画像取得装置、画像取得方法及び画像取得プログラム
【課題】蛍光標識が付された生体サンプルを効率よく撮影することが可能となる画像取得装置、画像取得方法及び画像取得プログラムを提供する。
【解決手段】本技術の一形態に係る画像取得装置は、光源と、光学系と、撮像素子と、移動制御部と、データ処理部とを具備する。前記光源は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する。前記光学系は、前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む。前記撮像素子は、前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される。前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる。前記データ処理部は、前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する。
【解決手段】本技術の一形態に係る画像取得装置は、光源と、光学系と、撮像素子と、移動制御部と、データ処理部とを具備する。前記光源は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する。前記光学系は、前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む。前記撮像素子は、前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される。前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる。前記データ処理部は、前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、顕微鏡を用いて画像を取得する画像取得装置、画像取得方法及び画像取得プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば乳がんの治療等において、手術により摘出された組織切片が解析され、その解析結果をもとに手術後に患者に投与される薬剤が選択されるという方式が用いられている。
【０００３】
例えば手術により摘出された組織切片が、アボット社のＨＥＲ−２ＤＮＡプローブキットが用いられて蛍光染色される。組織切片に励起光が照射されると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子から赤色を呈する蛍光が発せられ、アルファサテライトＤＮＡ配列から緑色を呈する蛍光が発せられる。従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子は赤色を呈する輝点により標識され、アルファサテライトＤＮＡ配列は緑色を呈する輝点により標識される。
【０００４】
蛍光顕微鏡を用いた診断により赤色の輝点の数と緑色の輝点の数とがそれぞれ数えられる。そして緑色の輝点の数と比べて、赤色の輝点の数が２．２倍以上であれば、ＨＥＲ２陽性反応と判定される。この場合、ロシュ社のハーセプチンという分子標的薬剤が投与されることで、患者の手術後の予後が大幅に良くなると言われている。（非特許文献１参照）。
【０００５】
また、特許文献１には、生体サンプルの蛍光像から細胞を標識する輝点を検出する技術が記載されている。特許文献１に記載の生体サンプル像取得装置では、生体サンプルの対象とすべき部位が対物レンズにより拡大されて撮影される。その撮影の際に対物レンズの焦点を適宜移動させることで輝点の検出精度の向上が図られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１０７６６９公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＨＥＲ２検査ガイド、第３版、トラスツズマブ病理部会作成、２００９年９月、第１０頁＜ＦＩＳＨ法判定方法＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記したような蛍光顕微鏡を用いた診断等においては、光学系の焦点位置を適切に設定することが重要となる。例えばスライドガラス上に組織切片等の試料が配置され、封入剤を介してカバーガラスが載せられる。このようにして作成されたプレパラートが蛍光顕微鏡のステージ上にセットされる。この際、試料の厚さが一定でないこと、スライドガラスの厚さが一定でないこと、スライドガラスとステージとの間にゴミが挟まってしまうこと等の様々な理由により、ステージに載置されるプレパラートごとに焦点位置の調整が必要となる。
【０００９】
一方、蛍光顕微鏡で観察される像の解像度および輝点の輝度は、光学系の開口数（ＮＡ）が高いほど高くなる。従って開口数（ＮＡ）が高い光学系を用いた顕微鏡のほうが、上記の診断の正確性が高められる傾向にある。しかし、光学系の開口数（ＮＡ）を高くすると、焦点深度が狭くなってしまうので、焦点位置を見失いやすい。すなわち上記した焦点位置の調整が困難となる。
【００１０】
そこで、例えば焦点深度よりも小さい間隔で焦点位置を変えてその都度画像を撮影し、各撮影画像を分析することで焦点位置を探し出す方法が考えられる。しかし、この方法では多数の画像を撮影する必要があり、撮影枚数分の画像データを保存するための大容量のメモリが必要となる。また焦点位置を算出するために複数の画像データを参照しなければならず、多くの工数がかかり非効率である。
【００１１】
以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、蛍光標識が付された生体サンプルを効率よく撮影することが可能となる画像取得装置、画像取得方法及び画像取得プログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本技術の一形態に係る画像取得装置は、光源と、光学系と、撮像素子と、移動制御部と、データ処理部とを具備する。
前記光源は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する。
前記光学系は、前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む。
前記撮像素子は、前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される。
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる。
前記データ処理部は、前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する。
【００１３】
この画像取得装置では、撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で光学系の焦点位置が移動させられる。当該移動の間撮像素子が露光され生体サンプルの蛍光像が取得される。そして生体サンプルの蛍光像をもとに、撮像対象の厚さ方向における蛍光標識の分布情報が算出される。これにより例えば蛍光標識を適切に撮影するための焦点位置を容易に算出することが可能となる。この結果、蛍光標識が付された生体サンプルを効率よく撮影することが可能となる。
【００１４】
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さ方向に前記焦点位置を移動させるとともに、前記厚さ方向に垂直な面方向に前記焦点位置を移動させてもよい。
【００１５】
前記データ処理部は、前記蛍光像の前記蛍光標識の形状をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１６】
前記移動制御部は、前記撮影範囲を前記撮像対象の厚さ方向に分割する複数の分割撮影範囲のそれぞれにおいて、前記光学系の焦点位置を移動させてもよい。その場合、前記データ処理部は、前記複数の分割撮影範囲のそれぞれで取得された複数の蛍光像をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１７】
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの周波数成分を算出し、最大周波数成分が最も高い蛍光像をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１８】
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの輝度を算出し、最大輝度を有する蛍光像をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１９】
前記画像取得装置は、前記算出された分布情報をもとに、前記生体サンプルに対する撮影モードを決定する撮影モード決定部をさらに具備してもよい。
【００２０】
本技術の一形態に係る画像取得方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射することを含む。
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置が移動される。
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像が取得される。
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報が算出される。
【００２１】
本技術の一形態に係る画像取得プログラムは、コンピュータに以下の工程を実行させる。
蛍光標識が付された生体サンプルに光源より当該蛍光標識に対する励起光を照射させる。
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置を移動させる。
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像を取得する。
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する。
【発明の効果】
【００２２】
以上のように、本技術によれば、蛍光標識が付された生体サンプルを効率よく撮影することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本技術の一実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。
【図２】図１に示すステージに載置される生体サンプルを側面方向から示した図である。
【図３】図１に示すデータ処理部のハードウェアの構成を示すブロック図である。
【図４】本実施形態に係る生体サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。
【図５】図１の画像取得装置による撮像対象の領域を示す図である。
【図６】図１に示すステージが移動した場合の光学系の焦点位置の移動を示す模式的な図である。
【図７】本実施形態に係る焦点位置の移動範囲について詳しく説明するための模式的な図である。
【図８】図７に示す分割撮影範囲のそれぞれにおいて撮影されたサンプル部位の蛍光像を示す模式的な図である。
【図９】本実施形態の実施例として撮影された写真であり、図８に示すそれぞれの蛍光像に相当するものである。
【図１０】図４に示す分布情報算出部による算出処理の一例を示すフローチャートである。
【図１１】本実施形態の開始位置から合焦像までの角度θを算出する処理の一例を示す図である。
【図１２】本実施形態に係る複数の蛍光マーカの分布情報の一例を示すグラフである。
【図１３】本実施形態に係る複数の蛍光マーカの分布情報の一例を示すグラフである。
【図１４】本実施形態に係る複数の蛍光マーカの分布情報の一例を示すグラフである。
【図１５】スライドガラスとステージとの間にゴミ等が挟まってしまう状態を示す模式図である。
【図１６】図１０に示す分布情報算出部による算出処理の変形例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
【００２５】
［画像取得装置の構成］
図１は、本技術の一実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。同図に示すように、本実施形態における画像取得装置１００は、顕微鏡１０と、データ処理部２０とを有する。
【００２６】
[顕微鏡の構成]
顕微鏡１０は、ステージ１１、光学系１２、光源１３及び撮像素子１４を有する。ステージ１１は、例えば組織切片、細胞、染色体等の生体高分子等の生体サンプルＳＰＬを載置可能な載置面を有し、当該載置面に対してその平行方向（ｘ−ｙ平面方向）及び垂直方向（ｚ軸方向）へ移動可能とされている。
【００２７】
載置面の垂直方向（ｚ軸方向）は、生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に相当する。載置面の平行方向（ｘ−ｙ平面方向）は、上記厚さ方向に垂直な面方向に相当する。
【００２８】
図２は、上記ステージ１１に載置される生体サンプルＳＰＬをステージ１１の側面方向から示した図である。同図に示すように、生体サンプルＳＰＬは、Ｚ方向に例えば数μｍから数十μｍの厚さを有し、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれて所定の固定手法により固定されている。スライドガラスＳＧの厚さは例えば約１ｍｍである。カバーガラスＣＧの厚さは例えば約０．１５〜０．１７ｍｍである。
【００２９】
生体サンプルＳＰＬは蛍光染色剤によって染色されている。蛍光染色剤は同一の光源から照射される励起光によって蛍光を発する染色剤である。蛍光染色剤としては、例えば、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ＳｐＡｑｕａ、ＳｐＧｒｅｅｎなどを挙げることができる。
【００３０】
生体サンプルＳＰＬが染色されることにより、生体サンプルＳＰＬのターゲットとなる生体組織５０に蛍光標識が付されることになる。蛍光標識に対して所定の励起光が照射されると、蛍光標識から所定の蛍光が発せられる。従って生体サンプルＳＰＬが撮影されて蛍光像が生成された場合、ターゲットの生体組織５０は所定の色を呈する輝点（以下、「蛍光マーカ５５」という）により標識される。
【００３１】
図１に戻り、ステージ１１の上方には光学系１２が配置される。光学系１２は、対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂ、ダイクロイックミラー１２Ｃ、エミッションフィルタ１２Ｄ及び励起フィルタ１２Ｅを有する。光源１３は、例えば水銀ランプ等の電球やＬＥＤ（Light Emitting Diode）など、蛍光標識が付された生体サンプルＳＰＬに当該蛍光標識に対する励起光を照射するものである。
【００３２】
励起フィルタ１２Ｅは、生体サンプルＳＰＬの蛍光像を得る場合に、光源１３から出射された光のうち蛍光色素を励起する励起波長の光のみを透過させることで励起光を生成する。ダイクロイックミラー１２Ｃは、当該励起フィルタで透過されて入射する励起光を反射させて対物レンズ１２Ａへ導く。対物レンズ１２Ａは、当該励起光を生体サンプルＳＰＬへ集光する。そして対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂは、生体サンプルＳＰＬの像を所定の倍率に拡大し、当該拡大像を撮像素子１４の撮像面に結像させる。
【００３３】
生体サンプルＳＰＬに励起光が照射されると、生体サンプルＳＰＬの各組織に結合している染色剤が蛍光を発する。この蛍光は、対物レンズ１２Ａを介してダイクロイックミラー１２Ｃを透過し、エミッションフィルタ１２Ｄを介して結像レンズ１２Ｂへ到達する。エミッションフィルタ１２Ｄは、上記対物レンズ１２Ａによって拡大された、励起フィルタ１２Eを透過した光を吸収し発色光の一部のみが透過する。当該外光が喪失された発色光の像は、上述のとおり、結像レンズ１２Ｂにより拡大され、撮像素子１４上に結像される。
【００３４】
撮像素子１４としては、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ等が用いられる。撮像素子１４は、ＲＧＢ(Red、Green、Blue)の色別に光を受けて電気信号に変換する光電変換素子を有し、入射光からカラー画像を得るカラーイメージャである。
【００３５】
データ処理部２０は、光源１３を駆動させ、撮像素子１４を用いて生体サンプルＳＰＬの蛍光像を取得し、これをサンプルデータとして保存する。
【００３６】
［データ処理部の構成］
図３は、データ処理部２０のハードウェアの構成を示すブロック図である。データ処理部２０は、例えばＰＣ（Personal Computer）等のコンピュータにより構成される。データ処理部２０は、撮像素子１４より取得した生体サンプルＳＰＬの蛍光像を、例えばＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）等の任意形式のデジタル画像データとして保存する。
【００３７】
同図に示すようにデータ処理部２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、ＲＯＭ（Read Only Memory）２２、ＲＡＭ（Random Access Memory）２３、操作入力部２４、インターフェイス部２５、表示部２６及び記憶部２７を有し、これら各ブロックがバス２８を介して接続されている。
【００３８】
ＲＯＭ２２は、各種の処理を実行するためのファームウェア等の複数のプログラムやデータを固定的に記憶する。ＲＡＭ２３は、ＣＰＵ２１の作業用領域として用いられ、ＯＳ（Operating System）、実行中の各種アプリケーション、処理中の各種データを一時的に保持する。
【００３９】
記憶部２７は、例えばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や、フラッシュメモリ、その他の固体メモリ等の不揮発性メモリである。当該記憶部２７には、ＯＳや各種アプリケーション、各種データが記憶される。特に本実施形態では、記憶部２７には、撮像素子１４から取り込まれた蛍光画像データや、蛍光画像データを画像処理する画像処理アプリケーションも記憶される。
【００４０】
インターフェイス部２５は、顕微鏡１０のステージ１１、光源１３及び撮像素子１４をそれぞれ駆動するコントロール基板（ステージ駆動部１５、光源駆動部１６、撮像制御部１７）とそれぞれ接続され、所定の通信規格により当該コントロール基板とデータ処理部２０との間で信号のやり取りを行う。
【００４１】
ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２や記憶部２７に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開し、当該展開されたプログラムにしたがって、表示部２６及び記憶部２７を適宜制御する。
【００４２】
操作入力部２４は、例えばマウス等のポインティングデバイス、キーボード、タッチパネル、その他の操作装置である。
【００４３】
表示部２６は、例えば液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro-Luminescence）ディスプレイ、プラズマディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイ等である。当該表示部２６は、データ処理部２０に内蔵されていてもよいし、データ処理部２０に外部接続されていてもよい。
【００４４】
［生体サンプル像取得処理］
本実施形態では、生体サンプルＳＰＬのうち撮像対象となる部分の厚さの範囲を含む撮影範囲で、光学系１２の焦点位置が移動される。焦点位置が移動する間撮像素子１４が露光されることで生体サンプルＳＰＬの蛍光像が取得される。この蛍光像をもとに撮像対象の厚さ方向における蛍光標識の分布情報が算出される。蛍光標識の分布情報は、蛍光マーカ５５により標識されるターゲットの生体組織５０の分布情報に相当する。
【００４５】
算出された分布情報をもとに、例えば蛍光マーカ５５を適切に撮影するための焦点位置を容易に算出すること等が可能となる。この結果、蛍光マーカ５５が付された生体サンプルＳＰＬを効率よく撮影することが可能となる。以下、詳しく説明する。
【００４６】
データ処理部２０のＣＰＵ２１はＲＯＭ２２や記憶部２７に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開する。ＣＰＵ２１は、この展開されたプログラム（画像取得プログラム）に基づいて生体サンプル像取得処理を実行する。
【００４７】
図４はこの生体サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。同図において、ステージ制御部３１（移動制御部）は、生体サンプルＳＰＬの撮像対象とすべき部位（以下、これをサンプル部位とも呼ぶ）が撮像範囲に位置するようステージ１１を順次移動させて、例えば図５に示すように、該撮像範囲ＡＲに対して生体サンプルＳＰＬを割り当てる。なお、図５では、撮像範囲ＡＲに割り当てるべき生体サンプルＳＰＬの領域が重ならない態様となっているが、隣接する領域の一部が重なる態様であってもよい。
【００４８】
また、ステージ制御部３１は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、ステージ１１を移動する。これによりサンプル部位に対する光学系の焦点が移動する。本実施形態ではステージ１１の移動が制御されることで、サンプル部位の厚さ方向（ｚ軸方向（対物レンズ１２Ａの光軸方向）に焦点が移動するとともに、当該厚さ方向に垂直な面方向（ｘ−ｙ平面方向）に焦点が移動する。
【００４９】
具体的な例として、ステージ制御部３１は、ステージ１１の位置を次式に従って移動させる。
【００５０】
【数１】
【００５１】
式（１）及び式（２）に示すように、ステージ１１は、ｘ−ｙ平面上において座標（ｘ0，ｙ0）を中心とした半径Ｌの円に沿って移動させられる。中心座標（ｘ0，ｙ0）の位置及び半径Ｌの大きさは、撮像範囲ＡＲが撮影可能であるのなら任意に設定されてよい。
【００５２】
式（１）及び（２）中のｔexは露光時間を示す。すなわちステージ１１は、撮像素子１４により露光されている間、円移動させられる。言い換えれば、本実施形態では、ステージ１１を円移動させている間撮像素子１４が露光される。
【００５３】
式（３）に示すように、ステージ１１は、ｚ軸方向に沿っても移動させられる。ステージ１１は、撮像素子１４の露光時間に合わせて移動開始位置であるｚstartから、移動終了位置であるｚendまで等速で移動される。
【００５４】
図６は、ステージ１１が移動させられた場合の光学系の焦点位置の移動を示す模式的な図である。図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、焦点位置を含む焦点面ＦＰは、ｚ軸方向に沿ってｚstartからｚendまで移動させられる。それとともに、ｘ−ｙ平面上では中心座標（ｘ0，ｙ0）を中心として円移動させられる。
【００５５】
画像取得部３２（露光制御部）は、対象とすべきサンプル部位をステージ制御部３１が撮像範囲ＡＲに移動するごとに、ステージ１１の移動が開始された時点から終了する時点まで撮像素子１４を露光させるように撮像制御部１７に指令を送る。
【００５６】
画像取得部３２は、ステージ１１の移動が終了する時点で、当該移動終了時点と移動開始時点との間の露光により得られるサンプル部位の像を撮像制御部１７を介して撮像素子１４から取得する。そして画像取得部３２は、各撮像範囲ＡＲに割り当てられるサンプル部位の像を、所定の連結アルゴリズムを用いて連結することによって全体の生体サンプル像を生成する。
【００５７】
図７は、本実施形態に係る焦点位置の移動範囲について詳しく説明するための模式的な図である。図７に示すように、本実施形態では、サンプル部位の厚さの範囲Ｔを少なくとも含む撮影範囲Ｌをｚ軸方向に分割する複数の分割撮影範囲（Ｚｓｃａｎ＿１〜３）が設定される。これらの分割撮影範囲のそれぞれにおいて、上記した焦点位置の移動制御が行われる。すなわちそれぞれの分割撮影範囲において、ｚstart（１〜３）とｚend（１〜３）とが設定される（図７（Ｂ）参照）。
【００５８】
分割撮影範囲のｚ軸方向における大きさは、例えば２０μｍ〜５０μｍである。しかしながらこの数値に限定されない。また分割撮影範囲の数も限定されない。またサンプル部位の厚さの範囲Ｔを少なくとも含む撮影範囲Ｌの大きさも限定されない。
【００５９】
撮像範囲ＡＲに対して所定のサンプル部位が割り当てられた状態で、複数の分割撮影範囲のそれぞれにて焦点位置が移動させられる。そして分割撮影範囲ごとに蛍光像が取得される。従って所定のサンプル部位に対して３つの蛍光像が取得されることになる。
【００６０】
例えば所定のサンプル部位が割り当てられた状態で連続して３つの蛍光像が撮影されてもよい。あるいは、１つの分割撮影範囲にて生体サンプルＳＰＬの全体の撮影が行われ、その後に他の分割撮影範囲での撮影が実行されてもよい。
【００６１】
図８は、図７に示すＺｓｃａｎ＿１〜３のそれぞれにおいて撮影されたサンプル部位の蛍光像を示す模式的な図である。図９は、本実施形態の実施例として撮影された写真であり、図８に示すそれぞれの蛍光像に相当するものである。図９に示す写真は、半径Ｌが１５μｍ、ｚ軸方向の移動量（ｚend−ｚstart）が２０μｍ、撮像素子１４を露光させて画像を取り込む時間が１ｓｅｃの条件で撮影された蛍光像である。その他、ガンマ値等の撮影条件も適宜調整される。
【００６２】
図７に示すように、Ｚｓｃａｎ＿１及び３は、ｚ軸方向において蛍光マーカ５５を含まない範囲である。従ってこの範囲で撮影された蛍光像であるｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１及び３では、図８及び図９に示すように、蛍光マーカ５５の像は非常のぼやけてしまっている（それぞれの図の（Ａ）と（Ｃ））。
【００６３】
一方、Ｚｓｃａｎ＿２にて撮像された蛍光像であるｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２では、蛍光マーカ５５の位置から近い範囲で焦点位置が移動される。従って撮影されたｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２では、図８及び図９の（Ｂ）に示すように、焦点位置の移動にともなう蛍光マーカ５５の軌跡の像が写されている。
【００６４】
分布情報算出部３３は、画像取得部３２により生成された生体サンプルＳＰＬの蛍光像をもとに、サンプル部位の厚さ方向における蛍光マーカ５５の分布情報を算出する。本実施形態では、図８及び図９に示す、Ｚｓｃａｎ＿１〜３のそれぞれにおいて撮影された複数の蛍光像をもとに分布情報が算出される。
【００６５】
図１０は、分布情報算出部３３による算出処理の一例を示すフローチャートである。本実施形態では、Ｚｓｃａｎ＿１〜３のそれぞれにおいて撮影された複数の蛍光像に対して周波数解析が実行される（ステップ１０１）。これにより、複数の蛍光像（ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３）のそれぞれ空間周波数が算出される。
【００６６】
各蛍光像の最大周波数成分が比較され、最大周波数成分が最も高い蛍光像が選択される（ステップ１０２）。図８及び図９に示すように、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１及び３では蛍光マーカ５５の像がぼやけている。一方、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２には蛍光マーカ５５の軌跡の像が写されている。従って、ステップ１０２において、最大周波数が最も高い蛍光像としてｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２が選択される。
【００６７】
最大周波数が最も高いｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２の蛍光マーカ５５の軌跡の像が解析される（ステップ１０３）。すなわち本実施形態では、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２の蛍光マーカ５５の形状が解析される。
【００６８】
分布情報算出部３３は、画像取得部３２により生成されたｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２から、ターゲットとされる生体組織５０を標識する蛍光マーカ５５（以下「標的マーカ」とも呼ぶ。また蛍光マーカ５５ａと記載する）を検出する。
【００６９】
分布情報算出部３３には、例えば、設定情報として、標的マーカが呈する色（以下「標的マーカ色」と呼ぶ。）と、細胞核を標識する蛍光マーカ５５（以下「核マーカ」と呼ぶ。）が呈する色（以下「核マーカ色」と呼ぶ。）とが設定される。
【００７０】
また、対照とすべき遺伝子を標識する蛍光マーカ５５（以下「対照マーカ」と呼ぶ。また蛍光マーカ５５ｂと記載する）が用いられている場合、該対照とすべき遺伝子が正常の細胞核内に存在する数が設定される。またこの場合、対照遺伝子を標識する蛍光マーカが呈する色（以下「対照マーカ色」と呼ぶ。）も設定される。
【００７１】
これら設定情報は、蛍光染色に使用すべきプローブの製造元や、蛍光マーカの種などの使用条件によって一義的に決まる。具体的には、例えばアボット社のＨＥＲ−２ＤＮＡプローブキットの場合、ＨＥＲ２遺伝子の標的マーカ色は「赤」として設定され、核マーカ色は「青」として設定される。またこの場合、染色体上のＨＥＲ２遺伝子の隣に位置する遺伝子が対照遺伝子とされ、該対照遺伝子の対照マーカ色は「緑」として設定される。
【００７２】
分布情報算出部３３は、設定された各マーカ色を呈し、かつ閾値以上の輝度を検出することで、蛍光マーカ５５の形状（面積）や数等を検出する。そして当該蛍光マーカ５５の形状を解析することで、複数の蛍光マーカ５５の分布情報を算出する。
【００７３】
図８（Ｂ）には、例として２つの蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂが図示されている。上記したように光学系１２の焦点位置が移動される間、撮像素子１４が露光されることでｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２が生成される。ステージ１１の面方向であるｘ−ｙ平面において焦点位置は円移動されるので、蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂは円Ｏに沿って移動する。すなわち焦点移動の開始位置ｚstartから終了位置ｚendまで蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂの軌跡は半円を描く（ここでは露光時間の間焦点位置が半円上を移動する場合が図示されている）。
【００７４】
光学系１２の焦点位置は、ｚ軸方向にも上方に向けてＺｓｃａｎ＿２の範囲で移動される。その移動の間のいずれかの焦点位置で、蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂのそれぞれに対する焦点が最も合うことになる。最も焦点が合っている状態では、蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂの像の面積は最も小さくなり、輝度が最も高くなる。この面積が最も小さい像を合焦像６０と記載する。
【００７５】
本実施形態では、開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが算出され、この角度θをもとにサンプル部位の厚さ方向における蛍光マーカ５５の分布情報が算出される。
【００７６】
例えば図（Ｂ）に示す蛍光マーカ５５ｂでは、半円を描く蛍光マーカ５５ｂの軌跡の中間位置に合焦像６０が存在する。角度θは約９０度となる。この場合、焦点位置がＺｓｃａｎ＿２の中間に移動したときに最も焦点が合っていることになる。従って蛍光マーカ５５ｂが、Ｚｓｃａｎ＿２の中間に位置していることが分かる。
【００７７】
もう一方の蛍光マーカ５５ａを見ると、半円を描く蛍光マーカ５５ａの軌跡の中間位置から終了位置ｚendに近い位置に合焦像６０が存在する。角度θは約１３５度となる。この場合、焦点位置がＺｓｃａｎ＿２の中間をこえて上部に移動したときに最も焦点が合っていることになる。従って蛍光マーカ５５ａが、Ｚｓｃａｎ＿２の上部側に位置していることが分かる。
【００７８】
開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが小さいほど、蛍光マーカ５５は、開始位置ｚstartに近い位置に存在することになる。すなわち蛍光マーカ５５は、生体サンプルＳＰＬ内のステージ１１に近い側に位置することになる。
【００７９】
一方、角度θが大きいほど、蛍光マーカ５５は、終了位置ｚendに近い位置に存在することになる。すなわち蛍光マーカ５５は、生体サンプルＳＰＬ内のステージ１１から離れた側に位置することになる。
【００８０】
図１１は、本実施形態の開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θを算出する処理の一例を示す図である。
【００８１】
撮影された画像７０から解析対象となる蛍光マーカ５５の像がトリミング処理により切り取られる（ステップ２０１）。切り取られたトリミング画像７５は、理論的な画像とマッチング処理される。
【００８２】
図１１に示すように、本実施形態では、理論的な画像のファイルが記憶部２７等に記憶されている。このファイルには、０度から３５９度までの角度にそれぞれ紐付けられた複数の理論的な画像８０が格納されている。本実施形態では、紐付けられた角度の大きさがその理論的な画像８０の識別番号となっている。
【００８３】
理論的な画像８０を作成するための、波長、開口数、倍率、画素ピッチ等は適宜設定されてよい。またどの角度を０度として設定するか、また何度ごとに理論的な画像を準備するか等も適宜設定可能である。例えば１度ごとに理論的な画像８０を準備する場合、３５９枚の理論的な画像８０が作成されることになる。
【００８４】
これら複数の理論的な画像８０と、トリミング画像７５との相関係数が計算される（ステップ２０２）。そして最も相関係数が高い理論的な画像８０の識別番号が算出される（図１１のグラフ参照）。撮影画像７０の複数の蛍光マーカ５５について、最も相関係数が高くなる理論的な画像８０の識別番号がそれぞれ算出される。複数の蛍光マーカ５５に対応付けられた識別番号のリストが生成されそのファイルが記憶部２７等に記憶される（ステップ２０３）。
【００８５】
それぞれの蛍光マーカ５５に応じて算出された理論的な画像８０の識別番号（角度）をもとに、上記した開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが適宜算出される。例えば当該角度θが識別番号としての角度と一致するように理論的な画像８０が準備されてもよい。あるいは識別番号としての角度により、蛍光マーカ５５の形状が判別され、そこから改めて開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが算出されてもよい。なお、開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θを算出する方法は図１１に示すものに限定されず、他の方法が用いられてもよい。
【００８６】
複数の蛍光マーカ５５のそれぞれについて算出された開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θをもとに、サンプル部位の厚さ方向における蛍光マーカ５５の分布情報が算出される（ステップ１０４）。すなわち本実施形態では、蛍光マーカ５５ごとにｚ軸方向での位置情報が算出されるので、複数の蛍光マーカ５５の分布情報が算出可能となる。
【００８７】
図１２から図１４は、複数の蛍光マーカ５５の分布情報の一例を示すグラフである。このように蛍光マーカ５５の分布情報は、ヒストグラム形式のデータとして生成可能である。これらのグラフでは、横軸がｚ軸方向での位置、縦軸が蛍光マーカ５５の数を示している。
【００８８】
本実施形態では、横軸を対物レンズの焦点深度Ｆの半分の大きさ（Ｆ／２）で区切り、各範囲に含まれる蛍光マーカ５５の数がカウントされている。横軸の分解能は、Ｆ／２に限定されず、焦点深度よりも小さい値が適宜設定されればよい。また焦点深度よりも大きい値が設定されてもかまわない。
【００８９】
すなわち光学系１２の焦点位置を横軸のある範囲内に設定すると、その範囲に含まれる蛍光マーカ５５の合焦像が撮影される。その他の範囲に含まれる蛍光マーカ５５は、焦点位置から遠い位置にあるものほど、ぼけて撮影される。
【００９０】
このような蛍光マーカ５５の分布情報をもとに、生体サンプルＳＰＬの撮影が行われる。蛍光マーカ５５の分布情報が参照可能であるので、撮影モードや撮影目的に合わせた効率のよい高精度の撮影が可能となる。
【００９１】
例えば生体サンプルＳＰＬに存在する複数の蛍光マーカ５５のうち、ある程度の数の蛍光マーカ５５にピントが合っていればよいような蛍光像を撮影することが目的であるとする。この場合、図１２に示すように、最も蛍光マーカ５５の数が多い範囲に含まれる位置Ａに焦点位置を合わせた撮影を１回行えばよいと判断される。これにより高精度の蛍光像を撮影することが可能となる。
【００９２】
生体サンプルＳＰＬに含まれる蛍光マーカ５５全体の数や種類等を定量的に観察することが目的であるとする。この場合、分布情報より蛍光マーカ５５が位置する全体範囲Ｂを算出し、全体範囲Ｂをスキャンすることで、全ての蛍光マーカ５５がもれなく撮影された蛍光像を撮像することが可能である。
【００９３】
例えば焦点位置を全体範囲Ｂの始点と終点まで移動させる間、撮像素子１４を露出することで、１つの蛍光像が撮影されてもよい。または、図１３に示すように、全体範囲Ｂの両側に所定のマージンＭを加えた延長範囲Ｃにて焦点位置が移動されてもよい。これにより全体範囲Ｂの中間に位置する蛍光マーカ５５の像と、端に位置する蛍光マーカ５５の像とが、略同様にぼけて撮影される。すなわち全体の蛍光マーカ５５が略同様の大きさ及び輝度で撮影されるので、蛍光マーカ５５の測定精度を向上させることができる。
【００９４】
１つのサンプル部位に対して、ｚ軸方向における異なる焦点位置で複数の蛍光像を撮影する、いわゆるZ-stackと呼ばれる撮影モードがある。このZ-stackが行われる場合でも、分布情報が適宜利用可能である。例えば図１３に示す全体範囲Ｂを参照することで、Z-stackを実行する範囲が定められる。またグラフを参照することで、異なる焦点位置の間隔や撮影枚数等を適宜設定することできる。例えば横軸を区切る範囲に合わせてZ-stackが実行されてもよい。このように分布情報を参照することで高精度の蛍光像を撮影することができる。
【００９５】
図１４に示すように、蛍光マーカ５５の分布が２つの山に分かれるようなグラフとなる場合も考えられる。すなわち異なる２つの位置の付近に、それぞれ蛍光マーカ５５が集中している場合等である。このような場合に、ある程度の数の蛍光マーカ５５にピントが合っていればよいということで、中間位置にて１回の撮影を行ってしまうと撮影が失敗してしまう可能性がある。
【００９６】
分布情報が参照されることで、各山に含まれる位置Ｄ及び位置Ｅが焦点位置として算出される。それらの位置に焦点位置が合わせられ、計２回の撮影が実行されることで、撮影失敗のない、高精度の蛍光像を撮影することができる。
【００９７】
図４に示すデータ記録部３４は、画像取得部３２により生成されたサンプル部位毎の生体サンプル像を連結して１つの生体サンプル画像を生成し、ＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）など所定の圧縮形式のサンプルデータに符号化してデータ記憶部３５に記録する。この処理は分布情報算出部３３による分布情報の算出の前に行われてもよい。
【００９８】
またデータ記録部３４は、分布情報算出部３３により算出された分布情報を受けて、そのデータをデータ記憶部３５にサンプルデータと関連付けて記録する。
【００９９】
その他データ記憶部３５には、例えば分布情報算出部３３による蛍光マーカ５５の測定結果データ（蛍光マーカの面積、数、種類等）、生体サンプルＳＰＬの採取者名、採取者性別、採取者年齢及び採取日付などの情報が記録されてもよい。
【０１００】
以上、本実施形態に係る画像取得装置１００は、サンプル部位の厚さの範囲Ｔを少なくとも含む撮影範囲Ｌで光学系１２の焦点位置が移動させられる。当該移動の間撮像素子１４が露光され生体サンプルＳＰＬの蛍光像が取得される。そして生体サンプルＳＰＬの蛍光像をもとに、サンプル部位の厚さ方向（ｚ軸方向）における蛍光マーカ５５の分布情報が算出される。これにより例えば撮影モードや撮影目的に合った、蛍光マーカ５５を適切に撮影するための焦点位置を容易に算出することが可能となる。この結果、蛍光マーカ５５が付された生体サンプルＳＰＬを効率よく撮影することが可能となる。
【０１０１】
例えば焦点深度よりも小さい間隔で焦点位置を変えてその都度画像を撮影し、各撮影画像を分析することで焦点位置を探し出す方法を想定する。この方法では多数の画像を撮影する必要があり、撮影枚数分の画像データを保存するための大容量のメモリが必要となる。また焦点位置を算出するために複数の画像データを参照しなければならず、多くの工数がかかり非効率である。
【０１０２】
具体的には、ＮＡを０．８とした場合においては、焦点深度は約１μｍ程度となる。そして焦点位置を捜すために、焦点位置を例えば１μｍずつ変えながら複数枚の画像撮影を行い、その画像を分析することにより焦点位置を捜すこととする。その場合５０μｍをこえる範囲を１μｍずつ焦点位置を変化させた測定を行うと５０枚以上の画像を撮影し、記録する必要がある。イメージャに１４ｂｉｔで２４Ｍｐｉｘのイメージャを用いた場合においては、１枚の画像ファイルがｔｉｆ方式で約１００ＭＢの容量となる。従って５０枚以上の画像を処理する場合には、５ＧＢ以上のメモリを要することとなるので、工程が煩雑となる。
【０１０３】
本実施形態では、図７に示すように、３つの分割撮影範囲としてＺｓｃａｎ＿１〜３が設定された。このように焦点深度よりも大きい範囲が設定され、少ない回数の撮影により分布情報が算出される。これにより大幅に撮影枚数を削減した焦点位置の探索が可能となる。
【０１０４】
図７では、生体サンプルＳＰＬが位置しない範囲も含めて撮影範囲Ｌが設定されている（Ｚｓｃａｎ＿１及び３）。例えば図１５に示すように、スライドガラスＳＧとステージ１１との間に毛髪等のゴミ９０（例えば約２０μｍ〜５０μｍの大きさ）等が挟まってしまう場合がある。このような場合に、例えばスライドガラスＳＧの厚さのみを考慮して撮影範囲Ｌを設定すると焦点位置を見失ってしまう可能性が高い。従って生体サンプルＳＰＬが位置しない範囲も含めて撮影範囲Ｌを適宜設定することで、蛍光マーカ５５の分布情報を高精度に算出することが可能となる。上記したように少ない撮影枚数で焦点位置を探索することが可能なので、撮像範囲Ｌを大きく設定することが可能である。
【０１０５】
自動的に焦点位置を探索及び調整する場合においては、イメージャ上のゴミ、イメージャの欠陥と、スライドガラスＧＳ上の蛍光の輝点とを誤認識してしまい、焦点位置が異なる位置を合焦点位置であると判断してしまうというエラー発生もあり得る。
【０１０６】
本実施形態では、図１０に示すステップ１０１及び１０２にて、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３のそれぞれの空間周波数が算出され、最大周波数が最も高い画像が選択された。このように周波数成分が解析され比較されることで、イメージャ（撮像素子１４）上のゴミやイメージャの欠陥等の影響を受けずに、蛍光マーカ５５の合焦像６０を含む画像（ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２）を選択することが可能となる。
【０１０７】
＜変形例＞
本技術に係る実施形態は、上記で説明した実施形態に限定されず種々変形される。
【０１０８】
図１６は、図１０に示す分布情報算出部３３による算出処理の変形例を示すフローチャートである。本変形例では、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３のそれぞれにおいて輝度が算出される（ステップ３０１）。そして最大輝度を有する蛍光像が選択され（ステップ３０２）、その蛍光像に対して蛍光マーカ解析処理が実行される（ステップ３０３）。このように複数の分割撮影範囲にてそれぞれ撮影された蛍光像の輝度をもとに、分布情報の算出処理の対象となる蛍光像が選択されてもよい。これにより演算量を抑えることができる。
【０１０９】
上記の実施形態では、図７に示すように、撮影範囲Ｌを分割する複数の分割撮影範囲が設定され、当該分割撮影範囲ごとに蛍光像が撮影された。しかしながら撮影範囲Ｌ全体でステージを移動させて、１回の撮影で蛍光像が生成されてもよい。そしてその蛍光像をもとに蛍光マーカ５５の分布情報が算出されてもよい。
【０１１０】
例えば１００μｍ程度の撮影範囲Ｌに対して１回の撮影が実行されてもよい。これにより演算量の軽減、処理速度の向上等を図ることができる。分割撮影範囲の設定の有無は、例えば撮影範囲Ｌの大きさや撮像素子１４の精度等をもとに判断されればよい。
【０１１１】
上記では、撮影モードや撮影目的に合わせて適宜分布情報を利用することができることを説明した。逆に分布情報に基づいて、最適な撮影モードや撮影目的が選択されてもよい例えば複数の蛍光マーカ５５が焦点深度の範囲内に集まっている場合は、焦点位置が固定された１回の撮影が選択される。複数の蛍光マーカ５５が分散している場合は、Z-stackによる撮影が選択されるといった等の判断処理が実行されてもよい。この際、例えばデータ処理部２０が、撮影モード決定部として機能する。
【０１１２】
また蛍光マーカ５５のうち、標的マーカ（赤色）のみ、あるいは対照マーカ（緑）のみが、分布情報算出の対象として設定されてもよい。これらの設定は、例えばユーザの操作により入力されてもよい。
【０１１３】
また蛍光像に写されている蛍光マーカ５５の全てにおいて位置情報が算出されなくてもよい。すなわち蛍光マーカ５５が間引かれて選択され、その位置情報をもとに分布情報が算出されてもよい。
【０１１４】
なお、上述の実施形態の顕微鏡１０の構成において、対物レンズ１２Ａは接眼レンズとすることもできる。
【０１１５】
また、上述の実施形態では、焦点位置を移動させるためにステージ１１を移動させることとしたが、光学系１２の対物レンズ１２Ａを移動させるようにしてもよい。
【０１１６】
上述の実施の形態では、データ処理部２０にデータ記憶部３５を設けて、これに生体サンプル像と蛍光マーカ５５の分布情報等を記録することとしたが、外部の記憶装置に記録するようにしてもよい。
【０１１７】
顕微鏡１０とデータ処理部２０との接続には、バス伝送路の他、ローカルエリアネットワークやインターネット、デジタル衛星放送等の有線又は無線の伝送媒体を用いることができる。
【０１１８】
なお、本技術は以下のような構成も採ることができる。
【０１１９】
（１）蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出するデータ処理部と
を具備する画像取得装置。
（２）前記（１）に記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さ方向に前記焦点位置を移動させるとともに、前記厚さ方向に垂直な面方向に前記焦点位置を移動させる
画像取得装置。
（３）前記（１）又は（２）に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記蛍光像の前記蛍光標識の形状をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（４）前記（１）から（３）のうちいずれか１つに記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮影範囲を前記撮像対象の厚さ方向に分割する複数の分割撮影範囲のそれぞれにおいて、前記光学系の焦点位置を移動させ、
前記データ処理部は、前記複数の分割撮影範囲のそれぞれで取得された複数の蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（５）前記（４）に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの周波数成分を算出し、最大周波数成分が最も高い蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（６）前記（４）に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの輝度を算出し、最大輝度を有する蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（７）前記（１）から（６）のうちいずれか１つに記載の画像取得装置であって、
前記算出された分布情報をもとに、前記生体サンプルに対する撮影モードを決定する撮影モード決定部を
さらに具備する画像取得装置。
【符号の説明】
【０１２０】
ＳＰＬ…生体サンプル
ＦＰ…焦点面
Ｔ…サンプル部位の厚さの範囲範囲
Ｌ…撮影範囲
Ｚｓｃａｎ＿１〜３…分割撮影範囲
ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３…蛍光像
１０…顕微鏡
１２…光学系
１３…光源
１４…撮像素子
２０…データ処理部
３１…ステージ制御部
３２…画像取得部
３３…分布情報算出部
５０…生体組織
５５…蛍光マーカ
１００…画像取得装置
【技術分野】
【０００１】
本技術は、顕微鏡を用いて画像を取得する画像取得装置、画像取得方法及び画像取得プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば乳がんの治療等において、手術により摘出された組織切片が解析され、その解析結果をもとに手術後に患者に投与される薬剤が選択されるという方式が用いられている。
【０００３】
例えば手術により摘出された組織切片が、アボット社のＨＥＲ−２ＤＮＡプローブキットが用いられて蛍光染色される。組織切片に励起光が照射されると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子から赤色を呈する蛍光が発せられ、アルファサテライトＤＮＡ配列から緑色を呈する蛍光が発せられる。従ってＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子は赤色を呈する輝点により標識され、アルファサテライトＤＮＡ配列は緑色を呈する輝点により標識される。
【０００４】
蛍光顕微鏡を用いた診断により赤色の輝点の数と緑色の輝点の数とがそれぞれ数えられる。そして緑色の輝点の数と比べて、赤色の輝点の数が２．２倍以上であれば、ＨＥＲ２陽性反応と判定される。この場合、ロシュ社のハーセプチンという分子標的薬剤が投与されることで、患者の手術後の予後が大幅に良くなると言われている。（非特許文献１参照）。
【０００５】
また、特許文献１には、生体サンプルの蛍光像から細胞を標識する輝点を検出する技術が記載されている。特許文献１に記載の生体サンプル像取得装置では、生体サンプルの対象とすべき部位が対物レンズにより拡大されて撮影される。その撮影の際に対物レンズの焦点を適宜移動させることで輝点の検出精度の向上が図られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１０７６６９公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＨＥＲ２検査ガイド、第３版、トラスツズマブ病理部会作成、２００９年９月、第１０頁＜ＦＩＳＨ法判定方法＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記したような蛍光顕微鏡を用いた診断等においては、光学系の焦点位置を適切に設定することが重要となる。例えばスライドガラス上に組織切片等の試料が配置され、封入剤を介してカバーガラスが載せられる。このようにして作成されたプレパラートが蛍光顕微鏡のステージ上にセットされる。この際、試料の厚さが一定でないこと、スライドガラスの厚さが一定でないこと、スライドガラスとステージとの間にゴミが挟まってしまうこと等の様々な理由により、ステージに載置されるプレパラートごとに焦点位置の調整が必要となる。
【０００９】
一方、蛍光顕微鏡で観察される像の解像度および輝点の輝度は、光学系の開口数（ＮＡ）が高いほど高くなる。従って開口数（ＮＡ）が高い光学系を用いた顕微鏡のほうが、上記の診断の正確性が高められる傾向にある。しかし、光学系の開口数（ＮＡ）を高くすると、焦点深度が狭くなってしまうので、焦点位置を見失いやすい。すなわち上記した焦点位置の調整が困難となる。
【００１０】
そこで、例えば焦点深度よりも小さい間隔で焦点位置を変えてその都度画像を撮影し、各撮影画像を分析することで焦点位置を探し出す方法が考えられる。しかし、この方法では多数の画像を撮影する必要があり、撮影枚数分の画像データを保存するための大容量のメモリが必要となる。また焦点位置を算出するために複数の画像データを参照しなければならず、多くの工数がかかり非効率である。
【００１１】
以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、蛍光標識が付された生体サンプルを効率よく撮影することが可能となる画像取得装置、画像取得方法及び画像取得プログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本技術の一形態に係る画像取得装置は、光源と、光学系と、撮像素子と、移動制御部と、データ処理部とを具備する。
前記光源は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する。
前記光学系は、前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む。
前記撮像素子は、前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される。
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる。
前記データ処理部は、前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する。
【００１３】
この画像取得装置では、撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で光学系の焦点位置が移動させられる。当該移動の間撮像素子が露光され生体サンプルの蛍光像が取得される。そして生体サンプルの蛍光像をもとに、撮像対象の厚さ方向における蛍光標識の分布情報が算出される。これにより例えば蛍光標識を適切に撮影するための焦点位置を容易に算出することが可能となる。この結果、蛍光標識が付された生体サンプルを効率よく撮影することが可能となる。
【００１４】
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さ方向に前記焦点位置を移動させるとともに、前記厚さ方向に垂直な面方向に前記焦点位置を移動させてもよい。
【００１５】
前記データ処理部は、前記蛍光像の前記蛍光標識の形状をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１６】
前記移動制御部は、前記撮影範囲を前記撮像対象の厚さ方向に分割する複数の分割撮影範囲のそれぞれにおいて、前記光学系の焦点位置を移動させてもよい。その場合、前記データ処理部は、前記複数の分割撮影範囲のそれぞれで取得された複数の蛍光像をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１７】
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの周波数成分を算出し、最大周波数成分が最も高い蛍光像をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１８】
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの輝度を算出し、最大輝度を有する蛍光像をもとに前記分布情報を算出してもよい。
【００１９】
前記画像取得装置は、前記算出された分布情報をもとに、前記生体サンプルに対する撮影モードを決定する撮影モード決定部をさらに具備してもよい。
【００２０】
本技術の一形態に係る画像取得方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射することを含む。
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置が移動される。
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像が取得される。
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報が算出される。
【００２１】
本技術の一形態に係る画像取得プログラムは、コンピュータに以下の工程を実行させる。
蛍光標識が付された生体サンプルに光源より当該蛍光標識に対する励起光を照射させる。
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置を移動させる。
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像を取得する。
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する。
【発明の効果】
【００２２】
以上のように、本技術によれば、蛍光標識が付された生体サンプルを効率よく撮影することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本技術の一実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。
【図２】図１に示すステージに載置される生体サンプルを側面方向から示した図である。
【図３】図１に示すデータ処理部のハードウェアの構成を示すブロック図である。
【図４】本実施形態に係る生体サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。
【図５】図１の画像取得装置による撮像対象の領域を示す図である。
【図６】図１に示すステージが移動した場合の光学系の焦点位置の移動を示す模式的な図である。
【図７】本実施形態に係る焦点位置の移動範囲について詳しく説明するための模式的な図である。
【図８】図７に示す分割撮影範囲のそれぞれにおいて撮影されたサンプル部位の蛍光像を示す模式的な図である。
【図９】本実施形態の実施例として撮影された写真であり、図８に示すそれぞれの蛍光像に相当するものである。
【図１０】図４に示す分布情報算出部による算出処理の一例を示すフローチャートである。
【図１１】本実施形態の開始位置から合焦像までの角度θを算出する処理の一例を示す図である。
【図１２】本実施形態に係る複数の蛍光マーカの分布情報の一例を示すグラフである。
【図１３】本実施形態に係る複数の蛍光マーカの分布情報の一例を示すグラフである。
【図１４】本実施形態に係る複数の蛍光マーカの分布情報の一例を示すグラフである。
【図１５】スライドガラスとステージとの間にゴミ等が挟まってしまう状態を示す模式図である。
【図１６】図１０に示す分布情報算出部による算出処理の変形例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
【００２５】
［画像取得装置の構成］
図１は、本技術の一実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。同図に示すように、本実施形態における画像取得装置１００は、顕微鏡１０と、データ処理部２０とを有する。
【００２６】
[顕微鏡の構成]
顕微鏡１０は、ステージ１１、光学系１２、光源１３及び撮像素子１４を有する。ステージ１１は、例えば組織切片、細胞、染色体等の生体高分子等の生体サンプルＳＰＬを載置可能な載置面を有し、当該載置面に対してその平行方向（ｘ−ｙ平面方向）及び垂直方向（ｚ軸方向）へ移動可能とされている。
【００２７】
載置面の垂直方向（ｚ軸方向）は、生体サンプルＳＰＬの厚さ方向に相当する。載置面の平行方向（ｘ−ｙ平面方向）は、上記厚さ方向に垂直な面方向に相当する。
【００２８】
図２は、上記ステージ１１に載置される生体サンプルＳＰＬをステージ１１の側面方向から示した図である。同図に示すように、生体サンプルＳＰＬは、Ｚ方向に例えば数μｍから数十μｍの厚さを有し、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれて所定の固定手法により固定されている。スライドガラスＳＧの厚さは例えば約１ｍｍである。カバーガラスＣＧの厚さは例えば約０．１５〜０．１７ｍｍである。
【００２９】
生体サンプルＳＰＬは蛍光染色剤によって染色されている。蛍光染色剤は同一の光源から照射される励起光によって蛍光を発する染色剤である。蛍光染色剤としては、例えば、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ＳｐＡｑｕａ、ＳｐＧｒｅｅｎなどを挙げることができる。
【００３０】
生体サンプルＳＰＬが染色されることにより、生体サンプルＳＰＬのターゲットとなる生体組織５０に蛍光標識が付されることになる。蛍光標識に対して所定の励起光が照射されると、蛍光標識から所定の蛍光が発せられる。従って生体サンプルＳＰＬが撮影されて蛍光像が生成された場合、ターゲットの生体組織５０は所定の色を呈する輝点（以下、「蛍光マーカ５５」という）により標識される。
【００３１】
図１に戻り、ステージ１１の上方には光学系１２が配置される。光学系１２は、対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂ、ダイクロイックミラー１２Ｃ、エミッションフィルタ１２Ｄ及び励起フィルタ１２Ｅを有する。光源１３は、例えば水銀ランプ等の電球やＬＥＤ（Light Emitting Diode）など、蛍光標識が付された生体サンプルＳＰＬに当該蛍光標識に対する励起光を照射するものである。
【００３２】
励起フィルタ１２Ｅは、生体サンプルＳＰＬの蛍光像を得る場合に、光源１３から出射された光のうち蛍光色素を励起する励起波長の光のみを透過させることで励起光を生成する。ダイクロイックミラー１２Ｃは、当該励起フィルタで透過されて入射する励起光を反射させて対物レンズ１２Ａへ導く。対物レンズ１２Ａは、当該励起光を生体サンプルＳＰＬへ集光する。そして対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂは、生体サンプルＳＰＬの像を所定の倍率に拡大し、当該拡大像を撮像素子１４の撮像面に結像させる。
【００３３】
生体サンプルＳＰＬに励起光が照射されると、生体サンプルＳＰＬの各組織に結合している染色剤が蛍光を発する。この蛍光は、対物レンズ１２Ａを介してダイクロイックミラー１２Ｃを透過し、エミッションフィルタ１２Ｄを介して結像レンズ１２Ｂへ到達する。エミッションフィルタ１２Ｄは、上記対物レンズ１２Ａによって拡大された、励起フィルタ１２Eを透過した光を吸収し発色光の一部のみが透過する。当該外光が喪失された発色光の像は、上述のとおり、結像レンズ１２Ｂにより拡大され、撮像素子１４上に結像される。
【００３４】
撮像素子１４としては、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ等が用いられる。撮像素子１４は、ＲＧＢ(Red、Green、Blue)の色別に光を受けて電気信号に変換する光電変換素子を有し、入射光からカラー画像を得るカラーイメージャである。
【００３５】
データ処理部２０は、光源１３を駆動させ、撮像素子１４を用いて生体サンプルＳＰＬの蛍光像を取得し、これをサンプルデータとして保存する。
【００３６】
［データ処理部の構成］
図３は、データ処理部２０のハードウェアの構成を示すブロック図である。データ処理部２０は、例えばＰＣ（Personal Computer）等のコンピュータにより構成される。データ処理部２０は、撮像素子１４より取得した生体サンプルＳＰＬの蛍光像を、例えばＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）等の任意形式のデジタル画像データとして保存する。
【００３７】
同図に示すようにデータ処理部２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、ＲＯＭ（Read Only Memory）２２、ＲＡＭ（Random Access Memory）２３、操作入力部２４、インターフェイス部２５、表示部２６及び記憶部２７を有し、これら各ブロックがバス２８を介して接続されている。
【００３８】
ＲＯＭ２２は、各種の処理を実行するためのファームウェア等の複数のプログラムやデータを固定的に記憶する。ＲＡＭ２３は、ＣＰＵ２１の作業用領域として用いられ、ＯＳ（Operating System）、実行中の各種アプリケーション、処理中の各種データを一時的に保持する。
【００３９】
記憶部２７は、例えばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や、フラッシュメモリ、その他の固体メモリ等の不揮発性メモリである。当該記憶部２７には、ＯＳや各種アプリケーション、各種データが記憶される。特に本実施形態では、記憶部２７には、撮像素子１４から取り込まれた蛍光画像データや、蛍光画像データを画像処理する画像処理アプリケーションも記憶される。
【００４０】
インターフェイス部２５は、顕微鏡１０のステージ１１、光源１３及び撮像素子１４をそれぞれ駆動するコントロール基板（ステージ駆動部１５、光源駆動部１６、撮像制御部１７）とそれぞれ接続され、所定の通信規格により当該コントロール基板とデータ処理部２０との間で信号のやり取りを行う。
【００４１】
ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２や記憶部２７に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開し、当該展開されたプログラムにしたがって、表示部２６及び記憶部２７を適宜制御する。
【００４２】
操作入力部２４は、例えばマウス等のポインティングデバイス、キーボード、タッチパネル、その他の操作装置である。
【００４３】
表示部２６は、例えば液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro-Luminescence）ディスプレイ、プラズマディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイ等である。当該表示部２６は、データ処理部２０に内蔵されていてもよいし、データ処理部２０に外部接続されていてもよい。
【００４４】
［生体サンプル像取得処理］
本実施形態では、生体サンプルＳＰＬのうち撮像対象となる部分の厚さの範囲を含む撮影範囲で、光学系１２の焦点位置が移動される。焦点位置が移動する間撮像素子１４が露光されることで生体サンプルＳＰＬの蛍光像が取得される。この蛍光像をもとに撮像対象の厚さ方向における蛍光標識の分布情報が算出される。蛍光標識の分布情報は、蛍光マーカ５５により標識されるターゲットの生体組織５０の分布情報に相当する。
【００４５】
算出された分布情報をもとに、例えば蛍光マーカ５５を適切に撮影するための焦点位置を容易に算出すること等が可能となる。この結果、蛍光マーカ５５が付された生体サンプルＳＰＬを効率よく撮影することが可能となる。以下、詳しく説明する。
【００４６】
データ処理部２０のＣＰＵ２１はＲＯＭ２２や記憶部２７に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開する。ＣＰＵ２１は、この展開されたプログラム（画像取得プログラム）に基づいて生体サンプル像取得処理を実行する。
【００４７】
図４はこの生体サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。同図において、ステージ制御部３１（移動制御部）は、生体サンプルＳＰＬの撮像対象とすべき部位（以下、これをサンプル部位とも呼ぶ）が撮像範囲に位置するようステージ１１を順次移動させて、例えば図５に示すように、該撮像範囲ＡＲに対して生体サンプルＳＰＬを割り当てる。なお、図５では、撮像範囲ＡＲに割り当てるべき生体サンプルＳＰＬの領域が重ならない態様となっているが、隣接する領域の一部が重なる態様であってもよい。
【００４８】
また、ステージ制御部３１は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、ステージ１１を移動する。これによりサンプル部位に対する光学系の焦点が移動する。本実施形態ではステージ１１の移動が制御されることで、サンプル部位の厚さ方向（ｚ軸方向（対物レンズ１２Ａの光軸方向）に焦点が移動するとともに、当該厚さ方向に垂直な面方向（ｘ−ｙ平面方向）に焦点が移動する。
【００４９】
具体的な例として、ステージ制御部３１は、ステージ１１の位置を次式に従って移動させる。
【００５０】
【数１】
【００５１】
式（１）及び式（２）に示すように、ステージ１１は、ｘ−ｙ平面上において座標（ｘ0，ｙ0）を中心とした半径Ｌの円に沿って移動させられる。中心座標（ｘ0，ｙ0）の位置及び半径Ｌの大きさは、撮像範囲ＡＲが撮影可能であるのなら任意に設定されてよい。
【００５２】
式（１）及び（２）中のｔexは露光時間を示す。すなわちステージ１１は、撮像素子１４により露光されている間、円移動させられる。言い換えれば、本実施形態では、ステージ１１を円移動させている間撮像素子１４が露光される。
【００５３】
式（３）に示すように、ステージ１１は、ｚ軸方向に沿っても移動させられる。ステージ１１は、撮像素子１４の露光時間に合わせて移動開始位置であるｚstartから、移動終了位置であるｚendまで等速で移動される。
【００５４】
図６は、ステージ１１が移動させられた場合の光学系の焦点位置の移動を示す模式的な図である。図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、焦点位置を含む焦点面ＦＰは、ｚ軸方向に沿ってｚstartからｚendまで移動させられる。それとともに、ｘ−ｙ平面上では中心座標（ｘ0，ｙ0）を中心として円移動させられる。
【００５５】
画像取得部３２（露光制御部）は、対象とすべきサンプル部位をステージ制御部３１が撮像範囲ＡＲに移動するごとに、ステージ１１の移動が開始された時点から終了する時点まで撮像素子１４を露光させるように撮像制御部１７に指令を送る。
【００５６】
画像取得部３２は、ステージ１１の移動が終了する時点で、当該移動終了時点と移動開始時点との間の露光により得られるサンプル部位の像を撮像制御部１７を介して撮像素子１４から取得する。そして画像取得部３２は、各撮像範囲ＡＲに割り当てられるサンプル部位の像を、所定の連結アルゴリズムを用いて連結することによって全体の生体サンプル像を生成する。
【００５７】
図７は、本実施形態に係る焦点位置の移動範囲について詳しく説明するための模式的な図である。図７に示すように、本実施形態では、サンプル部位の厚さの範囲Ｔを少なくとも含む撮影範囲Ｌをｚ軸方向に分割する複数の分割撮影範囲（Ｚｓｃａｎ＿１〜３）が設定される。これらの分割撮影範囲のそれぞれにおいて、上記した焦点位置の移動制御が行われる。すなわちそれぞれの分割撮影範囲において、ｚstart（１〜３）とｚend（１〜３）とが設定される（図７（Ｂ）参照）。
【００５８】
分割撮影範囲のｚ軸方向における大きさは、例えば２０μｍ〜５０μｍである。しかしながらこの数値に限定されない。また分割撮影範囲の数も限定されない。またサンプル部位の厚さの範囲Ｔを少なくとも含む撮影範囲Ｌの大きさも限定されない。
【００５９】
撮像範囲ＡＲに対して所定のサンプル部位が割り当てられた状態で、複数の分割撮影範囲のそれぞれにて焦点位置が移動させられる。そして分割撮影範囲ごとに蛍光像が取得される。従って所定のサンプル部位に対して３つの蛍光像が取得されることになる。
【００６０】
例えば所定のサンプル部位が割り当てられた状態で連続して３つの蛍光像が撮影されてもよい。あるいは、１つの分割撮影範囲にて生体サンプルＳＰＬの全体の撮影が行われ、その後に他の分割撮影範囲での撮影が実行されてもよい。
【００６１】
図８は、図７に示すＺｓｃａｎ＿１〜３のそれぞれにおいて撮影されたサンプル部位の蛍光像を示す模式的な図である。図９は、本実施形態の実施例として撮影された写真であり、図８に示すそれぞれの蛍光像に相当するものである。図９に示す写真は、半径Ｌが１５μｍ、ｚ軸方向の移動量（ｚend−ｚstart）が２０μｍ、撮像素子１４を露光させて画像を取り込む時間が１ｓｅｃの条件で撮影された蛍光像である。その他、ガンマ値等の撮影条件も適宜調整される。
【００６２】
図７に示すように、Ｚｓｃａｎ＿１及び３は、ｚ軸方向において蛍光マーカ５５を含まない範囲である。従ってこの範囲で撮影された蛍光像であるｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１及び３では、図８及び図９に示すように、蛍光マーカ５５の像は非常のぼやけてしまっている（それぞれの図の（Ａ）と（Ｃ））。
【００６３】
一方、Ｚｓｃａｎ＿２にて撮像された蛍光像であるｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２では、蛍光マーカ５５の位置から近い範囲で焦点位置が移動される。従って撮影されたｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２では、図８及び図９の（Ｂ）に示すように、焦点位置の移動にともなう蛍光マーカ５５の軌跡の像が写されている。
【００６４】
分布情報算出部３３は、画像取得部３２により生成された生体サンプルＳＰＬの蛍光像をもとに、サンプル部位の厚さ方向における蛍光マーカ５５の分布情報を算出する。本実施形態では、図８及び図９に示す、Ｚｓｃａｎ＿１〜３のそれぞれにおいて撮影された複数の蛍光像をもとに分布情報が算出される。
【００６５】
図１０は、分布情報算出部３３による算出処理の一例を示すフローチャートである。本実施形態では、Ｚｓｃａｎ＿１〜３のそれぞれにおいて撮影された複数の蛍光像に対して周波数解析が実行される（ステップ１０１）。これにより、複数の蛍光像（ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３）のそれぞれ空間周波数が算出される。
【００６６】
各蛍光像の最大周波数成分が比較され、最大周波数成分が最も高い蛍光像が選択される（ステップ１０２）。図８及び図９に示すように、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１及び３では蛍光マーカ５５の像がぼやけている。一方、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２には蛍光マーカ５５の軌跡の像が写されている。従って、ステップ１０２において、最大周波数が最も高い蛍光像としてｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２が選択される。
【００６７】
最大周波数が最も高いｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２の蛍光マーカ５５の軌跡の像が解析される（ステップ１０３）。すなわち本実施形態では、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２の蛍光マーカ５５の形状が解析される。
【００６８】
分布情報算出部３３は、画像取得部３２により生成されたｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２から、ターゲットとされる生体組織５０を標識する蛍光マーカ５５（以下「標的マーカ」とも呼ぶ。また蛍光マーカ５５ａと記載する）を検出する。
【００６９】
分布情報算出部３３には、例えば、設定情報として、標的マーカが呈する色（以下「標的マーカ色」と呼ぶ。）と、細胞核を標識する蛍光マーカ５５（以下「核マーカ」と呼ぶ。）が呈する色（以下「核マーカ色」と呼ぶ。）とが設定される。
【００７０】
また、対照とすべき遺伝子を標識する蛍光マーカ５５（以下「対照マーカ」と呼ぶ。また蛍光マーカ５５ｂと記載する）が用いられている場合、該対照とすべき遺伝子が正常の細胞核内に存在する数が設定される。またこの場合、対照遺伝子を標識する蛍光マーカが呈する色（以下「対照マーカ色」と呼ぶ。）も設定される。
【００７１】
これら設定情報は、蛍光染色に使用すべきプローブの製造元や、蛍光マーカの種などの使用条件によって一義的に決まる。具体的には、例えばアボット社のＨＥＲ−２ＤＮＡプローブキットの場合、ＨＥＲ２遺伝子の標的マーカ色は「赤」として設定され、核マーカ色は「青」として設定される。またこの場合、染色体上のＨＥＲ２遺伝子の隣に位置する遺伝子が対照遺伝子とされ、該対照遺伝子の対照マーカ色は「緑」として設定される。
【００７２】
分布情報算出部３３は、設定された各マーカ色を呈し、かつ閾値以上の輝度を検出することで、蛍光マーカ５５の形状（面積）や数等を検出する。そして当該蛍光マーカ５５の形状を解析することで、複数の蛍光マーカ５５の分布情報を算出する。
【００７３】
図８（Ｂ）には、例として２つの蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂが図示されている。上記したように光学系１２の焦点位置が移動される間、撮像素子１４が露光されることでｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２が生成される。ステージ１１の面方向であるｘ−ｙ平面において焦点位置は円移動されるので、蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂは円Ｏに沿って移動する。すなわち焦点移動の開始位置ｚstartから終了位置ｚendまで蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂの軌跡は半円を描く（ここでは露光時間の間焦点位置が半円上を移動する場合が図示されている）。
【００７４】
光学系１２の焦点位置は、ｚ軸方向にも上方に向けてＺｓｃａｎ＿２の範囲で移動される。その移動の間のいずれかの焦点位置で、蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂのそれぞれに対する焦点が最も合うことになる。最も焦点が合っている状態では、蛍光マーカ５５ａ及び５５ｂの像の面積は最も小さくなり、輝度が最も高くなる。この面積が最も小さい像を合焦像６０と記載する。
【００７５】
本実施形態では、開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが算出され、この角度θをもとにサンプル部位の厚さ方向における蛍光マーカ５５の分布情報が算出される。
【００７６】
例えば図（Ｂ）に示す蛍光マーカ５５ｂでは、半円を描く蛍光マーカ５５ｂの軌跡の中間位置に合焦像６０が存在する。角度θは約９０度となる。この場合、焦点位置がＺｓｃａｎ＿２の中間に移動したときに最も焦点が合っていることになる。従って蛍光マーカ５５ｂが、Ｚｓｃａｎ＿２の中間に位置していることが分かる。
【００７７】
もう一方の蛍光マーカ５５ａを見ると、半円を描く蛍光マーカ５５ａの軌跡の中間位置から終了位置ｚendに近い位置に合焦像６０が存在する。角度θは約１３５度となる。この場合、焦点位置がＺｓｃａｎ＿２の中間をこえて上部に移動したときに最も焦点が合っていることになる。従って蛍光マーカ５５ａが、Ｚｓｃａｎ＿２の上部側に位置していることが分かる。
【００７８】
開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが小さいほど、蛍光マーカ５５は、開始位置ｚstartに近い位置に存在することになる。すなわち蛍光マーカ５５は、生体サンプルＳＰＬ内のステージ１１に近い側に位置することになる。
【００７９】
一方、角度θが大きいほど、蛍光マーカ５５は、終了位置ｚendに近い位置に存在することになる。すなわち蛍光マーカ５５は、生体サンプルＳＰＬ内のステージ１１から離れた側に位置することになる。
【００８０】
図１１は、本実施形態の開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θを算出する処理の一例を示す図である。
【００８１】
撮影された画像７０から解析対象となる蛍光マーカ５５の像がトリミング処理により切り取られる（ステップ２０１）。切り取られたトリミング画像７５は、理論的な画像とマッチング処理される。
【００８２】
図１１に示すように、本実施形態では、理論的な画像のファイルが記憶部２７等に記憶されている。このファイルには、０度から３５９度までの角度にそれぞれ紐付けられた複数の理論的な画像８０が格納されている。本実施形態では、紐付けられた角度の大きさがその理論的な画像８０の識別番号となっている。
【００８３】
理論的な画像８０を作成するための、波長、開口数、倍率、画素ピッチ等は適宜設定されてよい。またどの角度を０度として設定するか、また何度ごとに理論的な画像を準備するか等も適宜設定可能である。例えば１度ごとに理論的な画像８０を準備する場合、３５９枚の理論的な画像８０が作成されることになる。
【００８４】
これら複数の理論的な画像８０と、トリミング画像７５との相関係数が計算される（ステップ２０２）。そして最も相関係数が高い理論的な画像８０の識別番号が算出される（図１１のグラフ参照）。撮影画像７０の複数の蛍光マーカ５５について、最も相関係数が高くなる理論的な画像８０の識別番号がそれぞれ算出される。複数の蛍光マーカ５５に対応付けられた識別番号のリストが生成されそのファイルが記憶部２７等に記憶される（ステップ２０３）。
【００８５】
それぞれの蛍光マーカ５５に応じて算出された理論的な画像８０の識別番号（角度）をもとに、上記した開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが適宜算出される。例えば当該角度θが識別番号としての角度と一致するように理論的な画像８０が準備されてもよい。あるいは識別番号としての角度により、蛍光マーカ５５の形状が判別され、そこから改めて開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θが算出されてもよい。なお、開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θを算出する方法は図１１に示すものに限定されず、他の方法が用いられてもよい。
【００８６】
複数の蛍光マーカ５５のそれぞれについて算出された開始位置ｚstartから合焦像６０までの角度θをもとに、サンプル部位の厚さ方向における蛍光マーカ５５の分布情報が算出される（ステップ１０４）。すなわち本実施形態では、蛍光マーカ５５ごとにｚ軸方向での位置情報が算出されるので、複数の蛍光マーカ５５の分布情報が算出可能となる。
【００８７】
図１２から図１４は、複数の蛍光マーカ５５の分布情報の一例を示すグラフである。このように蛍光マーカ５５の分布情報は、ヒストグラム形式のデータとして生成可能である。これらのグラフでは、横軸がｚ軸方向での位置、縦軸が蛍光マーカ５５の数を示している。
【００８８】
本実施形態では、横軸を対物レンズの焦点深度Ｆの半分の大きさ（Ｆ／２）で区切り、各範囲に含まれる蛍光マーカ５５の数がカウントされている。横軸の分解能は、Ｆ／２に限定されず、焦点深度よりも小さい値が適宜設定されればよい。また焦点深度よりも大きい値が設定されてもかまわない。
【００８９】
すなわち光学系１２の焦点位置を横軸のある範囲内に設定すると、その範囲に含まれる蛍光マーカ５５の合焦像が撮影される。その他の範囲に含まれる蛍光マーカ５５は、焦点位置から遠い位置にあるものほど、ぼけて撮影される。
【００９０】
このような蛍光マーカ５５の分布情報をもとに、生体サンプルＳＰＬの撮影が行われる。蛍光マーカ５５の分布情報が参照可能であるので、撮影モードや撮影目的に合わせた効率のよい高精度の撮影が可能となる。
【００９１】
例えば生体サンプルＳＰＬに存在する複数の蛍光マーカ５５のうち、ある程度の数の蛍光マーカ５５にピントが合っていればよいような蛍光像を撮影することが目的であるとする。この場合、図１２に示すように、最も蛍光マーカ５５の数が多い範囲に含まれる位置Ａに焦点位置を合わせた撮影を１回行えばよいと判断される。これにより高精度の蛍光像を撮影することが可能となる。
【００９２】
生体サンプルＳＰＬに含まれる蛍光マーカ５５全体の数や種類等を定量的に観察することが目的であるとする。この場合、分布情報より蛍光マーカ５５が位置する全体範囲Ｂを算出し、全体範囲Ｂをスキャンすることで、全ての蛍光マーカ５５がもれなく撮影された蛍光像を撮像することが可能である。
【００９３】
例えば焦点位置を全体範囲Ｂの始点と終点まで移動させる間、撮像素子１４を露出することで、１つの蛍光像が撮影されてもよい。または、図１３に示すように、全体範囲Ｂの両側に所定のマージンＭを加えた延長範囲Ｃにて焦点位置が移動されてもよい。これにより全体範囲Ｂの中間に位置する蛍光マーカ５５の像と、端に位置する蛍光マーカ５５の像とが、略同様にぼけて撮影される。すなわち全体の蛍光マーカ５５が略同様の大きさ及び輝度で撮影されるので、蛍光マーカ５５の測定精度を向上させることができる。
【００９４】
１つのサンプル部位に対して、ｚ軸方向における異なる焦点位置で複数の蛍光像を撮影する、いわゆるZ-stackと呼ばれる撮影モードがある。このZ-stackが行われる場合でも、分布情報が適宜利用可能である。例えば図１３に示す全体範囲Ｂを参照することで、Z-stackを実行する範囲が定められる。またグラフを参照することで、異なる焦点位置の間隔や撮影枚数等を適宜設定することできる。例えば横軸を区切る範囲に合わせてZ-stackが実行されてもよい。このように分布情報を参照することで高精度の蛍光像を撮影することができる。
【００９５】
図１４に示すように、蛍光マーカ５５の分布が２つの山に分かれるようなグラフとなる場合も考えられる。すなわち異なる２つの位置の付近に、それぞれ蛍光マーカ５５が集中している場合等である。このような場合に、ある程度の数の蛍光マーカ５５にピントが合っていればよいということで、中間位置にて１回の撮影を行ってしまうと撮影が失敗してしまう可能性がある。
【００９６】
分布情報が参照されることで、各山に含まれる位置Ｄ及び位置Ｅが焦点位置として算出される。それらの位置に焦点位置が合わせられ、計２回の撮影が実行されることで、撮影失敗のない、高精度の蛍光像を撮影することができる。
【００９７】
図４に示すデータ記録部３４は、画像取得部３２により生成されたサンプル部位毎の生体サンプル像を連結して１つの生体サンプル画像を生成し、ＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）など所定の圧縮形式のサンプルデータに符号化してデータ記憶部３５に記録する。この処理は分布情報算出部３３による分布情報の算出の前に行われてもよい。
【００９８】
またデータ記録部３４は、分布情報算出部３３により算出された分布情報を受けて、そのデータをデータ記憶部３５にサンプルデータと関連付けて記録する。
【００９９】
その他データ記憶部３５には、例えば分布情報算出部３３による蛍光マーカ５５の測定結果データ（蛍光マーカの面積、数、種類等）、生体サンプルＳＰＬの採取者名、採取者性別、採取者年齢及び採取日付などの情報が記録されてもよい。
【０１００】
以上、本実施形態に係る画像取得装置１００は、サンプル部位の厚さの範囲Ｔを少なくとも含む撮影範囲Ｌで光学系１２の焦点位置が移動させられる。当該移動の間撮像素子１４が露光され生体サンプルＳＰＬの蛍光像が取得される。そして生体サンプルＳＰＬの蛍光像をもとに、サンプル部位の厚さ方向（ｚ軸方向）における蛍光マーカ５５の分布情報が算出される。これにより例えば撮影モードや撮影目的に合った、蛍光マーカ５５を適切に撮影するための焦点位置を容易に算出することが可能となる。この結果、蛍光マーカ５５が付された生体サンプルＳＰＬを効率よく撮影することが可能となる。
【０１０１】
例えば焦点深度よりも小さい間隔で焦点位置を変えてその都度画像を撮影し、各撮影画像を分析することで焦点位置を探し出す方法を想定する。この方法では多数の画像を撮影する必要があり、撮影枚数分の画像データを保存するための大容量のメモリが必要となる。また焦点位置を算出するために複数の画像データを参照しなければならず、多くの工数がかかり非効率である。
【０１０２】
具体的には、ＮＡを０．８とした場合においては、焦点深度は約１μｍ程度となる。そして焦点位置を捜すために、焦点位置を例えば１μｍずつ変えながら複数枚の画像撮影を行い、その画像を分析することにより焦点位置を捜すこととする。その場合５０μｍをこえる範囲を１μｍずつ焦点位置を変化させた測定を行うと５０枚以上の画像を撮影し、記録する必要がある。イメージャに１４ｂｉｔで２４Ｍｐｉｘのイメージャを用いた場合においては、１枚の画像ファイルがｔｉｆ方式で約１００ＭＢの容量となる。従って５０枚以上の画像を処理する場合には、５ＧＢ以上のメモリを要することとなるので、工程が煩雑となる。
【０１０３】
本実施形態では、図７に示すように、３つの分割撮影範囲としてＺｓｃａｎ＿１〜３が設定された。このように焦点深度よりも大きい範囲が設定され、少ない回数の撮影により分布情報が算出される。これにより大幅に撮影枚数を削減した焦点位置の探索が可能となる。
【０１０４】
図７では、生体サンプルＳＰＬが位置しない範囲も含めて撮影範囲Ｌが設定されている（Ｚｓｃａｎ＿１及び３）。例えば図１５に示すように、スライドガラスＳＧとステージ１１との間に毛髪等のゴミ９０（例えば約２０μｍ〜５０μｍの大きさ）等が挟まってしまう場合がある。このような場合に、例えばスライドガラスＳＧの厚さのみを考慮して撮影範囲Ｌを設定すると焦点位置を見失ってしまう可能性が高い。従って生体サンプルＳＰＬが位置しない範囲も含めて撮影範囲Ｌを適宜設定することで、蛍光マーカ５５の分布情報を高精度に算出することが可能となる。上記したように少ない撮影枚数で焦点位置を探索することが可能なので、撮像範囲Ｌを大きく設定することが可能である。
【０１０５】
自動的に焦点位置を探索及び調整する場合においては、イメージャ上のゴミ、イメージャの欠陥と、スライドガラスＧＳ上の蛍光の輝点とを誤認識してしまい、焦点位置が異なる位置を合焦点位置であると判断してしまうというエラー発生もあり得る。
【０１０６】
本実施形態では、図１０に示すステップ１０１及び１０２にて、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３のそれぞれの空間周波数が算出され、最大周波数が最も高い画像が選択された。このように周波数成分が解析され比較されることで、イメージャ（撮像素子１４）上のゴミやイメージャの欠陥等の影響を受けずに、蛍光マーカ５５の合焦像６０を含む画像（ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ２）を選択することが可能となる。
【０１０７】
＜変形例＞
本技術に係る実施形態は、上記で説明した実施形態に限定されず種々変形される。
【０１０８】
図１６は、図１０に示す分布情報算出部３３による算出処理の変形例を示すフローチャートである。本変形例では、ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３のそれぞれにおいて輝度が算出される（ステップ３０１）。そして最大輝度を有する蛍光像が選択され（ステップ３０２）、その蛍光像に対して蛍光マーカ解析処理が実行される（ステップ３０３）。このように複数の分割撮影範囲にてそれぞれ撮影された蛍光像の輝度をもとに、分布情報の算出処理の対象となる蛍光像が選択されてもよい。これにより演算量を抑えることができる。
【０１０９】
上記の実施形態では、図７に示すように、撮影範囲Ｌを分割する複数の分割撮影範囲が設定され、当該分割撮影範囲ごとに蛍光像が撮影された。しかしながら撮影範囲Ｌ全体でステージを移動させて、１回の撮影で蛍光像が生成されてもよい。そしてその蛍光像をもとに蛍光マーカ５５の分布情報が算出されてもよい。
【０１１０】
例えば１００μｍ程度の撮影範囲Ｌに対して１回の撮影が実行されてもよい。これにより演算量の軽減、処理速度の向上等を図ることができる。分割撮影範囲の設定の有無は、例えば撮影範囲Ｌの大きさや撮像素子１４の精度等をもとに判断されればよい。
【０１１１】
上記では、撮影モードや撮影目的に合わせて適宜分布情報を利用することができることを説明した。逆に分布情報に基づいて、最適な撮影モードや撮影目的が選択されてもよい例えば複数の蛍光マーカ５５が焦点深度の範囲内に集まっている場合は、焦点位置が固定された１回の撮影が選択される。複数の蛍光マーカ５５が分散している場合は、Z-stackによる撮影が選択されるといった等の判断処理が実行されてもよい。この際、例えばデータ処理部２０が、撮影モード決定部として機能する。
【０１１２】
また蛍光マーカ５５のうち、標的マーカ（赤色）のみ、あるいは対照マーカ（緑）のみが、分布情報算出の対象として設定されてもよい。これらの設定は、例えばユーザの操作により入力されてもよい。
【０１１３】
また蛍光像に写されている蛍光マーカ５５の全てにおいて位置情報が算出されなくてもよい。すなわち蛍光マーカ５５が間引かれて選択され、その位置情報をもとに分布情報が算出されてもよい。
【０１１４】
なお、上述の実施形態の顕微鏡１０の構成において、対物レンズ１２Ａは接眼レンズとすることもできる。
【０１１５】
また、上述の実施形態では、焦点位置を移動させるためにステージ１１を移動させることとしたが、光学系１２の対物レンズ１２Ａを移動させるようにしてもよい。
【０１１６】
上述の実施の形態では、データ処理部２０にデータ記憶部３５を設けて、これに生体サンプル像と蛍光マーカ５５の分布情報等を記録することとしたが、外部の記憶装置に記録するようにしてもよい。
【０１１７】
顕微鏡１０とデータ処理部２０との接続には、バス伝送路の他、ローカルエリアネットワークやインターネット、デジタル衛星放送等の有線又は無線の伝送媒体を用いることができる。
【０１１８】
なお、本技術は以下のような構成も採ることができる。
【０１１９】
（１）蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出するデータ処理部と
を具備する画像取得装置。
（２）前記（１）に記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さ方向に前記焦点位置を移動させるとともに、前記厚さ方向に垂直な面方向に前記焦点位置を移動させる
画像取得装置。
（３）前記（１）又は（２）に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記蛍光像の前記蛍光標識の形状をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（４）前記（１）から（３）のうちいずれか１つに記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮影範囲を前記撮像対象の厚さ方向に分割する複数の分割撮影範囲のそれぞれにおいて、前記光学系の焦点位置を移動させ、
前記データ処理部は、前記複数の分割撮影範囲のそれぞれで取得された複数の蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（５）前記（４）に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの周波数成分を算出し、最大周波数成分が最も高い蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（６）前記（４）に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの輝度を算出し、最大輝度を有する蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
（７）前記（１）から（６）のうちいずれか１つに記載の画像取得装置であって、
前記算出された分布情報をもとに、前記生体サンプルに対する撮影モードを決定する撮影モード決定部を
さらに具備する画像取得装置。
【符号の説明】
【０１２０】
ＳＰＬ…生体サンプル
ＦＰ…焦点面
Ｔ…サンプル部位の厚さの範囲範囲
Ｌ…撮影範囲
Ｚｓｃａｎ＿１〜３…分割撮影範囲
ｉｍａｇｅ＿Ｚｓｃａｎ１〜３…蛍光像
１０…顕微鏡
１２…光学系
１３…光源
１４…撮像素子
２０…データ処理部
３１…ステージ制御部
３２…画像取得部
３３…分布情報算出部
５０…生体組織
５５…蛍光マーカ
１００…画像取得装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出するデータ処理部と
を具備する画像取得装置。
【請求項２】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さ方向に前記焦点位置を移動させるとともに、前記厚さ方向に垂直な面方向に前記焦点位置を移動させる
画像取得装置。
【請求項３】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記蛍光像の前記蛍光標識の形状をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項４】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮影範囲を前記撮像対象の厚さ方向に分割する複数の分割撮影範囲のそれぞれにおいて、前記光学系の焦点位置を移動させ、
前記データ処理部は、前記複数の分割撮影範囲のそれぞれで取得された複数の蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項５】
請求項４に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの周波数成分を算出し、最大周波数成分が最も高い蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項６】
請求項４に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの輝度を算出し、最大輝度を有する蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項７】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記算出された分布情報をもとに、前記生体サンプルに対する撮影モードを決定する撮影モード決定部を
さらに具備する画像取得装置。
【請求項８】
蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置を移動させ、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像を取得し、
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する
画像取得方法。
【請求項９】
蛍光標識が付された生体サンプルに光源より当該蛍光標識に対する励起光を照射させ、
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置を移動させ、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像を取得し、
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する
ことをコンピュータに実行させる画像取得プログラム。
【請求項１】
蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記撮像対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記撮像素子を露光させて前記生体サンプルの蛍光像を取得し、当該蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出するデータ処理部と
を具備する画像取得装置。
【請求項２】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮像対象の厚さ方向に前記焦点位置を移動させるとともに、前記厚さ方向に垂直な面方向に前記焦点位置を移動させる
画像取得装置。
【請求項３】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記蛍光像の前記蛍光標識の形状をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項４】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記移動制御部は、前記撮影範囲を前記撮像対象の厚さ方向に分割する複数の分割撮影範囲のそれぞれにおいて、前記光学系の焦点位置を移動させ、
前記データ処理部は、前記複数の分割撮影範囲のそれぞれで取得された複数の蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項５】
請求項４に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの周波数成分を算出し、最大周波数成分が最も高い蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項６】
請求項４に記載の画像取得装置であって、
前記データ処理部は、前記複数の蛍光像のそれぞれの輝度を算出し、最大輝度を有する蛍光像をもとに前記分布情報を算出する
画像取得装置。
【請求項７】
請求項１に記載の画像取得装置であって、
前記算出された分布情報をもとに、前記生体サンプルに対する撮影モードを決定する撮影モード決定部を
さらに具備する画像取得装置。
【請求項８】
蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置を移動させ、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像を取得し、
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する
画像取得方法。
【請求項９】
蛍光標識が付された生体サンプルに光源より当該蛍光標識に対する励起光を照射させ、
前記生体サンプルの撮影対象の厚さの範囲を少なくとも含む撮影範囲で、前記撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系の焦点位置を移動させ、
前記焦点位置を前記撮影範囲で移動させる間前記対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子を露光させて、前記生体サンプルの蛍光像を取得し、
前記取得された蛍光像をもとに前記撮像対象の厚さ方向における前記蛍光標識の分布情報を算出する
ことをコンピュータに実行させる画像取得プログラム。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１１】
【公開番号】特開２０１３−１１４０４２（Ｐ２０１３−１１４０４２Ａ）
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６０２７１（Ｐ２０１１−２６０２７１）
【出願日】平成２３年１１月２９日（２０１１．１１．２９）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月２９日（２０１１．１１．２９）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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