画像認識システムを用いてサンプルの薄切片を作製する方法及び装置
【課題】作製された薄切片の高品質を保障しつつ、ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法を提供する。
【解決手段】カメラ２４が、サンプル１６の切片化によって作製された表面の少なくとも１の画像を獲得する。評価装置の助けにより、表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価する。その際に、同定された特徴値の関数として、サンプル１６の切片が許容されるか否かの決定を行う。
【解決手段】カメラ２４が、サンプル１６の切片化によって作製された表面の少なくとも１の画像を獲得する。評価装置の助けにより、表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価する。その際に、同定された特徴値の関数として、サンプル１６の切片が許容されるか否かの決定を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いてサンプルの薄切片を作製する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロトームによって作製された薄切片は、通常、ユーザによって注意深く検査され、そして後の顕微鏡観察の際に、個々の薄切片における情報内容が評価できるように、それらがある品質基準を満足しているかどうかがチェックされる。そのような手順とともに、サンプル、例えば、生体組織サンプルから最大の情報回収率を取得するために、薄切片の作製の分野及び顕微鏡観察の分野における特別な知識及び経験を持つことがユーザにとって必要である。例えば、サンプルが十分深くプレカット（precut）されており、そしてそれの比較的に大きな断面の表面が調査できる点でのみ、パラフィンに包埋したサンプルの薄切片が作製されるべきである。薄切片は、顕微鏡観察下の誤解釈になり得る縦方向の溝（grooves）及び／または横方向の溝を、含有するべきでないか、ないしは少しのみ含有するべきである。加えて、薄切片の厚さの変動は、容認可能な許容限度内でなければならない。多数のサンプルを調査しなければならない場合、薄切片の品質基準の評価のために必要な仕事は、ユーザにとって疲れることであり、そして誤った評価が起こり得る。
【０００３】
ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／６２０３５Ａ１は、組織サンプルの自動作製のシステム及び方法を開示する。光学的な画像作製システムの助けにより、パラフィン内の組織サンプルの位置が決定できるし、そして切片化される組織サンプルを整列できる。加えて、光学的な画像作製方法は、標本スライド上への薄切片の設置を補助することに使用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ００／６２０３５Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
作製された薄切片の高品質を保障しつつ、ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法及びその方法を実行する装置を提示することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
方法のための、この目的は、請求項１の特徴によって達成される。即ち、本発明の一視点において、ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法が提供される。該方法は、カメラが、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得し、評価装置が画像処理プログラムを有し、該画像処理プログラムは、前記表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、前記評価装置のティーチインフェーズにおいて、作業者が、どのサンプルの切片が承認可能であるか否かの通知を行い、切片が予め作業者によって主観的に「良」若しくは「悪」の分類に区分され、前記評価装置が切片に関連する画像を評価して、関連する特徴値を同定し、各薄切片の切断方向に沿った縦方向の細溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、及び／又は、各薄切片の切断方向に対する横方向の溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、そして前記評価装置による後続の自動作動において、同定された特徴値を関数として、サンプルの切片が承認されるか否かを決定する。
なお、特許請求の範囲に付記した図面参照符号は、専ら理解を助けるためのものであり、図示の態様に限定することを意図するものではない。
本発明において以下の形態が可能である。
（形態１）カメラが、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得し、評価装置が、該表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、そして同定された特徴値を関数として、サンプルの切片が承認されるか否かを決定する、ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法。
（形態２）上記の方法において、トリミングモードにおいて、トリミング平面を探すための切片化処理が行われ、トリミングモードにおける切片の切片厚が、１０から５０μｍ（好ましくは２０から３０μｍ）の範囲内であることが好ましい。
（形態３）上記の方法において、トリミング平面の決定のために、サンプルが包埋されたパラフィンブロックの明るい表面と、サンプル物質を表すプレカットされたサンプルの暗い切片化領域との間のコントラストの違いが、評価装置の助けにより特徴値として評価されることが好ましい。
（形態４）上記の方法において、プレカットされたサンプルの切片化領域が、サンプルの切片方向における前決定された最大の断面領域の一部に等しい（好ましくは、少なくとも８０％に等しい）場合に、トリミング平面が同定されることが好ましい。
（形態５）上記の方法において、薄切片を作製するための薄切片モードにおいて、切片厚が１から１０μｍ（好ましくは、２から５μｍ）までの範囲内であり、切片化過程がトリミングモードと比べて減速した切片化速度で行われることが好ましい。
（形態６）上記の方法において、薄切片の作製のための薄切片モードにおける切片化過程がトリミング平面の同定の後でのみ行われることが好ましい。
（形態７）上記の方法において、評価装置が特徴値を同定する画像処理プログラムを有することが好ましい。
（形態８）上記の方法において、切片厚が薄切片品質の特徴値として使用され、薄切片内において、切片厚内のゆらぎの構成が前定義された値未満である（好ましくは、前定義された切片厚の５％未満である）薄切片が承認されることが好ましい。
（形態９）上記の方法において、切片のしわが薄切片品質の特徴値として使用されることが好ましい。
（形態１０）上記の方法において、各薄切片の切断方向に沿った縦方向の細溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前定義された数（好ましくは５未満）に基づいて当該薄切片が承認されることが好ましい。
（形態１１）上記の方法において、各薄切片の切断方向に対する横方向の溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前定義された数（好ましくは５未満）に基づいて当該薄切片が承認されることが好ましい。
（形態１２）上記の方法において、表示装置がユーザに現在の薄切片が承認される否かを示すことが好ましい。
（形態１３）上記の方法において、前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に、切片化ナイフが置き換えられることが好ましい。
（形態１４）上記の方法において、前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に切片化パラメータが訂正されることが好ましい。
（形態１５）上記の方法において、切片化パラメータを訂正するために切片化速度、逃げ角及び切片厚の１以上が変更されることが好ましい。
（形態１６）上記の方法において、薄切片の特定の数に到達するまで切片化過程が薄切片モードにおいて行われることが好ましい。
（形態１７）上記の方法において、一度前定義された数の承認可能な薄切片が取得された場合、若しくは承認不可能な薄切片の前定義された数を関数として、若しくは作業者指示を関数として、切片化過程がトリミングモードにおいて続行され、新たなトリミング平面が探されて、薄切片モードへの移行が行われることが好ましい。
（形態１８）上記の方法において、評価装置のティーチインフェーズ（teach-in phase）において、作業者が、どのサンプルの切片が承認可能であるか否かの通知を行い、評価装置が切片に関連する画像を評価して、特徴値を同定することが好ましい。
（形態１９）上記の方法において、透過光モードにおいて、カメラを用いて若しくは超音波測定方法の助けにより、未カットのサンプル上で、サンプルの最大の断面領域が同定されることが好ましい。
（形態２０）サンプルが包埋されたパラフィンブロックを切片化するためのミクロトーム、カメラ及び評価装置を有し、カメラが、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得し、評価装置が、該表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、そして同定された特徴値を関数として、サンプルの切片が承認されるか否かを決定する、サンプルの薄切片作製装置。
（形態２１）上記の装置において、トリミング平面の決定のために、評価装置が、パラフィンブロックの明るい表面と、プレカットされたサンプルの暗い切片化領域との間のコントラストの違いを特徴値として評価することが好ましい。
（形態２２）上記の装置において、評価装置が、特徴値を同定する画像処理プログラムを有することが好ましい。
（形態２３）上記の装置において、評価装置が、作製された薄切片の薄切片品質の特徴値を同定し、前記特徴値の機能としてミクロトームの切片化パラメータを調節することが好ましい。
（形態２４）切片化パラメータを訂正するために切片化速度、逃げ角及び切片厚の１以上が変更されることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、薄切片の、その高品質を保障しつつミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法及びその方法を実行する装置を提供することができる。即ち、高い評価品質とともに、その優れた再現性が達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明の具体例の例示は、以下に図面を参照して開示される。
【図１】図１は、分割するサンプルを伴うミクロトームの側面図である。
【図２】図２は、自動的に薄切片を製造する装置のハードウェア配置を模式的に表わす。
【図３Ａ】図３Ａは、薄切片を自動的に製造する方法の実行のフローチャートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、薄切片を自動的に製造する方法の実行のフローチャートである。
【図４】図４は、パラフィンブロック及びそこに配置されたサンプルを有するカセットの側面図である。
【図５】図５は、図４による配置（ないしアレンジメント）の斜視図である。
【図６】図６は、図４による配置の平面図である。
【図７】図７は、プレカットサンプルを伴う図４による配置を示す。
【図８】図８は、その斜視図である。
【図９】図９は、その平面図である。
【図１０】図１０は、最大の領域領域（ないし断面積）を有するプレカットサンプルを示す。
【図１１】図１１は、その斜視図である。
【図１２】図１２は、その平面図である。
【図１３】図１３は、カセット、光源及びカメラを有する配置を示す。
【図１４】図１４は、横方向及び縦方向の溝を含有する切片を有するカセットの斜視図である。
【図１５】図１５は、図１４による配置の平面図である。
【図１６】図１６は、サンプルの最大の断面積を同定するための配置を示す。
【図１７】図１７は、図１６による配置の平面図である。
【図１８】図１８は、超音波センサを有する配置を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明によれば、カメラは、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得する。評価装置は、前定義された切片品質の特徴値に基づいて、該表面の画像を評価する。同定された特徴値を関数として、その時に、サンプルの切片が承認されたか否かの決定が行われる。
【００１０】
カメラ及びカメラによって獲得された画像を評価する評価装置の使用は、サンプルの切片の評価作業を客観的にする。サンプルのこの切片は、顕微鏡観察によって後に調査される薄切片であり得る、又は、そこから始まって薄切片が作製される（さらに詳細に後に開示されるように）トリミング平面（trimming plane）を位置づけるためのサンプルへの初期のカットであり得る。評価装置及び前決定された切片品質の特徴値の助けにより、サンプルの切片が承認されたか否かの決定が行われる。客観化されうる特徴値に基づいてこの決定が行われるので、薄切片の、その高品質を保障しつつミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法及びその方法を実行する装置を提示することができる。即ち、高評価品質とともに、その優れた再現性が達成される。
【００１１】
評価装置は、好ましくは、種々の特徴値を同定する画像処理プログラムを包含する。この種の画像処理プログラムは、明／暗コントラストを評価することによってサンプル物質の輪郭を同定でき、そしてそこから切片化サンプルの断面領域を算出できる。この種の画像処理プログラム及びコントラスト評価システムの助けにより、縦方向の筋（細溝ないし線：striations）及び／または横方向の筋（溝ないし線）を検出すること、切片化サンプルの画像におけるそれらの寸法の伸び（dimensional extensions）若しくは他の不規則性を検出すること及び関連する特徴量を算出することは、同様に可能である。
【００１２】
ティーチインフェーズ（学習段階：teach-in phase）において、手動検査の後に、どのサンプルの画像若しくはどの薄切片が承認可能か及びどれが承認不可能かを、評価装置との連絡において（例えば、キーを押すことによって）、ユーザが評価装置に通知すれば、有利である。画像処理プログラムは、その時、関連する画像に基づいて、承認可能な切片、若しくは承認不可能な切片に割り当てることができる特徴値を同定する。例えば、画像処理プログラムは、「良」と判断される切片の全ての画像を、共通する特徴及びパターンについて検査し、そして種々の評価基準に従って特徴値の範囲（値）を同定する。それによって、ティーチインフェーズにおいて、どの獲得された切片が承認可能かを評価装置に客観的に通知することが可能である。手順は、承認不可能な切片についても同様であり、ティーチインフェーズが終わった後に、評価装置が、現在の切片に基づいて、「良」と判断される切片であるか若しくは「悪」と判断される切片であるかを決定できる。画像処理プログラムによって同定された種々の特徴値は、データベースに蓄積される。十分大きなデータ目録が存在する場合、ユーザは、新たな切片のさらなる評価を評価装置に全て任せることができる。しかしながら、ユーザは、切片品質を手動で評価することを継続することもでき、また評価装置による評価の結果の指示の助けによって、承認可能な切片若しくは承認不可能な切片に関する操作者の決定について補助されることもできる。拡張したテストフェーズの後、切片品質の評価において、評価装置が良好な様式で作動するとユーザが決定すれば、ユーザは、ユーザによる介入無しに、切片作製（さらに除去）及び切片品質の評価が自動的に実行される自動作動モードに移すことができる。
【００１３】
薄切片品質若しくは切片画像に基づく品質要求は、種々の利用領域（分野）において、大きくお互いに異なることがありうる。上記ティーチインフェーズの助けにより、別の用途のために、半自動の作業若しくは実際に完全な自動作業を可能にする客観的な評価基準が同定できる。
【００１４】
本発明の更なる側面によれば、開示された方法を実行するための装置が提示される。
【実施例】
【００１５】
図１は、ベースベッド（基台）１２、切片化ナイフ１４を保持する切片化ナイフホルダー１３、及びパラフィンブロック１８に包埋されたサンプル１６を有し、顕微鏡観察に十分な高切片品質の薄切片が大部分は自動的に作製されるミクロトーム１０の側面図の単純化した描写である。ミクロトーム１０の作業の間に、第一に、粗い運転設定において、切片化ナイフ１４はすぐにサンプル１６が包埋されたパラフィンブロック１８の近くに運ばれ、パラフィンブロック１８に隣接し、長さＬ１を有する近領域２２（この位置で近領域２２が定義される）の位置に移動する。この粗い運転モードにおいて、切片化ナイフ１４は、近領域２２の長さＬ１よりもより大きい長さＬ２を有する移動経路２０上を移動する。切片化ナイフ１４がセンサ（図１に表さない）によってモニタされた近領域２２を超えて行くとき、最初はトリミング平面（trimming plane）を探すためにトリミングモードで、トリミングモードにおける切片化の切片厚は１０から５０μｍまでの範囲内で、好ましくは２０から３０μｍまでの範囲内で、自動切片化処理が開始する。一度トリミング平面が同定されると、次に、切片化処理は、薄切片を作製するために薄切片モードにて続行され、薄切片モードにおける切片化の切片厚は、１から１０μｍまでの範囲内、好ましくは、２から５μｍまでの範囲内であり、そして、切片化処理は、トリミングモードと比べて減速した切片化速度で行われる。自動切片化処理を、さらに詳細に図２、図３Ａ及び３Ｂを参照して説明する。
【００１６】
図２は、自動的に薄切片を製造する装置のハードウェア配置を模式的に表す。完全に自動化されたミクロトーム１０は、作業コンソール２８、そして評価装置２６に連結（機能的に連携）したカメラ２４、さらに中央制御ユニット３０及び表示装置３１に接続される。評価装置２６及び作業コンソール２８は、次々に中央制御ユニット３０に接続され、評価装置２６は、データ獲得システム３２及び画像処理プログラム３４を包含する。作業コンソール２８上のスタート／ストップボタンの手動の作動の際に、作業者は、中央制御ユニット３０におけるスタート信号をトリガーすることができるので、ミクロトーム１０がスイッチオンになり、そして自動切片化処理を開始できる。切片化処理は、もう一度、作業コンソール２８上のスタート／ストップボタンを作動することによって、途中で終了させることもできる。
【００１７】
図３Ａ及び３Ｂは、ミクロトーム１０を使用してサンプル１６の薄切片を自動的に製造する方法の実行に関するフローチャートである。ティーチイン（学習）フェーズにおいて、最初のステップＳ８において、薄切片の品質の特徴値を有するデータ獲得システム３２に設定されるデータが、ユーザによって最初に前定義される。このティーチインフェーズにおいて、サンプル１６の切片化によって生成した表面の画像は、カメラ２４のカメラの助けにより、定義された薄切片の数だけ、獲得され、薄切片の切片品質が、ユーザによって主観的に「良」若しくは「悪」の分類に区分される。次に、画像処理プログラム３４の助けにより、ユーザによって承認された及び承認されなかった薄切片の獲得画像は、十分に良い切片品質のそれらの特徴値の関連制限値を同定するために、薄切片品質の特徴値に基づいて検査される。
【００１８】
例えば、厚薄効果（Thick-thin effects）は、薄切片品質の１の特徴値である。その厚薄効果で、厚い及び薄い切片は、切片化処理の間に交互に発生する、すなわち、薄切片モードにおける承認可能な薄切片の切片厚の変化は、±０．２μｍを超えるべきでない。薄切片品質の別の特徴値は、サンプル１６の切片化領域上の縦方向の筋（細溝）及び／または横方向の筋（溝）の数そして幅である、すなわち、縦方向の筋（細溝）若しくは横方向の筋（溝）のそれぞれの最大の容認可能な数は、５であるべきで、そして承認可能な薄切片の縦方向の筋（細溝）若しくは横方向の筋（溝）の幅は、０．５μｍを超えるべきでない。ミクロトーム１０のユーザは、必要であれば、前定義された薄切片品質の特徴値を変更することができる。種々の切片化品質の特徴値は、以下で更に詳細に図１３から図１５を参照して説明する。
【００１９】
従って、データ獲得システム３２は、切片化されるサンプル１６の薄切片がそのまま承認されるように、ティーチインフェーズにおいて、薄切片品質の特徴値によって超過されてはならない制限値としてのデータを含有する。個々の組織タイプのさらに良い同定のために、調査される全てのサンプル１６は、連続番号でコード化される。加えて、コードは、サンプル１６の使用される手順としての、そして切片方向における個々のサンプル１６の最大の断面領域の大きさとしての情報を含有する。
【００２０】
方法の２番目のステップＳ１０では、保存された薄切片品質の特徴値を変更するかどうかの質問がユーザによってなされる。いくつかの変更の後若しくは特徴値の確認の後、ステップ１２において、粗い運転設定において、すぐに、サンプル１６の近くに切片化ナイフ１４を移動する準備がなされる。それから、次のステップＳ１４において、最初は、トリミングモードで、トリミングカットごとにおよそ２０から３０μｍの前進で、トリミング平面を同定するために、切片化処置が開始する。
【００２１】
適正なトリミング平面は、薄切片モードにおいて、薄切片を作製するために、およそ２から５μｍで前進して切片化処理を続行することに適する切片化サンプル１６の切片化平面として理解される。サンプル１６が包埋されたパラフィンブロック１８上の切片化処理の結果として、初期のカットサンプル１６の切片化領域が、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域とおよそ同じ大きさである場合に、適正なトリミング平面が同定される。トリミングモードにおけるトリミング平面の同定を、更に詳細に図４から図１２を参照して説明する。
【００２２】
トリミング深度が、サンプル１６の切片化領域がその最大の断面領域の少なくとも８０％に等しいトリミング深度（サンプル１６が十分にプレカットされたと考えられるのは、このトリミング深度のみである）に到達した場合にのみ、トリミングモードと薄切片モード間の切り替えが起こる。その時、薄切片モードにおいて、切片化処理は、トリミングモードと比べて減速した切片化速度を使用して、そして減少した前進［幅］で、薄切片を作製する次のステップＳ１８に継続される。
【００２３】
切片品質を評価するために、薄切片を作製する各切片化作業において、サンプル１６の切片化によって生成した表面の画像は、自動的にカメラ２４の助けにより獲得される。カメラ２４に接続する評価装置２６は、トリミング平面の決定のみではなく、画像における特異的なパターンの検出及び評価、特に、定義された薄切片品質の特徴値に基づく画像の評価も果たす。
【００２４】
それから、次のステップＳ２０において、画像の特異的なパターンと、データ獲得システム３２に蓄積された薄切片品質の特徴値との間で比較がなされ、評価装置２６は、サンプルの切片化領域の切片品質を、「良」若しくは「悪」のいずれかとして評価することができる。評価装置２６は、例えば、縦方向の筋（細溝）の数が５を超えていれば、切片品質を「悪」として分類する。切片品質が「良」として分類されれば、次の切片化作業は、薄切片モードで遂行するように続行する。例えば、サンプルの切片化領域上の縦方向の筋（細溝）の数が高い［ないし多］すぎるため、数回の切片化作業の後、切片品質が「悪」として分類されれば、その時、次の切片化作業は、薄切片モードではなく、新たなトリミング平面を決定するために、むしろトリミングモードで遂行される。
【００２５】
切片化作業の後に切片品質が「良」として分類されれば、その時、ステップＳ２２において、薄切片を作製するために切片化処理が薄切片モードで起きるように、中央制御ユニット３０において信号がトリガーされる。
【００２６】
数回の切片化作業の後、切片品質が「良」として分類されなければ、その時、最終ステップＳ２４において、例えば、切片化速度、切片厚及び逃げ角などの切片化パラメータによって、自動訂正がなされ、自動訂正は、薄切片品質として同定された特徴値に依存する。切片のしわが過剰であれば、例えば、切片化速度の減速若しくは逃げ角の再調節が必要である。厚薄効果には、切片厚の設定における訂正が要求される。
【００２７】
薄切片の切片品質を改善するためにさらに重要な行為は、切片化ナイフ１４の置き換えであり得る。例えば、サンプル１６の切片化領域上の縦方向の筋（細溝）若しくは横方向の筋（溝）の前決定された最大の容認可能な数が超過になれば、切片化ナイフ１４の置き換えが遂行される。
【００２８】
切片化パラメータの訂正の後になっても切片品質が改善されなければ、その時、ユーザは、薄切片が、切片化するサンプル１６から作製できないこと、そして、例えば、更なる脱ミネラル化の形におけるサンプル１６の再処理が必要であることの通知を受け取る。この目的は、ユーザに現在の薄切片が承認されたか否かを示す表示装置３１によって果たされる。
【００２９】
適正なトリミング平面の自動同定の方法は、図４から図１２を参照してさらに詳細に説明する。このトリミング平面は、サンプル１６の切片化領域がその最大の断面領域の少なくとも８０％に等しい場合に同定され、その同定は、後述する。関連する深度は、関連するトリミング深度を意味する。従って、関連するトリミング深度とは、サンプル１６がプレカットされた範囲を表す。例えば、プレカットサンプル１６の領域が、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域に等しい場合、関連するトリミング深度は、１００％に等しい。パラフィンブロック１８に包埋されたサンプル１６がカットされていなければ、トリミング深度は、０％である。トリミングモードにおける各切片化作業の後に、カメラ２４が、サンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８の表面の少なくとも１の画像を獲得するという事象によって、関連するトリミング深度は、同定できる。評価装置２６の助けにより、この画像は、明るいパラフィンブロック１８の表面と、プレカットサンプル１６の暗い若しくは光沢がない切片化領域との間のコントラストの違いに基づいて調査される。このコントラストの違いによって、プレカットサンプル１６の切片化領域の大きさを決定することができ、切片方向におけるプレカットサンプル１６の切片化領域と、サンプル１６の最大の断面領域との間の割合を算出することによって関連するトリミング深度を次々に同定できる。
【００３０】
図４から図６は、種々の角度からの、切片化されるサンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８を表し、パラフィンブロック１８は、カセット３５上に配置される。このケースでは、サンプル１６がプレカットされていないので、以前に定義した関連するトリミング深度は０％である。
【００３１】
図７から図９は、もう一度種々の角度からの、プレカットサンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８を表し、プレカットサンプル１６の切片化領域１７は、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域４４のおよそ２５％に等しい。このケースでは、関連するトリミング深度は２５％である。
【００３２】
図１０から図１２は、種々の角度からの、プレカットサンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８を表し、図７から図９とは対象的に、プレカットサンプル１６の切片化領域１７は、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域４４のほぼ１００％に等しい。このケースでは、関連するトリミング深度が８０％よりも大きいので、適正なトリミング平面が同定される。
【００３３】
図１３から図１５は、薄切片品質の特徴値としての縦方向の筋（細溝）の数及び幅、薄切片品質の特徴値としての横方向の筋（溝）の数及び幅を決定するための、さらに詳細な画像に基づく検出の手順を開示する。
【００３４】
図１３は、カセット３５上に配置されたパラフィンブロック１８の側面図の単純化した切片描写を示す。切片化されるサンプル１６、例えば、生物の組織物質の試料は、このパラフィンブロック１８に包埋される。カメラ２４及びサンプル１６の切片化領域１７上に向く光源３６の光は、パラフィンブロック１８の表面１９及びサンプルの切片化領域１７の画像に基づく検出を果たし、光源は、カラーフィルター装置若しくは偏光フィルター装置３８を有する。光源３６の光によって対応する励起が行われた後に、サンプルから放射された蛍光照射を評価する蛍光装置も含むことができる。従って、特異的な波長若しくは偏光を有する光は、カラーフィルター装置、蛍光フィルター若しくは偏光装置３８の使用によって作製できる。適切なフィルター装置３８の選定は、サンプル１６の組織タイプに依存する。光源３６を用いた照明及び／またはサンプル１６の画像の検出は、０℃（垂直）からほぼ９０℃（かなり水平）の範囲内の種々の角度で各々達成できる。
【００３５】
図１４は、３次元の（立体）描写における、包埋されたプレカットサンプル１６を有するパラフィンブロック１８、パラフィンブロック１８の表面１９及びＸ矢印方向４１の切断方向に沿った縦方向の筋（細溝）４０を有し、そして同時に切断方向に対して横方向に横方向の筋（溝）４２があるサンプル１６の切片化領域１７を示す。縦方向の筋（細溝）４０は、おそらく損傷した若しくは鈍った切片化ナイフ１４によって起こり、これに対して横方向の筋（溝）４２は、切断方向に対して横方向の切片化ナイフの振動運動から発生する。
【００３６】
図１５は、切片方向における、包埋されたサンプル１６の切片化領域１７を伴うパラフィンブロック１８の平面図を示す。カメラ２４及びそれに連結した評価装置２６（ここに表さない）の助けにより、薄切片の品質は、前定義された薄切片品質の特徴値に基づいて、サンプル１６の切片化領域１７の画像を評価することによって同定できる。評価装置２６の助けにより、例えば、サンプル１６の切片化領域１７上の縦方向の筋（細溝）４０の数及び／または横方向の筋（溝）４２の数が、同定できる。
【００３７】
図１６から図１８は、初期に考察した、サンプル１６の最大の断面領域４４の検出の方法ステップの例を示す。図１６による例では、カセット３５は、裏面からの光で、例えば、ＬＥＤ４６から照射される。この種の光源は、例えば、ミクロトーム１０におけるカセット３５を受け取る受取装置に配置できる。パラフィンブロック１８に包埋され、まだプレカットされていないサンプル１６は、透過光モードにおいて、背後から照射される。サンプル１６がパラフィンとは異なる透過特徴を有するので、サンプルの影画像が、カメラ２４の認識領域４８の中に呈する。平面図としての図１７に表すように、この影画像の領域は、サンプルの最大の断面領域に一致する。カメラ２４から、入射光モードで、上からパラフィンに包埋されたサンプル１６を照射することもできる。サンプル１６及びパラフィンの異なる反射特徴の結果として、輪郭によって取り囲まれたサンプル１６の領域は、もう一度、検出可能であり、最大の断面領域４４が同定できる。図１８による更なる変形では、超音波センサ５０からの超音波が、包埋されたサンプル１６の前面上に（若しくは後面も）衝突する、そのため、サンプルの最大の大きさ及び最大の断面領域４４が、サンプルから反射した超音波に基づいて同定できる。
【００３８】
ユーザへの手動の評価の助けとして、評価装置によって発行された作製された切片の評価を評価装置によってユーザに示す方法のように、提示した方法は部分的な自動様式で作動できる。この様式では、多数のサンプルの切片の評価において、ユーザは、上記方法によって補助及び支援される、従って、ミクロトームによるサンプルの薄切片の作製において、全体的に品質を改良することができる。方法が確かに作動する場合、切片品質の評価がもっぱら評価装置によって遂行される完全な自動作業に移すこともできる。その時、ユーザは、切片化処理を自動的に進める複数の装置を入荷、運転することのみに責任があり、切片化作業は、自動的に遂行する。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
開示した方法は、切片品質の評価の一定の品質基準を作製する。これらの品質基準は、作業者の精神状況及び環境状況、そして他の妨害影響から独立する。この方法は、個々の研究室の基準への理想的な適応を可能にする。高資格が与えられていない作業者でさえ、すぐに訓練でき、ティーチインフェーズの助けにより切片品質の評価における十分な経験を獲得できる。使用したデータでデータベースがすでに満たされていれば、開示した方法を使用して、長期間の訓練期間無しに、ほとんど経験がない作業者がミクロトームを作動できる。
【００４０】
なお、実施例において、上述したが、本発明は、上述の実施例に限定されるものではなく、開示した種々の形態及び特許請求の範囲の各請求項の範囲内において、種々の修正ないし変形、要素の選択、組合せの変更等が可能である。
【符号の説明】
【００４１】
１０ ミクロトーム
１２ ベースベッド
１３ 切片化ナイフホルダー
１４ 切片化ナイフ
１６ サンプル
１７ サンプルの切片化領域
１８ パラフィンブロック
１９ パラフィンの表面
２０ 移動経路
２２ 近領域
２４ カメラ
２６ 評価装置
２８ 作業コンソール
３０ 中央制御ユニット
３１ 表示装置
３２ データ獲得システム
３４ 画像処理プログラム
３５ カセット
３６ 光源
３８ フィルター装置
４０ 縦方向の筋（細溝）
４１ Ｘ矢印方向
４２ 横方向の筋（溝）
４４ サンプルの最大の断面領域
４６ ＬＥＤ
４８ 認識領域
５０ 超音波センサ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いてサンプルの薄切片を作製する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロトームによって作製された薄切片は、通常、ユーザによって注意深く検査され、そして後の顕微鏡観察の際に、個々の薄切片における情報内容が評価できるように、それらがある品質基準を満足しているかどうかがチェックされる。そのような手順とともに、サンプル、例えば、生体組織サンプルから最大の情報回収率を取得するために、薄切片の作製の分野及び顕微鏡観察の分野における特別な知識及び経験を持つことがユーザにとって必要である。例えば、サンプルが十分深くプレカット（precut）されており、そしてそれの比較的に大きな断面の表面が調査できる点でのみ、パラフィンに包埋したサンプルの薄切片が作製されるべきである。薄切片は、顕微鏡観察下の誤解釈になり得る縦方向の溝（grooves）及び／または横方向の溝を、含有するべきでないか、ないしは少しのみ含有するべきである。加えて、薄切片の厚さの変動は、容認可能な許容限度内でなければならない。多数のサンプルを調査しなければならない場合、薄切片の品質基準の評価のために必要な仕事は、ユーザにとって疲れることであり、そして誤った評価が起こり得る。
【０００３】
ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／６２０３５Ａ１は、組織サンプルの自動作製のシステム及び方法を開示する。光学的な画像作製システムの助けにより、パラフィン内の組織サンプルの位置が決定できるし、そして切片化される組織サンプルを整列できる。加えて、光学的な画像作製方法は、標本スライド上への薄切片の設置を補助することに使用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ００／６２０３５Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
作製された薄切片の高品質を保障しつつ、ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法及びその方法を実行する装置を提示することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
方法のための、この目的は、請求項１の特徴によって達成される。即ち、本発明の一視点において、ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法が提供される。該方法は、カメラが、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得し、評価装置が画像処理プログラムを有し、該画像処理プログラムは、前記表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、前記評価装置のティーチインフェーズにおいて、作業者が、どのサンプルの切片が承認可能であるか否かの通知を行い、切片が予め作業者によって主観的に「良」若しくは「悪」の分類に区分され、前記評価装置が切片に関連する画像を評価して、関連する特徴値を同定し、各薄切片の切断方向に沿った縦方向の細溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、及び／又は、各薄切片の切断方向に対する横方向の溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、そして前記評価装置による後続の自動作動において、同定された特徴値を関数として、サンプルの切片が承認されるか否かを決定する。
なお、特許請求の範囲に付記した図面参照符号は、専ら理解を助けるためのものであり、図示の態様に限定することを意図するものではない。
本発明において以下の形態が可能である。
（形態１）カメラが、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得し、評価装置が、該表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、そして同定された特徴値を関数として、サンプルの切片が承認されるか否かを決定する、ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法。
（形態２）上記の方法において、トリミングモードにおいて、トリミング平面を探すための切片化処理が行われ、トリミングモードにおける切片の切片厚が、１０から５０μｍ（好ましくは２０から３０μｍ）の範囲内であることが好ましい。
（形態３）上記の方法において、トリミング平面の決定のために、サンプルが包埋されたパラフィンブロックの明るい表面と、サンプル物質を表すプレカットされたサンプルの暗い切片化領域との間のコントラストの違いが、評価装置の助けにより特徴値として評価されることが好ましい。
（形態４）上記の方法において、プレカットされたサンプルの切片化領域が、サンプルの切片方向における前決定された最大の断面領域の一部に等しい（好ましくは、少なくとも８０％に等しい）場合に、トリミング平面が同定されることが好ましい。
（形態５）上記の方法において、薄切片を作製するための薄切片モードにおいて、切片厚が１から１０μｍ（好ましくは、２から５μｍ）までの範囲内であり、切片化過程がトリミングモードと比べて減速した切片化速度で行われることが好ましい。
（形態６）上記の方法において、薄切片の作製のための薄切片モードにおける切片化過程がトリミング平面の同定の後でのみ行われることが好ましい。
（形態７）上記の方法において、評価装置が特徴値を同定する画像処理プログラムを有することが好ましい。
（形態８）上記の方法において、切片厚が薄切片品質の特徴値として使用され、薄切片内において、切片厚内のゆらぎの構成が前定義された値未満である（好ましくは、前定義された切片厚の５％未満である）薄切片が承認されることが好ましい。
（形態９）上記の方法において、切片のしわが薄切片品質の特徴値として使用されることが好ましい。
（形態１０）上記の方法において、各薄切片の切断方向に沿った縦方向の細溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前定義された数（好ましくは５未満）に基づいて当該薄切片が承認されることが好ましい。
（形態１１）上記の方法において、各薄切片の切断方向に対する横方向の溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前定義された数（好ましくは５未満）に基づいて当該薄切片が承認されることが好ましい。
（形態１２）上記の方法において、表示装置がユーザに現在の薄切片が承認される否かを示すことが好ましい。
（形態１３）上記の方法において、前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に、切片化ナイフが置き換えられることが好ましい。
（形態１４）上記の方法において、前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に切片化パラメータが訂正されることが好ましい。
（形態１５）上記の方法において、切片化パラメータを訂正するために切片化速度、逃げ角及び切片厚の１以上が変更されることが好ましい。
（形態１６）上記の方法において、薄切片の特定の数に到達するまで切片化過程が薄切片モードにおいて行われることが好ましい。
（形態１７）上記の方法において、一度前定義された数の承認可能な薄切片が取得された場合、若しくは承認不可能な薄切片の前定義された数を関数として、若しくは作業者指示を関数として、切片化過程がトリミングモードにおいて続行され、新たなトリミング平面が探されて、薄切片モードへの移行が行われることが好ましい。
（形態１８）上記の方法において、評価装置のティーチインフェーズ（teach-in phase）において、作業者が、どのサンプルの切片が承認可能であるか否かの通知を行い、評価装置が切片に関連する画像を評価して、特徴値を同定することが好ましい。
（形態１９）上記の方法において、透過光モードにおいて、カメラを用いて若しくは超音波測定方法の助けにより、未カットのサンプル上で、サンプルの最大の断面領域が同定されることが好ましい。
（形態２０）サンプルが包埋されたパラフィンブロックを切片化するためのミクロトーム、カメラ及び評価装置を有し、カメラが、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得し、評価装置が、該表面の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、そして同定された特徴値を関数として、サンプルの切片が承認されるか否かを決定する、サンプルの薄切片作製装置。
（形態２１）上記の装置において、トリミング平面の決定のために、評価装置が、パラフィンブロックの明るい表面と、プレカットされたサンプルの暗い切片化領域との間のコントラストの違いを特徴値として評価することが好ましい。
（形態２２）上記の装置において、評価装置が、特徴値を同定する画像処理プログラムを有することが好ましい。
（形態２３）上記の装置において、評価装置が、作製された薄切片の薄切片品質の特徴値を同定し、前記特徴値の機能としてミクロトームの切片化パラメータを調節することが好ましい。
（形態２４）切片化パラメータを訂正するために切片化速度、逃げ角及び切片厚の１以上が変更されることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、薄切片の、その高品質を保障しつつミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法及びその方法を実行する装置を提供することができる。即ち、高い評価品質とともに、その優れた再現性が達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明の具体例の例示は、以下に図面を参照して開示される。
【図１】図１は、分割するサンプルを伴うミクロトームの側面図である。
【図２】図２は、自動的に薄切片を製造する装置のハードウェア配置を模式的に表わす。
【図３Ａ】図３Ａは、薄切片を自動的に製造する方法の実行のフローチャートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、薄切片を自動的に製造する方法の実行のフローチャートである。
【図４】図４は、パラフィンブロック及びそこに配置されたサンプルを有するカセットの側面図である。
【図５】図５は、図４による配置（ないしアレンジメント）の斜視図である。
【図６】図６は、図４による配置の平面図である。
【図７】図７は、プレカットサンプルを伴う図４による配置を示す。
【図８】図８は、その斜視図である。
【図９】図９は、その平面図である。
【図１０】図１０は、最大の領域領域（ないし断面積）を有するプレカットサンプルを示す。
【図１１】図１１は、その斜視図である。
【図１２】図１２は、その平面図である。
【図１３】図１３は、カセット、光源及びカメラを有する配置を示す。
【図１４】図１４は、横方向及び縦方向の溝を含有する切片を有するカセットの斜視図である。
【図１５】図１５は、図１４による配置の平面図である。
【図１６】図１６は、サンプルの最大の断面積を同定するための配置を示す。
【図１７】図１７は、図１６による配置の平面図である。
【図１８】図１８は、超音波センサを有する配置を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明によれば、カメラは、サンプルの切片化によって生成した表面の少なくとも１の画像を獲得する。評価装置は、前定義された切片品質の特徴値に基づいて、該表面の画像を評価する。同定された特徴値を関数として、その時に、サンプルの切片が承認されたか否かの決定が行われる。
【００１０】
カメラ及びカメラによって獲得された画像を評価する評価装置の使用は、サンプルの切片の評価作業を客観的にする。サンプルのこの切片は、顕微鏡観察によって後に調査される薄切片であり得る、又は、そこから始まって薄切片が作製される（さらに詳細に後に開示されるように）トリミング平面（trimming plane）を位置づけるためのサンプルへの初期のカットであり得る。評価装置及び前決定された切片品質の特徴値の助けにより、サンプルの切片が承認されたか否かの決定が行われる。客観化されうる特徴値に基づいてこの決定が行われるので、薄切片の、その高品質を保障しつつミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法及びその方法を実行する装置を提示することができる。即ち、高評価品質とともに、その優れた再現性が達成される。
【００１１】
評価装置は、好ましくは、種々の特徴値を同定する画像処理プログラムを包含する。この種の画像処理プログラムは、明／暗コントラストを評価することによってサンプル物質の輪郭を同定でき、そしてそこから切片化サンプルの断面領域を算出できる。この種の画像処理プログラム及びコントラスト評価システムの助けにより、縦方向の筋（細溝ないし線：striations）及び／または横方向の筋（溝ないし線）を検出すること、切片化サンプルの画像におけるそれらの寸法の伸び（dimensional extensions）若しくは他の不規則性を検出すること及び関連する特徴量を算出することは、同様に可能である。
【００１２】
ティーチインフェーズ（学習段階：teach-in phase）において、手動検査の後に、どのサンプルの画像若しくはどの薄切片が承認可能か及びどれが承認不可能かを、評価装置との連絡において（例えば、キーを押すことによって）、ユーザが評価装置に通知すれば、有利である。画像処理プログラムは、その時、関連する画像に基づいて、承認可能な切片、若しくは承認不可能な切片に割り当てることができる特徴値を同定する。例えば、画像処理プログラムは、「良」と判断される切片の全ての画像を、共通する特徴及びパターンについて検査し、そして種々の評価基準に従って特徴値の範囲（値）を同定する。それによって、ティーチインフェーズにおいて、どの獲得された切片が承認可能かを評価装置に客観的に通知することが可能である。手順は、承認不可能な切片についても同様であり、ティーチインフェーズが終わった後に、評価装置が、現在の切片に基づいて、「良」と判断される切片であるか若しくは「悪」と判断される切片であるかを決定できる。画像処理プログラムによって同定された種々の特徴値は、データベースに蓄積される。十分大きなデータ目録が存在する場合、ユーザは、新たな切片のさらなる評価を評価装置に全て任せることができる。しかしながら、ユーザは、切片品質を手動で評価することを継続することもでき、また評価装置による評価の結果の指示の助けによって、承認可能な切片若しくは承認不可能な切片に関する操作者の決定について補助されることもできる。拡張したテストフェーズの後、切片品質の評価において、評価装置が良好な様式で作動するとユーザが決定すれば、ユーザは、ユーザによる介入無しに、切片作製（さらに除去）及び切片品質の評価が自動的に実行される自動作動モードに移すことができる。
【００１３】
薄切片品質若しくは切片画像に基づく品質要求は、種々の利用領域（分野）において、大きくお互いに異なることがありうる。上記ティーチインフェーズの助けにより、別の用途のために、半自動の作業若しくは実際に完全な自動作業を可能にする客観的な評価基準が同定できる。
【００１４】
本発明の更なる側面によれば、開示された方法を実行するための装置が提示される。
【実施例】
【００１５】
図１は、ベースベッド（基台）１２、切片化ナイフ１４を保持する切片化ナイフホルダー１３、及びパラフィンブロック１８に包埋されたサンプル１６を有し、顕微鏡観察に十分な高切片品質の薄切片が大部分は自動的に作製されるミクロトーム１０の側面図の単純化した描写である。ミクロトーム１０の作業の間に、第一に、粗い運転設定において、切片化ナイフ１４はすぐにサンプル１６が包埋されたパラフィンブロック１８の近くに運ばれ、パラフィンブロック１８に隣接し、長さＬ１を有する近領域２２（この位置で近領域２２が定義される）の位置に移動する。この粗い運転モードにおいて、切片化ナイフ１４は、近領域２２の長さＬ１よりもより大きい長さＬ２を有する移動経路２０上を移動する。切片化ナイフ１４がセンサ（図１に表さない）によってモニタされた近領域２２を超えて行くとき、最初はトリミング平面（trimming plane）を探すためにトリミングモードで、トリミングモードにおける切片化の切片厚は１０から５０μｍまでの範囲内で、好ましくは２０から３０μｍまでの範囲内で、自動切片化処理が開始する。一度トリミング平面が同定されると、次に、切片化処理は、薄切片を作製するために薄切片モードにて続行され、薄切片モードにおける切片化の切片厚は、１から１０μｍまでの範囲内、好ましくは、２から５μｍまでの範囲内であり、そして、切片化処理は、トリミングモードと比べて減速した切片化速度で行われる。自動切片化処理を、さらに詳細に図２、図３Ａ及び３Ｂを参照して説明する。
【００１６】
図２は、自動的に薄切片を製造する装置のハードウェア配置を模式的に表す。完全に自動化されたミクロトーム１０は、作業コンソール２８、そして評価装置２６に連結（機能的に連携）したカメラ２４、さらに中央制御ユニット３０及び表示装置３１に接続される。評価装置２６及び作業コンソール２８は、次々に中央制御ユニット３０に接続され、評価装置２６は、データ獲得システム３２及び画像処理プログラム３４を包含する。作業コンソール２８上のスタート／ストップボタンの手動の作動の際に、作業者は、中央制御ユニット３０におけるスタート信号をトリガーすることができるので、ミクロトーム１０がスイッチオンになり、そして自動切片化処理を開始できる。切片化処理は、もう一度、作業コンソール２８上のスタート／ストップボタンを作動することによって、途中で終了させることもできる。
【００１７】
図３Ａ及び３Ｂは、ミクロトーム１０を使用してサンプル１６の薄切片を自動的に製造する方法の実行に関するフローチャートである。ティーチイン（学習）フェーズにおいて、最初のステップＳ８において、薄切片の品質の特徴値を有するデータ獲得システム３２に設定されるデータが、ユーザによって最初に前定義される。このティーチインフェーズにおいて、サンプル１６の切片化によって生成した表面の画像は、カメラ２４のカメラの助けにより、定義された薄切片の数だけ、獲得され、薄切片の切片品質が、ユーザによって主観的に「良」若しくは「悪」の分類に区分される。次に、画像処理プログラム３４の助けにより、ユーザによって承認された及び承認されなかった薄切片の獲得画像は、十分に良い切片品質のそれらの特徴値の関連制限値を同定するために、薄切片品質の特徴値に基づいて検査される。
【００１８】
例えば、厚薄効果（Thick-thin effects）は、薄切片品質の１の特徴値である。その厚薄効果で、厚い及び薄い切片は、切片化処理の間に交互に発生する、すなわち、薄切片モードにおける承認可能な薄切片の切片厚の変化は、±０．２μｍを超えるべきでない。薄切片品質の別の特徴値は、サンプル１６の切片化領域上の縦方向の筋（細溝）及び／または横方向の筋（溝）の数そして幅である、すなわち、縦方向の筋（細溝）若しくは横方向の筋（溝）のそれぞれの最大の容認可能な数は、５であるべきで、そして承認可能な薄切片の縦方向の筋（細溝）若しくは横方向の筋（溝）の幅は、０．５μｍを超えるべきでない。ミクロトーム１０のユーザは、必要であれば、前定義された薄切片品質の特徴値を変更することができる。種々の切片化品質の特徴値は、以下で更に詳細に図１３から図１５を参照して説明する。
【００１９】
従って、データ獲得システム３２は、切片化されるサンプル１６の薄切片がそのまま承認されるように、ティーチインフェーズにおいて、薄切片品質の特徴値によって超過されてはならない制限値としてのデータを含有する。個々の組織タイプのさらに良い同定のために、調査される全てのサンプル１６は、連続番号でコード化される。加えて、コードは、サンプル１６の使用される手順としての、そして切片方向における個々のサンプル１６の最大の断面領域の大きさとしての情報を含有する。
【００２０】
方法の２番目のステップＳ１０では、保存された薄切片品質の特徴値を変更するかどうかの質問がユーザによってなされる。いくつかの変更の後若しくは特徴値の確認の後、ステップ１２において、粗い運転設定において、すぐに、サンプル１６の近くに切片化ナイフ１４を移動する準備がなされる。それから、次のステップＳ１４において、最初は、トリミングモードで、トリミングカットごとにおよそ２０から３０μｍの前進で、トリミング平面を同定するために、切片化処置が開始する。
【００２１】
適正なトリミング平面は、薄切片モードにおいて、薄切片を作製するために、およそ２から５μｍで前進して切片化処理を続行することに適する切片化サンプル１６の切片化平面として理解される。サンプル１６が包埋されたパラフィンブロック１８上の切片化処理の結果として、初期のカットサンプル１６の切片化領域が、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域とおよそ同じ大きさである場合に、適正なトリミング平面が同定される。トリミングモードにおけるトリミング平面の同定を、更に詳細に図４から図１２を参照して説明する。
【００２２】
トリミング深度が、サンプル１６の切片化領域がその最大の断面領域の少なくとも８０％に等しいトリミング深度（サンプル１６が十分にプレカットされたと考えられるのは、このトリミング深度のみである）に到達した場合にのみ、トリミングモードと薄切片モード間の切り替えが起こる。その時、薄切片モードにおいて、切片化処理は、トリミングモードと比べて減速した切片化速度を使用して、そして減少した前進［幅］で、薄切片を作製する次のステップＳ１８に継続される。
【００２３】
切片品質を評価するために、薄切片を作製する各切片化作業において、サンプル１６の切片化によって生成した表面の画像は、自動的にカメラ２４の助けにより獲得される。カメラ２４に接続する評価装置２６は、トリミング平面の決定のみではなく、画像における特異的なパターンの検出及び評価、特に、定義された薄切片品質の特徴値に基づく画像の評価も果たす。
【００２４】
それから、次のステップＳ２０において、画像の特異的なパターンと、データ獲得システム３２に蓄積された薄切片品質の特徴値との間で比較がなされ、評価装置２６は、サンプルの切片化領域の切片品質を、「良」若しくは「悪」のいずれかとして評価することができる。評価装置２６は、例えば、縦方向の筋（細溝）の数が５を超えていれば、切片品質を「悪」として分類する。切片品質が「良」として分類されれば、次の切片化作業は、薄切片モードで遂行するように続行する。例えば、サンプルの切片化領域上の縦方向の筋（細溝）の数が高い［ないし多］すぎるため、数回の切片化作業の後、切片品質が「悪」として分類されれば、その時、次の切片化作業は、薄切片モードではなく、新たなトリミング平面を決定するために、むしろトリミングモードで遂行される。
【００２５】
切片化作業の後に切片品質が「良」として分類されれば、その時、ステップＳ２２において、薄切片を作製するために切片化処理が薄切片モードで起きるように、中央制御ユニット３０において信号がトリガーされる。
【００２６】
数回の切片化作業の後、切片品質が「良」として分類されなければ、その時、最終ステップＳ２４において、例えば、切片化速度、切片厚及び逃げ角などの切片化パラメータによって、自動訂正がなされ、自動訂正は、薄切片品質として同定された特徴値に依存する。切片のしわが過剰であれば、例えば、切片化速度の減速若しくは逃げ角の再調節が必要である。厚薄効果には、切片厚の設定における訂正が要求される。
【００２７】
薄切片の切片品質を改善するためにさらに重要な行為は、切片化ナイフ１４の置き換えであり得る。例えば、サンプル１６の切片化領域上の縦方向の筋（細溝）若しくは横方向の筋（溝）の前決定された最大の容認可能な数が超過になれば、切片化ナイフ１４の置き換えが遂行される。
【００２８】
切片化パラメータの訂正の後になっても切片品質が改善されなければ、その時、ユーザは、薄切片が、切片化するサンプル１６から作製できないこと、そして、例えば、更なる脱ミネラル化の形におけるサンプル１６の再処理が必要であることの通知を受け取る。この目的は、ユーザに現在の薄切片が承認されたか否かを示す表示装置３１によって果たされる。
【００２９】
適正なトリミング平面の自動同定の方法は、図４から図１２を参照してさらに詳細に説明する。このトリミング平面は、サンプル１６の切片化領域がその最大の断面領域の少なくとも８０％に等しい場合に同定され、その同定は、後述する。関連する深度は、関連するトリミング深度を意味する。従って、関連するトリミング深度とは、サンプル１６がプレカットされた範囲を表す。例えば、プレカットサンプル１６の領域が、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域に等しい場合、関連するトリミング深度は、１００％に等しい。パラフィンブロック１８に包埋されたサンプル１６がカットされていなければ、トリミング深度は、０％である。トリミングモードにおける各切片化作業の後に、カメラ２４が、サンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８の表面の少なくとも１の画像を獲得するという事象によって、関連するトリミング深度は、同定できる。評価装置２６の助けにより、この画像は、明るいパラフィンブロック１８の表面と、プレカットサンプル１６の暗い若しくは光沢がない切片化領域との間のコントラストの違いに基づいて調査される。このコントラストの違いによって、プレカットサンプル１６の切片化領域の大きさを決定することができ、切片方向におけるプレカットサンプル１６の切片化領域と、サンプル１６の最大の断面領域との間の割合を算出することによって関連するトリミング深度を次々に同定できる。
【００３０】
図４から図６は、種々の角度からの、切片化されるサンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８を表し、パラフィンブロック１８は、カセット３５上に配置される。このケースでは、サンプル１６がプレカットされていないので、以前に定義した関連するトリミング深度は０％である。
【００３１】
図７から図９は、もう一度種々の角度からの、プレカットサンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８を表し、プレカットサンプル１６の切片化領域１７は、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域４４のおよそ２５％に等しい。このケースでは、関連するトリミング深度は２５％である。
【００３２】
図１０から図１２は、種々の角度からの、プレカットサンプル１６が包埋したパラフィンブロック１８を表し、図７から図９とは対象的に、プレカットサンプル１６の切片化領域１７は、切片方向におけるサンプル１６の最大の断面領域４４のほぼ１００％に等しい。このケースでは、関連するトリミング深度が８０％よりも大きいので、適正なトリミング平面が同定される。
【００３３】
図１３から図１５は、薄切片品質の特徴値としての縦方向の筋（細溝）の数及び幅、薄切片品質の特徴値としての横方向の筋（溝）の数及び幅を決定するための、さらに詳細な画像に基づく検出の手順を開示する。
【００３４】
図１３は、カセット３５上に配置されたパラフィンブロック１８の側面図の単純化した切片描写を示す。切片化されるサンプル１６、例えば、生物の組織物質の試料は、このパラフィンブロック１８に包埋される。カメラ２４及びサンプル１６の切片化領域１７上に向く光源３６の光は、パラフィンブロック１８の表面１９及びサンプルの切片化領域１７の画像に基づく検出を果たし、光源は、カラーフィルター装置若しくは偏光フィルター装置３８を有する。光源３６の光によって対応する励起が行われた後に、サンプルから放射された蛍光照射を評価する蛍光装置も含むことができる。従って、特異的な波長若しくは偏光を有する光は、カラーフィルター装置、蛍光フィルター若しくは偏光装置３８の使用によって作製できる。適切なフィルター装置３８の選定は、サンプル１６の組織タイプに依存する。光源３６を用いた照明及び／またはサンプル１６の画像の検出は、０℃（垂直）からほぼ９０℃（かなり水平）の範囲内の種々の角度で各々達成できる。
【００３５】
図１４は、３次元の（立体）描写における、包埋されたプレカットサンプル１６を有するパラフィンブロック１８、パラフィンブロック１８の表面１９及びＸ矢印方向４１の切断方向に沿った縦方向の筋（細溝）４０を有し、そして同時に切断方向に対して横方向に横方向の筋（溝）４２があるサンプル１６の切片化領域１７を示す。縦方向の筋（細溝）４０は、おそらく損傷した若しくは鈍った切片化ナイフ１４によって起こり、これに対して横方向の筋（溝）４２は、切断方向に対して横方向の切片化ナイフの振動運動から発生する。
【００３６】
図１５は、切片方向における、包埋されたサンプル１６の切片化領域１７を伴うパラフィンブロック１８の平面図を示す。カメラ２４及びそれに連結した評価装置２６（ここに表さない）の助けにより、薄切片の品質は、前定義された薄切片品質の特徴値に基づいて、サンプル１６の切片化領域１７の画像を評価することによって同定できる。評価装置２６の助けにより、例えば、サンプル１６の切片化領域１７上の縦方向の筋（細溝）４０の数及び／または横方向の筋（溝）４２の数が、同定できる。
【００３７】
図１６から図１８は、初期に考察した、サンプル１６の最大の断面領域４４の検出の方法ステップの例を示す。図１６による例では、カセット３５は、裏面からの光で、例えば、ＬＥＤ４６から照射される。この種の光源は、例えば、ミクロトーム１０におけるカセット３５を受け取る受取装置に配置できる。パラフィンブロック１８に包埋され、まだプレカットされていないサンプル１６は、透過光モードにおいて、背後から照射される。サンプル１６がパラフィンとは異なる透過特徴を有するので、サンプルの影画像が、カメラ２４の認識領域４８の中に呈する。平面図としての図１７に表すように、この影画像の領域は、サンプルの最大の断面領域に一致する。カメラ２４から、入射光モードで、上からパラフィンに包埋されたサンプル１６を照射することもできる。サンプル１６及びパラフィンの異なる反射特徴の結果として、輪郭によって取り囲まれたサンプル１６の領域は、もう一度、検出可能であり、最大の断面領域４４が同定できる。図１８による更なる変形では、超音波センサ５０からの超音波が、包埋されたサンプル１６の前面上に（若しくは後面も）衝突する、そのため、サンプルの最大の大きさ及び最大の断面領域４４が、サンプルから反射した超音波に基づいて同定できる。
【００３８】
ユーザへの手動の評価の助けとして、評価装置によって発行された作製された切片の評価を評価装置によってユーザに示す方法のように、提示した方法は部分的な自動様式で作動できる。この様式では、多数のサンプルの切片の評価において、ユーザは、上記方法によって補助及び支援される、従って、ミクロトームによるサンプルの薄切片の作製において、全体的に品質を改良することができる。方法が確かに作動する場合、切片品質の評価がもっぱら評価装置によって遂行される完全な自動作業に移すこともできる。その時、ユーザは、切片化処理を自動的に進める複数の装置を入荷、運転することのみに責任があり、切片化作業は、自動的に遂行する。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
開示した方法は、切片品質の評価の一定の品質基準を作製する。これらの品質基準は、作業者の精神状況及び環境状況、そして他の妨害影響から独立する。この方法は、個々の研究室の基準への理想的な適応を可能にする。高資格が与えられていない作業者でさえ、すぐに訓練でき、ティーチインフェーズの助けにより切片品質の評価における十分な経験を獲得できる。使用したデータでデータベースがすでに満たされていれば、開示した方法を使用して、長期間の訓練期間無しに、ほとんど経験がない作業者がミクロトームを作動できる。
【００４０】
なお、実施例において、上述したが、本発明は、上述の実施例に限定されるものではなく、開示した種々の形態及び特許請求の範囲の各請求項の範囲内において、種々の修正ないし変形、要素の選択、組合せの変更等が可能である。
【符号の説明】
【００４１】
１０ ミクロトーム
１２ ベースベッド
１３ 切片化ナイフホルダー
１４ 切片化ナイフ
１６ サンプル
１７ サンプルの切片化領域
１８ パラフィンブロック
１９ パラフィンの表面
２０ 移動経路
２２ 近領域
２４ カメラ
２６ 評価装置
２８ 作業コンソール
３０ 中央制御ユニット
３１ 表示装置
３２ データ獲得システム
３４ 画像処理プログラム
３５ カセット
３６ 光源
３８ フィルター装置
４０ 縦方向の筋（細溝）
４１ Ｘ矢印方向
４２ 横方向の筋（溝）
４４ サンプルの最大の断面領域
４６ ＬＥＤ
４８ 認識領域
５０ 超音波センサ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カメラ（２４）が、サンプル（１６）の切片化によって生成した表面（１７）の少なくとも１の画像を獲得し、
評価装置（２６）が画像処理プログラム（３４）を有し、該画像処理プログラム（３４）は、前記表面（１７）の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、
前記評価装置（２６）のティーチインフェーズにおいて、作業者が、どのサンプル（１６）の切片が承認可能であるか否かの通知を行い、切片が予め作業者によって主観的に「良」若しくは「悪」の分類に区分され、前記評価装置（２６）が切片に関連する画像を評価して、関連する特徴値を同定し、
各薄切片の切断方向に沿った縦方向の細溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、及び／又は、各薄切片の切断方向に対する横方向の溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、
そして前記評価装置（２６）による後続の自動作動において、同定された特徴値を関数として、サンプル（１６）の切片が承認されるか否かを決定する、
ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法。
【請求項２】
前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に、切片化ナイフ（１４）が置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に切片化パラメータが訂正される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
切片化パラメータを訂正するために切片化速度、逃げ角及び切片厚の１以上が変更される、請求項３に記載の方法。
【請求項１】
カメラ（２４）が、サンプル（１６）の切片化によって生成した表面（１７）の少なくとも１の画像を獲得し、
評価装置（２６）が画像処理プログラム（３４）を有し、該画像処理プログラム（３４）は、前記表面（１７）の画像を前定義された切片品質の特徴値に基づいて評価し、
前記評価装置（２６）のティーチインフェーズにおいて、作業者が、どのサンプル（１６）の切片が承認可能であるか否かの通知を行い、切片が予め作業者によって主観的に「良」若しくは「悪」の分類に区分され、前記評価装置（２６）が切片に関連する画像を評価して、関連する特徴値を同定し、
各薄切片の切断方向に沿った縦方向の細溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、及び／又は、各薄切片の切断方向に対する横方向の溝の数が、薄切片品質の特徴値として使用され、前記ティーチインフェーズにおいて同定された値未満の数のときに当該薄切片が承認され、
そして前記評価装置（２６）による後続の自動作動において、同定された特徴値を関数として、サンプル（１６）の切片が承認されるか否かを決定する、
ミクロトームを用いてサンプルの薄切片を作製する方法。
【請求項２】
前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に、切片化ナイフ（１４）が置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前決定された承認されなかった連続する薄切片の数が超過した場合に切片化パラメータが訂正される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
切片化パラメータを訂正するために切片化速度、逃げ角及び切片厚の１以上が変更される、請求項３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−２３３９１８（Ｐ２０１２−２３３９１８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７２７３４（Ｐ２０１２−１７２７３４）
【出願日】平成２４年８月３日（２０１２．８．３）
【分割の表示】特願２００９−１８２４９１（Ｐ２００９−１８２４９１）の分割
【原出願日】平成２１年８月５日（２００９．８．５）
【出願人】（５００１１３６４８）ライカ ビオズュステムス ヌスロッホ ゲーエムベーハー (45)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月３日（２０１２．８．３）
【分割の表示】特願２００９−１８２４９１（Ｐ２００９−１８２４９１）の分割
【原出願日】平成２１年８月５日（２００９．８．５）
【出願人】（５００１１３６４８）ライカ ビオズュステムス ヌスロッホ ゲーエムベーハー (45)
【Ｆターム（参考）】
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