癌の予防または治療のための腫瘍抗原
【課題】癌の予防および／または治療、特に免疫療法に使用するための、腫瘍抗原をコードする外来遺伝子の挿入および発現のための改良されたベクターを提供する。
【解決手段】特定の配列をコードする、プラスミドまたはウイルスベクタである発現ベクター；前記特定配列をコードする単離核酸分子；特定の配列群のいずれか１つにより表される単離ペプチド；ならびに前記単離ペプチドおよび医薬的に許容されるキャリヤーを含む組成物。
【解決手段】特定の配列をコードする、プラスミドまたはウイルスベクタである発現ベクター；前記特定配列をコードする単離核酸分子；特定の配列群のいずれか１つにより表される単離ペプチド；ならびに前記単離ペプチドおよび医薬的に許容されるキャリヤーを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年５月１６日出願の米国特許出願第６０／４７１，１１９号、および２００３年５月１６日出願の米国特許出願第６０／４７１，１９３号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリペプチドをコードする核酸、ならびに、癌の予防および／または治療におけるその核酸またはポリペプチドの使用に関する。より詳細には、本発明は、癌の免疫療法に使用するための、腫瘍抗原をコードする外来遺伝子の挿入および発現のための改良されたベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
高密度マイクロアレイ、ＳＥＲＥＸ、免役組織化学法（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）およびレーザー捕捉顕微法といったいくつかの技術による、原発性腫瘍および正常細胞についての発現プロファイリングに基づく分子の同定の大きな進歩のため、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を用いた癌ワクチンの開発においては最近数年間に大変な拡大があった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９９； Ｓｇｒｏｉ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｏｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ，２０００）。ＴＡＡとは、腫瘍細胞によって発現または過剰発現されている抗原であり、および１またはいくつかの腫瘍に特異的である可能性があり、たとえばＣＥＡ抗原は直腸結腸癌、乳癌、および肺癌で発現される。Ｓｇｒｏｉら（１９９９）は、浸潤性および転移性癌細胞で発現に差のあるいくつかの遺伝子を、レーザー捕捉顕微解剖法およびｃＤＮＡマイクロアレイを組み合わせて用いて同定した。ＤＮＡまたはウイルスのようないくつかの運搬系(delivery system)は、ヒト癌に対する治療ワクチン接種に用いることができ（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ，２０００）、および免疫応答を導きおよびまたＴＡＡに対する免疫寛容を打破することができる。腫瘍細胞は、Ｂ７．１といったＴ細胞共刺激分子または特にＩＦＮ−γ、ＩＬ２、またはＧＭ−ＣＳＦといったサイトカインをコードする導入遺伝子を挿入することによって、より免疫原性を高めることができる。ＴＡＡおよびサイトカインまたは共刺激分子の共発現はまた、効果的な治療ワクチンの開発において有用であることが示されている（Ｈｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ，９５，Ｂｒｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本分野には、癌を予防または治療するために免疫応答を刺激することにおいて有用な試薬および方法の必要性がある。本発明は、癌を治療する試みにおいて他の試薬および方法が直面する問題の多数を克服する試薬および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、癌を予防および／または治療するための患者への投与のための免疫原性標的を提供する。特に、その免疫原性標的は、腫瘍抗原（「ＴＡ」）および／または血管新生関連抗原（「ＡＡ」）である。一実施形態では、免疫原性標的は、配列番号３４または配列番号３６によってコードされるか、または配列番号３５または配列番号３７のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＴＡおよび／またはＡＡは、プラスミド、または組換えウイルスといった他の運搬ベクター内に含まれた核酸として患者に投与される。ＴＡおよび／またはＡＡはまた、共刺激分子(co-stimulatory molecule)またはアジュバントといった免疫促進剤と組み合わせて投与されうる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ−１】ＡＡＣ２−１およびＡＡＣ２−２のヌクレオチド配列。欠けたヌクレオチドまたはアミノ酸は「＊」で示される。配列間の差は下線で示す。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１の続き。
【図１Ｂ】ＡＡＣ２−１およびＡＡＣ２−２の予想アミノ酸配列の整列。欠けたヌクレオチドまたはアミノ酸は「＊」で示される。配列間の差は下線で示す。
【図２】ヒトリンパ球は、ＡＡＣ２−２タンパク質に由来するペプチドに反応して、ＩＦＮ−γを分泌するエフェクター細胞へ分化する。Ｔ細胞は、表ＩＩＩ（群１〜９）に示されるペプチドの群で刺激された。３回の刺激後、リンパ球をペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生についてＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。挿入図のグラフは、ペプチド群６番によって刺激された活性化細胞は、抗原特異的ＣＴＬ活性の能力を有し、ペプチド負荷されたＴ２標的細胞を傷害することを示す。ペプチドＥＣ５は、ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γ分泌の両方の誘導における主な活性を誘導する。
【図３】ＨＬＡ−Ａ２−Ｋｂ遺伝子導入マウス由来のマウスＴ細胞は、ヒトＡＡＣ２−２をコードするＤＮＡプラスミドを用いたＤＮＡ免疫を認識およびそれに応答してＩＦＮ−γ分泌する。ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２免疫マウス由来の脾臓細胞は、さまざまな群のペプチドを用いて再刺激された。６日後、細胞を採取しおよび各ペプチド群のそれぞれまたは対照ＨＬＡ−Ａ２結合９量体ＨＩＶペプチドに応答したＩＦＮ−γ分泌について試験した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを一夜インキュベートしおよび発色させた。各群は、陽性対照として用いたＰＭＡおよびイオノマイシンに応答して、高レベルのＩＦＮ−γ産生（２５０スポットより大）で反応した。反応性の高いペプチド群の１つ（群６）はまた、これまでに試験したＨＬＡ−Ａ−０２０１＋ドナー由来のヒトリンパ球によっても認識される。
【図４】ヒトＡＡＣ２−２をコードする遺伝子を用いたＤＮＡワクチン接種は、移植されたＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の増殖を完全に阻害する。この作用は、ｆｌｕ−ＮＰタンパク質およびヒトｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ−２）をコードするプラスミドが腫瘍増殖を妨げることができないことによって示される通り、非特異的免疫応答が原因ではない。
【図５】ヒトＡＡＣ２−２ベクターを用いたＤＮＡワクチン接種が腫瘍増殖の作用に対して完全に防御する能力を示す、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞のＣ５７ＢＬ／６マウスへの移植後のマウスの生存。この防御作用は抗原特異的であり、および他の遺伝子を用いたワクチン接種を介して誘導することができない。
【図６】Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴリンパ球は、ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２発現プラスミドを用いたＤＮＡワクチン接種後に、ヒトＡＡＣ２−２のペプチドに応答して、エフェクター細胞活性を示しおよびＩＦＮ−γを分泌する。これらのペプチドは、Ｂ６ＭＨＣクラスＩについて交差反応性を示しうる。群１および群５のペプチドは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞によって強い反応性を誘導する。
【図７】ＢＦＡ４ｃＤＮＡ配列。
【図８】ＢＦＡ４アミノ酸配列。
【図９】ＢＦＡ４ペプチドに対する免疫応答。
【図１０】ＢＣＹ１ヌクレオチド（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）配列。
【図１１】特異的ＢＣＹ１ペプチドに対する免疫応答。
【図１２】ＢＦＡ５ｃＤＮＡ配列。
【図１３】ＢＦＡ５アミノ酸配列。
【図１４Ａ】ＢＦＡ５由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１４Ｂ】ＢＦＡ５由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１４Ｃ】ＢＦＡ５由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１５】ＢＣＺ４ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。
【図１６Ａ】ＢＣＺ４由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１６Ｂ】ＢＣＺ４由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１６Ｃ】ＢＣＺ４由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１７】ＢＦＹ３ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。
【図１８Ａ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｂ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｃ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｄ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｅ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、癌の予防および／または治療に有用な試薬および方法を提供する。本明細書中で引用されたすべての参考文献は参照により本開示に含まれる。
一実施形態では、本発明は、癌を予防および／または治療するための、１つ以上の腫瘍抗原（「ＴＡ」）に対する免疫応答の誘導または促進に関する。一部の実施形態では、１つ以上のＴＡは組み合わせることができる。好ましい実施形態では、免疫応答は、たとえば腫瘍抗原をコードする核酸ベクターまたはペプチドまたはポリペプチドの形の腫瘍抗原自体の投与後の、宿主細胞におけるＴＡの発現の結果として生じる。
【０００８】
ここでは、「抗原」とは、抗原が投与されている宿主において免疫応答を生じる、ポリペプチドまたはその一部といった分子である。免疫応答は、抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の産生および／または抗原のエピトープを発現している細胞に対する細胞性免疫応答の発生を含みうる。応答は、たとえば、抗体産生の増加、抗原に対する親和性の増大した抗体の産生、または増大したかまたはより効果的な細胞性応答（すなわち、Ｔ細胞の増加、またはより高い抗腫瘍活性を持つＴ細胞）を生じることによる、現在の免疫応答の促進でありうる。免疫応答を生じる抗原を、代替的に、免疫原性であると、または免疫原ということができる。本発明の説明においては、ＴＡを「免疫原性標的」ということができる。
【０００９】
ＴＡは、癌細胞が抗原の起源である場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の両方を含む。ＴＡＡとは、正常細胞上で観察されるよりも多量に腫瘍細胞の表面上で発現されている抗原、または胎児発生中に正常細胞上に発現されている抗原である。ＴＳＡとは、腫瘍細胞に独特であり、および正常細胞上には発現されていない抗原である。ＴＡはさらに、ＴＡＡまたはＴＳＡ、その抗原性断片、およびその抗原性を保った改変型を含む。
【００１０】
ＴＡは典型的には、発現パターン、機能、または遺伝的起源にしたがって５つのカテゴリ：癌精巣（ＣＴ）抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１）；メラノサイト分化抗原（すなわち、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇａｐ１００）；突然変異抗原（すなわち、ＭＵＭ−１、ｐ５３、ＣＤＫ−４）；過剰発現された「自己」抗原（すなわち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３）；および、ウイルス抗原（すなわち、ＨＰＶ、ＥＢＶ）に分類される。本発明を実施する目的上は、適当なＴＡとは、ＴＡが発現している宿主において抗腫瘍免疫応答を誘導または促進する任意のＴＡである。適当なＴＡは、たとえば、ｇａｐ１００（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：７１６−７１９（１９９４））、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０： ３４７−３５２（１９９４））、ｇｐ７５（ＴＲＰ−１）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６： １１３１−１１４０ （１９９６））、チロシナーゼ（Ｗｏｌｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：７５９−７６４ （１９９４）；国際公開第２００１７５１１７号パンフレット；国際公開第２００１７５０１６号パンフレット；国際公開第２００１７５００７号パンフレット）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（国際公開第９８／１４４６４号パンフレット；国際公開第９９／１８２０６号パンフレット）、黒色腫プロテオグリカン（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０： １４６７−１４７２ （１９８３））、ＭＡＧＥファミリー抗原（すなわち、ＭＡＧＥ−１，２，３，４，６，１２，５１ ； Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４： １６４３− １６４７ （１９９１）；米国特許第６，２３５，５２５号明細書；ＣＮ１３１９６１１）、ＢＡＧＥファミリー抗原（Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２： １６７−１７５ （１９９５））、ＧＡＧＥファミリー抗原（すなわちＧＡＧＥ−１，２ ； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２： ６８９−６９８ （１９９５）； 米国特許第６，０１３，７６５号明細書）、ＲＡＧＥファミリー抗原（すなわちＲＡＧＥ−１； Ｇａｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｔ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４４： ３２３−３３０ （１９９６）；米国特許第５，９３９，５２６号明細書）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｇｕｉｌｌｏｕｘ ｅｔ ａｔ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３ ： １１７３−１１８３ （１９９６））、ｐ１５（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４： ５９４４−５９５０（１９９５））、Ｂ−カテニン（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３： １１８５−１１９２ （１９９６） ）、ＭＵＭ−１（Ｃｏｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２： ７９７６−７９８０ （１９９５））、サイクリン依存性キナーゼ−４（ＣＤＫ４）（Ｗｏｌｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１２８１−１２８４ （１９９５））、ｐ２１−ｒａｓ（Ｆｏｓｓｕｍ ｅｔ ａｔ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５６： ４０−４５（１９９４））、ＢＣＲ−ａｂｌ（Ｂｏｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８５： ２６８０− ２６８４ （１９９５））、ｐ５３（Ｔｈｅｏｂａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２： １１９９３−１１９９７ （１９９５））、ｐｌ８５ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂ−Ｂｌ ； Ｆｉｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１： ２１０９−２１１７ （１９９５））、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ，２９： １−２ （１９９４））、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８５： ９８２−９９０ （１９９５）米国特許第５，７５６，１０３号明細書；第５，２７４，０８７号明細書；第５，５７１，７１０号明細書；第６，０７１，７１６号明細書；第５，６９８，５３０号明細書；第６，０４５，８０２号明細書；欧州特許第２６３９３３号明細書；欧州特許第３４６７１０号明細書；および欧州特許第７８４４８３号明細書）；癌関連変異ムチン（すなわちＭＵＣ−１遺伝子産物； Ｊｅｒｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１： １６５４−１６６２（１９９３））；ＥＢＶのＥＢＮＡ遺伝子産物（すなわちＥＢＮＡ−１；Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ−Ｓｕｒｖｅｙｓ，１３ ： ５３−８０ （１９９２））；ヒトパピローマウイルスのＥ７、Ｅ６タンパク質（Ｒｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５４： ５９３４−５９４３ （１９９５））；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ； Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ，３０： ７３−７８ （１９９７））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ； Ｉｓｒａｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：１８０７−１８１１ （１９９４））；イディオタイプエピトープまたは抗原、たとえば、免疫グロブリンイディオタイプまたはＴ細胞受容体イディオタイプ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３： ４７７５−４７８７ （１９９４））；ＫＳＡ（米国特許第５，３４８，８８７号明細書）、キネシン２（Ｄｉｅｔｚ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｓｅｐ ７； ２７５ （３）： ７３１−８）、ＨＩＰ−５５、ＴＧＦβ−１抗アポトーシス因子（Ｔｏｏｍｅｙ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２００１； ５８ （３）： １７７−８３）、腫瘍タンパク質Ｄ５２（Ｂｒｙｎｅ Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３５： ５２３−５３２ （１９９６））、Ｈ１ＦＴ、ＮＹ−ＢＲ−１（国際公開第０１／４７９５９号パンフレット）、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−７５、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＢＲ−８７、ＮＹ−ＢＲ−９６（Ｓｃａｎｌａｎ，Ｍ．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ワクチンｓ ２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＢＦＡ４（配列番号２８および２９）、ＢＣＹ１（配列番号３０および３１）、ＢＦＡ５（配列番号３２および３３）、ＢＣＺ４（配列番号３４および３５）、およびＢＦＹ３（配列番号３６および３７）を含み、「野生型」（すなわち、ゲノムによって通常コードされる、天然に存在する）、改変型、および変異型、およびその他の断片および誘導体を含む。これらのＴＡはいずれも、単独で、または共免疫手順において互いに組み合わせて使用することができる。
【００１１】
一部の場合には、ＴＡおよび血管新生関連抗原（「ＡＡ」）といった他の抗原の両方を用いて患者を共免疫することが有益でありうる。ＡＡとは、血管の誘導および／または連続した発達に関与する細胞に随伴する免疫原性分子（すなわち、ペプチド、ポリペプチド）である。たとえば、ＡＡは、血管の主要な構造要素である内皮細胞（「ＥＣ」）上で発現されうる。癌の治療のためには、腫瘍に供給する血管の内部または近傍にＡＡが見出されることが好ましい。ＡＡに対する患者の免疫は、好ましくは抗ＡＡ免疫応答を結果として生じ、それによって腫瘍の近傍または内部で生じる血管新生過程が予防されおよび／または阻害される。
【００１２】
典型的なＡＡは、たとえば、血管内皮増殖因子（すなわちＶＥＧＦ；Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｕｒｏｌ．，２００１，１６６ （４）： １２７５−９； Ｓｔａｒｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，２００１，１２２ （３）： ５１８−２３； Ｄｉａｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００２，９９ ：２１７９−２１８４）、ＶＥＧＦ受容体（すなわちＶＥＧＦ−Ｒ、ｆｌｋ−１／ＫＤＲ；Ｓｔａｒｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，２００１，１２２ （３）： ５１８−２３）、ＥＰＨ受容体（すなわちＥＰＨＡ２；Ｇｅｒｅｔｙ，ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｃｅｌｌ，４： ４０３−４１４）、上皮増殖因子受容体（すなわちＥＧＦＲ；Ｃｉａｒｄｅｉｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７ （１０）： ２９５８−７０）、塩基性線維芽細胞増殖因子（すなわちｂＦＧＦ；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２０００，１８ （６）： ５０１−７； Ｐｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ．Ｓｕｒｇ．，２００１，１８２ （３）： ２９８−３０４）、血小板由来細胞増殖因子（すなわちＰＤＧＦ−Ｂ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ；Ｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００１，８ （２）： １４１−８）、形質転換増殖因子（すなわち、ＴＧＦ−α； Ｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００１，８ （２）：１４１−８）、エンドグリン（Ｂａｌｚａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００１，９４ ： ５７９−５８５）、Ｉｄタンパク質（Ｂｅｎｅｚｒａ，Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，２００１，１１ （６）： ２３７−４１）、プロテアーゼたとえばｕＰＡ、ｕＰＡＲ、およびマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９；Ｄｊｏｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００１，１９５ （２）： １４７−５５）、一酸化窒素合成酵素（Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，２００１，１３２ （４）： ５５１−６）、アミノペプチダーゼ（Ｒｏｕｓｌｈａｔｉ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒ，２： ８４−９０，２００２）、トロンボスポンジン（すなわちＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２；Ａｌｖａｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１，８２ （２）： ２７３−８； Ｓｅｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１，１９ （２）： ３０５−１０）、ｋ−ｒａｓ（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，６１ （１６）： ６０５０−４）、Ｗｎｔ（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，６１ （１６）： ６０５０−４）、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ； Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．２０００，３ （２）： ８３−８８）、微小管（Ｔｉｍａｒ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐａｔｈ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．，７（２） ： ８５− ９４）、熱ショックタンパク質（すなわちＨＳＰ９０（Ｔｉｍａｒ、上記））、ヘパリン結合因子（すなわちへパリナーゼ； Ｇｏｈｊｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００１，９５ （５）： ２９５−３０１）、合成酵素（すなわちＡＴＰ合成酵素、チミジル酸合成酵素）、コラーゲン受容体、インテグリン（すなわちαν３、αν５、α１β１、α２β１、α５β１）、表面プロテオグリカンＮＧ２、ＡＡＣ２−１（配列番号１）、またはＡＡＣ２−２（配列番号２）を特に含み、「野生型」（すなわち、ゲノムによって通常コードされる、天然に存在する）、改変型、および変異型、およびその他の断片および誘導体を含む。これらの標的はいずれも、単独で、または互いにまたは他の物質と組み合わせて、本発明の実施に適当であろう。
【００１３】
一部の実施形態では、免疫原性標的をコードする核酸分子が利用される。その核酸分子は、ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ中のＤＮＡ挿入部に含まれるもののような、１つ以上の免疫原性標的をコードするヌクレオチド配列、またはその断片または誘導体を含みうるかまたはそれから構成されうる。「核酸配列」または「核酸分子」の語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。その語は、特に４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５'−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン、といった、しかしそれに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのうち任意のものから生じる分子を包含する。
【００１４】
単離された核酸分子とは、（１）総核酸が起源細胞から単離される際に天然に共存して見出されるタンパク質、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている；（２）その核酸分子が天然で結合しているポリヌクレオチドの全部または一部と結合していない；（３）天然では結合していないポリヌクレオチドと調節可能に結合している；および／または、（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然に存在しない：ものである。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ポリペプチド産生における用途、または、治療用途、診断用途、予防用途もしくは研究用途に干渉する、天然の環境で見出されるいかなる他の夾雑核酸分子または他の夾雑物も実質的に含まない。ここでは、「天然に存在する」または「天然」または「天然に見出される」の語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞、などといった生物材料との関連において用いられる場合、人による操作無しに自然界に見出される物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「非天然」はここでは、自然界に見られないかまたは人によって構造的に改変されたかもしくは合成された物質をいう。
【００１５】
２つ以上の核酸またはポリペプチド分子の同一性は、配列を比較することによって決定される。本分野で知られる通り、「同一性」とは、分子を構成する単位（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）間の一致によって決定される、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（すなわちアルゴリズム）によって処理された、ギャップ整列（あれば）を伴う２つ以上の配列のうち小さい方の間の同一マッチの割合を測定する。核酸配列間の同一性は、類縁配列が核酸配列または単離された核酸分子とハイブリダイズする能力によっても決定されうる。そのような配列の定義において、「高度にストリンジェントな条件」および「中等度にストリンジェントな条件」の語句は、配列が相補的である核酸鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、および顕著にミスマッチである核酸のハイブリダイゼーションを除外するための手順をいう。ハイブリダイゼーションおよび洗浄について「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ７ １９８９）； Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｃｈ．４ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照）。「中等度にストリンジェントな条件」の語句は、「高度にストリンジェントな条件」下で起こりうるよりも高い程度の塩基対ミスマッチを有するＤＮＡ 二重鎖 が生じうる条件をいう。典型的な中等度にストリンジェントな条件は、０．０１５ Ｍ塩化ナトリウム，０．００１５ Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５ Ｍ塩化ナトリウム，０．００１５ Ｍクエン酸ナトリウム，および２０％ホルムアミド 、３７〜５０℃である。一例として、５０℃、０．０１５ Ｍナトリウムイオン中での中等度にストリンジェントな条件は、２１％ ミスマッチを可能にする。ハイブリダイゼーション中に、非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減するために、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に他の物質を含めることが可能である。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、フィコール、Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適当な物質もまた用いることができる。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件の厳密性に実質的に影響することなく変えることができる。ハイブリダイゼーション実験は、ｐＨ６．８〜７．４で通常実施される；しかし、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨにほとんど依存しない。
【００１６】
本発明の一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸配列を細胞へ運搬するためにベクターが用いられる。ベクターとは、核酸配列を宿主細胞へ運搬するのに用いられる任意の分子である。一部の場合には、発現ベクターが用いられる。発現ベクターとは、宿主細胞の形質転換に適し、および運搬される核酸配列の発現を指示および／または調節する核酸配列を含む核酸分子である。発現は、転写、翻訳、および、イントロンが存在する場合にはスプライシング、といった過程を含むがそれらに限定されない。発現ベクターは典型的には、ポリペプチドをコードする異種核酸配列と調節可能に結合した１つ以上の隣接配列を含む。隣接配列は、たとえば、同種（すなわち、宿主細胞と同一の種および／または株に由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種に由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の起源に由来する隣接配列の組み合わせ）、または合成でありうる。
【００１７】
隣接配列は、好ましくは、コード配列の複製、転写および／または翻訳を達成することができ、およびコード配列と調節可能に結合している。ここでは、調節可能に結合という語句は、機能的関係にあるポリヌクレオチド配列の結合をいう。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合は、コード配列と調節可能に結合している。しかし、隣接配列は、正しく機能するかぎり、必ずしもコード配列と隣接している必要は無い。したがって、たとえば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、およびプロモーター配列はそれでもコード配列と調節可能に結合していると考えることができる。同様に、エンハンサー配列は、コード配列の上流または下流に位置しおよび配列の転写に影響を与えることができる。
【００１８】
一部の実施形態では、隣接配列は、標的細胞において高レベル遺伝子発現を推進する転写調節領域であることが好ましい。転写調節領域は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、リプレッサー配列、またはその組み合わせを含みうる。転写調節領域は、構成性、組織特異的、細胞型特異的（すなわち、その領域は、ある種類の組織または細胞において、他の種類と比較してより高いレベルの転写を推進する）、または調節可能（すなわち、化合物との相互作用に対して応答性である）でありうる。転写調節領域の起源は、隣接配列が細胞においてその細胞内の核酸の転写を引き起こすことによって機能するならば、任意の原核または真核生物、任意の脊椎動物または非脊椎動物、または任意の植物でありうる。さまざまな転写調節領域を、本発明の実施において利用しうる。
【００１９】
適当な転写調節領域は、たとえば、ＣＭＶプロモーター（すなわち、ＣＭＶ最初期プロモーター）；真核遺伝子由来プロモーター（すなわちエストロゲン誘導性ニワトリ卵白アルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子、グルココルチコイド誘導性チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、およびチミジンキナーゼ遺伝子）；および主要初期および後期アデノウイルス遺伝子プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０： ３０４−１０）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３'長末端反復（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．ＳＡ．７８： １４４４−４５）；メタロチオナイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６： ３９−４２）；ベータ−ラクタマーゼプロモーターといった原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５： ３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０： ２１−２５）を含む。組織型および／または細胞型特異的転写調節領域は、たとえば、膵腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８ ： ６３９−４６； Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０： ３９９−４０９ （１９８６）； ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７： ４２５−５１５）；膵ベータ細胞で活性であるインシュリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５： １１５−２２）；リンパ系細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８ ： ６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８： ５３３−３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７： １４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞中のマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓のアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１ ：２６８−７６）；肝臓のアルファ−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，５：１６３９−４８； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓のアルファ１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞中のベータ−グロブリン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ２１ ５：３３８−４０； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の乏突起膠細胞中のミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｃｅｉｌ ４８：７０３−１ ２）； 骨格筋のミオシン軽鎖２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；視床下部のゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８），および黒色腫細胞のチロシナーゼプロモーター（Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９６ Ｆｃｂ；２３（ｌ）：１５４−８； Ｓｉｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９８ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；５（５）：２８１−９１）を特に含む。たとえば光、熱、放射線、テトラサイクリン、または熱ショックタンパク質といった特定の化合物または条件の存在下で活性化される誘導性プロモーターもまた利用することができる（たとえば国際公開第ＷＯ００／１０６１２号パンフレットを参照）。他の適当なプロモーターが本分野で知られている。
【００２０】
上記の通り、エンハンサーはまた適当な隣接配列でもある。エンハンサーはＤＮＡのｃｉｓ作用配列であり、通常は長さ約１０〜３００ｂｐで、プロモーターに作用して転写を増大させる。エンハンサーは典型的には方向および位置に依存せず、調節されるコード配列に対して５’および３’の両方が同定されている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（すなわち、グロビン、ジアスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインシュリン）。同様に、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核プロモーター配列に有用である。エンハンサーは核酸コード領域に対して５’または３’の位置でスプライスされてベクターに入りうるが、典型的にはプロモーターから５'位に位置する。他の適当なエンハンサーが本分野で公知であり、および本発明に適用可能である。
【００２１】
本発明の試薬を調製する間に、細胞をトランスフェクションまたは形質転換する必要がありうる。トランスフェクションとは、細胞による外来すなわち外因性ＤＮＡの取り込みをいい、および外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された時に細胞はトランスフェクションされている。いくつかのトランスフェクション法が本分野でよく知られている（すなわち、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２： ４５６； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）； およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ １３： １９７）。そのような方法は、１つ以上の 外因性 ＤＮＡ部分を適当な宿主細胞へ導入するのに用いることができる。
【００２２】
一部の実施形態では、細胞のトランスフェクションがその細胞の形質転換を結果として生じることが好ましい。細胞の特性に変化がある場合、細胞は形質転換されており、新しい核酸を含むように改変された場合は形質転換されている。トランスフェクション後に、トランスフェクションされた核酸は、細胞の染色体内へ物理的に組み込むことによって細胞の核酸と組換えることができ、複製されずにエピソーム配列として一過性に維持されることができ、または、プラスミドとして独立して複製することができる。その核酸が細胞分裂と共に複製される場合、細胞は安定に形質転換されている。
【００２３】
本発明はさらに、ポリペプチドの形の、単離された免疫原性標的を提供する。ポリペプチドは下記の場合に単離されていると考えられる：（１）起源細胞から単離される際に天然に共存して見出されるポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている；（２）その「単離されたポリペプチド」が天然で結合しているポリペプチドの全部または一部と（共有または非共有相互作用によって）結合していない；（３）天然で結合していないポリペプチドと（共有または非共有相互作用によって）調節可能に結合している；または、（４）天然に存在しない。好ましくは、単離されたポリペプチドは、治療用途、診断用途、予防用途もしくは研究用途に干渉する、天然の環境で見出されるいかなる他の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物も実質的に含まない。
【００２４】
免疫原性標的ポリペプチドは、ここでの定義では、成熟ポリペプチドでよく、および、調製される方法に応じて、アミノ末端メチオニン残基を有していてもいなくてもよい。たとえば免疫原性標的の特性または活性（すなわち、活性、抗原性）の少なくとも１つを有する、たとえば、断片、変異体（すなわち、対立遺伝子、スプライス）、オルソログ、ホモログといった類縁ポリペプチド、および、誘導体もまたさらに考慮される。配列が由来するポリペプチドの少なくとも一部に対応する配列を有する、一連の隣接しているアミノ酸残基をいうペプチドもまた関連している。好ましい実施形態では、ペプチドはアミノ酸約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜３０個、または３０〜５０個を含む。より好ましい一実施形態では、ペプチドは、たとえばクラスＩＭＨＣ分子上での提示に適した、アミノ酸９〜１２個を含む。
【００２５】
核酸またはポリペプチドの断片は、配列（すなわち、核酸またはポリペプチド）のアミノ末端（リーダー配列ありまたは無し）および／またはカルボキシ末端での切断を含む。断片はまた、変異体（すなわち、対立遺伝子、スプライス）、オルソログ、ホモログ、および親配列と比較して１つ以上のアミノ酸付加または置換または内部欠失を有する他の変異体を含みうる。好ましい実施形態では、切断および／または欠失は、アミノ酸約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、またはより多数を含む。そのように生じたポリペプチド断片は、アミノ酸約１０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、またはより多数を含む。そのようなポリペプチド断片は、随意的にアミノ末端メチオニン残基を含みうる。そのような断片は、たとえば、免疫原性標的ポリペプチドに対して抗体または細胞性免疫応答を生じるために用いることができることが理解される。
【００２６】
変異体とは、対象配列と比較して、１つ以上の配列置換、欠失、および／または付加を有する配列である。変異体は、天然に存在しうるかまたは人工的に構築されうる。変異体は、対応する核酸分子から調製されうる。好ましい実施形態では、変異体は、１ないし３、または１ないし５、または１ないし１０、または１ないし１５、または１ないし２０、または１ないし２５、または１ないし３０、または１ないし４０、または１ないし５０、または５０以上のアミノ酸置換、挿入、付加および／または欠失を有する。
【００２７】
対立遺伝子変異体とは、１個体の生物または生物の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める、遺伝子のいくつかの可能な天然に存在する代替型の１つである。スプライス変異体とは、一次転写物のスプライシングの結果として生じた、いくつかのＲＮＡ転写物の１つから生じたポリペプチドである。オルソログとは、別の種に由来する類似の核酸またはポリペプチド配列である。たとえば、免疫原性標的ポリペプチドのマウス型およびヒト型は互いにオルソログと考えられる。配列の誘導体とは、親配列に由来する、置換、付加、欠失を有するか、または化学的に改変された変異体である。変異体はまた、１つ以上の第１の配列（たとえばペプチド）の、少なくとも１つの別の配列（たとえば異種ペプチド）のアミノまたはカルボキシ末端での融合をいう、融合タンパク質を含みうる。
【００２８】
「類似性」とは、類似性が同一マッチおよび保存的置換マッチの両方を含む関連性の尺度をいう他は、同一性と関係する概念である。２つのポリペプチド配列が、たとえば、１０／２０個の同一アミノ酸を有し、および残りがすべて非保存的置換であるならば、パーセント同一性および類似性は両方とも５０％となる。同一の例で、保存的置換が存在するさらに５つの位置があれば、パーセント同一性は５０％のままであるが、しかしパーセント類似性は７５％（１５／２０）となる。したがって、保存的置換が存在する場合には、２つのポリペプチド間のパーセント類似性は、それらの２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高くなる。
【００２９】
置換は、保存的、または非保存的、またはその任意の組み合わせでありうる。ポリペプチドの配列への保存的アミノ酸改変（およびコードヌクレオチドへの対応する改変）は、親ポリペプチドと類似の機能的および化学的特性を有するポリペプチドを生じうる。たとえば、「保存的アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基の位置での大きさ、電荷、疎水性、または親水性にほとんどまたは全く影響しないような、および特に、免疫原性の低下を結果として生じないような、天然アミノ酸残基の非天然残基での置換を含みうる。適当な保存的アミノ酸置換を表１に示す。
【表１】
【００３０】
当業者は、よく知られた方法を用いて、ポリペプチドの適当な変異体を決定することができる。分子の、活性（すなわち、ＭＨＣ結合、免疫原性）を破壊することなく変化させうる適当な部分を特定するために、当業者は、その活性にとって重要でないと考えられる部分を標的するであろう。たとえば、同一の種または別の種に由来し類似の活性を有する類似のポリペプチドが知られている場合、当業者はポリペプチドのアミノ酸配列を、そのような類似のポリペプチドと比較することができる。そのような分析を実施することによって、類似のポリペプチドの間で保存されている残基、および分子の部分を特定することができる。そのような類似のポリペプチドと比較して保存されていない分子の部分における変化は、ポリペプチドの生物学的活性および／または構造に悪影響を与える可能性がより低いことが理解される。同様に、ＭＨＣへの結合に必要な残基が知られており、および結合を改善するために改変されうる。しかし、ＭＨＣへの結合の低下を結果として生じる改変は、大部分の場合には適切でない。当業者はまた、相対的に保存された領域においてさえ、活性を保つ一方で、化学的に類似のアミノ酸を天然に存在する残基と置換しうることを理解する。したがって、生物学的活性のためにまたは構造のために重要でありうる部分さえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供しうる。
【００３１】
他の好ましい ポリペプチド 変異体は、グリコシル化 部位の数および／または種類が対象アミノ酸 配列と比較して変更されたグリコシル化 変異体を含む。一実施形態では、 ポリペプチド 変異体 は、対象アミノ酸 配列よりも多数または少数のＮ−結合型 グリコシル化 部位を含む。Ｎ−結合型 グリコシル化 部位 は、配列 Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ または Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴づけられ、Ｘで表されるアミノ酸残基はプロリン以外の任意のアミノ酸 残基でよい。 この配列を生じるためのアミノ酸 残基の置換は、 Ｎ−結合型糖鎖の付加のための可能性のある新しい部位を提供する。代替的に，この配列 を消去する置換は、既存の Ｎ−結合型糖鎖を除去する。１つ以上の Ｎ−結合型 グリコシル化 部位 （典型的には天然に存在するもの）が消去されおよび１つ以上の 新しいＮ−結合型 部位が精製される、Ｎ−結合型糖鎖の再配列もまた提供される。ポリペプチドのＯ−結合型 グリコシル化に影響を与えるためには、セリン および／または スレオニン 残基を改変する。
別の好ましい変異体は、対象アミノ酸配列組と比較して、１つ以上のシステイン残基が欠失したかまたは別のアミノ酸（たとえば、セリン）で置換された、システイン変異体を含む。システイン変異体は、たとえば不溶性の封入体の単離後に、ポリペプチドを生物学的に活性な立体構造へ再折りたたみしなければならない場合に有用である。システイン変異体は一般的に天然タンパク質よりも少数のシステイン残基を有し、および典型的には、対にならないシステインの結果として生じる相互作用を最小化するために、偶数を有する。
【００３２】
他の実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの精製を補助する融合ポリペプチド部分を含む。融合は、その対象ポリペプチド変異体のアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらでも行いうる。融合は、リンカーまたはアダプター分子無しに直接でよく、またはリンカーまたはアダプター分子を介しうる。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、典型的にはアミノ酸残基約２０ないし約５０個でありうる。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼのためまたはプロテアーゼのための切断部位と共に設計されうる。一旦構築されれば、融合ポリペプチドを本明細書に記載の方法にしたがって誘導体化できることが理解される。適当な融合部分は、特に、金属結合ドメイン（たとえば、ポリヒスチジン部分）、免疫グロブリン結合ドメイン（すなわち、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃ受容体、または補体タンパク質抗体結合ドメイン）、糖結合ドメイン（たとえば、マルトース結合ドメイン）、および／または「タグ」ドメイン（すなわち、〜の少なくとも一部α−ガラクトシダーゼ、ｓｔｒｅｐタグペプチド、Ｔ７タグペプチド、ＦＬＡＧペプチド、または、モノクローナル抗体のようなそのドメインと結合する化合物を用いて精製しうる他のドメイン）を含む。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現に際してポリペプチドと融合され、および宿主細胞からの目的ポリペプチドの配列のアフィニティ精製のための手段として役立つ。アフィニティ精製は、たとえば、アフィニティマトリクスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーによって達成することができる。随意的に、タグは、切断のためにある種のペプチダーゼを用いることのようなさまざまな方法によって、目的ポリペプチドの精製された配列から続いて除去することができる。下記の通り、融合はまた、ＴＡとたとえばケモカインＣＸＣ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、またはＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）といった共刺激因子との間で行いうる。
【００３３】
融合モチーフは、小胞体といったＭＨＣ処理区画への、免疫原性標的の運搬を促進しうる。伝達配列または経細胞運搬配列といわれるこれらの配列は、ＨＩＶ ｔａｔ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９： １６６６を参照）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ｓｃｈｕｔｚｅ−Ｒｅｄｅｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７： ６５０を参照）、またはヒトｐｅｒｉｏｄ−１タンパク質（ｈＰＥＲ１；特に、ＳＲＲＨＨＣＲＳＫＡＫＲＳＲＨＨ（配列番号４２））に由来する配列を含む。
【００３４】
加えて、ポリペプチドまたはその変異体は、同種ポリペプチドと融合してホモ二量体を生じ、または異種ポリペプチドと融合してヘテロ二量体を生じうる。異種ペプチドおよびポリペプチドは：融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインといった、膜貫通受容体タンパク質またはその一部；膜貫通受容体タンパク質と結合するリガンドまたはその一部；触媒として活性である酵素またはその一部；ロイシンジッパードメインのような、オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド；免疫グロブリン定常領域のような、安定性を増加するポリペプチドまたはペプチド；および、そのポリペプチドまたはその変異体とは異なる治療活性を有するポリペプチドを含むがそれらに限定されない。
【００３５】
一部の実施形態では、免疫原性標的、ポリペプチド、またはその誘導体をコードする核酸配列を、細胞表面タンパク質、サイトカインまたはケモカインといった１つ以上の共刺激因子と、本発明の組成物中で組み合わせることが有利でありうる。共刺激因子は、たとえば、ポリペプチドとして、またはそのポリペプチドをコードする核酸として、組成物に含めることができる。適当な共刺激分子は、たとえば、ＣＤ２８ファミリーのメンバー（すなわち、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ；Ｈｕｔｌｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９９，３９７ ： ２６３−２６５； Ｐｅａｃｈ，ｅｔ ａｌ．ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １９９４，１８０ ： ２０４９−２０５８）を結合するポリペプチド、たとえば ＣＤ２８結合ポリペプチドＢ７．１（ＣＤ８０ ； Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９９２； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９２ ； Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６ （８）： ２７００−９）およびＢ７．２（ＣＤ８６ ； Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６（８） ： ２７００−９）；インテグリンファミリーのメンバー（すなわちＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８） ； Ｓｅｄｗｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９，１６２ ： １３６７−１３７５；Ｗｕｌｆｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，２８２： ２２６６−２２６９； Ｌｕｂ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９９５，１６ ： ４７９−４８３）を、ＩＣＡＭファミリーのメンバー（すなわち、ＩＣＡＭ−１、−２または−３）を含め、結合するポリペプチド；ＣＤ２ファミリーメンバー（すなわち、ＣＤ２、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＣＤｗ１５０または「ＳＬＡＭ」； Ａｖｅｒｓａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７，１５８ ： ４０３６−４０４４） ）と結合するポリペプチド、たとえばＣＤ５８（ＬＦＡ−３；ＣＤ２リガンド；Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９９６，１７ ： １７７−１８７）またはＳＬＡＭリガンド（Ｓａｙｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９５： ４６２−４６９）；熱安定性抗原（ＨＳＡまたはＣＤ２４； Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７，２７： ２５２４−２５２８）と結合するポリペプチド；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーと結合するポリペプチド（すなわち、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７； Ｖｉｎａｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０ ： ４８１−４８９）、ＯＸ４０ （ＣＤ１３４； Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ４７１−４８０； Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９，１６２： ４８６−４９３）、およびＣＤ２７（Ｌｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ４９１−４９９） ）たとえば４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド； Ｖｉｎａｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ４８１−４８； ＤｅＢｅｎｅｄｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７，１５８ ： ５５１−５５９）、 ＴＮＦＲ随伴因子−１（ＴＲＡＦ−１；４−１ＢＢリガンド； Ｓａｏｕｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １９９８，１８７ ：１８４９− １８６２，Ａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８，１８： ５５８−５６５）、 ＴＲＡＦ−２（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；Ｓａｏｕｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９８，１８７ ： １８４９−１８６２； Ｏｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ５１７−５２６，Ｋａｗａｍａｔａ，ｅｔ ａｌ．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８，２７３ ：５８０８−５８１４）、ＴＲＡＦ−３（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；Ａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８，１８： ５５８−５６５； Ｊａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８，２４２ ： ６１３−６２０； Ｋａｗａｍａｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８，２７３ ： ５８０８−５８１４）、 ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド；Ｇｒａｍａｇｌｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１６１ ： ６５１０−６５１７）、ＴＲＡＦ−５（ＯＸ４０リガンド；Ａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８，１８： ５５８−５６５； Ｋａｗａｍａｔａ，ｅｔ ａｌ．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８，２７３ ： ５８０８−５８１４）、およびＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド；Ｃｏｕｄｅｒｃ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，５ （３）： １６３−７５）を含む。ＣＤ１５４ （ＣＤ４０ ｌｉｇおよび／または「ＣＤ４０Ｌ」； Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１ ： ４５６３−４５７１； Ｓｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００１，１２ ： １０９１−１１０２）もまた適当でありうる。
【００３６】
１つ以上のサイトカインもまた、本発明の組成物中に含まれるポリペプチドまたは核酸によってコードされる共刺激因子または「アジュバント」として適当でありうる（Ｐａｒｍｉａｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２０００ Ｓｅｐ １５； ７４（１） ： ４１−４； Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１： ２０９−２１９）。適当なサイトカインは、たとえば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４： ３２１−３２７ （１９９８） ）、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（Ｐａｒｄｏｌｌによる総説、１９９２； Ｈａｒｒｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２０００ Ｊｕｌ−Ａｕｇ； ２ （４）： ２４３−９； Ｒａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６： ３３５７−３３６５ （１９９６） ）、ＩＬ−１５（Ｘｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７： ８５８−８６６，１９９９）、ＩＬ−１６（Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｅｕｋ Ｂｉｏｌ．６７ （６）： ７５７−６６，２０００）、ＩＬ−１８（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００１．１２７ （１２）： ７１８−７２６）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ（Ｄｉｓｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，８８ ： ２０２−２１０ （１９９６） ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、またはＩＦＮ−αまたはＩＮＦ−γといったインターフェロンを含む。本分野で知られる通りの、他のサイトカインもまた、本発明を実施するために適当である可能性がある。
【００３７】
ケモカインもまた利用することができる。たとえば、腫瘍自己抗原へ融合したＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）を含む融合タンパク質は、抗腫瘍免疫を誘導することが示されている（Ｂｉｒａｇｙｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７ ：２５３−２５８）。ケモカインＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）（Ｂｏｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９９，１７ （Ｓｕｐｐ．２）： Ｓ５３−Ｓ６４）もまた、本発明の実施において有用でありうる。他の適当なケモカインが本分野で公知である。
抑制性または負の調節免疫機構をブロックし、結果として免疫応答の促進を生じうることもまた本分野で公知である。たとえば、抗ＣＴＬＡ−４（Ｓｈｒｉｋａｎｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９６，１４ ： １４５−１５５； Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１，１９４： ８２３−８３２）、抗ＣＤ２５（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ、上記）、抗ＣＤ４（Ｍａｔｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６３： １８４−１９３）、融合タンパク質ＩＬ１３Ｒａ２−Ｆｃ（Ｔｅｒａｂｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１：５１５−５２０）、およびその組み合わせ（すなわち、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＣＤ２５、Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ，上記）を用いた処置は、抗腫瘍免疫応答をアップレギュレートすることが示されており、および本発明の実施に適する。
【００３８】
これらの成分はいずれも、単独でまたは他の物質と併用して使用しうる。たとえば、ＣＤ８０、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の組み合わせ（「ＴＲＩＣＯＭ」）は抗癌免疫応答を促進しうることが示されている（Ｈｏｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９： ５８００−５８０７ （１９９９）。他の効果的な組み合わせは、たとえば、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ（Ａｈｌｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８： ３９４７−３９５８ （１９９７）； Ｉｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８： ４５９１−４６０１（１９９７））、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ−α（Ａｈｌｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３： ８９７−９０８ （２００１））、ＣＤ８０＋ＩＬ−１２（Ｆｒｕｅｎｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８５： ５０８−５１７ （２０００）； Ｒａｏ，ｅｔ ａｌ．上記）、およびＣＤ８６＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１２（Ｉｗａｓａｋｉ、上記）を含む。当業者は、本発明の実施に有用である別の組み合わせを知る。加えて、当業者は、そのような機構を調節するために用いることができる別の試薬または方法を知る。これらの試薬および方法、および当業者に公知であるその他は、本発明の実施に利用することができる。
【００３９】
たとえば、自己複製ウイルスレプリコンの使用（Ｃａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７： ３１２４−２１３５； Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６： ７２３−７３２； Ｌｅｉｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０： ５１−５５）、コドン最適化（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１：４９７−５００ ； Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，上記 ； Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５： ４９４７−４９５１）、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション（Ｗｉｄｅｒａ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４ ： ４６３５−３６４０）、ＣｐＧ刺激モチーフの組み込み（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１８ ： ９２７−９７４； Ｌｅｉｔｎｅｒ，上記；Ｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８ （１０）： ４９０７−１３）、エンドサイトーシスまたはユビキチン処理経路の標的化のための配列（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２： ２２４６−２２５２； Ｖｅｌｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６： ５３６６− ５３７３）、マレック病ウイルス１型ＶＰ２２配列（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６ （６）： ２６７６−８２，２００２）、基礎免疫−追加免疫処方（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，上記 ； Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ，４０８： ６０５−６０９； Ｈａｎｋｅ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ，１６： ４３９−４４５； Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２： ６９−７４）、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような粘膜運搬ベクターの使用（Ｄａｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｃｅｌｌ，９１： ７６５−７７５； Ｗｏｏ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９： ２９４５−２９５４）を含む、核酸を基礎とする免疫の効率を改善するための別の戦略もまた用いることができる。他の方法が本分野で公知であり、その一部を下に記載する。
化学治療剤、放射線、抗血管新生化合物、または他の物質もまた、免疫原性標的を用いる癌の治療および／または予防に利用できる（Ｓｅｂｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００ Ｄｅｃ ２７； １９ （５６）： ６５６６−７３）。たとえば、転移性乳癌の治療において、有用な化学治療剤は、特にシクロホスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナベルビン、カペシタビン、およびマイトマイシンＣを含む。たとえば、シクロホスファミド＋メトトレキサート＋５−フルオロウラシル；シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋５−フルオロウラシル；または、シクロホスファミド＋ドキソルビシンを含む、併用化学治療処方もまた有用であることが証明されている。プレドニゾン、タキサン、ナベルビン、マイトマイシンＣ、またはビンブラスチンといった他の化合物が、さまざまな理由で利用されている。大部分の乳癌患者はエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）腫瘍を有し、およびこれらの患者では、内分泌療法（すなわち、タモキシフェン）が化学療法より好ましいそのような患者には、タモキシフェンまたは、第二次治療として、プロゲスチン（酢酸メドロキシプロゲステロンまたは酢酸メゲストロール）が好ましい。アロマターゼ阻害剤（すなわち、レトロゾールといった、アミノグルテチミドおよびその類縁物質）は、腫瘍増殖を維持するために必要なエストロゲンのアベイラビリティを低下させ、および一部の患者において第二次または第三次の内分泌療法に使用しうる。
【００４０】
他の癌は異なる化学治療処方を必要としうる。たとえば、転移性直腸結腸癌は典型的には、カンプトサール（イリノテカンまたはＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシルまたはロイコボリンを用いて、単独でまたは互いに併用して治療される。プロテイナーゼおよびインテグリン阻害剤、たとえばＭＭＰ阻害剤マリマステート（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｅｘ）、ネオバスタット（Ａｅｔｅｒｎａ）、ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＧＳ２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）またはインテグリン阻害剤ビタキシン（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、またはＭＥＤ１５２２（ＭｅｒｃｋＫｇａＡ）もまた使用に適している可能性がある。このように、直腸結腸癌に随伴する免疫原性標的の免疫標的化は、それらの化学治療剤を用いた治療と併用して実施しうる。同様に、他の種類の癌を治療するのに用いられる化学治療剤は本分野でよく知られており、および本明細書に記載の免疫原性標的と組み合わせることができる。
【００４１】
多数の抗血管新生物質が本分野で公知であり、および免疫原性標的ワクチンとの同時投与に適する（たとえば、Ｔｉｍａｒ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．，７ （２）：８５−９４を参照）。そのような物質は、たとえば、増殖因子（すなわち、ＡＮＧ−２、ＮＫ１、２、４（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β））、サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−α、−β、−γといったインターフェロン、血小板因子４（ＰＦ−４）、ＰＲ−３９）、プロテアーゼ（すなわち、切断ＡＴ−ＩＩＩ、コラーゲンＸＶＩＩＩ断片（エンドスタチン））、Ｈｍｗカリクレイン−ｄ５プラスミン断片（アンギオスタチン）、プロトロンビン−Ｆ１−２、ＴＳＰ−１）、プロテアーゼ阻害剤（すなわち、ＴＩＭＰ−１、−２、または−３といったメタロプロテアーゼ組織阻害剤；マスピン；ＰＡＩ−１といったプラスミノーゲン活性化因子−阻害因子；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ））、ツムスタチン（ＩＬＥＸ，Ｉｎｃ．から入手可能）、抗体産物（すなわち、コラーゲン結合抗体ＨＵＩＶ２６、ＨＵＩ７７、ＸＬ３１３；抗ＶＥＧＦ；抗インテグリン（すなわち、ビタキシン（Ｌｘｓｙｓ）））、およびグリコシダーゼ（すなわち、へパリナーゼ−Ｉ、−ＩＩＩ）といった生理的物質を含む。抗血管新生能を有するのが公知であるかまたは有すると考えられている「化学的」または改変された生理的物質は、たとえば、ビンブラスチン、タキソール、ケトコナゾール、サリドマイド、ドルスタチン、コンブレスタチンＡ、ラパマイシン（Ｇｕｂａ，ｅｔ ａｌ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，８：１２８−１３５）、ＣＥＰ−７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能）、フラボン酢酸、Ｂａｙ１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．）、ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ，Ｉｎｃ．）、ＣＧＳ２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、テトラサイクリン誘導体（すなわち、ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．））、ネオバスタット（Ａｅｔｅｒｎａ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、低用量５−ＦＵ、低用量メトトレキサート（ＭＴＸ）、イルソフラジン、ラジシコール、シクロスポリン、カプトプリル、セレコキシブ、Ｄ４５１５２硫酸化多糖、陽イオン性タンパク質（プロタミン）、陽イオン性ペプチド−ＶＥＧＦ、スラミン（ポリスルホン化ナフチル尿素）、ＶＥＧＦの機能または産生に干渉する化合物（すなわち、ＳＵ５４１６またはＳＵ６６６８（Ｓｕｇｅｎ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ジスタマイシンＡ、アンギオザイム（リボザイム）、イソフラビノイド、スタウロスポリン誘導体、ゲニステイン、ＥＭＤ１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ ＫｃｇａＡ）、チロホスチン、イソキノロン、レチノイン酸、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、オクトレオチド、２−メトキシエストラジオール、アミノステロール （すなわち、スクワラミン）、グルタチオン類縁物質（すなわち、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）、コンブレタスタチンＡ−４（Ｏｘｉｇｅｎｅ）、Ｅｐｈ受容体遮断剤（Ｎａｔｕｒｅ，４１４： ９３３−９３８，２００１）、Ｒｈ−アンギオスタチン、Ｒｈ−エンドスタチン（国際公開第０１／９３８９７号パンフレット）、環状ＲＧＤペプチド、アキューチン−ディスインテグリン、ベンゾジアゼピン、ヒト化抗ａｖｂ３抗体、Ｒｈ−ＰＡＩ−２、アミロライド、ｐ−アミドベンズアミジン、抗ｕＰＡ抗体、抗ｕＰＡＲ抗体、Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−メチルアミド（すなわち、バチミステート、マリマステート）、ＡＧ３３４０、およびミノサイクリンを含む。多数の他の適当な物質が本分野で公知でありおよび本発明の実施に十分である。
本発明はまた、癌の治療の「従来でない」方法と組み合わせて利用することができる。たとえば、ある種の嫌気性細菌の投与が腫瘍 増殖を遅らせることを補助しうることが近年実証されている。１つの研究では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉを改変してファージエピソーム上にある毒素遺伝子を消去し、および直腸結腸腫瘍を有するマウスに投与した（Ｄａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，９８ （２６）： １５１５５−１５１６０，２００１）。化学療法と併用して、その処置は動物における腫瘍壊死を引き起こすことが示された。本明細書中で記載される試薬および方法は、そのような治療方法と組み合わせることができる。
【００４２】
免疫原性標的をコードする核酸は、いくつかの利用可能な方法のうち任意のものによって患者へ投与することができる。核酸を宿主へ導入するために使用が成功しているさまざまなウイルスベクターは、特に、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスを含む。多数のそのようなウイルスベクターが本分野で利用可能であることが本分野で理解される。本発明のベクターは、当業者に広く利用可能である標準的な組換え方法を用いて構築することができる。そのような方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、 Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）といった一般的な分子生物学参考文献に見出すことができる。
好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスの誘導体、およびマウスまたは鳥レトロウイルスの誘導体である。適当なレトロウイルスベクターの例は、たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含む。いくつかのレトロウイルスベクターは、複数の外因性核酸配列を組み込むことができる。組換えレトロウイルスは不完全であるため、それらは感染性ベクター粒子を生じるためには補助を必要とする。この補助は、たとえば、レトロウイルス構造遺伝子をコードするヘルパー細胞株によって提供することができる。適当なヘルパー細胞株は、特に、Ｔ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含む。そのような細胞株を用いて作製したベクター粒子を、次いで、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のような組織細胞株を感染させるのに使用し、大量のキメラレトロウイルス粒子を生じることができる。レトロウイルスベクターは、従来の方法（すなわち注射）によって、または標的細胞集団の近傍への「産生細胞株」の移植によって投与することができる（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，５ （３）：３４３−７９ ； Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５９： ６８５−９０）； Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４（１）：３９−６９）。産生細胞株は、ウイルスベクターを産生し、およびウイルス粒子を標的細胞付近に放出するように操作されている。放出されたウイルス粒子の一部は標的細胞と接触しおよびそれらの細胞に感染し、そのようにして本発明の核酸を標的細胞へ送る。標的 細胞の感染後、ベクターの核酸の発現が起こる。
【００４３】
アデノウイルスベクターは、真核細胞中への遺伝子運搬のために（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２ （５００４）： ４３１−４； Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，８ （１） ： ４２−５１）、真核遺伝子発現研究（Ｌｅｖｒｅｒｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０１ （２）： １９５−２０２）、ワクチン開発（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０： ３６３−９０）、および動物モデルにおいて（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，９ （Ｓｕｐｐｌ．１） ： １５１−２； Ｒｉｃｈ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４（４） ： ４６１−７６）、特に有用であることが証明されている。組換えＡｄをさまざまな組織へｉｎ ｖｉｖｏで投与するための実験的経路は、特に、気管内導入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ，６８（１） ： １４３−５５）、筋肉内注射（Ｑｕａｎｔｉｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９ （７）： ２５８１−４）、末梢静脈注射（Ｈｅｒｚ，Ｊ．，ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０ （７）： ２８１２−６）および脳への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９ （５０９７）： ９８８−９０）を含んできた。
【００４４】
アデノ随伴 ウイルス（ＡＡＶ）は、宿主細胞ゲノムへの一体化において、高レベル感染性、広い宿主域および特異性を示す（Ｈｅｒｍｏｎａｔ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１（２０） ： ６４６６−７０）。および単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１） は、特にその神経親和性のために、神経系における使用について、さらに別の魅力的なベクター系である（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ．，１４ （１０）： ４２８−３２； Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４（１） ： ８７−９９； Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：６７５−７１０）。
ポックスウイルスは別の有用な発現ベクターである（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｇｅｎｅ，２５（１） ： ２１−８； Ｍｏｓｓ，ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０： ３４５−６２； Ｍｏｓｓ，ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８ ： ２５−３８； Ｍｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２： １６６２−１６６７）。有用であることが示されているポックスウイルスは、特に、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、鶏痘、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、およびＡＬＶＡＣ（２）を含む。
【００４５】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株から、既知のまたは可能性のある病原性因子をコードする、ゲノムの必須でない領域６個を欠失することによって得られた（たとえば、米国特許第５，３６４，７７３号および第５，４９４，８０７号明細書を参照）。欠失した遺伝子座はまた、外来遺伝子の挿入のための受容遺伝子座として組換えられた。欠失した領域は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）；出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）；Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）；ヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）；宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）；および、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニット（Ｉ４Ｌ）である。ＮＹＶＡＣは、病原性および宿主域に関連する遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレーム１８個の特異的欠失によって作製された、遺伝子組換えされたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣはＴＡを発現するために有用であることが示されている（たとえば、米国特許第６，２６５，１８９号明細書を参照）。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９９４、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ１４３３、ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌ逆方向、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３およびｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢもまたＡＴＣＣへブダペスト条約の条項に従って寄託されており、登録番号はそれぞれＶＲ−２５５９、ＶＲ−２５５８、ＶＲ−２５５７、ＶＲ−２５５６、ＡＴＣＣ−９７９１３、ＡＴＣＣ−９７９１２、およびＡＴＣＣ−９７９１４である。
【００４６】
ＡＬＶＡＣを基礎とする組換えウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ−１およびＡＬＶＡＣ−２）もまた、本発明の実施における使用に適している（たとえば、 米国特許第５，７５６，１０３号明細書を参照）。ＡＬＶＡＣ（２）は、ＡＬＶＡＣ（２）ゲノムがワクシニアプロモーターの調節下にあるワクシニアＥ３ＬおよびＫ３Ｌ遺伝子を含む以外は、ＡＬＶＡＣ（１）と同一である（米国特許第６，１３０，０６６号明細書；Ｂｅａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ａ，１９９５ｂ，１９９１； Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＡＬＶＡＣ（１）およびＡＬＶＡＣ（２）の両方が、ＴＡといった外来ＤＮＡ配列の発現に有用であることが実証されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ａ，ｂ； 米国特許第５，８３３，９７５号明細書）。ＡＬＶＡＣはブダペスト条約の条項に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託されており、ＡＴＣＣ登録番号はＶＲ−２５４７であった。
【００４７】
別の有用なポックスウイルスベクターがＴＲＯＶＡＣである。ＴＲＯＶＡＣとは、１日齢雛のワクチン接種用に認可されている鶏痘ウイルスのＦＰ−１ワクチン株に由来するプラークからクローニングされた弱毒化鶏痘をいう。ＴＲＯＶＡＣは同様に、ブダペスト条約の条項に従ってＡＴＣＣに寄託され、登録番号は２５５３であった。
【００４８】
「非ウイルス」プラスミドベクターもまた、本発明の実施において適当でありうる。好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫、および／または哺乳類宿主細胞に適合する。そのようなベクターは、たとえば、ＰＣＲ−１１、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、 ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（国際公開第９０／１４３６３号パンフレット）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数のＣＯＬＥ１を基礎とするファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（たとえば、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。細菌ベクターもまた本発明に用いることができる。これらのベクターは、たとえば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｅ ｃａｌｍｅｔｔｅ ｇｕｅｒｉｎ （ＢＣＧ）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを含む（たとえば、国際公開第８８／６６２６号；国際公開第９０／０５９４号；国際公開第９１／１３１５７号；国際公開第９２／１７９６号；および国際公開第９２／２１３７６号パンフレットを参照）。多数の他の非ウイルスプラスミド発現ベクターおよび系が本分野で公知であり、および本発明に用いることができる。
【００４９】
適当な核酸運搬方法は、特に、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注射、ＣａＰＯ４沈降、遺伝子銃法、エレクトロポレーション、およびコロイド分散系を含む。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、および、水中油滴エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質を基礎とする系を含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームであり、これはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび ｉｎ ｖｉｖｏで運搬媒体として有用である人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なウイルス粒子をその水系の内部に封入し、および細胞へ生物学的に活性な形で送ることができる（Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６： ７７）。リポソームの組成物は通常、リン脂質の組み合わせ、特に、通常はステロイド特にコレステロールと組み合わせた高温相転移リン脂質である。他のリン脂質または他の脂質もまた使用することができる。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度、および二価陽イオンの存在に依存する。リポソーム作製に有用である脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンといったホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドを含む。特に有用なのは、脂質部分が１４〜１８個、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、および飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例となるリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【００５０】
免疫原性標的もまた、免疫応答を高めるために、１つ以上のアジュバントと組み合わせて投与することができる。典型的なアジュバントを下記の表２に示す：
【表２】
【００５１】
本発明の免疫原性標的はまた、スクリーニング検定法における用途のためまたは免疫療法のための抗体を作製するのに用いることができる。他の用途は当業者に明らかとなる。「抗体」の語は、本分野で公知であるいくつかの方法によって作製された、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、１本鎖抗体（たとえばＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体を含む抗体断片を、本分野で公知である通り含む。さまざまな種類の抗体を調製および使用する方法は当業者によく知られており、および本発明の実施に有用である（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８ ； Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．１，１９９８； Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６： ４９５ （１９７５）を参照）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２： ３２３−３２９ （１９８８）； Ｐｒｅｓｔａ （Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２： ５９３−５９６ （１９９２）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９： １５３４−１５３６ （１９８８）； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７： ３８１ （１９９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２： ５８１ （１９９１）； Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５） ；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１） ： ８６−９５ （１９９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９− ７８３ （１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８８５６−８５９ （１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３ （１９９５）号；第および米国特許第４，８１６，５６７号号；第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号明細書）。抗体またはそれに由来する誘導体はまた、特に、細胞毒性医薬または毒素、または活性なその断片、たとえばジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンといった治療用部分と複合体化しうる。細胞毒性物質はまた、放射性化学物質を含みうる。抗体およびその誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ用途のために本発明の組成物に組み込むことができる。
【００５２】
免疫原性標的を表す核酸、タンパク質、またはその誘導体は、患者において疾患状態の存在を判定するための、予後を予測するための、または化学治療または他の治療処方の有効性を判定するための、検定法に用いることができる。本分野で知られる通りに実施される発現プロファイルは、免疫原性標的の発現の相対レベルを測定するために用いることができる。発現のレベルは次いで、基底レベルと相関させ、特定の疾患が患者に存在するかどうか、患者の予後、または特定の治療処方が有効かどうかを判定することができる。たとえば、患者が特定の化学治療処方を用いて治療されているならば、患者組織中（すなわち末梢血中）の免疫原性標的の発現のレベル低下は、その処方がその宿主における癌量を低下させていることを示しうる。同様に、発現のレベルが上昇しているならば、別の治療様式を用いる必要がありうる。一実施形態では、免疫原性標的をコードする核酸に対応する核酸プローブを、宿主における発現の検出および定量のために、本分野で公知である通りのバイオチップに結合させることができる。
【００５３】
核酸、タンパク質、その誘導体、またはそれに対する抗体を、医薬スクリーニング検定法において試薬として用いることもまた可能である。その試薬は、患者の細胞株、または細胞または組織における免疫原性標的の発現に対する医薬候補の作用を確認するために用いることができる。発現プロファイリング法は、高処理量スクリーニング法と組み合わせて、有用な化合物の迅速な特定を可能にしおよび医薬候補を用いた治療の有効性を監視することを可能にすることができる（たとえば、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９，８４−８ （１９９８）を参照）。医薬候補は、天然に存在するかまたは合成によって得られる、化合物、核酸、タンパク質、抗体、またはそれに由来する誘導体であることができる。このように特定された医薬候補は、用途の中でも特に、患者への投与のための医薬組成物として、またはさらにスクリーニング検定法における用途のために、使用することができる。
【００５４】
本発明の組成物の宿主への投与は、当業者に公知であるさまざまな方法のいずれかを用いて達成することができる。組成物は、ヒトおよび他の哺乳類を含む、患者への投与のための薬剤（すなわち、「医薬組成物」）を製造するための製薬学の従来の方法に従って処理することができる。医薬組成物は好ましくは、たとえば、ＤＮＡ、ウイルスベクター粒子、ポリペプチドまたはペプチドの所定の量を含む単位用量の形に作製される。ヒトまたは他の哺乳類のために適した１日量は、患者の状態および他の要素に応じて大幅に変化しうるが、しかし、今度も、所定の方法を用いて決定することができる。
【００５５】
医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸に、節内に、または局所的に、医薬品として許容されるキャリヤー、アジュバント、および媒体を含む単位用量処方で投与することができる。「医薬品として許容されるキャリヤー」または「生理的に許容されるキャリヤー」の語句はここでは、医薬組成物としての核酸、ポリペプチド、またはペプチドの運搬を達成または促進するために適した、１つ以上の処方材料をいう。「医薬組成物」は、核酸またはポリペプチドの治療上有効な量を含む組成物である。「有効量」および「治療上有効な量」の語句はそれぞれ、有効な免疫応答を誘導または促進するために用いられる核酸またはポリペプチドの量をいう。本発明の組成物は、宿主において、腫瘍の発生から宿主を保護しおよび／または宿主が既存の腫瘍を身体から排除することを可能にする、抗腫瘍免疫応答の誘導または促進を提供することが好ましい。
【００５６】
経口投与のためには、医薬組成物は、たとえば、特に、カプセル、錠剤、懸濁剤、液剤を含むいくつかの剤形のいずれかでありうる。液剤は、生理食塩水、デキストロース、または水を含む適当なキャリヤーを含む組成物として、注射によって投与することができる。非経口の語はここでは、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、輸液、または腹腔内投与を含む。医薬の直腸投与のための坐剤は、ココアバターおよびポリエチレングリコールといった通常の温度で個体であるが直腸温で液体である適当な非刺激性添加物と医薬を混合することによって調製できる。
【００５７】
宿主を免疫するため、またはそうでなければ本発明の組成物を用いて障害または疾患を治療するための用量処方は、疾患の種類、年齢、体重、性別、患者の医学的症状、症状の重症度、投与経路、および使用する特定の化合物を含むさまざまな因子に基づく。たとえば、ポックスウイルスベクターは、１回用量当たり１ｘ１０６感染性粒子を含む組成物として投与することができる。このように、用量処方は大幅に変動しうるが、しかし標準的な方法を用いて普通に決定することができる。
【００５８】
基礎免疫段階で標的となる免疫原が１つの形で最初に投与され、その後、追加免疫段階で標的となる免疫原が別の形で投与される、基礎免疫−追加免疫処方もまた使用することができる（たとえば、国際公開第０１／３０３８２Ａ１を参照。基礎免疫段階および追加免疫段階の標的となる免疫原の形は異なる。たとえば、基礎免疫段階が核酸を用いたならば、追加免疫はペプチドとして投与しうる。同様に、基礎免疫段階が１つの種類の組換えウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ）を用いた場合、追加免疫段階は別の種類のウイルス（すなわち、ＮＹＶＡＣ）を使用しうる。この投与の基礎免疫−追加免疫法は、強い免疫応答を誘導することが示されている。
【００５９】
本発明の組成物は、単独の活性な医薬として投与することができる一方、それらはまた１つ以上の他の組成物または物質（すなわち、他の免疫原性標的、共刺激分子、アジュバント）と組み合わせて用いることもできる。組み合わせとして投与される場合、個々の成分は、同時にまたは別の時に投与される別々の組成物として処方することができ、または成分は単一の組成物として合わせることができる。
滅菌注射用水性または油性懸濁液といった注射用調製物は、公知の方法に従って、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて処方することができる。注射用調製物はまた、無毒性の非経口的に許容しうる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用液または懸濁液でありうる。使用できる適当な媒体および溶媒は、特に、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液である。たとえば、ポックスウイルスといったウイルスベクターを０．４％ＮａＣｌ中に処方することができる。加えて、滅菌不揮発性油が従来、溶媒または懸濁媒として用いられている。この目的には、合成モノまたはジグリセリドを含むどのブランドの不揮発性油も用いることができる。加えて、オレイン酸といった脂肪酸は注射剤の調製に用いられる。
【００６０】
局所投与のためには、組成物の適当な局所用量を、毎日１から４回、および好ましくは２から３回投与することができる。用量はまた、用量を投与しない中間日を用いて投与しうる。適当な組成物は、処方の重量で０．００１％ないし１０％ｗ／ｗ、たとえば１％ないし２％を含みうるが、処方の１０％ｗ／ｗと同じ量、しかし好ましくは５％ｗ／ｗ以下、およびより好ましくは０．１％ないし１％を含みうる。局所投与に適した処方は、皮膚を通る浸透に適した液体または半液体（たとえば、リニメント、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）および目、耳、または鼻への投与に適した滴下剤を含む。
【００６１】
医薬組成物はまた、固形（顆粒、粉剤または坐剤を含む）に調製することができる。医薬組成物は、滅菌といった従来の製薬操作に供することができ、および／または従来の補助剤、たとえば保存料、安定剤、湿潤剤、懸濁剤、緩衝剤などを含みうる。経口投与用の固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤を含みうる。そのような固体剤形では、活性化合物は、白糖、乳糖、またはデンプンといった、少なくとも１つの不活性な希釈剤と混合しうる。そのような剤形はまた、通常の慣行の通り、たとえば、ステアリン酸マグネシウムといった滑沢剤のような、不活性な希釈剤以外の別の物質も含みうる。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた緩衝剤を含みうる。錠剤および丸剤は別に腸溶性コーティングと共に調製しうる。経口投与用の液体剤形は、水といった本分野で一般的に用いられる不活性な希釈剤を含む、医薬品として許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含みうる。そのような組成物はまた、補助剤、たとえば湿潤剤、甘味料、香味料、および香料を含みうる。
【００６２】
本発明の核酸またはポリペプチドを含む医薬組成物は、いくつかの形状のいずれかを取ることができ、およびいくつかの経路のいずれかによって投与しうる。好ましい実施形態では、組成物は非経口経路（皮内、筋肉内または皮下）を介して投与され、宿主において免疫応答を誘導する。代替的に、組成物はリンパ節（節内）または腫瘤（すなわち、腫瘍内投与）内へ直接投与することができる。たとえば、用量は０、７、および１４日目に皮下投与することができる。ＴＡを含む組成物を用いる免疫に適した方法は、特にｐ５３（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ｐ２１−ｒａｓ（Ａｌｍｏｇｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＨＥＲ−２ （Ｆｅｎｄｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−２）（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ｐ９７（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、黒色腫関連抗原Ｅ（国際公開第９９／３０７３７号パンフレット）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｋａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３； Ｆｉｓｈｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）について示された通り、本分野で公知である。
【００６３】
投与可能な組成物の好ましい実施形態は、たとえば、核酸またはポリペプチドを含む懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤といった液体調製物を含む。好ましい注射用調製物は、たとえば、懸濁剤または乳剤といった、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈投与に適した核酸またはポリペプチドを含む。たとえば、組換えポックスウイルスは、滅菌水、生理食塩水、グルコースなどといった適当なキャリヤー、希釈剤、または添加物と混合することができる。組成物はまた、たとえば等張水性の生理食塩緩衝液中での再構成のための凍結乾燥形で提供することができる。加えて、組成物は、他の抗新生物剤、抗腫瘍剤または抗癌剤と、および／または、抗新生物剤、抗腫瘍剤または抗癌剤の悪影響を低減または緩和する物質と、同時に投与または連続的に投与することができる。
【００６４】
本発明の組成物を含むキットもまた提供される。キットは、適当なキャリヤー、希釈剤または添加物入りの別々の容器を含みうる。キットはまた、同時または連続的な投与のための、別の抗癌剤、抗腫瘍剤または抗新生物剤、および／または、抗新生物剤、抗腫瘍剤または抗癌剤の悪影響を低減または緩和する物質を含むことができる。別に、キットは成分を混合または合わせる、および／または投与のための説明書を含みうる。
【００６５】
本発明のよりよい理解およびその多数の利点は、例によって示される下記の実施例から得られる。
【実施例】
【００６６】
実施例１
ＡＡＣ２腫瘍関連抗原
ＡＡＣ２コード配列の１つの型（ＡＡＣ２−１）が共同研究者によって提供され、およびマウスｂｃｌ−６関連亜鉛フィンガータンパク質（「ＢＡＺＦ」）と高い配列類似性を有することが見出された。この配列情報に基づいて、ＰＣＲプライマーを下記の通り設計した：
ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴ ＴＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＡ（順方向プライマー；配列番号６）
ＣＴＡＧＧＧＣＣＣＣ ＣＣＧＡＧＡＡＴＧＴ ＧＧＴＡＧＴＧＣＡＣ ＴＴＴ（逆方向プライマー；配列番号７）
ＲＮＡは、集密状態のＨＵＶＥＣ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｃｋｅｒ；品番ＣＣ２５１７、ロット番号１Ｆ０１４１）培養からトリアゾールを用いて、取扱説明書に従って単離された（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，品番１５５９６）。高信頼性ＲＴ−ＰＣＲを次いでその順方向および逆方向プライマーを用いて実施し（９４度、２分；９４度、３０秒；５６．８度、３０秒；６８度、１分４０秒で２４サイクル；２５回目のサイクルは６８度、７分）、１，４４７塩基対ｃＤＮＡの単離を結果として生じた。ｃＤＮＡをｐＥＦ６−ＴＯＰＯ真核発現プラスミドへクローニングし、および「ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２」と称した。ｃＤＮＡｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２を、４種類のプライマーを用いて配列決定し、および、ＡＡＣ２−１およびマウスＢＡＺＦの配列と整列した（図１）。図に示す通り、ＡＡＣ２−２は、ＡＡＣ２−１の２４５位に見出されるセリン残基（Ｓ）を欠く。次に、ＡＡＣ２−２の２９８位から３１６位のアミノ酸１７個の一連（ＳＥＦＦＳＣＱＮＣＥＡＶＡＧＣＳＳ）は、ＡＡＣ２−１のアミノ酸２９８〜３１６と１１．８％の配列同一性だけを示した（図１）。興味深いことに、２９８位から３１６位のアミノ酸１７個の一連はマウスＢＡＺＦと１００％同一であり、これが長いセリン鎖に伴う転写因子機能（亜鉛フィンガー）に決定的でありうることを示唆する。ＡＡＣ２−２は次いでｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ真核発現プラスミドへクローニングされた（「ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＡＡＣ２−２」）。
【００６７】
実施例２
ＡＡＣ２ペプチドに対するヒトＴ細胞反応性
ＡＡＣ２−２アミノ酸配列を用いて、ＨＬＡ−Ａ−０２０１と結合することが予測される９量体ペプチドのライブラリを構築した（表３；「Ｎ」はその配列がマウスホモログ中に見出されないことを示し、一方、「Ｙ」はそのがマウスホモログ中に見出されることを示す）。２３のペプチドをＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌにて溶解し（表４）、およびヒトＰＢＭＣ培養に用いてＣＤ８およびＣＤ４ａｐＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導する能力を試験した。
【表３】
【００６８】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いて、ＨＬＡ−Ａ−０２０１を発現している供血者の末梢血単球から樹状細胞（ＤＣ）を作製した。ＤＣを、表４に示す９量体ＡＡＣ２−２ペプチドの異なるプールを用いてパルスした。
【表４】
【００６９】
これらのＤＣを用いて、自家Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣ調製物を刺激した。Ｔ細胞を、自家ＰＢＭＣを用いて再刺激し、および次いでＣＤ４０−リガンド−活性化自家Ｂ細胞を用いて再刺激した。各ペプチドプールを用いた３回目および４回目の刺激後に、ＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析は、Ｔ細胞がＡＡＣ２−２ペプチドのプールの１つに対して非常に強く反応したことを示した（ペプチド群６；図２）。ペプチド群６は下記のペプチドを含む：ＩＬＴＤＶＴＬＬＶ（ａａ３６〜４４）、ＴＬＬＶＧＧＱＰＬ（ａａ４１〜４９）、およびＦＭＹＴＳＲＬＲＬ（ａａ９５〜１０３）。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）は、このペプチド特異的株に由来するリンパ球は、＞５０％の記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）表現型を有するＣＤ８Ｔ細胞から成ることを示した。抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞はごく少数しかなく（＜２％）、観察されたＩＦＮ−γ産生はＮＫ細胞活性が原因でないことを示した。
【００７０】
このペプチドプール特異的Ｔ細胞株からのＣＴＬ活性の分析はまた、活性化Ｔ細胞が、ペプチド負荷されたＴＡＰ欠損Ｔ２細胞をＨＬＡ−Ａ−０２０１制限的な方法で傷害する能力を有したことを実証した（図２）。この分析はまた、ＩＬＴＤＶＴＬＬＶが、ペプチド特異的ＣＴＬ活性の大部分を刺激した主なペプチドであったことを明らかにした。したがって、ＡＡＣ２−２ペプチドはヒト免疫系において免疫原性であることが決定した。
【００７１】
実施例３
ＡＡＣ２−２のｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性
ＨＬＡ−Ａ２−Ｋｂ遺伝子導入マウスにＤＮＡ免疫を用いて、ＡＡＣ２−２タンパク質は処理されて免疫原性ペプチドとなり、およびＨＬＡ−Ａ−０２０１制限Ｔ細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導することができることが見出された。マウスは１日目にｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２を用いた注射によって免疫し、および同じプラスミドを用いて２１日目に追加免疫した。リンパ球を、免疫したマウスから追加免疫の２１日後に採取し、および表４に示すさまざまな群のＡＡＣ２−２ペプチドを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。これらのペプチドに対するペプチド特異的エフェクターＴ細胞機能を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて見出した（図３）。ヒト培養ＰＢＭＣにおいて強く免疫原性であることが以前に示された同じプールのペプチド（群６）がまた、ＤＮＡワクチン接種後にＴ細胞による顕著な反応性を導いたことが見出された（図３）。このように、ＤＮＡを基礎とするワクチンとして投与されたＡＡＣ２遺伝子産物はｉｎ ｖｉｖｏで免疫原性であり、およびＣＴＬ活性の活性化で特徴づけられる強い細胞媒介性免疫応答を誘導する。
【００７２】
実施例４
治療用ＡＡＣ２−２ワクチン
ＡＡＣ２−２遺伝子産物に対するｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２ＤＮＡワクチンを用いる治療用ワクチン接種は、固形腫瘍の増殖を完全に遮断することが見出された。Ｃ５７ＢＬ／６マウス８個体の群に、活発なおよび相対的に非免疫原性の腫瘍細胞株であるＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞１０４個を皮下に負荷した。マウスを次いで、腫瘍負荷の６日後に開始して週間隔で免疫した。ｆｌｕ−ＮＰタンパク質をコードするプラスミドまたは生理食塩水単独のどちらかを用いて処理した対照マウス（群当たり８個体）はすべて大きい腫瘍を生じた。対照的に、ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２で免疫したマウスのすべて（８／８）は、５０日の期間にわたって検出可能な腫瘍が無かった（図４）。すべてのマウスは８０日間を通じて腫瘍が無いままであった（データ記載せず）。図５は、黒色腫移植後の、記載のさまざまなＤＮＡベクターで処理したマウスの生存をプロットし、ふたたび黒色腫増殖に対するマウスの保護におけるＡＡＣ２−２ワクチン接種の完全な有効性を示す。ヒトＡＡＣ２−２遺伝子をコードするベクターを用いた免疫の結果として、有害な健康上の作用は観察されていない（免疫したマウスは対照マウスと同程度に活動的であり、および体重減少を示さなかった）。
【００７３】
図４および５に示す通り、ヒトＶＥＧＦＲ−２（ｐＢＬＡＳＴ−ｈｆｌｋ１）をコードするプラスミドを用いたワクチン接種は、腫瘍負荷されたマウスを保護しなかった。実際、腫瘍はこれらのマウスではさらに速やかにさえ増殖した。ｐＢＬＡＳＴ−ｈｆｌｋ１プラスミドを用いてワクチン接種したマウス由来の血清のＥＬＩＳＡによる分析は、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質に対するＩｇＧが顕著な力価で誘導されることを見出した（データ記載せず）。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−２に対して向けられる、抗体を基礎とする免疫応答は、血管新生および固形腫瘍増殖を防ぐのに有効でない可能性があることを示唆する。
【００７４】
ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２を用いて免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける黒色腫固形腫瘍増殖の阻害は、そのタンパク質に対する免疫応答と相関する（図６）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの免疫は上記の通り実施された。免疫したマウスに由来する脾臓細胞を、ＨＬＡ−Ａ２−Ｋｂ遺伝子導入マウスを用いた実験で使用したのと同一のペプチドプールで再刺激した（表３）。相当数のペプチドが、Ｃ５７ＢＬ／６クラスＩ ＭＨＣ（ＫｂおよびＤｂ分子）と交差反応した。ペプチドのプールの２つが特に（群１および群５）強いエフェクター細胞活性を誘導することがＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定で見出された（図６）。これらの群のペプチドのすべてがまた、マウスＢＡＺＦタンパク質中の対応する配列と同一である。これらの結果は、ヒトＡＡＣ２−２を用いた免疫はそのマウスオルソログＢＡＺＦに対する免疫応答をマウスにおいて活性化し、および結果として腫瘍血管新生を阻害できることを強く示唆する。これらの結果は単一の実験に由来し、およびこれらの結果を示したのはすべての実験ではなかった。
【００７５】
実施例５
ＢＦＡ４腫瘍抗原
ＢＦＡ４配列は、以前は何らかの種類の癌に原因づけられる機能が無かった既知の転写因子である「ｔｒｉｃｈｏｒｈｉｎｏｐｈａｌａｎｇｅａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ１」（ＴＲＰＳ−１） 遺伝子 （Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ番号６６８４５３３ ； Ｍｏｍｅｎｉｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（１），７１−７４，２０００）であることが見出された。ＢＦＡ４ｃＤＮＡ配列を図７に示し（配列番号２８）、および推論されるアミノ酸配列を図８に示す（配列番号２９）。
【００７６】
Ａ．ＢＦＡ４ペプチドおよびポリクローナル抗血清
監視目的で、ウサギ抗ＢＦＡ４ポリクローナル抗体を作製した。ＢＦＡ４に対する抗体反応を誘導するために、下記の６種類のペプチド（２２量体）を設計および合成した：
CLP 2589 MVRKKNPPLRNVASEGEGQILE BFA4(1-22)（配列番号７８）
CLP 2590 SPKATEETGQAQSGQANCQGLS BFA4(157-178)（配列番号７９）
CLP 2591 VAKPSEKNSNKSIPALQSSDSG BFA4(371-392)（配列番号８０）
CLP 2592 NHLQGSDGQQSVKESKEHSCTK BFA4(649-670)（配列番号８１）
CLP 2593 NGEQIIRRRTRKRLNPEALQAE BFA4(940-961)（配列番号８２）
CLP 2594 ANGASKEKTKAPPNVKNEGPLNV BFA4(1178-1199)（配列番号８３）
ウサギをペプチドで免疫し、血清を単離し、および下記の抗体力価が観察された：
【００７７】
ペプチドはまた、下記の通り、免疫応答を促進するためＫＬＨペプチドと結合することによって改変した：
BFA4(1-22) KLH-MVRKKNPPLRNVASEGEGQILE (CLP-2589；（配列番号７８）)
BFA4(157-178) KLH-SPKATEETGQAQSGQANCQGLS (CLP-2590;（配列番号７９）)
BFA4(371-392) KLH-VAKPSEKNSNKSIPALQSSDSG (CLP-2591;（配列番号８０）)
BFA4(649-670) KLH-NHLQGSDGQQSVKESKEHSCTK (CLP-2592;（配列番号８１）)
BFA4(940-961) KLH-NGEQIIRRRTRKRLNPEALQAE (CLP-2593;（配列番号８２）)
BFA4(1178-1200) KLH-ANGASKEKTKAPPNVKNEGPLNV (CLP-2594;（配列番号８３）)
ｐｃＤＮＡ３．２ＢＦＡ４（３．６ｍｇ）はまた、ニワトリにおいてポリクローナル血清を生じるためのＤＮＡ免疫に用いた。
【００７８】
Ｂ．ＢＦＡ４のクローニング
ＢＦＡ４に関する完全なｃＤＮＡ配列は〜１０ｋｂであり、および遺伝子はＢＴ４７４腺管癌細胞で発現される。ＲＴ−ＰＣＲによる４ｋｂ，７ｋｂまたは１０ｋｂ産物の増幅によって完全長ＢＦＡ４遺伝子を増幅するために、プライマー７７１７（順方向プライマー）および７７２３（逆方向プライマー）を設計した
プライマー７７１７：ＢＦＡ４−ＢａｍＨｌ／Ｆｌ（５'末端順方向）、Ｋｏｚａｋを伴う：
５'ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＣ ３' （ＤＮＡ３．１についてＢａｍＨＩ，ＭＰ７６）（配列番号８４）
プライマー７７２３：ＢＦＡ４−ＢａｍＨＩ／Ｒ１（３'末端逆方向４ｋｂ）：
５'ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣ ３' （ＤＮＡ３．１についてＢａｍＨＩ，ＭＰ７６）（配列番号８５）
ＢＴ−４７４細胞からＴｒｉｚｏｌを用いて取扱説明書に従って（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）異なるバッチで単離および凍結された総ＲＮＡ１０ｍｇをＲＴ−ＰＣＲで用い、ＢＦＡ４遺伝子を増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、Ｔａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ 高信頼性酵素、ＯＰＣ（オリゴ精製カートリッジ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）精製プライマーおよび精製総ＲＮＡ／ポリＡ ｍＲＮＡ（ＢＴ４７４細胞）を用いて最適化した。最適化の結果として、単一バンドで４．０ｋｂ断片を生じた。
【００７９】
ＢＦＡ４配列を再増幅するために、ｍＲＮＡをＤＮアーゼを用いて取扱説明書に従って（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）処理した。４ｋｂ ＤＮＡを、ＰＣＲを用いて、プライマー７７１７および７７２３プライマー（１０ｐｍｏｌ／マイクロリットル）およびＴａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ高信頼性 ポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）酵素を用いて再増幅した。反応の組の両方についてサーモサイクラー条件は下記の通りであった：９４℃（２分）、その後９４℃（３０秒）、５２℃（３０秒）、６７℃（４分）および６７℃（５分）の３０サイクル、および最後に４０℃１０分。３個のＢＦＡ４クローンが、ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング後に同定された。
【００８０】
いくつかの突然変異が、ＢＦＡ４配列の分析中に同定された。これらの配列を訂正するために、クローンＪＢ−３５５２−１−２由来のＢＦＡ４遺伝子（ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ／ＢＦＡ４）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片（５'）を、クローンＪＢ−３５５２−１−４由来のＢＦＡ４遺伝子（ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ／ＢＦＡ４）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片（３'）と交換した。この再組換え断片を次いでｐＭＣＳ５ＢａｍＨＩ／ＣＡＰにライゲーションした。クローンＪＢ−３６２４−１−５が作製され、および正しい配列を含むことが見出された。
【００８１】
単離されたＢＦＡ４クローンのヌクレオチド３４４は報告された配列とは異なった（ＢＦＡ４ではＣ、ＴＲＰＳ−１ではＴ）。その変化は結果としてｐｈｅからｓｅｒへのアミノ酸変化を生じた。この配列を報告された配列へ変えるために、クローンＪＢ−３５５２−１−２由来のＢＦＡ４遺伝子（ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ／ＢＦＡ４）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片（５'）をｐＵＣ８：２へサブクローニングし、クローンＪＢ−３６３１−２を生じた。このクローンは、ＢＦＡ４タンパク質のアミノ酸１１５をセリンからフェニルアラニンへＴＲＰＳ１タンパク質のように変化させるＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）突然変異誘発のためのテンプレートとして用いた。選択されたクローンはＪＢ−３６４８−２−３であった。突然変異誘発はまた、ｐＭＣＳ５ＢＦＡ４（ＢＴ４７４）をＢＦＡ４タンパク質のアミノ酸１１５をセリンからフェニルアラニンへＴＲＰＳ１タンパク質のように変化させるＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）突然変異誘発のためのテンプレートとして用いて繰り返した。いくつかのクローンが、ＤＮＡ配列決定によって正しいことが見出され、およびクローンの１つ（ＪＢ−３６８５−１−１８）を以降のサブクローニングに用いた。
【００８２】
ＪＢ−３６８５−１−１８を次いで、ＢＦＡ４コード配列を４種類の異なる発現ベクター：１）ポックスウイルス（ＮＹＶＡＣ）ベクターｐＳＤ５５４ＶＣ（ＣＯＰＡＫ／Ｈ６；ＪＢ−３７０７−１−７）；２）ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（ＪＢ−３７０７−３−２）；３）ｐＣＡＭｙｃＨｉｓ（ＪＢ−３７０７−５−１）；および、４）セムリキ森林ウイルスアルファウイルスレプリコンベクターｐＭＰ７６（ＪＢ−３７３５−１−２３）のＢａｍＨＩ部位へサブクローニングするのに用いた。ＪＢ−３７０７−１−７、ＪＢ−３７０７−５−１、およびＪＢ−３７３５−１−２３内のＢＦＡ４コード配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
終止コドンがｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４構造（ＪＢ−３７０７−３−２）中のクローニングされた配列の終わり近くに導入された。独自のＥｃｏＲ１部位を開き、および挿入してＢＦＡ４コード配列と共に終止コドンをフレーム内に導入した。いくつかの推定されるクローンがＥｃｏＲ１部位の消失によって同定されたが、しかし３個のクローン（ＪＢ−３７５６−１−２；ＪＢ−３７５６−３−１；およびＪＢ−３７５６−４−１）が配列決定された。３個すべては挿入の部分について正しいことが見出された。クローンＪＢ−３７５６−３−１は正しい配列および方向を有することが同定された。
【００８３】
Ｍｙｃおよびｍｙｃ／ｈｉｓタグ（Ｅｖａｎｓｅｔａｌ、１９８５）をオリゴヌクレオチドを用いて導入し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４構造（ＪＢ−３７０７−３−２）中へＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ部位にアニーリングおよびライゲーションした。これらの構造についていくつかのクローンが得られた。正しい配列および方向を有する３個のクローンが得られた：１）ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ｍｙｃ−ｔａｇ（ＪＢ−３７７３−１−２）；２）ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ｍｙｃｈｉｓ−ｔａｇ（ＪＢ−３７７３−２−１）；および、３）ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ｍｙｃｈｉｓ−ｔａｇ（ＪＢ−３７７３−２−２）。
【００８４】
Ｃ．ＢＦＡ４の発現
１．ポックスウイルスベクターからの発現
ｐＳＤ５５４ＶＣ（ＣＯＰＡＫ／Ｈ６；ＪＢ−３７０７−１−７）ベクターを用いてＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４ウイルスを作製した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えを、プラスミドＣＯＰＡＫ／Ｈ６／ＢＦＡ４およびＮＹＶＡＣを用いてＲＫ１３／ＣＥＦ細胞で実施した。ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４（ｖＰ２０３３−ＮＹＶＡＣ−ＲＫ１３）を作製し、およびストック終濃度１．１２ｘ１０９／ｍｌ（１０ｍｌ）での３回の濃縮の完了後、Ｐ３レベルへ増幅した。Ｖｅｒｏ細胞をＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４にＭ．Ｏ．Ｉ．０．５ｐｆｕ／細胞にて感染させた。ＢＦＡ４タンパク質の発現を確認するために、細胞溶解物および培地を感染の２４時間後に採取した。濃縮した培地の１／２０および溶解物の１／４０をウェスタンブロットに負荷し、およびＢＦＡ４ペプチドＣＬＰ２５８９、２５９１、２５９８および２５９４（抗ＢＦＡ４抗血清のペプチド配列および調製については上記参照）に対するウサギ抗血清と共にインキュベートした。約１２０ｋＤのバンドが、ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４感染Ｖｅｒｏ細胞の溶解物および濃縮培地の両方に見られ、これはＶｅｒｏ対照細胞（「ブランク感染」）、親ＮＹＶＡＣウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞、または濃縮培地のどれにも見られなかった。
【００８５】
２．ｐｃＤＮＡ３．１を基礎とするベクターからの発現
ｐｃＤＮＡを基礎とするベクターからのＢＦＡ４の発現を証明するため、およびＢＦＡ４ペプチドに対して作製したポリクローナル血清の品質を分析するため、一過性トランスフェクション試験を実施した。下記の構造を用いてＢＦＡ４遺伝子の発現を試験した：ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４、ｐＭＰ７６／ＢＦＡ４、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／Ｍｙｃ ｔａｇおよび ｐｃＤＮＡ ３．１ ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ。ＢＦＡ４発現プラスミド（５μｇおよび１０μｇ）をｐＧＬ３ルシフェラーゼ（１□ｇ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、Ｇｅｎｅポーター試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をトランスフェクション 試薬として用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、全細胞抽出物を、細胞を細胞溶解試薬（２００μｌ）中にかき取りおよび１サイクルの凍結融解（−２０℃凍結、３７℃融解）によって調製した。トランスフェクション効率は、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を２連で測定することでルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を分析することにより定量した。同様のＲＬＵ値が、ＢＦＡ４発現ベクターの存在下および非存在下でルシフェラーゼ構造を同時トランスフェクションした試料で得られた。異なる量（５μｇおよび１０μｇ）のＢＦＡ４発現ベクターについて毒性またはＲＬＵ値に有意差は観察されなかった。アルカリホスファターゼ系を使用しＣＨＯＫ１細胞抽出物（ｐＣＤＮＡ３．１／ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓＴａｇ）および抗ＢＦＡ４ポリクローナル抗血清を用いた予備ウェスタンブロット分析は、ＢＦＡ４ベクターでトランスフェクションされた細胞の抽出物中に、約１２０ｋＤａバンドにバンドを証明した。
【００８６】
ＢＦＡ４を発現しているＣＯＳＡ２細胞の安定クローンを得るために、安定トランスフェクション試験を開始した。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激検定法に有用である。ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４（２．５μｇおよび２０μｇ）、およびｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ （２．５μｇ）を用いてＢＦＡ４の発現を試験した）。ｐＧＬ３ルシフェラーゼ（２．５μｇ）を、トランスフェクション効率を監視する対象ベクターとして用いた。
【００８７】
Ｇｅｎｅポーター試薬を用いてＤＮＡベクターのトランスフェクションを促進した。最初の実験について、トランスフェクション後４８時間で、全細胞抽出物を、細胞を細胞溶解試薬（２００μｌ）中にかき取りおよび１サイクルの−２０℃／３７℃での凍結融解によって調製した。２回目の実権から得られたトランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、凍結ショックで確立し、および細胞をＺｅｏｃｉｎの漸増濃度（０、２５０、５００、７５０および１０００μｇ／ｍｌ）中に平板播種した。トランスフェクションされていないＣｏｓＡ２細胞は、６０〜８０％集密にて３週間１００μｇ／ｍｌ（Ｚｅｏｃｉｎ）、および１０％集密にて２５０μｇ／ｍｌ（Ｚｅｏｃｉｎ）で生存した。しかし、３週間後、より高い薬物濃度では（５００〜１０００μｇ／ｍｌ）、トランスフェクションされていない細胞およびＺｅｏｃｉｎの高濃度（５００〜１０００μｇ／ｍｌ）を含むプレートでは生細胞は観察されなかった。
【００８８】
異なる薬物濃度（Ｚｅｏｃｉｎ−２５０、５００、７５０および１０００μｇ／ｍｌ）で増殖しているいくつかのＺｅｏｃｉｎ耐性クローンを、１０ｃｍプレートから３週間後に採取した。これらのクローンをさらに３．５ｃｍプレートでＺｅｏｃｉｎ５００、７５０および１０００μｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。これらのクローンの凍結ロットを調製し、および各プール（ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４、およびｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ）からいくつかのクローンをＴ７５ｃｍ２培養瓶でＺｅｏｃｉｎ１ｍｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。各プール（ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４、およびｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ）からの５個のクローンをＴ７５ｃｍ２培養瓶でＺｅｏｃｉｎ１ｍｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。細胞はＺｅｏｃｉｎ医薬（１ｍｇ／ｍｌ）選択下に維持される。６個のクローンをＢＦＡ４ペプチドパルス標的実験に使用し、および２個のクローンがＢＦＡ４を中等度のレベルで発現することが免疫検定法によって見出された。非接着細胞株Ｋ５６２Ａ２およびＥＬ４Ａ２もまた、安定な細胞株を作製するために、これらのベクターを用いてトランスフェクションした。
【００８９】
３．原核発現ベクター
ｐＣＤＮＡ３．１／ＢＦＡ４由来のＮ−末端５４ｋＤａＢＦＤＡ４をコードするＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ−１断片（１．５Ｋｂｐ）断片をｐＧＥＸ４Ｔ１−６Ｈｉｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ）プラスミドにクローニングした。このベクターは、ｔａｃプロモーター、その後にＮ−末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−２６ｋＤａ）およびＧＳＴ融合タンパク質のＣ末端に６ヒスチジンタグを含む。
【００９０】
ＢＦＡ４−Ｎ５４発現プラスミドを用いてＢＬ２１細胞を形質転換し、および２５℃にて抗生物質選択培地（２Ｌ培養）中で一定のＯＤ（６００ｎｍ）まで増殖させ、およびその後、１ｍＭ ＩＰＴＧ．を用いて誘導した。ＧＳＴ−ＢＦＡ４−Ｎ５４は可溶性タンパク質であることがわかった。可溶性画分の清澄化抽出物をバッチ毎にグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに吸着させ、および１０ｍＭ還元グルタチオンを用いて溶出した。タンパク質濃度の推定およびＴＣＡ沈澱後に画分を分析した。溶出液中の分子量８５ｋＤａの特異的ポリペプチドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。組換えタンパク質はグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって精製され、さらなる精製のためにＮｉＮＴＡカラムに吸収された。結合したタンパク質は０．２５Ｍイミダゾールを用いて溶出した。タンパク質を、４０％グリセロールを含むＴＢＳに対して透析し、結果として４．５ｍｇのＧＳＴ−ＢＦＡ４−Ｎ５４−６Ｈｉｓ（Ｎ末端ＢＦＡ４タンパク質）タンパク質を生じた。ＢＦＡ４の発現は、ウサギ抗ＢＦＡ４ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットによって確認された。
【００９１】
Ｄ．抗ＢＦＡ４免疫応答
１．ＢＦＡ４ペプチド
ＢＦＡ４に対する遺伝子免疫ベクターに加えて、ＢＦＡ４に対する免疫試薬が作製されている。ＢＦＡ４遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表５は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、ＢＦＡ４タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表５−１】
【表５−２】
【００９２】
ペプチドライブラリを、免疫試験のために、表６（下記参照）に示す通りの７〜１０種類の異なるペプチドを含む別々の群へプールした。ＢＦＡ４全体にわたるペプチドライブラリに加えて、Ｎ−末端の３００個のアミノ酸（１〜３００位）にわたる組換えタンパク質が合成されおよびＥ．ｃｏｌｉから精製されている。
【表６−１】
【表６−２】
【００９３】
２．ＢＦＡ４ペプチドの免疫反応性およびヒトエフェクターＴ細胞の作製：
ＢＦＡ４ペプチドを、免疫試験のために７〜１０種類のペプチドを含む別々のプールに群分けした。溶解したペプチドプールを自家ＨＬＡ−Ａ＊０２０１樹状細胞にパルスし、および自家Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣ調製物を活性化するために用いた。各ペプチドプール刺激培養に由来する活性化Ｔ細胞を、ＣＤ４０Ｌ活性化自家Ｂ細胞を用いてさらに３〜５回再刺激した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析およびペプチドパルスした標的細胞のＣＴＬ傷害についての検定を、ＢＦＡ４に由来するこれらのエピトープの免疫原性を実証するために実施した。
【００９４】
ヒトＴ細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴ検定においてＩＦＮ−γを分泌する能力によって示される通り、ＢＦＡ４タンパク質に由来するペプチドのいくつかのプールに対してエフェクター細胞活性を実証した。これらの実験は異なる回数のＡＰＣ刺激後に繰り返し、結果として同一の反応性ペプチド群が得られた。ペプチド群１、２、４、５、６、７、８、９、および１０はこれらの検定において免疫反応性であることが見出された。続いて、これらの反応性ペプチド群を、各群から単一のペプチドを別々に試験した別のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定でデコンボルーションした。ＥＬＩＳＰＯＴ検定でのＢＦＡ４ペプチド群１、５、６、７、８、９、および１０からの個別のペプチド。この分析は、ヒトＴ細胞によって認識される、ＢＦＡ４タンパク質に由来するいくつかの個別の強く反応性であるペプチドを明らかにした。これらの単独のペプチドの多数はまた、ペプチド負荷したヒトＴ２リンパ腫細胞標的のＣＴＬ活性傷害も誘導したことも観察された。これらのペプチドを表７に列記する：
【表７】
【００９５】
Ｄ．ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫後のＢＦＡ４に対する免疫応答：
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＢＦＡ４プラスミドを用いて、マウスＫｂα３ドメインに融合したハイブリッドＨＬＡ−Ａ＊０２０１α１α２ドメインをＣ５７ＢＬ／６マウスで発現している遺伝子導入マウス（Ａ２−Ｋｂマウス）を免疫した。ＤＮＡ免疫および活性化された脾臓細胞の採取後の、プールしたペプチドの群を用いたＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析は、いくつかの反応性ＢＦＡ４ペプチド群を明らかにした。これらの群の一部（特に群７および８）はまた、培養ヒトＴ細胞において強く反応し、ペプチドの重なり合う群がヒトＴ細胞によって認識され、およびワクチン接種後に自然に処理されＨＬＡ−Ａ２上に提示されることを示唆した。
【００９６】
ワクチン接種実験はまた、ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４およびＭＰ７６−１８−ＢＦＡ４ベクターを用いてＡ２−Ｋｂマウスで実施した。マウスを、１０〜２０ｇのＭＰ−７６−１８−ＢＦＡ４および１〜２ｘ１０７ｐｆｕのｖＰ２０３３（ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４）を用いて皮下免疫し、および２８日後に等しい量の各ベクターを用いて追加免疫した。免疫マウス由来の脾臓細胞の、ＢＦＡ４ペプチドのプールを用いた再刺激は、ＢＦＡ４ペプチド群２、３、４、５、７、９、および１０に応答したＩＦＮ−γ産生の誘導をＥＬＩＳＰＯＴ検定で明らかにした。このように、ＣＭＶプロモーターに動かされる真核プラスミド、ＮＹＶＡＣ、またはセムリキレプリカーゼを基礎とするＤＮＡプラスミドにコードされるＢＦＡ４遺伝子はすべて、ＢＦＡ４タンパク質に対してｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞応答を誘導する能力があった。
【００９７】
実施例６
ＢＣＹ１腫瘍抗原
ＢＣＹ１遺伝子は、「後側発現物質（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍａｔｅｒｎａｌ）遺伝子−３」（ＰＥＭ−３）と呼ばれＣａｅｎｏｒｈａｂｔｉｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ胚における後側から前側のパターン化に関与する線虫遺伝子と相同である部分オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として検出された。この遺伝子の癌への関与は以前に記録されていない。
【００９８】
Ａ．ＢＣＹ１およびアミノ酸ＤＮＡ配列
部分ＤＮＡ配列がＢＣＹ１について最初に決定された。プライマー９６１６ＳＸＣおよび９６１７ＳＸＣは、ＢＣＹ Ｉ部分ＤＮＡ 配列に由来し、およびＢＣＹ ＩをＲＴ−ＰＣＲによってＣａｌｕ ６ 総ＲＮＡからクローニングするために設計されている。プライマーは、下記の通り、ＰＣＲ産物が両端にＢａｍＨＩ部位を有しおよびＡＴＧ開始コドンおよびＫｏｚａｋ配列を５'末端に有するように設計された：
9616SXC: 5′ CAGTACGGATCCACCATGGCCGAGCTGCGCCTGAAGGGC 3 （配列番号１８３）
9617SXC: 5′ CCACGAGGATCCTTAGGAGAATATTCGGATGGCTTGCG 3′（配列番号１８４）
１．２ Ｋｂの予想単位複製配列が、最適化された条件下でＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて得られた。３回の別々のＲＴ−ＰＣＲに由来するＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、および別々にｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）に挿入した。結果として生じるクローンは、最初のＲＴ−ＰＣＲからＭＣ５０Ａ６、ＭＣ５０Ａ８およびＭＣ５０Ａ１９；２回目のＲＴ−ＰＣＲからＭＣ５４．２１およびＭＣ５５．２９；および、３回目のＲＴ−ＰＣＲからＭＣ５５．３２であった。下記のプライマーをクローンの配列決定に使用した：
9620MC: 5′ TAATACGACTCACTATAGGG 3′（配列番号１８５）
9621MC: 5′ TAGAAGGCACAGTCGAGG 3′（配列番号１８６）
9618MC: 5′ GAAAACGACTTCCTGGCGGGGAG 3′（配列番号１８７）
9619MC: 5′ GCTCACCCAGGCGTGGGGCCTC 3′（配列番号１８８）
６個すべてのクローンのＤＮＡ配列決定は、図１０に示す通りの、元の部分ＢＣＹ１配列とは下記の差を有する共通配列（配列番号３０）を示した：結果としてＡｌａからＧｌｙへのアミノ酸置換を生じる１０３１位のＣからＧへの置換；結果としてＴｈｒ欠失を生じる１０３２〜１０３４位のＧＣ欠失；および、ＴｈｒからＡｌａへのアミノ酸置換を生じる１１７７位のＡからＧへの置換。クローンＭＣ５０Ａ８およびＭＣ５５．２９は共通配列と同一である。ＢＣＹ１のアミノ酸配列を図１０（配列番号３１）に示す。
Ｂ．ＢＣＹ１乳癌抗原に対する免疫試薬：
ＢＣＹ１遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表８は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、ＢＣＹ１タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表８−１】
【表８−２】
【００９９】
表９は、免疫試験に用いたペプチドの群を示す：
【表９】
【０１００】
Ｃ．ＢＣＹ１ペプチドの免疫反応性およびヒトエフェクターＴ細胞の作製
ＢＣＹ１に由来する１００種類のペプチドのライブラリを、免疫試験のために７〜１０種類のペプチドを含む１０群に分けた。溶解したペプチドプールを自家ＨＬＡ−Ａ＊０２０１樹状細胞にパルスし、および自家Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣ調製物を活性化するために用いた。各ペプチドプール刺激培養に由来する活性化Ｔ細胞を、ＣＤ４０Ｌ活性化自家Ｂ細胞を用いてさらに３〜５回再刺激した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析およびペプチドパルスした標的細胞のＣＴＬ傷害についての検定を、ＢＣＹ１に由来するこれらのエピトープの免疫原性を実証するために実施した。
【０１０１】
ヒトＴ細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴ検定においてＩＦＮ−γを分泌する能力によって示される通り、ＢＣＹ１タンパク質に由来するペプチドのいくつかのプールに対してエフェクター細胞活性を実証した。これらの実験は異なる回数のＡＰＣ刺激後に繰り返し、結果として同一の反応性ペプチド群が得られた。ペプチド群１、２、３、４、５、６、および７はこれらの検定において免疫反応性であることが見出された。続いて、これらの反応性ペプチド群を、各群から単一のペプチドを別々に試験した別のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定でデコンボルーションした。この分析は、ヒトＴ細胞によって認識される、ＢＣＹ１タンパク質に由来するいくつかの個別の強く反応性であるペプチドを明らかにした。（図１１）。これらの単独のペプチドの多数はまた、ペプチド負荷したヒトＴ２リンパ腫細胞標的のＣＴＬ活性傷害も誘導した。これらのペプチドを表９に列記する。
【０１０２】
実施例７
ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１乳癌抗原
Ａ．ＢＦＡ５の同定
マイクロアレイプロファイリング分析は、５２の正常非腫瘍組織のパネルと比較して、ＢＦＡ５が、乳房腫瘤生検試料５４のうち４１で（７６％）低〜高レベルで、および乳房腫瘤５４のうち３１で（５７％）高レベルで発現したことを示した。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を、一連のＢＦＡ５ＤＮＡプローブを用いて実施し、およびそのマイクロアレイを腫瘍の少なくとも６１％について非常に強いシグナルを示して確認した。さらなるバイオインフォマティクス評価は、これらの遺伝子発現分析結果の結果を支持した。
【０１０３】
ＢＦＡ５ヌクレオチド配列の配列分析は、いくつかの胎児および成人脳ｃＤＮＡクローンから単離された２つの未同定ヒト遺伝子：ＫＩＡＡ１０７４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ~１５９７３２）；および、ＫＩＡＡ０５６５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１１１３７）（Ｋｉｋｕｎｏ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ １００ ｎｅｗ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｂｒａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＤＮＡ Ｒｅｓ．６：１９７−２０５）との高度の類似性を明らかにした。これらの遺伝子は、推定されるＺｎフィンガー領域および核局在化配列を含むことが見出された。ＢＦＡ５は、別の研究者によって、乳癌抗原の可能性があることが示唆されている（Ｊａｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：２０５５−２０６１および国際公開第０１／４７９５９号パンフレット）。これらの発表のそれぞれで、ヌクレオチド配列ＢＦＡ５はＮＹＢＲ−１（「Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ−１」；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６９０８７（ヌクレオチド）およびＡＡＫ２７３２５（アミノ酸）と表された。本明細書の目的のためには、その配列をＢＦＡ−５と呼び、ＢＦＡ−５ および ＮＹＢＲ−１ の語は相互に交換可能である。
【０１０４】
Ｊａｇｅｒらによって以前に示されおよび上記の国際公開第０１／４７９５９号パンフレットに記載の通り、ＢＦＡ５は乳腺で特異的に発現され、分析した乳房腫瘤の１２／１９に発現されている。ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１遺伝子の構造は、それがｂＺＩＰ部位（ＤＮＡ結合ドメインとそれに続くロイシンジッパーモチーフ）を伴う１５０〜１６０ｋＤの核転写因子をコードすることを明らかにしている。その遺伝子はまた、タンパク質−タンパク質相互作用における役割を示唆する５個縦列アンキリン反復を含む。これらのアンキリン反復は、そのタンパク質のホモ二量体化に関与しうる。ＢＦＡ５ｃＤＮＡ配列を図１２および配列番号３２に示す。ＢＦＡ５アミノ酸配列を図１３および配列番号３３に示す。
【０１０５】
Ｂ．ＢＦＡ５１の免疫反応性
ヒトＴ細胞の活性化およびＥＬＩＳＰＯＴにおけるＩＦＮ−γ分泌。
【０１０６】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する中程度または強力な結合物質であることが予想される、ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１コード配列に由来する１００種類のペプチドのライブラリを、ＲａｍｍｅｎｓｅｅおよびＰａｒｋｅｒアルゴリズムを用いて設計した。ライブラリを１０種類のペプチドの１０個のプールにさらに分け（表１１参照）、および、ペプチドを成熟自家樹状細胞にパルス後に、各プールを用いて１０の異なる培養Ｔ細胞を活性化した。ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１ペプチドのライブラリを用いて２回の実験を実施し、下記の通りＨＬＡ−Ａ＊０２０１ヒトＴ細胞における免疫反応性を実証した。
【表１０】
【０１０７】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析を、ＢＦＡ５ペプチドの各プールを用いて４回の刺激で活性化したヒト培養Ｔ細胞について実施した。図１４Ａでは、Ｘ軸の下の数字はペプチドプールの番号（１〜１０）を示す。ＣＭＶｐｐ６５ペプチドおよびＦｌｕマトリクスペプチドに対する反応性を、実験でＴ細胞活性化について陽性対照として用いた。各実験は、「ＡＰ１０」で表す一人のＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ドナーに由来するＰＢＭＣおよび樹状細胞を用いて実施した。結果は、ＢＦＡ４は検定では１００、０００細胞当たりの高いＥＬＩＳＰＯＴカウントを有し顕著に反応性であったが、ＢＦＡ５は９／１０プールについてさらに反応性であり、ＥＬＩＳＰＯＴ反応性を実証したことを示す。同様の結果が、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１の両方に関して別のＨＬＡ−Ａ＊０２０１について得られた。グラフは６００スポットで最高値となるが、それを超えるとＥＬＩＳＰＯＴ読み取り機が正確な計数を与えないためである。６００スポットの値を有する培養は、この数のスポットよりも多数を有する。
【０１０８】
多数のＢＦＡ５ペプチドプールは、高レベルのＩＦＮ−γ産生によって示される通り、反応性である（図１４Ａ）。単独の反応性ＢＦＡ５ペプチドを単離するために、各反応性ペプチドプールを次いで個別のペプチドに分け、および免疫原性についてＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて分析した。図１４Ｂに示す通り、ＢＦＡ５はいくつかの単一の反応性ペプチドを有し、ＢＦＡ４よりも高度に免疫原性である。同様の結果が、２つの独立したＰＢＭＣ培養実験で得られた。
【０１０９】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析に加えて、ＢＦＡ５ペプチドによって活性化されたヒトＴ細胞を、ＣＴＬとして機能する能力を測定するために検定した。細胞をペプチドパルスした樹状細胞、続いてＣＤ４０リガンド活性化Ｂ細胞（５回の刺激）を用いて活性化した。示した実験は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ドナーＡＰ３１から単離されたＰＢＭＣを用いて実施した。単離されたＴ細胞は、５１Ｃｒ放出検定で、ペプチド負荷Ｔ２細胞を用いて試験した。Ｔ細胞対標的比１０：１、５：１、および１：１での％特異的溶解を、ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１ペプチドのプールのどちらかまたは個別のペプチドを用いてパルスしたＴ２細胞について示す。グラフはｃ非特異的ＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合ＨＩＶペプチド（対照）を用いて負荷された標的に対して誘導されたＣＴＬ活性、続いてペプチドプール（プール１など）に対するＣＴＬ活性、および次いで各プールからの個別のペプチドによって誘導された活性を右側に示す。高レベルの細胞毒性が、１：１のＥ：Ｔ比で一部のペプチドに観察された。対照ＨＩＶペプチドによって誘導されたＣＴＬ活性（パーセント特異的溶解）は一般的に＜１０％であった。同様の結果が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現している別のＰＢＭＣドナー（ＡＰ１０）について得られた。図１４Ｃは、多数のＢＦＡ５ペプチドが、ＢＦＡ５ペプチド負荷標的細胞のＴ細胞媒介性細胞毒性を引き起こすことを示す。表１１は、免疫原性を有するペプチドを列記する。５種類のペプチド（ＬＭＤＭＱＴＦＫＡ、ＩＬＩＤＳＧＡＤＩ、ＩＬＳＷＡＫＬＬ、ＳＱＹＳＧＱＬＫＶ、およびＥＬＣＳＶＲＬＴＬ）が、ＩＦＮ−γ分泌およびＣＴＬ活性の両方を、両方のドナーに由来するＴ細胞で誘導することが見出された。
【表１１】
【０１１０】
Ｃ．免疫試薬
ポリクローナル抗血清を、ＢＦＡ５の下記の一連の２２〜２３量体ペプチドに対して作製した：
9620MC: 5′ TAATACGACTCACTATAGGG 3′
9621MC: 5′ TAGAAGGCACAGTCGAGG 3′
9618MC: 5′ GAAAACGACTTCCTGGCGGGGAG 3′
9619MC: 5′ GCTCACCCAGGCGTGGGGCCTC 3′
ウサギからの予備採血試料を処理しおよび−２０℃にて保存した。ウサギを下記の通り免疫した：１）ペプチドをフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とのエマルジョンとして投与した；および、２）２週間後、ペプチドをスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合し、およびフロイント不完全アジュバントＦＩＡとのエマルジョンとして投与した。下記の結果が観察された：
【表１２】
【０１１１】
予備採血試料の結果は、すべての試料についてＩｇＧ力価＜１００を示した。
【０１１２】
ポリクローナル抗血清の品質を評価するために、ウェスタンブロットを、ＢＦＡ５に対する血清を用いて実施した。血清を、ＢＴ４７４、ＭＤＭＢ４５３、ＭＣＦ−７、Ｃａｌｕ−６、およびＣｏｓＡ２細胞から得られた細胞抽出物に対して別々にスクリーニングした。ＢＦＡ５タンパク質のおよその予想分子量は１５３ｋＤａである。２２０ｋＤのバンドがＢＴ４７４抽出物でＣＬＰ２９８０抗体について観察され、しかしＭＤＭＢ４５３細胞抽出物には観察されなかったが、しかし１３０ｋＤのバンドがＭＤＭＢ４５３抽出物に存在した。両方のバンドはこの分析で試験したポリクローナル抗血清と合致することが見出された。これらのバンドのどちらも、陰性対照には存在しなかった。したがって、そのポリクローナル抗血清はＢＦＡ５に対して特異的であると結論することができる。
【０１１３】
実施例８
ＢＣＺ４腫瘍抗原
Ａ．ＢＣＺ４配列
ＢＣＺ４配列は、乳癌試料において過剰発現された配列として検出された。ＢＣＺ４のヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列を、図１５、配列番号３４（ＢＣＺ４ｃＤＮＡ）、および配列番号３５（ＢＣＺ４アミノ酸配列）に示す。
【０１１４】
Ｂ．ＢＣＺ４乳癌抗原に対する免疫試薬：
ＢＣＺ４遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表１３は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、ＢＣＺ４タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表１３】
【０１１５】
Ｃ．ＢＣＺ４ペプチドの免疫反応性およびヒトエフェクターＴ細胞の作製
ＡＰ１０で表されるＨＬＡ−Ａ２．１陽性ドナーに由来するヒトＰＢＭＣを、ＢＣＺ４抗原に由来する９量体ペプチドの異なるプール（一覧は表１３を参照）を用いてパルスした自家樹状細胞を用いて活性化した。活性化Ｔ細胞を、１２日後に、同一の各ペプチドプールを用いてパルスした自家ＣＤ４０−リガンド活性化Ｂ細胞を用いてさらに８〜１０日間再刺激した。この二次刺激をさらに、計３回の刺激を繰り返した。活性化Ｔ細胞を３回目の刺激後に単離し、および示す通り（図１６Ａ）、各ＢＣＺ４ペプチドプールに対するヒトＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。図１６Ａでは、青色の棒はＢＣＺ４ペプチドプールに対する反応性を、および赤色の棒は陰性対照としてＨＬＡ−Ａ２．１−結合ＨＩＶペプチドについて示す。陽性対照ＣＭＶおよびｆｌｕに対するＨＬＡ−Ａ２．１−結合記憶抗原ペプチドを実験で陽性対照として用いた。標準偏差を表示する。実験を、追加のもう１回のペプチド刺激後の活性化Ｔ細胞について繰り返し、同様の結果を得た。
【０１１６】
ペプチドプールを、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いてデコンボルーションした（図１６Ｂ）。ドナーＡＰ１０由来のヒトＴ細胞を、表１３に示す異なるプールのＢＣＺ４ペプチドで刺激した。刺激は記載した別の抗原について記載の通り医実施した。４回および５回の刺激後に、Ｔ細胞を採取し、および各プール中の各個別のペプチドを用いてＩＦＮ−γ産生についてＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。表示の棒はペプチド反応性ｆｏｒ各特異的プールについての個別のペプチド反応性を表す。表１３は反応性ペプチドのそれぞれを特定する。この実験を、ＡＰ１０ドナーＴ細胞のもう１回の刺激後に繰り返し、同様の結果を得た。
【０１１７】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析に加えて、ＢＣＺ４ ペプチドによって活性化されたヒトＴ細胞を、ＣＴＬとして機能する能力を測定するために検定した。細胞をペプチドパルスした樹状細胞、続いてＣＤ４０リガンド活性化Ｂ細胞（５回の刺激）を用いて活性化した。示した実験は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ドナーＡＰ３１から単離されたＰＢＭＣを用いて実施した。単離されたＴ細胞は、５１Ｃｒ放出検定で、ペプチド負荷Ｔ２細胞を用いて試験した。Ｔ細胞対標的比１０：１での％特異的溶解を、個別のＢＣＺ４ペプチドを用いてパルスしたＴ２細胞について示す。高レベルの細胞毒性が、一部のペプチドに観察された（図１６Ｃ）。対照ＨＩＶペプチドによって誘導されたＣＴＬ活性（パーセント特異的溶解）は一般的に＜１０％であった。同様の結果が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現している別のＰＢＭＣドナー（ＡＰ１０）について得られた。
【０１１８】
表１４は個別のペプチドの反応性を列記する：
【表１４】
【０１１９】
Ｄ．ＢＣＺ４発現ベクター
ＢＣＺ４を、ｐＳｐｏｒｔｙ／ＢＣＺ４というプラスミドをテンプレートとして用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅条件は下記の通り：１）９４℃２分；２）９４℃３０秒、５３℃３０秒、６７℃２．５分のサイクル３５回；および、３）６７℃７分。ＰＣＲプライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位を含み、およびＯＲＦに直接隣接する（すなわち、無関係な配列が無い）ように設計した。プライマー配列は下記の通り：ＡＳ０３２Ｆ（順方向プライマー）５'ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧ ３'（配列番号５９１） ＡＳ０３４Ｒ （逆方向 プライマー） ５'ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＧＡＣ ＡＡＧＡＴＴＧ３'（配列番号５９２）。Ｋｏｚａｋ配列もまた順方向プライマーに含まれた。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ （＋） をＥｃｏＲＩで切断し、および自己ライゲーションを防ぐためにＣＩＰを用いて処理した。ＢＣＺ４単位複製配列を次いでＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）にライゲーションした。配列決定は、予測ＢＣＺ４配列に合致する１個のクローン（ＡＳ−５７９−５）を与えた。ＢＣＺ４タンパク質を次いで、この発現ベクターから標準的方法を用いて発現した。
【０１２０】
実施例９
ＢＦＹ３腫瘍抗原
Ａ．ＢＦＹ３配列
ＢＦＹ３配列が、過剰発現された配列として乳癌試料中に検出された。ＢＦＹ３ｗ／ＥｃｏＲＩ末端の、ＨＴＢ１３１総ＲＮＡからの、ＡＳ００７Ｆ（順方向プライマー）５'ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴ ３'（配列番号５９３）およびＡＳ０１０Ｒ（逆方向プライマー）５'ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡ３'（配列番号５９４）を用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１で消化し、および、ＥｃｏＲＩ消化しおよびＣＩＰ処理したｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターへライゲーションによってクローニングした。いくつかの陽性クローンが、制限消化およびＡＳ−３９１−２一致予測ＢＦＹ３配列の配列結果によって特定された。ＢＦＹ３のヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列を、図１７、配列番号３６（ＢＦＹ３ｃＤＮＡ）、および配列番号３７（ＢＦＹ３アミノ酸配列）に示す。
Ｂ．ＢＦＹ３乳癌抗原に対する免疫試薬
ＢＦＹ３遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表１５は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、試験したＢＦＹ３タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表１５】
【０１２１】
ＡＰ３１で表される、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＢＦＹ３抗原に由来する９量体ペプチドの異なるプール（一覧は表１を参照）を用いてパルスした自家樹状細胞を用いて活性化した。活性化Ｔ細胞を、１２日後に、同一の各ペプチドプールを用いてパルスした自家ＣＤ４０−リガンド活性化Ｂ細胞を用いてさらに８〜１０日間再刺激した。この二次刺激をさらに２回、計４回の刺激を繰り返した。活性化Ｔ細胞を４回目の刺激後に単離し、および示す通り、各ＢＦＹ３ペプチドプールに対するヒトＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。反応性青色の棒はＢＦＹ３ペプチドプールに対する反応性を、および赤色の棒は陰性対照としてＨＬＡ−Ａ２．１−結合ＨＩＶペプチドについて示す。標準偏差を表示する。実験を、異なる回のペプチド刺激からの活性化Ｔ細胞について２回繰り返し、同様の結果を得た（図１８Ａ）。
【０１２２】
ＢＦＹ３ペプチドプールを、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定でデコンボルーションしおよび試験した。ドナーＡＰ１０由来のヒトＴ細胞を、表１５に示すＢＦＹ３ペプチドの異なるプールを用いて刺激した。刺激は、記載した他の抗原について前述した通りに実施した。４回の刺激後、各培養からのＴ細胞を採取し、および、ペプチド各プール中の個々のペプチドを用いてＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。図１８Ｂは、特定の各プールについての個々のペプチド反応性を図解する。
【０１２３】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析に加えて、ＢＦＹ３ペプチドによって活性化されたヒトＴ細胞を反応性について検定した。ペプチドプール当たり１０種類のペプチドから成るペプチドのプール１０個を用いてＣＴＬを作製した。エフェクターのこれらの１０個の群を、対応するペプチドプールを用いてパルスした標的を傷害するのに使用した。プール１、３、５、６、および７に由来するペプチドは認識されたことが見出され、それらのプール中のペプチドはＣＴＬを生じることができることを示した（図１８Ｃ）。これらの１０個のプールから、ペプチド３３４４、３３２０、３３７８、２２７２、および３３８７がＣＴＬによって強く認識された（図１８Ｄ）。「中等度に認識された」ペプチドは、３３６９、３３５５、および３３６２を含んだ（図１８Ｄ）。ＢＦＹ３をトランスフェクションしたＣｏｓＡ２細胞は、プール１および３から生じたＣＴＬによって殺され、これらのプールに由来する処理されおよび提示されたエピトープは免疫的に関係することを示した（図１８Ｅ）。この細胞毒性を担うペプチドは３３２０および３３４４である。表１６はＢＦＹ３ペプチドの特性を要約する。
【表１６】
【０１２４】
Ｃ．ＢＦＹ３発現ベクター
ＢＦＹ３発現ベクターを構築するために、ＡＳ００７Ｆ（順方向プライマー）５' ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴ３'（配列番号５９５）およびＡＳ０１０Ｒ（逆方向プライマー）５' ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡ３'（配列番号５９６）を用いたＨＴＢ１３１総ＲＮＡからのＢＦＹ３ｗ／ＥｃｏＲＩ末端のＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲは標準的方法を用いて実施した。増幅産物はＥｃｏＲＩを用いて消化し、およびＣＩＰ処理ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターへライゲーションによって、標準的方法を用いてクローニングした。いくつかの陽性クローンが、制限消化によって特定されおよび配列決定された。配列決定は、クローンＡＳ−３９１−２の配列が、予想されるＢＦＹ３配列とマッチしたことを示した。ＢＦＹ３タンパク質が次いでＢＦＹ３発現ベクターを用いて標準的方法を用いて発現された。
【０１２５】
実施例１０
複数の腫瘍抗原をコードする発現ベクター
一部の場合には、複数の腫瘍抗原をコードする発現ベクターを構築するのが好ましい可能性がある。抗原の一定の組み合わせが、単一の発現ベクターと組み合わせた場合、単一のベクターで多数の患者の発現プロファイルを包含することがわかっている。たとえば、異なる患者に由来する乳癌試料の１つの試験は、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の７４％の発現プロファイルをカバーし；ＢＣＹ１およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の６５％をカバーし；ＢＣＺ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の６９％をカバーし；ＢＦＹ３およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の６７％をカバーし；ＢＣＹ１、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の７８％をカバーし；ＢＣＺ４、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の８１％をカバーし；および、ＢＦＹ３、ＢＦＡ４、およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の７４％をカバーしたことを示した。したがって、乳癌患者の間で最も一般的な発現プロファイルが単一のベクターを用いて対処されうるように、複数抗原発現構造を構築することができる。そのような複数抗原発現ベクターは、腫瘍抗原配列のそれぞれをコードする核酸を、プロモーターまたは他の転写調節配列の近傍に配置する、標準的なクローニング技術を用いて構築する。発現ベクターは、腫瘍抗原をコードする各ヌクレオチド配列が特異的プロモーターと調節可能に結合するように、または腫瘍抗原が集合的に単一のプロモーターと調節可能に結合しおよび単一の発現単位として発現されうるように、操作することができる。単一の発現単位が構築される場合は、腫瘍抗原配列を発現後に分けるために有用であるヌクレオチド配列を腫瘍抗原配列の間に挿入することができる。有用な配列は、ＩＲＥＳ配列、プロテアーゼ切断部位に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、などを含む。そのような複数抗原発現ベクターを構築するのに適したベクターは、たとえば、ワクシニア、アビポックス、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣといったポックスウイルスを含む。
【０１２６】
本発明は好ましい実施形態に関して説明されている一方、変化および改変を当業者が考えられることが理解される。したがって、請求される本発明の範囲内となるそのような同等の変化のすべてを付属の請求項が包含することが意図される。
【０１２７】
他の実施態様
１．配列番号３４または配列番号３６に示される核酸配列；配列番号３５または配列番号３７に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいはそれらの断片；を含む発現ベクター。
【０１２８】
２．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様１記載の発現ベクター。
【０１２９】
３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様２記載の発現ベクター。
【０１３０】
４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様３記載の発現ベクター。
【０１３１】
５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様４記載の発現ベクター。
【０１３２】
６．少なくとも１つの別の腫瘍関連抗原をさらに含むことを特徴とする実施態様１記載の発現ベクター。
【０１３３】
７．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様６記載の発現ベクター。
【０１３４】
８．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様７記載の発現ベクター。
【０１３５】
９．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様８記載の発現ベクター。
【０１３６】
１０．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様９記載の発現ベクター。
【０１３７】
１１．血管新生関連抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様１記載の発現ベクター。
【０１３８】
１２．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様１１記載の発現ベクター。
【０１３９】
１３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様１２記載の発現ベクター。
【０１４０】
１４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１３記載の発現ベクター。
【０１４１】
１５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１４記載の発現ベクター。
【０１４２】
１６．血管新生関連抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様６記載の発現ベクター。
【０１４３】
１７．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様１６記載の発現ベクター。
【０１４４】
１８．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様１７記載の発現ベクター。
【０１４５】
１９．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１７記載の発現ベクター。
【０１４６】
２０．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１８のポックスウイルス。
【０１４７】
２１．共刺激因子をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様１、６、１１または１６記載の発現ベクター。
【０１４８】
２２．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様２２記載の発現ベクター。
【０１４９】
２３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様２３記載の発現ベクター。
【０１５０】
２４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様２４記載の発現ベクター。
【０１５１】
２５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１８のポックスウイルス。
【０１５２】
２６．医薬品として許容されるキャリヤーに含まれる発現ベクターを含有する組成物であって、前記ベクターが、配列番号３４または配列番号３６に示される核酸配列；配列番号３５または配列番号３７に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいはそれらの断片を含むことを特徴とする組成物。
【０１５３】
２７．前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様２６記載の組成物。
【０１５４】
２８．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様２７記載の組成物。
【０１５５】
２９．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様２８記載の組成物。
【０１５６】
３０．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様２９記載の組成物。
【０１５７】
３１．配列番号３４または配列番号３６に示される核酸配列；配列番号３５または配列番号３７に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいはそれらの断片；を含む発現ベクターを宿主に投与することを含む、癌を予防または治療する方法。
【０１５８】
３２．前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様３１記載の方法。
【０１５９】
３３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様３２記載の方法。
【０１６０】
３４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様３３記載の方法。
【０１６１】
３５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様３４の方法。
【０１６２】
３６．表１５または１６に示されるＢＦＹ３由来の単離ペプチド。
【０１６３】
３７．表１５または１６に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＦＹ３に対して宿主を免疫する方法。
【０１６４】
３８．表１５または１６に示されるＢＦＹ３由来の単離ペプチド。
【０１６５】
３９．表１５または１６に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＦＹ３に対して宿主を免疫する方法。
【０１６６】
４０．表１３または１４に示されるＢＣＺ４由来の単離ペプチド。
【０１６７】
４１．表１３または１４に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＣＺ４に対して宿主を免疫する方法。
【０１６８】
４２．表１３または１４に示されるＢＣＺ４由来の単離ペプチド。
【０１６９】
４３．表１３または１４に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＣＺ４に対して宿主を免疫する方法。
【０１７０】
４４．少なくとも２つの異なる腫瘍抗原またはその断片をコードする少なくとも２つの核酸配列を含み、前記腫瘍抗原がＢＦＡ４、ＢＣＹ１、ＢＦＡ５、ＢＣＺ４およびＢＦＹ３より成る群から選択されることを特徴とする、複数の腫瘍抗原またはその断片の発現のための発現ベクター。
【０１７１】
４５．少なくとも２つの腫瘍抗原またはその断片をコードする少なくとも２つの核酸配列を含み、該核酸配列が配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３６の配列より成る群から選択されることを特徴とする、複数の腫瘍抗原またはその断片の発現のための発現ベクター。
【０１７２】
４６．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様４４または４５記載の発現ベクター。
【０１７３】
４７．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様４６記載の発現ベクター。
【０１７４】
４８．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様４７記載の発現ベクター。
【０１７５】
４９．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様４８記載の発現ベクター。
【０１７６】
５０．共刺激因子をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様４４から４９いずれ１項記載の発現ベクター。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年５月１６日出願の米国特許出願第６０／４７１，１１９号、および２００３年５月１６日出願の米国特許出願第６０／４７１，１９３号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリペプチドをコードする核酸、ならびに、癌の予防および／または治療におけるその核酸またはポリペプチドの使用に関する。より詳細には、本発明は、癌の免疫療法に使用するための、腫瘍抗原をコードする外来遺伝子の挿入および発現のための改良されたベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
高密度マイクロアレイ、ＳＥＲＥＸ、免役組織化学法（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）およびレーザー捕捉顕微法といったいくつかの技術による、原発性腫瘍および正常細胞についての発現プロファイリングに基づく分子の同定の大きな進歩のため、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を用いた癌ワクチンの開発においては最近数年間に大変な拡大があった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９９； Ｓｇｒｏｉ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｏｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ，２０００）。ＴＡＡとは、腫瘍細胞によって発現または過剰発現されている抗原であり、および１またはいくつかの腫瘍に特異的である可能性があり、たとえばＣＥＡ抗原は直腸結腸癌、乳癌、および肺癌で発現される。Ｓｇｒｏｉら（１９９９）は、浸潤性および転移性癌細胞で発現に差のあるいくつかの遺伝子を、レーザー捕捉顕微解剖法およびｃＤＮＡマイクロアレイを組み合わせて用いて同定した。ＤＮＡまたはウイルスのようないくつかの運搬系(delivery system)は、ヒト癌に対する治療ワクチン接種に用いることができ（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ，２０００）、および免疫応答を導きおよびまたＴＡＡに対する免疫寛容を打破することができる。腫瘍細胞は、Ｂ７．１といったＴ細胞共刺激分子または特にＩＦＮ−γ、ＩＬ２、またはＧＭ−ＣＳＦといったサイトカインをコードする導入遺伝子を挿入することによって、より免疫原性を高めることができる。ＴＡＡおよびサイトカインまたは共刺激分子の共発現はまた、効果的な治療ワクチンの開発において有用であることが示されている（Ｈｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ，９５，Ｂｒｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本分野には、癌を予防または治療するために免疫応答を刺激することにおいて有用な試薬および方法の必要性がある。本発明は、癌を治療する試みにおいて他の試薬および方法が直面する問題の多数を克服する試薬および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、癌を予防および／または治療するための患者への投与のための免疫原性標的を提供する。特に、その免疫原性標的は、腫瘍抗原（「ＴＡ」）および／または血管新生関連抗原（「ＡＡ」）である。一実施形態では、免疫原性標的は、配列番号３４または配列番号３６によってコードされるか、または配列番号３５または配列番号３７のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＴＡおよび／またはＡＡは、プラスミド、または組換えウイルスといった他の運搬ベクター内に含まれた核酸として患者に投与される。ＴＡおよび／またはＡＡはまた、共刺激分子(co-stimulatory molecule)またはアジュバントといった免疫促進剤と組み合わせて投与されうる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ−１】ＡＡＣ２−１およびＡＡＣ２−２のヌクレオチド配列。欠けたヌクレオチドまたはアミノ酸は「＊」で示される。配列間の差は下線で示す。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１の続き。
【図１Ｂ】ＡＡＣ２−１およびＡＡＣ２−２の予想アミノ酸配列の整列。欠けたヌクレオチドまたはアミノ酸は「＊」で示される。配列間の差は下線で示す。
【図２】ヒトリンパ球は、ＡＡＣ２−２タンパク質に由来するペプチドに反応して、ＩＦＮ−γを分泌するエフェクター細胞へ分化する。Ｔ細胞は、表ＩＩＩ（群１〜９）に示されるペプチドの群で刺激された。３回の刺激後、リンパ球をペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生についてＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。挿入図のグラフは、ペプチド群６番によって刺激された活性化細胞は、抗原特異的ＣＴＬ活性の能力を有し、ペプチド負荷されたＴ２標的細胞を傷害することを示す。ペプチドＥＣ５は、ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γ分泌の両方の誘導における主な活性を誘導する。
【図３】ＨＬＡ−Ａ２−Ｋｂ遺伝子導入マウス由来のマウスＴ細胞は、ヒトＡＡＣ２−２をコードするＤＮＡプラスミドを用いたＤＮＡ免疫を認識およびそれに応答してＩＦＮ−γ分泌する。ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２免疫マウス由来の脾臓細胞は、さまざまな群のペプチドを用いて再刺激された。６日後、細胞を採取しおよび各ペプチド群のそれぞれまたは対照ＨＬＡ−Ａ２結合９量体ＨＩＶペプチドに応答したＩＦＮ−γ分泌について試験した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを一夜インキュベートしおよび発色させた。各群は、陽性対照として用いたＰＭＡおよびイオノマイシンに応答して、高レベルのＩＦＮ−γ産生（２５０スポットより大）で反応した。反応性の高いペプチド群の１つ（群６）はまた、これまでに試験したＨＬＡ−Ａ−０２０１＋ドナー由来のヒトリンパ球によっても認識される。
【図４】ヒトＡＡＣ２−２をコードする遺伝子を用いたＤＮＡワクチン接種は、移植されたＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の増殖を完全に阻害する。この作用は、ｆｌｕ−ＮＰタンパク質およびヒトｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ−２）をコードするプラスミドが腫瘍増殖を妨げることができないことによって示される通り、非特異的免疫応答が原因ではない。
【図５】ヒトＡＡＣ２−２ベクターを用いたＤＮＡワクチン接種が腫瘍増殖の作用に対して完全に防御する能力を示す、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞のＣ５７ＢＬ／６マウスへの移植後のマウスの生存。この防御作用は抗原特異的であり、および他の遺伝子を用いたワクチン接種を介して誘導することができない。
【図６】Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴリンパ球は、ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２発現プラスミドを用いたＤＮＡワクチン接種後に、ヒトＡＡＣ２−２のペプチドに応答して、エフェクター細胞活性を示しおよびＩＦＮ−γを分泌する。これらのペプチドは、Ｂ６ＭＨＣクラスＩについて交差反応性を示しうる。群１および群５のペプチドは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞によって強い反応性を誘導する。
【図７】ＢＦＡ４ｃＤＮＡ配列。
【図８】ＢＦＡ４アミノ酸配列。
【図９】ＢＦＡ４ペプチドに対する免疫応答。
【図１０】ＢＣＹ１ヌクレオチド（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）配列。
【図１１】特異的ＢＣＹ１ペプチドに対する免疫応答。
【図１２】ＢＦＡ５ｃＤＮＡ配列。
【図１３】ＢＦＡ５アミノ酸配列。
【図１４Ａ】ＢＦＡ５由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１４Ｂ】ＢＦＡ５由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１４Ｃ】ＢＦＡ５由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１５】ＢＣＺ４ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。
【図１６Ａ】ＢＣＺ４由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１６Ｂ】ＢＣＺ４由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１６Ｃ】ＢＣＺ４由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１７】ＢＦＹ３ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。
【図１８Ａ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｂ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｃ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｄ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【図１８Ｅ】ＢＦＹ３由来ペプチドに対する免疫応答。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、癌の予防および／または治療に有用な試薬および方法を提供する。本明細書中で引用されたすべての参考文献は参照により本開示に含まれる。
一実施形態では、本発明は、癌を予防および／または治療するための、１つ以上の腫瘍抗原（「ＴＡ」）に対する免疫応答の誘導または促進に関する。一部の実施形態では、１つ以上のＴＡは組み合わせることができる。好ましい実施形態では、免疫応答は、たとえば腫瘍抗原をコードする核酸ベクターまたはペプチドまたはポリペプチドの形の腫瘍抗原自体の投与後の、宿主細胞におけるＴＡの発現の結果として生じる。
【０００８】
ここでは、「抗原」とは、抗原が投与されている宿主において免疫応答を生じる、ポリペプチドまたはその一部といった分子である。免疫応答は、抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の産生および／または抗原のエピトープを発現している細胞に対する細胞性免疫応答の発生を含みうる。応答は、たとえば、抗体産生の増加、抗原に対する親和性の増大した抗体の産生、または増大したかまたはより効果的な細胞性応答（すなわち、Ｔ細胞の増加、またはより高い抗腫瘍活性を持つＴ細胞）を生じることによる、現在の免疫応答の促進でありうる。免疫応答を生じる抗原を、代替的に、免疫原性であると、または免疫原ということができる。本発明の説明においては、ＴＡを「免疫原性標的」ということができる。
【０００９】
ＴＡは、癌細胞が抗原の起源である場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の両方を含む。ＴＡＡとは、正常細胞上で観察されるよりも多量に腫瘍細胞の表面上で発現されている抗原、または胎児発生中に正常細胞上に発現されている抗原である。ＴＳＡとは、腫瘍細胞に独特であり、および正常細胞上には発現されていない抗原である。ＴＡはさらに、ＴＡＡまたはＴＳＡ、その抗原性断片、およびその抗原性を保った改変型を含む。
【００１０】
ＴＡは典型的には、発現パターン、機能、または遺伝的起源にしたがって５つのカテゴリ：癌精巣（ＣＴ）抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１）；メラノサイト分化抗原（すなわち、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇａｐ１００）；突然変異抗原（すなわち、ＭＵＭ−１、ｐ５３、ＣＤＫ−４）；過剰発現された「自己」抗原（すなわち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３）；および、ウイルス抗原（すなわち、ＨＰＶ、ＥＢＶ）に分類される。本発明を実施する目的上は、適当なＴＡとは、ＴＡが発現している宿主において抗腫瘍免疫応答を誘導または促進する任意のＴＡである。適当なＴＡは、たとえば、ｇａｐ１００（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：７１６−７１９（１９９４））、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０： ３４７−３５２（１９９４））、ｇｐ７５（ＴＲＰ−１）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６： １１３１−１１４０ （１９９６））、チロシナーゼ（Ｗｏｌｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：７５９−７６４ （１９９４）；国際公開第２００１７５１１７号パンフレット；国際公開第２００１７５０１６号パンフレット；国際公開第２００１７５００７号パンフレット）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（国際公開第９８／１４４６４号パンフレット；国際公開第９９／１８２０６号パンフレット）、黒色腫プロテオグリカン（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０： １４６７−１４７２ （１９８３））、ＭＡＧＥファミリー抗原（すなわち、ＭＡＧＥ−１，２，３，４，６，１２，５１ ； Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４： １６４３− １６４７ （１９９１）；米国特許第６，２３５，５２５号明細書；ＣＮ１３１９６１１）、ＢＡＧＥファミリー抗原（Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２： １６７−１７５ （１９９５））、ＧＡＧＥファミリー抗原（すなわちＧＡＧＥ−１，２ ； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２： ６８９−６９８ （１９９５）； 米国特許第６，０１３，７６５号明細書）、ＲＡＧＥファミリー抗原（すなわちＲＡＧＥ−１； Ｇａｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｔ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４４： ３２３−３３０ （１９９６）；米国特許第５，９３９，５２６号明細書）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｇｕｉｌｌｏｕｘ ｅｔ ａｔ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３ ： １１７３−１１８３ （１９９６））、ｐ１５（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４： ５９４４−５９５０（１９９５））、Ｂ−カテニン（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３： １１８５−１１９２ （１９９６） ）、ＭＵＭ−１（Ｃｏｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２： ７９７６−７９８０ （１９９５））、サイクリン依存性キナーゼ−４（ＣＤＫ４）（Ｗｏｌｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１２８１−１２８４ （１９９５））、ｐ２１−ｒａｓ（Ｆｏｓｓｕｍ ｅｔ ａｔ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５６： ４０−４５（１９９４））、ＢＣＲ−ａｂｌ（Ｂｏｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８５： ２６８０− ２６８４ （１９９５））、ｐ５３（Ｔｈｅｏｂａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２： １１９９３−１１９９７ （１９９５））、ｐｌ８５ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂ−Ｂｌ ； Ｆｉｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１： ２１０９−２１１７ （１９９５））、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ，２９： １−２ （１９９４））、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８５： ９８２−９９０ （１９９５）米国特許第５，７５６，１０３号明細書；第５，２７４，０８７号明細書；第５，５７１，７１０号明細書；第６，０７１，７１６号明細書；第５，６９８，５３０号明細書；第６，０４５，８０２号明細書；欧州特許第２６３９３３号明細書；欧州特許第３４６７１０号明細書；および欧州特許第７８４４８３号明細書）；癌関連変異ムチン（すなわちＭＵＣ−１遺伝子産物； Ｊｅｒｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１： １６５４−１６６２（１９９３））；ＥＢＶのＥＢＮＡ遺伝子産物（すなわちＥＢＮＡ−１；Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ−Ｓｕｒｖｅｙｓ，１３ ： ５３−８０ （１９９２））；ヒトパピローマウイルスのＥ７、Ｅ６タンパク質（Ｒｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５４： ５９３４−５９４３ （１９９５））；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ； Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ，３０： ７３−７８ （１９９７））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ； Ｉｓｒａｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：１８０７−１８１１ （１９９４））；イディオタイプエピトープまたは抗原、たとえば、免疫グロブリンイディオタイプまたはＴ細胞受容体イディオタイプ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３： ４７７５−４７８７ （１９９４））；ＫＳＡ（米国特許第５，３４８，８８７号明細書）、キネシン２（Ｄｉｅｔｚ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｓｅｐ ７； ２７５ （３）： ７３１−８）、ＨＩＰ−５５、ＴＧＦβ−１抗アポトーシス因子（Ｔｏｏｍｅｙ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２００１； ５８ （３）： １７７−８３）、腫瘍タンパク質Ｄ５２（Ｂｒｙｎｅ Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３５： ５２３−５３２ （１９９６））、Ｈ１ＦＴ、ＮＹ−ＢＲ−１（国際公開第０１／４７９５９号パンフレット）、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−７５、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＢＲ−８７、ＮＹ−ＢＲ−９６（Ｓｃａｎｌａｎ，Ｍ．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ワクチンｓ ２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＢＦＡ４（配列番号２８および２９）、ＢＣＹ１（配列番号３０および３１）、ＢＦＡ５（配列番号３２および３３）、ＢＣＺ４（配列番号３４および３５）、およびＢＦＹ３（配列番号３６および３７）を含み、「野生型」（すなわち、ゲノムによって通常コードされる、天然に存在する）、改変型、および変異型、およびその他の断片および誘導体を含む。これらのＴＡはいずれも、単独で、または共免疫手順において互いに組み合わせて使用することができる。
【００１１】
一部の場合には、ＴＡおよび血管新生関連抗原（「ＡＡ」）といった他の抗原の両方を用いて患者を共免疫することが有益でありうる。ＡＡとは、血管の誘導および／または連続した発達に関与する細胞に随伴する免疫原性分子（すなわち、ペプチド、ポリペプチド）である。たとえば、ＡＡは、血管の主要な構造要素である内皮細胞（「ＥＣ」）上で発現されうる。癌の治療のためには、腫瘍に供給する血管の内部または近傍にＡＡが見出されることが好ましい。ＡＡに対する患者の免疫は、好ましくは抗ＡＡ免疫応答を結果として生じ、それによって腫瘍の近傍または内部で生じる血管新生過程が予防されおよび／または阻害される。
【００１２】
典型的なＡＡは、たとえば、血管内皮増殖因子（すなわちＶＥＧＦ；Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｕｒｏｌ．，２００１，１６６ （４）： １２７５−９； Ｓｔａｒｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，２００１，１２２ （３）： ５１８−２３； Ｄｉａｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００２，９９ ：２１７９−２１８４）、ＶＥＧＦ受容体（すなわちＶＥＧＦ−Ｒ、ｆｌｋ−１／ＫＤＲ；Ｓｔａｒｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，２００１，１２２ （３）： ５１８−２３）、ＥＰＨ受容体（すなわちＥＰＨＡ２；Ｇｅｒｅｔｙ，ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｃｅｌｌ，４： ４０３−４１４）、上皮増殖因子受容体（すなわちＥＧＦＲ；Ｃｉａｒｄｅｉｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７ （１０）： ２９５８−７０）、塩基性線維芽細胞増殖因子（すなわちｂＦＧＦ；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２０００，１８ （６）： ５０１−７； Ｐｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ．Ｓｕｒｇ．，２００１，１８２ （３）： ２９８−３０４）、血小板由来細胞増殖因子（すなわちＰＤＧＦ−Ｂ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ；Ｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００１，８ （２）： １４１−８）、形質転換増殖因子（すなわち、ＴＧＦ−α； Ｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００１，８ （２）：１４１−８）、エンドグリン（Ｂａｌｚａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００１，９４ ： ５７９−５８５）、Ｉｄタンパク質（Ｂｅｎｅｚｒａ，Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，２００１，１１ （６）： ２３７−４１）、プロテアーゼたとえばｕＰＡ、ｕＰＡＲ、およびマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９；Ｄｊｏｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００１，１９５ （２）： １４７−５５）、一酸化窒素合成酵素（Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，２００１，１３２ （４）： ５５１−６）、アミノペプチダーゼ（Ｒｏｕｓｌｈａｔｉ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒ，２： ８４−９０，２００２）、トロンボスポンジン（すなわちＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２；Ａｌｖａｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１，８２ （２）： ２７３−８； Ｓｅｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２００１，１９ （２）： ３０５−１０）、ｋ−ｒａｓ（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，６１ （１６）： ６０５０−４）、Ｗｎｔ（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，６１ （１６）： ６０５０−４）、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ； Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．２０００，３ （２）： ８３−８８）、微小管（Ｔｉｍａｒ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐａｔｈ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．，７（２） ： ８５− ９４）、熱ショックタンパク質（すなわちＨＳＰ９０（Ｔｉｍａｒ、上記））、ヘパリン結合因子（すなわちへパリナーゼ； Ｇｏｈｊｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００１，９５ （５）： ２９５−３０１）、合成酵素（すなわちＡＴＰ合成酵素、チミジル酸合成酵素）、コラーゲン受容体、インテグリン（すなわちαν３、αν５、α１β１、α２β１、α５β１）、表面プロテオグリカンＮＧ２、ＡＡＣ２−１（配列番号１）、またはＡＡＣ２−２（配列番号２）を特に含み、「野生型」（すなわち、ゲノムによって通常コードされる、天然に存在する）、改変型、および変異型、およびその他の断片および誘導体を含む。これらの標的はいずれも、単独で、または互いにまたは他の物質と組み合わせて、本発明の実施に適当であろう。
【００１３】
一部の実施形態では、免疫原性標的をコードする核酸分子が利用される。その核酸分子は、ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ中のＤＮＡ挿入部に含まれるもののような、１つ以上の免疫原性標的をコードするヌクレオチド配列、またはその断片または誘導体を含みうるかまたはそれから構成されうる。「核酸配列」または「核酸分子」の語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。その語は、特に４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５'−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン、といった、しかしそれに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのうち任意のものから生じる分子を包含する。
【００１４】
単離された核酸分子とは、（１）総核酸が起源細胞から単離される際に天然に共存して見出されるタンパク質、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている；（２）その核酸分子が天然で結合しているポリヌクレオチドの全部または一部と結合していない；（３）天然では結合していないポリヌクレオチドと調節可能に結合している；および／または、（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然に存在しない：ものである。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ポリペプチド産生における用途、または、治療用途、診断用途、予防用途もしくは研究用途に干渉する、天然の環境で見出されるいかなる他の夾雑核酸分子または他の夾雑物も実質的に含まない。ここでは、「天然に存在する」または「天然」または「天然に見出される」の語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞、などといった生物材料との関連において用いられる場合、人による操作無しに自然界に見出される物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「非天然」はここでは、自然界に見られないかまたは人によって構造的に改変されたかもしくは合成された物質をいう。
【００１５】
２つ以上の核酸またはポリペプチド分子の同一性は、配列を比較することによって決定される。本分野で知られる通り、「同一性」とは、分子を構成する単位（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）間の一致によって決定される、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（すなわちアルゴリズム）によって処理された、ギャップ整列（あれば）を伴う２つ以上の配列のうち小さい方の間の同一マッチの割合を測定する。核酸配列間の同一性は、類縁配列が核酸配列または単離された核酸分子とハイブリダイズする能力によっても決定されうる。そのような配列の定義において、「高度にストリンジェントな条件」および「中等度にストリンジェントな条件」の語句は、配列が相補的である核酸鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、および顕著にミスマッチである核酸のハイブリダイゼーションを除外するための手順をいう。ハイブリダイゼーションおよび洗浄について「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ７ １９８９）； Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｃｈ．４ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照）。「中等度にストリンジェントな条件」の語句は、「高度にストリンジェントな条件」下で起こりうるよりも高い程度の塩基対ミスマッチを有するＤＮＡ 二重鎖 が生じうる条件をいう。典型的な中等度にストリンジェントな条件は、０．０１５ Ｍ塩化ナトリウム，０．００１５ Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５ Ｍ塩化ナトリウム，０．００１５ Ｍクエン酸ナトリウム，および２０％ホルムアミド 、３７〜５０℃である。一例として、５０℃、０．０１５ Ｍナトリウムイオン中での中等度にストリンジェントな条件は、２１％ ミスマッチを可能にする。ハイブリダイゼーション中に、非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減するために、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に他の物質を含めることが可能である。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、フィコール、Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適当な物質もまた用いることができる。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件の厳密性に実質的に影響することなく変えることができる。ハイブリダイゼーション実験は、ｐＨ６．８〜７．４で通常実施される；しかし、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨにほとんど依存しない。
【００１６】
本発明の一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸配列を細胞へ運搬するためにベクターが用いられる。ベクターとは、核酸配列を宿主細胞へ運搬するのに用いられる任意の分子である。一部の場合には、発現ベクターが用いられる。発現ベクターとは、宿主細胞の形質転換に適し、および運搬される核酸配列の発現を指示および／または調節する核酸配列を含む核酸分子である。発現は、転写、翻訳、および、イントロンが存在する場合にはスプライシング、といった過程を含むがそれらに限定されない。発現ベクターは典型的には、ポリペプチドをコードする異種核酸配列と調節可能に結合した１つ以上の隣接配列を含む。隣接配列は、たとえば、同種（すなわち、宿主細胞と同一の種および／または株に由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種に由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の起源に由来する隣接配列の組み合わせ）、または合成でありうる。
【００１７】
隣接配列は、好ましくは、コード配列の複製、転写および／または翻訳を達成することができ、およびコード配列と調節可能に結合している。ここでは、調節可能に結合という語句は、機能的関係にあるポリヌクレオチド配列の結合をいう。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合は、コード配列と調節可能に結合している。しかし、隣接配列は、正しく機能するかぎり、必ずしもコード配列と隣接している必要は無い。したがって、たとえば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、およびプロモーター配列はそれでもコード配列と調節可能に結合していると考えることができる。同様に、エンハンサー配列は、コード配列の上流または下流に位置しおよび配列の転写に影響を与えることができる。
【００１８】
一部の実施形態では、隣接配列は、標的細胞において高レベル遺伝子発現を推進する転写調節領域であることが好ましい。転写調節領域は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、リプレッサー配列、またはその組み合わせを含みうる。転写調節領域は、構成性、組織特異的、細胞型特異的（すなわち、その領域は、ある種類の組織または細胞において、他の種類と比較してより高いレベルの転写を推進する）、または調節可能（すなわち、化合物との相互作用に対して応答性である）でありうる。転写調節領域の起源は、隣接配列が細胞においてその細胞内の核酸の転写を引き起こすことによって機能するならば、任意の原核または真核生物、任意の脊椎動物または非脊椎動物、または任意の植物でありうる。さまざまな転写調節領域を、本発明の実施において利用しうる。
【００１９】
適当な転写調節領域は、たとえば、ＣＭＶプロモーター（すなわち、ＣＭＶ最初期プロモーター）；真核遺伝子由来プロモーター（すなわちエストロゲン誘導性ニワトリ卵白アルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子、グルココルチコイド誘導性チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、およびチミジンキナーゼ遺伝子）；および主要初期および後期アデノウイルス遺伝子プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０： ３０４−１０）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３'長末端反復（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．ＳＡ．７８： １４４４−４５）；メタロチオナイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６： ３９−４２）；ベータ−ラクタマーゼプロモーターといった原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５： ３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０： ２１−２５）を含む。組織型および／または細胞型特異的転写調節領域は、たとえば、膵腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８ ： ６３９−４６； Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０： ３９９−４０９ （１９８６）； ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７： ４２５−５１５）；膵ベータ細胞で活性であるインシュリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５： １１５−２２）；リンパ系細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８ ： ６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８： ５３３−３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７： １４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞中のマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓のアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１ ：２６８−７６）；肝臓のアルファ−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，５：１６３９−４８； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓のアルファ１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞中のベータ−グロブリン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ２１ ５：３３８−４０； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の乏突起膠細胞中のミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｃｅｉｌ ４８：７０３−１ ２）； 骨格筋のミオシン軽鎖２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；視床下部のゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８），および黒色腫細胞のチロシナーゼプロモーター（Ｈａｒｔ，Ｉ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９６ Ｆｃｂ；２３（ｌ）：１５４−８； Ｓｉｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９８ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；５（５）：２８１−９１）を特に含む。たとえば光、熱、放射線、テトラサイクリン、または熱ショックタンパク質といった特定の化合物または条件の存在下で活性化される誘導性プロモーターもまた利用することができる（たとえば国際公開第ＷＯ００／１０６１２号パンフレットを参照）。他の適当なプロモーターが本分野で知られている。
【００２０】
上記の通り、エンハンサーはまた適当な隣接配列でもある。エンハンサーはＤＮＡのｃｉｓ作用配列であり、通常は長さ約１０〜３００ｂｐで、プロモーターに作用して転写を増大させる。エンハンサーは典型的には方向および位置に依存せず、調節されるコード配列に対して５’および３’の両方が同定されている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（すなわち、グロビン、ジアスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインシュリン）。同様に、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核プロモーター配列に有用である。エンハンサーは核酸コード領域に対して５’または３’の位置でスプライスされてベクターに入りうるが、典型的にはプロモーターから５'位に位置する。他の適当なエンハンサーが本分野で公知であり、および本発明に適用可能である。
【００２１】
本発明の試薬を調製する間に、細胞をトランスフェクションまたは形質転換する必要がありうる。トランスフェクションとは、細胞による外来すなわち外因性ＤＮＡの取り込みをいい、および外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された時に細胞はトランスフェクションされている。いくつかのトランスフェクション法が本分野でよく知られている（すなわち、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２： ４５６； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）； およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ １３： １９７）。そのような方法は、１つ以上の 外因性 ＤＮＡ部分を適当な宿主細胞へ導入するのに用いることができる。
【００２２】
一部の実施形態では、細胞のトランスフェクションがその細胞の形質転換を結果として生じることが好ましい。細胞の特性に変化がある場合、細胞は形質転換されており、新しい核酸を含むように改変された場合は形質転換されている。トランスフェクション後に、トランスフェクションされた核酸は、細胞の染色体内へ物理的に組み込むことによって細胞の核酸と組換えることができ、複製されずにエピソーム配列として一過性に維持されることができ、または、プラスミドとして独立して複製することができる。その核酸が細胞分裂と共に複製される場合、細胞は安定に形質転換されている。
【００２３】
本発明はさらに、ポリペプチドの形の、単離された免疫原性標的を提供する。ポリペプチドは下記の場合に単離されていると考えられる：（１）起源細胞から単離される際に天然に共存して見出されるポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている；（２）その「単離されたポリペプチド」が天然で結合しているポリペプチドの全部または一部と（共有または非共有相互作用によって）結合していない；（３）天然で結合していないポリペプチドと（共有または非共有相互作用によって）調節可能に結合している；または、（４）天然に存在しない。好ましくは、単離されたポリペプチドは、治療用途、診断用途、予防用途もしくは研究用途に干渉する、天然の環境で見出されるいかなる他の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物も実質的に含まない。
【００２４】
免疫原性標的ポリペプチドは、ここでの定義では、成熟ポリペプチドでよく、および、調製される方法に応じて、アミノ末端メチオニン残基を有していてもいなくてもよい。たとえば免疫原性標的の特性または活性（すなわち、活性、抗原性）の少なくとも１つを有する、たとえば、断片、変異体（すなわち、対立遺伝子、スプライス）、オルソログ、ホモログといった類縁ポリペプチド、および、誘導体もまたさらに考慮される。配列が由来するポリペプチドの少なくとも一部に対応する配列を有する、一連の隣接しているアミノ酸残基をいうペプチドもまた関連している。好ましい実施形態では、ペプチドはアミノ酸約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜３０個、または３０〜５０個を含む。より好ましい一実施形態では、ペプチドは、たとえばクラスＩＭＨＣ分子上での提示に適した、アミノ酸９〜１２個を含む。
【００２５】
核酸またはポリペプチドの断片は、配列（すなわち、核酸またはポリペプチド）のアミノ末端（リーダー配列ありまたは無し）および／またはカルボキシ末端での切断を含む。断片はまた、変異体（すなわち、対立遺伝子、スプライス）、オルソログ、ホモログ、および親配列と比較して１つ以上のアミノ酸付加または置換または内部欠失を有する他の変異体を含みうる。好ましい実施形態では、切断および／または欠失は、アミノ酸約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、またはより多数を含む。そのように生じたポリペプチド断片は、アミノ酸約１０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、またはより多数を含む。そのようなポリペプチド断片は、随意的にアミノ末端メチオニン残基を含みうる。そのような断片は、たとえば、免疫原性標的ポリペプチドに対して抗体または細胞性免疫応答を生じるために用いることができることが理解される。
【００２６】
変異体とは、対象配列と比較して、１つ以上の配列置換、欠失、および／または付加を有する配列である。変異体は、天然に存在しうるかまたは人工的に構築されうる。変異体は、対応する核酸分子から調製されうる。好ましい実施形態では、変異体は、１ないし３、または１ないし５、または１ないし１０、または１ないし１５、または１ないし２０、または１ないし２５、または１ないし３０、または１ないし４０、または１ないし５０、または５０以上のアミノ酸置換、挿入、付加および／または欠失を有する。
【００２７】
対立遺伝子変異体とは、１個体の生物または生物の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める、遺伝子のいくつかの可能な天然に存在する代替型の１つである。スプライス変異体とは、一次転写物のスプライシングの結果として生じた、いくつかのＲＮＡ転写物の１つから生じたポリペプチドである。オルソログとは、別の種に由来する類似の核酸またはポリペプチド配列である。たとえば、免疫原性標的ポリペプチドのマウス型およびヒト型は互いにオルソログと考えられる。配列の誘導体とは、親配列に由来する、置換、付加、欠失を有するか、または化学的に改変された変異体である。変異体はまた、１つ以上の第１の配列（たとえばペプチド）の、少なくとも１つの別の配列（たとえば異種ペプチド）のアミノまたはカルボキシ末端での融合をいう、融合タンパク質を含みうる。
【００２８】
「類似性」とは、類似性が同一マッチおよび保存的置換マッチの両方を含む関連性の尺度をいう他は、同一性と関係する概念である。２つのポリペプチド配列が、たとえば、１０／２０個の同一アミノ酸を有し、および残りがすべて非保存的置換であるならば、パーセント同一性および類似性は両方とも５０％となる。同一の例で、保存的置換が存在するさらに５つの位置があれば、パーセント同一性は５０％のままであるが、しかしパーセント類似性は７５％（１５／２０）となる。したがって、保存的置換が存在する場合には、２つのポリペプチド間のパーセント類似性は、それらの２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高くなる。
【００２９】
置換は、保存的、または非保存的、またはその任意の組み合わせでありうる。ポリペプチドの配列への保存的アミノ酸改変（およびコードヌクレオチドへの対応する改変）は、親ポリペプチドと類似の機能的および化学的特性を有するポリペプチドを生じうる。たとえば、「保存的アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基の位置での大きさ、電荷、疎水性、または親水性にほとんどまたは全く影響しないような、および特に、免疫原性の低下を結果として生じないような、天然アミノ酸残基の非天然残基での置換を含みうる。適当な保存的アミノ酸置換を表１に示す。
【表１】
【００３０】
当業者は、よく知られた方法を用いて、ポリペプチドの適当な変異体を決定することができる。分子の、活性（すなわち、ＭＨＣ結合、免疫原性）を破壊することなく変化させうる適当な部分を特定するために、当業者は、その活性にとって重要でないと考えられる部分を標的するであろう。たとえば、同一の種または別の種に由来し類似の活性を有する類似のポリペプチドが知られている場合、当業者はポリペプチドのアミノ酸配列を、そのような類似のポリペプチドと比較することができる。そのような分析を実施することによって、類似のポリペプチドの間で保存されている残基、および分子の部分を特定することができる。そのような類似のポリペプチドと比較して保存されていない分子の部分における変化は、ポリペプチドの生物学的活性および／または構造に悪影響を与える可能性がより低いことが理解される。同様に、ＭＨＣへの結合に必要な残基が知られており、および結合を改善するために改変されうる。しかし、ＭＨＣへの結合の低下を結果として生じる改変は、大部分の場合には適切でない。当業者はまた、相対的に保存された領域においてさえ、活性を保つ一方で、化学的に類似のアミノ酸を天然に存在する残基と置換しうることを理解する。したがって、生物学的活性のためにまたは構造のために重要でありうる部分さえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供しうる。
【００３１】
他の好ましい ポリペプチド 変異体は、グリコシル化 部位の数および／または種類が対象アミノ酸 配列と比較して変更されたグリコシル化 変異体を含む。一実施形態では、 ポリペプチド 変異体 は、対象アミノ酸 配列よりも多数または少数のＮ−結合型 グリコシル化 部位を含む。Ｎ−結合型 グリコシル化 部位 は、配列 Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ または Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴づけられ、Ｘで表されるアミノ酸残基はプロリン以外の任意のアミノ酸 残基でよい。 この配列を生じるためのアミノ酸 残基の置換は、 Ｎ−結合型糖鎖の付加のための可能性のある新しい部位を提供する。代替的に，この配列 を消去する置換は、既存の Ｎ−結合型糖鎖を除去する。１つ以上の Ｎ−結合型 グリコシル化 部位 （典型的には天然に存在するもの）が消去されおよび１つ以上の 新しいＮ−結合型 部位が精製される、Ｎ−結合型糖鎖の再配列もまた提供される。ポリペプチドのＯ−結合型 グリコシル化に影響を与えるためには、セリン および／または スレオニン 残基を改変する。
別の好ましい変異体は、対象アミノ酸配列組と比較して、１つ以上のシステイン残基が欠失したかまたは別のアミノ酸（たとえば、セリン）で置換された、システイン変異体を含む。システイン変異体は、たとえば不溶性の封入体の単離後に、ポリペプチドを生物学的に活性な立体構造へ再折りたたみしなければならない場合に有用である。システイン変異体は一般的に天然タンパク質よりも少数のシステイン残基を有し、および典型的には、対にならないシステインの結果として生じる相互作用を最小化するために、偶数を有する。
【００３２】
他の実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの精製を補助する融合ポリペプチド部分を含む。融合は、その対象ポリペプチド変異体のアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらでも行いうる。融合は、リンカーまたはアダプター分子無しに直接でよく、またはリンカーまたはアダプター分子を介しうる。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、典型的にはアミノ酸残基約２０ないし約５０個でありうる。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼのためまたはプロテアーゼのための切断部位と共に設計されうる。一旦構築されれば、融合ポリペプチドを本明細書に記載の方法にしたがって誘導体化できることが理解される。適当な融合部分は、特に、金属結合ドメイン（たとえば、ポリヒスチジン部分）、免疫グロブリン結合ドメイン（すなわち、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃ受容体、または補体タンパク質抗体結合ドメイン）、糖結合ドメイン（たとえば、マルトース結合ドメイン）、および／または「タグ」ドメイン（すなわち、〜の少なくとも一部α−ガラクトシダーゼ、ｓｔｒｅｐタグペプチド、Ｔ７タグペプチド、ＦＬＡＧペプチド、または、モノクローナル抗体のようなそのドメインと結合する化合物を用いて精製しうる他のドメイン）を含む。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現に際してポリペプチドと融合され、および宿主細胞からの目的ポリペプチドの配列のアフィニティ精製のための手段として役立つ。アフィニティ精製は、たとえば、アフィニティマトリクスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーによって達成することができる。随意的に、タグは、切断のためにある種のペプチダーゼを用いることのようなさまざまな方法によって、目的ポリペプチドの精製された配列から続いて除去することができる。下記の通り、融合はまた、ＴＡとたとえばケモカインＣＸＣ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、またはＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）といった共刺激因子との間で行いうる。
【００３３】
融合モチーフは、小胞体といったＭＨＣ処理区画への、免疫原性標的の運搬を促進しうる。伝達配列または経細胞運搬配列といわれるこれらの配列は、ＨＩＶ ｔａｔ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９： １６６６を参照）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ｓｃｈｕｔｚｅ−Ｒｅｄｅｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７： ６５０を参照）、またはヒトｐｅｒｉｏｄ−１タンパク質（ｈＰＥＲ１；特に、ＳＲＲＨＨＣＲＳＫＡＫＲＳＲＨＨ（配列番号４２））に由来する配列を含む。
【００３４】
加えて、ポリペプチドまたはその変異体は、同種ポリペプチドと融合してホモ二量体を生じ、または異種ポリペプチドと融合してヘテロ二量体を生じうる。異種ペプチドおよびポリペプチドは：融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインといった、膜貫通受容体タンパク質またはその一部；膜貫通受容体タンパク質と結合するリガンドまたはその一部；触媒として活性である酵素またはその一部；ロイシンジッパードメインのような、オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド；免疫グロブリン定常領域のような、安定性を増加するポリペプチドまたはペプチド；および、そのポリペプチドまたはその変異体とは異なる治療活性を有するポリペプチドを含むがそれらに限定されない。
【００３５】
一部の実施形態では、免疫原性標的、ポリペプチド、またはその誘導体をコードする核酸配列を、細胞表面タンパク質、サイトカインまたはケモカインといった１つ以上の共刺激因子と、本発明の組成物中で組み合わせることが有利でありうる。共刺激因子は、たとえば、ポリペプチドとして、またはそのポリペプチドをコードする核酸として、組成物に含めることができる。適当な共刺激分子は、たとえば、ＣＤ２８ファミリーのメンバー（すなわち、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ；Ｈｕｔｌｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９９，３９７ ： ２６３−２６５； Ｐｅａｃｈ，ｅｔ ａｌ．ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １９９４，１８０ ： ２０４９−２０５８）を結合するポリペプチド、たとえば ＣＤ２８結合ポリペプチドＢ７．１（ＣＤ８０ ； Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９９２； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９２ ； Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６ （８）： ２７００−９）およびＢ７．２（ＣＤ８６ ； Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６（８） ： ２７００−９）；インテグリンファミリーのメンバー（すなわちＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８） ； Ｓｅｄｗｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９，１６２ ： １３６７−１３７５；Ｗｕｌｆｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，２８２： ２２６６−２２６９； Ｌｕｂ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９９５，１６ ： ４７９−４８３）を、ＩＣＡＭファミリーのメンバー（すなわち、ＩＣＡＭ−１、−２または−３）を含め、結合するポリペプチド；ＣＤ２ファミリーメンバー（すなわち、ＣＤ２、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＣＤｗ１５０または「ＳＬＡＭ」； Ａｖｅｒｓａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７，１５８ ： ４０３６−４０４４） ）と結合するポリペプチド、たとえばＣＤ５８（ＬＦＡ−３；ＣＤ２リガンド；Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９９６，１７ ： １７７−１８７）またはＳＬＡＭリガンド（Ｓａｙｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９５： ４６２−４６９）；熱安定性抗原（ＨＳＡまたはＣＤ２４； Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７，２７： ２５２４−２５２８）と結合するポリペプチド；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーと結合するポリペプチド（すなわち、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７； Ｖｉｎａｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０ ： ４８１−４８９）、ＯＸ４０ （ＣＤ１３４； Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ４７１−４８０； Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９，１６２： ４８６−４９３）、およびＣＤ２７（Ｌｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ４９１−４９９） ）たとえば４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド； Ｖｉｎａｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ４８１−４８； ＤｅＢｅｎｅｄｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７，１５８ ： ５５１−５５９）、 ＴＮＦＲ随伴因子−１（ＴＲＡＦ−１；４−１ＢＢリガンド； Ｓａｏｕｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １９９８，１８７ ：１８４９− １８６２，Ａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８，１８： ５５８−５６５）、 ＴＲＡＦ−２（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；Ｓａｏｕｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９８，１８７ ： １８４９−１８６２； Ｏｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１０： ５１７−５２６，Ｋａｗａｍａｔａ，ｅｔ ａｌ．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８，２７３ ：５８０８−５８１４）、ＴＲＡＦ−３（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；Ａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８，１８： ５５８−５６５； Ｊａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８，２４２ ： ６１３−６２０； Ｋａｗａｍａｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８，２７３ ： ５８０８−５８１４）、 ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド；Ｇｒａｍａｇｌｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１６１ ： ６５１０−６５１７）、ＴＲＡＦ−５（ＯＸ４０リガンド；Ａｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８，１８： ５５８−５６５； Ｋａｗａｍａｔａ，ｅｔ ａｌ．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８，２７３ ： ５８０８−５８１４）、およびＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド；Ｃｏｕｄｅｒｃ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，５ （３）： １６３−７５）を含む。ＣＤ１５４ （ＣＤ４０ ｌｉｇおよび／または「ＣＤ４０Ｌ」； Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１ ： ４５６３−４５７１； Ｓｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００１，１２ ： １０９１−１１０２）もまた適当でありうる。
【００３６】
１つ以上のサイトカインもまた、本発明の組成物中に含まれるポリペプチドまたは核酸によってコードされる共刺激因子または「アジュバント」として適当でありうる（Ｐａｒｍｉａｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２０００ Ｓｅｐ １５； ７４（１） ： ４１−４； Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１： ２０９−２１９）。適当なサイトカインは、たとえば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４： ３２１−３２７ （１９９８） ）、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（Ｐａｒｄｏｌｌによる総説、１９９２； Ｈａｒｒｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２０００ Ｊｕｌ−Ａｕｇ； ２ （４）： ２４３−９； Ｒａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６： ３３５７−３３６５ （１９９６） ）、ＩＬ−１５（Ｘｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７： ８５８−８６６，１９９９）、ＩＬ−１６（Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｅｕｋ Ｂｉｏｌ．６７ （６）： ７５７−６６，２０００）、ＩＬ−１８（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００１．１２７ （１２）： ７１８−７２６）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ（Ｄｉｓｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，８８ ： ２０２−２１０ （１９９６） ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、またはＩＦＮ−αまたはＩＮＦ−γといったインターフェロンを含む。本分野で知られる通りの、他のサイトカインもまた、本発明を実施するために適当である可能性がある。
【００３７】
ケモカインもまた利用することができる。たとえば、腫瘍自己抗原へ融合したＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）を含む融合タンパク質は、抗腫瘍免疫を誘導することが示されている（Ｂｉｒａｇｙｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７ ：２５３−２５８）。ケモカインＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）（Ｂｏｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９９，１７ （Ｓｕｐｐ．２）： Ｓ５３−Ｓ６４）もまた、本発明の実施において有用でありうる。他の適当なケモカインが本分野で公知である。
抑制性または負の調節免疫機構をブロックし、結果として免疫応答の促進を生じうることもまた本分野で公知である。たとえば、抗ＣＴＬＡ−４（Ｓｈｒｉｋａｎｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９６，１４ ： １４５−１５５； Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１，１９４： ８２３−８３２）、抗ＣＤ２５（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ、上記）、抗ＣＤ４（Ｍａｔｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６３： １８４−１９３）、融合タンパク質ＩＬ１３Ｒａ２−Ｆｃ（Ｔｅｒａｂｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１：５１５−５２０）、およびその組み合わせ（すなわち、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＣＤ２５、Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ，上記）を用いた処置は、抗腫瘍免疫応答をアップレギュレートすることが示されており、および本発明の実施に適する。
【００３８】
これらの成分はいずれも、単独でまたは他の物質と併用して使用しうる。たとえば、ＣＤ８０、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の組み合わせ（「ＴＲＩＣＯＭ」）は抗癌免疫応答を促進しうることが示されている（Ｈｏｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９： ５８００−５８０７ （１９９９）。他の効果的な組み合わせは、たとえば、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ（Ａｈｌｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８： ３９４７−３９５８ （１９９７）； Ｉｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８： ４５９１−４６０１（１９９７））、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ−α（Ａｈｌｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３： ８９７−９０８ （２００１））、ＣＤ８０＋ＩＬ−１２（Ｆｒｕｅｎｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８５： ５０８−５１７ （２０００）； Ｒａｏ，ｅｔ ａｌ．上記）、およびＣＤ８６＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１２（Ｉｗａｓａｋｉ、上記）を含む。当業者は、本発明の実施に有用である別の組み合わせを知る。加えて、当業者は、そのような機構を調節するために用いることができる別の試薬または方法を知る。これらの試薬および方法、および当業者に公知であるその他は、本発明の実施に利用することができる。
【００３９】
たとえば、自己複製ウイルスレプリコンの使用（Ｃａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７： ３１２４−２１３５； Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６： ７２３−７３２； Ｌｅｉｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０： ５１−５５）、コドン最適化（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１：４９７−５００ ； Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，上記 ； Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５： ４９４７−４９５１）、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション（Ｗｉｄｅｒａ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４ ： ４６３５−３６４０）、ＣｐＧ刺激モチーフの組み込み（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１８ ： ９２７−９７４； Ｌｅｉｔｎｅｒ，上記；Ｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８ （１０）： ４９０７−１３）、エンドサイトーシスまたはユビキチン処理経路の標的化のための配列（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２： ２２４６−２２５２； Ｖｅｌｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６： ５３６６− ５３７３）、マレック病ウイルス１型ＶＰ２２配列（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６ （６）： ２６７６−８２，２００２）、基礎免疫−追加免疫処方（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，上記 ； Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ，４０８： ６０５−６０９； Ｈａｎｋｅ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ，１６： ４３９−４４５； Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２： ６９−７４）、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような粘膜運搬ベクターの使用（Ｄａｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｃｅｌｌ，９１： ７６５−７７５； Ｗｏｏ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９： ２９４５−２９５４）を含む、核酸を基礎とする免疫の効率を改善するための別の戦略もまた用いることができる。他の方法が本分野で公知であり、その一部を下に記載する。
化学治療剤、放射線、抗血管新生化合物、または他の物質もまた、免疫原性標的を用いる癌の治療および／または予防に利用できる（Ｓｅｂｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００ Ｄｅｃ ２７； １９ （５６）： ６５６６−７３）。たとえば、転移性乳癌の治療において、有用な化学治療剤は、特にシクロホスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナベルビン、カペシタビン、およびマイトマイシンＣを含む。たとえば、シクロホスファミド＋メトトレキサート＋５−フルオロウラシル；シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋５−フルオロウラシル；または、シクロホスファミド＋ドキソルビシンを含む、併用化学治療処方もまた有用であることが証明されている。プレドニゾン、タキサン、ナベルビン、マイトマイシンＣ、またはビンブラスチンといった他の化合物が、さまざまな理由で利用されている。大部分の乳癌患者はエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）腫瘍を有し、およびこれらの患者では、内分泌療法（すなわち、タモキシフェン）が化学療法より好ましいそのような患者には、タモキシフェンまたは、第二次治療として、プロゲスチン（酢酸メドロキシプロゲステロンまたは酢酸メゲストロール）が好ましい。アロマターゼ阻害剤（すなわち、レトロゾールといった、アミノグルテチミドおよびその類縁物質）は、腫瘍増殖を維持するために必要なエストロゲンのアベイラビリティを低下させ、および一部の患者において第二次または第三次の内分泌療法に使用しうる。
【００４０】
他の癌は異なる化学治療処方を必要としうる。たとえば、転移性直腸結腸癌は典型的には、カンプトサール（イリノテカンまたはＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシルまたはロイコボリンを用いて、単独でまたは互いに併用して治療される。プロテイナーゼおよびインテグリン阻害剤、たとえばＭＭＰ阻害剤マリマステート（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｅｘ）、ネオバスタット（Ａｅｔｅｒｎａ）、ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＧＳ２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）またはインテグリン阻害剤ビタキシン（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、またはＭＥＤ１５２２（ＭｅｒｃｋＫｇａＡ）もまた使用に適している可能性がある。このように、直腸結腸癌に随伴する免疫原性標的の免疫標的化は、それらの化学治療剤を用いた治療と併用して実施しうる。同様に、他の種類の癌を治療するのに用いられる化学治療剤は本分野でよく知られており、および本明細書に記載の免疫原性標的と組み合わせることができる。
【００４１】
多数の抗血管新生物質が本分野で公知であり、および免疫原性標的ワクチンとの同時投与に適する（たとえば、Ｔｉｍａｒ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．，７ （２）：８５−９４を参照）。そのような物質は、たとえば、増殖因子（すなわち、ＡＮＧ−２、ＮＫ１、２、４（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β））、サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−α、−β、−γといったインターフェロン、血小板因子４（ＰＦ−４）、ＰＲ−３９）、プロテアーゼ（すなわち、切断ＡＴ−ＩＩＩ、コラーゲンＸＶＩＩＩ断片（エンドスタチン））、Ｈｍｗカリクレイン−ｄ５プラスミン断片（アンギオスタチン）、プロトロンビン−Ｆ１−２、ＴＳＰ−１）、プロテアーゼ阻害剤（すなわち、ＴＩＭＰ−１、−２、または−３といったメタロプロテアーゼ組織阻害剤；マスピン；ＰＡＩ−１といったプラスミノーゲン活性化因子−阻害因子；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ））、ツムスタチン（ＩＬＥＸ，Ｉｎｃ．から入手可能）、抗体産物（すなわち、コラーゲン結合抗体ＨＵＩＶ２６、ＨＵＩ７７、ＸＬ３１３；抗ＶＥＧＦ；抗インテグリン（すなわち、ビタキシン（Ｌｘｓｙｓ）））、およびグリコシダーゼ（すなわち、へパリナーゼ−Ｉ、−ＩＩＩ）といった生理的物質を含む。抗血管新生能を有するのが公知であるかまたは有すると考えられている「化学的」または改変された生理的物質は、たとえば、ビンブラスチン、タキソール、ケトコナゾール、サリドマイド、ドルスタチン、コンブレスタチンＡ、ラパマイシン（Ｇｕｂａ，ｅｔ ａｌ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，８：１２８−１３５）、ＣＥＰ−７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能）、フラボン酢酸、Ｂａｙ１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．）、ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ，Ｉｎｃ．）、ＣＧＳ２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、テトラサイクリン誘導体（すなわち、ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．））、ネオバスタット（Ａｅｔｅｒｎａ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、低用量５−ＦＵ、低用量メトトレキサート（ＭＴＸ）、イルソフラジン、ラジシコール、シクロスポリン、カプトプリル、セレコキシブ、Ｄ４５１５２硫酸化多糖、陽イオン性タンパク質（プロタミン）、陽イオン性ペプチド−ＶＥＧＦ、スラミン（ポリスルホン化ナフチル尿素）、ＶＥＧＦの機能または産生に干渉する化合物（すなわち、ＳＵ５４１６またはＳＵ６６６８（Ｓｕｇｅｎ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ジスタマイシンＡ、アンギオザイム（リボザイム）、イソフラビノイド、スタウロスポリン誘導体、ゲニステイン、ＥＭＤ１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ ＫｃｇａＡ）、チロホスチン、イソキノロン、レチノイン酸、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、オクトレオチド、２−メトキシエストラジオール、アミノステロール （すなわち、スクワラミン）、グルタチオン類縁物質（すなわち、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）、コンブレタスタチンＡ−４（Ｏｘｉｇｅｎｅ）、Ｅｐｈ受容体遮断剤（Ｎａｔｕｒｅ，４１４： ９３３−９３８，２００１）、Ｒｈ−アンギオスタチン、Ｒｈ−エンドスタチン（国際公開第０１／９３８９７号パンフレット）、環状ＲＧＤペプチド、アキューチン−ディスインテグリン、ベンゾジアゼピン、ヒト化抗ａｖｂ３抗体、Ｒｈ−ＰＡＩ−２、アミロライド、ｐ−アミドベンズアミジン、抗ｕＰＡ抗体、抗ｕＰＡＲ抗体、Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−メチルアミド（すなわち、バチミステート、マリマステート）、ＡＧ３３４０、およびミノサイクリンを含む。多数の他の適当な物質が本分野で公知でありおよび本発明の実施に十分である。
本発明はまた、癌の治療の「従来でない」方法と組み合わせて利用することができる。たとえば、ある種の嫌気性細菌の投与が腫瘍 増殖を遅らせることを補助しうることが近年実証されている。１つの研究では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉを改変してファージエピソーム上にある毒素遺伝子を消去し、および直腸結腸腫瘍を有するマウスに投与した（Ｄａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，９８ （２６）： １５１５５−１５１６０，２００１）。化学療法と併用して、その処置は動物における腫瘍壊死を引き起こすことが示された。本明細書中で記載される試薬および方法は、そのような治療方法と組み合わせることができる。
【００４２】
免疫原性標的をコードする核酸は、いくつかの利用可能な方法のうち任意のものによって患者へ投与することができる。核酸を宿主へ導入するために使用が成功しているさまざまなウイルスベクターは、特に、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスを含む。多数のそのようなウイルスベクターが本分野で利用可能であることが本分野で理解される。本発明のベクターは、当業者に広く利用可能である標準的な組換え方法を用いて構築することができる。そのような方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、 Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）といった一般的な分子生物学参考文献に見出すことができる。
好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスの誘導体、およびマウスまたは鳥レトロウイルスの誘導体である。適当なレトロウイルスベクターの例は、たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含む。いくつかのレトロウイルスベクターは、複数の外因性核酸配列を組み込むことができる。組換えレトロウイルスは不完全であるため、それらは感染性ベクター粒子を生じるためには補助を必要とする。この補助は、たとえば、レトロウイルス構造遺伝子をコードするヘルパー細胞株によって提供することができる。適当なヘルパー細胞株は、特に、Ｔ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含む。そのような細胞株を用いて作製したベクター粒子を、次いで、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のような組織細胞株を感染させるのに使用し、大量のキメラレトロウイルス粒子を生じることができる。レトロウイルスベクターは、従来の方法（すなわち注射）によって、または標的細胞集団の近傍への「産生細胞株」の移植によって投与することができる（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，５ （３）：３４３−７９ ； Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５９： ６８５−９０）； Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４（１）：３９−６９）。産生細胞株は、ウイルスベクターを産生し、およびウイルス粒子を標的細胞付近に放出するように操作されている。放出されたウイルス粒子の一部は標的細胞と接触しおよびそれらの細胞に感染し、そのようにして本発明の核酸を標的細胞へ送る。標的 細胞の感染後、ベクターの核酸の発現が起こる。
【００４３】
アデノウイルスベクターは、真核細胞中への遺伝子運搬のために（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２ （５００４）： ４３１−４； Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，８ （１） ： ４２−５１）、真核遺伝子発現研究（Ｌｅｖｒｅｒｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０１ （２）： １９５−２０２）、ワクチン開発（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０： ３６３−９０）、および動物モデルにおいて（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，９ （Ｓｕｐｐｌ．１） ： １５１−２； Ｒｉｃｈ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４（４） ： ４６１−７６）、特に有用であることが証明されている。組換えＡｄをさまざまな組織へｉｎ ｖｉｖｏで投与するための実験的経路は、特に、気管内導入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ，６８（１） ： １４３−５５）、筋肉内注射（Ｑｕａｎｔｉｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９ （７）： ２５８１−４）、末梢静脈注射（Ｈｅｒｚ，Ｊ．，ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０ （７）： ２８１２−６）および脳への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９ （５０９７）： ９８８−９０）を含んできた。
【００４４】
アデノ随伴 ウイルス（ＡＡＶ）は、宿主細胞ゲノムへの一体化において、高レベル感染性、広い宿主域および特異性を示す（Ｈｅｒｍｏｎａｔ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１（２０） ： ６４６６−７０）。および単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１） は、特にその神経親和性のために、神経系における使用について、さらに別の魅力的なベクター系である（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ．，１４ （１０）： ４２８−３２； Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４（１） ： ８７−９９； Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：６７５−７１０）。
ポックスウイルスは別の有用な発現ベクターである（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｇｅｎｅ，２５（１） ： ２１−８； Ｍｏｓｓ，ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０： ３４５−６２； Ｍｏｓｓ，ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８ ： ２５−３８； Ｍｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２： １６６２−１６６７）。有用であることが示されているポックスウイルスは、特に、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、鶏痘、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、およびＡＬＶＡＣ（２）を含む。
【００４５】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株から、既知のまたは可能性のある病原性因子をコードする、ゲノムの必須でない領域６個を欠失することによって得られた（たとえば、米国特許第５，３６４，７７３号および第５，４９４，８０７号明細書を参照）。欠失した遺伝子座はまた、外来遺伝子の挿入のための受容遺伝子座として組換えられた。欠失した領域は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）；出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）；Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）；ヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）；宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）；および、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニット（Ｉ４Ｌ）である。ＮＹＶＡＣは、病原性および宿主域に関連する遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレーム１８個の特異的欠失によって作製された、遺伝子組換えされたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣはＴＡを発現するために有用であることが示されている（たとえば、米国特許第６，２６５，１８９号明細書を参照）。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９９４、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ１４３３、ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌ逆方向、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３およびｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢもまたＡＴＣＣへブダペスト条約の条項に従って寄託されており、登録番号はそれぞれＶＲ−２５５９、ＶＲ−２５５８、ＶＲ−２５５７、ＶＲ−２５５６、ＡＴＣＣ−９７９１３、ＡＴＣＣ−９７９１２、およびＡＴＣＣ−９７９１４である。
【００４６】
ＡＬＶＡＣを基礎とする組換えウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ−１およびＡＬＶＡＣ−２）もまた、本発明の実施における使用に適している（たとえば、 米国特許第５，７５６，１０３号明細書を参照）。ＡＬＶＡＣ（２）は、ＡＬＶＡＣ（２）ゲノムがワクシニアプロモーターの調節下にあるワクシニアＥ３ＬおよびＫ３Ｌ遺伝子を含む以外は、ＡＬＶＡＣ（１）と同一である（米国特許第６，１３０，０６６号明細書；Ｂｅａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ａ，１９９５ｂ，１９９１； Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＡＬＶＡＣ（１）およびＡＬＶＡＣ（２）の両方が、ＴＡといった外来ＤＮＡ配列の発現に有用であることが実証されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ａ，ｂ； 米国特許第５，８３３，９７５号明細書）。ＡＬＶＡＣはブダペスト条約の条項に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託されており、ＡＴＣＣ登録番号はＶＲ−２５４７であった。
【００４７】
別の有用なポックスウイルスベクターがＴＲＯＶＡＣである。ＴＲＯＶＡＣとは、１日齢雛のワクチン接種用に認可されている鶏痘ウイルスのＦＰ−１ワクチン株に由来するプラークからクローニングされた弱毒化鶏痘をいう。ＴＲＯＶＡＣは同様に、ブダペスト条約の条項に従ってＡＴＣＣに寄託され、登録番号は２５５３であった。
【００４８】
「非ウイルス」プラスミドベクターもまた、本発明の実施において適当でありうる。好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫、および／または哺乳類宿主細胞に適合する。そのようなベクターは、たとえば、ＰＣＲ−１１、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、 ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（国際公開第９０／１４３６３号パンフレット）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数のＣＯＬＥ１を基礎とするファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（たとえば、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。細菌ベクターもまた本発明に用いることができる。これらのベクターは、たとえば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｅ ｃａｌｍｅｔｔｅ ｇｕｅｒｉｎ （ＢＣＧ）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを含む（たとえば、国際公開第８８／６６２６号；国際公開第９０／０５９４号；国際公開第９１／１３１５７号；国際公開第９２／１７９６号；および国際公開第９２／２１３７６号パンフレットを参照）。多数の他の非ウイルスプラスミド発現ベクターおよび系が本分野で公知であり、および本発明に用いることができる。
【００４９】
適当な核酸運搬方法は、特に、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注射、ＣａＰＯ４沈降、遺伝子銃法、エレクトロポレーション、およびコロイド分散系を含む。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、および、水中油滴エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質を基礎とする系を含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームであり、これはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび ｉｎ ｖｉｖｏで運搬媒体として有用である人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なウイルス粒子をその水系の内部に封入し、および細胞へ生物学的に活性な形で送ることができる（Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６： ７７）。リポソームの組成物は通常、リン脂質の組み合わせ、特に、通常はステロイド特にコレステロールと組み合わせた高温相転移リン脂質である。他のリン脂質または他の脂質もまた使用することができる。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度、および二価陽イオンの存在に依存する。リポソーム作製に有用である脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンといったホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドを含む。特に有用なのは、脂質部分が１４〜１８個、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、および飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例となるリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【００５０】
免疫原性標的もまた、免疫応答を高めるために、１つ以上のアジュバントと組み合わせて投与することができる。典型的なアジュバントを下記の表２に示す：
【表２】
【００５１】
本発明の免疫原性標的はまた、スクリーニング検定法における用途のためまたは免疫療法のための抗体を作製するのに用いることができる。他の用途は当業者に明らかとなる。「抗体」の語は、本分野で公知であるいくつかの方法によって作製された、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、１本鎖抗体（たとえばＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体を含む抗体断片を、本分野で公知である通り含む。さまざまな種類の抗体を調製および使用する方法は当業者によく知られており、および本発明の実施に有用である（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８ ； Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．１，１９９８； Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６： ４９５ （１９７５）を参照）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２： ３２３−３２９ （１９８８）； Ｐｒｅｓｔａ （Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２： ５９３−５９６ （１９９２）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９： １５３４−１５３６ （１９８８）； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７： ３８１ （１９９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２： ５８１ （１９９１）； Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５） ；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１） ： ８６−９５ （１９９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９− ７８３ （１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８８５６−８５９ （１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３ （１９９５）号；第および米国特許第４，８１６，５６７号号；第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号明細書）。抗体またはそれに由来する誘導体はまた、特に、細胞毒性医薬または毒素、または活性なその断片、たとえばジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンといった治療用部分と複合体化しうる。細胞毒性物質はまた、放射性化学物質を含みうる。抗体およびその誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ用途のために本発明の組成物に組み込むことができる。
【００５２】
免疫原性標的を表す核酸、タンパク質、またはその誘導体は、患者において疾患状態の存在を判定するための、予後を予測するための、または化学治療または他の治療処方の有効性を判定するための、検定法に用いることができる。本分野で知られる通りに実施される発現プロファイルは、免疫原性標的の発現の相対レベルを測定するために用いることができる。発現のレベルは次いで、基底レベルと相関させ、特定の疾患が患者に存在するかどうか、患者の予後、または特定の治療処方が有効かどうかを判定することができる。たとえば、患者が特定の化学治療処方を用いて治療されているならば、患者組織中（すなわち末梢血中）の免疫原性標的の発現のレベル低下は、その処方がその宿主における癌量を低下させていることを示しうる。同様に、発現のレベルが上昇しているならば、別の治療様式を用いる必要がありうる。一実施形態では、免疫原性標的をコードする核酸に対応する核酸プローブを、宿主における発現の検出および定量のために、本分野で公知である通りのバイオチップに結合させることができる。
【００５３】
核酸、タンパク質、その誘導体、またはそれに対する抗体を、医薬スクリーニング検定法において試薬として用いることもまた可能である。その試薬は、患者の細胞株、または細胞または組織における免疫原性標的の発現に対する医薬候補の作用を確認するために用いることができる。発現プロファイリング法は、高処理量スクリーニング法と組み合わせて、有用な化合物の迅速な特定を可能にしおよび医薬候補を用いた治療の有効性を監視することを可能にすることができる（たとえば、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９，８４−８ （１９９８）を参照）。医薬候補は、天然に存在するかまたは合成によって得られる、化合物、核酸、タンパク質、抗体、またはそれに由来する誘導体であることができる。このように特定された医薬候補は、用途の中でも特に、患者への投与のための医薬組成物として、またはさらにスクリーニング検定法における用途のために、使用することができる。
【００５４】
本発明の組成物の宿主への投与は、当業者に公知であるさまざまな方法のいずれかを用いて達成することができる。組成物は、ヒトおよび他の哺乳類を含む、患者への投与のための薬剤（すなわち、「医薬組成物」）を製造するための製薬学の従来の方法に従って処理することができる。医薬組成物は好ましくは、たとえば、ＤＮＡ、ウイルスベクター粒子、ポリペプチドまたはペプチドの所定の量を含む単位用量の形に作製される。ヒトまたは他の哺乳類のために適した１日量は、患者の状態および他の要素に応じて大幅に変化しうるが、しかし、今度も、所定の方法を用いて決定することができる。
【００５５】
医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸に、節内に、または局所的に、医薬品として許容されるキャリヤー、アジュバント、および媒体を含む単位用量処方で投与することができる。「医薬品として許容されるキャリヤー」または「生理的に許容されるキャリヤー」の語句はここでは、医薬組成物としての核酸、ポリペプチド、またはペプチドの運搬を達成または促進するために適した、１つ以上の処方材料をいう。「医薬組成物」は、核酸またはポリペプチドの治療上有効な量を含む組成物である。「有効量」および「治療上有効な量」の語句はそれぞれ、有効な免疫応答を誘導または促進するために用いられる核酸またはポリペプチドの量をいう。本発明の組成物は、宿主において、腫瘍の発生から宿主を保護しおよび／または宿主が既存の腫瘍を身体から排除することを可能にする、抗腫瘍免疫応答の誘導または促進を提供することが好ましい。
【００５６】
経口投与のためには、医薬組成物は、たとえば、特に、カプセル、錠剤、懸濁剤、液剤を含むいくつかの剤形のいずれかでありうる。液剤は、生理食塩水、デキストロース、または水を含む適当なキャリヤーを含む組成物として、注射によって投与することができる。非経口の語はここでは、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、輸液、または腹腔内投与を含む。医薬の直腸投与のための坐剤は、ココアバターおよびポリエチレングリコールといった通常の温度で個体であるが直腸温で液体である適当な非刺激性添加物と医薬を混合することによって調製できる。
【００５７】
宿主を免疫するため、またはそうでなければ本発明の組成物を用いて障害または疾患を治療するための用量処方は、疾患の種類、年齢、体重、性別、患者の医学的症状、症状の重症度、投与経路、および使用する特定の化合物を含むさまざまな因子に基づく。たとえば、ポックスウイルスベクターは、１回用量当たり１ｘ１０６感染性粒子を含む組成物として投与することができる。このように、用量処方は大幅に変動しうるが、しかし標準的な方法を用いて普通に決定することができる。
【００５８】
基礎免疫段階で標的となる免疫原が１つの形で最初に投与され、その後、追加免疫段階で標的となる免疫原が別の形で投与される、基礎免疫−追加免疫処方もまた使用することができる（たとえば、国際公開第０１／３０３８２Ａ１を参照。基礎免疫段階および追加免疫段階の標的となる免疫原の形は異なる。たとえば、基礎免疫段階が核酸を用いたならば、追加免疫はペプチドとして投与しうる。同様に、基礎免疫段階が１つの種類の組換えウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ）を用いた場合、追加免疫段階は別の種類のウイルス（すなわち、ＮＹＶＡＣ）を使用しうる。この投与の基礎免疫−追加免疫法は、強い免疫応答を誘導することが示されている。
【００５９】
本発明の組成物は、単独の活性な医薬として投与することができる一方、それらはまた１つ以上の他の組成物または物質（すなわち、他の免疫原性標的、共刺激分子、アジュバント）と組み合わせて用いることもできる。組み合わせとして投与される場合、個々の成分は、同時にまたは別の時に投与される別々の組成物として処方することができ、または成分は単一の組成物として合わせることができる。
滅菌注射用水性または油性懸濁液といった注射用調製物は、公知の方法に従って、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて処方することができる。注射用調製物はまた、無毒性の非経口的に許容しうる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用液または懸濁液でありうる。使用できる適当な媒体および溶媒は、特に、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液である。たとえば、ポックスウイルスといったウイルスベクターを０．４％ＮａＣｌ中に処方することができる。加えて、滅菌不揮発性油が従来、溶媒または懸濁媒として用いられている。この目的には、合成モノまたはジグリセリドを含むどのブランドの不揮発性油も用いることができる。加えて、オレイン酸といった脂肪酸は注射剤の調製に用いられる。
【００６０】
局所投与のためには、組成物の適当な局所用量を、毎日１から４回、および好ましくは２から３回投与することができる。用量はまた、用量を投与しない中間日を用いて投与しうる。適当な組成物は、処方の重量で０．００１％ないし１０％ｗ／ｗ、たとえば１％ないし２％を含みうるが、処方の１０％ｗ／ｗと同じ量、しかし好ましくは５％ｗ／ｗ以下、およびより好ましくは０．１％ないし１％を含みうる。局所投与に適した処方は、皮膚を通る浸透に適した液体または半液体（たとえば、リニメント、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）および目、耳、または鼻への投与に適した滴下剤を含む。
【００６１】
医薬組成物はまた、固形（顆粒、粉剤または坐剤を含む）に調製することができる。医薬組成物は、滅菌といった従来の製薬操作に供することができ、および／または従来の補助剤、たとえば保存料、安定剤、湿潤剤、懸濁剤、緩衝剤などを含みうる。経口投与用の固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤を含みうる。そのような固体剤形では、活性化合物は、白糖、乳糖、またはデンプンといった、少なくとも１つの不活性な希釈剤と混合しうる。そのような剤形はまた、通常の慣行の通り、たとえば、ステアリン酸マグネシウムといった滑沢剤のような、不活性な希釈剤以外の別の物質も含みうる。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた緩衝剤を含みうる。錠剤および丸剤は別に腸溶性コーティングと共に調製しうる。経口投与用の液体剤形は、水といった本分野で一般的に用いられる不活性な希釈剤を含む、医薬品として許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含みうる。そのような組成物はまた、補助剤、たとえば湿潤剤、甘味料、香味料、および香料を含みうる。
【００６２】
本発明の核酸またはポリペプチドを含む医薬組成物は、いくつかの形状のいずれかを取ることができ、およびいくつかの経路のいずれかによって投与しうる。好ましい実施形態では、組成物は非経口経路（皮内、筋肉内または皮下）を介して投与され、宿主において免疫応答を誘導する。代替的に、組成物はリンパ節（節内）または腫瘤（すなわち、腫瘍内投与）内へ直接投与することができる。たとえば、用量は０、７、および１４日目に皮下投与することができる。ＴＡを含む組成物を用いる免疫に適した方法は、特にｐ５３（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ｐ２１−ｒａｓ（Ａｌｍｏｇｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＨＥＲ−２ （Ｆｅｎｄｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−２）（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ｐ９７（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、黒色腫関連抗原Ｅ（国際公開第９９／３０７３７号パンフレット）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｋａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３； Ｆｉｓｈｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）について示された通り、本分野で公知である。
【００６３】
投与可能な組成物の好ましい実施形態は、たとえば、核酸またはポリペプチドを含む懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤といった液体調製物を含む。好ましい注射用調製物は、たとえば、懸濁剤または乳剤といった、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈投与に適した核酸またはポリペプチドを含む。たとえば、組換えポックスウイルスは、滅菌水、生理食塩水、グルコースなどといった適当なキャリヤー、希釈剤、または添加物と混合することができる。組成物はまた、たとえば等張水性の生理食塩緩衝液中での再構成のための凍結乾燥形で提供することができる。加えて、組成物は、他の抗新生物剤、抗腫瘍剤または抗癌剤と、および／または、抗新生物剤、抗腫瘍剤または抗癌剤の悪影響を低減または緩和する物質と、同時に投与または連続的に投与することができる。
【００６４】
本発明の組成物を含むキットもまた提供される。キットは、適当なキャリヤー、希釈剤または添加物入りの別々の容器を含みうる。キットはまた、同時または連続的な投与のための、別の抗癌剤、抗腫瘍剤または抗新生物剤、および／または、抗新生物剤、抗腫瘍剤または抗癌剤の悪影響を低減または緩和する物質を含むことができる。別に、キットは成分を混合または合わせる、および／または投与のための説明書を含みうる。
【００６５】
本発明のよりよい理解およびその多数の利点は、例によって示される下記の実施例から得られる。
【実施例】
【００６６】
実施例１
ＡＡＣ２腫瘍関連抗原
ＡＡＣ２コード配列の１つの型（ＡＡＣ２−１）が共同研究者によって提供され、およびマウスｂｃｌ−６関連亜鉛フィンガータンパク質（「ＢＡＺＦ」）と高い配列類似性を有することが見出された。この配列情報に基づいて、ＰＣＲプライマーを下記の通り設計した：
ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴ ＴＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＡ（順方向プライマー；配列番号６）
ＣＴＡＧＧＧＣＣＣＣ ＣＣＧＡＧＡＡＴＧＴ ＧＧＴＡＧＴＧＣＡＣ ＴＴＴ（逆方向プライマー；配列番号７）
ＲＮＡは、集密状態のＨＵＶＥＣ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｃｋｅｒ；品番ＣＣ２５１７、ロット番号１Ｆ０１４１）培養からトリアゾールを用いて、取扱説明書に従って単離された（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，品番１５５９６）。高信頼性ＲＴ−ＰＣＲを次いでその順方向および逆方向プライマーを用いて実施し（９４度、２分；９４度、３０秒；５６．８度、３０秒；６８度、１分４０秒で２４サイクル；２５回目のサイクルは６８度、７分）、１，４４７塩基対ｃＤＮＡの単離を結果として生じた。ｃＤＮＡをｐＥＦ６−ＴＯＰＯ真核発現プラスミドへクローニングし、および「ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２」と称した。ｃＤＮＡｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２を、４種類のプライマーを用いて配列決定し、および、ＡＡＣ２−１およびマウスＢＡＺＦの配列と整列した（図１）。図に示す通り、ＡＡＣ２−２は、ＡＡＣ２−１の２４５位に見出されるセリン残基（Ｓ）を欠く。次に、ＡＡＣ２−２の２９８位から３１６位のアミノ酸１７個の一連（ＳＥＦＦＳＣＱＮＣＥＡＶＡＧＣＳＳ）は、ＡＡＣ２−１のアミノ酸２９８〜３１６と１１．８％の配列同一性だけを示した（図１）。興味深いことに、２９８位から３１６位のアミノ酸１７個の一連はマウスＢＡＺＦと１００％同一であり、これが長いセリン鎖に伴う転写因子機能（亜鉛フィンガー）に決定的でありうることを示唆する。ＡＡＣ２−２は次いでｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ真核発現プラスミドへクローニングされた（「ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＡＡＣ２−２」）。
【００６７】
実施例２
ＡＡＣ２ペプチドに対するヒトＴ細胞反応性
ＡＡＣ２−２アミノ酸配列を用いて、ＨＬＡ−Ａ−０２０１と結合することが予測される９量体ペプチドのライブラリを構築した（表３；「Ｎ」はその配列がマウスホモログ中に見出されないことを示し、一方、「Ｙ」はそのがマウスホモログ中に見出されることを示す）。２３のペプチドをＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌにて溶解し（表４）、およびヒトＰＢＭＣ培養に用いてＣＤ８およびＣＤ４ａｐＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導する能力を試験した。
【表３】
【００６８】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いて、ＨＬＡ−Ａ−０２０１を発現している供血者の末梢血単球から樹状細胞（ＤＣ）を作製した。ＤＣを、表４に示す９量体ＡＡＣ２−２ペプチドの異なるプールを用いてパルスした。
【表４】
【００６９】
これらのＤＣを用いて、自家Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣ調製物を刺激した。Ｔ細胞を、自家ＰＢＭＣを用いて再刺激し、および次いでＣＤ４０−リガンド−活性化自家Ｂ細胞を用いて再刺激した。各ペプチドプールを用いた３回目および４回目の刺激後に、ＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析は、Ｔ細胞がＡＡＣ２−２ペプチドのプールの１つに対して非常に強く反応したことを示した（ペプチド群６；図２）。ペプチド群６は下記のペプチドを含む：ＩＬＴＤＶＴＬＬＶ（ａａ３６〜４４）、ＴＬＬＶＧＧＱＰＬ（ａａ４１〜４９）、およびＦＭＹＴＳＲＬＲＬ（ａａ９５〜１０３）。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）は、このペプチド特異的株に由来するリンパ球は、＞５０％の記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）表現型を有するＣＤ８Ｔ細胞から成ることを示した。抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞はごく少数しかなく（＜２％）、観察されたＩＦＮ−γ産生はＮＫ細胞活性が原因でないことを示した。
【００７０】
このペプチドプール特異的Ｔ細胞株からのＣＴＬ活性の分析はまた、活性化Ｔ細胞が、ペプチド負荷されたＴＡＰ欠損Ｔ２細胞をＨＬＡ−Ａ−０２０１制限的な方法で傷害する能力を有したことを実証した（図２）。この分析はまた、ＩＬＴＤＶＴＬＬＶが、ペプチド特異的ＣＴＬ活性の大部分を刺激した主なペプチドであったことを明らかにした。したがって、ＡＡＣ２−２ペプチドはヒト免疫系において免疫原性であることが決定した。
【００７１】
実施例３
ＡＡＣ２−２のｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性
ＨＬＡ−Ａ２−Ｋｂ遺伝子導入マウスにＤＮＡ免疫を用いて、ＡＡＣ２−２タンパク質は処理されて免疫原性ペプチドとなり、およびＨＬＡ−Ａ−０２０１制限Ｔ細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導することができることが見出された。マウスは１日目にｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２を用いた注射によって免疫し、および同じプラスミドを用いて２１日目に追加免疫した。リンパ球を、免疫したマウスから追加免疫の２１日後に採取し、および表４に示すさまざまな群のＡＡＣ２−２ペプチドを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。これらのペプチドに対するペプチド特異的エフェクターＴ細胞機能を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて見出した（図３）。ヒト培養ＰＢＭＣにおいて強く免疫原性であることが以前に示された同じプールのペプチド（群６）がまた、ＤＮＡワクチン接種後にＴ細胞による顕著な反応性を導いたことが見出された（図３）。このように、ＤＮＡを基礎とするワクチンとして投与されたＡＡＣ２遺伝子産物はｉｎ ｖｉｖｏで免疫原性であり、およびＣＴＬ活性の活性化で特徴づけられる強い細胞媒介性免疫応答を誘導する。
【００７２】
実施例４
治療用ＡＡＣ２−２ワクチン
ＡＡＣ２−２遺伝子産物に対するｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２ＤＮＡワクチンを用いる治療用ワクチン接種は、固形腫瘍の増殖を完全に遮断することが見出された。Ｃ５７ＢＬ／６マウス８個体の群に、活発なおよび相対的に非免疫原性の腫瘍細胞株であるＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞１０４個を皮下に負荷した。マウスを次いで、腫瘍負荷の６日後に開始して週間隔で免疫した。ｆｌｕ−ＮＰタンパク質をコードするプラスミドまたは生理食塩水単独のどちらかを用いて処理した対照マウス（群当たり８個体）はすべて大きい腫瘍を生じた。対照的に、ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２で免疫したマウスのすべて（８／８）は、５０日の期間にわたって検出可能な腫瘍が無かった（図４）。すべてのマウスは８０日間を通じて腫瘍が無いままであった（データ記載せず）。図５は、黒色腫移植後の、記載のさまざまなＤＮＡベクターで処理したマウスの生存をプロットし、ふたたび黒色腫増殖に対するマウスの保護におけるＡＡＣ２−２ワクチン接種の完全な有効性を示す。ヒトＡＡＣ２−２遺伝子をコードするベクターを用いた免疫の結果として、有害な健康上の作用は観察されていない（免疫したマウスは対照マウスと同程度に活動的であり、および体重減少を示さなかった）。
【００７３】
図４および５に示す通り、ヒトＶＥＧＦＲ−２（ｐＢＬＡＳＴ−ｈｆｌｋ１）をコードするプラスミドを用いたワクチン接種は、腫瘍負荷されたマウスを保護しなかった。実際、腫瘍はこれらのマウスではさらに速やかにさえ増殖した。ｐＢＬＡＳＴ−ｈｆｌｋ１プラスミドを用いてワクチン接種したマウス由来の血清のＥＬＩＳＡによる分析は、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質に対するＩｇＧが顕著な力価で誘導されることを見出した（データ記載せず）。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−２に対して向けられる、抗体を基礎とする免疫応答は、血管新生および固形腫瘍増殖を防ぐのに有効でない可能性があることを示唆する。
【００７４】
ｐＥＦ６−ｈＡＡＣ２−２を用いて免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける黒色腫固形腫瘍増殖の阻害は、そのタンパク質に対する免疫応答と相関する（図６）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの免疫は上記の通り実施された。免疫したマウスに由来する脾臓細胞を、ＨＬＡ−Ａ２−Ｋｂ遺伝子導入マウスを用いた実験で使用したのと同一のペプチドプールで再刺激した（表３）。相当数のペプチドが、Ｃ５７ＢＬ／６クラスＩ ＭＨＣ（ＫｂおよびＤｂ分子）と交差反応した。ペプチドのプールの２つが特に（群１および群５）強いエフェクター細胞活性を誘導することがＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定で見出された（図６）。これらの群のペプチドのすべてがまた、マウスＢＡＺＦタンパク質中の対応する配列と同一である。これらの結果は、ヒトＡＡＣ２−２を用いた免疫はそのマウスオルソログＢＡＺＦに対する免疫応答をマウスにおいて活性化し、および結果として腫瘍血管新生を阻害できることを強く示唆する。これらの結果は単一の実験に由来し、およびこれらの結果を示したのはすべての実験ではなかった。
【００７５】
実施例５
ＢＦＡ４腫瘍抗原
ＢＦＡ４配列は、以前は何らかの種類の癌に原因づけられる機能が無かった既知の転写因子である「ｔｒｉｃｈｏｒｈｉｎｏｐｈａｌａｎｇｅａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ１」（ＴＲＰＳ−１） 遺伝子 （Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ番号６６８４５３３ ； Ｍｏｍｅｎｉｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（１），７１−７４，２０００）であることが見出された。ＢＦＡ４ｃＤＮＡ配列を図７に示し（配列番号２８）、および推論されるアミノ酸配列を図８に示す（配列番号２９）。
【００７６】
Ａ．ＢＦＡ４ペプチドおよびポリクローナル抗血清
監視目的で、ウサギ抗ＢＦＡ４ポリクローナル抗体を作製した。ＢＦＡ４に対する抗体反応を誘導するために、下記の６種類のペプチド（２２量体）を設計および合成した：
CLP 2589 MVRKKNPPLRNVASEGEGQILE BFA4(1-22)（配列番号７８）
CLP 2590 SPKATEETGQAQSGQANCQGLS BFA4(157-178)（配列番号７９）
CLP 2591 VAKPSEKNSNKSIPALQSSDSG BFA4(371-392)（配列番号８０）
CLP 2592 NHLQGSDGQQSVKESKEHSCTK BFA4(649-670)（配列番号８１）
CLP 2593 NGEQIIRRRTRKRLNPEALQAE BFA4(940-961)（配列番号８２）
CLP 2594 ANGASKEKTKAPPNVKNEGPLNV BFA4(1178-1199)（配列番号８３）
ウサギをペプチドで免疫し、血清を単離し、および下記の抗体力価が観察された：
【００７７】
ペプチドはまた、下記の通り、免疫応答を促進するためＫＬＨペプチドと結合することによって改変した：
BFA4(1-22) KLH-MVRKKNPPLRNVASEGEGQILE (CLP-2589；（配列番号７８）)
BFA4(157-178) KLH-SPKATEETGQAQSGQANCQGLS (CLP-2590;（配列番号７９）)
BFA4(371-392) KLH-VAKPSEKNSNKSIPALQSSDSG (CLP-2591;（配列番号８０）)
BFA4(649-670) KLH-NHLQGSDGQQSVKESKEHSCTK (CLP-2592;（配列番号８１）)
BFA4(940-961) KLH-NGEQIIRRRTRKRLNPEALQAE (CLP-2593;（配列番号８２）)
BFA4(1178-1200) KLH-ANGASKEKTKAPPNVKNEGPLNV (CLP-2594;（配列番号８３）)
ｐｃＤＮＡ３．２ＢＦＡ４（３．６ｍｇ）はまた、ニワトリにおいてポリクローナル血清を生じるためのＤＮＡ免疫に用いた。
【００７８】
Ｂ．ＢＦＡ４のクローニング
ＢＦＡ４に関する完全なｃＤＮＡ配列は〜１０ｋｂであり、および遺伝子はＢＴ４７４腺管癌細胞で発現される。ＲＴ−ＰＣＲによる４ｋｂ，７ｋｂまたは１０ｋｂ産物の増幅によって完全長ＢＦＡ４遺伝子を増幅するために、プライマー７７１７（順方向プライマー）および７７２３（逆方向プライマー）を設計した
プライマー７７１７：ＢＦＡ４−ＢａｍＨｌ／Ｆｌ（５'末端順方向）、Ｋｏｚａｋを伴う：
５'ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＣ ３' （ＤＮＡ３．１についてＢａｍＨＩ，ＭＰ７６）（配列番号８４）
プライマー７７２３：ＢＦＡ４−ＢａｍＨＩ／Ｒ１（３'末端逆方向４ｋｂ）：
５'ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣ ３' （ＤＮＡ３．１についてＢａｍＨＩ，ＭＰ７６）（配列番号８５）
ＢＴ−４７４細胞からＴｒｉｚｏｌを用いて取扱説明書に従って（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）異なるバッチで単離および凍結された総ＲＮＡ１０ｍｇをＲＴ−ＰＣＲで用い、ＢＦＡ４遺伝子を増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、Ｔａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ 高信頼性酵素、ＯＰＣ（オリゴ精製カートリッジ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）精製プライマーおよび精製総ＲＮＡ／ポリＡ ｍＲＮＡ（ＢＴ４７４細胞）を用いて最適化した。最適化の結果として、単一バンドで４．０ｋｂ断片を生じた。
【００７９】
ＢＦＡ４配列を再増幅するために、ｍＲＮＡをＤＮアーゼを用いて取扱説明書に従って（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）処理した。４ｋｂ ＤＮＡを、ＰＣＲを用いて、プライマー７７１７および７７２３プライマー（１０ｐｍｏｌ／マイクロリットル）およびＴａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ高信頼性 ポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）酵素を用いて再増幅した。反応の組の両方についてサーモサイクラー条件は下記の通りであった：９４℃（２分）、その後９４℃（３０秒）、５２℃（３０秒）、６７℃（４分）および６７℃（５分）の３０サイクル、および最後に４０℃１０分。３個のＢＦＡ４クローンが、ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング後に同定された。
【００８０】
いくつかの突然変異が、ＢＦＡ４配列の分析中に同定された。これらの配列を訂正するために、クローンＪＢ−３５５２−１−２由来のＢＦＡ４遺伝子（ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ／ＢＦＡ４）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片（５'）を、クローンＪＢ−３５５２−１−４由来のＢＦＡ４遺伝子（ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ／ＢＦＡ４）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片（３'）と交換した。この再組換え断片を次いでｐＭＣＳ５ＢａｍＨＩ／ＣＡＰにライゲーションした。クローンＪＢ−３６２４−１−５が作製され、および正しい配列を含むことが見出された。
【００８１】
単離されたＢＦＡ４クローンのヌクレオチド３４４は報告された配列とは異なった（ＢＦＡ４ではＣ、ＴＲＰＳ−１ではＴ）。その変化は結果としてｐｈｅからｓｅｒへのアミノ酸変化を生じた。この配列を報告された配列へ変えるために、クローンＪＢ−３５５２−１−２由来のＢＦＡ４遺伝子（ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ／ＢＦＡ４）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片（５'）をｐＵＣ８：２へサブクローニングし、クローンＪＢ−３６３１−２を生じた。このクローンは、ＢＦＡ４タンパク質のアミノ酸１１５をセリンからフェニルアラニンへＴＲＰＳ１タンパク質のように変化させるＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）突然変異誘発のためのテンプレートとして用いた。選択されたクローンはＪＢ−３６４８−２−３であった。突然変異誘発はまた、ｐＭＣＳ５ＢＦＡ４（ＢＴ４７４）をＢＦＡ４タンパク質のアミノ酸１１５をセリンからフェニルアラニンへＴＲＰＳ１タンパク質のように変化させるＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）突然変異誘発のためのテンプレートとして用いて繰り返した。いくつかのクローンが、ＤＮＡ配列決定によって正しいことが見出され、およびクローンの１つ（ＪＢ−３６８５−１−１８）を以降のサブクローニングに用いた。
【００８２】
ＪＢ−３６８５−１−１８を次いで、ＢＦＡ４コード配列を４種類の異なる発現ベクター：１）ポックスウイルス（ＮＹＶＡＣ）ベクターｐＳＤ５５４ＶＣ（ＣＯＰＡＫ／Ｈ６；ＪＢ−３７０７−１−７）；２）ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（ＪＢ−３７０７−３−２）；３）ｐＣＡＭｙｃＨｉｓ（ＪＢ−３７０７−５−１）；および、４）セムリキ森林ウイルスアルファウイルスレプリコンベクターｐＭＰ７６（ＪＢ−３７３５−１−２３）のＢａｍＨＩ部位へサブクローニングするのに用いた。ＪＢ−３７０７−１−７、ＪＢ−３７０７−５−１、およびＪＢ−３７３５−１−２３内のＢＦＡ４コード配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
終止コドンがｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４構造（ＪＢ−３７０７−３−２）中のクローニングされた配列の終わり近くに導入された。独自のＥｃｏＲ１部位を開き、および挿入してＢＦＡ４コード配列と共に終止コドンをフレーム内に導入した。いくつかの推定されるクローンがＥｃｏＲ１部位の消失によって同定されたが、しかし３個のクローン（ＪＢ−３７５６−１−２；ＪＢ−３７５６−３−１；およびＪＢ−３７５６−４−１）が配列決定された。３個すべては挿入の部分について正しいことが見出された。クローンＪＢ−３７５６−３−１は正しい配列および方向を有することが同定された。
【００８３】
Ｍｙｃおよびｍｙｃ／ｈｉｓタグ（Ｅｖａｎｓｅｔａｌ、１９８５）をオリゴヌクレオチドを用いて導入し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４構造（ＪＢ−３７０７−３−２）中へＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ部位にアニーリングおよびライゲーションした。これらの構造についていくつかのクローンが得られた。正しい配列および方向を有する３個のクローンが得られた：１）ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ｍｙｃ−ｔａｇ（ＪＢ−３７７３−１−２）；２）ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ｍｙｃｈｉｓ−ｔａｇ（ＪＢ−３７７３−２−１）；および、３）ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ｍｙｃｈｉｓ−ｔａｇ（ＪＢ−３７７３−２−２）。
【００８４】
Ｃ．ＢＦＡ４の発現
１．ポックスウイルスベクターからの発現
ｐＳＤ５５４ＶＣ（ＣＯＰＡＫ／Ｈ６；ＪＢ−３７０７−１−７）ベクターを用いてＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４ウイルスを作製した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えを、プラスミドＣＯＰＡＫ／Ｈ６／ＢＦＡ４およびＮＹＶＡＣを用いてＲＫ１３／ＣＥＦ細胞で実施した。ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４（ｖＰ２０３３−ＮＹＶＡＣ−ＲＫ１３）を作製し、およびストック終濃度１．１２ｘ１０９／ｍｌ（１０ｍｌ）での３回の濃縮の完了後、Ｐ３レベルへ増幅した。Ｖｅｒｏ細胞をＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４にＭ．Ｏ．Ｉ．０．５ｐｆｕ／細胞にて感染させた。ＢＦＡ４タンパク質の発現を確認するために、細胞溶解物および培地を感染の２４時間後に採取した。濃縮した培地の１／２０および溶解物の１／４０をウェスタンブロットに負荷し、およびＢＦＡ４ペプチドＣＬＰ２５８９、２５９１、２５９８および２５９４（抗ＢＦＡ４抗血清のペプチド配列および調製については上記参照）に対するウサギ抗血清と共にインキュベートした。約１２０ｋＤのバンドが、ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４感染Ｖｅｒｏ細胞の溶解物および濃縮培地の両方に見られ、これはＶｅｒｏ対照細胞（「ブランク感染」）、親ＮＹＶＡＣウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞、または濃縮培地のどれにも見られなかった。
【００８５】
２．ｐｃＤＮＡ３．１を基礎とするベクターからの発現
ｐｃＤＮＡを基礎とするベクターからのＢＦＡ４の発現を証明するため、およびＢＦＡ４ペプチドに対して作製したポリクローナル血清の品質を分析するため、一過性トランスフェクション試験を実施した。下記の構造を用いてＢＦＡ４遺伝子の発現を試験した：ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４、ｐＭＰ７６／ＢＦＡ４、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／Ｍｙｃ ｔａｇおよび ｐｃＤＮＡ ３．１ ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ。ＢＦＡ４発現プラスミド（５μｇおよび１０μｇ）をｐＧＬ３ルシフェラーゼ（１□ｇ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、Ｇｅｎｅポーター試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をトランスフェクション 試薬として用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、全細胞抽出物を、細胞を細胞溶解試薬（２００μｌ）中にかき取りおよび１サイクルの凍結融解（−２０℃凍結、３７℃融解）によって調製した。トランスフェクション効率は、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を２連で測定することでルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を分析することにより定量した。同様のＲＬＵ値が、ＢＦＡ４発現ベクターの存在下および非存在下でルシフェラーゼ構造を同時トランスフェクションした試料で得られた。異なる量（５μｇおよび１０μｇ）のＢＦＡ４発現ベクターについて毒性またはＲＬＵ値に有意差は観察されなかった。アルカリホスファターゼ系を使用しＣＨＯＫ１細胞抽出物（ｐＣＤＮＡ３．１／ｚｅｏ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓＴａｇ）および抗ＢＦＡ４ポリクローナル抗血清を用いた予備ウェスタンブロット分析は、ＢＦＡ４ベクターでトランスフェクションされた細胞の抽出物中に、約１２０ｋＤａバンドにバンドを証明した。
【００８６】
ＢＦＡ４を発現しているＣＯＳＡ２細胞の安定クローンを得るために、安定トランスフェクション試験を開始した。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激検定法に有用である。ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４（２．５μｇおよび２０μｇ）、およびｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ （２．５μｇ）を用いてＢＦＡ４の発現を試験した）。ｐＧＬ３ルシフェラーゼ（２．５μｇ）を、トランスフェクション効率を監視する対象ベクターとして用いた。
【００８７】
Ｇｅｎｅポーター試薬を用いてＤＮＡベクターのトランスフェクションを促進した。最初の実験について、トランスフェクション後４８時間で、全細胞抽出物を、細胞を細胞溶解試薬（２００μｌ）中にかき取りおよび１サイクルの−２０℃／３７℃での凍結融解によって調製した。２回目の実権から得られたトランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、凍結ショックで確立し、および細胞をＺｅｏｃｉｎの漸増濃度（０、２５０、５００、７５０および１０００μｇ／ｍｌ）中に平板播種した。トランスフェクションされていないＣｏｓＡ２細胞は、６０〜８０％集密にて３週間１００μｇ／ｍｌ（Ｚｅｏｃｉｎ）、および１０％集密にて２５０μｇ／ｍｌ（Ｚｅｏｃｉｎ）で生存した。しかし、３週間後、より高い薬物濃度では（５００〜１０００μｇ／ｍｌ）、トランスフェクションされていない細胞およびＺｅｏｃｉｎの高濃度（５００〜１０００μｇ／ｍｌ）を含むプレートでは生細胞は観察されなかった。
【００８８】
異なる薬物濃度（Ｚｅｏｃｉｎ−２５０、５００、７５０および１０００μｇ／ｍｌ）で増殖しているいくつかのＺｅｏｃｉｎ耐性クローンを、１０ｃｍプレートから３週間後に採取した。これらのクローンをさらに３．５ｃｍプレートでＺｅｏｃｉｎ５００、７５０および１０００μｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。これらのクローンの凍結ロットを調製し、および各プール（ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４、およびｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ）からいくつかのクローンをＴ７５ｃｍ２培養瓶でＺｅｏｃｉｎ１ｍｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。各プール（ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４、およびｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏＲ／ＢＦＡ４／ＭｙｃＨｉｓ ｔａｇ）からの５個のクローンをＴ７５ｃｍ２培養瓶でＺｅｏｃｉｎ１ｍｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。細胞はＺｅｏｃｉｎ医薬（１ｍｇ／ｍｌ）選択下に維持される。６個のクローンをＢＦＡ４ペプチドパルス標的実験に使用し、および２個のクローンがＢＦＡ４を中等度のレベルで発現することが免疫検定法によって見出された。非接着細胞株Ｋ５６２Ａ２およびＥＬ４Ａ２もまた、安定な細胞株を作製するために、これらのベクターを用いてトランスフェクションした。
【００８９】
３．原核発現ベクター
ｐＣＤＮＡ３．１／ＢＦＡ４由来のＮ−末端５４ｋＤａＢＦＤＡ４をコードするＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ−１断片（１．５Ｋｂｐ）断片をｐＧＥＸ４Ｔ１−６Ｈｉｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ）プラスミドにクローニングした。このベクターは、ｔａｃプロモーター、その後にＮ−末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−２６ｋＤａ）およびＧＳＴ融合タンパク質のＣ末端に６ヒスチジンタグを含む。
【００９０】
ＢＦＡ４−Ｎ５４発現プラスミドを用いてＢＬ２１細胞を形質転換し、および２５℃にて抗生物質選択培地（２Ｌ培養）中で一定のＯＤ（６００ｎｍ）まで増殖させ、およびその後、１ｍＭ ＩＰＴＧ．を用いて誘導した。ＧＳＴ−ＢＦＡ４−Ｎ５４は可溶性タンパク質であることがわかった。可溶性画分の清澄化抽出物をバッチ毎にグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに吸着させ、および１０ｍＭ還元グルタチオンを用いて溶出した。タンパク質濃度の推定およびＴＣＡ沈澱後に画分を分析した。溶出液中の分子量８５ｋＤａの特異的ポリペプチドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。組換えタンパク質はグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって精製され、さらなる精製のためにＮｉＮＴＡカラムに吸収された。結合したタンパク質は０．２５Ｍイミダゾールを用いて溶出した。タンパク質を、４０％グリセロールを含むＴＢＳに対して透析し、結果として４．５ｍｇのＧＳＴ−ＢＦＡ４−Ｎ５４−６Ｈｉｓ（Ｎ末端ＢＦＡ４タンパク質）タンパク質を生じた。ＢＦＡ４の発現は、ウサギ抗ＢＦＡ４ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットによって確認された。
【００９１】
Ｄ．抗ＢＦＡ４免疫応答
１．ＢＦＡ４ペプチド
ＢＦＡ４に対する遺伝子免疫ベクターに加えて、ＢＦＡ４に対する免疫試薬が作製されている。ＢＦＡ４遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表５は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、ＢＦＡ４タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表５−１】
【表５−２】
【００９２】
ペプチドライブラリを、免疫試験のために、表６（下記参照）に示す通りの７〜１０種類の異なるペプチドを含む別々の群へプールした。ＢＦＡ４全体にわたるペプチドライブラリに加えて、Ｎ−末端の３００個のアミノ酸（１〜３００位）にわたる組換えタンパク質が合成されおよびＥ．ｃｏｌｉから精製されている。
【表６−１】
【表６−２】
【００９３】
２．ＢＦＡ４ペプチドの免疫反応性およびヒトエフェクターＴ細胞の作製：
ＢＦＡ４ペプチドを、免疫試験のために７〜１０種類のペプチドを含む別々のプールに群分けした。溶解したペプチドプールを自家ＨＬＡ−Ａ＊０２０１樹状細胞にパルスし、および自家Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣ調製物を活性化するために用いた。各ペプチドプール刺激培養に由来する活性化Ｔ細胞を、ＣＤ４０Ｌ活性化自家Ｂ細胞を用いてさらに３〜５回再刺激した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析およびペプチドパルスした標的細胞のＣＴＬ傷害についての検定を、ＢＦＡ４に由来するこれらのエピトープの免疫原性を実証するために実施した。
【００９４】
ヒトＴ細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴ検定においてＩＦＮ−γを分泌する能力によって示される通り、ＢＦＡ４タンパク質に由来するペプチドのいくつかのプールに対してエフェクター細胞活性を実証した。これらの実験は異なる回数のＡＰＣ刺激後に繰り返し、結果として同一の反応性ペプチド群が得られた。ペプチド群１、２、４、５、６、７、８、９、および１０はこれらの検定において免疫反応性であることが見出された。続いて、これらの反応性ペプチド群を、各群から単一のペプチドを別々に試験した別のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定でデコンボルーションした。ＥＬＩＳＰＯＴ検定でのＢＦＡ４ペプチド群１、５、６、７、８、９、および１０からの個別のペプチド。この分析は、ヒトＴ細胞によって認識される、ＢＦＡ４タンパク質に由来するいくつかの個別の強く反応性であるペプチドを明らかにした。これらの単独のペプチドの多数はまた、ペプチド負荷したヒトＴ２リンパ腫細胞標的のＣＴＬ活性傷害も誘導したことも観察された。これらのペプチドを表７に列記する：
【表７】
【００９５】
Ｄ．ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫後のＢＦＡ４に対する免疫応答：
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＢＦＡ４プラスミドを用いて、マウスＫｂα３ドメインに融合したハイブリッドＨＬＡ−Ａ＊０２０１α１α２ドメインをＣ５７ＢＬ／６マウスで発現している遺伝子導入マウス（Ａ２−Ｋｂマウス）を免疫した。ＤＮＡ免疫および活性化された脾臓細胞の採取後の、プールしたペプチドの群を用いたＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析は、いくつかの反応性ＢＦＡ４ペプチド群を明らかにした。これらの群の一部（特に群７および８）はまた、培養ヒトＴ細胞において強く反応し、ペプチドの重なり合う群がヒトＴ細胞によって認識され、およびワクチン接種後に自然に処理されＨＬＡ−Ａ２上に提示されることを示唆した。
【００９６】
ワクチン接種実験はまた、ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４およびＭＰ７６−１８−ＢＦＡ４ベクターを用いてＡ２−Ｋｂマウスで実施した。マウスを、１０〜２０ｇのＭＰ−７６−１８−ＢＦＡ４および１〜２ｘ１０７ｐｆｕのｖＰ２０３３（ＮＹＶＡＣ−ＢＦＡ４）を用いて皮下免疫し、および２８日後に等しい量の各ベクターを用いて追加免疫した。免疫マウス由来の脾臓細胞の、ＢＦＡ４ペプチドのプールを用いた再刺激は、ＢＦＡ４ペプチド群２、３、４、５、７、９、および１０に応答したＩＦＮ−γ産生の誘導をＥＬＩＳＰＯＴ検定で明らかにした。このように、ＣＭＶプロモーターに動かされる真核プラスミド、ＮＹＶＡＣ、またはセムリキレプリカーゼを基礎とするＤＮＡプラスミドにコードされるＢＦＡ４遺伝子はすべて、ＢＦＡ４タンパク質に対してｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞応答を誘導する能力があった。
【００９７】
実施例６
ＢＣＹ１腫瘍抗原
ＢＣＹ１遺伝子は、「後側発現物質（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍａｔｅｒｎａｌ）遺伝子−３」（ＰＥＭ−３）と呼ばれＣａｅｎｏｒｈａｂｔｉｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ胚における後側から前側のパターン化に関与する線虫遺伝子と相同である部分オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として検出された。この遺伝子の癌への関与は以前に記録されていない。
【００９８】
Ａ．ＢＣＹ１およびアミノ酸ＤＮＡ配列
部分ＤＮＡ配列がＢＣＹ１について最初に決定された。プライマー９６１６ＳＸＣおよび９６１７ＳＸＣは、ＢＣＹ Ｉ部分ＤＮＡ 配列に由来し、およびＢＣＹ ＩをＲＴ−ＰＣＲによってＣａｌｕ ６ 総ＲＮＡからクローニングするために設計されている。プライマーは、下記の通り、ＰＣＲ産物が両端にＢａｍＨＩ部位を有しおよびＡＴＧ開始コドンおよびＫｏｚａｋ配列を５'末端に有するように設計された：
9616SXC: 5′ CAGTACGGATCCACCATGGCCGAGCTGCGCCTGAAGGGC 3 （配列番号１８３）
9617SXC: 5′ CCACGAGGATCCTTAGGAGAATATTCGGATGGCTTGCG 3′（配列番号１８４）
１．２ Ｋｂの予想単位複製配列が、最適化された条件下でＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて得られた。３回の別々のＲＴ−ＰＣＲに由来するＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、および別々にｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）に挿入した。結果として生じるクローンは、最初のＲＴ−ＰＣＲからＭＣ５０Ａ６、ＭＣ５０Ａ８およびＭＣ５０Ａ１９；２回目のＲＴ−ＰＣＲからＭＣ５４．２１およびＭＣ５５．２９；および、３回目のＲＴ−ＰＣＲからＭＣ５５．３２であった。下記のプライマーをクローンの配列決定に使用した：
9620MC: 5′ TAATACGACTCACTATAGGG 3′（配列番号１８５）
9621MC: 5′ TAGAAGGCACAGTCGAGG 3′（配列番号１８６）
9618MC: 5′ GAAAACGACTTCCTGGCGGGGAG 3′（配列番号１８７）
9619MC: 5′ GCTCACCCAGGCGTGGGGCCTC 3′（配列番号１８８）
６個すべてのクローンのＤＮＡ配列決定は、図１０に示す通りの、元の部分ＢＣＹ１配列とは下記の差を有する共通配列（配列番号３０）を示した：結果としてＡｌａからＧｌｙへのアミノ酸置換を生じる１０３１位のＣからＧへの置換；結果としてＴｈｒ欠失を生じる１０３２〜１０３４位のＧＣ欠失；および、ＴｈｒからＡｌａへのアミノ酸置換を生じる１１７７位のＡからＧへの置換。クローンＭＣ５０Ａ８およびＭＣ５５．２９は共通配列と同一である。ＢＣＹ１のアミノ酸配列を図１０（配列番号３１）に示す。
Ｂ．ＢＣＹ１乳癌抗原に対する免疫試薬：
ＢＣＹ１遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表８は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、ＢＣＹ１タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表８−１】
【表８−２】
【００９９】
表９は、免疫試験に用いたペプチドの群を示す：
【表９】
【０１００】
Ｃ．ＢＣＹ１ペプチドの免疫反応性およびヒトエフェクターＴ細胞の作製
ＢＣＹ１に由来する１００種類のペプチドのライブラリを、免疫試験のために７〜１０種類のペプチドを含む１０群に分けた。溶解したペプチドプールを自家ＨＬＡ−Ａ＊０２０１樹状細胞にパルスし、および自家Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣ調製物を活性化するために用いた。各ペプチドプール刺激培養に由来する活性化Ｔ細胞を、ＣＤ４０Ｌ活性化自家Ｂ細胞を用いてさらに３〜５回再刺激した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析およびペプチドパルスした標的細胞のＣＴＬ傷害についての検定を、ＢＣＹ１に由来するこれらのエピトープの免疫原性を実証するために実施した。
【０１０１】
ヒトＴ細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴ検定においてＩＦＮ−γを分泌する能力によって示される通り、ＢＣＹ１タンパク質に由来するペプチドのいくつかのプールに対してエフェクター細胞活性を実証した。これらの実験は異なる回数のＡＰＣ刺激後に繰り返し、結果として同一の反応性ペプチド群が得られた。ペプチド群１、２、３、４、５、６、および７はこれらの検定において免疫反応性であることが見出された。続いて、これらの反応性ペプチド群を、各群から単一のペプチドを別々に試験した別のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定でデコンボルーションした。この分析は、ヒトＴ細胞によって認識される、ＢＣＹ１タンパク質に由来するいくつかの個別の強く反応性であるペプチドを明らかにした。（図１１）。これらの単独のペプチドの多数はまた、ペプチド負荷したヒトＴ２リンパ腫細胞標的のＣＴＬ活性傷害も誘導した。これらのペプチドを表９に列記する。
【０１０２】
実施例７
ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１乳癌抗原
Ａ．ＢＦＡ５の同定
マイクロアレイプロファイリング分析は、５２の正常非腫瘍組織のパネルと比較して、ＢＦＡ５が、乳房腫瘤生検試料５４のうち４１で（７６％）低〜高レベルで、および乳房腫瘤５４のうち３１で（５７％）高レベルで発現したことを示した。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を、一連のＢＦＡ５ＤＮＡプローブを用いて実施し、およびそのマイクロアレイを腫瘍の少なくとも６１％について非常に強いシグナルを示して確認した。さらなるバイオインフォマティクス評価は、これらの遺伝子発現分析結果の結果を支持した。
【０１０３】
ＢＦＡ５ヌクレオチド配列の配列分析は、いくつかの胎児および成人脳ｃＤＮＡクローンから単離された２つの未同定ヒト遺伝子：ＫＩＡＡ１０７４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ~１５９７３２）；および、ＫＩＡＡ０５６５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１１１３７）（Ｋｉｋｕｎｏ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ １００ ｎｅｗ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｂｒａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＤＮＡ Ｒｅｓ．６：１９７−２０５）との高度の類似性を明らかにした。これらの遺伝子は、推定されるＺｎフィンガー領域および核局在化配列を含むことが見出された。ＢＦＡ５は、別の研究者によって、乳癌抗原の可能性があることが示唆されている（Ｊａｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：２０５５−２０６１および国際公開第０１／４７９５９号パンフレット）。これらの発表のそれぞれで、ヌクレオチド配列ＢＦＡ５はＮＹＢＲ−１（「Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ−１」；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６９０８７（ヌクレオチド）およびＡＡＫ２７３２５（アミノ酸）と表された。本明細書の目的のためには、その配列をＢＦＡ−５と呼び、ＢＦＡ−５ および ＮＹＢＲ−１ の語は相互に交換可能である。
【０１０４】
Ｊａｇｅｒらによって以前に示されおよび上記の国際公開第０１／４７９５９号パンフレットに記載の通り、ＢＦＡ５は乳腺で特異的に発現され、分析した乳房腫瘤の１２／１９に発現されている。ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１遺伝子の構造は、それがｂＺＩＰ部位（ＤＮＡ結合ドメインとそれに続くロイシンジッパーモチーフ）を伴う１５０〜１６０ｋＤの核転写因子をコードすることを明らかにしている。その遺伝子はまた、タンパク質−タンパク質相互作用における役割を示唆する５個縦列アンキリン反復を含む。これらのアンキリン反復は、そのタンパク質のホモ二量体化に関与しうる。ＢＦＡ５ｃＤＮＡ配列を図１２および配列番号３２に示す。ＢＦＡ５アミノ酸配列を図１３および配列番号３３に示す。
【０１０５】
Ｂ．ＢＦＡ５１の免疫反応性
ヒトＴ細胞の活性化およびＥＬＩＳＰＯＴにおけるＩＦＮ−γ分泌。
【０１０６】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する中程度または強力な結合物質であることが予想される、ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１コード配列に由来する１００種類のペプチドのライブラリを、ＲａｍｍｅｎｓｅｅおよびＰａｒｋｅｒアルゴリズムを用いて設計した。ライブラリを１０種類のペプチドの１０個のプールにさらに分け（表１１参照）、および、ペプチドを成熟自家樹状細胞にパルス後に、各プールを用いて１０の異なる培養Ｔ細胞を活性化した。ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１ペプチドのライブラリを用いて２回の実験を実施し、下記の通りＨＬＡ−Ａ＊０２０１ヒトＴ細胞における免疫反応性を実証した。
【表１０】
【０１０７】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析を、ＢＦＡ５ペプチドの各プールを用いて４回の刺激で活性化したヒト培養Ｔ細胞について実施した。図１４Ａでは、Ｘ軸の下の数字はペプチドプールの番号（１〜１０）を示す。ＣＭＶｐｐ６５ペプチドおよびＦｌｕマトリクスペプチドに対する反応性を、実験でＴ細胞活性化について陽性対照として用いた。各実験は、「ＡＰ１０」で表す一人のＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ドナーに由来するＰＢＭＣおよび樹状細胞を用いて実施した。結果は、ＢＦＡ４は検定では１００、０００細胞当たりの高いＥＬＩＳＰＯＴカウントを有し顕著に反応性であったが、ＢＦＡ５は９／１０プールについてさらに反応性であり、ＥＬＩＳＰＯＴ反応性を実証したことを示す。同様の結果が、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１の両方に関して別のＨＬＡ−Ａ＊０２０１について得られた。グラフは６００スポットで最高値となるが、それを超えるとＥＬＩＳＰＯＴ読み取り機が正確な計数を与えないためである。６００スポットの値を有する培養は、この数のスポットよりも多数を有する。
【０１０８】
多数のＢＦＡ５ペプチドプールは、高レベルのＩＦＮ−γ産生によって示される通り、反応性である（図１４Ａ）。単独の反応性ＢＦＡ５ペプチドを単離するために、各反応性ペプチドプールを次いで個別のペプチドに分け、および免疫原性についてＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて分析した。図１４Ｂに示す通り、ＢＦＡ５はいくつかの単一の反応性ペプチドを有し、ＢＦＡ４よりも高度に免疫原性である。同様の結果が、２つの独立したＰＢＭＣ培養実験で得られた。
【０１０９】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析に加えて、ＢＦＡ５ペプチドによって活性化されたヒトＴ細胞を、ＣＴＬとして機能する能力を測定するために検定した。細胞をペプチドパルスした樹状細胞、続いてＣＤ４０リガンド活性化Ｂ細胞（５回の刺激）を用いて活性化した。示した実験は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ドナーＡＰ３１から単離されたＰＢＭＣを用いて実施した。単離されたＴ細胞は、５１Ｃｒ放出検定で、ペプチド負荷Ｔ２細胞を用いて試験した。Ｔ細胞対標的比１０：１、５：１、および１：１での％特異的溶解を、ＢＦＡ５／ＮＹＢＲ−１ペプチドのプールのどちらかまたは個別のペプチドを用いてパルスしたＴ２細胞について示す。グラフはｃ非特異的ＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合ＨＩＶペプチド（対照）を用いて負荷された標的に対して誘導されたＣＴＬ活性、続いてペプチドプール（プール１など）に対するＣＴＬ活性、および次いで各プールからの個別のペプチドによって誘導された活性を右側に示す。高レベルの細胞毒性が、１：１のＥ：Ｔ比で一部のペプチドに観察された。対照ＨＩＶペプチドによって誘導されたＣＴＬ活性（パーセント特異的溶解）は一般的に＜１０％であった。同様の結果が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現している別のＰＢＭＣドナー（ＡＰ１０）について得られた。図１４Ｃは、多数のＢＦＡ５ペプチドが、ＢＦＡ５ペプチド負荷標的細胞のＴ細胞媒介性細胞毒性を引き起こすことを示す。表１１は、免疫原性を有するペプチドを列記する。５種類のペプチド（ＬＭＤＭＱＴＦＫＡ、ＩＬＩＤＳＧＡＤＩ、ＩＬＳＷＡＫＬＬ、ＳＱＹＳＧＱＬＫＶ、およびＥＬＣＳＶＲＬＴＬ）が、ＩＦＮ−γ分泌およびＣＴＬ活性の両方を、両方のドナーに由来するＴ細胞で誘導することが見出された。
【表１１】
【０１１０】
Ｃ．免疫試薬
ポリクローナル抗血清を、ＢＦＡ５の下記の一連の２２〜２３量体ペプチドに対して作製した：
9620MC: 5′ TAATACGACTCACTATAGGG 3′
9621MC: 5′ TAGAAGGCACAGTCGAGG 3′
9618MC: 5′ GAAAACGACTTCCTGGCGGGGAG 3′
9619MC: 5′ GCTCACCCAGGCGTGGGGCCTC 3′
ウサギからの予備採血試料を処理しおよび−２０℃にて保存した。ウサギを下記の通り免疫した：１）ペプチドをフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とのエマルジョンとして投与した；および、２）２週間後、ペプチドをスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合し、およびフロイント不完全アジュバントＦＩＡとのエマルジョンとして投与した。下記の結果が観察された：
【表１２】
【０１１１】
予備採血試料の結果は、すべての試料についてＩｇＧ力価＜１００を示した。
【０１１２】
ポリクローナル抗血清の品質を評価するために、ウェスタンブロットを、ＢＦＡ５に対する血清を用いて実施した。血清を、ＢＴ４７４、ＭＤＭＢ４５３、ＭＣＦ−７、Ｃａｌｕ−６、およびＣｏｓＡ２細胞から得られた細胞抽出物に対して別々にスクリーニングした。ＢＦＡ５タンパク質のおよその予想分子量は１５３ｋＤａである。２２０ｋＤのバンドがＢＴ４７４抽出物でＣＬＰ２９８０抗体について観察され、しかしＭＤＭＢ４５３細胞抽出物には観察されなかったが、しかし１３０ｋＤのバンドがＭＤＭＢ４５３抽出物に存在した。両方のバンドはこの分析で試験したポリクローナル抗血清と合致することが見出された。これらのバンドのどちらも、陰性対照には存在しなかった。したがって、そのポリクローナル抗血清はＢＦＡ５に対して特異的であると結論することができる。
【０１１３】
実施例８
ＢＣＺ４腫瘍抗原
Ａ．ＢＣＺ４配列
ＢＣＺ４配列は、乳癌試料において過剰発現された配列として検出された。ＢＣＺ４のヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列を、図１５、配列番号３４（ＢＣＺ４ｃＤＮＡ）、および配列番号３５（ＢＣＺ４アミノ酸配列）に示す。
【０１１４】
Ｂ．ＢＣＺ４乳癌抗原に対する免疫試薬：
ＢＣＺ４遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表１３は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、ＢＣＺ４タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表１３】
【０１１５】
Ｃ．ＢＣＺ４ペプチドの免疫反応性およびヒトエフェクターＴ細胞の作製
ＡＰ１０で表されるＨＬＡ−Ａ２．１陽性ドナーに由来するヒトＰＢＭＣを、ＢＣＺ４抗原に由来する９量体ペプチドの異なるプール（一覧は表１３を参照）を用いてパルスした自家樹状細胞を用いて活性化した。活性化Ｔ細胞を、１２日後に、同一の各ペプチドプールを用いてパルスした自家ＣＤ４０−リガンド活性化Ｂ細胞を用いてさらに８〜１０日間再刺激した。この二次刺激をさらに、計３回の刺激を繰り返した。活性化Ｔ細胞を３回目の刺激後に単離し、および示す通り（図１６Ａ）、各ＢＣＺ４ペプチドプールに対するヒトＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。図１６Ａでは、青色の棒はＢＣＺ４ペプチドプールに対する反応性を、および赤色の棒は陰性対照としてＨＬＡ−Ａ２．１−結合ＨＩＶペプチドについて示す。陽性対照ＣＭＶおよびｆｌｕに対するＨＬＡ−Ａ２．１−結合記憶抗原ペプチドを実験で陽性対照として用いた。標準偏差を表示する。実験を、追加のもう１回のペプチド刺激後の活性化Ｔ細胞について繰り返し、同様の結果を得た。
【０１１６】
ペプチドプールを、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いてデコンボルーションした（図１６Ｂ）。ドナーＡＰ１０由来のヒトＴ細胞を、表１３に示す異なるプールのＢＣＺ４ペプチドで刺激した。刺激は記載した別の抗原について記載の通り医実施した。４回および５回の刺激後に、Ｔ細胞を採取し、および各プール中の各個別のペプチドを用いてＩＦＮ−γ産生についてＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。表示の棒はペプチド反応性ｆｏｒ各特異的プールについての個別のペプチド反応性を表す。表１３は反応性ペプチドのそれぞれを特定する。この実験を、ＡＰ１０ドナーＴ細胞のもう１回の刺激後に繰り返し、同様の結果を得た。
【０１１７】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析に加えて、ＢＣＺ４ ペプチドによって活性化されたヒトＴ細胞を、ＣＴＬとして機能する能力を測定するために検定した。細胞をペプチドパルスした樹状細胞、続いてＣＤ４０リガンド活性化Ｂ細胞（５回の刺激）を用いて活性化した。示した実験は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ドナーＡＰ３１から単離されたＰＢＭＣを用いて実施した。単離されたＴ細胞は、５１Ｃｒ放出検定で、ペプチド負荷Ｔ２細胞を用いて試験した。Ｔ細胞対標的比１０：１での％特異的溶解を、個別のＢＣＺ４ペプチドを用いてパルスしたＴ２細胞について示す。高レベルの細胞毒性が、一部のペプチドに観察された（図１６Ｃ）。対照ＨＩＶペプチドによって誘導されたＣＴＬ活性（パーセント特異的溶解）は一般的に＜１０％であった。同様の結果が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現している別のＰＢＭＣドナー（ＡＰ１０）について得られた。
【０１１８】
表１４は個別のペプチドの反応性を列記する：
【表１４】
【０１１９】
Ｄ．ＢＣＺ４発現ベクター
ＢＣＺ４を、ｐＳｐｏｒｔｙ／ＢＣＺ４というプラスミドをテンプレートとして用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅条件は下記の通り：１）９４℃２分；２）９４℃３０秒、５３℃３０秒、６７℃２．５分のサイクル３５回；および、３）６７℃７分。ＰＣＲプライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位を含み、およびＯＲＦに直接隣接する（すなわち、無関係な配列が無い）ように設計した。プライマー配列は下記の通り：ＡＳ０３２Ｆ（順方向プライマー）５'ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧ ３'（配列番号５９１） ＡＳ０３４Ｒ （逆方向 プライマー） ５'ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＧＡＣ ＡＡＧＡＴＴＧ３'（配列番号５９２）。Ｋｏｚａｋ配列もまた順方向プライマーに含まれた。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ （＋） をＥｃｏＲＩで切断し、および自己ライゲーションを防ぐためにＣＩＰを用いて処理した。ＢＣＺ４単位複製配列を次いでＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）にライゲーションした。配列決定は、予測ＢＣＺ４配列に合致する１個のクローン（ＡＳ−５７９−５）を与えた。ＢＣＺ４タンパク質を次いで、この発現ベクターから標準的方法を用いて発現した。
【０１２０】
実施例９
ＢＦＹ３腫瘍抗原
Ａ．ＢＦＹ３配列
ＢＦＹ３配列が、過剰発現された配列として乳癌試料中に検出された。ＢＦＹ３ｗ／ＥｃｏＲＩ末端の、ＨＴＢ１３１総ＲＮＡからの、ＡＳ００７Ｆ（順方向プライマー）５'ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴ ３'（配列番号５９３）およびＡＳ０１０Ｒ（逆方向プライマー）５'ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡ３'（配列番号５９４）を用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１で消化し、および、ＥｃｏＲＩ消化しおよびＣＩＰ処理したｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターへライゲーションによってクローニングした。いくつかの陽性クローンが、制限消化およびＡＳ−３９１−２一致予測ＢＦＹ３配列の配列結果によって特定された。ＢＦＹ３のヌクレオチド配列および推論されるアミノ酸配列を、図１７、配列番号３６（ＢＦＹ３ｃＤＮＡ）、および配列番号３７（ＢＦＹ３アミノ酸配列）に示す。
Ｂ．ＢＦＹ３乳癌抗原に対する免疫試薬
ＢＦＹ３遺伝子産物の範囲にわたる九量体ペプチド１００種類のライブラリが合成された。ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する潜在能力に基づいて選択された。表１５は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する、試験したＢＦＹ３タンパク質に由来する試験した１００種類の九量体ペプチドエピトープを列記する（下記参照）：
【表１５】
【０１２１】
ＡＰ３１で表される、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＢＦＹ３抗原に由来する９量体ペプチドの異なるプール（一覧は表１を参照）を用いてパルスした自家樹状細胞を用いて活性化した。活性化Ｔ細胞を、１２日後に、同一の各ペプチドプールを用いてパルスした自家ＣＤ４０−リガンド活性化Ｂ細胞を用いてさらに８〜１０日間再刺激した。この二次刺激をさらに２回、計４回の刺激を繰り返した。活性化Ｔ細胞を４回目の刺激後に単離し、および示す通り、各ＢＦＹ３ペプチドプールに対するヒトＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。反応性青色の棒はＢＦＹ３ペプチドプールに対する反応性を、および赤色の棒は陰性対照としてＨＬＡ−Ａ２．１−結合ＨＩＶペプチドについて示す。標準偏差を表示する。実験を、異なる回のペプチド刺激からの活性化Ｔ細胞について２回繰り返し、同様の結果を得た（図１８Ａ）。
【０１２２】
ＢＦＹ３ペプチドプールを、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定でデコンボルーションしおよび試験した。ドナーＡＰ１０由来のヒトＴ細胞を、表１５に示すＢＦＹ３ペプチドの異なるプールを用いて刺激した。刺激は、記載した他の抗原について前述した通りに実施した。４回の刺激後、各培養からのＴ細胞を採取し、および、ペプチド各プール中の個々のペプチドを用いてＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。図１８Ｂは、特定の各プールについての個々のペプチド反応性を図解する。
【０１２３】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析に加えて、ＢＦＹ３ペプチドによって活性化されたヒトＴ細胞を反応性について検定した。ペプチドプール当たり１０種類のペプチドから成るペプチドのプール１０個を用いてＣＴＬを作製した。エフェクターのこれらの１０個の群を、対応するペプチドプールを用いてパルスした標的を傷害するのに使用した。プール１、３、５、６、および７に由来するペプチドは認識されたことが見出され、それらのプール中のペプチドはＣＴＬを生じることができることを示した（図１８Ｃ）。これらの１０個のプールから、ペプチド３３４４、３３２０、３３７８、２２７２、および３３８７がＣＴＬによって強く認識された（図１８Ｄ）。「中等度に認識された」ペプチドは、３３６９、３３５５、および３３６２を含んだ（図１８Ｄ）。ＢＦＹ３をトランスフェクションしたＣｏｓＡ２細胞は、プール１および３から生じたＣＴＬによって殺され、これらのプールに由来する処理されおよび提示されたエピトープは免疫的に関係することを示した（図１８Ｅ）。この細胞毒性を担うペプチドは３３２０および３３４４である。表１６はＢＦＹ３ペプチドの特性を要約する。
【表１６】
【０１２４】
Ｃ．ＢＦＹ３発現ベクター
ＢＦＹ３発現ベクターを構築するために、ＡＳ００７Ｆ（順方向プライマー）５' ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴ３'（配列番号５９５）およびＡＳ０１０Ｒ（逆方向プライマー）５' ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡ３'（配列番号５９６）を用いたＨＴＢ１３１総ＲＮＡからのＢＦＹ３ｗ／ＥｃｏＲＩ末端のＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲは標準的方法を用いて実施した。増幅産物はＥｃｏＲＩを用いて消化し、およびＣＩＰ処理ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターへライゲーションによって、標準的方法を用いてクローニングした。いくつかの陽性クローンが、制限消化によって特定されおよび配列決定された。配列決定は、クローンＡＳ−３９１−２の配列が、予想されるＢＦＹ３配列とマッチしたことを示した。ＢＦＹ３タンパク質が次いでＢＦＹ３発現ベクターを用いて標準的方法を用いて発現された。
【０１２５】
実施例１０
複数の腫瘍抗原をコードする発現ベクター
一部の場合には、複数の腫瘍抗原をコードする発現ベクターを構築するのが好ましい可能性がある。抗原の一定の組み合わせが、単一の発現ベクターと組み合わせた場合、単一のベクターで多数の患者の発現プロファイルを包含することがわかっている。たとえば、異なる患者に由来する乳癌試料の１つの試験は、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の７４％の発現プロファイルをカバーし；ＢＣＹ１およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の６５％をカバーし；ＢＣＺ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の６９％をカバーし；ＢＦＹ３およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の６７％をカバーし；ＢＣＹ１、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の７８％をカバーし；ＢＣＺ４、ＢＦＡ４およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の８１％をカバーし；および、ＢＦＹ３、ＢＦＡ４、およびＢＦＡ５の組み合わせが試料の７４％をカバーしたことを示した。したがって、乳癌患者の間で最も一般的な発現プロファイルが単一のベクターを用いて対処されうるように、複数抗原発現構造を構築することができる。そのような複数抗原発現ベクターは、腫瘍抗原配列のそれぞれをコードする核酸を、プロモーターまたは他の転写調節配列の近傍に配置する、標準的なクローニング技術を用いて構築する。発現ベクターは、腫瘍抗原をコードする各ヌクレオチド配列が特異的プロモーターと調節可能に結合するように、または腫瘍抗原が集合的に単一のプロモーターと調節可能に結合しおよび単一の発現単位として発現されうるように、操作することができる。単一の発現単位が構築される場合は、腫瘍抗原配列を発現後に分けるために有用であるヌクレオチド配列を腫瘍抗原配列の間に挿入することができる。有用な配列は、ＩＲＥＳ配列、プロテアーゼ切断部位に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、などを含む。そのような複数抗原発現ベクターを構築するのに適したベクターは、たとえば、ワクシニア、アビポックス、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣといったポックスウイルスを含む。
【０１２６】
本発明は好ましい実施形態に関して説明されている一方、変化および改変を当業者が考えられることが理解される。したがって、請求される本発明の範囲内となるそのような同等の変化のすべてを付属の請求項が包含することが意図される。
【０１２７】
他の実施態様
１．配列番号３４または配列番号３６に示される核酸配列；配列番号３５または配列番号３７に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいはそれらの断片；を含む発現ベクター。
【０１２８】
２．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様１記載の発現ベクター。
【０１２９】
３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様２記載の発現ベクター。
【０１３０】
４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様３記載の発現ベクター。
【０１３１】
５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様４記載の発現ベクター。
【０１３２】
６．少なくとも１つの別の腫瘍関連抗原をさらに含むことを特徴とする実施態様１記載の発現ベクター。
【０１３３】
７．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様６記載の発現ベクター。
【０１３４】
８．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様７記載の発現ベクター。
【０１３５】
９．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様８記載の発現ベクター。
【０１３６】
１０．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様９記載の発現ベクター。
【０１３７】
１１．血管新生関連抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様１記載の発現ベクター。
【０１３８】
１２．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様１１記載の発現ベクター。
【０１３９】
１３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様１２記載の発現ベクター。
【０１４０】
１４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１３記載の発現ベクター。
【０１４１】
１５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１４記載の発現ベクター。
【０１４２】
１６．血管新生関連抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様６記載の発現ベクター。
【０１４３】
１７．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様１６記載の発現ベクター。
【０１４４】
１８．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様１７記載の発現ベクター。
【０１４５】
１９．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１７記載の発現ベクター。
【０１４６】
２０．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１８のポックスウイルス。
【０１４７】
２１．共刺激因子をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様１、６、１１または１６記載の発現ベクター。
【０１４８】
２２．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様２２記載の発現ベクター。
【０１４９】
２３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様２３記載の発現ベクター。
【０１５０】
２４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様２４記載の発現ベクター。
【０１５１】
２５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様１８のポックスウイルス。
【０１５２】
２６．医薬品として許容されるキャリヤーに含まれる発現ベクターを含有する組成物であって、前記ベクターが、配列番号３４または配列番号３６に示される核酸配列；配列番号３５または配列番号３７に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいはそれらの断片を含むことを特徴とする組成物。
【０１５３】
２７．前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様２６記載の組成物。
【０１５４】
２８．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様２７記載の組成物。
【０１５５】
２９．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様２８記載の組成物。
【０１５６】
３０．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様２９記載の組成物。
【０１５７】
３１．配列番号３４または配列番号３６に示される核酸配列；配列番号３５または配列番号３７に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいはそれらの断片；を含む発現ベクターを宿主に投与することを含む、癌を予防または治療する方法。
【０１５８】
３２．前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様３１記載の方法。
【０１５９】
３３．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様３２記載の方法。
【０１６０】
３４．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様３３記載の方法。
【０１６１】
３５．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様３４の方法。
【０１６２】
３６．表１５または１６に示されるＢＦＹ３由来の単離ペプチド。
【０１６３】
３７．表１５または１６に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＦＹ３に対して宿主を免疫する方法。
【０１６４】
３８．表１５または１６に示されるＢＦＹ３由来の単離ペプチド。
【０１６５】
３９．表１５または１６に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＦＹ３に対して宿主を免疫する方法。
【０１６６】
４０．表１３または１４に示されるＢＣＺ４由来の単離ペプチド。
【０１６７】
４１．表１３または１４に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＣＺ４に対して宿主を免疫する方法。
【０１６８】
４２．表１３または１４に示されるＢＣＺ４由来の単離ペプチド。
【０１６９】
４３．表１３または１４に示されるペプチドを、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含み、組み合わせて投与する場合個々の成分は同時にまたは別々に投与される、腫瘍抗原ＢＣＺ４に対して宿主を免疫する方法。
【０１７０】
４４．少なくとも２つの異なる腫瘍抗原またはその断片をコードする少なくとも２つの核酸配列を含み、前記腫瘍抗原がＢＦＡ４、ＢＣＹ１、ＢＦＡ５、ＢＣＺ４およびＢＦＹ３より成る群から選択されることを特徴とする、複数の腫瘍抗原またはその断片の発現のための発現ベクター。
【０１７１】
４５．少なくとも２つの腫瘍抗原またはその断片をコードする少なくとも２つの核酸配列を含み、該核酸配列が配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３６の配列より成る群から選択されることを特徴とする、複数の腫瘍抗原またはその断片の発現のための発現ベクター。
【０１７２】
４６．プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする実施態様４４または４５記載の発現ベクター。
【０１７３】
４７．ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする実施態様４６記載の発現ベクター。
【０１７４】
４８．ウイルスベクターが、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘およびＴＲＯＶＡＣより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様４７記載の発現ベクター。
【０１７５】
４９．ウイルスベクターが、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）より成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする実施態様４８記載の発現ベクター。
【０１７６】
５０．共刺激因子をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする実施態様４４から４９いずれ１項記載の発現ベクター。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３５の配列をコードする発現ベクター。
【請求項２】
配列番号３５の配列が、配列番号３４によりコードされていることを特徴とする請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
配列番号２９、３１および３３よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の発現ベクター。
【請求項４】
配列番号３７の配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
配列番号２９の配列をコードする核酸配列が配列番号２８の配列であり、配列番号３１の配列をコードする核酸配列が配列番号３０の配列であり、配列番号３３の配列をコードする核酸配列が配列番号３２の配列であり、配列番号３５の配列をコードする核酸配列が配列番号３４の配列であり、配列番号３７の配列をコードする核酸配列が配列番号３６の配列であることを特徴とする請求項３または４記載の発現ベクター。
【請求項６】
ヒトＢ７．１をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１−５いずれか１項記載の発現ベクター。
【請求項７】
プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする請求項１−６いずれか１項記載の発現ベクター。
【請求項８】
ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の発現ベクター。
【請求項９】
ポックスウイルスが、ワクシニアまたはＮＹＶＡＣであることを特徴とする請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１０】
ポックスウイルスが、アビポックスウイルスであることを特徴とする請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１１】
アビポックスウイルスが、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
配列番号３５の配列をコードする単離核酸分子。
【請求項１３】
配列番号３４の配列を含む単離核酸分子。
【請求項１４】
配列番号２９、３１および３３よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１２または１３記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
配列番号３７の配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１４記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
配列番号２９の配列をコードする核酸配列が配列番号２８の配列であり、配列番号３１の配列をコードする核酸配列が配列番号３０の配列であり、配列番号３３の配列をコードする核酸配列が配列番号３２の配列であり、配列番号３５の配列をコードする核酸配列が配列番号３４の配列であり、配列番号３７の配列をコードする核酸配列が配列番号３６の配列であることを特徴とする請求項１４または１５記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
医薬的に許容されるキャリヤー中に請求項１−１１いずれか１項記載の発現ベクターまたは請求項１２−１６いずれか１項記載の単離核酸分子を含む組成物。
【請求項１８】
配列番号３８９から４８８のいずれかの配列により表される単離ペプチド。
【請求項１９】
配列番号３９１、３９４、３９５、３９６、３９８、４００、４０１、４０４、４０６、４０８、４０９、４１７、４２９、４３０、４３５、４３６、４３７、４３８、４４０、４４６、４５７、４５８、４６３、４６７、４６８、４７０、４７５、４７６、４７７、４７８、４８６および４８８のいずれか１つにより表される請求項１８記載の単離ペプチド。
【請求項２０】
配列番号３９１、３９５、４０１、４１７、４３０および４６８のいずれか１つにより表される請求項１９記載の単離ペプチド。
【請求項２１】
請求項１８−２０いずれか１項記載の少なくとも１つの単離ペプチド、および医薬的に許容されるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１】
配列番号３５の配列をコードする発現ベクター。
【請求項２】
配列番号３５の配列が、配列番号３４によりコードされていることを特徴とする請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
配列番号２９、３１および３３よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の発現ベクター。
【請求項４】
配列番号３７の配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
配列番号２９の配列をコードする核酸配列が配列番号２８の配列であり、配列番号３１の配列をコードする核酸配列が配列番号３０の配列であり、配列番号３３の配列をコードする核酸配列が配列番号３２の配列であり、配列番号３５の配列をコードする核酸配列が配列番号３４の配列であり、配列番号３７の配列をコードする核酸配列が配列番号３６の配列であることを特徴とする請求項３または４記載の発現ベクター。
【請求項６】
ヒトＢ７．１をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１−５いずれか１項記載の発現ベクター。
【請求項７】
プラスミドまたはウイルスベクターであることを特徴とする請求項１−６いずれか１項記載の発現ベクター。
【請求項８】
ウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の発現ベクター。
【請求項９】
ポックスウイルスが、ワクシニアまたはＮＹＶＡＣであることを特徴とする請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１０】
ポックスウイルスが、アビポックスウイルスであることを特徴とする請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１１】
アビポックスウイルスが、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
配列番号３５の配列をコードする単離核酸分子。
【請求項１３】
配列番号３４の配列を含む単離核酸分子。
【請求項１４】
配列番号２９、３１および３３よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１２または１３記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
配列番号３７の配列をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１４記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
配列番号２９の配列をコードする核酸配列が配列番号２８の配列であり、配列番号３１の配列をコードする核酸配列が配列番号３０の配列であり、配列番号３３の配列をコードする核酸配列が配列番号３２の配列であり、配列番号３５の配列をコードする核酸配列が配列番号３４の配列であり、配列番号３７の配列をコードする核酸配列が配列番号３６の配列であることを特徴とする請求項１４または１５記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
医薬的に許容されるキャリヤー中に請求項１−１１いずれか１項記載の発現ベクターまたは請求項１２−１６いずれか１項記載の単離核酸分子を含む組成物。
【請求項１８】
配列番号３８９から４８８のいずれかの配列により表される単離ペプチド。
【請求項１９】
配列番号３９１、３９４、３９５、３９６、３９８、４００、４０１、４０４、４０６、４０８、４０９、４１７、４２９、４３０、４３５、４３６、４３７、４３８、４４０、４４６、４５７、４５８、４６３、４６７、４６８、４７０、４７５、４７６、４７７、４７８、４８６および４８８のいずれか１つにより表される請求項１８記載の単離ペプチド。
【請求項２０】
配列番号３９１、３９５、４０１、４１７、４３０および４６８のいずれか１つにより表される請求項１９記載の単離ペプチド。
【請求項２１】
請求項１８−２０いずれか１項記載の少なくとも１つの単離ペプチド、および医薬的に許容されるキャリヤーを含む組成物。
【図１Ａ−１】
【図１Ａ−２】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【図１Ａ−２】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【公開番号】特開２０１２−１１０３２８（Ｐ２０１２−１１０３２８Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７７０２６（Ｐ２０１１−２７７０２６）
【出願日】平成２３年１２月１９日（２０１１．１２．１９）
【分割の表示】特願２０１０−２３５４２２（Ｐ２０１０−２３５４２２）の分割
【原出願日】平成１６年５月１５日（２００４．５．１５）
【出願人】（５０３２６３００１）サノフィ パストゥール インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月１９日（２０１１．１２．１９）
【分割の表示】特願２０１０−２３５４２２（Ｐ２０１０−２３５４２２）の分割
【原出願日】平成１６年５月１５日（２００４．５．１５）
【出願人】（５０３２６３００１）サノフィ パストゥール インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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