病的免疫応答を抑制するサイトカインおよびマイトジェンの使用
【課題】抗体仲介および細胞仲介の両方の異常を含む自己免疫異常を処置する方法の提供。
【解決手段】生体外の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)中の免疫応答を阻害する方法であって、該方法は、患者由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を患者から取り出すこと、およびこの細胞をＴＧＦ−およびＩＬ−２を含む調節組成物で、免疫細胞による組織損傷を抑制するのに十分な時間処理した後、該処理済細胞を患者に再導入することで、これにより自己免疫の症状が改善する。
【解決手段】生体外の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)中の免疫応答を阻害する方法であって、該方法は、患者由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を患者から取り出すこと、およびこの細胞をＴＧＦ−およびＩＬ−２を含む調節組成物で、免疫細胞による組織損傷を抑制するのに十分な時間処理した後、該処理済細胞を患者に再導入することで、これにより自己免疫の症状が改善する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般的に、抗体仲介および細胞仲介の両方の異常を含む自己免疫異常を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
自己免疫疾患は、自己か自己でないかを識別する免疫システムの機能不全によっておこる。これらの疾患で、免疫系は自己組織に対して作用し、その応答は最終的に炎症や組織損傷をもたらす。自己免疫疾患は２つの基本的部類に分類される：全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、シェーグレン症および皮膚筋炎などの抗体仲介疾患と、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、真性糖尿病、慢性関節リウマチおよび硬皮症などの細胞仲介疾患である。
【０００３】
多くの自己免疫疾患において、組織損傷は元の組織に対する抗体の産生によって引き起こされる。この抗体は自己抗体と言われている。哺乳動物によって産生され、哺乳動物自体の組織に対する結合部位を持つためである。この疾患のうちいくつかは、循環する抗体量の特有な漸増と漸減を有し、やがて徴候に変化をもたらす。
【０００４】
抗体仲介自己免疫異常の種々のタイプの中でもＳＬＥは充分研究され考証されている異常である。ＳＬＥは一般化した自己免疫の異常であり、核、細胞質および細胞表面の抗原に対する様々な自己抗体でのＢ細胞の活動過多を特徴とする。この自己免疫疾患は、遺伝的および環境的な促進因子による多因性病原を有する(参照：Hahn, B.H., Dobois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 69−76 (D.J. Wallace et al. ads., Williams and Wilkins, Baltimore))。ＳＬＥで説明されている多数のリンパ球欠失は、調節性Ｔ細胞の機能不全であり、Ｂ細胞の機能を阻害する(Horwitz, D.A., Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 155−194 (D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore))。インビトロでポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体を持続的に産生するには、Ｔ細胞の助力が必要である(Shivakumar, S. et al. (1989), J Immunel 143:103−112)。
【０００５】
調節性Ｔ細胞は、胞溶解性またはサイトカイン仲介メカニズムによる抗体合成を下方制御する。後者はトランスフォーミング成長因子−β(ＴＧＦ−β)と他の抑制的サイトカインを必要とする(Wahl, S.M. (1994), J Exp Med 180:1587−190)。 循環Ｂリンパ球自発的分泌抗体は、活動性ＳＬＥの患者で増加する(Klinman, D.M. et al. (1991), Arthritis Rheum 34:1404−1410)。
【０００６】
ＳＬＥの臨床症状は、発疹(特に、顔面の蝶型紅斑)、糸球体腎炎、肋膜炎、心膜炎および中枢神経系関与がある。患者の大部分は女性であり、比較的若い(診断時の平均年齢は２９才である)。
【０００７】
ＳＬＥに対する処置は臨床的症状によって変わる。穏やかな臨床症状の患者は、非ステロイド性抗炎症剤等の簡単な処置で効き目がでる。しかし、さらに重い症状に対しては、通常、プレドニゾンなどの強い抗炎症および免疫抑制の作用をもつステロイドが必要となる。他の強力な免疫抑制剤として、アザチオプリンとシクロホスファミドを使用することができる。ステロイドおよび他の免疫抑制剤では、哺乳動物の免疫システムが全体的に低下するために副作用が生じる。現在、ＳＬＥに対する理想的な処置はなく、疾患を治すことができない。
【０００８】
現在、ＳＬＥに対する感受性または抵抗性を高める遺伝子の同定、疾患を引き起こす抗原性決定子の同定、生存かアポトーシスかを決定づけるＴ細胞活性化の分子メカニズム、Ｔ細胞の機能を決定するサイトカイン、および自己抗体を形成するＢ細胞の特性が、かなり注目されている。ＳＬＥのＴ細胞調節不全について多くの例証が叙述されている(参照：Horwitz, D.A. et al., Duobois’Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 83−96 (D.J. Wallace et al. ads., Wiliams and Wilkins, Baltimore)。あるリンパ球の一次的役割が免疫応答の下方調節であることは充分認められているが、これらの細胞の産生で必要とされる同一性およびメカニズムの解明は進んでいない。
【０００９】
インターロイキン−２(ＩＬ−２)は、これまで抗原非特異的Ｔ抑制細胞の産生で重要な役割を果たすと考えられている。マウスに与えられる抗ＩＬ−２抗体(移植片対宿主病の誘導物と一致する)はＳＬＥの特色をもたらす(Via, C.S. et al. (1993), Intemational Immunol. 5:565−572)。ＩＬ−２が抑制の産生において直接的または間接的に重要であるかどうかが議論されている(Fast, L.D. (1992), J. Immunol. 149:1510−1515; Hirohata, S. et al. (1989), J. Immunol. 142.3104−3112; Baylor, C.E. (1992), Advances Exp. Med. Biol. 319:125−135)。最近、ＩＬ−２が、ＣＤ８＋細胞を誘発して、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＨＩＶ複製を非分解メカニズムにより抑制することがわかった。この効果はサイトカイン仲介性であるが、具体的なサイトカインは同定されていない(Kinter, A.L. et a1. Proc. Nalt Acad. Sci. USA 92:10985−10989; Barker, T.D. et al. (1996), J. Immunol. 156.4478−4483)。ＩＬ−２のＴ細胞産生はＳＬＥで減少する(Horwitz, D.A. et al. (1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 83−96, D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore)。
【００１０】
ＳＬＥ患者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ポリクローナルＩgＧ産生を抑制するよりむしろ維持する(Linker−Israeli, M. et al. (1990), Arthritis Rheum. 33:1216−1225)。健康なドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して抗体産生を高めることができる(Takahashi, T. et al. (1991), Clin. Immunol. Immunopath. 58:352−365)。しかしＩＬ−２またはＣＤ４＋Ｔ細胞のどちらも、それ自体では強力な抑制活性を発生させるＣＤ８＋Ｔ細胞を産出しないことがわかった。ＮＫ細胞を培地に含めると、強力な抑制活性が現われた(Gray, J.D. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1937−1942)。培地中のＮＫ細胞の働きは、トランスフォーミング成長因子ベータ(ＴＧＦ−β)を活性形態で産出するものと考えられる。非免疫抑制(２−１０pg/ml)濃度のこのサイトカインは、ＩgＧおよびＩgＭの産生に対する強力な抑制作用をつくるための補助因子として働くことが見出された(Gray, J.D. et al (1994) J. Exp. Med 180:1937−1942)。加えて、ＮＫ細胞は非刺激リンパ球でＴＧＦ−βの主要源であると考えられる(Gray, J.D. etaL (1998), J. Immunol. 160:2248−2254)。
【００１１】
ＴＧＦ−βは、組織修復、炎症および免疫調節における重要なサイトカインの多機能性系統群である(Massague, J. (198O), Ann. Rev. Cell Biol. 6:597)。ＴＧＦ−βは、他の大部分のサイトカインと異なり、その放出タンパク質が生物学的に不活性であり、特定の受容体と結合することができない(Sporn, M.B. et al. (1987) J. Cell Biol. 105:1039−1045)。潜在の複合体が細胞外で切断され、以下に記すように活性サイトカインを放出する。ＴＧＦ−βの応答は単核細胞に偏在する２つの表面受容体(ＴＧＦ−β−Ｒ１とＴＧＦ−β−Ｒ２)の相互作用を必要とする(Massague, J. (1992), Cell 69:1067−1070)。従って、潜在型の活性ＴＧＦ−βへの変化は、サイトカインの生物学的効果を決定する重大な段階である。
【００１２】
ＳＬＥ患者ではＮＫ細胞によるＴＧＦ−βの産生が減少することが分かっている。ＮＫ細胞により産生される構成ＴＧＦ−βの欠失および誘導されたＴＧＦ−βの欠失は、３８人のＳＬＥ患者についての研究で報告されている(Ohtsuka, K. et al. (1998), J. Immunol. 160.2539−2545)。組換え型ＩＬ−２やＴＮＦ−αまたはＩＬ−１０拮抗エフェクターの何れを加えても、ＳＬＥでのＴＧＦ−β欠失を正常し得なかった。ＳＬＥでのＴＧＦ−β産生の減少は、疾病の活性と相関しておらず、従って、初期の欠失かも知れない。
【００１３】
ＳＬＥ患者をＴＧＦ−β、ＩＬ−２またはその両方の組合せで処置する全身的な投与は、深刻な副作用を引き起こす。これらのサイトカインは、種々の体組織に対して非常に多くの影響を与えるので、患者に全身的に送達するのはあまり安全ではない。従って、本発明の対象は、自己抗体調節制御に関与する哺乳類細胞を処置して、自己抗体産生を下方制御する細胞集団を増加させる方法およびキットを提供することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
（本発明の要旨）
ここに概略する目的のように、本発明は、生体外の末梢血単核細胞 (ＰＢＭＣ)のサンプル中の免疫応答を阻害する方法であって、細胞集団に調節組成物を添加することを含む方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
更なる態様では、本発明は、患者の自己免疫異常を処置する方法を提供する。その方法は、患者由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を患者から取り出すこと、およびこの細胞を調節組成物で、免疫細胞による組織損傷を抑制するのに十分な時間、処理することを含む。特に、本発明の方法は、抗体産生を抑制し、または細胞を誘発して、抗体産生を下方調節し、そして抗体仲介自己免疫疾患の患者における細胞仲介免疫応答を高める。次いで、細胞を患者に再導入すると、自己免疫の症状が改善する。調節組成物は、好ましくは、ＴＧＦ−βおよびＴ細胞のＴＧＦ−βヘの応答を可能にする物質を含む。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、細胞仲介自己免疫異常を処置する方法を提供する。この方法は、該患者から末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を取り出し、該細胞を調節組成物で、異常の免疫応答を抑制するのに十分な時間処置することを含む。処置細胞を患者に再導入すると、自己免疫症状の改善が得られる。調節組成物は、好ましくは、ＴＧＦ−βおよびＴ細胞のＴＧＦ−βへの応答を可能にする物質を含む。
【００１７】
更なる態様では、本発明は、患者の自己免疫異常の処置用キットを提供する。このキットは、抗体仲介自己免疫異常または細胞仲介異常の患者の細胞を受容するのに適当な細胞処置容器および少なくとも１用量の調節組成物を含む。
【００１８】
（図面の説明）
図１は、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ−２およびＴＧＦ−βと共にインキュベーションすることにより、自発的免疫グロブリン産生が減少することを示す。ＰＢＭＣ(２×１０5／ｗｅｌｌ)を、ＡＩＭ−Ｖ血清を含まない培地であって、ＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)およびＴＧＦ−β(１０ｐｇ/ｍｌ)を含むか、または含まない培地中で培養した。３日後、ウェルを３回洗浄し、新たなＡＩＭ−Ｖ培地を加えた。更に７日後、上清をウェルから回収し、ＩｇＧ成分をＥＬＩＳＡで測定した。
【００１９】
図２は、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの両方により、自発的ＩｇＧ産生が有意に減少することを示す。その値は、図１の説明に記載の通りに培養した１２人のＳＬＥ患者のＰＢＭＣにより産生した平均±ＳＥＭのＩｇＧ(μｇ／ｍｌ)を示す。ただし、ＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)のみ、またはＴＧＦ−β(１０ｐｇ/ｍｌ)のみで培養した細胞もある。
【００２０】
図３Ａおよび３Ｂは、抗ＴＧＦ−βがＩＬ−２の効果を逆転することを示す。ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを、３日間、ＩＬ−２(１０Ｕ/ｍｌ)の存在下(黒色バー)、または非存在下(灰色バー)で培養した。これらの培養液中に含まれていたのは、培地、抗ＴＧＦ−β(１０μｇ/ｍｌ)または対照マウスＩｇＧ１(１０μｇ/ｍｌ)であった。３日後、ウェルを洗浄し、新たなＡＩＭ−Ｖ培地を加えた。更に７日後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＩｇＧ(図３Ａ)または抗核タンパク質（ＮＰ）(図３Ｂ)成分を検定した。
【００２１】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、抗体産生に対するＤＣ８＋Ｔ細胞の調節効果を示す。(Ａ)健康人のＩｇＧ産生の抑制におけるＮＫ細胞とＣＤ８＋細胞の相乗作用。ＣＤ４＋細胞およびＢ細胞を抗ＣＤ２で刺激し、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞の作用を調べた。ＮＫおよびＣＤ８＋細胞の組み合わせは、我々が以前報告した(Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160: 2248−2254; Gray, J.D. et al., (1994), J Exp Med 180; 1937−1942)抗ＣＤ２誘発性ＩｇＧ産生を顕著に阻害した。(Ｂ)ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞はＳＬＥにおけるＩｇＧ合成を促進する。活動性ＳＬＥの患者由来のＣＤ４＋細胞および正常人の休止Ｂ細胞を、抗ＣＤ２で刺激した。ＳＬＥ ＣＤ８＋細胞によるＩｇＧ産生の促進は、ＮＫ細胞の添加により顕著に増加した。(Ｃ)ＳＬＥにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞機能のサイトカインによる正常化。図４Ｂに示す試験と平行して、この患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下または非存在下、抗ＣＤ２で刺激した。表示のようにＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)および／またはＴＧＦ−β(２ｐｇ／ｍｌ)を加えた。これらサイトカインにより、ＣＤ８＋細胞のヘルパー作用が喪失し、その細胞がＩｇＧ産生の７５％を阻害した。
【００２２】
図５Ａおよび５Ｂは、非刺激細胞および抗ＣＤ２刺激細胞によるＴＧＦ−β１のリンパ球産生を示す。健常者ドナーならびにＳＬＥ患者およびＲＡ患者のＰＢＬを、マイクロタイタープレートに１×１０5／ウェルで加えた。幾つかのウェルは、抗ＣＤ２ｍＡｂｓＧＴ２(１：４０)およびＴ１１(１：８０)であった。３７℃で２日後、上清を回収し、活性ＴＧＦ−β１および全ＴＧＦ−β１を検定した。有意なｐ値を示す。
【００２３】
図６は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のＴ細胞産生に対するＴＧＦ−βの作用を示す。血清なしのＡＩＭＶ培地中の精製Ｔ細胞（１ｘ１０５細胞／ウエル）を、平底ミクロウエルに加え、低量（０.５μｇ／ｍｌ）または高量（５μｇ／ｍｌ）のＣｏｎＡで、ＩＬ−２と共にまたはなしに、ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下に刺激した。上清を２日および５日に採取し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０についてＥＬＩＳＡで調べた。最大産生がＴＧＦ−βは２日に、ＩＬ−１０は１０日にあった。ＴＧＦ−βはＩＬ−１０の産生をなくし、ＴＮＦ−αの産生を上方調節した。
【００２４】
図７は、ＴＧＦ−βによる調節性Ｔ細胞の生成にＴＮＦ−αが必須の中間体であることを示す。精製ＣＤ８＋細胞を、ＣｏｎＡ（２.５μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（１０Ｕ）およびＴＧＦ−β（１０ｐｇ／ｍｌ）で一夜インキュベートした。洗浄後これらの細胞をＣＤ４＋Ｂ細胞に加え、抗ＣＤ２で刺激した。いくつかのウエルに抗ＴＮＦ−α抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはイソ型対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）を入れた。７日後に上清をＩｇＧ含量についてＥＬＩＳＡで調べた。抗ＴＮＦ−αは条件ＣＤ８＋細胞の調節活性を逆転した。
【００２５】
図８は、ＴＧＦ−β起動Ｔ細胞によるＴｈ１サイトカインの産生の増加がＴＮＦ−αに依存性であることを示す。精製ナイーブＴ細胞をＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）とともにＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下に培養した。いくつかのウエルには中和抗ＴＮＦ−α抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはイソ型対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）も加えた。５日培養後に細胞を水洗し、１ｘ１０５細胞／ウエルで新鮮な培地に入れた。翌日にＣｏｎＡおよびＩＬ−２で６時間再刺激し、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下にＣＤ８およびサイトカインについて着色した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋およびＣＤ８−細胞の％を示す。一次培地におけるＴＮＦの中和はＴｈ１サイトカイン産生に対するＴＧＦ−β作用の増加を無くする。
【００２６】
図９は、細胞毒性Ｔ細胞活性の抑制物質の産生におけるＴＧＦ−βの作用を示す。Ｅロゼット法によりつくられたドナーＡ由来のＴ細胞を２つに分けた。１つを同種異系混合リンパ球反応（allo−MLR）についての応答物として用いた。他の１つを用いて、細胞を適当なモノクロナール抗体で染め、その細胞を免疫磁性ビーズで除いた後、陰性選択で表示されるＴ細胞サブセットをつくった。応答Ｔ細胞をドナーＢ由来の刺激細胞と混合し（照射Ｔ細胞は末梢血単核細胞を枯渇した）、５日培養してキラー細胞を作った。対照は刺激細胞の有無で５日培養したＴ細胞サブセットからなる。その後、細胞を洗い、計数し、アロ細胞毒性Ｔ細胞活性の検定に使用した。ドナーＡ由来の応答細胞をドナーＢ由来のクロミウム標識リンパ芽球とエフェクター質中で混合し、細胞比率を標的にして、クロミウム放出を標準的４時間検定法で測定した（白四角）。刺激物とともに培養したＴ細胞サブセットを、４応答細胞につき１調節細胞の比率で加えた（白丸）。刺激物と培養のＴ細胞サブセットへのＴＧＦ−βの添加を黒丸で示す。すべての試験で、ＴＧＦ−βの最大作用はナイーブＣＤ４ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−細胞に対して見られた。
【００２７】
図１０は、ＴＧＦ−βにより起動されたＣＤ４細胞のアロ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性に対する作用を示す。刺激物質なしで５日間培養されたＣＤ４ＣＤ４５ＲＡの付加はＣＴＬ活性に対する作用を有しない（結果を示していない)。これらのＴ細胞を刺激物質と培養すると、低度から中程度の抑制活性となる。すべての試験において、これらのＴ細胞のＴＧＦ−β１ｎｇ／ｍｌとの培養は、アロＣＴＬ活性を顕著に抑制するか無くする。
【００２８】
図１１は、調節性Ｔ細胞がＣＴＬ活性を抑制するために細胞接触を必要とすることを示す。調節性ＣＤ４細胞は、上記のように、ＴＧＦ−βと培養したＣＤ４ＣＤ４５ＲＡからつくった。これらの細胞のいくつかを応答物質およびクロミウム標識の標的細胞と混合し、他の細胞を膜によりキラー細胞から分離した。細胞毒性Ｔリンパ球活性（ＣＴＬ）の抑制を、Ｔ細胞がキラー細胞と直接接触したときにのみ認めた。
【００２９】
図１２は、ＴＧＦ−βで誘発された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球増殖の抑制を示す。ドナーＡ由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を上記のように刺激細胞と混合し、表示の比率で新鮮な応答物質および刺激物質に加えた。バーは７日間培養後のトリチウム標識チミジンの取り込み±ＳＥＭを示す。薄色のバー（Nil)は、添加ＣＤ４＋細胞なしの応答Ｔ細胞の増殖性応答を示す。濃色バーは、刺激細胞と培養した対照ＣＤ４＋細胞のＴＧＦ−βなしでの作用を示す。黒バーは、刺激細胞と培養した対照ＣＤ４＋細胞のＴＧＦ−βあり（１ｎｇ／ｍｌ）での作用を示す。照射刺激細胞に加えた新鮮な応答細胞の増殖性応答に対するこれらのＣＤ４＋細胞の作用を培養７日間後に示す。バーはトリチウム標識チミジンの平均取り込みを示す。
【００３０】
図１３は、ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞の調節活性を示す。ＣＤ４＋細胞を照射同種異系非Ｔ細胞±ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）で５日間刺激した。水洗後、ＣＤ４＋細胞をＤIIで染め、新鮮な応答Ｔ細胞をカルボキシフルオレセイン（ＣＦＳＥ）で染めた。対照またはＴＧＦ−β駆動ＣＤ＋細胞を応答Ｔ細胞およびアロ刺激細胞に１：４の比率で加えた。５日後に細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ８＋におけるＣＦＳＥの強さをＤII陰性細胞でもって決定した。ＴＧＦ−β駆動ＣＤ＋細胞の応答Ｔ細胞への付加はＣＤ８＋細胞による細胞分裂を顕著に低下した。
【００３１】
図１４は、調節ＣＤ＋４細胞がその表面でＣＤ２５＋（ＩＬ−２）受容体を発現することを示す。対照またはＴＧＦ−β誘発ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を上記のようにつくった。アロ刺激細胞およびＴＧＦ−βで条件を整えた後、ＣＤ４＋細胞を細胞選別によりＣＤ２５＋とＣＤ２５−に分けて、新鮮な応答Ｔ細胞および照射刺激細胞に加えた。これらの応答細胞のキラー刺激Ｔリンパ芽細胞に対する能力を、標準的４時間クロミウム放出検定で示す。
【００３２】
図１４Ａにおいて、白四角は添付のＣＤ４＋細胞のないＣＴＬ活性を表示する。対照またはＴＧＦ−β誘発調節性Ｔ細胞を応答細胞とともに１：４の比率で加えた。白丸からすると対照ＣＤ４＋細胞がＣＴＬ活性を変えなかった。黒丸からするとＴＧＦ−βが誘発ＣＤ４＋がＣＴＬ活性をほとんど完全に抑制した。黒菱形からするとＣＤ２５＋サブセットのみが抑制活性を有していた。ＣＤ２５サブセット（黒四角）は抑制活性を有していなかった。
【００３３】
図１４Ｂは、ＭＬＲに加えたＣＤ４＋調節細胞の数を減少さす作用を示す。わずか３％への減少は抑制作用の減少における最小の作用である。
【００３４】
図１５は、少量のブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）でのＴ細胞の反復刺激がＴ細胞を誘発してＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＳＥＢ（０.０１ｎｇ／ｍｌ）およびスパー抗原提示細胞として照射Ｂ細胞で、ＴＧＦ−βの存在または不存在で、矢印で表示の時に刺激した。活性ＴＧＦ−βを２日または５日後に測定した。
【００３５】
図１６は、低量のＳＥＢでＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激によってＴ細胞がＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＳＥＢ（０.０１ｎｇ／ｍｌ）およびスパー抗原提示細胞として照射Ｂ細胞で、ＴＧＦ−βの存在または不存在で、矢印で表示の時に刺激した。活性ＴＧＦ−βを２日または５日後に測定した。
【００３６】
図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの作用を示す。細胞をＳＥＢで５日毎に計３回刺激した。各Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ２５ＩＬ−２受容体活性マーカーを発現する細胞の％を各刺激後に測定した。パネルＡおよびＣは、ＴＧＦ−β１ｎｇ／ｍｌが最初の刺激に含まれていると、ＣＤ４＋Ｔ細胞が反復刺激後に培養基中で優勢になることを示す。パネルＢおよびＣは、ＳＥＢ刺激細胞によるＣＤ２５発現が対照培養基中で第３刺激で減少することを示す。しかしＣＤ２５発現は、Ｔ細胞がＴＧＦ−βで駆動されていると、高く留まっている。
【００３７】
（詳細な説明）
本発明は、全身性エリマトーデス（ＳＬＥ）などの細胞仲介および抗体仲介の両方の異常を含む自己免疫異常を処置する方法に関する。この方法は、患者から細胞を取り出し、この両方の１つに作用できる組成物でもって細胞を処置する。１つの実施態様において、抗体仲介自己免疫異常の症状を本発明の組成物によって改善する。この組成物は、自己抗体などの抗体の産生を阻害して、Ｂ細胞の過剰活性を下方調節する。さらに、この組成物は、ＳＬＥや他のある種の抗体仲介自己免疫異常の患者においてしばしば欠失している細胞仲介免疫応答を高める。すなわち、抗体仲介自己免疫異常の患者を処置して、その欠失細胞仲介症状を改善できる。
【００３８】
あるいは、この組成物を使用して細胞仲介自己免疫疾患を処置する。この実施態様において、組成物は免疫細胞を誘発し、抑制Ｔ細胞をつくる。この抑制Ｔ細胞は他のＴ細胞が細胞毒性になって個体の細胞および組織を攻撃するのを防ぐ。このように、組成物は細胞毒性を低下することにより細胞仲介自己免疫異常の症状を改善する。
【００３９】
この方策は、現在のほとんどすべての処置が抗炎症剤や免疫抑制剤を使用すると異なっている。普通よく用いられるコルチコステロイドは、サイトカインの産生を抑制し、組織の損傷を起こす最終事象を阻止するが、基にある自己免疫応答を一般に変えることはない。細胞障害剤またはモノクローナル抗体などの実験的に遺伝子工学的に処理された生物剤も、特殊なリンパ球集団をなくするか、その機能を妨害する。これらの薬剤は、一般に緩和な効果をもたらすのみであって、また重大な有害副作用を起こす。ある種のサイトカインは、患者に全身的に与えられるが、重大な有害副作用に関連する広範な作用を有している。
【００４０】
一方、本発明の方法による治癒効果では、正常な調節性細胞機能が回復し、免疫系が「再置」される。本方法の他の重要な利点は、重大な有害副作用があまり起きないことである。サイトカインなどの調節組成物のごく少量を患者に戻すにすぎないので、毒性が最小となる。
【００４１】
ＩｇＧを自発的に分泌する循環Ｂリンパ球が活動性ＳＬＥの患者で増加する（Blaese, R.M., et al.(1980), Am J. Med. 69: 345−350; Klinman, D.M. et al.(1991) Arthritis Rheum 34: 1404−1410）。インビトロでのポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体の持続的な産生には、Ｔ細胞の助けを必要とする（Shivakumar, S. et al.(1989), J Immunol 143: 103−112）。自発的ＩｇＧ産生のＴ細胞による調節についての以前の研究によると、健常人ではＣＤ８＋Ｔ細胞が抗体産生を阻害するのに対し、ＳＬＥではこの細胞が代りにＢ細胞機能を支持する（Linker−Israeli, M. et al.(1990), Arthritis Rheum 33: 1216−1225）。他の自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチや多発性硬化症において、抗体よりもむしろＴ細胞が組織損傷の原因であり炎症をもたらす（Panayl GS et al. Anthritis Rheum (1992) 35: 725−775, Allegretta M et al. Science (1990) 247: 718−722)。
【００４２】
従って、本発明は、抗体−およびＴ細胞−仲介自己免疫疾患を処置する方法に関し、自己免疫異常の患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取りだし、その細胞を調節組成物で処置する。
【００４３】
理論に拘束されるわけでないが、本発明方法が作動するには、いくつかの経路があるようである。その第１は、調節組成物で細胞を処置すると、処置細胞における抗体産生が直接抑制され、自己免疫症状の改善につながり得る。あるいは、または加えて、細胞の処置は調節性細胞を誘導して、他の細胞における抗体産生を下方調節する。本明細書における抗体はすべての形態の抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥなどを含む。明らかな結果は系における抗体量の低下である。
【００４４】
さらに、細胞の処置は、抗体仲介自己免疫症状の患者において細胞仲介免疫応答を高める。理論に縛られるものでないが、細胞の処置がＩＬ−１０とＴＮＦ−αとの均衡を修復して、Ｔｈ１サイトカインの産生を高め、細胞仲介免疫を正常化するようである。
【００４５】
さらに、ＴＧＦ−βを含む調節組成物で免疫細胞を刺激すると、細胞仲介免疫応答が抑制される。理論に縛られるものでないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激すると、活性ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくり、細胞仲介免疫応答を抑制するようである。あるいは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激すると、他のＴ細胞の活性化および/またはエフェクター機能を作用の接触依存性メカニズムによって抑制する。これらの作用には、ＴＧＦ−βの存在で活性化されるＣＤ４＋細胞を必要とする。
【００４６】
このように、本発明は、異常な免疫応答を阻害する。抗体仲介自己免疫異常の患者において、本発明は、調節組成物で末梢血Ｔ細胞を生体外で処置することにより、Ｔ細胞の能力を修復し、抗体産生を下方調節し、細胞仲介応答を修復する。細胞仲介異常の患者において本発明は、他のＴ細胞において細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する調節性Ｔ細胞をつくる。
【００４７】
「免疫応答」とは、外部または自己の抗原に対する宿主の応答を意味する。「異常免疫応答」とは、自己と非自己とを識別する免疫系のないこと、または外部抗原に応答しないことを意味する。換言すると、異常免疫応答とは、患者の症状をもたらしている不適当に調節された免疫応答である。「不適当に調節された」とは、不適当に誘発されること、不適当に抑制されること、および/または応答性のないことを意味する。異常な免疫応答は、限定でないが、生体自身の組織に対する抗体の産生により生じる組織損傷や炎症、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生の障害、作用の細胞毒性または非毒性メカニズムにより生じる組織障害を含む。
【００４８】
従って、好ましい実施態様において、本発明は患者の抗体仲介自己免疫異常を処置する方法を提供する。「抗体仲介自己免疫疾患」とは、個体が自己の細胞または組織の構成成分に対する抗体を発生する疾患を意味する。抗体仲介自己免疫疾患には、限定するのではないが、全身性エリマトーデス（ＳＬＥ）、天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑症、グレーブス症、皮膚真菌症、シェーグレン症などがある。本発明方法による処置に好適な疾患はＳＬＥである。
【００４９】
さらに、抗体仲介異常の患者は細胞仲介免疫応答において欠失をしばしば有する。「細胞仲介免疫応答の欠失」とは、感染に対する宿主防御の障害を意味する。感染に対する宿主防御の障害は、限定でないが、遅い過剰反応の障害、Ｔ細胞の細胞毒性の障害、ＴＧＦ−β産生の障害を含む。他の欠失は、限定でないが、ＩＬ−１０産生の増加、およびＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生の減少を含む。本発明の方法を用いて、精製Ｔ細胞を刺激して、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生を増加させ、ＩＬ−１０の産生を低下させる。この方法で刺激し得るＴ細胞は、限定でないが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を含む。
【００５０】
ある実施態様においては、抗体仲介異常を処置しない。
好ましい実施態様において、本発明は、患者における細胞仲介自己免疫異常を処置する方法を提供する。「細胞仲介自己免疫疾患」とは、個体の細胞が活性化または刺激されて、細胞毒性となり、自己の細胞または組織を攻撃する疾患を意味する。あるいは、個体の自己免疫細胞が他の細胞を刺激して作用の細胞毒性または非細胞毒性メカニズムによって組織障害を起こす。細胞仲介自己免疫疾患は、限定でないが、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、真性糖尿病、慢性関節リウマチおよび硬皮症などを含む。
【００５１】
自己免疫異常の「処置」とは、自己免疫異常の少なくとも１つの症状が、本明細書に記載の方法で改善されることである。その評価を種々の方法でなす。この評価には、患者側の主観的または客観的な因子が含まれる。例えば、疾患の免疫原性徴候を調べる。例えば、自発的抗体および自己抗体産生のレベル、ＳＬＥの場合は特にＩｇＧ産生のレベルを低下する。全Ｉｇ抗体または自己抗体のレベルを測定する。限定するものでないが、抗２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体、抗核タンパク質抗体、抗Ｓｍ、抗Ｒｈｏおよび抗Ｌａである。身体症状が変化する。例えば、ＳＬＥの皮疹の消失または減少である。腎機能検査を行って変化を調べる。炎症に関する組織障害について臨床検査を行う。循環免疫複合体レベルおよび血清補体レベルの低下も改善の証拠である。ＳＬＥの場合、貧血の減少も見られる。免疫抑制剤などの薬剤に対する患者の必要性が低下することも処置効果の証である。処置効果について他の判定方法は、自己免疫疾患分野の当業者にとって明らかであろう。
【００５２】
「患者」とは、処置の対象となる哺乳動物を意味するが、ヒトが好ましい。ある場合において、本発明方法は、実験動物、獣医学分野、疾患モデル動物にも使用され、これらの動物には、限定ではないが、マウスラット、ハムスターなどのゲッシ類および霊長類がある。
【００５３】
本発明では、患者から血液細胞を取り出す。一般に、標準的な方法で患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取り出す。「末梢血単核細胞」すなわち「ＰＢＭＣ」とは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）および単球を意味する。詳しく下記するように、調節組成物の主要な作用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＧ産生を抑制することである。好ましくは、ＰＢＭＣのみを採取する。赤血球または多形核白血球を患者に残すようにするか、これらを患者にもどす。これは既知の方法、例えば、白血球泳動(leukophoresis)で行う。一般に５から７リットルの白血球泳動工程を行う。患者からＰＢＭＣを基本的に採取し、他の血液成分を戻す。細胞サンプルの採取は、ヘパリンなど抗凝固剤の存在下で、既知方法により行う。
【００５４】
いくつかの実施態様においては、白血球泳動工程を必要としない。
一般に、ＰＢＭＣ含有のサンプルを種々の方法であらかじめ処理する。まず細胞を採取し、次いで採取に際して自動的に濃縮されていなければ、濃縮し、さらに精製および／または濃縮する。細胞を水洗し、計数し、緩衝液中に入れる。
【００５５】
一般的にＰＢＭＣを標準的方法で処置のために濃縮する。好ましい態様において、白血球泳動採取工程によってＰＢＭＣの濃縮サンプルを無菌の血球パックに得、ある種の試薬および／または調節組成物を含有せしめる。詳しくは下記する。一般に、追加の濃縮／精製工程を行なう。既知のＦicoll−Ｈypaque密度勾配遠心法などである。
【００５６】
好ましい態様において、ＰＢＭＣを洗い、血清タンパク質および溶性血液成分、例えば自己抗体、阻害剤などを既知方法で取り出す。一般に、生理媒質または緩衝液を加え、遠心法を行なう。必要に応じて繰り返す。ＰＢＭＣを生理培養液、好ましくはＡＩＭ−Ｖ血液なしの培地（Ｔechnologie）に再懸濁するが（血清がかなりの量の阻害剤を含有するので）、Ｈanksバランス塩溶液（ＨＢＢＳ）や生理塩緩衝液（ＰＢＳ）も使用する。
【００５７】
一般に、次いで細胞数を数える。一般に１×１０9から２×１０9の白血球を５−７リットルの白血球泳動工程から採取する。これらの細胞を大略２００ｍｌの緩衝液または培地に移す。
【００５８】
好ましい態様において、ＰＢＭＣを１以上の細胞型について富ます。例えば、ＰＢＭＳをＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞ついて富ます。このことは既知である（Gray et al.(1998),J.lmmunol.160:2248、出典明示により本明細書の一部とする。）。一般に、これは市販の免疫吸収カラムを用いるか、研究的方法で行なう（ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、溶出の非接着細胞をＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１１６、ＣＤ７４に対する抗体で処理し、免疫磁気ビーズで処理して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に富んだ集団を取る）。
【００５９】
好ましい実施態様において、ＰＢＭＣを自動化閉鎖系、例えば、Nexell Isolex 300i Magnet Cell Selection System において分離する。一般的に、これは、細胞の分離、活性化、抑制細胞機能の開発のために使用する方法の無菌性の確保および標準化の確保のために行う。
【００６０】
細胞に必要な前処理を一旦ほどこしてから、細胞を調節組成物で処置する。「処置」とは、細胞を調節組成物と共に十分な時間でインキュベートし、抗体および自己抗体産生を阻害する能力が、特に患者にもどしたときに、発生するようにすることである。インキュベーションは一般に生理的温度で行なわれる。上記したように、阻害が起きるのは、処置細胞による抗体産生の直接的抑制の結果か、患者リンパ臓器における抗体産生を下方調節する調節細胞の誘導の結果である。
【００６１】
「調節組成物」または「抗体産生阻害組成物」または「液素性阻害組成物」「非特異的免疫細胞阻害物質」または「特異的Ｔ細胞阻害物質」または「阻害組成物」または「抑制組成物」は、免疫応答の抑制を起こし得る組成物を意味する。この抑制は、Ｔ細胞活性化の阻害、自発的抗体および自己抗体の産生または細胞毒性の阻害を含む。一般に、これらの組成物はサイトカインである。適切な調節組成物は、限定でないが、抗ＣＤ２などのＴ細胞アクチベーター、例えば抗ＣＤ２抗体およびＣＤ２リガンド、ＬＦＡ−３、Ｔ細胞アクチベーターの混合物や組合せ物、例えば、コンカナバリン Concanavalin A（ＣｏｎＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αを含む。抗体抑制に好ましい調節組成物は、Ｔ細胞アクチベーター、ＩＬ−２、ＴＧＦ−βの混合物である。細胞毒性の抑制に好ましい組成物はＴＧＦ−βである。
【００６２】
調節組成物の濃度は、組成物の性質によって変ってくる。好ましい態様においては、ＴＦＧ−βが調節組成物の成分である。「トランスフォーミング成長因子−β」すなわち「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βファミリーのいずれか１つを意味する。３種のイソ型、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３がある。参照、Massague,J.(1980),J.Ann.Rev.Cell Biol 6:597。リンパ球および単球は、このサイトカインのβ１のイソ型である(Kehrl,J.H.et al.(1991),lnt J Cell Cloning 9:438−450)。ＴＧＦ−βは、処置される哺乳動物に対して活性であるＴＦＧ−βのすべての型であり得る。ヒトでは、組換えＴＦＧ−βが現在のところ好ましい。好ましいヒトＴＧＦ−βは、Genzyme Pharmaceuticals，Farmington，MA．から購入できる。一般に、ＴＧＦ−βの濃度は、細胞懸濁液の約２picogram／ｍｌから約５nanogramであって、約１０ｐｇから約４ｎｇが好ましく、約１００ｐｇから約２ｎｇが特に好ましく、１ｎｇ／ｍｌが理想的である。
【００６３】
好ましい態様において、ＩＬ−２を調節組成物で用いる。ＩＬ−２は、処置される哺乳動物に対して活性であるＩＬ−２のすべての型であり得る。ヒトでは組換えＩＬ−２が現在のところ好ましい。組換えＩＬ−２は Cetus，Emerville、CA.から購入できる。一般に、使用されるＩＬ−２の濃度は、細胞懸濁液の約１Ｕnit／ｍｌから約１００Ｕ／ｍｌであり、約５Ｕ／ｍｌから約２５Ｕ／ｍｌが好ましく、１０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。好ましい態様においてＩＬ−２は単独で用いない。
【００６４】
好ましい態様において、抗ＣＤ２抗体またはＣＤ２リガンドＬＦＡ−３などのＣＤアクチベーターを、調節組成物として用いる。ＣＤ２はＴリンパ球により発現される細胞表面グリコタンパク質である。「ＣＤ２アクチベーター」とは、ＣＤ２情報伝達経路を開始する化合物を意味する。好ましいＣＤ２アクチベーターには、抗ＣＤ抗体（OKT11,American Type Culture Collection,Rockville MD）が含まれる。一般に、ＣＤ２アクチベーターの濃度は、ＴＧＦ−βの産生を誘導するのに十分なものである。抗ＣＤ２抗体の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌの範囲にあり、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌが特に好ましい。
【００６５】
いくつかの態様においては、細胞を活性化するためにマイトジェンの使用が望ましい。すなわち、多くの休止相細胞は多量のサイトカイン受容体を含有していない。ＣoncanavalinＡなどのマイトジェンを使用すると細胞が刺激されて、サイトカイン受容体が産生し、本発明方法をさらに効果的にする。マイトジェンを用いるとき、既知方法で知られているように、その濃度範囲は１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌである。さらに、既知方法のように、ＣｏＡを離す成分、例えばα−メチルマンノシッドと共に細胞を洗うのが望ましい。
【００６６】
好ましい実施態様において、Ｔ細胞を、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８などのマイトジェンあるいはモノクロナール抗体の組み合せ、すなわち自己抗原と補刺激物質としてのＣＤ２８やＩＬ-２でもって刺激する。ＣｏｎＡもＴ細胞の刺激に使用する。第２培養におけるＴＧＦ−βのありなしでのＴ細胞の反復刺激は最大抑制活性を得るのに必要なようである。
【００６７】
好ましい実施態様において、本発明は、Ｔ細胞をＴＧＦ−βで調整することを含む。このＴ細胞には、限定でないが、ＣＤ８＋ＴやＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８−ＣＤ４−などの他のマイナーＴ細胞サブセット、ＮＫ細胞などが含まれる。これらのＴ細胞は、他のＴ細胞が細胞毒性エフェクター細胞になるのを防ぐ。
【００６８】
好ましい実施態様において、本発明は、ＣＤ８＋ＴまたはＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βで調整して、免疫抑制レベルのＴＧＦ−βをつくる方法を含む。
好ましい実施態様において、本発明は、ＣＤ８＋ＴまたはＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βで調整して、接触依存性メカニズムにより抑制されるＴ細胞をつくる方法を含む。
【００６９】
好ましい実施態様において、本発明は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激物質で処置して、該ＣＤ４＋細胞が免疫抑制レベルの活性ＴＧＦ−βをつくるようにすることを含む方法を提供する。
【００７０】
好ましい実施態様において、本発明は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βの存在下に刺激してＣＤ４＋細胞数を増やすことを含む方法を提供する。
好ましい実施態様において、本発明は、ＩＬ−１０の産生を減少し、併せてＴＮＦ−αの産生を増加する方法を提供する。
【００７１】
調節組成物を細胞と共に、効果を発揮するに十分な時間インキュベートする。好ましい態様において、細胞は、調節組成物での処置に続いて、患者にもどす。好ましい態様において、細胞と調節組成物とのインキュベーションは、約１２から約７日行なう。この時間は望む抑制活性により変る。抗体産生の抑制については、４８時間が特に好ましい。細胞毒性の抑制については、５日が特に好ましい。
【００７２】
ある態様において、細胞を一定の時間インキュベートし、水洗して調節組成物を除去し、再びインキュベートする。患者に導入する前に、ここに概記したように細胞を好ましくは水洗し、調節組成物を除去する。試験または検査のために、さらなるインキュベーションも行うことができ、数時間から数日間である。患者への導入前に抗体産生の検査をしょうとするときは、細胞を数日間インキュベートすると、抗体産生（またはその非産生）が明らかになる。
【００７３】
細胞の処置後すぐに、患者に自動的に再移行する前に細胞を検査することができる。例えば、細胞を採取して行う。無菌検査、グラム染色、微生物学的検査、ＬＡＬ試験、マイコフラズマ検査、細胞型同定のためのフローサイトメトリー、機能検査などである。同様に、これらの検査などの試験を処置の前や後に行うことができる。
【００７４】
好ましい態様において、抗体産生の定量や定性（すなわちタイプについて）をなし得る。例えば、抗体の全レベルあるいは抗体の具体的なタイプを調べる。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、抗ＤＮＡ自己抗体、抗核タンパク質（ＮＰ）抗体などの具体的なタイプについてである。調節性Ｔ細胞も、Ｔ細胞活性を抑制する活性、インビトロで特異的な標的細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を防ぐ活性について、検査できる。
【００７５】
好ましい態様において、抗体、特にＩｇＧのレベルの検査をＥＬＩＳＡアッセイなどの既知の方法（Abo et al.(1987),Clin Exp.lmmunol.67:544 and Linker−Israeli et al.(1990),Arthritis Rheum 33:1216, 出典明示により本明細書の一部とする。）で行なう。これらの技術は自己抗体などの特異的な抗体のレベルを検出するのにも用い得る。
【００７６】
好ましい態様において、処置によって産生ＩｇＧおよび自己抗体の量の有意な低下が起きる。低下は、少なくとも１０％が好ましく、少なくとも２５％が特に好ましく、少なくとも５０％が特別に好ましい。多くの態様において７５％以上の低下がみられる。
【００７７】
好ましい態様において、移行前に全または活性のＴＧＦ−βの量も検査できる。記載のように、ＴＧＦ−βを移行後に活性化される潜在的前駆物質としてつくる。
【００７８】
処置後、細胞を患者に移行すなわち再導入する。一般に既知のよう行ない、通常は静脈投与によって処置細胞を患者に注入すなわち導入する。例えば、無菌シリンジなどの移行手段を用いて注射により５０ｍｌのＦenwall注入バッグに細胞を入れる。次いで細胞をすぐに静脈投与によって一定の時間、例えば、１５分間で患者の自由に流れている静脈に注入する。ある態様では、緩衝剤や塩などの追加の試薬も加え得る。
【００７９】
細胞を患者に再導入後に、処置の効果を所望に応じて、上記の方法で検査できる。すなわち、疾患の免疫原性徴候を検査する。例えば、全抗体または特異的な免疫グロブリンの力価、腎機能、組織障害などを検査する。Ｔ細胞の機能についての試験、例えば、Ｔ細胞数、表現型、活性状態、抗体および／またはマイトジェンに応答する能力などについても検査し得る。
【００８０】
処置は必要に応じて繰り返えす。例えば、数週の期間で週１回、または時間の期間で数回、例えば、２週間に３−５回行う。一般に、自己免疫疾患の症状の改善はなんらかの期間、好ましくは少なくとも数カ月続く。その間に患者が症状の再起を感じると、その時点で処置を繰り返えす。
【００８１】
好ましい態様において、本発明方法を実行ため、すなわち細胞を調節組成物と共にインキュベートするためのキットを提供する。キットはいくつかの成分を含有する。キットは、抗体仲介自己免疫疾患の患者からの細胞を受容するのに用いられる細胞処置容器を含む。この容器は無菌とする。ある態様において、細胞処置容器を細胞採取に用いる。例えば、入口を介して白血球泳動器と共に用いる。他の態様では、分離した細胞採取容器を用い得る。
【００８２】
好ましい実施態様において、キットは、細胞仲介異常の患者からの細胞を受けるように調整された細胞処置容器を含む。キットはまた、特異的Ｔ細胞サブセットを精製し、それを患者に戻すように増やすために、自動化閉鎖系での使用に調整できる。
【００８３】
細胞処置容器の形および材質は様々であり、当業者によく知られている。一般に、容器はいくつかの異なる形態を取る。例えば、ＩＶバッグのような柔かいバッグであり、または細胞培養器のような硬い容器である。攪拌できるようになっている。一般に、容器の材質は何でもよいが、生物学的に非活性の物質であり、例えばガラス、ポリプロピレンやポリエチレンなどを含むプラスチックである。細胞処置容器は１以上の入口または出口を有し得る。細胞、試薬、調節組成物などの導入または取り出しのためのものである。例えば、容器は、患者に再導入する前の分析のために細胞のフラクションを採取するためのサンプル採取口を有する。同様に、容器は、患者に細胞を導入するための出口を有する。例えば、容器はＩＶ装置につけるためのアダプターを含み得る。
【００８４】
キットは調節組成物の少なくとも１つの用量を含む。本明細書での「用量」とは、サイトカインなどの調節組成物の１つの量で、作用を発揮するのに十分な量を意味する。ある場合には、複数の用量物を含む。ある態様において、用量物の細胞処置容器への添加は入口を介して行なう。あるいは好ましい態様において、用量物は細胞処置容器にすでに存在している。好ましい態様において、用量物は安定性のために乳濁形態にあり、細胞培養液や他の試薬を用いて再生する。
【００８５】
ある態様において、キットは少なくとも１種の試薬を追加的に含む。それには緩衝液、塩、培養液、タンパク質、薬剤などがある。例えば、マイトジエン、モノクローナル抗体、細胞分離のための処置磁気ビードを含み得る。
ある態様において、キットはその使用に際しての説明書を追加的に含む。
【００８６】
下記の実施例は、上記の本発明をより完全に記述したものであり、また、本発明の種々の態様を実施するために考えられる最上の方法を記述した。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものでなく、説明の目的のために提示される。出典明示されたすべての引用文献は全体を本明細書の一部とする。
【００８７】
実施例
実施例１
ＩＬ-２およびＴＦＧ-βの混合物によるＰＢＭＣの処置
実施例１によって示されるのは、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２およびＴＦＧ-βで比較的簡単に処置することにより、自発的ポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体産生が顕著に阻害されることである。下記で考察するように、１２人の活動性ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを、ＴＧＦ-βの存在または非存在で３日間ＩＬ-２に曝露し、洗浄し、そして７日以上培養した。ＩｇＧ分泌の平均減少は７９％であった。最も強力な阻害効果は、最も顕著なＢ細胞の活動過剰の場合に観察された。抗核タンパク質(ＮＰ)抗体の自発的産生が観察されたのは４例あり、ＰＢＭＣのサイトカイン処置により自己抗体産生は、５０から９６％減少した。ＩＬ-２は、個々の患者におけるＴＧＦ-β依存性または非依存性の何れかの機構による抗体産生を阻害した。活動性ＳＬＥ患者における抗ＣＤ２刺激性ＩｇＧ産生の試験では、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βがＩｇＧ産生におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の促進効果を逆転し、代わりに抑制活性を誘発し得る。
【００８８】
方法
自発的抗体合成についての被験者
１２人の被験者をＳＬＥ診断で選択した。それらはＳＬＥを分類するＡＲＡ基準(Arnett, F.C. et al., (1998), Arthritis Rheum 31: 315-324)を満たしていた。これらの患者はすべて女性であり、スペイン人８人、アフリカ系アメリカ人２人、そしてアジア人２人であった。それぞれの患者の年齢および病歴を表１に示す。５人が入院患者で、７人は外来患者であった。コルチコイド（コルチコステロイド）および抗マラリア薬を投与されている患者も表示した。８人の患者が未処置であった。疾患活動性を、ＳＬＡＭ(Liang, M.H. et al., (1989), Arthritis Rheum 32:1107-1148)およびＳＬＥＤＡＩ(Bombardier, C. et al., (1992), Arthritis Rheum 35:630-640)で評価すると、それぞれ平均値１６．５および１３．４であった。
表１
ＳＬＥ患者の概略
【表１】
【００８９】
試薬
組換え体ＴＧＦ-βおよびモノクローナル抗ＴＧＦ-β(1D11.16)抗体、ネズミＩｇＧ１は、Dr. Bruce Pratt(Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA)から好意的に提供された。組換え体ＩＬ-１０およびモノクローナル抗ＩＬ-１０(JES3-19F1)抗体および対照ラットＩｇＧ２ａは、Dr. Satwant Narula(Schering Plough Pharmaceuticals, Kenilworth, NJ)から好意的に提供された。対照マウスＩｇＧ１骨髄腫タンパク質は、Calbiochem, San Diego, CAから購入した。組換え体ヒトＩＬ-２は、Chiron, Emmeryville, CAより購入した。ＯＫＴ１１を用いた抗ＣＤ２分泌ハイブリドーマ抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC）Rockville、MDから得、ＧＴ２は、A. Bernard, Nice, Franceから好意的に提供された。他の抗体には、J. Unkeless, New York, NYから好意的に提供された抗ＣＤ４(ＯＫＴ４、ＡＴＣＣ)、抗ＣＤ８(ＯＫＴ８、ATCC;ＣＤ８、Dako, Carpentaria, CA)、抗ＣＤ１１ｂ(ＯＫＭ１、ATCC)、抗ＣＤ１６(３Ｇ８)；抗ＣＤ２０(Ｌｅｕ １６、Becton Dickinson, San Jose, CA)および抗ＣＤ７４(Ｌ２４３、ATCC)が含まれていた。
【００９０】
血中単核細胞の単離
末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll-Hypaque(Pharmacia, Piscataway, NJ)密度勾配遠心分離によりヘパリン処理静脈血から調製した。単核細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ(Life Technologies, Grand Island, NY)で洗浄し、血小板を取り除いた。それはＴＧＦ-βを多く含んでいる。
【００９１】
細胞培養の手順
細胞培養の手順は以前述べられている通りである(Wahl, S.M. (1994), J Exp Med 180: 1587-1590; Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160: 2248-2254)。簡単に言うと、２ｘ１０5のＰＢＭＣを、血清を含まないＡＩＭ-Ｖ培養培地(Life Technologies)中、記載のサイトカインを含むか、または含まない９６-ウェルの底の平らなマイクロタイタープレートにおいて培養した。培養３日後、ＰＢＭＣを３回洗浄し、次いで、新たに血清を含まない培地を添加した。更に３７℃で７日後、上清を回収し、以前に述べられている(Linker-Israeli, M. et al., (1990), Arthritis Rheum 33: 1216-1225)通り固相酵素結合免疫収着検定(ＥＬＩＳＡ)によりウシ胸腺核タンパク質(ＮＰ)と反応する全ＩｇＧおよび自己抗体を検定する。光学的密度(ＯＤ)の読み値を、陽性および陰性標準を用いる標準曲線より、ｕｎｉｔｓ／ｍｌ(Ｕ／ｍｌ)に変換した。ＳＬＥ患者(高力価の抗ＮＰ抗体を有する)および健康な被験者のＰＢＭＣ培養の上清を対照として用いた。
【００９２】
統計学的分析
データをGraph Pad, Prism software(San Diego, CA)を用い分析した。データの対数変換および非パラメーター性マン‐ホイットニー試験後、分散(ANOVA)分析を使用した。
【００９３】
抗ＣＤ２誘発ＩｇＧ合成
抗ＣＤ２刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞に対する、ＮＫ細胞と共にまたはＮＫ細胞を伴わずに培養したＣＤ８＋Ｔ細胞の効果を、ＳＬＥ患者および正常対照者で試験した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、以前述べられている通りに、免疫磁性ビーズを用いる陰性選択により、ナイロン非付着性リンパ球から調製した(Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160:2248-2254)。ＣＤ４＋細胞の場合、ナイロン非付着性細胞をＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ７４に対する抗体で染色した。同じ抗体を用い、ＣＤ８＋細胞が得られた。ただし、ＣＤ４をＣＤ８と置き換える。ＣＤ４＋細胞の純度は９５％であり、ＣＤ８＋細胞は８９％であった。ＮＫ細胞を得るため、ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、そして溶出した非付着性細胞をＡＥＴ処置ヒツジ赤血球細胞で即座にロゼットした。次いで、非ロゼット画分を抗ＣＤ３および抗ＣＤ７４(抗ＨＬＡ-ＤＲ)抗体で染色し、免疫磁性ビーズ(Dynal)を用い反応細胞をなくした。得られた群にはＣＤ５６＋が９８％およびＣＤ３が０．５％未満およびＣＤ２０＋リンパ球が０．５％未満含まれていた。ＳＬＥ Ｂ細胞が大量のＩｇＧを自発的に分泌するため、そして、これらの試験に多数のＢ細胞を調製するのに多量の血液を必要とするため、本試験では、健康な被験者ドナーの休止Ｂ細胞を患者のＢ細胞の代用とした。Ｂ細胞を得るため、ナイロンウール付着性細胞を、直ぐにＳＲＢＣでロゼットし、任意のＴ細胞を除去し、単球および機能性ＮＫ細胞を完全に除去するため５ｍＭ Ｌ-ロイシンメチルエステルで処理した。得た集団ではＣＤ２０＋が９２％を超え、ＣＤ３＋が０．５％未満であった。
【００９４】
結果
１２人の試験患者において、自発的ＩｇＧは０.４から１３.７μｇ／ｍｌの範囲であった(図１)。ＰＢＭＣをＩＬ-２±ＴＧＦ-βに７２時間曝露することにより、ＩｇＧ合成が、試験した１２例のうち８例で、少なくとも５０％減少した(平均減少７９％、ｐ＝０.００８、Mann Whitney)。最も劇的な減少は、最も顕著なＢ細胞の活動過剰の場合に観察された。分泌するＩｇＧ量とＩＬ-２およびＴＧＦ-βによる阻害％との相関関係は、ｒ＝０.６４７、ｐ＝０.０２であった。
【００９５】
ＩＬ-２およびＴＧＦ-β単独の効果を、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの組み合わせと比較した。図２によって示されるのは、これらサイトカインのそれぞれがまたＩＬ-２産生を阻害することである。しかし、対数変換によるデータの正規分布の達成および複数比較のためのBonnferoni補正適用後では、分散分析から、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの組合せによってのみ有意な阻害(ｐ=０.０５)が生ずることがわかる。
【００９６】
ＩＬ-１０産生はＳＬＥ中で増加しており(Llorente, L. et al., (1993), Eur Cytokine Network 4:421-427)、このサイトカインはＩＬ-２およびＴＧＦ-βの両方の産生を阻害し得る。９例において、我々はまた、抗ＩＬ-１０の効果を調べたが、ＩｇＧ合成の幾分の低下が数例で観察されたのみであり、この違いは統計的に有意でなかった。同様に、ＴＮＦ−α産生も一部のＳＬＥ患者で減少する(Jacob, C.O. et al., (1990), Proc Natl Acad Sci 87:1233-1237)。また、このサイトカインは活性ＴＧＦ-βの産生を増加するが(Ohtsuka, K. et al., (198), J Immunol 160:2539-2545)、ＴＮＦ−αを培養に加えることにより最小の効果を生じた(結果は示していない)。
【００９７】
抗核タンパク質（ＮＰ）自己抗体の自発的産生につきＳＬＥ ＰＢＭＣを試験し、有意な力価が４例みられた。ＰＢＭＣをＩＬ-２またはＩＬ-２とＴＧＦ-βのどちらかに曝露した場合の全例において、少なくとも５０％の抗ＮＰ産生が阻害された。ＴＧＦ-β自身は効果がなかった(表２)。これらの場合、ＩＬ-２自身の効果は、ＩＬ-２とＴＧＦ-βとの組み合わせの場合と同等であった。
【００９８】
【表２】
【００９９】
ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２(１０u/ｍｌ)およびＴＧＦ-β(１０ｐｇ/ｍｌ)に７２時間さらした。その細胞を洗浄し、更に７日間培養した。上清中に放出された抗ＮＰをＥＬＩＳＡで測定した。
【０１００】
以前、我々が報告したのは、ＩＬ-２により生物学的に活性なＴＧＦ-β(Ohtsuka, K. et al., (1998), J Immunol 160: 2539-2545)の産生が増加することである。そのため、自発的抗体合成におけるＩＬ-２の少なくとも幾つかの効果がＴＧＦ-βで仲介される可能性があった。この可能性について、ＩＬ-２の効果が抗ＴＧＦ-β中性化抗体により逆転され得るかどうかを測定することにより調べた。図３Ａに示した例では、抗ＴＧＦ-βの添加は自発的ＩｇＧ合成に影響を与えなかった。しかし、ＴＧＦ-βの拮抗物はＩｇＧ合成におけるＩＬ-２の阻害効果をなくした。この患者(表２のケースＣ)のＰＢＭＣもまた、抗ＮＰ抗体を自発的に産生した。ここで、抗ＴＧＦ-βも、抗ＮＰ産生におけるＩＬ-２の阻害効果をなくした(図３Ｂ)。即ち、この被験者おいて、自発的ＩｇＧおよび自己抗体合成に対するＩＬ-２の阻害効果はＴＧＦ-βを介していた。抗ＴＧＦ-βのこの効果は、試験した８例のうち４例で記録された。故に、ＩＬ-２の阻害効果は、ＴＧＦ-β依存性または非依存性であり得る。各効果の例を表３に示す。
【表３】
【０１０１】
ステロイド治療開始後２８日のＳＬＥ患者において試験を繰り返す機会を得た(表４)。処置前には、自発的ＩｇＧ合成はＩｇＧ２μｇ／ｍｌよりも多かった。ＰＢＭＣをＩＬ-２に曝露すると、これがＩｇＧ産生を顕著に阻害し、ＴＧＦ-βは適度な効果を有した。コルチコステロイド治療の後、自発的ＩｇＧ産生は７５％減少した。上記の通り、ＰＢＭＣをＩＬ-２±ＴＧＦ-βに曝露すると、ＩｇＧ産生は５０％減少した。しかし、この阻害は抗ＴＧＦ-βにより逆転した。ここでさらに、ＩＬ-２のこの効果は、内在性活性ＴＧＦ-βの上方制御によるものと説明できよう。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
健康な被験者についての我々の先の試験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βが活性化ＣＤ＋Ｔ細胞を誘導し、Ｉｇ産生を下方制御することから、本試験でＳＬＥ患者からのＣＤ８＋Ｔ細胞の単離および処置を試みた。先の試験が不成功であったのは、自発的抗体合成に顕著な可変性があること、および細胞分離法のために活動性ＳＬＥ患者からの大量の血液を必要とすることであった。しかし、我々は、活動性ＳＬＥの患者の１人から十分な血液を得ることができ、抗ＣＤ２誘導ＩｇＧ合成のＣＤ８＋Ｔ細胞調節に対するＩＬ−２およびＴＧＦ−βの効果を調べた。抗ＣＤ３とは異なり、抗ＣＤ２モノクローナル抗体のマイトジェン性組合わせが、ＰＢＬを誘導しないで、ＩｇＧを産生することを、我々は最近報告した(Gray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:2248-2254)。例を図４Ａに示す。これは、抗ＣＤ２がＮＫ細胞を刺激してＴＧＦ−βを産生し、それが順番にＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、抗体産生を下方制御するためであった(Gray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:2248-2254)。この患者において、我々が以前に報告したように(Gray J. D. et al. (1994), J Exp Med 180:1937-1972)、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩｇＧ合成を増加し、ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の組合わせにより増加が著しく強化された(図４Ａ)。一方、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＳＬＥ ＣＤ８＋Ｔ細胞のヘルパー効果を無くし、これらの細胞がＩｇＧ産生を抑制することを可能にした。ＩＬ−２およびＴＧＦ−βのこの阻害効果はＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に依存した(図４Ｂ)。このように、ＩＬ−２およびＴＧＦ−β効果がＣＤ８＋Ｔ細胞により仲介され得るという証拠が得られた。
【０１０４】
これらの試験は、ＰＢＭＣのＩＬ−２およびＴＧＦ−βへの短い暴露により、ＳＬＥ、特に重症な疾病の患者および著しいＢ細胞活動亢進の患者において、続く自発的ポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体産生を大きく減少できることを証明した。この試験は、ＩＬ−２が抗体産生を阻害できることを示す先の報告(Hirohata, S. et al. (1989), J Immunol 142:3104-3112およびFast, L. D. (1992), J Immunol 149:1510-1515)を確認し、ピコモル濃度のＴＧＦ−βがこの下方制御の一因となり得ることを明らかにする。試験した１２名の患者のグループにおいて、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βのポリクローナルＩｇＧ合成に対する阻害効果は、ＩＬ−２単独より大きかった。しかし、ＩＬ−２の阻害活性は異なっていた。試験した８名のうち４名において、阻害はＴＧＦ−β依存的であり、中和化抗ＴＧＦ−β ｍＡｂが作用を無くした。残りの例において、ＩＬ−２の下方制御効果はＴＧＦ−β非依存的であった。同様に、自発的抗ＮＰ自己抗体産生におけるＴＧＦ−β依存的および非依存的阻害の両方が証明された。また、我々がＩＬ−１０の拮抗およびＴＮＦ−α添加についての効果を調べたのは、ＳＬＥにおけるこれらサイトカイン産生の異常について、先に記載されていたためである(Llorente L. et al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421-427; Jacob, C.O. et al. (1990), Proc Natl Acad Sci 87:1233-1237)。しかし、これらの方法は、リンパ球が先に活性化されているとき、自発的抗体合成に対する最小の効果を示した。
【０１０５】
ＳＬＥにおけるＢ細胞活動亢進の程度が疾病活動性と相関するという他の報告がある(Blaese, R. M. et al. (1980), Am J Med 69:345-350; Klinman, D. M. et al. (1991), Arthritis Rheum 34:1404-1410)。このことが本試験で起きなかったのは、同時薬剤治療によるためであろう。概して、著しい自発的抗体合成の患者は処置せず、かわりにＢ細胞活性が低い患者にはプレドニゾンを普通に投与した。我々はコルチコステロイド治療開始後に著しく自発的ＩｇＧ合成が減少した一つの例を提示する。この患者のＢ細胞は、処置前に抗ＮＰ抗体も分泌したが、この自己抗体の産生はステロイド治療後に検出されなくなった(データは示していない)。
【０１０６】
ＴＧＦ−βは、組織修復、炎症および免疫調節において重要なサイトカインの多機能性ファミリーから成る(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641)。ＴＧＦ−βは、不活性前駆体分子として分泌され、細胞外で生物学的活性形に変換する点で、多くの他のサイトカインと異なる(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641; Flaumenhaft, R. et al. (1993), Adv Pharmacol 24:51-76)。実験的自己免疫脳炎(Weiner, H. L. et al. (1994), Annu Rev Immunol 12:809-837)および大腸炎(Neurath, M. F. et al. (1996), J Exp Med 183:2605-2516)のような種々の実験的自己免疫モデルは、このサイトカインを産生する。ＴＧＦ−βは、ナノモル濃度で免疫抑制性であり、ＴおよびＢ細胞増殖、ＮＫ細胞の細胞毒性活性およびＴ細胞の細胞毒性発生を阻害できる(Letterio, J. J. et al. (1998), Ann Rev Immunol 16:137-162)。対照的に、ＴＧＦ−βはマウスＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の増殖を促進する(Kehrl, J. H. et al. (1986), J Exp Med 163:1037-1050; Lee, H. M. et al. (1993), J Immunol 151:668-677)、およびＢ細胞分化を促進できる(Van Vlasselaer, P. et al. (1992), J Immunol 148:2062-2067)と報告されている。
【０１０７】
健康な被験者から得たリンパ球で調節性Ｔ細胞を発生させるという先の試験において、使用したＴＧＦ−βの濃度は、ＴまたはＢ細胞機能の阻害に必要とされるピコモル濃度より低かった(Gray, J. D.ら（1998）,J Immunol 160:2248-2254；Gray,J. D.ら（1994），J Exp Med 180：1937-1942)。同様の濃度をＳＬＥ患者での本発明の試験において使用すると、ＴＧＦ−β自体が抗体合成に対して僅かな阻害効果を有していた。前記の通り、ＴＧＦ−βとＩＬ−２の組み合わせが最も強力な阻害をもたらした。先の試験において、この効果はＣＤ８＋ Ｔ細胞により仲介された。
【０１０８】
ＩＬ−２について、Ｔ抑制細胞活性の誘発に対する効果が十分確立されている(Hirohata，S. ら（1989),J Immunol 142：3104−3112；Fast，L. D.，J Immunol 149：1510-1515)が、これらの効果が直接的なものであるか、または間接的なものであるかどうかは明らかではない。マウスにおいて、ＩＬ−２遺伝子の欠失は、大量のリンパ球増殖および自己免疫疾患を生ずる(Sadlack，B.ら（1995）,Eur J Immunol 25：3053-3059)。ＳＬＥにおいて、ＩＬ−２レベルとＢ細胞機能亢進との負の相関関係が報告されている(Huang，Y. P.ら（1988)，J Immunol 141:827-833)。以前、ＳＬＥでＩＬ−２によって自発的Ｉg産生を阻害しようと試みたが、しかしながら、その結果は極めて可変的であった。強い阻害を幾つかの場合において観察したが、一方で他のＩＬ−２では抗体産生が著しく増大した。我々は、時期およびサイトカイン環境により、この試験で見られる阻害よりもさらに一定した阻害が説明されると考える。ここで、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、全培養期間というよりはむしろ、最初の７２時間の培養の間にしか存在していなかった。後者の事例での抗体合成の増加は、Ｂ細胞分化に対するＩＬ−２の正の効果によって説明し得る(Coffman，R. L.ら(1988)，Immunol Rev 102:5-28)。ＩＬ−２は、抗体産生を幾つかの機構により下方制御することができる。該報告に記載されているＴＧＦ−β回路に加えて、ＩＬ−２が誘発する阻害は、ＩＦＮ−γの上方制御(Noble，A.ら(1998)，J Immunol 160:566-571)により、または細胞溶解機構(Stohl，W.ら(1998)，J Immunol 160:5231-5238;Esser,M. T.ら(1997)，J Immunol 158:5612-5618)により起こり得る。
【０１０９】
以前、我々は、抗体合成に対するＮＫ細胞の調節効果を調べ、ＮＫ細胞の直接的効果がＩgＧ合成を上方制御することである(Kinter，A.ら(1995)，Proc Natl Acad Sci USA 92：10985-10989)が、これらのリンパ球が、正常な被験者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞との培養の場合、正反対の効果を有すると報告した(Gray，J. D.ら(1994)，J Exp Med 180:1937-1942)。しかしながら、ＳＬＥ患者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞との組み合わせがＩgＧ産生を高める(Linker-Israeli，M.ら(1990)，Arthritis Rheum 33：1216-1225)。これは、本発明の報告において再び観察された。正常な被験者では、ＮＫ細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞に添加すると、抗ＣＤ２刺激ＩgＧ合成を著しく阻害したが、正反対のことがＳＬＥにおいて観察された。標準的試験から、ＮＫ細胞から得たＴＧＦ−βがＣＤ８＋Ｔ細胞の同時刺激を誘発して、ＩgＧおよびＩgＭ産生を下方制御することがわかった(Gray，J. D.ら(1998)，J Immunol 160：2248-2254)。この試験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞による中程度の抑制活性を誘発した。従って、ＳＬＥにおいて、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βがＢ細胞活性を阻害する少なくとも１つの方法は、調節性Ｔ細胞を発生させることによるものであるらしい。加えて、これらまたは他のサイトカインで処理した他のリンパ球群もまた、ＳＬＥにおけるＢ細胞活性を下方制御し得る。
【０１１０】
実施例２
疾患の活性および重症度とＴＧＦ−β産生との相関関係
全体および活性型のＴＧＦ−βのリンパ球産生が減少することが分かったので、次に、これらの欠失が疾患の活性および／または重症度と関連があるかどうかを調べた。１７人の検査したＳＬＥ患者から得た血液リンパ球によるＴＧＦ−β１産生を、１０人の慢性関節リウマチ(ＲＡ)患者および２３人の適応する健康な対照と比較した。ＲＡにおける活性ＴＧＦ−β１のレベルは、対照より低かったが、ＳＬＥにおける程度までは減少しなかった。ピコモル量で検出される構造性ＴＧＦ−β１および抗ＣＤ２刺激された活性ＴＧＦ−β１のレベルは、最近発症の非常に活性で重症なＳＬＥのために入院した６人の未処置患者において著しく減少し、処置され活性の低い疾患の１１人の患者においても同様に減少した。このように、活性ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性とは関連がなかった。これとは対照的に、全ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性と逆の相関関係があった。このように、ＴＧＦ−β１の潜在性前駆体のリンパ球分泌の欠陥は、疾患活性の結果として生じ得るが、前駆体分子をその活性型に転換する能力は、内因性細胞欠失となり得るようである。活性化される時点でのピコモル濃度量のＴＧＦ−β１へのＴ細胞の不十分な暴露は、抗体合成の下方制御の欠陥を生じ得る。このように、ＳＬＥにおける活性ＴＧＦ−β１のリンパ球産生の減少は、この疾患に特徴的なＢ細胞機能亢進に起因するのであろう。
【０１１１】
方法
試験の被験者
ＳＬＥの分類に関するアメリカ大学のリウマチ病学基準(Tan，E. M.ら(1982)、Arthritis Rheum 25：1271-1277)を満たすＳＬＥ診断を受けた１７人の被験者、ＲＡの分類に関するＡＣＲ １９８７ 改定基準 (Arnett，F. C.ら(1988），Arthritis Rheum 31:315-324)を満たすＲＡ診断を受けた１０人の被験者、および２３人の健康なドナーを試験した。ＳＬＥグループは、女性１５人および男性２人(スペイン人１５人、アフリカ系アメリカ人１人、アジア人１人)からなっていた。平均年齢は、３４.５歳(範囲：２０−７５歳)であった。６人の患者を入院させて、１１人を外来診療所に通わせた。入院患者は皆、入院するまでは未処置であり、試験した後、彼らに第一回用量のコルチコステロイドを投与した。外来患者には、プレドニゾンを２０mg未満を投与し、誰にも細胞毒性薬物を投与しなかった。疾患の活性を、平均値が各々６.６および７.６であるＳＬＡＭ(Liang，M. H.ら(1989)、Arthritis Rheum 32:1107-1118)およびＳＬＥＤＡＩ(Bombardier，C.ら(1992)、Arthritis Rheum 35:630-640)指数で評価した。ＲＡグループは、女性９人および男性１人(スペイン人９人、アジア人１人)からなっていた。平均年齢は、５０.９歳(範囲：３９−６７歳)であった。患者は皆、外来診療所に通わせ、軽度〜中程度に疾患活性を有していた。疾患の平均期間は９.５年であった。１人の患者にマイオクリシン(myochrysine)を投与し、３人の患者にプレドニゾン(１、１および２０mg)を投与し、３人の患者にメトトキサレートを投与し、１人の患者にスルファサラジンを投与した。健康なドナーを対照として、年齢、性別、および民族グループに関して可能な限り厳密に適応させた。
【０１１２】
表５
ＳＬＥ患者の２つのグループの臨床的特徴
【表５】
【０１１３】
試薬
使用した抗体は、抗ＣＤ２を分泌するハイブリドーマ(ＯＫＴ１１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)，Rockville，MD、およびＧＴ２は、Alain Bernard博士，Nice，Franceにより入手可能となった)の上清であった。ＴＧＦ−βイソ型 １、２、および３(１Ｄ１１)を認識するモノクローナル抗体、ＴＧＦ−βイソ型 ２および３(３Ｃ７)に対する抗体、並びにrＴＧＦ−β２は、Bruce Pratt博士(Genzyme Pharmaceuticals，Farmington，MA)により快く提供された。
【０１１４】
血液リンパ球の単離
先に記載した方法(Ohtsuka，K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)を使用して、Ｆicoll−Ｈypaque(Pharmacia, Piscataway, NJ)密度勾配遠心分離により、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をヘパリン処置した静脈血から調製した。単核細胞を、５mＭ ＥＤＴＡ(Life Technologies, Grand Island，NY)を含むＰＢＳで洗浄して、ＴＧＦ−βの豊富な原料である血小板を取り除いた。連続Ｐercoll(Pharmacia)密度勾配によって、末梢血リンパ球(ＰＢＬ)を遠心分離によりＰＢＭＣから分離した。高密度のリンパ球に富む画分に残留する単球のパーセンテージは、ＳＬＥにおいて幾分高かった(８.５％ 対 ４.３％)。
【０１１５】
細胞培養方法
細胞培養方法は、以前に記載されている(Ohtsuka，K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)。簡単に言えば、１×１０5個のリンパ球を９６ウェルの平底マイクロタイタープレート(Greiner Rocky Mountain Scientific，Salt Lake City UT)のウェルに加えた。血清が著しい量の潜在性ＴＧＦ−βを含むことから、培養をＡＩＭ−Ｖ血清不含有培地(Life Technologies)で行った。抗ＣＤ２を最適濃度で使用して、ＴＧＦ−β産生(ＧＴ２ １：４０およびＴ１１ １：８０)ハイブリドーマ培養上清を誘導した。先の試験は、抗ＣＤ２がＰＢＬを強く刺激して、ＴＧＦ−βを産生することを明らかにしている(Gray，J. D.ら(1998),J Immunol 160：2248-2254)。
【０１１６】
ＴＧＦ−βアッセイ
ルシフェラーゼ・リポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化因子阻害剤(ＰＡＩ−１)プロモーターを含む発現構築物をトランスフェクトしたイタチ肺上皮細胞(ＭＬＥＣ)は、Ｄ. Ｂ. Ｒifkin博士，Ｎew Ｙork，ＮＹにより快く提供された。２×１０4／ウェルのＭＬＥＣを上清２００μlと共に３７℃で１８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性についてアッセイするために、ＭＬＥＣを細胞溶解試薬(Analytical Luminescence，Ann Arbor，MI)により溶解した。次いで、細胞溶解物をアッセイ緩衝液およびルシフェリン溶液(両方とも、Analytical Luminescenceから得た)と反応させた後、直ちに、照度計(Lumat，Berthold Analytical Instruments Inc.，Nashua，NH)で測定した。全ＴＧＦ−β活性を測定するために、試料を８０℃で３分間加熱して、潜在性複合体から活性サイトカインを放出させた。上清を加熱することなく、活性ＴＧＦ−βの活性を測定した。全てのアッセイおいて、幾つかの濃度のrＴＧＦ−βが標準曲線を作成するために含まれていた。同型培養の可変性は１０％未満であった(Ohtsuka,K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)。
【０１１７】
統計解析
ＧＢＳＴＡＴソフトウェア(Professional Statistics and Graphics Computer Program，Dynamic Microsystems Inc.，Silver Spring，MD)を使用して行うマン‐ホイットニー（Ｍann−Ｗhitney）試験およびＳpearman順位相関関係を使用して、結果の有意性を解析した。
【０１１８】
結果
ＳＬＥまたはＲＡの患者由来のＰＢＬにより産生される構造的および刺激されたＴＧＦ−β１を測定し、正常対照の値と比較した。培養上清中で検出されるサイトカインは、イソ形１、２および３を認識するｍＡｂで中和されたが、イソ形２および３に対するｍＡＢではされず、結果としてＴＧＦ−β１の産生を確認した。正常対照と比較して、活性ＴＧＦ−β１の構造的産生はＳＬＥで有意に減少した(１４±４対５６±２１pg／ml、ｐ＝０.０２、図５)。抗ＣＤ２刺激活性ＴＧＦ−β１も減少した(８７±２２対３９９±１０３pg／ml、ｐ＝０.００３)。ＲＡにおいて、構造的ＴＧＦ−β１の平均値は、ＳＬＥ(１９±５pg／mg)と同様であり、抗ＣＤ２により刺激された後、正常とＳＬＥの中間値であった(１９７±５４pg／ml)。
【０１１９】
リンパ球により産生された構造的全ＴＧＦ−β１も、正常グループと比較してＳＬＥで減少した(２８６±８２対６３１±１８５pg／ml、ｐ＝０.０５)。ＲＡでの値は、正常とＳＬＥの中間値であった(４３５±１６１pg／ml)。抗ＣＤ２の添加に続き、全ＴＧＦ−β１はＳＬＥで正常対照より幾分増加したが、差異は統計学的に有意でなかった。ＲＡグループでの値も正常とＳＬＥグループの中間値であった。
【０１２０】
ＴＧＦ−β１の減少したレベルと疾病活動性の相関関係の可能性を調べるために、ＳＬＥの入院患者と外来患者とを比較した。これらの２つのグループの臨床的特徴は、表５に要約する。入院患者の方が若かった；６名中５名が、３ヶ月以内の症状を示し；そして、著しく活動的な疾病に罹患していた；そして殆どが、腎炎および／または溶血性貧血を伴う重症ＳＬＥであった。比較して、外来患者は、処置により活動性が低くなった慢性疾病であった。疾病異種性、期間、活動性および重症度の著しい差異にもかかわらず、構造的および刺激ＴＧＦ−β１産生は、正常対照と比較して両グループで有意に減少した(表６)。
【０１２１】
【表６】
【０１２２】
活性および全ＴＧＦ−β１のレベルと疾病活動性との相関関係をみると、全ＴＧＦ−β１の抗ＣＤ２刺激産生は、ＳＬＥＤＡＩ指数と有意な負の相関関係があるが(ｒ＝０.５５、ｐ＝０.０３）、ＳＬＡＭ指数とは相関がなかった(−０.４３、ｐ＝１１)。ＳＬＥＤＡＩ指数は、中枢神経系関与および腎臓疾患に重きを置く。このように、ＴＧＦ−β１の前駆体形を分泌するリンパ球の能力の減少は、重症な疾病と関連するように見える。活性ＴＧＦ−β１のレベルは、疾病活動性と相関しなかった。
【０１２３】
本例での主な発見は、ＳＬＥでの活性ＴＧＦ−β１の産生減少が、疾病活動性または重症度と相関しないことである。構造的および刺激活性のＴＧＦ−β１量の減少は、最近発症した疾病および確立した疾病の両方の患者で見られた。更に、この値は、ＳＬＡＭおよびＳＬＥＤＡＩ指数で測定して活動性と、または生体臓器関与により評価した重症度と相関しなかった。しかし、全ＴＧＦ−β１産生がＳＬＥで減少もするが、この欠失は疾病活動性と相関するように見えた。これは、主として入院ＳＬＥ患者で見られた。全ＴＧＦ−β１産生が主要な臓器系関与に重きを置くＳＬＥＤＡＩ指数と最も相関するというこの発見はまた、疾病重症度との関係を示す。
【０１２４】
この試験はまた、確立された疾病のＳＬＥ患者と疾病活動性が同等であるＲＡ患者の対照グループを含む。ＲＡグループでのＴＧＦ−β１値は、構造的活性ＴＧＦ−β１以外、正常対照より幾分低いが、欠失の強度はＳＬＥ程著しくなく、統計的に有意ではなかった。
【０１２５】
以前に、我々は、ＮＫ細胞がＴＧＦ−βの主なリンパ球源であり、このサイトカインを活性形で構造的に産生する唯一のリンパ球集団であることを証明した(Gray, J. D. et al., (1988), J. Immunol. 169:2248-2254)。従って、ＮＫ細胞由来ＴＧＦ−βの構造的産生はＳＬＥで減少しているとの発見は、興味深かった。我々はまたＩＬ−２およびＴＮＦ−αの両方が活性ＴＧＦ−βの産生を促進できることを知った。これら両サイトカイン産生はＳＬＥで減少する(Gray J. D. et al., (1994), J Exp Med 180:1937-1942)。しかし、殆どの患者において、外来性ＩＬ−２およびＴＮＦ−αはＴＧＦ−βを正常に回復できなかった(実施例２)。ＩＬ−１０産生はＳＬＥで増加し(Llorente, L. et al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421))、増加したレベルと疾病活動性の相関関係が報告されている(Housslau, F. A. et al. (1995), Lupus 4:393-395; Haglwara, E. et al. (1996), Arthritis Rheum 39:379)。ＩＬ−１０はＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−β産生を阻害できる(実施例２およびMoore, K. W. et al. (1993), Ann Rev Immunol 11:165-190)。活性ＴＧＦ−βの産生が軽いおよび活動性の疾病の患者で減少したこと、およびＩＬ−１０の拮抗によって産生欠失を部分的にしか回復できなかったことは(実施例２)、増加したＩＬ−１０産生自体がＳＬＥにおけるＴＧＦ−β１のリンパ球産生の減少について説明となり得ないことを示す。数個の機構が恐らく関与するのであろう。潜伏性前駆体の成熟活動性形への細胞外変換における１個またはそれ以上の欠失がこの異常性を説明し得る。
【０１２６】
ＴＧＦ−βは、リンパ球増殖およびエフェクター細胞機能に対する阻害特性が詳細に説明されているが(Letterio, J. J. et al. (1998), Ann Rev. Immunol 16:137-162)、刺激特性も報告されている(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:668-677)。ＴＧＦ−βは、刺激Ｔ細胞およびその産生の上方制御によりサイトカイン産生を調節する。マウスにおいて、ＴＧＦ−β１は、ＣＤ８+Ｔ細胞を選択的に活性化して増殖させ(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:668-667)、ナイーブ細胞からメモリーＴ細胞への成熟を増加する(Lee, M. H. et al. (1991), J. Immunol 147:1127-1133)。ヒトにおいて、ＴＧＦ−β１はエフェクターＴ細胞の強い誘発物である(Cerwenka, A. et al. (1994), J Immunol 153:4367-4377)。免疫抑制作用には大量(ナノグラム／ml)が必要であるが、我々が示したように、抗体産生の下方制御効果に関してＣＤ８+Ｔ細胞を共刺激するのには、少量(ピコグラム／ml)でよい(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol 160:2248-2254)。
【０１２７】
そのため、これらの試験によると、ＴＧＦ−β１の潜伏性前駆体のリンパ球分泌の欠失が疾病活動性の結果として起こり得るが、ＳＬＥにおける活性ＴＧＦ−β１産生の減少は、さらに複雑であり、数個の異なる機構からもたらされる。ナイーブＴ細胞が抗体産生を下方制御するように計画するには、Ｔ細胞が活性化される時点でpg／ml量の活性ＴＧＦ−βの存在を必要とすると我々は考え、またこの考えを支持する証拠がある(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol 160:2248-2254)。従って、決定的な時点での局所環境におけるピコモル量の活性ＴＧＦ−βを欠くことは、ＳＬＥにおけるＢリンパ球活性を制御するＴ細胞調節機能の無効によるのであろう。
【０１２８】
実施例３
マイトジェンでのＳＬＥの処置
本実施例において、ＩｇＧ産生は、調節組成物で細胞を処理することにより下方制御される。この調節組成物はマイトジェン抗ＣＤ２モノクローナル抗体組合せ物のようにマイトジェンを含む。これら抗体は、可溶化形態で添加するか、ビーズ上に固定化して、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上の受容体と橋かけ結合せしめる。これらの細胞は、上記の実施例で説明したように調製し、次いで、マイトジェンとインキュベートし、増幅した。抗体産生が下方制御された細胞数が増加する。ＣｏｎＡはシグマから入手できる（St. Louis, MO）。
【０１２９】
抗ＣＤ２がどのように機能するかは知られていないが、これら抗体がＰＢＭＣ調製物中においてＮＫ細胞を誘導し、活性ＴＧＦ−βを分泌し（Ohtsuka, K. et al.(198), J. Imunol 160: 2539-2545）、次いでＴＧＦ−βが働いて、Ｔ細胞が抗体抑制細胞となると考えられている。
次いで、細胞を必要であれば洗浄し、患者に移植し戻す。
【０１３０】
実施例４
サイトカインとマイトジェンの混合物での細胞の処理
細胞を上記のように調製して、抗体産生を下方制御する細胞集団を誘導するために、マイトジェンとサイトカインの混合物を含む調節組成物で細胞をインキュベートした。この手法の例は、図４Ｃにおいて示す。この実施例において、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞をＣｏｎＡ、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βで処理して、抑制に関する最大誘導を得た。
【０１３１】
患者に再移送される調節性Ｔ細胞の調製のために、抗ＣＤ２および／または抗ＣＤ３モノクローナル抗体をＣｏｎＡの代わりに使用して、Ｔ細胞を活性化する。調節組成物は、ＩＬ−２を伴いまたは伴なわずに、ＴＧＦ−βを含有する。この細胞を、例えば、Nexell 300i. Magnetic Cell Selection System のような閉鎖系中で標準インキュベーション技術を用いて４〜７時間、組成物と共にインキュベーションした。
【０１３２】
インキュベートの後、細胞をＨＢＢＳと洗浄して、溶液中のサイトカインおよびマイトジェンを除去する。所望により、ビーズ上に固定した抗ＣＤ３±抗ＣＤ２８と培養して、細胞数を増加さす。次いで、細胞を２００−５００mlのＨＢＢＳ中に懸濁し、患者に再挿入する。
【０１３３】
実施例５
細胞の細胞仲介免疫を正常化する処置
ＳＬＥの自己抗体産生に対する要因は、ＩＬ−１０とＴＮＦ−αとのアンバランスにある。ＩＬ−１０のレベルは過多で、ＴＮＦ−αレベルは低い［Llorente et al. 1995. J. Exp. Med. 181:839-44，Houssiau, F.A. et al., 1995. Lupus 4:393-5.(Ishida, H. et al. 1994. J. Exp. Med. 179:305-10)(Jacob, C. O. and McDevitt, H. O.,1988. Nature 331: 356-358)］。我々は、このアンバランスが、ＴＧＦ−βの存在下でＴ細胞を強く活性化することによって補正されるという証拠を得て、近年この効果の作用機構を解明した。
【０１３４】
精製されたＴ細胞を、上記概要に沿って調製し、ＴＧＦ−βの存在または不存在で、ＣｏｎＡとＩＬ−２でインキュベーションした。図６では、ＴＧＦ−βの非存在下でのＴ細胞の刺激によって、ＩＬ−１０の産生が増加したことを示す。しかし、ＴＧＦ−αを刺激されたＴ細胞に加えると、ＩＬ−１０の産生が遮断され、ＴＮＦ−αの産生が増加した。さらに、ＴＮＦＲ２の発現が有意に増加した。理論にしばられるわけではないが、ＴＧＦ−βによって誘導されるＴＮＦＲ２を介するＴＧＦ−α情報伝達の促進が、抗体産生を抑制する調節性Ｔ細胞を生じると考える。我々の結果は、この考察を支持するものであった。
【０１３５】
ＴＧＦ−βによるＴＮＦ−αの上方制御が調節性Ｔ細胞の誘導に重要であることを説明してきた。図７は、ＴＧＦ−βを活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に添加することで、ＩｇＧ産生の顕著な抑制が起こることを示す。この抑制活性は、主な中間体としてＴＮＦ−αに依存する。これらの各試験において、抗ＴＮＦ−α抗体を中和することによって、ＣＤ８＋調節性Ｔ細胞（ＣＤ８reg）抑制効果を完全になくした。
【０１３６】
ＳＬＥ患者は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生減少を伴なう細胞仲介免疫に著しい欠失を有する（Horwitz, D.A. et al.,(1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp.83-96, D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore)。理論にしばられるわけではないが、ＴＧＦ−βのリンパ球産生における欠失は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生減少に対する部分的な要因である。ＴＧＦ−βの存在下でのＴ細胞の刺激によって、これらの細胞を再び刺激すると、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生が顕著に増加することを見出した。さらに、この結果は、ＴＧＦ−βによるＴＮＦ−αの上方制御にも依存する（図８を参照）。
【０１３７】
ＴＧＦ−βの産生がＳＬＥで低下し、その欠失がＩＬ−１０とＴＮＦ−αとのアンバランスによるものであるということを示す。理論にしばられるわけではないが、ＳＬＥにおけるＩＬ−１０の高いレベルが、自己抗体産生を保ち、ＴＧＦ−α、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ産生の原因であると考える。これらサイトカインの産生低下がＳＬＥにおける欠失性細胞免疫の原因である。明記した条件下で、ＴＧＦ−βはＩＬ−１０を下方制御し、ＴＮＦ−αの産生を強めることを示す。ＴＧＦ−βによるＩＬ−１０の下方制御とＴＮＦ−β産生の増強は、ＳＬＥにおける調節性Ｔ細胞の正常化、細胞仲介免疫の修復、疾病の軽減に関して重大な役割をになう。
【０１３８】
実施例６
細胞仲介自己免疫を抑制する調節性Ｔ細胞の生成
前記実施例では、調節組成物を使用して、抗体介在性自己抗免疫疾患を処置した。類似組成物を使用して、ＣＤ４＋に加えてＣＤ＋８Ｔ細胞を誘導し、細胞仲介自己免疫疾患を抑制した。ＴＧＦ−βによって調節されたＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞が、Ｔ細胞の細胞毒性の生成を抑制することを示す。
【０１３９】
調節性Ｔ細胞を誘導するためにマイトジェンを使用する代わりに、同種異系性混合リンパ球反応を、この目的のために使用した。この反応では、１個体からのＴ細胞が、他の個体のＰＢＭＣによって提示された外来の組織適合性抗原を認識し、応答する。これらの応答Ｔ細胞は、増加して、これらの標的細胞を殺傷する能力を発展させる。
【０１４０】
抑制Ｔ細胞を創生するために、一個体（ドナーＡ）からの様々なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットを、別の個体（ドナーＢ）からの照射されたＴ細胞なしの単球性細胞と共に培養した。その細胞を、懸濁液中のＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在で、５日間培養した。これ以降は、ＴＧＦ−βを除き、該細胞を、新たなドナーＡからのＴ細胞とドナーＢ細胞からの非Ｔ細胞に添加した。図９は、ＴＧＦ−βが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方を誘導し、細胞仲介細胞毒性を抑制する能力を開発することを示す。図１０は、ＴＧＦ−βによって誘導されたＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を用いる２つの追加試験を示す。
【０１４１】
さらなる試験によると、この方法でつくった調節ＣＤ４＋Ｔ細胞が、該作用に関する独特の作用を示す。前につくったＣＤ８＋およびＣＤ４＋両方のＴ細胞が阻害性サイトカインの分泌により抑制をおこすのと異なり、これらアロ特異的調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、接触依存性の作用機構を示す（図１１）。理論にしばられるわけではないが、これらの調節性Ｔ細胞は、別のＴ細胞が活性化されるのを抑制すると考える。これらのＴ細胞の応答Ｔ細胞およびアロ刺激細胞への添加は、増殖を抑制し（図１２）、応答ＣＤ８＋キラー前駆体細胞が活性化される能力を低下させた（図１３）。
【０１４２】
次のことも分かった。これら調節性ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）をそれら細胞表面で発現し、非常に強力である（図１４）。調節ＣＤ４＋細胞の応答Ｔ細胞との割合が、１：４（２０％）から１：３２（３％）に低下すると、これら細胞の阻害効果がごく僅か低下した。
【０１４３】
これら細胞の少量のみを強い下方制御効果に必要とするので、十分な数を患者に移送し、自己免疫性もしくは他の所望の免疫抑制効果、例えば移植拒絶反応を抑制することができる。
【０１４４】
実施例７
ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激してＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成する
ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ３細胞と称されているが、その発生に関する機構は殆ど理解されていない。われわれが得た証拠によると、スーパー抗原、スタフィロコッカス・エンテロトキシン（ＳＥＢ）によるＣＤ４＋細胞の強い刺激、または低濃度のＳＥＢよるＣＤ４＋細胞の反復刺激が、これらの細胞を誘導し、活性ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成した。
【０１４５】
図１５は、活性および全ＴＧＦ−βの産生増加が、ＳＥＢ濃度の増加によって刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によりなされたことを示す。図１６は、ＳＥＢの低用量によってＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激に関する効果を示す。Ｔ細胞をＳＥＢで３回刺激すると、顕著な量のＴＧＦ−βの活性型が生成した。
【０１４６】
図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの効果を示す。この細胞をＳＥＢで５日ごとに合計３回刺激した。各Ｔ細胞のサブセットおよびＣＤ２５ＩＬ−２受容体活性マーカーを発現する細胞の％を各々の刺激後に測定した。パネルＡおよびＣは、最初の刺激にＴＧＦ−β １ｎｇ／ｍｌが含まれていると、ＣＤ４＋Ｔ細胞が反復刺激の培養物中で優勢なサブセットとなったことを示す。パネルＢおよびＤは、ＳＥＢ刺激細胞によるＣＤ２５の発現が、対照培養物中で３回目の刺激によって低下したことを示す。しかし、ＣＤ２５の発現は、Ｔ細胞がＴＧＦ−βで駆動されると、非常に高いままであった。即ち、ＴＧＦ−βは、これらのＴ細胞が反復刺激されると、ＣＤ４＋細胞に対する優先効果を有するようであり、これらの細胞の殆ど全てが２０日間の培養後にＣＤ２５＋であった。
【０１４７】
要約すると、Ｔ細胞の刺激の結果として、ＴＧＦ−βの優勢な調節効果が、ＣＤ８＋細胞に与えられる。反復刺激によって、このサイトカインはＣＤ４＋細胞を誘導して、調節性細胞とする。この細胞は、抑制活性に関してＣＤ８＋細胞よりも強力である。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ−２およびＴＧＦ−βと共にインキュベーションすることにより、自発的免疫グロブリン産生が減少することを示す。
【図２】図２は、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの両方により、自発的ＩｇＧ産生が有意に減少することを示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、抗ＴＧＦ−βがＩＬ−２の効果を逆転することを示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、抗体産生に対するＤＣ８＋Ｔ細胞の調節効果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、非刺激細胞および抗ＣＤ２刺激細胞によるＴＧＦ−β１のリンパ球産生を示す。
【図６】図６は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のＴ細胞産生に対するＴＧＦ−βの作用を示す。
【図７】図７は、ＴＧＦ−βによる調節性Ｔ細胞の生成にＴＮＦ−αが必須の中間体であることを示す。
【図８】図８は、ＴＧＦ−β起動Ｔ細胞によるＴｈ１サイトカインの産生の増加がＴＮＦ−αに依存性であることを示す。
【図９】図９は、細胞毒性Ｔ細胞活性の抑制物質の産生におけるＴＧＦ−βの作用を示す。
【図１０】図１０は、ＴＧＦ−βにより起動されたＣＤ４細胞のアロ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性に対する作用を示す。
【図１１】図１１は、調節性Ｔ細胞がＣＴＬ活性を抑制するために細胞接触を必要とすることを示す。
【図１２】図１２は、ＴＧＦ−βで誘発された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球増殖の抑制を示す。
【図１３】図１３は、ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞の調節活性を示す。
【図１４】図１４は、調節ＣＤ＋４細胞がその表面でＣＤ２５＋（ＩＬ−２）受容体を発現することを示す。
【図１５】図１５は、少量のブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）でのＴ細胞の反復刺激がＴ細胞を誘発してＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
【図１６】図１６は、低量のＳＥＢでＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激によってＴ細胞がＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
【図１７】図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの作用を示す。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般的に、抗体仲介および細胞仲介の両方の異常を含む自己免疫異常を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
自己免疫疾患は、自己か自己でないかを識別する免疫システムの機能不全によっておこる。これらの疾患で、免疫系は自己組織に対して作用し、その応答は最終的に炎症や組織損傷をもたらす。自己免疫疾患は２つの基本的部類に分類される：全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、シェーグレン症および皮膚筋炎などの抗体仲介疾患と、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、真性糖尿病、慢性関節リウマチおよび硬皮症などの細胞仲介疾患である。
【０００３】
多くの自己免疫疾患において、組織損傷は元の組織に対する抗体の産生によって引き起こされる。この抗体は自己抗体と言われている。哺乳動物によって産生され、哺乳動物自体の組織に対する結合部位を持つためである。この疾患のうちいくつかは、循環する抗体量の特有な漸増と漸減を有し、やがて徴候に変化をもたらす。
【０００４】
抗体仲介自己免疫異常の種々のタイプの中でもＳＬＥは充分研究され考証されている異常である。ＳＬＥは一般化した自己免疫の異常であり、核、細胞質および細胞表面の抗原に対する様々な自己抗体でのＢ細胞の活動過多を特徴とする。この自己免疫疾患は、遺伝的および環境的な促進因子による多因性病原を有する(参照：Hahn, B.H., Dobois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 69−76 (D.J. Wallace et al. ads., Williams and Wilkins, Baltimore))。ＳＬＥで説明されている多数のリンパ球欠失は、調節性Ｔ細胞の機能不全であり、Ｂ細胞の機能を阻害する(Horwitz, D.A., Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 155−194 (D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore))。インビトロでポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体を持続的に産生するには、Ｔ細胞の助力が必要である(Shivakumar, S. et al. (1989), J Immunel 143:103−112)。
【０００５】
調節性Ｔ細胞は、胞溶解性またはサイトカイン仲介メカニズムによる抗体合成を下方制御する。後者はトランスフォーミング成長因子−β(ＴＧＦ−β)と他の抑制的サイトカインを必要とする(Wahl, S.M. (1994), J Exp Med 180:1587−190)。 循環Ｂリンパ球自発的分泌抗体は、活動性ＳＬＥの患者で増加する(Klinman, D.M. et al. (1991), Arthritis Rheum 34:1404−1410)。
【０００６】
ＳＬＥの臨床症状は、発疹(特に、顔面の蝶型紅斑)、糸球体腎炎、肋膜炎、心膜炎および中枢神経系関与がある。患者の大部分は女性であり、比較的若い(診断時の平均年齢は２９才である)。
【０００７】
ＳＬＥに対する処置は臨床的症状によって変わる。穏やかな臨床症状の患者は、非ステロイド性抗炎症剤等の簡単な処置で効き目がでる。しかし、さらに重い症状に対しては、通常、プレドニゾンなどの強い抗炎症および免疫抑制の作用をもつステロイドが必要となる。他の強力な免疫抑制剤として、アザチオプリンとシクロホスファミドを使用することができる。ステロイドおよび他の免疫抑制剤では、哺乳動物の免疫システムが全体的に低下するために副作用が生じる。現在、ＳＬＥに対する理想的な処置はなく、疾患を治すことができない。
【０００８】
現在、ＳＬＥに対する感受性または抵抗性を高める遺伝子の同定、疾患を引き起こす抗原性決定子の同定、生存かアポトーシスかを決定づけるＴ細胞活性化の分子メカニズム、Ｔ細胞の機能を決定するサイトカイン、および自己抗体を形成するＢ細胞の特性が、かなり注目されている。ＳＬＥのＴ細胞調節不全について多くの例証が叙述されている(参照：Horwitz, D.A. et al., Duobois’Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 83−96 (D.J. Wallace et al. ads., Wiliams and Wilkins, Baltimore)。あるリンパ球の一次的役割が免疫応答の下方調節であることは充分認められているが、これらの細胞の産生で必要とされる同一性およびメカニズムの解明は進んでいない。
【０００９】
インターロイキン−２(ＩＬ−２)は、これまで抗原非特異的Ｔ抑制細胞の産生で重要な役割を果たすと考えられている。マウスに与えられる抗ＩＬ−２抗体(移植片対宿主病の誘導物と一致する)はＳＬＥの特色をもたらす(Via, C.S. et al. (1993), Intemational Immunol. 5:565−572)。ＩＬ−２が抑制の産生において直接的または間接的に重要であるかどうかが議論されている(Fast, L.D. (1992), J. Immunol. 149:1510−1515; Hirohata, S. et al. (1989), J. Immunol. 142.3104−3112; Baylor, C.E. (1992), Advances Exp. Med. Biol. 319:125−135)。最近、ＩＬ−２が、ＣＤ８＋細胞を誘発して、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＨＩＶ複製を非分解メカニズムにより抑制することがわかった。この効果はサイトカイン仲介性であるが、具体的なサイトカインは同定されていない(Kinter, A.L. et a1. Proc. Nalt Acad. Sci. USA 92:10985−10989; Barker, T.D. et al. (1996), J. Immunol. 156.4478−4483)。ＩＬ−２のＴ細胞産生はＳＬＥで減少する(Horwitz, D.A. et al. (1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 83−96, D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore)。
【００１０】
ＳＬＥ患者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ポリクローナルＩgＧ産生を抑制するよりむしろ維持する(Linker−Israeli, M. et al. (1990), Arthritis Rheum. 33:1216−1225)。健康なドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して抗体産生を高めることができる(Takahashi, T. et al. (1991), Clin. Immunol. Immunopath. 58:352−365)。しかしＩＬ−２またはＣＤ４＋Ｔ細胞のどちらも、それ自体では強力な抑制活性を発生させるＣＤ８＋Ｔ細胞を産出しないことがわかった。ＮＫ細胞を培地に含めると、強力な抑制活性が現われた(Gray, J.D. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1937−1942)。培地中のＮＫ細胞の働きは、トランスフォーミング成長因子ベータ(ＴＧＦ−β)を活性形態で産出するものと考えられる。非免疫抑制(２−１０pg/ml)濃度のこのサイトカインは、ＩgＧおよびＩgＭの産生に対する強力な抑制作用をつくるための補助因子として働くことが見出された(Gray, J.D. et al (1994) J. Exp. Med 180:1937−1942)。加えて、ＮＫ細胞は非刺激リンパ球でＴＧＦ−βの主要源であると考えられる(Gray, J.D. etaL (1998), J. Immunol. 160:2248−2254)。
【００１１】
ＴＧＦ−βは、組織修復、炎症および免疫調節における重要なサイトカインの多機能性系統群である(Massague, J. (198O), Ann. Rev. Cell Biol. 6:597)。ＴＧＦ−βは、他の大部分のサイトカインと異なり、その放出タンパク質が生物学的に不活性であり、特定の受容体と結合することができない(Sporn, M.B. et al. (1987) J. Cell Biol. 105:1039−1045)。潜在の複合体が細胞外で切断され、以下に記すように活性サイトカインを放出する。ＴＧＦ−βの応答は単核細胞に偏在する２つの表面受容体(ＴＧＦ−β−Ｒ１とＴＧＦ−β−Ｒ２)の相互作用を必要とする(Massague, J. (1992), Cell 69:1067−1070)。従って、潜在型の活性ＴＧＦ−βへの変化は、サイトカインの生物学的効果を決定する重大な段階である。
【００１２】
ＳＬＥ患者ではＮＫ細胞によるＴＧＦ−βの産生が減少することが分かっている。ＮＫ細胞により産生される構成ＴＧＦ−βの欠失および誘導されたＴＧＦ−βの欠失は、３８人のＳＬＥ患者についての研究で報告されている(Ohtsuka, K. et al. (1998), J. Immunol. 160.2539−2545)。組換え型ＩＬ−２やＴＮＦ−αまたはＩＬ−１０拮抗エフェクターの何れを加えても、ＳＬＥでのＴＧＦ−β欠失を正常し得なかった。ＳＬＥでのＴＧＦ−β産生の減少は、疾病の活性と相関しておらず、従って、初期の欠失かも知れない。
【００１３】
ＳＬＥ患者をＴＧＦ−β、ＩＬ−２またはその両方の組合せで処置する全身的な投与は、深刻な副作用を引き起こす。これらのサイトカインは、種々の体組織に対して非常に多くの影響を与えるので、患者に全身的に送達するのはあまり安全ではない。従って、本発明の対象は、自己抗体調節制御に関与する哺乳類細胞を処置して、自己抗体産生を下方制御する細胞集団を増加させる方法およびキットを提供することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
（本発明の要旨）
ここに概略する目的のように、本発明は、生体外の末梢血単核細胞 (ＰＢＭＣ)のサンプル中の免疫応答を阻害する方法であって、細胞集団に調節組成物を添加することを含む方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
更なる態様では、本発明は、患者の自己免疫異常を処置する方法を提供する。その方法は、患者由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を患者から取り出すこと、およびこの細胞を調節組成物で、免疫細胞による組織損傷を抑制するのに十分な時間、処理することを含む。特に、本発明の方法は、抗体産生を抑制し、または細胞を誘発して、抗体産生を下方調節し、そして抗体仲介自己免疫疾患の患者における細胞仲介免疫応答を高める。次いで、細胞を患者に再導入すると、自己免疫の症状が改善する。調節組成物は、好ましくは、ＴＧＦ−βおよびＴ細胞のＴＧＦ−βヘの応答を可能にする物質を含む。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、細胞仲介自己免疫異常を処置する方法を提供する。この方法は、該患者から末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を取り出し、該細胞を調節組成物で、異常の免疫応答を抑制するのに十分な時間処置することを含む。処置細胞を患者に再導入すると、自己免疫症状の改善が得られる。調節組成物は、好ましくは、ＴＧＦ−βおよびＴ細胞のＴＧＦ−βへの応答を可能にする物質を含む。
【００１７】
更なる態様では、本発明は、患者の自己免疫異常の処置用キットを提供する。このキットは、抗体仲介自己免疫異常または細胞仲介異常の患者の細胞を受容するのに適当な細胞処置容器および少なくとも１用量の調節組成物を含む。
【００１８】
（図面の説明）
図１は、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ−２およびＴＧＦ−βと共にインキュベーションすることにより、自発的免疫グロブリン産生が減少することを示す。ＰＢＭＣ(２×１０5／ｗｅｌｌ)を、ＡＩＭ−Ｖ血清を含まない培地であって、ＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)およびＴＧＦ−β(１０ｐｇ/ｍｌ)を含むか、または含まない培地中で培養した。３日後、ウェルを３回洗浄し、新たなＡＩＭ−Ｖ培地を加えた。更に７日後、上清をウェルから回収し、ＩｇＧ成分をＥＬＩＳＡで測定した。
【００１９】
図２は、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの両方により、自発的ＩｇＧ産生が有意に減少することを示す。その値は、図１の説明に記載の通りに培養した１２人のＳＬＥ患者のＰＢＭＣにより産生した平均±ＳＥＭのＩｇＧ(μｇ／ｍｌ)を示す。ただし、ＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)のみ、またはＴＧＦ−β(１０ｐｇ/ｍｌ)のみで培養した細胞もある。
【００２０】
図３Ａおよび３Ｂは、抗ＴＧＦ−βがＩＬ−２の効果を逆転することを示す。ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを、３日間、ＩＬ−２(１０Ｕ/ｍｌ)の存在下(黒色バー)、または非存在下(灰色バー)で培養した。これらの培養液中に含まれていたのは、培地、抗ＴＧＦ−β(１０μｇ/ｍｌ)または対照マウスＩｇＧ１(１０μｇ/ｍｌ)であった。３日後、ウェルを洗浄し、新たなＡＩＭ−Ｖ培地を加えた。更に７日後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＩｇＧ(図３Ａ)または抗核タンパク質（ＮＰ）(図３Ｂ)成分を検定した。
【００２１】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、抗体産生に対するＤＣ８＋Ｔ細胞の調節効果を示す。(Ａ)健康人のＩｇＧ産生の抑制におけるＮＫ細胞とＣＤ８＋細胞の相乗作用。ＣＤ４＋細胞およびＢ細胞を抗ＣＤ２で刺激し、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞の作用を調べた。ＮＫおよびＣＤ８＋細胞の組み合わせは、我々が以前報告した(Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160: 2248−2254; Gray, J.D. et al., (1994), J Exp Med 180; 1937−1942)抗ＣＤ２誘発性ＩｇＧ産生を顕著に阻害した。(Ｂ)ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞はＳＬＥにおけるＩｇＧ合成を促進する。活動性ＳＬＥの患者由来のＣＤ４＋細胞および正常人の休止Ｂ細胞を、抗ＣＤ２で刺激した。ＳＬＥ ＣＤ８＋細胞によるＩｇＧ産生の促進は、ＮＫ細胞の添加により顕著に増加した。(Ｃ)ＳＬＥにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞機能のサイトカインによる正常化。図４Ｂに示す試験と平行して、この患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下または非存在下、抗ＣＤ２で刺激した。表示のようにＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)および／またはＴＧＦ−β(２ｐｇ／ｍｌ)を加えた。これらサイトカインにより、ＣＤ８＋細胞のヘルパー作用が喪失し、その細胞がＩｇＧ産生の７５％を阻害した。
【００２２】
図５Ａおよび５Ｂは、非刺激細胞および抗ＣＤ２刺激細胞によるＴＧＦ−β１のリンパ球産生を示す。健常者ドナーならびにＳＬＥ患者およびＲＡ患者のＰＢＬを、マイクロタイタープレートに１×１０5／ウェルで加えた。幾つかのウェルは、抗ＣＤ２ｍＡｂｓＧＴ２(１：４０)およびＴ１１(１：８０)であった。３７℃で２日後、上清を回収し、活性ＴＧＦ−β１および全ＴＧＦ−β１を検定した。有意なｐ値を示す。
【００２３】
図６は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のＴ細胞産生に対するＴＧＦ−βの作用を示す。血清なしのＡＩＭＶ培地中の精製Ｔ細胞（１ｘ１０５細胞／ウエル）を、平底ミクロウエルに加え、低量（０.５μｇ／ｍｌ）または高量（５μｇ／ｍｌ）のＣｏｎＡで、ＩＬ−２と共にまたはなしに、ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在下に刺激した。上清を２日および５日に採取し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０についてＥＬＩＳＡで調べた。最大産生がＴＧＦ−βは２日に、ＩＬ−１０は１０日にあった。ＴＧＦ−βはＩＬ−１０の産生をなくし、ＴＮＦ−αの産生を上方調節した。
【００２４】
図７は、ＴＧＦ−βによる調節性Ｔ細胞の生成にＴＮＦ−αが必須の中間体であることを示す。精製ＣＤ８＋細胞を、ＣｏｎＡ（２.５μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（１０Ｕ）およびＴＧＦ−β（１０ｐｇ／ｍｌ）で一夜インキュベートした。洗浄後これらの細胞をＣＤ４＋Ｂ細胞に加え、抗ＣＤ２で刺激した。いくつかのウエルに抗ＴＮＦ−α抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはイソ型対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）を入れた。７日後に上清をＩｇＧ含量についてＥＬＩＳＡで調べた。抗ＴＮＦ−αは条件ＣＤ８＋細胞の調節活性を逆転した。
【００２５】
図８は、ＴＧＦ−β起動Ｔ細胞によるＴｈ１サイトカインの産生の増加がＴＮＦ−αに依存性であることを示す。精製ナイーブＴ細胞をＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）とともにＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下に培養した。いくつかのウエルには中和抗ＴＮＦ−α抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはイソ型対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）も加えた。５日培養後に細胞を水洗し、１ｘ１０５細胞／ウエルで新鮮な培地に入れた。翌日にＣｏｎＡおよびＩＬ−２で６時間再刺激し、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下にＣＤ８およびサイトカインについて着色した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋およびＣＤ８−細胞の％を示す。一次培地におけるＴＮＦの中和はＴｈ１サイトカイン産生に対するＴＧＦ−β作用の増加を無くする。
【００２６】
図９は、細胞毒性Ｔ細胞活性の抑制物質の産生におけるＴＧＦ−βの作用を示す。Ｅロゼット法によりつくられたドナーＡ由来のＴ細胞を２つに分けた。１つを同種異系混合リンパ球反応（allo−MLR）についての応答物として用いた。他の１つを用いて、細胞を適当なモノクロナール抗体で染め、その細胞を免疫磁性ビーズで除いた後、陰性選択で表示されるＴ細胞サブセットをつくった。応答Ｔ細胞をドナーＢ由来の刺激細胞と混合し（照射Ｔ細胞は末梢血単核細胞を枯渇した）、５日培養してキラー細胞を作った。対照は刺激細胞の有無で５日培養したＴ細胞サブセットからなる。その後、細胞を洗い、計数し、アロ細胞毒性Ｔ細胞活性の検定に使用した。ドナーＡ由来の応答細胞をドナーＢ由来のクロミウム標識リンパ芽球とエフェクター質中で混合し、細胞比率を標的にして、クロミウム放出を標準的４時間検定法で測定した（白四角）。刺激物とともに培養したＴ細胞サブセットを、４応答細胞につき１調節細胞の比率で加えた（白丸）。刺激物と培養のＴ細胞サブセットへのＴＧＦ−βの添加を黒丸で示す。すべての試験で、ＴＧＦ−βの最大作用はナイーブＣＤ４ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−細胞に対して見られた。
【００２７】
図１０は、ＴＧＦ−βにより起動されたＣＤ４細胞のアロ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性に対する作用を示す。刺激物質なしで５日間培養されたＣＤ４ＣＤ４５ＲＡの付加はＣＴＬ活性に対する作用を有しない（結果を示していない)。これらのＴ細胞を刺激物質と培養すると、低度から中程度の抑制活性となる。すべての試験において、これらのＴ細胞のＴＧＦ−β１ｎｇ／ｍｌとの培養は、アロＣＴＬ活性を顕著に抑制するか無くする。
【００２８】
図１１は、調節性Ｔ細胞がＣＴＬ活性を抑制するために細胞接触を必要とすることを示す。調節性ＣＤ４細胞は、上記のように、ＴＧＦ−βと培養したＣＤ４ＣＤ４５ＲＡからつくった。これらの細胞のいくつかを応答物質およびクロミウム標識の標的細胞と混合し、他の細胞を膜によりキラー細胞から分離した。細胞毒性Ｔリンパ球活性（ＣＴＬ）の抑制を、Ｔ細胞がキラー細胞と直接接触したときにのみ認めた。
【００２９】
図１２は、ＴＧＦ−βで誘発された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球増殖の抑制を示す。ドナーＡ由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を上記のように刺激細胞と混合し、表示の比率で新鮮な応答物質および刺激物質に加えた。バーは７日間培養後のトリチウム標識チミジンの取り込み±ＳＥＭを示す。薄色のバー（Nil)は、添加ＣＤ４＋細胞なしの応答Ｔ細胞の増殖性応答を示す。濃色バーは、刺激細胞と培養した対照ＣＤ４＋細胞のＴＧＦ−βなしでの作用を示す。黒バーは、刺激細胞と培養した対照ＣＤ４＋細胞のＴＧＦ−βあり（１ｎｇ／ｍｌ）での作用を示す。照射刺激細胞に加えた新鮮な応答細胞の増殖性応答に対するこれらのＣＤ４＋細胞の作用を培養７日間後に示す。バーはトリチウム標識チミジンの平均取り込みを示す。
【００３０】
図１３は、ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞の調節活性を示す。ＣＤ４＋細胞を照射同種異系非Ｔ細胞±ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）で５日間刺激した。水洗後、ＣＤ４＋細胞をＤIIで染め、新鮮な応答Ｔ細胞をカルボキシフルオレセイン（ＣＦＳＥ）で染めた。対照またはＴＧＦ−β駆動ＣＤ＋細胞を応答Ｔ細胞およびアロ刺激細胞に１：４の比率で加えた。５日後に細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ８＋におけるＣＦＳＥの強さをＤII陰性細胞でもって決定した。ＴＧＦ−β駆動ＣＤ＋細胞の応答Ｔ細胞への付加はＣＤ８＋細胞による細胞分裂を顕著に低下した。
【００３１】
図１４は、調節ＣＤ＋４細胞がその表面でＣＤ２５＋（ＩＬ−２）受容体を発現することを示す。対照またはＴＧＦ−β誘発ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を上記のようにつくった。アロ刺激細胞およびＴＧＦ−βで条件を整えた後、ＣＤ４＋細胞を細胞選別によりＣＤ２５＋とＣＤ２５−に分けて、新鮮な応答Ｔ細胞および照射刺激細胞に加えた。これらの応答細胞のキラー刺激Ｔリンパ芽細胞に対する能力を、標準的４時間クロミウム放出検定で示す。
【００３２】
図１４Ａにおいて、白四角は添付のＣＤ４＋細胞のないＣＴＬ活性を表示する。対照またはＴＧＦ−β誘発調節性Ｔ細胞を応答細胞とともに１：４の比率で加えた。白丸からすると対照ＣＤ４＋細胞がＣＴＬ活性を変えなかった。黒丸からするとＴＧＦ−βが誘発ＣＤ４＋がＣＴＬ活性をほとんど完全に抑制した。黒菱形からするとＣＤ２５＋サブセットのみが抑制活性を有していた。ＣＤ２５サブセット（黒四角）は抑制活性を有していなかった。
【００３３】
図１４Ｂは、ＭＬＲに加えたＣＤ４＋調節細胞の数を減少さす作用を示す。わずか３％への減少は抑制作用の減少における最小の作用である。
【００３４】
図１５は、少量のブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）でのＴ細胞の反復刺激がＴ細胞を誘発してＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＳＥＢ（０.０１ｎｇ／ｍｌ）およびスパー抗原提示細胞として照射Ｂ細胞で、ＴＧＦ−βの存在または不存在で、矢印で表示の時に刺激した。活性ＴＧＦ−βを２日または５日後に測定した。
【００３５】
図１６は、低量のＳＥＢでＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激によってＴ細胞がＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＳＥＢ（０.０１ｎｇ／ｍｌ）およびスパー抗原提示細胞として照射Ｂ細胞で、ＴＧＦ−βの存在または不存在で、矢印で表示の時に刺激した。活性ＴＧＦ−βを２日または５日後に測定した。
【００３６】
図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの作用を示す。細胞をＳＥＢで５日毎に計３回刺激した。各Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ２５ＩＬ−２受容体活性マーカーを発現する細胞の％を各刺激後に測定した。パネルＡおよびＣは、ＴＧＦ−β１ｎｇ／ｍｌが最初の刺激に含まれていると、ＣＤ４＋Ｔ細胞が反復刺激後に培養基中で優勢になることを示す。パネルＢおよびＣは、ＳＥＢ刺激細胞によるＣＤ２５発現が対照培養基中で第３刺激で減少することを示す。しかしＣＤ２５発現は、Ｔ細胞がＴＧＦ−βで駆動されていると、高く留まっている。
【００３７】
（詳細な説明）
本発明は、全身性エリマトーデス（ＳＬＥ）などの細胞仲介および抗体仲介の両方の異常を含む自己免疫異常を処置する方法に関する。この方法は、患者から細胞を取り出し、この両方の１つに作用できる組成物でもって細胞を処置する。１つの実施態様において、抗体仲介自己免疫異常の症状を本発明の組成物によって改善する。この組成物は、自己抗体などの抗体の産生を阻害して、Ｂ細胞の過剰活性を下方調節する。さらに、この組成物は、ＳＬＥや他のある種の抗体仲介自己免疫異常の患者においてしばしば欠失している細胞仲介免疫応答を高める。すなわち、抗体仲介自己免疫異常の患者を処置して、その欠失細胞仲介症状を改善できる。
【００３８】
あるいは、この組成物を使用して細胞仲介自己免疫疾患を処置する。この実施態様において、組成物は免疫細胞を誘発し、抑制Ｔ細胞をつくる。この抑制Ｔ細胞は他のＴ細胞が細胞毒性になって個体の細胞および組織を攻撃するのを防ぐ。このように、組成物は細胞毒性を低下することにより細胞仲介自己免疫異常の症状を改善する。
【００３９】
この方策は、現在のほとんどすべての処置が抗炎症剤や免疫抑制剤を使用すると異なっている。普通よく用いられるコルチコステロイドは、サイトカインの産生を抑制し、組織の損傷を起こす最終事象を阻止するが、基にある自己免疫応答を一般に変えることはない。細胞障害剤またはモノクローナル抗体などの実験的に遺伝子工学的に処理された生物剤も、特殊なリンパ球集団をなくするか、その機能を妨害する。これらの薬剤は、一般に緩和な効果をもたらすのみであって、また重大な有害副作用を起こす。ある種のサイトカインは、患者に全身的に与えられるが、重大な有害副作用に関連する広範な作用を有している。
【００４０】
一方、本発明の方法による治癒効果では、正常な調節性細胞機能が回復し、免疫系が「再置」される。本方法の他の重要な利点は、重大な有害副作用があまり起きないことである。サイトカインなどの調節組成物のごく少量を患者に戻すにすぎないので、毒性が最小となる。
【００４１】
ＩｇＧを自発的に分泌する循環Ｂリンパ球が活動性ＳＬＥの患者で増加する（Blaese, R.M., et al.(1980), Am J. Med. 69: 345−350; Klinman, D.M. et al.(1991) Arthritis Rheum 34: 1404−1410）。インビトロでのポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体の持続的な産生には、Ｔ細胞の助けを必要とする（Shivakumar, S. et al.(1989), J Immunol 143: 103−112）。自発的ＩｇＧ産生のＴ細胞による調節についての以前の研究によると、健常人ではＣＤ８＋Ｔ細胞が抗体産生を阻害するのに対し、ＳＬＥではこの細胞が代りにＢ細胞機能を支持する（Linker−Israeli, M. et al.(1990), Arthritis Rheum 33: 1216−1225）。他の自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチや多発性硬化症において、抗体よりもむしろＴ細胞が組織損傷の原因であり炎症をもたらす（Panayl GS et al. Anthritis Rheum (1992) 35: 725−775, Allegretta M et al. Science (1990) 247: 718−722)。
【００４２】
従って、本発明は、抗体−およびＴ細胞−仲介自己免疫疾患を処置する方法に関し、自己免疫異常の患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取りだし、その細胞を調節組成物で処置する。
【００４３】
理論に拘束されるわけでないが、本発明方法が作動するには、いくつかの経路があるようである。その第１は、調節組成物で細胞を処置すると、処置細胞における抗体産生が直接抑制され、自己免疫症状の改善につながり得る。あるいは、または加えて、細胞の処置は調節性細胞を誘導して、他の細胞における抗体産生を下方調節する。本明細書における抗体はすべての形態の抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥなどを含む。明らかな結果は系における抗体量の低下である。
【００４４】
さらに、細胞の処置は、抗体仲介自己免疫症状の患者において細胞仲介免疫応答を高める。理論に縛られるものでないが、細胞の処置がＩＬ−１０とＴＮＦ−αとの均衡を修復して、Ｔｈ１サイトカインの産生を高め、細胞仲介免疫を正常化するようである。
【００４５】
さらに、ＴＧＦ−βを含む調節組成物で免疫細胞を刺激すると、細胞仲介免疫応答が抑制される。理論に縛られるものでないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激すると、活性ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくり、細胞仲介免疫応答を抑制するようである。あるいは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激すると、他のＴ細胞の活性化および/またはエフェクター機能を作用の接触依存性メカニズムによって抑制する。これらの作用には、ＴＧＦ−βの存在で活性化されるＣＤ４＋細胞を必要とする。
【００４６】
このように、本発明は、異常な免疫応答を阻害する。抗体仲介自己免疫異常の患者において、本発明は、調節組成物で末梢血Ｔ細胞を生体外で処置することにより、Ｔ細胞の能力を修復し、抗体産生を下方調節し、細胞仲介応答を修復する。細胞仲介異常の患者において本発明は、他のＴ細胞において細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する調節性Ｔ細胞をつくる。
【００４７】
「免疫応答」とは、外部または自己の抗原に対する宿主の応答を意味する。「異常免疫応答」とは、自己と非自己とを識別する免疫系のないこと、または外部抗原に応答しないことを意味する。換言すると、異常免疫応答とは、患者の症状をもたらしている不適当に調節された免疫応答である。「不適当に調節された」とは、不適当に誘発されること、不適当に抑制されること、および/または応答性のないことを意味する。異常な免疫応答は、限定でないが、生体自身の組織に対する抗体の産生により生じる組織損傷や炎症、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生の障害、作用の細胞毒性または非毒性メカニズムにより生じる組織障害を含む。
【００４８】
従って、好ましい実施態様において、本発明は患者の抗体仲介自己免疫異常を処置する方法を提供する。「抗体仲介自己免疫疾患」とは、個体が自己の細胞または組織の構成成分に対する抗体を発生する疾患を意味する。抗体仲介自己免疫疾患には、限定するのではないが、全身性エリマトーデス（ＳＬＥ）、天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑症、グレーブス症、皮膚真菌症、シェーグレン症などがある。本発明方法による処置に好適な疾患はＳＬＥである。
【００４９】
さらに、抗体仲介異常の患者は細胞仲介免疫応答において欠失をしばしば有する。「細胞仲介免疫応答の欠失」とは、感染に対する宿主防御の障害を意味する。感染に対する宿主防御の障害は、限定でないが、遅い過剰反応の障害、Ｔ細胞の細胞毒性の障害、ＴＧＦ−β産生の障害を含む。他の欠失は、限定でないが、ＩＬ−１０産生の増加、およびＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生の減少を含む。本発明の方法を用いて、精製Ｔ細胞を刺激して、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの産生を増加させ、ＩＬ−１０の産生を低下させる。この方法で刺激し得るＴ細胞は、限定でないが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を含む。
【００５０】
ある実施態様においては、抗体仲介異常を処置しない。
好ましい実施態様において、本発明は、患者における細胞仲介自己免疫異常を処置する方法を提供する。「細胞仲介自己免疫疾患」とは、個体の細胞が活性化または刺激されて、細胞毒性となり、自己の細胞または組織を攻撃する疾患を意味する。あるいは、個体の自己免疫細胞が他の細胞を刺激して作用の細胞毒性または非細胞毒性メカニズムによって組織障害を起こす。細胞仲介自己免疫疾患は、限定でないが、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、真性糖尿病、慢性関節リウマチおよび硬皮症などを含む。
【００５１】
自己免疫異常の「処置」とは、自己免疫異常の少なくとも１つの症状が、本明細書に記載の方法で改善されることである。その評価を種々の方法でなす。この評価には、患者側の主観的または客観的な因子が含まれる。例えば、疾患の免疫原性徴候を調べる。例えば、自発的抗体および自己抗体産生のレベル、ＳＬＥの場合は特にＩｇＧ産生のレベルを低下する。全Ｉｇ抗体または自己抗体のレベルを測定する。限定するものでないが、抗２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体、抗核タンパク質抗体、抗Ｓｍ、抗Ｒｈｏおよび抗Ｌａである。身体症状が変化する。例えば、ＳＬＥの皮疹の消失または減少である。腎機能検査を行って変化を調べる。炎症に関する組織障害について臨床検査を行う。循環免疫複合体レベルおよび血清補体レベルの低下も改善の証拠である。ＳＬＥの場合、貧血の減少も見られる。免疫抑制剤などの薬剤に対する患者の必要性が低下することも処置効果の証である。処置効果について他の判定方法は、自己免疫疾患分野の当業者にとって明らかであろう。
【００５２】
「患者」とは、処置の対象となる哺乳動物を意味するが、ヒトが好ましい。ある場合において、本発明方法は、実験動物、獣医学分野、疾患モデル動物にも使用され、これらの動物には、限定ではないが、マウスラット、ハムスターなどのゲッシ類および霊長類がある。
【００５３】
本発明では、患者から血液細胞を取り出す。一般に、標準的な方法で患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取り出す。「末梢血単核細胞」すなわち「ＰＢＭＣ」とは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）および単球を意味する。詳しく下記するように、調節組成物の主要な作用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＧ産生を抑制することである。好ましくは、ＰＢＭＣのみを採取する。赤血球または多形核白血球を患者に残すようにするか、これらを患者にもどす。これは既知の方法、例えば、白血球泳動(leukophoresis)で行う。一般に５から７リットルの白血球泳動工程を行う。患者からＰＢＭＣを基本的に採取し、他の血液成分を戻す。細胞サンプルの採取は、ヘパリンなど抗凝固剤の存在下で、既知方法により行う。
【００５４】
いくつかの実施態様においては、白血球泳動工程を必要としない。
一般に、ＰＢＭＣ含有のサンプルを種々の方法であらかじめ処理する。まず細胞を採取し、次いで採取に際して自動的に濃縮されていなければ、濃縮し、さらに精製および／または濃縮する。細胞を水洗し、計数し、緩衝液中に入れる。
【００５５】
一般的にＰＢＭＣを標準的方法で処置のために濃縮する。好ましい態様において、白血球泳動採取工程によってＰＢＭＣの濃縮サンプルを無菌の血球パックに得、ある種の試薬および／または調節組成物を含有せしめる。詳しくは下記する。一般に、追加の濃縮／精製工程を行なう。既知のＦicoll−Ｈypaque密度勾配遠心法などである。
【００５６】
好ましい態様において、ＰＢＭＣを洗い、血清タンパク質および溶性血液成分、例えば自己抗体、阻害剤などを既知方法で取り出す。一般に、生理媒質または緩衝液を加え、遠心法を行なう。必要に応じて繰り返す。ＰＢＭＣを生理培養液、好ましくはＡＩＭ−Ｖ血液なしの培地（Ｔechnologie）に再懸濁するが（血清がかなりの量の阻害剤を含有するので）、Ｈanksバランス塩溶液（ＨＢＢＳ）や生理塩緩衝液（ＰＢＳ）も使用する。
【００５７】
一般に、次いで細胞数を数える。一般に１×１０9から２×１０9の白血球を５−７リットルの白血球泳動工程から採取する。これらの細胞を大略２００ｍｌの緩衝液または培地に移す。
【００５８】
好ましい態様において、ＰＢＭＣを１以上の細胞型について富ます。例えば、ＰＢＭＳをＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞ついて富ます。このことは既知である（Gray et al.(1998),J.lmmunol.160:2248、出典明示により本明細書の一部とする。）。一般に、これは市販の免疫吸収カラムを用いるか、研究的方法で行なう（ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、溶出の非接着細胞をＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１１６、ＣＤ７４に対する抗体で処理し、免疫磁気ビーズで処理して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に富んだ集団を取る）。
【００５９】
好ましい実施態様において、ＰＢＭＣを自動化閉鎖系、例えば、Nexell Isolex 300i Magnet Cell Selection System において分離する。一般的に、これは、細胞の分離、活性化、抑制細胞機能の開発のために使用する方法の無菌性の確保および標準化の確保のために行う。
【００６０】
細胞に必要な前処理を一旦ほどこしてから、細胞を調節組成物で処置する。「処置」とは、細胞を調節組成物と共に十分な時間でインキュベートし、抗体および自己抗体産生を阻害する能力が、特に患者にもどしたときに、発生するようにすることである。インキュベーションは一般に生理的温度で行なわれる。上記したように、阻害が起きるのは、処置細胞による抗体産生の直接的抑制の結果か、患者リンパ臓器における抗体産生を下方調節する調節細胞の誘導の結果である。
【００６１】
「調節組成物」または「抗体産生阻害組成物」または「液素性阻害組成物」「非特異的免疫細胞阻害物質」または「特異的Ｔ細胞阻害物質」または「阻害組成物」または「抑制組成物」は、免疫応答の抑制を起こし得る組成物を意味する。この抑制は、Ｔ細胞活性化の阻害、自発的抗体および自己抗体の産生または細胞毒性の阻害を含む。一般に、これらの組成物はサイトカインである。適切な調節組成物は、限定でないが、抗ＣＤ２などのＴ細胞アクチベーター、例えば抗ＣＤ２抗体およびＣＤ２リガンド、ＬＦＡ−３、Ｔ細胞アクチベーターの混合物や組合せ物、例えば、コンカナバリン Concanavalin A（ＣｏｎＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αを含む。抗体抑制に好ましい調節組成物は、Ｔ細胞アクチベーター、ＩＬ−２、ＴＧＦ−βの混合物である。細胞毒性の抑制に好ましい組成物はＴＧＦ−βである。
【００６２】
調節組成物の濃度は、組成物の性質によって変ってくる。好ましい態様においては、ＴＦＧ−βが調節組成物の成分である。「トランスフォーミング成長因子−β」すなわち「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βファミリーのいずれか１つを意味する。３種のイソ型、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３がある。参照、Massague,J.(1980),J.Ann.Rev.Cell Biol 6:597。リンパ球および単球は、このサイトカインのβ１のイソ型である(Kehrl,J.H.et al.(1991),lnt J Cell Cloning 9:438−450)。ＴＧＦ−βは、処置される哺乳動物に対して活性であるＴＦＧ−βのすべての型であり得る。ヒトでは、組換えＴＦＧ−βが現在のところ好ましい。好ましいヒトＴＧＦ−βは、Genzyme Pharmaceuticals，Farmington，MA．から購入できる。一般に、ＴＧＦ−βの濃度は、細胞懸濁液の約２picogram／ｍｌから約５nanogramであって、約１０ｐｇから約４ｎｇが好ましく、約１００ｐｇから約２ｎｇが特に好ましく、１ｎｇ／ｍｌが理想的である。
【００６３】
好ましい態様において、ＩＬ−２を調節組成物で用いる。ＩＬ−２は、処置される哺乳動物に対して活性であるＩＬ−２のすべての型であり得る。ヒトでは組換えＩＬ−２が現在のところ好ましい。組換えＩＬ−２は Cetus，Emerville、CA.から購入できる。一般に、使用されるＩＬ−２の濃度は、細胞懸濁液の約１Ｕnit／ｍｌから約１００Ｕ／ｍｌであり、約５Ｕ／ｍｌから約２５Ｕ／ｍｌが好ましく、１０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。好ましい態様においてＩＬ−２は単独で用いない。
【００６４】
好ましい態様において、抗ＣＤ２抗体またはＣＤ２リガンドＬＦＡ−３などのＣＤアクチベーターを、調節組成物として用いる。ＣＤ２はＴリンパ球により発現される細胞表面グリコタンパク質である。「ＣＤ２アクチベーター」とは、ＣＤ２情報伝達経路を開始する化合物を意味する。好ましいＣＤ２アクチベーターには、抗ＣＤ抗体（OKT11,American Type Culture Collection,Rockville MD）が含まれる。一般に、ＣＤ２アクチベーターの濃度は、ＴＧＦ−βの産生を誘導するのに十分なものである。抗ＣＤ２抗体の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌの範囲にあり、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌが特に好ましい。
【００６５】
いくつかの態様においては、細胞を活性化するためにマイトジェンの使用が望ましい。すなわち、多くの休止相細胞は多量のサイトカイン受容体を含有していない。ＣoncanavalinＡなどのマイトジェンを使用すると細胞が刺激されて、サイトカイン受容体が産生し、本発明方法をさらに効果的にする。マイトジェンを用いるとき、既知方法で知られているように、その濃度範囲は１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌである。さらに、既知方法のように、ＣｏＡを離す成分、例えばα−メチルマンノシッドと共に細胞を洗うのが望ましい。
【００６６】
好ましい実施態様において、Ｔ細胞を、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８などのマイトジェンあるいはモノクロナール抗体の組み合せ、すなわち自己抗原と補刺激物質としてのＣＤ２８やＩＬ-２でもって刺激する。ＣｏｎＡもＴ細胞の刺激に使用する。第２培養におけるＴＧＦ−βのありなしでのＴ細胞の反復刺激は最大抑制活性を得るのに必要なようである。
【００６７】
好ましい実施態様において、本発明は、Ｔ細胞をＴＧＦ−βで調整することを含む。このＴ細胞には、限定でないが、ＣＤ８＋ＴやＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８−ＣＤ４−などの他のマイナーＴ細胞サブセット、ＮＫ細胞などが含まれる。これらのＴ細胞は、他のＴ細胞が細胞毒性エフェクター細胞になるのを防ぐ。
【００６８】
好ましい実施態様において、本発明は、ＣＤ８＋ＴまたはＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βで調整して、免疫抑制レベルのＴＧＦ−βをつくる方法を含む。
好ましい実施態様において、本発明は、ＣＤ８＋ＴまたはＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βで調整して、接触依存性メカニズムにより抑制されるＴ細胞をつくる方法を含む。
【００６９】
好ましい実施態様において、本発明は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激物質で処置して、該ＣＤ４＋細胞が免疫抑制レベルの活性ＴＧＦ−βをつくるようにすることを含む方法を提供する。
【００７０】
好ましい実施態様において、本発明は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βの存在下に刺激してＣＤ４＋細胞数を増やすことを含む方法を提供する。
好ましい実施態様において、本発明は、ＩＬ−１０の産生を減少し、併せてＴＮＦ−αの産生を増加する方法を提供する。
【００７１】
調節組成物を細胞と共に、効果を発揮するに十分な時間インキュベートする。好ましい態様において、細胞は、調節組成物での処置に続いて、患者にもどす。好ましい態様において、細胞と調節組成物とのインキュベーションは、約１２から約７日行なう。この時間は望む抑制活性により変る。抗体産生の抑制については、４８時間が特に好ましい。細胞毒性の抑制については、５日が特に好ましい。
【００７２】
ある態様において、細胞を一定の時間インキュベートし、水洗して調節組成物を除去し、再びインキュベートする。患者に導入する前に、ここに概記したように細胞を好ましくは水洗し、調節組成物を除去する。試験または検査のために、さらなるインキュベーションも行うことができ、数時間から数日間である。患者への導入前に抗体産生の検査をしょうとするときは、細胞を数日間インキュベートすると、抗体産生（またはその非産生）が明らかになる。
【００７３】
細胞の処置後すぐに、患者に自動的に再移行する前に細胞を検査することができる。例えば、細胞を採取して行う。無菌検査、グラム染色、微生物学的検査、ＬＡＬ試験、マイコフラズマ検査、細胞型同定のためのフローサイトメトリー、機能検査などである。同様に、これらの検査などの試験を処置の前や後に行うことができる。
【００７４】
好ましい態様において、抗体産生の定量や定性（すなわちタイプについて）をなし得る。例えば、抗体の全レベルあるいは抗体の具体的なタイプを調べる。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、抗ＤＮＡ自己抗体、抗核タンパク質（ＮＰ）抗体などの具体的なタイプについてである。調節性Ｔ細胞も、Ｔ細胞活性を抑制する活性、インビトロで特異的な標的細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を防ぐ活性について、検査できる。
【００７５】
好ましい態様において、抗体、特にＩｇＧのレベルの検査をＥＬＩＳＡアッセイなどの既知の方法（Abo et al.(1987),Clin Exp.lmmunol.67:544 and Linker−Israeli et al.(1990),Arthritis Rheum 33:1216, 出典明示により本明細書の一部とする。）で行なう。これらの技術は自己抗体などの特異的な抗体のレベルを検出するのにも用い得る。
【００７６】
好ましい態様において、処置によって産生ＩｇＧおよび自己抗体の量の有意な低下が起きる。低下は、少なくとも１０％が好ましく、少なくとも２５％が特に好ましく、少なくとも５０％が特別に好ましい。多くの態様において７５％以上の低下がみられる。
【００７７】
好ましい態様において、移行前に全または活性のＴＧＦ−βの量も検査できる。記載のように、ＴＧＦ−βを移行後に活性化される潜在的前駆物質としてつくる。
【００７８】
処置後、細胞を患者に移行すなわち再導入する。一般に既知のよう行ない、通常は静脈投与によって処置細胞を患者に注入すなわち導入する。例えば、無菌シリンジなどの移行手段を用いて注射により５０ｍｌのＦenwall注入バッグに細胞を入れる。次いで細胞をすぐに静脈投与によって一定の時間、例えば、１５分間で患者の自由に流れている静脈に注入する。ある態様では、緩衝剤や塩などの追加の試薬も加え得る。
【００７９】
細胞を患者に再導入後に、処置の効果を所望に応じて、上記の方法で検査できる。すなわち、疾患の免疫原性徴候を検査する。例えば、全抗体または特異的な免疫グロブリンの力価、腎機能、組織障害などを検査する。Ｔ細胞の機能についての試験、例えば、Ｔ細胞数、表現型、活性状態、抗体および／またはマイトジェンに応答する能力などについても検査し得る。
【００８０】
処置は必要に応じて繰り返えす。例えば、数週の期間で週１回、または時間の期間で数回、例えば、２週間に３−５回行う。一般に、自己免疫疾患の症状の改善はなんらかの期間、好ましくは少なくとも数カ月続く。その間に患者が症状の再起を感じると、その時点で処置を繰り返えす。
【００８１】
好ましい態様において、本発明方法を実行ため、すなわち細胞を調節組成物と共にインキュベートするためのキットを提供する。キットはいくつかの成分を含有する。キットは、抗体仲介自己免疫疾患の患者からの細胞を受容するのに用いられる細胞処置容器を含む。この容器は無菌とする。ある態様において、細胞処置容器を細胞採取に用いる。例えば、入口を介して白血球泳動器と共に用いる。他の態様では、分離した細胞採取容器を用い得る。
【００８２】
好ましい実施態様において、キットは、細胞仲介異常の患者からの細胞を受けるように調整された細胞処置容器を含む。キットはまた、特異的Ｔ細胞サブセットを精製し、それを患者に戻すように増やすために、自動化閉鎖系での使用に調整できる。
【００８３】
細胞処置容器の形および材質は様々であり、当業者によく知られている。一般に、容器はいくつかの異なる形態を取る。例えば、ＩＶバッグのような柔かいバッグであり、または細胞培養器のような硬い容器である。攪拌できるようになっている。一般に、容器の材質は何でもよいが、生物学的に非活性の物質であり、例えばガラス、ポリプロピレンやポリエチレンなどを含むプラスチックである。細胞処置容器は１以上の入口または出口を有し得る。細胞、試薬、調節組成物などの導入または取り出しのためのものである。例えば、容器は、患者に再導入する前の分析のために細胞のフラクションを採取するためのサンプル採取口を有する。同様に、容器は、患者に細胞を導入するための出口を有する。例えば、容器はＩＶ装置につけるためのアダプターを含み得る。
【００８４】
キットは調節組成物の少なくとも１つの用量を含む。本明細書での「用量」とは、サイトカインなどの調節組成物の１つの量で、作用を発揮するのに十分な量を意味する。ある場合には、複数の用量物を含む。ある態様において、用量物の細胞処置容器への添加は入口を介して行なう。あるいは好ましい態様において、用量物は細胞処置容器にすでに存在している。好ましい態様において、用量物は安定性のために乳濁形態にあり、細胞培養液や他の試薬を用いて再生する。
【００８５】
ある態様において、キットは少なくとも１種の試薬を追加的に含む。それには緩衝液、塩、培養液、タンパク質、薬剤などがある。例えば、マイトジエン、モノクローナル抗体、細胞分離のための処置磁気ビードを含み得る。
ある態様において、キットはその使用に際しての説明書を追加的に含む。
【００８６】
下記の実施例は、上記の本発明をより完全に記述したものであり、また、本発明の種々の態様を実施するために考えられる最上の方法を記述した。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものでなく、説明の目的のために提示される。出典明示されたすべての引用文献は全体を本明細書の一部とする。
【００８７】
実施例
実施例１
ＩＬ-２およびＴＦＧ-βの混合物によるＰＢＭＣの処置
実施例１によって示されるのは、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２およびＴＦＧ-βで比較的簡単に処置することにより、自発的ポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体産生が顕著に阻害されることである。下記で考察するように、１２人の活動性ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを、ＴＧＦ-βの存在または非存在で３日間ＩＬ-２に曝露し、洗浄し、そして７日以上培養した。ＩｇＧ分泌の平均減少は７９％であった。最も強力な阻害効果は、最も顕著なＢ細胞の活動過剰の場合に観察された。抗核タンパク質(ＮＰ)抗体の自発的産生が観察されたのは４例あり、ＰＢＭＣのサイトカイン処置により自己抗体産生は、５０から９６％減少した。ＩＬ-２は、個々の患者におけるＴＧＦ-β依存性または非依存性の何れかの機構による抗体産生を阻害した。活動性ＳＬＥ患者における抗ＣＤ２刺激性ＩｇＧ産生の試験では、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βがＩｇＧ産生におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の促進効果を逆転し、代わりに抑制活性を誘発し得る。
【００８８】
方法
自発的抗体合成についての被験者
１２人の被験者をＳＬＥ診断で選択した。それらはＳＬＥを分類するＡＲＡ基準(Arnett, F.C. et al., (1998), Arthritis Rheum 31: 315-324)を満たしていた。これらの患者はすべて女性であり、スペイン人８人、アフリカ系アメリカ人２人、そしてアジア人２人であった。それぞれの患者の年齢および病歴を表１に示す。５人が入院患者で、７人は外来患者であった。コルチコイド（コルチコステロイド）および抗マラリア薬を投与されている患者も表示した。８人の患者が未処置であった。疾患活動性を、ＳＬＡＭ(Liang, M.H. et al., (1989), Arthritis Rheum 32:1107-1148)およびＳＬＥＤＡＩ(Bombardier, C. et al., (1992), Arthritis Rheum 35:630-640)で評価すると、それぞれ平均値１６．５および１３．４であった。
表１
ＳＬＥ患者の概略
【表１】
【００８９】
試薬
組換え体ＴＧＦ-βおよびモノクローナル抗ＴＧＦ-β(1D11.16)抗体、ネズミＩｇＧ１は、Dr. Bruce Pratt(Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA)から好意的に提供された。組換え体ＩＬ-１０およびモノクローナル抗ＩＬ-１０(JES3-19F1)抗体および対照ラットＩｇＧ２ａは、Dr. Satwant Narula(Schering Plough Pharmaceuticals, Kenilworth, NJ)から好意的に提供された。対照マウスＩｇＧ１骨髄腫タンパク質は、Calbiochem, San Diego, CAから購入した。組換え体ヒトＩＬ-２は、Chiron, Emmeryville, CAより購入した。ＯＫＴ１１を用いた抗ＣＤ２分泌ハイブリドーマ抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC）Rockville、MDから得、ＧＴ２は、A. Bernard, Nice, Franceから好意的に提供された。他の抗体には、J. Unkeless, New York, NYから好意的に提供された抗ＣＤ４(ＯＫＴ４、ＡＴＣＣ)、抗ＣＤ８(ＯＫＴ８、ATCC;ＣＤ８、Dako, Carpentaria, CA)、抗ＣＤ１１ｂ(ＯＫＭ１、ATCC)、抗ＣＤ１６(３Ｇ８)；抗ＣＤ２０(Ｌｅｕ １６、Becton Dickinson, San Jose, CA)および抗ＣＤ７４(Ｌ２４３、ATCC)が含まれていた。
【００９０】
血中単核細胞の単離
末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll-Hypaque(Pharmacia, Piscataway, NJ)密度勾配遠心分離によりヘパリン処理静脈血から調製した。単核細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ(Life Technologies, Grand Island, NY)で洗浄し、血小板を取り除いた。それはＴＧＦ-βを多く含んでいる。
【００９１】
細胞培養の手順
細胞培養の手順は以前述べられている通りである(Wahl, S.M. (1994), J Exp Med 180: 1587-1590; Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160: 2248-2254)。簡単に言うと、２ｘ１０5のＰＢＭＣを、血清を含まないＡＩＭ-Ｖ培養培地(Life Technologies)中、記載のサイトカインを含むか、または含まない９６-ウェルの底の平らなマイクロタイタープレートにおいて培養した。培養３日後、ＰＢＭＣを３回洗浄し、次いで、新たに血清を含まない培地を添加した。更に３７℃で７日後、上清を回収し、以前に述べられている(Linker-Israeli, M. et al., (1990), Arthritis Rheum 33: 1216-1225)通り固相酵素結合免疫収着検定(ＥＬＩＳＡ)によりウシ胸腺核タンパク質(ＮＰ)と反応する全ＩｇＧおよび自己抗体を検定する。光学的密度(ＯＤ)の読み値を、陽性および陰性標準を用いる標準曲線より、ｕｎｉｔｓ／ｍｌ(Ｕ／ｍｌ)に変換した。ＳＬＥ患者(高力価の抗ＮＰ抗体を有する)および健康な被験者のＰＢＭＣ培養の上清を対照として用いた。
【００９２】
統計学的分析
データをGraph Pad, Prism software(San Diego, CA)を用い分析した。データの対数変換および非パラメーター性マン‐ホイットニー試験後、分散(ANOVA)分析を使用した。
【００９３】
抗ＣＤ２誘発ＩｇＧ合成
抗ＣＤ２刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞に対する、ＮＫ細胞と共にまたはＮＫ細胞を伴わずに培養したＣＤ８＋Ｔ細胞の効果を、ＳＬＥ患者および正常対照者で試験した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、以前述べられている通りに、免疫磁性ビーズを用いる陰性選択により、ナイロン非付着性リンパ球から調製した(Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160:2248-2254)。ＣＤ４＋細胞の場合、ナイロン非付着性細胞をＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ７４に対する抗体で染色した。同じ抗体を用い、ＣＤ８＋細胞が得られた。ただし、ＣＤ４をＣＤ８と置き換える。ＣＤ４＋細胞の純度は９５％であり、ＣＤ８＋細胞は８９％であった。ＮＫ細胞を得るため、ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、そして溶出した非付着性細胞をＡＥＴ処置ヒツジ赤血球細胞で即座にロゼットした。次いで、非ロゼット画分を抗ＣＤ３および抗ＣＤ７４(抗ＨＬＡ-ＤＲ)抗体で染色し、免疫磁性ビーズ(Dynal)を用い反応細胞をなくした。得られた群にはＣＤ５６＋が９８％およびＣＤ３が０．５％未満およびＣＤ２０＋リンパ球が０．５％未満含まれていた。ＳＬＥ Ｂ細胞が大量のＩｇＧを自発的に分泌するため、そして、これらの試験に多数のＢ細胞を調製するのに多量の血液を必要とするため、本試験では、健康な被験者ドナーの休止Ｂ細胞を患者のＢ細胞の代用とした。Ｂ細胞を得るため、ナイロンウール付着性細胞を、直ぐにＳＲＢＣでロゼットし、任意のＴ細胞を除去し、単球および機能性ＮＫ細胞を完全に除去するため５ｍＭ Ｌ-ロイシンメチルエステルで処理した。得た集団ではＣＤ２０＋が９２％を超え、ＣＤ３＋が０．５％未満であった。
【００９４】
結果
１２人の試験患者において、自発的ＩｇＧは０.４から１３.７μｇ／ｍｌの範囲であった(図１)。ＰＢＭＣをＩＬ-２±ＴＧＦ-βに７２時間曝露することにより、ＩｇＧ合成が、試験した１２例のうち８例で、少なくとも５０％減少した(平均減少７９％、ｐ＝０.００８、Mann Whitney)。最も劇的な減少は、最も顕著なＢ細胞の活動過剰の場合に観察された。分泌するＩｇＧ量とＩＬ-２およびＴＧＦ-βによる阻害％との相関関係は、ｒ＝０.６４７、ｐ＝０.０２であった。
【００９５】
ＩＬ-２およびＴＧＦ-β単独の効果を、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの組み合わせと比較した。図２によって示されるのは、これらサイトカインのそれぞれがまたＩＬ-２産生を阻害することである。しかし、対数変換によるデータの正規分布の達成および複数比較のためのBonnferoni補正適用後では、分散分析から、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの組合せによってのみ有意な阻害(ｐ=０.０５)が生ずることがわかる。
【００９６】
ＩＬ-１０産生はＳＬＥ中で増加しており(Llorente, L. et al., (1993), Eur Cytokine Network 4:421-427)、このサイトカインはＩＬ-２およびＴＧＦ-βの両方の産生を阻害し得る。９例において、我々はまた、抗ＩＬ-１０の効果を調べたが、ＩｇＧ合成の幾分の低下が数例で観察されたのみであり、この違いは統計的に有意でなかった。同様に、ＴＮＦ−α産生も一部のＳＬＥ患者で減少する(Jacob, C.O. et al., (1990), Proc Natl Acad Sci 87:1233-1237)。また、このサイトカインは活性ＴＧＦ-βの産生を増加するが(Ohtsuka, K. et al., (198), J Immunol 160:2539-2545)、ＴＮＦ−αを培養に加えることにより最小の効果を生じた(結果は示していない)。
【００９７】
抗核タンパク質（ＮＰ）自己抗体の自発的産生につきＳＬＥ ＰＢＭＣを試験し、有意な力価が４例みられた。ＰＢＭＣをＩＬ-２またはＩＬ-２とＴＧＦ-βのどちらかに曝露した場合の全例において、少なくとも５０％の抗ＮＰ産生が阻害された。ＴＧＦ-β自身は効果がなかった(表２)。これらの場合、ＩＬ-２自身の効果は、ＩＬ-２とＴＧＦ-βとの組み合わせの場合と同等であった。
【００９８】
【表２】
【００９９】
ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２(１０u/ｍｌ)およびＴＧＦ-β(１０ｐｇ/ｍｌ)に７２時間さらした。その細胞を洗浄し、更に７日間培養した。上清中に放出された抗ＮＰをＥＬＩＳＡで測定した。
【０１００】
以前、我々が報告したのは、ＩＬ-２により生物学的に活性なＴＧＦ-β(Ohtsuka, K. et al., (1998), J Immunol 160: 2539-2545)の産生が増加することである。そのため、自発的抗体合成におけるＩＬ-２の少なくとも幾つかの効果がＴＧＦ-βで仲介される可能性があった。この可能性について、ＩＬ-２の効果が抗ＴＧＦ-β中性化抗体により逆転され得るかどうかを測定することにより調べた。図３Ａに示した例では、抗ＴＧＦ-βの添加は自発的ＩｇＧ合成に影響を与えなかった。しかし、ＴＧＦ-βの拮抗物はＩｇＧ合成におけるＩＬ-２の阻害効果をなくした。この患者(表２のケースＣ)のＰＢＭＣもまた、抗ＮＰ抗体を自発的に産生した。ここで、抗ＴＧＦ-βも、抗ＮＰ産生におけるＩＬ-２の阻害効果をなくした(図３Ｂ)。即ち、この被験者おいて、自発的ＩｇＧおよび自己抗体合成に対するＩＬ-２の阻害効果はＴＧＦ-βを介していた。抗ＴＧＦ-βのこの効果は、試験した８例のうち４例で記録された。故に、ＩＬ-２の阻害効果は、ＴＧＦ-β依存性または非依存性であり得る。各効果の例を表３に示す。
【表３】
【０１０１】
ステロイド治療開始後２８日のＳＬＥ患者において試験を繰り返す機会を得た(表４)。処置前には、自発的ＩｇＧ合成はＩｇＧ２μｇ／ｍｌよりも多かった。ＰＢＭＣをＩＬ-２に曝露すると、これがＩｇＧ産生を顕著に阻害し、ＴＧＦ-βは適度な効果を有した。コルチコステロイド治療の後、自発的ＩｇＧ産生は７５％減少した。上記の通り、ＰＢＭＣをＩＬ-２±ＴＧＦ-βに曝露すると、ＩｇＧ産生は５０％減少した。しかし、この阻害は抗ＴＧＦ-βにより逆転した。ここでさらに、ＩＬ-２のこの効果は、内在性活性ＴＧＦ-βの上方制御によるものと説明できよう。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
健康な被験者についての我々の先の試験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βが活性化ＣＤ＋Ｔ細胞を誘導し、Ｉｇ産生を下方制御することから、本試験でＳＬＥ患者からのＣＤ８＋Ｔ細胞の単離および処置を試みた。先の試験が不成功であったのは、自発的抗体合成に顕著な可変性があること、および細胞分離法のために活動性ＳＬＥ患者からの大量の血液を必要とすることであった。しかし、我々は、活動性ＳＬＥの患者の１人から十分な血液を得ることができ、抗ＣＤ２誘導ＩｇＧ合成のＣＤ８＋Ｔ細胞調節に対するＩＬ−２およびＴＧＦ−βの効果を調べた。抗ＣＤ３とは異なり、抗ＣＤ２モノクローナル抗体のマイトジェン性組合わせが、ＰＢＬを誘導しないで、ＩｇＧを産生することを、我々は最近報告した(Gray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:2248-2254)。例を図４Ａに示す。これは、抗ＣＤ２がＮＫ細胞を刺激してＴＧＦ−βを産生し、それが順番にＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、抗体産生を下方制御するためであった(Gray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:2248-2254)。この患者において、我々が以前に報告したように(Gray J. D. et al. (1994), J Exp Med 180:1937-1972)、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩｇＧ合成を増加し、ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の組合わせにより増加が著しく強化された(図４Ａ)。一方、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＳＬＥ ＣＤ８＋Ｔ細胞のヘルパー効果を無くし、これらの細胞がＩｇＧ産生を抑制することを可能にした。ＩＬ−２およびＴＧＦ−βのこの阻害効果はＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に依存した(図４Ｂ)。このように、ＩＬ−２およびＴＧＦ−β効果がＣＤ８＋Ｔ細胞により仲介され得るという証拠が得られた。
【０１０４】
これらの試験は、ＰＢＭＣのＩＬ−２およびＴＧＦ−βへの短い暴露により、ＳＬＥ、特に重症な疾病の患者および著しいＢ細胞活動亢進の患者において、続く自発的ポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体産生を大きく減少できることを証明した。この試験は、ＩＬ−２が抗体産生を阻害できることを示す先の報告(Hirohata, S. et al. (1989), J Immunol 142:3104-3112およびFast, L. D. (1992), J Immunol 149:1510-1515)を確認し、ピコモル濃度のＴＧＦ−βがこの下方制御の一因となり得ることを明らかにする。試験した１２名の患者のグループにおいて、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βのポリクローナルＩｇＧ合成に対する阻害効果は、ＩＬ−２単独より大きかった。しかし、ＩＬ−２の阻害活性は異なっていた。試験した８名のうち４名において、阻害はＴＧＦ−β依存的であり、中和化抗ＴＧＦ−β ｍＡｂが作用を無くした。残りの例において、ＩＬ−２の下方制御効果はＴＧＦ−β非依存的であった。同様に、自発的抗ＮＰ自己抗体産生におけるＴＧＦ−β依存的および非依存的阻害の両方が証明された。また、我々がＩＬ−１０の拮抗およびＴＮＦ−α添加についての効果を調べたのは、ＳＬＥにおけるこれらサイトカイン産生の異常について、先に記載されていたためである(Llorente L. et al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421-427; Jacob, C.O. et al. (1990), Proc Natl Acad Sci 87:1233-1237)。しかし、これらの方法は、リンパ球が先に活性化されているとき、自発的抗体合成に対する最小の効果を示した。
【０１０５】
ＳＬＥにおけるＢ細胞活動亢進の程度が疾病活動性と相関するという他の報告がある(Blaese, R. M. et al. (1980), Am J Med 69:345-350; Klinman, D. M. et al. (1991), Arthritis Rheum 34:1404-1410)。このことが本試験で起きなかったのは、同時薬剤治療によるためであろう。概して、著しい自発的抗体合成の患者は処置せず、かわりにＢ細胞活性が低い患者にはプレドニゾンを普通に投与した。我々はコルチコステロイド治療開始後に著しく自発的ＩｇＧ合成が減少した一つの例を提示する。この患者のＢ細胞は、処置前に抗ＮＰ抗体も分泌したが、この自己抗体の産生はステロイド治療後に検出されなくなった(データは示していない)。
【０１０６】
ＴＧＦ−βは、組織修復、炎症および免疫調節において重要なサイトカインの多機能性ファミリーから成る(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641)。ＴＧＦ−βは、不活性前駆体分子として分泌され、細胞外で生物学的活性形に変換する点で、多くの他のサイトカインと異なる(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641; Flaumenhaft, R. et al. (1993), Adv Pharmacol 24:51-76)。実験的自己免疫脳炎(Weiner, H. L. et al. (1994), Annu Rev Immunol 12:809-837)および大腸炎(Neurath, M. F. et al. (1996), J Exp Med 183:2605-2516)のような種々の実験的自己免疫モデルは、このサイトカインを産生する。ＴＧＦ−βは、ナノモル濃度で免疫抑制性であり、ＴおよびＢ細胞増殖、ＮＫ細胞の細胞毒性活性およびＴ細胞の細胞毒性発生を阻害できる(Letterio, J. J. et al. (1998), Ann Rev Immunol 16:137-162)。対照的に、ＴＧＦ−βはマウスＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の増殖を促進する(Kehrl, J. H. et al. (1986), J Exp Med 163:1037-1050; Lee, H. M. et al. (1993), J Immunol 151:668-677)、およびＢ細胞分化を促進できる(Van Vlasselaer, P. et al. (1992), J Immunol 148:2062-2067)と報告されている。
【０１０７】
健康な被験者から得たリンパ球で調節性Ｔ細胞を発生させるという先の試験において、使用したＴＧＦ−βの濃度は、ＴまたはＢ細胞機能の阻害に必要とされるピコモル濃度より低かった(Gray, J. D.ら（1998）,J Immunol 160:2248-2254；Gray,J. D.ら（1994），J Exp Med 180：1937-1942)。同様の濃度をＳＬＥ患者での本発明の試験において使用すると、ＴＧＦ−β自体が抗体合成に対して僅かな阻害効果を有していた。前記の通り、ＴＧＦ−βとＩＬ−２の組み合わせが最も強力な阻害をもたらした。先の試験において、この効果はＣＤ８＋ Ｔ細胞により仲介された。
【０１０８】
ＩＬ−２について、Ｔ抑制細胞活性の誘発に対する効果が十分確立されている(Hirohata，S. ら（1989),J Immunol 142：3104−3112；Fast，L. D.，J Immunol 149：1510-1515)が、これらの効果が直接的なものであるか、または間接的なものであるかどうかは明らかではない。マウスにおいて、ＩＬ−２遺伝子の欠失は、大量のリンパ球増殖および自己免疫疾患を生ずる(Sadlack，B.ら（1995）,Eur J Immunol 25：3053-3059)。ＳＬＥにおいて、ＩＬ−２レベルとＢ細胞機能亢進との負の相関関係が報告されている(Huang，Y. P.ら（1988)，J Immunol 141:827-833)。以前、ＳＬＥでＩＬ−２によって自発的Ｉg産生を阻害しようと試みたが、しかしながら、その結果は極めて可変的であった。強い阻害を幾つかの場合において観察したが、一方で他のＩＬ−２では抗体産生が著しく増大した。我々は、時期およびサイトカイン環境により、この試験で見られる阻害よりもさらに一定した阻害が説明されると考える。ここで、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、全培養期間というよりはむしろ、最初の７２時間の培養の間にしか存在していなかった。後者の事例での抗体合成の増加は、Ｂ細胞分化に対するＩＬ−２の正の効果によって説明し得る(Coffman，R. L.ら(1988)，Immunol Rev 102:5-28)。ＩＬ−２は、抗体産生を幾つかの機構により下方制御することができる。該報告に記載されているＴＧＦ−β回路に加えて、ＩＬ−２が誘発する阻害は、ＩＦＮ−γの上方制御(Noble，A.ら(1998)，J Immunol 160:566-571)により、または細胞溶解機構(Stohl，W.ら(1998)，J Immunol 160:5231-5238;Esser,M. T.ら(1997)，J Immunol 158:5612-5618)により起こり得る。
【０１０９】
以前、我々は、抗体合成に対するＮＫ細胞の調節効果を調べ、ＮＫ細胞の直接的効果がＩgＧ合成を上方制御することである(Kinter，A.ら(1995)，Proc Natl Acad Sci USA 92：10985-10989)が、これらのリンパ球が、正常な被験者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞との培養の場合、正反対の効果を有すると報告した(Gray，J. D.ら(1994)，J Exp Med 180:1937-1942)。しかしながら、ＳＬＥ患者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞との組み合わせがＩgＧ産生を高める(Linker-Israeli，M.ら(1990)，Arthritis Rheum 33：1216-1225)。これは、本発明の報告において再び観察された。正常な被験者では、ＮＫ細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞に添加すると、抗ＣＤ２刺激ＩgＧ合成を著しく阻害したが、正反対のことがＳＬＥにおいて観察された。標準的試験から、ＮＫ細胞から得たＴＧＦ−βがＣＤ８＋Ｔ細胞の同時刺激を誘発して、ＩgＧおよびＩgＭ産生を下方制御することがわかった(Gray，J. D.ら(1998)，J Immunol 160：2248-2254)。この試験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞による中程度の抑制活性を誘発した。従って、ＳＬＥにおいて、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βがＢ細胞活性を阻害する少なくとも１つの方法は、調節性Ｔ細胞を発生させることによるものであるらしい。加えて、これらまたは他のサイトカインで処理した他のリンパ球群もまた、ＳＬＥにおけるＢ細胞活性を下方制御し得る。
【０１１０】
実施例２
疾患の活性および重症度とＴＧＦ−β産生との相関関係
全体および活性型のＴＧＦ−βのリンパ球産生が減少することが分かったので、次に、これらの欠失が疾患の活性および／または重症度と関連があるかどうかを調べた。１７人の検査したＳＬＥ患者から得た血液リンパ球によるＴＧＦ−β１産生を、１０人の慢性関節リウマチ(ＲＡ)患者および２３人の適応する健康な対照と比較した。ＲＡにおける活性ＴＧＦ−β１のレベルは、対照より低かったが、ＳＬＥにおける程度までは減少しなかった。ピコモル量で検出される構造性ＴＧＦ−β１および抗ＣＤ２刺激された活性ＴＧＦ−β１のレベルは、最近発症の非常に活性で重症なＳＬＥのために入院した６人の未処置患者において著しく減少し、処置され活性の低い疾患の１１人の患者においても同様に減少した。このように、活性ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性とは関連がなかった。これとは対照的に、全ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性と逆の相関関係があった。このように、ＴＧＦ−β１の潜在性前駆体のリンパ球分泌の欠陥は、疾患活性の結果として生じ得るが、前駆体分子をその活性型に転換する能力は、内因性細胞欠失となり得るようである。活性化される時点でのピコモル濃度量のＴＧＦ−β１へのＴ細胞の不十分な暴露は、抗体合成の下方制御の欠陥を生じ得る。このように、ＳＬＥにおける活性ＴＧＦ−β１のリンパ球産生の減少は、この疾患に特徴的なＢ細胞機能亢進に起因するのであろう。
【０１１１】
方法
試験の被験者
ＳＬＥの分類に関するアメリカ大学のリウマチ病学基準(Tan，E. M.ら(1982)、Arthritis Rheum 25：1271-1277)を満たすＳＬＥ診断を受けた１７人の被験者、ＲＡの分類に関するＡＣＲ １９８７ 改定基準 (Arnett，F. C.ら(1988），Arthritis Rheum 31:315-324)を満たすＲＡ診断を受けた１０人の被験者、および２３人の健康なドナーを試験した。ＳＬＥグループは、女性１５人および男性２人(スペイン人１５人、アフリカ系アメリカ人１人、アジア人１人)からなっていた。平均年齢は、３４.５歳(範囲：２０−７５歳)であった。６人の患者を入院させて、１１人を外来診療所に通わせた。入院患者は皆、入院するまでは未処置であり、試験した後、彼らに第一回用量のコルチコステロイドを投与した。外来患者には、プレドニゾンを２０mg未満を投与し、誰にも細胞毒性薬物を投与しなかった。疾患の活性を、平均値が各々６.６および７.６であるＳＬＡＭ(Liang，M. H.ら(1989)、Arthritis Rheum 32:1107-1118)およびＳＬＥＤＡＩ(Bombardier，C.ら(1992)、Arthritis Rheum 35:630-640)指数で評価した。ＲＡグループは、女性９人および男性１人(スペイン人９人、アジア人１人)からなっていた。平均年齢は、５０.９歳(範囲：３９−６７歳)であった。患者は皆、外来診療所に通わせ、軽度〜中程度に疾患活性を有していた。疾患の平均期間は９.５年であった。１人の患者にマイオクリシン(myochrysine)を投与し、３人の患者にプレドニゾン(１、１および２０mg)を投与し、３人の患者にメトトキサレートを投与し、１人の患者にスルファサラジンを投与した。健康なドナーを対照として、年齢、性別、および民族グループに関して可能な限り厳密に適応させた。
【０１１２】
表５
ＳＬＥ患者の２つのグループの臨床的特徴
【表５】
【０１１３】
試薬
使用した抗体は、抗ＣＤ２を分泌するハイブリドーマ(ＯＫＴ１１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)，Rockville，MD、およびＧＴ２は、Alain Bernard博士，Nice，Franceにより入手可能となった)の上清であった。ＴＧＦ−βイソ型 １、２、および３(１Ｄ１１)を認識するモノクローナル抗体、ＴＧＦ−βイソ型 ２および３(３Ｃ７)に対する抗体、並びにrＴＧＦ−β２は、Bruce Pratt博士(Genzyme Pharmaceuticals，Farmington，MA)により快く提供された。
【０１１４】
血液リンパ球の単離
先に記載した方法(Ohtsuka，K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)を使用して、Ｆicoll−Ｈypaque(Pharmacia, Piscataway, NJ)密度勾配遠心分離により、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をヘパリン処置した静脈血から調製した。単核細胞を、５mＭ ＥＤＴＡ(Life Technologies, Grand Island，NY)を含むＰＢＳで洗浄して、ＴＧＦ−βの豊富な原料である血小板を取り除いた。連続Ｐercoll(Pharmacia)密度勾配によって、末梢血リンパ球(ＰＢＬ)を遠心分離によりＰＢＭＣから分離した。高密度のリンパ球に富む画分に残留する単球のパーセンテージは、ＳＬＥにおいて幾分高かった(８.５％ 対 ４.３％)。
【０１１５】
細胞培養方法
細胞培養方法は、以前に記載されている(Ohtsuka，K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)。簡単に言えば、１×１０5個のリンパ球を９６ウェルの平底マイクロタイタープレート(Greiner Rocky Mountain Scientific，Salt Lake City UT)のウェルに加えた。血清が著しい量の潜在性ＴＧＦ−βを含むことから、培養をＡＩＭ−Ｖ血清不含有培地(Life Technologies)で行った。抗ＣＤ２を最適濃度で使用して、ＴＧＦ−β産生(ＧＴ２ １：４０およびＴ１１ １：８０)ハイブリドーマ培養上清を誘導した。先の試験は、抗ＣＤ２がＰＢＬを強く刺激して、ＴＧＦ−βを産生することを明らかにしている(Gray，J. D.ら(1998),J Immunol 160：2248-2254)。
【０１１６】
ＴＧＦ−βアッセイ
ルシフェラーゼ・リポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化因子阻害剤(ＰＡＩ−１)プロモーターを含む発現構築物をトランスフェクトしたイタチ肺上皮細胞(ＭＬＥＣ)は、Ｄ. Ｂ. Ｒifkin博士，Ｎew Ｙork，ＮＹにより快く提供された。２×１０4／ウェルのＭＬＥＣを上清２００μlと共に３７℃で１８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性についてアッセイするために、ＭＬＥＣを細胞溶解試薬(Analytical Luminescence，Ann Arbor，MI)により溶解した。次いで、細胞溶解物をアッセイ緩衝液およびルシフェリン溶液(両方とも、Analytical Luminescenceから得た)と反応させた後、直ちに、照度計(Lumat，Berthold Analytical Instruments Inc.，Nashua，NH)で測定した。全ＴＧＦ−β活性を測定するために、試料を８０℃で３分間加熱して、潜在性複合体から活性サイトカインを放出させた。上清を加熱することなく、活性ＴＧＦ−βの活性を測定した。全てのアッセイおいて、幾つかの濃度のrＴＧＦ−βが標準曲線を作成するために含まれていた。同型培養の可変性は１０％未満であった(Ohtsuka,K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)。
【０１１７】
統計解析
ＧＢＳＴＡＴソフトウェア(Professional Statistics and Graphics Computer Program，Dynamic Microsystems Inc.，Silver Spring，MD)を使用して行うマン‐ホイットニー（Ｍann−Ｗhitney）試験およびＳpearman順位相関関係を使用して、結果の有意性を解析した。
【０１１８】
結果
ＳＬＥまたはＲＡの患者由来のＰＢＬにより産生される構造的および刺激されたＴＧＦ−β１を測定し、正常対照の値と比較した。培養上清中で検出されるサイトカインは、イソ形１、２および３を認識するｍＡｂで中和されたが、イソ形２および３に対するｍＡＢではされず、結果としてＴＧＦ−β１の産生を確認した。正常対照と比較して、活性ＴＧＦ−β１の構造的産生はＳＬＥで有意に減少した(１４±４対５６±２１pg／ml、ｐ＝０.０２、図５)。抗ＣＤ２刺激活性ＴＧＦ−β１も減少した(８７±２２対３９９±１０３pg／ml、ｐ＝０.００３)。ＲＡにおいて、構造的ＴＧＦ−β１の平均値は、ＳＬＥ(１９±５pg／mg)と同様であり、抗ＣＤ２により刺激された後、正常とＳＬＥの中間値であった(１９７±５４pg／ml)。
【０１１９】
リンパ球により産生された構造的全ＴＧＦ−β１も、正常グループと比較してＳＬＥで減少した(２８６±８２対６３１±１８５pg／ml、ｐ＝０.０５)。ＲＡでの値は、正常とＳＬＥの中間値であった(４３５±１６１pg／ml)。抗ＣＤ２の添加に続き、全ＴＧＦ−β１はＳＬＥで正常対照より幾分増加したが、差異は統計学的に有意でなかった。ＲＡグループでの値も正常とＳＬＥグループの中間値であった。
【０１２０】
ＴＧＦ−β１の減少したレベルと疾病活動性の相関関係の可能性を調べるために、ＳＬＥの入院患者と外来患者とを比較した。これらの２つのグループの臨床的特徴は、表５に要約する。入院患者の方が若かった；６名中５名が、３ヶ月以内の症状を示し；そして、著しく活動的な疾病に罹患していた；そして殆どが、腎炎および／または溶血性貧血を伴う重症ＳＬＥであった。比較して、外来患者は、処置により活動性が低くなった慢性疾病であった。疾病異種性、期間、活動性および重症度の著しい差異にもかかわらず、構造的および刺激ＴＧＦ−β１産生は、正常対照と比較して両グループで有意に減少した(表６)。
【０１２１】
【表６】
【０１２２】
活性および全ＴＧＦ−β１のレベルと疾病活動性との相関関係をみると、全ＴＧＦ−β１の抗ＣＤ２刺激産生は、ＳＬＥＤＡＩ指数と有意な負の相関関係があるが(ｒ＝０.５５、ｐ＝０.０３）、ＳＬＡＭ指数とは相関がなかった(−０.４３、ｐ＝１１)。ＳＬＥＤＡＩ指数は、中枢神経系関与および腎臓疾患に重きを置く。このように、ＴＧＦ−β１の前駆体形を分泌するリンパ球の能力の減少は、重症な疾病と関連するように見える。活性ＴＧＦ−β１のレベルは、疾病活動性と相関しなかった。
【０１２３】
本例での主な発見は、ＳＬＥでの活性ＴＧＦ−β１の産生減少が、疾病活動性または重症度と相関しないことである。構造的および刺激活性のＴＧＦ−β１量の減少は、最近発症した疾病および確立した疾病の両方の患者で見られた。更に、この値は、ＳＬＡＭおよびＳＬＥＤＡＩ指数で測定して活動性と、または生体臓器関与により評価した重症度と相関しなかった。しかし、全ＴＧＦ−β１産生がＳＬＥで減少もするが、この欠失は疾病活動性と相関するように見えた。これは、主として入院ＳＬＥ患者で見られた。全ＴＧＦ−β１産生が主要な臓器系関与に重きを置くＳＬＥＤＡＩ指数と最も相関するというこの発見はまた、疾病重症度との関係を示す。
【０１２４】
この試験はまた、確立された疾病のＳＬＥ患者と疾病活動性が同等であるＲＡ患者の対照グループを含む。ＲＡグループでのＴＧＦ−β１値は、構造的活性ＴＧＦ−β１以外、正常対照より幾分低いが、欠失の強度はＳＬＥ程著しくなく、統計的に有意ではなかった。
【０１２５】
以前に、我々は、ＮＫ細胞がＴＧＦ−βの主なリンパ球源であり、このサイトカインを活性形で構造的に産生する唯一のリンパ球集団であることを証明した(Gray, J. D. et al., (1988), J. Immunol. 169:2248-2254)。従って、ＮＫ細胞由来ＴＧＦ−βの構造的産生はＳＬＥで減少しているとの発見は、興味深かった。我々はまたＩＬ−２およびＴＮＦ−αの両方が活性ＴＧＦ−βの産生を促進できることを知った。これら両サイトカイン産生はＳＬＥで減少する(Gray J. D. et al., (1994), J Exp Med 180:1937-1942)。しかし、殆どの患者において、外来性ＩＬ−２およびＴＮＦ−αはＴＧＦ−βを正常に回復できなかった(実施例２)。ＩＬ−１０産生はＳＬＥで増加し(Llorente, L. et al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421))、増加したレベルと疾病活動性の相関関係が報告されている(Housslau, F. A. et al. (1995), Lupus 4:393-395; Haglwara, E. et al. (1996), Arthritis Rheum 39:379)。ＩＬ−１０はＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−β産生を阻害できる(実施例２およびMoore, K. W. et al. (1993), Ann Rev Immunol 11:165-190)。活性ＴＧＦ−βの産生が軽いおよび活動性の疾病の患者で減少したこと、およびＩＬ−１０の拮抗によって産生欠失を部分的にしか回復できなかったことは(実施例２)、増加したＩＬ−１０産生自体がＳＬＥにおけるＴＧＦ−β１のリンパ球産生の減少について説明となり得ないことを示す。数個の機構が恐らく関与するのであろう。潜伏性前駆体の成熟活動性形への細胞外変換における１個またはそれ以上の欠失がこの異常性を説明し得る。
【０１２６】
ＴＧＦ−βは、リンパ球増殖およびエフェクター細胞機能に対する阻害特性が詳細に説明されているが(Letterio, J. J. et al. (1998), Ann Rev. Immunol 16:137-162)、刺激特性も報告されている(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:668-677)。ＴＧＦ−βは、刺激Ｔ細胞およびその産生の上方制御によりサイトカイン産生を調節する。マウスにおいて、ＴＧＦ−β１は、ＣＤ８+Ｔ細胞を選択的に活性化して増殖させ(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:668-667)、ナイーブ細胞からメモリーＴ細胞への成熟を増加する(Lee, M. H. et al. (1991), J. Immunol 147:1127-1133)。ヒトにおいて、ＴＧＦ−β１はエフェクターＴ細胞の強い誘発物である(Cerwenka, A. et al. (1994), J Immunol 153:4367-4377)。免疫抑制作用には大量(ナノグラム／ml)が必要であるが、我々が示したように、抗体産生の下方制御効果に関してＣＤ８+Ｔ細胞を共刺激するのには、少量(ピコグラム／ml)でよい(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol 160:2248-2254)。
【０１２７】
そのため、これらの試験によると、ＴＧＦ−β１の潜伏性前駆体のリンパ球分泌の欠失が疾病活動性の結果として起こり得るが、ＳＬＥにおける活性ＴＧＦ−β１産生の減少は、さらに複雑であり、数個の異なる機構からもたらされる。ナイーブＴ細胞が抗体産生を下方制御するように計画するには、Ｔ細胞が活性化される時点でpg／ml量の活性ＴＧＦ−βの存在を必要とすると我々は考え、またこの考えを支持する証拠がある(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol 160:2248-2254)。従って、決定的な時点での局所環境におけるピコモル量の活性ＴＧＦ−βを欠くことは、ＳＬＥにおけるＢリンパ球活性を制御するＴ細胞調節機能の無効によるのであろう。
【０１２８】
実施例３
マイトジェンでのＳＬＥの処置
本実施例において、ＩｇＧ産生は、調節組成物で細胞を処理することにより下方制御される。この調節組成物はマイトジェン抗ＣＤ２モノクローナル抗体組合せ物のようにマイトジェンを含む。これら抗体は、可溶化形態で添加するか、ビーズ上に固定化して、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上の受容体と橋かけ結合せしめる。これらの細胞は、上記の実施例で説明したように調製し、次いで、マイトジェンとインキュベートし、増幅した。抗体産生が下方制御された細胞数が増加する。ＣｏｎＡはシグマから入手できる（St. Louis, MO）。
【０１２９】
抗ＣＤ２がどのように機能するかは知られていないが、これら抗体がＰＢＭＣ調製物中においてＮＫ細胞を誘導し、活性ＴＧＦ−βを分泌し（Ohtsuka, K. et al.(198), J. Imunol 160: 2539-2545）、次いでＴＧＦ−βが働いて、Ｔ細胞が抗体抑制細胞となると考えられている。
次いで、細胞を必要であれば洗浄し、患者に移植し戻す。
【０１３０】
実施例４
サイトカインとマイトジェンの混合物での細胞の処理
細胞を上記のように調製して、抗体産生を下方制御する細胞集団を誘導するために、マイトジェンとサイトカインの混合物を含む調節組成物で細胞をインキュベートした。この手法の例は、図４Ｃにおいて示す。この実施例において、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞をＣｏｎＡ、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βで処理して、抑制に関する最大誘導を得た。
【０１３１】
患者に再移送される調節性Ｔ細胞の調製のために、抗ＣＤ２および／または抗ＣＤ３モノクローナル抗体をＣｏｎＡの代わりに使用して、Ｔ細胞を活性化する。調節組成物は、ＩＬ−２を伴いまたは伴なわずに、ＴＧＦ−βを含有する。この細胞を、例えば、Nexell 300i. Magnetic Cell Selection System のような閉鎖系中で標準インキュベーション技術を用いて４〜７時間、組成物と共にインキュベーションした。
【０１３２】
インキュベートの後、細胞をＨＢＢＳと洗浄して、溶液中のサイトカインおよびマイトジェンを除去する。所望により、ビーズ上に固定した抗ＣＤ３±抗ＣＤ２８と培養して、細胞数を増加さす。次いで、細胞を２００−５００mlのＨＢＢＳ中に懸濁し、患者に再挿入する。
【０１３３】
実施例５
細胞の細胞仲介免疫を正常化する処置
ＳＬＥの自己抗体産生に対する要因は、ＩＬ−１０とＴＮＦ−αとのアンバランスにある。ＩＬ−１０のレベルは過多で、ＴＮＦ−αレベルは低い［Llorente et al. 1995. J. Exp. Med. 181:839-44，Houssiau, F.A. et al., 1995. Lupus 4:393-5.(Ishida, H. et al. 1994. J. Exp. Med. 179:305-10)(Jacob, C. O. and McDevitt, H. O.,1988. Nature 331: 356-358)］。我々は、このアンバランスが、ＴＧＦ−βの存在下でＴ細胞を強く活性化することによって補正されるという証拠を得て、近年この効果の作用機構を解明した。
【０１３４】
精製されたＴ細胞を、上記概要に沿って調製し、ＴＧＦ−βの存在または不存在で、ＣｏｎＡとＩＬ−２でインキュベーションした。図６では、ＴＧＦ−βの非存在下でのＴ細胞の刺激によって、ＩＬ−１０の産生が増加したことを示す。しかし、ＴＧＦ−αを刺激されたＴ細胞に加えると、ＩＬ−１０の産生が遮断され、ＴＮＦ−αの産生が増加した。さらに、ＴＮＦＲ２の発現が有意に増加した。理論にしばられるわけではないが、ＴＧＦ−βによって誘導されるＴＮＦＲ２を介するＴＧＦ−α情報伝達の促進が、抗体産生を抑制する調節性Ｔ細胞を生じると考える。我々の結果は、この考察を支持するものであった。
【０１３５】
ＴＧＦ−βによるＴＮＦ−αの上方制御が調節性Ｔ細胞の誘導に重要であることを説明してきた。図７は、ＴＧＦ−βを活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に添加することで、ＩｇＧ産生の顕著な抑制が起こることを示す。この抑制活性は、主な中間体としてＴＮＦ−αに依存する。これらの各試験において、抗ＴＮＦ−α抗体を中和することによって、ＣＤ８＋調節性Ｔ細胞（ＣＤ８reg）抑制効果を完全になくした。
【０１３６】
ＳＬＥ患者は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生減少を伴なう細胞仲介免疫に著しい欠失を有する（Horwitz, D.A. et al.,(1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp.83-96, D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore)。理論にしばられるわけではないが、ＴＧＦ−βのリンパ球産生における欠失は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生減少に対する部分的な要因である。ＴＧＦ−βの存在下でのＴ細胞の刺激によって、これらの細胞を再び刺激すると、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生が顕著に増加することを見出した。さらに、この結果は、ＴＧＦ−βによるＴＮＦ−αの上方制御にも依存する（図８を参照）。
【０１３７】
ＴＧＦ−βの産生がＳＬＥで低下し、その欠失がＩＬ−１０とＴＮＦ−αとのアンバランスによるものであるということを示す。理論にしばられるわけではないが、ＳＬＥにおけるＩＬ−１０の高いレベルが、自己抗体産生を保ち、ＴＧＦ−α、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ産生の原因であると考える。これらサイトカインの産生低下がＳＬＥにおける欠失性細胞免疫の原因である。明記した条件下で、ＴＧＦ−βはＩＬ−１０を下方制御し、ＴＮＦ−αの産生を強めることを示す。ＴＧＦ−βによるＩＬ−１０の下方制御とＴＮＦ−β産生の増強は、ＳＬＥにおける調節性Ｔ細胞の正常化、細胞仲介免疫の修復、疾病の軽減に関して重大な役割をになう。
【０１３８】
実施例６
細胞仲介自己免疫を抑制する調節性Ｔ細胞の生成
前記実施例では、調節組成物を使用して、抗体介在性自己抗免疫疾患を処置した。類似組成物を使用して、ＣＤ４＋に加えてＣＤ＋８Ｔ細胞を誘導し、細胞仲介自己免疫疾患を抑制した。ＴＧＦ−βによって調節されたＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞が、Ｔ細胞の細胞毒性の生成を抑制することを示す。
【０１３９】
調節性Ｔ細胞を誘導するためにマイトジェンを使用する代わりに、同種異系性混合リンパ球反応を、この目的のために使用した。この反応では、１個体からのＴ細胞が、他の個体のＰＢＭＣによって提示された外来の組織適合性抗原を認識し、応答する。これらの応答Ｔ細胞は、増加して、これらの標的細胞を殺傷する能力を発展させる。
【０１４０】
抑制Ｔ細胞を創生するために、一個体（ドナーＡ）からの様々なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットを、別の個体（ドナーＢ）からの照射されたＴ細胞なしの単球性細胞と共に培養した。その細胞を、懸濁液中のＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在で、５日間培養した。これ以降は、ＴＧＦ−βを除き、該細胞を、新たなドナーＡからのＴ細胞とドナーＢ細胞からの非Ｔ細胞に添加した。図９は、ＴＧＦ−βが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方を誘導し、細胞仲介細胞毒性を抑制する能力を開発することを示す。図１０は、ＴＧＦ−βによって誘導されたＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を用いる２つの追加試験を示す。
【０１４１】
さらなる試験によると、この方法でつくった調節ＣＤ４＋Ｔ細胞が、該作用に関する独特の作用を示す。前につくったＣＤ８＋およびＣＤ４＋両方のＴ細胞が阻害性サイトカインの分泌により抑制をおこすのと異なり、これらアロ特異的調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、接触依存性の作用機構を示す（図１１）。理論にしばられるわけではないが、これらの調節性Ｔ細胞は、別のＴ細胞が活性化されるのを抑制すると考える。これらのＴ細胞の応答Ｔ細胞およびアロ刺激細胞への添加は、増殖を抑制し（図１２）、応答ＣＤ８＋キラー前駆体細胞が活性化される能力を低下させた（図１３）。
【０１４２】
次のことも分かった。これら調節性ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）をそれら細胞表面で発現し、非常に強力である（図１４）。調節ＣＤ４＋細胞の応答Ｔ細胞との割合が、１：４（２０％）から１：３２（３％）に低下すると、これら細胞の阻害効果がごく僅か低下した。
【０１４３】
これら細胞の少量のみを強い下方制御効果に必要とするので、十分な数を患者に移送し、自己免疫性もしくは他の所望の免疫抑制効果、例えば移植拒絶反応を抑制することができる。
【０１４４】
実施例７
ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激してＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成する
ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ３細胞と称されているが、その発生に関する機構は殆ど理解されていない。われわれが得た証拠によると、スーパー抗原、スタフィロコッカス・エンテロトキシン（ＳＥＢ）によるＣＤ４＋細胞の強い刺激、または低濃度のＳＥＢよるＣＤ４＋細胞の反復刺激が、これらの細胞を誘導し、活性ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成した。
【０１４５】
図１５は、活性および全ＴＧＦ−βの産生増加が、ＳＥＢ濃度の増加によって刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によりなされたことを示す。図１６は、ＳＥＢの低用量によってＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激に関する効果を示す。Ｔ細胞をＳＥＢで３回刺激すると、顕著な量のＴＧＦ−βの活性型が生成した。
【０１４６】
図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの効果を示す。この細胞をＳＥＢで５日ごとに合計３回刺激した。各Ｔ細胞のサブセットおよびＣＤ２５ＩＬ−２受容体活性マーカーを発現する細胞の％を各々の刺激後に測定した。パネルＡおよびＣは、最初の刺激にＴＧＦ−β １ｎｇ／ｍｌが含まれていると、ＣＤ４＋Ｔ細胞が反復刺激の培養物中で優勢なサブセットとなったことを示す。パネルＢおよびＤは、ＳＥＢ刺激細胞によるＣＤ２５の発現が、対照培養物中で３回目の刺激によって低下したことを示す。しかし、ＣＤ２５の発現は、Ｔ細胞がＴＧＦ−βで駆動されると、非常に高いままであった。即ち、ＴＧＦ−βは、これらのＴ細胞が反復刺激されると、ＣＤ４＋細胞に対する優先効果を有するようであり、これらの細胞の殆ど全てが２０日間の培養後にＣＤ２５＋であった。
【０１４７】
要約すると、Ｔ細胞の刺激の結果として、ＴＧＦ−βの優勢な調節効果が、ＣＤ８＋細胞に与えられる。反復刺激によって、このサイトカインはＣＤ４＋細胞を誘導して、調節性細胞とする。この細胞は、抑制活性に関してＣＤ８＋細胞よりも強力である。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ−２およびＴＧＦ−βと共にインキュベーションすることにより、自発的免疫グロブリン産生が減少することを示す。
【図２】図２は、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの両方により、自発的ＩｇＧ産生が有意に減少することを示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、抗ＴＧＦ−βがＩＬ−２の効果を逆転することを示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、抗体産生に対するＤＣ８＋Ｔ細胞の調節効果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、非刺激細胞および抗ＣＤ２刺激細胞によるＴＧＦ−β１のリンパ球産生を示す。
【図６】図６は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のＴ細胞産生に対するＴＧＦ−βの作用を示す。
【図７】図７は、ＴＧＦ−βによる調節性Ｔ細胞の生成にＴＮＦ−αが必須の中間体であることを示す。
【図８】図８は、ＴＧＦ−β起動Ｔ細胞によるＴｈ１サイトカインの産生の増加がＴＮＦ−αに依存性であることを示す。
【図９】図９は、細胞毒性Ｔ細胞活性の抑制物質の産生におけるＴＧＦ−βの作用を示す。
【図１０】図１０は、ＴＧＦ−βにより起動されたＣＤ４細胞のアロ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性に対する作用を示す。
【図１１】図１１は、調節性Ｔ細胞がＣＴＬ活性を抑制するために細胞接触を必要とすることを示す。
【図１２】図１２は、ＴＧＦ−βで誘発された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球増殖の抑制を示す。
【図１３】図１３は、ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞の調節活性を示す。
【図１４】図１４は、調節ＣＤ＋４細胞がその表面でＣＤ２５＋（ＩＬ−２）受容体を発現することを示す。
【図１５】図１５は、少量のブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）でのＴ細胞の反復刺激がＴ細胞を誘発してＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
【図１６】図１６は、低量のＳＥＢでＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激によってＴ細胞がＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
【図１７】図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの作用を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ-βおよびＩＬ−２を含む組成物を用いて、細胞仲介自己免疫異常患者から得たＰＢＭＣを処置することを含む、該患者を処理するための処理済末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製方法。
【請求項２】
処理済ＰＢＭＣが、細胞仲介自己免疫異常に関連する細胞毒性を減少せしめる作用を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞仲介自己免疫異常が、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、真性糖尿病、慢性関節リウマチおよび硬皮症よりなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項４】
ＰＢＭＣがＣＤ８＋Ｔ細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
ＰＢＭＣがＣＤ４＋細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項６】
ＰＢＭＣがナイーブＣＤ４＋細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項７】
ＰＢＭＣがＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項８】
ＰＢＭＣがＮＫ細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項９】
調節用組成物がＴ細胞アクチベーターを含む、請求項１−８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞アクチベーターが抗ＣＤ２抗体である、請求項９の方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞アクチベーターが抗ＣＤ３抗体である、請求項９の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞アクチベーターが抗ＣＤ２８抗体である、請求項９の方法。
【請求項１３】
処理済ＰＢＭＣが、該患者における他のＴ細胞が細胞毒性エフェクター細胞になるのを防止する作用を有する、請求項１−１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
処置済細胞が、誘発されて、活性ＴＧＦ-βの免疫抑制レベルをつくる、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
ＴＧＦ-βおよびＩＬ−２を含む組成物を用いて、細胞仲介自己免疫異常患者から得たＰＢＭＣを処置することを含む、該患者を処理するための処理済末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製方法。
【請求項２】
処理済ＰＢＭＣが、細胞仲介自己免疫異常に関連する細胞毒性を減少せしめる作用を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞仲介自己免疫異常が、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、真性糖尿病、慢性関節リウマチおよび硬皮症よりなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項４】
ＰＢＭＣがＣＤ８＋Ｔ細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
ＰＢＭＣがＣＤ４＋細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項６】
ＰＢＭＣがナイーブＣＤ４＋細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項７】
ＰＢＭＣがＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項８】
ＰＢＭＣがＮＫ細胞に富む、請求項１−３のいずれか記載の方法。
【請求項９】
調節用組成物がＴ細胞アクチベーターを含む、請求項１−８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞アクチベーターが抗ＣＤ２抗体である、請求項９の方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞アクチベーターが抗ＣＤ３抗体である、請求項９の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞アクチベーターが抗ＣＤ２８抗体である、請求項９の方法。
【請求項１３】
処理済ＰＢＭＣが、該患者における他のＴ細胞が細胞毒性エフェクター細胞になるのを防止する作用を有する、請求項１−１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
処置済細胞が、誘発されて、活性ＴＧＦ-βの免疫抑制レベルをつくる、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−１７４５６４（Ｐ２００８−１７４５６４Ａ）
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３１４１（Ｐ２００８−３３１４１）
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【分割の表示】特願２０００−６１５０４２（Ｐ２０００−６１５０４２）の分割
【原出願日】平成１２年５月５日（２０００．５．５）
【出願人】（５９２０４８８４４）ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア (26)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【分割の表示】特願２０００−６１５０４２（Ｐ２０００−６１５０４２）の分割
【原出願日】平成１２年５月５日（２０００．５．５）
【出願人】（５９２０４８８４４）ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア (26)
【Ｆターム（参考）】
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