癌性疾患修飾抗体
本発明は、スクリーニングの新しい模範を使用している産生性の患者癌疾患修飾抗体のための方法に関するものである。抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、原発腫瘍と腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。 抗癌抗体は、毒素、酵素、放射性合成物と血液原細胞に抱合型でありえる。更なる発明は、ラミニン受容体1前駆体タンパク質37LRPと結合する5LAC23モノクローナル抗体(またはそこから引き出される抗原性の結合フラグメント)の能力の周りを回転するそのような診断と処置に関するものであり、具体的には、通常、認識される特定の抗原性部位で肝細胞腺腫細胞で過剰発現した5LAC−23の直接的な結合に依存するさまざまな平均値による肝細胞腺腫の診断と処置に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌疾患修飾抗体(CDMAB)の単離および生産に、そして、治療的で診断過程の、任意に一つ以上の化学療法剤と結合するこれらのCDMABの使用に関するものである。更なる発明は、本発明のCDMABを利用する結合アッセイに関するものである。より詳しくは、この発明は、診断とラミニン受容体1前駆体タンパク質37LRPと結合する5LAC−23モノクローナル抗体(またはそこから引き出される抗原性の結合フラグメント)の能力の周りを回転するガン疾患の治療に関するものであり、特に特にそれによって、そして、通常、認識される特定の抗原性部位で5LAC−23の直接的な結合に依存するさまざまな平均値による肝細胞腺腫の診断と処置に対するほとんどは、肝細胞腺腫細胞で過剰発現する。
【背景技術】
【0002】
かかわらず、同様に、同じ段階で、現在の治療は、同じ癌種を有する全ての患者を処置する。これらの患者の少なくとも30パーセントは第1の線治療に失敗する。このように、処置の更なる回と治療失敗、転移と、最後に、死亡の増加した確率に導く。処置への優れたアプローチは、特定の個人のための治療の専用化である。専用化に向く唯一の現在の治療は、手術である。化学療法と放射線治療は患者に合わせて調整されることができない、そして、ほとんどの場合、手術は単独で産生性の治癒に不十分である。モノクローナル抗体の出現で、各々の抗体が一つのエピトープに導かれることができる時から、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になった。さらにまた、独自に特定の個人の腫瘍を定義するエピトープの星座にあてられる抗体の組合せを発生することは、可能である。ガンで通常の細胞との間の有意差が癌細胞が悪性変換細胞に特有である抗原を含むということであると認めて、科学界はモノクローナル抗体が特に特にこれらの癌抗原と結合することによって悪性変換細胞を目標とするようになっていることがありえると長く考えた;このように信念を引き起こして、そのモノクローナル抗体は、癌細胞を除去するために、「魔法のBullets」として用いられることができる。しかしながら、一つのモノクローナル抗体も癌の全ての例でサーブすることができるというわけでないと現在広く認められる、そして、目標とされた癌治療として、クラスとして、そのモノクローナル抗体は展開されることができる。すぐに開示された発明の教義に従って分離されるモノクローナル抗体は、全身腫瘍組織量を減らすことによる例のために、患者に有益で、ここでは癌疾患修飾抗体(CDMAB)または「抗癌」抗体とさまざまに称する方法でガン疾病経過を修正することが示された。今のところ、癌患者には通常処置のほとんど任意選択がない。癌治療への規格化されたアプローチは、世界的な生存と罹患率の改善をもたらした。しかしながら、特定の個人に、これらの改善された統計が、それらの個人状況の改善と、必ずしも相関するというわけではない。このように、開業医は同じコホートでそれぞれに他の患者の各々の腫瘍を処置することができた方法論が出される場合、これはちょうどその一人の人に裁断治療の固有の接近ができるようにするだろう。治療のそのようなコースは、理想的には、治癒の率を増加させて、より良好な結果を生む。そして、それによってlong−フェルト必要を満たす。歴史的に、ポリクローナル抗体の使用が、ヒト癌の治療における限られた成功で使われた。リンパ腫と白血病havebeenはヒト血漿と交渉した、しかし、ほとんど遷延性緩解または反応がなかった。さらにまた、再現性と付加給付でない欠如が、化学療法と比較してあった。乳癌、黒色腫と腎細胞癌のような固形腫瘍は、対応して予測不可能で無効な結果で、人血、チンパンジー血清、ヒト血漿とウマ血清で治療されもした。モノクローナル抗体の多くの臨床試験が、固形腫瘍のためにあった。1980年代に、少なくとも4つの臨床試験が、1人の応答者だけを特異性抗原に対して抗体を使用しているか、組織選択性に基づく少なくとも47人の患者から作り出したヒト乳癌のためにあった。それは、37人の患者が約4分の1が部分的な反応率を持った、そして、追加25セントには軽度のまたは安定病態進歩があった反応のために評価されてあった本研究においてCISPLATIN.と結合してヒト化の抗Her2/neu抗体(HERCEPTIN)を使用している成功した臨床試験があった1998年まで、なかった。進行に時間の中央値の間で応答者は、5.3ヵ月の反応期間の中央値による8.4ヵ月であった。HERCEPTINが、TaxolR(3.0ヵ月)単独を受けた群に、割に、結果が抗体療法を受けた人々のために疾患進行までの時間の中央値の増加に示したTaxolR. Clinical検査さらにTaxolR(6.9ヵ月)と結合して第1の線使用のために1998年に承認された。わずかな増加が、生存期間の中央値でもあった;TaxolR処置腕を加えたHERCEPTIN対TaxolR処置のための22対18ヵ月は、単独で武装する。加えて、完全(8対2パーセント)で部分的な応答者(34対15パーセント)inthe抗体さらにTaxolRの組合せ群の数の増加が、単独で割にTaxolRにあった。しかしながら、HERCEPTINとTaxolRによる処置は、TaxolR処置(13対1パーセントそれぞれ)単独に、割に心毒性のより高い発生率に導いた。免疫組織化学で測定されるにつれて、臨床試験では、Her2/neuの表現レベルはHERCEPTIN治療に対する反応を予測した。転移性乳癌患者の間で、Her2/neu(スケールを記録している病理学の上で2−3+に指定される)の過剰発現を持つ人々だけは、抗体療法から利益を得た。転移性乳癌が認められる約25パーセントの患者は、Her2/neuを過剰発現して、HERCEPTINで治療されることができた;過剰発現以外の患者、そして、このように、利益を得なくて、抗体を用いた治療を受けない。HERCEPTIN治療のための選択は疾患の分子マーカーの識別に基づく処置にふさわしい患者を選択する方法を意味する、そして、この方法はアメリカ食品医薬局によって診断ルーチンとして承認された。しかしながら、乳癌患者の大きい会ったことのない必要が、まだある。HERCEPTIN処置を利益を受けることができる人々さえ、化学療法をまだ必要として、従って、少なくともある程度に、この種の処置の副作用をまだ扱わなければならない。結腸直腸癌を調査している臨床試験は、糖蛋白と糖脂質目標に対して抗体を含む。17−アイソレーション増幅器(それには、腺癌のために若干の特異性がある)のような抗体受けられたPhase 2を分析的にするパーシャルレスポンスを持っている1人の患者だけを有する60人以上の患者で試験。他の試行において、17−1Aの使用は、添加されたシクロホスファミドを使用しているプロトコルで、52人の患者の間で1つの完全寛解と2つのやや有効だけを発生した。17−1Aが関係している他の試行は、類似していた結果を得た。現在まで、示されない17−IAhaveのPhase臨床実験中は、段階HI大腸癌のためにアジュバント療法として効力を高めた。まず最初にイメージングのためにも承認されるヒト化のネズミのモノクローナル抗体の使用は、腫瘍退縮を発生しなかった。最近だけ、どんな陽性結果でも、モノクローナル抗体を用いて結腸直腸癌臨床研究からあった。2004年に、ERBITUXはイリノテカンに基づく化学療法に不応性であるEGFRを表している転移性の結腸直腸癌患者の第2の線治療のために承認された。2−腕Phase II臨床研究と一回の腕検査からの成績は、イリノテカンと結合するERBITUXがそれぞれ4.1と6.5ヵ月の疾患進行までの時間の中央値でそれぞれ23と15パーセントの反応率を持つことを示した。同じ2−腕Phase II臨床研究ともう一つの一回の腕検査からの成績は、ERBITUX単独による処置がそれぞれ1.5と4.2ヵ月の疾患進行までの時間の中央値でそれぞれ11と9パーセントの反応率に帰着することを示した。従ってスイスと米国で、イリノテカンとintheアメリカ合衆国(ERBITUX処置単独)と結合するERBITUX処置は、失敗した第1の線イリノテカン治療を受ける大腸癌患者の第2の線治療として承認された。従って、HERCEPTINの様に、スイスの処置は、モノクローナル抗体と化学療法の組合せとして承認されるだけである。加えて、スイスと米国での処置は、第2の線治療として患者のために承認されるだけである。また、2004年に、AVASTINは転移性の結腸直腸癌の第1の線治療として、静脈内5−フルオロウラシルに基づく化学療法と結合して、使用のために承認された。第三相臨床研究結果は、5−フルオ尿ウラシル(20ヵ月対16ヵ月それぞれ)単独を用いた治療を受ける患者と比較してAVASTIN+5‐フルオロウラシルで治療される患者の生存期間の中央値で、延長を示した。しかしながら、再びHERCEPTIN andERBITUXの様に、処置はモノクローナル抗体と化学療法の組合せとして承認されるだけである。加えて、承認された診断ルーチンが免疫組織化学プラットフォームに基づく癌診断のために、HERCEPTINとERBITUX抗原性の目標に基礎をおいたアメリカF.D.Aが、ある。同様に、等しく劣った結果が、肺、脳、卵巣の(膵臓の)前立腺と胃癌のためにあった。抗GD3モノクローナル抗体のいくらかの限られた成功inthe使用が、黒色腫のためにあった。このように、ヒトの必要条件である成功した小さい動物試験にもかかわらず、臨床試験(ここまで試験された抗体)が大部分のためで、効果がなかったことが分かる。肺、脳、卵巣の(膵臓の)前立腺、胃癌と肝細胞癌のための劣った結果であり続ける。非−肺小細胞癌のために最も有望な最近の結果は、処置がモノクローナル抗体を含んだPhase II臨床試験から生まれた(SGN−15;dox−BR96(抗Sialyl−LeX))化学療法剤TAXOTERE.と結合する細胞殺害薬ドキソルビシンに抱合型であるTAXOTEREは、肺癌の第2の線治療のための唯一の食品医薬品庁承認された化学療法である。最初のデータは、単独でTAXOTEREと比較して改善された総生存率を示す。本研究のために補充された62人の患者から、残留する3分の1が単独でTAXOTEREを受ける間、3分の2はTAXOTEREと結合してSGN−15を受けた。TAXOTEREと結合するSGN−15の投与を受けた患者のために、総生存率の中央値は単独で割にTAXOTEREの投与を受けた患者のための5.9ヵ月につき7.3ヵ月であった。1年と18ヵ月総生存率は、それぞれ単独でTAXOTEREの投与を受けた患者のためにそれぞれ24と8パーセントと比較してSGN−15+TAXOTEREを受けている患者のための29と18パーセントであった。更なる臨床試験は、この薬のために予定される。SGN−15がマーケティングのために承認されなかったにもかかわらず、癌のためのいくつかの他の抗体複合体は2000年以降アメリカ食品医薬局の承認を得た。これらは、再発性非Hodgkinリンパ腫の治療のために、再発された急性骨髄性白血病の治療、非Hodgkinリンパ腫の治療のためのZEVALIN(ibritumomab tiuxetan、Yttrium抱合型のRITUXEVIAB、ヒト化抗CD20 MAb)、BEXXAR(1−131は、tositumomabを活用させた、抗CD20 MAb)のためにMYLOTARG(gemtuzumab ozogamicin、ヒト化抗CD33 MAb)を含む。これらの抗体は癌特異的な分子に対して開発された。そして、それはいずれの毒素もまたは同位元素にそれらを接合に適当にした。血液原疾患だけが抱合型の抗体を用いた現在うまく治療を受けることは明瞭である、そして、固形腫瘍(例えば肝細胞癌)はそのような治療をまだ必要とする。浸潤と転移がそうである腫瘍は、癌細胞を含む一連のプロセスと宿主によって余分の細胞マトリックスを特徴づけた。基底膜は、それらに基づく細胞を系統化することにおいて重要な役割を果たす専門余分の細胞構造である。腫瘍細胞の転移は、細胞外基質(ECM)の構成要素で、細胞の相互作用を含む。ラミニンは細胞付着(増殖)を促進する基底膜の主要成分である成長、分化、そして、遊走(クラインマン・ヘキソキナーゼその他は、J Cell Biochem 1985(217:317−25)である。小マーティンGは、アール、Annual Rev Cell Biol 1987、3である:57−85。小BeckKは、アール、FASEB J 1990、4である:148−60).生体外でインビボのモデルは癌浸潤と関係しているラミニンと結合している腫瘍細胞を示した、遊走、そして、転移するcability(小テッラノーヴァVPは
、アール、Cancerレニウム1982、42である:2265〜2269。Varani Jなど、病理Am Jは、1983、111ある:27−34.小バースキーSHは、アール、JクランInvest 1984、74:843 ― 848 ― である。Malinoff HL、Int J Cancer 1984、33:651−655。小カネモトKは、アール、ProcNatl Acad Sci米国1990、87である:2279−2283)。67kDラミニン受容体(67LR)、非インテグリン高親和性は表現が癌細胞でかなり増加して、他の細胞表面タンパク質の間でラミニンと相互に作用するラミニン−結合タンパク質である(Malinoff HLその他は、Int J Cnacer 1984(33:651−655)である。ラオCNその他は、Bicohem Biophys Res Commun 1983(111:804 ― 808 )である。テッラノーヴァVPその他は、Proc Natl Acad Sci USA 1983(80:444−448)である。MalinoffHその他は、J Cell Biol 1983(96:1475〜1480)である。Ruyman RBその他は、J Cell Biol 1988(107:1863〜1871)である。アルベルダ・スフィンゴミエリンその他は、FASEB J 1990(4:2868〜2880)である。雹Department of Employmentその他は、J Cell Biol 1990(110:2175 ― 2184 )である)。それは67LRの表示が胸部(大腸)のような癌で増加することを明らかにされた、そして、正常組織と比較した胃癌‖(Cioce Vその他は、J Natl Cancer Inst 1991(83:29−36)である。カストロノバVその他は、Am J Pathol 1990(137:1373〜1381)である。D’Errico Aその他は、Mod Pathol 1991(4:239−246)である)。67kDラミニン受容体(67LR;表1)最初はネズミの黒色腫の細胞膜から分離した(小ラオは、アール(1983)である。Biochem Biophysレニウム。Commun。111:804−808)、線維肉しゅ細胞(Malinoff及びWicha(1983)。J Cell Biol 96:1475−1479)、そして、通常のウシの筋細胞‖(小Lesotは、アール(1983)である。EMBO J 2:861).それ以来、それは多数の種で発見されていて、人体組織の幅広い範囲で存在する(見本用は、Barsoumローラーとコギン2000をみる。細胞MoI Biolレット語。5:207−230;小メナードが、アール(1998のJ. Cell.)である生化学67:155−165; Mecham 1991アンヌRev Cell Biol 7:71−91)。
【0003】
【表1】
【0004】
37kD ラミニン結合タンパク質(37LBP)未成熟ラミニンは、受容体たんぱく(iLRP):67LRのための32kD ラミニン結合タンパク質(LBP 32)ヒト相補DNAは最初は悪性結腸癌から分離された(それゆえに、タンパク質は大腸癌ラミニン結合タンパク質としても知られている;小雌羊は、アール(1988)である。85:6394−6398)、そして、最初に予想されるより、小さい。相補DNA予測された配列は、32kDの算出量で、295のアミノ酸性蛋白のためにコードする。しかしながら、それはSDS−PAGEゲルの上で37−44kDで通常動作する。そして、それは酸性タンパク質(算出π4.83)の還元型の電気泳動易動度による可能性がある。A少数(16)、N末端の方のプレゼントは、疎水性アミノ酸である(カストロノバ、Taraboletti及びソーブル(1991)。J. Biol. Chem. 266:20440−20446)、それは細胞膜にわたる可能性がある。37kDタンパク質と67kDタンパク質は抗原性に関連があることが示された(小ラオは、アール(1989)である;生化学28:7476−7486)黒色腫細胞に対して行われるパルス‐チェイス実験が発生する37kDタンパク質が67kD製品に追跡されることを示す、(小カストロノバは、アール(1991)である。生化学Biophys。レニウム。Commun。177:177−183).これらの結果は、2つのタンパク質の直接的な前駆体−製品関係があることを示唆した。それ故、37kDタンパク質は、37kDラミニン受容体前駆体と称される(37LRP;表1)。パルス‐チェイス実験は前駆体と最終的な67LR(カストロノバなど、1991)の間で少しの中間形もの存在を明らかにしなかった、しかし、5OkD分解生成物は発見されていた。37kDポリペプチドには細胞質と膜での多機能性の役割がある可能性があって、67LRの配位子を結合している構成要素である可能性がある(エリアス・カンポその他、病理Am Jは、1992、141ある:ノー1073.5−1083)。癌細胞において、67kDタンパク質に対する抗体が細胞表面と細胞質(Wever UMその他は、Cancerレニウム1987、47である:5691−5698)と結合することを示された。それは完全には、最終的なレセプターが、脂肪酸パルミチン酸塩によるアシル化以外は、67kDレセプターを成し遂げるために細胞によって作られるよく理解されている方法でない。そして、オレイン酸剤とステアリン酸エステルは含まれる可能性がある(ランドヴスキ、Dratz及びスターキー(1995)。34:11276−87;小Butoは、アール(1998のJ. Cell Biochem. 69)である:244−251).広範囲な糖化は、複雑にならない。予測された相補DNA配列はNにリンクされた糖化のために、そして、セリンとトレオニン残りの存在にもかかわらず共通配列部位を含まない、Oにリンクされたグリコシル群の証拠がない(小カストロノバは、アール(1991)である。生化学Biophys。レニウム。Commun。177:177−183;ランドヴスキ、Dratz及びスターキー(1995)。34:11276−87).しかしながら、カストロノバ(カストロノバ(1993のInvasion Metastasis 13):1−30)は67LRがcross−がβ−ガラクトシダーゼ結合性レクチンと反応するエピトープを表すように提案した。67LRは、脂質(ランドヴスキ、Dratz及びスターキー、1998)によって結合される前駆体ポリペプチドの二量体の成り立つ可能性がある。ヘテロ二量体化がレクチンのようなタンパク質またはガレクチン3で起こる可能性があることを示唆された(小カストロノバは、アール(1991)である;小Butoは、アール(1998)である)。抗ガレクチン−3抗体は、ガレクチン3だけでなく67LR(小Butoが、アール(1998)である)も認めた。レセプターの最終的な構造は、解明されていない。培養で細胞の表面から放棄されるとき67LRラミニンと結合するその能力を保持する(小Karpatovaは、アール(1996)である。J. Cell。生化学60:226−503)。67LRがどのように細胞膜に取り付けられるかは、いまだ明らかでない。レセプターがそのN末端の終わりの方へ16の疎水性アミノ酸を持つにもかかわらず、それが必須膜タンパク質として存在することよりむしろ会合分子と対話するかもしれない。ithasにしかしなから、確立するポリペプチドのアミノ末端基が、実際、この領域が他の分子と相互に作用することを示唆している非−透過させられた細胞で到達できない(小カストロノバは、アール(1991)である。J. Biol. Chem. 3020440−20446;小Wewerは、アール(1987のCancerレニウム)である。47:5691−5698).アクセサリーファクターが67LRを伴う可能性がある、または、それがアクセサリー分子自体として作用することを示唆された。そのような性質は、結合している細胞表面および/またはラミニンに輸送を援助する可能性がある。67LRの同時発現と肺小細胞癌細胞系のαeβiがラミニンに細胞接着で直接相互関係のある点に注意された‖(小Pellergrineは、アール(1994)である。Int J Cancer Suppl 8:116−120).ヒト黒色腫細胞が両方の67LRラミニンとotで処置された?原形質膜に共同転位置されたβi(小ロマノフ王朝は、アール(1994)である。細胞Adhes Commun。2:201−209).α6βiを伴う67LRは、ラミニンにヒト記憶T細胞の集団の高いアビディティ付着の媒介となった(Clanfield andKhakoo(1999)。J. Immunol。163:3430−3440).etalなArdini、1997notedthat‖67LR、そして、共同局在化させられなかったα6β4同時制御された、67LRとα6サブユニットの間の物理的な相互作用を経て(小Ardiniは、アール(1997)である;J. Biol. Chem. 272:2342−2345)。しかしながら、卵巣癌で37LRPメッセンジャーRNAとタンパク質の表現度がα6サブユニットから独立していること(Givant−ホーウィッツ(2003人のクラン)。exp.転移20:599−609;小Skubitzは、アール(1996)である。病理Jは、148:1445−1461である)。一緒に、これらの結果は67LRが細胞質でラミニンに特有のインテグリン(特にα6サブユニット)を一体にする可能性があることを示唆する。そして、両方のレセプターがラミニンの認識に関与する総合ビルとして細胞膜に到達して、相互作用が高さか低親和性(ランドヴスキ、Dratz、スターキー、1995)のうちの1つであるかどうか決定する。3p21.3に活発な人間の37LRP遺伝子地図、癌を伴う遺伝子の変更にしばしば関与している染色体場所(小木材選別人は、アール(1996)である。オンコジーン13:495−503).活性遺伝子は7つのエキソンと6つのイントロンを含む(小木材選別人は、アール1996である。オンコジーン13:495−503;小鳥類の遺伝子Clausseは、アール(1996のDNA Cell Biol 15)である:1009− 1023).それは古典的タタボックスを含まない、しかし、複数の転写開始点がある可能性がある。部位がプロモーター領域に示す4つのSpI、イントロン1の6つのSpI部位と2つのAIu配列が可変スプライシングに影響を及ぼす可能性があるイントロン3にある。イントロン4は核内低分子RNA E2のために配列を含む(小木材選別人は、アール1996である。オンコジーン13:495−503).遺伝子の少なくとも26部は、ヒトゲノムで存在する、高いhomologywiththe機能的な遺伝子を示している全て(etalな木材選別人(1996)。Biochem Biophys Acta。1305:98− 104).これらのコピーのうちの19は、分析されて、機能不全のコピーを引き起こしている謄写刷政府印刷物偽遺伝子であることが示された。これらの偽遺伝子がレトロ位置的なイベントによってきっと発生したと思われる‖(小木材選別人は、アール(1996)である。Biochem Biophys Acta。1305:98−104).ラットとヒト配列が99%の相同性を共有する間、相補DNAはマウス、ウシとヒト配列の間で少なくとも98.3%の相同性で進化の全体を通じて非常に節約される(見本用は、メナードなどを見る、1997。J Cell Biochem 67:155−165)。37LRP遺伝子は、37LRP以外の多数の機能蛋白質を生じるように見える。37LRPタンパク質は、99%の相同性をp40リボソーム関連のタンパク質と共有する(p40ポリペプチド;p40;リボソームタンパク質社;ItPSA)翻訳の機械に関係する(小Makridesは、アール(1988)である。核のAcidレニウム。16:2349;小Tohgoは、アール(1994)である。FEBSレット語。340:133−138;ローゼンタール及びWordeman 1995。J. Cell Sci. 108:245−256).胚目の開発の位置的なマーカーは37LRP相補DNAと同一の遺伝子にもよってコードされる(小Rabacchiは、アール(1990)である。発現109:521−531;McCafferey、ネーブとドレーガー(1990)。PNAS 87:8570−8574).腫瘍胎児性抗原(OFA;37−44kD)、免疫原性の糖蛋白は、齧歯目で人間の腫瘍と初期の胎児で表される。ネズミの37LRPは、最高99.5%のアイデンティティをOFAと共有する(コギン、Barsoum、ローラー1999。抗癌性のResearch 19:5535−5542).それは、37LRPの自動免疫原性の相同体と称された。OFAはマウスとヒトでTとBリンパ球を刺激して、癌において免疫原性の役割を果たすことが示された特に腎臓癌で‖(小Zelle−Rieserは、アール(2001)である。J. Urol。165:1705−9;小ホールトは、アール(2002)である。臨床癌レニウム。8:3369−3376;小ローラーは、アール(1992)である;J. Natl. CancerInst。(ベセズダ)84:602−609;etalなローラー(1994)。J. Immunol。155:755−764;小ローラーは、アール(1995)である。J. Immunol。155:5719−5727;ローラーなど、2001。モッズ。態様Immunibiol。1:191−195;小ローラーは、アール(1999)である。J. Immunol 162:6880−6892).37LRPと67LRmayのアイソフォームまたは相同体が存在することを示唆するなにかの証拠が、ある。55kDタンパク質は、アイデンティティを37LRPと共有しているヒトと鈍い内皮細胞で特定された(etalなアイルランド(1998)。臨床exp.Immunol。112:255−261)、アイソフォームのanda数はネズミの脳組織で見つかった(小シモノーは、アール(2003)である。生物学Chem.384:243−246).これらのタンパク質はさまざまな方向で翻訳後に修正されていておよび/または他の分子と相互に作用している37LRPに起因する可能性があるか、他の非常に相同性遺伝子に起因する可能性がある。67LRの配布があった過剰発現と異常な表面は腫瘍の幅広い範囲にデモをした、メッセンジャーRNAとタンパク質レベルのさまざまな技術によって発見された(見本用は、メナードなどを見る1998;小Barsoumは、アール(2000)である)。37LRPのレベルの変化および/または67LRは、疾患進行、感染度、転移、積極性と予後に関
して腫瘍生物学に影響を及ぼすことが示された。67LRの過剰発現は腫瘍発達で役割を果たしているレセプターと関係していた、進行の段階が腫瘍タイプに依存している可能性がある、(小カンポは、アール(1992)である。Jは、Pathol 41である:1073−83;小デメテルは、アール(1992のCancerレニウム)である。52:1561−1567;小Martignoneは、アール(1992)である。臨床exp.転移10:379−386:乳癌;小バッソは、アール(1993)である;癌15:455−461:黒色腫;小Boukercheは、アール(2004)である。Gene343:191− 201:黒色腫;小Waltregnyは、アール1997である。J. Natl. Caner Inst 89:1224−1227)。冷凍された結腸直腸組織の中の37LRPメッセンジャーRNAの増加は腺腫と比較して腺癌で見られることができたのに、レベルは正常なおよび腺腫組織の間で一定だった。これらの結果は37LRPの表示または67LRが腺腫から腺癌/デュークスC癌まで疾患進行で遅いイベントで相互関係のあることを示唆する(小カンポは、アール(1992)である。Jは、Pathol 41である:1073−83.).対照的に、37LRPメッセンジャーRNAは疾患進行で初期のイベントを提案している腺腫頸部病変が増加した(小デメテルは、アール(1992のCancerレニウム)である。52:1561−1567).67LRは、単球の急性骨髄性白血病で血統関連の抗原としても関係した(AML;小Montouriは、アール(1999)である。臨床癌レニウム。5:1465−1472).他の検査は67LRが感染度と転移で役割を果たす可能性があることを示した、それがさまざまな腫瘍で転移表現型の獲得において重要な役割を果たすことを意味する(小Wewerは、アール(1987)である。癌レニウム47:5691−8;カストロノバ及びソーブル1990。Biochem Biophys Res Commun 68:1110−1117;小Cioceは、アール(1991)である。J Natl Cancer Inst 83:29−36;ソーブル(1993人のセミン)。癌Biol. 4:311−317;カストロノバInvasion Metastasis 1993 13:1−30;あなたなど、1988。PNAS 85:6394−6398;小Pelosiは、アール(1997)である。J. Pathol。183:62−69;小Boukercheは、アール(2004)である。遺伝子343:191−201)。例えば、メッセンジャーRNAのレベルはより大きな悪質な可能性でヒト大腸細胞系と組織が増加することが示された(小Kondahは、アール(1992)である。癌レニウム52:791−796).細胞がpre−であったとき、ヒト線維肉腫細胞系の転移の抑制が思いついて免疫グロブリンG分数(P4G)と交渉した37LRP−一般システムズ理論fusionproteinで免疫されるウサギからの血清の(345bp相補DNA;13kD; etalなナルミ(1999)。Jpn J. Cancer Res.90:425−431).血清も、用量依存的な方法で細胞付着性をラミニンに下げた。37LRPのアンチセンスRNAも、生体外で低分化ヒト結腸癌細胞系の感染度を阻害した(マフネとRavikumar(1992)。J. Surg。レニウム。52:340−346).転移の間の表現がもう一つの非インテグリン・ラミニン結合タンパク質の表現度で減少によって平行にされてしばしばある67LRで増加、ガレクチン−3(バン巣ブリュレetal(1994)。Eur.。J. Cancer 32A:1598−1602;etalなスー(1995)。いる。J. Pathol。147:815− 822;小カストロノバは、アール(1995)である。J. Pathol。179:43−48;小ロッツは、アール(1993)である。PNAS 90:3466− 3470).これらの結果はこれらの2つのラミニン受容体が反対に調整されることを示唆する、そして、これはレセプターが使われているラミニン−結合能の変化を説明する可能性がある。対照的に、ガレクチン3の発現増加と結腸癌の悪性間の直接的な相互関係は、観察された(Schoeppner.etアール(1995のCancer 75):2818〜2826)。発現増加が増殖と著しい腫瘍成長と関係している傾向がある時から、67LR表現は腫瘍の積極性のためのマーカーである可能性もある。37LRPメッセンジャーRNAの増加したレベルはヒト肺癌組織で発見されていた(小サトウは、アール(1992)である。生化学Biophys。レニウム。Commun 182:746−752)、そして、膵内分泌腫瘍‖(小Pelosiは、アール(1997)である。J. Pathol。183:62−69)、それは急速に増殖性だった。ヒト乳頭腫ウイルスと関連する頸部新生物において、37LRPメッセンジャーRNAの増加したレベルは、細胞(デメテルなど、1992)の浸潤性質によるよりむしろ細胞の増殖性の性質と相関していた。ネズミの肺癌細胞系TIlへのアンチセンス37LRP RNAの導入はそれらの倍加時間を延長した(小サトウは、アール(1999)である。臭素。J. Cancer 80:1115−1122).これらの細胞もラミニンでより弱い相互作用を示した、そして、皮下に、アンチセンスRNAを用いた治療を受ける細胞を接種されるマウスの生存期間は長くなった。それが舌端ノルマル1のタンパク分解性の裂開を強化する可能性がある時から、67LRが腫瘍aggressivenssで役割を果たす可能性もあって、従って、基底膜の低下率で援助する(小Ardiniは、アール(2002)である。癌レニウム。62:1321−1325).37LRPの過剰発現および/または67LRは数種類の腫瘍で予後不良を伴う可能性もある(見本用は、Barsoumローラーとコギン2000をみる。細胞MoI Biol Lett.5:207−230;小メナードが、アール(1998のJ. Cell.)であるBiochem.67:155−165;メナード、タリアブーエとColnaghi(1998)。胸部Cancerレニウム。処置52:137−145).予後はラミニンも生産している乳癌で好ましくない(小Martigoneは、アール1993である。J Natl. Cancer学会85:379−386;小ペッレグリーニは、アール(1985のBreast Cancer Res Treat 35)である:195− 199).ヒト・リンパ腫において、67LRは表面ofCD30+未分化大細胞リンパ腫に関して、そして、優秀なB細胞の小さいサブセットで検出可能だった非ホジキンまたはホジキンリンパ腫‖(小カルボーネは、アール(1995)である。うなりなさい。病理学2:541−546).近年では、67LRは腫瘍生物学以外の生物過程に関係した。レセプターがサイトカイン、炎症性の試薬、ラミニンを含む細胞外基質タンパク質に対する相互作用とステロイド(見本用は、メナードなどを見る、1998)によって上方制御されるとわかった。そして、37LRPと67LRが標準状態の下で調整される可能性があることを示唆した。レセプターは、ホスト防御機構でリンパ球化学走性、癒着と自動誘導またはでaroleを演奏する可能性がある。67LRhas人間の活性化の記憶末梢血T細胞(CD4+とCD8+は、良い面を選び出す)の集団(10−15%)の表面で発見する。それは神経ペプチドに反応した上方制御されることも示された(小チェンは、アール(2002人のナット)である。med. 8:1421−1426).フェラリーニによって検査など、γδ+リンパ球からレセプターのための免疫学的な役割が部位が肺癌細胞を殺してできた肺腫瘍で局在化させた1996支持物、67LRに対する相互作用によって仲介する(小フェラリーニは、アール(1996)である。J. Natl. Cancer hist.。88:436−441).ラミニンが共刺激シグナルを提供することができたのに対して、殺害はナチュラル・キラー(NK)細胞、リンフォカイン活性化の(LAK)細胞とT細胞受容体(TCR)から独立していることが示された。67LRmayも、他の細胞型の成長、遊走と輸送に影響を及ぼす。67LRはα(αGMR)と対話する、そして、GM−CSFレセプターのβ(βGMR)サブユニット‖(小チェンは、アール(2003)である。PNAS 100:14000−14005)、そして、GM−CSFレセプター複合体の形成を阻害する。GM−CSFは骨髄様前駆細胞の成長、分化と成熟を調整して、成熟した好中球、好酸球と単核貪食細胞の機能を強化する。67LRは、防止GM−CSF複合体形成によってこれらの活性を阻害する可能性がある。それが刷子縁で、そして、パネート細胞分泌顆粒で見つかった時から、67LRのための分泌源とエンドサイトーシスの役割は黙示的なでもあった(小Shmakovは、アール(2000)である。J. Pathol。191:318−322).67LRがラミニンと相互に作用する正確な方法は、未決定のままである。2つのペプチド領域は、可能なラミニン結合部位として67LRから確認された。これら、Peptide G、37LRPの配列に由来する合成ペプチドのうちの1つは、パリンドローム配列LMWWMLを含む。それは、内皮細胞に腫瘍細胞の結合を阻害するために、ラミニンを結合することが示された、そして、ヌードマウスでヒト黒色腫細胞の転移を増加させること(小カストロノバは、アール(1991のJ Biol. Chem. 266)である:20440−20446;カストロノバ、Tarabolettiとソーブル1991。癌レニウム。51:5672−5678;小Tarabolettiは、アール(1993)である。J. Natl. Cancer。学会85:235−240).ペプチドGが増加して、腫瘍細胞の上でラミニンを結合することを安定させるということを発見された‖(小逸品は、アール(1996)である。J. Biol. Chem. 271:31179− 31184).第2の可能なラミニンを結合している領域は、37LRPのC末端の配列の疎水性からの予測されたであった(a.a.205−229;ランドヴスキ、Uthayakumar、スターキー、1995。臨床exp.転移13:357−372).レセプターのラミニン認識がラクトースに依存している時から、67LRのレクチン領域がラミニンと相互に作用することが、可能でもある(小カストロノバは、アール(1991)である。生化学Biophys。レニウム。Commun。177:177−183).67LRは、ラミニン残基YIGSRと結合する可能性がある(a.a。929−933;βl鎖;Massi、ラオとハッベル(1993)。J. Biol. Chem. 268:8063−8059;ランドヴスキ、Uthayakumar、スターキー、1995。13:357−72)、IKVAV(a.a.2091−2108;α鎖;小Kibbeyは、アール(1993)である。PNAS 90:10150−10153)、そして、LGTIPG‖(a.a.442−446;βl鎖;Mechametal 1989 J. Biol. Chem. 264:16652−16657).67LRは、ラミニン、特にポリ酢酸ビニル(lactosamino)構造、ガラクトース(αl,3)ガラクトース結合とターミナルの非−還元性のβ−ガラクトシル残りの炭水化物成分と結合する可能性もある(Mecham(1991人のアンヌ)。Cell師。生物学7:71−91)。残りYIGSRに対する結合は転移を阻害する(小イワモトは、アール(1996)である。臭素。J. Cancer 73:589−595)、転移がIKVAV相互作用によって刺激される、(小Br
esalierは、アール(1995)である。癌レニウム。55:2476−2480).第1のラミニン受容体の発見以来、67LR、1983年に、少なくとも14の他のラミニン受容体は記載され(Mecham 1991)て、ラミニンの上で同じ結合部位を利用する可能性がある。67LRも、ラミニンに加えて他の分子と相互に作用する。これらはエラスチンを含む(小グロッソは、アール(1991)である。生化学30:3346−3350)、フィブロネクチン(FN)、IV型コラーゲン(小ナラシマンは、アール(1994)である。PNAS 91:7440−7444;小イワブチは、アール(1996のBlood 87)である:365−372)、そして、ヘパリン‖(小グアノシンは、アール(1992)である。PNAS 89:3040−3044).他の検査は、67LRがシンドビスウイルスのためにレセプターとして用いられることを示した(小ワングが、アール(1992のJ. Virol.)である66:4992−5001)、37LRPがプリオン蛋白の取り込みを可能にする、(小リーガーは、アール(1997)である。ナット。med. 3:1383−1387).
【0005】
肝臓癌
肝臓で最も普通型原発性悪性腫瘍は、hepatoceullar癌(HCC)である。HCCの発生率はHepatitis Bのリスクが高い集団で増加する、そして、すでに慢性肝炎、肝硬変、ヘモクロマトーシスと2つの先天性の肝障害(α−1−アンチトリプシン欠損症とtyrosinema)を被っているC. PatientsはHCCを呈するより大きな危険でもある。特定の毒素と化学製品はアフラトキシンを含む原発性肝癌を引き起こす可能性もある。そして、型からの製品がアフリカで不適当に貯蔵型のピーナッツで見つかる。HCCが切除によってうまく除去される場合、再発と転移はありそうである。多数の検査は原発性肝癌と転移性の再発のためにさまざまな予後のマーカーを現した(見本用は、QinとTang(2004)を見る。J Cancer Res Clin Oncol 130:497−513).HCCによる肝疾患の関連は、設計上の変化が原発性肝癌を呈する可能性を増加させる可能性があることを示唆する。標準状態の下で、肝細胞は基底膜(SchaffherとPopper 1963 Gastroenterology 44:230−242)の欠如によって特徴づけられる。細胞外基質タンパク質(ラミニンを含む)肝硬変が発現するにつれて、生じられることができる、そして、構造基底膜を形成して、類洞周辺で寄託する。ラミニン5が通常であるか腫瘍周囲の硬化性の組織で始原HCC小結節で以外存在しないとわかった(小Giannelliは、アール(2003)である。臨床。Research。9:3684−3691).ラミニンはラミニン沈澱物が他のタンパク質の異常な表現度を生じることを示唆しているサイトケラチン19の表現度を誘導することも示された(小Suは、アール(2003)である。世界J Gastroenterol:921−929).それは、ラミニンの表現度がそのレセプターのいずれかの表示を増加させるということである可能性がある。67LRが1990年に肝細胞で表されるとわかった(小クレメントは、アール(1990)である。J. Cell Biol. 110:185−192)、それが唯一のラミニン受容体でなかったにもかかわらず、現れなさい。67LR陽性細胞の数の増加は、HCCと肝硬変患者から取り出される肝臓試料で、近隣の実質と比較して腫瘍性領域で観察された(Grigioniなど(1991(Am J Pathol 138):647−654)。もう一つの検査(小オザキは、アール(1998)である。腸43:837−842)正常肝組織で発見された弱い37LRPメッセンジャーRNA表現。メッセンジャーRNA濃度は慢性肝炎で非癌肝臓組織が増加して、腫瘍地方に更に上昇した。37LRP翻訳と発現タンパク質は本研究の未検であった(小オザキは、アール(1998)である。腸43:837−842).67LRのさらなる生合成はRNAとタンパク質の増加間の直接的な相互関係で転移性のHCC組織で観察された(小鄭は、アール(1997)である。J Tongji医科大学。17:200−202).L−02通常の肝細胞と癌細胞系HepG2とSMMC−7721は細胞系の腫瘍州と相関しなかった37LRPメッセンジャーRNAと67LR表現の様々なパターンを示した(小鄭は、アール(2002)である。中国のJ Cancer 22:248−252).しかしながら、細胞全体が結合研究のために使われた時からこれが単独で67LRに帰されることができないにもかかわらず、癌細胞系SMMC−7721は他の細胞系より高いラミニン結合能を表す可能性がある。しかしながら、プロテオミクス検査で67LRが高転移性の細胞系MHCC97−Hで上方制御されることが分かった、低転移性の相対物MHCC97−Lと比較して(Li et al, 2001. World J Gastroenterol 7: 630−636; Ding et al, 2004. Proteomics 4; 982− 994).67LRがHCCにおいて直接的な役割を果たすかどうかに関係なく、転移は決定待ちのままである。
【0006】
先行特許
米国特許第5,750、102号は、患者の腫瘍からの細胞が患者由来の細胞または組織からクローンをつくられる可能性があるMHC遺伝子で形質移入されるプロセスを開示する。これらのトランスフェクション細胞は、それから、患者に予防接種をするのに用いられる。
【0007】
米国特許第4,861,581号は、哺乳類の腫瘍性で通常の細胞の内部細胞構成要素に特有であるモノクローナル抗体を得るが、外部部品以外に、モノクローナル抗体にラベルをつけるステップから成立していて、新生細胞を殺すために治療を受けた哺乳類の組織で標識抗体を接触させていて、標識抗体を変性している腫瘍細胞の内部細胞構成要素に結合することを測定することによって治療の効果を決定しているプロセスを開示する。人間の細胞内抗原に導かれる抗体を準備する際に、特許資格は悪性細胞がそのような抗原の便利な供給源を表すと認める。
【0008】
米国特許第5,171,665号は、新しい抗体とその生産方法を提供する。具体的には、特許は強くヒト腫瘍(例えば大腸と肺のそれら)を伴う蛋白抗原と結合する性質を持つモノクローナル抗体の形成を教える、その一方で、非常により小さい程度に正常細胞と結合する。
【0009】
米国特許第5,484,596号はヒト癌患者から外科的に除去腫瘍組織から成立している癌治療の方法を提供する。そして、同時に転移を阻害する間、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置して、生存可能であるが、非腫瘍形成性腫瘍細胞を放射線で治療して、原発腫瘍の抑制性の再発ができる患者のためにワクチンを用意するためにこれらの細胞を使用する。特許は、腫瘍細胞の表面抗原で反応性であるモノクローナル抗体の発現を教える。第4カラム第5行以下参照で述べられるように、特許資格はヒト新形成で活発な特異的免疫療法を表しているモノクローナル抗体の進展で自所性腫瘍細胞を利用する。
【0010】
米国特許5,693,763号は、ヒト癌に特有の糖蛋白抗原が起源の上皮組織に依存していないことを教える。
【0011】
米国特許5,783,186号は、細胞を表しているHer2、抗体を生産しているハイブリドーマ細胞系、抗体を使用している癌を処置する方法と前記抗体を含んでいる医薬組成物でアポトーシスを誘発する抗Her2抗体に引き出される。米国特許第5,849,876号は、腫瘍と非腫瘍組織ソースから精製されるムチン抗原に、モノクローナル抗体の生産のために、新しいハイブリドーマ細胞系を記載する。
【0012】
米国特許第5,869,268号は、方法によって生産されるモノクローナル抗体と同様に、望ましい抗原(モノクローナル抗体を生産する方法)に特有の抗体を生産しているtoamethodfor generatingaヒトlymphocyteをつがれる。特許は、特に診断に役立つ抗HDヒト・モノクローナル抗体の生産と癌の治療に引かれる。
【0013】
米国特許5,869,045号は、抗体(ヒト癌細胞で反応性抗体フラグメント、抗体複合体と単鎖の免疫毒素)に関するものである。抗体にはカルシノーマ細胞の中で内在化する能力があるという点で分子がヒト癌の表面で出席している細胞膜抗原で反応性で、より遠いという点で、これらの抗体が機能する機構は二倍である。そして、結合の後である。そして、それらを特に形成性抗体−薬と抗体−毒素複合体に役立つようにする。それらの無修飾フォームにおいて、抗体も特異的な集中で細胞障害性の性質を呈する。
【0014】
米国特許5,780,033号は、腫瘍治療と予防のために自己抗体の使用を開示する。しかしながら、この抗体は、老いた哺乳類からの抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる1種類の自然抗体であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳類」から来るので、自己抗体が実際に、処置されている患者から来る必要条件がない。加えて、特許は老いた哺乳類から天然で単クローン系抗核自己抗体を開示する、そして、ハイブリドーマ細胞系が単クローン系抗核自己抗体を生産する。
【特許文献1】米国特許第5,750、102号
【特許文献2】米国特許第4,861,581号
【特許文献3】米国特許第5,171,665号
【特許文献4】米国特許第5,484,596号
【特許文献5】米国特許5,693,763号
【特許文献6】米国特許5,783,186号
【特許文献7】米国特許第5,869,268号
【特許文献8】米国特許5,869,045号
【特許文献9】米国特許5,780,033号
【発明の開示】
【0015】
本発明者らは、以前得た米国特許6,180,357(個々にカスタマイズされた癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を選択する方法に導かれる「Individualized Patient Specific Anti−Cancer Antibodies」と名付けられる)。この文書、「抗体」と「モノクローナル抗体」(mAb)が同義的に使われる可能性があって、適当なものとして、ハイブリドーマ(例えばマウスまたはヒト)、免疫複合体と免疫グロブリンフラグメントによって生産される完全な免疫グロブリンと免疫グロブリン、キメラのたとえば〜などとヒト化の免疫グロブリンに由来する組換え型のタンパク質を参照する可能性がある期間、のためにF(腹筋』)、そして、2が分解するF(腹筋)、単鎖の抗体、組換え型の可変部領域(Fv)s、融合タンパク質など。この文書、「組織標本」が少なくとも1つのセル、意味すると理解される用語または細胞の集合の目的が哺乳類から得たFor。芸術で、若干のアミノ酸配列が構造に対する重要な効果またはタンパク質の機能なしでポリペプチドで多様であることができるとよく認められる。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸シーケンスの変形は、通常、許容的でありえる。これらは含む、制限されるために、置換(保存的置換は好まれる)、削除または追加。さらにまた、本発明のCDMABで標準の化学療法(例えば放射性核種)を活用させることはこの発明の範囲の中でである。そして、それによって前記化学療法剤の使用を集中させる。CDMABは毒素、細胞毒性部位、酵素(例えばビオチン複合酵素)または血液原細胞に抱合型でもありえる。そして、それによって抗体複合体を形成する。6BD−25と称されるハイブリドーマ細胞系に由来するモノクローナル抗体に抱合型であるように、そのような抱合部位はこの中に例示される;類似の抗体複合体は、5LAC−23と称されるハイブリドーマ細胞系に由来するモノクローナル抗体を利用して形成されることができた。細胞障害性の薬剤のための担体としての腫瘍関連のモノクローナル抗体の使用は、ここ数年で相当な注意を受けた。このworkhasの多くの目的抱合型の薬または毒素の望まれないものとしばしば時間中毒性副作用を減弱させている間、抗癌薬の効力を高めるためにある。このアプローチが効果的であるために抗体が高く選択的な腫瘍であることが、必要である、まったく、本剤は実行中の、細胞障害性の形の引渡済みである。METHOTREXATEのような細胞毒、DAUNOMYCIN MITOMYCIN C(独占・合併管理委員会)、そして、VINCAhave抗体に取り付ける、そして、派生複合体は、抗腫瘍活性のために調査された。加えて、シュードモナス属Exotoxinのような生物学的製剤とCalicheamicinとAuristatinsのようなより新しい毒素は、それぞれ、抗CD33と抗CD30抗体の有効性を強化するために使用された。多くの例は、遅い非特異的な解放を受ける比較的安定化学結合によって薬に抗体の結合を例示する芸術の中に存在する。Iodine131、Yttrium90またはIndium111のような放射性核種は、腫瘍破壊の目的のためにまたは画像診断のために抗体に抱合型でもありえる。アプローチにかかわりなく、主要な目的は、腫瘍を破壊することになっている:特異的なアプローチは、37LR抗原を表している細胞を目標とする利用できる方法がかなり異なることができるように、利用される特定の抗37LR抗体で測定されることができる。『モノクローナル抗体を修正しているガン疾患のためにコードするハイブリドーマ細胞系を分離することの357の特許で教えられるにつれて、このアプリケーションは方法を産生性の患者の特異的な抗癌抗体のために利用する。これらの抗体は特に1つの腫瘍に作られることができて、このように癌治療の専用化を可能にすることができる。このアプリケーションの前後関係の範囲内で、細胞殺害(細胞障害能)か細胞増殖を(細胞分裂停止)性質を阻害させている抗癌抗体は、今後細胞障害能と称される。これらの抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。個別的抗癌性の処置の見込みは、患者が管理される方法の変化をもたらす。ありそうな臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍は癌疾患修飾抗体より先に存在するパネルから型でありえる。患者は従来は、示される、しかし、利用できる抗体は更に患者を示す際に有用でありえる。患者は既存の抗体を用いたすぐ治療を受けることができるおよび/または、腫瘍に特有の抗体のパネルはこの中に概説される方法を用いてまたはこの中のスクリーニング法と同時のライブラリが開示したファージディスプレイを用いることにより生産されることができる。発生する全ての抗体はanti−のライブラリに加えられる。そして、他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を運ぶことができるという可能性がある時から、癌が抗体である。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌があるどんな患者数ででもガン疾患を処置するために役立つ可能性がある。実質的にUS 6,180,370の、そして、US 6,657,048で概説するものとしてのプロセスを使用して、マウス・モノクローナル抗体6BD−25および5LAC−23は、それぞれ患者の胸部と肺腫瘍生検から細胞でマウスの免疫化の後で得られた。6BD−25抗原は、まず最初に細胞ELISA/FACSによって種々の人間の正常なおよび癌細胞系の上で、発見されていなかった。ビオチンに6BD−25抗体の接合を通して分析の感度を増加させた後に、抗原は乳癌細胞系最低降下高度−MB−231と卵巣癌細胞系C−13(OVCA−429とOV2008)の上で発見されていた。乳癌細胞系Hs574.Tは、浄化されていない6BD−25の細胞毒性に影響されやすかった。MCF−乳癌細胞系7、卵巣癌細胞系OVCAR−3と大腸癌細胞系SWl 116は細胞系が試験したわずか3つの癌であった。そして、純化された6BD−25の細胞毒性に影響されやすかった。FACS分析を用いることにより、5LAC−23のための抗原は、SW620大腸癌細胞系の上で見つけられて、他の細胞系の何の上でも、試験されなかった。胸部(Hs574.T)、肺(NCI−H661)と皮膚(A2058)癌細胞系は、浄化されていない5LAC−23の細胞毒性に影響されやすかった。卵巣癌細胞系OVCAR−3は細胞系が試験した唯一の癌であった。そして、純化された5LAC−23の細胞毒性に影響されやすかった。マウスに移植されるとき、OVCAR−3とSWlに対する6BD−25細胞毒性の結果は116セル、培養でこれらの細胞の方へその抗腫瘍活性によって更に広げられた。大腸癌のインビボのモデルにおいて、ヒトSWl116細胞が襟首で卵巣癌のインビボのモデルのためにの間皮下に移植されたこと、人間のOVCAR−3細胞は、腹腔内に移植された。両方のモデルのために、それは特定の免疫細胞の欠如によるヒト腫瘍細胞を拒絶することができないにつれて、免疫不全のマウスが使われた。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予言者と考えられる。マウスの異種移植片は、支質、中心壊死とネオ脈管構造を発達させている固形腫瘍として成長する。腫瘍細胞系OVCAR−3とSWl 116は、免疫不全のマウスでインビボの異種移植モデルとして評価された。良好な移植またはOVCAR−3とSWl116腫瘍の『take−rateする』、そして、標準の化学療法剤に対する腫瘍の感度は、それらを適切なモデルとして描写した。親の細胞系と細胞系の異型が、広範囲にわたる治療薬を評価するために、異種移植腫瘍モデルで使われた。ヒト大腸癌の予防的インビボのモデルにおいて、6BD−25は、7週の期間の間毎週の注射が続く腫瘍細胞の着床の前に、マウス一日に与えられた。6BD−25処置は、バッファ制御より、治療期間の間に腫瘍成長を抑制することに有意に効果的だった(p=0.001)。処置相終了後、6BD−25を与えられるマウスは、対照群のわずか54パーセントに増大した腫瘍が認められた。後処理追跡調査期間の間に、6BD−25の処置効果は維持された、そして、処置群の平均の腫瘍容積は測定相(p=0.002)の終わりまでの対照よりかなり少なくし続けた。それが毒性(還元型の体重または臨床苦痛の他の表れを含む)の少しの合図も誘導しなかったので、6BD−25処置は安全に見えた。このように、それがヒト大腸癌の安定したモデルで制御処置群と比較して腫瘍成長を遅延させたので、6BD−25処置は有効だった。大腸癌の予防的インビボの腫瘍モデルの他に、6BD−25は、予防卵巣のインビボの腫瘍モデルで、OVCAR−3細胞に対して抗腫瘍活性を示した。この異種移植腫瘍モデルにおいて、OVCAR−3卵巣の癌細胞は、合計10の用量のために移植の後、日を始めている処置で、免疫不全のマウスにintraperitoenallyに移植された。6BD−25による処置は、バッファ制御と比較された。体重が、腫瘍発達の代わりの程度として使われた。重量増加が腹水形成に起因する時から、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。移植後の(処置の終わりの後の16日)日80で、投与群のマウスは、対照群(p=0.002)よりかなり少ない体重を持った。重要な生存利点が、6BD−25対バッファ制御(p<0.02)の処置でもあった。また、それが毒性または臨床苦痛の少しの表れも誘導しなかったので、6BD−25処置は安全に見えた。6BD−25の抗腫瘍活性と毒性のその見た目の不足は、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が発達する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者から得られる赤血球に抱合型でありえて、転移の処置のために再注入した。転移癌のほとんど効果的治療がなかった、そして、転移は通常、死に帰着しているapoor結果を予告する。しかしながら、転移癌は通常かなり血管化である、そして、赤血球によるanti¬癌抗体の配送には腫瘍の部位で抗体に集中する効果があることができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している、そして、赤血球に活用する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合型である可能性がある。そして、Thereは抗体の5つのクラスである、そして、各々はそのH鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)または補体依存性細胞障害作用(CDC)を通して媒介となられると通常、思われる。例えば、ネズミの免疫グロブリンMとIgG2a抗体は、それによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を起動させている補体系のCI構成要素を結合することによって、ヒト補体を起動させることができる。ヒト抗体のために、抗体を起動させている最も効果的complement−は、通常、免疫グロブリンMとIgGlである。IgG2aとIgG3アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球と特定のリンパ球によって細胞殺害に導くFcレセプタを持っている細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。IgGlとIgG3アイソタイプのヒト抗体は、ADCCの媒介となる。抗体によって媒介される癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連する糖蛋白または糖脂質で(いわゆる触媒抗体)さまざまな化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりある可能性がある。より広く認められる抗体によって媒介される癌細胞殺害のさらに2つの機構が、ある。第一は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答をもたらすために体を誘導するワクチ
ンとしての抗体の使用である。その機能が効果的に失われるように、第2は成長レセプターを目標として、それらの機能に干渉するか、減少してそのレセプターを調整する抗体の使用である。明白に疾患病因に関与する30,000の既知の遺伝子の製品の間で、疾患を処置する新薬の発見は、関連した目標の識別の不足によって妨げられる。腫瘍学調査において、潜在的薬目標は、それが腫瘍細胞で過剰発現されるという事実のために、単にしばしば選択される。このように特定される目標は、それから合成物の多数で、相互作用のために放送される。潜在的抗体療法の場合、これらの候補合成物は、通常、ケーラーとミルシテイン(1975、ネイチャー、256、495−497、ケーラーとミルシテイン)によって置かれる基本的な原理に従って、モノクローナル抗体生成の従来の方法に由来する。ひ細胞は抗原(例えば細胞全体、細胞分画、精製された抗原)で予防接種をされるマウスから集められて、不滅にされたハイブリドーマ・パートナーと融和する。結果として生じるハイブリドーマは映写される、そして、目標に熱心に抗体の分泌のためにどのbindmostを選択したか。多くの治療的で診断抗体はHERCEPTINとRITUXIMABを含む癌細胞に対して指示した。そして、havebeenがこれらの方法を使用して発生されて、目標のそれらの親和性と特異性を基礎として選択された。細胞障害能による抗原特異性の試薬の発現は腫瘍細胞の上で生じて、認められた抗原(s)を表している細胞を結合して、そして、これらの試薬が正常な菌体群の上で重要な有害作用なしで腫瘍細胞の発達(進行と転移)を阻害するように、それ自身による、または毒素(薬または同位元素)のような他の分子と関連する、細胞でインビボの生理活性を持つ、治療的な可能性として非常に有益である、そして、または診断ツール。癌関連の目標として5LAC−23エピトープを確認するために、冷凍正常な人体組織の5LAC−23抗原の表現度は、決定された。免疫組織化学によって、5LAC−23抗原は、正常組織の表現を制限したことが示された。これは、組織配列スライドの中でホルマリン固定パラフィン包埋通常の器官で5LAC−23抗原の表現度を調べることによって確認された。全部で、弱い染色が正常組織のうちの5LAC−23時までにある。そして、HCC(下記参照)のような癌と比較して正常肝、胃、脳と腎臓組織で抗原の制限されて還元型の表現度を示す。そのような表現は、時々生体内で、細胞質(それは通常、完全な抗体にとって到達できない)にも限定された。胃腺癌の表現もあったにもかかわらず、同じ組織配列において、5LAC−23抗原の表現度はHCCにおいて卓越していた。HCCの目標のより広範囲な研究は、免疫組織化学によって有病率ofthe 5LAC−23の抗原inthis癌を調べるために行われた。驚くべきことに、肝臓癌の55の試料の73%は、この目標を表した。診断法、theranostics、予後徴候または療法の目標として、有用性を示すために、マッチされた正常肝と肝臓癌の目標の配布の比較は、行われた。明らかに、5LAC−23は腫瘍試料だけを染色して、悪質な組織をこれらの断片において代表する中心領域に特有だった。アイソタイプ対照でけがされるとき、断面は負だった。そして、5LAC−23を結合することがはっきりしていたことを示して、5LAC−23抗原の癌特異性のサポートを与えた。更に、5LAC−23抗原がウエスタンブロット法、FACS分析とイムノ組織化学豚小屋を通って例えば、種々の分析(それの若干の非極限の実施形態は例の方法によって含まれる)で発見されていることがありえることを示された。当業者にとって明らかで、この発明の範囲の中にある他の分析は、以下を含む:ELISA、免疫細胞学、immunoaffmityベースの分析(例えばSELDI質量分光)、表面プラズモン反響の決定、放射性同位元素標識免疫測定法と分子診断検査法。この中に概説されるように、付加的な生化学データも5LAC−23時までに認められる抗原が37LRPのエピトープであることを示す。これは、二次元電気泳動とウエスタンブロット法による5LAC−23抗原と質量分光を確認することによって裏付だった。標的抗原の識別はco−を示すことによって確認された。そして、抗体による目標の限局化が組織の免疫組織化学検査と同様にウェスタンブロットと明確な37LRPに知られているか、37LRP相補DNAで形質移入される細胞でH−150のような37LRPと結合するために知られていた。重要なことに、5LAC−23は、他の抗37LRP抗体(H−150)と比較して、ユニークな製本見本を示した。より制限された結合を示している5LAC−23で、これは2つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを示唆する。さらに、例で、12Hの−150は細胞系の合計37LRPを見つける、しかし、5LAC−23によって認識される抗原エピトープの表示は異なる細胞可溶化物全体で変化して、いくつかで存在しなかった。両方の抗体をCHO細胞可溶化物に結合することが類似していた時から、抗体のこの違いはH−150と比較してその抗原のために5LAC−23の下部の親和性によらなかった。5LAC−23 andH−150によって見つけられるエピトープの違いを支援して、5LAC−23は、非還元の状況(図16B、レーン12)の下で、LS174T溶解産物でほぼHOkDのユニークな汚れを見つけた。このスミアは、37LRP前駆体に対応している帯域の増加なしで、還元性の状況の下で消えた。既知の抗LRP抗体H−150と比較して、これらの結果は、37LRPの上で5LAC−23時までに認識されるエピトープがユニークであるという更なる証拠を提示する。これらのIHCと生化学結果は、5LAC−23がユニークな37LRP抗原エピトープに向けられることを証明する。制癌剤の臨床有用性は、患者に許容リスク側面の下で本剤の有益性に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の後で最も捜された、しかしながら、多数の他のよく認識された利点が生命を延長することに加えてある。これらの他の利点(処置が生存に悪影響を与えないところ)は、症状寛解、有害事象からの保護、再発または疾患のない生存に時間内の延長と進行に時間内の延長を含む。これらの判定基準はアメリカ食品医薬品局(F .D. A。)のような一般に認められて調節性体であるこれらの利点を発生する薬を承認する(ハーシェフェルドその他は、Critical Reviews inOncology/Hematolgy42である:137−143 2002).これらの判定基準に加えて、この種の利点の前兆となる可能性がある他の終末点があるとよく認められる。一つには、アメリカ食品医薬局によって承諾される促進的な承認プロセスは、患者利点をたぶん予測する代用物があると承認する。会計年度末の(2003)より、このプロセス中で承認される16の薬があった、そして、これらの、4は完全な承認(すなわち研究が代わりの終末点によって予測されて直接の患者利点を示した追跡調査)に移った。固形腫瘍で薬効を決定するための1つの重要な終末点は処置に対する測定反応による全身腫瘍組織量の評価である(Therasseその他は、国立癌研究所92(3)ジャーナルである:205−216 2000).そのような評価のための臨床判定基準(RECIST判定基準)は、充実性腫瘍研究グループ(癌の一団の国際的な専門家)で、応答評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果による薬は、最終的に、群が傾向がある適切な制御に対する比較で、RECIST判定基準に従う客観的な反応で示すように、直接の患者利点を発生する。全身腫瘍組織量が通常、より直接に評価することになっている症状発現前設定と文書で。前臨床試験が臨床設定に解釈されることができるという点で、症状発現前モデルで生存延長をもたらす薬には最大の予想された臨床ユーティリティがある。臨床治療に産生性の肯定応答に類似して、症状発現前設定で全身腫瘍組織量を減らす薬は疾患に重要な直接的な影響を及ぼす可能性もある。生存の延長が制癌剤治療から臨床転帰の後、最も求められる、臨床有用性を持つ他の利点があって、そして、全身腫瘍組織量減少(それは疾患進行の遅れに相関する可能性がある)が生存または両方とも延長したことは明らかである、直接の利点に導くこともできて、そして、臨床影響を持つこともできる(エックハートその他は、Developmental Therapeuticsである:Targeted CompoundsのClinical Trial Designsの大当りとFailures;ASCO Educational Book、39回目の年会、2003、ページ209−219)。全部で、この発明は、治療薬の目標として、6BD−25および5LAC−23抗原の使用を教える。それは、投与されるとき、6BD−25が抗原を表している癌で哺乳類で全身腫瘍組織量を減らすことができて、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできることを証明する。生体内6BD−25処置とSWl 116とOVCAR−3細胞の抗原式の付随する検出不可能であるか低いレベルの有効性は、抗原表現のレベルがインビボの有効性と必ずしも相関するというわけではないことをそれぞれ示す。さらにまた、この発明も、癌細胞で6BD−25 5LAC−23抗原を見つけることが診断、治療の予測とこの抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の予後に役立つことがありえることを教える。それは、診断法、theranostics、予後徴候または療法の目標として、更に5LAC−23抗原の使用を示す。したがって、特定の個人に由来する細胞から方法を産生性の癌疾患修飾抗体のために利用することは、本発明の目的である。
【0016】
ハイブリドーマ細胞系と対応の単離モノクローナル抗体を分離しなさいという命令とそれについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされる抗原結合フラグメントで、同時に非癌細胞に比較的無毒性間、これらは癌細胞に関して細胞毒性である。それは抗原性のフラグメントとして定義されて単離モノクローナル抗体で37LRPの特定のエピトープの結合のためにラミニン受容体1前駆体タンパク質(指定の37LRP)を確認する発明の更なる目的、指定の5LAC−23またはそれのフラグメントである。抗原フラグメントは前記特定のエピトープと結合する、そしてそれは、単離モノクローナル抗体は同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から産生性の癌疾患修飾抗体のための方法によって発生された。
【0017】
抗原フラグメントは前記特定のエピトープと結合する、そしてそれは、単離モノクローナル抗体は癌疾患修飾抗体を同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から作り出す方法によって発生された。5LAC−23時までに認識される37LRPの特定のエピトープで結合ができる抱合部位を提供することは、この発明の更なる目的である。
【0018】
それは抗体がそれについて、前記特定のエピトープと結合する5LAC−23またはフラグメントである薬−抗体複合体と称されてこの中にある、そして、複合体は放射性核種でありえる、または、生物学的であるか化学毒素または合成物の形の活発な抗腫瘍剤が化学療法剤を含むがこれに限らず等価の抗腫瘍活性を持つ。活発な抗腫瘍剤を届ける方法を教えることはこの発明のもう一つの目的である。
【0019】
そして、酵素または放射性核種が抗腫瘍剤としてまたは抱合部位と抗原エピトープの選択的な結合が起こるそれによって本発明に従って哺乳類に抱合部位を投与することを成立している哺乳類の腫瘍細胞の部位に対する画像診断の方法の援助として効果的である。悪性の存在を示すのに十分なレベルで37LRP前駆体タンパク質で5LAC−23抗体の選択的な結合を立証するためにどんな平均値ででも癌細胞の存在を測定する方法を教えることは、まだ本発明のさらなる目的である。
【0020】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後、治療、イメージングと37LRPの特定の抗原性部位で5LAC−23、抗原性の結合断片(先に定義されるように)または複合体半量(先に定義されるように)の結合に依存する方法を利用しているガンであるか前癌性の細胞のモニタリングのための方法を教えることになっている。それのCDMABと抗原結合フラグメントを教えることは、本発明のさらなる目的である。
【0021】
細胞毒性がADCCを通して媒介となられるCDMABを発生することは、本発明の更なる目的である。細胞毒性がCDCを通して媒介となられるCDMABを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。細胞毒性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるCDMABを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。
【0022】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合アッセイに役立つCDMABを発生することである。この発明の他の目的と長所はそこで以下の説明(図と例の横道)から明らかになる。そして、この発明の実施形態が述べられることを確信している。
【0023】
(図面の簡単な説明)
図1は、6BD−25、5LAC−23と抗ファス(正の制御)抗体の代表的なFACSヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
図2は、予防SWl116大腸癌モデルの腫瘍成長に関する6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
図3は、予防OVCAR−3卵巣癌モデルの体重の6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
図4は、6BD−25またはバッファ制御による腫瘍を含んだマウス後処理の残存。マウスは、240日以上後処理のために生存をモニターされた。
図5Aと5Bは、全細胞可溶化物(T)と細胞質の分数(C)のウエスタンブロットは、アイソタイプ対照(パネルA)か5LAC−23(パネルB)で染色されるOVCAR−3 Cellsから作った。異なった帯域は5LAC−23で見つけられて、黒い矢で示される。
図6Aと6Bは、OVCAR−3細胞質のタンパク質のウエスタンブロットは、2次元の電気泳動によって分かれた。パネルBが5LAC−23で探索される汚点を示す間、パネルAは免疫グロブリンMアイソタイプ対照と探索されるブロットを示す。矢は、5LAC−23時までに認められる点に対応する。
図7A、7Bと7Cは、OVCAR−3細胞質のタンパク質の2次元 SDS−PAGEとウエスタンブロット。図中パネルAは、細胞質の分数のシルバー染色されたゲルである。Panel Bがアイソタイプ制御抗体で探索される類似の汚点を示す間、パネルCは5LAC−23時までに認められるタンパク質の位置を示す。
図8A、8B、8Cと8Dは、5LAC−23よって認められる点に対応する。OVCAR−3細胞質の分数のウエスタンブロットは、抗37LRP抗体H−150の(A)、抗37LRP抗体F−18(B)、免疫グロブリンMアイソタイプ制御(C)と5LAC−23(B)で深く探った。
図9Aと9Bは、OVCAR−3細胞からの細胞質のタンパク質の2−次元ウエスタンブロット。Blot Aの矢は、5LAC−23が結合する主要発疹を示す。Blot Bの線は、抗37LRP(H−150)抗体に特有である点を示す。汚点の上で明かされる他の点は、抗体のアイソタイプでまたは使用される二次抗体で相互作用による。
図10A、10B、10Cと10Dは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ制御(一番上の列)で37LRP(pCMV−XL537LRP)コードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されたCHO細胞(10X拡大)の免疫染色される。細胞はFugene試薬(甲欄)単独で形質移入されたか、pCMV−XL537LRPの量を増加させていた(1マイクログラム:柱B;2マイクログラム:柱C;4マイクログラム:柱D)。細胞が5LAC−23でけがされたとき、陽性細胞(茶色の)の増加性の数はプラスミドの増加性の量で見られることができる。
図11A、11B、および11Cは、アイソレーション増幅器。37LRPコードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されるCHO細胞(40X)の免疫染色される(pCMV−XL537LRP;2マイクログラム)。細胞は5LAC−23(A)で染色された、抗37LRP抗体H−150(B)と抗67LR抗体MLuC5(C)と陽性細胞は全部で見られることができる免疫染色する。
図12A、12Bと12Cは、ウエスタン分析によってさまざまな抗体によって見つけられるE.coliのヒト37LRPの表示。細菌反応混合物に含まれたプラスミドは、C末端のHisβ−タグ(レーン1)で、Control媒介生物GFPを含んだ、pIVEX2.3dLRP(37LRP;レーン2)andprVEX2.4dLRPNHjS6(aN−terminalHis6−タグによる37LRP;レーン3)。汚点は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(パネルA)、5LAC−23(パネルB)と抗37LRP抗体H−150(パネルC)で探索された。
図13A、13Bと13Cは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ対照(一番上の列)と一緒のパラフィン包埋組織の染色。断面は、通常の胃(甲欄)、noπnal肝臓(柱B)と肝細胞癌(柱C)から取り出された。
図14A、14Bと14Cは、マッチされたnoπnal(一番上の列)とマッチされた腫瘍組織(一番下の列)からの寒冷保存された肝臓組織に対するさまざまな抗体の結合。使用される抗体は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(甲欄)、5LAC−23(柱B)と抗サイトケラチン8(柱C)であった。
図15Aと15Bは、5LAC−23()と免疫グロブリンMアイソタイプ対照()と一緒の通常の肺上皮細胞系列Beas−2Bのイムノ組織化学染色。細胞は成長される(柱B)か、外で(甲欄)Vitrogenであった。
図16Aと16B。非還元の条件のウエスタンブロット法によって発見されたものとしての多数の腫瘍と形質転換細胞系の表現oftheエピトープ 抗37LRP antibodyH−150の(A)と5LAC−23(B)。細胞系は、野生型CHO細胞(レーン1)とヒト細胞系を含んだ:HB4aR4.a(レーン2)、HMT 3522(レーン3)、MCF−7(レーン4)、最低降下高度−MB−231(レーン5);最低降下高度−MB−361(レーン6)、OVCAR−3(レーン7)、チャンのLiver(レーン8)、HepG2(レーン9);A375(レーン10)、DLD−I(レーン11)、LS174T(レーン12)とSW620(レーン13)。
【発明を実施するための最良の形態】
【0024】
実施例1
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞系:6BD−25および5LAC−23
それぞれ寄託番号PTA−5691とPTA−5690の下で、2003年12月9日の20110−2209 ATCC(ATCC)(the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110−2209 on December 9, 200)、ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞系6BD−25および5LAC−23は寄託された。37の運賃込み条件1.808に従って、沈澱器は寄託資料の市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。6BD−25および5LAC−23のクローン、上清と細胞ELISAスクリーニングの派生は、以前US 6,657,048で記載された。6BD−25 5LAC−23モノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度/週でハイブリドーマをCL−1000フラスコ(ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)で培養することによって生産された。抗体は、Protein Gセファロース4 Fast Flow(アマシャムBiosciences、Baie d’Urfe、QC)で、標準の抗体精製処置によって精製された。6BD−25および5LAC−23は、細胞毒性分析(表2)で、多数の陽性(抗ファス(EOS9.1、免疫グロブリンM、カッパ、20マイクログラム/mL、eBioscience、サンディエゴ、CA)、抗EGFR(C225、IgGl、カッパ、5マイクログラム/niL、Cedarlane、ホーンビー、ON)、Cycloheximide(100マイクロモル、シグマ、Oakville、ON)、アジ化ナトリウム(0.1%、シグマ、Oakville、ON))で陰性の(107.3(抗喘ぎ、IgGl、カッパ、20マイクログラム/mL、ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)、G155−178(抗喘ぎ、IgG2a、カッパ、20マイクログラム/mL、ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)、最大許容濃度−11(抗原特異性未知数、IgG2b、カッパ、20マイクログラム/mL)、J606(抗フルクトサン、IgG3、カッパ、20マイクログラム/mL)、免疫グロブリンG Buffer(2%)、免疫グロブリンMバッファ(2%))対照と比較された。乳癌(最低降下高度−MB−231(MB−231)、最低降下高度−MB−468(MB−468)、MCF−7)、大腸癌(HT−29、SWl 116、SW620)、肺癌(NCI−H460)、卵巣癌(OVCAR−3)、前立腺癌(PC−3)と非癌(CCD−27sk、Hs888.Lu)細胞系は、試験された(ATCC、Manassas、VAからの全て)。Live/Dead細胞毒性分析は、Molecular Probes(Eugene,OR)から得られた。分析は、下で概説される変化で、製造業者の指示に従って実行された。細胞は、予め定められた適当な密度で分析の前にメッキをされた。2日後に、精製された抗体または対照はメディアに希釈された、それから、100マイクロリットルは細胞板に転写されて、5日の間5パーセントのCO2インキュベーターで暖められた。プレートは、それから逆にすることによって空にされて、乾燥質で拭かれた。室温DPBSはMgCl2を含んでいる、そして、塩化カルシウムはマルチ・チャンネル・スクィーズボトルからよい各々に分配されて、3回軽くたたかれて、逆転によって空にされて、それから、乾燥質で拭かれた。DPBSで希釈される蛍光カルセイン染料の50マイクロリットルはMgCl2を含んでいる、そして、塩化カルシウムはよい各々に加えられて、30分の間5パーセントのCO2インキュベーターで370Cで暖められた。プレートはパーキン−エルマーHTS7000蛍光プレート読本で読まれた、そして、データはMicrosoft Excelで分析された、そして、結果は表1で表化された。データは、平均4つの実験が三通りで検証されて、質的に以下の様式に示されることを表した:4/4実験より大きい閾値細胞毒性(+++)、3/4実験より大きい閾値細胞毒性(++)、2/4実験より大きい閾値細胞毒性(+)。表1の印がない細胞は矛盾していて抗議する、または、効果が閾値細胞毒性より少ない。比較のためにも含まれた他の抗体のnii Ni Pttegaveosumberが生物学的細胞分析の限定を与えられるCl Cttornosonr期待されるとして実行する間、化学細胞障害性の薬剤はそれらの期待される細胞傷害を誘発した。6BD−25抗体は胸部(卵巣のおよび大腸癌細胞系選択的に)で細胞毒性を示した、その一方で、非変わる正常細胞の上に無効を持った。また、非−の上に無効を持つことが正常細胞を変える間、5LAC−23抗体は選択的に卵巣癌細胞系で細胞毒性を示した。全ての癌細胞タイプが影響されやすいというわけではなかった時から、抗体6BD−25および5LAC−23はそれらの活性で選択的だった。さらにまた、それが非−癌細胞型に対して細胞毒性を発生しなかった時から、6BD−25および5LAC−23は機能的な特異性を示した。そして、それは重要な治療的な因子である。
【0025】
【表2】
【0026】
癌と正常な細胞系の前述のパネルに対する6BD−25の結合は、フローサイトメトリ(FACS)によって評価された。細胞は、まず最初にDPBS(Ca+’’1なしで」、そして、Mg++)で細胞単層を洗うことによって、FACSの準備ができていた。細胞解離バッファ(INVITROGEN、バーリントン、ON)はそうだった、そして、37°C. After遠沈殿法と収集で細胞をそれらの細胞培養プレートから除去するのに用いられて、細胞はMgCl2を含んでいるダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水で再懸濁された。そして、CaCl2and25パーセント・ウシ胎児血清が40C(メディアを洗う)状態にあられて、計数されて、適当な細胞密度に等分されて、細胞に小球をぶつけるために下って回転して、30分の間氷の上で20マイクログラム/mLで6BD−25(非抱合型であるかビオチンで抱合型の)、5LAC−23または制御抗体(アイソタイプ制御または抗ファス)を含んでいる染色メディア(DPBSは、MgCl2と塩化カルシウムを含んでいる)で再懸濁された。ビオチンに6BD−25を接合することは、ビオチン標識試薬(ピアスE2−Link Sulfo−NHS−集線装置−ビオチン、ロックフォード、IL)で実行された。ビオチン標識試薬は6BD−25まで20回モル過剰で加えられて、振盪で室温で2時間の間暖められた。ビオチン標識された6BD−25は、それから40CでPBSに対して終夜透析された。Alexaフルーアの追加の前に488抱合型の二次抗体(非抱合型の主要な抗体のために)またはストレプトアビジンR−フィコエリトリンが二次抗体(ビオチン標識された6BD−25のために)を接合したこと、細胞は洗浄メディアで一度洗われた。染色メディアの中の適当な二次抗体は、それから20分の間加えられた。細胞は、それから最後の時間の間洗われて、ヨウ化1マイクログラムの/mLのプロピジウムを含んでいる媒体を染色する際に再懸濁された。細胞の流動細胞獲得は、CellQuestソフトウェア(ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)を使用しているFACScanの上で試料を走らせることによって評価された。細胞のフォワード(国際販売会社)と側方散乱(SSC)は電圧を調整することによってセットされた、そして、振幅は国際販売会社とSSC探知器に追い迫る。細胞が約1−5単位の蛍光強度の中央値で同一のピークを持ったように、3本の蛍光チャネル(FLl、FL2とFL3)のための探知器は適当な二次抗体が続く精製されたアイソタイプ制御抗体で染色される走行細胞によって調整された。有効な細胞は、国際販売会社とプロピジウム・ヨウ化物除外のためにゲーティングによって後天性だった。各々の試料のために、約10,000の有効な細胞は、表3に示される分析と結果のために後天性だった。表3はアイソタイプ制御より上に平均の蛍光強度折り目増加を表化して、質的に示される:1.5未満();1.5〜2つの(+);2〜3(++);3〜10の(+++)と>10(++++)。6BD−25 5LAC−23抗体の代表的なヒストグラムは、図1のために編集された。非抱合型の6BD−25は、まず最初に、FACSによって試験される少しの細胞系も結合しなかった。しかしながら、ビオチンに6BD−25を接合することによって分析の感度を増加させた後に、抗原の低レベルが最低降下高度−MB−231、C−13、OVCA−429とOV2008癌細胞の表面で存在することを証明された。FACSによって、5LAC−23は、大腸癌細胞系SW620に高くて特異的な結合を見せた。6BD−25および5LAC−23のために、これは結合の程度がその同族の抗原の抗体結紮の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、非明らかな知見であったという更なる証拠であった。これは、異なる細胞の抗体結紮の前後関係が抗体結合よりはむしろ細胞毒性で決定的なことを示唆した。
【0027】
【表3】
【0028】
実施例2
生体内の大腸予防的腫瘍実験
8週間目まで図2、4に示されるデータに関して、雌の重篤複合免疫不全マウスは、100マイクロリットルの塩水湖の116のヒト大腸癌細胞が襟首で皮下に注射した500万のSWlで入れられた。マウスは、10の2つの投与群に、ランダムに分けられた。着床より前の日に、20mg/kgの6BD−25試験抗体またはバッファ制御は、500mMNaCl、20mMのNa2HPOWH2Oと20mMNaH2PO4^H2Oを含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、300マイクロリットル量で、intrapertioneallyに投与された。同じ様式の7週の期間の間の1週当たり、抗体はそれから投与された。腫瘍成長は最高16週の間のカリパス副木による正確に計ったざっとあらゆる7回目の日であったか、個々の動物までAnimal Care(CCAC)エンドポイントまたは日112の間カナダの会議に達した。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、CCACガイドラインに従って安楽死させられた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通じてなかった。データは独立試料試験を使用して分析された、そして、有意性は平均値の同等のためにt検定を使用して測定された。日50(最終的な処置の後の1日)で、腫瘍容積inthe 6BD−25の処置群は、バッファ制御(p=0.001)の54パーセントであった。発育遅延ofthe腫瘍は、治療期間過ぎに続いた。日112(63日後処理)で、抗体投与群の腫瘍容積は、バッファ制御(p=0.002)の59パーセントであった。要約すると、6BD−25抗体処置は、ヒト大腸癌のよく認識されたモデルで、割に全身腫瘍組織量をバッファ制御に下げた。これらの結果は、人を含む他の哺乳類で、治療としてこの抗体(6BD−25)の潜在的薬理学で製薬利点を暗示する。
【0029】
実施例2
生体内の卵巣予防的腫瘍実験:
図3と4に示されるデータに関して、4〜8週間目、雌のSCEDマウスは、1000マイクロリットルの食塩注入された腹腔内で、500万のOVCAR−3ヒト卵巣癌細胞で挿入された。マウスは、10の2つの投与群に、ランダムに分けられた。移植の後の日に、20mg/kgの6BD−25試験抗体または抗体バッファは、500mMNaCl、20mMのNa2HPO4* 7H2Oと20mMのNaH2PO4^H2Oを含んだ賦形薬による家畜濃度からの希釈の300マイクロリットル後にの量の投与された腹腔内であった。同じ様式の9週の期間の間の1週当たり、抗体はそれから投与された。体重は最高11週の間の正確に計ったざっとあらゆる7回目の日であったか、個々の動物までAnimal Care(CCAC)エンドポイントまたは日76の間カナダの会議に達した。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、CCACガイドラインに従って安楽死させられた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通じてなかった。体重が、腫瘍発達(図3)の代わりの程度として使われた。重量増加が腹水形成に起因する時から、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。有意性は、ダネットのt検定を使用して測定された。移植後の(処置の終わりの後の16日)日80で、6BD−25投与群のマウスは、緩衝対照群(p=0.002)よりかなり少ない体重を持った。ログランク検定で測定されるにつれて、バッファ制御(図4)と比較した6BD−25による処置による生存も強化された。対照群のマウスは、87.0日の生存期間の中央値対6BD−25投与群(p<0.02)の107.5の日を過ごした。また、緩衝投与群の全てのマウスは、日中120のポスト着床(56日後療法)になって死んだ。抗体投与群において、生存しているまだ1匹のマウスが、日250後処理(186日後処理)でいた。要約すると、6BD−25抗体処置は、ヒト癌疾患のもう一つのよく認識されたモデルで、バッファ制御に割に全身腫瘍組織量を予防した。6BD−25も、卵巣の異種移植モデルで生存を強化した。全体として、6BD−25は、重篤複合免疫不全マウスで大腸と卵巣癌の予防腫瘍異種移植モデルで腫瘍成長を抑制することでのバッファ制御よりかなり効果的である。6BD−25にもよる処置は、人を含む他の哺乳類で治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を提案しているヒト卵巣癌疾患のよく認識されたモデルで、生存利点を示した。さらにまた、SWl116とOVCAR−3細胞の抗原式の検出不可能であるか低いレベルは、抗原表現のレベルがインビボの有効性と必ずしも相関するというわけではないことをそれぞれ示す。
【0030】
実施例4
ウエスタンブロット法による結合タンパク質の同定
抗原を表している抗体5LAC−23、細胞可溶化物と細胞質の分数によって認められる抗原(s)を特定することは、ゲル電気泳動に従属して、膜に移った。ウエスタンブロット法は、この抗体によって見つけられるタンパク質を決定するのに用いられた。
【0031】
1. 1次元のSDS−PAGE
前の仕事はFACS分析によって5LAC−23の弱い結合を卵巣癌細胞系OVCAR−3に示した、そして、その5LAC−23はこの細胞系(米国特許出願No.10/810、163、いずれが参照によって組み込まれてこの中にあるかという内容)に対して細胞毒性を持つことが示された。全細胞可溶化物は、RIPAバッファで準備された[5OmMトリス−HCl(pH 7.2);15OmM NaCl;0.1%(w/v)のSDS;1%(w/v)のデオキシコール酸ナトリウム;1%(w/v)のトリトンX−100]細胞分画がMem−PER Eukaryotic Membrane Protein摘出キットを使用しているようにされる、(ネコ。No.89826;ピアス;Tattenhall、チェシャー、英国)。発生する親水性の断片は、膜成分の除去によって基本的に豊かにされて、細胞質の断片であると考慮された。プロテアーゼ阻害薬(SIGMA P8340)は、全ての細胞溶解ステップに含まれた。細胞標品のアリコートは30分の間60Vで12%のゲル類andranに積まれた、それから、染料正面までの150Vはゲル類の一番下に着いた。ゲル類は、NOVEX XCeIl II Blot Module(インビトロゲン、ペイズリー、英国)を用いて、2時間30VでPVDF膜上へタンパク質の転送の準備ができていた。転送の後で、膜は40Cで終夜0.5%のツイーン(TBST)を含んでいるTris−緩衝食塩水の5%の脱脂粉乳によるブロック状態のであった。膜は、室温で4時間主要な抗体で暖められた。主要な抗体含まれた5LAC−23(5つのμg/mL)、そして、アイソタイプ制御‖(マウス抗トリニトロフェノール、免疫グロブリンM、K;G155−228のクローンをつくりなさい;ネコ。No.553472;ビジネスデザインPharMingen;オックスフォード、オックスフォード大学の、英国の;5μg/ml)。膜がTBSTで3回洗われた、膜は接合される西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)で暖められたヤギ抗マウス免疫グロブリンM、μ鎖特異抗体(1/10,0000;ネコ。数115−035〜075;ジャクソンImmunologicals West Grove、PA、アメリカ合衆国)Ih.のために5回膜を洗った後に、HRPは腸クロム親和性細胞様西洋のBlotting Detection Reagents(アマシャム)を使用しているのを見つけられた。帯域を産生されるOVCAR−3細胞の細胞質の分数に対する5LAC−23の結合は、近いMW 4OkDa(図5)黒い矢で示されるように、の。この帯域はOVCAR−3細胞から作られる全細胞可溶化物が非常に不得意だった。そして、抗原が細胞質の分数を生み出して濃縮されることができたthattheを関係させた。帯域は、5LAC−23に対する相互作用がはっきりしていたことを示しているアイソタイプ対照によって、見つけられなかった。優性の帯域が約7OkDでも観察されたにもかかわらず、この帯域はより少ない強度でアイソタイプ対照にもよって見つけられた。この実験から、5LAC−23は、特に約40kDのタンパク質と結合するように見える。
【0032】
2. 2次元のSDS−PAGE
上で述べられるように、細胞質のタンパク質が準備した合計、プラスOneを使用している沈降したは、2次元のClean−Upキットであった(ネコ。No.80−6484−51;アマシャム、リトル・チャルフォント、バックス、英国)、それから、pH範囲3−10で両性電解質を含んでいる再水和バッファで再懸濁される。第1のアスペクト等電点電気泳動(IEF)は、7cmの固定されたpH 3−10勾配(IPG)で、IPGphor(アマシャム)の上で実行された−再水和溶液の面前で細片(アマシャム、リトル・チャルフォント、バックス、英国)の基礎を形成する(8Mの尿素(2%のCHAPS);アマシャム)。電圧限度は再水和を起こらせる14時間の30Vであった、そして、1時間の200V、1時間の500V、30分の間の1000Vと8000Vhまでの8000Vは達された。IEF分離の後で、細片は15分の間2.5%のヨードアセタミドでDTTなしでSDS−PAGE平衡バッファで平衡化された。細片は10%のゲルの表面に配置されて、0.5%のアガロースで封着された。SDS−PAGEは30分の間60Vで動作した、それから、染料正面までの150Vはゲル類の一番下に着いた。ゲル類は、Hoefer TE 77を用いてPVDF膜上へタンパク質の転送のために、Semi−Dry Transfer Unit(アマシャム)を用意された。転送の後で、膜は40Cで終夜0.5%のツイーン(TBST)を含んでいるトリス−緩衝食塩水の5%の脱脂粉乳によるブロック状態のであった。膜は、室温で4時間主要な抗体で暖められた。主要な抗体含まれた5LAC−23(5つのμg/mL)、そして、アイソタイプ制御‖(マウス抗トリニトロフェノール、免疫グロブリンM、K;G155−228のクローンをつくりなさい;ネコ。No.553472;ビジネスデザインPharMingen;オックスフォード、オックスフォード大学の、英国の;5μg/mL)。膜がTBSTで3回洗われた、膜は接合される西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)で暖められたヤギ抗マウス免疫グロブリンM、μ鎖特異抗体(1/5000−10,0000;Cat.No。115−035−075;ジャクソンImmunologicals West Grove(PA,USA))Ih.のために5回膜を洗った後に、HRPは腸クロム親和性細胞様西洋のBlotting Detection Reagents(アマシャム)を使用しているのを見つけられた。図6は、5LAC−23で暖められるOVCAR−3細胞質の分数から得られるウエスタンブロットを示す。アイソタイプ対照(図6a)と暖められる汚点と比較して、一つの異なった点は、5LAC−23(図6b)で探索される汚点で見られることができる。ユニークな発疹は矢で示されて、分子量で酸性のπを36IcDタンパク質マーカーと類似しているようにする。二次元電気泳動法は、より広い通りを使用して繰り返された(18cm;アマシャム)、それを確認するために、5LAC−23は酸性タンパク質と結合した。そして、タンパク質点の分離を改善して、以降の質量分析分析のために十分なタンパク質を得ることが可能だった。再水和とIEFは、プログラムされた設定によって実施された:30V 14時間;200V 30分;500V 30分;勾配の1000VのIh;勾配の6500V 3時間;8000V。完全Vhは、54,000−60,000であった。IEF分離の後で、細片は15分の間2.5%のヨードアセタミドでSDS−PAGE平衡バッファで平衡化された。細片は12%のゲルの表面に配置されて、0.5%のアガロースで封着された、そして、SDS−PAGEは60Vで終夜実行された。ゲル類のうちの1つは、PlusOne Sliver Stainingキットを使用しているタンパク質のために染色された(ネコ。第17−1150−01;アマシャム)MS分析と互換性を持つようにという製造業者の指示に従うこと。他のゲル類は、先に述べたようにPVDF膜上へタンパク質の転送の準備ができていた。膜は、先に述べたように5LAC−23とアイソタイプ対照と探索された。転送の後で、ゲル類はタンパク質点の配列で援助するために、先に述べたようにタンパク質のためにも染色された。5LAC−23が結合するOVCAR−3細胞質の分数からのタンパク質点は、図7で明らかに見られることができる。図中図7aは、OVCAR−3細胞質の分数の銀の染色されたゲルである。図7bは、一つの異なった点も36kDタンパク質マーカーと類似の分子量で5LAC−23(図7c)で探索される汚点で明瞭な間、アイソタイプ制御が少しのタンパク質点もと結合しなかったことを明らかにする。点がアイソタイプ対照(図7b)と発見されていなかったので、5LAC−23の結合ははっきりしていた。この実験は、5LAC−23時までに結合される抗原性部位が約36のKD(酸性のπを有する)であることを確認した。
【0033】
実施例5
質量分析法による結合タンパク質の同定
5LAC−23によって認識される37ないし40kDタンパク質スポットに対応するゲル領域を無菌のピペットで切り出した。ゲル・プラグが、それから質量分光によってタンパク質の識別のために使われた。試料は、aMWGRoboseq 4204ロボット(MWG Biotech)を使用しているトリプシンで、in−gel消化に従属した。ペプチドは、1%のfoπnic酸と2%のアセトニトリルでゲル・プラグから自由にされた。一部の結果として生じるダイジェスト上清は、ペプチド分離のために8桁、75mmの塩素を使用しているMicroMass Q−TOF Globalの上で分析された。データは、MASCOTを使用して検索された。5LAC−23時までに認められたゲルの領域でMS分析によって特定されるタンパク質は、表4に示される。質量分光によって確認される5LAC−23のための抗原は、ラミニン受容体1であった。
【0034】
【表4】
【0035】
実施例6
5LAC−23のための抗原の確認
【0036】
1. 共局在化検査による確認
推定上の抗原の確認は決定することによって援助されたどうか、抗体がそうすることができた既知の抗37LRPは5LAC−23による共局在化である。OVCAR−3細胞からの細胞質の分数のタンパク質は、SDS−PAGEによって分離されて、ニトロセルロース膜上へ拭かれた。ウエスタンブロット法は、一次元SDS−PAGEのために、先に述べたように実行された。主要な抗体は5LAC−23(5つのμg/mL)を含んだ、免疫グロブリンMアイソタイプは制御する(先に述べたように;5μg/mL)、H−抗37LRP抗体150(0.2のμg/mL;ネコ。No.sc−20979;サンタクルスBiotechnology;サンタクルス、CA、アメリカ合衆国;この抗体は、ヒト37LRPのAA 110−250に対応している組換え型のタンパク質に対して起毛していた)、F−抗37LRP抗体18(0.4のμg/mL;ネコ。第sc−21534;サンタクルス)、そして、正常なウサギ免疫グロブリンG‖(0.2のμg/mL;ネコ。No.AB−105C;研究開発Systems;アビンドン、オックスフォード大学の、英国の)。二次抗体は、上述のHRP抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンMを含んだ(1/5000−10,000;ジャクソンImmunologicals)免疫グロブリンMの検出のために、HRP抱合型の抗ウサギの免疫グロブリン(1/2000;Cat.no。P0448;DAKO、Carpentaria、CA、アメリカ合衆国)、そして、HRP抱合型の抗ヤギの免疫グロブリン‖(1/2000;ネコ。No.P0449)。2つの抗37LRP抗体(H−150とF−18)は、近似のMW 40IcD(図8Aと8B)で、abandと結合する。免疫グロブリンM isotyope制御がそうしない間、5LAC−23も類似のサイズ(図4D)の帯域と結合する。そして、このタンパク質による相互作用of5LAC−23がはっきりしていることを確認する。2次元 SDS−PAGEセクションで記述されるにつれて、OVCAR−3細胞からの細胞質のタンパク質の更なる2次元の西部劇は準備されたが、IEFはpH範囲を制限するために3.5−5でπでpharmylatesを使用して実行された。ブロッティングのために使用される初等・中等抗体は、上で記載される。5LAC−23とH−150をウエスタンブロットに結合することは、図9で示されて、適当なアイソタイプ対照(示されないデータ)と探索される汚点と比較された。5LAC−23時までに認められるタンパク質点は図9Aで示される。そして、黒い矢で示される。抗37LRP抗体(H−150)は、5LAC−23も結合したゲルの付近と一致する黒線(図9B)で強調されるタンパク質のより幅広い汚れと結合した。H−150によって認められるスミアが少なくとも3つのタンパク質点を含んで、タンパク質の異なるアイソフォームがOVCAR−3細胞から細胞質の分数で存在することを示す可能性があることは、ありそうである。汚点の上で見つけられる他のタンパク質は、抗体または二次抗体のアイソタイプによる相互作用によって、どちらの5LAC−23もH−150にも特有でない。抗37LRP抗体と5LAC−23は、37LRPが実際5LAC−23のための抗原であるという約4OkD providng更なる証拠のタンパク質と結合した。しかしながら、分子量が同程度だったにもかかわらず、5LAC−23は他の抗37LRP抗体と比較してユニークな製本見本を示した。より制限された結合を示している5LAC−23で、これは2つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを示唆する。
【0037】
2. トランスフェクション試験による確認
推定上の抗原の確認は、5LAC−23が相補的DNAクローンof37LRPで形質移入された細胞と結合することができたかどうか決定することによって実行された。37LRPコードしている相補DNAのクローンは、plasmidpCMV6−XL5で得られた(pCMV−XL537LRPとしてを参照した;部材TC107938番;寄託番号:NM−002295;ORIGENE Technologies;ロックビル、MA、アメリカ合衆国)。中国のHamster Ovary(CHO)細胞は、6穴のプレートの60−70%の集密的であるために大きくなった(F12ハムNutrient Mixture;10%のFBS;2mMのGlutamine)。細胞は、製造業者のプロトコルに従ってFugene Transfection Reagentを使用しているpCMV−XL537LRPで形質移入された(ネコ。No.1988387;ロシュDiagnostics;ルイス、イースト・サセックス、英国)。細胞は、免疫染色の前に少なくとも48時間大きくなった。細胞はPBSで二回洗われて、それから氷冷アセトンを据えられた:3分の間のメタノール(1:1)。アセトン:メタノールは除去された、そして、細胞は風乾された。それはPBSで3回洗われて、それから30分の間PBSで2%のFBSで遮断された。主要な抗体は加えられた、そして、細胞は室温で1時間孵化した。主要な抗体は5LAC−23(5μg/ml)を含んだ、免疫グロブリンMアイソタイプは制御する(先に述べたように;5μg/mL),the抗37LRP抗体(H−150;0.2のμg/mL;サンタクルスBiotechnology)、anti−67LR抗体‖(MLuC5;ネコ。ab3099番;4つのμg/mL;制限される真横、ケンブリッジ、Cambs、英国)、そして、正常なウサギ免疫グロブリンG‖(0.2のμg/mL;ネコ。No.AB−105−C;研究開発Systems;アビンドン、オックスフォード大学の、英国の)。細胞が洗われた3回withPBS(二次抗体)であった、(HRP−は、ヤギ抗マウス免疫グロブリンM(1/1000)をconjuagtedした;ジャクソンImmunologicals)、加えられて、1時間孵化した。二次抗体は、上述のHRP抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンMを含んだ(1/1000;ジャクソンImmunologicals)、免疫グロブリンMの検出とHRP−のために、抗ウサギの免疫グロブリンは接合した(1/200;DAKO)。HRPがDAB−Substrateキットを使用しているのを見つけられる前に、細胞は3回洗われた(ネコ。第SK−4100;ベクター研究室;ピーターバラ(Cambs.,UK))製造業者の指示に対する従って。免疫染色するDNA(pCMV−XL537LRP)の量として5LAC−23増加でけがされる陽性の(茶色の)細胞の数が増加する(図10)ことを明らかにする。アイソタイプ制御はCHO細胞をいくらかの背景染色でけがした、しかし、これはトランスフェクション処置(図10、Top列)に含まれたDNAの量を問わず類似している。そして、一過性に形質移入された細胞に対する5LAC−23の結合がはっきりしていることを示した。これらの結果は、5LAC−23のための結合タンパク質が37kdのLRPであることを確認する。やあ、5LAC−23によるトランスフェクション細胞染色への追加、と、また、2つの他の抗体で染色される若干の細胞が37LRPと67LR(図11)に対して指令した。37LRP抗体H−150が細胞質(図1つのIB)に局在化させて形質移入された数セル、認めたanti−。異なるパターンでであるけれども、第二抗体MLuC5(それは67LRを認める)はまた、若干の細胞(図ハイドロコーチゾン)と結合した5LAC−23とH−150(図1つのアイソレーション増幅器とハイドロコーチゾン)のそれに。他の研究者は、MLuC5が形質移入されたCHO細胞と結合するのに失敗したことを発見した。これは、実験的な違い(例えば異なるプロモーター、二次抗体またはクローンの使用または染色テクニックにおける変化)による可能性がある。ラミニンとの接触に応じて取付けのためにレセプターの発散を可能にして、MLuC5の染色がリソソームの膜である可能性がある区画に制限される点に注意しなさい。これらの結果は、形質移入されたタンパク質(37LRP)がCHO細胞でうまく表されることを確認する。これらの結果も、67LRが37LRPポリペプチドに関連があるという、そして、それがCHO細胞で合成されることができるという証拠を提供する。SDS−PAGE結果は、5LAC−23が約37−45kD(例4)であるタンパク質と結合するにつれて、67kDラミニンよりむしろ前駆体分子に対する5LAC−23ひもが受容体たんぱくことを示唆する。トランスフェクション細胞の免疫染色パターンが5LAC−23の位置が主に細胞質で、MluC5結合によりH−150結合と類似していることを示すことを明らかにしているこの実験からの結果‖全体としてやあ、この証拠の合計は、5LAC−23のための抗原が67LRよりむしろ37LRP前駆体分子であることを示唆する。
【0038】
2. 37LRPの細菌表示による確認
更に5LAC−23の推定上の抗原を評価するために、37LRP相補DNAは、細胞フリーな生体外翻訳系で、タンパク質の生合成のために、発現ベクターにクローンをつくられた。プラスミドpCMV−XL537LRP(上記を記載した;ORIGENEは)プライマー5’−GGGAAATTTTCCATATGTCCGGAGC−3による37LRP相補DNAの増幅のテンプレートとして使用した』(合成Nde I部位を含む)、そして、5−CCTATGC AAGCCCGGGTTAAGACCAG−3』(astopコドンと合成Smal部位を含む)。PCR増幅は、Turbo DNAポリメラーゼ(戦略)を使用して実行された。DNAテンプレートの後に940Cで5分の間変性させられて、30サイクル(940C、600Cの45分、720Cの1分の45分)が続いて、720Cで10分の間広げられた。37LRP PCR製品はいずれのpIVEX2.3dもとpIVEX2.4dにクローンをつくられた(ネコ。no. 03 269 019 001;ロシュ)Nde IとSma I部位を使用すること。発生したプラスミドは、pIVEX2.3dLRP(His6−タグのない37LRP)andprVEX2.4dLRPNHiS6(N末端の終わりのHis6−タグによる37LRP)を含む。37LRPタンパク質の表示は、バクテリアで細胞フリーな生体外翻訳系を使用して実行された(RTS 100大腸菌HYキット;ネコno. 3186 148;ロシュDiagnostics、ルイス、英国)製造業者の指示に従うこと。反応混合物のアリコートは、10%のゲル類に積まれて、ニトロセルロースへ移された。膜は、終夜40CのTBSTの5%の脱脂乳によるブロック状態のであった。主要な抗体は加えられた、そして、汚点は3時間室温で暖められた。5がTBSTで洗ったあと、二次抗体は室温で1時間加えられた。主要な抗体は5LAC−23(5つのμg/mL)を含んだ、免疫グロブリンMアイソタイプは制御する(先に述べたように;5μg/mL),the抗37LRP抗体(H−150;0.2のμg/mL;サンタクルスBiotechnology)、そして、正常なウサギ免疫グロブリンG‖(0.2のμg/mL;研究開発Systems)。二次抗体は、上述のHRP抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンMを含んだ(1/5000−10,000;ジャクソンImmunologicals)免疫グロブリンMとHRP抱合型の抗ウサギの免疫グロブリンの検出のために(1/2000;DAKO)。5回を洗った後に、HRP抱合型の抗体は、発見されたwithECL西洋のBlotting Detection Reagents(アマシャム)であった。ウエスタンブロット分析で両方の抗37LRP抗体、H−150と5LAC−23が細菌反応混合物だけで合成されるタンパク質と結合することが分かった37LRPのテンプレート(pIVEX2.3dLRP(37LRP andprVEX2.4dLRPNHis6)は、反応混合物(図12)に含まれた。GFPを表している制御プラスミドが反応混合物に含まれたとき、5LAC−23とH−150は反応混合物と結合しなかった。C末端のHis6−タグに対する抗体は、GFPタンパク質が合成される(示されないデータ)ことを確認した。反応混合物は、pIVEXLRP構造物からの最低2つのタンパク質製品で、おそらくこれらの構造物(Ribosomal結合部位の直後に1と1は、クローニングのために使用されるNde I部位を計上する)の2つの開始コードンのために、またはpost−に翻訳のmodifciationsを生成するだろうように見えた。5LAC−23とH−150が2つの類似のタンパク質帯域を認めるにもかかわらず、結合のパターンは全く明瞭である。5LAC−23は、優先して、可能な翻訳後修飾を提案しているより多くのスミアとして現れる一番上の帯域と結合する。H−150は異なった帯域と結合する(各々の帯域がダブレットである点に注意しなさい;写真の中で見える)。トップ37LRP bandby theIgMアイソタイプ制御に対する若干の結合であるように見える‖(図8;タンパク質のオーバーロードによる非特異的な結合による可能性があるパネルA)。更なるこれらの結果は37kD LRPに5LAC−23の結合を確認して、この抗体の結合がユニークなエピトープにあるという更なる証拠を提供する。そして、既知の抗37LRP抗体H−150の結合とは別である。ロシュからRTSシステムを使用して、多数の翻訳後修飾は、37LRP製品の生合成から除外されることができる。これらはN−を含む、そして、Oにリンクされた糖化、リン酸化反応とジスルフィドは形成を結合する。他の分子がポリペプチド(例えば脂質と硫酸化された群)に加えられる可能性があって、5LAC−23が結合するエピトープの一部である可能性があるかもしれない。ScanProsite(Expasy)は37LRP配列が多数のリン酸化部位、2N−myristolyation部位とチロシン硫酸化部位があることをを予想する。E.coliがこの変形を収めることができない時から、潜在的myristyl群は5LAC−23のエピトープから除外されることができる。リン酸化反応の欠如は5LAC−23がペプチド配列と結合する場合、この配列が正常なヒト細胞でリン酸化される可能性があって、腫瘍細胞で非phosphoprylatedされている可能性があるというで興味深い可能性がある。このように、5LAC−23の抗原を露出させる。
【0039】
実施例7
寒冷保存された正常組織のヒトの抗原分布のIHC検査
研究が実行されたIHCは、正常な人体組織で5LAC−23抗原分布を特徴づけるために、組織を凍結保存した。正常な人体組織の寒冷保存されたスライドは、Covance(英国)から入手可能にされた。それをそれから二回洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)で洗われる10分の間のアセトン中で固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。それは、2%のBSAのブロック状態のであった(SP−5050;ベクターLaboratories社)更なる20分の間。内因性ビオチン部位は、製造業者の指示に従ってアビジン/ビオチン遮断キット(SP−2001;媒介生物Laboratories社)を使用しているブロック状態のであった。5LAC−23、サイトケラチン−8抗(M0631;ダコCytomation)、そして、免疫グロブリンM抗眼球運動計アイソタイプ制御‖(550340;ビジネスデザインPharMingen)、暖められたwiththeは、RTの60分の間の2%のBSA/洗浄バッファの5つのμg/mLのスライドであった。スライドは、ヤギの潜伏より前の抗マウスの免疫グロブリンMが従属的にビオチン標識したという洗われた3つの時であった(B9265;シグマアルドリッチ社社)、1を希釈した:RTの30分の間の1%のウマ血清/洗浄バッファの100。スライドは3回洗われて、アビジン−HRPで孵化した、マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキットによってメイクアップする(PK−6102;ベクターLaboratories社)RTの30分の間:3回を洗った後に、スライドは製造業者によるとDABを使用して開発される色であった』s指導(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後でスライドが脱水の前に水のおびただしい量で洗われるハリスのhaematoxylinthenで対比染色剤で着色されて、DPX封入剤でマウントしたこと(M/Dl 10/08;フィッシャーScientific社)。寒冷保存された正常組織の上で、5LAC−23は、弱く、通常の脳と尿細管と試験される(表5)他の組織のいずれもと結合しない。
【0040】
【表5】
【0041】
これらの結果は、5LAC−23のための抗原が正常組織の上で広く表されなかった、そして、抗体がヒトの限定された数の組織だけと結合することを示唆した。
【0042】
実施例8
ヒトの正常なおよび腫瘍IHC
人体組織結合結果は、それから、ホルマリン固定人体組織のより広いパネルで結合を調べることによって延長された。ホルマリン固定パラフィン包埋通常の器官と腫瘍は、スライドを配列する(B A3;アクセス方式サービスBiotechnology社)、de−はアルコールを通してワックスを塗られた。スライドは、洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)に、短時間に浸漬された。抗原検索は、低pH目標検索溶液で、20分の間全速力でミクロ・ウィービングによって実行された(S1699;ダコCytomation)。内因性過酸化物活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。内因性ビオチン部位は、アビジン/ビオチン遮断キットを使用しているブロック状態のであった(SP−2001;ベクターLaboratories社)製造業者の指示に対する従って。5LAC−23て、そして、免疫グロブリンM anti−、眼球運動計アイソタイプは、制御する(550340;ビジネスデザインPharMingen)、RTで90分の間1%のウマ血清洗浄バッファで、0.75のμg/mLでスライドで暖められた。スライドは、従属的でビオチン標識されるヤギ抗マウス免疫グロブリンMで、潜伏の前に二回洗われた(B9265;シグマアルドリッチ社社)、1を希釈した:RTの30分の間の1%のウマ血清/洗浄バッファの100。二回洗った後に、スライドがアビジン−HRPで暖められたこと、マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキットによってメイクアップする(PK−6102;ベクターLaboratories社)RTの30分の間。スライドは、二回洗われた、そして、色はキットによってDABを使用することを開発した‖(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後で、スライドはそれからDPX封入剤で脱水とマウンティングの前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色された(MfDl 10/08;フィッシャーScientific社)。表6は、組織がパラフィン埋め込まれているとき、5LAC−23が弱く骨格筋、正常肝と通常の胃と結合することを証明する。前の例の場合のように、5LAC−23結合は、正常組織で制限される。5LAC−23は、肝細胞癌(HCC)に最も強く、そして、弱く、胃腺癌と結合する。それは、試験される他の正常なまたは腫瘍組織のいずれかと結合しない。これらのIHC検査で、結合の明確な差が正常肝と大部分の他の正常組織と比較してHCCにあることが分かった。
【0043】
【表6】
【0044】
通常の胃(カラムA)、正常肝(カラムB)と肝腫瘍(カラムC)のうちの5LAC−23による染色の例は、図13で見られることができる。そこで、アイソタイプで組織のいずれかと結合しているisnoは、5LAC−23の結合がはっきりしている示度を制御する。5LAC−23は細胞の細胞質と主に結合した、しかし、若干の膜状の局在化は観察された。5LAC−23は非常に弱く正常肝と通常の胃と結合するが、強く悪質な肝臓と結合する。
【0045】
実施例9
ヒト肝腫瘍部に対する5LAC−23の結合
IHC検査は、ヒト肝臓癌で5LAC−23抗原の癌関連を決定するために行われた。ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓配列は、滑動する(CSl;アクセス方式サービスBiotechnology社)、アルコールを通して非ワックスを塗った。スライドは、洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)に、短時間に浸漬された。抗原検索は、低pH目標検索溶液で、20分の間全速力でミクロ・ウィービングによって実行された(S1699;ダコCytomation)。内因性過酸化物活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。内因性ビオチン部位は、アビジン/ビオチン遮断キットを使用しているブロック状態のであった(SP−2001;ベクターLaboratories社)製造業者の指示に対する従って。5LAC−23と免疫グロブリンM抗眼球運動計アイソタイプは、制御する(550340;ビジネスデザインPharMingen)、RTで90分の間1%のウマ血清洗浄バッファで、0.75のμg/mLでスライドで暖められた。スライドは、従属的でビオチン標識されるヤギ抗マウス免疫グロブリンMで、潜伏の前に二回洗われた(B 9265;Sigma−オールドリッチ社社)RTで30分の間1%のウマ血清/洗浄バッファで、1:100に希釈される。二回洗った後に、スライドがアビジン−HRPで暖められたこと、マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキットによってメイクアップする(PK−6102;ベクターLaboratories社)RTの30分の間。スライドは、二回洗われた、そして、色はキットによってDABを使用することを開発した‖(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後で、スライドはそれからDPX封入剤で脱水とマウンティングの前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色された(M/Dl10/08;フィッシャーScientific社)。1、2試料でほんの少数の細胞だけが染色されたにもかかわらず、5LAC−23は、HCC組織配列スライド(表7を見る)の上で、73%のHCC断面と結合した。染色は、主に細胞質だった。これらの結果は、5−LAC−23抗原が他の組織タイプと比較して肝臓癌でとても表されるだけではない、しかし、それが異なる患者から大部分のヒト肝臓癌で表されることを示す。
【0046】
【表7】
【0047】
実施例10
マッチされた正常なおよび肝腫瘍染色
マッチされた近隣の通常で始原ヒト肝細胞癌肝臓組織のスライドを凍結保存した(T6235149;アクセス方式サービスBiotechnology社)、除氷されて、風乾された。それをそれから二回洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)で洗われるlOminsのためのアセトン中で固定した。内因性過酸化物活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。それは、2%のBSAのブロック状態のであった(SP−5050;ベクターLaboratories社)更なる20分の間。内因性ビオチン部位は、製造業者『s指導によってアビジン/ビオチン遮断キット(SP−2001;媒介生物Laboratories社)を使用しているブロック状態のであった。5LAC−23、サイトケラチン−8抗(M0631;ダコCytomation)、そして、免疫グロブリンM抗眼球運動計アイソタイプ制御(550340;ビジネスデザインPharMingen)、RTで60分の間2%のBSA/洗浄バッファで、5つのμg/mLでスライドで暖められた。スライドは、ヤギの潜伏より前の抗マウスの免疫グロブリンMが従属的にビオチン標識したという洗われた3つの時であった(B9265;Sigma−オールドリッチ社社)、1を希釈した:RTの30分の間の1%のウマ血清/洗浄バッファの100。スライドは3回洗われて、アビジン−HRPで暖められた。そして、RTで30分の間マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキット(PK−6102;媒介生物Laboratories社)によって占められた。3回を洗った後に、スライドは製造業者の指示に従ってDABを使用して開発される色であった(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後でスライドがそれから脱水の前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色されて、DPX封入剤でマウントしたこと(MTD110/08;フィッシャーScientific社)。図14は、同じ個人からマッチされた正常なおよび腫瘍組織の寒冷保存された肝臓断片を示す。サイトケラチン8(パネルC)が通常の肝細胞と結合に局在化させる注は正常組織に制限される。そして、断面の一部が通常でガン組織の混合物であることを示す。5LAC−23は腫瘍試料と結合して、悪質な組織をこの断片において代表する中心領域に特有なだけである。アイソタイプ対照でけがされるとき、断面は負である。そして、5LAC−23の結合がはっきりしていることを示す。染色パターンは、5LAC−23から、患者試料で、抗体がそれによってそれを魅力的なdruggableな目標としている悪性細胞に非常に特有だったことを示した。
【0048】
実施例11
変えられた増殖条件による正常細胞の結合の誘導
実験は、5LAC−23発現が選択された状況の下で正常細胞で誘発されることができたかどうか調査するために行われた。Beas−2B『通常の』肺上皮細胞は、コーティングしてないフラスコの上で大きくなって、vitrogenでおおわれていた(0.03mg/ml vifrogel;結合Technologies社)。細胞は、気管支の上皮細胞増殖培養液で大きくなった(CC−3170;Clonetics)370Cの95%の空気/5%のCO2の加湿された空気で。約80%融合性のとき、細胞は細胞解離溶液(SIGMA Cat.番号C5914)で取り出されて、二回inPBSを洗って、10%のホルマリンfor30分で固定した。細胞ペレットは固形パラフィンの懸濁させたである前にアルコールで脱水されて、60分の間450Cで暖められた。固形パラフィンは冷却していて、固まっている45°C. Afterで60分の潜伏で3回よみがえった、3μm部はライカ磁気レイノルズ数の上で2135のミクロトームを切られて、ガラス・スライド上へ焼かれた。断面は、上述のマッチされた肝臓試料に関しては、5μg/mL 5LAC−23または免疫グロブリンMアイソタイプ対照でけがされた。細胞がVitrogen(図15)で大きくなる場合にだけ、通常の肺上皮細胞系列Beas−2Bに対する5LAC−23の結合は見られることができる。免疫グロブリンMアイソタイプ制御の結合は、5LAC−23の結合がはっきりしていたことを示しているのを見られることができない。正常細胞でさえ、これらの結果は、特定の状況では、例えば成長因子、接着分子と細胞外基質分子の面前で、5LAC−23の抗原の表現度が誘発されることができることを意味する可能性がある。これらの増殖条件の異常は、しばしば悪質で前悪性の国で生じて、37LRP(肝細胞癌で観察されるそれのような)の発現変化に関与する可能性がある。
【0049】
実施例12
ウエスタン分析によるさまざまなヒト細胞系の5LAC−23の配布
ヒト細胞系の調査は、37LRPの配布と5LAC−23のエピトープを評価するために、ウエスタン分析によって実行された。細胞可溶化物はプロテアーゼ阻害薬でRIPAバッファで多数のヒト腫瘍または形質転換細胞系から準備された、そして、1−Dimensional SDS−PAGEセクションで記述されるにつれて、ウエスタンブロットは準備された。溶解産物は、胸部細胞系HB4aR4.a(ラジウムで変わる正常な乳房細胞)、HMT 3522(正常細胞)、MCF−7(腫瘍細胞)、最低降下高度−MB−231(腫瘍細胞)から作られた;MDA−MB−361(乳房腫瘍による脳転移);卵巣腫瘍細胞系OVCAR−3;肝細胞は、チャンのLiverとHepG2に沿って並ぶ;メラノーマ細胞ラインA375;そして、大腸腫瘍細胞は、DLD−I、LS174TとSW620に沿って並ぶ。37LRPタンパク質が以前チャイニーズハムスターから記載された時から、野生型CHO細胞も含まれた(Cricetulus灰白;NCBI Accession番号:298088).コバルト−局在化セクションで記述されるにつれて、汚点はいずれのH−150もまたは5LAC−23で探索された。抗37LRP抗体H−150は試験される細胞系の全てでタンパク質帯域を認める。そして、野生型CHO細胞(図16A)を含む。少なくとも2つのタンパク質帯域が異なるヒト・アイソフォームの存在を示しているH−150で見つけられて大腸細胞系(DLD−I)にある点に注意しなさい。H−150と5LAC−23が西部劇の中で類似の大きさを設定された帯域と結合したにもかかわらず、5LAC−23はH−150(図16B)のそれに異なるパターンで細胞可溶化物と結合した。H−150は細胞系の合計37LRPを見つける、5LAC−23のエピトープの表示は異なる細胞可溶化物全体で変化する、そして、中で、一部は存在しない。CHO細胞可溶化物に対する両方の抗体の結合が類似しているにつれて、抗体のこの違いはその抗原のためにH−150と比較してその抗原のために5LAC−23の下部の親和性によらない。5LAC−23は、近似のユニークなスミアを見つける。非還元の条件(図16B、レーン12)のLS174T溶解産物のHOkD。このスミアは還元性の状況の下で消える、しかし、増加が37LRP前駆体(示されないデータ)に対応している帯域にない。既知の抗LRP抗体H−150と比較して、これらの結果は、37LRPの上で5LAC−23時までに認識されるエピトープがユニークであるという更なる証拠を提示する。5LAC−23は免疫組織化学(トランスフェクション部、例6)によって野生型CHO細胞と結合しなかったが、還元性で非還元の状況(図16)の下で、西部劇によってwt CHO溶解産物と結合する。これは、5LAC−23のエピトープが高次構造的に依存している可能性があるおよび/またはエピトープが自国の状況の下で露出しないか抗体にアクセスできないことを示唆する。全体として、このデータは、5LAC−23の抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも5LAC−23抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。全体として、このデータは、5LAC−23抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも5LAC−23の抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。この仕様で言及される全ての特許と刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって組み込まれてこの中にある。発明の特定の形状が例示される間、それが記載されてこの中の部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。さまざまな変化が発明の範囲から出発することなくなされる可能性があることは当業者にとって明らかである、そして、発明は示されて、明細書で記述されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、直ちに本発明が物体を実行するのにかなり適していると認めて、その中で固有のそれらと同様に、言及される終わりと利点を得る。この中に記載されるどんなオリゴヌクレオチドでも、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した合成物、方法、処置と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、発明の精神の範囲内で含まれて、添付の請求項の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその発明請求する‖そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための描かれたモードのさまざまな変形は、以下の請求項の範囲内のことを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1A】6BD−25、5LAC−23と抗ファス(正の制御)抗体の代表的なFACSヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
【図1B】6BD−25、5LAC−23と抗ファス(正の制御)抗体の代表的なFACSヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
【図2】予防SWl116大腸癌モデルの腫瘍成長に関する6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
【図3】予防OVCAR−3卵巣癌モデルの体重の6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
【図4】6BD−25またはバッファ制御による腫瘍を含んだマウス後処理の残存。マウスは、240日以上後処理のために生存をモニターされた。
【図5】図5Aと5Bは、全細胞可溶化物(T)と細胞質の分数(C)のウエスタンブロットは、アイソタイプ対照(パネルA)か5LAC−23(パネルB)で染色されるOVCAR−3 Cellsから作った。異なった帯域は5LAC−23で見つけられて、黒い矢で示される。
【図6】図6Aと6Bは、OVCAR−3細胞質のタンパク質のウエスタンブロットは、2次元の電気泳動によって分かれた。パネルBが5LAC−23で探索される汚点を示す間、パネルAは免疫グロブリンMアイソタイプ対照と探索されるブロットを示す。矢は、5LAC−23時までに認められる点に対応する。
【図7】図7A、7Bと7Cは、OVCAR−3細胞質のタンパク質の2次元 SDS−PAGEとウエスタンブロット。図中パネルAは、細胞質の分数のシルバー染色されたゲルである。Panel Bがアイソタイプ制御抗体で探索される類似の汚点を示す間、パネルCは5LAC−23時までに認められるタンパク質の位置を示す。
【図8】図8A、8B、8Cと8Dは、5LAC−23よって認められる点に対応する。OVCAR−3細胞質の分数のウエスタンブロットは、抗37LRP抗体H−150の(A)、抗37LRP抗体F−18(B)、免疫グロブリンMアイソタイプ制御(C)と5LAC−23(B)で深く探った。
【図9】図9Aと9Bは、OVCAR−3細胞からの細胞質のタンパク質の2−次元ウエスタンブロット。Blot Aの矢は、5LAC−23が結合する主要発疹を示す。Blot Bの線は、抗37LRP(H−150)抗体に特有である点を示す。汚点の上で明かされる他の点は、抗体のアイソタイプでまたは使用される二次抗体で相互作用による。
【図10】図10A、10B、10Cと10Dは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ制御(一番上の列)で37LRP(pCMV−XL537LRP)コードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されたCHO細胞(10X拡大)の免疫染色される。細胞はFugene試薬(甲欄)単独で形質移入されたか、pCMV−XL537LRPの量を増加させていた(1マイクログラム:柱B;2マイクログラム:柱C;4マイクログラム:柱D)。細胞が5LAC−23でけがされたとき、陽性細胞(茶色の)の増加性の数はプラスミドの増加性の量で見られることができる。
【図11】図11A、11B、および11Cは、アイソレーション増幅器。37LRPコードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されるCHO細胞(40X)の免疫染色される(pCMV−XL537LRP;2マイクログラム)。細胞は5LAC−23(A)で染色された、抗37LRP抗体H−150(B)と抗67LR抗体MLuC5(C)と陽性細胞は全部で見られることができる免疫染色する。
【図12】図12A、12Bと12Cは、ウエスタン分析によってさまざまな抗体によって見つけられるE.coliのヒト37LRPの表示。細菌反応混合物に含まれたプラスミドは、C末端のHisβ−タグ(レーン1)で、Control媒介生物GFPを含んだ、pIVEX2.3dLRP(37LRP;レーン2)andprVEX2.4dLRPNHjS6(aN−terminalHis6−タグによる37LRP;レーン3)。汚点は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(パネルA)、5LAC−23(パネルB)と抗37LRP抗体H−150(パネルC)で探索された。
【図13】図13A、13Bと13Cは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ対照(一番上の列)と一緒のパラフィン包埋組織の染色。断面は、通常の胃(甲欄)、noπnal肝臓(柱B)と肝細胞癌(柱C)から取り出された。
【図14】図14A、14Bと14Cは、マッチされたnoπnal(一番上の列)とマッチされた腫瘍組織(一番下の列)からの寒冷保存された肝臓組織に対するさまざまな抗体の結合。使用される抗体は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(甲欄)、5LAC−23(柱B)と抗サイトケラチン8(柱C)であった。
【図15】図15Aと15Bは、5LAC−23()と免疫グロブリンMアイソタイプ対照()と一緒の通常の肺上皮細胞系列Beas−2Bのイムノ組織化学染色。細胞は成長される(柱B)か、外で(甲欄)Vitrogenであった。
【図16】図16Aと16B。非還元の条件のウエスタンブロット法によって発見されたものとしての多数の腫瘍と形質転換細胞系の表現oftheエピトープ 抗37LRP antibodyH−150の(A)と5LAC−23(B)。細胞系は、野生型CHO細胞(レーン1)とヒト細胞系を含んだ:HB4aR4.a(レーン2)、HMT 3522(レーン3)、MCF−7(レーン4)、最低降下高度−MB−231(レーン5);最低降下高度−MB−361(レーン6)、OVCAR−3(レーン7)、チャンのLiver(レーン8)、HepG2(レーン9);A375(レーン10)、DLD−I(レーン11)、LS174T(レーン12)とSW620(レーン13)である。
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌疾患修飾抗体(CDMAB)の単離および生産に、そして、治療的で診断過程の、任意に一つ以上の化学療法剤と結合するこれらのCDMABの使用に関するものである。更なる発明は、本発明のCDMABを利用する結合アッセイに関するものである。より詳しくは、この発明は、診断とラミニン受容体1前駆体タンパク質37LRPと結合する5LAC−23モノクローナル抗体(またはそこから引き出される抗原性の結合フラグメント)の能力の周りを回転するガン疾患の治療に関するものであり、特に特にそれによって、そして、通常、認識される特定の抗原性部位で5LAC−23の直接的な結合に依存するさまざまな平均値による肝細胞腺腫の診断と処置に対するほとんどは、肝細胞腺腫細胞で過剰発現する。
【背景技術】
【0002】
かかわらず、同様に、同じ段階で、現在の治療は、同じ癌種を有する全ての患者を処置する。これらの患者の少なくとも30パーセントは第1の線治療に失敗する。このように、処置の更なる回と治療失敗、転移と、最後に、死亡の増加した確率に導く。処置への優れたアプローチは、特定の個人のための治療の専用化である。専用化に向く唯一の現在の治療は、手術である。化学療法と放射線治療は患者に合わせて調整されることができない、そして、ほとんどの場合、手術は単独で産生性の治癒に不十分である。モノクローナル抗体の出現で、各々の抗体が一つのエピトープに導かれることができる時から、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になった。さらにまた、独自に特定の個人の腫瘍を定義するエピトープの星座にあてられる抗体の組合せを発生することは、可能である。ガンで通常の細胞との間の有意差が癌細胞が悪性変換細胞に特有である抗原を含むということであると認めて、科学界はモノクローナル抗体が特に特にこれらの癌抗原と結合することによって悪性変換細胞を目標とするようになっていることがありえると長く考えた;このように信念を引き起こして、そのモノクローナル抗体は、癌細胞を除去するために、「魔法のBullets」として用いられることができる。しかしながら、一つのモノクローナル抗体も癌の全ての例でサーブすることができるというわけでないと現在広く認められる、そして、目標とされた癌治療として、クラスとして、そのモノクローナル抗体は展開されることができる。すぐに開示された発明の教義に従って分離されるモノクローナル抗体は、全身腫瘍組織量を減らすことによる例のために、患者に有益で、ここでは癌疾患修飾抗体(CDMAB)または「抗癌」抗体とさまざまに称する方法でガン疾病経過を修正することが示された。今のところ、癌患者には通常処置のほとんど任意選択がない。癌治療への規格化されたアプローチは、世界的な生存と罹患率の改善をもたらした。しかしながら、特定の個人に、これらの改善された統計が、それらの個人状況の改善と、必ずしも相関するというわけではない。このように、開業医は同じコホートでそれぞれに他の患者の各々の腫瘍を処置することができた方法論が出される場合、これはちょうどその一人の人に裁断治療の固有の接近ができるようにするだろう。治療のそのようなコースは、理想的には、治癒の率を増加させて、より良好な結果を生む。そして、それによってlong−フェルト必要を満たす。歴史的に、ポリクローナル抗体の使用が、ヒト癌の治療における限られた成功で使われた。リンパ腫と白血病havebeenはヒト血漿と交渉した、しかし、ほとんど遷延性緩解または反応がなかった。さらにまた、再現性と付加給付でない欠如が、化学療法と比較してあった。乳癌、黒色腫と腎細胞癌のような固形腫瘍は、対応して予測不可能で無効な結果で、人血、チンパンジー血清、ヒト血漿とウマ血清で治療されもした。モノクローナル抗体の多くの臨床試験が、固形腫瘍のためにあった。1980年代に、少なくとも4つの臨床試験が、1人の応答者だけを特異性抗原に対して抗体を使用しているか、組織選択性に基づく少なくとも47人の患者から作り出したヒト乳癌のためにあった。それは、37人の患者が約4分の1が部分的な反応率を持った、そして、追加25セントには軽度のまたは安定病態進歩があった反応のために評価されてあった本研究においてCISPLATIN.と結合してヒト化の抗Her2/neu抗体(HERCEPTIN)を使用している成功した臨床試験があった1998年まで、なかった。進行に時間の中央値の間で応答者は、5.3ヵ月の反応期間の中央値による8.4ヵ月であった。HERCEPTINが、TaxolR(3.0ヵ月)単独を受けた群に、割に、結果が抗体療法を受けた人々のために疾患進行までの時間の中央値の増加に示したTaxolR. Clinical検査さらにTaxolR(6.9ヵ月)と結合して第1の線使用のために1998年に承認された。わずかな増加が、生存期間の中央値でもあった;TaxolR処置腕を加えたHERCEPTIN対TaxolR処置のための22対18ヵ月は、単独で武装する。加えて、完全(8対2パーセント)で部分的な応答者(34対15パーセント)inthe抗体さらにTaxolRの組合せ群の数の増加が、単独で割にTaxolRにあった。しかしながら、HERCEPTINとTaxolRによる処置は、TaxolR処置(13対1パーセントそれぞれ)単独に、割に心毒性のより高い発生率に導いた。免疫組織化学で測定されるにつれて、臨床試験では、Her2/neuの表現レベルはHERCEPTIN治療に対する反応を予測した。転移性乳癌患者の間で、Her2/neu(スケールを記録している病理学の上で2−3+に指定される)の過剰発現を持つ人々だけは、抗体療法から利益を得た。転移性乳癌が認められる約25パーセントの患者は、Her2/neuを過剰発現して、HERCEPTINで治療されることができた;過剰発現以外の患者、そして、このように、利益を得なくて、抗体を用いた治療を受けない。HERCEPTIN治療のための選択は疾患の分子マーカーの識別に基づく処置にふさわしい患者を選択する方法を意味する、そして、この方法はアメリカ食品医薬局によって診断ルーチンとして承認された。しかしながら、乳癌患者の大きい会ったことのない必要が、まだある。HERCEPTIN処置を利益を受けることができる人々さえ、化学療法をまだ必要として、従って、少なくともある程度に、この種の処置の副作用をまだ扱わなければならない。結腸直腸癌を調査している臨床試験は、糖蛋白と糖脂質目標に対して抗体を含む。17−アイソレーション増幅器(それには、腺癌のために若干の特異性がある)のような抗体受けられたPhase 2を分析的にするパーシャルレスポンスを持っている1人の患者だけを有する60人以上の患者で試験。他の試行において、17−1Aの使用は、添加されたシクロホスファミドを使用しているプロトコルで、52人の患者の間で1つの完全寛解と2つのやや有効だけを発生した。17−1Aが関係している他の試行は、類似していた結果を得た。現在まで、示されない17−IAhaveのPhase臨床実験中は、段階HI大腸癌のためにアジュバント療法として効力を高めた。まず最初にイメージングのためにも承認されるヒト化のネズミのモノクローナル抗体の使用は、腫瘍退縮を発生しなかった。最近だけ、どんな陽性結果でも、モノクローナル抗体を用いて結腸直腸癌臨床研究からあった。2004年に、ERBITUXはイリノテカンに基づく化学療法に不応性であるEGFRを表している転移性の結腸直腸癌患者の第2の線治療のために承認された。2−腕Phase II臨床研究と一回の腕検査からの成績は、イリノテカンと結合するERBITUXがそれぞれ4.1と6.5ヵ月の疾患進行までの時間の中央値でそれぞれ23と15パーセントの反応率を持つことを示した。同じ2−腕Phase II臨床研究ともう一つの一回の腕検査からの成績は、ERBITUX単独による処置がそれぞれ1.5と4.2ヵ月の疾患進行までの時間の中央値でそれぞれ11と9パーセントの反応率に帰着することを示した。従ってスイスと米国で、イリノテカンとintheアメリカ合衆国(ERBITUX処置単独)と結合するERBITUX処置は、失敗した第1の線イリノテカン治療を受ける大腸癌患者の第2の線治療として承認された。従って、HERCEPTINの様に、スイスの処置は、モノクローナル抗体と化学療法の組合せとして承認されるだけである。加えて、スイスと米国での処置は、第2の線治療として患者のために承認されるだけである。また、2004年に、AVASTINは転移性の結腸直腸癌の第1の線治療として、静脈内5−フルオロウラシルに基づく化学療法と結合して、使用のために承認された。第三相臨床研究結果は、5−フルオ尿ウラシル(20ヵ月対16ヵ月それぞれ)単独を用いた治療を受ける患者と比較してAVASTIN+5‐フルオロウラシルで治療される患者の生存期間の中央値で、延長を示した。しかしながら、再びHERCEPTIN andERBITUXの様に、処置はモノクローナル抗体と化学療法の組合せとして承認されるだけである。加えて、承認された診断ルーチンが免疫組織化学プラットフォームに基づく癌診断のために、HERCEPTINとERBITUX抗原性の目標に基礎をおいたアメリカF.D.Aが、ある。同様に、等しく劣った結果が、肺、脳、卵巣の(膵臓の)前立腺と胃癌のためにあった。抗GD3モノクローナル抗体のいくらかの限られた成功inthe使用が、黒色腫のためにあった。このように、ヒトの必要条件である成功した小さい動物試験にもかかわらず、臨床試験(ここまで試験された抗体)が大部分のためで、効果がなかったことが分かる。肺、脳、卵巣の(膵臓の)前立腺、胃癌と肝細胞癌のための劣った結果であり続ける。非−肺小細胞癌のために最も有望な最近の結果は、処置がモノクローナル抗体を含んだPhase II臨床試験から生まれた(SGN−15;dox−BR96(抗Sialyl−LeX))化学療法剤TAXOTERE.と結合する細胞殺害薬ドキソルビシンに抱合型であるTAXOTEREは、肺癌の第2の線治療のための唯一の食品医薬品庁承認された化学療法である。最初のデータは、単独でTAXOTEREと比較して改善された総生存率を示す。本研究のために補充された62人の患者から、残留する3分の1が単独でTAXOTEREを受ける間、3分の2はTAXOTEREと結合してSGN−15を受けた。TAXOTEREと結合するSGN−15の投与を受けた患者のために、総生存率の中央値は単独で割にTAXOTEREの投与を受けた患者のための5.9ヵ月につき7.3ヵ月であった。1年と18ヵ月総生存率は、それぞれ単独でTAXOTEREの投与を受けた患者のためにそれぞれ24と8パーセントと比較してSGN−15+TAXOTEREを受けている患者のための29と18パーセントであった。更なる臨床試験は、この薬のために予定される。SGN−15がマーケティングのために承認されなかったにもかかわらず、癌のためのいくつかの他の抗体複合体は2000年以降アメリカ食品医薬局の承認を得た。これらは、再発性非Hodgkinリンパ腫の治療のために、再発された急性骨髄性白血病の治療、非Hodgkinリンパ腫の治療のためのZEVALIN(ibritumomab tiuxetan、Yttrium抱合型のRITUXEVIAB、ヒト化抗CD20 MAb)、BEXXAR(1−131は、tositumomabを活用させた、抗CD20 MAb)のためにMYLOTARG(gemtuzumab ozogamicin、ヒト化抗CD33 MAb)を含む。これらの抗体は癌特異的な分子に対して開発された。そして、それはいずれの毒素もまたは同位元素にそれらを接合に適当にした。血液原疾患だけが抱合型の抗体を用いた現在うまく治療を受けることは明瞭である、そして、固形腫瘍(例えば肝細胞癌)はそのような治療をまだ必要とする。浸潤と転移がそうである腫瘍は、癌細胞を含む一連のプロセスと宿主によって余分の細胞マトリックスを特徴づけた。基底膜は、それらに基づく細胞を系統化することにおいて重要な役割を果たす専門余分の細胞構造である。腫瘍細胞の転移は、細胞外基質(ECM)の構成要素で、細胞の相互作用を含む。ラミニンは細胞付着(増殖)を促進する基底膜の主要成分である成長、分化、そして、遊走(クラインマン・ヘキソキナーゼその他は、J Cell Biochem 1985(217:317−25)である。小マーティンGは、アール、Annual Rev Cell Biol 1987、3である:57−85。小BeckKは、アール、FASEB J 1990、4である:148−60).生体外でインビボのモデルは癌浸潤と関係しているラミニンと結合している腫瘍細胞を示した、遊走、そして、転移するcability(小テッラノーヴァVPは
、アール、Cancerレニウム1982、42である:2265〜2269。Varani Jなど、病理Am Jは、1983、111ある:27−34.小バースキーSHは、アール、JクランInvest 1984、74:843 ― 848 ― である。Malinoff HL、Int J Cancer 1984、33:651−655。小カネモトKは、アール、ProcNatl Acad Sci米国1990、87である:2279−2283)。67kDラミニン受容体(67LR)、非インテグリン高親和性は表現が癌細胞でかなり増加して、他の細胞表面タンパク質の間でラミニンと相互に作用するラミニン−結合タンパク質である(Malinoff HLその他は、Int J Cnacer 1984(33:651−655)である。ラオCNその他は、Bicohem Biophys Res Commun 1983(111:804 ― 808 )である。テッラノーヴァVPその他は、Proc Natl Acad Sci USA 1983(80:444−448)である。MalinoffHその他は、J Cell Biol 1983(96:1475〜1480)である。Ruyman RBその他は、J Cell Biol 1988(107:1863〜1871)である。アルベルダ・スフィンゴミエリンその他は、FASEB J 1990(4:2868〜2880)である。雹Department of Employmentその他は、J Cell Biol 1990(110:2175 ― 2184 )である)。それは67LRの表示が胸部(大腸)のような癌で増加することを明らかにされた、そして、正常組織と比較した胃癌‖(Cioce Vその他は、J Natl Cancer Inst 1991(83:29−36)である。カストロノバVその他は、Am J Pathol 1990(137:1373〜1381)である。D’Errico Aその他は、Mod Pathol 1991(4:239−246)である)。67kDラミニン受容体(67LR;表1)最初はネズミの黒色腫の細胞膜から分離した(小ラオは、アール(1983)である。Biochem Biophysレニウム。Commun。111:804−808)、線維肉しゅ細胞(Malinoff及びWicha(1983)。J Cell Biol 96:1475−1479)、そして、通常のウシの筋細胞‖(小Lesotは、アール(1983)である。EMBO J 2:861).それ以来、それは多数の種で発見されていて、人体組織の幅広い範囲で存在する(見本用は、Barsoumローラーとコギン2000をみる。細胞MoI Biolレット語。5:207−230;小メナードが、アール(1998のJ. Cell.)である生化学67:155−165; Mecham 1991アンヌRev Cell Biol 7:71−91)。
【0003】
【表1】
【0004】
37kD ラミニン結合タンパク質(37LBP)未成熟ラミニンは、受容体たんぱく(iLRP):67LRのための32kD ラミニン結合タンパク質(LBP 32)ヒト相補DNAは最初は悪性結腸癌から分離された(それゆえに、タンパク質は大腸癌ラミニン結合タンパク質としても知られている;小雌羊は、アール(1988)である。85:6394−6398)、そして、最初に予想されるより、小さい。相補DNA予測された配列は、32kDの算出量で、295のアミノ酸性蛋白のためにコードする。しかしながら、それはSDS−PAGEゲルの上で37−44kDで通常動作する。そして、それは酸性タンパク質(算出π4.83)の還元型の電気泳動易動度による可能性がある。A少数(16)、N末端の方のプレゼントは、疎水性アミノ酸である(カストロノバ、Taraboletti及びソーブル(1991)。J. Biol. Chem. 266:20440−20446)、それは細胞膜にわたる可能性がある。37kDタンパク質と67kDタンパク質は抗原性に関連があることが示された(小ラオは、アール(1989)である;生化学28:7476−7486)黒色腫細胞に対して行われるパルス‐チェイス実験が発生する37kDタンパク質が67kD製品に追跡されることを示す、(小カストロノバは、アール(1991)である。生化学Biophys。レニウム。Commun。177:177−183).これらの結果は、2つのタンパク質の直接的な前駆体−製品関係があることを示唆した。それ故、37kDタンパク質は、37kDラミニン受容体前駆体と称される(37LRP;表1)。パルス‐チェイス実験は前駆体と最終的な67LR(カストロノバなど、1991)の間で少しの中間形もの存在を明らかにしなかった、しかし、5OkD分解生成物は発見されていた。37kDポリペプチドには細胞質と膜での多機能性の役割がある可能性があって、67LRの配位子を結合している構成要素である可能性がある(エリアス・カンポその他、病理Am Jは、1992、141ある:ノー1073.5−1083)。癌細胞において、67kDタンパク質に対する抗体が細胞表面と細胞質(Wever UMその他は、Cancerレニウム1987、47である:5691−5698)と結合することを示された。それは完全には、最終的なレセプターが、脂肪酸パルミチン酸塩によるアシル化以外は、67kDレセプターを成し遂げるために細胞によって作られるよく理解されている方法でない。そして、オレイン酸剤とステアリン酸エステルは含まれる可能性がある(ランドヴスキ、Dratz及びスターキー(1995)。34:11276−87;小Butoは、アール(1998のJ. Cell Biochem. 69)である:244−251).広範囲な糖化は、複雑にならない。予測された相補DNA配列はNにリンクされた糖化のために、そして、セリンとトレオニン残りの存在にもかかわらず共通配列部位を含まない、Oにリンクされたグリコシル群の証拠がない(小カストロノバは、アール(1991)である。生化学Biophys。レニウム。Commun。177:177−183;ランドヴスキ、Dratz及びスターキー(1995)。34:11276−87).しかしながら、カストロノバ(カストロノバ(1993のInvasion Metastasis 13):1−30)は67LRがcross−がβ−ガラクトシダーゼ結合性レクチンと反応するエピトープを表すように提案した。67LRは、脂質(ランドヴスキ、Dratz及びスターキー、1998)によって結合される前駆体ポリペプチドの二量体の成り立つ可能性がある。ヘテロ二量体化がレクチンのようなタンパク質またはガレクチン3で起こる可能性があることを示唆された(小カストロノバは、アール(1991)である;小Butoは、アール(1998)である)。抗ガレクチン−3抗体は、ガレクチン3だけでなく67LR(小Butoが、アール(1998)である)も認めた。レセプターの最終的な構造は、解明されていない。培養で細胞の表面から放棄されるとき67LRラミニンと結合するその能力を保持する(小Karpatovaは、アール(1996)である。J. Cell。生化学60:226−503)。67LRがどのように細胞膜に取り付けられるかは、いまだ明らかでない。レセプターがそのN末端の終わりの方へ16の疎水性アミノ酸を持つにもかかわらず、それが必須膜タンパク質として存在することよりむしろ会合分子と対話するかもしれない。ithasにしかしなから、確立するポリペプチドのアミノ末端基が、実際、この領域が他の分子と相互に作用することを示唆している非−透過させられた細胞で到達できない(小カストロノバは、アール(1991)である。J. Biol. Chem. 3020440−20446;小Wewerは、アール(1987のCancerレニウム)である。47:5691−5698).アクセサリーファクターが67LRを伴う可能性がある、または、それがアクセサリー分子自体として作用することを示唆された。そのような性質は、結合している細胞表面および/またはラミニンに輸送を援助する可能性がある。67LRの同時発現と肺小細胞癌細胞系のαeβiがラミニンに細胞接着で直接相互関係のある点に注意された‖(小Pellergrineは、アール(1994)である。Int J Cancer Suppl 8:116−120).ヒト黒色腫細胞が両方の67LRラミニンとotで処置された?原形質膜に共同転位置されたβi(小ロマノフ王朝は、アール(1994)である。細胞Adhes Commun。2:201−209).α6βiを伴う67LRは、ラミニンにヒト記憶T細胞の集団の高いアビディティ付着の媒介となった(Clanfield andKhakoo(1999)。J. Immunol。163:3430−3440).etalなArdini、1997notedthat‖67LR、そして、共同局在化させられなかったα6β4同時制御された、67LRとα6サブユニットの間の物理的な相互作用を経て(小Ardiniは、アール(1997)である;J. Biol. Chem. 272:2342−2345)。しかしながら、卵巣癌で37LRPメッセンジャーRNAとタンパク質の表現度がα6サブユニットから独立していること(Givant−ホーウィッツ(2003人のクラン)。exp.転移20:599−609;小Skubitzは、アール(1996)である。病理Jは、148:1445−1461である)。一緒に、これらの結果は67LRが細胞質でラミニンに特有のインテグリン(特にα6サブユニット)を一体にする可能性があることを示唆する。そして、両方のレセプターがラミニンの認識に関与する総合ビルとして細胞膜に到達して、相互作用が高さか低親和性(ランドヴスキ、Dratz、スターキー、1995)のうちの1つであるかどうか決定する。3p21.3に活発な人間の37LRP遺伝子地図、癌を伴う遺伝子の変更にしばしば関与している染色体場所(小木材選別人は、アール(1996)である。オンコジーン13:495−503).活性遺伝子は7つのエキソンと6つのイントロンを含む(小木材選別人は、アール1996である。オンコジーン13:495−503;小鳥類の遺伝子Clausseは、アール(1996のDNA Cell Biol 15)である:1009− 1023).それは古典的タタボックスを含まない、しかし、複数の転写開始点がある可能性がある。部位がプロモーター領域に示す4つのSpI、イントロン1の6つのSpI部位と2つのAIu配列が可変スプライシングに影響を及ぼす可能性があるイントロン3にある。イントロン4は核内低分子RNA E2のために配列を含む(小木材選別人は、アール1996である。オンコジーン13:495−503).遺伝子の少なくとも26部は、ヒトゲノムで存在する、高いhomologywiththe機能的な遺伝子を示している全て(etalな木材選別人(1996)。Biochem Biophys Acta。1305:98− 104).これらのコピーのうちの19は、分析されて、機能不全のコピーを引き起こしている謄写刷政府印刷物偽遺伝子であることが示された。これらの偽遺伝子がレトロ位置的なイベントによってきっと発生したと思われる‖(小木材選別人は、アール(1996)である。Biochem Biophys Acta。1305:98−104).ラットとヒト配列が99%の相同性を共有する間、相補DNAはマウス、ウシとヒト配列の間で少なくとも98.3%の相同性で進化の全体を通じて非常に節約される(見本用は、メナードなどを見る、1997。J Cell Biochem 67:155−165)。37LRP遺伝子は、37LRP以外の多数の機能蛋白質を生じるように見える。37LRPタンパク質は、99%の相同性をp40リボソーム関連のタンパク質と共有する(p40ポリペプチド;p40;リボソームタンパク質社;ItPSA)翻訳の機械に関係する(小Makridesは、アール(1988)である。核のAcidレニウム。16:2349;小Tohgoは、アール(1994)である。FEBSレット語。340:133−138;ローゼンタール及びWordeman 1995。J. Cell Sci. 108:245−256).胚目の開発の位置的なマーカーは37LRP相補DNAと同一の遺伝子にもよってコードされる(小Rabacchiは、アール(1990)である。発現109:521−531;McCafferey、ネーブとドレーガー(1990)。PNAS 87:8570−8574).腫瘍胎児性抗原(OFA;37−44kD)、免疫原性の糖蛋白は、齧歯目で人間の腫瘍と初期の胎児で表される。ネズミの37LRPは、最高99.5%のアイデンティティをOFAと共有する(コギン、Barsoum、ローラー1999。抗癌性のResearch 19:5535−5542).それは、37LRPの自動免疫原性の相同体と称された。OFAはマウスとヒトでTとBリンパ球を刺激して、癌において免疫原性の役割を果たすことが示された特に腎臓癌で‖(小Zelle−Rieserは、アール(2001)である。J. Urol。165:1705−9;小ホールトは、アール(2002)である。臨床癌レニウム。8:3369−3376;小ローラーは、アール(1992)である;J. Natl. CancerInst。(ベセズダ)84:602−609;etalなローラー(1994)。J. Immunol。155:755−764;小ローラーは、アール(1995)である。J. Immunol。155:5719−5727;ローラーなど、2001。モッズ。態様Immunibiol。1:191−195;小ローラーは、アール(1999)である。J. Immunol 162:6880−6892).37LRPと67LRmayのアイソフォームまたは相同体が存在することを示唆するなにかの証拠が、ある。55kDタンパク質は、アイデンティティを37LRPと共有しているヒトと鈍い内皮細胞で特定された(etalなアイルランド(1998)。臨床exp.Immunol。112:255−261)、アイソフォームのanda数はネズミの脳組織で見つかった(小シモノーは、アール(2003)である。生物学Chem.384:243−246).これらのタンパク質はさまざまな方向で翻訳後に修正されていておよび/または他の分子と相互に作用している37LRPに起因する可能性があるか、他の非常に相同性遺伝子に起因する可能性がある。67LRの配布があった過剰発現と異常な表面は腫瘍の幅広い範囲にデモをした、メッセンジャーRNAとタンパク質レベルのさまざまな技術によって発見された(見本用は、メナードなどを見る1998;小Barsoumは、アール(2000)である)。37LRPのレベルの変化および/または67LRは、疾患進行、感染度、転移、積極性と予後に関
して腫瘍生物学に影響を及ぼすことが示された。67LRの過剰発現は腫瘍発達で役割を果たしているレセプターと関係していた、進行の段階が腫瘍タイプに依存している可能性がある、(小カンポは、アール(1992)である。Jは、Pathol 41である:1073−83;小デメテルは、アール(1992のCancerレニウム)である。52:1561−1567;小Martignoneは、アール(1992)である。臨床exp.転移10:379−386:乳癌;小バッソは、アール(1993)である;癌15:455−461:黒色腫;小Boukercheは、アール(2004)である。Gene343:191− 201:黒色腫;小Waltregnyは、アール1997である。J. Natl. Caner Inst 89:1224−1227)。冷凍された結腸直腸組織の中の37LRPメッセンジャーRNAの増加は腺腫と比較して腺癌で見られることができたのに、レベルは正常なおよび腺腫組織の間で一定だった。これらの結果は37LRPの表示または67LRが腺腫から腺癌/デュークスC癌まで疾患進行で遅いイベントで相互関係のあることを示唆する(小カンポは、アール(1992)である。Jは、Pathol 41である:1073−83.).対照的に、37LRPメッセンジャーRNAは疾患進行で初期のイベントを提案している腺腫頸部病変が増加した(小デメテルは、アール(1992のCancerレニウム)である。52:1561−1567).67LRは、単球の急性骨髄性白血病で血統関連の抗原としても関係した(AML;小Montouriは、アール(1999)である。臨床癌レニウム。5:1465−1472).他の検査は67LRが感染度と転移で役割を果たす可能性があることを示した、それがさまざまな腫瘍で転移表現型の獲得において重要な役割を果たすことを意味する(小Wewerは、アール(1987)である。癌レニウム47:5691−8;カストロノバ及びソーブル1990。Biochem Biophys Res Commun 68:1110−1117;小Cioceは、アール(1991)である。J Natl Cancer Inst 83:29−36;ソーブル(1993人のセミン)。癌Biol. 4:311−317;カストロノバInvasion Metastasis 1993 13:1−30;あなたなど、1988。PNAS 85:6394−6398;小Pelosiは、アール(1997)である。J. Pathol。183:62−69;小Boukercheは、アール(2004)である。遺伝子343:191−201)。例えば、メッセンジャーRNAのレベルはより大きな悪質な可能性でヒト大腸細胞系と組織が増加することが示された(小Kondahは、アール(1992)である。癌レニウム52:791−796).細胞がpre−であったとき、ヒト線維肉腫細胞系の転移の抑制が思いついて免疫グロブリンG分数(P4G)と交渉した37LRP−一般システムズ理論fusionproteinで免疫されるウサギからの血清の(345bp相補DNA;13kD; etalなナルミ(1999)。Jpn J. Cancer Res.90:425−431).血清も、用量依存的な方法で細胞付着性をラミニンに下げた。37LRPのアンチセンスRNAも、生体外で低分化ヒト結腸癌細胞系の感染度を阻害した(マフネとRavikumar(1992)。J. Surg。レニウム。52:340−346).転移の間の表現がもう一つの非インテグリン・ラミニン結合タンパク質の表現度で減少によって平行にされてしばしばある67LRで増加、ガレクチン−3(バン巣ブリュレetal(1994)。Eur.。J. Cancer 32A:1598−1602;etalなスー(1995)。いる。J. Pathol。147:815− 822;小カストロノバは、アール(1995)である。J. Pathol。179:43−48;小ロッツは、アール(1993)である。PNAS 90:3466− 3470).これらの結果はこれらの2つのラミニン受容体が反対に調整されることを示唆する、そして、これはレセプターが使われているラミニン−結合能の変化を説明する可能性がある。対照的に、ガレクチン3の発現増加と結腸癌の悪性間の直接的な相互関係は、観察された(Schoeppner.etアール(1995のCancer 75):2818〜2826)。発現増加が増殖と著しい腫瘍成長と関係している傾向がある時から、67LR表現は腫瘍の積極性のためのマーカーである可能性もある。37LRPメッセンジャーRNAの増加したレベルはヒト肺癌組織で発見されていた(小サトウは、アール(1992)である。生化学Biophys。レニウム。Commun 182:746−752)、そして、膵内分泌腫瘍‖(小Pelosiは、アール(1997)である。J. Pathol。183:62−69)、それは急速に増殖性だった。ヒト乳頭腫ウイルスと関連する頸部新生物において、37LRPメッセンジャーRNAの増加したレベルは、細胞(デメテルなど、1992)の浸潤性質によるよりむしろ細胞の増殖性の性質と相関していた。ネズミの肺癌細胞系TIlへのアンチセンス37LRP RNAの導入はそれらの倍加時間を延長した(小サトウは、アール(1999)である。臭素。J. Cancer 80:1115−1122).これらの細胞もラミニンでより弱い相互作用を示した、そして、皮下に、アンチセンスRNAを用いた治療を受ける細胞を接種されるマウスの生存期間は長くなった。それが舌端ノルマル1のタンパク分解性の裂開を強化する可能性がある時から、67LRが腫瘍aggressivenssで役割を果たす可能性もあって、従って、基底膜の低下率で援助する(小Ardiniは、アール(2002)である。癌レニウム。62:1321−1325).37LRPの過剰発現および/または67LRは数種類の腫瘍で予後不良を伴う可能性もある(見本用は、Barsoumローラーとコギン2000をみる。細胞MoI Biol Lett.5:207−230;小メナードが、アール(1998のJ. Cell.)であるBiochem.67:155−165;メナード、タリアブーエとColnaghi(1998)。胸部Cancerレニウム。処置52:137−145).予後はラミニンも生産している乳癌で好ましくない(小Martigoneは、アール1993である。J Natl. Cancer学会85:379−386;小ペッレグリーニは、アール(1985のBreast Cancer Res Treat 35)である:195− 199).ヒト・リンパ腫において、67LRは表面ofCD30+未分化大細胞リンパ腫に関して、そして、優秀なB細胞の小さいサブセットで検出可能だった非ホジキンまたはホジキンリンパ腫‖(小カルボーネは、アール(1995)である。うなりなさい。病理学2:541−546).近年では、67LRは腫瘍生物学以外の生物過程に関係した。レセプターがサイトカイン、炎症性の試薬、ラミニンを含む細胞外基質タンパク質に対する相互作用とステロイド(見本用は、メナードなどを見る、1998)によって上方制御されるとわかった。そして、37LRPと67LRが標準状態の下で調整される可能性があることを示唆した。レセプターは、ホスト防御機構でリンパ球化学走性、癒着と自動誘導またはでaroleを演奏する可能性がある。67LRhas人間の活性化の記憶末梢血T細胞(CD4+とCD8+は、良い面を選び出す)の集団(10−15%)の表面で発見する。それは神経ペプチドに反応した上方制御されることも示された(小チェンは、アール(2002人のナット)である。med. 8:1421−1426).フェラリーニによって検査など、γδ+リンパ球からレセプターのための免疫学的な役割が部位が肺癌細胞を殺してできた肺腫瘍で局在化させた1996支持物、67LRに対する相互作用によって仲介する(小フェラリーニは、アール(1996)である。J. Natl. Cancer hist.。88:436−441).ラミニンが共刺激シグナルを提供することができたのに対して、殺害はナチュラル・キラー(NK)細胞、リンフォカイン活性化の(LAK)細胞とT細胞受容体(TCR)から独立していることが示された。67LRmayも、他の細胞型の成長、遊走と輸送に影響を及ぼす。67LRはα(αGMR)と対話する、そして、GM−CSFレセプターのβ(βGMR)サブユニット‖(小チェンは、アール(2003)である。PNAS 100:14000−14005)、そして、GM−CSFレセプター複合体の形成を阻害する。GM−CSFは骨髄様前駆細胞の成長、分化と成熟を調整して、成熟した好中球、好酸球と単核貪食細胞の機能を強化する。67LRは、防止GM−CSF複合体形成によってこれらの活性を阻害する可能性がある。それが刷子縁で、そして、パネート細胞分泌顆粒で見つかった時から、67LRのための分泌源とエンドサイトーシスの役割は黙示的なでもあった(小Shmakovは、アール(2000)である。J. Pathol。191:318−322).67LRがラミニンと相互に作用する正確な方法は、未決定のままである。2つのペプチド領域は、可能なラミニン結合部位として67LRから確認された。これら、Peptide G、37LRPの配列に由来する合成ペプチドのうちの1つは、パリンドローム配列LMWWMLを含む。それは、内皮細胞に腫瘍細胞の結合を阻害するために、ラミニンを結合することが示された、そして、ヌードマウスでヒト黒色腫細胞の転移を増加させること(小カストロノバは、アール(1991のJ Biol. Chem. 266)である:20440−20446;カストロノバ、Tarabolettiとソーブル1991。癌レニウム。51:5672−5678;小Tarabolettiは、アール(1993)である。J. Natl. Cancer。学会85:235−240).ペプチドGが増加して、腫瘍細胞の上でラミニンを結合することを安定させるということを発見された‖(小逸品は、アール(1996)である。J. Biol. Chem. 271:31179− 31184).第2の可能なラミニンを結合している領域は、37LRPのC末端の配列の疎水性からの予測されたであった(a.a.205−229;ランドヴスキ、Uthayakumar、スターキー、1995。臨床exp.転移13:357−372).レセプターのラミニン認識がラクトースに依存している時から、67LRのレクチン領域がラミニンと相互に作用することが、可能でもある(小カストロノバは、アール(1991)である。生化学Biophys。レニウム。Commun。177:177−183).67LRは、ラミニン残基YIGSRと結合する可能性がある(a.a。929−933;βl鎖;Massi、ラオとハッベル(1993)。J. Biol. Chem. 268:8063−8059;ランドヴスキ、Uthayakumar、スターキー、1995。13:357−72)、IKVAV(a.a.2091−2108;α鎖;小Kibbeyは、アール(1993)である。PNAS 90:10150−10153)、そして、LGTIPG‖(a.a.442−446;βl鎖;Mechametal 1989 J. Biol. Chem. 264:16652−16657).67LRは、ラミニン、特にポリ酢酸ビニル(lactosamino)構造、ガラクトース(αl,3)ガラクトース結合とターミナルの非−還元性のβ−ガラクトシル残りの炭水化物成分と結合する可能性もある(Mecham(1991人のアンヌ)。Cell師。生物学7:71−91)。残りYIGSRに対する結合は転移を阻害する(小イワモトは、アール(1996)である。臭素。J. Cancer 73:589−595)、転移がIKVAV相互作用によって刺激される、(小Br
esalierは、アール(1995)である。癌レニウム。55:2476−2480).第1のラミニン受容体の発見以来、67LR、1983年に、少なくとも14の他のラミニン受容体は記載され(Mecham 1991)て、ラミニンの上で同じ結合部位を利用する可能性がある。67LRも、ラミニンに加えて他の分子と相互に作用する。これらはエラスチンを含む(小グロッソは、アール(1991)である。生化学30:3346−3350)、フィブロネクチン(FN)、IV型コラーゲン(小ナラシマンは、アール(1994)である。PNAS 91:7440−7444;小イワブチは、アール(1996のBlood 87)である:365−372)、そして、ヘパリン‖(小グアノシンは、アール(1992)である。PNAS 89:3040−3044).他の検査は、67LRがシンドビスウイルスのためにレセプターとして用いられることを示した(小ワングが、アール(1992のJ. Virol.)である66:4992−5001)、37LRPがプリオン蛋白の取り込みを可能にする、(小リーガーは、アール(1997)である。ナット。med. 3:1383−1387).
【0005】
肝臓癌
肝臓で最も普通型原発性悪性腫瘍は、hepatoceullar癌(HCC)である。HCCの発生率はHepatitis Bのリスクが高い集団で増加する、そして、すでに慢性肝炎、肝硬変、ヘモクロマトーシスと2つの先天性の肝障害(α−1−アンチトリプシン欠損症とtyrosinema)を被っているC. PatientsはHCCを呈するより大きな危険でもある。特定の毒素と化学製品はアフラトキシンを含む原発性肝癌を引き起こす可能性もある。そして、型からの製品がアフリカで不適当に貯蔵型のピーナッツで見つかる。HCCが切除によってうまく除去される場合、再発と転移はありそうである。多数の検査は原発性肝癌と転移性の再発のためにさまざまな予後のマーカーを現した(見本用は、QinとTang(2004)を見る。J Cancer Res Clin Oncol 130:497−513).HCCによる肝疾患の関連は、設計上の変化が原発性肝癌を呈する可能性を増加させる可能性があることを示唆する。標準状態の下で、肝細胞は基底膜(SchaffherとPopper 1963 Gastroenterology 44:230−242)の欠如によって特徴づけられる。細胞外基質タンパク質(ラミニンを含む)肝硬変が発現するにつれて、生じられることができる、そして、構造基底膜を形成して、類洞周辺で寄託する。ラミニン5が通常であるか腫瘍周囲の硬化性の組織で始原HCC小結節で以外存在しないとわかった(小Giannelliは、アール(2003)である。臨床。Research。9:3684−3691).ラミニンはラミニン沈澱物が他のタンパク質の異常な表現度を生じることを示唆しているサイトケラチン19の表現度を誘導することも示された(小Suは、アール(2003)である。世界J Gastroenterol:921−929).それは、ラミニンの表現度がそのレセプターのいずれかの表示を増加させるということである可能性がある。67LRが1990年に肝細胞で表されるとわかった(小クレメントは、アール(1990)である。J. Cell Biol. 110:185−192)、それが唯一のラミニン受容体でなかったにもかかわらず、現れなさい。67LR陽性細胞の数の増加は、HCCと肝硬変患者から取り出される肝臓試料で、近隣の実質と比較して腫瘍性領域で観察された(Grigioniなど(1991(Am J Pathol 138):647−654)。もう一つの検査(小オザキは、アール(1998)である。腸43:837−842)正常肝組織で発見された弱い37LRPメッセンジャーRNA表現。メッセンジャーRNA濃度は慢性肝炎で非癌肝臓組織が増加して、腫瘍地方に更に上昇した。37LRP翻訳と発現タンパク質は本研究の未検であった(小オザキは、アール(1998)である。腸43:837−842).67LRのさらなる生合成はRNAとタンパク質の増加間の直接的な相互関係で転移性のHCC組織で観察された(小鄭は、アール(1997)である。J Tongji医科大学。17:200−202).L−02通常の肝細胞と癌細胞系HepG2とSMMC−7721は細胞系の腫瘍州と相関しなかった37LRPメッセンジャーRNAと67LR表現の様々なパターンを示した(小鄭は、アール(2002)である。中国のJ Cancer 22:248−252).しかしながら、細胞全体が結合研究のために使われた時からこれが単独で67LRに帰されることができないにもかかわらず、癌細胞系SMMC−7721は他の細胞系より高いラミニン結合能を表す可能性がある。しかしながら、プロテオミクス検査で67LRが高転移性の細胞系MHCC97−Hで上方制御されることが分かった、低転移性の相対物MHCC97−Lと比較して(Li et al, 2001. World J Gastroenterol 7: 630−636; Ding et al, 2004. Proteomics 4; 982− 994).67LRがHCCにおいて直接的な役割を果たすかどうかに関係なく、転移は決定待ちのままである。
【0006】
先行特許
米国特許第5,750、102号は、患者の腫瘍からの細胞が患者由来の細胞または組織からクローンをつくられる可能性があるMHC遺伝子で形質移入されるプロセスを開示する。これらのトランスフェクション細胞は、それから、患者に予防接種をするのに用いられる。
【0007】
米国特許第4,861,581号は、哺乳類の腫瘍性で通常の細胞の内部細胞構成要素に特有であるモノクローナル抗体を得るが、外部部品以外に、モノクローナル抗体にラベルをつけるステップから成立していて、新生細胞を殺すために治療を受けた哺乳類の組織で標識抗体を接触させていて、標識抗体を変性している腫瘍細胞の内部細胞構成要素に結合することを測定することによって治療の効果を決定しているプロセスを開示する。人間の細胞内抗原に導かれる抗体を準備する際に、特許資格は悪性細胞がそのような抗原の便利な供給源を表すと認める。
【0008】
米国特許第5,171,665号は、新しい抗体とその生産方法を提供する。具体的には、特許は強くヒト腫瘍(例えば大腸と肺のそれら)を伴う蛋白抗原と結合する性質を持つモノクローナル抗体の形成を教える、その一方で、非常により小さい程度に正常細胞と結合する。
【0009】
米国特許第5,484,596号はヒト癌患者から外科的に除去腫瘍組織から成立している癌治療の方法を提供する。そして、同時に転移を阻害する間、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置して、生存可能であるが、非腫瘍形成性腫瘍細胞を放射線で治療して、原発腫瘍の抑制性の再発ができる患者のためにワクチンを用意するためにこれらの細胞を使用する。特許は、腫瘍細胞の表面抗原で反応性であるモノクローナル抗体の発現を教える。第4カラム第5行以下参照で述べられるように、特許資格はヒト新形成で活発な特異的免疫療法を表しているモノクローナル抗体の進展で自所性腫瘍細胞を利用する。
【0010】
米国特許5,693,763号は、ヒト癌に特有の糖蛋白抗原が起源の上皮組織に依存していないことを教える。
【0011】
米国特許5,783,186号は、細胞を表しているHer2、抗体を生産しているハイブリドーマ細胞系、抗体を使用している癌を処置する方法と前記抗体を含んでいる医薬組成物でアポトーシスを誘発する抗Her2抗体に引き出される。米国特許第5,849,876号は、腫瘍と非腫瘍組織ソースから精製されるムチン抗原に、モノクローナル抗体の生産のために、新しいハイブリドーマ細胞系を記載する。
【0012】
米国特許第5,869,268号は、方法によって生産されるモノクローナル抗体と同様に、望ましい抗原(モノクローナル抗体を生産する方法)に特有の抗体を生産しているtoamethodfor generatingaヒトlymphocyteをつがれる。特許は、特に診断に役立つ抗HDヒト・モノクローナル抗体の生産と癌の治療に引かれる。
【0013】
米国特許5,869,045号は、抗体(ヒト癌細胞で反応性抗体フラグメント、抗体複合体と単鎖の免疫毒素)に関するものである。抗体にはカルシノーマ細胞の中で内在化する能力があるという点で分子がヒト癌の表面で出席している細胞膜抗原で反応性で、より遠いという点で、これらの抗体が機能する機構は二倍である。そして、結合の後である。そして、それらを特に形成性抗体−薬と抗体−毒素複合体に役立つようにする。それらの無修飾フォームにおいて、抗体も特異的な集中で細胞障害性の性質を呈する。
【0014】
米国特許5,780,033号は、腫瘍治療と予防のために自己抗体の使用を開示する。しかしながら、この抗体は、老いた哺乳類からの抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる1種類の自然抗体であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳類」から来るので、自己抗体が実際に、処置されている患者から来る必要条件がない。加えて、特許は老いた哺乳類から天然で単クローン系抗核自己抗体を開示する、そして、ハイブリドーマ細胞系が単クローン系抗核自己抗体を生産する。
【特許文献1】米国特許第5,750、102号
【特許文献2】米国特許第4,861,581号
【特許文献3】米国特許第5,171,665号
【特許文献4】米国特許第5,484,596号
【特許文献5】米国特許5,693,763号
【特許文献6】米国特許5,783,186号
【特許文献7】米国特許第5,869,268号
【特許文献8】米国特許5,869,045号
【特許文献9】米国特許5,780,033号
【発明の開示】
【0015】
本発明者らは、以前得た米国特許6,180,357(個々にカスタマイズされた癌疾患の処置に有用である抗癌抗体を選択する方法に導かれる「Individualized Patient Specific Anti−Cancer Antibodies」と名付けられる)。この文書、「抗体」と「モノクローナル抗体」(mAb)が同義的に使われる可能性があって、適当なものとして、ハイブリドーマ(例えばマウスまたはヒト)、免疫複合体と免疫グロブリンフラグメントによって生産される完全な免疫グロブリンと免疫グロブリン、キメラのたとえば〜などとヒト化の免疫グロブリンに由来する組換え型のタンパク質を参照する可能性がある期間、のためにF(腹筋』)、そして、2が分解するF(腹筋)、単鎖の抗体、組換え型の可変部領域(Fv)s、融合タンパク質など。この文書、「組織標本」が少なくとも1つのセル、意味すると理解される用語または細胞の集合の目的が哺乳類から得たFor。芸術で、若干のアミノ酸配列が構造に対する重要な効果またはタンパク質の機能なしでポリペプチドで多様であることができるとよく認められる。抗体の分子内転位において、主鎖領域の核のまたはアミノ酸シーケンスの変形は、通常、許容的でありえる。これらは含む、制限されるために、置換(保存的置換は好まれる)、削除または追加。さらにまた、本発明のCDMABで標準の化学療法(例えば放射性核種)を活用させることはこの発明の範囲の中でである。そして、それによって前記化学療法剤の使用を集中させる。CDMABは毒素、細胞毒性部位、酵素(例えばビオチン複合酵素)または血液原細胞に抱合型でもありえる。そして、それによって抗体複合体を形成する。6BD−25と称されるハイブリドーマ細胞系に由来するモノクローナル抗体に抱合型であるように、そのような抱合部位はこの中に例示される;類似の抗体複合体は、5LAC−23と称されるハイブリドーマ細胞系に由来するモノクローナル抗体を利用して形成されることができた。細胞障害性の薬剤のための担体としての腫瘍関連のモノクローナル抗体の使用は、ここ数年で相当な注意を受けた。このworkhasの多くの目的抱合型の薬または毒素の望まれないものとしばしば時間中毒性副作用を減弱させている間、抗癌薬の効力を高めるためにある。このアプローチが効果的であるために抗体が高く選択的な腫瘍であることが、必要である、まったく、本剤は実行中の、細胞障害性の形の引渡済みである。METHOTREXATEのような細胞毒、DAUNOMYCIN MITOMYCIN C(独占・合併管理委員会)、そして、VINCAhave抗体に取り付ける、そして、派生複合体は、抗腫瘍活性のために調査された。加えて、シュードモナス属Exotoxinのような生物学的製剤とCalicheamicinとAuristatinsのようなより新しい毒素は、それぞれ、抗CD33と抗CD30抗体の有効性を強化するために使用された。多くの例は、遅い非特異的な解放を受ける比較的安定化学結合によって薬に抗体の結合を例示する芸術の中に存在する。Iodine131、Yttrium90またはIndium111のような放射性核種は、腫瘍破壊の目的のためにまたは画像診断のために抗体に抱合型でもありえる。アプローチにかかわりなく、主要な目的は、腫瘍を破壊することになっている:特異的なアプローチは、37LR抗原を表している細胞を目標とする利用できる方法がかなり異なることができるように、利用される特定の抗37LR抗体で測定されることができる。『モノクローナル抗体を修正しているガン疾患のためにコードするハイブリドーマ細胞系を分離することの357の特許で教えられるにつれて、このアプリケーションは方法を産生性の患者の特異的な抗癌抗体のために利用する。これらの抗体は特に1つの腫瘍に作られることができて、このように癌治療の専用化を可能にすることができる。このアプリケーションの前後関係の範囲内で、細胞殺害(細胞障害能)か細胞増殖を(細胞分裂停止)性質を阻害させている抗癌抗体は、今後細胞障害能と称される。これらの抗体が癌の病期分類と診断の補助として使われることができて、腫瘍転移を処置するのに用いられることができる。個別的抗癌性の処置の見込みは、患者が管理される方法の変化をもたらす。ありそうな臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍は癌疾患修飾抗体より先に存在するパネルから型でありえる。患者は従来は、示される、しかし、利用できる抗体は更に患者を示す際に有用でありえる。患者は既存の抗体を用いたすぐ治療を受けることができるおよび/または、腫瘍に特有の抗体のパネルはこの中に概説される方法を用いてまたはこの中のスクリーニング法と同時のライブラリが開示したファージディスプレイを用いることにより生産されることができる。発生する全ての抗体はanti−のライブラリに加えられる。そして、他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を運ぶことができるという可能性がある時から、癌が抗体である。この方法によって生産される抗体は、これらの抗体と結合する癌があるどんな患者数ででもガン疾患を処置するために役立つ可能性がある。実質的にUS 6,180,370の、そして、US 6,657,048で概説するものとしてのプロセスを使用して、マウス・モノクローナル抗体6BD−25および5LAC−23は、それぞれ患者の胸部と肺腫瘍生検から細胞でマウスの免疫化の後で得られた。6BD−25抗原は、まず最初に細胞ELISA/FACSによって種々の人間の正常なおよび癌細胞系の上で、発見されていなかった。ビオチンに6BD−25抗体の接合を通して分析の感度を増加させた後に、抗原は乳癌細胞系最低降下高度−MB−231と卵巣癌細胞系C−13(OVCA−429とOV2008)の上で発見されていた。乳癌細胞系Hs574.Tは、浄化されていない6BD−25の細胞毒性に影響されやすかった。MCF−乳癌細胞系7、卵巣癌細胞系OVCAR−3と大腸癌細胞系SWl 116は細胞系が試験したわずか3つの癌であった。そして、純化された6BD−25の細胞毒性に影響されやすかった。FACS分析を用いることにより、5LAC−23のための抗原は、SW620大腸癌細胞系の上で見つけられて、他の細胞系の何の上でも、試験されなかった。胸部(Hs574.T)、肺(NCI−H661)と皮膚(A2058)癌細胞系は、浄化されていない5LAC−23の細胞毒性に影響されやすかった。卵巣癌細胞系OVCAR−3は細胞系が試験した唯一の癌であった。そして、純化された5LAC−23の細胞毒性に影響されやすかった。マウスに移植されるとき、OVCAR−3とSWlに対する6BD−25細胞毒性の結果は116セル、培養でこれらの細胞の方へその抗腫瘍活性によって更に広げられた。大腸癌のインビボのモデルにおいて、ヒトSWl116細胞が襟首で卵巣癌のインビボのモデルのためにの間皮下に移植されたこと、人間のOVCAR−3細胞は、腹腔内に移植された。両方のモデルのために、それは特定の免疫細胞の欠如によるヒト腫瘍細胞を拒絶することができないにつれて、免疫不全のマウスが使われた。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予言者と考えられる。マウスの異種移植片は、支質、中心壊死とネオ脈管構造を発達させている固形腫瘍として成長する。腫瘍細胞系OVCAR−3とSWl 116は、免疫不全のマウスでインビボの異種移植モデルとして評価された。良好な移植またはOVCAR−3とSWl116腫瘍の『take−rateする』、そして、標準の化学療法剤に対する腫瘍の感度は、それらを適切なモデルとして描写した。親の細胞系と細胞系の異型が、広範囲にわたる治療薬を評価するために、異種移植腫瘍モデルで使われた。ヒト大腸癌の予防的インビボのモデルにおいて、6BD−25は、7週の期間の間毎週の注射が続く腫瘍細胞の着床の前に、マウス一日に与えられた。6BD−25処置は、バッファ制御より、治療期間の間に腫瘍成長を抑制することに有意に効果的だった(p=0.001)。処置相終了後、6BD−25を与えられるマウスは、対照群のわずか54パーセントに増大した腫瘍が認められた。後処理追跡調査期間の間に、6BD−25の処置効果は維持された、そして、処置群の平均の腫瘍容積は測定相(p=0.002)の終わりまでの対照よりかなり少なくし続けた。それが毒性(還元型の体重または臨床苦痛の他の表れを含む)の少しの合図も誘導しなかったので、6BD−25処置は安全に見えた。このように、それがヒト大腸癌の安定したモデルで制御処置群と比較して腫瘍成長を遅延させたので、6BD−25処置は有効だった。大腸癌の予防的インビボの腫瘍モデルの他に、6BD−25は、予防卵巣のインビボの腫瘍モデルで、OVCAR−3細胞に対して抗腫瘍活性を示した。この異種移植腫瘍モデルにおいて、OVCAR−3卵巣の癌細胞は、合計10の用量のために移植の後、日を始めている処置で、免疫不全のマウスにintraperitoenallyに移植された。6BD−25による処置は、バッファ制御と比較された。体重が、腫瘍発達の代わりの程度として使われた。重量増加が腹水形成に起因する時から、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。移植後の(処置の終わりの後の16日)日80で、投与群のマウスは、対照群(p=0.002)よりかなり少ない体重を持った。重要な生存利点が、6BD−25対バッファ制御(p<0.02)の処置でもあった。また、それが毒性または臨床苦痛の少しの表れも誘導しなかったので、6BD−25処置は安全に見えた。6BD−25の抗腫瘍活性と毒性のその見た目の不足は、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。患者が治療の最初のコースに不応性の、または、転移が発達する場合、腫瘍に対する創成特異抗体のプロセスは再治療のために繰り返されることができる。さらにまた、抗癌抗体はその患者から得られる赤血球に抱合型でありえて、転移の処置のために再注入した。転移癌のほとんど効果的治療がなかった、そして、転移は通常、死に帰着しているapoor結果を予告する。しかしながら、転移癌は通常かなり血管化である、そして、赤血球によるanti¬癌抗体の配送には腫瘍の部位で抗体に集中する効果があることができる。転移の前にさえ、大部分の癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存している、そして、赤血球に活用する抗癌抗体は同様に元の位置の腫瘍に対して効果的でありえる。あるいは、抗体は他の血液原細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞、その他に抱合型である可能性がある。そして、Thereは抗体の5つのクラスである、そして、各々はそのH鎖によって与えられる機能と関係している。裸の抗体による癌細胞殺害が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)または補体依存性細胞障害作用(CDC)を通して媒介となられると通常、思われる。例えば、ネズミの免疫グロブリンMとIgG2a抗体は、それによって、腫瘍細胞溶解に導くことができる補体活性化の古典経路を起動させている補体系のCI構成要素を結合することによって、ヒト補体を起動させることができる。ヒト抗体のために、抗体を起動させている最も効果的complement−は、通常、免疫グロブリンMとIgGlである。IgG2aとIgG3アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球と特定のリンパ球によって細胞殺害に導くFcレセプタを持っている細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。IgGlとIgG3アイソタイプのヒト抗体は、ADCCの媒介となる。抗体によって媒介される癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜とその関連する糖蛋白または糖脂質で(いわゆる触媒抗体)さまざまな化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすために機能する抗体を用いることによりある可能性がある。より広く認められる抗体によって媒介される癌細胞殺害のさらに2つの機構が、ある。第一は、癌細胞にある推定上の抗原に対して免疫応答をもたらすために体を誘導するワクチ
ンとしての抗体の使用である。その機能が効果的に失われるように、第2は成長レセプターを目標として、それらの機能に干渉するか、減少してそのレセプターを調整する抗体の使用である。明白に疾患病因に関与する30,000の既知の遺伝子の製品の間で、疾患を処置する新薬の発見は、関連した目標の識別の不足によって妨げられる。腫瘍学調査において、潜在的薬目標は、それが腫瘍細胞で過剰発現されるという事実のために、単にしばしば選択される。このように特定される目標は、それから合成物の多数で、相互作用のために放送される。潜在的抗体療法の場合、これらの候補合成物は、通常、ケーラーとミルシテイン(1975、ネイチャー、256、495−497、ケーラーとミルシテイン)によって置かれる基本的な原理に従って、モノクローナル抗体生成の従来の方法に由来する。ひ細胞は抗原(例えば細胞全体、細胞分画、精製された抗原)で予防接種をされるマウスから集められて、不滅にされたハイブリドーマ・パートナーと融和する。結果として生じるハイブリドーマは映写される、そして、目標に熱心に抗体の分泌のためにどのbindmostを選択したか。多くの治療的で診断抗体はHERCEPTINとRITUXIMABを含む癌細胞に対して指示した。そして、havebeenがこれらの方法を使用して発生されて、目標のそれらの親和性と特異性を基礎として選択された。細胞障害能による抗原特異性の試薬の発現は腫瘍細胞の上で生じて、認められた抗原(s)を表している細胞を結合して、そして、これらの試薬が正常な菌体群の上で重要な有害作用なしで腫瘍細胞の発達(進行と転移)を阻害するように、それ自身による、または毒素(薬または同位元素)のような他の分子と関連する、細胞でインビボの生理活性を持つ、治療的な可能性として非常に有益である、そして、または診断ツール。癌関連の目標として5LAC−23エピトープを確認するために、冷凍正常な人体組織の5LAC−23抗原の表現度は、決定された。免疫組織化学によって、5LAC−23抗原は、正常組織の表現を制限したことが示された。これは、組織配列スライドの中でホルマリン固定パラフィン包埋通常の器官で5LAC−23抗原の表現度を調べることによって確認された。全部で、弱い染色が正常組織のうちの5LAC−23時までにある。そして、HCC(下記参照)のような癌と比較して正常肝、胃、脳と腎臓組織で抗原の制限されて還元型の表現度を示す。そのような表現は、時々生体内で、細胞質(それは通常、完全な抗体にとって到達できない)にも限定された。胃腺癌の表現もあったにもかかわらず、同じ組織配列において、5LAC−23抗原の表現度はHCCにおいて卓越していた。HCCの目標のより広範囲な研究は、免疫組織化学によって有病率ofthe 5LAC−23の抗原inthis癌を調べるために行われた。驚くべきことに、肝臓癌の55の試料の73%は、この目標を表した。診断法、theranostics、予後徴候または療法の目標として、有用性を示すために、マッチされた正常肝と肝臓癌の目標の配布の比較は、行われた。明らかに、5LAC−23は腫瘍試料だけを染色して、悪質な組織をこれらの断片において代表する中心領域に特有だった。アイソタイプ対照でけがされるとき、断面は負だった。そして、5LAC−23を結合することがはっきりしていたことを示して、5LAC−23抗原の癌特異性のサポートを与えた。更に、5LAC−23抗原がウエスタンブロット法、FACS分析とイムノ組織化学豚小屋を通って例えば、種々の分析(それの若干の非極限の実施形態は例の方法によって含まれる)で発見されていることがありえることを示された。当業者にとって明らかで、この発明の範囲の中にある他の分析は、以下を含む:ELISA、免疫細胞学、immunoaffmityベースの分析(例えばSELDI質量分光)、表面プラズモン反響の決定、放射性同位元素標識免疫測定法と分子診断検査法。この中に概説されるように、付加的な生化学データも5LAC−23時までに認められる抗原が37LRPのエピトープであることを示す。これは、二次元電気泳動とウエスタンブロット法による5LAC−23抗原と質量分光を確認することによって裏付だった。標的抗原の識別はco−を示すことによって確認された。そして、抗体による目標の限局化が組織の免疫組織化学検査と同様にウェスタンブロットと明確な37LRPに知られているか、37LRP相補DNAで形質移入される細胞でH−150のような37LRPと結合するために知られていた。重要なことに、5LAC−23は、他の抗37LRP抗体(H−150)と比較して、ユニークな製本見本を示した。より制限された結合を示している5LAC−23で、これは2つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを示唆する。さらに、例で、12Hの−150は細胞系の合計37LRPを見つける、しかし、5LAC−23によって認識される抗原エピトープの表示は異なる細胞可溶化物全体で変化して、いくつかで存在しなかった。両方の抗体をCHO細胞可溶化物に結合することが類似していた時から、抗体のこの違いはH−150と比較してその抗原のために5LAC−23の下部の親和性によらなかった。5LAC−23 andH−150によって見つけられるエピトープの違いを支援して、5LAC−23は、非還元の状況(図16B、レーン12)の下で、LS174T溶解産物でほぼHOkDのユニークな汚れを見つけた。このスミアは、37LRP前駆体に対応している帯域の増加なしで、還元性の状況の下で消えた。既知の抗LRP抗体H−150と比較して、これらの結果は、37LRPの上で5LAC−23時までに認識されるエピトープがユニークであるという更なる証拠を提示する。これらのIHCと生化学結果は、5LAC−23がユニークな37LRP抗原エピトープに向けられることを証明する。制癌剤の臨床有用性は、患者に許容リスク側面の下で本剤の有益性に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の後で最も捜された、しかしながら、多数の他のよく認識された利点が生命を延長することに加えてある。これらの他の利点(処置が生存に悪影響を与えないところ)は、症状寛解、有害事象からの保護、再発または疾患のない生存に時間内の延長と進行に時間内の延長を含む。これらの判定基準はアメリカ食品医薬品局(F .D. A。)のような一般に認められて調節性体であるこれらの利点を発生する薬を承認する(ハーシェフェルドその他は、Critical Reviews inOncology/Hematolgy42である:137−143 2002).これらの判定基準に加えて、この種の利点の前兆となる可能性がある他の終末点があるとよく認められる。一つには、アメリカ食品医薬局によって承諾される促進的な承認プロセスは、患者利点をたぶん予測する代用物があると承認する。会計年度末の(2003)より、このプロセス中で承認される16の薬があった、そして、これらの、4は完全な承認(すなわち研究が代わりの終末点によって予測されて直接の患者利点を示した追跡調査)に移った。固形腫瘍で薬効を決定するための1つの重要な終末点は処置に対する測定反応による全身腫瘍組織量の評価である(Therasseその他は、国立癌研究所92(3)ジャーナルである:205−216 2000).そのような評価のための臨床判定基準(RECIST判定基準)は、充実性腫瘍研究グループ(癌の一団の国際的な専門家)で、応答評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果による薬は、最終的に、群が傾向がある適切な制御に対する比較で、RECIST判定基準に従う客観的な反応で示すように、直接の患者利点を発生する。全身腫瘍組織量が通常、より直接に評価することになっている症状発現前設定と文書で。前臨床試験が臨床設定に解釈されることができるという点で、症状発現前モデルで生存延長をもたらす薬には最大の予想された臨床ユーティリティがある。臨床治療に産生性の肯定応答に類似して、症状発現前設定で全身腫瘍組織量を減らす薬は疾患に重要な直接的な影響を及ぼす可能性もある。生存の延長が制癌剤治療から臨床転帰の後、最も求められる、臨床有用性を持つ他の利点があって、そして、全身腫瘍組織量減少(それは疾患進行の遅れに相関する可能性がある)が生存または両方とも延長したことは明らかである、直接の利点に導くこともできて、そして、臨床影響を持つこともできる(エックハートその他は、Developmental Therapeuticsである:Targeted CompoundsのClinical Trial Designsの大当りとFailures;ASCO Educational Book、39回目の年会、2003、ページ209−219)。全部で、この発明は、治療薬の目標として、6BD−25および5LAC−23抗原の使用を教える。それは、投与されるとき、6BD−25が抗原を表している癌で哺乳類で全身腫瘍組織量を減らすことができて、治療をうけている哺乳類の生存延長に導くこともできることを証明する。生体内6BD−25処置とSWl 116とOVCAR−3細胞の抗原式の付随する検出不可能であるか低いレベルの有効性は、抗原表現のレベルがインビボの有効性と必ずしも相関するというわけではないことをそれぞれ示す。さらにまた、この発明も、癌細胞で6BD−25 5LAC−23抗原を見つけることが診断、治療の予測とこの抗原を表す腫瘍を運んでいる哺乳類の予後に役立つことがありえることを教える。それは、診断法、theranostics、予後徴候または療法の目標として、更に5LAC−23抗原の使用を示す。したがって、特定の個人に由来する細胞から方法を産生性の癌疾患修飾抗体のために利用することは、本発明の目的である。
【0016】
ハイブリドーマ細胞系と対応の単離モノクローナル抗体を分離しなさいという命令とそれについて前記ハイブリドーマ細胞系がコードされる抗原結合フラグメントで、同時に非癌細胞に比較的無毒性間、これらは癌細胞に関して細胞毒性である。それは抗原性のフラグメントとして定義されて単離モノクローナル抗体で37LRPの特定のエピトープの結合のためにラミニン受容体1前駆体タンパク質(指定の37LRP)を確認する発明の更なる目的、指定の5LAC−23またはそれのフラグメントである。抗原フラグメントは前記特定のエピトープと結合する、そしてそれは、単離モノクローナル抗体は同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から産生性の癌疾患修飾抗体のための方法によって発生された。
【0017】
抗原フラグメントは前記特定のエピトープと結合する、そしてそれは、単離モノクローナル抗体は癌疾患修飾抗体を同時に非癌細胞に比較的無毒性間、癌細胞に関して細胞毒性である特定の個人に由来する細胞から作り出す方法によって発生された。5LAC−23時までに認識される37LRPの特定のエピトープで結合ができる抱合部位を提供することは、この発明の更なる目的である。
【0018】
それは抗体がそれについて、前記特定のエピトープと結合する5LAC−23またはフラグメントである薬−抗体複合体と称されてこの中にある、そして、複合体は放射性核種でありえる、または、生物学的であるか化学毒素または合成物の形の活発な抗腫瘍剤が化学療法剤を含むがこれに限らず等価の抗腫瘍活性を持つ。活発な抗腫瘍剤を届ける方法を教えることはこの発明のもう一つの目的である。
【0019】
そして、酵素または放射性核種が抗腫瘍剤としてまたは抱合部位と抗原エピトープの選択的な結合が起こるそれによって本発明に従って哺乳類に抱合部位を投与することを成立している哺乳類の腫瘍細胞の部位に対する画像診断の方法の援助として効果的である。悪性の存在を示すのに十分なレベルで37LRP前駆体タンパク質で5LAC−23抗体の選択的な結合を立証するためにどんな平均値ででも癌細胞の存在を測定する方法を教えることは、まだ本発明のさらなる目的である。
【0020】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後、治療、イメージングと37LRPの特定の抗原性部位で5LAC−23、抗原性の結合断片(先に定義されるように)または複合体半量(先に定義されるように)の結合に依存する方法を利用しているガンであるか前癌性の細胞のモニタリングのための方法を教えることになっている。それのCDMABと抗原結合フラグメントを教えることは、本発明のさらなる目的である。
【0021】
細胞毒性がADCCを通して媒介となられるCDMABを発生することは、本発明の更なる目的である。細胞毒性がCDCを通して媒介となられるCDMABを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。細胞毒性が細胞化学結合の加水分解に触媒作用を及ぼすそれらの能力の機能であるCDMABを発生することは、まだ本発明の更なる目的である。
【0022】
本発明のなお更なる目的は、診断、予後と癌のモニタリングのために結合アッセイに役立つCDMABを発生することである。この発明の他の目的と長所はそこで以下の説明(図と例の横道)から明らかになる。そして、この発明の実施形態が述べられることを確信している。
【0023】
(図面の簡単な説明)
図1は、6BD−25、5LAC−23と抗ファス(正の制御)抗体の代表的なFACSヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
図2は、予防SWl116大腸癌モデルの腫瘍成長に関する6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
図3は、予防OVCAR−3卵巣癌モデルの体重の6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
図4は、6BD−25またはバッファ制御による腫瘍を含んだマウス後処理の残存。マウスは、240日以上後処理のために生存をモニターされた。
図5Aと5Bは、全細胞可溶化物(T)と細胞質の分数(C)のウエスタンブロットは、アイソタイプ対照(パネルA)か5LAC−23(パネルB)で染色されるOVCAR−3 Cellsから作った。異なった帯域は5LAC−23で見つけられて、黒い矢で示される。
図6Aと6Bは、OVCAR−3細胞質のタンパク質のウエスタンブロットは、2次元の電気泳動によって分かれた。パネルBが5LAC−23で探索される汚点を示す間、パネルAは免疫グロブリンMアイソタイプ対照と探索されるブロットを示す。矢は、5LAC−23時までに認められる点に対応する。
図7A、7Bと7Cは、OVCAR−3細胞質のタンパク質の2次元 SDS−PAGEとウエスタンブロット。図中パネルAは、細胞質の分数のシルバー染色されたゲルである。Panel Bがアイソタイプ制御抗体で探索される類似の汚点を示す間、パネルCは5LAC−23時までに認められるタンパク質の位置を示す。
図8A、8B、8Cと8Dは、5LAC−23よって認められる点に対応する。OVCAR−3細胞質の分数のウエスタンブロットは、抗37LRP抗体H−150の(A)、抗37LRP抗体F−18(B)、免疫グロブリンMアイソタイプ制御(C)と5LAC−23(B)で深く探った。
図9Aと9Bは、OVCAR−3細胞からの細胞質のタンパク質の2−次元ウエスタンブロット。Blot Aの矢は、5LAC−23が結合する主要発疹を示す。Blot Bの線は、抗37LRP(H−150)抗体に特有である点を示す。汚点の上で明かされる他の点は、抗体のアイソタイプでまたは使用される二次抗体で相互作用による。
図10A、10B、10Cと10Dは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ制御(一番上の列)で37LRP(pCMV−XL537LRP)コードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されたCHO細胞(10X拡大)の免疫染色される。細胞はFugene試薬(甲欄)単独で形質移入されたか、pCMV−XL537LRPの量を増加させていた(1マイクログラム:柱B;2マイクログラム:柱C;4マイクログラム:柱D)。細胞が5LAC−23でけがされたとき、陽性細胞(茶色の)の増加性の数はプラスミドの増加性の量で見られることができる。
図11A、11B、および11Cは、アイソレーション増幅器。37LRPコードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されるCHO細胞(40X)の免疫染色される(pCMV−XL537LRP;2マイクログラム)。細胞は5LAC−23(A)で染色された、抗37LRP抗体H−150(B)と抗67LR抗体MLuC5(C)と陽性細胞は全部で見られることができる免疫染色する。
図12A、12Bと12Cは、ウエスタン分析によってさまざまな抗体によって見つけられるE.coliのヒト37LRPの表示。細菌反応混合物に含まれたプラスミドは、C末端のHisβ−タグ(レーン1)で、Control媒介生物GFPを含んだ、pIVEX2.3dLRP(37LRP;レーン2)andprVEX2.4dLRPNHjS6(aN−terminalHis6−タグによる37LRP;レーン3)。汚点は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(パネルA)、5LAC−23(パネルB)と抗37LRP抗体H−150(パネルC)で探索された。
図13A、13Bと13Cは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ対照(一番上の列)と一緒のパラフィン包埋組織の染色。断面は、通常の胃(甲欄)、noπnal肝臓(柱B)と肝細胞癌(柱C)から取り出された。
図14A、14Bと14Cは、マッチされたnoπnal(一番上の列)とマッチされた腫瘍組織(一番下の列)からの寒冷保存された肝臓組織に対するさまざまな抗体の結合。使用される抗体は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(甲欄)、5LAC−23(柱B)と抗サイトケラチン8(柱C)であった。
図15Aと15Bは、5LAC−23()と免疫グロブリンMアイソタイプ対照()と一緒の通常の肺上皮細胞系列Beas−2Bのイムノ組織化学染色。細胞は成長される(柱B)か、外で(甲欄)Vitrogenであった。
図16Aと16B。非還元の条件のウエスタンブロット法によって発見されたものとしての多数の腫瘍と形質転換細胞系の表現oftheエピトープ 抗37LRP antibodyH−150の(A)と5LAC−23(B)。細胞系は、野生型CHO細胞(レーン1)とヒト細胞系を含んだ:HB4aR4.a(レーン2)、HMT 3522(レーン3)、MCF−7(レーン4)、最低降下高度−MB−231(レーン5);最低降下高度−MB−361(レーン6)、OVCAR−3(レーン7)、チャンのLiver(レーン8)、HepG2(レーン9);A375(レーン10)、DLD−I(レーン11)、LS174T(レーン12)とSW620(レーン13)。
【発明を実施するための最良の形態】
【0024】
実施例1
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞系:6BD−25および5LAC−23
それぞれ寄託番号PTA−5691とPTA−5690の下で、2003年12月9日の20110−2209 ATCC(ATCC)(the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110−2209 on December 9, 200)、ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞系6BD−25および5LAC−23は寄託された。37の運賃込み条件1.808に従って、沈澱器は寄託資料の市民に有効性に押しつけられる全ての規制が特許を与えると、即座に、取り返しのつかないほど取り出されることを保証する。6BD−25および5LAC−23のクローン、上清と細胞ELISAスクリーニングの派生は、以前US 6,657,048で記載された。6BD−25 5LAC−23モノクローナル抗体は、コレクションと追いまき起こっている二度/週でハイブリドーマをCL−1000フラスコ(ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)で培養することによって生産された。抗体は、Protein Gセファロース4 Fast Flow(アマシャムBiosciences、Baie d’Urfe、QC)で、標準の抗体精製処置によって精製された。6BD−25および5LAC−23は、細胞毒性分析(表2)で、多数の陽性(抗ファス(EOS9.1、免疫グロブリンM、カッパ、20マイクログラム/mL、eBioscience、サンディエゴ、CA)、抗EGFR(C225、IgGl、カッパ、5マイクログラム/niL、Cedarlane、ホーンビー、ON)、Cycloheximide(100マイクロモル、シグマ、Oakville、ON)、アジ化ナトリウム(0.1%、シグマ、Oakville、ON))で陰性の(107.3(抗喘ぎ、IgGl、カッパ、20マイクログラム/mL、ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)、G155−178(抗喘ぎ、IgG2a、カッパ、20マイクログラム/mL、ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)、最大許容濃度−11(抗原特異性未知数、IgG2b、カッパ、20マイクログラム/mL)、J606(抗フルクトサン、IgG3、カッパ、20マイクログラム/mL)、免疫グロブリンG Buffer(2%)、免疫グロブリンMバッファ(2%))対照と比較された。乳癌(最低降下高度−MB−231(MB−231)、最低降下高度−MB−468(MB−468)、MCF−7)、大腸癌(HT−29、SWl 116、SW620)、肺癌(NCI−H460)、卵巣癌(OVCAR−3)、前立腺癌(PC−3)と非癌(CCD−27sk、Hs888.Lu)細胞系は、試験された(ATCC、Manassas、VAからの全て)。Live/Dead細胞毒性分析は、Molecular Probes(Eugene,OR)から得られた。分析は、下で概説される変化で、製造業者の指示に従って実行された。細胞は、予め定められた適当な密度で分析の前にメッキをされた。2日後に、精製された抗体または対照はメディアに希釈された、それから、100マイクロリットルは細胞板に転写されて、5日の間5パーセントのCO2インキュベーターで暖められた。プレートは、それから逆にすることによって空にされて、乾燥質で拭かれた。室温DPBSはMgCl2を含んでいる、そして、塩化カルシウムはマルチ・チャンネル・スクィーズボトルからよい各々に分配されて、3回軽くたたかれて、逆転によって空にされて、それから、乾燥質で拭かれた。DPBSで希釈される蛍光カルセイン染料の50マイクロリットルはMgCl2を含んでいる、そして、塩化カルシウムはよい各々に加えられて、30分の間5パーセントのCO2インキュベーターで370Cで暖められた。プレートはパーキン−エルマーHTS7000蛍光プレート読本で読まれた、そして、データはMicrosoft Excelで分析された、そして、結果は表1で表化された。データは、平均4つの実験が三通りで検証されて、質的に以下の様式に示されることを表した:4/4実験より大きい閾値細胞毒性(+++)、3/4実験より大きい閾値細胞毒性(++)、2/4実験より大きい閾値細胞毒性(+)。表1の印がない細胞は矛盾していて抗議する、または、効果が閾値細胞毒性より少ない。比較のためにも含まれた他の抗体のnii Ni Pttegaveosumberが生物学的細胞分析の限定を与えられるCl Cttornosonr期待されるとして実行する間、化学細胞障害性の薬剤はそれらの期待される細胞傷害を誘発した。6BD−25抗体は胸部(卵巣のおよび大腸癌細胞系選択的に)で細胞毒性を示した、その一方で、非変わる正常細胞の上に無効を持った。また、非−の上に無効を持つことが正常細胞を変える間、5LAC−23抗体は選択的に卵巣癌細胞系で細胞毒性を示した。全ての癌細胞タイプが影響されやすいというわけではなかった時から、抗体6BD−25および5LAC−23はそれらの活性で選択的だった。さらにまた、それが非−癌細胞型に対して細胞毒性を発生しなかった時から、6BD−25および5LAC−23は機能的な特異性を示した。そして、それは重要な治療的な因子である。
【0025】
【表2】
【0026】
癌と正常な細胞系の前述のパネルに対する6BD−25の結合は、フローサイトメトリ(FACS)によって評価された。細胞は、まず最初にDPBS(Ca+’’1なしで」、そして、Mg++)で細胞単層を洗うことによって、FACSの準備ができていた。細胞解離バッファ(INVITROGEN、バーリントン、ON)はそうだった、そして、37°C. After遠沈殿法と収集で細胞をそれらの細胞培養プレートから除去するのに用いられて、細胞はMgCl2を含んでいるダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水で再懸濁された。そして、CaCl2and25パーセント・ウシ胎児血清が40C(メディアを洗う)状態にあられて、計数されて、適当な細胞密度に等分されて、細胞に小球をぶつけるために下って回転して、30分の間氷の上で20マイクログラム/mLで6BD−25(非抱合型であるかビオチンで抱合型の)、5LAC−23または制御抗体(アイソタイプ制御または抗ファス)を含んでいる染色メディア(DPBSは、MgCl2と塩化カルシウムを含んでいる)で再懸濁された。ビオチンに6BD−25を接合することは、ビオチン標識試薬(ピアスE2−Link Sulfo−NHS−集線装置−ビオチン、ロックフォード、IL)で実行された。ビオチン標識試薬は6BD−25まで20回モル過剰で加えられて、振盪で室温で2時間の間暖められた。ビオチン標識された6BD−25は、それから40CでPBSに対して終夜透析された。Alexaフルーアの追加の前に488抱合型の二次抗体(非抱合型の主要な抗体のために)またはストレプトアビジンR−フィコエリトリンが二次抗体(ビオチン標識された6BD−25のために)を接合したこと、細胞は洗浄メディアで一度洗われた。染色メディアの中の適当な二次抗体は、それから20分の間加えられた。細胞は、それから最後の時間の間洗われて、ヨウ化1マイクログラムの/mLのプロピジウムを含んでいる媒体を染色する際に再懸濁された。細胞の流動細胞獲得は、CellQuestソフトウェア(ビジネスデザインBiosciences、Oakville、ON)を使用しているFACScanの上で試料を走らせることによって評価された。細胞のフォワード(国際販売会社)と側方散乱(SSC)は電圧を調整することによってセットされた、そして、振幅は国際販売会社とSSC探知器に追い迫る。細胞が約1−5単位の蛍光強度の中央値で同一のピークを持ったように、3本の蛍光チャネル(FLl、FL2とFL3)のための探知器は適当な二次抗体が続く精製されたアイソタイプ制御抗体で染色される走行細胞によって調整された。有効な細胞は、国際販売会社とプロピジウム・ヨウ化物除外のためにゲーティングによって後天性だった。各々の試料のために、約10,000の有効な細胞は、表3に示される分析と結果のために後天性だった。表3はアイソタイプ制御より上に平均の蛍光強度折り目増加を表化して、質的に示される:1.5未満();1.5〜2つの(+);2〜3(++);3〜10の(+++)と>10(++++)。6BD−25 5LAC−23抗体の代表的なヒストグラムは、図1のために編集された。非抱合型の6BD−25は、まず最初に、FACSによって試験される少しの細胞系も結合しなかった。しかしながら、ビオチンに6BD−25を接合することによって分析の感度を増加させた後に、抗原の低レベルが最低降下高度−MB−231、C−13、OVCA−429とOV2008癌細胞の表面で存在することを証明された。FACSによって、5LAC−23は、大腸癌細胞系SW620に高くて特異的な結合を見せた。6BD−25および5LAC−23のために、これは結合の程度がその同族の抗原の抗体結紮の結果を必ずしも予示するというわけではなくて、非明らかな知見であったという更なる証拠であった。これは、異なる細胞の抗体結紮の前後関係が抗体結合よりはむしろ細胞毒性で決定的なことを示唆した。
【0027】
【表3】
【0028】
実施例2
生体内の大腸予防的腫瘍実験
8週間目まで図2、4に示されるデータに関して、雌の重篤複合免疫不全マウスは、100マイクロリットルの塩水湖の116のヒト大腸癌細胞が襟首で皮下に注射した500万のSWlで入れられた。マウスは、10の2つの投与群に、ランダムに分けられた。着床より前の日に、20mg/kgの6BD−25試験抗体またはバッファ制御は、500mMNaCl、20mMのNa2HPOWH2Oと20mMNaH2PO4^H2Oを含んだ賦形薬で、家畜濃度から希釈の後、300マイクロリットル量で、intrapertioneallyに投与された。同じ様式の7週の期間の間の1週当たり、抗体はそれから投与された。腫瘍成長は最高16週の間のカリパス副木による正確に計ったざっとあらゆる7回目の日であったか、個々の動物までAnimal Care(CCAC)エンドポイントまたは日112の間カナダの会議に達した。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、CCACガイドラインに従って安楽死させられた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通じてなかった。データは独立試料試験を使用して分析された、そして、有意性は平均値の同等のためにt検定を使用して測定された。日50(最終的な処置の後の1日)で、腫瘍容積inthe 6BD−25の処置群は、バッファ制御(p=0.001)の54パーセントであった。発育遅延ofthe腫瘍は、治療期間過ぎに続いた。日112(63日後処理)で、抗体投与群の腫瘍容積は、バッファ制御(p=0.002)の59パーセントであった。要約すると、6BD−25抗体処置は、ヒト大腸癌のよく認識されたモデルで、割に全身腫瘍組織量をバッファ制御に下げた。これらの結果は、人を含む他の哺乳類で、治療としてこの抗体(6BD−25)の潜在的薬理学で製薬利点を暗示する。
【0029】
実施例2
生体内の卵巣予防的腫瘍実験:
図3と4に示されるデータに関して、4〜8週間目、雌のSCEDマウスは、1000マイクロリットルの食塩注入された腹腔内で、500万のOVCAR−3ヒト卵巣癌細胞で挿入された。マウスは、10の2つの投与群に、ランダムに分けられた。移植の後の日に、20mg/kgの6BD−25試験抗体または抗体バッファは、500mMNaCl、20mMのNa2HPO4* 7H2Oと20mMのNaH2PO4^H2Oを含んだ賦形薬による家畜濃度からの希釈の300マイクロリットル後にの量の投与された腹腔内であった。同じ様式の9週の期間の間の1週当たり、抗体はそれから投与された。体重は最高11週の間の正確に計ったざっとあらゆる7回目の日であったか、個々の動物までAnimal Care(CCAC)エンドポイントまたは日76の間カナダの会議に達した。動物の体重は、本研究の期間の間原建築費だった。本研究終了後、全ての動物は、CCACガイドラインに従って安楽死させられた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通じてなかった。体重が、腫瘍発達(図3)の代わりの程度として使われた。重量増加が腹水形成に起因する時から、増加した体重は全身腫瘍組織量を表す。有意性は、ダネットのt検定を使用して測定された。移植後の(処置の終わりの後の16日)日80で、6BD−25投与群のマウスは、緩衝対照群(p=0.002)よりかなり少ない体重を持った。ログランク検定で測定されるにつれて、バッファ制御(図4)と比較した6BD−25による処置による生存も強化された。対照群のマウスは、87.0日の生存期間の中央値対6BD−25投与群(p<0.02)の107.5の日を過ごした。また、緩衝投与群の全てのマウスは、日中120のポスト着床(56日後療法)になって死んだ。抗体投与群において、生存しているまだ1匹のマウスが、日250後処理(186日後処理)でいた。要約すると、6BD−25抗体処置は、ヒト癌疾患のもう一つのよく認識されたモデルで、バッファ制御に割に全身腫瘍組織量を予防した。6BD−25も、卵巣の異種移植モデルで生存を強化した。全体として、6BD−25は、重篤複合免疫不全マウスで大腸と卵巣癌の予防腫瘍異種移植モデルで腫瘍成長を抑制することでのバッファ制御よりかなり効果的である。6BD−25にもよる処置は、人を含む他の哺乳類で治療のためにこの抗体の薬理学で製薬利点を提案しているヒト卵巣癌疾患のよく認識されたモデルで、生存利点を示した。さらにまた、SWl116とOVCAR−3細胞の抗原式の検出不可能であるか低いレベルは、抗原表現のレベルがインビボの有効性と必ずしも相関するというわけではないことをそれぞれ示す。
【0030】
実施例4
ウエスタンブロット法による結合タンパク質の同定
抗原を表している抗体5LAC−23、細胞可溶化物と細胞質の分数によって認められる抗原(s)を特定することは、ゲル電気泳動に従属して、膜に移った。ウエスタンブロット法は、この抗体によって見つけられるタンパク質を決定するのに用いられた。
【0031】
1. 1次元のSDS−PAGE
前の仕事はFACS分析によって5LAC−23の弱い結合を卵巣癌細胞系OVCAR−3に示した、そして、その5LAC−23はこの細胞系(米国特許出願No.10/810、163、いずれが参照によって組み込まれてこの中にあるかという内容)に対して細胞毒性を持つことが示された。全細胞可溶化物は、RIPAバッファで準備された[5OmMトリス−HCl(pH 7.2);15OmM NaCl;0.1%(w/v)のSDS;1%(w/v)のデオキシコール酸ナトリウム;1%(w/v)のトリトンX−100]細胞分画がMem−PER Eukaryotic Membrane Protein摘出キットを使用しているようにされる、(ネコ。No.89826;ピアス;Tattenhall、チェシャー、英国)。発生する親水性の断片は、膜成分の除去によって基本的に豊かにされて、細胞質の断片であると考慮された。プロテアーゼ阻害薬(SIGMA P8340)は、全ての細胞溶解ステップに含まれた。細胞標品のアリコートは30分の間60Vで12%のゲル類andranに積まれた、それから、染料正面までの150Vはゲル類の一番下に着いた。ゲル類は、NOVEX XCeIl II Blot Module(インビトロゲン、ペイズリー、英国)を用いて、2時間30VでPVDF膜上へタンパク質の転送の準備ができていた。転送の後で、膜は40Cで終夜0.5%のツイーン(TBST)を含んでいるTris−緩衝食塩水の5%の脱脂粉乳によるブロック状態のであった。膜は、室温で4時間主要な抗体で暖められた。主要な抗体含まれた5LAC−23(5つのμg/mL)、そして、アイソタイプ制御‖(マウス抗トリニトロフェノール、免疫グロブリンM、K;G155−228のクローンをつくりなさい;ネコ。No.553472;ビジネスデザインPharMingen;オックスフォード、オックスフォード大学の、英国の;5μg/ml)。膜がTBSTで3回洗われた、膜は接合される西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)で暖められたヤギ抗マウス免疫グロブリンM、μ鎖特異抗体(1/10,0000;ネコ。数115−035〜075;ジャクソンImmunologicals West Grove、PA、アメリカ合衆国)Ih.のために5回膜を洗った後に、HRPは腸クロム親和性細胞様西洋のBlotting Detection Reagents(アマシャム)を使用しているのを見つけられた。帯域を産生されるOVCAR−3細胞の細胞質の分数に対する5LAC−23の結合は、近いMW 4OkDa(図5)黒い矢で示されるように、の。この帯域はOVCAR−3細胞から作られる全細胞可溶化物が非常に不得意だった。そして、抗原が細胞質の分数を生み出して濃縮されることができたthattheを関係させた。帯域は、5LAC−23に対する相互作用がはっきりしていたことを示しているアイソタイプ対照によって、見つけられなかった。優性の帯域が約7OkDでも観察されたにもかかわらず、この帯域はより少ない強度でアイソタイプ対照にもよって見つけられた。この実験から、5LAC−23は、特に約40kDのタンパク質と結合するように見える。
【0032】
2. 2次元のSDS−PAGE
上で述べられるように、細胞質のタンパク質が準備した合計、プラスOneを使用している沈降したは、2次元のClean−Upキットであった(ネコ。No.80−6484−51;アマシャム、リトル・チャルフォント、バックス、英国)、それから、pH範囲3−10で両性電解質を含んでいる再水和バッファで再懸濁される。第1のアスペクト等電点電気泳動(IEF)は、7cmの固定されたpH 3−10勾配(IPG)で、IPGphor(アマシャム)の上で実行された−再水和溶液の面前で細片(アマシャム、リトル・チャルフォント、バックス、英国)の基礎を形成する(8Mの尿素(2%のCHAPS);アマシャム)。電圧限度は再水和を起こらせる14時間の30Vであった、そして、1時間の200V、1時間の500V、30分の間の1000Vと8000Vhまでの8000Vは達された。IEF分離の後で、細片は15分の間2.5%のヨードアセタミドでDTTなしでSDS−PAGE平衡バッファで平衡化された。細片は10%のゲルの表面に配置されて、0.5%のアガロースで封着された。SDS−PAGEは30分の間60Vで動作した、それから、染料正面までの150Vはゲル類の一番下に着いた。ゲル類は、Hoefer TE 77を用いてPVDF膜上へタンパク質の転送のために、Semi−Dry Transfer Unit(アマシャム)を用意された。転送の後で、膜は40Cで終夜0.5%のツイーン(TBST)を含んでいるトリス−緩衝食塩水の5%の脱脂粉乳によるブロック状態のであった。膜は、室温で4時間主要な抗体で暖められた。主要な抗体含まれた5LAC−23(5つのμg/mL)、そして、アイソタイプ制御‖(マウス抗トリニトロフェノール、免疫グロブリンM、K;G155−228のクローンをつくりなさい;ネコ。No.553472;ビジネスデザインPharMingen;オックスフォード、オックスフォード大学の、英国の;5μg/mL)。膜がTBSTで3回洗われた、膜は接合される西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)で暖められたヤギ抗マウス免疫グロブリンM、μ鎖特異抗体(1/5000−10,0000;Cat.No。115−035−075;ジャクソンImmunologicals West Grove(PA,USA))Ih.のために5回膜を洗った後に、HRPは腸クロム親和性細胞様西洋のBlotting Detection Reagents(アマシャム)を使用しているのを見つけられた。図6は、5LAC−23で暖められるOVCAR−3細胞質の分数から得られるウエスタンブロットを示す。アイソタイプ対照(図6a)と暖められる汚点と比較して、一つの異なった点は、5LAC−23(図6b)で探索される汚点で見られることができる。ユニークな発疹は矢で示されて、分子量で酸性のπを36IcDタンパク質マーカーと類似しているようにする。二次元電気泳動法は、より広い通りを使用して繰り返された(18cm;アマシャム)、それを確認するために、5LAC−23は酸性タンパク質と結合した。そして、タンパク質点の分離を改善して、以降の質量分析分析のために十分なタンパク質を得ることが可能だった。再水和とIEFは、プログラムされた設定によって実施された:30V 14時間;200V 30分;500V 30分;勾配の1000VのIh;勾配の6500V 3時間;8000V。完全Vhは、54,000−60,000であった。IEF分離の後で、細片は15分の間2.5%のヨードアセタミドでSDS−PAGE平衡バッファで平衡化された。細片は12%のゲルの表面に配置されて、0.5%のアガロースで封着された、そして、SDS−PAGEは60Vで終夜実行された。ゲル類のうちの1つは、PlusOne Sliver Stainingキットを使用しているタンパク質のために染色された(ネコ。第17−1150−01;アマシャム)MS分析と互換性を持つようにという製造業者の指示に従うこと。他のゲル類は、先に述べたようにPVDF膜上へタンパク質の転送の準備ができていた。膜は、先に述べたように5LAC−23とアイソタイプ対照と探索された。転送の後で、ゲル類はタンパク質点の配列で援助するために、先に述べたようにタンパク質のためにも染色された。5LAC−23が結合するOVCAR−3細胞質の分数からのタンパク質点は、図7で明らかに見られることができる。図中図7aは、OVCAR−3細胞質の分数の銀の染色されたゲルである。図7bは、一つの異なった点も36kDタンパク質マーカーと類似の分子量で5LAC−23(図7c)で探索される汚点で明瞭な間、アイソタイプ制御が少しのタンパク質点もと結合しなかったことを明らかにする。点がアイソタイプ対照(図7b)と発見されていなかったので、5LAC−23の結合ははっきりしていた。この実験は、5LAC−23時までに結合される抗原性部位が約36のKD(酸性のπを有する)であることを確認した。
【0033】
実施例5
質量分析法による結合タンパク質の同定
5LAC−23によって認識される37ないし40kDタンパク質スポットに対応するゲル領域を無菌のピペットで切り出した。ゲル・プラグが、それから質量分光によってタンパク質の識別のために使われた。試料は、aMWGRoboseq 4204ロボット(MWG Biotech)を使用しているトリプシンで、in−gel消化に従属した。ペプチドは、1%のfoπnic酸と2%のアセトニトリルでゲル・プラグから自由にされた。一部の結果として生じるダイジェスト上清は、ペプチド分離のために8桁、75mmの塩素を使用しているMicroMass Q−TOF Globalの上で分析された。データは、MASCOTを使用して検索された。5LAC−23時までに認められたゲルの領域でMS分析によって特定されるタンパク質は、表4に示される。質量分光によって確認される5LAC−23のための抗原は、ラミニン受容体1であった。
【0034】
【表4】
【0035】
実施例6
5LAC−23のための抗原の確認
【0036】
1. 共局在化検査による確認
推定上の抗原の確認は決定することによって援助されたどうか、抗体がそうすることができた既知の抗37LRPは5LAC−23による共局在化である。OVCAR−3細胞からの細胞質の分数のタンパク質は、SDS−PAGEによって分離されて、ニトロセルロース膜上へ拭かれた。ウエスタンブロット法は、一次元SDS−PAGEのために、先に述べたように実行された。主要な抗体は5LAC−23(5つのμg/mL)を含んだ、免疫グロブリンMアイソタイプは制御する(先に述べたように;5μg/mL)、H−抗37LRP抗体150(0.2のμg/mL;ネコ。No.sc−20979;サンタクルスBiotechnology;サンタクルス、CA、アメリカ合衆国;この抗体は、ヒト37LRPのAA 110−250に対応している組換え型のタンパク質に対して起毛していた)、F−抗37LRP抗体18(0.4のμg/mL;ネコ。第sc−21534;サンタクルス)、そして、正常なウサギ免疫グロブリンG‖(0.2のμg/mL;ネコ。No.AB−105C;研究開発Systems;アビンドン、オックスフォード大学の、英国の)。二次抗体は、上述のHRP抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンMを含んだ(1/5000−10,000;ジャクソンImmunologicals)免疫グロブリンMの検出のために、HRP抱合型の抗ウサギの免疫グロブリン(1/2000;Cat.no。P0448;DAKO、Carpentaria、CA、アメリカ合衆国)、そして、HRP抱合型の抗ヤギの免疫グロブリン‖(1/2000;ネコ。No.P0449)。2つの抗37LRP抗体(H−150とF−18)は、近似のMW 40IcD(図8Aと8B)で、abandと結合する。免疫グロブリンM isotyope制御がそうしない間、5LAC−23も類似のサイズ(図4D)の帯域と結合する。そして、このタンパク質による相互作用of5LAC−23がはっきりしていることを確認する。2次元 SDS−PAGEセクションで記述されるにつれて、OVCAR−3細胞からの細胞質のタンパク質の更なる2次元の西部劇は準備されたが、IEFはpH範囲を制限するために3.5−5でπでpharmylatesを使用して実行された。ブロッティングのために使用される初等・中等抗体は、上で記載される。5LAC−23とH−150をウエスタンブロットに結合することは、図9で示されて、適当なアイソタイプ対照(示されないデータ)と探索される汚点と比較された。5LAC−23時までに認められるタンパク質点は図9Aで示される。そして、黒い矢で示される。抗37LRP抗体(H−150)は、5LAC−23も結合したゲルの付近と一致する黒線(図9B)で強調されるタンパク質のより幅広い汚れと結合した。H−150によって認められるスミアが少なくとも3つのタンパク質点を含んで、タンパク質の異なるアイソフォームがOVCAR−3細胞から細胞質の分数で存在することを示す可能性があることは、ありそうである。汚点の上で見つけられる他のタンパク質は、抗体または二次抗体のアイソタイプによる相互作用によって、どちらの5LAC−23もH−150にも特有でない。抗37LRP抗体と5LAC−23は、37LRPが実際5LAC−23のための抗原であるという約4OkD providng更なる証拠のタンパク質と結合した。しかしながら、分子量が同程度だったにもかかわらず、5LAC−23は他の抗37LRP抗体と比較してユニークな製本見本を示した。より制限された結合を示している5LAC−23で、これは2つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを示唆する。
【0037】
2. トランスフェクション試験による確認
推定上の抗原の確認は、5LAC−23が相補的DNAクローンof37LRPで形質移入された細胞と結合することができたかどうか決定することによって実行された。37LRPコードしている相補DNAのクローンは、plasmidpCMV6−XL5で得られた(pCMV−XL537LRPとしてを参照した;部材TC107938番;寄託番号:NM−002295;ORIGENE Technologies;ロックビル、MA、アメリカ合衆国)。中国のHamster Ovary(CHO)細胞は、6穴のプレートの60−70%の集密的であるために大きくなった(F12ハムNutrient Mixture;10%のFBS;2mMのGlutamine)。細胞は、製造業者のプロトコルに従ってFugene Transfection Reagentを使用しているpCMV−XL537LRPで形質移入された(ネコ。No.1988387;ロシュDiagnostics;ルイス、イースト・サセックス、英国)。細胞は、免疫染色の前に少なくとも48時間大きくなった。細胞はPBSで二回洗われて、それから氷冷アセトンを据えられた:3分の間のメタノール(1:1)。アセトン:メタノールは除去された、そして、細胞は風乾された。それはPBSで3回洗われて、それから30分の間PBSで2%のFBSで遮断された。主要な抗体は加えられた、そして、細胞は室温で1時間孵化した。主要な抗体は5LAC−23(5μg/ml)を含んだ、免疫グロブリンMアイソタイプは制御する(先に述べたように;5μg/mL),the抗37LRP抗体(H−150;0.2のμg/mL;サンタクルスBiotechnology)、anti−67LR抗体‖(MLuC5;ネコ。ab3099番;4つのμg/mL;制限される真横、ケンブリッジ、Cambs、英国)、そして、正常なウサギ免疫グロブリンG‖(0.2のμg/mL;ネコ。No.AB−105−C;研究開発Systems;アビンドン、オックスフォード大学の、英国の)。細胞が洗われた3回withPBS(二次抗体)であった、(HRP−は、ヤギ抗マウス免疫グロブリンM(1/1000)をconjuagtedした;ジャクソンImmunologicals)、加えられて、1時間孵化した。二次抗体は、上述のHRP抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンMを含んだ(1/1000;ジャクソンImmunologicals)、免疫グロブリンMの検出とHRP−のために、抗ウサギの免疫グロブリンは接合した(1/200;DAKO)。HRPがDAB−Substrateキットを使用しているのを見つけられる前に、細胞は3回洗われた(ネコ。第SK−4100;ベクター研究室;ピーターバラ(Cambs.,UK))製造業者の指示に対する従って。免疫染色するDNA(pCMV−XL537LRP)の量として5LAC−23増加でけがされる陽性の(茶色の)細胞の数が増加する(図10)ことを明らかにする。アイソタイプ制御はCHO細胞をいくらかの背景染色でけがした、しかし、これはトランスフェクション処置(図10、Top列)に含まれたDNAの量を問わず類似している。そして、一過性に形質移入された細胞に対する5LAC−23の結合がはっきりしていることを示した。これらの結果は、5LAC−23のための結合タンパク質が37kdのLRPであることを確認する。やあ、5LAC−23によるトランスフェクション細胞染色への追加、と、また、2つの他の抗体で染色される若干の細胞が37LRPと67LR(図11)に対して指令した。37LRP抗体H−150が細胞質(図1つのIB)に局在化させて形質移入された数セル、認めたanti−。異なるパターンでであるけれども、第二抗体MLuC5(それは67LRを認める)はまた、若干の細胞(図ハイドロコーチゾン)と結合した5LAC−23とH−150(図1つのアイソレーション増幅器とハイドロコーチゾン)のそれに。他の研究者は、MLuC5が形質移入されたCHO細胞と結合するのに失敗したことを発見した。これは、実験的な違い(例えば異なるプロモーター、二次抗体またはクローンの使用または染色テクニックにおける変化)による可能性がある。ラミニンとの接触に応じて取付けのためにレセプターの発散を可能にして、MLuC5の染色がリソソームの膜である可能性がある区画に制限される点に注意しなさい。これらの結果は、形質移入されたタンパク質(37LRP)がCHO細胞でうまく表されることを確認する。これらの結果も、67LRが37LRPポリペプチドに関連があるという、そして、それがCHO細胞で合成されることができるという証拠を提供する。SDS−PAGE結果は、5LAC−23が約37−45kD(例4)であるタンパク質と結合するにつれて、67kDラミニンよりむしろ前駆体分子に対する5LAC−23ひもが受容体たんぱくことを示唆する。トランスフェクション細胞の免疫染色パターンが5LAC−23の位置が主に細胞質で、MluC5結合によりH−150結合と類似していることを示すことを明らかにしているこの実験からの結果‖全体としてやあ、この証拠の合計は、5LAC−23のための抗原が67LRよりむしろ37LRP前駆体分子であることを示唆する。
【0038】
2. 37LRPの細菌表示による確認
更に5LAC−23の推定上の抗原を評価するために、37LRP相補DNAは、細胞フリーな生体外翻訳系で、タンパク質の生合成のために、発現ベクターにクローンをつくられた。プラスミドpCMV−XL537LRP(上記を記載した;ORIGENEは)プライマー5’−GGGAAATTTTCCATATGTCCGGAGC−3による37LRP相補DNAの増幅のテンプレートとして使用した』(合成Nde I部位を含む)、そして、5−CCTATGC AAGCCCGGGTTAAGACCAG−3』(astopコドンと合成Smal部位を含む)。PCR増幅は、Turbo DNAポリメラーゼ(戦略)を使用して実行された。DNAテンプレートの後に940Cで5分の間変性させられて、30サイクル(940C、600Cの45分、720Cの1分の45分)が続いて、720Cで10分の間広げられた。37LRP PCR製品はいずれのpIVEX2.3dもとpIVEX2.4dにクローンをつくられた(ネコ。no. 03 269 019 001;ロシュ)Nde IとSma I部位を使用すること。発生したプラスミドは、pIVEX2.3dLRP(His6−タグのない37LRP)andprVEX2.4dLRPNHiS6(N末端の終わりのHis6−タグによる37LRP)を含む。37LRPタンパク質の表示は、バクテリアで細胞フリーな生体外翻訳系を使用して実行された(RTS 100大腸菌HYキット;ネコno. 3186 148;ロシュDiagnostics、ルイス、英国)製造業者の指示に従うこと。反応混合物のアリコートは、10%のゲル類に積まれて、ニトロセルロースへ移された。膜は、終夜40CのTBSTの5%の脱脂乳によるブロック状態のであった。主要な抗体は加えられた、そして、汚点は3時間室温で暖められた。5がTBSTで洗ったあと、二次抗体は室温で1時間加えられた。主要な抗体は5LAC−23(5つのμg/mL)を含んだ、免疫グロブリンMアイソタイプは制御する(先に述べたように;5μg/mL),the抗37LRP抗体(H−150;0.2のμg/mL;サンタクルスBiotechnology)、そして、正常なウサギ免疫グロブリンG‖(0.2のμg/mL;研究開発Systems)。二次抗体は、上述のHRP抱合型のヤギ抗マウス免疫グロブリンMを含んだ(1/5000−10,000;ジャクソンImmunologicals)免疫グロブリンMとHRP抱合型の抗ウサギの免疫グロブリンの検出のために(1/2000;DAKO)。5回を洗った後に、HRP抱合型の抗体は、発見されたwithECL西洋のBlotting Detection Reagents(アマシャム)であった。ウエスタンブロット分析で両方の抗37LRP抗体、H−150と5LAC−23が細菌反応混合物だけで合成されるタンパク質と結合することが分かった37LRPのテンプレート(pIVEX2.3dLRP(37LRP andprVEX2.4dLRPNHis6)は、反応混合物(図12)に含まれた。GFPを表している制御プラスミドが反応混合物に含まれたとき、5LAC−23とH−150は反応混合物と結合しなかった。C末端のHis6−タグに対する抗体は、GFPタンパク質が合成される(示されないデータ)ことを確認した。反応混合物は、pIVEXLRP構造物からの最低2つのタンパク質製品で、おそらくこれらの構造物(Ribosomal結合部位の直後に1と1は、クローニングのために使用されるNde I部位を計上する)の2つの開始コードンのために、またはpost−に翻訳のmodifciationsを生成するだろうように見えた。5LAC−23とH−150が2つの類似のタンパク質帯域を認めるにもかかわらず、結合のパターンは全く明瞭である。5LAC−23は、優先して、可能な翻訳後修飾を提案しているより多くのスミアとして現れる一番上の帯域と結合する。H−150は異なった帯域と結合する(各々の帯域がダブレットである点に注意しなさい;写真の中で見える)。トップ37LRP bandby theIgMアイソタイプ制御に対する若干の結合であるように見える‖(図8;タンパク質のオーバーロードによる非特異的な結合による可能性があるパネルA)。更なるこれらの結果は37kD LRPに5LAC−23の結合を確認して、この抗体の結合がユニークなエピトープにあるという更なる証拠を提供する。そして、既知の抗37LRP抗体H−150の結合とは別である。ロシュからRTSシステムを使用して、多数の翻訳後修飾は、37LRP製品の生合成から除外されることができる。これらはN−を含む、そして、Oにリンクされた糖化、リン酸化反応とジスルフィドは形成を結合する。他の分子がポリペプチド(例えば脂質と硫酸化された群)に加えられる可能性があって、5LAC−23が結合するエピトープの一部である可能性があるかもしれない。ScanProsite(Expasy)は37LRP配列が多数のリン酸化部位、2N−myristolyation部位とチロシン硫酸化部位があることをを予想する。E.coliがこの変形を収めることができない時から、潜在的myristyl群は5LAC−23のエピトープから除外されることができる。リン酸化反応の欠如は5LAC−23がペプチド配列と結合する場合、この配列が正常なヒト細胞でリン酸化される可能性があって、腫瘍細胞で非phosphoprylatedされている可能性があるというで興味深い可能性がある。このように、5LAC−23の抗原を露出させる。
【0039】
実施例7
寒冷保存された正常組織のヒトの抗原分布のIHC検査
研究が実行されたIHCは、正常な人体組織で5LAC−23抗原分布を特徴づけるために、組織を凍結保存した。正常な人体組織の寒冷保存されたスライドは、Covance(英国)から入手可能にされた。それをそれから二回洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)で洗われる10分の間のアセトン中で固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。それは、2%のBSAのブロック状態のであった(SP−5050;ベクターLaboratories社)更なる20分の間。内因性ビオチン部位は、製造業者の指示に従ってアビジン/ビオチン遮断キット(SP−2001;媒介生物Laboratories社)を使用しているブロック状態のであった。5LAC−23、サイトケラチン−8抗(M0631;ダコCytomation)、そして、免疫グロブリンM抗眼球運動計アイソタイプ制御‖(550340;ビジネスデザインPharMingen)、暖められたwiththeは、RTの60分の間の2%のBSA/洗浄バッファの5つのμg/mLのスライドであった。スライドは、ヤギの潜伏より前の抗マウスの免疫グロブリンMが従属的にビオチン標識したという洗われた3つの時であった(B9265;シグマアルドリッチ社社)、1を希釈した:RTの30分の間の1%のウマ血清/洗浄バッファの100。スライドは3回洗われて、アビジン−HRPで孵化した、マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキットによってメイクアップする(PK−6102;ベクターLaboratories社)RTの30分の間:3回を洗った後に、スライドは製造業者によるとDABを使用して開発される色であった』s指導(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後でスライドが脱水の前に水のおびただしい量で洗われるハリスのhaematoxylinthenで対比染色剤で着色されて、DPX封入剤でマウントしたこと(M/Dl 10/08;フィッシャーScientific社)。寒冷保存された正常組織の上で、5LAC−23は、弱く、通常の脳と尿細管と試験される(表5)他の組織のいずれもと結合しない。
【0040】
【表5】
【0041】
これらの結果は、5LAC−23のための抗原が正常組織の上で広く表されなかった、そして、抗体がヒトの限定された数の組織だけと結合することを示唆した。
【0042】
実施例8
ヒトの正常なおよび腫瘍IHC
人体組織結合結果は、それから、ホルマリン固定人体組織のより広いパネルで結合を調べることによって延長された。ホルマリン固定パラフィン包埋通常の器官と腫瘍は、スライドを配列する(B A3;アクセス方式サービスBiotechnology社)、de−はアルコールを通してワックスを塗られた。スライドは、洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)に、短時間に浸漬された。抗原検索は、低pH目標検索溶液で、20分の間全速力でミクロ・ウィービングによって実行された(S1699;ダコCytomation)。内因性過酸化物活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。内因性ビオチン部位は、アビジン/ビオチン遮断キットを使用しているブロック状態のであった(SP−2001;ベクターLaboratories社)製造業者の指示に対する従って。5LAC−23て、そして、免疫グロブリンM anti−、眼球運動計アイソタイプは、制御する(550340;ビジネスデザインPharMingen)、RTで90分の間1%のウマ血清洗浄バッファで、0.75のμg/mLでスライドで暖められた。スライドは、従属的でビオチン標識されるヤギ抗マウス免疫グロブリンMで、潜伏の前に二回洗われた(B9265;シグマアルドリッチ社社)、1を希釈した:RTの30分の間の1%のウマ血清/洗浄バッファの100。二回洗った後に、スライドがアビジン−HRPで暖められたこと、マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキットによってメイクアップする(PK−6102;ベクターLaboratories社)RTの30分の間。スライドは、二回洗われた、そして、色はキットによってDABを使用することを開発した‖(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後で、スライドはそれからDPX封入剤で脱水とマウンティングの前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色された(MfDl 10/08;フィッシャーScientific社)。表6は、組織がパラフィン埋め込まれているとき、5LAC−23が弱く骨格筋、正常肝と通常の胃と結合することを証明する。前の例の場合のように、5LAC−23結合は、正常組織で制限される。5LAC−23は、肝細胞癌(HCC)に最も強く、そして、弱く、胃腺癌と結合する。それは、試験される他の正常なまたは腫瘍組織のいずれかと結合しない。これらのIHC検査で、結合の明確な差が正常肝と大部分の他の正常組織と比較してHCCにあることが分かった。
【0043】
【表6】
【0044】
通常の胃(カラムA)、正常肝(カラムB)と肝腫瘍(カラムC)のうちの5LAC−23による染色の例は、図13で見られることができる。そこで、アイソタイプで組織のいずれかと結合しているisnoは、5LAC−23の結合がはっきりしている示度を制御する。5LAC−23は細胞の細胞質と主に結合した、しかし、若干の膜状の局在化は観察された。5LAC−23は非常に弱く正常肝と通常の胃と結合するが、強く悪質な肝臓と結合する。
【0045】
実施例9
ヒト肝腫瘍部に対する5LAC−23の結合
IHC検査は、ヒト肝臓癌で5LAC−23抗原の癌関連を決定するために行われた。ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓配列は、滑動する(CSl;アクセス方式サービスBiotechnology社)、アルコールを通して非ワックスを塗った。スライドは、洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)に、短時間に浸漬された。抗原検索は、低pH目標検索溶液で、20分の間全速力でミクロ・ウィービングによって実行された(S1699;ダコCytomation)。内因性過酸化物活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。内因性ビオチン部位は、アビジン/ビオチン遮断キットを使用しているブロック状態のであった(SP−2001;ベクターLaboratories社)製造業者の指示に対する従って。5LAC−23と免疫グロブリンM抗眼球運動計アイソタイプは、制御する(550340;ビジネスデザインPharMingen)、RTで90分の間1%のウマ血清洗浄バッファで、0.75のμg/mLでスライドで暖められた。スライドは、従属的でビオチン標識されるヤギ抗マウス免疫グロブリンMで、潜伏の前に二回洗われた(B 9265;Sigma−オールドリッチ社社)RTで30分の間1%のウマ血清/洗浄バッファで、1:100に希釈される。二回洗った後に、スライドがアビジン−HRPで暖められたこと、マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキットによってメイクアップする(PK−6102;ベクターLaboratories社)RTの30分の間。スライドは、二回洗われた、そして、色はキットによってDABを使用することを開発した‖(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後で、スライドはそれからDPX封入剤で脱水とマウンティングの前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色された(M/Dl10/08;フィッシャーScientific社)。1、2試料でほんの少数の細胞だけが染色されたにもかかわらず、5LAC−23は、HCC組織配列スライド(表7を見る)の上で、73%のHCC断面と結合した。染色は、主に細胞質だった。これらの結果は、5−LAC−23抗原が他の組織タイプと比較して肝臓癌でとても表されるだけではない、しかし、それが異なる患者から大部分のヒト肝臓癌で表されることを示す。
【0046】
【表7】
【0047】
実施例10
マッチされた正常なおよび肝腫瘍染色
マッチされた近隣の通常で始原ヒト肝細胞癌肝臓組織のスライドを凍結保存した(T6235149;アクセス方式サービスBiotechnology社)、除氷されて、風乾された。それをそれから二回洗浄バッファ(0.02%のツイーン−20によるPBS)で洗われるlOminsのためのアセトン中で固定した。内因性過酸化物活性は、15分の間のメタノールの中の0.6%の過酸化水素の潜伏によるブロック状態のであった。スライドは、RTで20分の間洗浄バッファで1%のウマ血清をふさぐ前に、バッファで洗われた。それは、2%のBSAのブロック状態のであった(SP−5050;ベクターLaboratories社)更なる20分の間。内因性ビオチン部位は、製造業者『s指導によってアビジン/ビオチン遮断キット(SP−2001;媒介生物Laboratories社)を使用しているブロック状態のであった。5LAC−23、サイトケラチン−8抗(M0631;ダコCytomation)、そして、免疫グロブリンM抗眼球運動計アイソタイプ制御(550340;ビジネスデザインPharMingen)、RTで60分の間2%のBSA/洗浄バッファで、5つのμg/mLでスライドで暖められた。スライドは、ヤギの潜伏より前の抗マウスの免疫グロブリンMが従属的にビオチン標識したという洗われた3つの時であった(B9265;Sigma−オールドリッチ社社)、1を希釈した:RTの30分の間の1%のウマ血清/洗浄バッファの100。スライドは3回洗われて、アビジン−HRPで暖められた。そして、RTで30分の間マウス免疫グロブリンGベクタステインABCキット(PK−6102;媒介生物Laboratories社)によって占められた。3回を洗った後に、スライドは製造業者の指示に従ってDABを使用して開発される色であった(SK−4100;ベクターLaboratories社)。水洗浄の後でスライドがそれから脱水の前に水のおびただしい量で洗われるハリスのヘマトキシリンで対比染色剤で着色されて、DPX封入剤でマウントしたこと(MTD110/08;フィッシャーScientific社)。図14は、同じ個人からマッチされた正常なおよび腫瘍組織の寒冷保存された肝臓断片を示す。サイトケラチン8(パネルC)が通常の肝細胞と結合に局在化させる注は正常組織に制限される。そして、断面の一部が通常でガン組織の混合物であることを示す。5LAC−23は腫瘍試料と結合して、悪質な組織をこの断片において代表する中心領域に特有なだけである。アイソタイプ対照でけがされるとき、断面は負である。そして、5LAC−23の結合がはっきりしていることを示す。染色パターンは、5LAC−23から、患者試料で、抗体がそれによってそれを魅力的なdruggableな目標としている悪性細胞に非常に特有だったことを示した。
【0048】
実施例11
変えられた増殖条件による正常細胞の結合の誘導
実験は、5LAC−23発現が選択された状況の下で正常細胞で誘発されることができたかどうか調査するために行われた。Beas−2B『通常の』肺上皮細胞は、コーティングしてないフラスコの上で大きくなって、vitrogenでおおわれていた(0.03mg/ml vifrogel;結合Technologies社)。細胞は、気管支の上皮細胞増殖培養液で大きくなった(CC−3170;Clonetics)370Cの95%の空気/5%のCO2の加湿された空気で。約80%融合性のとき、細胞は細胞解離溶液(SIGMA Cat.番号C5914)で取り出されて、二回inPBSを洗って、10%のホルマリンfor30分で固定した。細胞ペレットは固形パラフィンの懸濁させたである前にアルコールで脱水されて、60分の間450Cで暖められた。固形パラフィンは冷却していて、固まっている45°C. Afterで60分の潜伏で3回よみがえった、3μm部はライカ磁気レイノルズ数の上で2135のミクロトームを切られて、ガラス・スライド上へ焼かれた。断面は、上述のマッチされた肝臓試料に関しては、5μg/mL 5LAC−23または免疫グロブリンMアイソタイプ対照でけがされた。細胞がVitrogen(図15)で大きくなる場合にだけ、通常の肺上皮細胞系列Beas−2Bに対する5LAC−23の結合は見られることができる。免疫グロブリンMアイソタイプ制御の結合は、5LAC−23の結合がはっきりしていたことを示しているのを見られることができない。正常細胞でさえ、これらの結果は、特定の状況では、例えば成長因子、接着分子と細胞外基質分子の面前で、5LAC−23の抗原の表現度が誘発されることができることを意味する可能性がある。これらの増殖条件の異常は、しばしば悪質で前悪性の国で生じて、37LRP(肝細胞癌で観察されるそれのような)の発現変化に関与する可能性がある。
【0049】
実施例12
ウエスタン分析によるさまざまなヒト細胞系の5LAC−23の配布
ヒト細胞系の調査は、37LRPの配布と5LAC−23のエピトープを評価するために、ウエスタン分析によって実行された。細胞可溶化物はプロテアーゼ阻害薬でRIPAバッファで多数のヒト腫瘍または形質転換細胞系から準備された、そして、1−Dimensional SDS−PAGEセクションで記述されるにつれて、ウエスタンブロットは準備された。溶解産物は、胸部細胞系HB4aR4.a(ラジウムで変わる正常な乳房細胞)、HMT 3522(正常細胞)、MCF−7(腫瘍細胞)、最低降下高度−MB−231(腫瘍細胞)から作られた;MDA−MB−361(乳房腫瘍による脳転移);卵巣腫瘍細胞系OVCAR−3;肝細胞は、チャンのLiverとHepG2に沿って並ぶ;メラノーマ細胞ラインA375;そして、大腸腫瘍細胞は、DLD−I、LS174TとSW620に沿って並ぶ。37LRPタンパク質が以前チャイニーズハムスターから記載された時から、野生型CHO細胞も含まれた(Cricetulus灰白;NCBI Accession番号:298088).コバルト−局在化セクションで記述されるにつれて、汚点はいずれのH−150もまたは5LAC−23で探索された。抗37LRP抗体H−150は試験される細胞系の全てでタンパク質帯域を認める。そして、野生型CHO細胞(図16A)を含む。少なくとも2つのタンパク質帯域が異なるヒト・アイソフォームの存在を示しているH−150で見つけられて大腸細胞系(DLD−I)にある点に注意しなさい。H−150と5LAC−23が西部劇の中で類似の大きさを設定された帯域と結合したにもかかわらず、5LAC−23はH−150(図16B)のそれに異なるパターンで細胞可溶化物と結合した。H−150は細胞系の合計37LRPを見つける、5LAC−23のエピトープの表示は異なる細胞可溶化物全体で変化する、そして、中で、一部は存在しない。CHO細胞可溶化物に対する両方の抗体の結合が類似しているにつれて、抗体のこの違いはその抗原のためにH−150と比較してその抗原のために5LAC−23の下部の親和性によらない。5LAC−23は、近似のユニークなスミアを見つける。非還元の条件(図16B、レーン12)のLS174T溶解産物のHOkD。このスミアは還元性の状況の下で消える、しかし、増加が37LRP前駆体(示されないデータ)に対応している帯域にない。既知の抗LRP抗体H−150と比較して、これらの結果は、37LRPの上で5LAC−23時までに認識されるエピトープがユニークであるという更なる証拠を提示する。5LAC−23は免疫組織化学(トランスフェクション部、例6)によって野生型CHO細胞と結合しなかったが、還元性で非還元の状況(図16)の下で、西部劇によってwt CHO溶解産物と結合する。これは、5LAC−23のエピトープが高次構造的に依存している可能性があるおよび/またはエピトープが自国の状況の下で露出しないか抗体にアクセスできないことを示唆する。全体として、このデータは、5LAC−23の抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも5LAC−23抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。全体として、このデータは、5LAC−23抗原が癌関連する抗原であって、ヒトで表されて、病理学的に関連した癌目標であることを証明する。更に、このデータも5LAC−23の抗体の結合をヒト癌組織に示して、診断でありえる分析のために適切に使われることがありえるか、治療を予示することがありえるか、予後でありえる。加えて、この抗原の細胞限局化は大部分の非悪性の細胞で抗原の表現度の不足による細胞の癌状態を表す、そして、この診察によってこの抗原、その遺伝子または誘導剤、そのタンパク質またはその異型の使用が診断でありえる分析のために使われるか、治療を予示するか、予後のことができる。この仕様で言及される全ての特許と刊行物は、発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも個々の刊行が参照によって組み込まれることを特に、そして、個々に示されるかのように、全ての特許と刊行物は同じ範囲への言及によって組み込まれてこの中にある。発明の特定の形状が例示される間、それが記載されてこの中の部品の特異的な形状または配置に限られていることになっていなくて、示されることになっていないと理解されることになっている。さまざまな変化が発明の範囲から出発することなくなされる可能性があることは当業者にとって明らかである、そして、発明は示されて、明細書で記述されることに限られて考慮されることになっていない。当業者は、直ちに本発明が物体を実行するのにかなり適していると認めて、その中で固有のそれらと同様に、言及される終わりと利点を得る。この中に記載されるどんなオリゴヌクレオチドでも、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した合成物、方法、処置と技術は、現在好ましい実施形態を代表して、典型的なことを目的として、範囲に対する制限を、意図しない。その中の変化と他の用途が、発明の精神の範囲内で含まれて、添付の請求項の範囲によって定義される当業者の心に浮かぶ。発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載された、それは理解されなければならないその発明請求する‖そのような特異的な実施形態に過度に制限しなければならない。実際、当業者にとって明らかである発明を実行するための描かれたモードのさまざまな変形は、以下の請求項の範囲内のことを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1A】6BD−25、5LAC−23と抗ファス(正の制御)抗体の代表的なFACSヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
【図1B】6BD−25、5LAC−23と抗ファス(正の制御)抗体の代表的なFACSヒストグラムは、いくつかの癌と非癌細胞系に対して指示した。
【図2】予防SWl116大腸癌モデルの腫瘍成長に関する6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
【図3】予防OVCAR−3卵巣癌モデルの体重の6BD−25の効果。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均の+/−SEMを表す。
【図4】6BD−25またはバッファ制御による腫瘍を含んだマウス後処理の残存。マウスは、240日以上後処理のために生存をモニターされた。
【図5】図5Aと5Bは、全細胞可溶化物(T)と細胞質の分数(C)のウエスタンブロットは、アイソタイプ対照(パネルA)か5LAC−23(パネルB)で染色されるOVCAR−3 Cellsから作った。異なった帯域は5LAC−23で見つけられて、黒い矢で示される。
【図6】図6Aと6Bは、OVCAR−3細胞質のタンパク質のウエスタンブロットは、2次元の電気泳動によって分かれた。パネルBが5LAC−23で探索される汚点を示す間、パネルAは免疫グロブリンMアイソタイプ対照と探索されるブロットを示す。矢は、5LAC−23時までに認められる点に対応する。
【図7】図7A、7Bと7Cは、OVCAR−3細胞質のタンパク質の2次元 SDS−PAGEとウエスタンブロット。図中パネルAは、細胞質の分数のシルバー染色されたゲルである。Panel Bがアイソタイプ制御抗体で探索される類似の汚点を示す間、パネルCは5LAC−23時までに認められるタンパク質の位置を示す。
【図8】図8A、8B、8Cと8Dは、5LAC−23よって認められる点に対応する。OVCAR−3細胞質の分数のウエスタンブロットは、抗37LRP抗体H−150の(A)、抗37LRP抗体F−18(B)、免疫グロブリンMアイソタイプ制御(C)と5LAC−23(B)で深く探った。
【図9】図9Aと9Bは、OVCAR−3細胞からの細胞質のタンパク質の2−次元ウエスタンブロット。Blot Aの矢は、5LAC−23が結合する主要発疹を示す。Blot Bの線は、抗37LRP(H−150)抗体に特有である点を示す。汚点の上で明かされる他の点は、抗体のアイソタイプでまたは使用される二次抗体で相互作用による。
【図10】図10A、10B、10Cと10Dは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ制御(一番上の列)で37LRP(pCMV−XL537LRP)コードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されたCHO細胞(10X拡大)の免疫染色される。細胞はFugene試薬(甲欄)単独で形質移入されたか、pCMV−XL537LRPの量を増加させていた(1マイクログラム:柱B;2マイクログラム:柱C;4マイクログラム:柱D)。細胞が5LAC−23でけがされたとき、陽性細胞(茶色の)の増加性の数はプラスミドの増加性の量で見られることができる。
【図11】図11A、11B、および11Cは、アイソレーション増幅器。37LRPコードしているヒト相補的DNAクローンを表しているプラスミドで形質移入されるCHO細胞(40X)の免疫染色される(pCMV−XL537LRP;2マイクログラム)。細胞は5LAC−23(A)で染色された、抗37LRP抗体H−150(B)と抗67LR抗体MLuC5(C)と陽性細胞は全部で見られることができる免疫染色する。
【図12】図12A、12Bと12Cは、ウエスタン分析によってさまざまな抗体によって見つけられるE.coliのヒト37LRPの表示。細菌反応混合物に含まれたプラスミドは、C末端のHisβ−タグ(レーン1)で、Control媒介生物GFPを含んだ、pIVEX2.3dLRP(37LRP;レーン2)andprVEX2.4dLRPNHjS6(aN−terminalHis6−タグによる37LRP;レーン3)。汚点は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(パネルA)、5LAC−23(パネルB)と抗37LRP抗体H−150(パネルC)で探索された。
【図13】図13A、13Bと13Cは、5LAC−23(一番下の列)と免疫グロブリンMアイソタイプ対照(一番上の列)と一緒のパラフィン包埋組織の染色。断面は、通常の胃(甲欄)、noπnal肝臓(柱B)と肝細胞癌(柱C)から取り出された。
【図14】図14A、14Bと14Cは、マッチされたnoπnal(一番上の列)とマッチされた腫瘍組織(一番下の列)からの寒冷保存された肝臓組織に対するさまざまな抗体の結合。使用される抗体は、免疫グロブリンMアイソタイプ対照(甲欄)、5LAC−23(柱B)と抗サイトケラチン8(柱C)であった。
【図15】図15Aと15Bは、5LAC−23()と免疫グロブリンMアイソタイプ対照()と一緒の通常の肺上皮細胞系列Beas−2Bのイムノ組織化学染色。細胞は成長される(柱B)か、外で(甲欄)Vitrogenであった。
【図16】図16Aと16B。非還元の条件のウエスタンブロット法によって発見されたものとしての多数の腫瘍と形質転換細胞系の表現oftheエピトープ 抗37LRP antibodyH−150の(A)と5LAC−23(B)。細胞系は、野生型CHO細胞(レーン1)とヒト細胞系を含んだ:HB4aR4.a(レーン2)、HMT 3522(レーン3)、MCF−7(レーン4)、最低降下高度−MB−231(レーン5);最低降下高度−MB−361(レーン6)、OVCAR−3(レーン7)、チャンのLiver(レーン8)、HepG2(レーン9);A375(レーン10)、DLD−I(レーン11)、LS174T(レーン12)とSW620(レーン13)である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および/または遅延疾患進行を延長する方法であり、前記腫瘍は特にそれについて、モノクローナル抗体の確認している特徴を寄託番号PTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードしておくモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと結合する抗原を発現する方法であって、 前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを含み、 それによって、疾患進行は遅延性であるおよび/または、生存率が高まる方法。
【請求項2】
前記抗体が細胞毒性部位に抱合型である請求項1の方法。
【請求項3】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項2の方法。
【請求項4】
前記抗体が補体を起動させる請求項1の方法。
【請求項5】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用の媒介となる請求項1の方法。
【請求項6】
前記抗体がマウス抗体である請求項1の方法。
【請求項7】
前記抗体がヒト化抗体である請求項1の方法。
【請求項8】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項1の方法。
【請求項9】
PTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードされた単離モノクローナル抗体。
【請求項10】
ヒト化抗体である請求項9の抗体。
【請求項11】
キメラ化抗体である請求項9の抗体。
【請求項12】
請求項9の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項13】
請求項10のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項14】
請求項11のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項15】
請求項9、10、11、12、13、またはl4のどれでもの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで接合し、それによって、抗体複合体は形成される抗体または抗原結合フラグメント
【請求項16】
PTA−5691としてATCCで寄託された単離されたクローン。
【請求項17】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞の存在を決定する結合アッセイ であって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること; PTA−5691としてのATCCまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンまたはそれの抗体複合体によってコードした単離モノクローナル抗体を提供すること;前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること;ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、前記組織標本の前記癌細胞の存在が示される結合アッセイ。
【請求項18】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣のおよび胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項17の結合アッセイ。
【請求項19】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること; PTA−5691としてのATCCまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンまたはそれの抗体複合体によってコードされた単離モノクローナル抗体を提供すること;前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること;ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、前記癌細胞は前記結合で分離され、前記組織標本のそれらの存在が確認される、プロセス。
【請求項20】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣のおよび胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項19のプロセス。
【請求項21】
単離モノクローナル抗体は、寄託番号PTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードした。
【請求項22】
ヒト化抗体である請求項21の抗体。
【請求項23】
キメラ化抗体である請求項21の抗体。
【請求項24】
請求項21の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項25】
請求項22のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項26】
請求項23のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項27】
細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで接合した請求項21,22,23,24,25または26のどれでもの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、それによって抗体複合体は形成される単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項28】
寄託番号PTA−5690としてATCCで寄託された単離されたクローン。
【請求項29】
ヒト腫瘍から選択される組織試料で癌細胞の存在を決定する結合アッセイであって、 前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること、寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたクローンでコードされる単離抗原またはそれの抗原結合フラグメン、または抗体複合体を提供すること、前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること、ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定すること を含み、それによって前記組織標本の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項30】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項29の結合アッセイ。
【請求項31】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞を分離するか、映るプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること、寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメント、またはの抗体複合体を提供すること、 前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること、ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、それによって前記癌細胞は前記結合で分離される、そして、前記組織標本のそれらの存在は確認される、プロセス。
【請求項32】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項31のプロセス。
【請求項33】
組織標本でラミン受容体1前駆体(37LRP)を確認する方法であって、 組織標本を提供すること、寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞またはその抗原性結合フラグメントで産生されるで単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと前記組織標本と接触させること、前記単離モノクローナル抗体に独自に結合されながら特徴づけられる前記抗原性部位;そして、前記抗原性部位の結合を決定すること; それによって、37LRPが同定される、方法。
【請求項34】
肝細胞癌を患っている患者を診断する方法であって、肝細胞癌を患うと疑われる患者から組織標本を提供すること;寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞またはその抗原性結合フラグメントで産生される単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと前記組織標本と接触させること、前記単離モノクローナル抗体に独自に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、そして、前記抗原性部位の結合しているdeteπnining;それによって、肝細胞癌の診断が同定される、方法。
【請求項35】
37LRPを表す細胞の分化、処置または画像診断のための方法であって、前記細胞の試料を提供すること;単離モノクローナル抗体を含む抱合部位またはそれの抗原結合フラグメントを提供すること、それの前記抗体または抗原結合フラグメントそれについて表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであって、モノクローナル抗体の同定している特徴をPTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位とし、それについて、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと活用している前記単離モノクローナル抗体または抗原性の結合フラグメント、それによって前記細胞による前記抱合部位の結合は、前記細胞の分化、処置または画像診断に帰着する、方法。
【請求項36】
癌疾患に罹ってる患者を処置する方法であって、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合型の半量、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供すること、モノクローナル抗体の同定している特徴をPTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、 それについて、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと活用している前記単離モノクローナル抗体または抗原性の結合フラグメント、そして、前記患者に前記抱合型の成分を投与することを含む、方法。
【請求項37】
特にPTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと結合する37LRP抗原性部位を表す細胞の存在を決定する結合アッセイであって、細胞試料を提供すること;単離された単クローン抗体またはそれの抗原結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて前記表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の同定している特徴をクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位は、PTA−5690としてATCCで寄託した前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを接触させること;そして、 前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体の結合またはそれの抗原結合フラグメントを決定すること、それによって 特に前記単離モノクローナル抗体と結合する37LRP抗原性部位を表す細胞の存在またはそれの抗原結合フラグメントは、決定される、結合アッセイ。
【請求項38】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項33の方法。
【請求項39】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項33の方法。
【請求項40】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項34の方法。
【請求項41】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項34の方法。
【請求項42】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項35の方法。
【請求項43】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項35の方法。
【請求項44】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項36の方法。
【請求項45】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項36の方法。
【請求項46】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項37の方法。
【請求項47】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項37の方法。
【請求項48】
哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および/または遅延疾患進行を延長する方法であって、そこで前記腫瘍は特にそれについて、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量、それによって進行が遅延する疾患および/または生存で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを成立している寄託番号PTA−5690が広げられるにつれて、モノクローナル抗体の確認している特徴をATCCで寄託されるクローンでコードしておくモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと結合する抗原を発現する、方法。
【請求項49】
モノクローナル抗体またはそれについてモノクローナル抗体の同一化している特徴を哺乳類でヒト腫瘍の処置のために薬の製造で寄託番号PTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードされた抗原結合フラグメントの使用であって、前記腫瘍は特にそれによって、進行が遅延するおよび/または生存がされる疾患を前記モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメント(前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で投与されている前記モノクローナル抗体)に結合する抗原を発現する、モノクローナル抗体またはそれについてモノクローナル抗体の使用。
【請求項50】
モノクローナル抗体の使用またはそれについてモノクローナル抗体の同定している特徴を哺乳類でヒト腫瘍の治療のために薬の製造で寄託番号PTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードしておく抗原結合フラグメント、そこで 前記腫瘍は特に前記モノクローナル抗体と結合する抗原またはそれの抗原結合フラグメントを発現し、疾患進行が遅延性であるおよび/または生存が広げられるそれによって前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で投与されているモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項51】
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用であって、それの前記抗体または抗原結合フラグメントそれについて表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであり、 モノクローナル抗体の同定している特徴をPTA−5690(s)としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、癌疾患に罹ってる患者を処置するための薬の製造において、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと抱合型で、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントを補助する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用。
【請求項52】
単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用であって、モノクローナル抗体の確認している特徴をPTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメント、癌疾患に罹ってる患者を処置するための薬の製造で、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと抱合型である、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用。
【請求項53】
一団の被験者から選択する方法、被験者が癌を患う所で、単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントでの処置に影響されやすいそれらはそれについて分解し、それは37LRPを発現する抗原性部位と結合する方法であって、癌を患っている被験者から組織標本を提供して、ハイブリドーマ細胞系によって発生される単離モノクローナル抗体で前記組織標本を接触させることは寄託番号PTA−5690としてのATCCまたはそれの抗原性の結合フラグメントで寄託した。そして、それは37のLRPによって表される抗原性部位と結合する。そして、前記抗原性部位が前記単離モノクローナル抗体に独自に束縛されながら特徴づけられた;そして、前記抗原性部位の結合を決定すること、それによって 被験者の選択は、なされる方法。
【請求項54】
請求項6にもとづく方法であって、単離モノクローナル抗体をもつ被験者またはそれの抗原性の結合断片を処置することを更に含む、37LRPを発現する抗原性部位と結合する、方法。
【請求項1】
哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および/または遅延疾患進行を延長する方法であり、前記腫瘍は特にそれについて、モノクローナル抗体の確認している特徴を寄託番号PTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードしておくモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと結合する抗原を発現する方法であって、 前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを含み、 それによって、疾患進行は遅延性であるおよび/または、生存率が高まる方法。
【請求項2】
前記抗体が細胞毒性部位に抱合型である請求項1の方法。
【請求項3】
前記細胞毒性部位が放射性同位元素である請求項2の方法。
【請求項4】
前記抗体が補体を起動させる請求項1の方法。
【請求項5】
前記抗体が抗体依存性細胞障害作用の媒介となる請求項1の方法。
【請求項6】
前記抗体がマウス抗体である請求項1の方法。
【請求項7】
前記抗体がヒト化抗体である請求項1の方法。
【請求項8】
前記抗体がキメラ化抗体である請求項1の方法。
【請求項9】
PTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードされた単離モノクローナル抗体。
【請求項10】
ヒト化抗体である請求項9の抗体。
【請求項11】
キメラ化抗体である請求項9の抗体。
【請求項12】
請求項9の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項13】
請求項10のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項14】
請求項11のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項15】
請求項9、10、11、12、13、またはl4のどれでもの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで接合し、それによって、抗体複合体は形成される抗体または抗原結合フラグメント
【請求項16】
PTA−5691としてATCCで寄託された単離されたクローン。
【請求項17】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞の存在を決定する結合アッセイ であって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること; PTA−5691としてのATCCまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンまたはそれの抗体複合体によってコードした単離モノクローナル抗体を提供すること;前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること;ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、前記組織標本の前記癌細胞の存在が示される結合アッセイ。
【請求項18】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣のおよび胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項17の結合アッセイ。
【請求項19】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞を単離またはスクリーニングするプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること; PTA−5691としてのATCCまたはそれの抗原結合フラグメントで寄託されるクローンまたはそれの抗体複合体によってコードされた単離モノクローナル抗体を提供すること;前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること;ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、前記癌細胞は前記結合で分離され、前記組織標本のそれらの存在が確認される、プロセス。
【請求項20】
ヒト腫瘍組織試料が卵巣のおよび胸部組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項19のプロセス。
【請求項21】
単離モノクローナル抗体は、寄託番号PTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードした。
【請求項22】
ヒト化抗体である請求項21の抗体。
【請求項23】
キメラ化抗体である請求項21の抗体。
【請求項24】
請求項21の単離モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項25】
請求項22のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項26】
請求項23のキメラ化抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項27】
細胞毒性部位、酵素、放射性化合物、および造血細胞からなる群から選択されるメンバーで接合した請求項21,22,23,24,25または26のどれでもの単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、それによって抗体複合体は形成される単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項28】
寄託番号PTA−5690としてATCCで寄託された単離されたクローン。
【請求項29】
ヒト腫瘍から選択される組織試料で癌細胞の存在を決定する結合アッセイであって、 前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること、寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたクローンでコードされる単離抗原またはそれの抗原結合フラグメン、または抗体複合体を提供すること、前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること、ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定すること を含み、それによって前記組織標本の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項30】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項29の結合アッセイ。
【請求項31】
ヒト腫瘍から選択される組織標本で癌細胞を分離するか、映るプロセスであって、前記ヒト腫瘍から組織標本を提供すること、寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメント、またはの抗体複合体を提供すること、 前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントまたはそれの抗体複合体を接触させること、ならびに前記組織標本で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントの結合またはそれの抗体複合体を決定することを含み、それによって前記癌細胞は前記結合で分離される、そして、前記組織標本のそれらの存在は確認される、プロセス。
【請求項32】
ヒト腫瘍組織試料が大腸組織からなる群から選択される組織から生じている腫瘍から得られる請求項31のプロセス。
【請求項33】
組織標本でラミン受容体1前駆体(37LRP)を確認する方法であって、 組織標本を提供すること、寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞またはその抗原性結合フラグメントで産生されるで単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと前記組織標本と接触させること、前記単離モノクローナル抗体に独自に結合されながら特徴づけられる前記抗原性部位;そして、前記抗原性部位の結合を決定すること; それによって、37LRPが同定される、方法。
【請求項34】
肝細胞癌を患っている患者を診断する方法であって、肝細胞癌を患うと疑われる患者から組織標本を提供すること;寄託番号PTA−5690としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞またはその抗原性結合フラグメントで産生される単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと前記組織標本と接触させること、前記単離モノクローナル抗体に独自に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、そして、前記抗原性部位の結合しているdeteπnining;それによって、肝細胞癌の診断が同定される、方法。
【請求項35】
37LRPを表す細胞の分化、処置または画像診断のための方法であって、前記細胞の試料を提供すること;単離モノクローナル抗体を含む抱合部位またはそれの抗原結合フラグメントを提供すること、それの前記抗体または抗原結合フラグメントそれについて表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであって、モノクローナル抗体の同定している特徴をPTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位とし、それについて、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと活用している前記単離モノクローナル抗体または抗原性の結合フラグメント、それによって前記細胞による前記抱合部位の結合は、前記細胞の分化、処置または画像診断に帰着する、方法。
【請求項36】
癌疾患に罹ってる患者を処置する方法であって、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合型の半量、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供すること、モノクローナル抗体の同定している特徴をPTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、 それについて、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと活用している前記単離モノクローナル抗体または抗原性の結合フラグメント、そして、前記患者に前記抱合型の成分を投与することを含む、方法。
【請求項37】
特にPTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードされる単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントと結合する37LRP抗原性部位を表す細胞の存在を決定する結合アッセイであって、細胞試料を提供すること;単離された単クローン抗体またはそれの抗原結合フラグメント、前記抗体またはそれの抗原結合フラグメントにそれについて前記表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであることを提供して、モノクローナル抗体の同定している特徴をクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位は、PTA−5690としてATCCで寄託した前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを接触させること;そして、 前記細胞試料で前記単離モノクローナル抗体の結合またはそれの抗原結合フラグメントを決定すること、それによって 特に前記単離モノクローナル抗体と結合する37LRP抗原性部位を表す細胞の存在またはそれの抗原結合フラグメントは、決定される、結合アッセイ。
【請求項38】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項33の方法。
【請求項39】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項33の方法。
【請求項40】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項34の方法。
【請求項41】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項34の方法。
【請求項42】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項35の方法。
【請求項43】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項35の方法。
【請求項44】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項36の方法。
【請求項45】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項36の方法。
【請求項46】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがヒト化である請求項37の方法。
【請求項47】
前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントがキメラ化である請求項37の方法。
【請求項48】
哺乳類でヒト腫瘍を処置することによって生存および/または遅延疾患進行を延長する方法であって、そこで前記腫瘍は特にそれについて、前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量、それによって進行が遅延する疾患および/または生存で前記ほ乳類に前記モノクローナル抗体を投与することを成立している寄託番号PTA−5690が広げられるにつれて、モノクローナル抗体の確認している特徴をATCCで寄託されるクローンでコードしておくモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと結合する抗原を発現する、方法。
【請求項49】
モノクローナル抗体またはそれについてモノクローナル抗体の同一化している特徴を哺乳類でヒト腫瘍の処置のために薬の製造で寄託番号PTA−5690としてATCCで寄託されるクローンでコードされた抗原結合フラグメントの使用であって、前記腫瘍は特にそれによって、進行が遅延するおよび/または生存がされる疾患を前記モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメント(前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で投与されている前記モノクローナル抗体)に結合する抗原を発現する、モノクローナル抗体またはそれについてモノクローナル抗体の使用。
【請求項50】
モノクローナル抗体の使用またはそれについてモノクローナル抗体の同定している特徴を哺乳類でヒト腫瘍の治療のために薬の製造で寄託番号PTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードしておく抗原結合フラグメント、そこで 前記腫瘍は特に前記モノクローナル抗体と結合する抗原またはそれの抗原結合フラグメントを発現し、疾患進行が遅延性であるおよび/または生存が広げられるそれによって前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減らすために効果的量で投与されているモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項51】
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用であって、それの前記抗体または抗原結合フラグメントそれについて表された37LRP抗原性部位と結合する単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであり、 モノクローナル抗体の同定している特徴をPTA−5690(s)としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、癌疾患に罹ってる患者を処置するための薬の製造において、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと抱合型で、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメントを補助する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用。
【請求項52】
単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用であって、モノクローナル抗体の確認している特徴をPTA−5691としてATCCで寄託されるクローンでコードしておいている抗体に束縛されながら特徴づけられる前記抗原性部位、前記単離モノクローナル抗体またはそれの抗原性の結合フラグメント、癌疾患に罹ってる患者を処置するための薬の製造で、薬、毒素、酵素または放射性合成物からなる群から選択される少なくとも1人のメンバーと抱合型である、単離モノクローナル抗体またはそれの抗原結合フラグメントを含む抱合部位の使用。
【請求項53】
一団の被験者から選択する方法、被験者が癌を患う所で、単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントでの処置に影響されやすいそれらはそれについて分解し、それは37LRPを発現する抗原性部位と結合する方法であって、癌を患っている被験者から組織標本を提供して、ハイブリドーマ細胞系によって発生される単離モノクローナル抗体で前記組織標本を接触させることは寄託番号PTA−5690としてのATCCまたはそれの抗原性の結合フラグメントで寄託した。そして、それは37のLRPによって表される抗原性部位と結合する。そして、前記抗原性部位が前記単離モノクローナル抗体に独自に束縛されながら特徴づけられた;そして、前記抗原性部位の結合を決定すること、それによって 被験者の選択は、なされる方法。
【請求項54】
請求項6にもとづく方法であって、単離モノクローナル抗体をもつ被験者またはそれの抗原性の結合断片を処置することを更に含む、37LRPを発現する抗原性部位と結合する、方法。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
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【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【公表番号】特表2007−530460(P2007−530460A)
【公表日】平成19年11月1日(2007.11.1)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−504229(P2007−504229)
【出願日】平成17年3月29日(2005.3.29)
【国際出願番号】PCT/CA2005/000456
【国際公開番号】WO2005/093048
【国際公開日】平成17年10月6日(2005.10.6)
【出願人】(504236592)アリアス リサーチ、インコーポレイテッド (28)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成19年11月1日(2007.11.1)
【国際特許分類】
【出願日】平成17年3月29日(2005.3.29)
【国際出願番号】PCT/CA2005/000456
【国際公開番号】WO2005/093048
【国際公開日】平成17年10月6日(2005.10.6)
【出願人】(504236592)アリアス リサーチ、インコーポレイテッド (28)
【Fターム(参考)】
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