍ付近の吸収強度がｐＨ６やｐＨ７でも完全に無くなっていないため、夾雑物のＣＦＤＡの蛍光をフェノールレッドが若干消光したためである。
【００９８】
また、クレゾールレッドを用いる場合は、上記と同様の緩衝液に、クレゾールレッドを好ましくは０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜２．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した消光染料溶液を用いる。消光染料の濃度が薄過ぎると、夾雑物に由来する蛍光染料の蛍光を十分に消光できなくなり、検出の誤差が大きくなる。一方、消光染料の濃度が濃過ぎると、例えば、フェノールレッドを用いた場合には生細胞の蛍光が弱くなり、クレゾールレッドを用いた場合には視野全体が緑に発色してしまい、生細胞を検出しにくくなる。
【００９９】
消光染料溶液は、雑菌の混入を防ぐために０．２μｍのフィルタで濾過しておく。また、長期保存する際には、必要に応じてアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加でき、例えば、アジ化ナトリウムの最終濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍＬ程度になるよう添加すればよい。
【０１００】
消光染料による染色は、上記のフィルタの濾過面あるいは上記の粘着シートの粘着層（集菌面）上に適量の消光染料溶液を滴下して広げる、又は該フィルタや粘着シートを消光染料溶液に浸漬し、２〜４０℃で１〜１０秒間放置した後、余分な消光染料溶液をブロワで吹き飛ばせばよい。
【０１０１】
なお、試料と蛍光染料溶液と消光染料溶液とを混合して染色後、フィルターで濾過した後、適宜、上記粘着シートに転写してもよい。
（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程
上記のようにして、蛍光染料と消光染料で染色したフィルタあるいは粘着シートに、蛍光染料の励起光（例えば、ＣＦＤＡの場合は波長４００〜４９５ｎｍ）を照射し、フィルタの濾過面あるいは粘着シートの粘着層表面上の蛍光の画像をＣＣＤカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等によって取り込む。
【０１０２】
本発明においては、蛍光の画像を取り込む際に、蛍光染料の蛍光波長の光のみを透過させる光学フィルタ等を介して生細胞の発する蛍光染料の蛍光のみを画像として取り込むことが好ましい。例えば、蛍光染料としてＣＦＤＡを用いた場合は、上記光学フィルタとして、波長５１０〜５５０ｎｍの光を透過するが波長５５０ｎｍより大きい光は透過しないフィルタが好ましく用いられる。
【０１０３】
上記のようにして取り込まれた画像では、蛍光染料で染色された夾雑物の蛍光は消光染料によって吸収・消光され、更に、蛍光染料の蛍光を吸収することで受け取ったエネルギーにより消光染料が発する蛍光は撮影されないので、蛍光染料に由来する蛍光を発する生細胞が輝点として検出できる。この輝点（生細胞）の検出は、目視で行ってもよいが、例えば、商品名「Optimas」（MEDIA CYBERNETICS社製）等の市販の画像解析ソフトを用いて行うこともできる。
【０１０４】
なお、検数のノイズとなりうる微弱な発光に対しては、減光光学フィルタを介して蛍光画像を取り込んでノイズを削除する、あるいは画像処理で閾値を設定して電気的に処理することが好ましい。このような画像処理は、例えば以下のようにして行うことができる。
【０１０５】
・バックグラウンドノイズを除くために所定値（スレッショルド値）以下の画素は黒色にする。なお、スレッショルド値は使用者が設定する。
【０１０６】
・背景除去処理（ＣＣＤカメラの不良による輝点、ステージの傾きによる輝度の違いを補正）
・エッジの検出（ソーベル、プレヴィット等の画像処理フィルタで処理）
・２値化処理
・各輝点のナンバリングと面積計算
を行った後、使用者が設定した所定のサイズに合致する輝点を検出する。
【０１０７】
また、本発明においては、蛍光染料に由来する蛍光と消光染料に由来する蛍光をカラー画像として取り込むこともできる。
【０１０８】
上記のようにして取り込まれた画像では、生細胞は蛍光染料に由来する蛍光を発する輝点として撮影され、夾雑物は消光染料に由来する蛍光（蛍光染料の蛍光より長波長の蛍光を発する）を発する輝点として撮影されるので、蛍光染料に由来する蛍光を発する輝点（生細胞）を、目視、あるいは上記のような市販の画像解析ソフトを用いて検出する。なお、上記の場合と同様に、検数のノイズとなりうる微弱な発光に対しては、減光光学フィルタを介して蛍光画像を取り込んでノイズを削除してもよく、画像処理で閾値を設定して電気的に処理してもよい。
【０１０９】
なお、本発明においては、蛍光画像を取り込む際に、検出する細胞のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるように、レンズ等の光学素子を用いて拡大してから取り込むことが好ましい。拡大倍率は、検出する細胞のサイズに応じて適宜選択すればよいが、通常、１０〜１０００倍で十分である。
【０１１０】
そして、上記のようにして検出された輝点（生細胞）の数から、試料中に含まれる生細胞数を以下のようにして算出することができる。例えば、「食品衛生管理指針（微生物版）」（厚生省生活衛生局監修、社団法人日本食品衛生協会）の総菌数測定方法に記載されているように、１６視野以上観察し、観察した視野の輝点（生細胞）数の合計（Ａ）を求める。そして、測定に供した液体試料の体積（Ｖ）と、フィルタの濾過面積（Ｓｍ）と、観察視野総面積（Ｓｐ）とから下記式に基づいて試料の生細胞数（Ｃ）を算出すればよい。
Ｃ＝Ａ×Ｓｍ／（Ｓｐ×Ｖ）
図３には、本発明の生細胞の検出方法において好適に用いられる検出装置の一実施形態が示されている。
【０１１１】
この検出装置１０は、固定台２、鏡筒３、レンズ４、バンドパスフィルタ５、画像取り込み手段６、励起光源７、バンドパスフィルタ８、ダイクロイックミラー９とから構成されており、固定台２上に固定されたサンプル１（フィルタ上に固定、あるいは粘着シート上に転写され、蛍光染料及び消光染料で染色された試料）に、励起光源７、バンドパスフィルタ８、鏡筒３、ダイクロックミラー９、レンズ４から構成される励起光を照射する光学的手段によって、蛍光染料の励起光が照射されるようになっている。
【０１１２】
そして、前記サンプル１が発する蛍光の画像は、レンズ４、ダイクロックミラー９、鏡筒３、バンドパスフィルタ５から構成される蛍光を捕集する光学的手段を介して、画像取り込み手段６に取り込まれるようになっている。すなわち、前記サンプル１が発する蛍光の画像は、検出する細胞のサイズが撮像素子の画素と同じサイズ若しくは撮像素子の画素よりも大きなサイズとなるようにレンズ４で拡大されると共に、蛍光染料の蛍光波長の光は透過するが、消光染料の発する波長の光は透過しないバンドパスフィルタ５を介することにより、生細胞から発せられる蛍光染料の蛍光のみが画像取り込み手段６に取り込まれるようになっている。
【０１１３】
前記画像取り込み手段としては、例えば、ＣＣＤカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等を用いることができ、前記バンドパスフィルタ５を使用しない場合は、前記画像取り込み手段としてカラーカメラを用いて、蛍光染料に由来する蛍光と消光染料に由来する蛍光をカラー画像として取り込めばよい。
【０１１４】
なお、上記検出装置１０は、更に、前記画像取り込み手段６に取り込まれた蛍光画像を、蛍光染料による蛍光の発光を捕らえて画像処理する手段と、前記処理した画像から輝点の数をカウントする手段を備えていてもよい。
【０１１５】
前記画像処理する手段及び前記輝点の数を検出する手段としては、コンピュータを用いることができ、例えば、上記（３）で説明したような画像処理プログラム及び画像解析プログラムを有するコンピュータを用いることができる。
【０１１６】
以下に、蛍光染料としてＣＦＤＡ、消光染料としてフェノールレッド又はクレゾールレッドを使用し、検出装置１０を用いて生細胞を検出する場合について説明する。
【０１１７】
励起光源７から出た光は、波長４００ｎｍ〜４９５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルタ８を通り、次いで、波長５００ｎｍ以下の光は反射して５００ｎｍ以上の光は透過するダイクロイックミラー９で反射され、波長４００〜４９５ｎｍの励起光がサンプル１に照射される。
【０１１８】
図１に示したように、ＣＦＤＡの蛍光波長と、フェノールレッド又はクレゾールレッドの吸収波長がオーバーラップするのでフェノールレッド又はクレゾールレッドはＣＦＤＡの蛍光を吸収・消光し、消光染料で染色された夾雑物は５５０〜８００ｎｍの赤色を発する。
【０１１９】
したがって、この蛍光画像を、波長５１０〜５５０ｎｍの光は透過するが５５０ｎｍより波長の大きい光は透過しないバンドパスフィルタ５を介して画像取り込み手段６に取り込んだ場合は、ｐＨの影響を受け難い生細胞に由来するＣＦＤＡの緑色光（波長５１０〜５５０ｎｍ）は撮影されるが、ｐＨの影響を受ける生細胞以外の夾雑物の発する赤色光（５５０ｎｍより波長の大きい光）は撮影されず、ＣＦＤＡで蛍光染色された生細胞のみが輝点として検出される。
【０１２０】
一方、この蛍光画像を、画像取り込み手段６としてカラーカメラを用い、前記バンドパスフィルタ５を介さずに取り込んだ場合は、生細胞はＣＦＤＡに由来する緑色光として、生細胞以外の夾雑物はフェノールレッド又はクレゾールレッドに由来する赤色光として撮影される。
【実施例１】
【０１２１】
以下の試薬を調製して用いた。
【０１２２】
・界面活性剤溶液：１０％トリトンＸ−１００水溶液を無菌濾過したもの
・タンパク質分解酵素溶液：２％トリプシン溶液（溶媒は生理食塩水）を無菌濾過したもの
・蛍光染料溶液：ＣＦＤＡを３００μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・消光染料溶液：フェノールレッドを１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解した後、０．２μｍのフィルタで濾過したもの
・洗浄液：リン酸緩衝液（ｐＨ８．６）
試料である生乳１ｍＬと、上記界面活性剤溶液２０μＬと、上記タンパク質分解酵素溶液２５０μＬとを、マイクロチューブ（トレフ社製１．５ｍＬ微量遠心チューブ、型番No.96.7246.9.01をオートクレーブ滅菌して使用）に入れて、試験管ミキサーで１０秒混合した。そして、４２℃の恒温水槽に上記マイクロチューブを浮かべ、１０分間保温した後、室温（約２５℃）で３分間遠心分離（７３００×ｇ）した。
【０１２３】
マイクロチューブを逆さまにして上澄みを捨て、乳脂肪を滅菌済み綿棒で拭いて除いた後、マイクロチューブにＰＢＳを１００μＬ入れ、ピペットで吸引と吐出を繰返して沈殿を懸濁した後、更にＰＢＳを１ｍＬ入れて菌体を分散させた。
【０１２４】
孔径０．４μｍのメンブレンフィルタ（商品名「Nuclepore Track-Etch Membrane」、Whatman製、直径２５ｍｍ）をセットした濾過器に、生理食塩水１０ｍＬを入れた後、上記試料を加えて濾過した（ファンネルの内径８ｍｍ、濾過面積２０１ｍｍ２）。
【０１２５】
濾過器のファンネル部分を外してメンブレンフィルタを取り出し、該メンブレンフィルタの濾過面にセロファンテープ状の無蛍光な粘着シート（日東電工株式会社製）を貼り付けて、メンブレンフィルタ上の菌体等を粘着シートの粘着面に転写した。
【０１２６】
そして、菌体等を転写した粘着シートの粘着面に、ＣＦＤＡ溶液を３００μＬ滴下して広げ、２５℃で１分間静置した後、洗浄液３００μＬで３回洗浄し、余分なＣＦＤＡを洗い流した。
【０１２７】
次いで、粘着シートの粘着面に消光染料溶液を３００μＬ滴下して広げ、２５℃で１０秒間静置し、粘着シートの粘着面の水分をブロワで吹き飛ばした後、図３に示す装置で輝点（生菌）の検出を行った（画像取り込み手段６としてカラーカメラを用い、バンドパスフィルタ５を介さずに撮影）。なお、ＣＦＤＡのみで染色したものを用いて同様にして輝点（生菌）の検出を行った。それらの結果を図４に示す。
【０１２８】
図４に示すように、試料をＣＦＤＡで染色後、フェノールレッドで染色した場合（ａ）は、試料をＣＦＤＡのみで染色した場合（ｂ）に比べて、生菌を示す輝点が明瞭に検出できることが分かる。
【実施例２】
【０１２９】
大腸菌を添加した固形食品（ほうれん草のナムル）を用いて、生菌の検出を行った。なお、固形食品中の生菌を液体に抽出する処理は、「食品衛生検査指針 微生物編」（社団法人 日本食品衛生協会，1990年）を参考にした。
【０１３０】
すなわち、大腸菌（約１０７個程度）を添加した固形食品（ほうれん草のナムル）１０ｇをストマック袋（ポリエチレンのような柔軟性のあるプラスチックフィルムで作られており、放射線による滅菌処理が施されている。また、内部には不織布や直径０．２８ｍｍ程の穴のあけたプラスチックフィルムで仕切られた部分があり、そこから大きな固形物を除いた液部を採取することができるようになっている。）に量り取り、滅菌リン酸緩衝液９０ｍＬを加え、ストマッカーにかけ、この固形食品を粉砕分散した。なお、ストマッカーとは、固定された板とパドルの間に食品を入れたストマック袋を置き、パドルを前後させることで袋ごと食品を圧縮して食品を粉砕分散し、食品中の生菌を液体に抽出する装置である。
【０１３１】
そして、ストマック袋から液部を回収し、これを用いて実施例１とほぼ同様の手順で生菌を検出した。その結果を図５、６に示す。
【０１３２】
図５は、蛍光染料として用いたＣＦＤＡ溶液と消光染料として用いたフェノールレッド溶液のｐＨを変えた場合（各溶液のｐＨは同じ）における生菌の検出効果を示す図である。図５に示すように、ｐＨ６〜８．６のＣＦＤＡ溶液とフェノールレッド溶液を用いた場合、夾雑物は消光され、生菌を示す輝点が明瞭に検出できることが分かる。一方、ｐＨ５のＣＦＤＡ溶液とフェノールレッド溶液を用いた場合は、生菌が蛍光染色されておらず、不適であることが分かる。
【０１３３】
また、図６（ａ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートを何も染色せずにそのまま蛍光顕微鏡で撮影した蛍光像、（ｂ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートをフェノールレッド溶液（ｐＨ７）だけで染色して蛍光顕微鏡で撮影した蛍光像である。図６（ａ）には生菌を示す輝点が観察されないが、（ｂ）では、生菌を示す輝点が多数観察され、フェノールレッドが生菌内に入り込んでいることが分かる。
【０１３４】
以上の結果から、消光染料として用いたフェノールレッドは、生菌内では蛍光染料の蛍光を吸収して消光することはなく、生菌以外の夾雑物等に由来する蛍光染料の蛍光のみを吸収して消光していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明の生細胞の検出方法は、医薬、農薬、食品衛生管理等の分野や医学、薬学、生物学等の研究分野において、生細胞の検出、測定に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＣＦＤＡの励起波長及び蛍光波長のスペクトル特性と、フェノールレッド及びクレゾールレッドの吸収波長のスペクトル特性を示す図である。
【図２】フェノールレッド（0.01mg/mL）の各ｐＨでの吸収スペクトル特性を示す図である。
【図３】本発明で用いられる生細胞の検出装置の一実施形態を示す模式図である。
【図４】本発明の方法により生乳中の菌を検出した結果を示す図であり、（ａ）はＣＦＤＡで染色後、フェノールレッドで染色し、蛍光顕微鏡で観察した場合の結果を示す図であり、（ｂ）はＣＦＤＡのみで染色し、蛍光顕微鏡で観察した場合の結果を示す図である。
【図５】ＣＦＤＡ溶液とフェノールレッド溶液のｐＨを変えた場合における生菌の検出効果を示す図である。
【図６】大腸菌の中に消光染料であるフェノールレッドが入り込み、染色されていることを示す図であり、（ａ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートを何も染色せずにそのまま蛍光顕微鏡で撮影した結果を示す図、（ｂ）はメンブレンフィルタ上の菌体等を転写した粘着シートをフェノールレッド溶液（ｐＨ７）だけで染色して蛍光顕微鏡で撮影した結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１３７】
１．サンプル
２．固定台
３．鏡筒
４．レンズ
５、８．バンドパスフィルタ
６．画像取り込み手段
７．励起光源
９．ダイクロイックミラー
１０．生細胞の検出装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）試料に蛍光染料を添加し、若しくは接触させて細胞を蛍光染色する工程と、（２）前記蛍光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を添加し、若しくは接触させる工程と、（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程とを有する生細胞の検出方法であって、
前記工程（２）において、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で添加し、若しくは接触させ、
前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下に保つことを特徴とする生細胞の検出方法。
【請求項２】
前記蛍光染料として、生細胞のみを染色できる蛍光染料を使用する請求項１に記載の生細胞の検出方法。
【請求項３】
前記蛍光染料として、核酸を蛍光標識する物質、又は酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質を用いる、請求項１又は２に記載の生細胞の検出方法。
【請求項４】
前記消光染料は、前記蛍光染料の蛍光波長を吸収する共役二重結合を有する化合物である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項５】
前記消光染料は、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物である、請求項４に記載の生細胞の検出方法。
【請求項６】
前記消光染料は、少なくとも１つの縮合芳香族環を有する芳香族化合物である、請求項４に記載の生細胞の検出方法。
【請求項７】
前記消光染料は、不飽和炭化水素構造を有する化合物である、請求項４に記載の生細胞の検出方法。
【請求項８】
前記消光染料は、下記構造式（I）〜（IX）に示されるいずれかの化合物又はアントシアン類である、請求項１〜４のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
上記構造式（I）〜（III）及び（V）中のＲ１〜Ｒ１１は、水素原子、メチル基、炭素原子が少なくとも２個以上からなる脂肪鎖又は脂肪酸エステル、ヨウ素、臭素を示し、同一若しくは異なっていてもよい。
【化７】
上記構造式（VII）中のＭｅは、鉄、銅又はマグネシウムを示し、Ｒ１〜Ｒ７は炭化水素基、Ｒ８〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【化８】
上記構造式（VIII）中のＲ１〜Ｒ８は炭化水素基、Ｒ９〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【化９】
上記構造式（IX）中のＲ１〜Ｒ４は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示し、ｎは１〜１１の整数である。
【請求項９】
前記工程（２）において、アルカリ性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料をアルカリ性条件下に保つ、請求項１〜８のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項１０】
前記工程（２）において、酸性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を酸性条件下に保つ、請求項１〜８のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項１１】
前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光のうち、前記蛍光染料の蛍光波長の光のみを捕集し、その蛍光像を取り込む、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項１２】
前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光を捕集し、捕集した蛍光をカラー画像として取り込み、前記蛍光染料に由来する蛍光と、それ以外の蛍光とを区別する、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項１】
（１）試料に蛍光染料を添加し、若しくは接触させて細胞を蛍光染色する工程と、（２）前記蛍光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を添加し、若しくは接触させる工程と、（３）前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程とを有する生細胞の検出方法であって、
前記工程（２）において、（ａ）生細胞の細胞膜を透過でき、（ｂ）生細胞内のｐＨでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、（ｃ）生細胞内のｐＨと異なるｐＨにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下で添加し、若しくは接触させ、
前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のｐＨと異なるｐＨ条件下に保つことを特徴とする生細胞の検出方法。
【請求項２】
前記蛍光染料として、生細胞のみを染色できる蛍光染料を使用する請求項１に記載の生細胞の検出方法。
【請求項３】
前記蛍光染料として、核酸を蛍光標識する物質、又は酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質を用いる、請求項１又は２に記載の生細胞の検出方法。
【請求項４】
前記消光染料は、前記蛍光染料の蛍光波長を吸収する共役二重結合を有する化合物である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項５】
前記消光染料は、少なくとも２つの芳香族環を有する芳香族化合物である、請求項４に記載の生細胞の検出方法。
【請求項６】
前記消光染料は、少なくとも１つの縮合芳香族環を有する芳香族化合物である、請求項４に記載の生細胞の検出方法。
【請求項７】
前記消光染料は、不飽和炭化水素構造を有する化合物である、請求項４に記載の生細胞の検出方法。
【請求項８】
前記消光染料は、下記構造式（I）〜（IX）に示されるいずれかの化合物又はアントシアン類である、請求項１〜４のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
上記構造式（I）〜（III）及び（V）中のＲ１〜Ｒ１１は、水素原子、メチル基、炭素原子が少なくとも２個以上からなる脂肪鎖又は脂肪酸エステル、ヨウ素、臭素を示し、同一若しくは異なっていてもよい。
【化７】
上記構造式（VII）中のＭｅは、鉄、銅又はマグネシウムを示し、Ｒ１〜Ｒ７は炭化水素基、Ｒ８〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【化８】
上記構造式（VIII）中のＲ１〜Ｒ８は炭化水素基、Ｒ９〜Ｒ１２は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
【化９】
上記構造式（IX）中のＲ１〜Ｒ４は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示し、ｎは１〜１１の整数である。
【請求項９】
前記工程（２）において、アルカリ性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料をアルカリ性条件下に保つ、請求項１〜８のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項１０】
前記工程（２）において、酸性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程（３）において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を酸性条件下に保つ、請求項１〜８のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項１１】
前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光のうち、前記蛍光染料の蛍光波長の光のみを捕集し、その蛍光像を取り込む、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【請求項１２】
前記工程（３）において、前記試料が発する蛍光を捕集し、捕集した蛍光をカラー画像として取り込み、前記蛍光染料に由来する蛍光と、それ以外の蛍光とを区別する、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−６８００２（Ｐ２００６−６８００２Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２２２７８２（Ｐ２００５−２２２７８２）
【出願日】平成１７年８月１日（２００５．８．１）
【出願人】（０００００５２３４）富士電機ホールディングス株式会社 (3,146)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１日（２００５．８．１）
【出願人】（０００００５２３４）富士電機ホールディングス株式会社 (3,146)
【Ｆターム（参考）】
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