甲虫類ルシフェラーゼ
【課題】 高いルシフェラーゼ活性および適切なＫＭ値を有する変異型甲虫類ルシフェラーゼおよびそれを利用した優れた細胞内ＡＴＰ濃度測定方法を提供する。
【解決手段】 酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【解決手段】 酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲虫類ルシフェラーゼおよびそれを利用したＡＴＰ濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲虫類ルシフェラーゼタンパク質は、ホタル、鉄道虫、ヒカリコメツキ等の甲虫類が持つ発光タンパク質である。甲虫類ルシフェラーゼタンパク質は、Ｄ−ルシフェリン、酸素分子およびＡＴＰを基質として、電子励起状態のオキシルシフェリンを生成する酸化反応を触媒する。生成された電子励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態に戻るときに可視光としてエネルギーを放出する。なお、本願では、甲虫類ルシフェラーゼタンパク質を総称して「ルシフェラーゼ」と呼ぶ場合があり、また、ルシフェラーゼが触媒する酸化反応および引き続き起こるオキシルシフェリンの化学発光をあわせた一連の反応に対して「ルシフェラーゼ活性」または「発光活性」という用語を使用する場合がある。
【０００３】
ルシフェラーゼは発光イメージングに利用さている。例えば、ルシフェラーゼを発現する細胞または組織をイメージングするための、高感度ＣＣＤカメラおよび明るい光学系を含む発光イメージング装置が現在市販されている。
【０００４】
発光イメージングは、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質による蛍光イメージングに勝る点が多い。発光イメージングは、観察の際に励起光を必要としないため、蛍光イメージングの場合に生じる蛍光分子の退色や光毒性による細胞へのダメージが無いため、数日間以上の長期間にわたって定量的な観察が可能である。また、蛍光イメージングでは生体内の様々な色素分子に由来する自家蛍光が観察の障害となるが、発光イメージングではこれが生じない。以上の点から、細胞、組織および個体といった幅広い範囲で、様々な用途に発光イメージング法が活用されている。
【０００５】
また、ルシフェラーゼは、ＡＴＰの定量的検出のために利用されている。ＡＴＰは、細胞内でのエネルギー通貨であるとともに、シグナル伝達系のリン酸化反応の基質でもあり、細胞内で非常に重要な役割を担っている。そのため、細胞内のＡＴＰ濃度の測定は細胞機能解析にとって重要である。ルシフェラーゼの濃度が一定で、試料内の基質（Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰ）のうち一方の濃度が十分に高い場合、ルシフェラーゼの発光強度は他方の基質の濃度に依存する。すなわち、恒常的に発現するプロモーターによってルシフェラーゼを発現させ、Ｄ−ルシフェリンを培地中に十分に添加することによって、細胞を生かしたままで細胞内のＡＴＰ濃度を経時的に計測することが可能となる。このような原理に基づき、高感度な光検出装置を用いることで１０−１２Ｍ程度の微量なＡＴＰを定量的に検出することが可能となっており、そのような測定を実現するための試薬キットも市販されている。
【０００６】
非特許文献１および非特許文献２には、既存のホタルルシフェラーゼを用いた、生きた細胞においてＡＴＰ濃度を測定する方法が記載されている。これらの方法でも、当該ホタルルシフェラーゼの発光強度を測定する。しかしながら、既存のホタルルシフェラーゼは、細胞内のＡＴＰ濃度ですでに飽和しており、少量のＡＴＰ濃度の変化では発光強度の変化が小さく、信頼性の高い測定を行うのが困難である。また、発光タンパク質の発光強度は蛍光タンパク質と比較して極めて弱いため、これらの方法では、鮮明な画像を取得するために長期間の露出を要するという制約が存在する。例えば、現在利用可能な、高感度ＣＣＤカメラおよび明るい光学系を備えた発光顕微鏡システム（オリンパス製ＬＶ２００等）を用いても、細胞内のルシフェラーゼの微弱な発光を画像として取得するには、典型的に数分の露光時間を要する。外部刺激に対する細胞内ＡＴＰ濃度変化の応答時間は、培地に呼吸系の阻害剤を添加した場合等の極端な例で２分程度と報告されている（非特許文献３）。この点から、細胞内ＡＴＰ濃度変化を経時的に精度良く測定するためには、露光時間を現在の数分のオーダーからさらに伸ばすことは望ましくない。また、現在の市販の高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製ＩｍａｇＥＭ等）の量子効率がルシフェラーゼの発光波長帯において９０％以上に達していることから、大きなブレークスルーが無い限り測定装置の改良によって現在の露光時間を大幅に短縮することは望めない。そのため、例えば発光イメージングによって細胞内ＡＴＰ濃度およびその時間変化を高感度に検出するためには、ルシフェラーゼ活性が高く且つＡＴＰに対する応答性が高いルシフェラーゼが必要である。
【０００７】
ルシフェラーゼ活性およびＡＴＰに対する応答性は、酵素学的パラメータを用いて議論される。すなわち、ルシフェラーゼの活性は、ミカエリス−メンテンのモデルに基づいて解析される。Ｄ−ルシフェリンの濃度が十分に高く、反応開始時のＡＴＰ濃度が［ＡＴＰ］０であるとき、初期反応速度ｖ０は、
【０００８】
【数１】
と表すことができる。ここで、ＫＭはＡＴＰに対するミカエリス定数である。また、ｖ０は、発生する光子数、すなわち発光強度と比例関係にある。Ｖｍａｘは、ルシフェラーゼの濃度［ＬＵＣ］ｔｏｔａｌに比例する。すなわち、
【０００９】
【数２】
という関係が成り立つ。ここで、［ＬＵＣ］ｔｏｔａｌと表記したのは、ＡＴＰと結合したルシフェラーゼと結合していないルシフェラーゼとを区別せずに、反応系に存在するすべてのルシフェラーゼの濃度であることを示すためである。ｋｃａｔは、基質が十分に存在する時の、ルシフェラーゼの単位時間および単位濃度あたりの発光活性に対応しており、「ルシフェラーゼの明るさ」と考えることができる。
【００１０】
図１は、ＫＭが異なる２つのルシフェラーゼについて、発光強度とＡＴＰ濃度との関係を式１から求めてプロットしたものである。図１中に示される縦軸に平行な２本の破線は、それぞれの曲線のＫＭを表す線である。すなわち、左の破線が実線からなる曲線についてのＫＭを表し、右の破線が破線からなる曲線についてのＫＭを表す。図１からわかるように、ルシフェラーゼの発光強度は、ＡＴＰ濃度が上昇するに従って急速に上昇する。ＡＴＰ濃度がＫＭに比べて低濃度のとき、ＡＴＰ濃度と発光強度とは比例に近い関係を示している。しかし、ＡＴＰ濃度がＫＭよりも大きくなると、ＡＴＰ濃度の変化量に対して発光強度の変化量は小さくなる。例えば、ＡＴＰ濃度がＫＭの値の３倍に達すると、ルシフェラーゼの発光強度はすでに最大発光強度の７５％に達しており、ＡＴＰ濃度がそれ以上に上昇しても発光強度の変化は小さい。このような濃度範囲では、ＡＴＰ濃度を測定することが困難となる。
【００１１】
以上より、ルシフェラーゼ活性が高く且つＡＴＰに対する応答性が高いというルシフェラーゼの好ましい条件は、ｋｃａｔが可能な限り大きく且つＫＭの値を３倍した値が測定したいＡＴＰ濃度範囲より大きいという条件に言い換えることができる。
【００１２】
生体組織中のＡＴＰ濃度は、その由来となった臓器および動物種によって違いがあるものの、ヒトの場合約２．１ｍＭであると報告されており（非特許文献４）、培養細胞については１〜１．３ｍＭとの報告がある（非特許文献２および非特許文献５）。したがって、上述したＫＭの条件を考慮すれば、これらの細胞のＡＴＰ濃度の測定に適したＫＭの下限値は０．３ｍＭ〜０．７ｍＭである。
【００１３】
しかしながら、現在までに報告されている野生型甲虫類ルシフェラーゼのＫＭは０．２ｍＭよりも低い。そこで、野生型甲虫類ルシフェラーゼに変異を導入してＫＭを上昇させた変異体が作製されている（非特許文献６および特許文献１）。しかし、非特許文献６に記載される変異体では基質結合部位から５Å以内の範囲に変異が導入されており、そのほとんどにおいて発光活性（すなわちｋｃａｔの値）が大幅に低下していた。また、特許文献１にはｋｃａｔについての具体的な記載がないものの、非特許文献６の場合と同様に、変異導入部位が基質結合部位に近い部分に存在する。そのため、特許文献１に記載の変異型ルシフェラーゼにおいても、発光活性が大幅に低下していることが予想される。したがって、現在までに公知となっている野生型または変異型ルシフェラーゼを用いて、理想的なＡＴＰ濃度測定を行うことは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６２６５１７７号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ainskow, E. K. et al. (2002), Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels, Journal of Physiology, 544.2, 429-445.
【非特許文献２】Kennedy, H. J. et al. (1999), Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in single islet β-cells, Journal of Biological Chemistry, 274, 13281-13291.
【非特許文献３】Imamura, H. et al. (2009), Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 106, 15651-15656.
【非特許文献４】Traut, T. W. (1994), Physiological concentrations of purines and pyrimidines, Molecular and Cellular Biochemistry, 140, 1-22.
【非特許文献５】Zamaraeva, M. V. et al. (2005), Cells die with increased cytosolic ATP during apoptosis: a bioluminescence study with intracellular luciferase, Cell Death and Differentiation, 12, 1390-1397.
【非特許文献６】Branchini, B. R. et al. (2003), A mutagenesis study of the putative luciferin binding site residues of firefly luciferase, Biochemistry, 42, 10429-10436.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、高いルシフェラーゼ活性および適切なＫＭ値を有する変異型甲虫類ルシフェラーゼおよびそれを利用した優れた細胞内ＡＴＰ濃度測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の実施態様によれば、酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼが提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、露光時間が短縮され、且つ精度の高いＡＴＰ濃度測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＫＭが異なる２つのルシフェラーゼの触媒反応における、発光強度とＡＴＰ濃度との関係を示す図。
【図２】ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの立体構造モデルを示す図。
【図３】様々なヤエヤマヒメボタル変異型ルシフェラーゼにおける、ＫＭとｋｃａｔとの関係を示す図。
【図４】ＧＬ３ルシフェラーゼおよびその変異体の発光強度のＡＴＰ濃度依存性およびミカエリス−メンテンのモデルによる解析結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一態様は、酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼである。そのような、変異型甲虫類ルシフェラーゼでは、タンパク質の立体構造において、基質結合部位から５Å以上離れた部位に変異が導入されていてよい。さらに、変異が導入されている前記部位は、変異導入前において、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基であってよい。
【００２１】
（発明に至る経緯）
まず、本発明者が本発明に至った経緯を説明する。
上述のように、非特許文献６では、基質結合部位付近に変異を導入した結果、ＡＴＰに対するＫＭが上昇すると同時にｋｃａｔが低下、あるいはＤ−ルシフェリンに対するＫＭが上昇している。本発明者は、このような現象について、基質結合部位付近に変異を導入することで基質が反応に好ましい配置を採ることを妨げられ、ＡＴＰに対するＫＭを上昇させるという好ましい変化と同時に、発光活性（ｋｃａｔ）の低下およびＤ−ルシフェリンに対するＫＭの上昇が起こったと考察した。
【００２２】
一方、本発明者は、ルシフェラーゼは、高効率に発光するために、すなわち反応効率を上げるために、ＡＴＰおよびルシフェリンといった基質を活性部位に集めるように進化してきたと仮定した。例えば、ルシフェラーゼ表面に接触したＡＴＰおよびルシフェリンを反応の場となる活性部位に向けて集約する機構を有していると考えた。そのような機構を実現するため、分子の表面且つ活性部位（すなわち基質結合部位）から離れた位置に、ＡＴＰとの結合に適した部位（例えばアミノ酸残基の側鎖）が存在すると考えた。そして、このような仮定が正しければ、この部位に変異を導入することで、ＡＴＰを取り込む効率（すなわちＫＭの値）を下げることができ、同時に活性部位に到達した基質同士の反応の進行は野生型と同程度に維持できる（すなわち高いｋｃａｔが得られる）と考えた。
【００２３】
ＡＴＰは生理的な溶液中でＭｇＡＴＰ２−として存在し、負電荷を帯びている。そのため、上記のＡＴＰが好む側鎖として、正電荷を帯びた塩基性アミノ酸残基の側鎖、例えばアルギニンおよびリジンの側鎖を検討した。また、このようなアミノ酸残基のタンパク質立体構造上の位置は、タンパク質の表面であって、基質が結合するくぼみを中心とする側の半球に位置すると予想した。
【００２４】
ホタルルシフェラーゼの立体構造は、北米ボタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）（Conti E. et al. (1996), Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes, Structure, 4, 287-298）およびゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）（Nakatsu, T. et al. (2006), Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence, Nature, 440, 372-376）について報告されている。北米ボタルルシフェラーゼとゲンジボタルルシフェラーゼは、アミノ酸配列上では６８％の相同性を有するが、フレキシブルなリンカーで繋がれた２つの主要なドメイン同士の位置関係を除き、これらのホタルルシフェラーゼの構造は良く一致している。このことから、フォールドおよびドメイン構造等の全体的な構造については、甲虫類ルシフェラーゼにおいて共通していると推測される。
【００２５】
本発明者は、基質アナログと結合した結晶構造が既知であるゲンジボタルルシフェラーゼの立体構造をテンプレートとして、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ（ＹａｅＬＵＣ）の構造モデルを作製し（図２）、その構造モデルをもとに、上述のようなＡＴＰ結合部位を探索した。ＹａｅＬＵＣは、秋吉らによってヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｙａｙｅｙａｍａｎａ）からクローニングされたホタルルシフェラーゼ（配列番号１）であり（国際公開第２００９／０７５３０６号）、北米ボタルルシフェラーゼとの間で６６％、ゲンジボタルルシフェラーゼとの間で８１％の相同性を有している。この点に着目し、相同性に基づく構造モデルの構築および基質近傍のアミノ酸残基の位置の特定のために利用した。
【００２６】
以上のような戦略のもと、本発明者が、様々な部位に対する変異体を設計および作製し、ＡＴＰに対する親和性および発光活性を調べた結果、本発明者の予想通り、ＡＴＰに対する親和性が低下し、同時に発光活性が高く維持された変異型ルシフェラーゼを得ることができた。例えば、ＹａｅＬＵＣの４４７位のリジン（Ｋ４４７）、５３５位のリジン（Ｋ５３５）または５３８位のアルギニン（Ｒ５３８）を、中性または酸性のアミノ酸残基に置換した変異体は、発光活性（ｋｃａｔ値）が野生型に対して５０％以上の高い値を維持しつつ、ＡＴＰに対するＫＭ値は０．３ｍＭ以上となった。
【００２７】
変異を導入したこれらの部位は、構造モデル上で基質結合部位（ＡＴＰが存在する部位）から５Å以上離れて位置しており（図２）、ＡＴＰとルシフェリンとの反応およびその後の発光を直接には阻害しないことが合理的に理解される。また、これらの変異を組み合わせた多重変異体では、発光活性を高く維持し且つＡＴＰに対するＫＭを下げるという効果が相乗的に得られることがわかった。
【００２８】
（変異型甲虫類ルシフェラーゼ）
次に、本発明の態様について説明する。
本発明の一態様は、酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼである。
【００２９】
本発明の一態様に係るルシフェラーゼは甲虫類に由来する。甲虫類とは甲虫綱コウチュウ目に分類される昆虫の総称であり、例えば、ホタル（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）科、フェンゴディダエ（Ｐｈｅｎｇｏｄｉｄａｅ）科またはコメツキムシ（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄａｅ）科に属する昆虫である。ホタル科に属する昆虫とは、例えば、ヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｙａｙｅｙａｍａｎａ）、ゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）、ヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、北米ボタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）である。フェンゴディダエ科に属する昆虫とは、例えば、鉄道虫（Ｐｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘ ｈｉｒｔｕｓ）である。コメツキムシ科に属する昆虫とは、例えば、ヒカリコメツキ（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）である。
【００３０】
本発明の一態様に係るルシフェラーゼは、変異型ルシフェラーゼである。すなわち、既知の野生型甲虫類ルシフェラーゼもしくはその変異体または新規に同定された野生型甲虫類ルシフェラーゼもしくはその変異体に対して変異を導入することで得られるルシフェラーゼである。既知の野生型甲虫類ルシフェラーゼまたはその変異体は、市販されているルシフェラーゼであってよい。ここにおいて、変異とは、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失もしくは付加等またはこれらの組み合わせを意味する。この変異は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、１つのアミノ酸残基に生じた変異であってよく、２つのアミノ酸残基に生じた変異であってよく、３つのアミノ酸残基に生じた変異であってよく、または４以上のアミノ酸残基に生じた変異であってよい。複数のアミノ酸残基における変異は、連続したアミノ酸残基に生じたものであっても、互いに離れたアミノ酸残基に生じたものであってもよい。変異型ルシフェラーゼは、その野生型ルシフェラーゼとの間で、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有してよい。
【００３１】
そのような変異は、関連する技術分野において一般的な方法によって導入されたものであってよい。例えば、ルシフェラーゼタンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入することで得られたものであってよい。そのような導入方法の例は、変異を導入したいルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡにおいて、変異を導入しようとするアミノ酸配列に対応する核酸に変異を導入するという方法である。ＤＮＡにおける変異の導入は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の市販のキット類を用いて容易に行うことが出来る。変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼ全長に対応するものであってよく、または野生型ルシフェラーゼの一部を欠損したタンパク質に対応するものであってもよい。また、変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼ以外のタンパク質の一部または全部を含んでよい。例えば、変異型ルシフェラーゼが、野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質とその他のタンパク質に由来するタンパク質とが融合したタンパク質であってよい。
【００３２】
本発明の一態様のルシフェラーゼにおいて、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭは０．３ｍＭ以上であり、好ましくは０．７ｍＭ以上である。ここにいう、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭとは、ルシフェラーゼによって触媒されるＡＴＰとルシフェリンとの反応において、ルシフェリンが十分に存在している場合に、ＡＴＰ濃度と反応速度との関係を示すミカエリス−メンテン式におけるＫＭである。すなわち、以下の式３に示されるミカエリス−メンテン式におけるＫＭである。
【００３３】
【数３】
この式において、ｖは反応速度または発光強度を意味し、［ＡＴＰ］はＡＴＰ濃度を意味する。また、ＶｍａｘはＡＴＰが十分量存在するときの反応速度を意味する。図１は、この式から算出されるＡＴＰ濃度と反応速度との関係を、ＡＴＰ濃度を横軸とし発光強度を縦軸としてプロットしたものである。この図には、Ｖｍａｘは同一であるが、ＫＭが異なる２つの曲線が示される。すなわち、これらの曲線のＫＭは、一方が０．１ｍＭであり、他方が１．０ｍＭである。この図からわかるように、ＡＴＰ濃度の増大とともに発光強度が増大するものの、ＡＴＰ濃度が一定値を超えると発光強度が飽和してしまい、ほとんど増大しなくなる。このように発光強度が飽和した範囲では、ＡＴＰ濃度を測定することが困難であり、発光強度が飽和する前の範囲が、ＡＴＰ濃度の測定に適していることがわかる。ＫＭの異なる２つの曲線を比較した場合、ＫＭが大きいルシフェラーゼの方が測定に適した範囲（飽和前の範囲）が広いことがわかる。図１によれば、ＫＭが０．１ｍＭの場合、例えば０．５ｍＭを超えるＡＴＰ濃度の範囲にて測定を行うことは困難であるが、ＫＭが１．０ｍＭの場合には、図示される最大のＡＴＰ濃度である２．０ｍＭ付近でも測定可能であることがわかる。上述の通り、ヒトの細胞ではＡＴＰ濃度が約２．１ｍＭと報告され、培養細胞では１〜１．３ｍＭと報告されているが、ＫＭが０．３ｍＭ以上であれば１ｍＭ付近の測定に利用でき、０．７ｍＭ以上であれば２．１ｍＭ付近の測定にも利用できる。
【００３４】
本発明の一態様に係る変異型甲虫類ルシフェラーゼでは、ｋｃａｔが、野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値であり、好ましくは６０％以上である。すなわち、本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼについて、その変異導入前のルシフェラーゼとの間でｋｃａｔを比較した場合、変異型甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔが、変異導入前のルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値となる。ｋｃａｔとは、基質が十分に存在する時の、ルシフェラーゼの単位時間および単位濃度あたりの発光活性であり、次の式４を満たす。
【００３５】
【数４】
ここにおいて、［ＬＵＣ］ｔｏｔａｌとは、反応系に存在する全てのルシフェラーゼの濃度である。ｋｃａｔが発光活性の最大値Ｖｍａｘと比例することを考えれば、ｋｃａｔが５０％以上であるという特定は、変異型ルシフェラーゼの発光活性が野生型ルシフェラーゼの発光活性の５０％以上であることを意味する。また、変異型ルシフェラーゼのｋｃａｔは、野生型甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの１００％以上であってもよい。すなわち、変異型ルシフェラーゼの方が、野生型ルシフェラーゼよりも高い発光活性を示してもよい。例えば、変異型ルシフェラーゼが、ＡＴＰの応答性に関する変異に加えて、発光活性を高めるような変異を含むことで、野生型よりも強く光るルシフェラーゼであってよい。
【００３６】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼは、野生型と比較してＡＴＰに対する親和性が低いものの、発光活性を高く維持している。このようなルシフェラーゼを使用することで、既存のルシフェラーゼでは測定できない濃度範囲における測定が可能となり、また測定可能であっても発光強度が低いために実用的でない範囲における測定が可能となる。さらに、ＡＴＰ濃度の測定だけでなく、変異型甲虫類ルシフェラーゼの特性を利用した様々な応用が期待できる。
【００３７】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼは、タンパク質の立体構造において、基質結合部位から５Å以上離れた部位に変異が導入されていてよい。すなわち、当該ルシフェラーゼにおける変異の少なくとも１つが、基質結合部位から５Å以上離れた部位に存在してよい。基質結合部位とは、ＡＴＰとルシフェリンとの反応が生じるときに、ＡＴＰが安定的に配置するルシフェラーゼ内の部位のことである。換言すれば、基質結合部位は活性部位である。変異が基質結合部位から５Å以上離れた部位に存在することで、発光活性に対する悪影響を最小化し（すなわちｋｃａｔの低下を抑制し）、ＡＴＰ応答性を上げる（すなわちＫＭを大きくする）ことができる。また、変異は、基質結合部位から５Å以上離れ且つルシフェラーゼタンパク質の表面に導入されていてよい。
【００３８】
基質結合部位からの距離の算出は、例えば、基質または基質アナログとの共結晶の結晶構造が既知のルシフェラーゼを利用して行うことができる。例えば、ゲンジボタルルシフェラーゼの結晶構造が既知であるため、これが利用される（Nakatsu, T. et al. (2006), Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence, Nature, 440, 372-376）。まず、ゲンジボタルルシフェラーゼにおいて、基質結合部位から５Å以上離れた部位を特定する。次に、本発明の一態様に係るルシフェラーゼとゲンジボタルルシフェラーゼとの間のアミノ酸配列の相同性を考慮して、本発明の一態様に係るルシフェラーゼにおける５Å以上離れた部位を特定することができる。
【００３９】
あるいは、本発明の一態様に係るルシフェラーゼの構造モデルを作製し、モデル上で５Å以上離れた部位を特定することもできる。具体的には、構造既知のタンパク質との配列相同性に基づいた構造予測によって構造モデルを作製し、そのモデル上で基質結合部位との距離を算出する。構造モデルの作製には、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（http://swissmodel.expasy.org/）といったオンラインサービスを利用することが可能である。図２には、このサービスを利用して作成した野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの構造モデルを示す。この構造モデルは、ゲンジボタルルシフェラーゼと、基質アナログである５’−Ｏ−［Ｎ−（デヒドロルシフェリル）−スルファモイル］アデノシン（ＤＬＳＡ）との共結晶の構造（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｄ１Ｓ）をテンプレート構造として作成した。この構造モデルに対して、テンプレート構造におけるＤＬＳＡを重ね合わせることで、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの構造モデルにおける基質結合部位を推定することができる。
【００４０】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼにおいて、変異が導入されている部位は、変異導入前において、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基であってよい。すなわち、変異型甲虫類ルシフェラーゼは、この塩基性アミノ酸残基に対して変異を導入することで得られたルシフェラーゼであってよい。塩基性アミノ酸残基は１つである場合に限らず、複数であってもよい。ここにいう変異導入前とは、変異導入前のタンパク質が、野生型ルシフェラーゼだけでなく、既に何らかの変異が導入されているルシフェラーゼをも含むことを意味する。塩基性アミノ酸とは、例えば２つ以上のアミノ基を有することで塩基性を有したアミノ酸のことであり、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンである。なお、このような変異型甲虫類ルシフェラーゼでは、塩基性アミノ酸残基に加えて、その他の残基に変異が導入されていてもよい。
【００４１】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼにおいて、変異が導入される塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジンに相当するアミノ酸残基、５３５位のリジンに相当するアミノ酸残基または５３８位のアルギニンに相当するアミノ酸残基であってよい。すなわち、任意の甲虫類ルシフェラーゼについて、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼとの間でアミノ酸配列の相同性を検討したとき、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジン、５３５位のリジンまたは５３８位のアルギニンに相当する、任意の甲虫類ルシフェラーゼにおけるアミノ酸残基に対して変異が導入されてよい。
【００４２】
甲虫類のルシフェラーゼ同士は、一般的に相同性が高いことが知られている。例えば、ヒカリコメツキとホタルとは、分類学上の科は違うにも関わらず、ルシフェラーゼ同士では５０％程度の相同性がある。また、全ての甲虫類ルシフェラーゼ間において完全に保存されている部位が多数存在する。したがって、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの特定のアミノ酸残基（例えば４４７位のリジン残基）に相当するアミノ酸残基を、別の種に由来するルシフェラーゼにおいて特定することは技術的に容易である。
【００４３】
そのような特定は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（http://www.clustal.org/）といった既知の配列比較プログラムを用いて行うことができる。この場合、比較を行いたい２つのルシフェラーゼの配列を入力してプログラムを実行することによって、配列比較を行うことができる。ここで、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを２つの配列の１つとして入力すれば、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの特定位置の残基が、他のルシフェラーゼにおいてどの位置に対応するかを容易に特定できる。
【００４４】
あるいは、基質または基質アナログとの共結晶の結晶構造が知られているルシフェラーゼ（例えば、ゲンジボタルルシフェラーゼ（Nakatsu, T. et al. (2006), Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence, Nature, 440, 372-376））との間で配列比較を行うことによって、任意のルシフェラーゼの特定の残基が、既知のルシフェラーゼタンパク質立体構造上でどこに対応するかを特定できる。
【００４５】
図２には、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの立体構造のモデルが示される。この図には、４４７位のリジン、５３５位のリジンおよび５３８位のアルギニンが示されている。この図からわかるように、これらの残基は基質結合部位（ＤＬＳＡが位置する部位）から離れており且つタンパク質の表面付近に位置することがわかる。一方、特許文献１に開示される変異型北米ボタルルシフェラーゼでは、その２４５位および３１８位の残基に変異が導入されている。これらの位置は、相同性検索によれば、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの２４７位および３２０位に相当し、図２に示されるように基質結合部位付近に位置する。すなわち、４４７位のリジン、５３５位のリジンおよび５３８位のアルギニンという位置は、少なくとも基質結合部位からの距離に関して、既知の変異型ルシフェラーゼにおける変異導入部位と大きく異なる。
【００４６】
以下の表１に、代表的な甲虫類ルシフェラーゼにおける、ヤエヤマヒメボタルの４４７位のリジン残基、５３５位のリジン残基および５３８位のアルギニン残基に相当する残基を示す。
【００４７】
【表１】
既知の各ルシフェラーゼについて、表１に示される残基に変異を導入することで本発明の一態様に係る変異型甲虫類ルシフェラーゼを作製することができる。
【００４８】
導入する変異としては、もとのアミノ酸残基の有する電気的性質を打ち消すような変異であることが好ましい。もとのアミノ酸残基が塩基性残基であれば、その正電荷を帯びているという性質を打ち消す変異が好ましく、すなわち、その塩基性残基を酸性残基または中性残基に置換する変異であることが好ましい。ＡＴＰとの親和性を低下させるためには、すなわちＫＭを増大させるためには、塩基性残基を酸性残基に置換することがより好ましい。例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンへの置換であることが好ましい。しかしながら、測定に適したＫＭ値およびｋｃａｔ値、ルシフェラーゼの安定性等に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼは、上述したような変異を複数含んでよい。すなわち、変異が導入される塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジンに相当するアミノ酸残基、５３５位のリジンに相当するアミノ酸残基および５３８位のアルギニンに相当するアミノ酸残基から成る群から選択される２以上のアミノ酸残基であってよい。このように、複数の塩基性アミノ酸残基に対して変異が導入された変異型ルシフェラーゼでは、相乗的にＫＭが増大する。
【００５０】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼの具体的な例は、Ｋ４４７Ｅ変異体（配列番号３）、Ｋ５３５Ｄ変異体（配列番号５）、Ｋ５３５Ｅ変異体（配列番号７）、Ｋ５３５Ｎ変異体（配列番号９）、Ｒ５３８Ｅ変異体（配列番号１１）およびＫ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体（配列番号１３）である。これらはいずれも、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼにおいて特定のアミノ酸残基を置換することで得られた変異体である。すなわち、Ｋ４４７Ｅ変異体とは４４７位のリジン残基をグルタミン酸に置換した変異体であり、Ｋ５３５Ｄ変異体とは５３５位のリジン残基をアスパラギン酸に置換した変異体であり、Ｋ５３５Ｅ変異体とは５３５位のリジン残基をグルタミン酸に置換した変異体であり、Ｋ５３５Ｎ変異体とは、５３５位のリジン残基をアスパラギンに置換した変異体であり、Ｒ５３８Ｅ変異体とは、５３８位のアルギニンをグルタミン酸に置換した変異体であり、Ｋ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体とは、４４７位のリジン残基をグルタミン酸に置換し且つ５３５位のリジン残基をグルタミン酸に置換した変異体である。これらの変異体において変異を導入した４４７位、５３５位および５３８位は、図２に示されるように、基質結合部位から離れて位置する。
【００５１】
（核酸）
本発明の別の態様は、変異型甲虫類ルシフェラーゼタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。このような塩基配列は、甲虫類に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、ここに規定される塩基配列には、甲虫類に属す生物が本来有する野生型の塩基配列だけでなく、それに変異が生じた塩基配列が含まれることを意味する。また、ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および／または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００５２】
このような核酸の好ましい例は、Ｋ４４７Ｅ変異体をコードする塩基配列（配列番号４）、Ｋ５３５Ｄ変異体をコードする塩基配列（配列番号６）、Ｋ５３５Ｅ変異体をコードする塩基配列（配列番号８）、Ｋ５３５Ｎ変異体をコードする塩基配列（配列番号１０）、Ｒ５３８Ｅ変異体をコードする塩基配列（配列番号１２）またはＫ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体（配列番号１４）をコードする塩基配列を含む核酸である。
【００５３】
また、本発明のさらに別の態様はこのような核酸を含むベクターである。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。また、その他のタンパク質の遺伝子を含んでもよい。当該ベクターは、例えば発現ベクターである。
【００５４】
（形質転換体および形質導入体）
本発明の別の態様は、上述のような核酸を含む形質転換体または形質導入体である。形質転換体とは、外部から核酸を取り込んだ生物（特に細胞）を意味する。当該細胞は、本発明の一態様に係る変異型甲虫類ルシフェラーゼの遺伝子を含んだ核酸が導入され、その結果、そのような遺伝子を含む核酸を保持している。そのような細胞とは、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞であってよい。形質転換体は、関連する技術分野において一般的な方法によって作製することが可能であり、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等によって、細胞等に核酸を導入することができる。また、形質導入体とは、バクテリオファージの感染によって、外部から核酸が導入された細菌を意味する。形質導入体は、関連する技術分野において一般的な方法によって作製することが可能であり、例えば、予め目的とする核酸を保有するバクテリオファージを作製し、それを細菌に感染させることで導入することができる。そのような細菌とは、例えば大腸菌である。
【００５５】
（製造方法）
本発明の別の態様は、変異型甲虫類ルシフェラーゼの製造方法である。当該製造方法は、上述のような形質転換体もしくは形質導入体にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる工程、または無細胞発現系にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを合成する工程を含む。形質転換体または形質導入体を用いる場合、それらをタンパク質の発現に適した条件下で培養することで変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる。その後、必要に応じて、変異型甲虫類ルシフェラーゼを精製する。これらの具体的な方法は、関連する技術分野において一般的なものを使用することができる。また、無細胞発現系においても、関連する技術分野において一般的なものを使用することができ、例えば、翻訳に必要となるリボソームやアミノ酸等を含む緩衝液に、変異体ルシフェラーゼをコードするＲＮＡを添加してルシフェラーゼを合成する。
【実施例】
【００５６】
[実施例１]
種々の変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを作製し、ＡＴＰに対する応答性および発光活性を調べた。
【００５７】
（発現ベクターの作製）
文献（Sambrook, J and Russell, D. W. (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に記載の方法に従って、ｃＤＮＡライブラリからクローニングしたヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ（ＹａｅＬＵＣ）をコードする塩基配列（配列番号２）（国際公開第２００９／０７５３０６号）を含むＤＮＡを、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイト間に挿入することで、ＹａｅＬＵＣ発現ベクターを作製した。当該発現ベクターからは、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ（配列番号１）が発現する。
【００５８】
その野生型ルシフェラーゼのＤＮＡに変異を導入して、変異型ルシフェラーゼの発現ベクターを作製した。具体的には、対象となる部位に変異を持つ一組の相補的なオリゴＤＮＡおよびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、同キットのマニュアルに示された方法に従って作製した。以下の表２に、作製した変異体、使用したオリゴＤＮＡのセット、導入された変異、得られた塩基配列およびアミノ酸配列をまとめる。
【００５９】
【表２】
なお、Ｋ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体については、Ｋ４４７Ｅ変異体の発現ベクターを作製した後、さらにＫ５３５Ｅの変異を導入することで作製した。
【００６０】
各変異体の塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および３１３０ＸＬジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して確認し、タンパク質をコードする領域に目的の変異が導入されていることおよびＰＣＲエラーに起因する意図しない変異が無いことを確認した。
【００６１】
（ルシフェラーゼタンパク質の精製）
次に、上記の通り作製した発現ベクターを用いて、大腸菌内にて変異型ルシフェラーゼタンパク質を作製した。
【００６２】
まず、上記の通り作製した各発現ベクターを、発現用の大腸菌に形質転換した。大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）のコンピテントセル５０μＬに、ルシフェラーゼ発現ベクター０．５μＬ（ＤＮＡ約１０ｎｇ）を加え、氷上に３０分間静置し、続いて４２℃の熱浴で４５秒間処理した後、再び氷上に２分間静置した。そこへＬＢ培地を０．５ｍＬ加え、３７℃で２０分間振盪培養を行った後、培養液の１００μＬを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布した。プレートを３７℃で一晩静置培養し、生じたコロニーを任意に１つ選び、２ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で１３０ｒｐｍの振盪培養を行った。４〜６時間後に目視で大腸菌の増殖が確認できた段階で２５０ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植え継ぎ、３０℃で１００ｒｐｍの振盪培養を一晩行った（１４〜１８時間）。培養終了後、４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離を行うことで、大腸菌を集菌した。得られた菌体ペーストを、２５ｍＬの洗菌バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に懸濁し、再び４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離を行った。得られた菌体（湿重量約１ｇ）を精製作業まで−８０℃で凍結保存した。
【００６３】
凍結した菌体を、１０ｍＬの破砕バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁し、サンプルを氷上に置いて超音波破砕を行った。超音波破砕は、タイテック社製超音波式ホモジナイザーＶＰ−０５０を用いて、出力パワー５０％での５秒間の処理とその後の５秒間の休止とから成るサイクルを１５分間行った。破砕後、懸濁液を３０ｍＬ遠心管に移し、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で３０分間遠心分離を行った。遠心後の上清を、破砕バッファで平衡化した０．５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に懸濁し、４℃で転倒撹拌（約６ｒｐｍ）を１時間行った。
【００６４】
次に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂懸濁液をφ１０ｍｍ×５０ｍｍのオープンカラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に注ぎ、樹脂をカラム下部に積層させた。懸濁液がすべてカラムを通過した後、１０ｍＬの破砕バッファを数回に分けてカラムに注ぎ、樹脂を洗浄した。１．２ｍＬの溶出バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）を静かにカラム上部から加え、溶出液を約１８０μＬずつ分画した。溶出後の分画は、直ちに氷上にて保存した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によって各画分のタンパク質濃度を算定し、最も濃度が濃い２〜３画分をＮｉ−ＮＴＡ溶出画分として回収した。回収画分を決定後、直ちにゲル濾過による脱塩を行った。脱塩バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＮｉ−ＮＴＡ溶出画分サンプルを供して、サンプルがすべてゲルに浸み込むまで待機した。サンプルとの合計が１ｍＬとなるように脱塩バッファを加え、バッファが浸み込むまで待機した後、１．５ｍＬの脱塩バッファを加え、溶出液を約２００μＬずつ分画した。溶出後の分画は、直ちに氷上にて保存した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法プロテインアッセイキットによって各画分のタンパク質濃度を算定し、最も濃度の濃い画分を脱塩溶出画分として回収した。溶出画分と等量の保存バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、９０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．５）を加え、−３０℃の冷凍庫で保存した。
【００６５】
（発光活性測定）
精製した各ルシフェラーゼについて発光活性を測定した。
ＡＴＰ溶液は、以下の様に調製した。ＡＴＰ二ナトリウム塩三水和物（Ｒｏｃｈｅ ＃５１９９７９）０．３ｇを３．５ｍＬの水に溶かし、ｐＨを測定しながら１Ｍ ＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨを７．０に調整した。２５９ｎｍにおける吸光度を測定し、ＡＴＰの消光係数ε＝１５４００（Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて濃度が１００ｍＭになるように水を加えて最終調整した。黒色の９６穴アッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル中に、２５μＬの基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、８００μＭ Ｄ−（−）−ルシフェリン、０〜２０ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ８．０）を入れておき、ルシフェラーゼ溶液（２μｇ／ｍＬ ルシフェラーゼ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を７５μＬ加えた時点から、発光強度を経時的に測定した。２５μＬの基質溶液に７５μＬのルシフェラーゼ溶液を加えた直後の１００μＬの反応溶液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２００μＭ Ｄ−（−）−ルシフェリン、１．５μｇ／ｍＬ（２５ｎＭ）ルシフェラーゼを含み、ＡＴＰは連続する８ウェルにそれぞれ０ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、２．５ｍＭおよび５ｍＭ含まれるように調製した。ルシフェラーゼ溶液の自動分注および発光強度の測定は、自動分注器および光電子増倍管を備えたＡＴＴＯ社製Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ ＪＮＲ−ＩＩを用いた。
【００６６】
（発光強度データの解析）
ＡＴＰに対するルシフェラーゼの酵素学的パラメータを算出するために、式３に示したミカエリス・メンテンのモデルによって発光活性データを評価した。ＫＭ値およびＶｍａｘ値の導出には、各ＡＴＰ濃度での発光強度の経時変化のピーク付近の値をｖ０として、異なるＡＴＰ濃度に対するｖ０値のデータに式３を当てはめてパラメータを導出した。式の当てはめには、レベンバーク−マーカート法による非線形最小二乗法を用いた。
【００６７】
（結果）
各変異体において求めたＫＭ値および相対ｋｃａｔ値を表３にまとめる。さらに、図３に、ＫＭを横軸とし相対ｋｃａｔを縦軸としてプロットする。図３中、横軸に平行な破線は相対ｋｃａｔ値が５０％である線を意味し、縦軸に平行な破線はＫＭ値が０．３ｍＭである線を意味する。
【００６８】
【表３】
表３および図３の結果から、各変異体のＫＭ値は野生型ルシフェラーゼと比較して増大しており、一方で、ｋｃａｔ値は野生型ルシフェラーゼと比較して高い水準に維持されていることがわかる。また、Ｋ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体は、Ｋ４４７Ｅ変異体およびＫ５３５変異体と比較してＫＭ値が増大している。このことは、変異を二重で導入することで、相乗的にＫＭ値を増大する効果が得られることを意味する。
【００６９】
［実施例２］
ＧＬ３ルシフェラーゼの変異体を作製し、ＡＴＰに対する応答性および発光活性を調べた。なお、ＧＬ３ルシフェラーゼは、北米ボタルルシフェラーゼに対して、Ｎ５０Ｄ／Ｎ１１９Ｇ／Ｓ５４８Ｉ／Ｋ５４９Ａ／Ｌ５５０Ｖの変異を導入して性質を改変したものであるから、以下の実施例は、北米ボタルルシフェラーゼ変異体に対して追加の変異を導入した実施例でもある。
【００７０】
（発現ベクターの作製）
ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターに組み込まれているルシフェラーゼをコードする遺伝子部分（配列番号２５）を実施例１と同様の方法で、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ＧＬ３発現ベクターを作製した。当該発現ベクターからは、ＧＬ３ルシフェラーゼ（配列番号２６）が発現する。
【００７１】
そのＧＬ３ルシフェラーゼのＤＮＡに変異を導入して、変異型ＧＬ３発現ベクターを作製した。具体的には、ＧＬ３のＫ４４５およびＲ５３３の部位に変異を持ち、センス鎖と相補的な二種類のオリゴＤＮＡを同時に用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって作製した。Ｋ４４５Ｅ変異導入オリゴＤＮＡ配列を配列番号２７に、Ｒ５３３Ｅ変異導入オリゴＤＮＡ配列を配列番号２８にそれぞれ示す。得られた変異型ＧＬ３の塩基配列は配列番号２９に、そのアミノ酸配列は配列番号３０に示す。
【００７２】
各変異体の塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および３１３０ＸＬジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して確認し、タンパク質をコードする領域に目的の変異が導入されていることおよびＰＣＲエラーに起因する意図しない変異が無いことを確認した。
【００７３】
（ルシフェラーゼタンパク質の精製）
上記ＧＬ３および変異型ＧＬ３発現ベクターを用いて、実施例１に記載の方法でルシフェラーゼタンパク質を作製し、精製を行った。
【００７４】
（発光活性測定）
精製したＧＬ３および変異型ＧＬ３タンパク質について、実施例１に記載の方法で発光活性を測定した。２５μＬの基質溶液に７５μＬのルシフェラーゼ溶液を加えた直後の１００μＬの反応溶液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２００μＭ Ｄ−（−）−ルシフェリン、１．５μｇ／ｍＬ（２５ｎＭ）ルシフェラーゼを含み、ＡＴＰは二列の隣り合う１６のウェルにそれぞれ０ｍＭ、０．０００２ｍＭ、０．０００５ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００２ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭおよび５ｍＭ含まれるように調製した。
【００７５】
（発光強度データの解析）
図４に、上記ＡＴＰ濃度条件におけるＧＬ３ルシフェラーゼおよびその変異体の発光強度をまとめる。また、式３を測定結果に当てはめた結果を図４の実線で示した。式の当てはめによって得られたパラメータを表４にまとめた。
【００７６】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲虫類ルシフェラーゼおよびそれを利用したＡＴＰ濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲虫類ルシフェラーゼタンパク質は、ホタル、鉄道虫、ヒカリコメツキ等の甲虫類が持つ発光タンパク質である。甲虫類ルシフェラーゼタンパク質は、Ｄ−ルシフェリン、酸素分子およびＡＴＰを基質として、電子励起状態のオキシルシフェリンを生成する酸化反応を触媒する。生成された電子励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態に戻るときに可視光としてエネルギーを放出する。なお、本願では、甲虫類ルシフェラーゼタンパク質を総称して「ルシフェラーゼ」と呼ぶ場合があり、また、ルシフェラーゼが触媒する酸化反応および引き続き起こるオキシルシフェリンの化学発光をあわせた一連の反応に対して「ルシフェラーゼ活性」または「発光活性」という用語を使用する場合がある。
【０００３】
ルシフェラーゼは発光イメージングに利用さている。例えば、ルシフェラーゼを発現する細胞または組織をイメージングするための、高感度ＣＣＤカメラおよび明るい光学系を含む発光イメージング装置が現在市販されている。
【０００４】
発光イメージングは、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質による蛍光イメージングに勝る点が多い。発光イメージングは、観察の際に励起光を必要としないため、蛍光イメージングの場合に生じる蛍光分子の退色や光毒性による細胞へのダメージが無いため、数日間以上の長期間にわたって定量的な観察が可能である。また、蛍光イメージングでは生体内の様々な色素分子に由来する自家蛍光が観察の障害となるが、発光イメージングではこれが生じない。以上の点から、細胞、組織および個体といった幅広い範囲で、様々な用途に発光イメージング法が活用されている。
【０００５】
また、ルシフェラーゼは、ＡＴＰの定量的検出のために利用されている。ＡＴＰは、細胞内でのエネルギー通貨であるとともに、シグナル伝達系のリン酸化反応の基質でもあり、細胞内で非常に重要な役割を担っている。そのため、細胞内のＡＴＰ濃度の測定は細胞機能解析にとって重要である。ルシフェラーゼの濃度が一定で、試料内の基質（Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰ）のうち一方の濃度が十分に高い場合、ルシフェラーゼの発光強度は他方の基質の濃度に依存する。すなわち、恒常的に発現するプロモーターによってルシフェラーゼを発現させ、Ｄ−ルシフェリンを培地中に十分に添加することによって、細胞を生かしたままで細胞内のＡＴＰ濃度を経時的に計測することが可能となる。このような原理に基づき、高感度な光検出装置を用いることで１０−１２Ｍ程度の微量なＡＴＰを定量的に検出することが可能となっており、そのような測定を実現するための試薬キットも市販されている。
【０００６】
非特許文献１および非特許文献２には、既存のホタルルシフェラーゼを用いた、生きた細胞においてＡＴＰ濃度を測定する方法が記載されている。これらの方法でも、当該ホタルルシフェラーゼの発光強度を測定する。しかしながら、既存のホタルルシフェラーゼは、細胞内のＡＴＰ濃度ですでに飽和しており、少量のＡＴＰ濃度の変化では発光強度の変化が小さく、信頼性の高い測定を行うのが困難である。また、発光タンパク質の発光強度は蛍光タンパク質と比較して極めて弱いため、これらの方法では、鮮明な画像を取得するために長期間の露出を要するという制約が存在する。例えば、現在利用可能な、高感度ＣＣＤカメラおよび明るい光学系を備えた発光顕微鏡システム（オリンパス製ＬＶ２００等）を用いても、細胞内のルシフェラーゼの微弱な発光を画像として取得するには、典型的に数分の露光時間を要する。外部刺激に対する細胞内ＡＴＰ濃度変化の応答時間は、培地に呼吸系の阻害剤を添加した場合等の極端な例で２分程度と報告されている（非特許文献３）。この点から、細胞内ＡＴＰ濃度変化を経時的に精度良く測定するためには、露光時間を現在の数分のオーダーからさらに伸ばすことは望ましくない。また、現在の市販の高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製ＩｍａｇＥＭ等）の量子効率がルシフェラーゼの発光波長帯において９０％以上に達していることから、大きなブレークスルーが無い限り測定装置の改良によって現在の露光時間を大幅に短縮することは望めない。そのため、例えば発光イメージングによって細胞内ＡＴＰ濃度およびその時間変化を高感度に検出するためには、ルシフェラーゼ活性が高く且つＡＴＰに対する応答性が高いルシフェラーゼが必要である。
【０００７】
ルシフェラーゼ活性およびＡＴＰに対する応答性は、酵素学的パラメータを用いて議論される。すなわち、ルシフェラーゼの活性は、ミカエリス−メンテンのモデルに基づいて解析される。Ｄ−ルシフェリンの濃度が十分に高く、反応開始時のＡＴＰ濃度が［ＡＴＰ］０であるとき、初期反応速度ｖ０は、
【０００８】
【数１】
と表すことができる。ここで、ＫＭはＡＴＰに対するミカエリス定数である。また、ｖ０は、発生する光子数、すなわち発光強度と比例関係にある。Ｖｍａｘは、ルシフェラーゼの濃度［ＬＵＣ］ｔｏｔａｌに比例する。すなわち、
【０００９】
【数２】
という関係が成り立つ。ここで、［ＬＵＣ］ｔｏｔａｌと表記したのは、ＡＴＰと結合したルシフェラーゼと結合していないルシフェラーゼとを区別せずに、反応系に存在するすべてのルシフェラーゼの濃度であることを示すためである。ｋｃａｔは、基質が十分に存在する時の、ルシフェラーゼの単位時間および単位濃度あたりの発光活性に対応しており、「ルシフェラーゼの明るさ」と考えることができる。
【００１０】
図１は、ＫＭが異なる２つのルシフェラーゼについて、発光強度とＡＴＰ濃度との関係を式１から求めてプロットしたものである。図１中に示される縦軸に平行な２本の破線は、それぞれの曲線のＫＭを表す線である。すなわち、左の破線が実線からなる曲線についてのＫＭを表し、右の破線が破線からなる曲線についてのＫＭを表す。図１からわかるように、ルシフェラーゼの発光強度は、ＡＴＰ濃度が上昇するに従って急速に上昇する。ＡＴＰ濃度がＫＭに比べて低濃度のとき、ＡＴＰ濃度と発光強度とは比例に近い関係を示している。しかし、ＡＴＰ濃度がＫＭよりも大きくなると、ＡＴＰ濃度の変化量に対して発光強度の変化量は小さくなる。例えば、ＡＴＰ濃度がＫＭの値の３倍に達すると、ルシフェラーゼの発光強度はすでに最大発光強度の７５％に達しており、ＡＴＰ濃度がそれ以上に上昇しても発光強度の変化は小さい。このような濃度範囲では、ＡＴＰ濃度を測定することが困難となる。
【００１１】
以上より、ルシフェラーゼ活性が高く且つＡＴＰに対する応答性が高いというルシフェラーゼの好ましい条件は、ｋｃａｔが可能な限り大きく且つＫＭの値を３倍した値が測定したいＡＴＰ濃度範囲より大きいという条件に言い換えることができる。
【００１２】
生体組織中のＡＴＰ濃度は、その由来となった臓器および動物種によって違いがあるものの、ヒトの場合約２．１ｍＭであると報告されており（非特許文献４）、培養細胞については１〜１．３ｍＭとの報告がある（非特許文献２および非特許文献５）。したがって、上述したＫＭの条件を考慮すれば、これらの細胞のＡＴＰ濃度の測定に適したＫＭの下限値は０．３ｍＭ〜０．７ｍＭである。
【００１３】
しかしながら、現在までに報告されている野生型甲虫類ルシフェラーゼのＫＭは０．２ｍＭよりも低い。そこで、野生型甲虫類ルシフェラーゼに変異を導入してＫＭを上昇させた変異体が作製されている（非特許文献６および特許文献１）。しかし、非特許文献６に記載される変異体では基質結合部位から５Å以内の範囲に変異が導入されており、そのほとんどにおいて発光活性（すなわちｋｃａｔの値）が大幅に低下していた。また、特許文献１にはｋｃａｔについての具体的な記載がないものの、非特許文献６の場合と同様に、変異導入部位が基質結合部位に近い部分に存在する。そのため、特許文献１に記載の変異型ルシフェラーゼにおいても、発光活性が大幅に低下していることが予想される。したがって、現在までに公知となっている野生型または変異型ルシフェラーゼを用いて、理想的なＡＴＰ濃度測定を行うことは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６２６５１７７号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ainskow, E. K. et al. (2002), Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels, Journal of Physiology, 544.2, 429-445.
【非特許文献２】Kennedy, H. J. et al. (1999), Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in single islet β-cells, Journal of Biological Chemistry, 274, 13281-13291.
【非特許文献３】Imamura, H. et al. (2009), Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 106, 15651-15656.
【非特許文献４】Traut, T. W. (1994), Physiological concentrations of purines and pyrimidines, Molecular and Cellular Biochemistry, 140, 1-22.
【非特許文献５】Zamaraeva, M. V. et al. (2005), Cells die with increased cytosolic ATP during apoptosis: a bioluminescence study with intracellular luciferase, Cell Death and Differentiation, 12, 1390-1397.
【非特許文献６】Branchini, B. R. et al. (2003), A mutagenesis study of the putative luciferin binding site residues of firefly luciferase, Biochemistry, 42, 10429-10436.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、高いルシフェラーゼ活性および適切なＫＭ値を有する変異型甲虫類ルシフェラーゼおよびそれを利用した優れた細胞内ＡＴＰ濃度測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の実施態様によれば、酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼが提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、露光時間が短縮され、且つ精度の高いＡＴＰ濃度測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＫＭが異なる２つのルシフェラーゼの触媒反応における、発光強度とＡＴＰ濃度との関係を示す図。
【図２】ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの立体構造モデルを示す図。
【図３】様々なヤエヤマヒメボタル変異型ルシフェラーゼにおける、ＫＭとｋｃａｔとの関係を示す図。
【図４】ＧＬ３ルシフェラーゼおよびその変異体の発光強度のＡＴＰ濃度依存性およびミカエリス−メンテンのモデルによる解析結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一態様は、酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼである。そのような、変異型甲虫類ルシフェラーゼでは、タンパク質の立体構造において、基質結合部位から５Å以上離れた部位に変異が導入されていてよい。さらに、変異が導入されている前記部位は、変異導入前において、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基であってよい。
【００２１】
（発明に至る経緯）
まず、本発明者が本発明に至った経緯を説明する。
上述のように、非特許文献６では、基質結合部位付近に変異を導入した結果、ＡＴＰに対するＫＭが上昇すると同時にｋｃａｔが低下、あるいはＤ−ルシフェリンに対するＫＭが上昇している。本発明者は、このような現象について、基質結合部位付近に変異を導入することで基質が反応に好ましい配置を採ることを妨げられ、ＡＴＰに対するＫＭを上昇させるという好ましい変化と同時に、発光活性（ｋｃａｔ）の低下およびＤ−ルシフェリンに対するＫＭの上昇が起こったと考察した。
【００２２】
一方、本発明者は、ルシフェラーゼは、高効率に発光するために、すなわち反応効率を上げるために、ＡＴＰおよびルシフェリンといった基質を活性部位に集めるように進化してきたと仮定した。例えば、ルシフェラーゼ表面に接触したＡＴＰおよびルシフェリンを反応の場となる活性部位に向けて集約する機構を有していると考えた。そのような機構を実現するため、分子の表面且つ活性部位（すなわち基質結合部位）から離れた位置に、ＡＴＰとの結合に適した部位（例えばアミノ酸残基の側鎖）が存在すると考えた。そして、このような仮定が正しければ、この部位に変異を導入することで、ＡＴＰを取り込む効率（すなわちＫＭの値）を下げることができ、同時に活性部位に到達した基質同士の反応の進行は野生型と同程度に維持できる（すなわち高いｋｃａｔが得られる）と考えた。
【００２３】
ＡＴＰは生理的な溶液中でＭｇＡＴＰ２−として存在し、負電荷を帯びている。そのため、上記のＡＴＰが好む側鎖として、正電荷を帯びた塩基性アミノ酸残基の側鎖、例えばアルギニンおよびリジンの側鎖を検討した。また、このようなアミノ酸残基のタンパク質立体構造上の位置は、タンパク質の表面であって、基質が結合するくぼみを中心とする側の半球に位置すると予想した。
【００２４】
ホタルルシフェラーゼの立体構造は、北米ボタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）（Conti E. et al. (1996), Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes, Structure, 4, 287-298）およびゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）（Nakatsu, T. et al. (2006), Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence, Nature, 440, 372-376）について報告されている。北米ボタルルシフェラーゼとゲンジボタルルシフェラーゼは、アミノ酸配列上では６８％の相同性を有するが、フレキシブルなリンカーで繋がれた２つの主要なドメイン同士の位置関係を除き、これらのホタルルシフェラーゼの構造は良く一致している。このことから、フォールドおよびドメイン構造等の全体的な構造については、甲虫類ルシフェラーゼにおいて共通していると推測される。
【００２５】
本発明者は、基質アナログと結合した結晶構造が既知であるゲンジボタルルシフェラーゼの立体構造をテンプレートとして、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ（ＹａｅＬＵＣ）の構造モデルを作製し（図２）、その構造モデルをもとに、上述のようなＡＴＰ結合部位を探索した。ＹａｅＬＵＣは、秋吉らによってヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｙａｙｅｙａｍａｎａ）からクローニングされたホタルルシフェラーゼ（配列番号１）であり（国際公開第２００９／０７５３０６号）、北米ボタルルシフェラーゼとの間で６６％、ゲンジボタルルシフェラーゼとの間で８１％の相同性を有している。この点に着目し、相同性に基づく構造モデルの構築および基質近傍のアミノ酸残基の位置の特定のために利用した。
【００２６】
以上のような戦略のもと、本発明者が、様々な部位に対する変異体を設計および作製し、ＡＴＰに対する親和性および発光活性を調べた結果、本発明者の予想通り、ＡＴＰに対する親和性が低下し、同時に発光活性が高く維持された変異型ルシフェラーゼを得ることができた。例えば、ＹａｅＬＵＣの４４７位のリジン（Ｋ４４７）、５３５位のリジン（Ｋ５３５）または５３８位のアルギニン（Ｒ５３８）を、中性または酸性のアミノ酸残基に置換した変異体は、発光活性（ｋｃａｔ値）が野生型に対して５０％以上の高い値を維持しつつ、ＡＴＰに対するＫＭ値は０．３ｍＭ以上となった。
【００２７】
変異を導入したこれらの部位は、構造モデル上で基質結合部位（ＡＴＰが存在する部位）から５Å以上離れて位置しており（図２）、ＡＴＰとルシフェリンとの反応およびその後の発光を直接には阻害しないことが合理的に理解される。また、これらの変異を組み合わせた多重変異体では、発光活性を高く維持し且つＡＴＰに対するＫＭを下げるという効果が相乗的に得られることがわかった。
【００２８】
（変異型甲虫類ルシフェラーゼ）
次に、本発明の態様について説明する。
本発明の一態様は、酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼである。
【００２９】
本発明の一態様に係るルシフェラーゼは甲虫類に由来する。甲虫類とは甲虫綱コウチュウ目に分類される昆虫の総称であり、例えば、ホタル（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）科、フェンゴディダエ（Ｐｈｅｎｇｏｄｉｄａｅ）科またはコメツキムシ（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄａｅ）科に属する昆虫である。ホタル科に属する昆虫とは、例えば、ヤエヤマヒメボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｙａｙｅｙａｍａｎａ）、ゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）、ヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、北米ボタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）である。フェンゴディダエ科に属する昆虫とは、例えば、鉄道虫（Ｐｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘ ｈｉｒｔｕｓ）である。コメツキムシ科に属する昆虫とは、例えば、ヒカリコメツキ（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）である。
【００３０】
本発明の一態様に係るルシフェラーゼは、変異型ルシフェラーゼである。すなわち、既知の野生型甲虫類ルシフェラーゼもしくはその変異体または新規に同定された野生型甲虫類ルシフェラーゼもしくはその変異体に対して変異を導入することで得られるルシフェラーゼである。既知の野生型甲虫類ルシフェラーゼまたはその変異体は、市販されているルシフェラーゼであってよい。ここにおいて、変異とは、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失もしくは付加等またはこれらの組み合わせを意味する。この変異は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、１つのアミノ酸残基に生じた変異であってよく、２つのアミノ酸残基に生じた変異であってよく、３つのアミノ酸残基に生じた変異であってよく、または４以上のアミノ酸残基に生じた変異であってよい。複数のアミノ酸残基における変異は、連続したアミノ酸残基に生じたものであっても、互いに離れたアミノ酸残基に生じたものであってもよい。変異型ルシフェラーゼは、その野生型ルシフェラーゼとの間で、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有してよい。
【００３１】
そのような変異は、関連する技術分野において一般的な方法によって導入されたものであってよい。例えば、ルシフェラーゼタンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入することで得られたものであってよい。そのような導入方法の例は、変異を導入したいルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡにおいて、変異を導入しようとするアミノ酸配列に対応する核酸に変異を導入するという方法である。ＤＮＡにおける変異の導入は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の市販のキット類を用いて容易に行うことが出来る。変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼ全長に対応するものであってよく、または野生型ルシフェラーゼの一部を欠損したタンパク質に対応するものであってもよい。また、変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼ以外のタンパク質の一部または全部を含んでよい。例えば、変異型ルシフェラーゼが、野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質とその他のタンパク質に由来するタンパク質とが融合したタンパク質であってよい。
【００３２】
本発明の一態様のルシフェラーゼにおいて、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭは０．３ｍＭ以上であり、好ましくは０．７ｍＭ以上である。ここにいう、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭとは、ルシフェラーゼによって触媒されるＡＴＰとルシフェリンとの反応において、ルシフェリンが十分に存在している場合に、ＡＴＰ濃度と反応速度との関係を示すミカエリス−メンテン式におけるＫＭである。すなわち、以下の式３に示されるミカエリス−メンテン式におけるＫＭである。
【００３３】
【数３】
この式において、ｖは反応速度または発光強度を意味し、［ＡＴＰ］はＡＴＰ濃度を意味する。また、ＶｍａｘはＡＴＰが十分量存在するときの反応速度を意味する。図１は、この式から算出されるＡＴＰ濃度と反応速度との関係を、ＡＴＰ濃度を横軸とし発光強度を縦軸としてプロットしたものである。この図には、Ｖｍａｘは同一であるが、ＫＭが異なる２つの曲線が示される。すなわち、これらの曲線のＫＭは、一方が０．１ｍＭであり、他方が１．０ｍＭである。この図からわかるように、ＡＴＰ濃度の増大とともに発光強度が増大するものの、ＡＴＰ濃度が一定値を超えると発光強度が飽和してしまい、ほとんど増大しなくなる。このように発光強度が飽和した範囲では、ＡＴＰ濃度を測定することが困難であり、発光強度が飽和する前の範囲が、ＡＴＰ濃度の測定に適していることがわかる。ＫＭの異なる２つの曲線を比較した場合、ＫＭが大きいルシフェラーゼの方が測定に適した範囲（飽和前の範囲）が広いことがわかる。図１によれば、ＫＭが０．１ｍＭの場合、例えば０．５ｍＭを超えるＡＴＰ濃度の範囲にて測定を行うことは困難であるが、ＫＭが１．０ｍＭの場合には、図示される最大のＡＴＰ濃度である２．０ｍＭ付近でも測定可能であることがわかる。上述の通り、ヒトの細胞ではＡＴＰ濃度が約２．１ｍＭと報告され、培養細胞では１〜１．３ｍＭと報告されているが、ＫＭが０．３ｍＭ以上であれば１ｍＭ付近の測定に利用でき、０．７ｍＭ以上であれば２．１ｍＭ付近の測定にも利用できる。
【００３４】
本発明の一態様に係る変異型甲虫類ルシフェラーゼでは、ｋｃａｔが、野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値であり、好ましくは６０％以上である。すなわち、本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼについて、その変異導入前のルシフェラーゼとの間でｋｃａｔを比較した場合、変異型甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔが、変異導入前のルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値となる。ｋｃａｔとは、基質が十分に存在する時の、ルシフェラーゼの単位時間および単位濃度あたりの発光活性であり、次の式４を満たす。
【００３５】
【数４】
ここにおいて、［ＬＵＣ］ｔｏｔａｌとは、反応系に存在する全てのルシフェラーゼの濃度である。ｋｃａｔが発光活性の最大値Ｖｍａｘと比例することを考えれば、ｋｃａｔが５０％以上であるという特定は、変異型ルシフェラーゼの発光活性が野生型ルシフェラーゼの発光活性の５０％以上であることを意味する。また、変異型ルシフェラーゼのｋｃａｔは、野生型甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの１００％以上であってもよい。すなわち、変異型ルシフェラーゼの方が、野生型ルシフェラーゼよりも高い発光活性を示してもよい。例えば、変異型ルシフェラーゼが、ＡＴＰの応答性に関する変異に加えて、発光活性を高めるような変異を含むことで、野生型よりも強く光るルシフェラーゼであってよい。
【００３６】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼは、野生型と比較してＡＴＰに対する親和性が低いものの、発光活性を高く維持している。このようなルシフェラーゼを使用することで、既存のルシフェラーゼでは測定できない濃度範囲における測定が可能となり、また測定可能であっても発光強度が低いために実用的でない範囲における測定が可能となる。さらに、ＡＴＰ濃度の測定だけでなく、変異型甲虫類ルシフェラーゼの特性を利用した様々な応用が期待できる。
【００３７】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼは、タンパク質の立体構造において、基質結合部位から５Å以上離れた部位に変異が導入されていてよい。すなわち、当該ルシフェラーゼにおける変異の少なくとも１つが、基質結合部位から５Å以上離れた部位に存在してよい。基質結合部位とは、ＡＴＰとルシフェリンとの反応が生じるときに、ＡＴＰが安定的に配置するルシフェラーゼ内の部位のことである。換言すれば、基質結合部位は活性部位である。変異が基質結合部位から５Å以上離れた部位に存在することで、発光活性に対する悪影響を最小化し（すなわちｋｃａｔの低下を抑制し）、ＡＴＰ応答性を上げる（すなわちＫＭを大きくする）ことができる。また、変異は、基質結合部位から５Å以上離れ且つルシフェラーゼタンパク質の表面に導入されていてよい。
【００３８】
基質結合部位からの距離の算出は、例えば、基質または基質アナログとの共結晶の結晶構造が既知のルシフェラーゼを利用して行うことができる。例えば、ゲンジボタルルシフェラーゼの結晶構造が既知であるため、これが利用される（Nakatsu, T. et al. (2006), Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence, Nature, 440, 372-376）。まず、ゲンジボタルルシフェラーゼにおいて、基質結合部位から５Å以上離れた部位を特定する。次に、本発明の一態様に係るルシフェラーゼとゲンジボタルルシフェラーゼとの間のアミノ酸配列の相同性を考慮して、本発明の一態様に係るルシフェラーゼにおける５Å以上離れた部位を特定することができる。
【００３９】
あるいは、本発明の一態様に係るルシフェラーゼの構造モデルを作製し、モデル上で５Å以上離れた部位を特定することもできる。具体的には、構造既知のタンパク質との配列相同性に基づいた構造予測によって構造モデルを作製し、そのモデル上で基質結合部位との距離を算出する。構造モデルの作製には、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（http://swissmodel.expasy.org/）といったオンラインサービスを利用することが可能である。図２には、このサービスを利用して作成した野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの構造モデルを示す。この構造モデルは、ゲンジボタルルシフェラーゼと、基質アナログである５’−Ｏ−［Ｎ−（デヒドロルシフェリル）−スルファモイル］アデノシン（ＤＬＳＡ）との共結晶の構造（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｄ１Ｓ）をテンプレート構造として作成した。この構造モデルに対して、テンプレート構造におけるＤＬＳＡを重ね合わせることで、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの構造モデルにおける基質結合部位を推定することができる。
【００４０】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼにおいて、変異が導入されている部位は、変異導入前において、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基であってよい。すなわち、変異型甲虫類ルシフェラーゼは、この塩基性アミノ酸残基に対して変異を導入することで得られたルシフェラーゼであってよい。塩基性アミノ酸残基は１つである場合に限らず、複数であってもよい。ここにいう変異導入前とは、変異導入前のタンパク質が、野生型ルシフェラーゼだけでなく、既に何らかの変異が導入されているルシフェラーゼをも含むことを意味する。塩基性アミノ酸とは、例えば２つ以上のアミノ基を有することで塩基性を有したアミノ酸のことであり、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンである。なお、このような変異型甲虫類ルシフェラーゼでは、塩基性アミノ酸残基に加えて、その他の残基に変異が導入されていてもよい。
【００４１】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼにおいて、変異が導入される塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジンに相当するアミノ酸残基、５３５位のリジンに相当するアミノ酸残基または５３８位のアルギニンに相当するアミノ酸残基であってよい。すなわち、任意の甲虫類ルシフェラーゼについて、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼとの間でアミノ酸配列の相同性を検討したとき、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジン、５３５位のリジンまたは５３８位のアルギニンに相当する、任意の甲虫類ルシフェラーゼにおけるアミノ酸残基に対して変異が導入されてよい。
【００４２】
甲虫類のルシフェラーゼ同士は、一般的に相同性が高いことが知られている。例えば、ヒカリコメツキとホタルとは、分類学上の科は違うにも関わらず、ルシフェラーゼ同士では５０％程度の相同性がある。また、全ての甲虫類ルシフェラーゼ間において完全に保存されている部位が多数存在する。したがって、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの特定のアミノ酸残基（例えば４４７位のリジン残基）に相当するアミノ酸残基を、別の種に由来するルシフェラーゼにおいて特定することは技術的に容易である。
【００４３】
そのような特定は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（http://www.clustal.org/）といった既知の配列比較プログラムを用いて行うことができる。この場合、比較を行いたい２つのルシフェラーゼの配列を入力してプログラムを実行することによって、配列比較を行うことができる。ここで、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを２つの配列の１つとして入力すれば、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの特定位置の残基が、他のルシフェラーゼにおいてどの位置に対応するかを容易に特定できる。
【００４４】
あるいは、基質または基質アナログとの共結晶の結晶構造が知られているルシフェラーゼ（例えば、ゲンジボタルルシフェラーゼ（Nakatsu, T. et al. (2006), Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence, Nature, 440, 372-376））との間で配列比較を行うことによって、任意のルシフェラーゼの特定の残基が、既知のルシフェラーゼタンパク質立体構造上でどこに対応するかを特定できる。
【００４５】
図２には、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの立体構造のモデルが示される。この図には、４４７位のリジン、５３５位のリジンおよび５３８位のアルギニンが示されている。この図からわかるように、これらの残基は基質結合部位（ＤＬＳＡが位置する部位）から離れており且つタンパク質の表面付近に位置することがわかる。一方、特許文献１に開示される変異型北米ボタルルシフェラーゼでは、その２４５位および３１８位の残基に変異が導入されている。これらの位置は、相同性検索によれば、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの２４７位および３２０位に相当し、図２に示されるように基質結合部位付近に位置する。すなわち、４４７位のリジン、５３５位のリジンおよび５３８位のアルギニンという位置は、少なくとも基質結合部位からの距離に関して、既知の変異型ルシフェラーゼにおける変異導入部位と大きく異なる。
【００４６】
以下の表１に、代表的な甲虫類ルシフェラーゼにおける、ヤエヤマヒメボタルの４４７位のリジン残基、５３５位のリジン残基および５３８位のアルギニン残基に相当する残基を示す。
【００４７】
【表１】
既知の各ルシフェラーゼについて、表１に示される残基に変異を導入することで本発明の一態様に係る変異型甲虫類ルシフェラーゼを作製することができる。
【００４８】
導入する変異としては、もとのアミノ酸残基の有する電気的性質を打ち消すような変異であることが好ましい。もとのアミノ酸残基が塩基性残基であれば、その正電荷を帯びているという性質を打ち消す変異が好ましく、すなわち、その塩基性残基を酸性残基または中性残基に置換する変異であることが好ましい。ＡＴＰとの親和性を低下させるためには、すなわちＫＭを増大させるためには、塩基性残基を酸性残基に置換することがより好ましい。例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンへの置換であることが好ましい。しかしながら、測定に適したＫＭ値およびｋｃａｔ値、ルシフェラーゼの安定性等に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼは、上述したような変異を複数含んでよい。すなわち、変異が導入される塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジンに相当するアミノ酸残基、５３５位のリジンに相当するアミノ酸残基および５３８位のアルギニンに相当するアミノ酸残基から成る群から選択される２以上のアミノ酸残基であってよい。このように、複数の塩基性アミノ酸残基に対して変異が導入された変異型ルシフェラーゼでは、相乗的にＫＭが増大する。
【００５０】
本発明の一態様の変異型甲虫類ルシフェラーゼの具体的な例は、Ｋ４４７Ｅ変異体（配列番号３）、Ｋ５３５Ｄ変異体（配列番号５）、Ｋ５３５Ｅ変異体（配列番号７）、Ｋ５３５Ｎ変異体（配列番号９）、Ｒ５３８Ｅ変異体（配列番号１１）およびＫ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体（配列番号１３）である。これらはいずれも、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼにおいて特定のアミノ酸残基を置換することで得られた変異体である。すなわち、Ｋ４４７Ｅ変異体とは４４７位のリジン残基をグルタミン酸に置換した変異体であり、Ｋ５３５Ｄ変異体とは５３５位のリジン残基をアスパラギン酸に置換した変異体であり、Ｋ５３５Ｅ変異体とは５３５位のリジン残基をグルタミン酸に置換した変異体であり、Ｋ５３５Ｎ変異体とは、５３５位のリジン残基をアスパラギンに置換した変異体であり、Ｒ５３８Ｅ変異体とは、５３８位のアルギニンをグルタミン酸に置換した変異体であり、Ｋ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体とは、４４７位のリジン残基をグルタミン酸に置換し且つ５３５位のリジン残基をグルタミン酸に置換した変異体である。これらの変異体において変異を導入した４４７位、５３５位および５３８位は、図２に示されるように、基質結合部位から離れて位置する。
【００５１】
（核酸）
本発明の別の態様は、変異型甲虫類ルシフェラーゼタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。このような塩基配列は、甲虫類に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、ここに規定される塩基配列には、甲虫類に属す生物が本来有する野生型の塩基配列だけでなく、それに変異が生じた塩基配列が含まれることを意味する。また、ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および／または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００５２】
このような核酸の好ましい例は、Ｋ４４７Ｅ変異体をコードする塩基配列（配列番号４）、Ｋ５３５Ｄ変異体をコードする塩基配列（配列番号６）、Ｋ５３５Ｅ変異体をコードする塩基配列（配列番号８）、Ｋ５３５Ｎ変異体をコードする塩基配列（配列番号１０）、Ｒ５３８Ｅ変異体をコードする塩基配列（配列番号１２）またはＫ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体（配列番号１４）をコードする塩基配列を含む核酸である。
【００５３】
また、本発明のさらに別の態様はこのような核酸を含むベクターである。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。また、その他のタンパク質の遺伝子を含んでもよい。当該ベクターは、例えば発現ベクターである。
【００５４】
（形質転換体および形質導入体）
本発明の別の態様は、上述のような核酸を含む形質転換体または形質導入体である。形質転換体とは、外部から核酸を取り込んだ生物（特に細胞）を意味する。当該細胞は、本発明の一態様に係る変異型甲虫類ルシフェラーゼの遺伝子を含んだ核酸が導入され、その結果、そのような遺伝子を含む核酸を保持している。そのような細胞とは、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞であってよい。形質転換体は、関連する技術分野において一般的な方法によって作製することが可能であり、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等によって、細胞等に核酸を導入することができる。また、形質導入体とは、バクテリオファージの感染によって、外部から核酸が導入された細菌を意味する。形質導入体は、関連する技術分野において一般的な方法によって作製することが可能であり、例えば、予め目的とする核酸を保有するバクテリオファージを作製し、それを細菌に感染させることで導入することができる。そのような細菌とは、例えば大腸菌である。
【００５５】
（製造方法）
本発明の別の態様は、変異型甲虫類ルシフェラーゼの製造方法である。当該製造方法は、上述のような形質転換体もしくは形質導入体にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる工程、または無細胞発現系にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを合成する工程を含む。形質転換体または形質導入体を用いる場合、それらをタンパク質の発現に適した条件下で培養することで変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる。その後、必要に応じて、変異型甲虫類ルシフェラーゼを精製する。これらの具体的な方法は、関連する技術分野において一般的なものを使用することができる。また、無細胞発現系においても、関連する技術分野において一般的なものを使用することができ、例えば、翻訳に必要となるリボソームやアミノ酸等を含む緩衝液に、変異体ルシフェラーゼをコードするＲＮＡを添加してルシフェラーゼを合成する。
【実施例】
【００５６】
[実施例１]
種々の変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを作製し、ＡＴＰに対する応答性および発光活性を調べた。
【００５７】
（発現ベクターの作製）
文献（Sambrook, J and Russell, D. W. (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に記載の方法に従って、ｃＤＮＡライブラリからクローニングしたヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ（ＹａｅＬＵＣ）をコードする塩基配列（配列番号２）（国際公開第２００９／０７５３０６号）を含むＤＮＡを、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイト間に挿入することで、ＹａｅＬＵＣ発現ベクターを作製した。当該発現ベクターからは、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ（配列番号１）が発現する。
【００５８】
その野生型ルシフェラーゼのＤＮＡに変異を導入して、変異型ルシフェラーゼの発現ベクターを作製した。具体的には、対象となる部位に変異を持つ一組の相補的なオリゴＤＮＡおよびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、同キットのマニュアルに示された方法に従って作製した。以下の表２に、作製した変異体、使用したオリゴＤＮＡのセット、導入された変異、得られた塩基配列およびアミノ酸配列をまとめる。
【００５９】
【表２】
なお、Ｋ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体については、Ｋ４４７Ｅ変異体の発現ベクターを作製した後、さらにＫ５３５Ｅの変異を導入することで作製した。
【００６０】
各変異体の塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および３１３０ＸＬジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して確認し、タンパク質をコードする領域に目的の変異が導入されていることおよびＰＣＲエラーに起因する意図しない変異が無いことを確認した。
【００６１】
（ルシフェラーゼタンパク質の精製）
次に、上記の通り作製した発現ベクターを用いて、大腸菌内にて変異型ルシフェラーゼタンパク質を作製した。
【００６２】
まず、上記の通り作製した各発現ベクターを、発現用の大腸菌に形質転換した。大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）のコンピテントセル５０μＬに、ルシフェラーゼ発現ベクター０．５μＬ（ＤＮＡ約１０ｎｇ）を加え、氷上に３０分間静置し、続いて４２℃の熱浴で４５秒間処理した後、再び氷上に２分間静置した。そこへＬＢ培地を０．５ｍＬ加え、３７℃で２０分間振盪培養を行った後、培養液の１００μＬを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布した。プレートを３７℃で一晩静置培養し、生じたコロニーを任意に１つ選び、２ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で１３０ｒｐｍの振盪培養を行った。４〜６時間後に目視で大腸菌の増殖が確認できた段階で２５０ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植え継ぎ、３０℃で１００ｒｐｍの振盪培養を一晩行った（１４〜１８時間）。培養終了後、４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離を行うことで、大腸菌を集菌した。得られた菌体ペーストを、２５ｍＬの洗菌バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に懸濁し、再び４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離を行った。得られた菌体（湿重量約１ｇ）を精製作業まで−８０℃で凍結保存した。
【００６３】
凍結した菌体を、１０ｍＬの破砕バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁し、サンプルを氷上に置いて超音波破砕を行った。超音波破砕は、タイテック社製超音波式ホモジナイザーＶＰ−０５０を用いて、出力パワー５０％での５秒間の処理とその後の５秒間の休止とから成るサイクルを１５分間行った。破砕後、懸濁液を３０ｍＬ遠心管に移し、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で３０分間遠心分離を行った。遠心後の上清を、破砕バッファで平衡化した０．５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に懸濁し、４℃で転倒撹拌（約６ｒｐｍ）を１時間行った。
【００６４】
次に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂懸濁液をφ１０ｍｍ×５０ｍｍのオープンカラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に注ぎ、樹脂をカラム下部に積層させた。懸濁液がすべてカラムを通過した後、１０ｍＬの破砕バッファを数回に分けてカラムに注ぎ、樹脂を洗浄した。１．２ｍＬの溶出バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）を静かにカラム上部から加え、溶出液を約１８０μＬずつ分画した。溶出後の分画は、直ちに氷上にて保存した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によって各画分のタンパク質濃度を算定し、最も濃度が濃い２〜３画分をＮｉ−ＮＴＡ溶出画分として回収した。回収画分を決定後、直ちにゲル濾過による脱塩を行った。脱塩バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＮｉ−ＮＴＡ溶出画分サンプルを供して、サンプルがすべてゲルに浸み込むまで待機した。サンプルとの合計が１ｍＬとなるように脱塩バッファを加え、バッファが浸み込むまで待機した後、１．５ｍＬの脱塩バッファを加え、溶出液を約２００μＬずつ分画した。溶出後の分画は、直ちに氷上にて保存した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法プロテインアッセイキットによって各画分のタンパク質濃度を算定し、最も濃度の濃い画分を脱塩溶出画分として回収した。溶出画分と等量の保存バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、９０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．５）を加え、−３０℃の冷凍庫で保存した。
【００６５】
（発光活性測定）
精製した各ルシフェラーゼについて発光活性を測定した。
ＡＴＰ溶液は、以下の様に調製した。ＡＴＰ二ナトリウム塩三水和物（Ｒｏｃｈｅ ＃５１９９７９）０．３ｇを３．５ｍＬの水に溶かし、ｐＨを測定しながら１Ｍ ＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨを７．０に調整した。２５９ｎｍにおける吸光度を測定し、ＡＴＰの消光係数ε＝１５４００（Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて濃度が１００ｍＭになるように水を加えて最終調整した。黒色の９６穴アッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル中に、２５μＬの基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、８００μＭ Ｄ−（−）−ルシフェリン、０〜２０ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ８．０）を入れておき、ルシフェラーゼ溶液（２μｇ／ｍＬ ルシフェラーゼ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を７５μＬ加えた時点から、発光強度を経時的に測定した。２５μＬの基質溶液に７５μＬのルシフェラーゼ溶液を加えた直後の１００μＬの反応溶液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２００μＭ Ｄ−（−）−ルシフェリン、１．５μｇ／ｍＬ（２５ｎＭ）ルシフェラーゼを含み、ＡＴＰは連続する８ウェルにそれぞれ０ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、２．５ｍＭおよび５ｍＭ含まれるように調製した。ルシフェラーゼ溶液の自動分注および発光強度の測定は、自動分注器および光電子増倍管を備えたＡＴＴＯ社製Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ ＪＮＲ−ＩＩを用いた。
【００６６】
（発光強度データの解析）
ＡＴＰに対するルシフェラーゼの酵素学的パラメータを算出するために、式３に示したミカエリス・メンテンのモデルによって発光活性データを評価した。ＫＭ値およびＶｍａｘ値の導出には、各ＡＴＰ濃度での発光強度の経時変化のピーク付近の値をｖ０として、異なるＡＴＰ濃度に対するｖ０値のデータに式３を当てはめてパラメータを導出した。式の当てはめには、レベンバーク−マーカート法による非線形最小二乗法を用いた。
【００６７】
（結果）
各変異体において求めたＫＭ値および相対ｋｃａｔ値を表３にまとめる。さらに、図３に、ＫＭを横軸とし相対ｋｃａｔを縦軸としてプロットする。図３中、横軸に平行な破線は相対ｋｃａｔ値が５０％である線を意味し、縦軸に平行な破線はＫＭ値が０．３ｍＭである線を意味する。
【００６８】
【表３】
表３および図３の結果から、各変異体のＫＭ値は野生型ルシフェラーゼと比較して増大しており、一方で、ｋｃａｔ値は野生型ルシフェラーゼと比較して高い水準に維持されていることがわかる。また、Ｋ４４７Ｅ／Ｋ５３５Ｅ変異体は、Ｋ４４７Ｅ変異体およびＫ５３５変異体と比較してＫＭ値が増大している。このことは、変異を二重で導入することで、相乗的にＫＭ値を増大する効果が得られることを意味する。
【００６９】
［実施例２］
ＧＬ３ルシフェラーゼの変異体を作製し、ＡＴＰに対する応答性および発光活性を調べた。なお、ＧＬ３ルシフェラーゼは、北米ボタルルシフェラーゼに対して、Ｎ５０Ｄ／Ｎ１１９Ｇ／Ｓ５４８Ｉ／Ｋ５４９Ａ／Ｌ５５０Ｖの変異を導入して性質を改変したものであるから、以下の実施例は、北米ボタルルシフェラーゼ変異体に対して追加の変異を導入した実施例でもある。
【００７０】
（発現ベクターの作製）
ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターに組み込まれているルシフェラーゼをコードする遺伝子部分（配列番号２５）を実施例１と同様の方法で、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ＧＬ３発現ベクターを作製した。当該発現ベクターからは、ＧＬ３ルシフェラーゼ（配列番号２６）が発現する。
【００７１】
そのＧＬ３ルシフェラーゼのＤＮＡに変異を導入して、変異型ＧＬ３発現ベクターを作製した。具体的には、ＧＬ３のＫ４４５およびＲ５３３の部位に変異を持ち、センス鎖と相補的な二種類のオリゴＤＮＡを同時に用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって作製した。Ｋ４４５Ｅ変異導入オリゴＤＮＡ配列を配列番号２７に、Ｒ５３３Ｅ変異導入オリゴＤＮＡ配列を配列番号２８にそれぞれ示す。得られた変異型ＧＬ３の塩基配列は配列番号２９に、そのアミノ酸配列は配列番号３０に示す。
【００７２】
各変異体の塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および３１３０ＸＬジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して確認し、タンパク質をコードする領域に目的の変異が導入されていることおよびＰＣＲエラーに起因する意図しない変異が無いことを確認した。
【００７３】
（ルシフェラーゼタンパク質の精製）
上記ＧＬ３および変異型ＧＬ３発現ベクターを用いて、実施例１に記載の方法でルシフェラーゼタンパク質を作製し、精製を行った。
【００７４】
（発光活性測定）
精製したＧＬ３および変異型ＧＬ３タンパク質について、実施例１に記載の方法で発光活性を測定した。２５μＬの基質溶液に７５μＬのルシフェラーゼ溶液を加えた直後の１００μＬの反応溶液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２００μＭ Ｄ−（−）−ルシフェリン、１．５μｇ／ｍＬ（２５ｎＭ）ルシフェラーゼを含み、ＡＴＰは二列の隣り合う１６のウェルにそれぞれ０ｍＭ、０．０００２ｍＭ、０．０００５ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００２ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭおよび５ｍＭ含まれるように調製した。
【００７５】
（発光強度データの解析）
図４に、上記ＡＴＰ濃度条件におけるＧＬ３ルシフェラーゼおよびその変異体の発光強度をまとめる。また、式３を測定結果に当てはめた結果を図４の実線で示した。式の当てはめによって得られたパラメータを表４にまとめた。
【００７６】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項２】
タンパク質の立体構造において、基質結合部位から５Å以上離れた部位に変異が導入されている請求項１に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項３】
変異が導入されている前記部位は、変異導入前において、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基である請求項２に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項４】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジン残基に相当するアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの５３５位のリジン残基に相当するアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項６】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの５３８位のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項７】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジン残基に相当するアミノ酸残基、５３５位のリジン残基に相当するアミノ酸残基および５３８位のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基から成る群から選択される２以上のアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項８】
請求項１から７の何れか１項に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸を含む形質導入体。
【請求項１１】
請求項９に記載の形質転換体もしくは請求項１０に記載の形質導入体にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる工程、または無細胞発現系にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを合成する工程を含む請求項１から７の何れか１項に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼの製造方法。
【請求項１】
酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ＡＴＰに対するミカエリス定数ＫＭが０．３ｍＭ以上であり、且つｋｃａｔが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのｋｃａｔの５０％以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項２】
タンパク質の立体構造において、基質結合部位から５Å以上離れた部位に変異が導入されている請求項１に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項３】
変異が導入されている前記部位は、変異導入前において、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基である請求項２に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項４】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジン残基に相当するアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの５３５位のリジン残基に相当するアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項６】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの５３８位のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項７】
前記塩基性アミノ酸残基は、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの４４７位のリジン残基に相当するアミノ酸残基、５３５位のリジン残基に相当するアミノ酸残基および５３８位のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基から成る群から選択される２以上のアミノ酸残基である請求項３に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
【請求項８】
請求項１から７の何れか１項に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸を含む形質導入体。
【請求項１１】
請求項９に記載の形質転換体もしくは請求項１０に記載の形質導入体にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる工程、または無細胞発現系にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを合成する工程を含む請求項１から７の何れか１項に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１２５２１６（Ｐ２０１２−１２５２１６Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８１５０３（Ｐ２０１０−２８１５０３）
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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