疎水性モノマー、疎水的に誘導体化された支持体、並びにその製造及び使用方法
下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）を有する疎水性モノマーを含む組成物を開示する。特定の実施形態では、疎水性モノマーは、疎水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される。前記疎水性モノマーを含み、場合により架橋モノマー及び／又は非架橋モノマーを含みうる重合性組成物も開示する。この重合性混合物を使用して、疎水的に誘導体化された支持体を形成することが可能であり、このような疎水的に誘導体化された支持体を疎水性相互作用クロマトグラフィーのような用途において使用することができる。
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）を有する疎水性モノマーを含む組成物を開示する。特定の実施形態では、疎水性モノマーは、疎水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される。前記疎水性モノマーを含み、場合により架橋モノマー及び／又は非架橋モノマーを含みうる重合性組成物も開示する。この重合性混合物を使用して、疎水的に誘導体化された支持体を形成することが可能であり、このような疎水的に誘導体化された支持体を疎水性相互作用クロマトグラフィーのような用途において使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般的に疎水性モノマー、及び例えば疎水的に誘導体化された支持体におけるその使用に関する。本開示は、このような疎水的に誘導体化された支持体を製造し、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの用途において使用するための方法にも一般的に関する。
【背景技術】
【０００２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、分子の疎水性に基づいて分子を分離することに基づくクロマトグラフィー技術である。一般的に試料分子は高塩緩衝液中でＨＩＣカラムに導入される。緩衝液中の塩が水分子と相互作用して溶液中の試料分子の溶媒和効果を低減することにより試料分子中の疎水性領域が露出し、その結果、試料分子がＨＩＣカラムの固定相によって吸収される。分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために必要とされる塩は少なくて済む。通常、低下する塩勾配を用いて疎水性が高くなる順にカラムから試料を溶出する。試料の溶出は、弱い有機修飾剤（例えば溶媒）又は洗剤を溶出緩衝液に加えるか、ｐＨを変化させるか、あるいはカオトロピック剤を加えることによっても行うことができる。
【０００３】
ＨＩＣの固定相は通常、アガロース、シリカ、又は有機ポリマー樹脂を含み、これらは疎水性配位子によって修飾されてもよい。このようなＨＩＣ固定相の１つは、求核物質を含む疎水性配位子を、アズラクトン部分を有する粒子（例えばビーズ）と反応させることによって調製される。例えば、米国特許第５，９９３，９３５号（ラスムッセン（Rasmussen）ら）は、直接的相互作用（すなわち、中間の活性化工程を必要としない）による粒子の表面上のアズラクトン部分と、求核配位子との共有結合について述べている。
【０００４】
米国特許第５，５６１，０９７号（Ｇｌｅａｓｏｎら）は、支持体（例えば粒子）の表面上のアズラクトン部分に共有結合した低分子量配位子の密度を制御する方法について述べている。この密度は、クエンチャーの存在下で共有結合反応を行うことによって制御される。アズラクトンで官能化された支持体は、支持体にアズラクトンモノマー又は前駆体を重合させ、次いでアズラクトンに環化させることによって調製される。次いでアズラクトン官能化された支持体を配位子（ベンジルアミン）と反応させて誘導体化された支持体を生成する。この誘導体化反応の過程では加水分解のような副反応は極めて低いレベルでしか起きないものの、実際、アズラクトンの加水分解が生じる場合があり、これによりカルボン酸基を生ずる。最終生成物がイオン交換樹脂である場合にはこのような少量の副反応は問題とならない。しかしながら、ＨＩＣ固定相のような特定の用途においては、イオン性官能基の存在はたとえ微量であっても例えば動的結合能及び／又は分離能における性能の変化に結びつきうる。
【０００５】
ＨＩＣ固定相は、疎水性の（メタ）アクリレートエステル及び／又は（メタ）アクリルアミドモノマーから誘導される場合には、塩基性条件下に曝される場合にやはり加水分解しやすい。例えば、各使用の間のクロマトグラフィーカラムの洗浄には１モルの水酸化ナトリウムがしばしば用いられるが、このような塩基性条件によって（メタ）アクリレートエステル及び／又は（メタ）アクリルアミドポリマーが加水分解されうる。このような加水分解によって支持体上にカルボン酸官能基が形成され、ひいてはクロマトグラフィー性能の低下につながる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本開示は下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーを含む組成物であって、該疎水性モノマーが、親水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される組成物を提供する。
【０００７】
別の態様では、本開示は下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーを含む重合性混合物を提供する。
【０００８】
一実施形態では、前記重合性混合物は、架橋モノマー及び／又は非架橋モノマーを更に含む。
【０００９】
更なる別の態様では、疎水性モノマー並びに場合により架橋モノマー及び／又は非架橋ポリマーの反応生成物を含む物品が提供される。
【００１０】
一実施形態では、前記物品は疎水的に誘導体化された支持体である。
【００１１】
別の態様では、タンパク質、抗体、融合タンパク質、ワクチン、ペプチド、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つを精製するために前記組成物相互作用クロマトグラフィー粒子を使用する方法が提供される。
【００１２】
更に別の態様では、疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）混合物を提供する工程であって、該混合物が、
（ｉｉ）下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーと、
（ｉｉ）架橋モノマーと、
（ｉｉｉ）場合により、非架橋モノマーと、を含む工程と、
（ｂ）前記混合物を重合する工程と、を含む方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーと、
（ｂ）基材を与える工程と、
（ｃ）前記疎水性モノマーを前記基材と接触させる工程と、
（ｄ）前記疎水性モノマーを重合する工程と、を含む方法が提供される。
【００１４】
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が説明文及び特許請求の範囲において現れる場合、限定的な意味を有するものではない。
【００１５】
「好ましい」及び「好ましくは」なる語は、特定の状況下で、特定の効果をもたらしうる本開示の実施形態のことを指す。しかしながら、同じ、又は他の状況下において他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１以上の好ましい実施形態の説明は、他の実施形態が有用ではないことを示唆するものではなく、本開示の範囲から他の実施形態を除外することを目的としたものではない。
【００１６】
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」なる用語は、述べられる要素の１以上を意味するうえで「少なくとも１つの」と互換可能に用いられる。
【００１７】
「及び／又は」なる用語は、列挙される要素の１つ若しくはすべて、又は列挙される要素のうちの任意の２以上の組み合わせを意味する。
【００１８】
「アルキル」なる用語は、飽和炭化水素であるアルカンのラジカルである１価の基のことを指す。アルキルは、直鎖状、分枝状、環状、又はこれらの組み合わせでありえ、通常は１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アルキル基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。アルキル基の例としては、これらに限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、及びエチルヘキシルが挙げられる。
【００１９】
「アルキレン」なる用語は、アルカンのラジカルである２価の基のことを指す。アルキレンは、直鎖状、分枝状、環状、又はこれらの組み合わせでありえる。アルキレンは、多くの場合、１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アルキレン基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。アルキレンのラジカル中心は、同一炭素原子上（即ち、アルキリデン）、又は異なる炭素原子上に存在しうる。
【００２０】
「アリール」なる用語は、芳香族である、炭素環式又は複素環式の１価の基のことを指す。アリールは、芳香環と結合又は縮合した１〜５個の環を有しうる。他の環構造は、芳香族、非芳香族、又はこれらの組み合わせでありえ、通常は１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アリール基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。アリール基の例としては、これらに限定されるものではないが、フェニル、ビフェニル、テルフェニル、アンスリル、ナフチル、アセナフチル、アントラキノニル、フェナンスリル、アントラセニル、ピレニル、ペリレニル、及びフルオレニルが挙げられる。
【００２１】
「アルキルアリール」なる用語は、アルキル基とアリール基との組み合わせである１価の基のことを指す。アルキルアリールはアラルキル、すなわちアリールによって置換されたアルキル、又はアルカリール、すなわちアルキルによって置換されたアリールでありうる。アルキルアリールは芳香環と結合又は縮合された１〜５個の環を有してよく、直鎖状、分枝状、若しくは環状部分、又はこれらの組み合わせを有しうる。アルキルアリール基は通常、１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アルキルアリール基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。
【００２２】
「（メタ）アクリルアミド」なる用語は、アクリルアミド若しくはメタクリルアミド構造又はこれらの組み合わせを有する化合物のことを指す。同様に、「（メタ）アクリレート」なる用語は、アクリレート若しくはメタクリレート構造又はこれらの組み合わせを有する化合物のことを指す。
【００２３】
「ポリマー」及び「ポリマー材料」なる用語は、ホモポリマーのような１種類のモノマーから調製される材料、又は、コポリマー、ターポリマーなどの２種類以上のモノマーから調製される材料の両方を指す。同様に、「重合させる」なる用語は、ホモポリマー、コポリマー、ターポリマーなどでありうるポリマー材料を製造するプロセスのことを指す。「コポリマー」及び「コポリマー材料」なる用語は、少なくとも２種類のモノマーから調製されるポリマー材料のことを指し、ターポリマー、クアドポリマーなどを含む。
【００２４】
「室温」及び「周囲温度」なる用語は、２０℃〜２５℃の範囲の温度を意味するうえで互換可能に用いられる。
【００２５】
本開示の上記の「課題を解決するための手段」は本開示の開示される各実施形態又はすべての実施を説明しようとするものではない。以下の説明文は、実例となる実施形態をより詳細に例示するものである。本出願の全体を通じて複数の箇所において、様々な組み合わせとして使用することが可能な例の羅列による指標が与えられる。それぞれの場合において記載される一覧はあくまで代表的な群として与えられるものであって、排他的な羅列として解釈されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１７及び実施例１８について疎水性相互作用のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）を示す図。
【図２】実施例１９及び実施例２０並びに比較例Ｂ及び比較例Ｃについて動的結合能のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）を示す図。
【図３】実施例２１及び実施例２２について疎水性相互作用のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）を示す図。
【図４】実施例２４及び比較例Ｄについて疎水性相互作用のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）の選択されたピークを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
容易に合成及び単離される疎水性のフリーラジカル重合可能な（メタ）アクリルアミドモノマーを合成することが求められている。更に、イオン性が低く、疎水性を有するポリマー支持体を製造することが求められている。高い動的結合能及び良好なタンパク質分離特性の両方を兼ね備えたＨＩＣ固定相として例えば使用することが可能な疎水性支持体を製造することが求められている。
【００２８】
本開示は、疎水性のフリーラジカル重合可能な（メタ）アクリルアミドモノマーを提供するものである。特定の実施形態では、これらの疎水性のフリーラジカル重合可能な（メタ）アクリルアミドモノマーを他のモノマーと重合させて疎水性基材を生成することができる。特定の実施形態では、これらの疎水性支持体を使用して生物学的試料と非生物学的試料とを分離することができる。
【００２９】
本開示に基づく疎水性モノマーは、下記式（Ｉ）に基づく構造を有する。
【００３０】
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３ （Ｉ）
式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり、ＸはＯ又はＮＨである。
【００３１】
一実施形態では、疎水性モノマーは、疎水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される。
【００３２】
一実施形態では、Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子、９個以下の炭素原子、８個以下の炭素原子、７個以下の炭素原子、６個以下の炭素原子、５個以下の炭素原子、４個以下の炭素原子、又は更には３個以下の炭素原子を有する。Ｒ１の例としては、水素原子、メチル基、エチル基、及びフェニル基が挙げられる。
【００３３】
一実施形態では、Ｒ３は、水素原子、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから独立して選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは、全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有する。特定の実施形態では、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは少なくとも４、５、６、８、１０、１２、１５、又は２０個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２４、２０、１５、１２、１０、８、又は６個の炭素原子を有する。Ｒ３の例としては、ベンジル基、フェネチル基、フェノキシエチル基、フェニルプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、オクタデシル基、及びフェニルブチル基が挙げられる。
【００３４】
本開示の疎水性モノマーは、室温でアルケニルアズラクトンと一級アミン又はアルコール配位子との間の求核反応によって合成される。アルケニルアズラクトンには、下記式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）に開示されるもののような、アルケニル置換基を有する５員及び６員のアズラクトンが含まれる（式中、Ｒ１及びＲ４は、上記で定義したものと同じである。）
【００３５】
【化１】
【００３６】
例示的なアルケニルアズラクトンとしては、４，４−ジメチル−２−ビニル−４Ｈ−オキサゾール−５−オン（ビニルジメチルアズラクトン）、２−イソプロペニル−４Ｈ−オキサゾール−５−オン、２−ビニル−４，５−ジヒドロ−［１，３］オキサジン−６−オン、４，４−ジメチル−２−ビニル−４，５−ジヒドロ−［１，３］オキサジン−６−オン、４，５−ジメチル−２−ビニル−４，５−ジヒドロ−［１，３］オキサジン−６−オン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３７】
疎水性モノマーの合成時には、一級アミン又はアルコールがアルケニルアズラクトンのカルボニルと反応し、アズラクトン環を開環して付加物を生成する。反応溶媒は、有機（アルコール、エーテル、炭化水素、エステル、ハロゲン化溶媒、又はこれらの組み合わせなど）、水性、又は混合溶媒であってよいが、アルケニルアズラクトン及び一級アミン又はアルコール配位子を溶解又は少なくとも部分的に溶解することができるものでなければならない。アズラクトン部分は加水分解に対して極めて安定であるが、水による開環反応がわずかに副反応として起きることが知られている。この加水分解によってカルボキシル基が形成され、このカルボキシル基によってイオン性が付与されうる。したがって、一実施形態においては、アルケニルアズラクトンの加水分解がほとんどあるいはまったく生じないようにアルケニルアズラクトンと一級アミン又はアルコールリガンドとの共有結合を有機溶媒中で行う。
【００３８】
アズラクトン部分は配位子の一級アミン又はアルコールと速やかに反応して、直接的な共有結合を形成し、副生成物分子の置換が生じない。このため、生じた疎水性モノマーの精製は最小限に抑えられる。一般的に、疎水性モノマーは反応溶媒から極めて純粋な形態で沈殿し（例えば９０％よりも高い純度、又は更には９９％よりも高い純度）、単純な濾過及び乾燥によって単離することができる。場合により、疎水性モノマーは再結晶させることによってその純度を更に高めることができるが、これは一般的に必要なものではない。
【００３９】
本開示の目的においては、疎水性モノマーの合成に用いられる一級アミン及びアルコール配位子の選択によって、得られる疎水性モノマーの疎水性が決定される。一級アミン及びアルコール配位子は、水素原子、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから独立して選択される疎水性基を有し、これらのアルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは、全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有する。特定の実施形態では、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは少なくとも４、５、６、８、１０、１２、１５、又は２０個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２４、２０、１５、１２、１０、８、又は６個の炭素原子を有する。
【００４０】
一実施形態では、疎水性モノマーは、計算上の疎水性指数（ＨＩ）が２５以下、２０以下、１５以下又は更には１０以下である。ＨＩは、参照により本明細書に援用する米国特許第４，４５１，６１９号（ヘイルマン（Heilmann）ら）に詳細に述べられる経験的な概念である。一般的にこの概念は、付加される一級アミン又はアルコール配位子が最終生成物（すなわち疎水性モノマー、重合性混合物、又は疎水的に誘導体化された支持体）の親水性又は疎水性に及ぼす影響を決定することを可能にするものである。本開示の目的では、ＨＩは、Ｒ３の一級アミン又はアルコール配位子（すなわちＨＸＲ３）に基づいて計算される。本開示に基づく疎水性モノマーのＨＩは、
【００４１】
【数１】
【００４２】
親水性基は一般的に、水と水素結合を形成することが機能的に可能なものである。親水性基の例としては、−Ｎ−、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ＝Ｏ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｍ＋（ただしＭ＋はアルカリ又はアルカリ土類金属イオン）、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−Ｍ＋、−ＣＯＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＲ３＋Ｘ−（ただしＲ＝Ｃ１〜４アルキルであり、Ｘ−は通常はハロゲン化物である）、−ＮＨＣＯＮＨ−などが挙げられる。
【００４３】
最終生成物に親水性を付与する傾向を有する一級アミン又はアルコール配位子は、通常、３０よりも高いＨＩを有するのに対して、最終生成物に疎水性を付与する一級アミン又はアルコール配位子は、通常、２０よりも低いＨＩを有する。２０〜３０の間のＨＩを有する一級アミン又はアルコール配位子は、通常、「中性」又は「ボーダーライン」として分類される。
【００４４】
表１は、本開示の目的において有用なことが示されている多数の一級アミン又はアルコール配位子のＨＩを示す。「ボーダーライン」のＨＩを有するある種の配位子（例えばブチルアミン及びフェノキシエチルアミン）をタンパク質精製などの用途で使用することができる点は興味深い。
【００４５】
【表１】
【００４６】
一級アミン配位子から誘導される疎水性モノマーは２個のアミド官能基が存在するために加水分解されにくいことから、特定の用途ではアルコールから誘導される疎水性モノマーよりも好ましい。
【００４７】
例示的な疎水性モノマーとしては、
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＣ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１１ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１７ＣＨ３；又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４８】
本開示の疎水性モノマーは、溶液中で自己会合する、あるいは、他のモノマー又はポリマーの存在下では他のモノマー又はポリマーと会合する傾向を有しうる。この会合は、２つの別々の相互作用の結果でありうる。第１に、疎水性モノマーの疎水性基同士が、特に水性媒質中において互いに、又は他のモノマー若しくはポリマーと会合しうる点である。第２に、疎水性モノマーのアミド官能基間、又は疎水性モノマーと他のモノマー若しくはポリマーとの間で水素結合相互作用が生じうる点である。水素結合相互作用は、２個のアミド基が存在する、アミン配位子から誘導される疎水性モノマーにおいて特に見られる。疎水性モノマーの会合する傾向は、例えば重合条件を操作することによってポリマーの微小構造（例えば重合した支持体内部における疎水性基の分布など）及び／又は最終生成物の性質（例えば疎水性及び／又は粘性）を制御することが可能になるために有利となりうる。
【００４９】
疎水性相互作用に関与しうる疎水性部分以外に、疎水性モノマーは、アルケニルアズラクトンのアルケニル置換基から誘導される不飽和部位（例えば二重結合）を更に有している。本開示の一態様においては、このような不飽和部位のために疎水性モノマーがフリーラジカル重合スキームに関与することが可能である。このため、これらの疎水性モノマーを重合性混合物に加え、次いでこの混合物を疎水的に誘導体化された支持体を製造するために用いることができる。
【００５０】
一態様では、重合性混合物は疎水性モノマーを含む。
【００５１】
一実施形態では、重合性混合物は架橋モノマーを更に含む。架橋モノマーは、重合反応においてポリマー主鎖の鎖長を伸長し、硬化反応においてポリマー主鎖同士を物理的に結合（又は架橋）する複数の重合可能な基を有している。架橋は、得られる物品の機械的安定性に寄与する。
【００５２】
架橋モノマーとしては例えば、Ｎ，Ｎ’−アルキレンビス（メタ）アクリルアミド、アルキレンビス（メタ）アクリレート、ジビニル芳香族化合物、ポリアリルエステル、又はこれらの組み合わせが挙げられる。例示的な架橋モノマーとしては、エチレンジアクリレート、エチレンジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート及びトリメタクリレートなどのエチレン性不飽和エステル；並びに、メチレンビス（アクリルアミド）、メチレンビス（メタクリルアミド）、Ｎ，Ｎ’−ジアクリロイルピペラジン、Ｎ，Ｎ’−ジアクリロイル−１，２−ジアミノエタン、及びＮ，Ｎ’−ジメタクリロイル−１，２−ジアミノエタンなどのα−及びβ−不飽和アミド、又はこれらの組み合わせが挙げられる。ＨＩＣタイプの用途のような特定の用途では、Ｎ，Ｎ’−アルキレンビス（メタ）アクリルアミドが高い親水性及び高い加水分解安定性のために好ましい。
【００５３】
一実施形態では、重合性混合物は非架橋モノマーを更に含む。非架橋モノマーは、ポリマー主鎖を伸長する（すなわち鎖長を伸ばす）ために用いられるがポリマー主鎖同士の物理的な結合には一般に関与しない。あるいは非架橋モノマーは疎水性モノマーを可溶化するために用いることができる。一実施形態では、非架橋モノマーは疎水的に誘導体化された支持体の全体にわたって均一に分配され、疎水的に誘導体化された支持体中における疎水性モノマーの均一な分配を助ける。
【００５４】
非架橋モノマーとしては、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミドモノマー、又はこれらのく見合わせが挙げられる。例示的な非架橋モノマーとしては、ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、又はこれらの組み合わせが挙げられる。これらの非架橋モノマーの使用により、疎水的に誘導体化された支持体の性質を大幅に向上させることができる。例えば、理論に束縛されることを望むものではないが、非架橋モノマーの濃度及び種類は、疎水的に誘導体化された支持体の多孔度及び／又は疎水性モノマーの分布に影響を及ぼすものと考えられる。
【００５５】
一実施形態では、式（Ｉ）の疎水性モノマー及び非架橋モノマーを、水性流体のレオロジー又は流動性改質剤として有用な、疎水的に会合したポリマーの調製において使用することができる。一実施形態では、これらの疎水的に会合したポリマーを、例えば汚水処理及び汚泥の脱水用、並びに石油の二次及び三次回収におけるレオロジー制御用の凝集助剤として使用することができる。別の実施形態では、これらの疎水的に会合したポリマーを、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定及び分離におけるキャピラリー電気泳動用の分離媒質として使用することもできる。
【００５６】
疎水性モノマー、架橋モノマー、及び／又は非架橋モノマーの量は、重合した混合物及び得られる疎水的に誘導体化された支持体の性質において重要となりうる。一般的に、添加される疎水性モノマーの量によって、得られる疎水的に誘導体化された支持体の疎水性が制御される。疎水性モノマーは、全モノマーの量に対して０．１〜３０重量％で加えることができる。特定の実施形態では、疎水性モノマーは、全モノマーの量に対して少なくとも０．１、０．２、０．５、１、１．５、３、５、１０、１５、２０、又は２５重量％、最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、３、１．５、１、０．５重量％である。一般的に、添加される架橋モノマーの量によって、粒子の剛性及び膨潤能が制御される。架橋モノマーは、全モノマーの量に対して０〜９９．９重量％で加えることができる。特定の実施形態では、架橋モノマーは、全モノマーの量に対して少なくとも０、０．１、０．５、１、１．５、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８重量％、最大で９９．９、９９．５、９９、９８、９５、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、３、１、又は０．５重量％である。一般的に非架橋モノマーの量は、最終的な用途に応じて親水性、溶解度、多孔度、架橋密度などの最終的なコポリマーの性質の決定を助ける。非架橋モノマーは全モノマーの量に対して０〜９９．９重量％で加えることができる。特定の実施形態では、非架橋モノマーは、全モノマーの量に対して少なくとも０、０．１、０．５、１、１．５、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８重量％、最大で９９．９、９９．５、９９、９８、９５、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、３、１、又は０．５重量％である。
【００５７】
一実施形態では、架橋モノマーの量は非架橋モノマーの量よりも大きい。一実施形態では、非架橋モノマーの量は疎水性モノマーの量よりも大きい。更に別の実施形態では、架橋モノマーの量は非架橋モノマーの量よりも大きく、非架橋モノマーの量は疎水性モノマーの量よりも大きい。例えば、ＨＩＣの用途では、架橋モノマーの量を全モノマーの量に対して６０重量％以上とすることによって、疎水的に誘導体化された支持体の剛性を許容圧力に耐えうるものとすることが可能であり、疎水性モノマーの量を全モノマーの量に対して１０重量％以下とすることによってＨＩＣの固定相から検体が確実に放出されるようにすることができる。
【００５８】
別の実施形態では、重合性混合物はポロゲン（porogen）を含みうる。ポロゲンを重合性混合物に加えることによって、特に疎水的に誘導体化された支持体が粒子又はコーティングである場合に、疎水的に誘導体化された支持体の孔構造を制御することができる。
【００５９】
ポリマー材料中の孔形成及び多孔度については、Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２７５〜２２８６（１９９８）に詳細に述べられている。特定の材料、特にゲルタイプの材料では、多孔性は、ポリマー鎖の絡み合い及び／又は架橋の結果として重合又は硬化反応において形成される。ポリマーの網目が溶媒によって高度に膨潤されないかぎり、通常はこのような多孔性は極めて低いかあるいは存在しない。また、ポロゲンを組成物に加えることによって永久的な小孔を形成することもできる。添加したポロゲンは通常、形成されるポリマーの網目がモノマー相混合物の残りの部分から相分離するタイミングに影響する。ポロゲンの例としては、水、アルコール（例えばメタノール、エタノール、及びイソプロパノールなど）、エチレングリコール、プロピレングリコール、少なくとも３個の水酸基を有するポリオール（例えばグリセロール、イノシトール、グルコース、スクロース、マルトース、デキストラン、ペンタエリスリトール、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、ジペンタエリスリトール、及びトリペンタエリスリトールなど）、並びにポリマーポロゲン（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリル酸、多糖類など）、分散有機凝集体（例えばエトキシル化炭化水素）、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６０】
例えば、コモノマー組成物間の相互作用及びポロゲンの選択、非架橋モノマーと架橋モノマーとの質量比、非架橋モノマーの化学構造、又はこれらの組み合わせといった他の因子も疎水的に誘導体化された支持体の孔構造を制御するうえで重要である。
【００６１】
上記に述べたように、重合性混合物を使用して疎水的に誘導体化された支持体を形成することができる。このような疎水的に誘導体化された支持体は、重合性混合物を基材上にグラフト重合させる、重合性混合物を基材上にコーティングし、基材の表面上で重合性混合物を重合させる、又は、重合性混合物を重合及び架橋して粒子を形成する（この粒子はそれ自体で支持体として使用するか、又は他の多孔質基材に加えることができる）、の少なくとも１つによって得ることができる。
【００６２】
疎水的に誘導体化された支持体の疎水性度は、疎水性配位子の性質、支持体表面上に存在する疎水性配位子の量、及び／又は支持体表面上の疎水性基の分布（疎水的に誘導体化された粒子の場合では、主として粒子の孔構造及び膨潤体積によって制御される）によって制御される。
【００６３】
一実施形態では、米国特許第５，３４４，７０１号（ガグノン（Gagnon）ら）に開示されるように、既存の支持体の表面を高エネルギー放射線に曝露することによって表面上にフリーラジカル反応部位を生成する。既存の支持体の重合可能な混合物への曝露は、既存の支持体の照射と同時又はその後で起こりうる。放射線の種類及び他の反応条件に応じて、重合性混合物は、既存の支持体の表面にグラフトされるか、あるいは既存の支持体上にコーティングとして形成されるか、あるいは支持体の空隙内に取り込まれた粒子となりうる。前者の場合には、疎水性モノマーは既存の支持体上に共有結合させられる。既存の支持体は、プラズマ、コロナ、β線、γ線、電子線、Ｘ線、紫外線、及び当該技術分野において知られる他の電磁放射線によって処理することができる。放射は、酸素などの他の化合物又は光開始剤の存在下で行ってもよい。最終的な用途に応じて、既存の支持体は、多孔質又は非孔質、連続的又は非連続的、及び可撓性又は非可撓性であってよい。既存の支持体の例としては、織布、不織布、繊維ウェブ、微多孔性膜、繊維、中空繊維、チューブ、微多孔性フィルム、非孔質フィルム、又はこれらの組み合わせが挙げられる。既存の支持体は、セラミック、ガラス、金属性、ポリマー材料、又はこれらの組み合わせなどの各種の材料で形成することができる。好適なポリマー材料の例としては、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン；ポリ塩化ビニル及びポリフッ化ビニリデンなどのハロゲン化ポリマー；ナイロンなどのポリアミド；ポリスチレン；ポリ（エチレン酢酸ビニル）；ポリメチルメタクリレートなどのポリアクリレート；ポリカーボネート；酢酸酪酸セルロースなどのセルロース誘導体；ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリエステル；ポリイミジン；ポリウレタン；又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６４】
別の実施形態では、重合性混合物は既存の支持体の表面上にコーティングされる。通常、疎水性モノマーのアルケニル部分は既存の支持体の表面に共有結合されないため、重合性混合物も既存の支持体上に重合性混合物を架橋するためにやはり架橋モノマー及び場合により非架橋モノマーを含んでよい。既存の支持体は上記に述べたものと同様である。重合反応及びその結果生ずる架橋反応は、例えば酸化還元化学反応、熱開始反応、紫外線照射若しくは電離放射線（例えば電子線及びγ線など）などの化学的及び／又は物理的手段、又は当該技術分野では周知の他の手段によって開始することができる。
【００６５】
一実施形態では、疎水性モノマーを重合することにより疎水的に誘導体化された粒子を生成する。疎水性モノマー、架橋モノマー、及び場合により非架橋モノマーを互いに混合し、逆懸濁液として重合させる。当業者には明らかであるように、反応開始システム、懸濁媒質、攪拌速度及び懸濁剤は、いずれも基本的には、重合反応における独立した重要な変量である。一実施形態では、各モノマーを水／アルコール溶液に溶解し、この溶液を有機の非混和性媒質に液滴として懸濁し、過硫酸ナトリウム及びテトラメチルエチレンジアミンを用いて重合を開始させる。同等の材料によって異なる成分を置換することが可能であることは確かであり、このような置換は本開示の趣旨及び範囲から外れるものではない。
【００６６】
本開示の疎水的に誘導体化された粒子は、球状の形状、規則的な形状、又は不規則な形状を有しうる。アズラクトンから誘導される官能化粒子の粒径は、本開示の範囲内で大きく異なりうる。一般的に、アズラクトンから誘導される官能化粒子の粒径は、平均直径で０．１μｍから５ｍｍの範囲である。
【００６７】
一実施形態では、疎水的に誘導体化された粒子は拘束される。例えば疎水的に誘導体化された粒子を容器（試験管など）に入れ、容器の少なくとも一端をフリットで塞いでクロマトグラフィーカラムを作製することができる。好適なカラムは当該技術分野では周知のものであり、ガラス、ポリマー材料、ステンレス鋼、チタン及びその合金、又はニッケル及びその合金などの材料で形成することができる。カラムに粒子を効果的に充填するためのカラム充填法は、当該技術分野では周知のものである。クロマトグラフィーカラムを疎水的に誘導体化された粒子で充填してＨＩＣの用途において使用することができる。
【００６８】
クロマトグラフィーにおける平均粒径は最大で２０００μｍでありうるが、平均粒径は通常は５００μｍ以下である。平均粒径が約５００μｍよりも大きい場合には、特にクロマトグラフィー粒子の小孔中への拡散速度がしばしば低いタンパク質などの巨大生体高分子の精製又は分離において、クロマトグラフィープロセスの効率が低くなる場合がある。
【００６９】
別の実施形態では、疎水的に誘導体化された粒子は連続的な多孔質の媒質中に分散させられる。連続的な多孔質の媒質は、通常、織繊維又は不織繊維ウェブ、多孔質繊維、多孔質膜、多孔質フィルム、中空の繊維、フィルム、又はチューブの少なくとも１つである。好適な連続多孔質媒質については、米国特許第５，９９３，９３５号（ラスムッセン（Rasmussen）ら）に更に述べられている。
【００７０】
更に別の実施形態では、疎水的に誘導体化された粒子は濾過媒質の表面上に配される。フィルタ要素をハウジング内に配置することによってフィルターカートリッジを与えることができる。好適な濾過媒質及びフィルターカートリッジを有するシステムについては、例えば米国特許第５，４６８，８４７号（ヘイルマン（Heilmann）ら）に更に述べられている。このようなフィルターカートリッジは、例えば生体分子の精製又は分離に使用することができる。フィルタカートリッジシステムに固有の小さい圧力低下のため、フィルターカートリッジの内部ではクロマトグラフィーカラムの内部と比較してより少ない剛体粒子又はより小さい多孔質粒子を通常は用いることができる。
【００７１】
本開示の一態様では、疎水的に誘導体化された支持体がその表面に有するイオン性基の量は少ない。理論によって束縛されることを望むものではないが、疎水的に誘導体化された支持体は、当該技術分野において現在知られている方法よりも更にイオン性官能基の少ないものを調製することが可能であると考えられる。支持体表面上にイオン性官能基がより少ないことは、疎水性モノマーが水と接触の前に調製及び生成され（すなわち、疎水性モノマーの合成を加水分解が起きないように有機溶媒中で行う）、重合反応が加水分解を受けないモノマーと行われることの結果であると考えられる。
【００７２】
アズラクトンは水による攻撃を受けやすいことが知られており、これによりカルボキシル基が形成され、このカルボキシル基によって表面の選択性が変化して支持体の表面にイオン交換特性及び親水性の両方が付与されうる。本開示では、支持体の表面におけるイオン性基の生成を制限しうる非水性条件下においてアズラクトン環を開環し、疎水性配位子と共有結合させることができる。競合する副反応がより少ないことにより、より純度の高い疎水性支持体を生成することが可能である（すなわち疎水的に誘導体化された支持体のイオン交換特性がより低い）。したがって、本開示の疎水的に誘導体化された支持体は疎水性相互作用をより受けやすく、他の官能基の相互作用（例えばイオン性相互作用）による影響を受けない。これにより、疎水性相互作用のみに基づいたより特異的な分離が与えられる。
【００７３】
更に、本開示の疎水的に誘導体化された支持体は従来の材料と同等の疎水性を示すが、疎水性配位子の密度は大幅に低くなっている。このことを検討する目的で、「配位子密度」とは、充填された支持材料１ｍＬ当たりの配位子のμｍｏｌ数である。理論によって束縛されることを望むものではないが、本開示の疎水的に誘導体化された支持体は、支持体の表面上における疎水性配位子の分布がよりランダムかつ均一であるために、対象とする検体（例えばタンパク質）との相互作用に疎水性配位子がより効率的に利用されるものと考えられる。
【００７４】
一実施形態では、重合性混合物及び疎水的に誘導体化された支持体のいずれもクエンチャーを含まない。疎水性モノマーがアズラクトンに共有結合させられた疎水性配位子を有しているため、疎水的に誘導体化された支持体を形成する際に例えば米国特許第５，５６１，０９７号（グリーソン（Gleason）ら）に述べられるようなクエンチャーは必要とされない。
【００７５】
疎水的に誘導体化された支持体の疎水性のため、疎水的に誘導体化された支持体を、ＨＩＣなどの用途において例えばタンパク質、抗体、融合タンパク質、ワクチン、ペプチド、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせなどの生体物質、及び疎水性を有する非生体分子の精製に使用することができる。
【００７６】
本開示の疎水的に誘導体化された支持体は、従来のＨＩＣ支持体と比較して利点を有しうる。本開示では、アルケニルアズラクトンを例えばアミンなどの求核物質を含む疎水性配位子と反応させることによって疎水性モノマー（すなわち付加物）を形成する。既にアズラクトン基が付加された支持体（例えば米国特許第５，９９３，９３５号及び同第５，５６１，０９７号に開示される）に疎水性配位子を付加する代わりに、重合工程において疎水性モノマーの一部として疎水性配位子を用いることにより、本開示の疎水的に誘導体化された支持体では、支持体の表面上の疎水性配位子の均一性を高め、支持体の表面に存在するイオン性部位の数を減らすことができる。これらの特性は一部のＨＩＣ用途では極めて重要である場合がある。本開示の疎水的に誘導体化された支持体は、２個のカルボニル基の間に挟まれた−Ｃ（Ｒ１Ｒ１）基によって与えられる立体障害のために、疎水性の（メタ）アクリレートエステル及び／又は（メタ）アクリルアミドモノマーを重合することによって調製されたＨＩＣ支持体よりも加水分解を受けにくいと考えられる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、あくまで説明を目的としたものであって、付属の特許請求の範囲をいかなる意味においても限定することを目的とするものではない。実施例における部、百分率、比等は全て、特に記載しない限り、重量基準である。特に断るか、明らかなものでないかぎり、すべての原材料は市販のものか、あるいは当業者には周知のものである。すべての新規な疎水性モノマーの構造は、Ｈ１核磁気共鳴及び赤外分光法によって確認した。
【００７８】
材料
【００７９】
【表２】
【００８０】
疎水性モノマーの調製
実施例１：以下の手順を用いて４−フェニルブチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、１００ｍＬ）を、凝縮器、４００回転／分（ｒｐｍ）のオーバーヘッド混合パドル、及び窒素取り入れ口を備えた３つ口フラスコに氷浴中で加えた。ビニルジメチルアズラクトン（ＶＤＭ、１０．４４ｇ）をフラスコに加えた。４−フェニルブチルアミン（１０ｇ）を添加漏斗に加えた。４−フェニルブチルアミンが保管されたボトルを、添加漏斗に加える前に少量ずつのＭＴＢＥ（全体で１０ｍＬ）ですすいだ。ボトルをすすぐのに用いたＭＴＢＥを添加漏斗に加えた。４−フェニルブチルアミンをＶＤＭが入ったフラスコに１０分間かけて滴下した。ＶＤＭへの４−フェニルブチルアミンの添加の完了後、添加漏斗を１０ｍＬのＭＴＢＥですすいだ。白色の沈殿物（生成物）がほぼすぐに形成された。この後、窒素下で混合しながら０℃で６０分間、反応を進行させた。
【００８１】
フラスコ及び少なくとも３００ｍＬのＭＴＢＥを約−２０℃に設定したフリーザーに移した。白色の沈殿物（生成物）を１〜２時間、結晶化させた。この固体生成物を、冷やしたＭＴＢＥの１００ｍＬ洗浄液を３回用いてフリット漏斗上で濾過した。生成物を一晩、６０℃、真空度約２５インチＨｇ（８４．７ｋＰａ）の真空オーブン中で乾燥した。収率は約９０％であった。純度をＭＴＢＥを移動相として用いたシリカ薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）によって確認した。反応物は、生成物と比較して両方ともＭＴＢＥによく溶けた。生成物、すなわち付加物の融点は８９〜９１℃であった。
【００８２】
実施例２：以下の手順を用いてベンジルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。４９．３ｇのベンジルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、６９．９ｇのＶＤＭ、及び３９３ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約８４％であった。
【００８３】
実施例３：以下の手順を用いてフェネチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。４３．８ｇのフェネチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、３６．３ｇのＶＤＭ、及び３００ｍＬのＭＴＢＥを使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約９４％であった。
【００８４】
実施例４：以下の手順を用いてフェノキシエチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。１０ｇのフェノキシエチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、１０．６ｇのＶＤＭ、及び１５０ｍＬのＭＴＢＥを使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約９２％であった。
【００８５】
実施例５：以下の手順を用いて３−フェニルプロピルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。２４．７ｇの３−フェニルプロピルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、２４．４ｇのＶＤＭ、及び１５０ｍＬのＭＴＢＥを使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約７７％であった。
【００８６】
実施例６：以下の手順を用いてブチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。４３．９ｇのブチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、８３．４ｇのＶＤＭ、及び５００ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００８７】
実施例７：以下の手順を用いてオクチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。７７．６ｇのオクチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、８３．４ｇのＶＤＭ、及び６５０ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００８８】
実施例８：以下の手順を用いてドデシルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。２６．９ｇのドデシルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、１３．９ｇのＶＤＭ、及び２５０ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００８９】
実施例９：以下の手順を用いてオクタデシルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。２６．９５ｇのオクタデシルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、１３．９ｇのＶＤＭ、及び２５０ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。ジエチルエーテル溶媒を蒸発させることにより生成物を単離したところ、収率は９５％よりも高かった。
【００９０】
実施例１０：以下の手順を用いてヘキシルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。６０．７ｇのヘキシルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、８３．４ｇのＶＤＭ、及び６７５ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００９１】
実施例１１：以下の手順を用いて４−フェニル−１−ブタノール／ＶＤＭ付加物を調製した。ヘプタン（５０ｍＬ）を、凝縮器及びマグネチックスターラーバーを備えた２５０ｍＬの丸底フラスコに氷浴中で加えた。４−フェニルブタノール（５．００ｇ）をフラスコに加えた後、触媒としてジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）を５滴加えた。ＶＤＭ（５．００ｇ）をヘプタン（２５ｍＬ）ととともに添加漏斗に加えた。添加漏斗の内容物を５分間かけてフラスコに滴下した。添加の完了後、混合物を４５分間攪拌してから氷浴を外した。無色の油状物（生成物）が形成された。混合しながら更に２時間反応を進行させた。ヘプタン上清を捨て、更なるヘプタン（５０ｍＬ）を加え、混合物を更に１５分間攪拌した後、攪拌せずに１０分間静置した。ヘプタン上清を再び捨て、残留油状物をロータリーエバポレーター上で３５℃に加熱して溶媒を除去することにより、９．２８ｇの無色油状物（収率９６．５％）を得た。油状物は室温で結晶化した。
【００９２】
粒子の調製
実施例１２：ヘプタン（１７４ｍＬ）及び１．４ｍＬのポリマー安定剤溶液（トルエン１ｍＬ当たり（イソオクチルアクリレート：ＶＤＭ（アンモニアによって開環したもの）の比＝９２．５：７．５からなるポリマー０．１ｇ）を含むもの）を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３００ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ、１１．３１ｇ）、２．０９ｇのアクリルアミド（ＡＡｍ）、及び０．６０ｇの４−フェニルブチルアミン／ＶＤＭ付加物（ＰｈＢＶＤＭ、上記実施例１に従って調製したもの）を、スターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。イソプロピルアルコール（６２．５ｍＬ）及び４２ｍＬの水を加えて固体を溶解した。次いでＰＥＧ ２，０００の５０％水溶液を１０ｇ加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（６ｍＬの水に０．５６ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応混合物が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（０．５５ｍＬ）を加えて重合を開始させた。粒子が形成されつつある間に重合反応液を２時間攪拌した。
【００９３】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６０μｍの平均粒径に分級した。
【００９４】
実施例１３：ＰＥＧ ２，０００の代わりにＰＥＧ ６，０００をポロゲン添加剤として加えた以外は、実施例１２において述べたのと同様の手順に従った。
【００９５】
実施例１４：ヘプタン（３４８ｍＬ）及び２．８ｍＬのポリマー安定剤溶液を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３００ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。ＭＢＡ（２１．３６ｇ）、５．５０ｇのジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）及び１．１４ｇのＰｈＢＶＤＭを、スターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。１２５ｍＬのイソプロピルアルコール及び８４ｍＬの水を用いて固体を溶解した。次いでＰＥＧ ６，０００の５０％水溶液を２０ｇ加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（３ｍＬの水に１．１０ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（１．１０ｍＬ）を加えて反応を開始させた。重合反応液を粒子が形成されるまで２時間、攪拌した。
【００９６】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６０μｍの平均粒径に分級した。
【００９７】
実施例１５：ＰＥＧ ６，０００の代わりにＰＥＧ １０，０００をポロゲン添加剤として加えた以外は、実施例１４において述べたのと同様の手順に従った。
【００９８】
実施例１６：ヘプタン（３４８ｍＬ）、トルエン（１８８ｍＬ）及び１．４ｍＬのポリマー安定剤溶液を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３６０ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。ＭＢＡ（１２．８９ｇ）及び１．１１ｇのベンジルアミン／ＶＤＭ付加物（上記実施例２に従って調製したもの）を、スターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。イソプロピルアルコール（６５ｍＬ）及び４７ｍＬの水を加えて固体を溶解した。次いでエチレングリコール（２５ｍＬ）を加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（３ｍＬの水に０．５５ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（０．５５ｍＬ）を加えて反応を開始させた。ビーズが形成されるまで重合反応液を２時間攪拌した。
【００９９】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６５μｍの平均粒径に分級した。
【０１００】
比較例Ａ：ヘプタン（３４８ｍＬ）、トルエン（１８８ｍＬ）及び１．４ｍＬのポリマー安定剤溶液を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３６０ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。ＭＢＡ（１３．３ｇ）及びＮ−アクリロイルメチルアラニン（ＡＭＡ、０．７ｇ）をスターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。イソプロピルアルコール（６５ｍＬ）及び４７ｍＬの水を加えて固体を溶解した。次いでエチレングリコール（２５ｍＬ）を加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（３ｍＬの水に０．５５ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（０．５５ｍＬ）を加えて反応を開始させた。粒子が形成されるまで重合反応液を２時間攪拌した。
【０１０１】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６５μｍの平均粒径に分級した。
【０１０２】
調製後、得られた粒子をアセトンでよく洗い、５００ｍＬの乾燥したジメチルスルフォキシド中に懸濁した。このスラリーに無水酢酸（２５ｍＬ）及びトリエチルアミン（２ｍＬ）を加えた。粒子を揺動により１時間攪拌し、濾過した後、アセトン及びＭＴＢＥで徹底的に洗った。得られたアズラクトン官能性反応性ビーズをベンジルアミンの１Ｍ水溶液に懸濁し、１時間反応させた。次いでビーズを濾過し、蒸留水で徹底的に洗った。
【０１０３】
実験方法
クロマトグラフィーカラムの調製：クロマトグラフィーカラムは、例示的な粒子をオミフィット社（Omifit）（英国、ケンブリッジ、ＣＢ１ ３ＨＤ）によって供給される３．０ｍｍ×１５０ｍｍのガラスチューブにスラリー充填することによって調製した。多孔質テフロン（登録商標）フリット（２５μｍの平均孔径、スモールパーツ社（Small Parts, Inc.）（フロリダ州マイアミレイクス））をチューブの両端に入れて、クロマトグラフィーカラムを形成した。
【０１０４】
クロマトグラフィーシステムの調製：上記のクロマトグラフィーカラムを、ＦＰＬＣ（「ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ」の商品名でジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）（ウプサラ、スウェーデン）より得られる、紫外線検出器および導電性検出器を備えた高速タンパク質液体クロマトグラフ）に組み込んだ。
【０１０５】
タンパク質分析：クロマトグラフィーシステム内のクロマトグラフィーカラムを１．０Ｍのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７）の移動相により、０．０８８ｍＬ／分の流速で平衡化した。１．０Ｍのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７）中に０．３０ｍｇ／ｍＬのミオグロビン（シグマ・アルドリッチ・ケミカル社（Sigma-Aldrich Chemical）ウィスコンシン州ミルウォーキー）、０．２４ｍｇ／ｍＬのβ−ラクトグロブリン（ユー・エス・ビー社（USB Corporation）オハイオ州クリーブランド）、０．１１ｍｇ／ｍＬのライソザイム（シグマ・アルドリッチ・ケミカル社）、及び０．１４ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・アルドリッチ・ケミカル社）を含む２００μＬの溶液をクロマトグラフィーカラムに注入した。初期の緩衝液条件（高塩濃度）から５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７）（低塩濃度）に至る勾配溶出（カラム４０個分の体積）を行った。紫外線検出を用いて溶出液を２８０ｎｍの波長でモニターした。
【０１０６】
動的結合能分析：クロマトグラフィーシステム内のクロマトグラフィーカラムを０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）の移動相で平衡化した。２．３ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（イクイテック社（Equitech）（テキサス州カービル）より販売されるｈＩｇＧ）を０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）に加えた溶液をクロマトグラフィーカラムを通じて１７０ｃｍ／時の流速で圧送した。紫外検出を使用し、溶出液を２８０ｎｍの波長で監視した。２８０ｎｍにおける吸光度はＩｇＧ濃度と相関していた。ＩｇＧの漏出（最大タンパク質濃度の１０％がカラムから溶出）を監視することによって動的結合能（ＤＢＣ）を調べた。
【０１０７】
粒子を使用した分析
実施例１７：上記で述べた方法を用いて実施例１２で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図１にクロマトグラムを示す。
【０１０８】
実施例１８：上記で述べた方法を用いて実施例１３で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べたタンパク質分析法を用いて分析を行った。図１にクロマトグラムを示す。
【０１０９】
図１には、実施例１７（実施例１２で調製した粒子を用いたもの）及び実施例１８（実施例１３で調製した粒子を用いたもの）からのクロマトグラムが重ねて示されている。実施例１２及び１３で調製した粒子は、同じモノマー組成物及び反応条件を使用して調製したものであるが、ＰＥＧ添加剤は粒子の全体の疎水性に対して一定の影響を及ぼした。図１に示されるように、ＰＥＧ ２，０００を含む実施例１２で調製した粒子は、ＰＥＧ ６，０００を含む実施例１３で調製した粒子よりも高い疎水性を示した（タンパク質の溶出により低い塩濃度の緩衝液を必要とした）。ＢＳＡの分離能は実施例１７及び１８で同等であったが、最大の溶出ピーク（β−ラクトグロブリンとライソザイムの共溶出）は実施例１７（ＰＥＧ ２，０００を加えて調製した粒子）においてよりシャープであった。
【０１１０】
実施例１９：上記で述べた方法を用いて実施例１２で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１１】
実施例２０：上記で述べた方法を用いて実施例１３で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１２】
比較例Ｂ：「ＰＨＥＮＹＬ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＬＯＷ ＳＵＢ）」の商品名でジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）（英国、チャルフォントセントガイルス）より市販される、エーテル結合を介してフェニル基によって誘導体化された高度架橋された９０μｍアガロースビーズの芳香族ＨＩＣ媒質を上記で述べた方法を用いてチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１３】
比較例Ｃ：「ＰＨＥＮＹＬ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＨＩＧＨ ＳＵＢ）」の商品名でジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）（英国、チャルフォントセントガイルス）より市販される、エーテル結合を介してフェニル基によって誘導体化された高度架橋された９０μｍアガロースビーズの芳香族ＨＩＣ媒質を上記で述べた方法を用いてチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１４】
図２は、実施例１９及び２０、並びに比較例Ｂ及びＣの漏出曲線を重ねて示したものである。図２に示される漏出曲線より、漏出点は以下のように計算された。実施例１９＝５８ｍｇ／ｍＬ、実施例２０＝４９ｍｇ／ｍＬ、比較例Ｂ＝３８ｍｇ／ｍＬ、及び比較例Ｃ＝５４ｍｇ／ｍＬ計算された漏出点は、実施例１９の粒子がＩｇＧの吸着度が最も高く、次いで比較例Ｃ、実施例２０、及び比較例Ｂが続くことを示している。図２には、各実施例の漏出のプロファイルが更に示されており、ＩｇＧが粒子／ビーズによってどのように吸着されるかを示している。実施例１９及び２０は、比較例Ｃよりも急な漏出曲線（指数的増加の勾配）を示した。比較例Ｂは、１０％漏出点において最も低いＤＢＣを有したばかりでなく、平坦なベースラインも示さなかったが、このことは、ＩｇＧのビーズに対する結合が一貫していないことを示す。図２に示される、粒子／ビーズ１ｍＬ当たりのフェニル基の量は以下のとおりである。実施例１９＝１４μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（粒子の調製に用いられたフェニルモノマーの量及び粒子の膨潤体積に基づいて計算）、実施例２０＝１３μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（粒子の調製に用いられたフェニルモノマーの量及び粒子の膨潤体積に基づいて計算）、比較例Ｂ＝２５μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（製品の文献より引用）、及び比較例Ｃ＝５０μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（製品の文献より引用）。図２に示されるデータに基づけば、本開示に基づく粒子は比較例Ｃと同等か、あるいは比較例Ｃよりも良好なＤＢＣを有するが、粒子１ｍＬ当たりのフェニル基の量は大幅に少ない。
【０１１５】
実施例２１：上記で述べた方法を用いて実施例１４で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図３にクロマトグラムを示す。
【０１１６】
実施例２２：上記で述べた方法を用いて実施例１５で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図３にクロマトグラムを示す。
【０１１７】
図３には、実施例２１（実施例１４で調製した粒子を用いたもの）及び実施例２２（実施例１５で調製した粒子を用いたもの）からのクロマトグラムが重ねて示されている。実施例１４及び１５で調製した粒子は、同じモノマー組成物及び反応条件を使用して調製したものであるが、ＰＥＧ添加剤は粒子の全体の疎水性に対して一定の影響を及ぼした。図３に示されるように、ＰＥＧ ６，０００を含む実施例１４で調製した粒子は、ＰＥＧ １０，０００を含む実施例１５で調製した粒子よりも高い疎水性を示した。しかしながら、ＰＥＧ １０，０００を含む実施例１５で調製した粒子がβ−ラクトグロブリン及びライソザイムからＢＳＡを分離することが可能であったのに対して、ＰＥＧ ６，０００を含む実施例１４で調製した粒子は、ＢＳＡの分離ピークは示さなかった。
【０１１８】
実施例２３：上記で述べた方法を用いて実施例１５で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。粒子の計算されたＤＢＣは３４ｍｇ／ｍＬであった。この値は、コモノマーとしてＡＡｍを用いて調製した粒子のＤＢＣ値（上記実施例１９及び２０に示される）よりも低い値である。
【０１１９】
実施例２４：上記で述べた方法を用いて実施例１６で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図４に、ＩｇＧピークを有するクロマトグラムの拡大図を示す。
【０１２０】
比較例Ｄ：上記で述べた方法を用いて比較例Ａで調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図４に、ＩｇＧピークを有するクロマトグラムの拡大図を示す。
【０１２１】
図４には、実施例２４及び比較例ＤからのＩｇＧピークが重ねて示されている。実施例２４及び比較例Ｄで使用した粒子は同じ粒子の組成を有している。すなわち、アズラクトン結合によってベンジルアミン疎水性基を有するアクリルアミド粒子が共有結合している。したがってこれらは同じ保持時間を有することが予想される。図４に示されるように、実施例２４におけるＩｇＧピークは比較例Ｄにおけるよりも保持時間が短い。理論によって束縛されることを望むものではないが、比較例Ｄにおける保持時間の増大は、ベンジルアミンとの反応の際にアズラクトンの加水分解によって生じた少量の負電荷の存在によるものと考えられる。更に、図４に示されるように、比較例ＤにおけるＩｇＧピークは実施例２４におけるＩｇＧピークよりも幅が広く、このこともやはり、ＩｇＧと固定相との混合相互作用（例えば疎水性相互作用及びイオン交換相互作用）を示しているものと考えられる。
【０１２２】
本開示の範囲及び趣旨を逸脱することなく本開示に対する様々な改変及び変更が可能であることは当業者には明らかであろう。本開示は本明細書に記載される説明的実施形態及び実施例によって不要に限定されるものではない点、更にこうした実施例及び実施形態はあくまで一例として示されるものであって本開示の範囲は以下の「特許請求の範囲」によってのみ限定されるものである点は理解されるはずである。
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般的に疎水性モノマー、及び例えば疎水的に誘導体化された支持体におけるその使用に関する。本開示は、このような疎水的に誘導体化された支持体を製造し、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの用途において使用するための方法にも一般的に関する。
【背景技術】
【０００２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、分子の疎水性に基づいて分子を分離することに基づくクロマトグラフィー技術である。一般的に試料分子は高塩緩衝液中でＨＩＣカラムに導入される。緩衝液中の塩が水分子と相互作用して溶液中の試料分子の溶媒和効果を低減することにより試料分子中の疎水性領域が露出し、その結果、試料分子がＨＩＣカラムの固定相によって吸収される。分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために必要とされる塩は少なくて済む。通常、低下する塩勾配を用いて疎水性が高くなる順にカラムから試料を溶出する。試料の溶出は、弱い有機修飾剤（例えば溶媒）又は洗剤を溶出緩衝液に加えるか、ｐＨを変化させるか、あるいはカオトロピック剤を加えることによっても行うことができる。
【０００３】
ＨＩＣの固定相は通常、アガロース、シリカ、又は有機ポリマー樹脂を含み、これらは疎水性配位子によって修飾されてもよい。このようなＨＩＣ固定相の１つは、求核物質を含む疎水性配位子を、アズラクトン部分を有する粒子（例えばビーズ）と反応させることによって調製される。例えば、米国特許第５，９９３，９３５号（ラスムッセン（Rasmussen）ら）は、直接的相互作用（すなわち、中間の活性化工程を必要としない）による粒子の表面上のアズラクトン部分と、求核配位子との共有結合について述べている。
【０００４】
米国特許第５，５６１，０９７号（Ｇｌｅａｓｏｎら）は、支持体（例えば粒子）の表面上のアズラクトン部分に共有結合した低分子量配位子の密度を制御する方法について述べている。この密度は、クエンチャーの存在下で共有結合反応を行うことによって制御される。アズラクトンで官能化された支持体は、支持体にアズラクトンモノマー又は前駆体を重合させ、次いでアズラクトンに環化させることによって調製される。次いでアズラクトン官能化された支持体を配位子（ベンジルアミン）と反応させて誘導体化された支持体を生成する。この誘導体化反応の過程では加水分解のような副反応は極めて低いレベルでしか起きないものの、実際、アズラクトンの加水分解が生じる場合があり、これによりカルボン酸基を生ずる。最終生成物がイオン交換樹脂である場合にはこのような少量の副反応は問題とならない。しかしながら、ＨＩＣ固定相のような特定の用途においては、イオン性官能基の存在はたとえ微量であっても例えば動的結合能及び／又は分離能における性能の変化に結びつきうる。
【０００５】
ＨＩＣ固定相は、疎水性の（メタ）アクリレートエステル及び／又は（メタ）アクリルアミドモノマーから誘導される場合には、塩基性条件下に曝される場合にやはり加水分解しやすい。例えば、各使用の間のクロマトグラフィーカラムの洗浄には１モルの水酸化ナトリウムがしばしば用いられるが、このような塩基性条件によって（メタ）アクリレートエステル及び／又は（メタ）アクリルアミドポリマーが加水分解されうる。このような加水分解によって支持体上にカルボン酸官能基が形成され、ひいてはクロマトグラフィー性能の低下につながる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本開示は下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーを含む組成物であって、該疎水性モノマーが、親水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される組成物を提供する。
【０００７】
別の態様では、本開示は下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーを含む重合性混合物を提供する。
【０００８】
一実施形態では、前記重合性混合物は、架橋モノマー及び／又は非架橋モノマーを更に含む。
【０００９】
更なる別の態様では、疎水性モノマー並びに場合により架橋モノマー及び／又は非架橋ポリマーの反応生成物を含む物品が提供される。
【００１０】
一実施形態では、前記物品は疎水的に誘導体化された支持体である。
【００１１】
別の態様では、タンパク質、抗体、融合タンパク質、ワクチン、ペプチド、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つを精製するために前記組成物相互作用クロマトグラフィー粒子を使用する方法が提供される。
【００１２】
更に別の態様では、疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）混合物を提供する工程であって、該混合物が、
（ｉｉ）下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーと、
（ｉｉ）架橋モノマーと、
（ｉｉｉ）場合により、非架橋モノマーと、を含む工程と、
（ｂ）前記混合物を重合する工程と、を含む方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
［式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。］を有する疎水性モノマーと、
（ｂ）基材を与える工程と、
（ｃ）前記疎水性モノマーを前記基材と接触させる工程と、
（ｄ）前記疎水性モノマーを重合する工程と、を含む方法が提供される。
【００１４】
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が説明文及び特許請求の範囲において現れる場合、限定的な意味を有するものではない。
【００１５】
「好ましい」及び「好ましくは」なる語は、特定の状況下で、特定の効果をもたらしうる本開示の実施形態のことを指す。しかしながら、同じ、又は他の状況下において他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１以上の好ましい実施形態の説明は、他の実施形態が有用ではないことを示唆するものではなく、本開示の範囲から他の実施形態を除外することを目的としたものではない。
【００１６】
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」なる用語は、述べられる要素の１以上を意味するうえで「少なくとも１つの」と互換可能に用いられる。
【００１７】
「及び／又は」なる用語は、列挙される要素の１つ若しくはすべて、又は列挙される要素のうちの任意の２以上の組み合わせを意味する。
【００１８】
「アルキル」なる用語は、飽和炭化水素であるアルカンのラジカルである１価の基のことを指す。アルキルは、直鎖状、分枝状、環状、又はこれらの組み合わせでありえ、通常は１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アルキル基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。アルキル基の例としては、これらに限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、及びエチルヘキシルが挙げられる。
【００１９】
「アルキレン」なる用語は、アルカンのラジカルである２価の基のことを指す。アルキレンは、直鎖状、分枝状、環状、又はこれらの組み合わせでありえる。アルキレンは、多くの場合、１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アルキレン基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。アルキレンのラジカル中心は、同一炭素原子上（即ち、アルキリデン）、又は異なる炭素原子上に存在しうる。
【００２０】
「アリール」なる用語は、芳香族である、炭素環式又は複素環式の１価の基のことを指す。アリールは、芳香環と結合又は縮合した１〜５個の環を有しうる。他の環構造は、芳香族、非芳香族、又はこれらの組み合わせでありえ、通常は１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アリール基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。アリール基の例としては、これらに限定されるものではないが、フェニル、ビフェニル、テルフェニル、アンスリル、ナフチル、アセナフチル、アントラキノニル、フェナンスリル、アントラセニル、ピレニル、ペリレニル、及びフルオレニルが挙げられる。
【００２１】
「アルキルアリール」なる用語は、アルキル基とアリール基との組み合わせである１価の基のことを指す。アルキルアリールはアラルキル、すなわちアリールによって置換されたアルキル、又はアルカリール、すなわちアルキルによって置換されたアリールでありうる。アルキルアリールは芳香環と結合又は縮合された１〜５個の環を有してよく、直鎖状、分枝状、若しくは環状部分、又はこれらの組み合わせを有しうる。アルキルアリール基は通常、１〜３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態では、アルキルアリール基は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又は２５個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、又は３個の炭素原子を有する。
【００２２】
「（メタ）アクリルアミド」なる用語は、アクリルアミド若しくはメタクリルアミド構造又はこれらの組み合わせを有する化合物のことを指す。同様に、「（メタ）アクリレート」なる用語は、アクリレート若しくはメタクリレート構造又はこれらの組み合わせを有する化合物のことを指す。
【００２３】
「ポリマー」及び「ポリマー材料」なる用語は、ホモポリマーのような１種類のモノマーから調製される材料、又は、コポリマー、ターポリマーなどの２種類以上のモノマーから調製される材料の両方を指す。同様に、「重合させる」なる用語は、ホモポリマー、コポリマー、ターポリマーなどでありうるポリマー材料を製造するプロセスのことを指す。「コポリマー」及び「コポリマー材料」なる用語は、少なくとも２種類のモノマーから調製されるポリマー材料のことを指し、ターポリマー、クアドポリマーなどを含む。
【００２４】
「室温」及び「周囲温度」なる用語は、２０℃〜２５℃の範囲の温度を意味するうえで互換可能に用いられる。
【００２５】
本開示の上記の「課題を解決するための手段」は本開示の開示される各実施形態又はすべての実施を説明しようとするものではない。以下の説明文は、実例となる実施形態をより詳細に例示するものである。本出願の全体を通じて複数の箇所において、様々な組み合わせとして使用することが可能な例の羅列による指標が与えられる。それぞれの場合において記載される一覧はあくまで代表的な群として与えられるものであって、排他的な羅列として解釈されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１７及び実施例１８について疎水性相互作用のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）を示す図。
【図２】実施例１９及び実施例２０並びに比較例Ｂ及び比較例Ｃについて動的結合能のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）を示す図。
【図３】実施例２１及び実施例２２について疎水性相互作用のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）を示す図。
【図４】実施例２４及び比較例Ｄについて疎水性相互作用のクロマトグラム（溶出体積に対する吸光度）の選択されたピークを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
容易に合成及び単離される疎水性のフリーラジカル重合可能な（メタ）アクリルアミドモノマーを合成することが求められている。更に、イオン性が低く、疎水性を有するポリマー支持体を製造することが求められている。高い動的結合能及び良好なタンパク質分離特性の両方を兼ね備えたＨＩＣ固定相として例えば使用することが可能な疎水性支持体を製造することが求められている。
【００２８】
本開示は、疎水性のフリーラジカル重合可能な（メタ）アクリルアミドモノマーを提供するものである。特定の実施形態では、これらの疎水性のフリーラジカル重合可能な（メタ）アクリルアミドモノマーを他のモノマーと重合させて疎水性基材を生成することができる。特定の実施形態では、これらの疎水性支持体を使用して生物学的試料と非生物学的試料とを分離することができる。
【００２９】
本開示に基づく疎水性モノマーは、下記式（Ｉ）に基づく構造を有する。
【００３０】
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３ （Ｉ）
式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり、ＸはＯ又はＮＨである。
【００３１】
一実施形態では、疎水性モノマーは、疎水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される。
【００３２】
一実施形態では、Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、前記アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子、９個以下の炭素原子、８個以下の炭素原子、７個以下の炭素原子、６個以下の炭素原子、５個以下の炭素原子、４個以下の炭素原子、又は更には３個以下の炭素原子を有する。Ｒ１の例としては、水素原子、メチル基、エチル基、及びフェニル基が挙げられる。
【００３３】
一実施形態では、Ｒ３は、水素原子、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから独立して選択される疎水性基であり、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは、全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有する。特定の実施形態では、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは少なくとも４、５、６、８、１０、１２、１５、又は２０個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２４、２０、１５、１２、１０、８、又は６個の炭素原子を有する。Ｒ３の例としては、ベンジル基、フェネチル基、フェノキシエチル基、フェニルプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、オクタデシル基、及びフェニルブチル基が挙げられる。
【００３４】
本開示の疎水性モノマーは、室温でアルケニルアズラクトンと一級アミン又はアルコール配位子との間の求核反応によって合成される。アルケニルアズラクトンには、下記式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）に開示されるもののような、アルケニル置換基を有する５員及び６員のアズラクトンが含まれる（式中、Ｒ１及びＲ４は、上記で定義したものと同じである。）
【００３５】
【化１】
【００３６】
例示的なアルケニルアズラクトンとしては、４，４−ジメチル−２−ビニル−４Ｈ−オキサゾール−５−オン（ビニルジメチルアズラクトン）、２−イソプロペニル−４Ｈ−オキサゾール−５−オン、２−ビニル−４，５−ジヒドロ−［１，３］オキサジン−６−オン、４，４−ジメチル−２−ビニル−４，５−ジヒドロ−［１，３］オキサジン−６−オン、４，５−ジメチル−２−ビニル−４，５−ジヒドロ−［１，３］オキサジン−６−オン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３７】
疎水性モノマーの合成時には、一級アミン又はアルコールがアルケニルアズラクトンのカルボニルと反応し、アズラクトン環を開環して付加物を生成する。反応溶媒は、有機（アルコール、エーテル、炭化水素、エステル、ハロゲン化溶媒、又はこれらの組み合わせなど）、水性、又は混合溶媒であってよいが、アルケニルアズラクトン及び一級アミン又はアルコール配位子を溶解又は少なくとも部分的に溶解することができるものでなければならない。アズラクトン部分は加水分解に対して極めて安定であるが、水による開環反応がわずかに副反応として起きることが知られている。この加水分解によってカルボキシル基が形成され、このカルボキシル基によってイオン性が付与されうる。したがって、一実施形態においては、アルケニルアズラクトンの加水分解がほとんどあるいはまったく生じないようにアルケニルアズラクトンと一級アミン又はアルコールリガンドとの共有結合を有機溶媒中で行う。
【００３８】
アズラクトン部分は配位子の一級アミン又はアルコールと速やかに反応して、直接的な共有結合を形成し、副生成物分子の置換が生じない。このため、生じた疎水性モノマーの精製は最小限に抑えられる。一般的に、疎水性モノマーは反応溶媒から極めて純粋な形態で沈殿し（例えば９０％よりも高い純度、又は更には９９％よりも高い純度）、単純な濾過及び乾燥によって単離することができる。場合により、疎水性モノマーは再結晶させることによってその純度を更に高めることができるが、これは一般的に必要なものではない。
【００３９】
本開示の目的においては、疎水性モノマーの合成に用いられる一級アミン及びアルコール配位子の選択によって、得られる疎水性モノマーの疎水性が決定される。一級アミン及びアルコール配位子は、水素原子、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから独立して選択される疎水性基を有し、これらのアルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは、全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有する。特定の実施形態では、前記アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは少なくとも４、５、６、８、１０、１２、１５、又は２０個の炭素原子、最大で３０、２８、２６、２４、２０、１５、１２、１０、８、又は６個の炭素原子を有する。
【００４０】
一実施形態では、疎水性モノマーは、計算上の疎水性指数（ＨＩ）が２５以下、２０以下、１５以下又は更には１０以下である。ＨＩは、参照により本明細書に援用する米国特許第４，４５１，６１９号（ヘイルマン（Heilmann）ら）に詳細に述べられる経験的な概念である。一般的にこの概念は、付加される一級アミン又はアルコール配位子が最終生成物（すなわち疎水性モノマー、重合性混合物、又は疎水的に誘導体化された支持体）の親水性又は疎水性に及ぼす影響を決定することを可能にするものである。本開示の目的では、ＨＩは、Ｒ３の一級アミン又はアルコール配位子（すなわちＨＸＲ３）に基づいて計算される。本開示に基づく疎水性モノマーのＨＩは、
【００４１】
【数１】
【００４２】
親水性基は一般的に、水と水素結合を形成することが機能的に可能なものである。親水性基の例としては、−Ｎ−、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ＝Ｏ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｍ＋（ただしＭ＋はアルカリ又はアルカリ土類金属イオン）、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−Ｍ＋、−ＣＯＮＨ２、−ＳＨ、−ＮＲ３＋Ｘ−（ただしＲ＝Ｃ１〜４アルキルであり、Ｘ−は通常はハロゲン化物である）、−ＮＨＣＯＮＨ−などが挙げられる。
【００４３】
最終生成物に親水性を付与する傾向を有する一級アミン又はアルコール配位子は、通常、３０よりも高いＨＩを有するのに対して、最終生成物に疎水性を付与する一級アミン又はアルコール配位子は、通常、２０よりも低いＨＩを有する。２０〜３０の間のＨＩを有する一級アミン又はアルコール配位子は、通常、「中性」又は「ボーダーライン」として分類される。
【００４４】
表１は、本開示の目的において有用なことが示されている多数の一級アミン又はアルコール配位子のＨＩを示す。「ボーダーライン」のＨＩを有するある種の配位子（例えばブチルアミン及びフェノキシエチルアミン）をタンパク質精製などの用途で使用することができる点は興味深い。
【００４５】
【表１】
【００４６】
一級アミン配位子から誘導される疎水性モノマーは２個のアミド官能基が存在するために加水分解されにくいことから、特定の用途ではアルコールから誘導される疎水性モノマーよりも好ましい。
【００４７】
例示的な疎水性モノマーとしては、
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＣ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１１ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１７ＣＨ３；又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４８】
本開示の疎水性モノマーは、溶液中で自己会合する、あるいは、他のモノマー又はポリマーの存在下では他のモノマー又はポリマーと会合する傾向を有しうる。この会合は、２つの別々の相互作用の結果でありうる。第１に、疎水性モノマーの疎水性基同士が、特に水性媒質中において互いに、又は他のモノマー若しくはポリマーと会合しうる点である。第２に、疎水性モノマーのアミド官能基間、又は疎水性モノマーと他のモノマー若しくはポリマーとの間で水素結合相互作用が生じうる点である。水素結合相互作用は、２個のアミド基が存在する、アミン配位子から誘導される疎水性モノマーにおいて特に見られる。疎水性モノマーの会合する傾向は、例えば重合条件を操作することによってポリマーの微小構造（例えば重合した支持体内部における疎水性基の分布など）及び／又は最終生成物の性質（例えば疎水性及び／又は粘性）を制御することが可能になるために有利となりうる。
【００４９】
疎水性相互作用に関与しうる疎水性部分以外に、疎水性モノマーは、アルケニルアズラクトンのアルケニル置換基から誘導される不飽和部位（例えば二重結合）を更に有している。本開示の一態様においては、このような不飽和部位のために疎水性モノマーがフリーラジカル重合スキームに関与することが可能である。このため、これらの疎水性モノマーを重合性混合物に加え、次いでこの混合物を疎水的に誘導体化された支持体を製造するために用いることができる。
【００５０】
一態様では、重合性混合物は疎水性モノマーを含む。
【００５１】
一実施形態では、重合性混合物は架橋モノマーを更に含む。架橋モノマーは、重合反応においてポリマー主鎖の鎖長を伸長し、硬化反応においてポリマー主鎖同士を物理的に結合（又は架橋）する複数の重合可能な基を有している。架橋は、得られる物品の機械的安定性に寄与する。
【００５２】
架橋モノマーとしては例えば、Ｎ，Ｎ’−アルキレンビス（メタ）アクリルアミド、アルキレンビス（メタ）アクリレート、ジビニル芳香族化合物、ポリアリルエステル、又はこれらの組み合わせが挙げられる。例示的な架橋モノマーとしては、エチレンジアクリレート、エチレンジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート及びトリメタクリレートなどのエチレン性不飽和エステル；並びに、メチレンビス（アクリルアミド）、メチレンビス（メタクリルアミド）、Ｎ，Ｎ’−ジアクリロイルピペラジン、Ｎ，Ｎ’−ジアクリロイル−１，２−ジアミノエタン、及びＮ，Ｎ’−ジメタクリロイル−１，２−ジアミノエタンなどのα−及びβ−不飽和アミド、又はこれらの組み合わせが挙げられる。ＨＩＣタイプの用途のような特定の用途では、Ｎ，Ｎ’−アルキレンビス（メタ）アクリルアミドが高い親水性及び高い加水分解安定性のために好ましい。
【００５３】
一実施形態では、重合性混合物は非架橋モノマーを更に含む。非架橋モノマーは、ポリマー主鎖を伸長する（すなわち鎖長を伸ばす）ために用いられるがポリマー主鎖同士の物理的な結合には一般に関与しない。あるいは非架橋モノマーは疎水性モノマーを可溶化するために用いることができる。一実施形態では、非架橋モノマーは疎水的に誘導体化された支持体の全体にわたって均一に分配され、疎水的に誘導体化された支持体中における疎水性モノマーの均一な分配を助ける。
【００５４】
非架橋モノマーとしては、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミドモノマー、又はこれらのく見合わせが挙げられる。例示的な非架橋モノマーとしては、ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、又はこれらの組み合わせが挙げられる。これらの非架橋モノマーの使用により、疎水的に誘導体化された支持体の性質を大幅に向上させることができる。例えば、理論に束縛されることを望むものではないが、非架橋モノマーの濃度及び種類は、疎水的に誘導体化された支持体の多孔度及び／又は疎水性モノマーの分布に影響を及ぼすものと考えられる。
【００５５】
一実施形態では、式（Ｉ）の疎水性モノマー及び非架橋モノマーを、水性流体のレオロジー又は流動性改質剤として有用な、疎水的に会合したポリマーの調製において使用することができる。一実施形態では、これらの疎水的に会合したポリマーを、例えば汚水処理及び汚泥の脱水用、並びに石油の二次及び三次回収におけるレオロジー制御用の凝集助剤として使用することができる。別の実施形態では、これらの疎水的に会合したポリマーを、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定及び分離におけるキャピラリー電気泳動用の分離媒質として使用することもできる。
【００５６】
疎水性モノマー、架橋モノマー、及び／又は非架橋モノマーの量は、重合した混合物及び得られる疎水的に誘導体化された支持体の性質において重要となりうる。一般的に、添加される疎水性モノマーの量によって、得られる疎水的に誘導体化された支持体の疎水性が制御される。疎水性モノマーは、全モノマーの量に対して０．１〜３０重量％で加えることができる。特定の実施形態では、疎水性モノマーは、全モノマーの量に対して少なくとも０．１、０．２、０．５、１、１．５、３、５、１０、１５、２０、又は２５重量％、最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、３、１．５、１、０．５重量％である。一般的に、添加される架橋モノマーの量によって、粒子の剛性及び膨潤能が制御される。架橋モノマーは、全モノマーの量に対して０〜９９．９重量％で加えることができる。特定の実施形態では、架橋モノマーは、全モノマーの量に対して少なくとも０、０．１、０．５、１、１．５、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８重量％、最大で９９．９、９９．５、９９、９８、９５、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、３、１、又は０．５重量％である。一般的に非架橋モノマーの量は、最終的な用途に応じて親水性、溶解度、多孔度、架橋密度などの最終的なコポリマーの性質の決定を助ける。非架橋モノマーは全モノマーの量に対して０〜９９．９重量％で加えることができる。特定の実施形態では、非架橋モノマーは、全モノマーの量に対して少なくとも０、０．１、０．５、１、１．５、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８重量％、最大で９９．９、９９．５、９９、９８、９５、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、３、１、又は０．５重量％である。
【００５７】
一実施形態では、架橋モノマーの量は非架橋モノマーの量よりも大きい。一実施形態では、非架橋モノマーの量は疎水性モノマーの量よりも大きい。更に別の実施形態では、架橋モノマーの量は非架橋モノマーの量よりも大きく、非架橋モノマーの量は疎水性モノマーの量よりも大きい。例えば、ＨＩＣの用途では、架橋モノマーの量を全モノマーの量に対して６０重量％以上とすることによって、疎水的に誘導体化された支持体の剛性を許容圧力に耐えうるものとすることが可能であり、疎水性モノマーの量を全モノマーの量に対して１０重量％以下とすることによってＨＩＣの固定相から検体が確実に放出されるようにすることができる。
【００５８】
別の実施形態では、重合性混合物はポロゲン（porogen）を含みうる。ポロゲンを重合性混合物に加えることによって、特に疎水的に誘導体化された支持体が粒子又はコーティングである場合に、疎水的に誘導体化された支持体の孔構造を制御することができる。
【００５９】
ポリマー材料中の孔形成及び多孔度については、Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２７５〜２２８６（１９９８）に詳細に述べられている。特定の材料、特にゲルタイプの材料では、多孔性は、ポリマー鎖の絡み合い及び／又は架橋の結果として重合又は硬化反応において形成される。ポリマーの網目が溶媒によって高度に膨潤されないかぎり、通常はこのような多孔性は極めて低いかあるいは存在しない。また、ポロゲンを組成物に加えることによって永久的な小孔を形成することもできる。添加したポロゲンは通常、形成されるポリマーの網目がモノマー相混合物の残りの部分から相分離するタイミングに影響する。ポロゲンの例としては、水、アルコール（例えばメタノール、エタノール、及びイソプロパノールなど）、エチレングリコール、プロピレングリコール、少なくとも３個の水酸基を有するポリオール（例えばグリセロール、イノシトール、グルコース、スクロース、マルトース、デキストラン、ペンタエリスリトール、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、ジペンタエリスリトール、及びトリペンタエリスリトールなど）、並びにポリマーポロゲン（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリル酸、多糖類など）、分散有機凝集体（例えばエトキシル化炭化水素）、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６０】
例えば、コモノマー組成物間の相互作用及びポロゲンの選択、非架橋モノマーと架橋モノマーとの質量比、非架橋モノマーの化学構造、又はこれらの組み合わせといった他の因子も疎水的に誘導体化された支持体の孔構造を制御するうえで重要である。
【００６１】
上記に述べたように、重合性混合物を使用して疎水的に誘導体化された支持体を形成することができる。このような疎水的に誘導体化された支持体は、重合性混合物を基材上にグラフト重合させる、重合性混合物を基材上にコーティングし、基材の表面上で重合性混合物を重合させる、又は、重合性混合物を重合及び架橋して粒子を形成する（この粒子はそれ自体で支持体として使用するか、又は他の多孔質基材に加えることができる）、の少なくとも１つによって得ることができる。
【００６２】
疎水的に誘導体化された支持体の疎水性度は、疎水性配位子の性質、支持体表面上に存在する疎水性配位子の量、及び／又は支持体表面上の疎水性基の分布（疎水的に誘導体化された粒子の場合では、主として粒子の孔構造及び膨潤体積によって制御される）によって制御される。
【００６３】
一実施形態では、米国特許第５，３４４，７０１号（ガグノン（Gagnon）ら）に開示されるように、既存の支持体の表面を高エネルギー放射線に曝露することによって表面上にフリーラジカル反応部位を生成する。既存の支持体の重合可能な混合物への曝露は、既存の支持体の照射と同時又はその後で起こりうる。放射線の種類及び他の反応条件に応じて、重合性混合物は、既存の支持体の表面にグラフトされるか、あるいは既存の支持体上にコーティングとして形成されるか、あるいは支持体の空隙内に取り込まれた粒子となりうる。前者の場合には、疎水性モノマーは既存の支持体上に共有結合させられる。既存の支持体は、プラズマ、コロナ、β線、γ線、電子線、Ｘ線、紫外線、及び当該技術分野において知られる他の電磁放射線によって処理することができる。放射は、酸素などの他の化合物又は光開始剤の存在下で行ってもよい。最終的な用途に応じて、既存の支持体は、多孔質又は非孔質、連続的又は非連続的、及び可撓性又は非可撓性であってよい。既存の支持体の例としては、織布、不織布、繊維ウェブ、微多孔性膜、繊維、中空繊維、チューブ、微多孔性フィルム、非孔質フィルム、又はこれらの組み合わせが挙げられる。既存の支持体は、セラミック、ガラス、金属性、ポリマー材料、又はこれらの組み合わせなどの各種の材料で形成することができる。好適なポリマー材料の例としては、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン；ポリ塩化ビニル及びポリフッ化ビニリデンなどのハロゲン化ポリマー；ナイロンなどのポリアミド；ポリスチレン；ポリ（エチレン酢酸ビニル）；ポリメチルメタクリレートなどのポリアクリレート；ポリカーボネート；酢酸酪酸セルロースなどのセルロース誘導体；ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリエステル；ポリイミジン；ポリウレタン；又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６４】
別の実施形態では、重合性混合物は既存の支持体の表面上にコーティングされる。通常、疎水性モノマーのアルケニル部分は既存の支持体の表面に共有結合されないため、重合性混合物も既存の支持体上に重合性混合物を架橋するためにやはり架橋モノマー及び場合により非架橋モノマーを含んでよい。既存の支持体は上記に述べたものと同様である。重合反応及びその結果生ずる架橋反応は、例えば酸化還元化学反応、熱開始反応、紫外線照射若しくは電離放射線（例えば電子線及びγ線など）などの化学的及び／又は物理的手段、又は当該技術分野では周知の他の手段によって開始することができる。
【００６５】
一実施形態では、疎水性モノマーを重合することにより疎水的に誘導体化された粒子を生成する。疎水性モノマー、架橋モノマー、及び場合により非架橋モノマーを互いに混合し、逆懸濁液として重合させる。当業者には明らかであるように、反応開始システム、懸濁媒質、攪拌速度及び懸濁剤は、いずれも基本的には、重合反応における独立した重要な変量である。一実施形態では、各モノマーを水／アルコール溶液に溶解し、この溶液を有機の非混和性媒質に液滴として懸濁し、過硫酸ナトリウム及びテトラメチルエチレンジアミンを用いて重合を開始させる。同等の材料によって異なる成分を置換することが可能であることは確かであり、このような置換は本開示の趣旨及び範囲から外れるものではない。
【００６６】
本開示の疎水的に誘導体化された粒子は、球状の形状、規則的な形状、又は不規則な形状を有しうる。アズラクトンから誘導される官能化粒子の粒径は、本開示の範囲内で大きく異なりうる。一般的に、アズラクトンから誘導される官能化粒子の粒径は、平均直径で０．１μｍから５ｍｍの範囲である。
【００６７】
一実施形態では、疎水的に誘導体化された粒子は拘束される。例えば疎水的に誘導体化された粒子を容器（試験管など）に入れ、容器の少なくとも一端をフリットで塞いでクロマトグラフィーカラムを作製することができる。好適なカラムは当該技術分野では周知のものであり、ガラス、ポリマー材料、ステンレス鋼、チタン及びその合金、又はニッケル及びその合金などの材料で形成することができる。カラムに粒子を効果的に充填するためのカラム充填法は、当該技術分野では周知のものである。クロマトグラフィーカラムを疎水的に誘導体化された粒子で充填してＨＩＣの用途において使用することができる。
【００６８】
クロマトグラフィーにおける平均粒径は最大で２０００μｍでありうるが、平均粒径は通常は５００μｍ以下である。平均粒径が約５００μｍよりも大きい場合には、特にクロマトグラフィー粒子の小孔中への拡散速度がしばしば低いタンパク質などの巨大生体高分子の精製又は分離において、クロマトグラフィープロセスの効率が低くなる場合がある。
【００６９】
別の実施形態では、疎水的に誘導体化された粒子は連続的な多孔質の媒質中に分散させられる。連続的な多孔質の媒質は、通常、織繊維又は不織繊維ウェブ、多孔質繊維、多孔質膜、多孔質フィルム、中空の繊維、フィルム、又はチューブの少なくとも１つである。好適な連続多孔質媒質については、米国特許第５，９９３，９３５号（ラスムッセン（Rasmussen）ら）に更に述べられている。
【００７０】
更に別の実施形態では、疎水的に誘導体化された粒子は濾過媒質の表面上に配される。フィルタ要素をハウジング内に配置することによってフィルターカートリッジを与えることができる。好適な濾過媒質及びフィルターカートリッジを有するシステムについては、例えば米国特許第５，４６８，８４７号（ヘイルマン（Heilmann）ら）に更に述べられている。このようなフィルターカートリッジは、例えば生体分子の精製又は分離に使用することができる。フィルタカートリッジシステムに固有の小さい圧力低下のため、フィルターカートリッジの内部ではクロマトグラフィーカラムの内部と比較してより少ない剛体粒子又はより小さい多孔質粒子を通常は用いることができる。
【００７１】
本開示の一態様では、疎水的に誘導体化された支持体がその表面に有するイオン性基の量は少ない。理論によって束縛されることを望むものではないが、疎水的に誘導体化された支持体は、当該技術分野において現在知られている方法よりも更にイオン性官能基の少ないものを調製することが可能であると考えられる。支持体表面上にイオン性官能基がより少ないことは、疎水性モノマーが水と接触の前に調製及び生成され（すなわち、疎水性モノマーの合成を加水分解が起きないように有機溶媒中で行う）、重合反応が加水分解を受けないモノマーと行われることの結果であると考えられる。
【００７２】
アズラクトンは水による攻撃を受けやすいことが知られており、これによりカルボキシル基が形成され、このカルボキシル基によって表面の選択性が変化して支持体の表面にイオン交換特性及び親水性の両方が付与されうる。本開示では、支持体の表面におけるイオン性基の生成を制限しうる非水性条件下においてアズラクトン環を開環し、疎水性配位子と共有結合させることができる。競合する副反応がより少ないことにより、より純度の高い疎水性支持体を生成することが可能である（すなわち疎水的に誘導体化された支持体のイオン交換特性がより低い）。したがって、本開示の疎水的に誘導体化された支持体は疎水性相互作用をより受けやすく、他の官能基の相互作用（例えばイオン性相互作用）による影響を受けない。これにより、疎水性相互作用のみに基づいたより特異的な分離が与えられる。
【００７３】
更に、本開示の疎水的に誘導体化された支持体は従来の材料と同等の疎水性を示すが、疎水性配位子の密度は大幅に低くなっている。このことを検討する目的で、「配位子密度」とは、充填された支持材料１ｍＬ当たりの配位子のμｍｏｌ数である。理論によって束縛されることを望むものではないが、本開示の疎水的に誘導体化された支持体は、支持体の表面上における疎水性配位子の分布がよりランダムかつ均一であるために、対象とする検体（例えばタンパク質）との相互作用に疎水性配位子がより効率的に利用されるものと考えられる。
【００７４】
一実施形態では、重合性混合物及び疎水的に誘導体化された支持体のいずれもクエンチャーを含まない。疎水性モノマーがアズラクトンに共有結合させられた疎水性配位子を有しているため、疎水的に誘導体化された支持体を形成する際に例えば米国特許第５，５６１，０９７号（グリーソン（Gleason）ら）に述べられるようなクエンチャーは必要とされない。
【００７５】
疎水的に誘導体化された支持体の疎水性のため、疎水的に誘導体化された支持体を、ＨＩＣなどの用途において例えばタンパク質、抗体、融合タンパク質、ワクチン、ペプチド、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせなどの生体物質、及び疎水性を有する非生体分子の精製に使用することができる。
【００７６】
本開示の疎水的に誘導体化された支持体は、従来のＨＩＣ支持体と比較して利点を有しうる。本開示では、アルケニルアズラクトンを例えばアミンなどの求核物質を含む疎水性配位子と反応させることによって疎水性モノマー（すなわち付加物）を形成する。既にアズラクトン基が付加された支持体（例えば米国特許第５，９９３，９３５号及び同第５，５６１，０９７号に開示される）に疎水性配位子を付加する代わりに、重合工程において疎水性モノマーの一部として疎水性配位子を用いることにより、本開示の疎水的に誘導体化された支持体では、支持体の表面上の疎水性配位子の均一性を高め、支持体の表面に存在するイオン性部位の数を減らすことができる。これらの特性は一部のＨＩＣ用途では極めて重要である場合がある。本開示の疎水的に誘導体化された支持体は、２個のカルボニル基の間に挟まれた−Ｃ（Ｒ１Ｒ１）基によって与えられる立体障害のために、疎水性の（メタ）アクリレートエステル及び／又は（メタ）アクリルアミドモノマーを重合することによって調製されたＨＩＣ支持体よりも加水分解を受けにくいと考えられる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、あくまで説明を目的としたものであって、付属の特許請求の範囲をいかなる意味においても限定することを目的とするものではない。実施例における部、百分率、比等は全て、特に記載しない限り、重量基準である。特に断るか、明らかなものでないかぎり、すべての原材料は市販のものか、あるいは当業者には周知のものである。すべての新規な疎水性モノマーの構造は、Ｈ１核磁気共鳴及び赤外分光法によって確認した。
【００７８】
材料
【００７９】
【表２】
【００８０】
疎水性モノマーの調製
実施例１：以下の手順を用いて４−フェニルブチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、１００ｍＬ）を、凝縮器、４００回転／分（ｒｐｍ）のオーバーヘッド混合パドル、及び窒素取り入れ口を備えた３つ口フラスコに氷浴中で加えた。ビニルジメチルアズラクトン（ＶＤＭ、１０．４４ｇ）をフラスコに加えた。４−フェニルブチルアミン（１０ｇ）を添加漏斗に加えた。４−フェニルブチルアミンが保管されたボトルを、添加漏斗に加える前に少量ずつのＭＴＢＥ（全体で１０ｍＬ）ですすいだ。ボトルをすすぐのに用いたＭＴＢＥを添加漏斗に加えた。４−フェニルブチルアミンをＶＤＭが入ったフラスコに１０分間かけて滴下した。ＶＤＭへの４−フェニルブチルアミンの添加の完了後、添加漏斗を１０ｍＬのＭＴＢＥですすいだ。白色の沈殿物（生成物）がほぼすぐに形成された。この後、窒素下で混合しながら０℃で６０分間、反応を進行させた。
【００８１】
フラスコ及び少なくとも３００ｍＬのＭＴＢＥを約−２０℃に設定したフリーザーに移した。白色の沈殿物（生成物）を１〜２時間、結晶化させた。この固体生成物を、冷やしたＭＴＢＥの１００ｍＬ洗浄液を３回用いてフリット漏斗上で濾過した。生成物を一晩、６０℃、真空度約２５インチＨｇ（８４．７ｋＰａ）の真空オーブン中で乾燥した。収率は約９０％であった。純度をＭＴＢＥを移動相として用いたシリカ薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）によって確認した。反応物は、生成物と比較して両方ともＭＴＢＥによく溶けた。生成物、すなわち付加物の融点は８９〜９１℃であった。
【００８２】
実施例２：以下の手順を用いてベンジルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。４９．３ｇのベンジルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、６９．９ｇのＶＤＭ、及び３９３ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約８４％であった。
【００８３】
実施例３：以下の手順を用いてフェネチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。４３．８ｇのフェネチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、３６．３ｇのＶＤＭ、及び３００ｍＬのＭＴＢＥを使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約９４％であった。
【００８４】
実施例４：以下の手順を用いてフェノキシエチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。１０ｇのフェノキシエチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、１０．６ｇのＶＤＭ、及び１５０ｍＬのＭＴＢＥを使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約９２％であった。
【００８５】
実施例５：以下の手順を用いて３−フェニルプロピルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。２４．７ｇの３−フェニルプロピルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、２４．４ｇのＶＤＭ、及び１５０ｍＬのＭＴＢＥを使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は約７７％であった。
【００８６】
実施例６：以下の手順を用いてブチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。４３．９ｇのブチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、８３．４ｇのＶＤＭ、及び５００ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００８７】
実施例７：以下の手順を用いてオクチルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。７７．６ｇのオクチルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、８３．４ｇのＶＤＭ、及び６５０ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００８８】
実施例８：以下の手順を用いてドデシルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。２６．９ｇのドデシルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、１３．９ｇのＶＤＭ、及び２５０ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００８９】
実施例９：以下の手順を用いてオクタデシルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。２６．９５ｇのオクタデシルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、１３．９ｇのＶＤＭ、及び２５０ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。ジエチルエーテル溶媒を蒸発させることにより生成物を単離したところ、収率は９５％よりも高かった。
【００９０】
実施例１０：以下の手順を用いてヘキシルアミン／ＶＤＭ付加物を調製した。６０．７ｇのヘキシルアミン（４−フェニルブチルアミンに代えて）、８３．４ｇのＶＤＭ、及び６７５ｍＬのジエチルエーテル（ＭＴＢＥに代えて）を使用した以外は、上記実施例１について述べたのと同様の手順に従った。収率は８５％よりも高かった。
【００９１】
実施例１１：以下の手順を用いて４−フェニル−１−ブタノール／ＶＤＭ付加物を調製した。ヘプタン（５０ｍＬ）を、凝縮器及びマグネチックスターラーバーを備えた２５０ｍＬの丸底フラスコに氷浴中で加えた。４−フェニルブタノール（５．００ｇ）をフラスコに加えた後、触媒としてジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）を５滴加えた。ＶＤＭ（５．００ｇ）をヘプタン（２５ｍＬ）ととともに添加漏斗に加えた。添加漏斗の内容物を５分間かけてフラスコに滴下した。添加の完了後、混合物を４５分間攪拌してから氷浴を外した。無色の油状物（生成物）が形成された。混合しながら更に２時間反応を進行させた。ヘプタン上清を捨て、更なるヘプタン（５０ｍＬ）を加え、混合物を更に１５分間攪拌した後、攪拌せずに１０分間静置した。ヘプタン上清を再び捨て、残留油状物をロータリーエバポレーター上で３５℃に加熱して溶媒を除去することにより、９．２８ｇの無色油状物（収率９６．５％）を得た。油状物は室温で結晶化した。
【００９２】
粒子の調製
実施例１２：ヘプタン（１７４ｍＬ）及び１．４ｍＬのポリマー安定剤溶液（トルエン１ｍＬ当たり（イソオクチルアクリレート：ＶＤＭ（アンモニアによって開環したもの）の比＝９２．５：７．５からなるポリマー０．１ｇ）を含むもの）を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３００ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ、１１．３１ｇ）、２．０９ｇのアクリルアミド（ＡＡｍ）、及び０．６０ｇの４−フェニルブチルアミン／ＶＤＭ付加物（ＰｈＢＶＤＭ、上記実施例１に従って調製したもの）を、スターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。イソプロピルアルコール（６２．５ｍＬ）及び４２ｍＬの水を加えて固体を溶解した。次いでＰＥＧ ２，０００の５０％水溶液を１０ｇ加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（６ｍＬの水に０．５６ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応混合物が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（０．５５ｍＬ）を加えて重合を開始させた。粒子が形成されつつある間に重合反応液を２時間攪拌した。
【００９３】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６０μｍの平均粒径に分級した。
【００９４】
実施例１３：ＰＥＧ ２，０００の代わりにＰＥＧ ６，０００をポロゲン添加剤として加えた以外は、実施例１２において述べたのと同様の手順に従った。
【００９５】
実施例１４：ヘプタン（３４８ｍＬ）及び２．８ｍＬのポリマー安定剤溶液を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３００ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。ＭＢＡ（２１．３６ｇ）、５．５０ｇのジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）及び１．１４ｇのＰｈＢＶＤＭを、スターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。１２５ｍＬのイソプロピルアルコール及び８４ｍＬの水を用いて固体を溶解した。次いでＰＥＧ ６，０００の５０％水溶液を２０ｇ加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（３ｍＬの水に１．１０ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（１．１０ｍＬ）を加えて反応を開始させた。重合反応液を粒子が形成されるまで２時間、攪拌した。
【００９６】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６０μｍの平均粒径に分級した。
【００９７】
実施例１５：ＰＥＧ ６，０００の代わりにＰＥＧ １０，０００をポロゲン添加剤として加えた以外は、実施例１４において述べたのと同様の手順に従った。
【００９８】
実施例１６：ヘプタン（３４８ｍＬ）、トルエン（１８８ｍＬ）及び１．４ｍＬのポリマー安定剤溶液を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３６０ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。ＭＢＡ（１２．８９ｇ）及び１．１１ｇのベンジルアミン／ＶＤＭ付加物（上記実施例２に従って調製したもの）を、スターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。イソプロピルアルコール（６５ｍＬ）及び４７ｍＬの水を加えて固体を溶解した。次いでエチレングリコール（２５ｍＬ）を加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（３ｍＬの水に０．５５ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（０．５５ｍＬ）を加えて反応を開始させた。ビーズが形成されるまで重合反応液を２時間攪拌した。
【００９９】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６５μｍの平均粒径に分級した。
【０１００】
比較例Ａ：ヘプタン（３４８ｍＬ）、トルエン（１８８ｍＬ）及び１．４ｍＬのポリマー安定剤溶液を、オーバーヘッドスターラー、熱電対、環流凝縮器、及び窒素ガス取り入れ口を備えた１Ｌのモートン型丸底フラスコに加えた。オーバーヘッドスターラーを約３６０ｒｐｍの攪拌速度に調節し、反応フラスコを徐々に窒素ガスでパージしながら３５℃に加熱した。ＭＢＡ（１３．３ｇ）及びＮ−アクリロイルメチルアラニン（ＡＭＡ、０．７ｇ）をスターラーバーを備えた２５０ｍＬの三角フラスコに加えた。イソプロピルアルコール（６５ｍＬ）及び４７ｍＬの水を加えて固体を溶解した。次いでエチレングリコール（２５ｍＬ）を加えた。固体がすべて溶解した時点で、過硫酸ナトリウムを攪拌した溶液に加えた（３ｍＬの水に０．５５ｇを加えたもの）。水相を有機相に加え、反応が３５℃に達するまで混合した。テトラメチルエチレンジアミン（０．５５ｍＬ）を加えて反応を開始させた。粒子が形成されるまで重合反応液を２時間攪拌した。
【０１０１】
粒子を粗濾過し、アセトンで２回（各２５０ｍＬ）、メタノールで２回（各２５０ｍＬ）、更にアセトンで２回（各２５０ｍＬ）で洗った。得られた粒子を５００ｍＬの三角フラスコに移した。アセトン（３００ｍＬ）を加えて粒子を懸濁した。懸濁した粒子を約１５分間、超音波処理した後、濾過した。得られた粒子を一連の積層したシーブを使用して約６５μｍの平均粒径に分級した。
【０１０２】
調製後、得られた粒子をアセトンでよく洗い、５００ｍＬの乾燥したジメチルスルフォキシド中に懸濁した。このスラリーに無水酢酸（２５ｍＬ）及びトリエチルアミン（２ｍＬ）を加えた。粒子を揺動により１時間攪拌し、濾過した後、アセトン及びＭＴＢＥで徹底的に洗った。得られたアズラクトン官能性反応性ビーズをベンジルアミンの１Ｍ水溶液に懸濁し、１時間反応させた。次いでビーズを濾過し、蒸留水で徹底的に洗った。
【０１０３】
実験方法
クロマトグラフィーカラムの調製：クロマトグラフィーカラムは、例示的な粒子をオミフィット社（Omifit）（英国、ケンブリッジ、ＣＢ１ ３ＨＤ）によって供給される３．０ｍｍ×１５０ｍｍのガラスチューブにスラリー充填することによって調製した。多孔質テフロン（登録商標）フリット（２５μｍの平均孔径、スモールパーツ社（Small Parts, Inc.）（フロリダ州マイアミレイクス））をチューブの両端に入れて、クロマトグラフィーカラムを形成した。
【０１０４】
クロマトグラフィーシステムの調製：上記のクロマトグラフィーカラムを、ＦＰＬＣ（「ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ」の商品名でジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）（ウプサラ、スウェーデン）より得られる、紫外線検出器および導電性検出器を備えた高速タンパク質液体クロマトグラフ）に組み込んだ。
【０１０５】
タンパク質分析：クロマトグラフィーシステム内のクロマトグラフィーカラムを１．０Ｍのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７）の移動相により、０．０８８ｍＬ／分の流速で平衡化した。１．０Ｍのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７）中に０．３０ｍｇ／ｍＬのミオグロビン（シグマ・アルドリッチ・ケミカル社（Sigma-Aldrich Chemical）ウィスコンシン州ミルウォーキー）、０．２４ｍｇ／ｍＬのβ−ラクトグロブリン（ユー・エス・ビー社（USB Corporation）オハイオ州クリーブランド）、０．１１ｍｇ／ｍＬのライソザイム（シグマ・アルドリッチ・ケミカル社）、及び０．１４ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・アルドリッチ・ケミカル社）を含む２００μＬの溶液をクロマトグラフィーカラムに注入した。初期の緩衝液条件（高塩濃度）から５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７）（低塩濃度）に至る勾配溶出（カラム４０個分の体積）を行った。紫外線検出を用いて溶出液を２８０ｎｍの波長でモニターした。
【０１０６】
動的結合能分析：クロマトグラフィーシステム内のクロマトグラフィーカラムを０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）の移動相で平衡化した。２．３ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（イクイテック社（Equitech）（テキサス州カービル）より販売されるｈＩｇＧ）を０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）に加えた溶液をクロマトグラフィーカラムを通じて１７０ｃｍ／時の流速で圧送した。紫外検出を使用し、溶出液を２８０ｎｍの波長で監視した。２８０ｎｍにおける吸光度はＩｇＧ濃度と相関していた。ＩｇＧの漏出（最大タンパク質濃度の１０％がカラムから溶出）を監視することによって動的結合能（ＤＢＣ）を調べた。
【０１０７】
粒子を使用した分析
実施例１７：上記で述べた方法を用いて実施例１２で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図１にクロマトグラムを示す。
【０１０８】
実施例１８：上記で述べた方法を用いて実施例１３で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べたタンパク質分析法を用いて分析を行った。図１にクロマトグラムを示す。
【０１０９】
図１には、実施例１７（実施例１２で調製した粒子を用いたもの）及び実施例１８（実施例１３で調製した粒子を用いたもの）からのクロマトグラムが重ねて示されている。実施例１２及び１３で調製した粒子は、同じモノマー組成物及び反応条件を使用して調製したものであるが、ＰＥＧ添加剤は粒子の全体の疎水性に対して一定の影響を及ぼした。図１に示されるように、ＰＥＧ ２，０００を含む実施例１２で調製した粒子は、ＰＥＧ ６，０００を含む実施例１３で調製した粒子よりも高い疎水性を示した（タンパク質の溶出により低い塩濃度の緩衝液を必要とした）。ＢＳＡの分離能は実施例１７及び１８で同等であったが、最大の溶出ピーク（β−ラクトグロブリンとライソザイムの共溶出）は実施例１７（ＰＥＧ ２，０００を加えて調製した粒子）においてよりシャープであった。
【０１１０】
実施例１９：上記で述べた方法を用いて実施例１２で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１１】
実施例２０：上記で述べた方法を用いて実施例１３で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１２】
比較例Ｂ：「ＰＨＥＮＹＬ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＬＯＷ ＳＵＢ）」の商品名でジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）（英国、チャルフォントセントガイルス）より市販される、エーテル結合を介してフェニル基によって誘導体化された高度架橋された９０μｍアガロースビーズの芳香族ＨＩＣ媒質を上記で述べた方法を用いてチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１３】
比較例Ｃ：「ＰＨＥＮＹＬ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＨＩＧＨ ＳＵＢ）」の商品名でジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）（英国、チャルフォントセントガイルス）より市販される、エーテル結合を介してフェニル基によって誘導体化された高度架橋された９０μｍアガロースビーズの芳香族ＨＩＣ媒質を上記で述べた方法を用いてチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。図２に漏出曲線を示す。
【０１１４】
図２は、実施例１９及び２０、並びに比較例Ｂ及びＣの漏出曲線を重ねて示したものである。図２に示される漏出曲線より、漏出点は以下のように計算された。実施例１９＝５８ｍｇ／ｍＬ、実施例２０＝４９ｍｇ／ｍＬ、比較例Ｂ＝３８ｍｇ／ｍＬ、及び比較例Ｃ＝５４ｍｇ／ｍＬ計算された漏出点は、実施例１９の粒子がＩｇＧの吸着度が最も高く、次いで比較例Ｃ、実施例２０、及び比較例Ｂが続くことを示している。図２には、各実施例の漏出のプロファイルが更に示されており、ＩｇＧが粒子／ビーズによってどのように吸着されるかを示している。実施例１９及び２０は、比較例Ｃよりも急な漏出曲線（指数的増加の勾配）を示した。比較例Ｂは、１０％漏出点において最も低いＤＢＣを有したばかりでなく、平坦なベースラインも示さなかったが、このことは、ＩｇＧのビーズに対する結合が一貫していないことを示す。図２に示される、粒子／ビーズ１ｍＬ当たりのフェニル基の量は以下のとおりである。実施例１９＝１４μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（粒子の調製に用いられたフェニルモノマーの量及び粒子の膨潤体積に基づいて計算）、実施例２０＝１３μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（粒子の調製に用いられたフェニルモノマーの量及び粒子の膨潤体積に基づいて計算）、比較例Ｂ＝２５μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（製品の文献より引用）、及び比較例Ｃ＝５０μｍｏｌのフェニル／ｍＬ粒子（製品の文献より引用）。図２に示されるデータに基づけば、本開示に基づく粒子は比較例Ｃと同等か、あるいは比較例Ｃよりも良好なＤＢＣを有するが、粒子１ｍＬ当たりのフェニル基の量は大幅に少ない。
【０１１５】
実施例２１：上記で述べた方法を用いて実施例１４で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図３にクロマトグラムを示す。
【０１１６】
実施例２２：上記で述べた方法を用いて実施例１５で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図３にクロマトグラムを示す。
【０１１７】
図３には、実施例２１（実施例１４で調製した粒子を用いたもの）及び実施例２２（実施例１５で調製した粒子を用いたもの）からのクロマトグラムが重ねて示されている。実施例１４及び１５で調製した粒子は、同じモノマー組成物及び反応条件を使用して調製したものであるが、ＰＥＧ添加剤は粒子の全体の疎水性に対して一定の影響を及ぼした。図３に示されるように、ＰＥＧ ６，０００を含む実施例１４で調製した粒子は、ＰＥＧ １０，０００を含む実施例１５で調製した粒子よりも高い疎水性を示した。しかしながら、ＰＥＧ １０，０００を含む実施例１５で調製した粒子がβ−ラクトグロブリン及びライソザイムからＢＳＡを分離することが可能であったのに対して、ＰＥＧ ６，０００を含む実施例１４で調製した粒子は、ＢＳＡの分離ピークは示さなかった。
【０１１８】
実施例２３：上記で述べた方法を用いて実施例１５で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記で述べた動的結合能の方法を用いて分析を行った。粒子の計算されたＤＢＣは３４ｍｇ／ｍＬであった。この値は、コモノマーとしてＡＡｍを用いて調製した粒子のＤＢＣ値（上記実施例１９及び２０に示される）よりも低い値である。
【０１１９】
実施例２４：上記で述べた方法を用いて実施例１６で調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図４に、ＩｇＧピークを有するクロマトグラムの拡大図を示す。
【０１２０】
比較例Ｄ：上記で述べた方法を用いて比較例Ａで調製した粒子をチューブに充填してクロマトグラフィーカラムを形成し、上記に述べたようなタンパク質分析法を用いて分析を行った。図４に、ＩｇＧピークを有するクロマトグラムの拡大図を示す。
【０１２１】
図４には、実施例２４及び比較例ＤからのＩｇＧピークが重ねて示されている。実施例２４及び比較例Ｄで使用した粒子は同じ粒子の組成を有している。すなわち、アズラクトン結合によってベンジルアミン疎水性基を有するアクリルアミド粒子が共有結合している。したがってこれらは同じ保持時間を有することが予想される。図４に示されるように、実施例２４におけるＩｇＧピークは比較例Ｄにおけるよりも保持時間が短い。理論によって束縛されることを望むものではないが、比較例Ｄにおける保持時間の増大は、ベンジルアミンとの反応の際にアズラクトンの加水分解によって生じた少量の負電荷の存在によるものと考えられる。更に、図４に示されるように、比較例ＤにおけるＩｇＧピークは実施例２４におけるＩｇＧピークよりも幅が広く、このこともやはり、ＩｇＧと固定相との混合相互作用（例えば疎水性相互作用及びイオン交換相互作用）を示しているものと考えられる。
【０１２２】
本開示の範囲及び趣旨を逸脱することなく本開示に対する様々な改変及び変更が可能であることは当業者には明らかであろう。本開示は本明細書に記載される説明的実施形態及び実施例によって不要に限定されるものではない点、更にこうした実施例及び実施形態はあくまで一例として示されるものであって本開示の範囲は以下の「特許請求の範囲」によってのみ限定されるものである点は理解されるはずである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性モノマーを含む組成物であって、
下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）
を有し、
前記疎水性モノマーは、親水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される組成物。
【請求項２】
Ｒ１が、メチル、エチル、フェニル、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから独立して選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ３が、ベンジル、フェネチル、フェノキシエチル、フェニルプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、オクタデシル、フェニルブチル、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記疎水性モノマーが、
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＣ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１１ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１７ＣＨ３；又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の疎水性モノマーを含む重合性混合物。
【請求項６】
架橋モノマーを更に含む、請求項５に記載の重合性混合物。
【請求項７】
前記架橋モノマーが、Ｎ，Ｎ’−アルキレンビス（メタ）アクリルアミド、アルキレンビス（メタ）アクリレート、ジビニル芳香族化合物、ポリアリルエステル、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項６に記載の重合性混合物。
【請求項８】
非架橋モノマーを更に含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の重合性混合物。
【請求項９】
前記非架橋モノマーが、ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項８に記載の重合性混合物。
【請求項１０】
前記架橋モノマーの量が前記非架橋モノマーの量よりも大きい、請求項８又は９に記載の重合性混合物。
【請求項１１】
前記非架橋モノマーの量が前記疎水性モノマーの量よりも大きい、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の重合性混合物。
【請求項１２】
ポロゲンを更に含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の重合性混合物。
【請求項１３】
前記ポロゲンが、アルコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、分散有機凝集体、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、多糖類、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項１２に記載の重合性混合物。
【請求項１４】
請求項５〜１３のいずれか一項に記載の重合性混合物の反応生成物を含む物品。
【請求項１５】
疎水的に誘導体化された支持体である、請求項１４に記載の物品。
【請求項１６】
前記疎水性モノマーが前記物品の全体にわたって均一に分配されている、請求項１４又は１５に記載の物品。
【請求項１７】
前記物品が、タンパク質、抗体、融合タンパク質、ワクチン、ペプチド、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つを精製するために使用される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の物品の使用方法。
【請求項１８】
疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）混合物であって、
（ｉ）下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）
を有する疎水性モノマーと、
（ｉｉ）架橋モノマーと、
（ｉｉｉ）場合により、非架橋モノマーと、
を含む混合物を提供する工程と、
（ｂ）前記混合物を重合する工程と、
を含む方法。
【請求項１９】
前記架橋モノマーの量が前記非架橋モノマーの量よりも大きい、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記非架橋モノマーの量が前記疎水性モノマーの量よりも大きい、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記重合性混合物が粒子である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記重合性混合物が、織布、不織布、微多孔性繊維、微多孔性膜、フィルム、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つにコーティング又はグラフトされる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）疎水性モノマーであって、
下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）
を有する疎水性モノマーを与える工程と、
（ｂ）基材を与える工程と、
（ｃ）前記疎水性モノマーを前記基材と接触させる工程と、
（ｄ）前記疎水性モノマーを重合する工程と、
を含む方法。
【請求項２４】
前記重合する工程によって、前記基材上にコーティングが形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記重合する工程によって、前記基材からのグラフトが形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記基材が、多孔性膜、フィルム、不織布、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
疎水性モノマーを含む組成物であって、
下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）
を有し、
前記疎水性モノマーは、親水性指数が２５以下であるアミン又はアルコール（ＨＸＲ３）から誘導される組成物。
【請求項２】
Ｒ１が、メチル、エチル、フェニル、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから独立して選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ３が、ベンジル、フェネチル、フェノキシエチル、フェニルプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、オクタデシル、フェニルブチル、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記疎水性モノマーが、
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＣ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３Ｃ６Ｈ５；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１１ＣＨ３；
ＣＨ２＝ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）１７ＣＨ３；又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の疎水性モノマーを含む重合性混合物。
【請求項６】
架橋モノマーを更に含む、請求項５に記載の重合性混合物。
【請求項７】
前記架橋モノマーが、Ｎ，Ｎ’−アルキレンビス（メタ）アクリルアミド、アルキレンビス（メタ）アクリレート、ジビニル芳香族化合物、ポリアリルエステル、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項６に記載の重合性混合物。
【請求項８】
非架橋モノマーを更に含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の重合性混合物。
【請求項９】
前記非架橋モノマーが、ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項８に記載の重合性混合物。
【請求項１０】
前記架橋モノマーの量が前記非架橋モノマーの量よりも大きい、請求項８又は９に記載の重合性混合物。
【請求項１１】
前記非架橋モノマーの量が前記疎水性モノマーの量よりも大きい、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の重合性混合物。
【請求項１２】
ポロゲンを更に含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の重合性混合物。
【請求項１３】
前記ポロゲンが、アルコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、分散有機凝集体、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、多糖類、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つから選択される、請求項１２に記載の重合性混合物。
【請求項１４】
請求項５〜１３のいずれか一項に記載の重合性混合物の反応生成物を含む物品。
【請求項１５】
疎水的に誘導体化された支持体である、請求項１４に記載の物品。
【請求項１６】
前記疎水性モノマーが前記物品の全体にわたって均一に分配されている、請求項１４又は１５に記載の物品。
【請求項１７】
前記物品が、タンパク質、抗体、融合タンパク質、ワクチン、ペプチド、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つを精製するために使用される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の物品の使用方法。
【請求項１８】
疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）混合物であって、
（ｉ）下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）
を有する疎水性モノマーと、
（ｉｉ）架橋モノマーと、
（ｉｉｉ）場合により、非架橋モノマーと、
を含む混合物を提供する工程と、
（ｂ）前記混合物を重合する工程と、
を含む方法。
【請求項１９】
前記架橋モノマーの量が前記非架橋モノマーの量よりも大きい、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記非架橋モノマーの量が前記疎水性モノマーの量よりも大きい、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記重合性混合物が粒子である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記重合性混合物が、織布、不織布、微多孔性繊維、微多孔性膜、フィルム、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つにコーティング又はグラフトされる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
疎水的に誘導体化された支持体を製造するための方法であって、
（ａ）疎水性モノマーであって、
下記構造：
ＣＨ２＝ＣＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｒ１Ｒ１）（Ｃ（Ｒ１Ｒ１））ｎＣ（Ｏ）ＸＲ３
（式中、ｎは０又は１の整数であり；Ｒ１は、水素原子、アルキル、アリール、及びアルキルアリールの少なくとも１つから独立して選択され、該アルキル、アリール、及びアルキルアリールは全体で１０個以下の炭素原子を有し；Ｒ３は、アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルの少なくとも１つから選択される疎水性基であり、該アルキル、アリール、アルキルアリール及びエーテルは全体で４〜３０個の範囲の炭素原子を有し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＨ３であり；ＸはＯ又はＮＨである。）
を有する疎水性モノマーを与える工程と、
（ｂ）基材を与える工程と、
（ｃ）前記疎水性モノマーを前記基材と接触させる工程と、
（ｄ）前記疎水性モノマーを重合する工程と、
を含む方法。
【請求項２４】
前記重合する工程によって、前記基材上にコーティングが形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記重合する工程によって、前記基材からのグラフトが形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記基材が、多孔性膜、フィルム、不織布、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５２２１１２（Ｐ２０１２−５２２１１２Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３４８１（Ｐ２０１２−５０３４８１）
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７９７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１７５９８
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７９７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１７５９８
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
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