界面活性剤に耐性な新規セルラーゼ
セルラーゼＮＣＥ５の１６２番目及び／又は１６６番目のアミノ酸残基が、前記セルラーゼのアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する新規セルラーゼを開示する。また、前記の新規セルラーゼをコードするポリヌクレオチド、それを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに前記セルラーゼを含むセルラーゼ調製物及び洗剤組成物を開示する。本発明のセルラーゼは、界面活性剤に耐性であり、かつアルカリ性条件下でも高い活性を保持している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる親セルラーゼの一部のアミノ酸配列が置換されたアミノ酸配列を有する新規なセルラーゼに関する。
【背景技術】
セルラーゼは、その特性を活かしてさまざまな産業分野で利用されている。具体的な利用分野の一つは繊維加工分野であり、特にセルロース含有繊維に所望の特性を与えるための処理がなされている。すなわち、セルロース含有繊維の肌ざわり及び／又は外観を改善するために、そして、着色されたセルロース含有繊維に色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」様外観を与える「バイオウオッシュ」のためにセルラーゼが使用されている。また、近年では木材パルプ由来のセルロースを有機溶媒に溶解して紡糸する再生セルロース系繊維であるリヨセルが、その強度や吸水性等の性質、更には環境汚染を起こしにくい製造法から注目を集めているが、その製造工程で発生する織物表面の毛羽を除く加工にセルラーゼが用いられている。
従来、セルラーゼは複数の酵素の共同作用によりセルロースを分解する作用があるとされてきた。近年、タンパク質分離技術や遺伝子技術の進展により、複合酵素であるセルラーゼから、前記の繊維加工に適した酵素成分を分離し製造する試みがなされている。とりわけ、糸状菌のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属又はフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属由来のセルラーゼについては研究が進み、フミコーラ属では、ＣＢＨ Ｉ、ＥＧ Ｖ、ＮＣＥ４、及びＮＣＥ２などが、トリコデルマ属では、ＣＢＨ Ｉ、ＣＢＨ ＩＩ、ＥＧ ＩＩ、及びＥＧ ＩＩＩなどの成分が単離され、遺伝子操作によって過剰発現酵素やモノコンポーネント酵素などを調製することにより、各用途に適した特定セルラーゼ成分を多量に含むセルラーゼ調製物が製造されるようになってきた。
また、エンドグルカナーゼ酵素ＮＣＥ５は、デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウォッシュ外観の付与、又は肌触りの改善において、その処理工程中で衣料にインジゴ染料の一部が再付着又は逆染色、すなわち白場汚染（ｂａｃｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ）の度合いが低いセルラーゼとして有用であることが知られている（特許文献１参照）。
一方、セルラーゼを衣料用洗浄剤用途に用いる場合には、必要なセルラーゼ成分を量的に改善するだけでなく質的に改善することが望まれている。すなわち、衣料用洗浄剤には各種界面活性剤が配合されているとともに、これを水に溶解した場合アルカリ性（ｐＨ１０〜１１）を示すことから、衣料用洗浄剤に配合されるセルラーゼの性質として各種界面活性剤に対して耐性であること及びアルカリ性条件下でより強い活性を示すことが求められている。
（特許文献１） 国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレット（第２−３頁及び配列表の配列番号１で表される配列）
【発明の開示】
本発明は、界面活性剤に耐性及び／又はアルカリ性条件下で高い活性を有する新規なセルラーゼを提供することを課題とする。
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼ（ＮＣＥ５）において、そのアミノ酸配列における１６２番目及び／又は１６６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することによって、界面活性剤に耐性及び／又はアルカリ性条件下で高い活性を有する新規なセルラーゼを取得することに成功した。すなわち本発明は、以下の通りである。
［１］（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼの１６２番目及び／又は１６６番目のアミノ酸残基が、前記セルラーゼのアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、あるいは、（２）前記アミノ酸配列（１）のＮ末端に１又は複数個のアミノ酸が付加又は欠失したアミノ酸配列を有する、セルラーゼ。
［２］配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する、前記［１］のセルラーゼ。
［３］１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されている、前記［１］のセルラーゼ。
［４］配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する、前記［３］のセルラーゼ。
［５］配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するセルラーゼ。
［６］前記［１］〜［５］のセルラーゼをコードするポリヌクレオチド。
［７］前記［６］のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［８］前記［７］の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
［９］前記［８］の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養物からセルラーゼを採取する工程を含む、前記［１］〜［５］のセルラーゼの製造法。
［１０］前記［１］〜［５］のセルラーゼを含む、セルラーゼ調製物。
［１１］前記［１］〜［５］のセルラーゼ、又は前記［１０］のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
［１２］セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１３］セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１４］セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１５］着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１６］着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１７］セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１８］繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、前記［１２］〜［１７］の方法。
［１９］古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
［２０］紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
［２１］動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
親セルラーゼ
本発明において、親セルラーゼとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列よりなるセルラーゼである。また、本親セルラーゼを生産する宿主の種類によっては分泌シグナル配列のプロセッシングが異なることがあることから、その結果としてＮ末端に１〜複数個のアミノ酸が付加又は欠失されたような相同体も親セルラーゼに含まれる。
本発明における新規なセルラーゼ
本発明における新規なセルラーゼは、親セルラーゼが配列番号１で表されるアミノ酸配列よりなるものである場合、そのアミノ酸配列中の１６２及び１６６番目のアミノ酸から選択される１個又は２個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されたセルラーゼがその具体例として挙げられるが、天然に分離された菌株等から結果として得られたセルラーゼも、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１６２及び／又は１６６番目のアミノ酸、又はそれに相当するアミノ酸が置換されたセルラーゼである限り、本発明のセルラーゼに含まれる。
本発明の好ましい態様によれば、配列番号１に記載されたアミノ酸配列の１６２番目のアミノ酸がプロリンに、１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されたものが好ましいものとして挙げられる。本発明の更に好ましい態様によれば、配列番号３〜配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するセルラーゼが更に好ましいものとして挙げられる。これらのセルラーゼは、界面活性剤に耐性及び／又はアルカリ性条件下で高い活性が保持されるという有利な性質を有している。
また、親セルラーゼが配列番号１で表されるアミノ酸配列の相同体である場合には、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６２及び１６６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸から選択される１個又は２個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されてなるものがその具体例として挙げられる。ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列よりなる親セルラーゼの相同体において置換されるべきアミノ酸残基の位置は、公知のアルゴリズムによるアミノ酸配列の比較によって容易に選択することができる。
本発明における新規なセルラーゼの作製
本発明の新規なセルラーゼは、組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成技術などによって作製することができるほか、天然から分離された菌株から取得することもできる。
組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、親セルラーゼをコードするＤＮＡを取得し、このＤＮＡ内で特異的部位に突然変異を発生させてコードするアミノ酸を置換させた後、変異処理を施したＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養することによって新規なセルラーゼを調製することができる。親セルラーゼをコードするＤＮＡとしては、使用する宿主細胞を勘案し、配列番号１で表されるアミノ酸配列から適宜全合成可能であるが、好ましくは配列番号２で表される塩基配列からなるものであり、これはフミコーラ・インソレンスのｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法で取得可能である。
遺伝子の特定部位に突然変異を導入するための幾つかの方法は、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０（１９８７）］、Ｋｕｎｋｅｌ法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７（１９８７）］など当業者に公知である。これらの方法は、親セルラーゼをコードするＤＮＡ内で特異的部位に突然変異を発生させることに利用することができる。変異処理後のＤＮＡの塩基配列は、マキサム−ギルバードの化学修飾法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）］やジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Ｇｅｎｅ，１９，２６９（１９８２）］等により確認することができ、本発明におけるセルラーゼのアミノ酸配列は、確認された塩基配列より解読することができる。
本発明における新規なセルラーゼの生産
本発明におけるセルラーゼは、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能且つ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に発現ベクター、の形態として宿主細胞の形質転換を行い、その宿主細胞において産生させることができる。
よって、本発明においては、前記の本発明によるセルラーゼをコードするＤＮＡ断片を、宿主微生物内で複製可能で、且つ、そのＤＮＡ断片がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるＤＮＡ断片の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、ターミネーター及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主徴生物と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、又は糸状菌などを用いた系、及び、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から前記の本発明によるタンパク質を単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明における新規なセルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明は、本発明のセルラーゼを含むセルラーゼ調製物に関する。
一般に、セルラーゼ調製物とは、セルラーゼ酵素の他に、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、又はソルビトール等）、防腐剤、及び／又は非イオン系界面活性剤等を含有させることができる。また、セルラーゼ調製物の形態は、固形状であっても液体状であってもよく、具体的には、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、又は液体製剤が挙げられる。本発明のセルラーゼ調製物には、本発明のセルラーゼに加えて、他のセルラーゼ酵素、例えば、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ及び本発明以外のエンドグルカナーゼを含めてもよい。
セルラーゼ調製物の１種である非粉塵化顆粒（好ましくは、飛散性のない顆粒状）は、通常の乾式造粒法を用いて製造することが可能である。すなわち、粉末状態の本発明のセルラーゼを、中性でエンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない無機塩（例えば、硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウム）、エンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない鉱物（例えば、ベントナイト又はモンモリナイト）、及び中性の有機物（例えば、澱粉又は粒状セルロース等）等から選ばれる１種又は複数種に混合した後、非イオン界面活性剤の１種又は複数種の粉末、あるいは微細に懸濁された懸濁液を加え、充分に混合又は混練する。状況に応じ、固形物を結着させる合成高分子（例えば、ポリエチレングリコール等）又は天然高分子（例えば、スターチ等）を適宜添加し、更に混練した後、ディスクペレッターなどの押し出し成形造粒を行い、成形物をマルメライザーにより球状に成形後、乾燥させることで非粉塵化顆粒を製造することが可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。また、顆粒表面をポリマー等でコーティングすることにより、酸素透過や水分透過をコントロールすることも可能である。
一方、セルラーゼ調製物の１種である液状製剤（好ましくは、安定化された液体状）は、本発明のセルラーゼを含む溶液に、エンドグルカナーゼの安定化剤（例えば、合成高分子又は天然高分子等）を配合し、必要に応じて無機塩類及び／又は合成防腐剤を添加して調製することが可能である。このとき、非イオン界面活性剤の１種又は複数種を配合することも可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数種の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。
更に、本発明は、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物を含む洗剤組成物を提供する。前記洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性又は双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。また、前記洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、及び／又は発泡促進剤等をも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルキル硫酸塩（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル塩（α−ＳＦＭｅ）及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。ノニオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、脂肪酸メチルエステルエトキシレート、スクロース、及びグルコースの脂肪酸エステル、並びにアルキルグルコシド、ポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステル等がある。
本発明のセルロース含有繊維の処理方法は、本発明のセルラーゼ、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を、セルロース含有繊維と接触させることにより行う。
本発明の繊維処理方法により改善されうる、セルロース含有繊維の性質としては、以下のものが含まれる。
（１）毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、又は毛羽立ちの低減）
（２）減量による繊維の肌触り及び外観の改善
（３）着色セルロース含有繊維の色の澄明化
（４）着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊維、代表的にはジーンズへのストーンウォッシュ様の外観及び風合いの付与
（５）柔軟化（ごわつき始める速度の低減、又はごわつきの低減）
本発明の繊維処理方法は、具体的には、繊維が浸漬されているか又は浸漬されうる水に、本発明のセルラーゼ、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を添加することにより行うことができ、例えば、繊維の浸漬工程、洗濯工程、又はすすぎ工程で行うことができる。
接触温度、又は前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、若しくは前記洗剤組成物の添加量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
更に、セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的とした減量加工の場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．１〜５０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
また、着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化することを目的とした場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
また、着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供するために用いる場合、２０〜６０℃程度の温度で、０．１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
また、前記の方法は、セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減させる場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
更に、本発明は、古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法に関する。
本発明のセルラーゼ又はセルラーゼ調製物は、古紙に作用させると脱インキの効率を向上させるため、古紙から再生紙を製造する過程において有用である。前記脱インキ方法によれば、残インキ繊維が大幅に減少するため、古紙の白色度を向上させることができる。
前記脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品であればよく、特に限定されないが、例えば、アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム等）、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、アニオン系の界面活性剤、ノニオン系の界面活性剤、又は補集材（例えば、オレイン酸等）などが挙げられ、助剤として、ｐＨ安定剤、キレート剤、又は分散剤等が挙げられる。
前記脱インキ方法を適用し得る古紙は、一般に古紙と呼ばれるものであればよく、特に限定されないが、例えば、機械パルプ及び化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、又はこれらの塗工紙等の印刷古紙が挙げられる。更に、一般に古紙と呼ばれるもの以外であっても、インクの付着している紙であれば、前記脱インキ方法を適用することができる。
更に、本発明は、紙パルプのろ水性の改善方法に関し、前記方法は、紙パルプを、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
前記方法によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、有意に改善されるものと考えられる。前記方法を適用し得るパルプは特に限定されないが、例えば、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、又は加工熱処理その他の高収率パルプ等が挙げられる。
更に、本発明は、動物飼料の消化能を改善する方法に関し、動物飼料を、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
前記方法によれば、動物飼料中のグルカンが適度に低分子化されるため、動物飼料の消化能を改善することができる。
更に、本発明によるセルラーゼを動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。従って、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のセルラーゼ又はセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む方法が提供される。
以上、本発明のセルラーゼ及び洗剤組成物並びにそれらを用いる本発明方法について説明したが、本発明セルラーゼの親セルラーゼであるセルラーゼＮＣＥ５が、セルラーゼ調製物又は洗剤組成物の有効成分として用いることができ、これらのセルラーゼＮＣＥ５又はセルラーゼＮＣＥ５含有セルラーゼ調製物若しくは洗剤組成物を用いることにより、例えば、セルロース含有線維の各種性質を改善［例えば、毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、又は毛羽立ちの低減）、減量による繊維の肌触り及び外観の改善、着色セルロース含有繊維の色の澄明化、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、又は柔軟化（ごわつき始める速度の低減、又はごわつきの低減）など］することができること、古紙の脱インキを行うことができること、紙パルプのろ水性を改善することができること、あるいは、動物飼料の症可能を改善することができることは、国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに開示されている。本発明のセルラーゼは、親セルラーゼであるＮＣＥ５と比較して、優れた界面活性剤耐性及びアルカリ耐性を示しており、従って、セルラーゼ調製物又は洗剤組成物の有効成分として、あるいは、セルラーゼＮＣＥ５を用いて実施する前記各種方法において、セルラーゼＮＣＥ５に代えて、本発明のセルラーゼを使用することにより、より優れた効果を期待することができる。
微生物の寄託
本発明の親セルラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、平成１２年（２０００年）４月１８日よりＦＥＲＭ ＢＰ−７１３８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）］に寄託されている。
また、実施例２（２）で使用するフミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７株は、平成８年（１９９６年）７月１５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３６）されたものであり、平成９年（１９９７年）６月１３日から国際寄託（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７）に移管されている。
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
実施例１：セルラーゼをコードする遺伝子の作成
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる親セルラーゼの１６２番目のアミノ酸がプロリンに置換されたセルラーゼ（以下Ａ１６２Ｐとする。配列番号３）、１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されたセルラーゼ（以下Ｋ１６６Ｅとする。配列番号４）、１６２番目及び１６６番目のアミノ酸がそれぞれプロリン及びグルタミン酸に置換されたセルラーゼ（以下ＡＰＫＥとする。配列番号５）をコードするＤＮＡは以下に示すようにして作成した。
国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに記載のプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍを鋳型ＤＮＡとし、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を使用して親セルラーゼをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入した。方法はキットに添付のプロトコールに従った。変異導入用のプライマーとして以下に示す３種のプライマーを使用した。
プライマーＮＣＥ５−Ａ１６２ＰはセルラーゼＡ１６２ＰをコードするＤＮＡを作成するためのプライマーであり、プライマーＮＣＥ５−Ｋ１６６ＥはセルラーゼＫ１６６ＥをコードするＤＮＡを作成するためのプライマーであり、プライマーＮＣＥ５−ＡＰＫＥはセルラーゼＡＰＫＥをコードするＤＮＡを作成するためのプライマーである。
前記３種のプライマーを使用して得られた変異導入ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＰｓｔ Ｉで消化後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出しエタノール沈殿を行った。これらを予め制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＰｓｔ Ｉで消化しておいたプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、プラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ−１１８（Ａ１６２Ｐ）、ｐＮＣＥ５ＫＥ−１１８（Ｋ１６６Ｅ）及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥ−１１８（ＡＰＫＥ）を得た。これら３種のプラスミドの挿入断片について全塩基配列を蛍光ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキン・エルマー社製）を用いて決定した結果、各ＤＮＡ断片には目的の変異のみが導入されていることが確認された。
実施例２：各セルラーゼ遺伝子のフミコーラ・インソレンスでの発現
（１）セルラーゼ遺伝子発現用プラスミドの構築
実施例１で得られた各セルラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ−１１８、ｐＮＣＥ５ＫＥ−１１８及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥ−１１８を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これらを、予め制限酵素ＢａｍＨ Ｉで消化し、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ末端を脱リン酸化しておいたフミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７用発現ベクターｐＪＤ−ｃ５（国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに記載）と連結し、各セルラーゼ遺伝子を発現させるためのプラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ（Ａ１６２Ｐ）、ｐＮＣＥ５ＫＥ（Ｋ１６６Ｅ）、及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥ（ＡＰＫＥ）を得た。
（２）フミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７の形質転換
フミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７を（Ｓ）培地中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。（Ｓ）培地の組成は、（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）にグルコース（３．０％）を加え、アビセルを除いたものである。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬ Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース）１０ｍＬに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液［０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）］で洗浄した。
以上のように調製したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのＤＮＡ（ＴＥ）溶液（１０μＬ）を加え氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液［６０％ ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）］を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
以上の処理を加えたプロトプラストを、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）添加ＹＭＧ培地［１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８）］上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃、５日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる形質転換体の評価
前述のようにしてプラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ、ｐＮＣＥ５ＫＥ、及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥを用いて得られたフミコーラ・インソレンス形質転換体を（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）で３７℃、５日間培養し、得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはテフコ社のシステムを用いて実施した。すなわち、電気泳動槽（Ｎｏ．０３−１０１）、電源（Ｍｏｄｅｌ：３５４０）、ゲル１２％（０１−００５）、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーキット（０６−０３０１）を用いた。泳動条件は、１８ｍＡ／９０分とした。泳動後のゲルの染色は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色液（０．１％クマシーブリリアントブルーＲ２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）を用いて行い、その後脱色液（１０％メタノール、７．５％酢酸）で脱色して蛋白質を検出した。分子量マーカーには、アマシャムバイオサイエンス社のＬＭＷ Ｍａｒｋｅｒ Ｋｉｔ（１７−０４４６−０１）を用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、２５ｋＤａ蛋白質が増強されている形質転換体が見出され、これら形質転換体では目的とするセルラーゼが生産されていることが確認された。これら形質転換体のうち、セルラーゼＡ１６２Ｐ、Ｋ１６６Ｅ、及びＡＰＫＥを生産する形質転換体としてＫ２１５−４０株、Ｋ２１５−４２株、及びＫ２２９−７２株をそれぞれ選択し以降の解析に使用した。また、国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに記載されたＮＣＥ５（親セルラーゼ）を解析のコントロールとして使用した。
実施例３：各形質転換体から得られたセルラーゼの評価
フミコーラ・インソレンス形質転換体Ｋ２１５−４０株、Ｋ２１５−４２株、及びＫ２２９−７２株を（Ｎ）培地で、３７℃、５日間培養して得られた培養上清を用いて、（１）ｐＨ６．０、（２）ｐＨ６．０且つリニアアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）２００ｐｐｍ添加、（３）ｐＨ１０．０の３試験区でＥＧＵ活性を測定した。
ＥＧＵ活性は以下のようにして測定した。基質溶液として、カルボキシメチルセルロース（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社製）を終濃度３．５％となるように適切な緩衝液に溶解した。すなわち、ｐＨ６．０で測定する場合は０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、またｐＨ１０．０で測定する場合は０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解した。基質溶液５ｍＬを試験管に取り、４０℃の恒温槽にいれ１０分間予熱した。これに試料溶液０．１５ｍＬを加え、良く攪拌し、４０℃で酵素反応を開始した。３０分間反応させた後、４０℃に設定しておいたＲ型粘度計（東機産業ＲＥ１００）で粘度を測定した。各酵素反応条件下において、初期粘度を１／２に低下させる酵素量を１単位とした。試験区（１）における酵素活性を１００％として試験区（２）及び（３）の酵素活性を相対値で示すと以下の表のようになった。
以上の結果から、各セルラーゼ（Ａ１６２Ｐ、Ｋ１６６Ｅ、及びＡＰＫＥ）は、親セルラーゼと比較してＬＡＳに対して耐性で且つアルカリ性条件下で高い活性が保持されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
本発明の新規なセルラーゼは、親セルラーゼと比較して界面活性剤に対して耐性であること及びアルカリ性条件下でより強い活性を示すことから、衣料用洗浄剤に配合した場合に有用である。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜５の配列で表される各アミノ酸配列は、界面活性剤耐性セルラーゼである。配列番号６〜７の配列で表される各塩基配列は、部位特異的変異導入用プライマーである。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【技術分野】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる親セルラーゼの一部のアミノ酸配列が置換されたアミノ酸配列を有する新規なセルラーゼに関する。
【背景技術】
セルラーゼは、その特性を活かしてさまざまな産業分野で利用されている。具体的な利用分野の一つは繊維加工分野であり、特にセルロース含有繊維に所望の特性を与えるための処理がなされている。すなわち、セルロース含有繊維の肌ざわり及び／又は外観を改善するために、そして、着色されたセルロース含有繊維に色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」様外観を与える「バイオウオッシュ」のためにセルラーゼが使用されている。また、近年では木材パルプ由来のセルロースを有機溶媒に溶解して紡糸する再生セルロース系繊維であるリヨセルが、その強度や吸水性等の性質、更には環境汚染を起こしにくい製造法から注目を集めているが、その製造工程で発生する織物表面の毛羽を除く加工にセルラーゼが用いられている。
従来、セルラーゼは複数の酵素の共同作用によりセルロースを分解する作用があるとされてきた。近年、タンパク質分離技術や遺伝子技術の進展により、複合酵素であるセルラーゼから、前記の繊維加工に適した酵素成分を分離し製造する試みがなされている。とりわけ、糸状菌のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属又はフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属由来のセルラーゼについては研究が進み、フミコーラ属では、ＣＢＨ Ｉ、ＥＧ Ｖ、ＮＣＥ４、及びＮＣＥ２などが、トリコデルマ属では、ＣＢＨ Ｉ、ＣＢＨ ＩＩ、ＥＧ ＩＩ、及びＥＧ ＩＩＩなどの成分が単離され、遺伝子操作によって過剰発現酵素やモノコンポーネント酵素などを調製することにより、各用途に適した特定セルラーゼ成分を多量に含むセルラーゼ調製物が製造されるようになってきた。
また、エンドグルカナーゼ酵素ＮＣＥ５は、デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウォッシュ外観の付与、又は肌触りの改善において、その処理工程中で衣料にインジゴ染料の一部が再付着又は逆染色、すなわち白場汚染（ｂａｃｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ）の度合いが低いセルラーゼとして有用であることが知られている（特許文献１参照）。
一方、セルラーゼを衣料用洗浄剤用途に用いる場合には、必要なセルラーゼ成分を量的に改善するだけでなく質的に改善することが望まれている。すなわち、衣料用洗浄剤には各種界面活性剤が配合されているとともに、これを水に溶解した場合アルカリ性（ｐＨ１０〜１１）を示すことから、衣料用洗浄剤に配合されるセルラーゼの性質として各種界面活性剤に対して耐性であること及びアルカリ性条件下でより強い活性を示すことが求められている。
（特許文献１） 国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレット（第２−３頁及び配列表の配列番号１で表される配列）
【発明の開示】
本発明は、界面活性剤に耐性及び／又はアルカリ性条件下で高い活性を有する新規なセルラーゼを提供することを課題とする。
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼ（ＮＣＥ５）において、そのアミノ酸配列における１６２番目及び／又は１６６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することによって、界面活性剤に耐性及び／又はアルカリ性条件下で高い活性を有する新規なセルラーゼを取得することに成功した。すなわち本発明は、以下の通りである。
［１］（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼの１６２番目及び／又は１６６番目のアミノ酸残基が、前記セルラーゼのアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、あるいは、（２）前記アミノ酸配列（１）のＮ末端に１又は複数個のアミノ酸が付加又は欠失したアミノ酸配列を有する、セルラーゼ。
［２］配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する、前記［１］のセルラーゼ。
［３］１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されている、前記［１］のセルラーゼ。
［４］配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する、前記［３］のセルラーゼ。
［５］配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するセルラーゼ。
［６］前記［１］〜［５］のセルラーゼをコードするポリヌクレオチド。
［７］前記［６］のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［８］前記［７］の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
［９］前記［８］の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養物からセルラーゼを採取する工程を含む、前記［１］〜［５］のセルラーゼの製造法。
［１０］前記［１］〜［５］のセルラーゼを含む、セルラーゼ調製物。
［１１］前記［１］〜［５］のセルラーゼ、又は前記［１０］のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
［１２］セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１３］セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１４］セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１５］着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１６］着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１７］セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物、又は前記［１１］の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
［１８］繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、前記［１２］〜［１７］の方法。
［１９］古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
［２０］紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
［２１］動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、前記［１］〜［５］のセルラーゼ、前記［１０］のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
親セルラーゼ
本発明において、親セルラーゼとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列よりなるセルラーゼである。また、本親セルラーゼを生産する宿主の種類によっては分泌シグナル配列のプロセッシングが異なることがあることから、その結果としてＮ末端に１〜複数個のアミノ酸が付加又は欠失されたような相同体も親セルラーゼに含まれる。
本発明における新規なセルラーゼ
本発明における新規なセルラーゼは、親セルラーゼが配列番号１で表されるアミノ酸配列よりなるものである場合、そのアミノ酸配列中の１６２及び１６６番目のアミノ酸から選択される１個又は２個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されたセルラーゼがその具体例として挙げられるが、天然に分離された菌株等から結果として得られたセルラーゼも、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１６２及び／又は１６６番目のアミノ酸、又はそれに相当するアミノ酸が置換されたセルラーゼである限り、本発明のセルラーゼに含まれる。
本発明の好ましい態様によれば、配列番号１に記載されたアミノ酸配列の１６２番目のアミノ酸がプロリンに、１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されたものが好ましいものとして挙げられる。本発明の更に好ましい態様によれば、配列番号３〜配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するセルラーゼが更に好ましいものとして挙げられる。これらのセルラーゼは、界面活性剤に耐性及び／又はアルカリ性条件下で高い活性が保持されるという有利な性質を有している。
また、親セルラーゼが配列番号１で表されるアミノ酸配列の相同体である場合には、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６２及び１６６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸から選択される１個又は２個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されてなるものがその具体例として挙げられる。ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列よりなる親セルラーゼの相同体において置換されるべきアミノ酸残基の位置は、公知のアルゴリズムによるアミノ酸配列の比較によって容易に選択することができる。
本発明における新規なセルラーゼの作製
本発明の新規なセルラーゼは、組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成技術などによって作製することができるほか、天然から分離された菌株から取得することもできる。
組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、親セルラーゼをコードするＤＮＡを取得し、このＤＮＡ内で特異的部位に突然変異を発生させてコードするアミノ酸を置換させた後、変異処理を施したＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養することによって新規なセルラーゼを調製することができる。親セルラーゼをコードするＤＮＡとしては、使用する宿主細胞を勘案し、配列番号１で表されるアミノ酸配列から適宜全合成可能であるが、好ましくは配列番号２で表される塩基配列からなるものであり、これはフミコーラ・インソレンスのｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法で取得可能である。
遺伝子の特定部位に突然変異を導入するための幾つかの方法は、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０（１９８７）］、Ｋｕｎｋｅｌ法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７（１９８７）］など当業者に公知である。これらの方法は、親セルラーゼをコードするＤＮＡ内で特異的部位に突然変異を発生させることに利用することができる。変異処理後のＤＮＡの塩基配列は、マキサム−ギルバードの化学修飾法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）］やジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Ｇｅｎｅ，１９，２６９（１９８２）］等により確認することができ、本発明におけるセルラーゼのアミノ酸配列は、確認された塩基配列より解読することができる。
本発明における新規なセルラーゼの生産
本発明におけるセルラーゼは、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能且つ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に発現ベクター、の形態として宿主細胞の形質転換を行い、その宿主細胞において産生させることができる。
よって、本発明においては、前記の本発明によるセルラーゼをコードするＤＮＡ断片を、宿主微生物内で複製可能で、且つ、そのＤＮＡ断片がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるＤＮＡ断片の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、ターミネーター及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主徴生物と同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、又は糸状菌などを用いた系、及び、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から前記の本発明によるタンパク質を単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明における新規なセルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明は、本発明のセルラーゼを含むセルラーゼ調製物に関する。
一般に、セルラーゼ調製物とは、セルラーゼ酵素の他に、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、又はソルビトール等）、防腐剤、及び／又は非イオン系界面活性剤等を含有させることができる。また、セルラーゼ調製物の形態は、固形状であっても液体状であってもよく、具体的には、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、又は液体製剤が挙げられる。本発明のセルラーゼ調製物には、本発明のセルラーゼに加えて、他のセルラーゼ酵素、例えば、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ及び本発明以外のエンドグルカナーゼを含めてもよい。
セルラーゼ調製物の１種である非粉塵化顆粒（好ましくは、飛散性のない顆粒状）は、通常の乾式造粒法を用いて製造することが可能である。すなわち、粉末状態の本発明のセルラーゼを、中性でエンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない無機塩（例えば、硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウム）、エンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない鉱物（例えば、ベントナイト又はモンモリナイト）、及び中性の有機物（例えば、澱粉又は粒状セルロース等）等から選ばれる１種又は複数種に混合した後、非イオン界面活性剤の１種又は複数種の粉末、あるいは微細に懸濁された懸濁液を加え、充分に混合又は混練する。状況に応じ、固形物を結着させる合成高分子（例えば、ポリエチレングリコール等）又は天然高分子（例えば、スターチ等）を適宜添加し、更に混練した後、ディスクペレッターなどの押し出し成形造粒を行い、成形物をマルメライザーにより球状に成形後、乾燥させることで非粉塵化顆粒を製造することが可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。また、顆粒表面をポリマー等でコーティングすることにより、酸素透過や水分透過をコントロールすることも可能である。
一方、セルラーゼ調製物の１種である液状製剤（好ましくは、安定化された液体状）は、本発明のセルラーゼを含む溶液に、エンドグルカナーゼの安定化剤（例えば、合成高分子又は天然高分子等）を配合し、必要に応じて無機塩類及び／又は合成防腐剤を添加して調製することが可能である。このとき、非イオン界面活性剤の１種又は複数種を配合することも可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数種の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。
更に、本発明は、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物を含む洗剤組成物を提供する。前記洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性又は双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。また、前記洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、及び／又は発泡促進剤等をも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルキル硫酸塩（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル塩（α−ＳＦＭｅ）及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。ノニオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、脂肪酸メチルエステルエトキシレート、スクロース、及びグルコースの脂肪酸エステル、並びにアルキルグルコシド、ポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステル等がある。
本発明のセルロース含有繊維の処理方法は、本発明のセルラーゼ、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を、セルロース含有繊維と接触させることにより行う。
本発明の繊維処理方法により改善されうる、セルロース含有繊維の性質としては、以下のものが含まれる。
（１）毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、又は毛羽立ちの低減）
（２）減量による繊維の肌触り及び外観の改善
（３）着色セルロース含有繊維の色の澄明化
（４）着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊維、代表的にはジーンズへのストーンウォッシュ様の外観及び風合いの付与
（５）柔軟化（ごわつき始める速度の低減、又はごわつきの低減）
本発明の繊維処理方法は、具体的には、繊維が浸漬されているか又は浸漬されうる水に、本発明のセルラーゼ、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を添加することにより行うことができ、例えば、繊維の浸漬工程、洗濯工程、又はすすぎ工程で行うことができる。
接触温度、又は前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、若しくは前記洗剤組成物の添加量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
更に、セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的とした減量加工の場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．１〜５０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
また、着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化することを目的とした場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
また、着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供するために用いる場合、２０〜６０℃程度の温度で、０．１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
また、前記の方法は、セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減させる場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の前記セルラーゼ、前記セルラーゼ調製物、又は前記洗剤組成物を使用することが好ましい。
更に、本発明は、古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法に関する。
本発明のセルラーゼ又はセルラーゼ調製物は、古紙に作用させると脱インキの効率を向上させるため、古紙から再生紙を製造する過程において有用である。前記脱インキ方法によれば、残インキ繊維が大幅に減少するため、古紙の白色度を向上させることができる。
前記脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品であればよく、特に限定されないが、例えば、アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム等）、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、アニオン系の界面活性剤、ノニオン系の界面活性剤、又は補集材（例えば、オレイン酸等）などが挙げられ、助剤として、ｐＨ安定剤、キレート剤、又は分散剤等が挙げられる。
前記脱インキ方法を適用し得る古紙は、一般に古紙と呼ばれるものであればよく、特に限定されないが、例えば、機械パルプ及び化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、又はこれらの塗工紙等の印刷古紙が挙げられる。更に、一般に古紙と呼ばれるもの以外であっても、インクの付着している紙であれば、前記脱インキ方法を適用することができる。
更に、本発明は、紙パルプのろ水性の改善方法に関し、前記方法は、紙パルプを、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
前記方法によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、有意に改善されるものと考えられる。前記方法を適用し得るパルプは特に限定されないが、例えば、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、又は加工熱処理その他の高収率パルプ等が挙げられる。
更に、本発明は、動物飼料の消化能を改善する方法に関し、動物飼料を、本発明のセルラーゼ又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
前記方法によれば、動物飼料中のグルカンが適度に低分子化されるため、動物飼料の消化能を改善することができる。
更に、本発明によるセルラーゼを動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。従って、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のセルラーゼ又はセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む方法が提供される。
以上、本発明のセルラーゼ及び洗剤組成物並びにそれらを用いる本発明方法について説明したが、本発明セルラーゼの親セルラーゼであるセルラーゼＮＣＥ５が、セルラーゼ調製物又は洗剤組成物の有効成分として用いることができ、これらのセルラーゼＮＣＥ５又はセルラーゼＮＣＥ５含有セルラーゼ調製物若しくは洗剤組成物を用いることにより、例えば、セルロース含有線維の各種性質を改善［例えば、毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、又は毛羽立ちの低減）、減量による繊維の肌触り及び外観の改善、着色セルロース含有繊維の色の澄明化、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、又は柔軟化（ごわつき始める速度の低減、又はごわつきの低減）など］することができること、古紙の脱インキを行うことができること、紙パルプのろ水性を改善することができること、あるいは、動物飼料の症可能を改善することができることは、国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに開示されている。本発明のセルラーゼは、親セルラーゼであるＮＣＥ５と比較して、優れた界面活性剤耐性及びアルカリ耐性を示しており、従って、セルラーゼ調製物又は洗剤組成物の有効成分として、あるいは、セルラーゼＮＣＥ５を用いて実施する前記各種方法において、セルラーゼＮＣＥ５に代えて、本発明のセルラーゼを使用することにより、より優れた効果を期待することができる。
微生物の寄託
本発明の親セルラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、平成１２年（２０００年）４月１８日よりＦＥＲＭ ＢＰ−７１３８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）］に寄託されている。
また、実施例２（２）で使用するフミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７株は、平成８年（１９９６年）７月１５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３６）されたものであり、平成９年（１９９７年）６月１３日から国際寄託（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７）に移管されている。
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
実施例１：セルラーゼをコードする遺伝子の作成
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる親セルラーゼの１６２番目のアミノ酸がプロリンに置換されたセルラーゼ（以下Ａ１６２Ｐとする。配列番号３）、１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されたセルラーゼ（以下Ｋ１６６Ｅとする。配列番号４）、１６２番目及び１６６番目のアミノ酸がそれぞれプロリン及びグルタミン酸に置換されたセルラーゼ（以下ＡＰＫＥとする。配列番号５）をコードするＤＮＡは以下に示すようにして作成した。
国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに記載のプラスミドｐＮＣＥ５Ｂａｍを鋳型ＤＮＡとし、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を使用して親セルラーゼをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入した。方法はキットに添付のプロトコールに従った。変異導入用のプライマーとして以下に示す３種のプライマーを使用した。
プライマーＮＣＥ５−Ａ１６２ＰはセルラーゼＡ１６２ＰをコードするＤＮＡを作成するためのプライマーであり、プライマーＮＣＥ５−Ｋ１６６ＥはセルラーゼＫ１６６ＥをコードするＤＮＡを作成するためのプライマーであり、プライマーＮＣＥ５−ＡＰＫＥはセルラーゼＡＰＫＥをコードするＤＮＡを作成するためのプライマーである。
前記３種のプライマーを使用して得られた変異導入ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＰｓｔ Ｉで消化後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出しエタノール沈殿を行った。これらを予め制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＰｓｔ Ｉで消化しておいたプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、プラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ−１１８（Ａ１６２Ｐ）、ｐＮＣＥ５ＫＥ−１１８（Ｋ１６６Ｅ）及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥ−１１８（ＡＰＫＥ）を得た。これら３種のプラスミドの挿入断片について全塩基配列を蛍光ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキン・エルマー社製）を用いて決定した結果、各ＤＮＡ断片には目的の変異のみが導入されていることが確認された。
実施例２：各セルラーゼ遺伝子のフミコーラ・インソレンスでの発現
（１）セルラーゼ遺伝子発現用プラスミドの構築
実施例１で得られた各セルラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ−１１８、ｐＮＣＥ５ＫＥ−１１８及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥ−１１８を制限酵素ＢａｍＨ Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これらを、予め制限酵素ＢａｍＨ Ｉで消化し、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ末端を脱リン酸化しておいたフミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７用発現ベクターｐＪＤ−ｃ５（国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに記載）と連結し、各セルラーゼ遺伝子を発現させるためのプラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ（Ａ１６２Ｐ）、ｐＮＣＥ５ＫＥ（Ｋ１６６Ｅ）、及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥ（ＡＰＫＥ）を得た。
（２）フミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７の形質転換
フミコーラ・インソレンスＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７を（Ｓ）培地中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。（Ｓ）培地の組成は、（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）にグルコース（３．０％）を加え、アビセルを除いたものである。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬ Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース）１０ｍＬに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液［０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）］で洗浄した。
以上のように調製したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのＤＮＡ（ＴＥ）溶液（１０μＬ）を加え氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液［６０％ ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５）］を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
以上の処理を加えたプロトプラストを、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）添加ＹＭＧ培地［１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８）］上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃、５日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる形質転換体の評価
前述のようにしてプラスミドｐＮＣＥ５ＡＰ、ｐＮＣＥ５ＫＥ、及びｐＮＣＥ５ＡＰＫＥを用いて得られたフミコーラ・インソレンス形質転換体を（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）で３７℃、５日間培養し、得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはテフコ社のシステムを用いて実施した。すなわち、電気泳動槽（Ｎｏ．０３−１０１）、電源（Ｍｏｄｅｌ：３５４０）、ゲル１２％（０１−００５）、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーキット（０６−０３０１）を用いた。泳動条件は、１８ｍＡ／９０分とした。泳動後のゲルの染色は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色液（０．１％クマシーブリリアントブルーＲ２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）を用いて行い、その後脱色液（１０％メタノール、７．５％酢酸）で脱色して蛋白質を検出した。分子量マーカーには、アマシャムバイオサイエンス社のＬＭＷ Ｍａｒｋｅｒ Ｋｉｔ（１７−０４４６−０１）を用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、２５ｋＤａ蛋白質が増強されている形質転換体が見出され、これら形質転換体では目的とするセルラーゼが生産されていることが確認された。これら形質転換体のうち、セルラーゼＡ１６２Ｐ、Ｋ１６６Ｅ、及びＡＰＫＥを生産する形質転換体としてＫ２１５−４０株、Ｋ２１５−４２株、及びＫ２２９−７２株をそれぞれ選択し以降の解析に使用した。また、国際公開第ＷＯ ０１／９０３７５号パンフレットに記載されたＮＣＥ５（親セルラーゼ）を解析のコントロールとして使用した。
実施例３：各形質転換体から得られたセルラーゼの評価
フミコーラ・インソレンス形質転換体Ｋ２１５−４０株、Ｋ２１５−４２株、及びＫ２２９−７２株を（Ｎ）培地で、３７℃、５日間培養して得られた培養上清を用いて、（１）ｐＨ６．０、（２）ｐＨ６．０且つリニアアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）２００ｐｐｍ添加、（３）ｐＨ１０．０の３試験区でＥＧＵ活性を測定した。
ＥＧＵ活性は以下のようにして測定した。基質溶液として、カルボキシメチルセルロース（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社製）を終濃度３．５％となるように適切な緩衝液に溶解した。すなわち、ｐＨ６．０で測定する場合は０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、またｐＨ１０．０で測定する場合は０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解した。基質溶液５ｍＬを試験管に取り、４０℃の恒温槽にいれ１０分間予熱した。これに試料溶液０．１５ｍＬを加え、良く攪拌し、４０℃で酵素反応を開始した。３０分間反応させた後、４０℃に設定しておいたＲ型粘度計（東機産業ＲＥ１００）で粘度を測定した。各酵素反応条件下において、初期粘度を１／２に低下させる酵素量を１単位とした。試験区（１）における酵素活性を１００％として試験区（２）及び（３）の酵素活性を相対値で示すと以下の表のようになった。
以上の結果から、各セルラーゼ（Ａ１６２Ｐ、Ｋ１６６Ｅ、及びＡＰＫＥ）は、親セルラーゼと比較してＬＡＳに対して耐性で且つアルカリ性条件下で高い活性が保持されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
本発明の新規なセルラーゼは、親セルラーゼと比較して界面活性剤に対して耐性であること及びアルカリ性条件下でより強い活性を示すことから、衣料用洗浄剤に配合した場合に有用である。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜５の配列で表される各アミノ酸配列は、界面活性剤耐性セルラーゼである。配列番号６〜７の配列で表される各塩基配列は、部位特異的変異導入用プライマーである。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼの１６２番目及び／又は１６６番目のアミノ酸残基が、前記セルラーゼのアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、あるいは、（２）前記アミノ酸配列（１）のＮ末端に１又は複数個のアミノ酸が付加又は欠失したアミノ酸配列
を有する、セルラーゼ。
【請求項２】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項３】
１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されている、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項４】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のセルラーゼ。
【請求項５】
配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するセルラーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養物からセルラーゼを採取する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼを含む、セルラーゼ調製物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、又は請求項１０に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
【請求項１２】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
【請求項２０】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
【請求項１】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるセルラーゼの１６２番目及び／又は１６６番目のアミノ酸残基が、前記セルラーゼのアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、あるいは、（２）前記アミノ酸配列（１）のＮ末端に１又は複数個のアミノ酸が付加又は欠失したアミノ酸配列
を有する、セルラーゼ。
【請求項２】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項３】
１６６番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されている、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項４】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のセルラーゼ。
【請求項５】
配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するセルラーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養物からセルラーゼを採取する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼを含む、セルラーゼ調製物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、又は請求項１０に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
【請求項１２】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１１に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
【請求項２０】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼ、請求項１０に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、前記方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９９６９
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【発行日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４８１０８（Ｐ２００４−５４８１０８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４０１３
【国際出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【発行日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４０１３
【国際出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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