疲労の予防・治療組成物及び予防・治療方法
【課題】 種々の疲労を予防または治療するために、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を有効成分として含有する医薬品組成物および飲食物を提供する。
【解決手段】 本発明では、キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物であるキノリン酸が、ＮＭＤＡ受容体の過度の活性化を引き起こして脳神経細胞を傷害し、これが原因となって種々の疲労を引き起こすというメカニズムを確認し、またＮＭＤＡ受容体拮抗物質が疲労軽減作用を有することを見出した。すなわち、肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および各種疾患に伴う疲労感などに対し、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を含有する医薬品組成物または飲食物が、疲労予防または疲労治療に有効である。
【解決手段】 本発明では、キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物であるキノリン酸が、ＮＭＤＡ受容体の過度の活性化を引き起こして脳神経細胞を傷害し、これが原因となって種々の疲労を引き起こすというメカニズムを確認し、またＮＭＤＡ受容体拮抗物質が疲労軽減作用を有することを見出した。すなわち、肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および各種疾患に伴う疲労感などに対し、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を含有する医薬品組成物または飲食物が、疲労予防または疲労治療に有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗物質を有効成分として含有する肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染、ウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など様々な疲労の予防・治療組成物及び予防・治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労とは、一般的に「過度の肉体的または精神的な活動により生じた特有の病的不快感と、休養を求める欲求を伴う身体または精神機能の減退状態」と定義される。
【０００３】
まず、疲労の代表的なものとして肉体的疲労が挙げられる。肉体的疲労は、長時間あるいは過度の運動などにより身体の代謝機能が低下して、疲労物質である乳酸が体内に蓄積して起きると考えられている。通常、肉体的疲労は身体の休息やマッサージなどにより軽減または解消させることができる。
【０００４】
次に、精神的疲労が挙げられる。精神的疲労は、生活スタイルの急速な変化や社会システムの多様化、あるいは複雑な人間関係などによるストレスが原因と考えられているが、詳細は不明である。近年、精神的疲労を自覚する人が急増しているため、精神的疲労については、科学的根拠に基づいた原因解明とともに、その予防方法および治療方法の開発が求められている。
【０００５】
次に、慢性疲労症候群が挙げられる。慢性疲労症候群は、健康に生活していた人が感冒などを引き金にして、それ以降激しい疲労感、微熱、頭痛、筋肉痛、脱力感、思考力・集中力の低下、抑うつなどの症状を長期間にわたって訴え、健全な社会生活ができなくなるという疾患である。慢性疲労症候群の患者には、既感染の各種ウイルスの再活性化、種々のサイトカインの産生異常、血中デヒドロエピアンドロステロン硫酸（ＤＨＥＡ−Ｓ）の減少、アセチルカルニチン代謝異常、ナチュラルキラー（ＮＫ）活性の低下など様々な異常が起きていることが確認されているが、いずれも発症原因との因果関係までは解明できていない。
【０００６】
その他の疲労として、細菌感染、ウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感が存在する。
【０００７】
これら種々の疲労の内科的治療として、肉体的疲労に対しては、ブドウ糖、果糖などの糖類をはじめ、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの各種アミノ酸などからなる栄養剤、ビタミンＢ１、Ｂ２、ビオチンなどビタミンＢ群に代表されるビタミン剤、エゾウコギ、ニンジン、大蒜（ニンニク）などの生薬、および補中益気湯、十全大補湯、人参養栄湯などの漢方薬などが用いられている。
【０００８】
また、これら以外にも、最近ではコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）、Ｌ−カルニチン、α−リポ酸など高エネルギー物質であるアデノシン−３−リン酸（ＡＴＰ）の産生促進や、乳酸代謝の促進を目的とした物質なども用いられている（特許文献１、特許文献２）。
【０００９】
しかし、これらの物質は肉体的疲労には一定の効果が認められるが、ストレスなどに起因する精神的疲労や慢性疲労症候群に対しては、十分な効果を得られていないのが実状である。
【００１０】
そこで本発明者は、肉体的疲労のみならず、精神的疲労や慢性疲労症候群など、様々の疲労に対し予防および治療効果を有する物質を求めて、従来の抗疲労物質とは異なる新たな作用メカニズムを模索し、その結果、必須アミノ酸のひとつであるトリプトファンの代謝経路に着目した。
【００１１】
トリプトファンは、生体においてセロトニン経路とキヌレニン経路で代謝され、セロトニン経路では精神や感情の調節に関与するセロトニンや、睡眠や生体リズムの調節に関与するメラトニンの前駆体として代謝される。一方キヌレニン経路では、ヒトの場合、摂取されたトリプトファンの約９５％がこの経路で代謝され、トリプトファンはキヌレニンやキノリン酸などの代謝産物を生成しながら、最終的にはニコチンアミドに代謝される。近年、このキヌレニン経路における代謝産物が、種々の疾患に関与していることが注目されている。
【００１２】
感染症や炎症性疾患ではインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターロイキン（ＩＬ）−６などの炎症性サイトカインが産生される。これらのサイトカインのうちＩＦＮやＴＮＦ−αは、キヌレニン経路におけるトリプトファン代謝の起始酵素であるインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の合成を誘導することが知られており（非特許文献１）、感染症や炎症性疾患ではこのＩＤＯは局所あるいは全身で劇的に誘導されるとの報告もある（非特許文献２）。一方で癌やＣ型肝炎の治療に用いられる前述のＩＦＮには、副作用として疲労感（全身倦怠感）が現れることが知られている。これらのことから、感染症や炎症性疾患あるいはＩＦＮ治療において現れる疲労感は、キヌレニン経路におけるトリプトファン代謝の亢進が関与しているのではないかと本発明者は推測した。
【００１３】
キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物であるキノリン酸は、酸化ストレスを惹起し、尿毒症時には体内で増加し、脳においてはグルタミン酸やアスパラギン酸などと同様にＮＭＤＡ受容体活性化物質として作用し、神経細胞に対し強い毒性を示すことが知られている（非特許文献３、４）。
【００１４】
前記ＮＭＤＡ受容体は興奮性アミノ酸であるグルタミン酸受容体の１つであり、神経細胞の表面に存在する。このグルタミン酸受容体はイオンチャネル型と代謝型とに大別され、イオンチャネル型は更にＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ（２-アミノ-３-（３-ヒドロキシ-５-メチルイソキサゾール-４-イル）プロパン酸）受容体、およびカイニン酸受容体の３種類に分類される。
【００１５】
このうちＮＭＤＡ受容体が、グルタミン酸やアスパラギン酸などの興奮性アミノ酸により活性化されると、大量のカルシウムイオンが神経細胞内に流入し、続いて種々のカルシウムイオン依存性酵素が活性化して細胞内に連鎖的な変化が起きる。ＮＭＤＡ受容体の活性化が通常レベルであれば、脳の可塑性や学習・記憶、知覚系の神経伝達など種々の生理的機能において重要な役割を果たすが、過度に活性化した場合には神経細胞を傷害し、最終的に細胞死に至らしめる。
【００１６】
これらのことから本発明者は、感染症や炎症性疾患あるいはＩＦＮ治療では、キヌレニン経路におけるトリプトファン代謝が亢進してキノリン酸が急増し、この急増したキノリン酸が脳においてＮＭＤＡ受容体の過度の活性化を引き起こし、その結果神経細胞が傷害され、神経細胞の傷害により疲労感が引き起こされると考えた。
【００１７】
また、マウスの実験ではＩＤＯを誘導するサイトカインであるＴＮＦ−αの血中濃度が、絶食・絶水ストレス、断眠ストレス、拘束ストレスなど様々なストレスによって上昇す
ることが認められている（非特許文献５）。このことから本発明者は、ストレスなどによる精神的疲労の原因にも、前述したキヌレニン経路におけるトリプトファン代謝の亢進、キノリン酸の増加、およびそれに伴うＮＭＤＡ受容体の過度の活性化による脳神経細胞の傷害が、関与していると考えた。
【００１８】
一方、マウスに運動負荷を与えると、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインが筋肉や血中などで増加することが確認されている（非特許文献６）。ラットでは運動負荷後に、キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物の１つであるキヌレニンが増加し（特許文献３）、さらに腹腔マクロファージのＩＤＯ活性が上昇するとの報告がある（非特許文献７）。これらのことから本発明者は、運動による肉体的疲労の原因にも、ＩＤＯ誘導に伴うトリプトファン代謝の亢進、キノリン酸の増加、およびそれに伴うＮＭＤＡ受容体の過度の活性化による脳神経細胞の傷害が関与していると考えた。
【００１９】
ところでキノリン酸は肝臓などの末梢で生成されており、通常は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することはできないため、キノリン酸が脳内に流入することはない。しかし生後間もない幼若ラットはＢＢＢが脆弱なため、キノリン酸が脳内に移行することが認められている（非特許文献８）。また、ヒトをはじめとする高等動物では、ストレスがＢＢＢの透過性を変化させるという報告があり、ストレスを受けると脳の視床下部室傍核から副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）が分泌され、このＣＲＦがＢＢＢの透過性を亢進させることが確認されている（非特許文献９）。このことから、ストレス状態ではＢＢＢの透過性が亢進し、末梢のキノリン酸が脳内に移行し易くなることが考えられる。
【００２０】
以上のことから、本発明者は、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有する物質を用いれば、キノリン酸によるＮＭＤＡ受容体の活性化を防止でき、その結果、脳神経細胞の傷害を防止することにつながり、肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染やウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など、様々な疲労に対して予防または治療効果を発揮することが期待できるのではないかと推察した。
【００２１】
【特許文献１】特開平６−３０５９６３
【特許文献２】特開２００５−９７１６１
【特許文献３】特開２００４−１９８３２５
【非特許文献１】「Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ 」 ２００２年、１６、ｐ．５９６−６０１
【非特許文献２】「Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 ２００４年、４、１０、ｐ．７６２−７７４
【非特許文献３】「Ｊｏｕｒｎａｌ Ｆｕｒ Ｈｉｒｎｆｏｒｓｃｈｕｎｇ」 １９９０年、３１、（５）、ｐ．６３５−６４３
【非特許文献４】「細胞膜の受容体 基礎知識から最新の情報まで」、南山堂
【非特許文献５】「Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ 」 １９９２年、３、ｐ．３９１−３９８
【非特許文献６】「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」 ２００１年、２２、ｐ．２６１−２６７
【非特許文献７】「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 ２００３年、５２７、ｐ．５３１−５３５
【非特許文献８】「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」 ２０００年、３９、ｐ．５０７−５１４
【非特許文献９】「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」 ２００２年、５３、（１）ｐ．８５−９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、過度の運動などによる肉体的疲労、ストレスや睡眠障害などによる精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染やウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など、様々な疲労を予防または治療するために、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を有効成分として含有する医薬品組成物および飲食物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者は、キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物であるキノリン酸が、ＮＭＤＡ受容体の過度の活性化を引き起こして脳神経細胞を傷害し、これが原因となって種々の疲労を引き起こしていることを突き止め、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで種々の疲労を予防、軽減できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２４】
すなわち本発明の疲労の予防・治療組成物は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗物質を有効成分として含有することを特徴とする。このＮＭＤＡ受容体拮抗物質は、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するメマンチン、ジゾシルピン（ＭＫ８０１）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル、３-（２-カルボキシピペラジン-４-イル）プロピル-１-リン酸（ＣＰＰ）、ケタミン、チレタミン、ブジピン、フルピルチン、Ｎ-［１-（２-チエニル）シクロヘキシル］ピペリジン（ＴＣＰ）、Ｄ（−）-２-アミノ-５-ホスホノバレリン酸（Ｄ-ＡＰ５）、Ｄ（−）-２-アミノ-７-ホスホノヘプタン酸（Ｄ-ＡＰ７）、キヌレン酸、６-ヒドロキシキヌレン酸、７-クロロキヌレン酸、テアニン（Ｌ‐グルタミン酸‐γ‐エチルアミド）などの化合物または該化合物の誘導体からなる群より１種または２種以上選択される。もしくは、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するイチョウ葉、緑茶、紅茶などからの抽出物からなる群より１種または２種以上選択される。
【００２５】
本願発明の疲労の予防・治療方法は、本発明の疲労の予防・治療組成物を用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を有効成分として含有する肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染やウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など様々な疲労に対して予防または治療作用を有する医薬品組成物、飲食物が提供できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明で用いられるＮＭＤＡ受容体拮抗物質としては、メマンチン、ジゾシルピン（ＭＫ８０１）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル、３-（２-カルボキシピペラジン-４-イル）プロピル-１-リン酸（ＣＰＰ）、ケタミン、チレタミン、ブジピン、フルピルチン、Ｎ-［１-（２-チエニル）シクロヘキシル］ピペリジン（ＴＣＰ）、Ｄ（−）-２-アミノ-５-ホスホノバレリン酸（Ｄ-ＡＰ５）、Ｄ（−）-２-アミノ-７-ホスホノヘプタン酸（Ｄ-ＡＰ７）、キヌレン酸、６-ヒドロキシキヌレン酸、７-クロロキヌレン酸、テアニン（Ｌ‐グルタミン酸‐γ‐エチルアミド）などの化合物、またはイチョウ葉、緑茶、紅茶などの天然物もしくはその抽出物で、好ましくは塩酸メマンチンなどが挙げられる。具体的な使用量として、ヒト1日の適切な摂取量の範囲内で、また食品などの場合は苦味などが
強すぎない範囲内で、１日あたり１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）摂取するのが好ましい。また、天然物もしくはその抽出物の場合には１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）で摂取するのが好ましい。
【実施例】
【００２８】
本発明者は、疲労にはキノリン酸の脳内増加が関与しており、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで疲労が軽減されることを、マウスの疲労モデルを用いて明らかにした。
【００２９】
まず最初に「キノリン酸の脳内増加により疲労症状が生じること」を実証するため、マウスの脳内にキノリン酸を直接投与し、疲労症状が誘発されるか否かを試験した。
【００３０】
（試験１） キノリン酸脳内投与による疲労度
［試験方法］
１群当り９〜１２匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に４μｍｏｌ／ｍＬ濃度のキノリン酸（生理食塩液に溶解）を０．０１ｍＬ脳内投与した（条件Ａ）。一方、対照群には同量の生理食塩液を脳内投与した（条件Ｂ）。投与３０分後にマウスを回転数カウンター付きの回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測し、自発運動量の指標とした。なお、回転かごの横には自由に摂餌、摂水することが可能なホームケージが付属されており、マウスはホームケージと回転かご内を自由に行き来できるようになっている。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ａ群（キノリン酸投与）と条件Ｂ群（生理食塩液投与）との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００３１】
［試験結果］
結果を表１に示す。この結果より、「キノリン酸が脳内で増加すると明らかに自発運動量が減少し、疲労状態になる」ことがいえる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
次に、「精神的疲労モデルにおけるキノリン酸の関与と、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで疲労度が軽減されるか」を検証した。
【００３４】
（試験２） 拘束ストレス下におけるキノリン酸末梢投与による疲労度
［試験方法］
１群当り５〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）を、換気用の穴を開けた５０ｍＬ容のポリプロピレンチューブ内に収容し拘束ストレスを負荷した。拘束１時間後、キノリン酸（生理食塩液に溶解）を１００ｍｇ／ｋｇ（マウス体重換算）の用量で腹腔内投与し、更に１時間拘束ストレスを負荷した（条件Ｃ）。一方対照群として、キノリン酸の代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｄ）、拘束ストレスを負荷しないでキノリン酸を腹腔内投与したもの（条件Ｅ）、同じく生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｆ）とした。その後、解放直後に試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。結果
は平均値±標準誤差で表し、条件Ｃ群（拘束ストレス＋キノリン酸）と各群との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００３５】
［試験結果］
結果を表２に示す。この結果より、「拘束ストレス下でキノリン酸を腹腔内投与する（条件Ｃ）と明らかに自発運動量が減少し、その他の群では自発運動量に大きな変化は認められない」ことを確認できた。
【００３６】
【表２】
【００３７】
引き続き、精神的疲労モデルにおいて、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質投与による疲労度変化」の試験を実施した。
【００３８】
（試験３） 拘束ストレス下におけるＮＭＤＡ受容体拮抗物質の作用
［試験方法］
１群当り５〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、まずＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチン（生理食塩液に溶解）を３０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、換気用の穴を開けた５０ｍＬ容のポリプロピレンチューブ内に収容し拘束ストレスを負荷した。拘束１時間後、キノリン酸（生理食塩液に溶解）を１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、更に１時間拘束ストレスを負荷した（条件Ｇ）。一方対照群として、塩酸メマンチンの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｈ）、キノリン酸の代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｊ）、腹腔内投与がいずれも生理食塩液のもの（条件Ｋ）とした。その後、解放直後に試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｈ群（キノリン酸のみ）と各群との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００３９】
［試験結果］
結果を表３に示す。（条件Ｈ）と（条件Ｇ）の結果より、「拘束ストレス時にＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを投与しておけば、自発運動量は減少しない」ことが認められた。一方、「キノリン酸投与がなければ、自発運動量は塩酸メマンチン投与の影響を受けない」ことも確認された。
【００４０】
【表３】
【００４１】
試験２および試験３の結果より、「拘束ストレス下においては、キノリン酸が脳内ではなく末梢投与であっても疲労症状（精神的疲労）が誘発される。しかしＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで、疲労症状は大幅に軽減される」ことが実証できた。
【００４２】
次に、「細菌感染モデルにおけるキノリン酸と疲労の関連性」、および「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで疲労度が軽減されるか」を検証した。
【００４３】
細菌感染に伴う疲労モデルを確立するにあたり、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）を使用した。ＬＰＳは細菌由来の内毒素であり、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＦＮの産生を促進し、その結果ＩＤＯを誘導してキヌレニン経路を活性化させるとともにＢＢＢの透過性を亢進させ、末梢で増加したキノリン酸がＢＢＢを通過して脳へ侵入し易くなると考えている。
【００４４】
（試験４） 細菌感染モデルにおける体内キノリン酸濃度の変動と疲労度
［試験方法］
１群当り７〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、大腸菌由来ＬＰＳを０．２ｍｇ/ｋｇ（条件Ｍ）、０．６ｍｇ/ｋｇ（条件Ｎ）、２．０ｍｇ/ｋｇ（条件Ｐ）の用量で、対象群には生理食塩液（条件Ｌ）を腹腔内投与し、その６時間後に試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。そして回転かごでの自発運動終了３時間後に採血し、血清中キノリン酸濃度を測定した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｌ群（生理食塩液投与）と各群（ＬＰＳ投与）との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００４５】
なお、血清中キノリン酸濃度は次の方法で測定した。血清を分離して超純水で適当に希釈した後、８０μＬを取り、これに１００ｎＭの３,５-ピリジンジカルボン酸溶液８０μＬ、５Ｎ塩酸４０μＬ、クロロホルム２００μＬを加えて激しく撹拌する。遠心分離後、上清１００μＬに６２．５ｍＭのＴＢＡＳ５０μＬを加えて凍結乾燥した後、乾燥ペレットを７．５%ジイソプロピルエチルアミン、３％ペンタフルオロベンジルブロマイドを含む塩化メチレン溶液２５μＬに溶解させ、６０℃にて１５分間加熱して誘導体化させる。常温に冷却後にデカン５０μＬ、超純水７５０μＬを加えて分配した後、遠心して得られた有機層１μＬをＧＣ／ＭＳで定量分析した。なお、キャピラリーカラムにはＤＢ−５ｍｓ ３０ ｍ、キャリアーガスおよび反応ガスにそれぞれヘリウム、イソブタンを用いた。イオン化はＮＣＩで行い、キノリン酸はｍ／ｚ値３４６のシグナルをモニターした。
【００４６】
［試験結果］
結果を表４と図１に示す。この結果より、「ＬＰＳ投与量の増加に伴い自発運動量は減少し、その一方で血清キノリン酸濃度は増加する」ことが確認された。また、図１に示し
たように、「血清キノリン酸濃度と自発運動量の間には、有意な負の相関関係がある」ことも確認された（ｒ＝−０．６９８８４、Ｐ＜０．００１）。
【００４７】
【表４】
【００４８】
続いて細菌感染モデルにおいて、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質投与による疲労度変化」の試験を実施した。
【００４９】
（試験５） 細菌感染モデルによる疲労症状下におけるＮＭＤＡ受容体拮抗物質の作用
［試験方法］
１群当り７〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを生理食塩液に溶解し３０ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与した。その０．５時間後に大腸菌由来ＬＰＳを０．６ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与し、さらにその６時間後に再び塩酸メマンチンを同量の３０ｍｇ/ｋｇ腹腔内投与した（条件Ｑ）。一方対照群として、塩酸メマンチンの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｒ）、大腸菌由来ＬＰＳの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｓ）、腹腔内投与がいずれも生理食塩液のもの（条件Ｔ）とした。その後、試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。そして回転かごでの自発運動終了３時間後に採血し、試験４と同じ方法で血清中キノリン酸濃度を測定した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｒ群（ＬＰＳ投与のみ）と各群間の有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００５０】
［試験結果］
結果を表５に示す。（条件Ｒ）と（条件Ｑ）の結果より、「ＬＰＳ投与時にＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを投与しておけば、血清キノリン酸濃度は増加するものの、自発運動量は減少しない」ことが認められた。一方「ＬＰＳ投与がなければ、自発運動量及び血清キノリン酸濃度は、塩酸メマンチン投与の影響を受けない」ことも確認された。
【００５１】
【表５】
【００５２】
試験４および試験５の結果より、「細菌やウイルス感染によって体内でキノリン酸の生成が加速され、疲労症状を誘発・加速する」。しかし「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで、キノリン酸生成の加速を止めることはできないが、疲労症状は大幅に軽減できる」ことを実証できた。
【００５３】
さらに疲労症状が起きる細菌感染モデルにおいて、「体内でキノリン酸の生成が加速し、キノリン酸がＮＭＤＡ受容体を過度に活性化して脳神経細胞を傷害する」こと、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質の投与によってその細胞傷害が抑制されるか」を検証した。
【００５４】
（試験６） 細菌感染モデルにおいて引き起こされる脳細胞傷害に対するＮＭＤＡ受容体拮抗物質の作用
［試験方法］
１群当り７〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを生理食塩液に溶解し３０ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与した。その０．５時間後に大腸菌由来ＬＰＳを０．６ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与し、さらにその６時間後に再び塩酸メマンチンを同量の３０ｍｇ/ｋｇ腹腔内投与した（条件Ｗ）。一方対照群として、塩酸メマンチンの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｘ）、大腸菌由来ＬＰＳの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｙ）、腹腔内投与がいずれも生理食塩液のもの（条件Ｚ）とした。そしてＬＰＳを腹腔内投与してから３日後に、マウスの左心室からリン酸緩衝生理食塩液と４％パラホルムアルデヒド液を流して灌流し、そのあと脳を摘出した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒド液で固定した後、常法によりパラフィン包埋を行い、このパラフィン包埋ブロックをミクロトームで海馬領域を含む３μｍ厚の切片として薄切し、Ｎｉｓｓｅｌ染色を行い、神経細胞を染め分けた。そして光学顕微鏡下で海馬のＣＡ１およびＣＡ３領域に存在する神経細胞数を計測し、１ｍｍ３当りの細胞密度を算出した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｘ群（ＬＰＳ投与のみ）と各群間の有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００５５】
【表６】
【００５６】
試験６の結果より、ＬＰＳ投与による細菌感染モデルでは、脳の海馬領域で神経細胞傷害が引き起こされるが、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで、その細胞傷害が有意に抑制されることを実証できた。
【００５７】
以上の試験結果から、疲労のメカニズムとして、「細菌やウイルス感染によってキノリン酸の増加とＢＢＢの弱体化が同時に起きた場合、キノリン酸が弱体化したＢＢＢを通過して脳内へ侵入し、続いてＮＭＤＡ受容体を過度に活性化して、脳神経細胞傷害を引き起こし、その結果疲労感を誘発する」ことが裏付けられた。また、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与してＮＭＤＡ受容体を不活性化することで、脳神経細胞傷害を抑制し、疲労症状を軽減できる」ことが実証できた。
【００５８】
以下に、本発明を更に具体的な商品として展開する場合の製造例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１） 錠剤
塩酸メマンチン ２５部、無水カフェイン １００部、アスパルテーム １５部、マンニット ９７０部、アビセル ６６部、メントール １２部、ステアリン酸マグネシウム １２部、全量 １２００部を常法に従い十分に混和した後、打錠して、１錠４００ｍｇの咀嚼錠を得た。
【００６０】
（実施例２） 錠剤
臭化水素酸デキストロメトルファンクレゾールスルホン酸カリウム ２５部、無水カフェイン １００部、アスパルテーム １５部、マンニット ９７０部、アビセル ６６部、メントール １２部、ステアリン酸マグネシウム １２部、全量 １２００部を常法に従い十分に混和した後、打錠して、１錠４００ｍｇの咀嚼錠を得た。
【００６１】
（実施例３） カプセル剤
酒石酸イフェンプロジル ２０．０ｍｇ、無水カフェイン９０．０ｍｇ、ラウリル硫酸ナトリウム１０．０ｍｇ、乳 糖 ３０．０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム３０．０ｍｇ、アルファ化デンプン ６０．０ｍｇ、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース １０．０ｍｇを常法に従い十分に混和した後、顆粒を製造し、１カプセル当り２５０．０ｍｇを２号カプセルに充填した。
【００６２】
（実施例４） ドリンク剤
イチョウ葉抽出エキス １ｇ、ＤＬ−酒石酸ナトリウム １００ｍｇ、コハク酸 ９ｍｇ、液糖 ８００ｇ、クエン酸 １２ｇ、ビタミンＣ １０ｇ、ニコチン酸アミド １２０ｍｇ、硝酸チアミン １００ｍｇ、塩酸ピリドキシン ５０ｍｇ、リン酸リボフラビン
ナトリウム ３０ｍｇ、無水カフェイン ５００ｍｇ、香料 １５ｍＬを蒸留水８Ｌに溶解し、蒸留水を加えて全量を１０Ｌとした後、フィルターろ過し、１００ｍＬずつ褐色びんに無菌充填してドリンク剤を製造した。
【００６３】
（実施例５） ドリンク剤
緑茶抽出エキス ２０ｇ、ＤＬ−酒石酸ナトリウム １００ｍｇ、コハク酸 ９ｍｇ、液糖 ８００ｇ、クエン酸 １２ｇ、ニコチン酸アミド １２０ｍｇ、ビタミンＣ １０ｇ、香料 １２ｍｌ、塩化カリウム １ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇを蒸留水８Ｌに溶解し、蒸留水を加えて全量を１０Ｌとした後、フィルターろ過し、１００ｍＬずつ褐色びんに無菌充填してドリンク剤を製造した。
【００６４】
（実施例６） ゼリー剤
テアニン １．５ｇ、バリン １ｇ、ロイシン １ｇ、イソロイシン １ｇ、ゲルアップＳＡ３Ｃ ０．２ｇ、ゲルアップＫ−Ｓ ０．１ｇ、トレハロース １２ｇ、デンプン
２ｇ、水 ６０．７ｇを８０℃の温浴で溶解させる。７０℃に冷却後に１％カードラン分散液 ２０ｍＬを加えてさらに撹拌し、パウチに充填した。１００℃、２０分間ボイル殺菌を行い、ゼリー剤とした。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】細菌感染モデルにおける血清キノリン酸濃度と自発運動量の相関関係
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗物質を有効成分として含有する肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染、ウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など様々な疲労の予防・治療組成物及び予防・治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労とは、一般的に「過度の肉体的または精神的な活動により生じた特有の病的不快感と、休養を求める欲求を伴う身体または精神機能の減退状態」と定義される。
【０００３】
まず、疲労の代表的なものとして肉体的疲労が挙げられる。肉体的疲労は、長時間あるいは過度の運動などにより身体の代謝機能が低下して、疲労物質である乳酸が体内に蓄積して起きると考えられている。通常、肉体的疲労は身体の休息やマッサージなどにより軽減または解消させることができる。
【０００４】
次に、精神的疲労が挙げられる。精神的疲労は、生活スタイルの急速な変化や社会システムの多様化、あるいは複雑な人間関係などによるストレスが原因と考えられているが、詳細は不明である。近年、精神的疲労を自覚する人が急増しているため、精神的疲労については、科学的根拠に基づいた原因解明とともに、その予防方法および治療方法の開発が求められている。
【０００５】
次に、慢性疲労症候群が挙げられる。慢性疲労症候群は、健康に生活していた人が感冒などを引き金にして、それ以降激しい疲労感、微熱、頭痛、筋肉痛、脱力感、思考力・集中力の低下、抑うつなどの症状を長期間にわたって訴え、健全な社会生活ができなくなるという疾患である。慢性疲労症候群の患者には、既感染の各種ウイルスの再活性化、種々のサイトカインの産生異常、血中デヒドロエピアンドロステロン硫酸（ＤＨＥＡ−Ｓ）の減少、アセチルカルニチン代謝異常、ナチュラルキラー（ＮＫ）活性の低下など様々な異常が起きていることが確認されているが、いずれも発症原因との因果関係までは解明できていない。
【０００６】
その他の疲労として、細菌感染、ウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感が存在する。
【０００７】
これら種々の疲労の内科的治療として、肉体的疲労に対しては、ブドウ糖、果糖などの糖類をはじめ、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの各種アミノ酸などからなる栄養剤、ビタミンＢ１、Ｂ２、ビオチンなどビタミンＢ群に代表されるビタミン剤、エゾウコギ、ニンジン、大蒜（ニンニク）などの生薬、および補中益気湯、十全大補湯、人参養栄湯などの漢方薬などが用いられている。
【０００８】
また、これら以外にも、最近ではコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）、Ｌ−カルニチン、α−リポ酸など高エネルギー物質であるアデノシン−３−リン酸（ＡＴＰ）の産生促進や、乳酸代謝の促進を目的とした物質なども用いられている（特許文献１、特許文献２）。
【０００９】
しかし、これらの物質は肉体的疲労には一定の効果が認められるが、ストレスなどに起因する精神的疲労や慢性疲労症候群に対しては、十分な効果を得られていないのが実状である。
【００１０】
そこで本発明者は、肉体的疲労のみならず、精神的疲労や慢性疲労症候群など、様々の疲労に対し予防および治療効果を有する物質を求めて、従来の抗疲労物質とは異なる新たな作用メカニズムを模索し、その結果、必須アミノ酸のひとつであるトリプトファンの代謝経路に着目した。
【００１１】
トリプトファンは、生体においてセロトニン経路とキヌレニン経路で代謝され、セロトニン経路では精神や感情の調節に関与するセロトニンや、睡眠や生体リズムの調節に関与するメラトニンの前駆体として代謝される。一方キヌレニン経路では、ヒトの場合、摂取されたトリプトファンの約９５％がこの経路で代謝され、トリプトファンはキヌレニンやキノリン酸などの代謝産物を生成しながら、最終的にはニコチンアミドに代謝される。近年、このキヌレニン経路における代謝産物が、種々の疾患に関与していることが注目されている。
【００１２】
感染症や炎症性疾患ではインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターロイキン（ＩＬ）−６などの炎症性サイトカインが産生される。これらのサイトカインのうちＩＦＮやＴＮＦ−αは、キヌレニン経路におけるトリプトファン代謝の起始酵素であるインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の合成を誘導することが知られており（非特許文献１）、感染症や炎症性疾患ではこのＩＤＯは局所あるいは全身で劇的に誘導されるとの報告もある（非特許文献２）。一方で癌やＣ型肝炎の治療に用いられる前述のＩＦＮには、副作用として疲労感（全身倦怠感）が現れることが知られている。これらのことから、感染症や炎症性疾患あるいはＩＦＮ治療において現れる疲労感は、キヌレニン経路におけるトリプトファン代謝の亢進が関与しているのではないかと本発明者は推測した。
【００１３】
キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物であるキノリン酸は、酸化ストレスを惹起し、尿毒症時には体内で増加し、脳においてはグルタミン酸やアスパラギン酸などと同様にＮＭＤＡ受容体活性化物質として作用し、神経細胞に対し強い毒性を示すことが知られている（非特許文献３、４）。
【００１４】
前記ＮＭＤＡ受容体は興奮性アミノ酸であるグルタミン酸受容体の１つであり、神経細胞の表面に存在する。このグルタミン酸受容体はイオンチャネル型と代謝型とに大別され、イオンチャネル型は更にＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ（２-アミノ-３-（３-ヒドロキシ-５-メチルイソキサゾール-４-イル）プロパン酸）受容体、およびカイニン酸受容体の３種類に分類される。
【００１５】
このうちＮＭＤＡ受容体が、グルタミン酸やアスパラギン酸などの興奮性アミノ酸により活性化されると、大量のカルシウムイオンが神経細胞内に流入し、続いて種々のカルシウムイオン依存性酵素が活性化して細胞内に連鎖的な変化が起きる。ＮＭＤＡ受容体の活性化が通常レベルであれば、脳の可塑性や学習・記憶、知覚系の神経伝達など種々の生理的機能において重要な役割を果たすが、過度に活性化した場合には神経細胞を傷害し、最終的に細胞死に至らしめる。
【００１６】
これらのことから本発明者は、感染症や炎症性疾患あるいはＩＦＮ治療では、キヌレニン経路におけるトリプトファン代謝が亢進してキノリン酸が急増し、この急増したキノリン酸が脳においてＮＭＤＡ受容体の過度の活性化を引き起こし、その結果神経細胞が傷害され、神経細胞の傷害により疲労感が引き起こされると考えた。
【００１７】
また、マウスの実験ではＩＤＯを誘導するサイトカインであるＴＮＦ−αの血中濃度が、絶食・絶水ストレス、断眠ストレス、拘束ストレスなど様々なストレスによって上昇す
ることが認められている（非特許文献５）。このことから本発明者は、ストレスなどによる精神的疲労の原因にも、前述したキヌレニン経路におけるトリプトファン代謝の亢進、キノリン酸の増加、およびそれに伴うＮＭＤＡ受容体の過度の活性化による脳神経細胞の傷害が、関与していると考えた。
【００１８】
一方、マウスに運動負荷を与えると、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインが筋肉や血中などで増加することが確認されている（非特許文献６）。ラットでは運動負荷後に、キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物の１つであるキヌレニンが増加し（特許文献３）、さらに腹腔マクロファージのＩＤＯ活性が上昇するとの報告がある（非特許文献７）。これらのことから本発明者は、運動による肉体的疲労の原因にも、ＩＤＯ誘導に伴うトリプトファン代謝の亢進、キノリン酸の増加、およびそれに伴うＮＭＤＡ受容体の過度の活性化による脳神経細胞の傷害が関与していると考えた。
【００１９】
ところでキノリン酸は肝臓などの末梢で生成されており、通常は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することはできないため、キノリン酸が脳内に流入することはない。しかし生後間もない幼若ラットはＢＢＢが脆弱なため、キノリン酸が脳内に移行することが認められている（非特許文献８）。また、ヒトをはじめとする高等動物では、ストレスがＢＢＢの透過性を変化させるという報告があり、ストレスを受けると脳の視床下部室傍核から副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）が分泌され、このＣＲＦがＢＢＢの透過性を亢進させることが確認されている（非特許文献９）。このことから、ストレス状態ではＢＢＢの透過性が亢進し、末梢のキノリン酸が脳内に移行し易くなることが考えられる。
【００２０】
以上のことから、本発明者は、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有する物質を用いれば、キノリン酸によるＮＭＤＡ受容体の活性化を防止でき、その結果、脳神経細胞の傷害を防止することにつながり、肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染やウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など、様々な疲労に対して予防または治療効果を発揮することが期待できるのではないかと推察した。
【００２１】
【特許文献１】特開平６−３０５９６３
【特許文献２】特開２００５−９７１６１
【特許文献３】特開２００４−１９８３２５
【非特許文献１】「Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ 」 ２００２年、１６、ｐ．５９６−６０１
【非特許文献２】「Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 ２００４年、４、１０、ｐ．７６２−７７４
【非特許文献３】「Ｊｏｕｒｎａｌ Ｆｕｒ Ｈｉｒｎｆｏｒｓｃｈｕｎｇ」 １９９０年、３１、（５）、ｐ．６３５−６４３
【非特許文献４】「細胞膜の受容体 基礎知識から最新の情報まで」、南山堂
【非特許文献５】「Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ 」 １９９２年、３、ｐ．３９１−３９８
【非特許文献６】「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」 ２００１年、２２、ｐ．２６１−２６７
【非特許文献７】「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 ２００３年、５２７、ｐ．５３１−５３５
【非特許文献８】「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」 ２０００年、３９、ｐ．５０７−５１４
【非特許文献９】「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」 ２００２年、５３、（１）ｐ．８５−９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、過度の運動などによる肉体的疲労、ストレスや睡眠障害などによる精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染やウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など、様々な疲労を予防または治療するために、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を有効成分として含有する医薬品組成物および飲食物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者は、キヌレニン経路におけるトリプトファンの代謝産物であるキノリン酸が、ＮＭＤＡ受容体の過度の活性化を引き起こして脳神経細胞を傷害し、これが原因となって種々の疲労を引き起こしていることを突き止め、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで種々の疲労を予防、軽減できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２４】
すなわち本発明の疲労の予防・治療組成物は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗物質を有効成分として含有することを特徴とする。このＮＭＤＡ受容体拮抗物質は、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するメマンチン、ジゾシルピン（ＭＫ８０１）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル、３-（２-カルボキシピペラジン-４-イル）プロピル-１-リン酸（ＣＰＰ）、ケタミン、チレタミン、ブジピン、フルピルチン、Ｎ-［１-（２-チエニル）シクロヘキシル］ピペリジン（ＴＣＰ）、Ｄ（−）-２-アミノ-５-ホスホノバレリン酸（Ｄ-ＡＰ５）、Ｄ（−）-２-アミノ-７-ホスホノヘプタン酸（Ｄ-ＡＰ７）、キヌレン酸、６-ヒドロキシキヌレン酸、７-クロロキヌレン酸、テアニン（Ｌ‐グルタミン酸‐γ‐エチルアミド）などの化合物または該化合物の誘導体からなる群より１種または２種以上選択される。もしくは、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するイチョウ葉、緑茶、紅茶などからの抽出物からなる群より１種または２種以上選択される。
【００２５】
本願発明の疲労の予防・治療方法は、本発明の疲労の予防・治療組成物を用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を有効成分として含有する肉体的疲労、精神的疲労、慢性疲労症候群、および細菌感染やウイルス感染、炎症、アレルギー、糖尿病、貧血、甲状腺機能低下、リウマチ、癌、ＡＩＤＳなどの各種疾患に伴う疲労感など様々な疲労に対して予防または治療作用を有する医薬品組成物、飲食物が提供できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明で用いられるＮＭＤＡ受容体拮抗物質としては、メマンチン、ジゾシルピン（ＭＫ８０１）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル、３-（２-カルボキシピペラジン-４-イル）プロピル-１-リン酸（ＣＰＰ）、ケタミン、チレタミン、ブジピン、フルピルチン、Ｎ-［１-（２-チエニル）シクロヘキシル］ピペリジン（ＴＣＰ）、Ｄ（−）-２-アミノ-５-ホスホノバレリン酸（Ｄ-ＡＰ５）、Ｄ（−）-２-アミノ-７-ホスホノヘプタン酸（Ｄ-ＡＰ７）、キヌレン酸、６-ヒドロキシキヌレン酸、７-クロロキヌレン酸、テアニン（Ｌ‐グルタミン酸‐γ‐エチルアミド）などの化合物、またはイチョウ葉、緑茶、紅茶などの天然物もしくはその抽出物で、好ましくは塩酸メマンチンなどが挙げられる。具体的な使用量として、ヒト1日の適切な摂取量の範囲内で、また食品などの場合は苦味などが
強すぎない範囲内で、１日あたり１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）摂取するのが好ましい。また、天然物もしくはその抽出物の場合には１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）で摂取するのが好ましい。
【実施例】
【００２８】
本発明者は、疲労にはキノリン酸の脳内増加が関与しており、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで疲労が軽減されることを、マウスの疲労モデルを用いて明らかにした。
【００２９】
まず最初に「キノリン酸の脳内増加により疲労症状が生じること」を実証するため、マウスの脳内にキノリン酸を直接投与し、疲労症状が誘発されるか否かを試験した。
【００３０】
（試験１） キノリン酸脳内投与による疲労度
［試験方法］
１群当り９〜１２匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に４μｍｏｌ／ｍＬ濃度のキノリン酸（生理食塩液に溶解）を０．０１ｍＬ脳内投与した（条件Ａ）。一方、対照群には同量の生理食塩液を脳内投与した（条件Ｂ）。投与３０分後にマウスを回転数カウンター付きの回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測し、自発運動量の指標とした。なお、回転かごの横には自由に摂餌、摂水することが可能なホームケージが付属されており、マウスはホームケージと回転かご内を自由に行き来できるようになっている。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ａ群（キノリン酸投与）と条件Ｂ群（生理食塩液投与）との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００３１】
［試験結果］
結果を表１に示す。この結果より、「キノリン酸が脳内で増加すると明らかに自発運動量が減少し、疲労状態になる」ことがいえる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
次に、「精神的疲労モデルにおけるキノリン酸の関与と、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで疲労度が軽減されるか」を検証した。
【００３４】
（試験２） 拘束ストレス下におけるキノリン酸末梢投与による疲労度
［試験方法］
１群当り５〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）を、換気用の穴を開けた５０ｍＬ容のポリプロピレンチューブ内に収容し拘束ストレスを負荷した。拘束１時間後、キノリン酸（生理食塩液に溶解）を１００ｍｇ／ｋｇ（マウス体重換算）の用量で腹腔内投与し、更に１時間拘束ストレスを負荷した（条件Ｃ）。一方対照群として、キノリン酸の代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｄ）、拘束ストレスを負荷しないでキノリン酸を腹腔内投与したもの（条件Ｅ）、同じく生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｆ）とした。その後、解放直後に試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。結果
は平均値±標準誤差で表し、条件Ｃ群（拘束ストレス＋キノリン酸）と各群との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００３５】
［試験結果］
結果を表２に示す。この結果より、「拘束ストレス下でキノリン酸を腹腔内投与する（条件Ｃ）と明らかに自発運動量が減少し、その他の群では自発運動量に大きな変化は認められない」ことを確認できた。
【００３６】
【表２】
【００３７】
引き続き、精神的疲労モデルにおいて、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質投与による疲労度変化」の試験を実施した。
【００３８】
（試験３） 拘束ストレス下におけるＮＭＤＡ受容体拮抗物質の作用
［試験方法］
１群当り５〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、まずＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチン（生理食塩液に溶解）を３０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、換気用の穴を開けた５０ｍＬ容のポリプロピレンチューブ内に収容し拘束ストレスを負荷した。拘束１時間後、キノリン酸（生理食塩液に溶解）を１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、更に１時間拘束ストレスを負荷した（条件Ｇ）。一方対照群として、塩酸メマンチンの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｈ）、キノリン酸の代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｊ）、腹腔内投与がいずれも生理食塩液のもの（条件Ｋ）とした。その後、解放直後に試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｈ群（キノリン酸のみ）と各群との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００３９】
［試験結果］
結果を表３に示す。（条件Ｈ）と（条件Ｇ）の結果より、「拘束ストレス時にＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを投与しておけば、自発運動量は減少しない」ことが認められた。一方、「キノリン酸投与がなければ、自発運動量は塩酸メマンチン投与の影響を受けない」ことも確認された。
【００４０】
【表３】
【００４１】
試験２および試験３の結果より、「拘束ストレス下においては、キノリン酸が脳内ではなく末梢投与であっても疲労症状（精神的疲労）が誘発される。しかしＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで、疲労症状は大幅に軽減される」ことが実証できた。
【００４２】
次に、「細菌感染モデルにおけるキノリン酸と疲労の関連性」、および「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで疲労度が軽減されるか」を検証した。
【００４３】
細菌感染に伴う疲労モデルを確立するにあたり、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）を使用した。ＬＰＳは細菌由来の内毒素であり、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＦＮの産生を促進し、その結果ＩＤＯを誘導してキヌレニン経路を活性化させるとともにＢＢＢの透過性を亢進させ、末梢で増加したキノリン酸がＢＢＢを通過して脳へ侵入し易くなると考えている。
【００４４】
（試験４） 細菌感染モデルにおける体内キノリン酸濃度の変動と疲労度
［試験方法］
１群当り７〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、大腸菌由来ＬＰＳを０．２ｍｇ/ｋｇ（条件Ｍ）、０．６ｍｇ/ｋｇ（条件Ｎ）、２．０ｍｇ/ｋｇ（条件Ｐ）の用量で、対象群には生理食塩液（条件Ｌ）を腹腔内投与し、その６時間後に試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。そして回転かごでの自発運動終了３時間後に採血し、血清中キノリン酸濃度を測定した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｌ群（生理食塩液投与）と各群（ＬＰＳ投与）との有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００４５】
なお、血清中キノリン酸濃度は次の方法で測定した。血清を分離して超純水で適当に希釈した後、８０μＬを取り、これに１００ｎＭの３,５-ピリジンジカルボン酸溶液８０μＬ、５Ｎ塩酸４０μＬ、クロロホルム２００μＬを加えて激しく撹拌する。遠心分離後、上清１００μＬに６２．５ｍＭのＴＢＡＳ５０μＬを加えて凍結乾燥した後、乾燥ペレットを７．５%ジイソプロピルエチルアミン、３％ペンタフルオロベンジルブロマイドを含む塩化メチレン溶液２５μＬに溶解させ、６０℃にて１５分間加熱して誘導体化させる。常温に冷却後にデカン５０μＬ、超純水７５０μＬを加えて分配した後、遠心して得られた有機層１μＬをＧＣ／ＭＳで定量分析した。なお、キャピラリーカラムにはＤＢ−５ｍｓ ３０ ｍ、キャリアーガスおよび反応ガスにそれぞれヘリウム、イソブタンを用いた。イオン化はＮＣＩで行い、キノリン酸はｍ／ｚ値３４６のシグナルをモニターした。
【００４６】
［試験結果］
結果を表４と図１に示す。この結果より、「ＬＰＳ投与量の増加に伴い自発運動量は減少し、その一方で血清キノリン酸濃度は増加する」ことが確認された。また、図１に示し
たように、「血清キノリン酸濃度と自発運動量の間には、有意な負の相関関係がある」ことも確認された（ｒ＝−０．６９８８４、Ｐ＜０．００１）。
【００４７】
【表４】
【００４８】
続いて細菌感染モデルにおいて、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質投与による疲労度変化」の試験を実施した。
【００４９】
（試験５） 細菌感染モデルによる疲労症状下におけるＮＭＤＡ受容体拮抗物質の作用
［試験方法］
１群当り７〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを生理食塩液に溶解し３０ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与した。その０．５時間後に大腸菌由来ＬＰＳを０．６ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与し、さらにその６時間後に再び塩酸メマンチンを同量の３０ｍｇ/ｋｇ腹腔内投与した（条件Ｑ）。一方対照群として、塩酸メマンチンの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｒ）、大腸菌由来ＬＰＳの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｓ）、腹腔内投与がいずれも生理食塩液のもの（条件Ｔ）とした。その後、試験１で用いたものと同じ回転かごに入れ、明暗サイクルの飼育室で、暗期１２時間、明期３時間を含む合計１５時間における回転数を計測した。そして回転かごでの自発運動終了３時間後に採血し、試験４と同じ方法で血清中キノリン酸濃度を測定した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｒ群（ＬＰＳ投与のみ）と各群間の有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００５０】
［試験結果］
結果を表５に示す。（条件Ｒ）と（条件Ｑ）の結果より、「ＬＰＳ投与時にＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを投与しておけば、血清キノリン酸濃度は増加するものの、自発運動量は減少しない」ことが認められた。一方「ＬＰＳ投与がなければ、自発運動量及び血清キノリン酸濃度は、塩酸メマンチン投与の影響を受けない」ことも確認された。
【００５１】
【表５】
【００５２】
試験４および試験５の結果より、「細菌やウイルス感染によって体内でキノリン酸の生成が加速され、疲労症状を誘発・加速する」。しかし「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで、キノリン酸生成の加速を止めることはできないが、疲労症状は大幅に軽減できる」ことを実証できた。
【００５３】
さらに疲労症状が起きる細菌感染モデルにおいて、「体内でキノリン酸の生成が加速し、キノリン酸がＮＭＤＡ受容体を過度に活性化して脳神経細胞を傷害する」こと、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質の投与によってその細胞傷害が抑制されるか」を検証した。
【００５４】
（試験６） 細菌感染モデルにおいて引き起こされる脳細胞傷害に対するＮＭＤＡ受容体拮抗物質の作用
［試験方法］
１群当り７〜８匹のｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）に、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質である塩酸メマンチンを生理食塩液に溶解し３０ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与した。その０．５時間後に大腸菌由来ＬＰＳを０．６ｍｇ/ｋｇの用量で腹腔内投与し、さらにその６時間後に再び塩酸メマンチンを同量の３０ｍｇ/ｋｇ腹腔内投与した（条件Ｗ）。一方対照群として、塩酸メマンチンの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｘ）、大腸菌由来ＬＰＳの代わりに生理食塩液を腹腔内投与したもの（条件Ｙ）、腹腔内投与がいずれも生理食塩液のもの（条件Ｚ）とした。そしてＬＰＳを腹腔内投与してから３日後に、マウスの左心室からリン酸緩衝生理食塩液と４％パラホルムアルデヒド液を流して灌流し、そのあと脳を摘出した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒド液で固定した後、常法によりパラフィン包埋を行い、このパラフィン包埋ブロックをミクロトームで海馬領域を含む３μｍ厚の切片として薄切し、Ｎｉｓｓｅｌ染色を行い、神経細胞を染め分けた。そして光学顕微鏡下で海馬のＣＡ１およびＣＡ３領域に存在する神経細胞数を計測し、１ｍｍ３当りの細胞密度を算出した。結果は平均値±標準誤差で表し、条件Ｘ群（ＬＰＳ投与のみ）と各群間の有意差検定をステューデントのｔ検定法により行い、危険率５％未満（Ｐ＜０．０５）を有意とした。
【００５５】
【表６】
【００５６】
試験６の結果より、ＬＰＳ投与による細菌感染モデルでは、脳の海馬領域で神経細胞傷害が引き起こされるが、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与することで、その細胞傷害が有意に抑制されることを実証できた。
【００５７】
以上の試験結果から、疲労のメカニズムとして、「細菌やウイルス感染によってキノリン酸の増加とＢＢＢの弱体化が同時に起きた場合、キノリン酸が弱体化したＢＢＢを通過して脳内へ侵入し、続いてＮＭＤＡ受容体を過度に活性化して、脳神経細胞傷害を引き起こし、その結果疲労感を誘発する」ことが裏付けられた。また、「ＮＭＤＡ受容体拮抗物質を投与してＮＭＤＡ受容体を不活性化することで、脳神経細胞傷害を抑制し、疲労症状を軽減できる」ことが実証できた。
【００５８】
以下に、本発明を更に具体的な商品として展開する場合の製造例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１） 錠剤
塩酸メマンチン ２５部、無水カフェイン １００部、アスパルテーム １５部、マンニット ９７０部、アビセル ６６部、メントール １２部、ステアリン酸マグネシウム １２部、全量 １２００部を常法に従い十分に混和した後、打錠して、１錠４００ｍｇの咀嚼錠を得た。
【００６０】
（実施例２） 錠剤
臭化水素酸デキストロメトルファンクレゾールスルホン酸カリウム ２５部、無水カフェイン １００部、アスパルテーム １５部、マンニット ９７０部、アビセル ６６部、メントール １２部、ステアリン酸マグネシウム １２部、全量 １２００部を常法に従い十分に混和した後、打錠して、１錠４００ｍｇの咀嚼錠を得た。
【００６１】
（実施例３） カプセル剤
酒石酸イフェンプロジル ２０．０ｍｇ、無水カフェイン９０．０ｍｇ、ラウリル硫酸ナトリウム１０．０ｍｇ、乳 糖 ３０．０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム３０．０ｍｇ、アルファ化デンプン ６０．０ｍｇ、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース １０．０ｍｇを常法に従い十分に混和した後、顆粒を製造し、１カプセル当り２５０．０ｍｇを２号カプセルに充填した。
【００６２】
（実施例４） ドリンク剤
イチョウ葉抽出エキス １ｇ、ＤＬ−酒石酸ナトリウム １００ｍｇ、コハク酸 ９ｍｇ、液糖 ８００ｇ、クエン酸 １２ｇ、ビタミンＣ １０ｇ、ニコチン酸アミド １２０ｍｇ、硝酸チアミン １００ｍｇ、塩酸ピリドキシン ５０ｍｇ、リン酸リボフラビン
ナトリウム ３０ｍｇ、無水カフェイン ５００ｍｇ、香料 １５ｍＬを蒸留水８Ｌに溶解し、蒸留水を加えて全量を１０Ｌとした後、フィルターろ過し、１００ｍＬずつ褐色びんに無菌充填してドリンク剤を製造した。
【００６３】
（実施例５） ドリンク剤
緑茶抽出エキス ２０ｇ、ＤＬ−酒石酸ナトリウム １００ｍｇ、コハク酸 ９ｍｇ、液糖 ８００ｇ、クエン酸 １２ｇ、ニコチン酸アミド １２０ｍｇ、ビタミンＣ １０ｇ、香料 １２ｍｌ、塩化カリウム １ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇを蒸留水８Ｌに溶解し、蒸留水を加えて全量を１０Ｌとした後、フィルターろ過し、１００ｍＬずつ褐色びんに無菌充填してドリンク剤を製造した。
【００６４】
（実施例６） ゼリー剤
テアニン １．５ｇ、バリン １ｇ、ロイシン １ｇ、イソロイシン １ｇ、ゲルアップＳＡ３Ｃ ０．２ｇ、ゲルアップＫ−Ｓ ０．１ｇ、トレハロース １２ｇ、デンプン
２ｇ、水 ６０．７ｇを８０℃の温浴で溶解させる。７０℃に冷却後に１％カードラン分散液 ２０ｍＬを加えてさらに撹拌し、パウチに充填した。１００℃、２０分間ボイル殺菌を行い、ゼリー剤とした。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】細菌感染モデルにおける血清キノリン酸濃度と自発運動量の相関関係
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗物質を有効成分として含有することを特徴とする疲労の予防・治療組成物。
【請求項２】
ＮＭＤＡ受容体拮抗物質が、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するメマンチン、ジゾシルピン（ＭＫ８０１）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル、３-（２-カルボキシピペラジン-４-イル）プロピル-１-リン酸（ＣＰＰ）、ケタミン、チレタミン、ブジピン、フルピルチン、Ｎ-［１-（２-チエニル）シクロヘキシル］ピペリジン（ＴＣＰ）、Ｄ（−）-２-アミノ-５-ホスホノバレリン酸（Ｄ-ＡＰ５）、Ｄ（−）-２-アミノ-７-ホスホノヘプタン酸（Ｄ-ＡＰ７）、キヌレン酸、６-ヒドロキシキヌレン酸、７-クロロキヌレン酸、テアニン（Ｌ‐グルタミン酸‐γ‐エチルアミド）などの化合物または該化合物の誘導体からなる群より１種または２種以上選択される請求項１に記載の疲労の予防・治療組成物。
【請求項３】
ＮＭＤＡ受容体拮抗物質が、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するイチョウ葉、緑茶、紅茶などからの抽出物からなる群より１種または２種以上選択される請求項１に記載の疲労の予防・治療組成物。
【請求項４】
請求項１〜３記載の疲労の予防・治療組成物を配合した食品もしくは飲料。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のいずれかを用いる疲労の予防・治療方法。
【請求項１】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗物質を有効成分として含有することを特徴とする疲労の予防・治療組成物。
【請求項２】
ＮＭＤＡ受容体拮抗物質が、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するメマンチン、ジゾシルピン（ＭＫ８０１）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル、３-（２-カルボキシピペラジン-４-イル）プロピル-１-リン酸（ＣＰＰ）、ケタミン、チレタミン、ブジピン、フルピルチン、Ｎ-［１-（２-チエニル）シクロヘキシル］ピペリジン（ＴＣＰ）、Ｄ（−）-２-アミノ-５-ホスホノバレリン酸（Ｄ-ＡＰ５）、Ｄ（−）-２-アミノ-７-ホスホノヘプタン酸（Ｄ-ＡＰ７）、キヌレン酸、６-ヒドロキシキヌレン酸、７-クロロキヌレン酸、テアニン（Ｌ‐グルタミン酸‐γ‐エチルアミド）などの化合物または該化合物の誘導体からなる群より１種または２種以上選択される請求項１に記載の疲労の予防・治療組成物。
【請求項３】
ＮＭＤＡ受容体拮抗物質が、ＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するイチョウ葉、緑茶、紅茶などからの抽出物からなる群より１種または２種以上選択される請求項１に記載の疲労の予防・治療組成物。
【請求項４】
請求項１〜３記載の疲労の予防・治療組成物を配合した食品もしくは飲料。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のいずれかを用いる疲労の予防・治療方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−２４６５０７（Ｐ２００７−２４６５０７Ａ）
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４９４４（Ｐ２００７−２４９４４）
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（３０６０１８３４３）クラシエ製薬株式会社 (32)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（３０６０１８３４３）クラシエ製薬株式会社 (32)
【Ｆターム（参考）】
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