疾患の検出方法
【課題】Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとして、癌又は腺腫を簡便に検出する方法の提供。
【解決手段】血清中のＣ３ａ濃度を疾患マーカーとする方法であって、前記疾患が癌又は腺腫であり、（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、（ｂ）工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）において得られた測定値を基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には罹患していないと判断する工程とを有し、前記血液試料が採血された時点から、工程（ｂ）におけるＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、基準時間範囲内の時間である疾患の検出方法。
【解決手段】血清中のＣ３ａ濃度を疾患マーカーとする方法であって、前記疾患が癌又は腺腫であり、（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、（ｂ）工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）において得られた測定値を基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には罹患していないと判断する工程とを有し、前記血液試料が採血された時点から、工程（ｂ）におけるＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、基準時間範囲内の時間である疾患の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中のＣ３ａ濃度を疾患マーカーとして、疾患を検出する方法に関する。より具体的には、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとして、癌又は腺腫を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ３ａは、血中の体液性免疫成分である補体の一種であり、Ｃ５ａとともに、アナフィラトキシンと呼ばれている分子量９０００、７８アミノ酸からなるタンパク質である。１９７５年にＴｏｎｙ Ｅ．らによってクローニングされた分子であり、感染症や炎症性疾患に罹患することにより、血中濃度が上昇することが報告されている。なお、血液中において、Ｃ末端のアルギニンが欠損した状態（Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ）で最も安定に存在することが報告されている。
【０００３】
また、近年、プロテオミクス技術の進歩により、血中の微量タンパク質の網羅的な解析が可能となり、癌検体（癌患者から採取された検体）と健常検体（健常者から採取された検体）とを用いた、血液検体での飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ；Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)を用いた網羅的なプロテオミクス解析により、特定の臓器の癌では、血中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が健常者と比較して高いことがわかってきた。例えば、大腸癌については、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が健常人群と比較して大腸癌群で上昇していることが報告されており、一定の濃度のカットオフ値を設定することで大腸癌のスクリーニングができる可能性が示されている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照。）。
【０００４】
Ｃ３ａは、巨大な補体成分のＣ３から、古典経路（Ｃ１酵素）又はレクチン経路（ＭＡＳＰ酵素）によって、それぞれ切り出されて産生される、Ｃ３タンパクのαへリックスの一部であるが、Ｃ３からＣ３ａを切り出すＣ１酵素やＭＡＳＰ酵素等のプロテアーゼは、血液中にも存在する。このため、採血後に、血液試料中のＣ３からＣ３ａが生じ、さらにすぐさま内因性の血清カルボキシペプチダーゼＮによりＣ末端のアルギニンが除去されＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが生じるため、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量が時間経過に伴い増大する傾向がある。例えば、血液試料中のＣ３切断後産物量は、採血後に比べて、３７℃で一日経過後には数倍になり、このような採血後保存による血液試料中のＣ３切断後産物量の増大は、ＥＤＴＡやクエン酸等のプロテアーゼ阻害剤を添加した場合であっても抑制されないが、一方で、４℃保存であれば、Ｃ３切断後産物濃度の上昇は抑制されること等が報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。また、室温保存された血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇は、個体差が大きい、という特徴もある。実際に、本発明者らの実験によれば、健常者から採取された血液試料同士であっても、室温で４時間保存した場合の血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度は、保存前の濃度と比べて、活性が高い人の場合では２．５倍、活性の低いヒトの場合には１倍（ほとんど上昇しない）、という結果が得られた。
【０００５】
このため、従来は、血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するための血液試料は、採血後のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇を抑制し得るような方法で保存・調製すべきと考えられている。例えば、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量を測定するための市販のキットの１つであるＱｕｉｄｅｌ社製のＣ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔでは、添付のプロトコールにおいて、ＥＤＴＡ２Ｎａ入りの真空採血管に採血し、迅速に４℃、２０００×ｇ、１５分間の条件で遠心分離し、上清として得られる血漿成分を、すぐに測定に供することが好ましく、直ぐに測定しない場合には、当該血漿成分を、４時間以内であれば氷中で、それより長時間であれば−７０℃で保存することを推奨している。このように、採血後速やかにＥＤＴＡ２Ｎａを添加し、低温で保存することにより、生体内での血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度をより精度よく測定できるようにしている。
【０００６】
その他、セリンプロテアーゼの阻害剤であるＦｕｔｈａｎ（メシル酸ナファモスタット）とＥＤＴＡとを採血後の血液試料に添加することによって、室温保存の血液試料であってもＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇を抑制し得ることが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。また、Ｆｕｔｈａｎ／ＥＤＴＡ入りの真空採血管（テルモヨーロッパ社製等）も市販されており、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）等の市販の測定キットの中には、測定に供される血液試料の調製に際して、Ｆｕｔｈａｎ／ＥＤＴＡ入りの真空採血管を用いることを推奨しているものもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５０９４０９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ヘイバーマン（Habermann）、外１６名、ガストロエンテロロジー（GASTROENTEROLOGY）、２００６年、第１３１巻、１０２０〜１０２９ページ。
【０００９】
【非特許文献２】モルネス（Mollnes）、外２名、クリニカル・エクスペリメンタル・イミュノロジー（Clinical and Experimental Immunology）、１９８８年、第７３巻、４８４〜４８８ページ。
【００１０】
【非特許文献３】フェイファー（Pfeifer）、外２名、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、１９９９年、第４５巻第８号、１１９０〜１１９９ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一方で、大腸癌等の特定の疾患の罹患者群において、血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が、健常者群よりも顕著に高いことが報告されている前記特許文献１や非特許文献１では、血漿中ではなく、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を比較している。このため、単に血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するのではなく、癌等の疾患の検出の指標とする場合には、血漿ではなく血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定することが好ましい。
しかしながら、強力なセリンプロテアーゼ阻害剤であるＦｕｔｈａｎやキレート剤であるＥＤＴＡは、Ｃ３分解酵素と同様に血液凝固因子も阻害するため、Ｆｕｔｈａｎ及び／又はＥＤＴＡ入りの真空採血管を用いた場合には、採血後の血液は凝固反応を伴わずに血漿となり、凝固反応後の血清を得ることはできなかった。なお、真空採血管への試薬の添加により血清が得られ、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇も抑制できる試薬はまだ存在しない。
【００１２】
これに対して、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定している前記非特許文献１では、血清用チューブに採血後、氷中に２時間以内放置することにより、血液凝固反応を進行させた後、分離した血清を測定時まで−２０℃で保存している。血液凝固反応を氷中で行うことにより、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇を抑制し得るためである。
【００１３】
ところが、実際の臨床現場では、採血後の血液試料は、一般に室温に保管され、すぐに冷却保存することは難しい。また、採血から血液凝固反応を経て遠心分離されるまでの時間も、３０分間〜４時間と幅があり、検体間であってもそのときの状況によってさまざまである。さらに、一般に、血液検体が遠心分離された後には、上清の血漿／血清成分を別のチューブに移し変えることはなされず、沈殿部の血球成分と分離されることなく自動分析機に設置されるが、臨床検査では多数の検体を処理するため、自動分析機に設置された後も、最初の検体と最後の検体では１時間程度の解析までのタイムラグが生じてしまう場合が多い。そのため、通常の臨床検査の運用に基づいて、採取後調製された血清を用いてＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定すると、検体ごとの採血後の血液中でのＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇の程度が不明であり、検体同士の正確なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の比較ができず、癌等の疾患を、十分な精度特異度で検出することができない。
一方で、従来法のように、個々の検体に対して、冷却や一定処理時間内かつ迅速な処理を必要とする場合には、操作が煩雑となる上に、臨床検査現場ではイレギュラーな扱いとなる。このため、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が、臨床検査マーカーとして普及することが難しくなる。
【００１４】
このように、血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、血中に存在するＣ３切断酵素の影響により、室温保存することによって上昇することが知られており、このため、各種阻害剤で処理した血漿での測定が一般である。一方で、迅速かつ冷却処理して得られた血清中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定による癌検出の可能性が示唆されている。
本発明は、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとした場合に、個々の検体に対して冷却や一定処理時間内かつ迅速な処理を必要とすることなく、臨床検査現場の運用に耐えうる簡便なフローにより、癌又は腺腫を高感度・高特異度で検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、癌患者から採取された血液試料及び健常者から採取された血液試料を、それぞれ室温保存し、得られた血清成分中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の時間経過を測定したところ、室温保存時間がある一定時間以上かつ一定時間以内であれば、癌患者から採取された血液試料と健常者から採取された血液試料とを、非常に高い感度・特異度で識別し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、
（１） 血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する方法であって、前記疾患が癌又は腺腫であり、（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する工程と、を有し、前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であることを特徴とする疾患の検出方法、
（２） １又は２以上の疾患罹患者、及び１又は２以上の対照者から採血された血液試料のそれぞれに対して、（ｐ１）血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、（ｐ２）前記工程（ｐ１）において、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の経時的変化を測定する工程と、（ｐ３）前記工程（ｐ２）において得られた測定値に基づき、各血液試料に対して、室温における保存時間と、血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度との関係をプロットしたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットを作成する工程と、を行い、前記工程（ｐ３）において作成された各血液試料のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットに基づいて、疾患罹患者から採血された血液試料と対照者から採血された血液試料とを予め設定された感度及び特異度で識別可能なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を、前記工程（ｃ）における基準値とし、疾患罹患者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以上であり、対照者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以下である保存時間の範囲を、前記基準時間範囲とすることを特徴とする前記（１）記載の疾患の検出方法、
（３） 前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、前記基準時間範囲内の時間ではない血液試料に対して、同一被験者から採血された血液試料に対して再度前記工程（ａ）〜（ｃ）を行うことを特徴とする前記（１）又は（２）記載の疾患の検出方法、
（４） 前記基準時間範囲が、１時間以上６時間以内であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の疾患の検出方法、
（５） 前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間の管理を、採血がなされた時間及びＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定が開始された時間を記録することにより行うことを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれか記載の疾患の検出方法、
（６） 時間の記録が、採血時間及び測定時間を、採血管へ直接記載する方法、採血管を番号化して記録する方法、採血管へ付加されたＩＣチップに記録する方法、及び採血管へ付加されたバーコードを用いて記録する方法からなる群より選択される１の方法により行うことを特徴とする前記（５）記載の疾患の検出方法、
（７） Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定を、免疫学的手法により行うことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の疾患の検出方法、
（８） 前記疾患が、大腸癌又は大腸腺腫であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載の疾患の検出方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の疾患の検出方法を用いることにより、被験者から採血された血液試料の血清成分中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を、臨床検査現場の運用に耐えうる簡便なフローにより測定し、当該被験者が癌又は腺腫に罹患しているか否かを、高感度・高特異度で検出することができる。すなわち、本発明の疾患の検出方法においては、血液試料が採血された時点から、当該血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、当該血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であれば、癌又は腺腫を高感度・高特異度で検出することができる。このため、従来法では、一律にＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度上昇を抑制するために、冷却や一定処理時間内かつ迅速な処理が必要とされていたが、この基準時間範囲を設定することにより、当該基準時間範囲内であれば、室温における保存時間や測定開始までの時間に、検体ごとの時間差があってもよく、通常の臨床検査室での運用にて運用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１において、疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【図２】実施例１において、対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【図３】比較例１において、疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【図４】比較例１において、対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の疾患の検出方法は、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ（以下、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ）濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する方法である。より具体的には、被験者から採血された血液試料を室温保存することにより凝固させ、血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する方法であって、採血時点からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時点までにおける、室温での保存時間の時間長が予め定めた基準時間範囲内の時間である検体を用いて、癌又は腺腫（以下、癌等ということがある。）を検出する方法である。
【００２０】
血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を指標として、癌等の疾患を検出する場合に、採血直後の血液試料や、採血後に血液凝固させることなく４℃以下で保存した血液試料を用いた場合よりも、採血後一定時間室温で保存し、血液凝固（凝血）反応を進行させた血液試料を用いることにより、癌等の疾患を高感度及び高特異度で検出できる。この理由は明らかではないが、下記のように推察される。
本発明者らは、血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、血液凝固反応に伴い１００倍以上上昇することを、新たに見出した。これは、血液中でのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの産生は、Ｃ３切断酵素と同じセリンプロテアーゼである血液凝固因子の活性化に伴って起こるためと考えられる。一方、消化器系の癌では、生体内での血液凝固が促進しているという報告もある。これらの知見より、癌等の罹患者では、健常者（対照者）と比較して血液凝固活性が高く、このため、血液凝固反応を起こすことにより、疾患罹患者の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度と、対照者の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度との差が大きくなり、この結果、癌等の疾患を高感度及び高特異度で検出し得ると推察される。
【００２１】
本発明の疾患の検出方法によって検出される疾患は、癌又は腺腫である。本発明において、癌には悪性腫瘍も含まれる。例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、膵癌、食道癌、胃癌等が挙げられる。本発明においては、大腸癌又は大腸腺腫を検出する方法であることが好ましい。
【００２２】
具体的には、本発明の疾患の検出方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を有し、下記血液試料が採血された時点から、下記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であることを特徴とする。
（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程。
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する工程。
（ｃ）前記工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する工程。
【００２３】
なお、本発明の疾患の検出方法において、血液凝固反応を行う温度は、室温であればよく、特段の温度制御環境下で行う必要はないが、１０℃〜３７℃であることが好ましく、１５〜３０℃であることがより好ましく、２０〜２８℃であることがさらに好ましい。これらの温度範囲であれば、血液凝固反応と血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの産生の両方が十分に進行し得るためである。
【００２４】
以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ａ）として、被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる。具体的には、血液試料を採血管に採取した後、当該採血管をそのまま室温で保存する。
【００２５】
血液試料を採取する採血管としては、血液凝固反応や、Ｃ３からのＣ３ａ産生反応に対する阻害物質を含まない採血管であれば、特に限定されるものではなく、血清を取得する場合に一般的に用いられている採血管を使用することができる。例えば、真空採血管内に凝固促進剤としてシリカやガラス微粒子を添加した血清取得用の真空採血管を用いた場合には、当該真空採血管に静脈血を採血し、数回転倒混和した後、室温で保存することにより、血液が凝固し、血清成分が得られる。また、トロンビン等がさらに添加された高速凝血用の採血管を使用した場合には、一般的に、シリカやガラス微粒子のみを添加した血清取得用の真空採血管を使用した場合よりも、血液試料をより短時間で凝固させることができる。
【００２６】
次に、工程（ｂ）として、凝固させた血液試料の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する。測定に供される血清成分は、凝固させた血液試料を遠心分離処理した後に分取したものであってもよく、遠心分離処理を省略し、凝固させた血液試料の上清を分取したものであってもよい。
【００２７】
また、工程（ａ）の後、工程（ｂ）を行うまでに長時間を要する場合には、工程（ａ）において得られた凝固させた血液試料を、血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定を行うまでの間冷蔵保存しておいてもよい。また、凝固させた血液試料を遠心分離処理し、分取した血清成分を冷蔵保存又は冷凍（凍結）保存しておいたものを、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定に用いてもよい。
【００２８】
血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する方法は、溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定し得る方法であれば、特に限定されるものではなく、公知の手法の中から適宜選択して使用することができる。本発明の疾患の検出方法においては、Ｃ３ａのＣ末端アルギニンを切断してできた切断面（ネオエピトープ）を抗原とする抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を使用した免疫学的手法を用いることが好ましい。このような免疫学的手法として、例えば、ＥＬＩＡ法やＥＩＡ法等がある（例えば、The Journal of Immunology、１９８８年、第１４１巻、５５３〜５５８ページ参照。）。また、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対してＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合的に結合する人工物質を用いた競合的免疫的測定法であってもよい。その他、Ｈｕｍａｎ Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）や、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ａ ｄｅｓＡｒｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＩＡキット（Ａｓｓａｙｄｅｓｉｇｎ社製）等の市販のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ測定用キットを用いてもよい。
【００２９】
その後、工程（ｃ）として、工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する。なお、本発明において、基準値とは、室温における血液凝固反応により血液試料から得られる血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を指標とした場合に、癌等の疾患罹患者から採取された血液試料（以下、「疾患検体」という。）と対照者から採取された血液試料（以下、「対照検体」という。）とを、予め定められた感度及び特異度で識別することが可能な一定のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を意味する。
【００３０】
本発明及び本願明細書において、感度とは、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した全疾患検体（疾患罹患者群から採血された血液試料）のうち、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度がある一定の基準値を超えた陽性者数の割合を意味する。また、特異度とは、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した全対照検体（対照者群から採血された血液試料）のうち、ある一定の基準値を下回った陰性者の数の割合を意味する。
【００３１】
また、本発明及び本願明細書において、対照者とは、癌又は腺腫に罹患していない者を意味する。すなわち、対照者は、健常者であることが好ましいが、癌又は腺腫以外の他の疾患に罹患している者であってもよい。
【００３２】
本発明の疾患の検出方法において、血液試料が採血された時点から、工程（ｂ）における当該血液試料の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定開始時点までの、当該血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間（以下、「室温存在時間」という。）とは、血液試料中、又は血液試料から血清成分が分離された場合にはその分離された血清成分中において、Ｃ３から新たにＣ３ａが産生され得る時間である。したがって、採血からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定開始までの全操作を室温で行った場合には、血液試料が採血された時点からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時点までが、室温存在時間である。一方、当該室温存在時間には、室温における血液凝固反応後の血球成分と血清成分に分離した血液試料を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定するまでの間冷蔵保存した場合の当該冷蔵保存時間は含まれない。また、血液凝固反応後の血液試料から血清成分を分離回収するために遠心分離処理を行う場合であって、当該遠心分離処理を室温で行った場合における当該遠心分離処理時間は室温存在時間に含まれるが、４℃等の低温条件下で行った場合における当該遠心分離処理時間は含まれない。同様に、分離回収された血清成分を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定するまでの間冷蔵又は凍結保存した場合には、当該冷蔵・凍結保存時間は室温存在時間に含まれない。その他、一度に多数の検体を測定する場合等のように、血液凝固反応後の血液試料から分離回収した後、凍結保存された血清成分を、再融解後にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時まで室温で保存する場合には、この融解後の室温における保存時間も、室温存在時間に含まれる。
【００３３】
室温存在時間が短すぎる場合には、採決後の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の上昇が不十分となり、疾患検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度と、対照検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度との差が小さく、疾患検出の感度が低くなる。逆に、室温存在時間が長すぎる場合には、採決後の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の上昇が過剰となり、やはり、疾患検体と対照検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の差が小さく、疾患検出の特異度が低くなる。
【００３４】
そこで、本発明の疾患の検出方法においては、室温存在時間を、予め設定された基準時間範囲内の時間とする。具体的には、室温存在時間を、室温における血液凝固反応により血液試料から得られる血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を指標とした場合に、疾患検体と対照検体とを、予め定められた感度及び特異度で識別することが可能な一定の時間範囲（基準時間範囲）内の時間とする。室温存在時間を、予め定めた感度特異度をとる基準時間範囲内の時間に設定することにより、例えば、凝血時間（血液凝固反応時間）が短すぎてＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が十分上昇せず、癌等の疾患を検出できないおそれや、室温における保存時間が長すぎて、対照検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が上昇しすぎ、対照検体と疾患検体との識別ができないおそれを、顕著に低減することができ、感度特異度の高い検出を行うことができる。
【００３５】
本発明の疾患の検出方法においては、基準値及び基準時間範囲は、疾患を検出する前に、予め設定しておく。当該基準値及び基準時間範囲は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定方法の種類、疾患の種類、疾患検出時の室温等を考慮して、適宜決定することができる。本発明における基準時間範囲としては、例えば、１〜６時間であることが好ましく、１〜４時間であることがより好ましく、１〜２時間であることがさらに好ましい。
【００３６】
疾患検体及び対照検体の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の室温保存における時間経過を測定することにより、予め定めた感度特異度で疾患検体と対照検体とを識別可能な基準値と、保存時間の範囲を算出することができる。具体的には、下記の方法により、基準値及び基準時間範囲を予め設定することができる。
【００３７】
まず、従来法によって特定の臓器の癌又は腺腫と診断されたヒトを疾患罹患者、当該臓器に癌がないと診断されたヒトを対照者とし、１又は２以上の疾患罹患者（疾患罹患者群）から採血された血液試料（疾患検体）、及び１又は２以上の対照者（対照者群）から採血された血液試料（対照検体）を用意する。例えば、大腸癌又は大腸腺腫を検出する場合の基準値及び基準時間範囲を設定するためには、下部内視鏡にて大腸癌および大腸進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｄｅｎｏｍａ）の存在があると診断されたヒトを疾患罹患者、同じく下部内視鏡にてそれらの腫瘍がないと診断されたヒトを対照者とし、それぞれから採血し、血液試料を用意する。基準値及び基準時間範囲を設定するための疾患検体及び対照検体は、それぞれ、２検体以上であることが好ましく、１０検体以上であることがより好ましく、３０検体以上であることがさらに好ましい。なお、疾患検体数と対照検体数を揃える必要はない。
【００３８】
得られた疾患検体及び対照検体は、採血後直ちに室温で保存する。室温保存により、血液凝固反応が進行し、血清成分が得られる。そこで、これらの室温保存されている各検体の血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の経時的変化を測定する。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の経時的変化は、複数の保存時間経過後のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することにより調べることができる。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定するタイムポイント（室温保存開始からの経過時点）としては、特に限定されるものではなく、測定方法や疾患の種類等を考慮して適宜決定することができる。例えば、採血後３０分から、８時間までの間の複数のタイムポイント、さらに好ましくは、採血後３０分から、３０分おきに６時間までの連続したタイムポイントを取得することが好ましい。
【００３９】
各検体は、測定するタイムポイント数に応じて、予め、複数本の採血管に採血されたものを用いることが好ましい。また、室温保存時間が０時間のタイムポイント（採血直後）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することも好ましい。なお、採血直後のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、ＥＤＴＡ等の血液凝固阻害剤を添加した血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することによっても得ることができる。
【００４０】
各タイムポイントにおける各検体の血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定は、前記と同様に行うことができる。測定に供される血清成分は、例えば、各タイムポイントにおいて、各検体を遠心分離処理して上清を回収することにより血清成分を得ることができる。回収された各タイムポイントの血清成分は、回収後速やかにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定を行ってもよく、回収後に冷蔵保存又は凍結保存し、全てのタイムポイントにおける血清成分を回収した後、必要に応じて再融解を行った後速やかにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定を行ってもよい。
【００４１】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定の結果得られた測定値に基づき、各検体に対して、室温保存時間と血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度との関係をプロットしたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを作成する。疾患検体群と対照検体群とで、前記Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを比較し、基準値及び基準時間範囲を設定する。具体的には、疾患検体群と対照検体群とを予め設定された感度及び特異度で識別可能なＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を基準値とし、疾患検体群の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が当該基準値以上であり、対照検体群の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が当該基準値以下である保存時間の範囲を基準時間範囲とする。
【００４２】
なお、血液凝固反応やＣ３切断反応は、酵素反応であり、一般的に温度の影響を受けやすい。このため、工程（ａ）における室温と、工程（ｐ１）における室温は、ほぼ同定度（平均温度で±５℃）であることが好ましい。すなわち、本発明の疾患の検出方法においては、検出を行うたびに基準値等を設定する必要はなく、基準値等を設定したときの室温と、被験者から採血した血液試料に対して、疾患の検出を行うとき（すなわち、工程（ａ）を行うとき）の室温とが、ほぼ同程度の温度である場合には、既に設定した基準値等をそのまま使用することができる。一方、季節変動等により、既存の基準値等を設定したときの室温と、被験者から採血した血液試料に対して疾患の検出を行うときの室温とに、あまりに温度差がある場合には、新たに基準値等を設定しなおすことが好ましい。
【００４３】
本発明の疾患の検出方法においては、予め、疾患罹患者から採取された血液と対照者から採取された血液とにおいて、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の時間変化を測定しておく等により、予め感度特異度を保つことが可能な時間範囲を設定し、各血液試料の室温存在時間が当該時間範囲内の任意の時間となるように検査を行うことができる。このため、本発明の疾患の検出方法は、多数の検体を高い精度で処理することが要求される臨床検査に特に好適な方法である。
【００４４】
また、本発明の疾患の検出方法においては、室温存在時間が、予め設定された基準時間範囲の時間ではない血液試料に対しては、検出結果が信頼できないと判断することができる。この場合には、再度同一被験者から採血し、得られた血液試料に対して検査を行うことも好ましい。このように、採血から凝固、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定までの時間をトレースし、予め設定された基準時間範囲を超えた検体については検出結果を排除することにより、疾患の検出における感度特異度を保証することができる。
【００４５】
各血液試料の室温存在時間は、各工程を行った時間を記録することにより、基準時間範囲内の時間となるように管理することができる。具体的には、血液試料が採血された時間、及びＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定が開始された時間を記録しておくことが好ましい。本発明において、血液試料が採血された時点から、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定までの工程を全て室温で行う場合には、採血時からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時までの時間が室温存在時間となることから、採血時点と測定開始時点のみを記録しておくことにより、これらの記録された時間に基づき、各血液試料の室温存在時間を簡便に管理することができる。凝固反応後の血液試料を冷蔵保存した場合や、遠心分離後に回収した血清成分を冷蔵・凍結保存した場合には、これらの処理の開始時点と終了時点の時間も記録しておくことにより、室温存在時間を管理することができる。
【００４６】
血液試料が採血された時間等の記録は、一般的に検体の処理日時等をトレースするために用いられる方法の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、採血管に採血時間や冷蔵保存時間等を直接記載したり、血液試料から分離した血清成分を回収した血清用容器に冷蔵・凍結時間や測定開始時間等を直接記載してもよい。また、採血管や血清用容器を番号化したり、採血管や血清用容器に付加させたバーコードを用いて、各採血管等に対して採血や冷蔵・凍結保存、測定等の操作を行った時間を記録してもよい。その他、採血管等にＩＣチップを付加させ、該ＩＣチップに各操作を行った時間を入力することによっても、室温存在時間を管理することができる。
【００４７】
また、採血後の血液試料中のＣ３切断活性（Ｃ３ａ産生活性）を測定することにより、間接的に室温存在時間を見積もることができる。例えば、Ｃ３からＣ３ａを産生する際に機能するＣ３切断酵素によって、Ｃ３ａと同様に切断されるペプチドフラグメントを準備しておく。当該ペプチドフラグメントとしては、例えば、Ｃ３のフラグメントであって、Ｃ３切断酵素による切断部位を含むペプチドフラグメント等が挙げられる。予め一定量の当該ペプチドフラグメントを添加させておいた採血管に採血された血液試料を室温で保存すると、血液試料中のＣ３切断酵素により、当該ペプチドフラグメントが切断されて切断物が生成される。つまり、生成された切断物量は、血液試料中のＣ３切断活性に依存するため、血液試料中で新たに産生されるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量と相関する。このため、室温保存された血液試料の血清成分中の当該切断物量を指標として、当該血液試料の室温存在時間が基準時間範囲内か否かを判断することができる。
【００４８】
具体的には、基準値や基準時間範囲を設定する場合と同様にして、疾患検体と対照検体に対して、血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定とともに、切断物量を測定し、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットに加えて、室温保存時間と血清成分の切断物量との関係をプロットした切断物量時間経過プロットを作成する。当該切断物の量は、当該切断物を抗原として作成した抗体との結合反応を利用した免疫的なアッセイによって検出することができる。これらのプロットから、前述したように基準値や基準時間範囲を設定し、当該基準時間範囲における切断物量の時間変化から、室温における保存時間が、当該基準時間範囲であることが予測可能な切断物量の範囲を算出する。血清成分中の切断物量が、この算出された範囲を超えた血液試料については、室温存在時間が基準時間範囲を超えているものと判定される。つまり、各血液試料に対して、採血時間等を記録せず、室温存在時間を測定していなかった場合でも、このようなペプチドフラグメントを予め採血管に添加しておくことにより、間接的に室温存在時間を推定し、検出結果の信頼性を判断することができる。また、切断物の量や濃度は、免疫学的方法で測定することができるため、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと同時に同一アッセイ内において測定することも可能であり、別アッセイ内において測定することもできる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［実施例１］
＜基準値及び基準時間範囲の設定＞
大腸癌患者１０名及び健常者１０名から採血を行い、疾患検体１０検体（Ｐ１〜Ｐ１０）及び対照検体１０検体（Ｃ１〜Ｃ１０）を得た。１検体に対し、６本の採血管に採血した。この６本の採血管のうち、１本はＥＤＴＡ２Ｎａが予め添加された真空採血管とし、残りの５本は凝血促進剤が予め添加された真空採血管とした。なお、真空採血管には、テルモ社製のベノジェクトIIを用い、かつ、採血時点の時間を、各採血管にそれぞれ記載した。
各検体のうち、ＥＤＴＡ２Ｎａ含有採血管については、採血後直ちに４℃で遠心分離処理を行い、分離回収した上清（血漿）を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定時まで凍結保存した。
残りの凝血促進剤含有採血管については、採血後そのまま室温で、保存時間が０．５時間、１時間、２時間、４時間、又は６時間となるように保存した後、室温で遠心分離処理を行い、分離回収した上清（血清）を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定時までそれぞれ凍結保存した。
各検体の血漿及び血清中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を、Ｃ３ａ ＥＩＡ キット（Ｑｕｉｄｅｌ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って測定した。より詳しくは、凍結保存された各検体の血漿及び血清を再融解し、これらを希釈して、ＥＬＩＳＡプレートにて測定を行った。測定結果を表１及び表２に示す。また、測定結果に基づき、各検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを作成した。図１は疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図であり、図２は対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】
この結果、基準値を７０００ｎｇ／ｍｌとした場合に、血液試料の室温保存時間が１時間以上４時間以内の範囲であれば、疾患検体と対照検体とを、感度９０％、特異度１００％で識別できることがわかった。また、室温における保存時間が４時間を越えた場合には、特異度が最小で７０％まで下がることもわかった。なお、図１及び図２中、太実線は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が７０００ｎｇ／ｍｌを示している。
一方、ＥＤＴＡ２Ｎａ含有採血管から回収された血漿検体では、表１の室温保存時間０ｈに記載の結果からも明らかであるように、疾患検体と対照検体におけるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度差が小さく、例えば、基準値を対照検体における最高値２４０ｎｇ／ｍｌ（Ｃ９）とした場合に、感度７０％、特異度９０％となった。これらの結果から、血漿検体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する従来法よりも、本発明の疾患の検出方法を用いたほうが、より高い性能で癌や腺腫を検出し得ることが明らかである。
【００５４】
＜被験者検体を用いた大腸癌の検出＞
上記で設定した基準値及び基準時間範囲に基づいて、別の大腸癌患者２名及び健常者２名から採血された新たな疾患検体２検体（Ｐ１１及びＰ１２）及び対照検体２検体（Ｃ１１及びＣ１２）を評価した。
具体的には、まず、各被験者から凝血促進剤が予め添加された真空採血管に採血し、それぞれの採血時間を採血管に記載した。その後、通常の臨床検査室のフローにのっとり、遠心分離をした後、上清の血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を上記と同様にしてＥＬＩＳＡキットにて定量した。なお、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時までの操作は、全て室温で行われた。各検体に対する、採血時間、測定開始時間、室温存在時間（測定開始時間から採血時間までの時間）、及び血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を表３に示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
この結果、全ての検体の室温存在時間は１〜４時間以内であり、基準時間範囲内であり、検出結果は信頼できると判断された。また、Ｐ１１及びＰ１２検体では、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が基準値（７０００ｎｇ／ｍｌ）以上であり、大腸癌であると判断された。一方、Ｃ１１及びＣ１２検体ではＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が基準値以下であり、大腸癌に罹患していないと判断された。つまり、本実施例における検出結果と、従来の他の診断方法による診断結果が一致し、したがって、本発明の疾患の検出方法により、他の診断方法と同様に、大腸癌等を検出し得ることが確認された。
また、これらの結果から、本発明の疾患の検出方法により、迅速な検体処理や、冷却等の煩雑な操作を行うことなく、通常の室温保存での臨床検査室のフローで検査可能であることがわかった。
【００５７】
［比較例１］
採血後の検体を、室温ではなく４℃で保存した場合の、各検体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の経時的変化を測定した。具体的には、実施例１において、基準値及び基準時間範囲の設定の際に用いたものと同じ検体｛疾患検体１０検体（Ｐ１〜Ｐ１０）及び対照検体１０検体（Ｃ１〜Ｃ１０）｝に対して、採血後の保存を４℃で行った以外は、実施例１と同様にして、血清又は血漿中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した。
測定結果を表４及び表５に示す。また、測定結果に基づき、各検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを作成した。図３は疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図であり、図４は対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。いずれの検体においても、室温保存した場合よりも、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は低く、濃度の上昇は緩やかであった。これは、低温の保存により、Ｃ３の切断酵素の活性が抑制され、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ産生スピードが抑えられたためと思われる。
また、疾患検体と対照検体とのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の差が、室温保存した場合よりも小さくなることが確認された。測定結果に基づき、カットオフ値（基準値）を４４００ｎｇ／ｍｌとした場合に、血液試料の４℃保存時間が４時間以上６時間以内の範囲で疾患検体と対照検体とを識別すると、感度８０％、特異度９５％となり、いずれも実施例１と比べて低下した。また、疾患検体、対照検体で値が近接した検体が多く、測定精度によっては、判定が変わるグレーゾーンの検体の数が増えた。
これらの結果から、採血後の血液試料を室温で保存し、当該血液試料中のＣ３切断酵素活性を一定時間働かせる本発明の疾患の検出方法のほうが、Ｃ３切断酵素活性を抑制させる従来法よりも、疾患検体と対照検体とを精度よく識別し得ることが明らかである。
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の疾患の検出方法を用いることにより、臨床検査現場の運用に耐えうる簡便なフローにより、癌又は腺腫を所望の感度・特異度で検出することができるため、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中のＣ３ａ濃度を疾患マーカーとして、疾患を検出する方法に関する。より具体的には、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとして、癌又は腺腫を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ３ａは、血中の体液性免疫成分である補体の一種であり、Ｃ５ａとともに、アナフィラトキシンと呼ばれている分子量９０００、７８アミノ酸からなるタンパク質である。１９７５年にＴｏｎｙ Ｅ．らによってクローニングされた分子であり、感染症や炎症性疾患に罹患することにより、血中濃度が上昇することが報告されている。なお、血液中において、Ｃ末端のアルギニンが欠損した状態（Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ）で最も安定に存在することが報告されている。
【０００３】
また、近年、プロテオミクス技術の進歩により、血中の微量タンパク質の網羅的な解析が可能となり、癌検体（癌患者から採取された検体）と健常検体（健常者から採取された検体）とを用いた、血液検体での飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ；Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)を用いた網羅的なプロテオミクス解析により、特定の臓器の癌では、血中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が健常者と比較して高いことがわかってきた。例えば、大腸癌については、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が健常人群と比較して大腸癌群で上昇していることが報告されており、一定の濃度のカットオフ値を設定することで大腸癌のスクリーニングができる可能性が示されている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照。）。
【０００４】
Ｃ３ａは、巨大な補体成分のＣ３から、古典経路（Ｃ１酵素）又はレクチン経路（ＭＡＳＰ酵素）によって、それぞれ切り出されて産生される、Ｃ３タンパクのαへリックスの一部であるが、Ｃ３からＣ３ａを切り出すＣ１酵素やＭＡＳＰ酵素等のプロテアーゼは、血液中にも存在する。このため、採血後に、血液試料中のＣ３からＣ３ａが生じ、さらにすぐさま内因性の血清カルボキシペプチダーゼＮによりＣ末端のアルギニンが除去されＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが生じるため、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量が時間経過に伴い増大する傾向がある。例えば、血液試料中のＣ３切断後産物量は、採血後に比べて、３７℃で一日経過後には数倍になり、このような採血後保存による血液試料中のＣ３切断後産物量の増大は、ＥＤＴＡやクエン酸等のプロテアーゼ阻害剤を添加した場合であっても抑制されないが、一方で、４℃保存であれば、Ｃ３切断後産物濃度の上昇は抑制されること等が報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。また、室温保存された血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇は、個体差が大きい、という特徴もある。実際に、本発明者らの実験によれば、健常者から採取された血液試料同士であっても、室温で４時間保存した場合の血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度は、保存前の濃度と比べて、活性が高い人の場合では２．５倍、活性の低いヒトの場合には１倍（ほとんど上昇しない）、という結果が得られた。
【０００５】
このため、従来は、血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するための血液試料は、採血後のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇を抑制し得るような方法で保存・調製すべきと考えられている。例えば、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量を測定するための市販のキットの１つであるＱｕｉｄｅｌ社製のＣ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔでは、添付のプロトコールにおいて、ＥＤＴＡ２Ｎａ入りの真空採血管に採血し、迅速に４℃、２０００×ｇ、１５分間の条件で遠心分離し、上清として得られる血漿成分を、すぐに測定に供することが好ましく、直ぐに測定しない場合には、当該血漿成分を、４時間以内であれば氷中で、それより長時間であれば−７０℃で保存することを推奨している。このように、採血後速やかにＥＤＴＡ２Ｎａを添加し、低温で保存することにより、生体内での血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度をより精度よく測定できるようにしている。
【０００６】
その他、セリンプロテアーゼの阻害剤であるＦｕｔｈａｎ（メシル酸ナファモスタット）とＥＤＴＡとを採血後の血液試料に添加することによって、室温保存の血液試料であってもＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇を抑制し得ることが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。また、Ｆｕｔｈａｎ／ＥＤＴＡ入りの真空採血管（テルモヨーロッパ社製等）も市販されており、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）等の市販の測定キットの中には、測定に供される血液試料の調製に際して、Ｆｕｔｈａｎ／ＥＤＴＡ入りの真空採血管を用いることを推奨しているものもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５０９４０９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ヘイバーマン（Habermann）、外１６名、ガストロエンテロロジー（GASTROENTEROLOGY）、２００６年、第１３１巻、１０２０〜１０２９ページ。
【０００９】
【非特許文献２】モルネス（Mollnes）、外２名、クリニカル・エクスペリメンタル・イミュノロジー（Clinical and Experimental Immunology）、１９８８年、第７３巻、４８４〜４８８ページ。
【００１０】
【非特許文献３】フェイファー（Pfeifer）、外２名、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、１９９９年、第４５巻第８号、１１９０〜１１９９ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一方で、大腸癌等の特定の疾患の罹患者群において、血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が、健常者群よりも顕著に高いことが報告されている前記特許文献１や非特許文献１では、血漿中ではなく、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を比較している。このため、単に血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するのではなく、癌等の疾患の検出の指標とする場合には、血漿ではなく血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定することが好ましい。
しかしながら、強力なセリンプロテアーゼ阻害剤であるＦｕｔｈａｎやキレート剤であるＥＤＴＡは、Ｃ３分解酵素と同様に血液凝固因子も阻害するため、Ｆｕｔｈａｎ及び／又はＥＤＴＡ入りの真空採血管を用いた場合には、採血後の血液は凝固反応を伴わずに血漿となり、凝固反応後の血清を得ることはできなかった。なお、真空採血管への試薬の添加により血清が得られ、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇も抑制できる試薬はまだ存在しない。
【００１２】
これに対して、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定している前記非特許文献１では、血清用チューブに採血後、氷中に２時間以内放置することにより、血液凝固反応を進行させた後、分離した血清を測定時まで−２０℃で保存している。血液凝固反応を氷中で行うことにより、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇を抑制し得るためである。
【００１３】
ところが、実際の臨床現場では、採血後の血液試料は、一般に室温に保管され、すぐに冷却保存することは難しい。また、採血から血液凝固反応を経て遠心分離されるまでの時間も、３０分間〜４時間と幅があり、検体間であってもそのときの状況によってさまざまである。さらに、一般に、血液検体が遠心分離された後には、上清の血漿／血清成分を別のチューブに移し変えることはなされず、沈殿部の血球成分と分離されることなく自動分析機に設置されるが、臨床検査では多数の検体を処理するため、自動分析機に設置された後も、最初の検体と最後の検体では１時間程度の解析までのタイムラグが生じてしまう場合が多い。そのため、通常の臨床検査の運用に基づいて、採取後調製された血清を用いてＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定すると、検体ごとの採血後の血液中でのＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の上昇の程度が不明であり、検体同士の正確なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の比較ができず、癌等の疾患を、十分な精度特異度で検出することができない。
一方で、従来法のように、個々の検体に対して、冷却や一定処理時間内かつ迅速な処理を必要とする場合には、操作が煩雑となる上に、臨床検査現場ではイレギュラーな扱いとなる。このため、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が、臨床検査マーカーとして普及することが難しくなる。
【００１４】
このように、血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、血中に存在するＣ３切断酵素の影響により、室温保存することによって上昇することが知られており、このため、各種阻害剤で処理した血漿での測定が一般である。一方で、迅速かつ冷却処理して得られた血清中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定による癌検出の可能性が示唆されている。
本発明は、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとした場合に、個々の検体に対して冷却や一定処理時間内かつ迅速な処理を必要とすることなく、臨床検査現場の運用に耐えうる簡便なフローにより、癌又は腺腫を高感度・高特異度で検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、癌患者から採取された血液試料及び健常者から採取された血液試料を、それぞれ室温保存し、得られた血清成分中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の時間経過を測定したところ、室温保存時間がある一定時間以上かつ一定時間以内であれば、癌患者から採取された血液試料と健常者から採取された血液試料とを、非常に高い感度・特異度で識別し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、
（１） 血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する方法であって、前記疾患が癌又は腺腫であり、（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する工程と、を有し、前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であることを特徴とする疾患の検出方法、
（２） １又は２以上の疾患罹患者、及び１又は２以上の対照者から採血された血液試料のそれぞれに対して、（ｐ１）血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、（ｐ２）前記工程（ｐ１）において、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の経時的変化を測定する工程と、（ｐ３）前記工程（ｐ２）において得られた測定値に基づき、各血液試料に対して、室温における保存時間と、血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度との関係をプロットしたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットを作成する工程と、を行い、前記工程（ｐ３）において作成された各血液試料のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットに基づいて、疾患罹患者から採血された血液試料と対照者から採血された血液試料とを予め設定された感度及び特異度で識別可能なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を、前記工程（ｃ）における基準値とし、疾患罹患者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以上であり、対照者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以下である保存時間の範囲を、前記基準時間範囲とすることを特徴とする前記（１）記載の疾患の検出方法、
（３） 前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、前記基準時間範囲内の時間ではない血液試料に対して、同一被験者から採血された血液試料に対して再度前記工程（ａ）〜（ｃ）を行うことを特徴とする前記（１）又は（２）記載の疾患の検出方法、
（４） 前記基準時間範囲が、１時間以上６時間以内であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の疾患の検出方法、
（５） 前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間の管理を、採血がなされた時間及びＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定が開始された時間を記録することにより行うことを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれか記載の疾患の検出方法、
（６） 時間の記録が、採血時間及び測定時間を、採血管へ直接記載する方法、採血管を番号化して記録する方法、採血管へ付加されたＩＣチップに記録する方法、及び採血管へ付加されたバーコードを用いて記録する方法からなる群より選択される１の方法により行うことを特徴とする前記（５）記載の疾患の検出方法、
（７） Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定を、免疫学的手法により行うことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の疾患の検出方法、
（８） 前記疾患が、大腸癌又は大腸腺腫であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載の疾患の検出方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の疾患の検出方法を用いることにより、被験者から採血された血液試料の血清成分中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を、臨床検査現場の運用に耐えうる簡便なフローにより測定し、当該被験者が癌又は腺腫に罹患しているか否かを、高感度・高特異度で検出することができる。すなわち、本発明の疾患の検出方法においては、血液試料が採血された時点から、当該血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、当該血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であれば、癌又は腺腫を高感度・高特異度で検出することができる。このため、従来法では、一律にＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度上昇を抑制するために、冷却や一定処理時間内かつ迅速な処理が必要とされていたが、この基準時間範囲を設定することにより、当該基準時間範囲内であれば、室温における保存時間や測定開始までの時間に、検体ごとの時間差があってもよく、通常の臨床検査室での運用にて運用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１において、疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【図２】実施例１において、対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【図３】比較例１において、疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【図４】比較例１において、対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の疾患の検出方法は、血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ（以下、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ）濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する方法である。より具体的には、被験者から採血された血液試料を室温保存することにより凝固させ、血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する方法であって、採血時点からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時点までにおける、室温での保存時間の時間長が予め定めた基準時間範囲内の時間である検体を用いて、癌又は腺腫（以下、癌等ということがある。）を検出する方法である。
【００２０】
血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を指標として、癌等の疾患を検出する場合に、採血直後の血液試料や、採血後に血液凝固させることなく４℃以下で保存した血液試料を用いた場合よりも、採血後一定時間室温で保存し、血液凝固（凝血）反応を進行させた血液試料を用いることにより、癌等の疾患を高感度及び高特異度で検出できる。この理由は明らかではないが、下記のように推察される。
本発明者らは、血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、血液凝固反応に伴い１００倍以上上昇することを、新たに見出した。これは、血液中でのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの産生は、Ｃ３切断酵素と同じセリンプロテアーゼである血液凝固因子の活性化に伴って起こるためと考えられる。一方、消化器系の癌では、生体内での血液凝固が促進しているという報告もある。これらの知見より、癌等の罹患者では、健常者（対照者）と比較して血液凝固活性が高く、このため、血液凝固反応を起こすことにより、疾患罹患者の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度と、対照者の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度との差が大きくなり、この結果、癌等の疾患を高感度及び高特異度で検出し得ると推察される。
【００２１】
本発明の疾患の検出方法によって検出される疾患は、癌又は腺腫である。本発明において、癌には悪性腫瘍も含まれる。例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、膵癌、食道癌、胃癌等が挙げられる。本発明においては、大腸癌又は大腸腺腫を検出する方法であることが好ましい。
【００２２】
具体的には、本発明の疾患の検出方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を有し、下記血液試料が採血された時点から、下記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であることを特徴とする。
（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程。
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する工程。
（ｃ）前記工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する工程。
【００２３】
なお、本発明の疾患の検出方法において、血液凝固反応を行う温度は、室温であればよく、特段の温度制御環境下で行う必要はないが、１０℃〜３７℃であることが好ましく、１５〜３０℃であることがより好ましく、２０〜２８℃であることがさらに好ましい。これらの温度範囲であれば、血液凝固反応と血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの産生の両方が十分に進行し得るためである。
【００２４】
以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ａ）として、被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる。具体的には、血液試料を採血管に採取した後、当該採血管をそのまま室温で保存する。
【００２５】
血液試料を採取する採血管としては、血液凝固反応や、Ｃ３からのＣ３ａ産生反応に対する阻害物質を含まない採血管であれば、特に限定されるものではなく、血清を取得する場合に一般的に用いられている採血管を使用することができる。例えば、真空採血管内に凝固促進剤としてシリカやガラス微粒子を添加した血清取得用の真空採血管を用いた場合には、当該真空採血管に静脈血を採血し、数回転倒混和した後、室温で保存することにより、血液が凝固し、血清成分が得られる。また、トロンビン等がさらに添加された高速凝血用の採血管を使用した場合には、一般的に、シリカやガラス微粒子のみを添加した血清取得用の真空採血管を使用した場合よりも、血液試料をより短時間で凝固させることができる。
【００２６】
次に、工程（ｂ）として、凝固させた血液試料の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する。測定に供される血清成分は、凝固させた血液試料を遠心分離処理した後に分取したものであってもよく、遠心分離処理を省略し、凝固させた血液試料の上清を分取したものであってもよい。
【００２７】
また、工程（ａ）の後、工程（ｂ）を行うまでに長時間を要する場合には、工程（ａ）において得られた凝固させた血液試料を、血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定を行うまでの間冷蔵保存しておいてもよい。また、凝固させた血液試料を遠心分離処理し、分取した血清成分を冷蔵保存又は冷凍（凍結）保存しておいたものを、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定に用いてもよい。
【００２８】
血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定する方法は、溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定し得る方法であれば、特に限定されるものではなく、公知の手法の中から適宜選択して使用することができる。本発明の疾患の検出方法においては、Ｃ３ａのＣ末端アルギニンを切断してできた切断面（ネオエピトープ）を抗原とする抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を使用した免疫学的手法を用いることが好ましい。このような免疫学的手法として、例えば、ＥＬＩＡ法やＥＩＡ法等がある（例えば、The Journal of Immunology、１９８８年、第１４１巻、５５３〜５５８ページ参照。）。また、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対してＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合的に結合する人工物質を用いた競合的免疫的測定法であってもよい。その他、Ｈｕｍａｎ Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）や、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ａ ｄｅｓＡｒｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＩＡキット（Ａｓｓａｙｄｅｓｉｇｎ社製）等の市販のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ測定用キットを用いてもよい。
【００２９】
その後、工程（ｃ）として、工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する。なお、本発明において、基準値とは、室温における血液凝固反応により血液試料から得られる血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を指標とした場合に、癌等の疾患罹患者から採取された血液試料（以下、「疾患検体」という。）と対照者から採取された血液試料（以下、「対照検体」という。）とを、予め定められた感度及び特異度で識別することが可能な一定のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を意味する。
【００３０】
本発明及び本願明細書において、感度とは、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した全疾患検体（疾患罹患者群から採血された血液試料）のうち、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度がある一定の基準値を超えた陽性者数の割合を意味する。また、特異度とは、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した全対照検体（対照者群から採血された血液試料）のうち、ある一定の基準値を下回った陰性者の数の割合を意味する。
【００３１】
また、本発明及び本願明細書において、対照者とは、癌又は腺腫に罹患していない者を意味する。すなわち、対照者は、健常者であることが好ましいが、癌又は腺腫以外の他の疾患に罹患している者であってもよい。
【００３２】
本発明の疾患の検出方法において、血液試料が採血された時点から、工程（ｂ）における当該血液試料の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定開始時点までの、当該血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間（以下、「室温存在時間」という。）とは、血液試料中、又は血液試料から血清成分が分離された場合にはその分離された血清成分中において、Ｃ３から新たにＣ３ａが産生され得る時間である。したがって、採血からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定開始までの全操作を室温で行った場合には、血液試料が採血された時点からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時点までが、室温存在時間である。一方、当該室温存在時間には、室温における血液凝固反応後の血球成分と血清成分に分離した血液試料を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定するまでの間冷蔵保存した場合の当該冷蔵保存時間は含まれない。また、血液凝固反応後の血液試料から血清成分を分離回収するために遠心分離処理を行う場合であって、当該遠心分離処理を室温で行った場合における当該遠心分離処理時間は室温存在時間に含まれるが、４℃等の低温条件下で行った場合における当該遠心分離処理時間は含まれない。同様に、分離回収された血清成分を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定するまでの間冷蔵又は凍結保存した場合には、当該冷蔵・凍結保存時間は室温存在時間に含まれない。その他、一度に多数の検体を測定する場合等のように、血液凝固反応後の血液試料から分離回収した後、凍結保存された血清成分を、再融解後にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時まで室温で保存する場合には、この融解後の室温における保存時間も、室温存在時間に含まれる。
【００３３】
室温存在時間が短すぎる場合には、採決後の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の上昇が不十分となり、疾患検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度と、対照検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度との差が小さく、疾患検出の感度が低くなる。逆に、室温存在時間が長すぎる場合には、採決後の血液試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の上昇が過剰となり、やはり、疾患検体と対照検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の差が小さく、疾患検出の特異度が低くなる。
【００３４】
そこで、本発明の疾患の検出方法においては、室温存在時間を、予め設定された基準時間範囲内の時間とする。具体的には、室温存在時間を、室温における血液凝固反応により血液試料から得られる血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を指標とした場合に、疾患検体と対照検体とを、予め定められた感度及び特異度で識別することが可能な一定の時間範囲（基準時間範囲）内の時間とする。室温存在時間を、予め定めた感度特異度をとる基準時間範囲内の時間に設定することにより、例えば、凝血時間（血液凝固反応時間）が短すぎてＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が十分上昇せず、癌等の疾患を検出できないおそれや、室温における保存時間が長すぎて、対照検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が上昇しすぎ、対照検体と疾患検体との識別ができないおそれを、顕著に低減することができ、感度特異度の高い検出を行うことができる。
【００３５】
本発明の疾患の検出方法においては、基準値及び基準時間範囲は、疾患を検出する前に、予め設定しておく。当該基準値及び基準時間範囲は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定方法の種類、疾患の種類、疾患検出時の室温等を考慮して、適宜決定することができる。本発明における基準時間範囲としては、例えば、１〜６時間であることが好ましく、１〜４時間であることがより好ましく、１〜２時間であることがさらに好ましい。
【００３６】
疾患検体及び対照検体の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の室温保存における時間経過を測定することにより、予め定めた感度特異度で疾患検体と対照検体とを識別可能な基準値と、保存時間の範囲を算出することができる。具体的には、下記の方法により、基準値及び基準時間範囲を予め設定することができる。
【００３７】
まず、従来法によって特定の臓器の癌又は腺腫と診断されたヒトを疾患罹患者、当該臓器に癌がないと診断されたヒトを対照者とし、１又は２以上の疾患罹患者（疾患罹患者群）から採血された血液試料（疾患検体）、及び１又は２以上の対照者（対照者群）から採血された血液試料（対照検体）を用意する。例えば、大腸癌又は大腸腺腫を検出する場合の基準値及び基準時間範囲を設定するためには、下部内視鏡にて大腸癌および大腸進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｄｅｎｏｍａ）の存在があると診断されたヒトを疾患罹患者、同じく下部内視鏡にてそれらの腫瘍がないと診断されたヒトを対照者とし、それぞれから採血し、血液試料を用意する。基準値及び基準時間範囲を設定するための疾患検体及び対照検体は、それぞれ、２検体以上であることが好ましく、１０検体以上であることがより好ましく、３０検体以上であることがさらに好ましい。なお、疾患検体数と対照検体数を揃える必要はない。
【００３８】
得られた疾患検体及び対照検体は、採血後直ちに室温で保存する。室温保存により、血液凝固反応が進行し、血清成分が得られる。そこで、これらの室温保存されている各検体の血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の経時的変化を測定する。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の経時的変化は、複数の保存時間経過後のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することにより調べることができる。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定するタイムポイント（室温保存開始からの経過時点）としては、特に限定されるものではなく、測定方法や疾患の種類等を考慮して適宜決定することができる。例えば、採血後３０分から、８時間までの間の複数のタイムポイント、さらに好ましくは、採血後３０分から、３０分おきに６時間までの連続したタイムポイントを取得することが好ましい。
【００３９】
各検体は、測定するタイムポイント数に応じて、予め、複数本の採血管に採血されたものを用いることが好ましい。また、室温保存時間が０時間のタイムポイント（採血直後）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することも好ましい。なお、採血直後のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、ＥＤＴＡ等の血液凝固阻害剤を添加した血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することによっても得ることができる。
【００４０】
各タイムポイントにおける各検体の血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定は、前記と同様に行うことができる。測定に供される血清成分は、例えば、各タイムポイントにおいて、各検体を遠心分離処理して上清を回収することにより血清成分を得ることができる。回収された各タイムポイントの血清成分は、回収後速やかにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定を行ってもよく、回収後に冷蔵保存又は凍結保存し、全てのタイムポイントにおける血清成分を回収した後、必要に応じて再融解を行った後速やかにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定を行ってもよい。
【００４１】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定の結果得られた測定値に基づき、各検体に対して、室温保存時間と血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度との関係をプロットしたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを作成する。疾患検体群と対照検体群とで、前記Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを比較し、基準値及び基準時間範囲を設定する。具体的には、疾患検体群と対照検体群とを予め設定された感度及び特異度で識別可能なＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を基準値とし、疾患検体群の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が当該基準値以上であり、対照検体群の血清成分のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が当該基準値以下である保存時間の範囲を基準時間範囲とする。
【００４２】
なお、血液凝固反応やＣ３切断反応は、酵素反応であり、一般的に温度の影響を受けやすい。このため、工程（ａ）における室温と、工程（ｐ１）における室温は、ほぼ同定度（平均温度で±５℃）であることが好ましい。すなわち、本発明の疾患の検出方法においては、検出を行うたびに基準値等を設定する必要はなく、基準値等を設定したときの室温と、被験者から採血した血液試料に対して、疾患の検出を行うとき（すなわち、工程（ａ）を行うとき）の室温とが、ほぼ同程度の温度である場合には、既に設定した基準値等をそのまま使用することができる。一方、季節変動等により、既存の基準値等を設定したときの室温と、被験者から採血した血液試料に対して疾患の検出を行うときの室温とに、あまりに温度差がある場合には、新たに基準値等を設定しなおすことが好ましい。
【００４３】
本発明の疾患の検出方法においては、予め、疾患罹患者から採取された血液と対照者から採取された血液とにおいて、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の時間変化を測定しておく等により、予め感度特異度を保つことが可能な時間範囲を設定し、各血液試料の室温存在時間が当該時間範囲内の任意の時間となるように検査を行うことができる。このため、本発明の疾患の検出方法は、多数の検体を高い精度で処理することが要求される臨床検査に特に好適な方法である。
【００４４】
また、本発明の疾患の検出方法においては、室温存在時間が、予め設定された基準時間範囲の時間ではない血液試料に対しては、検出結果が信頼できないと判断することができる。この場合には、再度同一被験者から採血し、得られた血液試料に対して検査を行うことも好ましい。このように、採血から凝固、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定までの時間をトレースし、予め設定された基準時間範囲を超えた検体については検出結果を排除することにより、疾患の検出における感度特異度を保証することができる。
【００４５】
各血液試料の室温存在時間は、各工程を行った時間を記録することにより、基準時間範囲内の時間となるように管理することができる。具体的には、血液試料が採血された時間、及びＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定が開始された時間を記録しておくことが好ましい。本発明において、血液試料が採血された時点から、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定までの工程を全て室温で行う場合には、採血時からＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時までの時間が室温存在時間となることから、採血時点と測定開始時点のみを記録しておくことにより、これらの記録された時間に基づき、各血液試料の室温存在時間を簡便に管理することができる。凝固反応後の血液試料を冷蔵保存した場合や、遠心分離後に回収した血清成分を冷蔵・凍結保存した場合には、これらの処理の開始時点と終了時点の時間も記録しておくことにより、室温存在時間を管理することができる。
【００４６】
血液試料が採血された時間等の記録は、一般的に検体の処理日時等をトレースするために用いられる方法の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、採血管に採血時間や冷蔵保存時間等を直接記載したり、血液試料から分離した血清成分を回収した血清用容器に冷蔵・凍結時間や測定開始時間等を直接記載してもよい。また、採血管や血清用容器を番号化したり、採血管や血清用容器に付加させたバーコードを用いて、各採血管等に対して採血や冷蔵・凍結保存、測定等の操作を行った時間を記録してもよい。その他、採血管等にＩＣチップを付加させ、該ＩＣチップに各操作を行った時間を入力することによっても、室温存在時間を管理することができる。
【００４７】
また、採血後の血液試料中のＣ３切断活性（Ｃ３ａ産生活性）を測定することにより、間接的に室温存在時間を見積もることができる。例えば、Ｃ３からＣ３ａを産生する際に機能するＣ３切断酵素によって、Ｃ３ａと同様に切断されるペプチドフラグメントを準備しておく。当該ペプチドフラグメントとしては、例えば、Ｃ３のフラグメントであって、Ｃ３切断酵素による切断部位を含むペプチドフラグメント等が挙げられる。予め一定量の当該ペプチドフラグメントを添加させておいた採血管に採血された血液試料を室温で保存すると、血液試料中のＣ３切断酵素により、当該ペプチドフラグメントが切断されて切断物が生成される。つまり、生成された切断物量は、血液試料中のＣ３切断活性に依存するため、血液試料中で新たに産生されるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量と相関する。このため、室温保存された血液試料の血清成分中の当該切断物量を指標として、当該血液試料の室温存在時間が基準時間範囲内か否かを判断することができる。
【００４８】
具体的には、基準値や基準時間範囲を設定する場合と同様にして、疾患検体と対照検体に対して、血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定とともに、切断物量を測定し、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットに加えて、室温保存時間と血清成分の切断物量との関係をプロットした切断物量時間経過プロットを作成する。当該切断物の量は、当該切断物を抗原として作成した抗体との結合反応を利用した免疫的なアッセイによって検出することができる。これらのプロットから、前述したように基準値や基準時間範囲を設定し、当該基準時間範囲における切断物量の時間変化から、室温における保存時間が、当該基準時間範囲であることが予測可能な切断物量の範囲を算出する。血清成分中の切断物量が、この算出された範囲を超えた血液試料については、室温存在時間が基準時間範囲を超えているものと判定される。つまり、各血液試料に対して、採血時間等を記録せず、室温存在時間を測定していなかった場合でも、このようなペプチドフラグメントを予め採血管に添加しておくことにより、間接的に室温存在時間を推定し、検出結果の信頼性を判断することができる。また、切断物の量や濃度は、免疫学的方法で測定することができるため、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと同時に同一アッセイ内において測定することも可能であり、別アッセイ内において測定することもできる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［実施例１］
＜基準値及び基準時間範囲の設定＞
大腸癌患者１０名及び健常者１０名から採血を行い、疾患検体１０検体（Ｐ１〜Ｐ１０）及び対照検体１０検体（Ｃ１〜Ｃ１０）を得た。１検体に対し、６本の採血管に採血した。この６本の採血管のうち、１本はＥＤＴＡ２Ｎａが予め添加された真空採血管とし、残りの５本は凝血促進剤が予め添加された真空採血管とした。なお、真空採血管には、テルモ社製のベノジェクトIIを用い、かつ、採血時点の時間を、各採血管にそれぞれ記載した。
各検体のうち、ＥＤＴＡ２Ｎａ含有採血管については、採血後直ちに４℃で遠心分離処理を行い、分離回収した上清（血漿）を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定時まで凍結保存した。
残りの凝血促進剤含有採血管については、採血後そのまま室温で、保存時間が０．５時間、１時間、２時間、４時間、又は６時間となるように保存した後、室温で遠心分離処理を行い、分離回収した上清（血清）を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定時までそれぞれ凍結保存した。
各検体の血漿及び血清中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を、Ｃ３ａ ＥＩＡ キット（Ｑｕｉｄｅｌ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って測定した。より詳しくは、凍結保存された各検体の血漿及び血清を再融解し、これらを希釈して、ＥＬＩＳＡプレートにて測定を行った。測定結果を表１及び表２に示す。また、測定結果に基づき、各検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを作成した。図１は疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図であり、図２は対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】
この結果、基準値を７０００ｎｇ／ｍｌとした場合に、血液試料の室温保存時間が１時間以上４時間以内の範囲であれば、疾患検体と対照検体とを、感度９０％、特異度１００％で識別できることがわかった。また、室温における保存時間が４時間を越えた場合には、特異度が最小で７０％まで下がることもわかった。なお、図１及び図２中、太実線は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が７０００ｎｇ／ｍｌを示している。
一方、ＥＤＴＡ２Ｎａ含有採血管から回収された血漿検体では、表１の室温保存時間０ｈに記載の結果からも明らかであるように、疾患検体と対照検体におけるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度差が小さく、例えば、基準値を対照検体における最高値２４０ｎｇ／ｍｌ（Ｃ９）とした場合に、感度７０％、特異度９０％となった。これらの結果から、血漿検体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する従来法よりも、本発明の疾患の検出方法を用いたほうが、より高い性能で癌や腺腫を検出し得ることが明らかである。
【００５４】
＜被験者検体を用いた大腸癌の検出＞
上記で設定した基準値及び基準時間範囲に基づいて、別の大腸癌患者２名及び健常者２名から採血された新たな疾患検体２検体（Ｐ１１及びＰ１２）及び対照検体２検体（Ｃ１１及びＣ１２）を評価した。
具体的には、まず、各被験者から凝血促進剤が予め添加された真空採血管に採血し、それぞれの採血時間を採血管に記載した。その後、通常の臨床検査室のフローにのっとり、遠心分離をした後、上清の血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を上記と同様にしてＥＬＩＳＡキットにて定量した。なお、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定開始時までの操作は、全て室温で行われた。各検体に対する、採血時間、測定開始時間、室温存在時間（測定開始時間から採血時間までの時間）、及び血清成分中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を表３に示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
この結果、全ての検体の室温存在時間は１〜４時間以内であり、基準時間範囲内であり、検出結果は信頼できると判断された。また、Ｐ１１及びＰ１２検体では、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が基準値（７０００ｎｇ／ｍｌ）以上であり、大腸癌であると判断された。一方、Ｃ１１及びＣ１２検体ではＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が基準値以下であり、大腸癌に罹患していないと判断された。つまり、本実施例における検出結果と、従来の他の診断方法による診断結果が一致し、したがって、本発明の疾患の検出方法により、他の診断方法と同様に、大腸癌等を検出し得ることが確認された。
また、これらの結果から、本発明の疾患の検出方法により、迅速な検体処理や、冷却等の煩雑な操作を行うことなく、通常の室温保存での臨床検査室のフローで検査可能であることがわかった。
【００５７】
［比較例１］
採血後の検体を、室温ではなく４℃で保存した場合の、各検体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の経時的変化を測定した。具体的には、実施例１において、基準値及び基準時間範囲の設定の際に用いたものと同じ検体｛疾患検体１０検体（Ｐ１〜Ｐ１０）及び対照検体１０検体（Ｃ１〜Ｃ１０）｝に対して、採血後の保存を４℃で行った以外は、実施例１と同様にして、血清又は血漿中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した。
測定結果を表４及び表５に示す。また、測定結果に基づき、各検体のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを作成した。図３は疾患検体（Ｐ１〜Ｐ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図であり、図４は対照検体（Ｃ１〜Ｃ１０）のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度時間経過プロットを示した図である。いずれの検体においても、室温保存した場合よりも、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は低く、濃度の上昇は緩やかであった。これは、低温の保存により、Ｃ３の切断酵素の活性が抑制され、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ産生スピードが抑えられたためと思われる。
また、疾患検体と対照検体とのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の差が、室温保存した場合よりも小さくなることが確認された。測定結果に基づき、カットオフ値（基準値）を４４００ｎｇ／ｍｌとした場合に、血液試料の４℃保存時間が４時間以上６時間以内の範囲で疾患検体と対照検体とを識別すると、感度８０％、特異度９５％となり、いずれも実施例１と比べて低下した。また、疾患検体、対照検体で値が近接した検体が多く、測定精度によっては、判定が変わるグレーゾーンの検体の数が増えた。
これらの結果から、採血後の血液試料を室温で保存し、当該血液試料中のＣ３切断酵素活性を一定時間働かせる本発明の疾患の検出方法のほうが、Ｃ３切断酵素活性を抑制させる従来法よりも、疾患検体と対照検体とを精度よく識別し得ることが明らかである。
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の疾患の検出方法を用いることにより、臨床検査現場の運用に耐えうる簡便なフローにより、癌又は腺腫を所望の感度・特異度で検出することができるため、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する方法であって、
前記疾患が癌又は腺腫であり、
（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する工程と、
を有し、
前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であることを特徴とする疾患の検出方法。
【請求項２】
１又は２以上の疾患罹患者、及び１又は２以上の対照者から採血された血液試料のそれぞれに対して、
（ｐ１）血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、
（ｐ２）前記工程（ｐ１）において、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の経時的変化を測定する工程と、
（ｐ３）前記工程（ｐ２）において得られた測定値に基づき、各血液試料に対して、室温における保存時間と、血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度との関係をプロットしたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットを作成する工程と、
を行い、
前記工程（ｐ３）において作成された各血液試料のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットに基づいて、疾患罹患者から採血された血液試料と対照者から採血された血液試料とを予め設定された感度及び特異度で識別可能なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を、前記工程（ｃ）における基準値とし、
疾患罹患者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以上であり、対照者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以下である保存時間の範囲を、前記基準時間範囲とすることを特徴とする請求項１記載の疾患の検出方法。
【請求項３】
前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、前記基準時間範囲内の時間ではない血液試料に対して、同一被験者から採血された血液試料に対して再度前記工程（ａ）〜（ｃ）を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の疾患の検出方法。
【請求項４】
前記基準時間範囲が、１時間以上６時間以内であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の疾患の検出方法。
【請求項５】
前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間の管理を、採血がなされた時間及びＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定が開始された時間を記録することにより行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の疾患の検出方法。
【請求項６】
時間の記録が、採血時間及び測定時間を、採血管へ直接記載する方法、採血管を番号化して記録する方法、採血管へ付加されたＩＣチップに記録する方法、及び採血管へ付加されたバーコードを用いて記録する方法からなる群より選択される１の方法により行うことを特徴とする請求項５記載の疾患の検出方法。
【請求項７】
Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定を、免疫学的手法により行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の疾患の検出方法。
【請求項８】
前記疾患が、大腸癌又は大腸腺腫であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の疾患の検出方法。
【請求項１】
血清中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を疾患マーカーとして疾患を検出する方法であって、
前記疾患が癌又は腺腫であり、
（ａ）被験者から採血された血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において得られた測定値を、予め設定された基準値と比較し、当該測定値が当該基準値よりも大きい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していると判断し、当該測定値が当該基準値よりも小さい場合には、前記被験者が癌又は腺腫に罹患していないと判断する工程と、
を有し、
前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、予め設定された基準時間範囲内の時間であることを特徴とする疾患の検出方法。
【請求項２】
１又は２以上の疾患罹患者、及び１又は２以上の対照者から採血された血液試料のそれぞれに対して、
（ｐ１）血液試料を、室温で保存することにより凝固させる工程と、
（ｐ２）前記工程（ｐ１）において、前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の経時的変化を測定する工程と、
（ｐ３）前記工程（ｐ２）において得られた測定値に基づき、各血液試料に対して、室温における保存時間と、血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度との関係をプロットしたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットを作成する工程と、
を行い、
前記工程（ｐ３）において作成された各血液試料のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度時間経過プロットに基づいて、疾患罹患者から採血された血液試料と対照者から採血された血液試料とを予め設定された感度及び特異度で識別可能なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を、前記工程（ｃ）における基準値とし、
疾患罹患者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以上であり、対照者から採血された血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度が前記基準値以下である保存時間の範囲を、前記基準時間範囲とすることを特徴とする請求項１記載の疾患の検出方法。
【請求項３】
前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間が、前記基準時間範囲内の時間ではない血液試料に対して、同一被験者から採血された血液試料に対して再度前記工程（ａ）〜（ｃ）を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の疾患の検出方法。
【請求項４】
前記基準時間範囲が、１時間以上６時間以内であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の疾患の検出方法。
【請求項５】
前記血液試料が採血された時点から、前記工程（ｂ）における前記血液試料の血清成分のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定開始時点までの、前記血液試料及びその血清成分を室温に置いた時間の管理を、採血がなされた時間及びＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定が開始された時間を記録することにより行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の疾患の検出方法。
【請求項６】
時間の記録が、採血時間及び測定時間を、採血管へ直接記載する方法、採血管を番号化して記録する方法、採血管へ付加されたＩＣチップに記録する方法、及び採血管へ付加されたバーコードを用いて記録する方法からなる群より選択される１の方法により行うことを特徴とする請求項５記載の疾患の検出方法。
【請求項７】
Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度の測定を、免疫学的手法により行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の疾患の検出方法。
【請求項８】
前記疾患が、大腸癌又は大腸腺腫であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の疾患の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１８１２７５（Ｐ２０１０−１８１２７５Ａ）
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５０４９（Ｐ２００９−２５０４９）
【出願日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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