異方性多孔質膜
【課題】血液成分の測定において血液の性状の違いによる影響を受けにくい異方性多孔質膜を提供する。
【解決手段】血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿が滲み出す第２の表面とを有し、第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性の多孔質膜であって、１）前記第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％であり、２）前記第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍであり、３）前記第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍであり、４）前記多孔質膜の膜厚が、７０〜１５０μｍであり、５）前記第１の表面からの赤血球の侵入率が、膜厚の２０〜４０％であり、６）ヘマトクリット値６０％の血液を前記第１の表面に適用したとき、展開が１秒以内に完了する、異方性多孔質膜。
【解決手段】血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿が滲み出す第２の表面とを有し、第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性の多孔質膜であって、１）前記第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％であり、２）前記第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍであり、３）前記第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍであり、４）前記多孔質膜の膜厚が、７０〜１５０μｍであり、５）前記第１の表面からの赤血球の侵入率が、膜厚の２０〜４０％であり、６）ヘマトクリット値６０％の血液を前記第１の表面に適用したとき、展開が１秒以内に完了する、異方性多孔質膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性の異方性多孔質膜で、血液成分測定に有用な試験紙に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値の測定を行う血糖値測定装置（血中成分測定装置）が知られている。この血糖値測定装置は、血中のグルコース量に応じて呈色する試験紙の呈色の度合いを光学的に測定（測色）して血糖値を定量化するものであり、試験紙の測色は、発光素子および受光素子を備える測光部において、試験紙に光を照射しその反射光の強度を測定することにより行われている。
【０００３】
試験紙としての合成ポリマー膜は、特許文献１に記載されている。特許文献１は、「対抗する２つの非対称な表面を有するポリスルホンポリマー膜の非対称性多孔質支持体であって、検体を測定する多孔質表皮層表面（第１の多孔質表皮層表面）が比較的開放孔構造を有し、検体と接する表面（第２の表面）がより開放孔構造を有し、支持構造体が検体を測定する多孔質表皮層表面に近接する等方性領域を含み、該等方性領域は実質的に一定の孔径を有し、該多孔質支持体はさらに該等方性領域に近接する非対称性領域を含み、該非対称性領域は高度の非対称性を有しかつ該支持構造体の少なくとも５０％であるが８０％以下にわたって広がるポリマー膜（特許文献１の請求項１）。」を記載する。このポリマー膜は、「実質的にすべての表皮層の孔が約１．２ミクロンより大きい直径を有する膜の一面にある積層多孔質表皮層、及び支持層が第１ゾーンと第２ゾーンとがあり、第２ゾーンから反対面の方向へ徐々に増加する孔径を有する膜（特許文献１の請求項１９）。」が記載される。
また、「１．２ミクロンより大きい表面孔を第１の多孔質表皮層表面に形成するに十分な時間、孔形成雰囲気を有する気体雰囲気にキャスト層を接触させる製造方法（請求項２９）」が記載される。このように、このポリマー膜は検体を測定する面の平均または最小孔径が１．２ミクロンより大きいものである。検体と接する第２の面の平均孔径は、より大きいものであることがわかる。
【０００４】
特許文献２には、「検体中の濾別物を濾別する機能を有し、該検体中の特定成分と反応して呈色する試薬を担持する多孔質膜からなる試験紙であって、前記多孔質膜が、検体が供給される表面を有する第１の層と、該検体がしみ出し測定される表面を有する第２の層とを有し、前記第１の層が断面密度４０％以下の大孔部からなり、該第１の層の表面が開孔部を有し、前記第２の層が断面密度４０％を超える小孔部からなり、該第２の層の表面が開孔部を有する表面であって、該第１の層は、該第１の層の表面から前記多孔質膜の膜厚の１／５乃至１／２までの範囲にあり、さらに、前記多孔質膜の膜厚が５０〜２００μｍ、空孔率が６０〜９５％であり、前記第１の層の表面の平均孔径が０．５〜１０μｍであり、前記第２の層の表面の平均孔径が０．１〜３．０μｍであり、前記第２の層のＪＩＳＺ８７４１による表面の光沢度が、１１以下である試験紙（特許文献２の請求項１）。」が、記載されている。特許文献２に記載の試験紙は、「検体の展開速度が速く、十分な試薬担持量を確保することができ、より高精度の測定を行うこと（段落００５８）。」ができる。
【０００５】
一方、血糖値を測定される血液は、人種、地域、年代、個人の状態によっても広い範囲で成分が変化する。また測定時の条件、特に温度によっても変化する。このような変化は、通常、予め多種類のデータから補正値または補正式を予測して、試験紙の測色結果を補正して結果を表示する。しかし、このような補正はあくまで一般的なものであり測定精度には一定の限界がある。
特に血液中のヘマトクリット値はおよそ２０から６０の幅があり、血液粘度が大きく異なるので従来の測定用多孔質膜では血液の展開速度（染み込み速度）が大きく変動し、測定精度を向上させるために苦労していた。
従来技術ではこのような測定される血中のヘマトクリット値が変動しても測定時間が一定範囲内である血糖値測定用多孔質膜は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３５８５１７５号公報
【特許文献２】特許第４３７４３４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者等は、上記従来技術の問題点を解決し、血液の性状による差の影響を受けにくい異方性多孔質膜（以下、多孔質膜ということがある）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、異方性多孔質膜において、血液が適用される第１の表面を適切な範囲で表面孔径を大きくすることによって、測定される血液の性状の影響を受けにくい測定が可能で、測定値の再現性が向上することを知見し本発明に至った。
【０００９】
すなわち本発明は以下を提供する。
（１）血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿が滲み出す第２の表面とを有し、前記第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性の多孔質膜であって、１）前記第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％であり、２）前記第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍであり、３）前記第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍであり、４）前記多孔質膜の膜厚が、７０〜１５０μｍであり、５）前記第１の表面からの赤血球の侵入率が、膜厚の２０〜４０％であり、６）ヘマトクリット値６０％の血液を前記第１の表面に適用したとき、展開が１秒以内に完了する、異方性多孔質膜。
（２）前記赤血球の侵入率が膜厚の２６〜３４％である（１）に記載の異方性多孔質膜。
（３）前記多孔質膜の膜厚が、１００〜１４０μｍである（１）または（２）に記載の異方性多孔質膜。
（４）前記第１の表面の表面開孔率が４．６〜８．２％であり、前記第１の表面の平均孔径が３．４〜４．４μｍである（１）ないし（３）のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
（５）前記多孔質膜の通気度が、１．７〜５．２Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である（１）ないし（４）のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
（６）前記多孔質膜の通気度が、２．０〜４．３Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である（１）ないし（５）のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
（７）上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の異方性多孔質膜を用いた血液成分測定用膜。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の異方性多孔質膜は、血液のしみこみが速く、血液成分測定用の試験紙として用いると短時間、低温（常温付近）での測定が可能となる。また、血液の性状による差の影響を受けにくいため測定値の再現性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１（標本番号３）の多孔質膜の断面（図１（Ａ））と第１の表面（図１（Ｂ））とを示すＳＥＭ写真である。
【図２】比較例１（標本番号１）の多孔質膜の断面（図２（Ａ））と第１の表面（図２（Ｂ））とを示すＳＥＭ写真である。
【図３】赤血液侵入率を示す実施例１（標本番号３）の顕微鏡写真（図３（Ａ−１））、およびこの写真の模式図（図３（Ａ−２））である。比較例１（標本番号１）の顕微鏡写真（図３（Ｂ−１））、およびこの写真の模式図（図３（Ｂ−２））である。
【図４】血液のヘマトクリット値の違いによる多孔質膜（比較例１、標本番号１）への血液の展開状態を測定したグラフである。
【図５】血液のヘマトクリット値の違いによる多孔質膜（実施例１、標本番号３）への血液の展開状態を測定したグラフである。
【図６】血液のヘマトクリット値の違いによる多孔質膜（比較例５、標本番号８）への血液の展開状態を測定したグラフである。
【図７】血糖測定値の同時再現性を実施例４および比較例７の血糖値測定用膜で比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜多孔質膜の形状＞
以下に本発明の異方性多孔質膜を説明する。以下、異方性多孔質膜を単に膜とも称する。
本発明の異方性多孔質膜は、血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿（実質的に血球成分を含まない液体成分）が滲み出す第２の表面とを有し、第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性多孔質膜であって、以下の１）から３）の範囲にある膜の中で、４）で規定される膜である。
１）第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％、好ましくは４．６〜８．２％であ
る。ここで、第１の表面についてφ２．０４μｍ（孔面積３．２７μｍ2）以上の孔の面積の総和の測定範囲面積に対する比率を表面開孔率とした。
表面開孔率(％)＝孔面積の総和／測定領域面積・・・式（１）
本発明の異方性多孔質膜の１例（実施例１、標本番号３）の表面のＳＥＭ写真を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）から、観察可能なφ２．０４μｍ以上の孔の面積の総和の、測定領域面積に対する比率を開孔率とする。
第１の表面の表面開孔率が上記範囲であると、第２の表面との間で毛細管現象が適切に働き、しかも赤血球の侵入深さが適正に確保される。
【００１３】
２）第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍ、好ましくは３．４〜４．４μｍである。第１の表面の平均孔径がこの範囲であると、第２の表面との間で表面張力が適切に働き、しかも赤血球の侵入を阻害しない。
３）第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍである。第２の表面の平均孔径がこの範囲であると、第１の表面との間で、毛細管現象が適切に働き、しかも赤血球が第２の表面に到達することがない。
【００１４】
また、上記第１の表面の平均孔径がこの範囲であれば、検体のしみ込みが速く、濾別物（赤血球）による目詰まりがない理由から好ましく、上記第２の表面の平均孔径がこの範囲であれば、検体の展開が速く、また、血液成分等の測定用の試薬を十分に担持させることができる理由から好ましい。第１の表面の平均孔径が大きくなりすぎて、それにつれて第２の表面の平均孔径も大きい場合は、毛細管現象による血液の吸引が弱くなり、血液のしみ込みが逆に遅くなる。
【００１５】
４）第１の表面からの赤血球の侵入率は、膜厚の２０〜４０％、好ましくは２６〜３４
％である。赤血球の侵入率がこの範囲であると血液のしみこみが速くなるため、短時間、低温での測定が可能となる。この範囲を超えると第２の表面での血液色が濃くなるため、血液色の影響を受けにくい測定波長の選定が必要になる。
赤血球の侵入率は、膜の大孔径面（第１の表面）から血液を点着した後、血液の展開が血液の性状によらずに充分完了する時間経過後、膜を細胞固定液で固定し、断面切片中の赤血球を染色し、光学顕微鏡で観察および写真撮影して、赤血球の侵入深さを測定し、その侵入深さの膜厚に対する比率を赤血球侵入率とした。
赤血球侵入率(%)＝侵入深さ(μｍ)／膜厚（μｍ）・・・式（２）
第１の表面からの赤血球の侵入率は異方性多孔質膜の内部の異方性の特性を示す指標となる。
【００１６】
本発明の多孔質膜は、血液が適用される第１の表面から血液を吸収して濾過しつつ血液中の濾別物（赤血球）を濾別する機能を有する。また、本発明の多孔質膜は、血液と接触する第１の表面に大きな孔を有し、表面開孔率が高い。一方で血液を測定する第２の表面の孔は比較的小さく、毛細管現象の吸い上げ力を維持している。多孔質膜内部は赤血球の侵入率が特定範囲に制御された異方性の多孔質膜である。
【００１７】
本発明の多孔質膜は、血中のグルコース量を測定する場合には、第２の表面から所定の深さまで血中のグルコースと反応して呈色する試薬を坦持していて、多孔質膜中で展開され濾過された血液が第２の表面に達し、試薬と反応して呈色する。第２の表面の呈色の度合いを光学的に測定（測色）して血糖値を定量測定する。第２の表面の測色は、発光素子および受光素子を備える測光部において、多孔質膜に光を照射しその反射光の強度を測定することにより行われる。
【００１８】
検体である血糖値を測定される血液は、人種、地域、年代、個人の状態によってもひろい範囲で成分が変化する。また測定時の条件、特に温度によっても変化する。特にヘマトクリット値は平均４０％位であるが、およそ２０％から６０％の幅があり、ヘマトクリット値によって血液粘度が大きく異なる。従来の多孔質膜ではヘマトクリット値の違いにより、多孔質膜での展開速度が異なり、それが測定精度に影響している。
本発明の多孔質膜は上記の特徴を有するので、ヘマトクリット値６０％〜２０％の血液の展開が１秒以内に完了する。ここで、血液の展開が完了するとは、測定面（第２の表面）をビデオカメラで撮影し動画解析したときの測定面での輝度が、時間の経過に対してプラトーを示す状態のことをいう。表面開孔率が増加すると展開速度も速くなるが、表面開孔率が大きすぎると展開速度は逆に低下する。これは、製造上の制約から、点着面（第１の表面）の開孔率が大きくなると、測定面側（第２の表面）の孔も大きくなりやすく、毛細管力が働きにくくなるためと考えられる。なお、ヘマトクリット値は、血液中に占める血球の容積の割合を示す数値で、ほぼ赤血球の容積比と等しい。成人男性で４０‐５０％、成人女性で３５‐４５％程度が正常値であるとされる。
【００１９】
本発明の多孔質膜は、第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性多孔質膜であって、第１の表面と第２の表面とその間にある異方性の多孔質層とのバランスによって、毛細管現象を損なうことなく、血液のしみ込み展開が早く、短時間、低温での血液成分の測定が可能になる。しかも測定面へ赤血球が近づくが露出せず、赤血球の色が呈色試薬の呈色を光学的に測定するときのノイズとなるような悪影響も少ない。さらに血液のヘマトクリット値によらず血液の性状による差の影響を受けにくくなり、測定値の再現性が向上する。
【００２０】
また、多孔質膜の膜厚は７０〜１５０μｍ、好ましくは１００〜１４０μｍである。多孔質膜の膜厚がこの範囲であれば、十分な膜強度が得られ、赤血球の色による測定への影響も少なくなり、また上記検体のしみ出し時間（展開時間）が短縮され、必要な検体量も少なくて済む理由から好ましい。
さらに、多孔質膜の通気度は、１．７〜５．２Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2であるのが好ましく、２．０〜４．３Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2であるのがより好ましい。通気度がこの範囲であれば、血液の侵入速度を確保する上で好ましい。
通気度の測定は、膜をφ１３のポンチで打ち抜いてシリコンリングを用いてホルダに固定し、第１の表面から第２の表面方向へ空気を圧力２０ｋＰａで透過させたときの透過速度（Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2）を膜の８箇所で測定し平均して求める。
【００２１】
上記多孔質膜の膜材質となるポリマーとしては、具体的には、例えば、ニトロセルロース、ポリビニルジフロライド、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン等が挙げられる。これらのうち、ポリエーテルスルホンであることが、血糖値測定に使用する試薬を担持する場合に試薬活性の経時的劣化が最も少ないという理由から好ましい。
【００２２】
また、上記多孔質膜は、親水化剤を担持させる、親水性を有する膜材質から構成する、もしくは親水化処理を行うことが、検体を吸い込み、展開させる時間を短縮することができるという理由から好ましい。
上記親水化剤としては、具体的には、例えば、トライトンＸ−１００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａ
ａｓ社製）等の界面活性剤、水溶性シリコン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。親水化処理としては、具体的には、プラズマ処理、グロー放電、コロナ放電、紫外線照射等の処理方法が好適に例示される。
さらに、上記多孔質膜は、上述した試薬および親水化剤以外に、所望により電解質（例えば、リン酸塩、フタル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩）、有機物（例えば、グリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン）を担持していてもよい。
【００２３】
上記試薬としては、本発明の試験紙を血糖値測定用に用いる場合、具体的には、酵素として、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）、発色剤として、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（４−アミノ−１，２−ジヒドロ−１，５−ジメチル−２−（４−スルホフェニル）−３Ｈ−ピラゾール−３−オン）、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンナトリウム（３−（（３，５−ジメチルフェニル）エチルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸ナトリウム・１水和物）および、コハク酸緩衝液等の緩衝剤等が好適に使用される。
上記多孔質膜に担持させる上記試薬の担持量について、好ましい範囲は以下の通りである。
・グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）：１３〜７２０Ｕ／ｃｍ2
・ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）：８〜１３００Ｕ／ｃｍ2
・１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン：３０〜１７５μｇ／ｃｍ2
・Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンナトリウム：５１〜２９５μｇ／ｃｍ2
なお、酵素の単位Ｕとは１分間に１μモルの基質を変化できる酵素量である。
【００２４】
＜多孔質膜の製造方法＞
次に、本発明の異方性多孔質膜の製造方法について詳細に説明する。
上記多孔質膜の製造方法としては、湿式製膜が好適に例示される。湿式製膜の他には、溶融製膜、乾式製膜等が知られているが、一方の表面の孔径が反対側の表面の孔径と異なる異方性膜を製造する場合、湿式製膜により製造することが好ましい。
上記湿式製膜は、製膜原液を基材上に膜状に広げる製膜原液供給工程と、該製膜原液供給工程後の基材を凝固浴に浸漬させる凝固浴浸漬工程と、該凝固浴浸漬工程後の基材を水浴中で溶剤成分および／または水溶性添加剤成分を除去する洗浄工程と、該洗浄工程後の基材を乾燥させる乾燥工程とを具備する。
【００２５】
上記製膜原液供給工程は、製膜原液を基材上に膜状に塗布する工程であり、具体的には、製膜原液を、基材の表面に、キャスト厚調整可能なアプリケータを用いて押し広げる、もしくは塗り広げる、もしくはＴ−ダイから吐出する工程である。
【００２６】
上記製膜原液としては、膜成分となる非水溶性第１成分ポリマーと被抽出成分である水溶性第２成分とを含み、第１成分ポリマーの濃度が１４〜１７ｗ／ｗ％のものが好ましい。非水溶性第１成分ポリマーと水溶性第２成分とを含んでいれば、ポリマーの凝集を抑制し、これらの成分を抽出除去したあとの空間に孔が形成され空孔率を向上させることができるため好ましい。
【００２７】
上記非水溶性第１成分ポリマーとしては、具体的には、例えば、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン等が挙げられる。これらのうち、ポリエーテルスルホンであることが、上述したように、血糖値測定に使用する試薬を担持する場合に試薬活性の経時的劣化が最も少ない理由から好ましい。
上記水溶性第２成分としては、具体的には、例えば、後述する溶媒には溶解し、後述する凝固浴浸漬工程後に容易に抽出除去できるポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース等が挙げられる。これらのうち、ポリビニルピロリドンは、ニトロセルロース、ポリビニルジフロライド、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホンなどとは溶解せず、これらのポリマーを溶かす極性溶媒に溶解し、凝固後には水により抽出除去できるといった特性を有するため好ましい。
【００２８】
第１成分ポリマーと水溶性第２成分との溶解を目的とする製膜原液の溶媒としては、具体的には、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド等の有機極性溶媒が挙げられ、Ｎ−メチル−２−ピロリドンであることが好ましい。
【００２９】
製膜原液において、上記第１成分ポリマーと上記水溶性第２成分との仕込み比は、１：１〜１：３であることが好ましい。仕込み比がこの範囲であると、本発明の特性を有する異方性多孔質膜が得られるので好ましい。
なお、上記製膜原液が基材上に塗布される時に調整されるキャスト厚は、７０〜３００μｍであることが、得られる多孔質膜の膜厚が上述した好適範囲に収まる理由から好ましい。
【００３０】
上記凝固浴浸漬工程は、上記製膜原液供給工程後の基材を、水を含有する凝固浴に浸漬させる工程であり、具体的には、上記製膜原液が塗布された基材を凝固浴に浸漬させて、上記第１成分ポリマーを該基材上に析出させる工程である。
凝固浴としては、６０〜８５ｗ／ｗ％、好ましくは７０〜８０ｗ／ｗ％、更に好ましくは７５〜７９ｗ／ｗ％の上記製膜原液の溶媒を含有する水系凝固浴が好適に例示され、具体的には、Ｎ−メチル−２−ピロリドンを６０〜８５ｗ／ｗ％含有する水溶液であることが好ましい。溶媒の含有率がこの範囲であれば、上記第１成分ポリマーの緩慢な凝固が実現し、多孔質構造の膜が形成される。
また、凝固浴中の製膜原液の溶媒の濃度が６０ｗ／ｗ％を下回ると、上述した製膜原液の溶媒の添加効果が得られず、８５ｗ／ｗ％を越えると膜が凝固しない。
【００３１】
また、上記凝固浴への基材の浸漬は、該凝固浴の温度が１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜２７℃で、３〜２０分間、好ましくは５〜１０分間浸漬させることが好ましい。凝固浴の温度がこの範囲であれば、第１成分ポリマーの析出速度が適当となり多孔質構造の膜が形成される。また、浸漬させる時間が３分より短いと第１成分ポリマーが全て析出しないため膜が形成されず、時間が２０分より長いと膜構造は変化せず生産効率が低下してしまう。
【００３２】
上記洗浄工程は、上記凝固浴浸漬工程後の基材を水浴中で溶剤成分および／または水溶性添加剤成分を除去する工程であり、具体的には、第１成分ポリマーが析出されて形成される膜（以下、単に「第１成分ポリマーからなる膜」という）を、水浴中に１０〜１０００分間、好ましくは１５〜６０分間浸漬させることで、上記溶剤成分および／または上記水溶性添加剤成分（例えば、上記溶媒、上記水溶性第２成分）等を抽出除去する工程である。
【００３３】
上記乾燥工程は、上記洗浄工程後の第１成分ポリマーからなる膜を乾燥させる工程であり、具体的には、自然乾燥や電気オーブン等を用いて、３０〜１００℃、好ましくは４０〜８０℃で、１分〜２４時間、好ましくは１分〜２時間乾燥させる方法が例示される。
【００３４】
＜膜特性の測定方法＞
１）血液展開性
試薬を坦持しない多孔質膜の大孔径面（第１の表面）から血液を点着したとき、裏面の小孔径面（第２の表面）からＬＥＤ（最大波長５２０ｎｍ付近）で照射して、血液展開の様子をカメラで動画画像を撮影する。撮影した動画について５２０ｎｍ付近の輝度（反射光量）変化を画像処理し、展開速度として比較し、解析した。血液のヘマトクリット値を変えたときの輝度の変化を比較した。なお、輝度は血液（実際には血漿）が第２の表面から滲み出すと変化が一定となり、血液の展開が完了したことがわかる。
（判断基準）
○（良好）：ヘマトクリット６０の血液展開が、１秒以内に完了する膜。この膜を「血液展開性の良い膜」と定義した。
×（不良）：ヘマトクリット６０の血液展開が、１秒以内に完了せず、１秒を超える膜。
測定条件と使用機器を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
２）赤血球侵入率
定義：膜の大孔径面（第１の表面）から血液を点着した断面図について、赤血球浸透深さの膜厚に対する比率を赤血球侵入率とした。
実験方法：大孔径面（第１の表面）から血液を点着して、中性緩衝ホルマリン溶液で固定する。膜サンプルをパラフィンで包埋、薄切後、切片のヘマトキシリン・エオジン染色を行う。切片断面を顕微鏡で観察、撮影し、染色された赤血球の侵入深さを計測ソフトで測定した。
計算：計測ソフトウエアで大孔径面（第１の表面）からの赤血球侵入深さおよび膜厚を測定する。５点測定値の平均値を使用して赤血球侵入率を算出した。
赤血球侵入率(%)＝侵入深さ(μｍ)／膜厚（μｍ）・・・式（２）
測定に用いた機器を表２に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
３）平均孔径、表面開孔率
実験方法：膜の孔径の測定範囲２５７μｍ×２５８μｍをレーザー顕微鏡で観察し、撮影する。撮影画像を画像解析ソフトで解析し、第１の表面については平均孔径および表面開孔率を算出し、第２の表面については平均孔径を算出した。測定に用いた機器を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
４）膜厚は、各多孔質膜をマイクロメーター（ミツトヨ社製）で測定した。
【００４１】
５）通気度
膜をφ１３のポンチで打ち抜いてシリコンリングを用いてホルダに固定し、第１の表面から第２の表面方向へ空気を圧力２０ｋＰａで透過させたときの透過速度（Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2）を膜の８箇所で測定し平均した。測定機器を次に示す。
圧力発生器：ＰＲＥＳＳＵＲＥ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＲ ＰＣ２０（長野計器）
流量計測器：ＦＩＬＭ ＦＬＯＷ ＭＥＴＥＲ（堀場ステック）
ホルダ：ＵＨＰ‐１３Ｃ用ホルダー（アドバンテック）
リング：特注フィルタ押えシリコンＯリング硬度５０°ナチュラル（アドバンテック）
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
多孔質膜の原液を基材上にキャスト厚２００〜２７０μｍとなるように膜状に塗り広げ（製膜原液供給工程）、基材を製膜原液の溶媒を含有する凝固浴に浸漬させる。凝固浴は、Ｎ−メチル−２−ピロリドンを含有する水溶液からなり、製膜原液が塗布された基材は、５〜１０分間浸漬される（凝固浴浸漬工程）。水浴中で溶剤成分を除去して（洗浄工程）、多孔質膜を製造することができる。表４の製膜原液の組成表に示すとおり、組成比が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）１５．０％、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）３２．０％、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）５３％の製膜原液を用いて、多孔質膜を製造した。
ここで、上記基材として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムをコートした板ガラスを用いた。また、ポリエーテルスルホンには商業的に入手可能な重量平均分子量８０，０００、数平均分子量４０，０００のものを使用し、ポリビニルピロリドンには商業的に入手可能な平均分子量５８，０００のものを使用した。
得られた多孔質膜（実施例１、標本番号３）の断面のＳＥＭ写真（下側が第１の表面）を、図１（Ａ）に示し、第１の表面のＳＥＭ写真を図１（Ｂ）に示す。
【００４３】
（実施例２、３）
表４に示す製膜原液の組成比で、ポリエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンの比率を変えることによって、実施例１と同様の条件で、２種類の多孔質膜を製造した。
【００４４】
（比較例１〜４）
表４に示す製膜原液の組成比で、ポリエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンの比率を変えることによって、実施例１と同様の条件で、４種類の多孔質膜を製造した。
得られた多孔質膜（比較例１、標本番号１）の断面のＳＥＭ写真（下側が第１の表面）を、図２（Ａ）に示し、第１の表面を図２（Ｂ）に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】
（比較例５、６）
ポール社から購入した、ＭＭＭシリーズ（比較例５、標本番号８）およびＢＴＳシリーズ（比較例６、標本番号９）の多孔質膜を試験に用いた。
【００４７】
（試験例１）
上記の実施例１〜３および比較例１〜６の多孔質膜を用いて、第１の表面から血液を点着したとき、第２の表面からみた血液展開を画像で解析した。血液のヘマトクリット値を２０％、４０％、６０％としたときの輝度（反射光量）を血液展開性として比較した。図４〜図６は、比較例１（標本番号１）、実施例１（標本番号３）、比較例５（標本番号８）の結果をグラフで示している。図４では、ヘマトクリット６０％（Ｈｔ６０）の血液は、展開するのに１秒を超え、ヘマトクリット４０％（Ｈｔ４０）の血液は、展開が１秒でプラトーに達したことが示されている。上記判断基準による結果を表５に示す。
また、実施例１〜３および比較例１〜６の多孔質膜を用いて赤血球侵入率を測定した。測定結果を表５に示す。図３では、実施例１（標本番号３、図３（Ａ））および比較例１（標本番号１、図３（Ｂ））の多孔質膜を用いたときの、赤血球が侵入した状態を示す顕微鏡写真ならびにその模式図を示す。赤く着色した赤血球４０は、標本番号１の多孔質膜１１（図３（Ｂ−２））よりも標本番号３の多孔質膜１０（図３（Ａ−２）の方が第１の表面２０、２１（大孔径面）である上面からより深く分布していることがわかる。
その他、表面開孔率、平均孔径、通気度および膜厚の測定結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
なお、表５中に示さないが、第２の表面の平均孔径は、実施例１〜３および比較例１〜４の多孔質膜において、いずれも０．１〜３．０μｍの範囲内であった。
【００４９】
（実施例４）
実施例１（標本番号３）の多孔質膜を用い、以下に示す試薬および親水化剤を担持させて、血液成分測定用膜の一例として血糖値測定用膜を製造した。
【００５０】
上記試薬としては、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）、発色剤として、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（４−アミノ−１，２−ジヒドロ−１，５−ジメチル−２−（４−スルホフェニル）−３Ｈ−ピラゾール−３−オン）、N−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンナトリウム（３−（（３，５−ジメチルフェニル）エチルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸ナトリウム・１水和物）を用いた。上記親水化剤としてはトライトンＸ−１００を用いた。
また、これらの試薬および親水化剤の担持方法は、通常行われる条件等を選択することができ、本実施例においては、上記試薬および親水化剤を溶解させたコハク酸緩衝液に、各多孔質膜を浸漬させ、該試薬および親水化剤がコートされた後に乾燥することにより担持させた。
【００５１】
（比較例７）
比較例１（標本番号１）の多孔質膜を用い、実施例４の製造方法と同様にして、血糖値測定用膜を製造した。
【００５２】
（試験例２）
同一条件下で血糖計を用いて測定した血糖測定値について同時再現性を比較した。実際には、Ｈｔ４０、ＢＧ１００に調製した血液を使用し、実施例４および比較例７の血糖値測定用膜を適用した測定チップを用いて測定を行い、同時再現性を比較した（図７）。個数ｎ=３０での測定値のバラツキをＣＶ％で示す。ＣＶ（変動係数、Coefficient of variation）は、母集団の標準偏差を母集団の算術平均で割ったものである。通常この値は１００倍した百分率で表示される。
ＣＶ（％）＝（標準偏差÷平均値）×１００
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の異方性多孔質膜は、不均一流体サンプルから、特定物質を検知し、測定する分析装置の膜（試験紙）として有用である。特に血液測定装置の成分測定用チップの膜（試験紙）に有用である。
血糖値測定装置に用いると測定値の同時再現性が向上する。血糖計の性能が検体、あるいは血液の状態による差の影響を受けにくくなり、測定装置の設計が容易である。
【符号の説明】
【００５４】
１０，１１・・・多孔質膜
２０，２１・・・第１の表面
３０，３１・・・第２の表面
４０・・・赤血球
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性の異方性多孔質膜で、血液成分測定に有用な試験紙に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値の測定を行う血糖値測定装置（血中成分測定装置）が知られている。この血糖値測定装置は、血中のグルコース量に応じて呈色する試験紙の呈色の度合いを光学的に測定（測色）して血糖値を定量化するものであり、試験紙の測色は、発光素子および受光素子を備える測光部において、試験紙に光を照射しその反射光の強度を測定することにより行われている。
【０００３】
試験紙としての合成ポリマー膜は、特許文献１に記載されている。特許文献１は、「対抗する２つの非対称な表面を有するポリスルホンポリマー膜の非対称性多孔質支持体であって、検体を測定する多孔質表皮層表面（第１の多孔質表皮層表面）が比較的開放孔構造を有し、検体と接する表面（第２の表面）がより開放孔構造を有し、支持構造体が検体を測定する多孔質表皮層表面に近接する等方性領域を含み、該等方性領域は実質的に一定の孔径を有し、該多孔質支持体はさらに該等方性領域に近接する非対称性領域を含み、該非対称性領域は高度の非対称性を有しかつ該支持構造体の少なくとも５０％であるが８０％以下にわたって広がるポリマー膜（特許文献１の請求項１）。」を記載する。このポリマー膜は、「実質的にすべての表皮層の孔が約１．２ミクロンより大きい直径を有する膜の一面にある積層多孔質表皮層、及び支持層が第１ゾーンと第２ゾーンとがあり、第２ゾーンから反対面の方向へ徐々に増加する孔径を有する膜（特許文献１の請求項１９）。」が記載される。
また、「１．２ミクロンより大きい表面孔を第１の多孔質表皮層表面に形成するに十分な時間、孔形成雰囲気を有する気体雰囲気にキャスト層を接触させる製造方法（請求項２９）」が記載される。このように、このポリマー膜は検体を測定する面の平均または最小孔径が１．２ミクロンより大きいものである。検体と接する第２の面の平均孔径は、より大きいものであることがわかる。
【０００４】
特許文献２には、「検体中の濾別物を濾別する機能を有し、該検体中の特定成分と反応して呈色する試薬を担持する多孔質膜からなる試験紙であって、前記多孔質膜が、検体が供給される表面を有する第１の層と、該検体がしみ出し測定される表面を有する第２の層とを有し、前記第１の層が断面密度４０％以下の大孔部からなり、該第１の層の表面が開孔部を有し、前記第２の層が断面密度４０％を超える小孔部からなり、該第２の層の表面が開孔部を有する表面であって、該第１の層は、該第１の層の表面から前記多孔質膜の膜厚の１／５乃至１／２までの範囲にあり、さらに、前記多孔質膜の膜厚が５０〜２００μｍ、空孔率が６０〜９５％であり、前記第１の層の表面の平均孔径が０．５〜１０μｍであり、前記第２の層の表面の平均孔径が０．１〜３．０μｍであり、前記第２の層のＪＩＳＺ８７４１による表面の光沢度が、１１以下である試験紙（特許文献２の請求項１）。」が、記載されている。特許文献２に記載の試験紙は、「検体の展開速度が速く、十分な試薬担持量を確保することができ、より高精度の測定を行うこと（段落００５８）。」ができる。
【０００５】
一方、血糖値を測定される血液は、人種、地域、年代、個人の状態によっても広い範囲で成分が変化する。また測定時の条件、特に温度によっても変化する。このような変化は、通常、予め多種類のデータから補正値または補正式を予測して、試験紙の測色結果を補正して結果を表示する。しかし、このような補正はあくまで一般的なものであり測定精度には一定の限界がある。
特に血液中のヘマトクリット値はおよそ２０から６０の幅があり、血液粘度が大きく異なるので従来の測定用多孔質膜では血液の展開速度（染み込み速度）が大きく変動し、測定精度を向上させるために苦労していた。
従来技術ではこのような測定される血中のヘマトクリット値が変動しても測定時間が一定範囲内である血糖値測定用多孔質膜は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３５８５１７５号公報
【特許文献２】特許第４３７４３４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者等は、上記従来技術の問題点を解決し、血液の性状による差の影響を受けにくい異方性多孔質膜（以下、多孔質膜ということがある）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、異方性多孔質膜において、血液が適用される第１の表面を適切な範囲で表面孔径を大きくすることによって、測定される血液の性状の影響を受けにくい測定が可能で、測定値の再現性が向上することを知見し本発明に至った。
【０００９】
すなわち本発明は以下を提供する。
（１）血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿が滲み出す第２の表面とを有し、前記第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性の多孔質膜であって、１）前記第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％であり、２）前記第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍであり、３）前記第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍであり、４）前記多孔質膜の膜厚が、７０〜１５０μｍであり、５）前記第１の表面からの赤血球の侵入率が、膜厚の２０〜４０％であり、６）ヘマトクリット値６０％の血液を前記第１の表面に適用したとき、展開が１秒以内に完了する、異方性多孔質膜。
（２）前記赤血球の侵入率が膜厚の２６〜３４％である（１）に記載の異方性多孔質膜。
（３）前記多孔質膜の膜厚が、１００〜１４０μｍである（１）または（２）に記載の異方性多孔質膜。
（４）前記第１の表面の表面開孔率が４．６〜８．２％であり、前記第１の表面の平均孔径が３．４〜４．４μｍである（１）ないし（３）のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
（５）前記多孔質膜の通気度が、１．７〜５．２Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である（１）ないし（４）のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
（６）前記多孔質膜の通気度が、２．０〜４．３Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である（１）ないし（５）のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
（７）上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の異方性多孔質膜を用いた血液成分測定用膜。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の異方性多孔質膜は、血液のしみこみが速く、血液成分測定用の試験紙として用いると短時間、低温（常温付近）での測定が可能となる。また、血液の性状による差の影響を受けにくいため測定値の再現性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１（標本番号３）の多孔質膜の断面（図１（Ａ））と第１の表面（図１（Ｂ））とを示すＳＥＭ写真である。
【図２】比較例１（標本番号１）の多孔質膜の断面（図２（Ａ））と第１の表面（図２（Ｂ））とを示すＳＥＭ写真である。
【図３】赤血液侵入率を示す実施例１（標本番号３）の顕微鏡写真（図３（Ａ−１））、およびこの写真の模式図（図３（Ａ−２））である。比較例１（標本番号１）の顕微鏡写真（図３（Ｂ−１））、およびこの写真の模式図（図３（Ｂ−２））である。
【図４】血液のヘマトクリット値の違いによる多孔質膜（比較例１、標本番号１）への血液の展開状態を測定したグラフである。
【図５】血液のヘマトクリット値の違いによる多孔質膜（実施例１、標本番号３）への血液の展開状態を測定したグラフである。
【図６】血液のヘマトクリット値の違いによる多孔質膜（比較例５、標本番号８）への血液の展開状態を測定したグラフである。
【図７】血糖測定値の同時再現性を実施例４および比較例７の血糖値測定用膜で比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜多孔質膜の形状＞
以下に本発明の異方性多孔質膜を説明する。以下、異方性多孔質膜を単に膜とも称する。
本発明の異方性多孔質膜は、血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿（実質的に血球成分を含まない液体成分）が滲み出す第２の表面とを有し、第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性多孔質膜であって、以下の１）から３）の範囲にある膜の中で、４）で規定される膜である。
１）第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％、好ましくは４．６〜８．２％であ
る。ここで、第１の表面についてφ２．０４μｍ（孔面積３．２７μｍ2）以上の孔の面積の総和の測定範囲面積に対する比率を表面開孔率とした。
表面開孔率(％)＝孔面積の総和／測定領域面積・・・式（１）
本発明の異方性多孔質膜の１例（実施例１、標本番号３）の表面のＳＥＭ写真を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）から、観察可能なφ２．０４μｍ以上の孔の面積の総和の、測定領域面積に対する比率を開孔率とする。
第１の表面の表面開孔率が上記範囲であると、第２の表面との間で毛細管現象が適切に働き、しかも赤血球の侵入深さが適正に確保される。
【００１３】
２）第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍ、好ましくは３．４〜４．４μｍである。第１の表面の平均孔径がこの範囲であると、第２の表面との間で表面張力が適切に働き、しかも赤血球の侵入を阻害しない。
３）第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍである。第２の表面の平均孔径がこの範囲であると、第１の表面との間で、毛細管現象が適切に働き、しかも赤血球が第２の表面に到達することがない。
【００１４】
また、上記第１の表面の平均孔径がこの範囲であれば、検体のしみ込みが速く、濾別物（赤血球）による目詰まりがない理由から好ましく、上記第２の表面の平均孔径がこの範囲であれば、検体の展開が速く、また、血液成分等の測定用の試薬を十分に担持させることができる理由から好ましい。第１の表面の平均孔径が大きくなりすぎて、それにつれて第２の表面の平均孔径も大きい場合は、毛細管現象による血液の吸引が弱くなり、血液のしみ込みが逆に遅くなる。
【００１５】
４）第１の表面からの赤血球の侵入率は、膜厚の２０〜４０％、好ましくは２６〜３４
％である。赤血球の侵入率がこの範囲であると血液のしみこみが速くなるため、短時間、低温での測定が可能となる。この範囲を超えると第２の表面での血液色が濃くなるため、血液色の影響を受けにくい測定波長の選定が必要になる。
赤血球の侵入率は、膜の大孔径面（第１の表面）から血液を点着した後、血液の展開が血液の性状によらずに充分完了する時間経過後、膜を細胞固定液で固定し、断面切片中の赤血球を染色し、光学顕微鏡で観察および写真撮影して、赤血球の侵入深さを測定し、その侵入深さの膜厚に対する比率を赤血球侵入率とした。
赤血球侵入率(%)＝侵入深さ(μｍ)／膜厚（μｍ）・・・式（２）
第１の表面からの赤血球の侵入率は異方性多孔質膜の内部の異方性の特性を示す指標となる。
【００１６】
本発明の多孔質膜は、血液が適用される第１の表面から血液を吸収して濾過しつつ血液中の濾別物（赤血球）を濾別する機能を有する。また、本発明の多孔質膜は、血液と接触する第１の表面に大きな孔を有し、表面開孔率が高い。一方で血液を測定する第２の表面の孔は比較的小さく、毛細管現象の吸い上げ力を維持している。多孔質膜内部は赤血球の侵入率が特定範囲に制御された異方性の多孔質膜である。
【００１７】
本発明の多孔質膜は、血中のグルコース量を測定する場合には、第２の表面から所定の深さまで血中のグルコースと反応して呈色する試薬を坦持していて、多孔質膜中で展開され濾過された血液が第２の表面に達し、試薬と反応して呈色する。第２の表面の呈色の度合いを光学的に測定（測色）して血糖値を定量測定する。第２の表面の測色は、発光素子および受光素子を備える測光部において、多孔質膜に光を照射しその反射光の強度を測定することにより行われる。
【００１８】
検体である血糖値を測定される血液は、人種、地域、年代、個人の状態によってもひろい範囲で成分が変化する。また測定時の条件、特に温度によっても変化する。特にヘマトクリット値は平均４０％位であるが、およそ２０％から６０％の幅があり、ヘマトクリット値によって血液粘度が大きく異なる。従来の多孔質膜ではヘマトクリット値の違いにより、多孔質膜での展開速度が異なり、それが測定精度に影響している。
本発明の多孔質膜は上記の特徴を有するので、ヘマトクリット値６０％〜２０％の血液の展開が１秒以内に完了する。ここで、血液の展開が完了するとは、測定面（第２の表面）をビデオカメラで撮影し動画解析したときの測定面での輝度が、時間の経過に対してプラトーを示す状態のことをいう。表面開孔率が増加すると展開速度も速くなるが、表面開孔率が大きすぎると展開速度は逆に低下する。これは、製造上の制約から、点着面（第１の表面）の開孔率が大きくなると、測定面側（第２の表面）の孔も大きくなりやすく、毛細管力が働きにくくなるためと考えられる。なお、ヘマトクリット値は、血液中に占める血球の容積の割合を示す数値で、ほぼ赤血球の容積比と等しい。成人男性で４０‐５０％、成人女性で３５‐４５％程度が正常値であるとされる。
【００１９】
本発明の多孔質膜は、第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性多孔質膜であって、第１の表面と第２の表面とその間にある異方性の多孔質層とのバランスによって、毛細管現象を損なうことなく、血液のしみ込み展開が早く、短時間、低温での血液成分の測定が可能になる。しかも測定面へ赤血球が近づくが露出せず、赤血球の色が呈色試薬の呈色を光学的に測定するときのノイズとなるような悪影響も少ない。さらに血液のヘマトクリット値によらず血液の性状による差の影響を受けにくくなり、測定値の再現性が向上する。
【００２０】
また、多孔質膜の膜厚は７０〜１５０μｍ、好ましくは１００〜１４０μｍである。多孔質膜の膜厚がこの範囲であれば、十分な膜強度が得られ、赤血球の色による測定への影響も少なくなり、また上記検体のしみ出し時間（展開時間）が短縮され、必要な検体量も少なくて済む理由から好ましい。
さらに、多孔質膜の通気度は、１．７〜５．２Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2であるのが好ましく、２．０〜４．３Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2であるのがより好ましい。通気度がこの範囲であれば、血液の侵入速度を確保する上で好ましい。
通気度の測定は、膜をφ１３のポンチで打ち抜いてシリコンリングを用いてホルダに固定し、第１の表面から第２の表面方向へ空気を圧力２０ｋＰａで透過させたときの透過速度（Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2）を膜の８箇所で測定し平均して求める。
【００２１】
上記多孔質膜の膜材質となるポリマーとしては、具体的には、例えば、ニトロセルロース、ポリビニルジフロライド、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン等が挙げられる。これらのうち、ポリエーテルスルホンであることが、血糖値測定に使用する試薬を担持する場合に試薬活性の経時的劣化が最も少ないという理由から好ましい。
【００２２】
また、上記多孔質膜は、親水化剤を担持させる、親水性を有する膜材質から構成する、もしくは親水化処理を行うことが、検体を吸い込み、展開させる時間を短縮することができるという理由から好ましい。
上記親水化剤としては、具体的には、例えば、トライトンＸ−１００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａ
ａｓ社製）等の界面活性剤、水溶性シリコン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。親水化処理としては、具体的には、プラズマ処理、グロー放電、コロナ放電、紫外線照射等の処理方法が好適に例示される。
さらに、上記多孔質膜は、上述した試薬および親水化剤以外に、所望により電解質（例えば、リン酸塩、フタル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩）、有機物（例えば、グリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン）を担持していてもよい。
【００２３】
上記試薬としては、本発明の試験紙を血糖値測定用に用いる場合、具体的には、酵素として、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）、発色剤として、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（４−アミノ−１，２−ジヒドロ−１，５−ジメチル−２−（４−スルホフェニル）−３Ｈ−ピラゾール−３−オン）、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンナトリウム（３−（（３，５−ジメチルフェニル）エチルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸ナトリウム・１水和物）および、コハク酸緩衝液等の緩衝剤等が好適に使用される。
上記多孔質膜に担持させる上記試薬の担持量について、好ましい範囲は以下の通りである。
・グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）：１３〜７２０Ｕ／ｃｍ2
・ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）：８〜１３００Ｕ／ｃｍ2
・１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン：３０〜１７５μｇ／ｃｍ2
・Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンナトリウム：５１〜２９５μｇ／ｃｍ2
なお、酵素の単位Ｕとは１分間に１μモルの基質を変化できる酵素量である。
【００２４】
＜多孔質膜の製造方法＞
次に、本発明の異方性多孔質膜の製造方法について詳細に説明する。
上記多孔質膜の製造方法としては、湿式製膜が好適に例示される。湿式製膜の他には、溶融製膜、乾式製膜等が知られているが、一方の表面の孔径が反対側の表面の孔径と異なる異方性膜を製造する場合、湿式製膜により製造することが好ましい。
上記湿式製膜は、製膜原液を基材上に膜状に広げる製膜原液供給工程と、該製膜原液供給工程後の基材を凝固浴に浸漬させる凝固浴浸漬工程と、該凝固浴浸漬工程後の基材を水浴中で溶剤成分および／または水溶性添加剤成分を除去する洗浄工程と、該洗浄工程後の基材を乾燥させる乾燥工程とを具備する。
【００２５】
上記製膜原液供給工程は、製膜原液を基材上に膜状に塗布する工程であり、具体的には、製膜原液を、基材の表面に、キャスト厚調整可能なアプリケータを用いて押し広げる、もしくは塗り広げる、もしくはＴ−ダイから吐出する工程である。
【００２６】
上記製膜原液としては、膜成分となる非水溶性第１成分ポリマーと被抽出成分である水溶性第２成分とを含み、第１成分ポリマーの濃度が１４〜１７ｗ／ｗ％のものが好ましい。非水溶性第１成分ポリマーと水溶性第２成分とを含んでいれば、ポリマーの凝集を抑制し、これらの成分を抽出除去したあとの空間に孔が形成され空孔率を向上させることができるため好ましい。
【００２７】
上記非水溶性第１成分ポリマーとしては、具体的には、例えば、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン等が挙げられる。これらのうち、ポリエーテルスルホンであることが、上述したように、血糖値測定に使用する試薬を担持する場合に試薬活性の経時的劣化が最も少ない理由から好ましい。
上記水溶性第２成分としては、具体的には、例えば、後述する溶媒には溶解し、後述する凝固浴浸漬工程後に容易に抽出除去できるポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース等が挙げられる。これらのうち、ポリビニルピロリドンは、ニトロセルロース、ポリビニルジフロライド、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホンなどとは溶解せず、これらのポリマーを溶かす極性溶媒に溶解し、凝固後には水により抽出除去できるといった特性を有するため好ましい。
【００２８】
第１成分ポリマーと水溶性第２成分との溶解を目的とする製膜原液の溶媒としては、具体的には、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド等の有機極性溶媒が挙げられ、Ｎ−メチル−２−ピロリドンであることが好ましい。
【００２９】
製膜原液において、上記第１成分ポリマーと上記水溶性第２成分との仕込み比は、１：１〜１：３であることが好ましい。仕込み比がこの範囲であると、本発明の特性を有する異方性多孔質膜が得られるので好ましい。
なお、上記製膜原液が基材上に塗布される時に調整されるキャスト厚は、７０〜３００μｍであることが、得られる多孔質膜の膜厚が上述した好適範囲に収まる理由から好ましい。
【００３０】
上記凝固浴浸漬工程は、上記製膜原液供給工程後の基材を、水を含有する凝固浴に浸漬させる工程であり、具体的には、上記製膜原液が塗布された基材を凝固浴に浸漬させて、上記第１成分ポリマーを該基材上に析出させる工程である。
凝固浴としては、６０〜８５ｗ／ｗ％、好ましくは７０〜８０ｗ／ｗ％、更に好ましくは７５〜７９ｗ／ｗ％の上記製膜原液の溶媒を含有する水系凝固浴が好適に例示され、具体的には、Ｎ−メチル−２−ピロリドンを６０〜８５ｗ／ｗ％含有する水溶液であることが好ましい。溶媒の含有率がこの範囲であれば、上記第１成分ポリマーの緩慢な凝固が実現し、多孔質構造の膜が形成される。
また、凝固浴中の製膜原液の溶媒の濃度が６０ｗ／ｗ％を下回ると、上述した製膜原液の溶媒の添加効果が得られず、８５ｗ／ｗ％を越えると膜が凝固しない。
【００３１】
また、上記凝固浴への基材の浸漬は、該凝固浴の温度が１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜２７℃で、３〜２０分間、好ましくは５〜１０分間浸漬させることが好ましい。凝固浴の温度がこの範囲であれば、第１成分ポリマーの析出速度が適当となり多孔質構造の膜が形成される。また、浸漬させる時間が３分より短いと第１成分ポリマーが全て析出しないため膜が形成されず、時間が２０分より長いと膜構造は変化せず生産効率が低下してしまう。
【００３２】
上記洗浄工程は、上記凝固浴浸漬工程後の基材を水浴中で溶剤成分および／または水溶性添加剤成分を除去する工程であり、具体的には、第１成分ポリマーが析出されて形成される膜（以下、単に「第１成分ポリマーからなる膜」という）を、水浴中に１０〜１０００分間、好ましくは１５〜６０分間浸漬させることで、上記溶剤成分および／または上記水溶性添加剤成分（例えば、上記溶媒、上記水溶性第２成分）等を抽出除去する工程である。
【００３３】
上記乾燥工程は、上記洗浄工程後の第１成分ポリマーからなる膜を乾燥させる工程であり、具体的には、自然乾燥や電気オーブン等を用いて、３０〜１００℃、好ましくは４０〜８０℃で、１分〜２４時間、好ましくは１分〜２時間乾燥させる方法が例示される。
【００３４】
＜膜特性の測定方法＞
１）血液展開性
試薬を坦持しない多孔質膜の大孔径面（第１の表面）から血液を点着したとき、裏面の小孔径面（第２の表面）からＬＥＤ（最大波長５２０ｎｍ付近）で照射して、血液展開の様子をカメラで動画画像を撮影する。撮影した動画について５２０ｎｍ付近の輝度（反射光量）変化を画像処理し、展開速度として比較し、解析した。血液のヘマトクリット値を変えたときの輝度の変化を比較した。なお、輝度は血液（実際には血漿）が第２の表面から滲み出すと変化が一定となり、血液の展開が完了したことがわかる。
（判断基準）
○（良好）：ヘマトクリット６０の血液展開が、１秒以内に完了する膜。この膜を「血液展開性の良い膜」と定義した。
×（不良）：ヘマトクリット６０の血液展開が、１秒以内に完了せず、１秒を超える膜。
測定条件と使用機器を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
２）赤血球侵入率
定義：膜の大孔径面（第１の表面）から血液を点着した断面図について、赤血球浸透深さの膜厚に対する比率を赤血球侵入率とした。
実験方法：大孔径面（第１の表面）から血液を点着して、中性緩衝ホルマリン溶液で固定する。膜サンプルをパラフィンで包埋、薄切後、切片のヘマトキシリン・エオジン染色を行う。切片断面を顕微鏡で観察、撮影し、染色された赤血球の侵入深さを計測ソフトで測定した。
計算：計測ソフトウエアで大孔径面（第１の表面）からの赤血球侵入深さおよび膜厚を測定する。５点測定値の平均値を使用して赤血球侵入率を算出した。
赤血球侵入率(%)＝侵入深さ(μｍ)／膜厚（μｍ）・・・式（２）
測定に用いた機器を表２に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
３）平均孔径、表面開孔率
実験方法：膜の孔径の測定範囲２５７μｍ×２５８μｍをレーザー顕微鏡で観察し、撮影する。撮影画像を画像解析ソフトで解析し、第１の表面については平均孔径および表面開孔率を算出し、第２の表面については平均孔径を算出した。測定に用いた機器を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
４）膜厚は、各多孔質膜をマイクロメーター（ミツトヨ社製）で測定した。
【００４１】
５）通気度
膜をφ１３のポンチで打ち抜いてシリコンリングを用いてホルダに固定し、第１の表面から第２の表面方向へ空気を圧力２０ｋＰａで透過させたときの透過速度（Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2）を膜の８箇所で測定し平均した。測定機器を次に示す。
圧力発生器：ＰＲＥＳＳＵＲＥ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＲ ＰＣ２０（長野計器）
流量計測器：ＦＩＬＭ ＦＬＯＷ ＭＥＴＥＲ（堀場ステック）
ホルダ：ＵＨＰ‐１３Ｃ用ホルダー（アドバンテック）
リング：特注フィルタ押えシリコンＯリング硬度５０°ナチュラル（アドバンテック）
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
多孔質膜の原液を基材上にキャスト厚２００〜２７０μｍとなるように膜状に塗り広げ（製膜原液供給工程）、基材を製膜原液の溶媒を含有する凝固浴に浸漬させる。凝固浴は、Ｎ−メチル−２−ピロリドンを含有する水溶液からなり、製膜原液が塗布された基材は、５〜１０分間浸漬される（凝固浴浸漬工程）。水浴中で溶剤成分を除去して（洗浄工程）、多孔質膜を製造することができる。表４の製膜原液の組成表に示すとおり、組成比が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）１５．０％、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）３２．０％、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）５３％の製膜原液を用いて、多孔質膜を製造した。
ここで、上記基材として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムをコートした板ガラスを用いた。また、ポリエーテルスルホンには商業的に入手可能な重量平均分子量８０，０００、数平均分子量４０，０００のものを使用し、ポリビニルピロリドンには商業的に入手可能な平均分子量５８，０００のものを使用した。
得られた多孔質膜（実施例１、標本番号３）の断面のＳＥＭ写真（下側が第１の表面）を、図１（Ａ）に示し、第１の表面のＳＥＭ写真を図１（Ｂ）に示す。
【００４３】
（実施例２、３）
表４に示す製膜原液の組成比で、ポリエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンの比率を変えることによって、実施例１と同様の条件で、２種類の多孔質膜を製造した。
【００４４】
（比較例１〜４）
表４に示す製膜原液の組成比で、ポリエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンの比率を変えることによって、実施例１と同様の条件で、４種類の多孔質膜を製造した。
得られた多孔質膜（比較例１、標本番号１）の断面のＳＥＭ写真（下側が第１の表面）を、図２（Ａ）に示し、第１の表面を図２（Ｂ）に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】
（比較例５、６）
ポール社から購入した、ＭＭＭシリーズ（比較例５、標本番号８）およびＢＴＳシリーズ（比較例６、標本番号９）の多孔質膜を試験に用いた。
【００４７】
（試験例１）
上記の実施例１〜３および比較例１〜６の多孔質膜を用いて、第１の表面から血液を点着したとき、第２の表面からみた血液展開を画像で解析した。血液のヘマトクリット値を２０％、４０％、６０％としたときの輝度（反射光量）を血液展開性として比較した。図４〜図６は、比較例１（標本番号１）、実施例１（標本番号３）、比較例５（標本番号８）の結果をグラフで示している。図４では、ヘマトクリット６０％（Ｈｔ６０）の血液は、展開するのに１秒を超え、ヘマトクリット４０％（Ｈｔ４０）の血液は、展開が１秒でプラトーに達したことが示されている。上記判断基準による結果を表５に示す。
また、実施例１〜３および比較例１〜６の多孔質膜を用いて赤血球侵入率を測定した。測定結果を表５に示す。図３では、実施例１（標本番号３、図３（Ａ））および比較例１（標本番号１、図３（Ｂ））の多孔質膜を用いたときの、赤血球が侵入した状態を示す顕微鏡写真ならびにその模式図を示す。赤く着色した赤血球４０は、標本番号１の多孔質膜１１（図３（Ｂ−２））よりも標本番号３の多孔質膜１０（図３（Ａ−２）の方が第１の表面２０、２１（大孔径面）である上面からより深く分布していることがわかる。
その他、表面開孔率、平均孔径、通気度および膜厚の測定結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
なお、表５中に示さないが、第２の表面の平均孔径は、実施例１〜３および比較例１〜４の多孔質膜において、いずれも０．１〜３．０μｍの範囲内であった。
【００４９】
（実施例４）
実施例１（標本番号３）の多孔質膜を用い、以下に示す試薬および親水化剤を担持させて、血液成分測定用膜の一例として血糖値測定用膜を製造した。
【００５０】
上記試薬としては、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）、発色剤として、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（４−アミノ−１，２−ジヒドロ−１，５−ジメチル−２−（４−スルホフェニル）−３Ｈ−ピラゾール−３−オン）、N−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンナトリウム（３−（（３，５−ジメチルフェニル）エチルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸ナトリウム・１水和物）を用いた。上記親水化剤としてはトライトンＸ−１００を用いた。
また、これらの試薬および親水化剤の担持方法は、通常行われる条件等を選択することができ、本実施例においては、上記試薬および親水化剤を溶解させたコハク酸緩衝液に、各多孔質膜を浸漬させ、該試薬および親水化剤がコートされた後に乾燥することにより担持させた。
【００５１】
（比較例７）
比較例１（標本番号１）の多孔質膜を用い、実施例４の製造方法と同様にして、血糖値測定用膜を製造した。
【００５２】
（試験例２）
同一条件下で血糖計を用いて測定した血糖測定値について同時再現性を比較した。実際には、Ｈｔ４０、ＢＧ１００に調製した血液を使用し、実施例４および比較例７の血糖値測定用膜を適用した測定チップを用いて測定を行い、同時再現性を比較した（図７）。個数ｎ=３０での測定値のバラツキをＣＶ％で示す。ＣＶ（変動係数、Coefficient of variation）は、母集団の標準偏差を母集団の算術平均で割ったものである。通常この値は１００倍した百分率で表示される。
ＣＶ（％）＝（標準偏差÷平均値）×１００
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の異方性多孔質膜は、不均一流体サンプルから、特定物質を検知し、測定する分析装置の膜（試験紙）として有用である。特に血液測定装置の成分測定用チップの膜（試験紙）に有用である。
血糖値測定装置に用いると測定値の同時再現性が向上する。血糖計の性能が検体、あるいは血液の状態による差の影響を受けにくくなり、測定装置の設計が容易である。
【符号の説明】
【００５４】
１０，１１・・・多孔質膜
２０，２１・・・第１の表面
３０，３１・・・第２の表面
４０・・・赤血球
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿が滲み出す第２の表面とを有し、前記第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性の多孔質膜であって、
１）前記第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％であり、
２）前記第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍであり、
３）前記第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍであり、
４）前記多孔質膜の膜厚が、７０〜１５０μｍであり、
５）前記第１の表面からの赤血球の侵入率が、膜厚の２０〜４０％であり、
６）ヘマトクリット値６０％の血液を前記第１の表面に適用したとき、展開が１秒以内に完了する、異方性多孔質膜。
【請求項２】
前記赤血球の侵入率が膜厚の２６〜３４％である請求項１に記載の異方性多孔質膜。
【請求項３】
前記多孔質膜の膜厚が、１００〜１４０μｍである請求項１または２に記載の異方性多孔質膜。
【請求項４】
前記第１の表面の表面開孔率が４．６〜８．２％であり、前記第１の表面の平均孔径が３．４〜４．４μｍである請求項１ないし３のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
【請求項５】
前記多孔質膜の通気度が、１．７〜５．２Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である請求項１ないし４のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
【請求項６】
前記多孔質膜の通気度が、２．０〜４．３Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である請求項１ないし５のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の異方性多孔質膜を用いた血液成分測定用膜。
【請求項１】
血液が適用される第１の表面とその反対側に位置し血漿が滲み出す第２の表面とを有し、前記第１の表面の平均孔径が第２の表面の平均孔径より大きい異方性の多孔質膜であって、
１）前記第１の表面の表面開孔率が、３．０〜９．５％であり、
２）前記第１の表面の平均孔径が、３．０〜５．０μｍであり、
３）前記第２の表面の平均孔径が、０．１〜３．０μｍであり、
４）前記多孔質膜の膜厚が、７０〜１５０μｍであり、
５）前記第１の表面からの赤血球の侵入率が、膜厚の２０〜４０％であり、
６）ヘマトクリット値６０％の血液を前記第１の表面に適用したとき、展開が１秒以内に完了する、異方性多孔質膜。
【請求項２】
前記赤血球の侵入率が膜厚の２６〜３４％である請求項１に記載の異方性多孔質膜。
【請求項３】
前記多孔質膜の膜厚が、１００〜１４０μｍである請求項１または２に記載の異方性多孔質膜。
【請求項４】
前記第１の表面の表面開孔率が４．６〜８．２％であり、前記第１の表面の平均孔径が３．４〜４．４μｍである請求項１ないし３のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
【請求項５】
前記多孔質膜の通気度が、１．７〜５．２Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である請求項１ないし４のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
【請求項６】
前記多孔質膜の通気度が、２．０〜４．３Ｌ／ｍｉｎ／ｃｍ2である請求項１ないし５のいずれかに記載の異方性多孔質膜。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の異方性多孔質膜を用いた血液成分測定用膜。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−１１５７１（Ｐ２０１３−１１５７１Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４６００５（Ｐ２０１１−１４６００５）
【出願日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
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