癌免疫療法のための組成物及び方法
肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む癌療法剤が提供される。一実施形態において、癌標的指向分子は、インビボで癌細胞又は腫瘍を標的とする抗体である。この癌標的指向分子は、ＬＥＣと非共有結合的又は共有結合的に結合される。本発明の癌療法剤は、個体において腫瘍のサイズを減少すること若しくは癌細胞の増殖を阻害することによる、及び／又は転移の発生を阻害することによる、個体における癌の治療のために有用である。ＬＥＣ癌療法剤を使用する治療の有効性は、免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少することによって、及び／又は免疫Ｔ細胞を養子移入することによって増加できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌標的指向分子及び肝発現ケモカイン「ＬＥＣ」を含む癌療法剤、並びに癌の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の本発明の背景の議論は、単に読者が本発明を理解する際に補助するために提供され、本発明の先行技術を記載又は構成することを認めるものではない
【０００３】
外科手術、放射線療法、及び化学療法は、癌（白血病、固形腫瘍、及び転移腫瘍を含む）の治療のために標準的に受容されている手法である。癌を縮小又は根絶するために、身体の免疫系を直接的又は間接的に使用する免疫療法（時折、生物学的療法、生物療法、又は生物学的応答調節剤療法と呼ばれる）は、従来の癌療法に対する補助療法として長年の間試験されてきた。ヒト免疫系は癌療法のための未開発の資源であり、一旦免疫系の成分が適切に利用されるならば有効な治療が開発できると考えられてきた。鍵となる免疫調節分子及び免疫シグナルが同定され、治療試薬として調製されているので、このような試薬の臨床的有効性は周知の癌モデルを使用して試験できる。免疫療法戦略には、ワクチン、活性化細胞、抗体、サイトカイン、ケモカイン、並びに低分子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与、及び遺伝子治療が含まれる（Ｍｏｃｅｌｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００２）５１：５８３−５９５；Ｄｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００２）２０：２８８１−２８９４、２００２）。
【０００４】
サイトカインは、炎症、免疫、分化、細胞分裂、線維症、及び修復に関与する細胞によって産生される細胞外タンパク質メッセンジャー分子である（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．：Ｂｌｏｏｄ（１９９３）８１：１４１４−１４２３）。ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＴＧＦβ、及びＣＤ４０リガンドなどのサイトカインはまた、細胞表面シグナル伝達分子として機能する。他の天然の生物活性分子からサイトカインを区別するサイトカインの特徴は、サイトカインが構成的に産生されるのではなく刺激に応答して生成されることである。サイトカイン遺伝子は高度に誘導性であり、それらのコードするｍＲＮＡレベルは、ＮＦκＢ、ＮＦ−ＡＴ、及びＡＰ−１などの転写因子による調節を受ける（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、「先天的宿主防御及び適応的免疫におけるサイトカインの役割についての序論（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ及びＦｅｌｄｍａｎｎ編、３〜２０頁、２００１））。サイトカイン産生は一般的に数時間から数日間続き、且つ短い行動半径を有する。したがって、サイトカインは、全身的に作用するのではなく、主として隣接細胞に作用する。医薬として全身的に投与される場合、サイトカインは、熱、低血圧、頭痛、倦怠感、及び衰弱を含む複数の徴候を引き起こす深刻な毒性を示す。毒性は、サイトカインを臨床的に適切な投薬量で投与することを困難にする。
【０００５】
癌療法の認可を得た最初のサイトカインはインターロイキン−２（ＩＬ−２）である（Ｒａｏら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５：７０７−７４７）。ＩＬ−２の第１の役割は、Ｔリンパ球の成長及び増殖を刺激することであるが、しかし、これは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、及びマクロファージを含む他の種々の免疫細胞に対して刺激効果を有する（同上）。ＩＬ−２は、腎臓癌及びメラノーマの治療においてある程度の見込みを示したのに対して（Ｓｉｌａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．（１９８６）５：４１１−４２２）、これは、身体の血管に対する損傷（毛細血管漏出症候群）を含む深刻な副作用を有し、これが他の癌に対するこの有用性を制限する。ＩＬ−２の腫瘍内投与は、全身投与よりもいくぶん有効であるが（Ｓｉｌａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．（１９８６）５：４１１−４２２；Ｓｏｎｅら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９４）５１：１７０−１７６）、しかし、腫瘍内投与は播腫性疾患のためには実行可能ではない。
【０００６】
Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｎ．Ａ．：Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９５５）１０２：１５７−７７）によってほぼ５０年前に最初に提示された、腫瘍に対する養子細胞療法の概念は、活性化されたＴ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞の移入を通して癌の撲滅をその目的としている。養子免疫療法は、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が癌患者中に存在するが、このような細胞は初回抗原刺激を受けておらず、且つ／又はその細胞のインビボ機能が損なわれているという信念に基づいている。細胞の初回刺激をするために、末梢Ｔ細胞が患者から取り出され、エキソビボで活性化され、次いで再注入される。エキソビボ活性化の工程はまた、患者の腫瘍細胞又は腫瘍細胞ワクチンへの曝露を含み得る。Ｔ細胞に基づく養子免疫療法は潜在的に見込みのある癌療法の型を提供するが、これは、この治療を受けた患者の大部分において長期間続く応答を誘導することに失敗した（Ｌｕｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００１）２４：４０８−１９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫応答を制御及び誘導することに関しては多くのことが判明したが、癌療法に対するより新しく且つより有効な免疫療法的手法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの態様において、本発明は、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む癌療法剤を提供する。好ましい実施形態において、癌療法剤はＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３ではない。
【０００９】
一実施形態において、癌標的指向分子はインビボで癌細胞又は腫瘍を標的とする抗体である。別の実施形態において、この抗体は腫瘍細胞表面抗原に特異的である。さらに別の実施形態において、この抗体は腫瘍のストローマ成分に特異的である。なおさらに別の実施形態において、この抗体は細胞内抗原、例えば核内抗原に特異的である。後者の場合、抗体は、マウス抗体ＴＮＴ−１、ＴＮＴ−２、ＴＮＴ−３、又はＮＨＳ７６に基づくヒト化抗体又はヒトキメラ抗体であってもよく、ここで抗体はＴＮＴ−３であり、標的指向作用剤はＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３でない。
【００１０】
癌標的指向分子とＬＥＣとの間の連結は、共有結合又は非共有結合を通してであってもよい。癌標的指向分子及びＬＥＣは化学架橋連結によって、又は遺伝子融合を通して（例えば、組換えＤＮＡ技術の適用によって）共有結合で結合できる。後者の手法において、ＬＥＣは、そのＣ末端又はＮ末端から、タンパク質細胞標的指向分子のＮ末端又はＣ末端で融合できる。細胞標的指向分子が抗体である場合、ＬＥＣのＣ末端が、抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端に好ましく融合される。
【００１１】
本発明の癌療法剤は、癌に罹患している個体における癌の治療のために使用できる。したがって、本発明の別の態様は、個体において腫瘍のサイズを減少するか、又は癌細胞の増殖を阻害する方法であって、有効量の本発明の癌療法剤を投与する工程を包含し、ここで癌療法剤は個体の癌細胞又は腫瘍に局在する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、癌に罹患している個体において転移性癌の発生を減少又は阻害する方法であって、有効量の本発明の癌療法剤を個体に投与する工程を包含し、ここで癌療法剤は個体の癌細胞又は腫瘍に局在する。
【００１３】
一実施形態において、本発明の癌療法剤を使用する治療の有効性は、個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少することによって増加し得る。これは、宿主の抗腫瘍免疫応答の抑制を特徴とする免疫調節性Ｔ細胞を、エキソビボで除去又はインビボで枯渇化若しくは不活性化することによって達成できる。一実施形態において、免疫調節性Ｔ細胞は、免疫調節性Ｔ細胞に結合する少なくとも１種の抗体を使用して除去又は枯渇化又は不活性化できる。この抗体はＩＬ−２レセプター、好ましくはＣＤ２５に結合し得る。免疫調節性Ｔ細胞の活性は、本発明の癌療法剤を投与する前、その間、又はその後で個体中で減少させ得る。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の癌療法剤を用いる治療はまた、免疫細胞の養子移入を含み得る。これらの免疫細胞は、好ましくは、エキソビボで活性化できるＴ細胞である。一実施形態において、活性化はＩＬ−２及び／又は抗ＣＤ３抗体への曝露によって達成される。別の実施形態において、エキソビボ活性化は、癌細胞又は癌細胞ワクチンへの曝露によって達成される。免疫細胞の養子移入は、本発明の癌療法剤を投与する前、その間、又はその後に行われ得る。ある実施形態において、養子移入は、個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させることと組み合わせられ得る。この場合において、養子移入は、免疫調節性Ｔ細胞の除去、枯渇化、又は不活性化の後で好ましく行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の１つの態様に従って、「ＬＥＣ」ケモカインに連結された癌標的指向分子を含む癌療法剤が提供される。このような本発明の癌療法剤（すなわち、ＬＥＣ癌療法剤）は本発明に従う癌療法のために有用である。
【００１６】
用語「癌標的指向分子」とは、インビボで癌細胞に局在化する能力を有する分子をいう。語句「個体において癌細胞に局在化する」（すなわち、「インビボ」）とは、作用剤が腫瘍細胞に結合し得ること、又は腫瘍細胞の近傍に結合し得ることを意味する。癌標的指向分子は癌細胞の表面上のレセプター又はリガンドに結合し得るか、又は癌細胞の細胞内標的に結合し得る（その標的が作用剤に接近可能であるという条件で）。細胞内癌細胞標的への接近可能性は、損なわれている原形質膜を有する癌細胞（例えば、アポトーシス、壊死などを受けている細胞など）において生じ得る。例えば、特定の癌標的指向分子は、損なわれた原形質膜を有さない細胞の細胞内部分に結合し得る。例えば、Ｐｏｒｋｋａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２００２）９９（１１）７４４４−９を参照のこと。
【００１７】
癌標的指向分子はまた、腫瘍中に存在する分子に結合し得る。本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、癌細胞、壊死、並びにストローマを含む。ストローマは、線維芽細胞などの細胞並びに血管及び毛細血管の内皮細胞並びに線維性成分及び非線維性成分から構成される細胞外マトリックスを含む。主要な線維性タンパク質はコラーゲン及びエラスチンである。癌標的指向分子は、腫瘍中の癌細胞を取り囲むストローマに結合することによって腫瘍に標的とする。したがって、癌標的指向分子は、線維芽細胞又は内皮細胞又は細胞外マトリックスの成分に結合することによって癌の近傍を標的とし得る。例えば、Ｓｃｈｒａａら、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８３（２）：２４１−５１；Ａｒａｐら、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（２００１）３１補遺１：３０−１を参照のこと。
【００１８】
本発明において有用な癌標的指向分子には、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原に結合する分子が含まれる。用語「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）とは、本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞上に、誕生後の選択された器官における胎児寿命中の正常細胞上に（胎児性癌抗原）、又は正常細胞上ではあるが、腫瘍細胞上よりもはるかに低濃度で存在するタンパク質を指す。ＴＡＡはまた、癌細胞の近傍のストローマ中に存在し得るが、身体の別の箇所のストローマにおいてはより少ない量で発現できる。種々のＴＡＡが記載されており、これにはＢＲＣＡ−１タンパク質及びＢＲＣＡ−２タンパク質、ＨＥＲ−２−ｎｅｕ、ＭＵＣ１などのムチン、インテグリン、サイトカインなどが含まれる。対照的に、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）（別名「腫瘍特異的移植抗原」又はＴＳＴＡ）とは、正常細胞には存在しない、腫瘍細胞発現タンパク質をいう。ＴＳＡは通常、感染性ウイルスが細胞を不死化し、且つウイルス抗原を発現させるときに出現する。例示的なウイルスＴＳＡは、ＨＰＶ１６型のＥ６タンパク質又はＥ７タンパク質である。ウイルスによって誘導されないＴＳＡは、Ｂ細胞リンパ腫上の免疫グロブリンのイディオタイプ又はＴ細胞リンパ腫上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であってもよい。
【００１９】
本発明の方法を使用して治療可能な癌には、癌腫、肉腫、並びに白血病及びリンパ腫、並びに他の型の癌が含まれる。癌腫には、肺、乳房、結腸、卵巣、前立腺などの癌腫が含まれる。これらの癌は原発性又は転移性であってもよい。白血病及びリンパ腫の場合、本発明の方法で治療可能な癌細胞には、腫瘍の形態のもの並びに骨髄中及び循環中の癌細胞が含まれる。
【００２０】
癌標的指向分子には、薬物、有機化合物、ペプチド、ペプチド模倣物などの低分子化合物、並びに糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、糖脂質、リン脂質などの高分子が含まれる。低分子癌標的指向分子は、約５，０００ダルトン以下のサイズであってもよい。癌標的指向分子には、抗新生物剤を含む周知の治療化合物を含まれ得る。抗新生物標的指向分子には、パクリタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシン、カルミノマイシン、４’−エピアドリアマイシン、４−デメトキシ−ダウノマイシン、１１−デオキシダウノルビシン、１３−デオキシダウノルビシン、アドリアマイシン−１４−ベンゾエート、アドリアマイシン−１４−オクタノエート、アドリアマイシン−１４−ナフタレンアセテート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、マイトマイシンＣ、Ｎ−メチルマイトマイシンＣ、ブレオマイシンＡ２、ジデアザテトラヒドロ葉酸、アミノプテリン、メトトレキサート、コルヒチン、及びシスプラチンなどが含まれ得る。癌標的指向分子にはまた、ジフテリア毒素などの毒素、ＣＳＦ、ＧＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦなどのサイトカイン、エリスロポエチン、インターフェロン又はインターロイキンなどの免疫調節物質又はサイトカイン、ニューロペプチド、ＨＧＨ、ＦＳＨ、又はＬＨなどの生殖ホルモン、甲状腺ホルモン、アセチルコリンなどの神経伝達物質、及びエストロゲンレセプターなどのホルモンレセプターが含まれ得る。
【００２１】
癌標的指向分子はタンパク質又はペプチドであってもよい。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミド結合によって連結されたアミノ酸のポリマーをいうために交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、これらの用語はアミノ酸ポリマーに適用され、ここでは１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学アナログである。したがって、タンパク質は、天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸を含み得る。アミノ酸は、ペプチドの結合機能が維持される限り、Ｌ型又はＤ型であってもよい。ペプチドは可変長であってもよいが、一般的には約４から２００アミノ酸長の間である。ペプチドはペプチド内の２つの隣接しないアミノ酸の間の分子内結合、例えば、バックボーンからバックボーン、側鎖からバックボーン、及び側鎖から側鎖の環状化を有して、環状であってもよい。環状ペプチドは当該分野において周知の方法によって調製できる。例えば、米国特許第６，０１３，６２５号を参照のこと。
【００２２】
癌標的指向分子はインテグリンのアンタゴニスト又はアゴニストであってもよい。インテグリンは、細胞接着事象及びシグナル伝達プロセスにおいて機能するヘテロダイマー膜貫通糖タンパク質複合体である。αサブユニット及びβサブユニットを含むインテグリンには、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１β１、α６β４、α４β７、αＤβ２、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＶβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、αｘβ２、αＩＩｂβ３、αＩＥＬｂβ７などを含む多数の型が含まれる。インテグリンαｖβ３は種々の細胞上で発現され、骨基質への破骨細胞の接着、血管平滑筋細胞の移動、及び血管形成を含むいくつかの生物学的に関連する過程を媒介することが示されてきた。インテグリンのための適切な標的指向分子には、ＲＧＤペプチド若しくはペプチド模倣物又は非ＲＧＤペプチド若しくはペプチド模倣物（例えば、米国特許第５，７６７，０７１号及び同第５，７８０，４２６号を参照されたい）が含まれ、α４β１（ＶＬＡ−４）、α４β７（例えば、米国特許第６，３６５，６１９号；Ｃｈａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１２：１５９−１６３（２００２）；Ｌｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１２：１３３−１３６（２００２）を参照のこと）などの他のインテグリンについても同様である。
【００２３】
好ましい癌標的指向分子は抗体である。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、Ｂ細胞の産物である免疫グロブリン及びその改変体、並びにＴ細胞の産物であるＴ細胞レセプター（ＴｃＲ）及びその改変体を含む。免疫グロブリンは、免疫グロブリンκ及びλ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子によって実質的にコードされる１種又は複数のポリペプチドを含むタンパク質である。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、これらは次にはそれぞれ免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを規定する。重鎖のサブクラスもまた公知である。例えば、ヒトにおけるＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスのいずれかであってもよい。
【００２４】
代表的な免疫グロブリンの構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは２つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識の原因である１００から１１０以上までのアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）とは、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれいう。
【００２５】
抗体は、完全長の無傷の抗体として、又は種々のペプチダーゼ若しくは化学物質を用いる消化によって産生される十分に特徴付けられた多数の断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ’）２を産生し、Ｆａｂのダイマーそれ自体が、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合された軽鎖である。Ｆ（ａｂ’）２は穏やかな条件下でヒンジ領域中のジスルフィド結合を開裂させるために還元でき、それによってＦ（ａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに転換する。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂ断片である（他の抗体断片のより詳細な記載については、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。種々の抗体断片が無傷の抗体の消化によって規定されているのに対して、当業者は、種々の抗体断片のいずれもが化学的又は組換えＤＮＡ技術を利用することのいずれかによってデノボ合成できることを認識する。したがって、用語抗体は、本明細書中で使用される場合、抗体全体の改変によって産生されるか若しくはデノボ合成されるかのいずれかの抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法論を使用して得られる抗体及び断片もまた含む。
【００２６】
組換え抗体は、従来の全長抗体、タンパク質分解性消化からの公知の抗体断片、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの独特な抗体断片、ドメイン欠失抗体などであってもよい。抗体は、１アミノ酸又は数アミノ酸までの少ないアミノ酸の欠失又は変異を有するドメイン又はポリペプチドを含み得るが、例えば１つ又は複数のドメインの欠失などのより広範な欠失も可能である。
【００２７】
Ｆｖ抗体は、約５０Ｋｄサイズであり、且つ軽鎖及び重鎖の可変領域を含む。単鎖抗体Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーであり、これは、直接結合されるか又はペプチドをコードするリンカーによって結合されるＶＨ及びＶＬコード配列を含む核酸から発現できる。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３を参照のこと。天然に凝集したが、化学的には分離している抗体Ｖ領域からの軽鎖及び重鎖のポリペプチド鎖をｓｃＦｖ分子に転換するための多数の構造は、抗原結合部位の構造と実質的に類似している三次元構造にフォールディングされる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、及び同第４，９５６，７７８号を参照のこと。
【００２８】
抗体は、非ヒト抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であってもよく、後者はヒト抗体配列及び非ヒト抗体配列を含む。当該分野において知られているように、キメラ抗体は、非ヒト定常領域（重鎖、軽鎖、又は両方）をヒト定常領域抗体と交換することによって調製される。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。マウス抗体などの非ヒト抗体からヒト化抗体を作製する方法もまた周知である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許５，５６５，３３２号を参照のこと）。
【００２９】
癌標的指向分子は、腫瘍の壊死部分中で接近可能な核抗原を標的とする抗体であってもよい。腫瘍壊死治療（ＴＮＴ）としても知られる壊死細胞標的指向（参考文献番号１〜５、７、８）は、腫瘍関連細胞表面抗原に結合する抗体を利用する方法とは異なる手法を表し、且つ腫瘍の各型について異なる抗体の使用を必要とする。ＴＮＴ抗体はすべての細胞において見出される細胞内抗原に結合し、これらの抗原は死滅しつつある細胞によって保持されており、且つ正常組織中にはまれにしか存在しない異常に浸透性である変性中の細胞の存在に起因して、悪性腫瘍において優先的な局在を示す。急速に分裂中の腫瘍はある割合の変性中の細胞又は死滅細胞を含むが、分裂中の細胞を殺傷する試みに注意を集中したので、変性中の成分は大部分無視してきた。腫瘍細胞の消失量の計算は、正常組織とは対照的に、腫瘍細胞分裂の子孫の３０〜８０％がすぐに変性を受けることを明らかにした。腫瘍においては、不完全な血管系及び損なわれた食細胞応答は、変性中の細胞の蓄積を許容し、長い間病理学者達に悪性腫瘍の典型的な特徴と認識されてきた、大きな領域の壊死の形成を伴うことが多い（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８８）４８：５８４２−５８４８）。したがって、腫瘍内での高い割合の死滅しつつある細胞の蓄積は、悪性腫瘍と正常組織の間の主要な区別を構成し、正常組織では、散発性の細胞死が比較的低い比率で起こり、組織からの壊死成分の迅速（数分間以内）且つ秩序立った除去を伴う。変性中の細胞は生存可能な細胞中では観察されない浸透可能な細胞表面膜を有するので、ＴＮＴ抗体は、腫瘍の壊死領域中に入り且つそれらの細胞内抗原に結合する。これとは反対に、腫瘍の生存可能な領域及び正常組織中では拡散したＴＮＴ抗体は結合せずに、通常のクリアランス機構によって除去される。それゆえに、ＴＮＴ抗体は、腫瘍の壊死領域を特異的に標的とするための有用な手法を提供し、腫瘍の中心コア中に深く位置し得るこれらの領域に診断作用剤及び治療作用剤を送達するために使用できる。ＴＮＴ抗体は、他の形態の抗体治療から区別される独特な多数の特色を有する。これらの特性のために、ＴＮＴ抗体は、放射性核種（参考文献番号５、７）、免疫刺激分子（参考文献９〜１１）、及び血管浸透性作用剤（参考文献番号１２〜１５）を癌の治療のために可能にするいくつかの利点を有する。
【００３０】
議論されるように、癌療法用の本発明の組成物はＬＥＣケモカインを含む。ケモカインは小さく（７〜１６ｋＤ）、分泌性の、且つ白血球及び樹状細胞の走化性、ＰＭＮ脱顆粒、並びに血管形成に関与する構造的に関連した可溶性タンパク質である（Ｍａｃｋａｙ ＣＲ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２：９５−１０１；Ｇｅｒａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２：１０８−１１５）。ケモカインは、損傷、アレルゲン、抗原、又は侵入微生物に対する宿主応答の最初の相の間に産生される。ケモカインは、細胞の移動及び活性化の両方を誘導して炎症性病巣に白血球を引き付ける。機能するために、ケモカインは主として損傷又は感染の部位で作られ、それらの小さなサイズのために非常に短い半減期を有する。全身投与が深刻な副作用と関連するので（６）、有効な免疫応答を達成するために腫瘍中のケモカインの高い局所的濃度を得ることは困難である。
【００３１】
ケモカインは、Ｃ末端の近傍のシステイン残基の配置に基づいて、α（Ｃ−Ｘ−Ｃ）、β（Ｃ−Ｃ）及びγ（Ｃ）のサブグループに分類されており、それらのいくつかは鎖内Ｓ−Ｓ架橋の形成に関与する。αケモカインは、それらの４つのシステイン残基のうちの最初と２番目の間に挿入された単一のアミノ酸を有するが、これらのシステインはβグループにおいては分離されない。γケモカインは１対のシステインのみを有する。免疫系におけるそれらの重要な役割に起因して、ケモカインは炎症性疾患及び自己免疫疾患（Ｖａｄｄｉら、ケモカインの事実の本（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｆａｃｔｓ ｂｏｏｋ １９９７））、ＨＩＶ（Ｂａｒｏｕｄｙ ＢＭ．「新規な抗レトロウイルス剤としての、ＨＩＶ−１潜在性を効率的に阻害するＣＣＲ５の低分子アンタゴニスト（Ａ Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＣＣＲ５ ｔｈａｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＨＩＶ−１ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）」７ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、２０００）、並びに癌（Ｍｙａｇｉｓｈｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏ Ｓｃｉ．（１９９５））を治療するために利用されてきた。
【００３２】
ケモカイン作用の機構は、標的細胞上の種々の膜貫通Ｇタンパク質共役レセプターへの最初の結合を含む。ケモカインとこれらのＧタンパク質共役レセプターとの相互作用は、応答する細胞の表面上で、βインテグリンなどの接着タンパク質の迅速な再構成を引き起こし、それらの内皮細胞（ＥＣ）裏層血管壁への接着を容易にする。この接着に続いて、ＥＣ間での組織への白血球の移動が起こる。一旦存在すると、炎症性白血球はケモカインの増加する濃度勾配に沿って元々の部位に移動する。損傷又は微生物侵入の部位でのより高いケモカイン濃度に応答して、白血球は、顆粒内容物の放出及びサイトカイン産生の増加などのエフェクター機能を実行するために活性化される。ＬＥＣはＣＣＲ１及びＣＣＲ８ケモカインレセプターに結合し且つこれらを活性化する。
【００３３】
「肝発現ケモカイン」又は「ＬＥＣ」（ＣＣＬ１６）（ＮＣＣ−４、ＬＭＣ、及びＨＣＣ−４、ＬＣＣ−１、及びモノタクチン−１としても知られる）は、発現配列タグのライブラリーにおいて元々見出され、後に１７ｑ染色体にＣＣケモカインクラスター中でマッピングされた（Ｎａｒｕｓｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９６）３４：２３６−２４０）。ＬＥＣは、健常成体ドナーからの血漿中に比較的高濃度で（０．３−４ｎＭ）存在する。ＬＥＣをコードするヒト遺伝子は約５ｋｂの長さを有し、３つのエキソンを有する。２つの型の転写物（５７９ｂｐ、１５０３ｂｐ）が選択的なポリアデニル化部位を通して生成される。マウスにおけるＬＥＣ遺伝子はイントロンの挿入に起因して、その機能を喪失した偽遺伝子である（同上）。
【００３４】
ヒトＬＥＣをコードするＤＮＡは、ＡＴＧコドンで開始して終止コドン（ＴＧＡ）を含む３６３塩基を含む（図７；配列番号１を参照のこと）。このＤＮＡは、１２０アミノ酸のヒトＬＥＣ前駆体（図８；配列番号２）をコードし、最初の２３アミノ酸は成熟ヒトＬＥＣタンパク質（図８；配列番号３）を産生するために発現の間に切断されるシグナルペプチドを表す。
【００３５】
ＬＥＣはヒト単球及び樹状細胞（ＡＰＣ細胞）の両方に対する強力な走化性因子である（Ｍｏｓｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）２：１２３−１２８；Ｔｈｅｌｅｎ，Ｍ．；Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）２：１２９−１３４）。ＬＥＣは、ケモカインレセプターＣＣＲ１及びＣＣＲ８を通してその活性を媒介する（Ｈｏｗａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ（２０００）９６：８４０−８４５）。ＬＥＣは一貫して結合し、レセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５に比較的低い親和性で結合する（Ｎｏｍｉｙａｍａら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１３（８）：１０２１−９）。ヒト肝細胞は、ＨｅｐＧ２などのヒト肝細胞系と同様に、ＬＥＣを強力に発現する。
【００３６】
ＬＥＣはケモカインの中で独特であり、ＩＬ−１０での細胞の治療後にそのｍＲＮＡレベルを増加及び安定化させる。インビトロ試験は、ＬＥＣが最大の走化性を誘導するために、接着のために必要とするよりもはるかにより高い濃度を必要とすることを示す（同上）。ＬＥＣの潜在的な治療的適用は、Ｇｉｏｖａｒｅｌｌｉら（参考文献番号６）によって試験され、彼らは、ＬＥＣを発現するように操作された哺乳動物癌腫ＴＳＡ細胞が腫瘍の転移性伝播を阻害し、且つマクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、及びＰＭＮの印象的な浸潤並びにＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の産生に起因する腫瘍拒絶を誘導することを示した。ＬＥＣの分泌による腫瘍の拒絶は、ＣＤ８＋リンパ球及び多形核白血球の両方を含む（参考文献番号６）。これらのマウスにおいて、抗腫瘍免疫記憶は、ＴＳＡ腫瘍チャレンジによって示されるように拒絶後迅速に確立された。
【００３７】
用語「ＬＥＣ」とは、本明細書中で使用される場合、ヒトＬＥＣタンパク質配列に実質的に類似であるか、又はその保存性変異を含んだアミノ酸配列を含む。用語「実質的に類似」及び「保存性変異」は、別の生物学的に類似した残基による、アミノ酸残基の置換を示す。保存性変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、若しくはメチオニンなどの疎水性残基での別の残基の代わりの置換、又は１つの極性残基での別の残基の代わりの置換（例えば、リジンの代わりのアルギニンでの置換、アスパラギン酸の代わりのグルタミン酸での置換、若しくはアスパラギンの代わりのグルタミンでの置換など）が含まれる。用語「保存性変異」及び「実質的に類似」はまた、置換ポリペプチドに対して惹起された抗体が非置換ポリペプチドともまた免疫反応するという条件で、非置換の親のアミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含む。
【００３８】
ヒトＬＥＣタンパク質に実質的に類似するＬＥＣタンパク質は、本発明の癌療法組成物中のヒトＬＥＣの代わりに代用できる。実質的に類似のＬＥＣタンパク質は、ネイティブヒトＬＥＣ配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及びより好ましくは９８％の配列同一性（すなわち、相同性）を共有する。ヒトＬＥＣアミノ酸配列に実質的に類似し、且つこの用語が本明細書中で使用される場合に「ＬＥＣ」タンパク質と見なされるタンパク質はまた、ヒトＬＥＣと少なくとも１つの生物学的特性を共有する。ＬＥＣの生物学的特性には、ケモカインレセプターＣＣＲ１若しくはＣＣＲ８への結合、又は単球、リンパ球、若しくはＰＭＮのための化学誘引物質としての機能が含まれる。この点に関して、ＬＥＣはカルシウム動員並びにＣＣＲ１及びＣＣＲ２を介する走化性を誘導する。ＬＥＣはまた、カルシウム動員を誘導するが、ＣＣＲ５を介する走化性はわずかである。
【００３９】
相同性及び同一性は、しばしば配列分析ソフトウェアを使用して測定される（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７０５）。このようなソフトウェアは、種々の欠失、置換、及び他の改変に対して相同性の程度を割り当てることによって類似の配列を一致させる。用語「相同性」及び「同一性」は、２つ又はそれ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈において、任意の数の配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動のアラインメント及び目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって最大の一致のために比較及びアラインされた場合に、同じであるか又は特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列をいう。
【００４０】
配列比較のために、代表的には、１つの配列が参照配列として働き、これに試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列はコンピュータに入力され、必要な場合、サブ配列座標が指定され、さらに配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用できるか、又は代替的なパラメータが指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００４１】
比較のための配列のアラインメントの方法は当該分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は手動のアラインメント及び目視検査によって行われ得る。相同性又は同一性を決定するための他のアルゴリズムには、例えば、上記に加えて以下が含まれる：ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ＡＭＰＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＡＳＳＥＴ（Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ）、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｏｄｅ）、ＢＬＩＭＰＳ（ＢＬｏｃｋｓ ＩＭＰｒｏｖｅｄ Ｓｅａｒｃｈｅｒ）、ＦＡＳＴＡ、Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ＆ Ｐｏｉｎｔｓ、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓアルゴリズム、ＦＮＡＴ（Ｆｏｒｃｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）、Ｆｒａｍｅａｌｉｇｎ、Ｆｒａｍｅｓｅａｒｃｈ、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ（Ｆｒｉｓｔｅｎｓｋｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、ＧＡＰ（Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、ＧｅｎＱｕｅｓｔ、ＩＳＳＣ（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、ＬＡＬＩＧＮ（Ｌｏｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｍｅｎｔ）、ＬＣＰ（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＡＣＡＷ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）、ＭＡＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ（Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｌｔｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＳＡＧＡ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、及びＷＨＡＴ−ＩＦ。このようなアライメントプログラムはまた、実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定するためにゲノムデータベースをスクリーニングするために使用できる。例えば、ヒトゲノム配列の実質的な部分は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）においてＢＬＡＳＴ検索ツールを介する検索のために利用可能である。複数の配列決定されたゲノム及びそれらを分析するための資源に関する情報はまた、ＮＣＢＩから、そのＧｅｎｏｍｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙウェブページ上で利用可能である。
【００４２】
有用なアルゴリズムの１つの例はＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）であり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ ２１５：４０３−４１０においてそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース中の同じ長さのワードと位置合わせしたときにある正の値の閾値スコアＴと一致又は満足するかのいずれかである、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出、１９７７及び１９９０）。これらの最初の隣接ワードのヒットが、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。これらのワードヒットが、累積的なアラインメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方の方向で伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基のペアについてのリワードスコア；常に＞０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大の達成されたスコアから量Ｘ低下するとき；１つ又は複数のネガティブスコア残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが０以下になるとき；又はいずれかの配列の末端に到達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。
【００４３】
ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【００４４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照配列核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満であるならば、核酸が参照配列に類似であると見なされる。
【００４５】
癌療法用の本発明の化合物は、ＬＥＣに連結された癌標的指向分子を含む。癌標的指向分子及びケモカインは、共有結合的又は非共有結合的に連結できる。本明細書中で使用される場合、「連結される」とは、ｐＨ、イオン強度、及び浸透ポテンシャルの生理学的条件下で、存在物が互いに平衡状態で結合されることを意味する。共有結合は種々の化学架橋剤のいずれかによってであってもよく、これには例えば、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性の架橋剤が含まれ、これらの多くは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．を参照のこと）。架橋は、当該分野において周知の種々の化学物質によって達成でき、これは、例えば、活性化ポリエチレングリコール、アルデヒド、イソシアネート、マレイミドなどが含まれる。
【００４６】
癌標的指向分子は、遺伝子融合を通してケモカインに連結でき、そして癌標的指向分子とケモカインの間のポリペプチドリンカー配列を含み得る。リンカーの組成及び長さは、当該分野で周知の方法に従って決定でき、且つ効力について試験できる。このリンカーは、一般的に約３から約１５アミノ酸長、より好ましくは約５から約１０アミノ酸長であるが、しかしより長いリンカー若しくはより短いリンカーが使用できるか、又はそのリンカーは全体的に免除できる。Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーが例示的なリンカーである。さらなる配列もまた、切断部位を組み込むために含まれ得、いくらか後の時点でＬＥＣから癌標的指向分子を分離する。したがって、リンカーは、酵素切断のための基質である配列、例えば、エンドペプチダーゼ認識配列を含み得る。
【００４７】
タンパク質系癌標的指向分子、ＬＥＣ又は標的指向分子−ＬＥＣ融合タンパク質は、当該分野において周知であるように、原核生物細胞又は真核生物細胞におけるなどの組換え発現方法を使用して調製できる（例えば、米国特許第５，１１６，９４３号及び同第６，３３１，４１５号を参照されたい）。一般的に、タンパク質をコードする核酸は、コードされた産物の高収量発現のために発現ベクターにクローニングできる。この発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよいか、又は核酸断片であってもよい。この発現ベクターは、タンパク質をコードする核酸が、プロモーター及び選択的にエンハンサーと作動可能に結合されてクローニングされる発現カセットを含む。この発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又は染色体組み込みエレメント（例えば、レトロウイルスＬＴＲ若しくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲなど）などの他の特徴を含み得る。タンパク質の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、タンパク質の成熟アミノ酸をコードする核酸の上流に配置できる。後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）、又はタンパク質を標識する際に補助するために使用できる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡが、タンパク質をコードする核酸の内部又はその末端に含まれ得る。
【００４８】
ＬＥＣは、標的指向分子及びＬＥＣがそれらの本質的な生物学的活性を保持するという条件で、そのＮ末端又はＣ末端から、タンパク質型癌標的指向分子のＣ末端又はＮ末端に直接的又は間接的に融合できる。ある場合において、ＬＥＣは、好ましくは、そのＣ末端から、タンパク質型癌標的指向分子のＮ末端に融合される。癌標的指向分子が抗体である場合、ＬＥＣは、抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端に融合できる。
【００４９】
タンパク質の組換え発現を複製及び補助するための適切な細胞は当該分野において周知である。このような細胞は、必要に応じて、特定の発現ベクターでトランスフェクト又は形質導入でき、且つベクターを含む大量の細胞を、臨床的適用のために十分な量のタンパク質を得るために大規模ファーメンターに播種するために増殖できる。このような細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの種々の他の真核生物が含んでもよい。これらの系において外来性遺伝子を発現するための標準的な方法論は当該分野において公知である。
【００５０】
本発明の癌療法剤は、癌に罹患した個体において癌の治療のために使用できる。したがって、本発明の別の局面は、個体において腫瘍のサイズを減少するか、又は癌の増殖を阻害する方法であり、この方法は有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含し、ここでこの癌療法剤は個体における癌細胞又は腫瘍に局在する。本発明のさらなる態様は、癌に罹患している個体において転移の発生を阻害する方法であり、この方法は有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含し、ここでこの癌療法剤は個体における転移性癌細胞に局在する。
【００５１】
したがって、本発明の癌療法剤は、個体において腫瘍のサイズを減少させるため、又は癌細胞の増殖を阻害するための医薬の調製において使用され、これは投与のための有効量の医薬を含み、ここでこの癌療法剤は個体における癌細胞又は腫瘍に局在する。１つの態様において、この癌療法剤は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３ではない。本明細書中で使用される場合、用語「ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３」は、ヒト／マウスキメラＴＮＴ−３の重鎖のＮ末端に、特定のペプチドリンカーを介してそのＣ末端に融合された天然のＬＥＣ配列を含む融合タンパク質をいう。この融合タンパク質の調製は実施例３に記載される。
【００５２】
本明細書の癌療法剤を使用する治療の有効性は、個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させることによって増加できる。これは、個体において、免疫調節性Ｔ細胞をエキソビボで除去することによって、又は免疫調節性Ｔ細胞を枯渇化若しくは不活性化することによって達成できる。用語「免疫調節性Ｔ細胞」は、本明細書中で使用される場合、宿主抗腫瘍免疫応答を抑制するように、直接的又は間接的に機能するＴ細胞の集団をいう。免疫調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、又は両方のマーカーにポジティブであってもよい。
【００５３】
免疫調節性Ｔ細胞に関して本明細書中で使用する場合の用語「エキソビボで除去する」とは、免疫調節性Ｔ細胞がエキソビボ方法（例えば、フローサイトメトリー細胞分離、カラム又はフィルター分離など）によって個体の循環系から除去される。カラム又はフィルターは、免疫調節性Ｔ細胞に結合し得る抗体がそこに結合されていてもよい。免疫調節性Ｔ細胞に結合する抗体はまた、フローサイトメトリー装置による除去のためにこのような細胞を同定するために使用できる。免疫調節性Ｔ細胞に結合するために適切な抗体には、ＣＤ４抗原に特異的な抗体、ＩＬ−２レセプターのα鎖サブユニット（すなわちＣＤ２５）などが含まれる。抗Ｔ細胞抗体の組合せもまた使用できる。ＣＤ２５に結合するヒト化モノクローナル抗体であるダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（登録商標）、又は同じ抗体のキメラ型であるバシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（登録商標）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧから市販されている。ＣＤ４に対する完全ヒト化抗体であるＨｕ−Ｍａｘ−ＣＤ４（登録商標）もまた市販されている（ＧｅｎＭａｂ）。
【００５４】
用語「免疫調節性Ｔ細胞をインビボで枯渇化又は不活性化する」とは、本明細書中で使用される場合、宿主への薬剤の投与後に宿主の抗腫瘍免疫応答を抑制する免疫調節性Ｔ細胞の能力の減少をいう。薬剤は、投与されたときに免疫調節性Ｔ細胞の損失（すなわち、枯渇化）又は免疫調節性Ｔ細胞の抗腫瘍免疫抑制機能の不活性化を引き起こすものである。免疫調節性Ｔ細胞を枯渇化又は不活性化することは、上記のように、ＣＤ４抗原に特異的な抗体、ＩＬ−２レセプターのα鎖サブユニット（すなわちＣＤ２５）などの薬剤を投与することによって達成できる。また、γδ免疫調節性Ｔ細胞に対する抗体は、このような細胞を枯渇化するため、及び以前に記載されるように抗腫瘍免疫を刺激するために使用できる。Ｓｅｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：２４２−２４９を参照のこと。抗ＣＤ４０リガンドもまた、免疫調節性Ｔ細胞を枯渇化又は不活性化するために使用できる。
【００５５】
ＣＴＬＡ４Ｉｇなどの部分抗体構築物、ＣＴＬＡ−４の融合タンパク質、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖のＦｃは、ＣＤ２８分子とＢ７分子の間の相互作用を阻止することを介して、完全なＴ細胞活性化のための本質的な同時刺激シグナルを阻害するために使用できる。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、調節性Ｔ細胞をＴ細胞非応答性にする（すなわち、不活性化する）ための医薬として投与できる。Ｐａｒｋら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．（２００３）２０（８）：１２３９−４８を参照のこと。シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素へのＩＬ−２融合物（ＯｎＴａｃ）は、調節性Ｔ細胞を枯渇化又は不活性化するためのなお別の試薬である。
【００５６】
別の手法において、ＣＤ８＋細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）腫瘍アネルギーの誘導を妨害する作用剤が投与できる。アネルギー性抗体などのＣＤ１３７を作動させる作用剤は、それらのコグネイト抗原に再接触する際に、確立されたアネルギー性ＣＴＬの腫瘍細胞溶解性機能を回復させるために使用できる。Ｗｉｌｃｏｘら、Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３：１７７−１８４を参照されたい。この手法は、腫瘍抗原に対するＴ細胞寛容を破壊するために使用できる。
【００５７】
糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子レセプターリガンドをＣＤ４／ＣＤ２５＋免疫調節性Ｔ細胞に対して作動させる作用剤は、これらの細胞（ＧＩＴＲ）の抑制作用を逆転する。Ｔｏｎｅら、ＰＮＡＳ（２００３）１００：１５０５９−１５０６４。
【００５８】
インビボで免疫調節性Ｔ細胞を除去し、枯渇化、又は不活性化する方法は、たとえこの方法が宿主抗腫瘍免疫応答を活性に抑制する免疫調節性Ｔ細胞以外の細胞を除去する場合でも使用できる。免疫調節性Ｔ細胞を除去し、枯渇化、又は不活性化するための労力は、所定の期間の治療の間に複数回実行できる。また、異なる方法が一緒に使用できる（例えば、エキソビボでの細胞除去及びインビボでの枯渇化又は不活性化）。枯渇化又は不活性化のために投与される抗Ｔ細胞抗体の量は、移植分野において使用される量と同様であってもよい。例えば、Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）２７；５８（４）：４１９−２３を参照のこと。抗ＣＤ−４０リガンド。
【００５９】
免疫調節性Ｔ細胞は、本発明の癌療法剤の投与の前、その間、及び／又はその後に枯渇化又は不活性化できる。免疫調節性Ｔ細胞は、好ましくは、本発明の癌療法剤を投与する前に枯渇化される。
【００６０】
さらなる態様において、本発明の癌療法のための方法には、抗腫瘍免疫を増強するための免疫細胞への養子移入が含まれる。本明細書中で使用される場合、「養子移入」とは、別の個体から、又は同じ個体からの免疫細胞の投与をいう。これらは好ましくはＴ細胞であり、これは、エキソビボで活性化でき、抗腫瘍免疫応答を支持する際に機能する能力を増強する。養子移入される免疫細胞は、例えば、ＩＬ−２及び／又は抗ＣＤ３抗体への曝露を含む、種々の周知の作用剤のいずれかによってエキソビボで活性化できる。エキソビボ活性化はまた、癌細胞ワクチンへの曝露を含み得る。このような癌細胞ワクチンは、処置される個体から、又は完全に別の癌からの、生きているか（しかし複製しない）又は殺傷された癌細胞を構成し得る。このワクチンはまた、癌細胞抽出物、又は癌細胞由来の精製されたワクチン調製物であってもよい。癌細胞ワクチンは当該分野において周知であり、周知の方法に従って調製できる。
【００６１】
養子移入されたＴ細胞は、本発明の癌標的指向分子組成物の投与の前、その間、及び／又はその後で投与できる。養子移入されたＴ細胞は、好ましくは、本発明の癌標的指向分子組成物の投与後に与えられる。この型の治療において、患者は、ＩＬ−２（Ｌｕｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００１）２４：４０８−１９）又は他の作用剤（例えば抗ＣＤ３＋抗体及び抗ＣＤ２８＋抗体（Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１）２４（５）：３８９−３９１））を用いるエキソビボ刺激後にＴ細胞の複数注入を受ける。
【００６２】
一部の実施形態においては、本発明の癌療法剤を使用する療法の有効性は、免疫調節性Ｔ細胞のエキソビボでの除去及び／又はインビボでの枯渇化若しくは不活性化の手法を、免疫細胞の養子移入と組み合わせることによって増加できる。このような実施形態において、免疫調節性Ｔ細胞を除去し、枯渇化、又は不活性化する工程の後で養子移入することが有利であってもよい。
【００６３】
本発明の癌療法剤は、薬学的に許容可能な担体とともに処方された作用剤又は医薬として投与できる。したがって、本発明の化合物は、医薬又は薬学的組成物の製造において使用できる。本発明の薬学的組成物は、溶液として又は非経口投与のための凍結乾燥粉末として処方できる。粉末は、使用前に適切な希釈剤又は他の薬学的に許容可能な担体の付加によって再構築できる。液体処方物は、緩衝化された等張の水溶液であってもよい。粉末はまた、乾燥形態でスプレーできる。適切な希釈剤の例は、通常の等張生理食塩水溶液、標準５％デキストロース水溶液、又は緩衝化酢酸ナトリウム若しくは酢酸アンモニウム溶液である。このような処方物は、非経口投与にとってとりわけ適切であるが、経口投与のためにもまた使用でき、又は秤量された用量で吸入のために計量吸入器若しくは噴霧器に含み得る。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの賦形剤を加えることが望ましいこともある。
【００６４】
代替的には、化合物は、経口投与のためのエマルジョン又はシロップ中で、カプセル化、錠剤化、又は調製できる。薬学的に許容可能な固体又は液体の担体は、組成物を増強若しくは安定化するために、組成物の調製を容易にするために加えられ得る。固体担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、石膏、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、又はゼラチンが含まれる。液体担体には、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブオイル、生理食塩水、及び水が含まれる。この担体はまた、単独で又はワックスとともに、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンなどの徐放性物質が含まれ得る。固体担体の量は変化するが、好ましくは、投薬量単位当たり約２０ｍｇから約１ｇの間である。薬学的調製物は、錠剤形態については、粉砕、混合、顆粒化、及び必要な場合は圧縮を、或いは硬質ゼラチンカプセル形態については、粉砕、混合、及び充填を含む従来の製薬技術に従って作製される。液体担体が使用される場合、調製物は、シロップ、エリキシル、エマルジョン、又は水溶性若しくは非水溶性懸濁液の形態であってもよい。直腸投与のために、本発明の化合物は、ココアバター、グリセリン、ゼラチン、又はポリエチレングリコールなどの賦形剤と合わせられ得、且つ坐剤に成形できる。
【００６５】
本発明の化合物は、他の医学的に有用な薬物又は生物学的作用剤を含むように処方できる。この化合物はまた、本発明の化合物が指向される疾患又は状態のために有用である他の薬物又は生物学的作用剤の投与と組み合わせて投与できる。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、語句「有効量」とは、そのレシピエントに有益な効果を付与するための十分に高い濃度を提供するために十分な量をいう。任意の特定の患者にとっての特定の治療有効用量レベルは、治療される障害、障害の重篤度、特定の化合物の活性、投与の経路、化合物のクリアランスの速度、治療の期間、化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物、年齢、体重、性別、食餌、及び被験体の一般的な健康、及び医学分野及び化学分野において周知である同様の要因を含む、種々の要因に依存する。「治療有効量」を決定する際に配慮される種々の一般的考慮は当業者に公知であり、例えば、Ｇｉｌｍａｎら編、グッドマン及びギルマンの治療薬の薬学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９０；並びにレミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０において記載されている。投薬量レベルは、約０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内にあり；約０．０５から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が一般的に適用可能である。化合物は、非経口的に、例えば、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下などで投与できる。投与はまた、経口、鼻腔、直腸、経皮的、又はエアロゾルを介して吸入的であってもよい。本発明の組成物は、ボーラスとして投与してもよく、又はゆっくりと注入してもよい。
【００６７】
治療有効用量は、ＩＣ５０を決定することによって細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。次いで、用量は、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲が得られるように、動物モデル中で処方できる。このような情報が使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定できる。正確な処方、投与の経路、及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択できる。
【００６８】
免疫応答性の個体への本発明の癌療法剤の投与は、癌標的指向分子、ＬＥＣに対する抗体、又は使用される場合、リンカーへの抗体の産生を生じ得る。本発明の癌療法剤の免疫原性を減少させることは、当該分野において周知の方法によって、例えば、癌標的指向分子、ＬＥＣに、又は使用されるリンカーに長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系スペーサーなどを結合させることによって対処できる。長鎖ＰＥＧ及び他のポリマーは、外来性エピトープをマスクするそれらの能力について知られており、外来性エピトープを提示する治療タンパク質の免疫原性の減少を生じる（Ｋａｔｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４４、２０９−２１３；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９８）６８、１−１８）。代替的には、又はさらに、抗体標的指向分子結合体を投与された個体は、シクロスポリンＡ、抗ＣＤ３抗体などの免疫抑制剤を投与できる。
【００６９】
以下の実施例は本発明を例証するために働く。これらの実施例は、いかなる場合においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
標的指向ビヒクルとしてのＴＮＴ抗体
ａ．キメラＴＮＴ−３
ＴＮＴモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用して、腫瘍の壊死領域中に局在する変性中の細胞を介して固形腫瘍を標的とした（１）。この手法は、抗原による免疫調整及びその脱落の問題を回避しながら、多様な起源の癌を標的とするために使用できる。３種のキメラＴＮＴ ＭＡｂが開発された。これらのｃｈＴＮＴ−１、ｃｈＴＮＴ−２、及びｃｈＴＮＴ−３は、それぞれ、ヒストンＤＮＡ複合体、ヘテロクロマチンＤＮＡ、及び一本鎖ＤＮＡからなる核内抗原を標的とする（４、５、Ｋｈａｗｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（２００２）１７：３５９−３７０）。腫瘍保有マウスにおける各ＴＮＴ ＭＡｂの薬物動態及び生体分布特性が提示されている。３種すべてのキメラＴＮＴ ＭＡｂは以前に記載されたように産生された（同上）。
【００７１】
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用してキメラＴＮＴ ＭＡｂの薬物動態クリアランスを決定した。マウスの群（ｎ＝５）に１２５Ｉ−標識したＭＡｂ（３０〜４０μＣｉ／マウス）の腹腔内注射を投与した。ｃｈＴＮＴ−２は、ｃｈＴＮＴ−１（Ｔ１／２＝３０．４時間）及びｃｈＴＮＴ−３（Ｔ１／２＝１３４．２時間）と比較して、最長の循環時間（Ｔ１／２＝１７８．７時間）を示した。１２５Ｉ−標識したキメラＴＮＴ ＭＡｂを固定化Ｒａｊｉ細胞とともにインキュベートし、結合した放射能を使用して、Ｓｃｈａｔｃｈａｒｄ分析によって親和性定数Ｋａを計算する親和性結合試験も行った。ｃｈＴＮＴ−１、ｃｈＴＮＴ−２、及びｃｈＴＮＴ−３の親和性定数は、それぞれ２．５×１０９Ｍ−１、１．２×１０９Ｍ−１、及び１．４×１０９Ｍ−１であった。
【００７２】
これらのＭＡｂの組織生体分布を試験するために、ＭＡＤ１０９マウス肺腺癌腫瘍モデルを使用した。腫瘍を左側腹皮下で５〜７日間増殖させ、その時点で腫瘍は約１ｃｍ直径に達した。各群において、個々のマウスに１００μＣｉ／１０μｇの１２５Ｉ−標識ＭＡｂを含む０．１ｍｌ接種物を腹腔内注射した。表１に示されるように、ｃｈＴＮＴ−１、ｃｈＴＮＴ−２、及びｃｈＴＮＴ−３はインビボで異なる生体分布特性を有し、この腫瘍モデルにおいて良好な取り込みを示した。ｃｈＴＮＴ−２及びｃｈＴＮＴ−３については、％注射用量／ｇはすべての器官においてｃｈＴＮＴ−１についてのそれよりも高い傾向があった。しかし、ｃｈＴＮＴ−１についての腫瘍対血液比は、ｃｈＴＮＴ−２及びｃｈＴＮＴ−３のそれと比較して有意に高かった（筋肉及び腸以外）。これらの結果は、腫瘍保有マウスにおける各キメラＴＮＴ ＭＡｂのインビボ結合特性を実証する。
【００７３】
【表１】
【００７４】
画像処理試験を実行して、１３１Ｉ−標識ｃｈＴＮＴ−３がＭＡＤ１０９腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスに局在することを実証した。１日目及び３日目の画像処理は腫瘍部位における強力なシグナルを示し、このことは、ｃｈＴＮＴ−３が腫瘍内に局在化し且つそこに保持されることが可能であることを示した。
【００７５】
ｂ．ファージディスプレイ由来ヒトＴＮＴ−１ ＭＡｂ ＮＨＳ７６の特徴付け
キメラＴＮＴ−１をヒトＩｇＧ１及びκ定常領域に対してマウス可変領域を遺伝子操作することによって、親のマウス抗体から初めて開発した。キメラ抗体の挙動はマウス抗体のそれと同様であったが、それが共有する３５％の相同性が、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の潜在能力を可能にする。この問題を回避するために、そのマウス対応物に対する同様の結合特性を示した完全なヒトＴＮＴ−１ Ｍａｂ、ＮＨＳ７６を開発した。ＮＨＳ７６は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）との共同作業で開発し、Ｒａｊｉ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞核抽出物を使用するラージｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングすることによって誘導した（Ｓｈａｒｉｆｉら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、（２００１）２０：３０５−３１２）。これは、ＮＳ０マウスミエローマ細胞系において、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｌｏｕｇｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手したグルタミンシンテターゼ発現系を使用して発現した。
【００７６】
ｃｈＴＮＴ−１に対するこの遺伝子操作したヒト対応物が類似の薬物動態特性、インビボの挙動、及び標的指向能力を有することを実証するために、両方の抗体を並行して厳格に試験した。これらの試験のために、ＬＳ１７４Ｔヒト結腸腫瘍保有ヌードマウスにおける生体分布分析を実行し、腫瘍及び正常器官における取り込みのレベルを比較した。さらに、マウス画像処理試験（図２）及びオートラジオグラフ試験（図３）を行って、腫瘍の壊死領域における活発な取り込み、並びに生存可能な組織及び器官における不活発な取り込みを実証した。これらの試験のために、生体分布を、１２５Ｉ−標識ＭＡｂの静脈内注射の１日、２日、３日、５日、及び７日後に実行した。組織１グラム当たりの注射用量パーセントによって示される１〜７日間の組織生体分布並びに腫瘍対正常器官比は、ＮＨＳ７６のより遅い身体クリアランスを示した。しかし、血液レベルが低下するに従って、腫瘍に残存している抗体の量は、７日までに約３％注射用量／グラムまで正常化された。このことは、ｃｈＴＮＴ−１についての３日間の腫瘍保持レベルと比較し得る。また、蛍光スクリーンオートラジオグラフィーは、ＮＨＳ７６がＬＳ１７４Ｔ腫瘍の壊死領域を標的とするのに対して、正常組織は比較的乏しく見えることを示した。これらの試験結果は、ヒト化ＴＮＴ抗体とキメラＴＮＴ抗体の両方の比較し得る性質を確認し、ヒトにおける使用のためにＮＨＳ７６の適切さを実証するための前臨床データを提供する。
【００７７】
（実施例２）
サイトカイン融合タンパク質
ｃｈＴＮＴ−３及びヒトＩＬ−２（参考文献番号１２）、マウスＩＦＮγ（参考文献番号９）、ヒトＩＦＮγ及びＴＮＦα（参考文献番号１０）、並びにｃＨＴＮＴ−３のＣ末端部分に遺伝子工学的に連結されたμＧＭ−ＣＳＦからなるいくつかの融合タンパク質の産生が記載されている。これらの構築、試験、及びこの構築物を用いる免疫療法実験における使用は、以下に手短に記載される。
【００７８】
ａ．ｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質の構築、発現、及び精製
ｃｈＴＮＴ−３（ＩｇＧ１γ）を、以前に記載されたように構築及び発現させた（参考文献番号５）。ＮＨＳ７６（ＩｇＧ１κ）の重鎖及び軽鎖の遺伝子を有するプラスミドを、以前に記載されるように産生した（参考文献番号１０）。候補ｓｃＦｖ抗体を、制限酵素消化、ライゲーション、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む標準的な分子生物学技術を使用して、全抗体に転換した。
【００７９】
ヒトケモカインＬＥＣ遺伝子を、ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞系からＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。次いで、ＬＥＣの成熟ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、そして抗体リーダー配列の翻訳下でＮＨＳ７６重鎖遺伝子のＮ末端に挿入した。次いで、得られる融合遺伝子を発現ベクターｐＥＥ１２に挿入し、次に軽鎖の挿入を行った（図９）。この構築物を、グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅系によってＮＳ０細胞にエレクトロポレーションした。最良の発現クローンを、粗ＤＮＡを抗原として使用する培養上清の間接的ＥＬＩＳＡアッセイによって選択した。
【００８０】
７アミノ酸リンカーペプチドが先行して、ヒトＩＬ−２、ＩＦＮγ、又はＴＮＦα ｃＤＮＡのいずれかを含むＰＣＲ断片を、ヒトγ１末端コドンのすぐ下流に事前に付加されたＮｏｔＩ部位に挿入し、ＴＮＴ−３ ＶＨ／ヒトγ１／ヒトサイトカイン融合遺伝子（参考文献番号９、１０、１２）を産生した。これは、そのＣ末端にヒトＩＬ−２、マウスＩＦＮγ、又はＴＮＦαを有するキメラＴＮＴ−３重鎖からなる融合タンパク質をコードする、発現ベクターｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ ＨＣ／ｈＩＬ−２、ｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ ＨＣ／ｍｕＩＦＮγ、ｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ ＨＣ／ＴＮＦαを生じた。これらの発現ベクターは、キメラＴＮＴ−３軽鎖、ｐＥＥ６／ｃｈＴＮＴ−３軽鎖についての発現ベクターと同時トランスフェクトした。融合タンパク質を、グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅系を使用してＮＳ０マウスミエローマ細胞中で発現させ、８リットルの曝気攪拌タンク培養液から、タンデムプロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【００８１】
キメラ抗体融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実証されるように適切に構築した。ｃｈＴＮＴ−３／ｈＩＬ−２について約２５ｋＤ及び７０ｋＤの２つのバンドに分かれた。これは、その重鎖が約５５ｋＤの見かけの分子量を示したｃｈＴＮＴ−３と比較して、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖とサイトカインとの組合せの分子量に対応する。同様に、ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮγについて２つのバンドに分かれ（ある程度の分解が見られる）、約２５ｋＤ及び７０ｋＤのｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦαは免疫グロブリン軽鎖及び重鎖−サイトカイン融合タンパク質の予想分子量に対応する。ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦ構築物については、成熟μＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ断片を、ｐＥＥ１２発現ベクターのマウスγ２末端コドンのＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩに挿入した。次いで、上記のように、ＰＥＥ１２／ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦを、ｐＥＥ６／ｍｕＴＮＴ−３軽鎖と同時トランスフェクトし、融合タンパク質をＮＳ０マウスミエローマ細胞中で発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２５ＫＤ及び７０ＫＤのおよその分子量を有する２つのバンドを示し、これは、それぞれ、ｍｕＴＮＴ−３軽鎖及び重鎖／サイトカインμＧＭ−ＣＳＦ融合に対応する。
【００８２】
ｂ．ＭＡｂ／サイトカイン融合タンパク質の生物活性
４種の融合タンパク質のサイトカイン部分の各々の生物学的活性を、インビトロアッセイによって決定した。ＩＬ−２生物活性は、ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞の増殖を支持するその能力を試験することによって実証した（Ｇｉｌｌｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７８）１２０：２０２７−２０３１）。異なる濃度のｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２、ｃｈＴＮＴ−３、又は組換えヒトＩＬ−２標準を、２×１０４個のＩＬ−２飢餓ＣＴＬＬ−２細胞とともに２０時間、加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。細胞を、３Ｈ−チミジンで６時間パルス標識し、細胞試料を収集し計数した。次いで、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２の活性を、外挿又はｒＩＬ−２曲線によって、ＩＵ／ｍｇで決定した。
【００８３】
ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質については、μＧＭ−ＣＳＦ部分の生物学的活性は、サイトカイン依存性細胞系ＦＤＣ−Ｐの増殖を支持する能力を測定することによって決定した（Ｄｅｌｔａ−Ｃｒｕｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：５１１２−５１２１）。手短に述べると、５，０００細胞／ウェルのＦＤＣ−Ｐ１を、８ｎｇ／ｍｌから４ｐｇ／ｍｌの濃度範囲のμＧＭ−ＣＳＦ又はｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦの存在下で、９６ウェル培養プレートに３ウェルずつピペッティングした。加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中での４８時間のインキュベーション後、細胞増殖を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して比色定量法によって測定した。このアッセイから、ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦについてのＥＤ５０が０．４から１．０ｎｇ／ｍｌであることが示された。
【００８４】
ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮγ融合タンパク質のｍｕＩＦＮγ部分については、ＲＡＷ ２６４．７マウスマクロファージ細胞における一酸化窒素（ＮＯ）の誘導を決定するためのアッセイを実行した（Ｋｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９６）１９８：２０３−２０９）。細胞を、ｒｍｕＩＦＮ−γ、ｃｈＴＮＴ−３、又はｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γを補充した完全培地中で２４時間増殖させ、次に、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を使用して、ＮＯの安定な分解産物である亜硝酸（ＮＯ２）について上清の分析を行った。この方法によると、ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γ融合タンパク質の比活性は、約４５０Ｕ／μｇであると計算された。ｃｈＴＮＴ−３はこのアッセイにおいて陰性であった。ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γの生物学的活性もまた、ＷＥＨＩ−３マウス骨髄単球細胞系において、フローサイトメトリーを使用してＭＨＣクラスＩＩ分子発現のアップレギュレーションによって測定した。細胞を、組換えｍｕＩＦＮγ、ｃｈＴＮＴ−３、又はｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γを補充した完全培地中で４８時間増殖させ、次いで、フローサイトメトリーによってＭＨＣクラスＩＩ分子発現についてアッセイした。この方法を使用して、融合タンパク質の比活性は４３０Ｕ／μｇ（参考文献番号９）であった。対照的に、ｃｈＴＮＴ−３はＭＨＣクラスＩＩアップレギュレーションを誘導することができなかった。
【００８５】
ｃｈＴＮＴ−３／ｈｕＴＮＦα融合タンパク質について、ＴＮＦα部分の生物学的活性を、以前に記載されたように、Ｈｅｐ−２細胞増殖の阻害パーセントによって決定した（Ｈｏｇａｎ，Ｍ．Ｍ．「腫瘍壊死因子α及びβの測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α ａｎｄ β）」Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．６１０１−６１０５頁、１９９３）。手短に述べると、Ｈｅｐ−２ヒト類表皮癌細胞を９６ウェル培養プレートに、１×１０５細胞／ウェルで、１０％ＦＣＭを含むＭＥＭ中に播種する。このプレートを３７℃で２〜３時間インキュベートし、さらにｒｈｕＴＮＦα又はｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦαを段階希釈でプレートに加えた。最大溶解量を決定するために、２００ｎｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを使用した。ＴＮＦα試料の付加後、プレートを再度３７℃、１８時間インキュベートし、次いでＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で穏やかに洗浄した。細胞死を改変クリスタルバイオレットアッセイによって定量した。この方法において、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα融合タンパク質は１０．８Ｕ／μｇの比活性を有することが見出された。
【００８６】
ｃ．融合タンパク質の免疫反応性及びアビディティー定数
融合タンパク質の免疫反応性を、上記に記載されたように、固定化Ｒａｊｉリンパ腫細胞への結合によって決定した。すべてのｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質は、同様の結合定数（０．５〜１×１０９Ｍ−１）を有することが見出され、ｃｈＴＮＴ−３の結合定数（１．４×１０９Ｍ−１）と比較可能であった。これは、ｃｈＴＮＴ−３の重鎖へのサイトカインの遺伝子連結が抗原結合を有意に妨害しなかったことを示す。
【００８７】
ｄ．薬物動態及び生体分布試験
クリアランス試験及び生体分布試験を、すべての融合タンパク質の薬物動態クリアランスの半減期及び腫瘍の取り込みを決定するために実行した。薬物動態試験のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１２５Ｉ標識した融合タンパク質又は裸の抗体を注射し、注射の時点及びその後の選択された時点での全身活性を微小線量計で測定した。これらの試験結果を図２に示す。クリアランス時間の顕著な違いが、ｍｕＩＦＮγ融合タンパク質と、ＩＬ−２、ＴＮＦα、及びｍｕＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質との間に記録される。ｃｈＴＮＴ−３は、これらの試験において異常に長い半減期を有することが見出された。
【００８８】
【表２】
【００８９】
生体分布的試験のために、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、約１０７個の腫瘍細胞を左側腹に皮下で接種した。５日後、この時点で腫瘍は約０．５〜１ｃｍ直径に達し、マウスに１２５Ｉ−標識抗体又は１２５Ｉ−標識抗体／サイトカインを含む０．１ｍＬ接種物を静脈内注射した。マウスをペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって屠殺し、上記に示すように、注射の３日後及び７日後に血液、腫瘍、及び選択された器官を取り出し、秤量した。表２に要約されたこれらの試験の結果は、融合タンパク質の迅速なクリアランスの薬物動態効果が、ｃｈＴＮＴ−３及びｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γの腫瘍及び正常器官の生体分布が比較された場合に明らかであったことを示す。すべての融合タンパク質の方が、腫瘍の取り込みは、注射の３日後及び７日後の両方でｃｈＴＮＴ−３について見られたものよりも有意に低かった。しかし、正常な器官の取り込みを反映し且つサイトカインに起因する可能性のある毒性の指標を適用する腫瘍対器官比は、同等か、又はすべての融合タンパク質の方が、わずかに高い程でさえあった。
【００９０】
要約すると、上記のインビトロによる特性決定試験は、すべての融合タンパク質が、抗原に対するそれらの結合親和性、並びにそれらの直接的な細胞傷害性効果及び免疫調節性機能を維持することが可能であったことを実証する。インビボでは、融合タンパク質は、親のｃｈＴＮＴ−３よりも実質的に短い全身半減期を有すことが見出されたが、生体分布分析によって示されるように、腫瘍を標的とすることができた。腫瘍中でのそれらの保持及び正常組織からの迅速なクリアランスのために、この融合タンパク質は、ｃｈＴＮＴ−３と等価か又はそれよりも高い正常組織／腫瘍比を有することが見出された。
【００９１】
（実施例３）
ケモカイン融合タンパク質
ａ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の構築、発現、及び精製
ｃｈＴＮＴ−３（ＩｇＧ１κ）の軽鎖遺伝子（ｐＥＥ６／ｈＣＭＶ−ＬＣ）及び重鎖遺伝子（ｐＥＥ１２／ＨＣ）を有するプラスミドを、以前に記載されたように産生した（５、１２）。ヒトケモカインＬＥＣ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）３１、１２４７−１２５４）によってＨｅｐＧ２肝臓癌細胞系から、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してクローニングし、全ＲＮＡを得た。次いで、ＬＥＣの成熟ｃＤＮＡを、プライマー５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号４）及び５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧ−ＧＧＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号５）を使用するＰＣＲによって増幅し、抗体のリーダー配列の翻訳下で、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩによって、ｃｈＴＮＴ−３の重鎖遺伝子のＮ末端に挿入した。次いで、得られる融合遺伝子を発現ベクターｐＥＥ１２に挿入し、グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅系によって規定されるように、エレクトロポレーションによって、ＮＳ０細胞にｐＥＥ６／ＴＮＴ−３軽鎖とともに同時トランスフェクションした。細胞培養培地をトランスフェクションの３週間後に毎週交換し、この時点で最良の発現クローンは、以前に記載されたように（参考文献番号５）、抗原として粗ＤＮＡを使用する培養上清の間接的ＥＬＩＳＡアッセイによって選択した。大量の融合タンパク質を産生するために、高発現クローンを８リットルの曝気攪拌フラスコ中で、５％熱不活化（６８℃で１時間、断続的に攪拌しながら）透析ウシ胎児血清を含む選択培地中で増殖させ、インキュベーション及び融合タンパク質の分解の間にＮＳ０細胞によるタンパク質分解性酵素の誘導を除去した。次いで、分泌された融合タンパク質を、タンデムプロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーの手順によって、清澄化細胞培養上清から精製した。融合タンパク質の純度は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって、及び溶媒系として０．０５Ｍリン酸緩衝液及び０．４Ｍ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．１を使用するＨＰＬＣによって調べた。精製後、融合タンパク質を０．２２μｍ Ｎａｌｇｅｎｅ使い捨てフィルターユニットを通して濾過し、分注し、１０ｍｌ滅菌チューブ中で、長期保存のために−２０℃で保存した。
【００９２】
ＬＥＣ遺伝子のＣ末端は、５アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーを使用してｃｈＴＮＴ−３の重鎖遺伝子のＮ末端に融合した。融合したＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の重鎖（図１）を抗体リーダーの下で翻訳させ、発現した融合タンパク質は以下に示されるようにその生物学的活性を保持していることが見出された。最高のＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３産生サブクローンは、静置培養において約２０μｇ／ｍｌ／１０６細胞／２４時間を分泌した。分子量及び融合タンパク質のアセンブリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実証した。これは、キメラ免疫グロブリン重鎖及びＬＥＣの合計、並びに抗体軽鎖にそれぞれ対応する、約６７ｋＤ及び２５ｋＤの２つのバンドを示した。構築物の純度をＨＰＬＣによって確認し、これは、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３が約４４２ｓの保持時間の主ピークを有することを示した。これらの分析は、融合タンパク質が−２０℃、６カ月間までの保存後でさえ完全なままであることを示した。
【００９３】
ｂ．走化性アッセイ
ＬＥＣ融合タンパク質の生物活性は、９６ウェル微小走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）において製造業者のプロトコールにおいて記載されるように標的細胞の移動を測定することによって実証された。手短に述べると、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３、組換えヒトＬＥＣ、又は親のｃｈＴＮＴ−３を、結合培地（１％ＢＳＡ及び２５ｎｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０）中で０．３９ｎＭから５０ｎＭまで段階希釈した（Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｂｌｏｏｄ（１９９８）９１：４２４２−４２４７；Ｚａｃｈ−Ｈｏｗａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ（２０００）９６：８４０−８４５）。この溶液を微小走化性装置の下側のチャンバー中に配置した。次いで、１０５ＴＨＰ−１ヒト単球細胞を含む１００μＬの結合培地を上側のチャンバーに加えて、加湿した５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター中での１．５時間のインキュベーション後、移動した細胞のパーセンテージを計算して、移動指数（（結合培地に曝露された細胞の平均数）で除算した（ケモカイン及び融合タンパク質に曝露された細胞の平均数））を決定した。すべてのアッセイは３重に実行した。
【００９４】
遊離のヒト組換えＬＥＣ及び融合タンパク質はＴＨＰ−１細胞移動を誘導した。融合タンパク質に曝露されたＴＨＰ−１細胞の移動は、１．６ｎＭまで低い濃度で開始し１２．５ｎＭでピークに達する、用量依存性であった。遊離のヒト組換えＬＥＣは、このアッセイにおいて約２５ｎＭの高濃度でピークとなった。親の抗体（ｃｈＴＮＴ−３）に曝露されたＴＨＰ−１細胞はまったく移動を示さず、融合タンパク質のＬＥＣ部分の生物学的活性を確証した。
【００９５】
ｃ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の放射性標識及び放射性結合体の安定性
１２５Ｉ−標識された融合タンパク質を、以前に記載されたように（５、７）、改変クロラミン−Ｔ法を使用して調製した。手短に述べると、１ｍＣｉ（３７ＭＢｑ）の放射性ヨード及び２０μＬのクロラミン−Ｔの水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬ ＰＢＳ中の１００μｇ ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を含む５ｍＬ試験管に加えた。２分後、２０μＬのメタ重亜硫酸ナトリウムで溶液をクエンチした。各反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用して精製し、代表的には９０〜９５％収率を回収した。放射性標識された抗体を注射のためにＰＢＳで希釈し、４℃で保存し、そして放射性標識後２時間以内に投与した。放射性ヨード標識された抗体を、シリカゲル含浸させたグラスファイバーからなる分析用インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）システム（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。細片（２×２０ｃｍ）を、使用前の１１０℃、１５分間の加熱によって活性化し、１μＬの試料をスポットし、風乾し、そしてメタノール／Ｈ２Ｏ（８０：２０）を用いて約１０ｃｍ溶離させ、再度風乾し、半分に切断し、そして結合したタンパク質及び遊離の放射性ヨードを決定するために計数した。ＩＴＬＣ分析は、０のＲｆ値（ＭＡｂ結合）及び９９％より高い放射性化学物質の純度を明らかにした。インビトロ血清安定性もまた、以前に記載されたように評価した（５）。手短に述べると、放射性標識されたＭＡｂをマウス血清中で３７℃、４８時間インキュベートする。トリクロロ酢酸沈殿及び遠心分離後、ＭＡｂ結合放射能をγカウンターで測定した。約９５％の活性がトリクロロ酢酸沈殿であり、この時間の間では放射性ヨードの放出は実質的に検出されなかった。
【００９６】
ｄ．アビディティー決定
精製ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３のアビディティー定数を決定するために、固定化細胞ラジオイムノアッセイを、以前に記載されたように実行した（１２）。手短に述べると、Ｒａｊｉリンパ腫細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＥＭグレード２％パラホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）で室温で１０分間固定し、そしてＰＢＳで再度洗浄し、その後０．２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で４℃にて保存した。１０から１１０ｎｇの１２５Ｉ−標識ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を、１０６固定化Ｒａｊｉ細胞と室温で１時間インキュベートした。この細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄して、いかなる未結合の抗体をも除去し、γカウンターで計数した。結合した融合タンパク質の量を、残存する結合した細胞の放射能（ｃｐｍ）及び融合タンパク質の比活性から決定した。データのＳｃａｔｃｈａｒｄプロット分析を使用して傾きを得た。この傾きから、平衡又はアビディティー定数Ｋが、式Ｋ＝−（傾き／ｎ）によって計算された。ここで、ｎは抗体の価数（ＩｇＧについては２）である。ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３は、ｃｈＴＮＴ−３（１．４×１０９Ｍ−１）と同様の結合定数（１．０×１０９Ｍ−１）を有することが見出された（５）。これは、ｃｈＴＮＴ−３の重鎖の可変領域へのＬＥＣの遺伝子連結が抗原結合を有意に妨害しなかったことを示す。
【００９７】
ｅ．薬物動態試験及び生体分布試験
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の薬物動態クリアランスを決定した。遊離の放射性ヨードの甲状腺の取り込みをブロックするために事前に２〜３日間、飲用水中にヨードカリウムを与えたマウスの群（ｎ＝５）に、０．１ｍＬ接種物を使用して、１２５Ｉ−標識融合タンパク質（３０〜４０μＣｉ／マウス）の静脈内注射を投与した。注射の時点及び注射後の選択された時点での全身活性を、ＣＲＣ−７微小線量計で測定した。データを分析し、ＰＳＴＲＩＰ薬物動態プログラム（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ）によって半減期を決定した。結果を平均±標準偏差として表現し、有意なレベル（Ｐ値）を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して決定した。これらの試験から、１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３が３時間±２０分（ｐ≦０．０１）のＴ１／２を有することが見出されたことが決定された。
【００９８】
腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の生体分布を決定するために使用した。手短に述べると、マウスに１０７ＭＡＤ１０９ｓｃを含む０．２ｍｌを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ−認可プロトコールを使用して左側腹に注射した。腫瘍を５日間、それらが直径約０．５ｃｍに達するまで増殖させた。次いで、マウスに１００μＣｉ／１０μｇの１２５Ｉ−標識ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を含む０．１ｍＬ接種物を静脈内注射した。マウスをペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって注射の３時間後、６時間後、１２時間後、及び２４時間後に屠殺し、そして器官、血液、及び腫瘍を取り出し、且つ秤量し、試料中の放射能をγカウンター中で測定した。各マウスについて、データはパーセント注射用量／グラム（％ＩＤ／ｇ）及び腫瘍対器官比として表現した。１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３は、注射後１２時間及び２４時間の両方で、２．４％ＩＤ／ｇ（ｐ≦０．０１）の腫瘍取り込みを実証した。１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の迅速なクリアランスはまた、すべての時点における血液及び他の正常組織の大部分での放射能レベルの減少を示し（ｐ≦０．０１）、高い腫瘍対器官比を生じた。これらのデータは、放射標識されたＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３が、腫瘍部位において優秀な保持を伴って腫瘍に特異的に結合することを実証する。
【００９９】
（実施例４）
免疫療法試験
ａ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝７）に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ−認可プロトコールの下で、約１０７のＭＡＤ１０９細胞、Ｃｏｌｏｎ２６細胞、又はＲＥＮＣＡ細胞を含む０．２ｍＬ接種物を左側腹に皮下注射した。腫瘍を５〜７日間、それらが直径約０．５ｃｍに達するまで増殖させた。次いで、腫瘍保有マウスの群を、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３（２０μｇ）、ＰＢＳ、又はｃｈＴＮＴ−３（２０μｇ）を伴う、０．１ｍＬ接種物で静脈内治療した。すべての群を１日５回治療し、１日おきに三次元のキャリパー測定によって腫瘍増殖をモニターした。腫瘍体積は式：長さ×幅×高さによって計算された。結果を平均±標準偏差として表現し有意なレベル（Ｐ値）を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して決定した。
【０１００】
一旦腫瘍が確立されると、マウスを毎日５回、２０μｇのＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３で治療した。図２に示されるように、２つのモデルについて、本試験の１９日目までのＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療は、未知量の対照と比較して、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルにおいて５５％（ｐ≦０．０５）の腫瘍増殖の減少、ＭＡＤ１０９腫瘍モデルにおける３７％（ｐ≦０．０５）の減少、及びＲＥＮＣＡ腫瘍モデルにおける４２％（ｐ≦０．０５）の減少を示した。
【０１０１】
ｂ．サイトカイン融合タンパク質との併用療法
ｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質を、ＣＯＬＯＮ２６結腸腺癌、ＭＡＤ１０９肺腺癌、及び以下の図３において示されるように、ＲＥＮＣＡ腎臓細胞癌を含むＢＡＬＢ／ｃマウスの異なる固形腫瘍モデルにおいて試験した。これらの試験のために、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、左側腹に５×１０６腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍を５〜７日間、それらが直径約０．５ｃｍ（０．２ｃｍ３）に達するまで増殖させ、マウスを群に分け（ｎ＝５）、４日間連続して毎日皮下注射した。次いで、腫瘍の増殖を、キャリパー測定によって１日おきに１７日目まで追跡し、そこで実験を終了した。０．１ｍｌ接種物中の融合タンパク質の用量は、ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＧＭ−ＣＳＦがより毒性であり５μｇ／用量の使用を必要とする以外は、２０μｇであった。融合タンパク質の組み合わせた使用される場合、これらは０．１ｍｌで接種物を維持するためにあらかじめ混合された。対照群は生理食塩水のみ又は２０μｇのｃｈＴＮＴ−３を受容し、これは、３つの腫瘍モデルの増殖曲線に効果がなかった。４つの個々の実験からの対照群の試験は、増殖曲線が非常に再現性が高いことを示した。図３に示される３つの腫瘍モデルにおけるこれらの実験の結果は、これらのモデルのうちの２つにおいて、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα、及びｃｈＴＮＴ−３／ＩＦＮγの組合せを受容するマウスが、大部分の腫瘍退行を示し、これは１７日目で対照群の約８０％であると見積もられることを実証した。個々の融合タンパク質はこれらの腫瘍モデルにおいて様々な有効性の程度を有したが、この組合せ、又はｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦαの代わりにｍｕＴＮＴ−３／ｍｕＧＭ−ＣＳＦが置換されたものが最も有効であった。キメラ抗体はこれらの融合タンパク質のいくつかの構築において使用されたので、治療は１回の４日間の期間に限定された。この限定のために、腫瘍は、処置の中断の直後に対照群のペースと同じペースで増殖し始めた。それゆえに、これらの処置治療効果は一過性であり、より持続する効果及び腫瘍の完全な退行のためには第２又は第３の処置過程の追加が必要と思われる。
【０１０２】
ｃ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３、ｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質を用いる併用療法
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、約５×１０６ＭＡＤ１０９マウス肺腺癌細胞を皮下接種した。５日後、腫瘍が直径約０．５ｃｍに達し、マウスに、２０μｇのＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３単独、又は２０μｇのＴＮＴ−３／ＩＦＮγ、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα、ｃｈＴＮＴ−３／ＧＭ−ＣＳＦ若しくはｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２を伴う、０．１ｍｌの接種物を注射した。すべての群を１日５回治療し、１日おきに三次元のキャリパー測定によって腫瘍増殖をモニターした。腫瘍体積は式：長さ×幅×高さによって計算された。結果を平均±標準偏差として表現した。図４において示されるように、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３及び４種のｃｈＴＮＴ−３サイトカイン融合タンパク質の各々を用いる併用療法は最小限の改善のみを生じたが、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２を含む組合せは１７日までに増殖曲線の平板化を示した。
【０１０３】
（実施例５）
ａ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の免疫組織化学及び組織試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、上記のように左側腹に１０７腫瘍細胞を注射した。腫瘍移植の７日後、マウスを、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３（２０μｇ）、ＰＢＳ、又はＴＮＴ−３（２０μｇ）を用いて、１日５回静脈内治療した。次いで、各群からのマウスを、腫瘍移植の１０日後、１２日後、１４日後、及び１６日後に屠殺し、腫瘍を切除し、そしてパラフィン包埋のために１０％中性緩衝化ホルマリン（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）中に固定するか、又は凍結切片のためにＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｌａｂ−Ｔｅｋ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＩＩ）中で液体窒素中で急速冷凍するかのいずれかであった。ＭＡＤ１０９腫瘍保有マウスからのパラフィン包埋切片を、形態学的試験のために、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫組織化学試験のために、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍保有マウスからの腫瘍の凍結切片を、リンパ、ＰＭＮ、及び樹状細胞亜集団を染色するための、ビオチン化抗ＣＤ４＋、抗ＣＤ８＋、抗ＣＤ１１ｂ＋、抗汎内皮、抗ＣＤ１１ｃ＋、抗ＣＤ１９＋、抗ＣＤ３ｅ＋、及び抗４５Ｒ＋（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）抗血清で染色した。次いで切片をＨＲＰ−結合体化ストレプトアビジンとともにインキュベートし、比色定量用作用剤で発色させ、その後ｈｒ ＆ Ｅで染色した。顕微鏡による知見を、Ｏｐｔｒｏｎｉｘデジタルカメラを使用して記録した。
【０１０４】
ケモカインの抗癌活性は、樹状細胞、ＰＭＮ、及びリンパ球亜集団の腫瘍への補充、並びにそれらの抗血管形成活性のためである。それゆえに、どの亜集団がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の抗腫瘍活性の原因であったかを同定することは興味深い。このことを達成するために、組織学的試験及び免疫組織化学試験を、治療したマウスから取り出した腫瘍切片上で実行した。驚くべきことに、形態学的試験は、ＬＥＣ／ｃｇＴＮＴ−３治療が、試験された腫瘍試料中で顕著な壊死及び血管のうっ血を誘導することを明らかにした。
【０１０５】
しかし、治療されたマウス及び対照マウスにおける血管の数は、汎内皮抗体を用いる免疫組織化学染色によって決定されるように、異なっていないことが見出された。ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療腫瘍はまた、これらの切片においてリンパ球の顕著な浸潤を示した。Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、及びＰＭＮ特異的抗体を用いる組織切片の免疫組織化学染色は、腫瘍に浸潤している亜集団の存在を同定するために使用された。これらの試験のために、Ｃｏｌｏｎ２６保有ＢＡＬＢ／ｃマウスからの凍結切片を、治療の完了の４日後に（腫瘍移植の１６日後に）免疫組織化学染色のために調製した。これらの試験の結果は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療腫瘍において、ＰＭＮ、樹状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の浸潤が未治療群よりも高いことを明らかにした。より早い時点で取り出した腫瘍は、樹状細胞及びマクロファージの浸潤が、治療３日目までに最初に観察され、治療の完了の４日後まで腫瘍中に保持されることを示した。対照的に、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）浸潤（１５〜２０細胞／４００倍視野）は、樹状細胞について見られたものほど劇的ではなく、且つ治療の完了の２日後に最初に見られた。ＰＭＮ及び樹状細胞による浸潤は、これらの試験においておそらく最も劇的な知見であった。
【０１０６】
ｂ．枯渇化試験
これらの腫瘍モデルの抑制のために部分的な原因であるＴ細胞の亜集団を評価するために、枯渇化試験を、上記の治療試験とともに実行した。マウスの群に、上記のようにＣｏｌｏｎ２６結腸癌を移植し、腫瘍が直径０．５ｃｍに達すると、これらは５日毎に、ＣＤ４＋（０．５ｍｇ／用量、クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８＋（０．５ｍｇ／用量、クローンＨ３５）、又はＮＫ細胞（０．３５ｍｇ／用量、抗−アシアロ−ＧＭ）に特異的な細胞傷害性抗血清を受容し、ＦＡＣＳ分析によって示されるように、これらの各々のＴ細胞亜集団の各々を末梢循環中で＜２％まで減少した。特定の亜集団がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３免疫療法のための道具であるならば、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３によって誘導される観察される腫瘍抑制が妨害され、腫瘍は対照治療マウスと同様の増殖曲線を有する。図５に示されるように、これらの抗血清各々単独による枯渇化は、ｃｈＴＮＴ−３治療対照の腫瘍の増殖から、その腫瘍の増殖を変化しなかった。対照的に、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療マウスは、５０％より高い阻害を示した。予測されるように、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療と組み合わせたＣＤ８＋及びＮＫ枯渇化治療は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の抗腫瘍活性を無効にし、このことは、これらのリンパ球亜集団がＬＥＣ機能において非常に重要であることを示す。対照的に、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療と組み合わせたＣＤ４＋枯渇化を受けるマウスは完全な治癒に至り、予想外であり且つ潜在的に非常に意味のある知見である。
【０１０７】
ＣＤ４＋集団の約１０％を表すＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＬＥＣ／ｃｈＴＢＴ−３と組み合わせて使用される場合に、等しく印象的な結果を生じ得るか否かを決定するために、さらなる枯渇化試験が次に実行された。以下の図６に示されるように、ＬＥＣ／ｃｈＴＢＴ−３の使用の前のラットモノクローナル抗体ＰＣ６１を使用するこれらのＴ細胞の枯渇化は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣｏｌｏｎ２６腫瘍増殖に対して高度に免疫抑制性であり、これは、このＴ免疫調節性細胞の小さな集団が、免疫療法の間の免疫反応の抑制原因であることを実証した。これらのすべての実験において、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３免疫療法は完全に非毒性であることが見出され、このことは、これらの実験においてある程度の毒性型を実証した、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα、及びｍｕＴＮＡ−３／ｍｕＧＭ−ＣＳＦの使用に対して顕著な対比をなすことが注目されるべきである。驚くべきことに、ＰＣ６１が、対照ｃｈＴＮＴ−３と組み合わせてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇化するために使用されたときに、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３単独とほぼ同程度の腫瘍増殖の印象的な減少を示した。しかし、これらの治療群の両方が、それらの移植された腫瘍のマウスを治癒しなかった。完全な且つ持続する寛解は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞枯渇化がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３と組み合わせて実行されるまで得られなかった。
【０１０８】
参考文献リスト：
１．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．、Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｍ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．：ヒト癌における壊死性損傷の検出のための新規な方法（Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ）。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５：５８４２−５８４８、１９８８。
２．Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｍ、Ｈａｎｓｅｎ，Ｅ．Ｂ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ Ａ．Ｌ．：多核性腫瘍スフェロイドにおけるモノクローナル抗体ＴＮＴ−１の拡散及び結合（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｉｔｉｂｏｄｙ ＴＮＴ−１ ｉｎ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８３：２００−２０４、１９９１。
３．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．、Ｃｈｅｎ，Ｄ．、Ａｎｓａｒｉ，Ａ．、Ｎａｊａｆｉ，Ａ．、Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．、Ｌｅｅ，Ｋ．、Ｈｕ，Ｅ．、Ｒｏｓｅｎ，Ｐ．、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｋ．、Ｓｔａｉｎ，Ｓ．、Ｗｅａｖｅｒ，Ｆ．、及びＴａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．：Ｉ−１３１標識ＴＮＴ−１ Ｆ（ａｂ’）２モノクローナル抗体を使用する、ヒト腫瘍における壊死性損傷における放射免疫検出（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｉ−１３１ ｌａｂｅｌｅｄ ＴＮＴ−１ Ｆ（ａｂ’）２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ，＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、４：１５１−１６１、１９９１。
４．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．、Ｎａｅｖｅ，Ｇ．Ｓ．、Ｇａｆｆａｒ，Ｓ．Ａ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：ＴＮＴ−１及びＴＮＴ−２モノクローナル抗体のヒストンに対する結合の免疫学的及び生化学的分析（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＮＴ−１ ａｎｄ ＴＮＴ−２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅｓ）。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６８９−６９８、１９９３。
５．Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｂｉｏｌａ，Ｂ．Ｈ．、Ｙｎｎ，Ａ．、Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：ｃｈＴＮＴ−３／Ｂ、固形腫瘍の腫瘍壊死治療のためのＤＮＡを指向する、新規に化学修飾されたキメラモノクローナル抗体（ｃｈＴＮＴ−３／Ｂ，ａ ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＤＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）。Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １３：２５５−２６８、１９９８。
６．Ｇｉｏｖａｒｅｌｌｉ Ｍ、Ｃａｐｐｅｌｌｏ Ｐ、Ｆｏｒｎｉ Ｇ、Ｓａｌｃｅｄｏ ＴＭ、Ｐａｕｌ Ａ．、ＬｅＦｌｅｕｒ ＤＷ、Ｎａｒｄｅｌｌｉ Ｂ、Ｃａｒｌｏ ＥＤ、Ｌｏｌｌｉｎｉ Ｐ−Ｌ、Ｒｕｂｅｎ Ｓ、Ｕｌｌｒｉｃｈ Ｓ、Ｇａｒｏｔｔａ Ｇ、Ｍｕｓｉａｎｉ Ｐ。局所的放出されるＬＥＣケモカインによって誘発される腫瘍拒絶及び免疫記憶はＡＰＣ、リンパ球、及び顆粒球の印象的補充と関連する（Ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｍｏｒｙ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｌｏｃａｌｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｄ ＬＥＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｉｍｐｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｃｒｕｉｔｅｅｎｔ ｏｆ ＡＰＣｓ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３２００−３２０６、２０００。
７．Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｉｎｇ，Ｓ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：固形腫瘍の壊死領域を指向するキメラＴＮＴ−１に対する、ファージディスプレイ由来モノクローナル抗体（ＮＨＳ７６）対応物（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＮＨＳ７６）Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ｔｏ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＮＴ−１ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｃｒｏｔｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２０：３０５−３１２、２００１。
８．Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｍ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．、Ｌｉ，Ｚ．、及びＴａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．：細胞表面抗原（Ｌｙｍ−１）及び細胞内抗原（ＴＮＴ−１）に対するモノクローナル抗体のディファレンシャルな腫瘍内局在を実証する比較的オートラジオグラフ試験（Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｒａ−ｔｕｍｏｒ ｌａｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌａｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ（Ｌｙｍ−１）ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｒ（ＴＮＴ−１）ａｎｔｉｇｅｎｓ）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３１：１０５９−１０６６、１９９０。
９．Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ｍ．Ｍ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：固形悪性腫瘍の免疫療法のためのキメラＴＮＴ−３抗体−マウス−インターフェロンγ融合タンパク質（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＮＴ−３ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｕｒｉｎｅ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）。投稿中。
１０．Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：ヒトインターフェロンγ及び腫瘍壊死因子αキメラＴＮＴ−３融合タンパク質の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｌｐｈａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＮＴ−３ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｈｙｂｏｒｉｄｏｍｉｃｓ、２１：４２１−４３２、２００２。
１１．Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｌｙｎｃｈ，Ｍ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｍ．、及びＥｐｓｔｅｒｎ，Ａ．Ｌ．：Ｂ細胞悪性細胞に対する特異性を有する、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子又はインターロイキン−２を含むキメラＣＬＬ−１抗体融合タンパク質は、腫瘍指向性を保持しながらエフェクター機能の増強を示す（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｃｌｌ−１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｂ−ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｗｈｉｌｅ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）。Ｂｌｏｏｄ ８９：４４３７−４４４７、１９９７。
１２．Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｈａｎｎａ，Ｃ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ：ＤＮＡを指向するモノクローナル抗体／インターロイキン−２融合タンパク質は固形腫瘍への治療分子の送達を増強する（Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＤＮＡ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）。Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５：５１−６０、１９９９。
１３．ＬｅＢｅｒｔｈｏｎ，Ｂ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．、Ｃｈａｒａｋ，Ｂ．Ｓ．、Ａｍｉｔａｂｈａ，Ｍ．及びＥｐｓｔｅｉｎ．Ａ．Ｌ．：新規な血管作用性インターロイキン−２免疫結合体によって誘導される高分子の腫瘍取り込みの増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：２６９４−２６９８、１９９１。
１４．Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：腫瘍におけるモノクローナル抗体取り込みの増強に対する新規な７つの血管作用性免疫結合体の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｎｅｗ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）。Ｃａｎｃｅｒ（に対する補遺）、７３（３）：８２４−８３１、１９９４。
１５．Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：血管作用性免疫結合体を使用するＩＵｄＲの化学療法指標の改善（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ＩＵｄＲ ｕｓｉｎｇ ａ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。Ｒａｄｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、７９：８３−８６、１９９７。
【０１０９】
本明細書中で言及されたすべての特許及び刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すものである。すべての特許及び刊行物は、あたかも各個々の刊行物が特異的且つ個々に参照として援用されるのと同程度に、参照として本明細書に援用される。
【０１１０】
本明細書中で適切に例示的に記載した本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント、限定が存在しなくとも実施できる。したがって、例えば、本明細書中の各々の場合において、用語「含む」「から実質的になる」及び「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。利用されてきた用語及び表現は、記載のためであり且つ限定のためではなく、及び、このような用語及び表現の使用において、示され且つ記載される特徴の任意の等価物を除外する意図は存在しないが、種々の改変が、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び選択的な特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示される概念の改変及び変異が、当業者によって行われ得ること、並びにこのような改変及び変異が、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の構築を実証する概略図である。Ｇｌｙ４ＳｅｒリンカーはＬＥＣ遺伝子とｃｈＴＮＴ−３の重鎖可変領域の間に局在する。
【図２】２種のマウス固形腫瘍のＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の免疫療法の図である。
【図３】ＲＥＮＣＡ腎臓癌腫瘍モデルにおけるｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質を使用する組合せ免疫療法の図である。各融合タンパク質はサイトカイン部分を列挙することによってチャート中に省略して示す。
【図４】ＭＡＤ１０９を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３及びｃｈＴＮＴ−３／サイトカインの併用療法の図である。
【図５】抗ＣＤ４＋抗血清、抗ＣＤ８＋抗血清、及び抗ＮＫ細胞抗血清との併用療法を示す、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を用いるＴ細胞枯渇化試験の図である。
【図６】抗ＣＤ２５＋抗血清を示すＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を用いるＴ細胞枯渇化試験の図である。
【図７】例示的なヒトＬＥＣ（配列番号１）のヌクレオチド配列の図である。
【図８】例示的なヒトＬＥＣ前駆体ケモカイン（配列番号２）及びヒトＬＥＣ成熟ケモカイン（配列番号３）のアミノ酸配列の図である。
【図９】ＮＨＳ７６に融合されたＬＥＣ遺伝子を発現するための発現ベクターマップの図である。Ｇｌｙ４ＳｅｒからなるリンカーはＬＥＣ遺伝子とＮＨＳ７６重鎖可変領域との間に挿入された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌標的指向分子及び肝発現ケモカイン「ＬＥＣ」を含む癌療法剤、並びに癌の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の本発明の背景の議論は、単に読者が本発明を理解する際に補助するために提供され、本発明の先行技術を記載又は構成することを認めるものではない
【０００３】
外科手術、放射線療法、及び化学療法は、癌（白血病、固形腫瘍、及び転移腫瘍を含む）の治療のために標準的に受容されている手法である。癌を縮小又は根絶するために、身体の免疫系を直接的又は間接的に使用する免疫療法（時折、生物学的療法、生物療法、又は生物学的応答調節剤療法と呼ばれる）は、従来の癌療法に対する補助療法として長年の間試験されてきた。ヒト免疫系は癌療法のための未開発の資源であり、一旦免疫系の成分が適切に利用されるならば有効な治療が開発できると考えられてきた。鍵となる免疫調節分子及び免疫シグナルが同定され、治療試薬として調製されているので、このような試薬の臨床的有効性は周知の癌モデルを使用して試験できる。免疫療法戦略には、ワクチン、活性化細胞、抗体、サイトカイン、ケモカイン、並びに低分子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与、及び遺伝子治療が含まれる（Ｍｏｃｅｌｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００２）５１：５８３−５９５；Ｄｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００２）２０：２８８１−２８９４、２００２）。
【０００４】
サイトカインは、炎症、免疫、分化、細胞分裂、線維症、及び修復に関与する細胞によって産生される細胞外タンパク質メッセンジャー分子である（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．：Ｂｌｏｏｄ（１９９３）８１：１４１４−１４２３）。ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＴＧＦβ、及びＣＤ４０リガンドなどのサイトカインはまた、細胞表面シグナル伝達分子として機能する。他の天然の生物活性分子からサイトカインを区別するサイトカインの特徴は、サイトカインが構成的に産生されるのではなく刺激に応答して生成されることである。サイトカイン遺伝子は高度に誘導性であり、それらのコードするｍＲＮＡレベルは、ＮＦκＢ、ＮＦ−ＡＴ、及びＡＰ−１などの転写因子による調節を受ける（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、「先天的宿主防御及び適応的免疫におけるサイトカインの役割についての序論（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ及びＦｅｌｄｍａｎｎ編、３〜２０頁、２００１））。サイトカイン産生は一般的に数時間から数日間続き、且つ短い行動半径を有する。したがって、サイトカインは、全身的に作用するのではなく、主として隣接細胞に作用する。医薬として全身的に投与される場合、サイトカインは、熱、低血圧、頭痛、倦怠感、及び衰弱を含む複数の徴候を引き起こす深刻な毒性を示す。毒性は、サイトカインを臨床的に適切な投薬量で投与することを困難にする。
【０００５】
癌療法の認可を得た最初のサイトカインはインターロイキン−２（ＩＬ−２）である（Ｒａｏら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５：７０７−７４７）。ＩＬ−２の第１の役割は、Ｔリンパ球の成長及び増殖を刺激することであるが、しかし、これは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、及びマクロファージを含む他の種々の免疫細胞に対して刺激効果を有する（同上）。ＩＬ−２は、腎臓癌及びメラノーマの治療においてある程度の見込みを示したのに対して（Ｓｉｌａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．（１９８６）５：４１１−４２２）、これは、身体の血管に対する損傷（毛細血管漏出症候群）を含む深刻な副作用を有し、これが他の癌に対するこの有用性を制限する。ＩＬ−２の腫瘍内投与は、全身投与よりもいくぶん有効であるが（Ｓｉｌａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．（１９８６）５：４１１−４２２；Ｓｏｎｅら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９４）５１：１７０−１７６）、しかし、腫瘍内投与は播腫性疾患のためには実行可能ではない。
【０００６】
Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｎ．Ａ．：Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９５５）１０２：１５７−７７）によってほぼ５０年前に最初に提示された、腫瘍に対する養子細胞療法の概念は、活性化されたＴ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞の移入を通して癌の撲滅をその目的としている。養子免疫療法は、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が癌患者中に存在するが、このような細胞は初回抗原刺激を受けておらず、且つ／又はその細胞のインビボ機能が損なわれているという信念に基づいている。細胞の初回刺激をするために、末梢Ｔ細胞が患者から取り出され、エキソビボで活性化され、次いで再注入される。エキソビボ活性化の工程はまた、患者の腫瘍細胞又は腫瘍細胞ワクチンへの曝露を含み得る。Ｔ細胞に基づく養子免疫療法は潜在的に見込みのある癌療法の型を提供するが、これは、この治療を受けた患者の大部分において長期間続く応答を誘導することに失敗した（Ｌｕｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００１）２４：４０８−１９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫応答を制御及び誘導することに関しては多くのことが判明したが、癌療法に対するより新しく且つより有効な免疫療法的手法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの態様において、本発明は、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む癌療法剤を提供する。好ましい実施形態において、癌療法剤はＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３ではない。
【０００９】
一実施形態において、癌標的指向分子はインビボで癌細胞又は腫瘍を標的とする抗体である。別の実施形態において、この抗体は腫瘍細胞表面抗原に特異的である。さらに別の実施形態において、この抗体は腫瘍のストローマ成分に特異的である。なおさらに別の実施形態において、この抗体は細胞内抗原、例えば核内抗原に特異的である。後者の場合、抗体は、マウス抗体ＴＮＴ−１、ＴＮＴ−２、ＴＮＴ−３、又はＮＨＳ７６に基づくヒト化抗体又はヒトキメラ抗体であってもよく、ここで抗体はＴＮＴ−３であり、標的指向作用剤はＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３でない。
【００１０】
癌標的指向分子とＬＥＣとの間の連結は、共有結合又は非共有結合を通してであってもよい。癌標的指向分子及びＬＥＣは化学架橋連結によって、又は遺伝子融合を通して（例えば、組換えＤＮＡ技術の適用によって）共有結合で結合できる。後者の手法において、ＬＥＣは、そのＣ末端又はＮ末端から、タンパク質細胞標的指向分子のＮ末端又はＣ末端で融合できる。細胞標的指向分子が抗体である場合、ＬＥＣのＣ末端が、抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端に好ましく融合される。
【００１１】
本発明の癌療法剤は、癌に罹患している個体における癌の治療のために使用できる。したがって、本発明の別の態様は、個体において腫瘍のサイズを減少するか、又は癌細胞の増殖を阻害する方法であって、有効量の本発明の癌療法剤を投与する工程を包含し、ここで癌療法剤は個体の癌細胞又は腫瘍に局在する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、癌に罹患している個体において転移性癌の発生を減少又は阻害する方法であって、有効量の本発明の癌療法剤を個体に投与する工程を包含し、ここで癌療法剤は個体の癌細胞又は腫瘍に局在する。
【００１３】
一実施形態において、本発明の癌療法剤を使用する治療の有効性は、個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少することによって増加し得る。これは、宿主の抗腫瘍免疫応答の抑制を特徴とする免疫調節性Ｔ細胞を、エキソビボで除去又はインビボで枯渇化若しくは不活性化することによって達成できる。一実施形態において、免疫調節性Ｔ細胞は、免疫調節性Ｔ細胞に結合する少なくとも１種の抗体を使用して除去又は枯渇化又は不活性化できる。この抗体はＩＬ−２レセプター、好ましくはＣＤ２５に結合し得る。免疫調節性Ｔ細胞の活性は、本発明の癌療法剤を投与する前、その間、又はその後で個体中で減少させ得る。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の癌療法剤を用いる治療はまた、免疫細胞の養子移入を含み得る。これらの免疫細胞は、好ましくは、エキソビボで活性化できるＴ細胞である。一実施形態において、活性化はＩＬ−２及び／又は抗ＣＤ３抗体への曝露によって達成される。別の実施形態において、エキソビボ活性化は、癌細胞又は癌細胞ワクチンへの曝露によって達成される。免疫細胞の養子移入は、本発明の癌療法剤を投与する前、その間、又はその後に行われ得る。ある実施形態において、養子移入は、個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させることと組み合わせられ得る。この場合において、養子移入は、免疫調節性Ｔ細胞の除去、枯渇化、又は不活性化の後で好ましく行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の１つの態様に従って、「ＬＥＣ」ケモカインに連結された癌標的指向分子を含む癌療法剤が提供される。このような本発明の癌療法剤（すなわち、ＬＥＣ癌療法剤）は本発明に従う癌療法のために有用である。
【００１６】
用語「癌標的指向分子」とは、インビボで癌細胞に局在化する能力を有する分子をいう。語句「個体において癌細胞に局在化する」（すなわち、「インビボ」）とは、作用剤が腫瘍細胞に結合し得ること、又は腫瘍細胞の近傍に結合し得ることを意味する。癌標的指向分子は癌細胞の表面上のレセプター又はリガンドに結合し得るか、又は癌細胞の細胞内標的に結合し得る（その標的が作用剤に接近可能であるという条件で）。細胞内癌細胞標的への接近可能性は、損なわれている原形質膜を有する癌細胞（例えば、アポトーシス、壊死などを受けている細胞など）において生じ得る。例えば、特定の癌標的指向分子は、損なわれた原形質膜を有さない細胞の細胞内部分に結合し得る。例えば、Ｐｏｒｋｋａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２００２）９９（１１）７４４４−９を参照のこと。
【００１７】
癌標的指向分子はまた、腫瘍中に存在する分子に結合し得る。本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、癌細胞、壊死、並びにストローマを含む。ストローマは、線維芽細胞などの細胞並びに血管及び毛細血管の内皮細胞並びに線維性成分及び非線維性成分から構成される細胞外マトリックスを含む。主要な線維性タンパク質はコラーゲン及びエラスチンである。癌標的指向分子は、腫瘍中の癌細胞を取り囲むストローマに結合することによって腫瘍に標的とする。したがって、癌標的指向分子は、線維芽細胞又は内皮細胞又は細胞外マトリックスの成分に結合することによって癌の近傍を標的とし得る。例えば、Ｓｃｈｒａａら、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８３（２）：２４１−５１；Ａｒａｐら、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（２００１）３１補遺１：３０−１を参照のこと。
【００１８】
本発明において有用な癌標的指向分子には、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原に結合する分子が含まれる。用語「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）とは、本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞上に、誕生後の選択された器官における胎児寿命中の正常細胞上に（胎児性癌抗原）、又は正常細胞上ではあるが、腫瘍細胞上よりもはるかに低濃度で存在するタンパク質を指す。ＴＡＡはまた、癌細胞の近傍のストローマ中に存在し得るが、身体の別の箇所のストローマにおいてはより少ない量で発現できる。種々のＴＡＡが記載されており、これにはＢＲＣＡ−１タンパク質及びＢＲＣＡ−２タンパク質、ＨＥＲ−２−ｎｅｕ、ＭＵＣ１などのムチン、インテグリン、サイトカインなどが含まれる。対照的に、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）（別名「腫瘍特異的移植抗原」又はＴＳＴＡ）とは、正常細胞には存在しない、腫瘍細胞発現タンパク質をいう。ＴＳＡは通常、感染性ウイルスが細胞を不死化し、且つウイルス抗原を発現させるときに出現する。例示的なウイルスＴＳＡは、ＨＰＶ１６型のＥ６タンパク質又はＥ７タンパク質である。ウイルスによって誘導されないＴＳＡは、Ｂ細胞リンパ腫上の免疫グロブリンのイディオタイプ又はＴ細胞リンパ腫上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であってもよい。
【００１９】
本発明の方法を使用して治療可能な癌には、癌腫、肉腫、並びに白血病及びリンパ腫、並びに他の型の癌が含まれる。癌腫には、肺、乳房、結腸、卵巣、前立腺などの癌腫が含まれる。これらの癌は原発性又は転移性であってもよい。白血病及びリンパ腫の場合、本発明の方法で治療可能な癌細胞には、腫瘍の形態のもの並びに骨髄中及び循環中の癌細胞が含まれる。
【００２０】
癌標的指向分子には、薬物、有機化合物、ペプチド、ペプチド模倣物などの低分子化合物、並びに糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、糖脂質、リン脂質などの高分子が含まれる。低分子癌標的指向分子は、約５，０００ダルトン以下のサイズであってもよい。癌標的指向分子には、抗新生物剤を含む周知の治療化合物を含まれ得る。抗新生物標的指向分子には、パクリタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシン、カルミノマイシン、４’−エピアドリアマイシン、４−デメトキシ−ダウノマイシン、１１−デオキシダウノルビシン、１３−デオキシダウノルビシン、アドリアマイシン−１４−ベンゾエート、アドリアマイシン−１４−オクタノエート、アドリアマイシン−１４−ナフタレンアセテート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、マイトマイシンＣ、Ｎ−メチルマイトマイシンＣ、ブレオマイシンＡ２、ジデアザテトラヒドロ葉酸、アミノプテリン、メトトレキサート、コルヒチン、及びシスプラチンなどが含まれ得る。癌標的指向分子にはまた、ジフテリア毒素などの毒素、ＣＳＦ、ＧＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦなどのサイトカイン、エリスロポエチン、インターフェロン又はインターロイキンなどの免疫調節物質又はサイトカイン、ニューロペプチド、ＨＧＨ、ＦＳＨ、又はＬＨなどの生殖ホルモン、甲状腺ホルモン、アセチルコリンなどの神経伝達物質、及びエストロゲンレセプターなどのホルモンレセプターが含まれ得る。
【００２１】
癌標的指向分子はタンパク質又はペプチドであってもよい。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミド結合によって連結されたアミノ酸のポリマーをいうために交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、これらの用語はアミノ酸ポリマーに適用され、ここでは１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学アナログである。したがって、タンパク質は、天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸を含み得る。アミノ酸は、ペプチドの結合機能が維持される限り、Ｌ型又はＤ型であってもよい。ペプチドは可変長であってもよいが、一般的には約４から２００アミノ酸長の間である。ペプチドはペプチド内の２つの隣接しないアミノ酸の間の分子内結合、例えば、バックボーンからバックボーン、側鎖からバックボーン、及び側鎖から側鎖の環状化を有して、環状であってもよい。環状ペプチドは当該分野において周知の方法によって調製できる。例えば、米国特許第６，０１３，６２５号を参照のこと。
【００２２】
癌標的指向分子はインテグリンのアンタゴニスト又はアゴニストであってもよい。インテグリンは、細胞接着事象及びシグナル伝達プロセスにおいて機能するヘテロダイマー膜貫通糖タンパク質複合体である。αサブユニット及びβサブユニットを含むインテグリンには、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１β１、α６β４、α４β７、αＤβ２、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＶβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、αｘβ２、αＩＩｂβ３、αＩＥＬｂβ７などを含む多数の型が含まれる。インテグリンαｖβ３は種々の細胞上で発現され、骨基質への破骨細胞の接着、血管平滑筋細胞の移動、及び血管形成を含むいくつかの生物学的に関連する過程を媒介することが示されてきた。インテグリンのための適切な標的指向分子には、ＲＧＤペプチド若しくはペプチド模倣物又は非ＲＧＤペプチド若しくはペプチド模倣物（例えば、米国特許第５，７６７，０７１号及び同第５，７８０，４２６号を参照されたい）が含まれ、α４β１（ＶＬＡ−４）、α４β７（例えば、米国特許第６，３６５，６１９号；Ｃｈａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１２：１５９−１６３（２００２）；Ｌｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１２：１３３−１３６（２００２）を参照のこと）などの他のインテグリンについても同様である。
【００２３】
好ましい癌標的指向分子は抗体である。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、Ｂ細胞の産物である免疫グロブリン及びその改変体、並びにＴ細胞の産物であるＴ細胞レセプター（ＴｃＲ）及びその改変体を含む。免疫グロブリンは、免疫グロブリンκ及びλ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子によって実質的にコードされる１種又は複数のポリペプチドを含むタンパク質である。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、これらは次にはそれぞれ免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを規定する。重鎖のサブクラスもまた公知である。例えば、ヒトにおけるＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスのいずれかであってもよい。
【００２４】
代表的な免疫グロブリンの構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは２つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識の原因である１００から１１０以上までのアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）とは、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれいう。
【００２５】
抗体は、完全長の無傷の抗体として、又は種々のペプチダーゼ若しくは化学物質を用いる消化によって産生される十分に特徴付けられた多数の断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ’）２を産生し、Ｆａｂのダイマーそれ自体が、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合された軽鎖である。Ｆ（ａｂ’）２は穏やかな条件下でヒンジ領域中のジスルフィド結合を開裂させるために還元でき、それによってＦ（ａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに転換する。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂ断片である（他の抗体断片のより詳細な記載については、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。種々の抗体断片が無傷の抗体の消化によって規定されているのに対して、当業者は、種々の抗体断片のいずれもが化学的又は組換えＤＮＡ技術を利用することのいずれかによってデノボ合成できることを認識する。したがって、用語抗体は、本明細書中で使用される場合、抗体全体の改変によって産生されるか若しくはデノボ合成されるかのいずれかの抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法論を使用して得られる抗体及び断片もまた含む。
【００２６】
組換え抗体は、従来の全長抗体、タンパク質分解性消化からの公知の抗体断片、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの独特な抗体断片、ドメイン欠失抗体などであってもよい。抗体は、１アミノ酸又は数アミノ酸までの少ないアミノ酸の欠失又は変異を有するドメイン又はポリペプチドを含み得るが、例えば１つ又は複数のドメインの欠失などのより広範な欠失も可能である。
【００２７】
Ｆｖ抗体は、約５０Ｋｄサイズであり、且つ軽鎖及び重鎖の可変領域を含む。単鎖抗体Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーであり、これは、直接結合されるか又はペプチドをコードするリンカーによって結合されるＶＨ及びＶＬコード配列を含む核酸から発現できる。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３を参照のこと。天然に凝集したが、化学的には分離している抗体Ｖ領域からの軽鎖及び重鎖のポリペプチド鎖をｓｃＦｖ分子に転換するための多数の構造は、抗原結合部位の構造と実質的に類似している三次元構造にフォールディングされる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、及び同第４，９５６，７７８号を参照のこと。
【００２８】
抗体は、非ヒト抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であってもよく、後者はヒト抗体配列及び非ヒト抗体配列を含む。当該分野において知られているように、キメラ抗体は、非ヒト定常領域（重鎖、軽鎖、又は両方）をヒト定常領域抗体と交換することによって調製される。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。マウス抗体などの非ヒト抗体からヒト化抗体を作製する方法もまた周知である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許５，５６５，３３２号を参照のこと）。
【００２９】
癌標的指向分子は、腫瘍の壊死部分中で接近可能な核抗原を標的とする抗体であってもよい。腫瘍壊死治療（ＴＮＴ）としても知られる壊死細胞標的指向（参考文献番号１〜５、７、８）は、腫瘍関連細胞表面抗原に結合する抗体を利用する方法とは異なる手法を表し、且つ腫瘍の各型について異なる抗体の使用を必要とする。ＴＮＴ抗体はすべての細胞において見出される細胞内抗原に結合し、これらの抗原は死滅しつつある細胞によって保持されており、且つ正常組織中にはまれにしか存在しない異常に浸透性である変性中の細胞の存在に起因して、悪性腫瘍において優先的な局在を示す。急速に分裂中の腫瘍はある割合の変性中の細胞又は死滅細胞を含むが、分裂中の細胞を殺傷する試みに注意を集中したので、変性中の成分は大部分無視してきた。腫瘍細胞の消失量の計算は、正常組織とは対照的に、腫瘍細胞分裂の子孫の３０〜８０％がすぐに変性を受けることを明らかにした。腫瘍においては、不完全な血管系及び損なわれた食細胞応答は、変性中の細胞の蓄積を許容し、長い間病理学者達に悪性腫瘍の典型的な特徴と認識されてきた、大きな領域の壊死の形成を伴うことが多い（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８８）４８：５８４２−５８４８）。したがって、腫瘍内での高い割合の死滅しつつある細胞の蓄積は、悪性腫瘍と正常組織の間の主要な区別を構成し、正常組織では、散発性の細胞死が比較的低い比率で起こり、組織からの壊死成分の迅速（数分間以内）且つ秩序立った除去を伴う。変性中の細胞は生存可能な細胞中では観察されない浸透可能な細胞表面膜を有するので、ＴＮＴ抗体は、腫瘍の壊死領域中に入り且つそれらの細胞内抗原に結合する。これとは反対に、腫瘍の生存可能な領域及び正常組織中では拡散したＴＮＴ抗体は結合せずに、通常のクリアランス機構によって除去される。それゆえに、ＴＮＴ抗体は、腫瘍の壊死領域を特異的に標的とするための有用な手法を提供し、腫瘍の中心コア中に深く位置し得るこれらの領域に診断作用剤及び治療作用剤を送達するために使用できる。ＴＮＴ抗体は、他の形態の抗体治療から区別される独特な多数の特色を有する。これらの特性のために、ＴＮＴ抗体は、放射性核種（参考文献番号５、７）、免疫刺激分子（参考文献９〜１１）、及び血管浸透性作用剤（参考文献番号１２〜１５）を癌の治療のために可能にするいくつかの利点を有する。
【００３０】
議論されるように、癌療法用の本発明の組成物はＬＥＣケモカインを含む。ケモカインは小さく（７〜１６ｋＤ）、分泌性の、且つ白血球及び樹状細胞の走化性、ＰＭＮ脱顆粒、並びに血管形成に関与する構造的に関連した可溶性タンパク質である（Ｍａｃｋａｙ ＣＲ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２：９５−１０１；Ｇｅｒａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２：１０８−１１５）。ケモカインは、損傷、アレルゲン、抗原、又は侵入微生物に対する宿主応答の最初の相の間に産生される。ケモカインは、細胞の移動及び活性化の両方を誘導して炎症性病巣に白血球を引き付ける。機能するために、ケモカインは主として損傷又は感染の部位で作られ、それらの小さなサイズのために非常に短い半減期を有する。全身投与が深刻な副作用と関連するので（６）、有効な免疫応答を達成するために腫瘍中のケモカインの高い局所的濃度を得ることは困難である。
【００３１】
ケモカインは、Ｃ末端の近傍のシステイン残基の配置に基づいて、α（Ｃ−Ｘ−Ｃ）、β（Ｃ−Ｃ）及びγ（Ｃ）のサブグループに分類されており、それらのいくつかは鎖内Ｓ−Ｓ架橋の形成に関与する。αケモカインは、それらの４つのシステイン残基のうちの最初と２番目の間に挿入された単一のアミノ酸を有するが、これらのシステインはβグループにおいては分離されない。γケモカインは１対のシステインのみを有する。免疫系におけるそれらの重要な役割に起因して、ケモカインは炎症性疾患及び自己免疫疾患（Ｖａｄｄｉら、ケモカインの事実の本（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｆａｃｔｓ ｂｏｏｋ １９９７））、ＨＩＶ（Ｂａｒｏｕｄｙ ＢＭ．「新規な抗レトロウイルス剤としての、ＨＩＶ−１潜在性を効率的に阻害するＣＣＲ５の低分子アンタゴニスト（Ａ Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＣＣＲ５ ｔｈａｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＨＩＶ−１ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）」７ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、２０００）、並びに癌（Ｍｙａｇｉｓｈｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏ Ｓｃｉ．（１９９５））を治療するために利用されてきた。
【００３２】
ケモカイン作用の機構は、標的細胞上の種々の膜貫通Ｇタンパク質共役レセプターへの最初の結合を含む。ケモカインとこれらのＧタンパク質共役レセプターとの相互作用は、応答する細胞の表面上で、βインテグリンなどの接着タンパク質の迅速な再構成を引き起こし、それらの内皮細胞（ＥＣ）裏層血管壁への接着を容易にする。この接着に続いて、ＥＣ間での組織への白血球の移動が起こる。一旦存在すると、炎症性白血球はケモカインの増加する濃度勾配に沿って元々の部位に移動する。損傷又は微生物侵入の部位でのより高いケモカイン濃度に応答して、白血球は、顆粒内容物の放出及びサイトカイン産生の増加などのエフェクター機能を実行するために活性化される。ＬＥＣはＣＣＲ１及びＣＣＲ８ケモカインレセプターに結合し且つこれらを活性化する。
【００３３】
「肝発現ケモカイン」又は「ＬＥＣ」（ＣＣＬ１６）（ＮＣＣ−４、ＬＭＣ、及びＨＣＣ−４、ＬＣＣ−１、及びモノタクチン−１としても知られる）は、発現配列タグのライブラリーにおいて元々見出され、後に１７ｑ染色体にＣＣケモカインクラスター中でマッピングされた（Ｎａｒｕｓｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９６）３４：２３６−２４０）。ＬＥＣは、健常成体ドナーからの血漿中に比較的高濃度で（０．３−４ｎＭ）存在する。ＬＥＣをコードするヒト遺伝子は約５ｋｂの長さを有し、３つのエキソンを有する。２つの型の転写物（５７９ｂｐ、１５０３ｂｐ）が選択的なポリアデニル化部位を通して生成される。マウスにおけるＬＥＣ遺伝子はイントロンの挿入に起因して、その機能を喪失した偽遺伝子である（同上）。
【００３４】
ヒトＬＥＣをコードするＤＮＡは、ＡＴＧコドンで開始して終止コドン（ＴＧＡ）を含む３６３塩基を含む（図７；配列番号１を参照のこと）。このＤＮＡは、１２０アミノ酸のヒトＬＥＣ前駆体（図８；配列番号２）をコードし、最初の２３アミノ酸は成熟ヒトＬＥＣタンパク質（図８；配列番号３）を産生するために発現の間に切断されるシグナルペプチドを表す。
【００３５】
ＬＥＣはヒト単球及び樹状細胞（ＡＰＣ細胞）の両方に対する強力な走化性因子である（Ｍｏｓｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）２：１２３−１２８；Ｔｈｅｌｅｎ，Ｍ．；Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）２：１２９−１３４）。ＬＥＣは、ケモカインレセプターＣＣＲ１及びＣＣＲ８を通してその活性を媒介する（Ｈｏｗａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ（２０００）９６：８４０−８４５）。ＬＥＣは一貫して結合し、レセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５に比較的低い親和性で結合する（Ｎｏｍｉｙａｍａら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１３（８）：１０２１−９）。ヒト肝細胞は、ＨｅｐＧ２などのヒト肝細胞系と同様に、ＬＥＣを強力に発現する。
【００３６】
ＬＥＣはケモカインの中で独特であり、ＩＬ−１０での細胞の治療後にそのｍＲＮＡレベルを増加及び安定化させる。インビトロ試験は、ＬＥＣが最大の走化性を誘導するために、接着のために必要とするよりもはるかにより高い濃度を必要とすることを示す（同上）。ＬＥＣの潜在的な治療的適用は、Ｇｉｏｖａｒｅｌｌｉら（参考文献番号６）によって試験され、彼らは、ＬＥＣを発現するように操作された哺乳動物癌腫ＴＳＡ細胞が腫瘍の転移性伝播を阻害し、且つマクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、及びＰＭＮの印象的な浸潤並びにＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の産生に起因する腫瘍拒絶を誘導することを示した。ＬＥＣの分泌による腫瘍の拒絶は、ＣＤ８＋リンパ球及び多形核白血球の両方を含む（参考文献番号６）。これらのマウスにおいて、抗腫瘍免疫記憶は、ＴＳＡ腫瘍チャレンジによって示されるように拒絶後迅速に確立された。
【００３７】
用語「ＬＥＣ」とは、本明細書中で使用される場合、ヒトＬＥＣタンパク質配列に実質的に類似であるか、又はその保存性変異を含んだアミノ酸配列を含む。用語「実質的に類似」及び「保存性変異」は、別の生物学的に類似した残基による、アミノ酸残基の置換を示す。保存性変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、若しくはメチオニンなどの疎水性残基での別の残基の代わりの置換、又は１つの極性残基での別の残基の代わりの置換（例えば、リジンの代わりのアルギニンでの置換、アスパラギン酸の代わりのグルタミン酸での置換、若しくはアスパラギンの代わりのグルタミンでの置換など）が含まれる。用語「保存性変異」及び「実質的に類似」はまた、置換ポリペプチドに対して惹起された抗体が非置換ポリペプチドともまた免疫反応するという条件で、非置換の親のアミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含む。
【００３８】
ヒトＬＥＣタンパク質に実質的に類似するＬＥＣタンパク質は、本発明の癌療法組成物中のヒトＬＥＣの代わりに代用できる。実質的に類似のＬＥＣタンパク質は、ネイティブヒトＬＥＣ配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及びより好ましくは９８％の配列同一性（すなわち、相同性）を共有する。ヒトＬＥＣアミノ酸配列に実質的に類似し、且つこの用語が本明細書中で使用される場合に「ＬＥＣ」タンパク質と見なされるタンパク質はまた、ヒトＬＥＣと少なくとも１つの生物学的特性を共有する。ＬＥＣの生物学的特性には、ケモカインレセプターＣＣＲ１若しくはＣＣＲ８への結合、又は単球、リンパ球、若しくはＰＭＮのための化学誘引物質としての機能が含まれる。この点に関して、ＬＥＣはカルシウム動員並びにＣＣＲ１及びＣＣＲ２を介する走化性を誘導する。ＬＥＣはまた、カルシウム動員を誘導するが、ＣＣＲ５を介する走化性はわずかである。
【００３９】
相同性及び同一性は、しばしば配列分析ソフトウェアを使用して測定される（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７０５）。このようなソフトウェアは、種々の欠失、置換、及び他の改変に対して相同性の程度を割り当てることによって類似の配列を一致させる。用語「相同性」及び「同一性」は、２つ又はそれ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈において、任意の数の配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動のアラインメント及び目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって最大の一致のために比較及びアラインされた場合に、同じであるか又は特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列をいう。
【００４０】
配列比較のために、代表的には、１つの配列が参照配列として働き、これに試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列はコンピュータに入力され、必要な場合、サブ配列座標が指定され、さらに配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用できるか、又は代替的なパラメータが指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００４１】
比較のための配列のアラインメントの方法は当該分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は手動のアラインメント及び目視検査によって行われ得る。相同性又は同一性を決定するための他のアルゴリズムには、例えば、上記に加えて以下が含まれる：ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ＡＭＰＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＡＳＳＥＴ（Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ）、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｏｄｅ）、ＢＬＩＭＰＳ（ＢＬｏｃｋｓ ＩＭＰｒｏｖｅｄ Ｓｅａｒｃｈｅｒ）、ＦＡＳＴＡ、Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ＆ Ｐｏｉｎｔｓ、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓアルゴリズム、ＦＮＡＴ（Ｆｏｒｃｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）、Ｆｒａｍｅａｌｉｇｎ、Ｆｒａｍｅｓｅａｒｃｈ、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ（Ｆｒｉｓｔｅｎｓｋｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、ＧＡＰ（Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、ＧｅｎＱｕｅｓｔ、ＩＳＳＣ（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、ＬＡＬＩＧＮ（Ｌｏｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｍｅｎｔ）、ＬＣＰ（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＡＣＡＷ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）、ＭＡＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ（Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｌｔｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＳＡＧＡ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、及びＷＨＡＴ−ＩＦ。このようなアライメントプログラムはまた、実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定するためにゲノムデータベースをスクリーニングするために使用できる。例えば、ヒトゲノム配列の実質的な部分は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）においてＢＬＡＳＴ検索ツールを介する検索のために利用可能である。複数の配列決定されたゲノム及びそれらを分析するための資源に関する情報はまた、ＮＣＢＩから、そのＧｅｎｏｍｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙウェブページ上で利用可能である。
【００４２】
有用なアルゴリズムの１つの例はＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）であり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ ２１５：４０３−４１０においてそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース中の同じ長さのワードと位置合わせしたときにある正の値の閾値スコアＴと一致又は満足するかのいずれかである、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出、１９７７及び１９９０）。これらの最初の隣接ワードのヒットが、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。これらのワードヒットが、累積的なアラインメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方の方向で伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基のペアについてのリワードスコア；常に＞０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大の達成されたスコアから量Ｘ低下するとき；１つ又は複数のネガティブスコア残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが０以下になるとき；又はいずれかの配列の末端に到達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。
【００４３】
ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【００４４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照配列核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満であるならば、核酸が参照配列に類似であると見なされる。
【００４５】
癌療法用の本発明の化合物は、ＬＥＣに連結された癌標的指向分子を含む。癌標的指向分子及びケモカインは、共有結合的又は非共有結合的に連結できる。本明細書中で使用される場合、「連結される」とは、ｐＨ、イオン強度、及び浸透ポテンシャルの生理学的条件下で、存在物が互いに平衡状態で結合されることを意味する。共有結合は種々の化学架橋剤のいずれかによってであってもよく、これには例えば、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性の架橋剤が含まれ、これらの多くは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．を参照のこと）。架橋は、当該分野において周知の種々の化学物質によって達成でき、これは、例えば、活性化ポリエチレングリコール、アルデヒド、イソシアネート、マレイミドなどが含まれる。
【００４６】
癌標的指向分子は、遺伝子融合を通してケモカインに連結でき、そして癌標的指向分子とケモカインの間のポリペプチドリンカー配列を含み得る。リンカーの組成及び長さは、当該分野で周知の方法に従って決定でき、且つ効力について試験できる。このリンカーは、一般的に約３から約１５アミノ酸長、より好ましくは約５から約１０アミノ酸長であるが、しかしより長いリンカー若しくはより短いリンカーが使用できるか、又はそのリンカーは全体的に免除できる。Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーが例示的なリンカーである。さらなる配列もまた、切断部位を組み込むために含まれ得、いくらか後の時点でＬＥＣから癌標的指向分子を分離する。したがって、リンカーは、酵素切断のための基質である配列、例えば、エンドペプチダーゼ認識配列を含み得る。
【００４７】
タンパク質系癌標的指向分子、ＬＥＣ又は標的指向分子−ＬＥＣ融合タンパク質は、当該分野において周知であるように、原核生物細胞又は真核生物細胞におけるなどの組換え発現方法を使用して調製できる（例えば、米国特許第５，１１６，９４３号及び同第６，３３１，４１５号を参照されたい）。一般的に、タンパク質をコードする核酸は、コードされた産物の高収量発現のために発現ベクターにクローニングできる。この発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよいか、又は核酸断片であってもよい。この発現ベクターは、タンパク質をコードする核酸が、プロモーター及び選択的にエンハンサーと作動可能に結合されてクローニングされる発現カセットを含む。この発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又は染色体組み込みエレメント（例えば、レトロウイルスＬＴＲ若しくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲなど）などの他の特徴を含み得る。タンパク質の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、タンパク質の成熟アミノ酸をコードする核酸の上流に配置できる。後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）、又はタンパク質を標識する際に補助するために使用できる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡが、タンパク質をコードする核酸の内部又はその末端に含まれ得る。
【００４８】
ＬＥＣは、標的指向分子及びＬＥＣがそれらの本質的な生物学的活性を保持するという条件で、そのＮ末端又はＣ末端から、タンパク質型癌標的指向分子のＣ末端又はＮ末端に直接的又は間接的に融合できる。ある場合において、ＬＥＣは、好ましくは、そのＣ末端から、タンパク質型癌標的指向分子のＮ末端に融合される。癌標的指向分子が抗体である場合、ＬＥＣは、抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端に融合できる。
【００４９】
タンパク質の組換え発現を複製及び補助するための適切な細胞は当該分野において周知である。このような細胞は、必要に応じて、特定の発現ベクターでトランスフェクト又は形質導入でき、且つベクターを含む大量の細胞を、臨床的適用のために十分な量のタンパク質を得るために大規模ファーメンターに播種するために増殖できる。このような細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの種々の他の真核生物が含んでもよい。これらの系において外来性遺伝子を発現するための標準的な方法論は当該分野において公知である。
【００５０】
本発明の癌療法剤は、癌に罹患した個体において癌の治療のために使用できる。したがって、本発明の別の局面は、個体において腫瘍のサイズを減少するか、又は癌の増殖を阻害する方法であり、この方法は有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含し、ここでこの癌療法剤は個体における癌細胞又は腫瘍に局在する。本発明のさらなる態様は、癌に罹患している個体において転移の発生を阻害する方法であり、この方法は有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含し、ここでこの癌療法剤は個体における転移性癌細胞に局在する。
【００５１】
したがって、本発明の癌療法剤は、個体において腫瘍のサイズを減少させるため、又は癌細胞の増殖を阻害するための医薬の調製において使用され、これは投与のための有効量の医薬を含み、ここでこの癌療法剤は個体における癌細胞又は腫瘍に局在する。１つの態様において、この癌療法剤は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３ではない。本明細書中で使用される場合、用語「ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３」は、ヒト／マウスキメラＴＮＴ−３の重鎖のＮ末端に、特定のペプチドリンカーを介してそのＣ末端に融合された天然のＬＥＣ配列を含む融合タンパク質をいう。この融合タンパク質の調製は実施例３に記載される。
【００５２】
本明細書の癌療法剤を使用する治療の有効性は、個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させることによって増加できる。これは、個体において、免疫調節性Ｔ細胞をエキソビボで除去することによって、又は免疫調節性Ｔ細胞を枯渇化若しくは不活性化することによって達成できる。用語「免疫調節性Ｔ細胞」は、本明細書中で使用される場合、宿主抗腫瘍免疫応答を抑制するように、直接的又は間接的に機能するＴ細胞の集団をいう。免疫調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、又は両方のマーカーにポジティブであってもよい。
【００５３】
免疫調節性Ｔ細胞に関して本明細書中で使用する場合の用語「エキソビボで除去する」とは、免疫調節性Ｔ細胞がエキソビボ方法（例えば、フローサイトメトリー細胞分離、カラム又はフィルター分離など）によって個体の循環系から除去される。カラム又はフィルターは、免疫調節性Ｔ細胞に結合し得る抗体がそこに結合されていてもよい。免疫調節性Ｔ細胞に結合する抗体はまた、フローサイトメトリー装置による除去のためにこのような細胞を同定するために使用できる。免疫調節性Ｔ細胞に結合するために適切な抗体には、ＣＤ４抗原に特異的な抗体、ＩＬ−２レセプターのα鎖サブユニット（すなわちＣＤ２５）などが含まれる。抗Ｔ細胞抗体の組合せもまた使用できる。ＣＤ２５に結合するヒト化モノクローナル抗体であるダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（登録商標）、又は同じ抗体のキメラ型であるバシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（登録商標）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧから市販されている。ＣＤ４に対する完全ヒト化抗体であるＨｕ−Ｍａｘ−ＣＤ４（登録商標）もまた市販されている（ＧｅｎＭａｂ）。
【００５４】
用語「免疫調節性Ｔ細胞をインビボで枯渇化又は不活性化する」とは、本明細書中で使用される場合、宿主への薬剤の投与後に宿主の抗腫瘍免疫応答を抑制する免疫調節性Ｔ細胞の能力の減少をいう。薬剤は、投与されたときに免疫調節性Ｔ細胞の損失（すなわち、枯渇化）又は免疫調節性Ｔ細胞の抗腫瘍免疫抑制機能の不活性化を引き起こすものである。免疫調節性Ｔ細胞を枯渇化又は不活性化することは、上記のように、ＣＤ４抗原に特異的な抗体、ＩＬ−２レセプターのα鎖サブユニット（すなわちＣＤ２５）などの薬剤を投与することによって達成できる。また、γδ免疫調節性Ｔ細胞に対する抗体は、このような細胞を枯渇化するため、及び以前に記載されるように抗腫瘍免疫を刺激するために使用できる。Ｓｅｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：２４２−２４９を参照のこと。抗ＣＤ４０リガンドもまた、免疫調節性Ｔ細胞を枯渇化又は不活性化するために使用できる。
【００５５】
ＣＴＬＡ４Ｉｇなどの部分抗体構築物、ＣＴＬＡ−４の融合タンパク質、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖のＦｃは、ＣＤ２８分子とＢ７分子の間の相互作用を阻止することを介して、完全なＴ細胞活性化のための本質的な同時刺激シグナルを阻害するために使用できる。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、調節性Ｔ細胞をＴ細胞非応答性にする（すなわち、不活性化する）ための医薬として投与できる。Ｐａｒｋら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．（２００３）２０（８）：１２３９−４８を参照のこと。シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素へのＩＬ−２融合物（ＯｎＴａｃ）は、調節性Ｔ細胞を枯渇化又は不活性化するためのなお別の試薬である。
【００５６】
別の手法において、ＣＤ８＋細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）腫瘍アネルギーの誘導を妨害する作用剤が投与できる。アネルギー性抗体などのＣＤ１３７を作動させる作用剤は、それらのコグネイト抗原に再接触する際に、確立されたアネルギー性ＣＴＬの腫瘍細胞溶解性機能を回復させるために使用できる。Ｗｉｌｃｏｘら、Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３：１７７−１８４を参照されたい。この手法は、腫瘍抗原に対するＴ細胞寛容を破壊するために使用できる。
【００５７】
糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子レセプターリガンドをＣＤ４／ＣＤ２５＋免疫調節性Ｔ細胞に対して作動させる作用剤は、これらの細胞（ＧＩＴＲ）の抑制作用を逆転する。Ｔｏｎｅら、ＰＮＡＳ（２００３）１００：１５０５９−１５０６４。
【００５８】
インビボで免疫調節性Ｔ細胞を除去し、枯渇化、又は不活性化する方法は、たとえこの方法が宿主抗腫瘍免疫応答を活性に抑制する免疫調節性Ｔ細胞以外の細胞を除去する場合でも使用できる。免疫調節性Ｔ細胞を除去し、枯渇化、又は不活性化するための労力は、所定の期間の治療の間に複数回実行できる。また、異なる方法が一緒に使用できる（例えば、エキソビボでの細胞除去及びインビボでの枯渇化又は不活性化）。枯渇化又は不活性化のために投与される抗Ｔ細胞抗体の量は、移植分野において使用される量と同様であってもよい。例えば、Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）２７；５８（４）：４１９−２３を参照のこと。抗ＣＤ−４０リガンド。
【００５９】
免疫調節性Ｔ細胞は、本発明の癌療法剤の投与の前、その間、及び／又はその後に枯渇化又は不活性化できる。免疫調節性Ｔ細胞は、好ましくは、本発明の癌療法剤を投与する前に枯渇化される。
【００６０】
さらなる態様において、本発明の癌療法のための方法には、抗腫瘍免疫を増強するための免疫細胞への養子移入が含まれる。本明細書中で使用される場合、「養子移入」とは、別の個体から、又は同じ個体からの免疫細胞の投与をいう。これらは好ましくはＴ細胞であり、これは、エキソビボで活性化でき、抗腫瘍免疫応答を支持する際に機能する能力を増強する。養子移入される免疫細胞は、例えば、ＩＬ−２及び／又は抗ＣＤ３抗体への曝露を含む、種々の周知の作用剤のいずれかによってエキソビボで活性化できる。エキソビボ活性化はまた、癌細胞ワクチンへの曝露を含み得る。このような癌細胞ワクチンは、処置される個体から、又は完全に別の癌からの、生きているか（しかし複製しない）又は殺傷された癌細胞を構成し得る。このワクチンはまた、癌細胞抽出物、又は癌細胞由来の精製されたワクチン調製物であってもよい。癌細胞ワクチンは当該分野において周知であり、周知の方法に従って調製できる。
【００６１】
養子移入されたＴ細胞は、本発明の癌標的指向分子組成物の投与の前、その間、及び／又はその後で投与できる。養子移入されたＴ細胞は、好ましくは、本発明の癌標的指向分子組成物の投与後に与えられる。この型の治療において、患者は、ＩＬ−２（Ｌｕｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００１）２４：４０８−１９）又は他の作用剤（例えば抗ＣＤ３＋抗体及び抗ＣＤ２８＋抗体（Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１）２４（５）：３８９−３９１））を用いるエキソビボ刺激後にＴ細胞の複数注入を受ける。
【００６２】
一部の実施形態においては、本発明の癌療法剤を使用する療法の有効性は、免疫調節性Ｔ細胞のエキソビボでの除去及び／又はインビボでの枯渇化若しくは不活性化の手法を、免疫細胞の養子移入と組み合わせることによって増加できる。このような実施形態において、免疫調節性Ｔ細胞を除去し、枯渇化、又は不活性化する工程の後で養子移入することが有利であってもよい。
【００６３】
本発明の癌療法剤は、薬学的に許容可能な担体とともに処方された作用剤又は医薬として投与できる。したがって、本発明の化合物は、医薬又は薬学的組成物の製造において使用できる。本発明の薬学的組成物は、溶液として又は非経口投与のための凍結乾燥粉末として処方できる。粉末は、使用前に適切な希釈剤又は他の薬学的に許容可能な担体の付加によって再構築できる。液体処方物は、緩衝化された等張の水溶液であってもよい。粉末はまた、乾燥形態でスプレーできる。適切な希釈剤の例は、通常の等張生理食塩水溶液、標準５％デキストロース水溶液、又は緩衝化酢酸ナトリウム若しくは酢酸アンモニウム溶液である。このような処方物は、非経口投与にとってとりわけ適切であるが、経口投与のためにもまた使用でき、又は秤量された用量で吸入のために計量吸入器若しくは噴霧器に含み得る。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの賦形剤を加えることが望ましいこともある。
【００６４】
代替的には、化合物は、経口投与のためのエマルジョン又はシロップ中で、カプセル化、錠剤化、又は調製できる。薬学的に許容可能な固体又は液体の担体は、組成物を増強若しくは安定化するために、組成物の調製を容易にするために加えられ得る。固体担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、石膏、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、又はゼラチンが含まれる。液体担体には、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブオイル、生理食塩水、及び水が含まれる。この担体はまた、単独で又はワックスとともに、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンなどの徐放性物質が含まれ得る。固体担体の量は変化するが、好ましくは、投薬量単位当たり約２０ｍｇから約１ｇの間である。薬学的調製物は、錠剤形態については、粉砕、混合、顆粒化、及び必要な場合は圧縮を、或いは硬質ゼラチンカプセル形態については、粉砕、混合、及び充填を含む従来の製薬技術に従って作製される。液体担体が使用される場合、調製物は、シロップ、エリキシル、エマルジョン、又は水溶性若しくは非水溶性懸濁液の形態であってもよい。直腸投与のために、本発明の化合物は、ココアバター、グリセリン、ゼラチン、又はポリエチレングリコールなどの賦形剤と合わせられ得、且つ坐剤に成形できる。
【００６５】
本発明の化合物は、他の医学的に有用な薬物又は生物学的作用剤を含むように処方できる。この化合物はまた、本発明の化合物が指向される疾患又は状態のために有用である他の薬物又は生物学的作用剤の投与と組み合わせて投与できる。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、語句「有効量」とは、そのレシピエントに有益な効果を付与するための十分に高い濃度を提供するために十分な量をいう。任意の特定の患者にとっての特定の治療有効用量レベルは、治療される障害、障害の重篤度、特定の化合物の活性、投与の経路、化合物のクリアランスの速度、治療の期間、化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物、年齢、体重、性別、食餌、及び被験体の一般的な健康、及び医学分野及び化学分野において周知である同様の要因を含む、種々の要因に依存する。「治療有効量」を決定する際に配慮される種々の一般的考慮は当業者に公知であり、例えば、Ｇｉｌｍａｎら編、グッドマン及びギルマンの治療薬の薬学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９０；並びにレミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０において記載されている。投薬量レベルは、約０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内にあり；約０．０５から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が一般的に適用可能である。化合物は、非経口的に、例えば、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下などで投与できる。投与はまた、経口、鼻腔、直腸、経皮的、又はエアロゾルを介して吸入的であってもよい。本発明の組成物は、ボーラスとして投与してもよく、又はゆっくりと注入してもよい。
【００６７】
治療有効用量は、ＩＣ５０を決定することによって細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。次いで、用量は、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲が得られるように、動物モデル中で処方できる。このような情報が使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定できる。正確な処方、投与の経路、及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択できる。
【００６８】
免疫応答性の個体への本発明の癌療法剤の投与は、癌標的指向分子、ＬＥＣに対する抗体、又は使用される場合、リンカーへの抗体の産生を生じ得る。本発明の癌療法剤の免疫原性を減少させることは、当該分野において周知の方法によって、例えば、癌標的指向分子、ＬＥＣに、又は使用されるリンカーに長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系スペーサーなどを結合させることによって対処できる。長鎖ＰＥＧ及び他のポリマーは、外来性エピトープをマスクするそれらの能力について知られており、外来性エピトープを提示する治療タンパク質の免疫原性の減少を生じる（Ｋａｔｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４４、２０９−２１３；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９８）６８、１−１８）。代替的には、又はさらに、抗体標的指向分子結合体を投与された個体は、シクロスポリンＡ、抗ＣＤ３抗体などの免疫抑制剤を投与できる。
【００６９】
以下の実施例は本発明を例証するために働く。これらの実施例は、いかなる場合においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
標的指向ビヒクルとしてのＴＮＴ抗体
ａ．キメラＴＮＴ−３
ＴＮＴモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用して、腫瘍の壊死領域中に局在する変性中の細胞を介して固形腫瘍を標的とした（１）。この手法は、抗原による免疫調整及びその脱落の問題を回避しながら、多様な起源の癌を標的とするために使用できる。３種のキメラＴＮＴ ＭＡｂが開発された。これらのｃｈＴＮＴ−１、ｃｈＴＮＴ−２、及びｃｈＴＮＴ−３は、それぞれ、ヒストンＤＮＡ複合体、ヘテロクロマチンＤＮＡ、及び一本鎖ＤＮＡからなる核内抗原を標的とする（４、５、Ｋｈａｗｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（２００２）１７：３５９−３７０）。腫瘍保有マウスにおける各ＴＮＴ ＭＡｂの薬物動態及び生体分布特性が提示されている。３種すべてのキメラＴＮＴ ＭＡｂは以前に記載されたように産生された（同上）。
【００７１】
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用してキメラＴＮＴ ＭＡｂの薬物動態クリアランスを決定した。マウスの群（ｎ＝５）に１２５Ｉ−標識したＭＡｂ（３０〜４０μＣｉ／マウス）の腹腔内注射を投与した。ｃｈＴＮＴ−２は、ｃｈＴＮＴ−１（Ｔ１／２＝３０．４時間）及びｃｈＴＮＴ−３（Ｔ１／２＝１３４．２時間）と比較して、最長の循環時間（Ｔ１／２＝１７８．７時間）を示した。１２５Ｉ−標識したキメラＴＮＴ ＭＡｂを固定化Ｒａｊｉ細胞とともにインキュベートし、結合した放射能を使用して、Ｓｃｈａｔｃｈａｒｄ分析によって親和性定数Ｋａを計算する親和性結合試験も行った。ｃｈＴＮＴ−１、ｃｈＴＮＴ−２、及びｃｈＴＮＴ−３の親和性定数は、それぞれ２．５×１０９Ｍ−１、１．２×１０９Ｍ−１、及び１．４×１０９Ｍ−１であった。
【００７２】
これらのＭＡｂの組織生体分布を試験するために、ＭＡＤ１０９マウス肺腺癌腫瘍モデルを使用した。腫瘍を左側腹皮下で５〜７日間増殖させ、その時点で腫瘍は約１ｃｍ直径に達した。各群において、個々のマウスに１００μＣｉ／１０μｇの１２５Ｉ−標識ＭＡｂを含む０．１ｍｌ接種物を腹腔内注射した。表１に示されるように、ｃｈＴＮＴ−１、ｃｈＴＮＴ−２、及びｃｈＴＮＴ−３はインビボで異なる生体分布特性を有し、この腫瘍モデルにおいて良好な取り込みを示した。ｃｈＴＮＴ−２及びｃｈＴＮＴ−３については、％注射用量／ｇはすべての器官においてｃｈＴＮＴ−１についてのそれよりも高い傾向があった。しかし、ｃｈＴＮＴ−１についての腫瘍対血液比は、ｃｈＴＮＴ−２及びｃｈＴＮＴ−３のそれと比較して有意に高かった（筋肉及び腸以外）。これらの結果は、腫瘍保有マウスにおける各キメラＴＮＴ ＭＡｂのインビボ結合特性を実証する。
【００７３】
【表１】
【００７４】
画像処理試験を実行して、１３１Ｉ−標識ｃｈＴＮＴ−３がＭＡＤ１０９腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスに局在することを実証した。１日目及び３日目の画像処理は腫瘍部位における強力なシグナルを示し、このことは、ｃｈＴＮＴ−３が腫瘍内に局在化し且つそこに保持されることが可能であることを示した。
【００７５】
ｂ．ファージディスプレイ由来ヒトＴＮＴ−１ ＭＡｂ ＮＨＳ７６の特徴付け
キメラＴＮＴ−１をヒトＩｇＧ１及びκ定常領域に対してマウス可変領域を遺伝子操作することによって、親のマウス抗体から初めて開発した。キメラ抗体の挙動はマウス抗体のそれと同様であったが、それが共有する３５％の相同性が、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の潜在能力を可能にする。この問題を回避するために、そのマウス対応物に対する同様の結合特性を示した完全なヒトＴＮＴ−１ Ｍａｂ、ＮＨＳ７６を開発した。ＮＨＳ７６は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）との共同作業で開発し、Ｒａｊｉ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞核抽出物を使用するラージｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングすることによって誘導した（Ｓｈａｒｉｆｉら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、（２００１）２０：３０５−３１２）。これは、ＮＳ０マウスミエローマ細胞系において、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｌｏｕｇｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手したグルタミンシンテターゼ発現系を使用して発現した。
【００７６】
ｃｈＴＮＴ−１に対するこの遺伝子操作したヒト対応物が類似の薬物動態特性、インビボの挙動、及び標的指向能力を有することを実証するために、両方の抗体を並行して厳格に試験した。これらの試験のために、ＬＳ１７４Ｔヒト結腸腫瘍保有ヌードマウスにおける生体分布分析を実行し、腫瘍及び正常器官における取り込みのレベルを比較した。さらに、マウス画像処理試験（図２）及びオートラジオグラフ試験（図３）を行って、腫瘍の壊死領域における活発な取り込み、並びに生存可能な組織及び器官における不活発な取り込みを実証した。これらの試験のために、生体分布を、１２５Ｉ−標識ＭＡｂの静脈内注射の１日、２日、３日、５日、及び７日後に実行した。組織１グラム当たりの注射用量パーセントによって示される１〜７日間の組織生体分布並びに腫瘍対正常器官比は、ＮＨＳ７６のより遅い身体クリアランスを示した。しかし、血液レベルが低下するに従って、腫瘍に残存している抗体の量は、７日までに約３％注射用量／グラムまで正常化された。このことは、ｃｈＴＮＴ−１についての３日間の腫瘍保持レベルと比較し得る。また、蛍光スクリーンオートラジオグラフィーは、ＮＨＳ７６がＬＳ１７４Ｔ腫瘍の壊死領域を標的とするのに対して、正常組織は比較的乏しく見えることを示した。これらの試験結果は、ヒト化ＴＮＴ抗体とキメラＴＮＴ抗体の両方の比較し得る性質を確認し、ヒトにおける使用のためにＮＨＳ７６の適切さを実証するための前臨床データを提供する。
【００７７】
（実施例２）
サイトカイン融合タンパク質
ｃｈＴＮＴ−３及びヒトＩＬ−２（参考文献番号１２）、マウスＩＦＮγ（参考文献番号９）、ヒトＩＦＮγ及びＴＮＦα（参考文献番号１０）、並びにｃＨＴＮＴ−３のＣ末端部分に遺伝子工学的に連結されたμＧＭ−ＣＳＦからなるいくつかの融合タンパク質の産生が記載されている。これらの構築、試験、及びこの構築物を用いる免疫療法実験における使用は、以下に手短に記載される。
【００７８】
ａ．ｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質の構築、発現、及び精製
ｃｈＴＮＴ−３（ＩｇＧ１γ）を、以前に記載されたように構築及び発現させた（参考文献番号５）。ＮＨＳ７６（ＩｇＧ１κ）の重鎖及び軽鎖の遺伝子を有するプラスミドを、以前に記載されるように産生した（参考文献番号１０）。候補ｓｃＦｖ抗体を、制限酵素消化、ライゲーション、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む標準的な分子生物学技術を使用して、全抗体に転換した。
【００７９】
ヒトケモカインＬＥＣ遺伝子を、ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞系からＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。次いで、ＬＥＣの成熟ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、そして抗体リーダー配列の翻訳下でＮＨＳ７６重鎖遺伝子のＮ末端に挿入した。次いで、得られる融合遺伝子を発現ベクターｐＥＥ１２に挿入し、次に軽鎖の挿入を行った（図９）。この構築物を、グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅系によってＮＳ０細胞にエレクトロポレーションした。最良の発現クローンを、粗ＤＮＡを抗原として使用する培養上清の間接的ＥＬＩＳＡアッセイによって選択した。
【００８０】
７アミノ酸リンカーペプチドが先行して、ヒトＩＬ−２、ＩＦＮγ、又はＴＮＦα ｃＤＮＡのいずれかを含むＰＣＲ断片を、ヒトγ１末端コドンのすぐ下流に事前に付加されたＮｏｔＩ部位に挿入し、ＴＮＴ−３ ＶＨ／ヒトγ１／ヒトサイトカイン融合遺伝子（参考文献番号９、１０、１２）を産生した。これは、そのＣ末端にヒトＩＬ−２、マウスＩＦＮγ、又はＴＮＦαを有するキメラＴＮＴ−３重鎖からなる融合タンパク質をコードする、発現ベクターｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ ＨＣ／ｈＩＬ−２、ｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ ＨＣ／ｍｕＩＦＮγ、ｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ ＨＣ／ＴＮＦαを生じた。これらの発現ベクターは、キメラＴＮＴ−３軽鎖、ｐＥＥ６／ｃｈＴＮＴ−３軽鎖についての発現ベクターと同時トランスフェクトした。融合タンパク質を、グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅系を使用してＮＳ０マウスミエローマ細胞中で発現させ、８リットルの曝気攪拌タンク培養液から、タンデムプロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【００８１】
キメラ抗体融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実証されるように適切に構築した。ｃｈＴＮＴ−３／ｈＩＬ−２について約２５ｋＤ及び７０ｋＤの２つのバンドに分かれた。これは、その重鎖が約５５ｋＤの見かけの分子量を示したｃｈＴＮＴ−３と比較して、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖とサイトカインとの組合せの分子量に対応する。同様に、ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮγについて２つのバンドに分かれ（ある程度の分解が見られる）、約２５ｋＤ及び７０ｋＤのｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦαは免疫グロブリン軽鎖及び重鎖−サイトカイン融合タンパク質の予想分子量に対応する。ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦ構築物については、成熟μＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ断片を、ｐＥＥ１２発現ベクターのマウスγ２末端コドンのＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩに挿入した。次いで、上記のように、ＰＥＥ１２／ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦを、ｐＥＥ６／ｍｕＴＮＴ−３軽鎖と同時トランスフェクトし、融合タンパク質をＮＳ０マウスミエローマ細胞中で発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２５ＫＤ及び７０ＫＤのおよその分子量を有する２つのバンドを示し、これは、それぞれ、ｍｕＴＮＴ−３軽鎖及び重鎖／サイトカインμＧＭ−ＣＳＦ融合に対応する。
【００８２】
ｂ．ＭＡｂ／サイトカイン融合タンパク質の生物活性
４種の融合タンパク質のサイトカイン部分の各々の生物学的活性を、インビトロアッセイによって決定した。ＩＬ−２生物活性は、ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞の増殖を支持するその能力を試験することによって実証した（Ｇｉｌｌｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７８）１２０：２０２７−２０３１）。異なる濃度のｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２、ｃｈＴＮＴ−３、又は組換えヒトＩＬ−２標準を、２×１０４個のＩＬ−２飢餓ＣＴＬＬ−２細胞とともに２０時間、加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。細胞を、３Ｈ−チミジンで６時間パルス標識し、細胞試料を収集し計数した。次いで、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２の活性を、外挿又はｒＩＬ−２曲線によって、ＩＵ／ｍｇで決定した。
【００８３】
ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質については、μＧＭ−ＣＳＦ部分の生物学的活性は、サイトカイン依存性細胞系ＦＤＣ−Ｐの増殖を支持する能力を測定することによって決定した（Ｄｅｌｔａ−Ｃｒｕｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：５１１２−５１２１）。手短に述べると、５，０００細胞／ウェルのＦＤＣ−Ｐ１を、８ｎｇ／ｍｌから４ｐｇ／ｍｌの濃度範囲のμＧＭ−ＣＳＦ又はｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦの存在下で、９６ウェル培養プレートに３ウェルずつピペッティングした。加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中での４８時間のインキュベーション後、細胞増殖を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して比色定量法によって測定した。このアッセイから、ｍｕＴＮＴ−３／μＧＭ−ＣＳＦについてのＥＤ５０が０．４から１．０ｎｇ／ｍｌであることが示された。
【００８４】
ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮγ融合タンパク質のｍｕＩＦＮγ部分については、ＲＡＷ ２６４．７マウスマクロファージ細胞における一酸化窒素（ＮＯ）の誘導を決定するためのアッセイを実行した（Ｋｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９６）１９８：２０３−２０９）。細胞を、ｒｍｕＩＦＮ−γ、ｃｈＴＮＴ−３、又はｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γを補充した完全培地中で２４時間増殖させ、次に、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を使用して、ＮＯの安定な分解産物である亜硝酸（ＮＯ２）について上清の分析を行った。この方法によると、ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γ融合タンパク質の比活性は、約４５０Ｕ／μｇであると計算された。ｃｈＴＮＴ−３はこのアッセイにおいて陰性であった。ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γの生物学的活性もまた、ＷＥＨＩ−３マウス骨髄単球細胞系において、フローサイトメトリーを使用してＭＨＣクラスＩＩ分子発現のアップレギュレーションによって測定した。細胞を、組換えｍｕＩＦＮγ、ｃｈＴＮＴ−３、又はｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γを補充した完全培地中で４８時間増殖させ、次いで、フローサイトメトリーによってＭＨＣクラスＩＩ分子発現についてアッセイした。この方法を使用して、融合タンパク質の比活性は４３０Ｕ／μｇ（参考文献番号９）であった。対照的に、ｃｈＴＮＴ−３はＭＨＣクラスＩＩアップレギュレーションを誘導することができなかった。
【００８５】
ｃｈＴＮＴ−３／ｈｕＴＮＦα融合タンパク質について、ＴＮＦα部分の生物学的活性を、以前に記載されたように、Ｈｅｐ−２細胞増殖の阻害パーセントによって決定した（Ｈｏｇａｎ，Ｍ．Ｍ．「腫瘍壊死因子α及びβの測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α ａｎｄ β）」Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．６１０１−６１０５頁、１９９３）。手短に述べると、Ｈｅｐ−２ヒト類表皮癌細胞を９６ウェル培養プレートに、１×１０５細胞／ウェルで、１０％ＦＣＭを含むＭＥＭ中に播種する。このプレートを３７℃で２〜３時間インキュベートし、さらにｒｈｕＴＮＦα又はｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦαを段階希釈でプレートに加えた。最大溶解量を決定するために、２００ｎｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを使用した。ＴＮＦα試料の付加後、プレートを再度３７℃、１８時間インキュベートし、次いでＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で穏やかに洗浄した。細胞死を改変クリスタルバイオレットアッセイによって定量した。この方法において、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα融合タンパク質は１０．８Ｕ／μｇの比活性を有することが見出された。
【００８６】
ｃ．融合タンパク質の免疫反応性及びアビディティー定数
融合タンパク質の免疫反応性を、上記に記載されたように、固定化Ｒａｊｉリンパ腫細胞への結合によって決定した。すべてのｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質は、同様の結合定数（０．５〜１×１０９Ｍ−１）を有することが見出され、ｃｈＴＮＴ−３の結合定数（１．４×１０９Ｍ−１）と比較可能であった。これは、ｃｈＴＮＴ−３の重鎖へのサイトカインの遺伝子連結が抗原結合を有意に妨害しなかったことを示す。
【００８７】
ｄ．薬物動態及び生体分布試験
クリアランス試験及び生体分布試験を、すべての融合タンパク質の薬物動態クリアランスの半減期及び腫瘍の取り込みを決定するために実行した。薬物動態試験のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１２５Ｉ標識した融合タンパク質又は裸の抗体を注射し、注射の時点及びその後の選択された時点での全身活性を微小線量計で測定した。これらの試験結果を図２に示す。クリアランス時間の顕著な違いが、ｍｕＩＦＮγ融合タンパク質と、ＩＬ−２、ＴＮＦα、及びｍｕＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質との間に記録される。ｃｈＴＮＴ−３は、これらの試験において異常に長い半減期を有することが見出された。
【００８８】
【表２】
【００８９】
生体分布的試験のために、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、約１０７個の腫瘍細胞を左側腹に皮下で接種した。５日後、この時点で腫瘍は約０．５〜１ｃｍ直径に達し、マウスに１２５Ｉ−標識抗体又は１２５Ｉ−標識抗体／サイトカインを含む０．１ｍＬ接種物を静脈内注射した。マウスをペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって屠殺し、上記に示すように、注射の３日後及び７日後に血液、腫瘍、及び選択された器官を取り出し、秤量した。表２に要約されたこれらの試験の結果は、融合タンパク質の迅速なクリアランスの薬物動態効果が、ｃｈＴＮＴ−３及びｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＩＦＮ−γの腫瘍及び正常器官の生体分布が比較された場合に明らかであったことを示す。すべての融合タンパク質の方が、腫瘍の取り込みは、注射の３日後及び７日後の両方でｃｈＴＮＴ−３について見られたものよりも有意に低かった。しかし、正常な器官の取り込みを反映し且つサイトカインに起因する可能性のある毒性の指標を適用する腫瘍対器官比は、同等か、又はすべての融合タンパク質の方が、わずかに高い程でさえあった。
【００９０】
要約すると、上記のインビトロによる特性決定試験は、すべての融合タンパク質が、抗原に対するそれらの結合親和性、並びにそれらの直接的な細胞傷害性効果及び免疫調節性機能を維持することが可能であったことを実証する。インビボでは、融合タンパク質は、親のｃｈＴＮＴ−３よりも実質的に短い全身半減期を有すことが見出されたが、生体分布分析によって示されるように、腫瘍を標的とすることができた。腫瘍中でのそれらの保持及び正常組織からの迅速なクリアランスのために、この融合タンパク質は、ｃｈＴＮＴ−３と等価か又はそれよりも高い正常組織／腫瘍比を有することが見出された。
【００９１】
（実施例３）
ケモカイン融合タンパク質
ａ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の構築、発現、及び精製
ｃｈＴＮＴ−３（ＩｇＧ１κ）の軽鎖遺伝子（ｐＥＥ６／ｈＣＭＶ−ＬＣ）及び重鎖遺伝子（ｐＥＥ１２／ＨＣ）を有するプラスミドを、以前に記載されたように産生した（５、１２）。ヒトケモカインＬＥＣ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）３１、１２４７−１２５４）によってＨｅｐＧ２肝臓癌細胞系から、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してクローニングし、全ＲＮＡを得た。次いで、ＬＥＣの成熟ｃＤＮＡを、プライマー５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号４）及び５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧ−ＧＧＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号５）を使用するＰＣＲによって増幅し、抗体のリーダー配列の翻訳下で、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩによって、ｃｈＴＮＴ−３の重鎖遺伝子のＮ末端に挿入した。次いで、得られる融合遺伝子を発現ベクターｐＥＥ１２に挿入し、グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅系によって規定されるように、エレクトロポレーションによって、ＮＳ０細胞にｐＥＥ６／ＴＮＴ−３軽鎖とともに同時トランスフェクションした。細胞培養培地をトランスフェクションの３週間後に毎週交換し、この時点で最良の発現クローンは、以前に記載されたように（参考文献番号５）、抗原として粗ＤＮＡを使用する培養上清の間接的ＥＬＩＳＡアッセイによって選択した。大量の融合タンパク質を産生するために、高発現クローンを８リットルの曝気攪拌フラスコ中で、５％熱不活化（６８℃で１時間、断続的に攪拌しながら）透析ウシ胎児血清を含む選択培地中で増殖させ、インキュベーション及び融合タンパク質の分解の間にＮＳ０細胞によるタンパク質分解性酵素の誘導を除去した。次いで、分泌された融合タンパク質を、タンデムプロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーの手順によって、清澄化細胞培養上清から精製した。融合タンパク質の純度は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって、及び溶媒系として０．０５Ｍリン酸緩衝液及び０．４Ｍ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．１を使用するＨＰＬＣによって調べた。精製後、融合タンパク質を０．２２μｍ Ｎａｌｇｅｎｅ使い捨てフィルターユニットを通して濾過し、分注し、１０ｍｌ滅菌チューブ中で、長期保存のために−２０℃で保存した。
【００９２】
ＬＥＣ遺伝子のＣ末端は、５アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーを使用してｃｈＴＮＴ−３の重鎖遺伝子のＮ末端に融合した。融合したＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の重鎖（図１）を抗体リーダーの下で翻訳させ、発現した融合タンパク質は以下に示されるようにその生物学的活性を保持していることが見出された。最高のＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３産生サブクローンは、静置培養において約２０μｇ／ｍｌ／１０６細胞／２４時間を分泌した。分子量及び融合タンパク質のアセンブリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実証した。これは、キメラ免疫グロブリン重鎖及びＬＥＣの合計、並びに抗体軽鎖にそれぞれ対応する、約６７ｋＤ及び２５ｋＤの２つのバンドを示した。構築物の純度をＨＰＬＣによって確認し、これは、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３が約４４２ｓの保持時間の主ピークを有することを示した。これらの分析は、融合タンパク質が−２０℃、６カ月間までの保存後でさえ完全なままであることを示した。
【００９３】
ｂ．走化性アッセイ
ＬＥＣ融合タンパク質の生物活性は、９６ウェル微小走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）において製造業者のプロトコールにおいて記載されるように標的細胞の移動を測定することによって実証された。手短に述べると、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３、組換えヒトＬＥＣ、又は親のｃｈＴＮＴ−３を、結合培地（１％ＢＳＡ及び２５ｎｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０）中で０．３９ｎＭから５０ｎＭまで段階希釈した（Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｂｌｏｏｄ（１９９８）９１：４２４２−４２４７；Ｚａｃｈ−Ｈｏｗａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ（２０００）９６：８４０−８４５）。この溶液を微小走化性装置の下側のチャンバー中に配置した。次いで、１０５ＴＨＰ−１ヒト単球細胞を含む１００μＬの結合培地を上側のチャンバーに加えて、加湿した５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター中での１．５時間のインキュベーション後、移動した細胞のパーセンテージを計算して、移動指数（（結合培地に曝露された細胞の平均数）で除算した（ケモカイン及び融合タンパク質に曝露された細胞の平均数））を決定した。すべてのアッセイは３重に実行した。
【００９４】
遊離のヒト組換えＬＥＣ及び融合タンパク質はＴＨＰ−１細胞移動を誘導した。融合タンパク質に曝露されたＴＨＰ−１細胞の移動は、１．６ｎＭまで低い濃度で開始し１２．５ｎＭでピークに達する、用量依存性であった。遊離のヒト組換えＬＥＣは、このアッセイにおいて約２５ｎＭの高濃度でピークとなった。親の抗体（ｃｈＴＮＴ−３）に曝露されたＴＨＰ−１細胞はまったく移動を示さず、融合タンパク質のＬＥＣ部分の生物学的活性を確証した。
【００９５】
ｃ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の放射性標識及び放射性結合体の安定性
１２５Ｉ−標識された融合タンパク質を、以前に記載されたように（５、７）、改変クロラミン−Ｔ法を使用して調製した。手短に述べると、１ｍＣｉ（３７ＭＢｑ）の放射性ヨード及び２０μＬのクロラミン−Ｔの水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬ ＰＢＳ中の１００μｇ ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を含む５ｍＬ試験管に加えた。２分後、２０μＬのメタ重亜硫酸ナトリウムで溶液をクエンチした。各反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用して精製し、代表的には９０〜９５％収率を回収した。放射性標識された抗体を注射のためにＰＢＳで希釈し、４℃で保存し、そして放射性標識後２時間以内に投与した。放射性ヨード標識された抗体を、シリカゲル含浸させたグラスファイバーからなる分析用インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）システム（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。細片（２×２０ｃｍ）を、使用前の１１０℃、１５分間の加熱によって活性化し、１μＬの試料をスポットし、風乾し、そしてメタノール／Ｈ２Ｏ（８０：２０）を用いて約１０ｃｍ溶離させ、再度風乾し、半分に切断し、そして結合したタンパク質及び遊離の放射性ヨードを決定するために計数した。ＩＴＬＣ分析は、０のＲｆ値（ＭＡｂ結合）及び９９％より高い放射性化学物質の純度を明らかにした。インビトロ血清安定性もまた、以前に記載されたように評価した（５）。手短に述べると、放射性標識されたＭＡｂをマウス血清中で３７℃、４８時間インキュベートする。トリクロロ酢酸沈殿及び遠心分離後、ＭＡｂ結合放射能をγカウンターで測定した。約９５％の活性がトリクロロ酢酸沈殿であり、この時間の間では放射性ヨードの放出は実質的に検出されなかった。
【００９６】
ｄ．アビディティー決定
精製ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３のアビディティー定数を決定するために、固定化細胞ラジオイムノアッセイを、以前に記載されたように実行した（１２）。手短に述べると、Ｒａｊｉリンパ腫細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＥＭグレード２％パラホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）で室温で１０分間固定し、そしてＰＢＳで再度洗浄し、その後０．２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で４℃にて保存した。１０から１１０ｎｇの１２５Ｉ−標識ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を、１０６固定化Ｒａｊｉ細胞と室温で１時間インキュベートした。この細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄して、いかなる未結合の抗体をも除去し、γカウンターで計数した。結合した融合タンパク質の量を、残存する結合した細胞の放射能（ｃｐｍ）及び融合タンパク質の比活性から決定した。データのＳｃａｔｃｈａｒｄプロット分析を使用して傾きを得た。この傾きから、平衡又はアビディティー定数Ｋが、式Ｋ＝−（傾き／ｎ）によって計算された。ここで、ｎは抗体の価数（ＩｇＧについては２）である。ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３は、ｃｈＴＮＴ−３（１．４×１０９Ｍ−１）と同様の結合定数（１．０×１０９Ｍ−１）を有することが見出された（５）。これは、ｃｈＴＮＴ−３の重鎖の可変領域へのＬＥＣの遺伝子連結が抗原結合を有意に妨害しなかったことを示す。
【００９７】
ｅ．薬物動態試験及び生体分布試験
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の薬物動態クリアランスを決定した。遊離の放射性ヨードの甲状腺の取り込みをブロックするために事前に２〜３日間、飲用水中にヨードカリウムを与えたマウスの群（ｎ＝５）に、０．１ｍＬ接種物を使用して、１２５Ｉ−標識融合タンパク質（３０〜４０μＣｉ／マウス）の静脈内注射を投与した。注射の時点及び注射後の選択された時点での全身活性を、ＣＲＣ−７微小線量計で測定した。データを分析し、ＰＳＴＲＩＰ薬物動態プログラム（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ）によって半減期を決定した。結果を平均±標準偏差として表現し、有意なレベル（Ｐ値）を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して決定した。これらの試験から、１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３が３時間±２０分（ｐ≦０．０１）のＴ１／２を有することが見出されたことが決定された。
【００９８】
腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の生体分布を決定するために使用した。手短に述べると、マウスに１０７ＭＡＤ１０９ｓｃを含む０．２ｍｌを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ−認可プロトコールを使用して左側腹に注射した。腫瘍を５日間、それらが直径約０．５ｃｍに達するまで増殖させた。次いで、マウスに１００μＣｉ／１０μｇの１２５Ｉ−標識ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を含む０．１ｍＬ接種物を静脈内注射した。マウスをペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって注射の３時間後、６時間後、１２時間後、及び２４時間後に屠殺し、そして器官、血液、及び腫瘍を取り出し、且つ秤量し、試料中の放射能をγカウンター中で測定した。各マウスについて、データはパーセント注射用量／グラム（％ＩＤ／ｇ）及び腫瘍対器官比として表現した。１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３は、注射後１２時間及び２４時間の両方で、２．４％ＩＤ／ｇ（ｐ≦０．０１）の腫瘍取り込みを実証した。１２５Ｉ−ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の迅速なクリアランスはまた、すべての時点における血液及び他の正常組織の大部分での放射能レベルの減少を示し（ｐ≦０．０１）、高い腫瘍対器官比を生じた。これらのデータは、放射標識されたＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３が、腫瘍部位において優秀な保持を伴って腫瘍に特異的に結合することを実証する。
【００９９】
（実施例４）
免疫療法試験
ａ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝７）に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ−認可プロトコールの下で、約１０７のＭＡＤ１０９細胞、Ｃｏｌｏｎ２６細胞、又はＲＥＮＣＡ細胞を含む０．２ｍＬ接種物を左側腹に皮下注射した。腫瘍を５〜７日間、それらが直径約０．５ｃｍに達するまで増殖させた。次いで、腫瘍保有マウスの群を、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３（２０μｇ）、ＰＢＳ、又はｃｈＴＮＴ−３（２０μｇ）を伴う、０．１ｍＬ接種物で静脈内治療した。すべての群を１日５回治療し、１日おきに三次元のキャリパー測定によって腫瘍増殖をモニターした。腫瘍体積は式：長さ×幅×高さによって計算された。結果を平均±標準偏差として表現し有意なレベル（Ｐ値）を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して決定した。
【０１００】
一旦腫瘍が確立されると、マウスを毎日５回、２０μｇのＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３で治療した。図２に示されるように、２つのモデルについて、本試験の１９日目までのＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療は、未知量の対照と比較して、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルにおいて５５％（ｐ≦０．０５）の腫瘍増殖の減少、ＭＡＤ１０９腫瘍モデルにおける３７％（ｐ≦０．０５）の減少、及びＲＥＮＣＡ腫瘍モデルにおける４２％（ｐ≦０．０５）の減少を示した。
【０１０１】
ｂ．サイトカイン融合タンパク質との併用療法
ｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質を、ＣＯＬＯＮ２６結腸腺癌、ＭＡＤ１０９肺腺癌、及び以下の図３において示されるように、ＲＥＮＣＡ腎臓細胞癌を含むＢＡＬＢ／ｃマウスの異なる固形腫瘍モデルにおいて試験した。これらの試験のために、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、左側腹に５×１０６腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍を５〜７日間、それらが直径約０．５ｃｍ（０．２ｃｍ３）に達するまで増殖させ、マウスを群に分け（ｎ＝５）、４日間連続して毎日皮下注射した。次いで、腫瘍の増殖を、キャリパー測定によって１日おきに１７日目まで追跡し、そこで実験を終了した。０．１ｍｌ接種物中の融合タンパク質の用量は、ｃｈＴＮＴ−３／ｍｕＧＭ−ＣＳＦがより毒性であり５μｇ／用量の使用を必要とする以外は、２０μｇであった。融合タンパク質の組み合わせた使用される場合、これらは０．１ｍｌで接種物を維持するためにあらかじめ混合された。対照群は生理食塩水のみ又は２０μｇのｃｈＴＮＴ−３を受容し、これは、３つの腫瘍モデルの増殖曲線に効果がなかった。４つの個々の実験からの対照群の試験は、増殖曲線が非常に再現性が高いことを示した。図３に示される３つの腫瘍モデルにおけるこれらの実験の結果は、これらのモデルのうちの２つにおいて、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα、及びｃｈＴＮＴ−３／ＩＦＮγの組合せを受容するマウスが、大部分の腫瘍退行を示し、これは１７日目で対照群の約８０％であると見積もられることを実証した。個々の融合タンパク質はこれらの腫瘍モデルにおいて様々な有効性の程度を有したが、この組合せ、又はｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦαの代わりにｍｕＴＮＴ−３／ｍｕＧＭ−ＣＳＦが置換されたものが最も有効であった。キメラ抗体はこれらの融合タンパク質のいくつかの構築において使用されたので、治療は１回の４日間の期間に限定された。この限定のために、腫瘍は、処置の中断の直後に対照群のペースと同じペースで増殖し始めた。それゆえに、これらの処置治療効果は一過性であり、より持続する効果及び腫瘍の完全な退行のためには第２又は第３の処置過程の追加が必要と思われる。
【０１０２】
ｃ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３、ｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質を用いる併用療法
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、約５×１０６ＭＡＤ１０９マウス肺腺癌細胞を皮下接種した。５日後、腫瘍が直径約０．５ｃｍに達し、マウスに、２０μｇのＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３単独、又は２０μｇのＴＮＴ−３／ＩＦＮγ、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα、ｃｈＴＮＴ−３／ＧＭ−ＣＳＦ若しくはｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２を伴う、０．１ｍｌの接種物を注射した。すべての群を１日５回治療し、１日おきに三次元のキャリパー測定によって腫瘍増殖をモニターした。腫瘍体積は式：長さ×幅×高さによって計算された。結果を平均±標準偏差として表現した。図４において示されるように、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３及び４種のｃｈＴＮＴ−３サイトカイン融合タンパク質の各々を用いる併用療法は最小限の改善のみを生じたが、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２を含む組合せは１７日までに増殖曲線の平板化を示した。
【０１０３】
（実施例５）
ａ．ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の免疫組織化学及び組織試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、上記のように左側腹に１０７腫瘍細胞を注射した。腫瘍移植の７日後、マウスを、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３（２０μｇ）、ＰＢＳ、又はＴＮＴ−３（２０μｇ）を用いて、１日５回静脈内治療した。次いで、各群からのマウスを、腫瘍移植の１０日後、１２日後、１４日後、及び１６日後に屠殺し、腫瘍を切除し、そしてパラフィン包埋のために１０％中性緩衝化ホルマリン（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）中に固定するか、又は凍結切片のためにＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｌａｂ−Ｔｅｋ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＩＩ）中で液体窒素中で急速冷凍するかのいずれかであった。ＭＡＤ１０９腫瘍保有マウスからのパラフィン包埋切片を、形態学的試験のために、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫組織化学試験のために、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍保有マウスからの腫瘍の凍結切片を、リンパ、ＰＭＮ、及び樹状細胞亜集団を染色するための、ビオチン化抗ＣＤ４＋、抗ＣＤ８＋、抗ＣＤ１１ｂ＋、抗汎内皮、抗ＣＤ１１ｃ＋、抗ＣＤ１９＋、抗ＣＤ３ｅ＋、及び抗４５Ｒ＋（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）抗血清で染色した。次いで切片をＨＲＰ−結合体化ストレプトアビジンとともにインキュベートし、比色定量用作用剤で発色させ、その後ｈｒ ＆ Ｅで染色した。顕微鏡による知見を、Ｏｐｔｒｏｎｉｘデジタルカメラを使用して記録した。
【０１０４】
ケモカインの抗癌活性は、樹状細胞、ＰＭＮ、及びリンパ球亜集団の腫瘍への補充、並びにそれらの抗血管形成活性のためである。それゆえに、どの亜集団がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の抗腫瘍活性の原因であったかを同定することは興味深い。このことを達成するために、組織学的試験及び免疫組織化学試験を、治療したマウスから取り出した腫瘍切片上で実行した。驚くべきことに、形態学的試験は、ＬＥＣ／ｃｇＴＮＴ−３治療が、試験された腫瘍試料中で顕著な壊死及び血管のうっ血を誘導することを明らかにした。
【０１０５】
しかし、治療されたマウス及び対照マウスにおける血管の数は、汎内皮抗体を用いる免疫組織化学染色によって決定されるように、異なっていないことが見出された。ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療腫瘍はまた、これらの切片においてリンパ球の顕著な浸潤を示した。Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、及びＰＭＮ特異的抗体を用いる組織切片の免疫組織化学染色は、腫瘍に浸潤している亜集団の存在を同定するために使用された。これらの試験のために、Ｃｏｌｏｎ２６保有ＢＡＬＢ／ｃマウスからの凍結切片を、治療の完了の４日後に（腫瘍移植の１６日後に）免疫組織化学染色のために調製した。これらの試験の結果は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療腫瘍において、ＰＭＮ、樹状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の浸潤が未治療群よりも高いことを明らかにした。より早い時点で取り出した腫瘍は、樹状細胞及びマクロファージの浸潤が、治療３日目までに最初に観察され、治療の完了の４日後まで腫瘍中に保持されることを示した。対照的に、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）浸潤（１５〜２０細胞／４００倍視野）は、樹状細胞について見られたものほど劇的ではなく、且つ治療の完了の２日後に最初に見られた。ＰＭＮ及び樹状細胞による浸潤は、これらの試験においておそらく最も劇的な知見であった。
【０１０６】
ｂ．枯渇化試験
これらの腫瘍モデルの抑制のために部分的な原因であるＴ細胞の亜集団を評価するために、枯渇化試験を、上記の治療試験とともに実行した。マウスの群に、上記のようにＣｏｌｏｎ２６結腸癌を移植し、腫瘍が直径０．５ｃｍに達すると、これらは５日毎に、ＣＤ４＋（０．５ｍｇ／用量、クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８＋（０．５ｍｇ／用量、クローンＨ３５）、又はＮＫ細胞（０．３５ｍｇ／用量、抗−アシアロ−ＧＭ）に特異的な細胞傷害性抗血清を受容し、ＦＡＣＳ分析によって示されるように、これらの各々のＴ細胞亜集団の各々を末梢循環中で＜２％まで減少した。特定の亜集団がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３免疫療法のための道具であるならば、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３によって誘導される観察される腫瘍抑制が妨害され、腫瘍は対照治療マウスと同様の増殖曲線を有する。図５に示されるように、これらの抗血清各々単独による枯渇化は、ｃｈＴＮＴ−３治療対照の腫瘍の増殖から、その腫瘍の増殖を変化しなかった。対照的に、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療マウスは、５０％より高い阻害を示した。予測されるように、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療と組み合わせたＣＤ８＋及びＮＫ枯渇化治療は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の抗腫瘍活性を無効にし、このことは、これらのリンパ球亜集団がＬＥＣ機能において非常に重要であることを示す。対照的に、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３治療と組み合わせたＣＤ４＋枯渇化を受けるマウスは完全な治癒に至り、予想外であり且つ潜在的に非常に意味のある知見である。
【０１０７】
ＣＤ４＋集団の約１０％を表すＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＬＥＣ／ｃｈＴＢＴ−３と組み合わせて使用される場合に、等しく印象的な結果を生じ得るか否かを決定するために、さらなる枯渇化試験が次に実行された。以下の図６に示されるように、ＬＥＣ／ｃｈＴＢＴ−３の使用の前のラットモノクローナル抗体ＰＣ６１を使用するこれらのＴ細胞の枯渇化は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣｏｌｏｎ２６腫瘍増殖に対して高度に免疫抑制性であり、これは、このＴ免疫調節性細胞の小さな集団が、免疫療法の間の免疫反応の抑制原因であることを実証した。これらのすべての実験において、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３免疫療法は完全に非毒性であることが見出され、このことは、これらの実験においてある程度の毒性型を実証した、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２、ｃｈＴＮＴ−３／ＴＮＦα、及びｍｕＴＮＡ−３／ｍｕＧＭ−ＣＳＦの使用に対して顕著な対比をなすことが注目されるべきである。驚くべきことに、ＰＣ６１が、対照ｃｈＴＮＴ−３と組み合わせてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇化するために使用されたときに、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍は、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３単独とほぼ同程度の腫瘍増殖の印象的な減少を示した。しかし、これらの治療群の両方が、それらの移植された腫瘍のマウスを治癒しなかった。完全な且つ持続する寛解は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞枯渇化がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３と組み合わせて実行されるまで得られなかった。
【０１０８】
参考文献リスト：
１．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．、Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｍ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．：ヒト癌における壊死性損傷の検出のための新規な方法（Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ）。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５：５８４２−５８４８、１９８８。
２．Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｍ、Ｈａｎｓｅｎ，Ｅ．Ｂ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ Ａ．Ｌ．：多核性腫瘍スフェロイドにおけるモノクローナル抗体ＴＮＴ−１の拡散及び結合（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｉｔｉｂｏｄｙ ＴＮＴ−１ ｉｎ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８３：２００−２０４、１９９１。
３．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．、Ｃｈｅｎ，Ｄ．、Ａｎｓａｒｉ，Ａ．、Ｎａｊａｆｉ，Ａ．、Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．、Ｌｅｅ，Ｋ．、Ｈｕ，Ｅ．、Ｒｏｓｅｎ，Ｐ．、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｋ．、Ｓｔａｉｎ，Ｓ．、Ｗｅａｖｅｒ，Ｆ．、及びＴａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．：Ｉ−１３１標識ＴＮＴ−１ Ｆ（ａｂ’）２モノクローナル抗体を使用する、ヒト腫瘍における壊死性損傷における放射免疫検出（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｉ−１３１ ｌａｂｅｌｅｄ ＴＮＴ−１ Ｆ（ａｂ’）２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ，＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、４：１５１−１６１、１９９１。
４．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．、Ｎａｅｖｅ，Ｇ．Ｓ．、Ｇａｆｆａｒ，Ｓ．Ａ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：ＴＮＴ−１及びＴＮＴ−２モノクローナル抗体のヒストンに対する結合の免疫学的及び生化学的分析（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＮＴ−１ ａｎｄ ＴＮＴ−２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅｓ）。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６８９−６９８、１９９３。
５．Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｂｉｏｌａ，Ｂ．Ｈ．、Ｙｎｎ，Ａ．、Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：ｃｈＴＮＴ−３／Ｂ、固形腫瘍の腫瘍壊死治療のためのＤＮＡを指向する、新規に化学修飾されたキメラモノクローナル抗体（ｃｈＴＮＴ−３／Ｂ，ａ ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＤＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）。Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １３：２５５−２６８、１９９８。
６．Ｇｉｏｖａｒｅｌｌｉ Ｍ、Ｃａｐｐｅｌｌｏ Ｐ、Ｆｏｒｎｉ Ｇ、Ｓａｌｃｅｄｏ ＴＭ、Ｐａｕｌ Ａ．、ＬｅＦｌｅｕｒ ＤＷ、Ｎａｒｄｅｌｌｉ Ｂ、Ｃａｒｌｏ ＥＤ、Ｌｏｌｌｉｎｉ Ｐ−Ｌ、Ｒｕｂｅｎ Ｓ、Ｕｌｌｒｉｃｈ Ｓ、Ｇａｒｏｔｔａ Ｇ、Ｍｕｓｉａｎｉ Ｐ。局所的放出されるＬＥＣケモカインによって誘発される腫瘍拒絶及び免疫記憶はＡＰＣ、リンパ球、及び顆粒球の印象的補充と関連する（Ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｍｏｒｙ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｌｏｃａｌｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｄ ＬＥＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｉｍｐｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｃｒｕｉｔｅｅｎｔ ｏｆ ＡＰＣｓ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３２００−３２０６、２０００。
７．Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｉｎｇ，Ｓ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：固形腫瘍の壊死領域を指向するキメラＴＮＴ−１に対する、ファージディスプレイ由来モノクローナル抗体（ＮＨＳ７６）対応物（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＮＨＳ７６）Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ｔｏ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＮＴ−１ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｃｒｏｔｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２０：３０５−３１２、２００１。
８．Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｍ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．、Ｌｉ，Ｚ．、及びＴａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．：細胞表面抗原（Ｌｙｍ−１）及び細胞内抗原（ＴＮＴ−１）に対するモノクローナル抗体のディファレンシャルな腫瘍内局在を実証する比較的オートラジオグラフ試験（Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｒａ−ｔｕｍｏｒ ｌａｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌａｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ（Ｌｙｍ−１）ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｒ（ＴＮＴ−１）ａｎｔｉｇｅｎｓ）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３１：１０５９−１０６６、１９９０。
９．Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ｍ．Ｍ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：固形悪性腫瘍の免疫療法のためのキメラＴＮＴ−３抗体−マウス−インターフェロンγ融合タンパク質（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＮＴ−３ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｕｒｉｎｅ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）。投稿中。
１０．Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：ヒトインターフェロンγ及び腫瘍壊死因子αキメラＴＮＴ−３融合タンパク質の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｌｐｈａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＮＴ−３ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｈｙｂｏｒｉｄｏｍｉｃｓ、２１：４２１−４３２、２００２。
１１．Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｌｙｎｃｈ，Ｍ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｍ．、及びＥｐｓｔｅｒｎ，Ａ．Ｌ．：Ｂ細胞悪性細胞に対する特異性を有する、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子又はインターロイキン−２を含むキメラＣＬＬ−１抗体融合タンパク質は、腫瘍指向性を保持しながらエフェクター機能の増強を示す（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｃｌｌ−１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｂ−ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｗｈｉｌｅ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）。Ｂｌｏｏｄ ８９：４４３７−４４４７、１９９７。
１２．Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｕ，Ｐ．、Ｋｈａｎｎａ，Ｃ．、及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ：ＤＮＡを指向するモノクローナル抗体／インターロイキン−２融合タンパク質は固形腫瘍への治療分子の送達を増強する（Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＤＮＡ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）。Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５：５１−６０、１９９９。
１３．ＬｅＢｅｒｔｈｏｎ，Ｂ．、Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．、Ｃｈａｒａｋ，Ｂ．Ｓ．、Ａｍｉｔａｂｈａ，Ｍ．及びＥｐｓｔｅｉｎ．Ａ．Ｌ．：新規な血管作用性インターロイキン−２免疫結合体によって誘導される高分子の腫瘍取り込みの増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：２６９４−２６９８、１９９１。
１４．Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：腫瘍におけるモノクローナル抗体取り込みの増強に対する新規な７つの血管作用性免疫結合体の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｎｅｗ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）。Ｃａｎｃｅｒ（に対する補遺）、７３（３）：８２４−８３１、１９９４。
１５．Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．、Ｈｏｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．、Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．：血管作用性免疫結合体を使用するＩＵｄＲの化学療法指標の改善（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ＩＵｄＲ ｕｓｉｎｇ ａ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。Ｒａｄｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、７９：８３−８６、１９９７。
【０１０９】
本明細書中で言及されたすべての特許及び刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すものである。すべての特許及び刊行物は、あたかも各個々の刊行物が特異的且つ個々に参照として援用されるのと同程度に、参照として本明細書に援用される。
【０１１０】
本明細書中で適切に例示的に記載した本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント、限定が存在しなくとも実施できる。したがって、例えば、本明細書中の各々の場合において、用語「含む」「から実質的になる」及び「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。利用されてきた用語及び表現は、記載のためであり且つ限定のためではなく、及び、このような用語及び表現の使用において、示され且つ記載される特徴の任意の等価物を除外する意図は存在しないが、種々の改変が、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び選択的な特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示される概念の改変及び変異が、当業者によって行われ得ること、並びにこのような改変及び変異が、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の構築を実証する概略図である。Ｇｌｙ４ＳｅｒリンカーはＬＥＣ遺伝子とｃｈＴＮＴ−３の重鎖可変領域の間に局在する。
【図２】２種のマウス固形腫瘍のＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３の免疫療法の図である。
【図３】ＲＥＮＣＡ腎臓癌腫瘍モデルにおけるｃｈＴＮＴ−３／サイトカイン融合タンパク質を使用する組合せ免疫療法の図である。各融合タンパク質はサイトカイン部分を列挙することによってチャート中に省略して示す。
【図４】ＭＡＤ１０９を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３及びｃｈＴＮＴ−３／サイトカインの併用療法の図である。
【図５】抗ＣＤ４＋抗血清、抗ＣＤ８＋抗血清、及び抗ＮＫ細胞抗血清との併用療法を示す、ＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を用いるＴ細胞枯渇化試験の図である。
【図６】抗ＣＤ２５＋抗血清を示すＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３を用いるＴ細胞枯渇化試験の図である。
【図７】例示的なヒトＬＥＣ（配列番号１）のヌクレオチド配列の図である。
【図８】例示的なヒトＬＥＣ前駆体ケモカイン（配列番号２）及びヒトＬＥＣ成熟ケモカイン（配列番号３）のアミノ酸配列の図である。
【図９】ＮＨＳ７６に融合されたＬＥＣ遺伝子を発現するための発現ベクターマップの図である。Ｇｌｙ４ＳｅｒからなるリンカーはＬＥＣ遺伝子とＮＨＳ７６重鎖可変領域との間に挿入された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において腫瘍のサイズを減少させるか、又は癌細胞の増殖を阻害する方法であって、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む有効量の癌療法剤を前記個体に投与する工程を含み、前記癌療法剤が前記個体の癌細胞又は腫瘍に局在する方法。
【請求項２】
癌に罹患している個体において転移性癌の発生を減少させるか、又は阻害する方法であって、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む有効量の癌療法剤を前記個体に投与する工程を含み、前記癌療法剤が前記個体の癌細胞又は腫瘍に局在する方法。
【請求項３】
個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、個体から免疫調節性Ｔ細胞をエキソビボで除去することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、個体における免疫調節性Ｔ細胞をインビボで枯渇化又は不活性化させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、免疫調節性Ｔ細胞に結合する少なくとも１種の抗体を使用して達成される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の抗体がＩＬ−２レセプターに特異的である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−２レセプターに特異的な抗体がＣＤ２５に特異的な抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、前記癌療法剤を投与する前に実行される、請求項３から８までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
癌に対する細胞傷害活性を有するＴ細胞を投与する工程をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞を投与する工程が、個体からＴ細胞を除去し、そのＴ細胞を活性化し、次いで前記個体に活性化Ｔ細胞を投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌療法剤がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３ではないという条件で、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む、癌療法剤。
【請求項１３】
前記癌標的指向分子が抗体である、請求項１２に記載の癌療法剤。
【請求項１４】
前記抗体が腫瘍細胞表面抗原に特異的である、請求項１３に記載の癌療法剤。
【請求項１５】
前記抗体が腫瘍のストローマ成分に特異的である、請求項１３に記載の癌療法剤。
【請求項１６】
前記抗体が細胞内抗原に特異的である、請求項１３に記載の癌療法剤。
【請求項１７】
前記抗体が核内抗原に特異的である、請求項１６に記載の癌療法剤。
【請求項１８】
前記抗体が、マウス抗体ＴＮＴ−１、ＴＮＴ−２、ＴＮＴ−３又はＮＨＳ７６のマウス型、キメラ型、ヒト化型、又はヒト型である、請求項１２、１３、１６、又は１７に記載の癌療法剤。
【請求項１９】
前記癌標的指向分子及びＬＥＣが共有結合で結合されている、請求項１２に記載の癌療法剤。
【請求項２０】
前記癌標的指向分子が遺伝子融合によってＬＥＣに連結されたタンパク質である、請求項１２から１９までのいずれかに記載の癌療法剤。
【請求項２１】
ＬＥＣがそのＣ末端で前記癌標的指向分子のＮ末端に融合される、請求項２０に記載の癌療法剤。
【請求項２２】
前記癌標的指向分子が抗体であり、且つＬＥＣが前記抗体の軽鎖若しくは重鎖のＮ末端に融合されるか、又はＬＥＣが前記抗体の軽鎖及び重鎖のＮ末端に融合される、請求項１２から２０までのいずれかに記載の癌療法剤。
【請求項２３】
請求項１２から２２までのいずれかに記載の癌療法剤及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項１】
個体において腫瘍のサイズを減少させるか、又は癌細胞の増殖を阻害する方法であって、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む有効量の癌療法剤を前記個体に投与する工程を含み、前記癌療法剤が前記個体の癌細胞又は腫瘍に局在する方法。
【請求項２】
癌に罹患している個体において転移性癌の発生を減少させるか、又は阻害する方法であって、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む有効量の癌療法剤を前記個体に投与する工程を含み、前記癌療法剤が前記個体の癌細胞又は腫瘍に局在する方法。
【請求項３】
個体における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、個体から免疫調節性Ｔ細胞をエキソビボで除去することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、個体における免疫調節性Ｔ細胞をインビボで枯渇化又は不活性化させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、免疫調節性Ｔ細胞に結合する少なくとも１種の抗体を使用して達成される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の抗体がＩＬ−２レセプターに特異的である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−２レセプターに特異的な抗体がＣＤ２５に特異的な抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる工程が、前記癌療法剤を投与する前に実行される、請求項３から８までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
癌に対する細胞傷害活性を有するＴ細胞を投与する工程をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞を投与する工程が、個体からＴ細胞を除去し、そのＴ細胞を活性化し、次いで前記個体に活性化Ｔ細胞を投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌療法剤がＬＥＣ／ｃｈＴＮＴ−３ではないという条件で、肝発現ケモカイン（ＬＥＣ）に連結された癌標的指向分子を含む、癌療法剤。
【請求項１３】
前記癌標的指向分子が抗体である、請求項１２に記載の癌療法剤。
【請求項１４】
前記抗体が腫瘍細胞表面抗原に特異的である、請求項１３に記載の癌療法剤。
【請求項１５】
前記抗体が腫瘍のストローマ成分に特異的である、請求項１３に記載の癌療法剤。
【請求項１６】
前記抗体が細胞内抗原に特異的である、請求項１３に記載の癌療法剤。
【請求項１７】
前記抗体が核内抗原に特異的である、請求項１６に記載の癌療法剤。
【請求項１８】
前記抗体が、マウス抗体ＴＮＴ−１、ＴＮＴ−２、ＴＮＴ−３又はＮＨＳ７６のマウス型、キメラ型、ヒト化型、又はヒト型である、請求項１２、１３、１６、又は１７に記載の癌療法剤。
【請求項１９】
前記癌標的指向分子及びＬＥＣが共有結合で結合されている、請求項１２に記載の癌療法剤。
【請求項２０】
前記癌標的指向分子が遺伝子融合によってＬＥＣに連結されたタンパク質である、請求項１２から１９までのいずれかに記載の癌療法剤。
【請求項２１】
ＬＥＣがそのＣ末端で前記癌標的指向分子のＮ末端に融合される、請求項２０に記載の癌療法剤。
【請求項２２】
前記癌標的指向分子が抗体であり、且つＬＥＣが前記抗体の軽鎖若しくは重鎖のＮ末端に融合されるか、又はＬＥＣが前記抗体の軽鎖及び重鎖のＮ末端に融合される、請求項１２から２０までのいずれかに記載の癌療法剤。
【請求項２３】
請求項１２から２２までのいずれかに記載の癌療法剤及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５１７９７０（Ｐ２００６−５１７９７０Ａ）
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０３５２１（Ｐ２００６−５０３５２１）
【出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００４１１６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４４３７
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５００２７９６２３）ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００４１１６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４４３７
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５００２７９６２３）ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]