甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途
【課題】 低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンの測定を実現する、安定化された甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬を提供する。
【解決手段】 本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬は、甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする。本発明の液体試薬を用いた甲状腺ホルモンの検出は、抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させ、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出することにより行える。本発明によれば、前記液体試薬のｐＨを前記所定の範囲とすることで、前記甲状腺ホルモン固定化担体を安定化できるため、長期間の保存が可能である。また、測定の度に、甲状腺ホルモン固定化担体を調製する必要がなく、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンを測定できる。
【解決手段】 本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬は、甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする。本発明の液体試薬を用いた甲状腺ホルモンの検出は、抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させ、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出することにより行える。本発明によれば、前記液体試薬のｐＨを前記所定の範囲とすることで、前記甲状腺ホルモン固定化担体を安定化できるため、長期間の保存が可能である。また、測定の度に、甲状腺ホルモン固定化担体を調製する必要がなく、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンを測定できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途に関し、より詳細には、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法、甲状腺ホルモンの検出方法、甲状腺ホルモンの検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺ホルモンは、甲状腺から分泌され、全身の細胞に作用して細胞の代謝率を向上させる等の作用を有するホルモンである。前記甲状腺ホルモンは、例えば、トリヨードチロニン（Ｔ３）およびチロキシン（Ｔ４）が知られている。近年、甲状腺ホルモンが過剰に分泌される甲状腺機能亢進症（例えば、バセドウ病等）、および、甲状腺ホルモンの分泌が不足する甲状腺機能低下症（例えば、橋本病等）等の甲状腺機能異常症の患者が増加している。このため、臨床検査等において、甲状腺ホルモンの正確な測定が重要である。
【０００３】
甲状腺ホルモンの測定には、例えば、抗甲状腺ホルモン抗体を用いる競合的免疫測定法が広く採用されている（特許文献１および２、非特許文献１参照）。前記測定法は、検体中の甲状腺ホルモンと試薬中の甲状腺ホルモンとを競合的に、抗甲状腺ホルモン抗体に反応させる測定系である。前記測定法には、一般的に、３試薬系キットが使用されている。前記キットは、第１試薬として標識化抗体、第２試薬としてビオチン化甲状腺ホルモンおよび第３試薬としてアビジン固定化担体から構成され、各試薬がそれぞれ別個となっている。前記３試薬系キットを使用した測定は、例えば、下記のように行う。すなわち、まず、検体と前記標識化抗体とを混合し、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記標識化抗体とを結合させる。つぎに、前記混合物に、さらに、前記ビオチン化甲状腺ホルモンおよび前記アビジン固定化担体を混合する。これによって、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合していない未反応の標識化抗体と、前記ビオチン化甲状腺ホルモンと、前記アビジン固定化担体とが、抗原抗体反応およびアビジン−ビオチン結合により、複合体を形成する。そして、前記複合体を分離して、前記複合体における前記標識化抗体を検出する。前記標識化抗体には、前記検体中の甲状腺ホルモンと、前記ビオチン化甲状腺ホルモンとが競合的に結合する。このため、前記複合体における標識化抗体を検出することで、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合した標識化抗体を測定でき、これによって、間接的に前記検体中の甲状腺ホルモンが測定できる。しかしながら、前記３試薬系では、測定の度に、３つの試薬を混合する必要があるため、操作が煩雑で時間がかかり、高コストである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−８９８８９号公報
【特許文献２】特開２０１０−５３１１８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｔｈｍａｎｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００５） Ｖｏｌ．３， Ｎｏ．１， Ｉｓｓｕｅ ９， ９１−９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、予め、前記ビオチン化甲状腺ホルモンと前記アビジン固定化担体とを結合させた甲状腺ホルモン固定化担体を試薬とし、これと標識化抗体との２試薬系とすることが考えられる。しかしながら、前記甲状腺ホルモン固定化担体は、安定性が低いため、例えば、試薬として長期間保存した場合、保存前と比較して、その活性が低下するという問題がある。
【０００７】
そこで、本発明は、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンの測定を実現する、安定化された甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬は、甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする。
【０００９】
本発明の溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法は、甲状腺ホルモン固定化担体を含む溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１１．５に設定することを特徴とする。
【００１０】
本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法は、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化工程を含み、前記安定化工程が、前記本発明の安定化方法によって実施されることを特徴とする。
【００１１】
本発明の甲状腺ホルモンの検出方法は、抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記本発明の液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程、および、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の甲状腺ホルモンの検出キットは、前記本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬、および、抗甲状腺ホルモン抗体を含み、前記本発明の検出方法に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、前記液体試薬のｐＨを前記所定の範囲とすることで、前記甲状腺ホルモン固定化担体を安定化できるため、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体を長期間保存できる。このため、本発明によれば、例えば、従来のように、測定の度に、甲状腺ホルモン固定化担体を調製する必要がなく、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンを測定できる。したがって、本発明は、臨床検査等において、極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬＞
本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬は、前述のように、甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする。
【００１５】
本発明において、前記溶媒のｐＨは、前記液体試薬の全構成成分が前記溶媒に含まれた状態における前記溶媒のｐＨを意味する。以下、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨを、「前記液体試薬のｐＨ」という。前記液体試薬のｐＨの下限は、８．７であり、例えば、８．８、９である。前記液体試薬のｐＨの上限は、１１．５であり、好ましくは１１であり、より好ましくは１０．５、９．５、９．４、９．２である。前記液体試薬のｐＨの範囲は、前述のように、８．７〜１１．５であり、好ましくは８．７〜１１の範囲、より好ましくは、８．７〜１０．５の範囲である。また、前記ｐＨの範囲は、例えば、８．７〜９．５の範囲、８．７〜９．４、８．７〜９．２の範囲である。また、前記ｐＨの範囲は、例えば、８．８〜１１の範囲、９〜１１の範囲であり、好ましくは８．８〜１０．５、９〜１０．５の範囲、９〜９．５の範囲、９〜９．４の範囲、９〜９．２の範囲である。
【００１６】
前記液体試薬は、前記溶媒中に、前記甲状腺ホルモン固定化担体の他に、例えば、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、例えば、界面活性剤、分散剤、防腐剤、塩、金属塩、タンパク質、糖、アミノ酸、キレート剤等があげられる。
【００１７】
前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液、血清、血漿等があげられる。前記溶媒は、例えば、前記液体試薬のｐＨを前記範囲に容易に調整できることから、前記緩衝液が好ましい。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記溶媒が前記緩衝液の場合、前記液体試薬における前記緩衝液の濃度は、例えば、０．１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１８】
前記甲状腺ホルモン固定化担体において、前記固定化された甲状腺ホルモンは、例えば、チロキシン（以下、Ｔ４）、３，３’，５−Ｌ−トリヨードチロニン（以下、Ｔ３）、これらの誘導体があげられる。本発明において、前記固定化された甲状腺ホルモンは、抗甲状腺ホルモン抗体に対して、検体中の甲状腺ホルモンと競合して結合できればよい。このため、前記誘導体は、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体に対する、Ｔ４およびＴ３のエピトープまたはエピトープを有する物質でもよい。前記誘導体は、例えば、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロニン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロニン、３，３’，５−Ｄ−トリヨードチロニン、３，３’，５’−Ｌ−トリヨードチロニン（リバースＴ３）、Ｄ−チロキシン等があげられる。前記固定化される甲状腺ホルモンの種類は、特に制限されず、例えば、検出目的の甲状腺ホルモンの種類に応じて決定でき、例えば、Ｔ３およびＴ４のいずれか一方でもよいし、その誘導体でもよいし、Ｔ３およびＴ４の両方でもよいし、Ｔ３、Ｔ４およびこれらの誘導体から選ばれる二つ以上の組合せでもよい。
【００１９】
前記甲状腺ホルモン固定化担体において、担体１個あたりに固定化される前記甲状腺ホルモンの数は、特に制限されず、１分子でもよいが、２分子以上の複数の分子が固定化されていることが好ましい。前記担体あたりの固定化された甲状腺ホルモンの分子数は、その下限が、例えば、１分子であり、好ましくは１０分子であり、より好ましくは１００分子であり、上限は、特に制限されず、例えば、１×１０２０分子であり、好ましくは１×１０１５分子であり、より好ましくは１×１０１０分子である。
【００２０】
前記担体は、特に制限されず、その材質、形状、大きさ等は適宜設定できる。前記担体の材質は、例えば、前記甲状腺ホルモンの検出時に使用する溶媒に不溶であることが好ましい。前記材質は、例えば、磁性材料、ケイ酸質無機材料、有機材料、金属材料等があげられる。前記磁性材料は、例えば、ニッケル、コバルト、鉄、サマリウム、ネオジウム、およびこれらの合金等があげられる。前記ケイ酸質無機材料は、例えば、ガラス、シリカゲル、ベントナイト、セラミック、シリコン等があげられる。前記有機材料は、例えば、プラスチック、デキストラン、ろ紙、スポンジ、ラテックス、リポソーム、活性炭、カーボンファイバー等があげられる。前記金属材料は、例えば、金、銀、白金、パラジウム、ニッケル、およびこれらの合金等があげられる。中でも、例えば、磁石等を使用して簡便に操作できるため、前記磁性材料が好ましい。また、前記担体は、標識の役割を果たしても良く、例えば、蛍光粒子等の蛍光担体があげられる。前記担体の前記形状は、例えば、粒子状、棒状、シート状、多孔状等があげられ、中でも、粒子状が好ましい。前記担体の大きさは、特に制限されず、例えば、粒子状の場合、平均粒径が、０．００１〜１００００μｍが好ましく、より好ましくは０．０１〜１０００μｍであり、特に好ましくは０．１〜１００μｍである。前記担体は、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２１】
前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、前記甲状腺ホルモンが前記担体に、直接固定化されたものでもよいし、間接的に固定化されたものでもよい。前記間接的な固定化は、特に制限されず、例えば、前記甲状腺ホルモンと前記担体とがリンカーを介して結合した形態があげられる。前記リンカーは、互いに特異的な結合性を有するリンカーの組み合わせが好ましい。前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、第１リンカーと前記第１リンカーに結合する第２リンカーとの結合を介して、前記甲状腺ホルモンと前記担体とが結合していることが好ましい。前記第１リンカーと前記第２リンカーの組み合わせは、例えば、ビオチンとアビジンとの組み合わせ、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ等が例示できる。前記第１リンカーと前記第２リンカーは、例えば、いずれがビオチンでもよい。本発明において、前記ビオチンは、例えば、ビオチンの他に、その誘導体でもよく、前記アビジンは、例えば、アビジンの他に、その誘導体でもよく、前記ストレプトアビジンは、例えば、前記ストレプトアビジンの他に、その誘導体でもよい。また、前記リンカーは、例えば、分子でもよいし、タンパク質でもよい。前記タンパク質は、例えば、アルブミン、グロブリン等があげられる。
【００２２】
前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、ビオチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合により、前記甲状腺ホルモンが前記担体に固定化されていることが好ましい。前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと、前記第２リンカーを付加した担体との複合体があげられ、具体例として、ビオチン化甲状腺ホルモンとアビジン固定化担体との複合体、ビオチン化甲状腺ホルモンとストレプトアビジン固定化担体との複合体、アビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固体化担体との複合体、ストレプトアビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固定化担体との複合体等があげられる。
【００２３】
前記甲状腺ホルモン固定化担体の調製方法は、特に制限されない。前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、前記甲状腺ホルモンと前記担体とを反応させることで調製できる。具体的には、例えば、前述のように、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと、前記第２リンカーを付加した担体とを反応させ、前記第１リンカーと前記第２リンカーとを結合させることで調製できる。前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との組合せは、特に制限されず、例えば、ビオチン化甲状腺ホルモンとアビジン固定化担体との組合せ、ビオチン化甲状腺ホルモンとストレプトアビジン固定化担体との組合せ、アビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固体化担体との組合せ、ストレプトアビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固定化担体との組合せ等があげられる。前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンおよび前記第２リンカーを付加した担体は、例えば、市販品を使用してもよいし、公知の方法によって調製することもできる。具体例として、前記ストレプトアビジン固定化担体は、例えば、Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅＴＭＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１」等が使用できる。また、前記甲状腺ホルモンまたは前記担体のビオチン化は、例えば、市販のキットを使用して行うことができ、具体例として、同仁化学研究所社製の商品名「Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２」等があげられる。
【００２４】
前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との反応は、例えば、溶媒中で行うことができる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が使用できる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記反応液における前記緩衝液の濃度は、例えば、０.１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。前記反応液のｐＨは、例えば、４〜１１であり、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜９である。前記溶媒は、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体の他に、例えば、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、例えば、界面活性剤、分散剤、防腐剤、塩、金属塩、タンパク質、糖、アミノ酸、キレート剤等があげられる。
【００２５】
前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との反応条件は、特に制限されず、例えば、前記リンカーの組合せ、前記担体の種類等に応じて適宜決定できる。前記反応温度は、例えば、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは４〜４０℃であり、反応時間は、例えば、５〜３６０分であり、好ましくは３０〜１２０分である。前記反応液において、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との添加割合は、特に制限されず、前記第１リンカーのモル数（Ａ）と前記第２リンカーのモル数（Ｂ）の比（Ａ：Ｂ）が、１：０．０１〜１：１００が好ましく、より好ましくは１：０．１〜１：１０である。
【００２６】
前述のように、前記担体１個あたりに固定化する甲状腺ホルモンの数を複数分子とする場合、例えば、前記担体１個あたりに複数の前記第２リンカーを付加し、前記第２リンカーのそれぞれに、前記第１リンカーを介して甲状腺ホルモンを結合させることが好ましい。
【００２７】
前記液体試薬において、前記甲状腺ホルモン固定化担体の濃度は、特に制限されない。前記濃度は、例えば、１〜１００００μｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは５〜５０００μｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬの範囲である。前記液体試薬は、例えば、一種類の前記甲状腺ホルモン固定化担体を含んでもよいし、二種類以上の前記甲状腺ホルモン固定化担体を含んでもよい。後者の場合、各甲状腺ホルモン固定化担体の濃度は、特に制限されず、例えば、各甲状腺ホルモン固定化担体の濃度が前述の範囲でもよいし、各甲状腺ホルモン固定化担体の合計濃度が前述の範囲でもよい。
【００２８】
前記液体試薬の調製方法は、特に制限されず、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨの範囲を、前述の範囲に設定することで行える。前記ｐＨの調整方法は、特に制限されない。例えば、予め、前述のｐＨの範囲に設定した緩衝能を有する溶媒（緩衝液）に、前記甲状腺ホルモン固定化担体および必要に応じて他の成分を添加し、前記溶媒の緩衝能によって、前記液体試薬のｐＨを前述の範囲に設定できる。また、例えば、前記溶媒に、前記甲状腺ホルモン固体化担体および必要に応じて他の成分を添加し、前記溶媒のｐＨをｐＨ調整試薬で調整することによって、前記液体試薬のｐＨを前述の範囲に設定することもできる。前記ｐＨ調整試薬は、例えば、酸、アルカリ、緩衝剤等があげられる。
【００２９】
本発明の液体試薬によれば、例えば、前記液体試薬を３７℃で保存した場合、約７日間、前記甲状腺ホルモン固定化担体の活性を維持できる。具体的には、製造時の前記液体試薬における前記甲状腺ホルモン固定化担体の活性を１００％とした場合、例えば、３７℃で７日間保存した後の前記活性を、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上に維持できる。
【００３０】
前記液体試薬は、例えば、治療や診断等の臨床検査における甲状腺ホルモンの測定等に極めて有用である。前記液体試薬の用途は、前記臨床検査に限定されず、例えば、診断および治療を除く、生化学等の広い分野における甲状腺ホルモンの検出にも適用できる。以下、同様である。
【００３１】
＜甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法＞
本発明の溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法は、前述のように、甲状腺ホルモン固定化担体を含む溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１１．５に設定することを特徴とする。本発明の安定化方法は、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨを前述の範囲に設定することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。前記溶媒のｐＨの設定は、例えば、前述した本発明の液体試薬の説明を引用できる。
【００３２】
＜甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法＞
本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法は、前述のように、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化工程を含み、前記安定化工程が、前記本発明の安定化方法によって実施されることを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の安定化方法により安定化工程を行うことが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法は、例えば、前述した本発明の液体試薬および本発明の安定化方法の説明を引用できる。
【００３３】
＜甲状腺ホルモンの検出方法＞
本発明の甲状腺ホルモンの検出方法は、前述のように、抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記本発明の液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程、および、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明において、「競合的に結合させる」とは、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体に、同時に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体を結合させる意味だけでなく、前記抗甲状腺ホルモン抗体に、前記検体中の甲状腺ホルモンおよび前記液体試薬中の前記甲状腺ホルモン固定化担体のいずれか一方を結合させた後、フリーの前記抗甲状腺ホルモン抗体に他方を結合させる意味も含む。
【００３５】
前記検出工程において、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体の検出方法は、特に制限されない。前記複合体の検出は、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体として、標識化抗甲状腺ホルモン抗体を使用し、前記複合体における前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識を検出してもよい。また、前記複合体の検出は、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体における担体として、前述のような標識の役割を果たす担体を使用し、前記複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体を前記標識として検出してもよい。この際、前記抗甲状腺ホルモン抗体は、例えば、標識化抗体でもよいし、未標識抗体でもよい。標識の役割を果たす前記担体は、例えば、前述のような蛍光粒子等の蛍光担体等があげられる。
【００３６】
本発明の検出目的である甲状腺ホルモンは、例えば、Ｔ４、Ｔ３、これらの誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、前述のようなものがあげられる。本発明において、検出目的の甲状腺ホルモンは、例えば、一種類でもよいし、二種類以上でもよい。本発明は、例えば、検出目的の甲状腺ホルモンの種類に応じて、前記抗甲状腺ホルモン抗体、前記甲状腺ホルモン固定化担体の固定化された甲状腺ホルモンを選択できる。
【００３７】
前記検体は、特に制限されず、例えば、生体試料等の試料があげられ、前記生体試料は、例えば、血液等があげられる。前記血液は、例えば、全血、血清、血漿等があげられる。前記検体は、例えば、前記試料をそのまま使用してもよいし、前記試料を溶媒に、懸濁、分散または溶解した希釈液等として使用してもよい。前記溶媒は、例えば、前述のものを使用できる。前記検体は、例えば、取り扱いが容易であることから液状の検体であることが好ましい。
【００３８】
前記抗甲状腺ホルモン抗体において、前記抗体は、特に制限されず、前記甲状腺ホルモンに結合性を有する抗体であればよい。前記抗体の種類は、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＹ等の免疫グロブリン分子、ならびにこれらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗体フラグメント（以下、抗原結合断片ともいう）等があげられる。前記抗体の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、または、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびヤギ等の非ヒトの哺乳類動物、ニワトリ等の鳥類等の動物種由来があげられる。前記抗体は、例えば、免疫動物の血清から、従来公知の方法により作製してもよいし、市販の抗体を使用してもよい。前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。
【００３９】
前記抗甲状腺ホルモン抗体は、例えば、前述のように、標識化抗甲状腺ホルモン抗体を使用できる。前記抗甲状腺ホルモン抗体を標識化する標識は、特に制限されず、検出可能であればよい。前記標識は、例えば、前記標識に由来する、発色、発光、蛍光等のシグナルを検出することにより検出できる。前記標識は、例えば、直接的に検出可能なものでもよいし、間接的に検出可能なものでもよい。前者としては、例えば、放射性同位元素、蛍光色素等があげられ、後者としては、例えば、酵素、遷移金属錯体、核酸等があげられる。
【００４０】
前記酵素は、例えば、基質と反応させ、前記基質の発色、発光、蛍光等を検出することで、間接的に検出できる。前記酵素は、特に制限されず、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等があげられる。前記基質は、特に制限されず、例えば、前記酵素の種類に応じて適宜決定できる。前記基質は、例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ｏ−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、４−クロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）等があげられる。
【００４１】
前記遷移金属錯体は、例えば、荷電による酸化還元反応により、発光するものが好ましい。前記遷移金属錯体は、例えば、ルテニウム錯体、オスミウム錯体等があげられる。前記ルテニウム錯体は、例えば、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（II）等のルテニウムピリジン錯体が好ましい。
【００４２】
前記抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識による標識化は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記標識がアルカリホスファターゼの場合、例えば、同仁化学研究所社製の商品名Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨを使用して、標識化抗甲状腺ホルモン抗体を調製できる。
【００４３】
本発明において、前記結合工程は、前述のように、前記抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程である。前記結合工程は、例えば、複合体形成工程であり、具体的には、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとの第１の複合体、および、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体との第２の複合体を形成させる複合体形成工程であることが好ましい。前記第１の複合体は、前記抗甲状腺ホルモン抗体と、前記検体中の甲状腺ホルモンとの抗原抗体反応により形成される。前記第２の複合体は、前記抗甲状腺ホルモン抗体と、前記甲状腺ホルモン固定化担体における前記甲状腺ホルモンとの抗原抗体反応により形成される。
【００４４】
前記複合体形成工程は、例えば、反応液中で行うことができる。前記反応液の溶媒は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記反応液のｐＨは、特に制限されず、例えば、４〜１１の範囲が好ましく、より好ましくは６〜９の範囲であり、特に好ましくは７〜８の範囲である。
【００４５】
前記複合体形成工程において、前記甲状腺ホルモン固定化担体は、前記本発明の液体試薬が使用される。前記抗甲状腺ホルモン抗体は、ドライの形態でもよいし、ウェットの形態でもよいが、例えば、取り扱いが容易であることから、液体試薬として使用することが好ましい。前記抗甲状腺ホルモン抗体の液体試薬は、例えば、溶媒に前記抗甲状腺ホルモン抗体が含まれている形態である。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液は、例えば、前述と同様のものがあげられる。前記抗甲状腺ホルモン抗体の液体試薬のｐＨは、特に制限されず、例えば、４〜１１の範囲が好ましく、より好ましくは６〜９の範囲であり、特に好ましくは７〜８の範囲である。前記抗甲状腺ホルモン抗体の液体試薬は、例えば、前記溶媒に、前記抗甲状腺ホルモン抗体の他に、さらにその他の成分を含んでもよい。
【００４６】
前記複合体形成工程は、例えば、前記検体と前記抗甲状腺ホルモン抗体、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させることにより行われる。これらの接触順序は、特に制限されない。具体的に、前記複合体形成工程は、例えば、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の工程があげられる。
（Ａ１）反応液において、前記検体、前記抗甲状腺ホルモン抗体および前記液体試薬を同時に接触させて、前記第１の複合体および前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ２）反応液において、前記検体および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第１の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記液体試薬を添加して、前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ３）反応液において、前記液体試薬および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第２の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記検体を添加して、前記第１の複合体を形成する複合体形成工程
【００４７】
前記（Ａ１）工程は、前記反応液において、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体に対して、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体とが、同時に、競合的に結合する。これによって、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとの第１の複合体、および、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体との第２の複合体が形成される。
【００４８】
前記（Ａ２）工程は、前記反応液において、例えば、まず、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記抗甲状腺ホルモン抗体とが結合して、前記第１の複合体が形成される。ついで、前記反応液において、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合しなかったフリーの前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体とが結合して、前記第２の複合体が形成される。
【００４９】
前記（Ａ３）工程は、前記反応液において、例えば、まず、前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体とが結合して、前記第２の複合体が形成される。ついで、前記反応液において、前記甲状腺ホルモン固定化担体と結合しなかったフリーの前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとが結合して、前記第１の複合体が形成される。
【００５０】
本発明において、前記検出工程は、前述のように、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程である。前記抗甲状腺ホルモン抗体として前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を使用し、前記標識を検出する場合、前記検出工程は、例えば、前記第２の複合体における前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識を検出する工程ともいえる。また、前記甲状腺ホルモン固定化担体として、標識の役割を果たす担体を使用し、前記担体を標識として検出する場合、前記検出工程は、例えば、前記第２の複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体を検出する工程ともいえる。
【００５１】
前記標識の検出方法は、特に制限されず、例えば、前記標識の種類に応じて適宜決定できる。前記標識は、前述のように、例えば、前記標識に由来する発色、発光、蛍光等のシグナルの検出により行うことができる。前記シグナルの検出は、例えば、目視で行ってもよいし、光学的手法により行ってもよい。後者の場合、例えば、光学分析機器等を用いて、反射率、透過率、吸光度、蛍光強度等を測定してもよい。前記標識の検出は、例えば、定性でもよいし、定量でもよい。前記標識の検出により、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出でき、その結果から、間接的に、前記検体中の甲状腺ホルモンを検出できる。
【００５２】
前記複合体形成工程において、例えば、前記第２の複合体の形成量は、前記検体中の甲状腺ホルモン量に依存する。すなわち、例えば、前記検体中の甲状腺ホルモン量の増加にともなって、前記第２の複合体の形成量が相対的に減少し、前記検体中の甲状腺ホルモン量の減少にともなって、前記第２の複合体の形成量が相対的に増加する。そこで、例えば、前記第２の複合体の形成量に対応する前記標識に由来するシグナル強度と、甲状腺ホルモン量との相関関係を示す検量線を使用することによって、前記検体中の甲状腺ホルモン量を定量できる。前記検量線は、例えば、既知量の甲状腺ホルモンを用いて、同様の条件で、前記第１の複合体および前記第２の複合体を形成し、前記第２の複合体における前記標識由来のシグナル強度を検出することによって、前記甲状腺ホルモン量と前記標識のシグナル強度とから作成できる。
【００５３】
本発明の検出方法は、前記結合工程の後、すなわち、前記複合体形成工程の後、前記検出工程に先立って、さらに、前記甲状腺ホルモン固定化担体と結合した前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を回収する工程を含むことが好ましい。前記回収工程は、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体との複合体、すなわち、前記第２の複合体の回収工程ともいえる。前記第２の複合体を回収することによって、例えば、前記第２の複合体を、前記第１の複合体および未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体等から分離できる。これによって、例えば、前記第１の複合体の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識および未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識の検出を排除し、前記第２の複合体の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識をより正確に検出できる。
【００５４】
前記第２の複合体の回収方法は、特に制限されず、例えば、前記担体の種類に応じて適宜設定できる。前記第２の複合体は、例えば、前記反応液から回収できる。前記回収方法は、例えば、前記第２の複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体を捕捉する方法、遠心処理、ろ過処理、沈殿処理、膜分離処理、吸着処理等があげられる。前記担体が前記磁性材料から形成されている場合、例えば、磁石等の磁力によって、前記第２の複合体を回収できる。
【００５５】
本発明の検出方法は、例えば、前記第２の複合体を回収した後、さらに前記第２の複合体を洗浄する工程を含んでもよい。これによって、例えば、前記第２の複合体を含む画分に、前記第１の複合体および前記未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を含まれている場合、これを十分に除去できる。
【００５６】
本発明の検出方法は、前述のような標識の役割を果たす担体を使用し、前記第２の複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体を前記標識として検出する場合、前記抗甲状腺ホルモン抗体として、例えば、容器およびプレート等の基板に固定化された前記抗甲状腺ホルモン抗体を使用してもよい。この場合、本発明の検出方法は、例えば、前記結合工程の後、すなわち、前記複合体形成工程の後、前記検出工程に先立って、さらに、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体を洗浄する工程を含むことが好ましい。前記洗浄によって、例えば、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体に結合しなかった成分が除去される。このため、例えば、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体に結合しなかった前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体の検出を排除し、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体に結合した前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体を、標識としてより正確に検出できる。
【００５７】
以下に、本発明の検出方法について、前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体として磁性粒子を使用し、前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識として酵素を使用する例をあげて説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
【００５８】
まず、液体の検体と前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体とを混合し、この反応液中で、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体とを結合させ、前記第１の複合体を形成する。
【００５９】
反応ｐＨは、例えば、４〜１１であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜８である。反応温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃ある。反応時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜２０分であり、より好ましくは５〜１０分である。前記反応液１ｍＬあたりの前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の添加量は、例えば、０．０５〜５μｇであり、好ましくは０．１〜１μｇである。
【００６０】
つぎに、前記反応液に、前記甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬を添加する。前記液体試薬は、ｐＨ８．７〜１１．５の条件下で保存した本発明の液体試薬を使用する。そして、前記反応液中で、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合しなかった未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体とを結合させ、前記第２の複合体を形成する。
【００６１】
反応ｐＨは、例えば、４〜１１であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜８である。反応温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃ある。反応時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜２０分であり、より好ましくは５〜１０分である。前記反応液１ｍＬあたりの前記甲状腺ホルモン固定化担体の添加量は、例えば、０．００１〜５ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１ｍｇである。
【００６２】
そして、前記磁石を使用し、磁力によって、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記第２の複合体を回収し、保持する。この際、前記反応液が入った容器の外部に磁石を配置し、前記容器の壁を介して前記第２の複合体を回収することが好ましい。このように、前記第２の複合体を保持した状態で、前記容器内の反応液を除去する。これによって、未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を除去できる。この分離方法は、一般に、結合（Ｂ）／遊離（Ｆ）分離と呼ばれる。
【００６３】
つぎに、磁力を解放して、新たな反応液中に前記第２の複合体を添加する。前記反応液には、例えば、前記第２の複合体の添加前または添加後に、前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識酵素に対する基質を添加することが好ましい。前記基質の種類は、例えば、前記標識酵素の種類に応じて適宜決定できる。前記反応液の条件は、例えば、前記標識酵素および前記基質の種類に応じて適宜決定できる。
【００６４】
前記反応液において、前記第２の複合体における前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識酵素の酵素反応を行い、酵素反応により生じるシグナルの強度を測定する。前記反応条件は、特に制限されず、反応ｐＨは、例えば、４〜１２であり、好ましくは６〜１１であり、より好ましくは８〜１０である。反応温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃ある。反応時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜２０分であり、より好ましくは５〜１０分である。
【００６５】
そして、予め作成した、甲状腺ホルモンの量とシグナル強度との相関関係を示す検量線から、前記検体中の甲状腺ホルモンの量を決定する。
【００６６】
また、前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識として前記遷移金属錯体を使用した場合は、例えば、以下のように検出できる。特に示さない限り、前述と同様である。
【００６７】
前記遷移金属錯体は、例えば、電気エネルギーの供与によって、電気化学的に発光する。このため、例えば、前述のように分離した前記第２の複合体に対して、電気エネルギーを供与することによって、前記遷移金属錯体を発光させ、この発光シグナルの検出により、前記標識である遷移金属錯体を検出すれば、この測定結果に基づいて、前記検体中の甲状腺ホルモンを検出できる。
【００６８】
前記遷移金属錯体を使用する場合、前述のように電気エネルギーを供与するため、電極上で、前記第２の複合体に、電気エネルギーを供与することが好ましい。前記電極は、例えば、作用極があげられる。
【００６９】
前記遷移金属錯体は、例えば、ルテニウム錯体が好ましく、中でも、前述のようなルテニウム錯体が好ましい。前記標識として前記遷移金属錯体を使用する場合、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）を併用することが好ましい。このようにＴＰＡを併用することによって、以下のように、前記第２の複合体から発光を生じさせることができる。まず、前記電極にプラス電位を与えることによって、前記第２の複合体におけるルテニウム錯体は、２価から３価に酸化され、同時に、前記ＴＰＡも酸化される。酸化された前記ＴＰＡは、脱水素によりＴＰＡラジカルに変換され、前記３価のルテニウム錯体を還元し、励起状態である２価のルテニウム錯体に変化させる。そして、ルテニウム錯体が、不安定な励起状態から安定な２価の状態に遷移する際、発光する。安定な状態に戻った２価のルテニウム錯体は、再度、プラス電位を与えることで、以上の励起発光が繰り返し行われる。
【００７０】
＜甲状腺ホルモンの検出キット＞
本発明の甲状腺ホルモンの検出キットは、前記本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬、および、抗甲状腺ホルモン抗体を含み、前記本発明の検出方法に使用することを特徴とする。本発明の検出キットは、例えば、前述した本発明の液体試薬および本発明の検出方法の説明を引用できる。前記検出キットは、前記甲状腺ホルモン固定化担体を試薬として含むため、例えば、従来のような前記３試薬系と比較して、試薬数が少なく、低コストである。
【００７１】
本発明の検出キットにおいて、前記抗甲状腺ホルモン抗体は、例えば、前述のように、ドライの形態でもよく、ウェットの形態でもよいが、例えば、取り扱いが容易であることから、前述のような液体試薬であることが好ましい。本発明の検出キットにおいて、前記抗甲状腺ホルモン抗体および前記甲状腺ホルモン固定化担体は、それぞれ別個の容器に収容されていることが好ましい。前記検出キットは、例えば、さらに使用説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００７２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【００７３】
［実施例１］
本例では、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬を調製し、保存安定性を評価した。
【００７４】
（１）甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の調製
Ｌ−チロキシン（ナカライテスク社製）をビオチン化して、ビオチン化Ｔ４を得た。前記ビオチン化は、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社製）を使用し、その取り扱い説明書に準じて行った。そして、前記ビオチン化Ｔ４とストレプトアビジン被覆磁性微粒子（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の商品名Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅＴＭＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１）とを混合し、前記ストレプトアビジン被覆磁性微粒子のストレプトアビジンに、前記ビオチン化Ｔ４のビオチンを結合させ、Ｔ４が固定化されたＴ４固定化磁性粒子を得た。前記ビオチンとストレプトアビジンとの結合は、トリス緩衝液溶媒中、３７℃、６０分、ｐＨ７．４の条件で行った。前記溶媒中における前記ビオチン化Ｔ４と前記ストレプトアビジン被覆磁性微粒子との添加割合は、総ストレプトアビジン量に対して過剰量のビオチン化Ｔ４とした。
【００７５】
下記緩衝液１に、５０μｇ／ｍＬとなるように前記Ｔ４固定化磁性粒子を混合し、ｐＨが異なる液体試薬を調製した。前記液体試薬のｐＨは、それぞれ、８．７、８．８、９．０、９．２、９．４、９．５、１０．５とした。下記緩衝液２に、５０μｇ／ｍＬとなるように前記Ｔ４固定化磁性粒子を混合し、ｐＨが異なる液体試薬を調製した。前記液体試薬のｐＨは、それぞれ、７．０、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６とした。ｐＨ８．７〜１０．５の前記液体試薬を、実施例１の液体試薬、ｐＨ７．０〜８．６の試薬を、比較例１の液体試薬とした。
【００７６】
（緩衝液１：ｐＨ８．７〜１０．５）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．１％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ３
（緩衝液２：ｐＨ７．０〜８．６）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．１％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ３
【００７７】
（２）競合的酵素免疫測定による甲状腺ホルモンの測定
抗Ｔ４マウスモノクローナル抗体を酵素で標識して、酵素標識抗体を得た。前記酵素標識化は、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品名、同仁化学研究所社製）を使用し、その取り扱い説明書に準じて行った。そして、下記緩衝液３に、０．２μｇ／ｍＬとなるように前記酵素標識抗体を混合し、酵素標識抗体液を調製した。
【００７８】
（緩衝液３：ｐＨ７．０）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．１％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ３
０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＺｎＣｌ２
５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２
【００７９】
前記検体として、遊離Ｔ４濃度が既知であるヒト血清（ｎ＝２）を使用した。前記酵素標識抗体液１００μＬと前記検体１０μＬとを、１．５ｍＬチューブ（商品コードＭＣＴ−１５０−Ｌ−Ｃ、Ａｘｙｇｅｎ社製）内で混合し、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、前記混合液に、前記実施例１または前記比較例１の液体試薬１００μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベートした。そして、前記チューブの外壁に磁石を配置し、磁力によって、前記混合液中の前記Ｔ４固定化磁性粒子を前記チューブの内壁側に捕獲し、この状態で、前記チューブ内の液体を除去した。ついで、前記磁力を解放し、前記チューブ内に洗浄液を添加し、前記Ｔ４固定化磁性粒子と混合した。この洗浄工程を３回行った。前記洗浄液は、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を０．０５％含むトリス緩衝液を使用した。再度、前記Ｔ４固定化磁性粒子を捕獲して、前記チューブ内の液体を除去し、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ４−メチルウンベリフェリルリン酸液５００μＬを添加して、前記Ｔ４固定化磁性粒子と混合した後、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、前述と同様にして、前記Ｔ４固定化磁性粒子を捕獲し、前記チューブ内の液体を回収した。前記液体に、２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ ５０μＬを添加した後、生成された４−メチルウンベリフェリルの蛍光強度を測定（測定波長：４５０ｎｍ）した。測定は、二回行い、その平均値を測定値とした。
【００８０】
（３）保存安定性の評価
前記実施例１および前記比較例１の液体試薬を、それぞれ、３７℃で７日間保存した。そして、保存開始前（０日）、および、保存開始から７日後における各液体試薬について、前記（２）に示す競合的酵素免疫測定を行い、検体中の遊離Ｔ４を測定した。
【００８１】
そして、保存開始前の液体試薬を用いた測定値（Ｘ０）および７日間保存後の液体試薬を用いた測定値（Ｘ７）を、下記式（Ｉ）に代入して、前記Ｔ４固定化磁性粒子の活性の残存率（％）を求めた。
活性の残存率（％）＝（Ｘ７／Ｘ０）×１００ （Ｉ）
【００８２】
下記表１に、前記液体試薬のｐＨと前記活性の残存率との関係を示す。表１に示すように、ｐＨを８．７以上に設定した実施例１の液体試薬は、ｐＨを８．７未満に設定した比較例１の液体試薬と比較して、保存後の活性の残存率が高かった。この結果から、液体試薬のｐＨを８．７以上に設定することにより、液体状態でのＴ４固定化磁性粒子の安定性が向上することがわかった。
【００８３】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上のように、本発明によれば、前記液体試薬のｐＨを前記所定の範囲とすることで、前記甲状腺ホルモン固定化担体を安定化できるため、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体を長期間保存できる。このため、本発明によれば、例えば、従来のように、測定の度に、甲状腺ホルモン固定化担体を調製する必要がなく、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンを測定できる。したがって、本発明は、臨床検査等において、極めて有用である。なお、本発明は、臨床検査のみに限定されず、例えば、生化学等の広い分野における甲状腺ホルモンの検出に適用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途に関し、より詳細には、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法、甲状腺ホルモンの検出方法、甲状腺ホルモンの検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺ホルモンは、甲状腺から分泌され、全身の細胞に作用して細胞の代謝率を向上させる等の作用を有するホルモンである。前記甲状腺ホルモンは、例えば、トリヨードチロニン（Ｔ３）およびチロキシン（Ｔ４）が知られている。近年、甲状腺ホルモンが過剰に分泌される甲状腺機能亢進症（例えば、バセドウ病等）、および、甲状腺ホルモンの分泌が不足する甲状腺機能低下症（例えば、橋本病等）等の甲状腺機能異常症の患者が増加している。このため、臨床検査等において、甲状腺ホルモンの正確な測定が重要である。
【０００３】
甲状腺ホルモンの測定には、例えば、抗甲状腺ホルモン抗体を用いる競合的免疫測定法が広く採用されている（特許文献１および２、非特許文献１参照）。前記測定法は、検体中の甲状腺ホルモンと試薬中の甲状腺ホルモンとを競合的に、抗甲状腺ホルモン抗体に反応させる測定系である。前記測定法には、一般的に、３試薬系キットが使用されている。前記キットは、第１試薬として標識化抗体、第２試薬としてビオチン化甲状腺ホルモンおよび第３試薬としてアビジン固定化担体から構成され、各試薬がそれぞれ別個となっている。前記３試薬系キットを使用した測定は、例えば、下記のように行う。すなわち、まず、検体と前記標識化抗体とを混合し、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記標識化抗体とを結合させる。つぎに、前記混合物に、さらに、前記ビオチン化甲状腺ホルモンおよび前記アビジン固定化担体を混合する。これによって、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合していない未反応の標識化抗体と、前記ビオチン化甲状腺ホルモンと、前記アビジン固定化担体とが、抗原抗体反応およびアビジン−ビオチン結合により、複合体を形成する。そして、前記複合体を分離して、前記複合体における前記標識化抗体を検出する。前記標識化抗体には、前記検体中の甲状腺ホルモンと、前記ビオチン化甲状腺ホルモンとが競合的に結合する。このため、前記複合体における標識化抗体を検出することで、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合した標識化抗体を測定でき、これによって、間接的に前記検体中の甲状腺ホルモンが測定できる。しかしながら、前記３試薬系では、測定の度に、３つの試薬を混合する必要があるため、操作が煩雑で時間がかかり、高コストである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−８９８８９号公報
【特許文献２】特開２０１０−５３１１８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｔｈｍａｎｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００５） Ｖｏｌ．３， Ｎｏ．１， Ｉｓｓｕｅ ９， ９１−９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、予め、前記ビオチン化甲状腺ホルモンと前記アビジン固定化担体とを結合させた甲状腺ホルモン固定化担体を試薬とし、これと標識化抗体との２試薬系とすることが考えられる。しかしながら、前記甲状腺ホルモン固定化担体は、安定性が低いため、例えば、試薬として長期間保存した場合、保存前と比較して、その活性が低下するという問題がある。
【０００７】
そこで、本発明は、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンの測定を実現する、安定化された甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬は、甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする。
【０００９】
本発明の溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法は、甲状腺ホルモン固定化担体を含む溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１１．５に設定することを特徴とする。
【００１０】
本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法は、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化工程を含み、前記安定化工程が、前記本発明の安定化方法によって実施されることを特徴とする。
【００１１】
本発明の甲状腺ホルモンの検出方法は、抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記本発明の液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程、および、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の甲状腺ホルモンの検出キットは、前記本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬、および、抗甲状腺ホルモン抗体を含み、前記本発明の検出方法に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、前記液体試薬のｐＨを前記所定の範囲とすることで、前記甲状腺ホルモン固定化担体を安定化できるため、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体を長期間保存できる。このため、本発明によれば、例えば、従来のように、測定の度に、甲状腺ホルモン固定化担体を調製する必要がなく、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンを測定できる。したがって、本発明は、臨床検査等において、極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬＞
本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬は、前述のように、甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする。
【００１５】
本発明において、前記溶媒のｐＨは、前記液体試薬の全構成成分が前記溶媒に含まれた状態における前記溶媒のｐＨを意味する。以下、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨを、「前記液体試薬のｐＨ」という。前記液体試薬のｐＨの下限は、８．７であり、例えば、８．８、９である。前記液体試薬のｐＨの上限は、１１．５であり、好ましくは１１であり、より好ましくは１０．５、９．５、９．４、９．２である。前記液体試薬のｐＨの範囲は、前述のように、８．７〜１１．５であり、好ましくは８．７〜１１の範囲、より好ましくは、８．７〜１０．５の範囲である。また、前記ｐＨの範囲は、例えば、８．７〜９．５の範囲、８．７〜９．４、８．７〜９．２の範囲である。また、前記ｐＨの範囲は、例えば、８．８〜１１の範囲、９〜１１の範囲であり、好ましくは８．８〜１０．５、９〜１０．５の範囲、９〜９．５の範囲、９〜９．４の範囲、９〜９．２の範囲である。
【００１６】
前記液体試薬は、前記溶媒中に、前記甲状腺ホルモン固定化担体の他に、例えば、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、例えば、界面活性剤、分散剤、防腐剤、塩、金属塩、タンパク質、糖、アミノ酸、キレート剤等があげられる。
【００１７】
前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液、血清、血漿等があげられる。前記溶媒は、例えば、前記液体試薬のｐＨを前記範囲に容易に調整できることから、前記緩衝液が好ましい。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記溶媒が前記緩衝液の場合、前記液体試薬における前記緩衝液の濃度は、例えば、０．１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１８】
前記甲状腺ホルモン固定化担体において、前記固定化された甲状腺ホルモンは、例えば、チロキシン（以下、Ｔ４）、３，３’，５−Ｌ−トリヨードチロニン（以下、Ｔ３）、これらの誘導体があげられる。本発明において、前記固定化された甲状腺ホルモンは、抗甲状腺ホルモン抗体に対して、検体中の甲状腺ホルモンと競合して結合できればよい。このため、前記誘導体は、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体に対する、Ｔ４およびＴ３のエピトープまたはエピトープを有する物質でもよい。前記誘導体は、例えば、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロニン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロニン、３，３’，５−Ｄ−トリヨードチロニン、３，３’，５’−Ｌ−トリヨードチロニン（リバースＴ３）、Ｄ−チロキシン等があげられる。前記固定化される甲状腺ホルモンの種類は、特に制限されず、例えば、検出目的の甲状腺ホルモンの種類に応じて決定でき、例えば、Ｔ３およびＴ４のいずれか一方でもよいし、その誘導体でもよいし、Ｔ３およびＴ４の両方でもよいし、Ｔ３、Ｔ４およびこれらの誘導体から選ばれる二つ以上の組合せでもよい。
【００１９】
前記甲状腺ホルモン固定化担体において、担体１個あたりに固定化される前記甲状腺ホルモンの数は、特に制限されず、１分子でもよいが、２分子以上の複数の分子が固定化されていることが好ましい。前記担体あたりの固定化された甲状腺ホルモンの分子数は、その下限が、例えば、１分子であり、好ましくは１０分子であり、より好ましくは１００分子であり、上限は、特に制限されず、例えば、１×１０２０分子であり、好ましくは１×１０１５分子であり、より好ましくは１×１０１０分子である。
【００２０】
前記担体は、特に制限されず、その材質、形状、大きさ等は適宜設定できる。前記担体の材質は、例えば、前記甲状腺ホルモンの検出時に使用する溶媒に不溶であることが好ましい。前記材質は、例えば、磁性材料、ケイ酸質無機材料、有機材料、金属材料等があげられる。前記磁性材料は、例えば、ニッケル、コバルト、鉄、サマリウム、ネオジウム、およびこれらの合金等があげられる。前記ケイ酸質無機材料は、例えば、ガラス、シリカゲル、ベントナイト、セラミック、シリコン等があげられる。前記有機材料は、例えば、プラスチック、デキストラン、ろ紙、スポンジ、ラテックス、リポソーム、活性炭、カーボンファイバー等があげられる。前記金属材料は、例えば、金、銀、白金、パラジウム、ニッケル、およびこれらの合金等があげられる。中でも、例えば、磁石等を使用して簡便に操作できるため、前記磁性材料が好ましい。また、前記担体は、標識の役割を果たしても良く、例えば、蛍光粒子等の蛍光担体があげられる。前記担体の前記形状は、例えば、粒子状、棒状、シート状、多孔状等があげられ、中でも、粒子状が好ましい。前記担体の大きさは、特に制限されず、例えば、粒子状の場合、平均粒径が、０．００１〜１００００μｍが好ましく、より好ましくは０．０１〜１０００μｍであり、特に好ましくは０．１〜１００μｍである。前記担体は、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２１】
前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、前記甲状腺ホルモンが前記担体に、直接固定化されたものでもよいし、間接的に固定化されたものでもよい。前記間接的な固定化は、特に制限されず、例えば、前記甲状腺ホルモンと前記担体とがリンカーを介して結合した形態があげられる。前記リンカーは、互いに特異的な結合性を有するリンカーの組み合わせが好ましい。前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、第１リンカーと前記第１リンカーに結合する第２リンカーとの結合を介して、前記甲状腺ホルモンと前記担体とが結合していることが好ましい。前記第１リンカーと前記第２リンカーの組み合わせは、例えば、ビオチンとアビジンとの組み合わせ、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ等が例示できる。前記第１リンカーと前記第２リンカーは、例えば、いずれがビオチンでもよい。本発明において、前記ビオチンは、例えば、ビオチンの他に、その誘導体でもよく、前記アビジンは、例えば、アビジンの他に、その誘導体でもよく、前記ストレプトアビジンは、例えば、前記ストレプトアビジンの他に、その誘導体でもよい。また、前記リンカーは、例えば、分子でもよいし、タンパク質でもよい。前記タンパク質は、例えば、アルブミン、グロブリン等があげられる。
【００２２】
前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、ビオチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合により、前記甲状腺ホルモンが前記担体に固定化されていることが好ましい。前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと、前記第２リンカーを付加した担体との複合体があげられ、具体例として、ビオチン化甲状腺ホルモンとアビジン固定化担体との複合体、ビオチン化甲状腺ホルモンとストレプトアビジン固定化担体との複合体、アビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固体化担体との複合体、ストレプトアビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固定化担体との複合体等があげられる。
【００２３】
前記甲状腺ホルモン固定化担体の調製方法は、特に制限されない。前記甲状腺ホルモン固定化担体は、例えば、前記甲状腺ホルモンと前記担体とを反応させることで調製できる。具体的には、例えば、前述のように、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと、前記第２リンカーを付加した担体とを反応させ、前記第１リンカーと前記第２リンカーとを結合させることで調製できる。前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との組合せは、特に制限されず、例えば、ビオチン化甲状腺ホルモンとアビジン固定化担体との組合せ、ビオチン化甲状腺ホルモンとストレプトアビジン固定化担体との組合せ、アビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固体化担体との組合せ、ストレプトアビジン化甲状腺ホルモンとビオチン化固定化担体との組合せ等があげられる。前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンおよび前記第２リンカーを付加した担体は、例えば、市販品を使用してもよいし、公知の方法によって調製することもできる。具体例として、前記ストレプトアビジン固定化担体は、例えば、Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅＴＭＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１」等が使用できる。また、前記甲状腺ホルモンまたは前記担体のビオチン化は、例えば、市販のキットを使用して行うことができ、具体例として、同仁化学研究所社製の商品名「Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２」等があげられる。
【００２４】
前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との反応は、例えば、溶媒中で行うことができる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が使用できる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記反応液における前記緩衝液の濃度は、例えば、０.１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。前記反応液のｐＨは、例えば、４〜１１であり、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜９である。前記溶媒は、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体の他に、例えば、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、例えば、界面活性剤、分散剤、防腐剤、塩、金属塩、タンパク質、糖、アミノ酸、キレート剤等があげられる。
【００２５】
前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との反応条件は、特に制限されず、例えば、前記リンカーの組合せ、前記担体の種類等に応じて適宜決定できる。前記反応温度は、例えば、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは４〜４０℃であり、反応時間は、例えば、５〜３６０分であり、好ましくは３０〜１２０分である。前記反応液において、前記第１リンカーを付加した甲状腺ホルモンと前記第２リンカーを付加した担体との添加割合は、特に制限されず、前記第１リンカーのモル数（Ａ）と前記第２リンカーのモル数（Ｂ）の比（Ａ：Ｂ）が、１：０．０１〜１：１００が好ましく、より好ましくは１：０．１〜１：１０である。
【００２６】
前述のように、前記担体１個あたりに固定化する甲状腺ホルモンの数を複数分子とする場合、例えば、前記担体１個あたりに複数の前記第２リンカーを付加し、前記第２リンカーのそれぞれに、前記第１リンカーを介して甲状腺ホルモンを結合させることが好ましい。
【００２７】
前記液体試薬において、前記甲状腺ホルモン固定化担体の濃度は、特に制限されない。前記濃度は、例えば、１〜１００００μｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは５〜５０００μｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬの範囲である。前記液体試薬は、例えば、一種類の前記甲状腺ホルモン固定化担体を含んでもよいし、二種類以上の前記甲状腺ホルモン固定化担体を含んでもよい。後者の場合、各甲状腺ホルモン固定化担体の濃度は、特に制限されず、例えば、各甲状腺ホルモン固定化担体の濃度が前述の範囲でもよいし、各甲状腺ホルモン固定化担体の合計濃度が前述の範囲でもよい。
【００２８】
前記液体試薬の調製方法は、特に制限されず、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨの範囲を、前述の範囲に設定することで行える。前記ｐＨの調整方法は、特に制限されない。例えば、予め、前述のｐＨの範囲に設定した緩衝能を有する溶媒（緩衝液）に、前記甲状腺ホルモン固定化担体および必要に応じて他の成分を添加し、前記溶媒の緩衝能によって、前記液体試薬のｐＨを前述の範囲に設定できる。また、例えば、前記溶媒に、前記甲状腺ホルモン固体化担体および必要に応じて他の成分を添加し、前記溶媒のｐＨをｐＨ調整試薬で調整することによって、前記液体試薬のｐＨを前述の範囲に設定することもできる。前記ｐＨ調整試薬は、例えば、酸、アルカリ、緩衝剤等があげられる。
【００２９】
本発明の液体試薬によれば、例えば、前記液体試薬を３７℃で保存した場合、約７日間、前記甲状腺ホルモン固定化担体の活性を維持できる。具体的には、製造時の前記液体試薬における前記甲状腺ホルモン固定化担体の活性を１００％とした場合、例えば、３７℃で７日間保存した後の前記活性を、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上に維持できる。
【００３０】
前記液体試薬は、例えば、治療や診断等の臨床検査における甲状腺ホルモンの測定等に極めて有用である。前記液体試薬の用途は、前記臨床検査に限定されず、例えば、診断および治療を除く、生化学等の広い分野における甲状腺ホルモンの検出にも適用できる。以下、同様である。
【００３１】
＜甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法＞
本発明の溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法は、前述のように、甲状腺ホルモン固定化担体を含む溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１１．５に設定することを特徴とする。本発明の安定化方法は、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨを前述の範囲に設定することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。前記溶媒のｐＨの設定は、例えば、前述した本発明の液体試薬の説明を引用できる。
【００３２】
＜甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法＞
本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法は、前述のように、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化工程を含み、前記安定化工程が、前記本発明の安定化方法によって実施されることを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の安定化方法により安定化工程を行うことが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法は、例えば、前述した本発明の液体試薬および本発明の安定化方法の説明を引用できる。
【００３３】
＜甲状腺ホルモンの検出方法＞
本発明の甲状腺ホルモンの検出方法は、前述のように、抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記本発明の液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程、および、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明において、「競合的に結合させる」とは、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体に、同時に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体を結合させる意味だけでなく、前記抗甲状腺ホルモン抗体に、前記検体中の甲状腺ホルモンおよび前記液体試薬中の前記甲状腺ホルモン固定化担体のいずれか一方を結合させた後、フリーの前記抗甲状腺ホルモン抗体に他方を結合させる意味も含む。
【００３５】
前記検出工程において、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体の検出方法は、特に制限されない。前記複合体の検出は、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体として、標識化抗甲状腺ホルモン抗体を使用し、前記複合体における前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識を検出してもよい。また、前記複合体の検出は、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体における担体として、前述のような標識の役割を果たす担体を使用し、前記複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体を前記標識として検出してもよい。この際、前記抗甲状腺ホルモン抗体は、例えば、標識化抗体でもよいし、未標識抗体でもよい。標識の役割を果たす前記担体は、例えば、前述のような蛍光粒子等の蛍光担体等があげられる。
【００３６】
本発明の検出目的である甲状腺ホルモンは、例えば、Ｔ４、Ｔ３、これらの誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、前述のようなものがあげられる。本発明において、検出目的の甲状腺ホルモンは、例えば、一種類でもよいし、二種類以上でもよい。本発明は、例えば、検出目的の甲状腺ホルモンの種類に応じて、前記抗甲状腺ホルモン抗体、前記甲状腺ホルモン固定化担体の固定化された甲状腺ホルモンを選択できる。
【００３７】
前記検体は、特に制限されず、例えば、生体試料等の試料があげられ、前記生体試料は、例えば、血液等があげられる。前記血液は、例えば、全血、血清、血漿等があげられる。前記検体は、例えば、前記試料をそのまま使用してもよいし、前記試料を溶媒に、懸濁、分散または溶解した希釈液等として使用してもよい。前記溶媒は、例えば、前述のものを使用できる。前記検体は、例えば、取り扱いが容易であることから液状の検体であることが好ましい。
【００３８】
前記抗甲状腺ホルモン抗体において、前記抗体は、特に制限されず、前記甲状腺ホルモンに結合性を有する抗体であればよい。前記抗体の種類は、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＹ等の免疫グロブリン分子、ならびにこれらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗体フラグメント（以下、抗原結合断片ともいう）等があげられる。前記抗体の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、または、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびヤギ等の非ヒトの哺乳類動物、ニワトリ等の鳥類等の動物種由来があげられる。前記抗体は、例えば、免疫動物の血清から、従来公知の方法により作製してもよいし、市販の抗体を使用してもよい。前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。
【００３９】
前記抗甲状腺ホルモン抗体は、例えば、前述のように、標識化抗甲状腺ホルモン抗体を使用できる。前記抗甲状腺ホルモン抗体を標識化する標識は、特に制限されず、検出可能であればよい。前記標識は、例えば、前記標識に由来する、発色、発光、蛍光等のシグナルを検出することにより検出できる。前記標識は、例えば、直接的に検出可能なものでもよいし、間接的に検出可能なものでもよい。前者としては、例えば、放射性同位元素、蛍光色素等があげられ、後者としては、例えば、酵素、遷移金属錯体、核酸等があげられる。
【００４０】
前記酵素は、例えば、基質と反応させ、前記基質の発色、発光、蛍光等を検出することで、間接的に検出できる。前記酵素は、特に制限されず、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等があげられる。前記基質は、特に制限されず、例えば、前記酵素の種類に応じて適宜決定できる。前記基質は、例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ｏ−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、４−クロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）等があげられる。
【００４１】
前記遷移金属錯体は、例えば、荷電による酸化還元反応により、発光するものが好ましい。前記遷移金属錯体は、例えば、ルテニウム錯体、オスミウム錯体等があげられる。前記ルテニウム錯体は、例えば、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（II）等のルテニウムピリジン錯体が好ましい。
【００４２】
前記抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識による標識化は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記標識がアルカリホスファターゼの場合、例えば、同仁化学研究所社製の商品名Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨを使用して、標識化抗甲状腺ホルモン抗体を調製できる。
【００４３】
本発明において、前記結合工程は、前述のように、前記抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび前記甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程である。前記結合工程は、例えば、複合体形成工程であり、具体的には、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとの第１の複合体、および、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体との第２の複合体を形成させる複合体形成工程であることが好ましい。前記第１の複合体は、前記抗甲状腺ホルモン抗体と、前記検体中の甲状腺ホルモンとの抗原抗体反応により形成される。前記第２の複合体は、前記抗甲状腺ホルモン抗体と、前記甲状腺ホルモン固定化担体における前記甲状腺ホルモンとの抗原抗体反応により形成される。
【００４４】
前記複合体形成工程は、例えば、反応液中で行うことができる。前記反応液の溶媒は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記反応液のｐＨは、特に制限されず、例えば、４〜１１の範囲が好ましく、より好ましくは６〜９の範囲であり、特に好ましくは７〜８の範囲である。
【００４５】
前記複合体形成工程において、前記甲状腺ホルモン固定化担体は、前記本発明の液体試薬が使用される。前記抗甲状腺ホルモン抗体は、ドライの形態でもよいし、ウェットの形態でもよいが、例えば、取り扱いが容易であることから、液体試薬として使用することが好ましい。前記抗甲状腺ホルモン抗体の液体試薬は、例えば、溶媒に前記抗甲状腺ホルモン抗体が含まれている形態である。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液は、例えば、前述と同様のものがあげられる。前記抗甲状腺ホルモン抗体の液体試薬のｐＨは、特に制限されず、例えば、４〜１１の範囲が好ましく、より好ましくは６〜９の範囲であり、特に好ましくは７〜８の範囲である。前記抗甲状腺ホルモン抗体の液体試薬は、例えば、前記溶媒に、前記抗甲状腺ホルモン抗体の他に、さらにその他の成分を含んでもよい。
【００４６】
前記複合体形成工程は、例えば、前記検体と前記抗甲状腺ホルモン抗体、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させることにより行われる。これらの接触順序は、特に制限されない。具体的に、前記複合体形成工程は、例えば、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の工程があげられる。
（Ａ１）反応液において、前記検体、前記抗甲状腺ホルモン抗体および前記液体試薬を同時に接触させて、前記第１の複合体および前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ２）反応液において、前記検体および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第１の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記液体試薬を添加して、前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ３）反応液において、前記液体試薬および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第２の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記検体を添加して、前記第１の複合体を形成する複合体形成工程
【００４７】
前記（Ａ１）工程は、前記反応液において、例えば、前記抗甲状腺ホルモン抗体に対して、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体とが、同時に、競合的に結合する。これによって、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとの第１の複合体、および、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体との第２の複合体が形成される。
【００４８】
前記（Ａ２）工程は、前記反応液において、例えば、まず、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記抗甲状腺ホルモン抗体とが結合して、前記第１の複合体が形成される。ついで、前記反応液において、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合しなかったフリーの前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体とが結合して、前記第２の複合体が形成される。
【００４９】
前記（Ａ３）工程は、前記反応液において、例えば、まず、前記液体試薬中の甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体とが結合して、前記第２の複合体が形成される。ついで、前記反応液において、前記甲状腺ホルモン固定化担体と結合しなかったフリーの前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとが結合して、前記第１の複合体が形成される。
【００５０】
本発明において、前記検出工程は、前述のように、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程である。前記抗甲状腺ホルモン抗体として前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を使用し、前記標識を検出する場合、前記検出工程は、例えば、前記第２の複合体における前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識を検出する工程ともいえる。また、前記甲状腺ホルモン固定化担体として、標識の役割を果たす担体を使用し、前記担体を標識として検出する場合、前記検出工程は、例えば、前記第２の複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体を検出する工程ともいえる。
【００５１】
前記標識の検出方法は、特に制限されず、例えば、前記標識の種類に応じて適宜決定できる。前記標識は、前述のように、例えば、前記標識に由来する発色、発光、蛍光等のシグナルの検出により行うことができる。前記シグナルの検出は、例えば、目視で行ってもよいし、光学的手法により行ってもよい。後者の場合、例えば、光学分析機器等を用いて、反射率、透過率、吸光度、蛍光強度等を測定してもよい。前記標識の検出は、例えば、定性でもよいし、定量でもよい。前記標識の検出により、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出でき、その結果から、間接的に、前記検体中の甲状腺ホルモンを検出できる。
【００５２】
前記複合体形成工程において、例えば、前記第２の複合体の形成量は、前記検体中の甲状腺ホルモン量に依存する。すなわち、例えば、前記検体中の甲状腺ホルモン量の増加にともなって、前記第２の複合体の形成量が相対的に減少し、前記検体中の甲状腺ホルモン量の減少にともなって、前記第２の複合体の形成量が相対的に増加する。そこで、例えば、前記第２の複合体の形成量に対応する前記標識に由来するシグナル強度と、甲状腺ホルモン量との相関関係を示す検量線を使用することによって、前記検体中の甲状腺ホルモン量を定量できる。前記検量線は、例えば、既知量の甲状腺ホルモンを用いて、同様の条件で、前記第１の複合体および前記第２の複合体を形成し、前記第２の複合体における前記標識由来のシグナル強度を検出することによって、前記甲状腺ホルモン量と前記標識のシグナル強度とから作成できる。
【００５３】
本発明の検出方法は、前記結合工程の後、すなわち、前記複合体形成工程の後、前記検出工程に先立って、さらに、前記甲状腺ホルモン固定化担体と結合した前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を回収する工程を含むことが好ましい。前記回収工程は、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体との複合体、すなわち、前記第２の複合体の回収工程ともいえる。前記第２の複合体を回収することによって、例えば、前記第２の複合体を、前記第１の複合体および未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体等から分離できる。これによって、例えば、前記第１の複合体の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識および未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識の検出を排除し、前記第２の複合体の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識をより正確に検出できる。
【００５４】
前記第２の複合体の回収方法は、特に制限されず、例えば、前記担体の種類に応じて適宜設定できる。前記第２の複合体は、例えば、前記反応液から回収できる。前記回収方法は、例えば、前記第２の複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体を捕捉する方法、遠心処理、ろ過処理、沈殿処理、膜分離処理、吸着処理等があげられる。前記担体が前記磁性材料から形成されている場合、例えば、磁石等の磁力によって、前記第２の複合体を回収できる。
【００５５】
本発明の検出方法は、例えば、前記第２の複合体を回収した後、さらに前記第２の複合体を洗浄する工程を含んでもよい。これによって、例えば、前記第２の複合体を含む画分に、前記第１の複合体および前記未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を含まれている場合、これを十分に除去できる。
【００５６】
本発明の検出方法は、前述のような標識の役割を果たす担体を使用し、前記第２の複合体における前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体を前記標識として検出する場合、前記抗甲状腺ホルモン抗体として、例えば、容器およびプレート等の基板に固定化された前記抗甲状腺ホルモン抗体を使用してもよい。この場合、本発明の検出方法は、例えば、前記結合工程の後、すなわち、前記複合体形成工程の後、前記検出工程に先立って、さらに、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体を洗浄する工程を含むことが好ましい。前記洗浄によって、例えば、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体に結合しなかった成分が除去される。このため、例えば、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体に結合しなかった前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体の検出を排除し、前記固定化抗甲状腺ホルモン抗体に結合した前記甲状腺ホルモン固定化担体の前記担体を、標識としてより正確に検出できる。
【００５７】
以下に、本発明の検出方法について、前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体として磁性粒子を使用し、前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識として酵素を使用する例をあげて説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
【００５８】
まず、液体の検体と前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体とを混合し、この反応液中で、前記検体中の甲状腺ホルモンと前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体とを結合させ、前記第１の複合体を形成する。
【００５９】
反応ｐＨは、例えば、４〜１１であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜８である。反応温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃ある。反応時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜２０分であり、より好ましくは５〜１０分である。前記反応液１ｍＬあたりの前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の添加量は、例えば、０．０５〜５μｇであり、好ましくは０．１〜１μｇである。
【００６０】
つぎに、前記反応液に、前記甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬を添加する。前記液体試薬は、ｐＨ８．７〜１１．５の条件下で保存した本発明の液体試薬を使用する。そして、前記反応液中で、前記検体中の甲状腺ホルモンと結合しなかった未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体とを結合させ、前記第２の複合体を形成する。
【００６１】
反応ｐＨは、例えば、４〜１１であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜８である。反応温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃ある。反応時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜２０分であり、より好ましくは５〜１０分である。前記反応液１ｍＬあたりの前記甲状腺ホルモン固定化担体の添加量は、例えば、０．００１〜５ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１ｍｇである。
【００６２】
そして、前記磁石を使用し、磁力によって、前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記第２の複合体を回収し、保持する。この際、前記反応液が入った容器の外部に磁石を配置し、前記容器の壁を介して前記第２の複合体を回収することが好ましい。このように、前記第２の複合体を保持した状態で、前記容器内の反応液を除去する。これによって、未反応の前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体を除去できる。この分離方法は、一般に、結合（Ｂ）／遊離（Ｆ）分離と呼ばれる。
【００６３】
つぎに、磁力を解放して、新たな反応液中に前記第２の複合体を添加する。前記反応液には、例えば、前記第２の複合体の添加前または添加後に、前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識酵素に対する基質を添加することが好ましい。前記基質の種類は、例えば、前記標識酵素の種類に応じて適宜決定できる。前記反応液の条件は、例えば、前記標識酵素および前記基質の種類に応じて適宜決定できる。
【００６４】
前記反応液において、前記第２の複合体における前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の前記標識酵素の酵素反応を行い、酵素反応により生じるシグナルの強度を測定する。前記反応条件は、特に制限されず、反応ｐＨは、例えば、４〜１２であり、好ましくは６〜１１であり、より好ましくは８〜１０である。反応温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃ある。反応時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜２０分であり、より好ましくは５〜１０分である。
【００６５】
そして、予め作成した、甲状腺ホルモンの量とシグナル強度との相関関係を示す検量線から、前記検体中の甲状腺ホルモンの量を決定する。
【００６６】
また、前記標識化抗甲状腺ホルモン抗体の標識として前記遷移金属錯体を使用した場合は、例えば、以下のように検出できる。特に示さない限り、前述と同様である。
【００６７】
前記遷移金属錯体は、例えば、電気エネルギーの供与によって、電気化学的に発光する。このため、例えば、前述のように分離した前記第２の複合体に対して、電気エネルギーを供与することによって、前記遷移金属錯体を発光させ、この発光シグナルの検出により、前記標識である遷移金属錯体を検出すれば、この測定結果に基づいて、前記検体中の甲状腺ホルモンを検出できる。
【００６８】
前記遷移金属錯体を使用する場合、前述のように電気エネルギーを供与するため、電極上で、前記第２の複合体に、電気エネルギーを供与することが好ましい。前記電極は、例えば、作用極があげられる。
【００６９】
前記遷移金属錯体は、例えば、ルテニウム錯体が好ましく、中でも、前述のようなルテニウム錯体が好ましい。前記標識として前記遷移金属錯体を使用する場合、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）を併用することが好ましい。このようにＴＰＡを併用することによって、以下のように、前記第２の複合体から発光を生じさせることができる。まず、前記電極にプラス電位を与えることによって、前記第２の複合体におけるルテニウム錯体は、２価から３価に酸化され、同時に、前記ＴＰＡも酸化される。酸化された前記ＴＰＡは、脱水素によりＴＰＡラジカルに変換され、前記３価のルテニウム錯体を還元し、励起状態である２価のルテニウム錯体に変化させる。そして、ルテニウム錯体が、不安定な励起状態から安定な２価の状態に遷移する際、発光する。安定な状態に戻った２価のルテニウム錯体は、再度、プラス電位を与えることで、以上の励起発光が繰り返し行われる。
【００７０】
＜甲状腺ホルモンの検出キット＞
本発明の甲状腺ホルモンの検出キットは、前記本発明の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬、および、抗甲状腺ホルモン抗体を含み、前記本発明の検出方法に使用することを特徴とする。本発明の検出キットは、例えば、前述した本発明の液体試薬および本発明の検出方法の説明を引用できる。前記検出キットは、前記甲状腺ホルモン固定化担体を試薬として含むため、例えば、従来のような前記３試薬系と比較して、試薬数が少なく、低コストである。
【００７１】
本発明の検出キットにおいて、前記抗甲状腺ホルモン抗体は、例えば、前述のように、ドライの形態でもよく、ウェットの形態でもよいが、例えば、取り扱いが容易であることから、前述のような液体試薬であることが好ましい。本発明の検出キットにおいて、前記抗甲状腺ホルモン抗体および前記甲状腺ホルモン固定化担体は、それぞれ別個の容器に収容されていることが好ましい。前記検出キットは、例えば、さらに使用説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００７２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【００７３】
［実施例１］
本例では、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬を調製し、保存安定性を評価した。
【００７４】
（１）甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の調製
Ｌ−チロキシン（ナカライテスク社製）をビオチン化して、ビオチン化Ｔ４を得た。前記ビオチン化は、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社製）を使用し、その取り扱い説明書に準じて行った。そして、前記ビオチン化Ｔ４とストレプトアビジン被覆磁性微粒子（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の商品名Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅＴＭＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１）とを混合し、前記ストレプトアビジン被覆磁性微粒子のストレプトアビジンに、前記ビオチン化Ｔ４のビオチンを結合させ、Ｔ４が固定化されたＴ４固定化磁性粒子を得た。前記ビオチンとストレプトアビジンとの結合は、トリス緩衝液溶媒中、３７℃、６０分、ｐＨ７．４の条件で行った。前記溶媒中における前記ビオチン化Ｔ４と前記ストレプトアビジン被覆磁性微粒子との添加割合は、総ストレプトアビジン量に対して過剰量のビオチン化Ｔ４とした。
【００７５】
下記緩衝液１に、５０μｇ／ｍＬとなるように前記Ｔ４固定化磁性粒子を混合し、ｐＨが異なる液体試薬を調製した。前記液体試薬のｐＨは、それぞれ、８．７、８．８、９．０、９．２、９．４、９．５、１０．５とした。下記緩衝液２に、５０μｇ／ｍＬとなるように前記Ｔ４固定化磁性粒子を混合し、ｐＨが異なる液体試薬を調製した。前記液体試薬のｐＨは、それぞれ、７．０、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６とした。ｐＨ８．７〜１０．５の前記液体試薬を、実施例１の液体試薬、ｐＨ７．０〜８．６の試薬を、比較例１の液体試薬とした。
【００７６】
（緩衝液１：ｐＨ８．７〜１０．５）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．１％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ３
（緩衝液２：ｐＨ７．０〜８．６）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．１％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ３
【００７７】
（２）競合的酵素免疫測定による甲状腺ホルモンの測定
抗Ｔ４マウスモノクローナル抗体を酵素で標識して、酵素標識抗体を得た。前記酵素標識化は、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品名、同仁化学研究所社製）を使用し、その取り扱い説明書に準じて行った。そして、下記緩衝液３に、０．２μｇ／ｍＬとなるように前記酵素標識抗体を混合し、酵素標識抗体液を調製した。
【００７８】
（緩衝液３：ｐＨ７．０）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．１％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ３
０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＺｎＣｌ２
５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２
【００７９】
前記検体として、遊離Ｔ４濃度が既知であるヒト血清（ｎ＝２）を使用した。前記酵素標識抗体液１００μＬと前記検体１０μＬとを、１．５ｍＬチューブ（商品コードＭＣＴ−１５０−Ｌ−Ｃ、Ａｘｙｇｅｎ社製）内で混合し、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、前記混合液に、前記実施例１または前記比較例１の液体試薬１００μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベートした。そして、前記チューブの外壁に磁石を配置し、磁力によって、前記混合液中の前記Ｔ４固定化磁性粒子を前記チューブの内壁側に捕獲し、この状態で、前記チューブ内の液体を除去した。ついで、前記磁力を解放し、前記チューブ内に洗浄液を添加し、前記Ｔ４固定化磁性粒子と混合した。この洗浄工程を３回行った。前記洗浄液は、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を０．０５％含むトリス緩衝液を使用した。再度、前記Ｔ４固定化磁性粒子を捕獲して、前記チューブ内の液体を除去し、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ４−メチルウンベリフェリルリン酸液５００μＬを添加して、前記Ｔ４固定化磁性粒子と混合した後、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、前述と同様にして、前記Ｔ４固定化磁性粒子を捕獲し、前記チューブ内の液体を回収した。前記液体に、２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ ５０μＬを添加した後、生成された４−メチルウンベリフェリルの蛍光強度を測定（測定波長：４５０ｎｍ）した。測定は、二回行い、その平均値を測定値とした。
【００８０】
（３）保存安定性の評価
前記実施例１および前記比較例１の液体試薬を、それぞれ、３７℃で７日間保存した。そして、保存開始前（０日）、および、保存開始から７日後における各液体試薬について、前記（２）に示す競合的酵素免疫測定を行い、検体中の遊離Ｔ４を測定した。
【００８１】
そして、保存開始前の液体試薬を用いた測定値（Ｘ０）および７日間保存後の液体試薬を用いた測定値（Ｘ７）を、下記式（Ｉ）に代入して、前記Ｔ４固定化磁性粒子の活性の残存率（％）を求めた。
活性の残存率（％）＝（Ｘ７／Ｘ０）×１００ （Ｉ）
【００８２】
下記表１に、前記液体試薬のｐＨと前記活性の残存率との関係を示す。表１に示すように、ｐＨを８．７以上に設定した実施例１の液体試薬は、ｐＨを８．７未満に設定した比較例１の液体試薬と比較して、保存後の活性の残存率が高かった。この結果から、液体試薬のｐＨを８．７以上に設定することにより、液体状態でのＴ４固定化磁性粒子の安定性が向上することがわかった。
【００８３】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上のように、本発明によれば、前記液体試薬のｐＨを前記所定の範囲とすることで、前記甲状腺ホルモン固定化担体を安定化できるため、例えば、前記甲状腺ホルモン固定化担体を長期間保存できる。このため、本発明によれば、例えば、従来のように、測定の度に、甲状腺ホルモン固定化担体を調製する必要がなく、低コストで、簡便且つ短時間で甲状腺ホルモンを測定できる。したがって、本発明は、臨床検査等において、極めて有用である。なお、本発明は、臨床検査のみに限定されず、例えば、生化学等の広い分野における甲状腺ホルモンの検出に適用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、
前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬。
【請求項２】
前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１０．５の範囲である、請求項１記載の液体試薬。
【請求項３】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、ビオチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合により、甲状腺ホルモンが固定化された担体である、請求項１または２記載の液体試薬。
【請求項４】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、アビジン固定化担体またはストレプトアビジン固定化担体とビオチン化甲状腺ホルモンとの複合体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の液体試薬。
【請求項５】
前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体が、磁性粒子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の液体試薬。
【請求項６】
前記甲状腺ホルモンが、チロキシン（Ｔ４）または３，３’，５−Ｌ−トリヨードチロニン（Ｔ３）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の液体試薬。
【請求項７】
甲状腺ホルモン固定化担体を含む溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１１．５に設定することを特徴とする、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法。
【請求項８】
前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１０．５に設定する、請求項７記載の安定化方法。
【請求項９】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、ビオチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合により、甲状腺ホルモンが固定化された担体である、請求項７または８記載の安定化方法。
【請求項１０】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、アビジン固定化担体またはストレプトアビジン固定化担体とビオチン化甲状腺ホルモンとの複合体である、請求項７から９のいずれか一項に記載の安定化方法。
【請求項１１】
前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体が、磁性粒子である、請求項７から１０のいずれか一項に記載の安定化方法。
【請求項１２】
溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化工程を含み、前記安定化工程が、請求項７から１１のいずれか一項に記載の安定化方法によって実施されることを特徴とする、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法。
【請求項１３】
抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび請求項１から６のいずれか一項に記載の液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程、および、
前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、甲状腺ホルモンの検出方法。
【請求項１４】
前記結合工程が、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとの第１の複合体、および、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体との第２の複合体を形成させる複合体形成工程である、請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
前記複合体形成工程が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）のいずれかの工程である、請求項１４記載の検出方法。
（Ａ１）反応液において、前記検体、前記抗甲状腺ホルモン抗体および前記液体試薬を同時に接触させて、前記第１の複合体および前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ２）反応液において、前記検体および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第１の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記液体試薬を添加して、前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ３）反応液において、前記液体試薬および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第２の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記検体を添加して、前記第１の複合体を形成する複合体形成工程
【請求項１６】
さらに、前記甲状腺ホルモン固定化担体と結合した前記抗甲状腺ホルモン抗体を回収する工程を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬、および、抗甲状腺ホルモン抗体を含み、
請求項１３から１６のいずれか一項に記載の検出方法に使用することを特徴とする、甲状腺ホルモンの検出キット。
【請求項１】
甲状腺ホルモン固定化担体および溶媒を含み、
前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１１．５の範囲であることを特徴とする、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬。
【請求項２】
前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨが、ｐＨ８．７〜１０．５の範囲である、請求項１記載の液体試薬。
【請求項３】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、ビオチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合により、甲状腺ホルモンが固定化された担体である、請求項１または２記載の液体試薬。
【請求項４】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、アビジン固定化担体またはストレプトアビジン固定化担体とビオチン化甲状腺ホルモンとの複合体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の液体試薬。
【請求項５】
前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体が、磁性粒子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の液体試薬。
【請求項６】
前記甲状腺ホルモンが、チロキシン（Ｔ４）または３，３’，５−Ｌ−トリヨードチロニン（Ｔ３）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の液体試薬。
【請求項７】
甲状腺ホルモン固定化担体を含む溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１１．５に設定することを特徴とする、溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化方法。
【請求項８】
前記甲状腺ホルモン固定化担体を含む前記溶媒のｐＨを、ｐＨ８．７〜１０．５に設定する、請求項７記載の安定化方法。
【請求項９】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、ビオチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプトアビジン結合により、甲状腺ホルモンが固定化された担体である、請求項７または８記載の安定化方法。
【請求項１０】
前記甲状腺ホルモン固定化担体が、アビジン固定化担体またはストレプトアビジン固定化担体とビオチン化甲状腺ホルモンとの複合体である、請求項７から９のいずれか一項に記載の安定化方法。
【請求項１１】
前記甲状腺ホルモン固定化担体の担体が、磁性粒子である、請求項７から１０のいずれか一項に記載の安定化方法。
【請求項１２】
溶媒中の甲状腺ホルモン固定化担体の安定化工程を含み、前記安定化工程が、請求項７から１１のいずれか一項に記載の安定化方法によって実施されることを特徴とする、甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬の製造方法。
【請求項１３】
抗甲状腺ホルモン抗体に、検体中の甲状腺ホルモンおよび請求項１から６のいずれか一項に記載の液体試薬の甲状腺ホルモン固定化担体を競合的に結合させる結合工程、および、
前記甲状腺ホルモン固定化担体と前記抗甲状腺ホルモン抗体との複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、甲状腺ホルモンの検出方法。
【請求項１４】
前記結合工程が、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記検体中の甲状腺ホルモンとの第１の複合体、および、前記抗甲状腺ホルモン抗体と前記甲状腺ホルモン固定化担体との第２の複合体を形成させる複合体形成工程である、請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
前記複合体形成工程が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）のいずれかの工程である、請求項１４記載の検出方法。
（Ａ１）反応液において、前記検体、前記抗甲状腺ホルモン抗体および前記液体試薬を同時に接触させて、前記第１の複合体および前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ２）反応液において、前記検体および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第１の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記液体試薬を添加して、前記第２の複合体を形成する複合体形成工程
（Ａ３）反応液において、前記液体試薬および前記抗甲状腺ホルモン抗体を接触させて、前記第２の複合体を形成し、さらに、前記反応液に、前記検体を添加して、前記第１の複合体を形成する複合体形成工程
【請求項１６】
さらに、前記甲状腺ホルモン固定化担体と結合した前記抗甲状腺ホルモン抗体を回収する工程を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬、および、抗甲状腺ホルモン抗体を含み、
請求項１３から１６のいずれか一項に記載の検出方法に使用することを特徴とする、甲状腺ホルモンの検出キット。
【公開番号】特開２０１２−１７７６８３（Ｐ２０１２−１７７６８３Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７３４０（Ｐ２０１２−１７３４０）
【出願日】平成２４年１月３０日（２０１２．１．３０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１月３０日（２０１２．１．３０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
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