産生宿主における抗体／タンパク質パフォーマンス及び発現の同時で統合された選択及び進化
【解決手段】 本明細書は、単一システムにおいて製造することを目的とした、真核生物宿主における治療用タンパク質及び抗体産生及び／若しくは選択、進化及び発現を統合する方法を提供するものである。抗体を含む治療用タンパク質は、同じ真核生物宿主システムにおいて産生、最適化及び製造されるものである。開示された包括的統合抗体最適化（ＣＩＡＯ（商標））のシステムは、タンパク質パフォーマンス及び発現最適化の同時進化を可能にするものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞産生宿主における抗体或いは抗体断片の選択、進化及び発現の方法であって、前記方法は、
ａ．抗体細胞表層ディスプレイを用いて真核細胞産生宿主において抗−抗原抗体ライブラリを作成する工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記ライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ．前記ライブラリから鋳型抗体を選択する工程と、
ｄ．抗体細胞表層ディスプレイを用いて前記真核細胞産生宿主において１セットの変異抗体を生成するために前記鋳型抗体を進化させる工程と、
ｅ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記変異抗体をスクリーニングする工程と、
ｆ．前記鋳型抗体と比較した場合、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化に基づいて前記１セットの変異抗体からアップ突然変異抗体を選択する工程と、
ｇ．前記作成する工程と同じ真核細胞産生宿主において前記アップ突然変異抗体を発現させる工程とを有する、方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、前記真核細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫイヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ラットカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウス形質細胞；ＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；ＰＥＲ Ｃ．６ヒト胚細胞；出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞；及びピキア酵母細胞から成る群のメンバーから選択されるものである、方法。
【請求項３】
請求項２の方法において、哺乳類システムは、ＣＨＯ−Ｓ或いはＨＥＫ２９３である、方法。
【請求項４】
請求項１の方法において、前記スクリーニングする工程は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を有するものである、方法。
【請求項５】
請求項１の方法において、前記進化させる工程は、ｍ個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を持つ前記鋳型抗体から形成された１セットの変異抗体を生成する工程であって、ここにおいて、ｍは１〜６の整数であり、各前記ＣＤＲはｎ個のアミノ酸残基を有するものである、前記生成する工程を有するものであって、前記方法は、
ａ．ｍｘｎの別々のセットの抗体を産生する工程であって、各セットはＣＤＲの単一の既定の位置にＸ個の異なる既定のアミノ酸残基を持つメンバー抗体を有するものであり、ここにおいて各セットの抗体は、単一の既定の位置が異なり；産生された異なるメンバー抗体の数はｍｘｎｘＸに等しいものである、前記抗体を産生する工程を有するものである、方法。
【請求項６】
請求項５の方法において、ｍは６である、方法。
【請求項７】
請求項１の方法において、前記抗体断片は、重鎖、軽鎖、可変ドメイン、定常ドメイン、超可変領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）から選択されるものである、方法。
【請求項８】
請求項１の方法において、
前記進化させる工程（ｄ）は、
ｈ．前記鋳型抗体からｎ−１の別々のセットの変異ポリペプチドを産生する工程であって、各セットは前記ポリペプチドの単一の既定の位置でＸ個の異なる既定のアミノ酸残基を持つメンバーポリペプチドを有するものであり；ここにおいて各セットのポリペプチドは前記単一の既定の位置が異なるものであり；産生された前記異なるメンバーポリペプチドの数は、［ｎ−１］ｘＸと等しいものである；前記産生する工程を有するものであり、
前記スクリーニングする工程（ｅ）は、
ｉ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して各メンバーポリペプチドをアッセイする工程と、
ｊ．前記鋳型ポリペプチドと比較して前記メンバーポリペプチドの性質、特徴或いは活性におけるあらゆる変化を同定する工程と、
ｋ．機能マップを作成する工程であって、ここにおいて前記機能マップは、前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異及び／若しくはサイレント変異を生じる、前記変異ポリペプチドにおける位置及び変異を同定するために使用されるものである、前記機能マップを作る工程とを有する、前記スクリーニングする工程を有するものである、方法。
【請求項９】
請求項８の方法において、前記Ｘは１９の天然由来のアミノ酸残基を示すものであり、前記鋳型ポリペプチドの所定の位置を表したものではない、方法。
【請求項１０】
請求項９の方法において、前記産生する工程は、
ｉ．変異誘発された各コドンに対する６４重縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ−ベース複製へ、前記鋳型ポリペプチドをコード化しているコドン−含有ポリヌクレオチドを暴露する工程であって、ここにおいて、１セットの子孫ポリヌクレオチドを産生するために、前記各６４重縮重オリゴヌクレオチドは、第一の相同配列及び変性Ｎ，Ｎ，Ｎトリプレット配列を有するものである、前記暴露する工程と、
ｉｉ．前記子孫ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドを発現させるように、クローン複製へ前記１セットの子孫ポリヌクレオチドを暴露する工程とを有するものである、方法。
【請求項１１】
請求項８の方法において、前記機能マップは、（ａ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、前記変異ポリペプチドの活性に影響を与えない位置及び変異；（ｂ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、完全に変異可能な部位；及び（ｃ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異を生じる位置及び変異、から成る群の１若しくはそれ以上を同定するために使用されるものである、方法。
【請求項１２】
請求項１の方法において、前記既定の性質、特徴或いは活性は、タンパク質−タンパク質凝集の軽減、タンパク質安定性の増強、タンパク質可溶性の増加、グリコシル化部位の導入、共役部位の導入、免疫原性の軽減、タンパク質発現の増強、抗原親和性における増加、抗原親和性の減少、結合親和性における変化、免疫原性における変化、或いは特異性の増強から選択されるものである、方法。
【請求項１３】
哺乳類細胞産生宿主における抗体を進化及び発現させる方法であって、
前記方法は、
ａ．鋳型抗体を選択する工程と、
ｂ．抗体細胞表層ディスプレイを用いて、哺乳類細胞産生宿主において１セットの変異抗体を生成するために前記鋳型抗体を進化させる工程と、
ｃ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記変異抗体をスクリーニングする工程と、
ｄ．前記鋳型抗体と比較して、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化に基づいて前記１セットの変異抗体からアップ突然変異抗体を選択する工程と、
ｅ．前記工程ｂ．と同じ哺乳類細胞産生宿主において前記アップ突然変異抗体を発現させる工程とを有するものである、方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法において、前記哺乳類細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫイヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ラットカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウス形質細胞；ＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；及びＰＥＲ Ｃ．６ヒト胚細胞から成る群のメンバーから選択されるものである、方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、哺乳類システムは、ＣＨＯ−Ｓ或いはＨＥＫ２９３である、方法。
【請求項１６】
請求項１の方法において、前記スクリーニングする工程は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を有するものである、方法。
【請求項１７】
請求項１の方法において、前記工程（ａ）は、抗原を選択する工程を有する工程が先行するものである、方法。
【請求項１８】
請求項１の方法において、前記抗−抗原抗体ライブラリは、ヒト化抗−抗原抗体ライブラリである、方法。
【請求項１９】
真核細胞産生宿主においてタンパク質を進化及び発現させる方法であって、
前記方法は、
ａ．鋳型抗体を選択する工程と、
ｂ．真核細胞産生宿主において１セットの変異抗体を産生するために前記鋳型抗体を進化させる工程と、
ｃ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記変異抗体をスクリーニングする工程と、
ｄ．前記鋳型抗体と比較して、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化に基づいて前記１セットの変異抗体からアップ突然変異抗体を選択する工程と、
ｅ．あらゆる工業規模に対しても、工程ｂと同じ真核細胞産生宿主において前記アップ突然変異抗体を発現させる工程とを有するものである、方法。
【請求項２０】
請求項１の方法において、前記哺乳類細胞産生宿主は、ＣＨＯＫ１ＳＶ或いはＮＳＯ宿主細胞株から選択されるものである、方法。
【請求項２１】
請求項１３の方法において、前記スクリーニングする工程は、機能マップを作成する工程であって、ここにおいて前記機能マップは、前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異及び／若しくはサイレント変異を生じる、前記変異ポリペプチドにおける位置及び変異を同定するために使用されるものである、前記機能マップを作成する工程を有するものである、方法。
【請求項２２】
細胞産生宿主においてヒトタンパク質を進化及び製造させる方法であって、
前記方法は、
ａ．細菌或いは真核生物産生宿主から成る群の１つから選択された細胞産生宿主において、ヒトタンパク質ライブラリを作成する工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記ライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に基づいて前記ライブラリから鋳型ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｄ．前記細胞産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を産生するために前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程と、
ｅ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程、及び修飾された発現に対してスクリーニングする工程と、
ｆ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、修飾された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｇ．前記作成する工程（ａ）と同じ産生宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有するヒトタンパク質を製造する工程とを有するものである、方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法において、前記修飾された発現は、改善された発現である、方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法において、前記進化させる工程は、包括的位置進化（ＣＰＥ）；包括的位置挿入進化（ＣＰＩ）；包括的位置欠失進化（ＣＰＤ）；コンビナトリアルタンパク質合成（ＣＰＳ）に続く包括的位置進化（ＣＰＥ）；或いはコンビナトリアルタンパク質合成（ＣＰＳ）に続く包括的位置欠失進化（ＣＰＤ）の１つを有するものである、方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法において、前記ヒトタンパク質は、抗体である、方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法において、前記抗体は、完全長抗体である、方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法において、前記スクリーニングする工程（ｅ）における前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性は、前記鋳型抗体と比較して、１若しくはそれ以上の（１）サイレント変異に対してスクリーニングする工程、及び（２）ミスセンス変異に対してスクリーニングする工程を有するものである、方法。
【請求項２８】
請求項２６の方法において、Ｆｃ及びＦｖから選択される１若しくはそれ以上の群；及び１若しくはそれ以上のＣＤＲｓは、前記鋳型ヒト抗体と比較して、前記アップ突然変異ヒト抗体において修飾されているものである、方法。
【請求項２９】
請求項２２の方法において、前記スクリーニングする工程（ｅ）は、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程と、修飾された発現に対してスクリーニングする工程とを同時に有するものである、方法。
【請求項３０】
請求項２２の方法において、前記ヒトタンパク質は、酵素サイトカイン、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、キレート剤或いはホルモンから選択されるものである、方法。
【請求項３１】
請求項２２の方法において、前記細胞産生宿主は、真核生物産生宿主であり、前記進化させる工程は、細胞表層ディスプレイを用いて前記真核細胞産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程を有するものである、方法。
【請求項３２】
請求項２６の方法において、前記細胞産生宿主は、真核生物産生宿主であり、前記進化させる工程は、細胞表層ディスプレイを用いて前記真核細胞産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程を有するものである、方法。
【請求項３３】
真核細胞産生宿主においてヒトタンパク質の増強した発現及び製造のために進化させる方法であって、
前記方法は、
ａ．進化のために鋳型ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｂ．前記産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を産生するために、前記鋳型ヒトタンパク質をコード化する変異コドンの産生を有する前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程と、
ｃ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングし、前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強した発現に対してスクリーニングする工程と、
ｄ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の保持或いは最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強した発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｅ．前記進化させる工程と同じ産生宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有する、前記アップ突然変異ヒトタンパク質を製造する工程とを有する、方法。
【請求項３４】
請求項３３の方法において、前記アップ突然変異ヒトタンパク質の変異コドンは、少なくとも１つのサイレント変異及び／若しくはミスセンス変異を生じるものである、方法。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、前記アップ突然変異ヒトタンパク質の変異コドンは、少なくとも１つのサイレント変異及び／若しくはミスセンス変異を生じるものである、方法。
【請求項３６】
請求項３５の方法において、前記鋳型ヒトタンパク質は、倫理的に承認されたタンパク質治療薬であり、前記アップ突然変異ヒトタンパク質は、バイオ後続品である、方法。
【請求項３７】
請求項３３の方法において、前記選択する工程（ｄ）は、（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強した発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程を有するものである、方法。
【請求項３８】
標的ヒトタンパク質を同定し生成する方法であって、前記方法は、
ａ．タンパク質細胞表層ディスプレイを用いて真核細胞産生宿主においてヒトタンパク質ライブラリを作成する工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記ライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に基づいて前記ライブラリから標的ヒトタンパク質を同定する工程と、
ｄ．標的ヒトタンパク質を生成するために、前記作成する工程と同じ真核細胞産生宿主において前記標的ヒトタンパク質を発現させる工程とを有するものである、方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法において、前記標的ヒトタンパク質は、抗体である、方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、前記抗体は、完全長抗体である、方法。
【請求項４１】
製造宿主におけるヒトタンパク質を進化させる方法であって、前記方法は、
ａ．製造宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を製造するために鋳型ヒトタンパク質を変異させる工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して１セットの変異子孫タンパク質をスクリーニングする工程とを有するものである、方法。
【請求項４２】
請求項４１の方法であってさらに、
ｃ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程とを有するものである、方法。
【請求項４３】
請求項４２の方法であって、前記方法はさらに、
ｄ．前記変異させる工程（ａ）と同じ産生宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有する、前記アップ突然変異ヒトタンパク質を製造する工程を有するものである、方法。
【請求項４４】
請求項４２の方法において、前記選択する工程（ｃ）はさらに、
（１）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、修飾された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程を有するものである、方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法において、前記修飾された発現は、増強された発現である、方法。
【請求項４６】
細胞製造宿主におけるヒトタンパク質を進化及び製造する方法であって、前記方法は、
ａ．製造宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために鋳型ヒトタンパク質を変異させる工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程、及び修飾された発現に対してスクリーニングする工程と、
ｃ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、修飾された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｄ．工程ａ．と同じ製造宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有する、前記ヒトタンパク質を製造する工程とを有するものである、方法。
【請求項４７】
真核細胞産生宿主においてヒトタンパク質の増強された発現及び製造のために進化させる方法であって、前記方法は、
ａ．製造宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために、鋳型ヒトタンパク質をコード化している変異コドンの産生を有する、前記鋳型ヒトタンパク質を変異させる工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングし、前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強された発現に対してスクリーニングする工程と、
ｃ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の保持或いは最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｄ．前記工程（ａ）と同じ製造宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を製造する工程とを有するものである、方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法において、前記スクリーニングする工程（ｂ）は、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程と、増強された発現に対してスクリーニングする工程とを同時に有するものである、方法。
【請求項１】
真核細胞産生宿主における抗体或いは抗体断片の選択、進化及び発現の方法であって、前記方法は、
ａ．抗体細胞表層ディスプレイを用いて真核細胞産生宿主において抗−抗原抗体ライブラリを作成する工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記ライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ．前記ライブラリから鋳型抗体を選択する工程と、
ｄ．抗体細胞表層ディスプレイを用いて前記真核細胞産生宿主において１セットの変異抗体を生成するために前記鋳型抗体を進化させる工程と、
ｅ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記変異抗体をスクリーニングする工程と、
ｆ．前記鋳型抗体と比較した場合、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化に基づいて前記１セットの変異抗体からアップ突然変異抗体を選択する工程と、
ｇ．前記作成する工程と同じ真核細胞産生宿主において前記アップ突然変異抗体を発現させる工程とを有する、方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、前記真核細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫイヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ラットカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウス形質細胞；ＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；ＰＥＲ Ｃ．６ヒト胚細胞；出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞；及びピキア酵母細胞から成る群のメンバーから選択されるものである、方法。
【請求項３】
請求項２の方法において、哺乳類システムは、ＣＨＯ−Ｓ或いはＨＥＫ２９３である、方法。
【請求項４】
請求項１の方法において、前記スクリーニングする工程は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を有するものである、方法。
【請求項５】
請求項１の方法において、前記進化させる工程は、ｍ個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を持つ前記鋳型抗体から形成された１セットの変異抗体を生成する工程であって、ここにおいて、ｍは１〜６の整数であり、各前記ＣＤＲはｎ個のアミノ酸残基を有するものである、前記生成する工程を有するものであって、前記方法は、
ａ．ｍｘｎの別々のセットの抗体を産生する工程であって、各セットはＣＤＲの単一の既定の位置にＸ個の異なる既定のアミノ酸残基を持つメンバー抗体を有するものであり、ここにおいて各セットの抗体は、単一の既定の位置が異なり；産生された異なるメンバー抗体の数はｍｘｎｘＸに等しいものである、前記抗体を産生する工程を有するものである、方法。
【請求項６】
請求項５の方法において、ｍは６である、方法。
【請求項７】
請求項１の方法において、前記抗体断片は、重鎖、軽鎖、可変ドメイン、定常ドメイン、超可変領域、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）から選択されるものである、方法。
【請求項８】
請求項１の方法において、
前記進化させる工程（ｄ）は、
ｈ．前記鋳型抗体からｎ−１の別々のセットの変異ポリペプチドを産生する工程であって、各セットは前記ポリペプチドの単一の既定の位置でＸ個の異なる既定のアミノ酸残基を持つメンバーポリペプチドを有するものであり；ここにおいて各セットのポリペプチドは前記単一の既定の位置が異なるものであり；産生された前記異なるメンバーポリペプチドの数は、［ｎ−１］ｘＸと等しいものである；前記産生する工程を有するものであり、
前記スクリーニングする工程（ｅ）は、
ｉ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して各メンバーポリペプチドをアッセイする工程と、
ｊ．前記鋳型ポリペプチドと比較して前記メンバーポリペプチドの性質、特徴或いは活性におけるあらゆる変化を同定する工程と、
ｋ．機能マップを作成する工程であって、ここにおいて前記機能マップは、前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異及び／若しくはサイレント変異を生じる、前記変異ポリペプチドにおける位置及び変異を同定するために使用されるものである、前記機能マップを作る工程とを有する、前記スクリーニングする工程を有するものである、方法。
【請求項９】
請求項８の方法において、前記Ｘは１９の天然由来のアミノ酸残基を示すものであり、前記鋳型ポリペプチドの所定の位置を表したものではない、方法。
【請求項１０】
請求項９の方法において、前記産生する工程は、
ｉ．変異誘発された各コドンに対する６４重縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ−ベース複製へ、前記鋳型ポリペプチドをコード化しているコドン−含有ポリヌクレオチドを暴露する工程であって、ここにおいて、１セットの子孫ポリヌクレオチドを産生するために、前記各６４重縮重オリゴヌクレオチドは、第一の相同配列及び変性Ｎ，Ｎ，Ｎトリプレット配列を有するものである、前記暴露する工程と、
ｉｉ．前記子孫ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドを発現させるように、クローン複製へ前記１セットの子孫ポリヌクレオチドを暴露する工程とを有するものである、方法。
【請求項１１】
請求項８の方法において、前記機能マップは、（ａ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、前記変異ポリペプチドの活性に影響を与えない位置及び変異；（ｂ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、完全に変異可能な部位；及び（ｃ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異を生じる位置及び変異、から成る群の１若しくはそれ以上を同定するために使用されるものである、方法。
【請求項１２】
請求項１の方法において、前記既定の性質、特徴或いは活性は、タンパク質−タンパク質凝集の軽減、タンパク質安定性の増強、タンパク質可溶性の増加、グリコシル化部位の導入、共役部位の導入、免疫原性の軽減、タンパク質発現の増強、抗原親和性における増加、抗原親和性の減少、結合親和性における変化、免疫原性における変化、或いは特異性の増強から選択されるものである、方法。
【請求項１３】
哺乳類細胞産生宿主における抗体を進化及び発現させる方法であって、
前記方法は、
ａ．鋳型抗体を選択する工程と、
ｂ．抗体細胞表層ディスプレイを用いて、哺乳類細胞産生宿主において１セットの変異抗体を生成するために前記鋳型抗体を進化させる工程と、
ｃ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記変異抗体をスクリーニングする工程と、
ｄ．前記鋳型抗体と比較して、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化に基づいて前記１セットの変異抗体からアップ突然変異抗体を選択する工程と、
ｅ．前記工程ｂ．と同じ哺乳類細胞産生宿主において前記アップ突然変異抗体を発現させる工程とを有するものである、方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法において、前記哺乳類細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫイヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ラットカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウス形質細胞；ＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；及びＰＥＲ Ｃ．６ヒト胚細胞から成る群のメンバーから選択されるものである、方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、哺乳類システムは、ＣＨＯ−Ｓ或いはＨＥＫ２９３である、方法。
【請求項１６】
請求項１の方法において、前記スクリーニングする工程は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を有するものである、方法。
【請求項１７】
請求項１の方法において、前記工程（ａ）は、抗原を選択する工程を有する工程が先行するものである、方法。
【請求項１８】
請求項１の方法において、前記抗−抗原抗体ライブラリは、ヒト化抗−抗原抗体ライブラリである、方法。
【請求項１９】
真核細胞産生宿主においてタンパク質を進化及び発現させる方法であって、
前記方法は、
ａ．鋳型抗体を選択する工程と、
ｂ．真核細胞産生宿主において１セットの変異抗体を産生するために前記鋳型抗体を進化させる工程と、
ｃ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記変異抗体をスクリーニングする工程と、
ｄ．前記鋳型抗体と比較して、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化に基づいて前記１セットの変異抗体からアップ突然変異抗体を選択する工程と、
ｅ．あらゆる工業規模に対しても、工程ｂと同じ真核細胞産生宿主において前記アップ突然変異抗体を発現させる工程とを有するものである、方法。
【請求項２０】
請求項１の方法において、前記哺乳類細胞産生宿主は、ＣＨＯＫ１ＳＶ或いはＮＳＯ宿主細胞株から選択されるものである、方法。
【請求項２１】
請求項１３の方法において、前記スクリーニングする工程は、機能マップを作成する工程であって、ここにおいて前記機能マップは、前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異及び／若しくはサイレント変異を生じる、前記変異ポリペプチドにおける位置及び変異を同定するために使用されるものである、前記機能マップを作成する工程を有するものである、方法。
【請求項２２】
細胞産生宿主においてヒトタンパク質を進化及び製造させる方法であって、
前記方法は、
ａ．細菌或いは真核生物産生宿主から成る群の１つから選択された細胞産生宿主において、ヒトタンパク質ライブラリを作成する工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記ライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に基づいて前記ライブラリから鋳型ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｄ．前記細胞産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を産生するために前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程と、
ｅ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程、及び修飾された発現に対してスクリーニングする工程と、
ｆ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、修飾された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｇ．前記作成する工程（ａ）と同じ産生宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有するヒトタンパク質を製造する工程とを有するものである、方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法において、前記修飾された発現は、改善された発現である、方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法において、前記進化させる工程は、包括的位置進化（ＣＰＥ）；包括的位置挿入進化（ＣＰＩ）；包括的位置欠失進化（ＣＰＤ）；コンビナトリアルタンパク質合成（ＣＰＳ）に続く包括的位置進化（ＣＰＥ）；或いはコンビナトリアルタンパク質合成（ＣＰＳ）に続く包括的位置欠失進化（ＣＰＤ）の１つを有するものである、方法。
【請求項２５】
請求項２３の方法において、前記ヒトタンパク質は、抗体である、方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法において、前記抗体は、完全長抗体である、方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法において、前記スクリーニングする工程（ｅ）における前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性は、前記鋳型抗体と比較して、１若しくはそれ以上の（１）サイレント変異に対してスクリーニングする工程、及び（２）ミスセンス変異に対してスクリーニングする工程を有するものである、方法。
【請求項２８】
請求項２６の方法において、Ｆｃ及びＦｖから選択される１若しくはそれ以上の群；及び１若しくはそれ以上のＣＤＲｓは、前記鋳型ヒト抗体と比較して、前記アップ突然変異ヒト抗体において修飾されているものである、方法。
【請求項２９】
請求項２２の方法において、前記スクリーニングする工程（ｅ）は、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程と、修飾された発現に対してスクリーニングする工程とを同時に有するものである、方法。
【請求項３０】
請求項２２の方法において、前記ヒトタンパク質は、酵素サイトカイン、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、キレート剤或いはホルモンから選択されるものである、方法。
【請求項３１】
請求項２２の方法において、前記細胞産生宿主は、真核生物産生宿主であり、前記進化させる工程は、細胞表層ディスプレイを用いて前記真核細胞産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程を有するものである、方法。
【請求項３２】
請求項２６の方法において、前記細胞産生宿主は、真核生物産生宿主であり、前記進化させる工程は、細胞表層ディスプレイを用いて前記真核細胞産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程を有するものである、方法。
【請求項３３】
真核細胞産生宿主においてヒトタンパク質の増強した発現及び製造のために進化させる方法であって、
前記方法は、
ａ．進化のために鋳型ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｂ．前記産生宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を産生するために、前記鋳型ヒトタンパク質をコード化する変異コドンの産生を有する前記鋳型ヒトタンパク質を進化させる工程と、
ｃ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングし、前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強した発現に対してスクリーニングする工程と、
ｄ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の保持或いは最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強した発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｅ．前記進化させる工程と同じ産生宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有する、前記アップ突然変異ヒトタンパク質を製造する工程とを有する、方法。
【請求項３４】
請求項３３の方法において、前記アップ突然変異ヒトタンパク質の変異コドンは、少なくとも１つのサイレント変異及び／若しくはミスセンス変異を生じるものである、方法。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、前記アップ突然変異ヒトタンパク質の変異コドンは、少なくとも１つのサイレント変異及び／若しくはミスセンス変異を生じるものである、方法。
【請求項３６】
請求項３５の方法において、前記鋳型ヒトタンパク質は、倫理的に承認されたタンパク質治療薬であり、前記アップ突然変異ヒトタンパク質は、バイオ後続品である、方法。
【請求項３７】
請求項３３の方法において、前記選択する工程（ｄ）は、（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強した発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程を有するものである、方法。
【請求項３８】
標的ヒトタンパク質を同定し生成する方法であって、前記方法は、
ａ．タンパク質細胞表層ディスプレイを用いて真核細胞産生宿主においてヒトタンパク質ライブラリを作成する工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記ライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に基づいて前記ライブラリから標的ヒトタンパク質を同定する工程と、
ｄ．標的ヒトタンパク質を生成するために、前記作成する工程と同じ真核細胞産生宿主において前記標的ヒトタンパク質を発現させる工程とを有するものである、方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法において、前記標的ヒトタンパク質は、抗体である、方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、前記抗体は、完全長抗体である、方法。
【請求項４１】
製造宿主におけるヒトタンパク質を進化させる方法であって、前記方法は、
ａ．製造宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を製造するために鋳型ヒトタンパク質を変異させる工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して１セットの変異子孫タンパク質をスクリーニングする工程とを有するものである、方法。
【請求項４２】
請求項４１の方法であってさらに、
ｃ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程とを有するものである、方法。
【請求項４３】
請求項４２の方法であって、前記方法はさらに、
ｄ．前記変異させる工程（ａ）と同じ産生宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有する、前記アップ突然変異ヒトタンパク質を製造する工程を有するものである、方法。
【請求項４４】
請求項４２の方法において、前記選択する工程（ｃ）はさらに、
（１）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、修飾された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程を有するものである、方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法において、前記修飾された発現は、増強された発現である、方法。
【請求項４６】
細胞製造宿主におけるヒトタンパク質を進化及び製造する方法であって、前記方法は、
ａ．製造宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために鋳型ヒトタンパク質を変異させる工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程、及び修飾された発現に対してスクリーニングする工程と、
ｃ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、修飾された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｄ．工程ａ．と同じ製造宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を発現させる工程を有する、前記ヒトタンパク質を製造する工程とを有するものである、方法。
【請求項４７】
真核細胞産生宿主においてヒトタンパク質の増強された発現及び製造のために進化させる方法であって、前記方法は、
ａ．製造宿主において１セットの変異ヒトタンパク質を生成するために、鋳型ヒトタンパク質をコード化している変異コドンの産生を有する、前記鋳型ヒトタンパク質を変異させる工程と、
ｂ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングし、前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強された発現に対してスクリーニングする工程と、
ｃ．（１）前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の保持或いは最適化、及び（２）前記鋳型ヒトタンパク質と比較した場合、増強された発現に基づいて、前記１セットの変異ヒトタンパク質からアップ突然変異ヒトタンパク質を選択する工程と、
ｄ．前記工程（ａ）と同じ製造宿主において前記アップ突然変異ヒトタンパク質を製造する工程とを有するものである、方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法において、前記スクリーニングする工程（ｂ）は、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記１セットの変異ヒトタンパク質をスクリーニングする工程と、増強された発現に対してスクリーニングする工程とを同時に有するものである、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５３３３０７（Ｐ２０１２−５３３３０７Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２０８１３（Ｐ２０１２−５２０８１３）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２３０２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９０５８
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５１１２１７３４８）バイオアトラ、エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２３０２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９０５８
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５１１２１７３４８）バイオアトラ、エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
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