生薬由来成分の高感度定量方法
【課題】生体試料中のグリチルリチンやその代謝物等を高感度に定量する方法の提供。
【解決手段】生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、前記抽出工程により抽出された抽出物中のグリチルリチン、グリチルレチン酸、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の代謝物、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の類縁物質、甘草に含有するサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する工程と、を有する生薬由来成分の高感度定量方法。
【解決手段】生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、前記抽出工程により抽出された抽出物中のグリチルリチン、グリチルレチン酸、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の代謝物、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の類縁物質、甘草に含有するサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する工程と、を有する生薬由来成分の高感度定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のグリチルリチンやその代謝物等を高感度に定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリチルリチン（以下、ＧＬと略記する）及びその塩は、抗アレルギー作用、抗炎症作用と共に、免疫調節作用、肝細胞障害抑制作用、肝細胞増殖促進作用、ウィルス増殖抑制・不活性化作用等の多様な生理活性を有する甘草根抽出成分である。日本では、古くから漢方薬等の臨床薬として用いられており、現在では、慢性肝疾患、湿疹・皮膚炎、小児ストロフルス、円形脱毛症、各種アレルギー、炎症等の治療に幅広く使用されている。また、医薬品以外の使用として、ＧＬは塩なれ効果をもち、甘味効果があることから甘味料として漬物や調味料など広範囲の食品に多用されている。
【０００３】
非臨床試験の結果から、ＧＬは肝臓に集積しやすく、且つ速やかに胆汁中へ排泄される特性があり、代謝及び腸肝循環を受けながら排出されると考えられている。特に経口投与において、配糖体で水溶性極性物質であるＧＬは低吸収性を示すと共に、腸内細菌による代謝や初回通過効果により、末梢血における濃度が極めて低い。このため、ＧＬの血中動態を測定するために、現在までに様々な方法が試みられているが、ＧＬを含有する製剤、甘草を配合する漢方製剤において、服用時の血中ＧＬは検出困難であり、その動態も長い間不明とされてきた。
【０００４】
例えば、ＧＬを経口投与された健常者から採取された血漿に対して、メタノール処理を行ってタンパク質を除去した後、当該血漿中のＧＬの量を、酵素免疫法（ＥＩＡ）により測定する方法やオクタデシル基化学結合型（ＯＤＳ）カラム等の逆相分配機能を備えるカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定する方法（例えば、非特許文献１〜４）がある。しかしながら、これらの測定方法では、定量限界値がせいぜい０．１μｇ／ｍＬ程度であり、主代謝物であるグリチルレチン酸（以下、ＧＡと略記する。）は検出することができても、ＧＬは検出することはできなかった。このため、尿中からの検出例をもって間接的にＧＬの血中移行が証明された（引用文献４参照。）。そして、ＧＬ含有製剤薬効については、ＧＬの代わりに、定量可能なＧＡが評価指標とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】イシワタ、他７名、バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリテン（Biological and Pharmaceutical Bulletin）、２０００年、第２３巻、第８号、第９０４〜９０５ページ。
【非特許文献２】デ・グルー（De Groot）、他１名、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、１９８８年、第４５６巻、第７１〜８１ページ。
【非特許文献３】ナカタ、他３名、和漢医薬学会誌、１９８６年、第３巻、第３号、第２７８〜２７９ページ。
【非特許文献４】ヤマムラ、他７名、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Journal of Pharmaceutical Sciences）、１９９２年、第８１巻、第１０号、第１０４２〜１０４６ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
活性本体である未変化体ＧＬの薬物動態は、有効性、安全性から適正使用を判断する上で有用である。このため、ＧＡを評価対象にするのではなく、血漿等の生体試料中のＧＬ量を定量できることが望ましい。
【０００７】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、血漿等の生体試料中のＧＬを検出し定量するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、まず、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相を用いた固相抽出法により、生体試料中からＧＬを含む成分を抽出した後、抽出物中のＧＬを質量分析法に供することにより、生体試料中のＧＬを検出し定量できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１） 生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、
前記抽出工程により抽出された抽出物中のグリチルリチン、グリチルレチン酸、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の代謝物、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の類縁物質、甘草に含有されているサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する工程、
を有し、
前記洗浄液が、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液であることを特徴とする生薬由来成分の高感度定量方法、
（２） 前記抽出工程において、固相の洗浄を、アルカリとアルコールと水の混合液により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことを特徴とする前記（１）に記載の生薬由来成分の高感度定量方法、
（３） 前記アルカリとアルコールと水の混合液が、０．５〜２８％アンモニア水とメタノールを９９：１〜１：３であることを特徴とする前記（２）に記載の生薬由来成分の高感度定量方法、
（４）前記生体試料が、血液、血漿、又は組織抽出物であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の生薬由来成分の高感度定量方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、含有量が非常に少ない生体試料中のＧＬを検出し、定量することができる。このため、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を用いることにより、ＧＬを含有する製剤や飲食品を摂取したヒトから採取された生体試料中のＧＬを定量し、薬物動態を精度よく解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例６において、ブランク血漿サンプルのクロマトグラムを示した図である。
【図２】実施例６において、標準溶液（Ｇ）を添加した血漿サンプル（血漿中のＧＬ添加量：０．５ｎｇ／ｍＬ、ＧＡ添加量：２ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した図である。
【図３】実施例７において、ＧＬの平均血漿中濃度推移を示した図である。
【図４】実施例７において、ＧＡの平均血漿中濃度推移を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、生体試料中のＧＬを逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相を用いた固相抽出法により抽出した後、得られた抽出物中のＧＬ含有量を質量分析法により定量することを特徴とする。従来のＨＰＬＣ法等に代えて質量分析法を利用して定量することにより、ＧＬの検出感度を高められる。また、従来のＯＤＳカラムのような逆相分配機能のみを備える固相を用いた固相抽出法ではなく、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相を用いて調製することにより、質量分析に供される抽出物からより多くの夾雑物を除去することができ、質量分析の感度を飛躍的に向上させることができる。
【００１３】
具体的には、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、前記抽出工程により抽出された抽出物中のＧＬ、ＧＡ、ＧＬ及びＧＡの代謝物、ＧＬ及びＧＡの類縁物質、甘草に含有するサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する工程を有し、前記洗浄液が、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により定量される生薬由来成分は、ＧＬ、ＧＡ、ＧＬ及びＧＡの代謝物、ＧＬ及びＧＡの類縁物質、甘草に含有されているサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群（以下、「ＧＬ等」ということがある。）より選択される少なくも１種以上である。
ＧＬ及びＧＡの代謝物としては、例えば、３−ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ−ｇｌｙｃｈｒｒｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ（２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３０−ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ−ｇｌｙｃｈｒｒｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ（３β−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ｏｘｏ−ＧＡ（３，１１−Ｄｉｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、３α−ＧＡ（３α−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、３位硫酸抱合体（３β−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、３β，２２α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ、及び３β，２４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ等が挙げられる。
【００１５】
また、ＧＬ及びＧＡの類縁物質としては、例えば、２０α−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−２９−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−２４−ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、１８α−ＧＬ（２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−（１８αＨ）−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、１８α−ＧＡ（３β−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−（１８αＨ）−ｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００１６】
また、甘草に含有されているサポニン成分としては、例えば、ｌｉｃｏｒｉｃｅ−ｓａｐｏｎｉｎ Ｃ１（２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００１７】
本発明において用いられるＧＬ等の薬学的に許容される塩は、生体内において、ＧＬ等と同様の薬理効果を有する塩であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００１８】
本発明においては、ＧＬ等のうち、１種類を定量してもよく、２種類以上を一の操作で定量してもよい。本発明においては、特に、ＧＬとＧＡを同時に定量することが好ましい。
【００１９】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法に供される生体試料は、生体から採取された試料であればよく、ヒトやマウス、ラット等の動物から採取されたものであることが好ましい。また、血液、血漿、血清、尿、腹水、胸水、関節液、骨髄液、胆汁等であってもよく、肝臓や膵臓、腎臓等の組織から採取された組織片等の抽出物（組織抽出物）であってもよい。組織片等の抽出物は、組織片等を常法によりホモジナイズすることにより調製することができる。本発明においては、血液、血漿、尿、又は組織抽出物であることが好ましく、血漿であることがより好ましい。
【００２０】
以下、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を工程ごとに説明する。
抽出工程として、まず、生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を調製する。生体試料に添加するアルカリとしては、得られる混和物のｐＨをアルカリ性にすることができるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、アンモニア、アンモニア水、水酸化ナトリウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液等が挙げられる。また、アルコールとしては、炭素数１〜６の低級アルコールであることが好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。また、水で希釈されたアルコール溶液であってもよい。本発明においては、生体試料に添加するアルカリ又はアルコールとしては、アンモニア、アンモニア水、メタノール、又はメタノール水溶液であることが好ましく、アンモニア又はアンモニア水であることがより好ましい。
【００２１】
生体試料に添加するアンモニア水の濃度は特に限定されるものではなく、生体試料の種類、その後に使用する固相の種類、得られる混和物のアンモニア濃度等を考慮して適宜調整することができる。本発明においては、生体試料に添加するアンモニア又はアンモニア水の濃度は、得られる混和物のアンモニア濃度が０．０１〜３０％となるような濃度であることが好ましく、０．０５〜２５％となるような濃度であることがより好ましく、０．０５〜２０％となるような濃度であることがさらに好ましい。
【００２２】
次いで、得られた混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入し、当該混和物中のＧＬ等を固相に吸着させる。逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相としては、例えば、Ｏａｓｉｓ ＭＡＸ（Ｗａｔｅｒｓ社製）等が挙げられる。
【００２３】
ＧＬ等を吸着させた固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、非特異的に結合している成分を除去する。洗浄液は、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液である。洗浄液として用いられるアルカリやアルコールとしては、生体試料に添加されるアルカリやアルコールと同様のものが挙げられる。また、固相の洗浄は、同種の洗浄液で２回以上行ってもよく、異なる種類の洗浄液で順次洗浄してもよい。
【００２４】
本発明においては、固相の洗浄を、アルカリとアルコールと水との混合液、アルカリと水との混合液、又は水により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことが好ましく、アルカリとアルコールと水との混合液により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことがより好ましい。アルカリとアルコールと水の混合液としては、アンモニアとアルコールと水の混合液であることが好ましく、アンモニアとメタノールと水の混合液であることがより好ましい。
【００２５】
アンモニアとメタノールと水の混合液中の各成分の組成比は、ＧＬ等を固相に吸着させた状態を保持することができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、混合液中のメタノール濃度が１〜７５％、アンモニア濃度が０．１〜２１％であることが好ましく、メタノール濃度が２５〜７５％、アンモニア濃度が０．１〜２１％であることがより好ましい。このような組成比の混合液は、例えば、０．５〜２８％アンモニア水とメタノールを９９：１〜１：３で混合することにより、調製することができる。
【００２６】
一回目の洗浄をアルカリとアルコールと水の混合液により行った後、２回目の洗浄に用いる洗浄液としては、アルコールを用いることが好ましく、メタノール又はエタノールを用いることがより好ましく、メタノールを用いることがさらに好ましい。
【００２７】
その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する。酸性化する溶媒としては、ギ酸アルコール、塩酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。本発明においては、ギ酸アルコールであることが好ましい。溶出液として用いるギ酸アルコールとしては、ギ酸と炭素数１〜６の低級アルコールとのエステルであることが好ましく、ギ酸メタノール又はギ酸エタノールであることがより好ましく、ギ酸メタノールであることがさらに好ましい。また、得られた溶出物は、以降の質量分析のために、蒸発乾固させる。
【００２８】
次いで、定量工程として、抽出工程により抽出された抽出物中のＧＬ等を、質量分析法により検出し定量する。質量分析法としては、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）法又はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析）法により行うことが好ましい。具体的には、蒸発乾固させた溶出物をＬＣの移動相に溶解させた後、ＬＣを行い、ＭＳを行う。ＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ＨＰＬＣと質量分析計を組み合わせた装置を用いることにより行うことができる。
【００２９】
ＬＣは、特許文献１〜４に記載されているように、ＯＤＳカラム等の逆相分配機能を有するカラムを用いて行うことが好ましい。また、ＭＳは常法により行うことができる。例えば、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）法やＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）法により試料をイオン化した後、磁場偏向型、四重極型、飛行時間型等の装置により、各イオンを分離して検出する。
【００３０】
質量分析をＬＣ−ＭＳ法により行うことにより、例えば血液、血漿、又は血清中のＧＬ等の定量限界を２０ｎｇ／ｍＬ程度にまで改善することができる。同様に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により行うことによって、血液等中のＧＬ等の定量限界を１０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば０．５ｎｇ／ｍＬ程度にまで向上させることができる。
【００３１】
市販試薬の大量経口投与（ＧＬとして１６００ｍｇ）における血漿中ＧＬ濃度は約５００ｎｇ／ｍＬ程度であった、という報告がなされている（Environmental Health Perspectives, 102(9), 65-68, 1994）。当該知見に基づいた比例計算の結果、肝疾患治療を目的とした場合、臨床常用量である投与量７５ｍｇ相当の推定血中濃度は約２３ｎｇ／ｍＬと算出される。つまり、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、従来法では検出不可能であった血液中のＧＬが定量可能となる。特に、ＧＬ製剤等を経口摂取後の血液中のＧＬ濃度は、個体差が大きく、定量限界が不十分な測定法では、血液検体によってはＧＬが検出されない場合や、長時間の薬物動態を測定することができず、測定の精度や測定結果の信頼性が不十分となるが、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法では、特に質量分析をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により行うことによって、より信頼性の高い測定結果を得ることができる。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を、質量分析をＬＣ−ＭＳ法によりを行った場合の、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量限界値を測定し、かつ検量線を作成した。
＜標準溶液の調製＞
まず、ＧＬ（常磐植物化学研究所製）１０．０ｍｇを正確に量り、メタノールに溶解した後、正確に１００ｍＬとし、１００μｇ／ｍＬのＧＬ標準原液を調製した。同様に、ＧＡ（アルプス薬品工業株式会社製）１０．０ｍｇを正確に量り、メタノールに溶解した後、正確に１００ｍＬとし、１００μｇ／ｍＬのＧＡ標準原液を調製した。
次いで、ＧＬ標準原液２ｍＬ及びＧＡ標準原液８ｍＬを正確に分取し、メタノールで正確に５０ｍＬとして、ＧＬ濃度が４０００ｎｇ／ｍＬ、ＧＡ濃度が１６０００ｎｇ／ｍＬである標準溶液（Ａ）を調製した。この標準溶液Ａをメタノールで順次希釈し、表１に記載の標準溶液（Ｂ）〜（Ｆ）を調製した。標準原液及び標準溶液はそれぞれ調製後冷蔵保存（５±４℃）した。調製器具はガラス製のものを用いた。
【００３４】
【表１】
【００３５】
＜血漿サンプルの調製＞
ヒト血漿０．５ｍＬに、標準溶液（Ａ）５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。標準溶液（Ｂ）〜（Ｆ）についても、それぞれ同様にして血漿サンプルを調製した。これらの血漿サンプルには、内部標準液（ＩＳ）５０μＬをさらに添加した。なお、本実施例では、内部標準物質としてα−Ｈｅｄｅｒｉｎを用いた。また、ブランク血漿サンプルとして、ヒト血漿０．５ｍＬにメタノールを１００μＬ添加したものを調製した。
【００３６】
＜抽出工程＞
各血漿サンプルに、０．５６％アンモニア水１ｍＬを添加して十分に混和した後（混和物中のアンモニア濃度：０．３７％）、得られた混和物を全量、Ｏａｓｉｓ ＭＡＸ（Ｗａｔｅｒｓ社製）（以下、単に「ＭＡＸ」）に注入（アプライ）した。当該ＭＡＸは、血漿サンプルを注入する前に予め、２％ギ酸／メタノール溶液を注入した後、水を注入することにより、コンディショニングしておいた。
血漿サンプルを注入後、当該ＭＡＸに０．５６％アンモニア水／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）で洗浄した後、メタノールでさらに洗浄した。
その後、２％ギ酸／メタノール溶液を注入し、当該ＭＡＸに吸着していたＧＬ等を溶出させた。溶出液（抽出物）は、４０℃加温下、窒素ガスにて蒸発乾固させた。
【００３７】
＜定量工程＞
蒸発乾固させた抽出物を、下記移動相Ａ液／Ｂ液（体積比１：１の混合液）２５０μＬに溶解させた。このうち２０μＬを分析カラムに注入し、下記に示す条件でＬＣを行った。
装置： Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社製）
分析カラム： ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（ＵＧ１２０、５μｍ、１．５ｍｍ×１５０ｍｍ、資生堂社製）
移動相：Ａ液 ０．１％ギ酸、Ｂ液 ０．１％ギ酸アセトニトリル、リニアグラジエント（表２）
流速： ０．３０ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度： ４０℃
試料注入量： ２０μＬ
【００３８】
【表２】
【００３９】
次いで、ＬＣにより得られたＧＬ等を含む画分に対して、下記に示す条件でＭＳを行った。
装置： ＺＱ２０００（Ｗａｔｅｒｓ社製）
イオン化法： ＥＳＩ（Ｔｕｒｂｏ Ｓｐｒａｙ）
検出法： ＧＬ（負、正イオン検出)、ＧＡ・ＩＳ（正イオン検出)、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ電圧： ２．５ｋＶ
Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ： ２Ｖ
ＲＦ ｌｅｎｓ： ０．２Ｖ
Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： １１０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： ３５０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ： ３５０Ｌ／ｈｒ
Ｃｏｎｅ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ： ５０Ｌ／ｈｒ
【００４０】
【表３】
【００４１】
この結果、ＬＣ−ＭＳの測定結果は血漿サンプル中のＧＬ又はＧＡ濃度依存的に増大しており、血漿サンプル中のＧＬ又はＧＡ濃度とＬＣ−ＭＳの測定結果により得られた検量線は直線性を示した。すなわち、これらの結果から、血漿等の生体試料中のＧＬの濃度が２０〜４００ｎｇ／ｍＬ、ＧＡの濃度が８０〜１６００ｎｇ／ｍＬであり、ＬＣ−ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、生体試料中のＧＬ等を高精度に定量可能であることが明らかである。
【００４２】
＜特異性、直線性、日内再現性の検討＞
さらに、特異性、直線性、及び日内再現性を検討した。この結果、ＬＣ−ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、それぞれ２０〜４００ｎｇ／ｍＬ及び８０〜１６００ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な直線性（検量線の相関係数は０．９９７９）と再現性を示した。また、日内再現性の結果、表４に示すように、ＧＬのネガティブモードの真度は−１.２〜＋０．６％、精度は５．２〜６．０％であり、ポジティブモードの真度は−５．９〜＋５．９％、精度は３．３〜７．７％であり、ＧＡの真度は−７．０〜＋７．２％、精度は３．０〜７．７％であった。以上の結果より、ＧＬ及びＧＡの定量限界濃度はそれぞれ、２０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬであることが確認された。
【００４３】
【表４】
【００４４】
［実施例２］
生体試料に混和するアルカリ又はアルコールの種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、表５に記載の溶液１ｍＬを血漿サンプルに添加してＭＡＸにアプライする混和物を調製した以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表５に示す。なお、表５中のアンモニア水の後ろの括弧書内の数値は、当該アンモニア水を添加して得られた混和物中のアンモニア濃度を示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
この結果、アルカリやアルコールを用いた場合は、水を用いた場合よりも回収率が良好であった。逆に、リン酸や過塩素酸等の酸性溶液を添加した場合には、ＧＬは検出されず、ＧＡもほとんど回収できなかった。また、アルコールの中では、エタノールよりもメタノールを用いた場合のほうが、ＧＬとＧＡのどちらの回収率も良好であった。アルカリの中では、水酸化ナトリウム水溶液や炭酸水素ナトリウム溶液を用いた場合よりも、アンモニア水を用いた場合のほうが、良好であった。ただし、アンモニア水の濃度による違いはあまり観察されなかった。
【００４７】
［実施例３］
固相の洗浄液の種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、血漿サンプルを注入後のＭＡＸを表６に記載の溶液で洗浄した後、メタノールでさらに洗浄した以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
血漿サンプルを注入後のＭＡＸの洗浄液が０．５６％アンモニア水／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表６に示す。なお、表６中、溶液名の後ろの括弧書内の比率は、各溶液の混合比を示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】
この結果、０．００２５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）で洗浄した場合にのみ、ＧＡの回収率がやや低かったものの、水、アンモニア水、アンモニア水とメタノールの混合溶液のいずれを洗浄液とした場合も、ＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率は全て良好であった。
【００５０】
［実施例４］
固相の洗浄液の種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、血漿サンプルを注入後のＭＡＸを０．５６％アンモニア水／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）で洗浄した後、エタノール、メタノール、５０％メタノール水溶液、又はアセトニトリルでさらに洗浄した以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
２度目の洗浄液がメタノールであった場合を１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表７に示す。この結果、いずれの溶液で洗浄した場合であっても、ＧＬの回収率は８０％以上であり、良好であった。また、ＧＡの回収率も、５０％メタノールの場合を除き８０％以上であり、良好であった。特に、メタノールが最も良好であった。
【００５１】
【表７】
【００５２】
［実施例５］
固相からの溶出液の種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸからの溶出を表８に記載の溶液を用いて行った以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
【００５３】
【表８】
【００５４】
溶出液がギ酸メタノールであった場合を１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表８に示す。この結果、ギ酸メタノールが最も回収率が高かった。また、ギ酸エタノールを用いた場合も、ギ酸メタノールには及ばないものの、ＧＬとＧＡを良好に回収することができた。これに対して、溶出液がギ酸アセトニトリルやリン酸メタノールであった場合には、ＧＬは検出できなかった。
【００５５】
［比較例１］
ＭＡＸに代えて、逆相分配機能のみを備える固相を用いて、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量を行った。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸに代えてＯＤＳカラムであるＳｅｐ−Ｐａｋ（３ｃｃ、６０ｍｇ、３０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたこと、当該カラムのコンディショニングをメタノール、次いで水で行ったこと、及び、カラムにアプライする混和物を調製するための溶液（希釈液）として０．５６％アンモニア水若しくは０．１Ｎ塩酸、固相の洗浄液として水若しくはアセトニトリル／水（体積比＝１：３、１Ｍテトラブチルアンモニウムブロミド含有）、及び固相からの溶出液として２％ギ酸メタノール、２％ギ酸アセトニトリル／水（体積比＝１：１）若しくは２％ギ酸メタノール／水（体積比＝１：１）をそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
実施例２において血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表９に示す。なお、表９中、「１−１」は０．５６％アンモニア水、「１−２」は０．１Ｎ塩酸、「２−１」は水、「２−２」はアセトニトリル／水（体積比＝１：３、１Ｍテトラブチルアンモニウムブロミド含有）、「３−１」は２％ギ酸メタノール、「３−２」は２％ギ酸アセトニトリル／水（体積比＝１：１）、「３−３」は２％ギ酸メタノール／水（体積比＝１：１）である。
【００５６】
【表９】
【００５７】
この結果、希釈液等の組み合わせの中で最も回収率が良好な場合であっても、ＧＬの回収率はせいぜい５０％程度であり、ＭＡＸを用いた場合よりも遥かにＧＬ等の検出感度が劣ることが分かった。
【００５８】
［比較例２］
ＭＡＸに代えて、逆相分配機能と極性相互作用機能とを備える固相を用いて、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量を行った。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸに代えて多孔性ポリマーであるＯａｓｉｓ ＨＬＢ（３ｃｃ、６０ｍｇ、３０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたこと、当該カラムのコンディショニングをメタノール、次いで水で行ったこと、及び、カラムにアプライする混和物を調製するための溶液（希釈液）として０．５６％アンモニア水若しくは０．１Ｎ塩酸を、固相の洗浄液として５％メタノール水溶液を、及び固相からの溶出液としてメタノールをそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
実施例２において血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表１０に示す。
【００５９】
【表１０】
【００６０】
この結果、希釈液として０．１Ｎ塩酸を用いた場合には、ＧＬは検出されず、ＧＡの回収率も非常に低かった。一方、０．５６％アンモニア水を用いた場合であってさえ、ＧＬの回収率はせいぜい５５％程度であり、ＭＡＸを用いた場合よりも遥かにＧＬ等の検出感度が劣ることが分かった。
【００６１】
［比較例３］
ＭＡＸに代えて、逆相分配機能と陽イオン交換機能とを備える固相を用いて、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量を行った。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸに代えてＯａｓｉｓ ＭＣＸ（３ｃｃ、６０ｍｇ、３０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたこと、当該カラムのコンディショニングをメタノール、次いで水で行ったこと、及び、カラムにアプライする混和物を調製するための溶液（希釈液）として０．１Ｎ塩酸を、固相の洗浄液として０．１Ｎ塩酸を、及び固相からの溶出液として２％アンモニア水／メタノール溶液をそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
【００６２】
【表１１】
【００６３】
実施例２において血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。独立した５回の試行の算出結果及び平均値を表１１に示す。この結果、ＧＬとＧＡのいずれも回収率が５０％に届かず、ＭＡＸを用いた場合よりも遥かにＧＬ等の検出感度が劣ることが分かった。
【００６４】
［実施例６］
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を、質量分析をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によりを行った場合の、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量限界値を測定し、かつ検量線を作成した。また、同時に、当該方法の精度や信頼性を検証した。
＜標準溶液の調製＞
実施例１で用いた標準原液を実施例１と同様にしてメタノールにより希釈し、表１２に記載の標準溶液（Ｂ）〜（Ｇ）を調製した。
【００６５】
【表１２】
【００６６】
＜血漿サンプルの調製及び抽出工程＞
実施例１と同様にして、標準溶液（Ｂ）〜（Ｇ）を添加したヒト血漿サンプルとブランク血漿サンプルを調製し、これらの血漿サンプルをそれぞれＭＡＸにアプライして、ＧＬ等を吸着させ、０．５６％アンモニア水／メタノール溶液及びメタノールで洗浄した後に、２％ギ酸／メタノール溶液で溶出させ、さらに蒸発乾固した。
【００６７】
＜定量工程＞
蒸発乾固させた抽出物を、下記移動相Ａ液／Ｂ液（体積比１：１の混合液）２５０μＬに溶解させた。このうち１μＬを分析カラムに注入し、下記に示す条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム： ＡＰＩ４０００システム（アプライドバイオシステムズ社製）
（ＬＣ）
装置： ＬＣ−２０Ａ（島津製作所製）
分析カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径５μｍ、ジーエルサイエンス社製）
流速： ０．５０ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度： ４０℃
オートサンプラー温度： ５℃
試料注入量： １μＬ
移動相：Ａ液 ０．１％ギ酸、Ｂ液 ０．１％ギ酸アセトニトリル、リニアグラジエント（表１３）
【００６８】
【表１３】
【００６９】
（ＭＳ／ＭＳ）
装置： ＡＰＩ４０００（アプライドバイオシステムズ）
イオン化法： ＥＳＩ （Ｔｕｒｂｏ Ｓｐｒａｙ）
検出法： 正イオン検出 ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
イオンスプレー電圧（ＩｏｎＳｐｒａｙ Ｖｏｌｔａｇｅ）： ５５００Ｖ（正)
イオン源温度（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）： ４００℃
カーテンガス （Ｃｕｒｔａｉｎ Ｇａｓ）： １０ (窒素)
イオンソースガス１（Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ １）： ７０ (窒素)
イオンソースガス２（Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ ２）： ５０（窒素)
コリジョンガス（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｇａｓ）： ８（窒素)
【００７０】
【表１４】
【００７１】
図１に、ブランク血漿サンプルのクロマトグラムを示す。図１（Ａ）はＧＬのピークの位置（ＧＬの保持時間；ｍ／ｚ ８２３→４５３）を、図１（Ｂ）はＧＡのピークの位置（ＧＡの保持時間；ｍ／ｚ ４７１→１４９）を、図１（Ｃ）はＩＳのピークの位置（ＩＳの保持時間；ｍ／ｚ ７５１→４５５）をそれぞれ示す。また、図２に、標準溶液（Ｇ）を添加した血漿サンプル（血漿中のＧＬ濃度：０．５ｎｇ／ｍＬ、ＧＡ濃度：２ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す。図２（Ａ）はＧＬのピーク（図中、矢頭で示す）を、図２（Ｂ）はＧＡのピーク（図中、矢頭で示す）を、図２（Ｃ）はＩＳのピーク（図中、矢頭で示す）を、それぞれ示す。ＧＬ、ＧＡ、ＩＳの保持時間は、それぞれ約１．２分、３．１分、１．４分であり、ブランク血漿サンプルのクロマトグラム上には定量を妨害するピークは認められず、ＧＬ、ＧＡ、ＩＳのピーク形状は良好であった。
【００７２】
定量結果を表１５に示す。また、実際の添加濃度と測定値（表中、定量値）との相対誤差も同じく表１５に示した。この結果、ＧＬとＧＡの両方とも、相対誤差が１５％以内であった。すなわち、これらの結果から、血漿等の生体試料中のＧＬの濃度が０．５〜２００ｎｇ／ｍＬ、ＧＡの濃度が２〜８００ｎｇ／ｍＬである場合に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、生体試料中のＧＬ等を高精度に定量可能であることが明らかである。
【００７３】
【表１５】
【００７４】
＜特異性、直線性、日内、日間再現性の検討＞
さらに、米国食品医薬品局の分析法バリデーションのガイダンス（”Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation”, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, May 2001）に従い、特異性、直線性、日内、日間再現性を検討した。また、安定性評価試験（室温下４時間及び−２０℃及び−８０℃下３カ月凍結保存における生体試料中保存安定性、凍結融解安定性、測定実試料中安定性、標準溶液安定性）についても実施した。検討結果を表１６に示す。この結果、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、それぞれ０．５〜２００ｎｇ／ｍＬ及び２〜８００ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な直線性と再現性を示した。日内再現性の結果、ＧＬの真度は−１２．８〜＋４．８％、精度は４．０〜９．５％であり、ＧＡの真度は−１３．４〜＋４．４％、精度は２．２〜９．０％であった。一方、日間再現性においても、ＧＬの真度は−９．４〜＋２．０％、精度は２．１〜５．５％、ＧＡの真度は−１０．９〜＋８．１％、精度は１．３〜９．１％であった。再現性の結果より、ＧＬ及びＧＡの定量限界濃度はそれぞれ、０．５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬである事を確認した。また、全ての安定性評価試験（生体試料中保存安定性、凍結融解安定性、測定実試料中安定性、標準溶液安定性）において、初期値と比較し±１５％以内であり安定であった。以上の結果から、米国食品医薬品局の分析法バリデーションのガイダンスに則り、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法が信頼性の確保された定量法であることが確認された。
【００７５】
【表１６】
【００７６】
［実施例７］
ＧＬ含有製剤を経口投与後の血漿中のＧＬの検出及び薬物動態を測定した。
なお、本実施例は、ヘルシンキ宣言に基づく倫理的原則、薬事法第１４条第３項、第８０条の２及び「医薬品の臨床試験の実施の基準（ＧＣＰ）に関する省令」（平成９年厚生省令第２８号）に従い実施されたものである。具体的には、ＧＬ含有製剤の経口投与及び血漿サンプルの採取は、出願人の依頼により、イーピーエス株式会社及び医療法人社団育生會山口病院によって、第三者委員会における承認の後、試験責任医師の管理の下、実施された。また、得られた血漿サンプルにおけるＧＬ及びＧＡの測定は、同じく出願人の依頼により、株式会社日本医学臨床検査研究所エコテクノ事業部（現医薬香粧品分析事業部）によって行われた。
また、被験者は、試験の目的、試験内容、プライバシーの保護等について十分説明された後、書面にて試験への参加を同意した健康な日本人男性６名（年齢：２０歳以上３５歳以下、事前検査時ＢＭＩ：１８．５以上２５．０以下）を対象とした。
ＧＬ含有製剤として、グリチルリチン酸一アンモニウム、グリシン、ＤＬ−メチオニンを配合した糖衣錠「グリチロン（登録商標）配合錠」を用いた。グリチロン配合錠は、十分な水分と共に臨床常用量に従い、３錠の単回経口投与とした。投与及び採血時間などの試験スケジュールを表１７に示す。得られた血液は、３０分以内に遠心分離処理（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間）により血漿として１ｍＬ以上を回収し、濃度測定時まで−２０℃以下で凍結保存した。
【００７７】
【表１７】
【００７８】
採取された血漿サンプル０．５ｍＬに、０．５６％アンモニア水１ｍＬを添加して十分に混和した後、実施例１と同様にして、得られた混和物をＭＡＸにアプライしてＧＬ等を吸着させ、０．５６％アンモニア水／メタノール溶液及びメタノールで洗浄した後に、２％ギ酸／メタノール溶液で溶出させ、さらに蒸発乾固した。
次いで、実施例６と同様にして、蒸発乾固させた抽出物に対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行い、各血漿サンプル中のＧＬ濃度及びＧＡ濃度を測定した。図３は、ＧＬの平均血漿中濃度推移を示した図であり、図４は、ＧＡの平均血漿中濃度推移を示した図である。なお、図３及び図４は、６検体の平均値及び標準偏差を示している。この結果、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、従来から代替的な指標とされてきた主代謝物であるＧＡのみならず、未変化体であるＧＬ自体の血漿中濃度を直接測定し得ることが確認された。すなわち、本発明により、血漿中ＧＬの微量検出に初めて成功し、長らく不明であったＧＬの血中動態が明らかにされた。
【００７９】
＜薬物動態の解析＞
ＧＬ及びＧＡの測定データから、最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、最高血漿中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）を算出した。また、投与後４８時間までの血漿中濃度-時間曲線下面積（ＡＵＣ０→４８ｈ）は台形法により、消失速度定数（ｋｅｌ）及び消失半減期（ｔ１／２）は消失相から最小二乗法により算出した。また、投与後無限大時間までの血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０―∞）、体内滞留時間（ＭＲＴ）についても算出した。
この結果、本実施例では、ＧＬのＣｍａｘは約１０〜４０ｎｇ／ｍＬの範囲にあり、平均値として２４．８ｎｇ／ｍＬであった。これは、前述の市販試薬の大量経口投与例に基づいた予測値（約２３ｎｇ／ｍＬ）とほぼ同等であったことから、ＧＬの投与量と血漿中濃度の相関性が示された。また、Ｔｍａｘは平均４．５時間であったが、それ以前（１〜２時間）あるいは以後（１２時間）など複数の濃度ピークを示す被験者も観察された。後方の濃度ピークは食後に出現したことから、食事摂取がＧＬの吸収あるいは腸肝循環に影響を与える可能性も示唆された。
【００８０】
一方、ＧＬの主代謝物であるＧＡは、血漿中に確認されるまで４時間のラグが確認され、６時間後にＧＬの約１０倍の血漿中濃度(モル換算で約２０倍)が検出された。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、ヒト肝ミクロソームを用いてＧＬを至適条件下でインキュベートした結果、速やかに中間代謝物である３−ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ−ｇｌｙｃｈｒｒｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄへ変換されたが、ＧＡの生成は僅かであった（Biochemical Pharmacology,42(6/7)1025-1029,1991。）。また、ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅラットにおいてＧＬを経口投与した結果、血漿及び糞便中にＧＡが確認されないことから、生体内でのＧＡ生成は腸内細菌が支配的に担っていると考えられている（引用：J. Pharm. Pharmacol. 46, 135-137, 1994）。したがって、吸収のラグは腸内細菌叢へ接触するまでの時間と推測され、食事条件（あるいは絶食条件）が薬物の消化管内の移動、腸内細菌叢の代謝能、消化管吸収に影響し、ＧＡ曝露量を左右する要因とも考えられた。吸収後のＧＡ動態を被験者別に観察すると、未変化体濃度が高い被験者において代謝物の出現が弱く、反対に未変化体濃度が低い被験者において代謝物の出現が強い傾向が認められた。このことから、ＧＡと同時に未変化体であるＧＬの消化管吸収も腸内細菌叢の代謝能と関連し、それが個人差として発現する可能性が示唆された（データ不掲載）。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、臨床用量のＧＬ含有製剤や飲食品等を摂取した後の血液中のＧＬを定量することができるため、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、主に、医薬品・漢方の適正使用、安全性評価、薬物動態解析、新規のＧＬ製剤開発等に利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のグリチルリチンやその代謝物等を高感度に定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリチルリチン（以下、ＧＬと略記する）及びその塩は、抗アレルギー作用、抗炎症作用と共に、免疫調節作用、肝細胞障害抑制作用、肝細胞増殖促進作用、ウィルス増殖抑制・不活性化作用等の多様な生理活性を有する甘草根抽出成分である。日本では、古くから漢方薬等の臨床薬として用いられており、現在では、慢性肝疾患、湿疹・皮膚炎、小児ストロフルス、円形脱毛症、各種アレルギー、炎症等の治療に幅広く使用されている。また、医薬品以外の使用として、ＧＬは塩なれ効果をもち、甘味効果があることから甘味料として漬物や調味料など広範囲の食品に多用されている。
【０００３】
非臨床試験の結果から、ＧＬは肝臓に集積しやすく、且つ速やかに胆汁中へ排泄される特性があり、代謝及び腸肝循環を受けながら排出されると考えられている。特に経口投与において、配糖体で水溶性極性物質であるＧＬは低吸収性を示すと共に、腸内細菌による代謝や初回通過効果により、末梢血における濃度が極めて低い。このため、ＧＬの血中動態を測定するために、現在までに様々な方法が試みられているが、ＧＬを含有する製剤、甘草を配合する漢方製剤において、服用時の血中ＧＬは検出困難であり、その動態も長い間不明とされてきた。
【０００４】
例えば、ＧＬを経口投与された健常者から採取された血漿に対して、メタノール処理を行ってタンパク質を除去した後、当該血漿中のＧＬの量を、酵素免疫法（ＥＩＡ）により測定する方法やオクタデシル基化学結合型（ＯＤＳ）カラム等の逆相分配機能を備えるカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定する方法（例えば、非特許文献１〜４）がある。しかしながら、これらの測定方法では、定量限界値がせいぜい０．１μｇ／ｍＬ程度であり、主代謝物であるグリチルレチン酸（以下、ＧＡと略記する。）は検出することができても、ＧＬは検出することはできなかった。このため、尿中からの検出例をもって間接的にＧＬの血中移行が証明された（引用文献４参照。）。そして、ＧＬ含有製剤薬効については、ＧＬの代わりに、定量可能なＧＡが評価指標とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】イシワタ、他７名、バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリテン（Biological and Pharmaceutical Bulletin）、２０００年、第２３巻、第８号、第９０４〜９０５ページ。
【非特許文献２】デ・グルー（De Groot）、他１名、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、１９８８年、第４５６巻、第７１〜８１ページ。
【非特許文献３】ナカタ、他３名、和漢医薬学会誌、１９８６年、第３巻、第３号、第２７８〜２７９ページ。
【非特許文献４】ヤマムラ、他７名、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Journal of Pharmaceutical Sciences）、１９９２年、第８１巻、第１０号、第１０４２〜１０４６ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
活性本体である未変化体ＧＬの薬物動態は、有効性、安全性から適正使用を判断する上で有用である。このため、ＧＡを評価対象にするのではなく、血漿等の生体試料中のＧＬ量を定量できることが望ましい。
【０００７】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、血漿等の生体試料中のＧＬを検出し定量するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、まず、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相を用いた固相抽出法により、生体試料中からＧＬを含む成分を抽出した後、抽出物中のＧＬを質量分析法に供することにより、生体試料中のＧＬを検出し定量できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１） 生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、
前記抽出工程により抽出された抽出物中のグリチルリチン、グリチルレチン酸、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の代謝物、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の類縁物質、甘草に含有されているサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する工程、
を有し、
前記洗浄液が、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液であることを特徴とする生薬由来成分の高感度定量方法、
（２） 前記抽出工程において、固相の洗浄を、アルカリとアルコールと水の混合液により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことを特徴とする前記（１）に記載の生薬由来成分の高感度定量方法、
（３） 前記アルカリとアルコールと水の混合液が、０．５〜２８％アンモニア水とメタノールを９９：１〜１：３であることを特徴とする前記（２）に記載の生薬由来成分の高感度定量方法、
（４）前記生体試料が、血液、血漿、又は組織抽出物であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の生薬由来成分の高感度定量方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、含有量が非常に少ない生体試料中のＧＬを検出し、定量することができる。このため、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を用いることにより、ＧＬを含有する製剤や飲食品を摂取したヒトから採取された生体試料中のＧＬを定量し、薬物動態を精度よく解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例６において、ブランク血漿サンプルのクロマトグラムを示した図である。
【図２】実施例６において、標準溶液（Ｇ）を添加した血漿サンプル（血漿中のＧＬ添加量：０．５ｎｇ／ｍＬ、ＧＡ添加量：２ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した図である。
【図３】実施例７において、ＧＬの平均血漿中濃度推移を示した図である。
【図４】実施例７において、ＧＡの平均血漿中濃度推移を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、生体試料中のＧＬを逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相を用いた固相抽出法により抽出した後、得られた抽出物中のＧＬ含有量を質量分析法により定量することを特徴とする。従来のＨＰＬＣ法等に代えて質量分析法を利用して定量することにより、ＧＬの検出感度を高められる。また、従来のＯＤＳカラムのような逆相分配機能のみを備える固相を用いた固相抽出法ではなく、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相を用いて調製することにより、質量分析に供される抽出物からより多くの夾雑物を除去することができ、質量分析の感度を飛躍的に向上させることができる。
【００１３】
具体的には、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、前記抽出工程により抽出された抽出物中のＧＬ、ＧＡ、ＧＬ及びＧＡの代謝物、ＧＬ及びＧＡの類縁物質、甘草に含有するサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する工程を有し、前記洗浄液が、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により定量される生薬由来成分は、ＧＬ、ＧＡ、ＧＬ及びＧＡの代謝物、ＧＬ及びＧＡの類縁物質、甘草に含有されているサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群（以下、「ＧＬ等」ということがある。）より選択される少なくも１種以上である。
ＧＬ及びＧＡの代謝物としては、例えば、３−ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ−ｇｌｙｃｈｒｒｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ（２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３０−ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ−ｇｌｙｃｈｒｒｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ（３β−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ｏｘｏ−ＧＡ（３，１１−Ｄｉｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、３α−ＧＡ（３α−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、３位硫酸抱合体（３β−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、３β，２２α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ、及び３β，２４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ等が挙げられる。
【００１５】
また、ＧＬ及びＧＡの類縁物質としては、例えば、２０α−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−２９−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−２４−ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、１８α−ＧＬ（２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−（１８αＨ）−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、１８α−ＧＡ（３β−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−（１８αＨ）−ｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３０−ｏｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００１６】
また、甘草に含有されているサポニン成分としては、例えば、ｌｉｃｏｒｉｃｅ−ｓａｐｏｎｉｎ Ｃ１（２０β−Ｃａｒｂｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−３０−ｎｏｒｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｙｌ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−（１→２）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００１７】
本発明において用いられるＧＬ等の薬学的に許容される塩は、生体内において、ＧＬ等と同様の薬理効果を有する塩であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００１８】
本発明においては、ＧＬ等のうち、１種類を定量してもよく、２種類以上を一の操作で定量してもよい。本発明においては、特に、ＧＬとＧＡを同時に定量することが好ましい。
【００１９】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法に供される生体試料は、生体から採取された試料であればよく、ヒトやマウス、ラット等の動物から採取されたものであることが好ましい。また、血液、血漿、血清、尿、腹水、胸水、関節液、骨髄液、胆汁等であってもよく、肝臓や膵臓、腎臓等の組織から採取された組織片等の抽出物（組織抽出物）であってもよい。組織片等の抽出物は、組織片等を常法によりホモジナイズすることにより調製することができる。本発明においては、血液、血漿、尿、又は組織抽出物であることが好ましく、血漿であることがより好ましい。
【００２０】
以下、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を工程ごとに説明する。
抽出工程として、まず、生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を調製する。生体試料に添加するアルカリとしては、得られる混和物のｐＨをアルカリ性にすることができるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、アンモニア、アンモニア水、水酸化ナトリウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液等が挙げられる。また、アルコールとしては、炭素数１〜６の低級アルコールであることが好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。また、水で希釈されたアルコール溶液であってもよい。本発明においては、生体試料に添加するアルカリ又はアルコールとしては、アンモニア、アンモニア水、メタノール、又はメタノール水溶液であることが好ましく、アンモニア又はアンモニア水であることがより好ましい。
【００２１】
生体試料に添加するアンモニア水の濃度は特に限定されるものではなく、生体試料の種類、その後に使用する固相の種類、得られる混和物のアンモニア濃度等を考慮して適宜調整することができる。本発明においては、生体試料に添加するアンモニア又はアンモニア水の濃度は、得られる混和物のアンモニア濃度が０．０１〜３０％となるような濃度であることが好ましく、０．０５〜２５％となるような濃度であることがより好ましく、０．０５〜２０％となるような濃度であることがさらに好ましい。
【００２２】
次いで、得られた混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入し、当該混和物中のＧＬ等を固相に吸着させる。逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相としては、例えば、Ｏａｓｉｓ ＭＡＸ（Ｗａｔｅｒｓ社製）等が挙げられる。
【００２３】
ＧＬ等を吸着させた固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、非特異的に結合している成分を除去する。洗浄液は、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液である。洗浄液として用いられるアルカリやアルコールとしては、生体試料に添加されるアルカリやアルコールと同様のものが挙げられる。また、固相の洗浄は、同種の洗浄液で２回以上行ってもよく、異なる種類の洗浄液で順次洗浄してもよい。
【００２４】
本発明においては、固相の洗浄を、アルカリとアルコールと水との混合液、アルカリと水との混合液、又は水により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことが好ましく、アルカリとアルコールと水との混合液により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことがより好ましい。アルカリとアルコールと水の混合液としては、アンモニアとアルコールと水の混合液であることが好ましく、アンモニアとメタノールと水の混合液であることがより好ましい。
【００２５】
アンモニアとメタノールと水の混合液中の各成分の組成比は、ＧＬ等を固相に吸着させた状態を保持することができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、混合液中のメタノール濃度が１〜７５％、アンモニア濃度が０．１〜２１％であることが好ましく、メタノール濃度が２５〜７５％、アンモニア濃度が０．１〜２１％であることがより好ましい。このような組成比の混合液は、例えば、０．５〜２８％アンモニア水とメタノールを９９：１〜１：３で混合することにより、調製することができる。
【００２６】
一回目の洗浄をアルカリとアルコールと水の混合液により行った後、２回目の洗浄に用いる洗浄液としては、アルコールを用いることが好ましく、メタノール又はエタノールを用いることがより好ましく、メタノールを用いることがさらに好ましい。
【００２７】
その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する。酸性化する溶媒としては、ギ酸アルコール、塩酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。本発明においては、ギ酸アルコールであることが好ましい。溶出液として用いるギ酸アルコールとしては、ギ酸と炭素数１〜６の低級アルコールとのエステルであることが好ましく、ギ酸メタノール又はギ酸エタノールであることがより好ましく、ギ酸メタノールであることがさらに好ましい。また、得られた溶出物は、以降の質量分析のために、蒸発乾固させる。
【００２８】
次いで、定量工程として、抽出工程により抽出された抽出物中のＧＬ等を、質量分析法により検出し定量する。質量分析法としては、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）法又はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析）法により行うことが好ましい。具体的には、蒸発乾固させた溶出物をＬＣの移動相に溶解させた後、ＬＣを行い、ＭＳを行う。ＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ＨＰＬＣと質量分析計を組み合わせた装置を用いることにより行うことができる。
【００２９】
ＬＣは、特許文献１〜４に記載されているように、ＯＤＳカラム等の逆相分配機能を有するカラムを用いて行うことが好ましい。また、ＭＳは常法により行うことができる。例えば、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）法やＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）法により試料をイオン化した後、磁場偏向型、四重極型、飛行時間型等の装置により、各イオンを分離して検出する。
【００３０】
質量分析をＬＣ−ＭＳ法により行うことにより、例えば血液、血漿、又は血清中のＧＬ等の定量限界を２０ｎｇ／ｍＬ程度にまで改善することができる。同様に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により行うことによって、血液等中のＧＬ等の定量限界を１０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば０．５ｎｇ／ｍＬ程度にまで向上させることができる。
【００３１】
市販試薬の大量経口投与（ＧＬとして１６００ｍｇ）における血漿中ＧＬ濃度は約５００ｎｇ／ｍＬ程度であった、という報告がなされている（Environmental Health Perspectives, 102(9), 65-68, 1994）。当該知見に基づいた比例計算の結果、肝疾患治療を目的とした場合、臨床常用量である投与量７５ｍｇ相当の推定血中濃度は約２３ｎｇ／ｍＬと算出される。つまり、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、従来法では検出不可能であった血液中のＧＬが定量可能となる。特に、ＧＬ製剤等を経口摂取後の血液中のＧＬ濃度は、個体差が大きく、定量限界が不十分な測定法では、血液検体によってはＧＬが検出されない場合や、長時間の薬物動態を測定することができず、測定の精度や測定結果の信頼性が不十分となるが、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法では、特に質量分析をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により行うことによって、より信頼性の高い測定結果を得ることができる。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を、質量分析をＬＣ−ＭＳ法によりを行った場合の、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量限界値を測定し、かつ検量線を作成した。
＜標準溶液の調製＞
まず、ＧＬ（常磐植物化学研究所製）１０．０ｍｇを正確に量り、メタノールに溶解した後、正確に１００ｍＬとし、１００μｇ／ｍＬのＧＬ標準原液を調製した。同様に、ＧＡ（アルプス薬品工業株式会社製）１０．０ｍｇを正確に量り、メタノールに溶解した後、正確に１００ｍＬとし、１００μｇ／ｍＬのＧＡ標準原液を調製した。
次いで、ＧＬ標準原液２ｍＬ及びＧＡ標準原液８ｍＬを正確に分取し、メタノールで正確に５０ｍＬとして、ＧＬ濃度が４０００ｎｇ／ｍＬ、ＧＡ濃度が１６０００ｎｇ／ｍＬである標準溶液（Ａ）を調製した。この標準溶液Ａをメタノールで順次希釈し、表１に記載の標準溶液（Ｂ）〜（Ｆ）を調製した。標準原液及び標準溶液はそれぞれ調製後冷蔵保存（５±４℃）した。調製器具はガラス製のものを用いた。
【００３４】
【表１】
【００３５】
＜血漿サンプルの調製＞
ヒト血漿０．５ｍＬに、標準溶液（Ａ）５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。標準溶液（Ｂ）〜（Ｆ）についても、それぞれ同様にして血漿サンプルを調製した。これらの血漿サンプルには、内部標準液（ＩＳ）５０μＬをさらに添加した。なお、本実施例では、内部標準物質としてα−Ｈｅｄｅｒｉｎを用いた。また、ブランク血漿サンプルとして、ヒト血漿０．５ｍＬにメタノールを１００μＬ添加したものを調製した。
【００３６】
＜抽出工程＞
各血漿サンプルに、０．５６％アンモニア水１ｍＬを添加して十分に混和した後（混和物中のアンモニア濃度：０．３７％）、得られた混和物を全量、Ｏａｓｉｓ ＭＡＸ（Ｗａｔｅｒｓ社製）（以下、単に「ＭＡＸ」）に注入（アプライ）した。当該ＭＡＸは、血漿サンプルを注入する前に予め、２％ギ酸／メタノール溶液を注入した後、水を注入することにより、コンディショニングしておいた。
血漿サンプルを注入後、当該ＭＡＸに０．５６％アンモニア水／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）で洗浄した後、メタノールでさらに洗浄した。
その後、２％ギ酸／メタノール溶液を注入し、当該ＭＡＸに吸着していたＧＬ等を溶出させた。溶出液（抽出物）は、４０℃加温下、窒素ガスにて蒸発乾固させた。
【００３７】
＜定量工程＞
蒸発乾固させた抽出物を、下記移動相Ａ液／Ｂ液（体積比１：１の混合液）２５０μＬに溶解させた。このうち２０μＬを分析カラムに注入し、下記に示す条件でＬＣを行った。
装置： Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社製）
分析カラム： ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（ＵＧ１２０、５μｍ、１．５ｍｍ×１５０ｍｍ、資生堂社製）
移動相：Ａ液 ０．１％ギ酸、Ｂ液 ０．１％ギ酸アセトニトリル、リニアグラジエント（表２）
流速： ０．３０ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度： ４０℃
試料注入量： ２０μＬ
【００３８】
【表２】
【００３９】
次いで、ＬＣにより得られたＧＬ等を含む画分に対して、下記に示す条件でＭＳを行った。
装置： ＺＱ２０００（Ｗａｔｅｒｓ社製）
イオン化法： ＥＳＩ（Ｔｕｒｂｏ Ｓｐｒａｙ）
検出法： ＧＬ（負、正イオン検出)、ＧＡ・ＩＳ（正イオン検出)、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ電圧： ２．５ｋＶ
Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ： ２Ｖ
ＲＦ ｌｅｎｓ： ０．２Ｖ
Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： １１０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： ３５０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ： ３５０Ｌ／ｈｒ
Ｃｏｎｅ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ： ５０Ｌ／ｈｒ
【００４０】
【表３】
【００４１】
この結果、ＬＣ−ＭＳの測定結果は血漿サンプル中のＧＬ又はＧＡ濃度依存的に増大しており、血漿サンプル中のＧＬ又はＧＡ濃度とＬＣ−ＭＳの測定結果により得られた検量線は直線性を示した。すなわち、これらの結果から、血漿等の生体試料中のＧＬの濃度が２０〜４００ｎｇ／ｍＬ、ＧＡの濃度が８０〜１６００ｎｇ／ｍＬであり、ＬＣ−ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、生体試料中のＧＬ等を高精度に定量可能であることが明らかである。
【００４２】
＜特異性、直線性、日内再現性の検討＞
さらに、特異性、直線性、及び日内再現性を検討した。この結果、ＬＣ−ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、それぞれ２０〜４００ｎｇ／ｍＬ及び８０〜１６００ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な直線性（検量線の相関係数は０．９９７９）と再現性を示した。また、日内再現性の結果、表４に示すように、ＧＬのネガティブモードの真度は−１.２〜＋０．６％、精度は５．２〜６．０％であり、ポジティブモードの真度は−５．９〜＋５．９％、精度は３．３〜７．７％であり、ＧＡの真度は−７．０〜＋７．２％、精度は３．０〜７．７％であった。以上の結果より、ＧＬ及びＧＡの定量限界濃度はそれぞれ、２０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬであることが確認された。
【００４３】
【表４】
【００４４】
［実施例２］
生体試料に混和するアルカリ又はアルコールの種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、表５に記載の溶液１ｍＬを血漿サンプルに添加してＭＡＸにアプライする混和物を調製した以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表５に示す。なお、表５中のアンモニア水の後ろの括弧書内の数値は、当該アンモニア水を添加して得られた混和物中のアンモニア濃度を示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
この結果、アルカリやアルコールを用いた場合は、水を用いた場合よりも回収率が良好であった。逆に、リン酸や過塩素酸等の酸性溶液を添加した場合には、ＧＬは検出されず、ＧＡもほとんど回収できなかった。また、アルコールの中では、エタノールよりもメタノールを用いた場合のほうが、ＧＬとＧＡのどちらの回収率も良好であった。アルカリの中では、水酸化ナトリウム水溶液や炭酸水素ナトリウム溶液を用いた場合よりも、アンモニア水を用いた場合のほうが、良好であった。ただし、アンモニア水の濃度による違いはあまり観察されなかった。
【００４７】
［実施例３］
固相の洗浄液の種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、血漿サンプルを注入後のＭＡＸを表６に記載の溶液で洗浄した後、メタノールでさらに洗浄した以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
血漿サンプルを注入後のＭＡＸの洗浄液が０．５６％アンモニア水／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表６に示す。なお、表６中、溶液名の後ろの括弧書内の比率は、各溶液の混合比を示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】
この結果、０．００２５Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）で洗浄した場合にのみ、ＧＡの回収率がやや低かったものの、水、アンモニア水、アンモニア水とメタノールの混合溶液のいずれを洗浄液とした場合も、ＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率は全て良好であった。
【００５０】
［実施例４］
固相の洗浄液の種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、血漿サンプルを注入後のＭＡＸを０．５６％アンモニア水／メタノール溶液（体積比１：１の混合液）で洗浄した後、エタノール、メタノール、５０％メタノール水溶液、又はアセトニトリルでさらに洗浄した以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
２度目の洗浄液がメタノールであった場合を１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表７に示す。この結果、いずれの溶液で洗浄した場合であっても、ＧＬの回収率は８０％以上であり、良好であった。また、ＧＡの回収率も、５０％メタノールの場合を除き８０％以上であり、良好であった。特に、メタノールが最も良好であった。
【００５１】
【表７】
【００５２】
［実施例５］
固相からの溶出液の種類が、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法の定量感度に及ぼす影響を調べた。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸからの溶出を表８に記載の溶液を用いて行った以外は実施例１と同様にして、ＧＬ及びＧＡを定量した。
【００５３】
【表８】
【００５４】
溶出液がギ酸メタノールであった場合を１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表８に示す。この結果、ギ酸メタノールが最も回収率が高かった。また、ギ酸エタノールを用いた場合も、ギ酸メタノールには及ばないものの、ＧＬとＧＡを良好に回収することができた。これに対して、溶出液がギ酸アセトニトリルやリン酸メタノールであった場合には、ＧＬは検出できなかった。
【００５５】
［比較例１］
ＭＡＸに代えて、逆相分配機能のみを備える固相を用いて、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量を行った。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸに代えてＯＤＳカラムであるＳｅｐ−Ｐａｋ（３ｃｃ、６０ｍｇ、３０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたこと、当該カラムのコンディショニングをメタノール、次いで水で行ったこと、及び、カラムにアプライする混和物を調製するための溶液（希釈液）として０．５６％アンモニア水若しくは０．１Ｎ塩酸、固相の洗浄液として水若しくはアセトニトリル／水（体積比＝１：３、１Ｍテトラブチルアンモニウムブロミド含有）、及び固相からの溶出液として２％ギ酸メタノール、２％ギ酸アセトニトリル／水（体積比＝１：１）若しくは２％ギ酸メタノール／水（体積比＝１：１）をそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
実施例２において血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表９に示す。なお、表９中、「１−１」は０．５６％アンモニア水、「１−２」は０．１Ｎ塩酸、「２−１」は水、「２−２」はアセトニトリル／水（体積比＝１：３、１Ｍテトラブチルアンモニウムブロミド含有）、「３−１」は２％ギ酸メタノール、「３−２」は２％ギ酸アセトニトリル／水（体積比＝１：１）、「３−３」は２％ギ酸メタノール／水（体積比＝１：１）である。
【００５６】
【表９】
【００５７】
この結果、希釈液等の組み合わせの中で最も回収率が良好な場合であっても、ＧＬの回収率はせいぜい５０％程度であり、ＭＡＸを用いた場合よりも遥かにＧＬ等の検出感度が劣ることが分かった。
【００５８】
［比較例２］
ＭＡＸに代えて、逆相分配機能と極性相互作用機能とを備える固相を用いて、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量を行った。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸに代えて多孔性ポリマーであるＯａｓｉｓ ＨＬＢ（３ｃｃ、６０ｍｇ、３０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたこと、当該カラムのコンディショニングをメタノール、次いで水で行ったこと、及び、カラムにアプライする混和物を調製するための溶液（希釈液）として０．５６％アンモニア水若しくは０．１Ｎ塩酸を、固相の洗浄液として５％メタノール水溶液を、及び固相からの溶出液としてメタノールをそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
実施例２において血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。算出結果を表１０に示す。
【００５９】
【表１０】
【００６０】
この結果、希釈液として０．１Ｎ塩酸を用いた場合には、ＧＬは検出されず、ＧＡの回収率も非常に低かった。一方、０．５６％アンモニア水を用いた場合であってさえ、ＧＬの回収率はせいぜい５５％程度であり、ＭＡＸを用いた場合よりも遥かにＧＬ等の検出感度が劣ることが分かった。
【００６１】
［比較例３］
ＭＡＸに代えて、逆相分配機能と陽イオン交換機能とを備える固相を用いて、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量を行った。
ヒト血漿０．５ｍＬに、実施例１の標準溶液（Ｅ）５０μＬ及びＩＳ５０μＬを添加し、十分に混和したものを血漿サンプルとした。
具体的には、ＭＡＸに代えてＯａｓｉｓ ＭＣＸ（３ｃｃ、６０ｍｇ、３０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたこと、当該カラムのコンディショニングをメタノール、次いで水で行ったこと、及び、カラムにアプライする混和物を調製するための溶液（希釈液）として０．１Ｎ塩酸を、固相の洗浄液として０．１Ｎ塩酸を、及び固相からの溶出液として２％アンモニア水／メタノール溶液をそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
【００６２】
【表１１】
【００６３】
実施例２において血漿サンプルに混和した溶液が０．５６％アンモニア水であった場合の定量結果をそれぞれ回収率１００％とし、各血漿サンプルのＧＬ、ＧＡ、及びＩＳの回収率（相対値）を算出した。独立した５回の試行の算出結果及び平均値を表１１に示す。この結果、ＧＬとＧＡのいずれも回収率が５０％に届かず、ＭＡＸを用いた場合よりも遥かにＧＬ等の検出感度が劣ることが分かった。
【００６４】
［実施例６］
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法を、質量分析をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によりを行った場合の、血漿中のＧＬ及びＧＡの定量限界値を測定し、かつ検量線を作成した。また、同時に、当該方法の精度や信頼性を検証した。
＜標準溶液の調製＞
実施例１で用いた標準原液を実施例１と同様にしてメタノールにより希釈し、表１２に記載の標準溶液（Ｂ）〜（Ｇ）を調製した。
【００６５】
【表１２】
【００６６】
＜血漿サンプルの調製及び抽出工程＞
実施例１と同様にして、標準溶液（Ｂ）〜（Ｇ）を添加したヒト血漿サンプルとブランク血漿サンプルを調製し、これらの血漿サンプルをそれぞれＭＡＸにアプライして、ＧＬ等を吸着させ、０．５６％アンモニア水／メタノール溶液及びメタノールで洗浄した後に、２％ギ酸／メタノール溶液で溶出させ、さらに蒸発乾固した。
【００６７】
＜定量工程＞
蒸発乾固させた抽出物を、下記移動相Ａ液／Ｂ液（体積比１：１の混合液）２５０μＬに溶解させた。このうち１μＬを分析カラムに注入し、下記に示す条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム： ＡＰＩ４０００システム（アプライドバイオシステムズ社製）
（ＬＣ）
装置： ＬＣ−２０Ａ（島津製作所製）
分析カラム： Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径５μｍ、ジーエルサイエンス社製）
流速： ０．５０ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度： ４０℃
オートサンプラー温度： ５℃
試料注入量： １μＬ
移動相：Ａ液 ０．１％ギ酸、Ｂ液 ０．１％ギ酸アセトニトリル、リニアグラジエント（表１３）
【００６８】
【表１３】
【００６９】
（ＭＳ／ＭＳ）
装置： ＡＰＩ４０００（アプライドバイオシステムズ）
イオン化法： ＥＳＩ （Ｔｕｒｂｏ Ｓｐｒａｙ）
検出法： 正イオン検出 ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
イオンスプレー電圧（ＩｏｎＳｐｒａｙ Ｖｏｌｔａｇｅ）： ５５００Ｖ（正)
イオン源温度（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）： ４００℃
カーテンガス （Ｃｕｒｔａｉｎ Ｇａｓ）： １０ (窒素)
イオンソースガス１（Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ １）： ７０ (窒素)
イオンソースガス２（Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ ２）： ５０（窒素)
コリジョンガス（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｇａｓ）： ８（窒素)
【００７０】
【表１４】
【００７１】
図１に、ブランク血漿サンプルのクロマトグラムを示す。図１（Ａ）はＧＬのピークの位置（ＧＬの保持時間；ｍ／ｚ ８２３→４５３）を、図１（Ｂ）はＧＡのピークの位置（ＧＡの保持時間；ｍ／ｚ ４７１→１４９）を、図１（Ｃ）はＩＳのピークの位置（ＩＳの保持時間；ｍ／ｚ ７５１→４５５）をそれぞれ示す。また、図２に、標準溶液（Ｇ）を添加した血漿サンプル（血漿中のＧＬ濃度：０．５ｎｇ／ｍＬ、ＧＡ濃度：２ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す。図２（Ａ）はＧＬのピーク（図中、矢頭で示す）を、図２（Ｂ）はＧＡのピーク（図中、矢頭で示す）を、図２（Ｃ）はＩＳのピーク（図中、矢頭で示す）を、それぞれ示す。ＧＬ、ＧＡ、ＩＳの保持時間は、それぞれ約１．２分、３．１分、１．４分であり、ブランク血漿サンプルのクロマトグラム上には定量を妨害するピークは認められず、ＧＬ、ＧＡ、ＩＳのピーク形状は良好であった。
【００７２】
定量結果を表１５に示す。また、実際の添加濃度と測定値（表中、定量値）との相対誤差も同じく表１５に示した。この結果、ＧＬとＧＡの両方とも、相対誤差が１５％以内であった。すなわち、これらの結果から、血漿等の生体試料中のＧＬの濃度が０．５〜２００ｎｇ／ｍＬ、ＧＡの濃度が２〜８００ｎｇ／ｍＬである場合に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、生体試料中のＧＬ等を高精度に定量可能であることが明らかである。
【００７３】
【表１５】
【００７４】
＜特異性、直線性、日内、日間再現性の検討＞
さらに、米国食品医薬品局の分析法バリデーションのガイダンス（”Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation”, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, May 2001）に従い、特異性、直線性、日内、日間再現性を検討した。また、安定性評価試験（室温下４時間及び−２０℃及び−８０℃下３カ月凍結保存における生体試料中保存安定性、凍結融解安定性、測定実試料中安定性、標準溶液安定性）についても実施した。検討結果を表１６に示す。この結果、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、それぞれ０．５〜２００ｎｇ／ｍＬ及び２〜８００ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な直線性と再現性を示した。日内再現性の結果、ＧＬの真度は−１２．８〜＋４．８％、精度は４．０〜９．５％であり、ＧＡの真度は−１３．４〜＋４．４％、精度は２．２〜９．０％であった。一方、日間再現性においても、ＧＬの真度は−９．４〜＋２．０％、精度は２．１〜５．５％、ＧＡの真度は−１０．９〜＋８．１％、精度は１．３〜９．１％であった。再現性の結果より、ＧＬ及びＧＡの定量限界濃度はそれぞれ、０．５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬである事を確認した。また、全ての安定性評価試験（生体試料中保存安定性、凍結融解安定性、測定実試料中安定性、標準溶液安定性）において、初期値と比較し±１５％以内であり安定であった。以上の結果から、米国食品医薬品局の分析法バリデーションのガイダンスに則り、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法が信頼性の確保された定量法であることが確認された。
【００７５】
【表１６】
【００７６】
［実施例７］
ＧＬ含有製剤を経口投与後の血漿中のＧＬの検出及び薬物動態を測定した。
なお、本実施例は、ヘルシンキ宣言に基づく倫理的原則、薬事法第１４条第３項、第８０条の２及び「医薬品の臨床試験の実施の基準（ＧＣＰ）に関する省令」（平成９年厚生省令第２８号）に従い実施されたものである。具体的には、ＧＬ含有製剤の経口投与及び血漿サンプルの採取は、出願人の依頼により、イーピーエス株式会社及び医療法人社団育生會山口病院によって、第三者委員会における承認の後、試験責任医師の管理の下、実施された。また、得られた血漿サンプルにおけるＧＬ及びＧＡの測定は、同じく出願人の依頼により、株式会社日本医学臨床検査研究所エコテクノ事業部（現医薬香粧品分析事業部）によって行われた。
また、被験者は、試験の目的、試験内容、プライバシーの保護等について十分説明された後、書面にて試験への参加を同意した健康な日本人男性６名（年齢：２０歳以上３５歳以下、事前検査時ＢＭＩ：１８．５以上２５．０以下）を対象とした。
ＧＬ含有製剤として、グリチルリチン酸一アンモニウム、グリシン、ＤＬ−メチオニンを配合した糖衣錠「グリチロン（登録商標）配合錠」を用いた。グリチロン配合錠は、十分な水分と共に臨床常用量に従い、３錠の単回経口投与とした。投与及び採血時間などの試験スケジュールを表１７に示す。得られた血液は、３０分以内に遠心分離処理（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間）により血漿として１ｍＬ以上を回収し、濃度測定時まで−２０℃以下で凍結保存した。
【００７７】
【表１７】
【００７８】
採取された血漿サンプル０．５ｍＬに、０．５６％アンモニア水１ｍＬを添加して十分に混和した後、実施例１と同様にして、得られた混和物をＭＡＸにアプライしてＧＬ等を吸着させ、０．５６％アンモニア水／メタノール溶液及びメタノールで洗浄した後に、２％ギ酸／メタノール溶液で溶出させ、さらに蒸発乾固した。
次いで、実施例６と同様にして、蒸発乾固させた抽出物に対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行い、各血漿サンプル中のＧＬ濃度及びＧＡ濃度を測定した。図３は、ＧＬの平均血漿中濃度推移を示した図であり、図４は、ＧＡの平均血漿中濃度推移を示した図である。なお、図３及び図４は、６検体の平均値及び標準偏差を示している。この結果、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、従来から代替的な指標とされてきた主代謝物であるＧＡのみならず、未変化体であるＧＬ自体の血漿中濃度を直接測定し得ることが確認された。すなわち、本発明により、血漿中ＧＬの微量検出に初めて成功し、長らく不明であったＧＬの血中動態が明らかにされた。
【００７９】
＜薬物動態の解析＞
ＧＬ及びＧＡの測定データから、最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、最高血漿中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）を算出した。また、投与後４８時間までの血漿中濃度-時間曲線下面積（ＡＵＣ０→４８ｈ）は台形法により、消失速度定数（ｋｅｌ）及び消失半減期（ｔ１／２）は消失相から最小二乗法により算出した。また、投与後無限大時間までの血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０―∞）、体内滞留時間（ＭＲＴ）についても算出した。
この結果、本実施例では、ＧＬのＣｍａｘは約１０〜４０ｎｇ／ｍＬの範囲にあり、平均値として２４．８ｎｇ／ｍＬであった。これは、前述の市販試薬の大量経口投与例に基づいた予測値（約２３ｎｇ／ｍＬ）とほぼ同等であったことから、ＧＬの投与量と血漿中濃度の相関性が示された。また、Ｔｍａｘは平均４．５時間であったが、それ以前（１〜２時間）あるいは以後（１２時間）など複数の濃度ピークを示す被験者も観察された。後方の濃度ピークは食後に出現したことから、食事摂取がＧＬの吸収あるいは腸肝循環に影響を与える可能性も示唆された。
【００８０】
一方、ＧＬの主代謝物であるＧＡは、血漿中に確認されるまで４時間のラグが確認され、６時間後にＧＬの約１０倍の血漿中濃度(モル換算で約２０倍)が検出された。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、ヒト肝ミクロソームを用いてＧＬを至適条件下でインキュベートした結果、速やかに中間代謝物である３−ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ−ｇｌｙｃｈｒｒｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄへ変換されたが、ＧＡの生成は僅かであった（Biochemical Pharmacology,42(6/7)1025-1029,1991。）。また、ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅラットにおいてＧＬを経口投与した結果、血漿及び糞便中にＧＡが確認されないことから、生体内でのＧＡ生成は腸内細菌が支配的に担っていると考えられている（引用：J. Pharm. Pharmacol. 46, 135-137, 1994）。したがって、吸収のラグは腸内細菌叢へ接触するまでの時間と推測され、食事条件（あるいは絶食条件）が薬物の消化管内の移動、腸内細菌叢の代謝能、消化管吸収に影響し、ＧＡ曝露量を左右する要因とも考えられた。吸収後のＧＡ動態を被験者別に観察すると、未変化体濃度が高い被験者において代謝物の出現が弱く、反対に未変化体濃度が低い被験者において代謝物の出現が強い傾向が認められた。このことから、ＧＡと同時に未変化体であるＧＬの消化管吸収も腸内細菌叢の代謝能と関連し、それが個人差として発現する可能性が示唆された（データ不掲載）。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の生薬由来成分の高感度定量方法により、臨床用量のＧＬ含有製剤や飲食品等を摂取した後の血液中のＧＬを定量することができるため、本発明の生薬由来成分の高感度定量方法は、主に、医薬品・漢方の適正使用、安全性評価、薬物動態解析、新規のＧＬ製剤開発等に利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、
前記抽出工程により抽出された抽出物中のグリチルリチン、グリチルレチン酸、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の代謝物、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の類縁物質、甘草に含有されているサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する定量工程と、
を有し、
前記洗浄液が、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液であることを特徴とする生薬由来成分の高感度定量方法。
【請求項２】
前記抽出工程において、固相の洗浄を、アルカリとアルコールと水の混合液により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことを特徴とする請求項１に記載の生薬由来成分の高感度定量方法。
【請求項３】
前記アルカリとアルコールと水の混合液が、０．５〜２８％アンモニア水とメタノールを９９：１〜１：３であることを特徴とする請求項２に記載の生薬由来成分の高感度定量方法。
【請求項４】
前記生体試料が、血液、血漿、又は組織抽出物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の生薬由来成分の高感度定量方法。
【請求項１】
生体試料をアルカリ又はアルコールに混和した混和物を、逆相分配機能及び陰イオン交換機能を備える固相に注入した後、前記固相を洗浄液で１回又は２回以上洗浄し、その後、酸性アルコールにより前記固相から溶出することにより、生薬由来成分を含む抽出物を調製する抽出工程と、
前記抽出工程により抽出された抽出物中のグリチルリチン、グリチルレチン酸、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の代謝物、グリチルリチン及びグリチルレチン酸の類縁物質、甘草に含有されているサポニン成分、並びにこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される少なくも１種以上を、質量分析法により検出し定量する定量工程と、
を有し、
前記洗浄液が、水、アルカリ、アルコール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１種又は２種以上の混合液であることを特徴とする生薬由来成分の高感度定量方法。
【請求項２】
前記抽出工程において、固相の洗浄を、アルカリとアルコールと水の混合液により洗浄した後、アルコール、アルコールと水の混合液、又はアセトニトリルにより洗浄することによって行うことを特徴とする請求項１に記載の生薬由来成分の高感度定量方法。
【請求項３】
前記アルカリとアルコールと水の混合液が、０．５〜２８％アンモニア水とメタノールを９９：１〜１：３であることを特徴とする請求項２に記載の生薬由来成分の高感度定量方法。
【請求項４】
前記生体試料が、血液、血漿、又は組織抽出物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の生薬由来成分の高感度定量方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１０７９５４（Ｐ２０１２−１０７９５４Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５６１８７（Ｐ２０１０−２５６１８７）
【出願日】平成２２年１１月１６日（２０１０．１１．１６）
【出願人】（０００１７０３５８）株式会社ミノファーゲン製薬 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１６日（２０１０．１１．１６）
【出願人】（０００１７０３５８）株式会社ミノファーゲン製薬 (16)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]