癌治療のためのＤＮＡ損傷修復阻害剤
本発明は、塩基除去修復経路の阻害が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する細胞に選択的に致死性があるという知見に関する。塩基除去修復の成分（ＰＡＲＰなど）を標的とする阻害剤を用いたＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の治療に関する方法及び手段が本明細書中に提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞、特に、相同組換え（ＨＲ）依存的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復を欠損する癌細胞中への細胞致死性の導入に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞中のＤＮＡ損傷の有効な修復は、損傷を感知した後、損傷シグナルを下流エフェクターへと伝達し、細胞周期チェックポイントで停止し、ＤＮＡ損傷を修復する機序によるものである。細胞は、種々のＤＮＡ損傷の修復を媒介するシグナル及びエフェクターからなるいくつかの異なる経路を含んでいる。これらの経路には、塩基除去修復（ＢＥＲ）、相同組換え（ＨＲ）依存的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、及びミスマッチ修復（ＭＭＲ）が含まれる。様々なＤＮＡ修復経路間の相互作用及び相互依存性は、未だ十分には理解されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、たとえばポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害によるＢＥＲ経路の阻害が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損する癌細胞に対して選択的に致死性であることを発見した。このことは、癌状態の治療において重要な意味を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一態様は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を欠損する癌の個体における治療に使用するための医薬の製造における塩基除去修復経路の阻害剤の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
個体における癌の治療方法は、前記個体へ塩基除去修復経路の阻害剤を投与するステップを含んでよく、前記癌は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損するものである。
【０００６】
癌は、前記の第二の修復経路によってＤＮＡを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含み得る。
【０００７】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路は、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を相同的な機序によって修復して、切れ目のないＤＮＡヘリックスを再構成する（K. K. Khanna及びS. P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)）。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分には、ＡＴＭ（ＮＭ＿００００５１）、ＲＡＤ５１（ＮＭ＿００２８７５）、ＲＡＤ５１Ｌ１（ＮＭ＿００２８７７）、ＲＡＤ５１Ｃ（ＮＭ＿００２８７６）、ＲＡＤ５１Ｌ３（ＮＭ＿００２８７８）、ＤＭＣ１（ＮＭ＿００７０６８）、ＸＲＣＣ２（ＮＭ＿００５４３１）、ＸＲＣＣ３（ＮＭ＿００５４３２）、ＲＡＤ５２（ＮＭ＿００２８７９）、ＲＡＤ５４Ｌ（ＮＭ＿００３５７９）、ＲＡＤ５４Ｂ（ＮＭ＿０１２４１５）、ＢＲＣＡ１（ＮＭ＿００７２９５）、ＢＲＣＡ２（ＮＭ＿００００５９）、ＲＡＤ５０（ＮＭ＿００５７３２）、ＭＲＥ１１Ａ（ＮＭ＿００５５９０）、及びＮＢＳ１（ＮＭ＿００２４８５）が挙げられる。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路に関与する他のタンパク質としては、ＥＭＳＹなどの調節因子が挙げられる（Hughes-Daviesら、Cell, Vol 115, pp 523-535）。
【０００８】
塩基除去修復（ＢＥＲ）経路は、ＤＮＡ一本鎖切断及びギャップを修復し、特定の損傷塩基を除去する。ＤＮＡヘリックス中のギャップは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）及びリガーゼの連続する作用によって埋められる（K. K. Khanna及びS. P. Jackson, Nat. Genet., 27(3): 247-254 (2001)、F. Dantzerら、Biochemistry 39, 7559-69 2000、J. H. Hoeijmakers, Nature 411 366-74 (2001)）。塩基除去修復の阻害剤は、塩基除去修復経路の成分のいずれか１を阻害し得るものである。ＢＥＲ経路の成分には、ＵＮＧ（ＮＭ＿００３３６２）、ＳＭＵＧ１（ＮＭ＿０１４３１１）、ＭＢＤ４（ＮＭ＿００３９２５）、ＴＤＧ（ＮＭ＿００３２１１）、ＯＧＧ１（ＮＭ＿００２５４２）、ＭＹＨ（ＮＭ＿０１２２２２）、ＮＴＨＬ１（ＮＭ＿００２５２８）、ＭＰＧ（ＮＭ＿００２４３４）、ＮＥＩＬ１（ＮＭ＿０２４６０８）、ＮＥＩＬ２（ＮＭ＿１４５０４３）、ＮＥＩＬ３（ＮＭ＿０１８２４８）、ＡＰＥ１（ＮＭ＿００１６４１）、ＡＰＥ２（ＮＭ＿０１４４８１）、ＬＩＧ３（ＮＭ＿０１３９７５）、ＸＲＣＣ１（ＮＭ＿００６２９７）、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ１）（ＮＭ＿００１６７１８）、及びＡＤＰＲＴＬ２（ＰＡＲＰ２）（ＮＰ＿００５４７５）が挙げられる。
【０００９】
ＢＥＲ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復が欠損している癌の治療に、ＤＮＡ損傷剤と組み合わせて使用することができる。ＤＮＡ損傷剤は、ＢＥＲ阻害剤なしでは、細胞にとって致死的でない投与量又は処方で使用することが好ましい。適切なＤＮＡ損傷化学療法剤について以下で述べる。
【００１０】
一部の好ましい実施形態では、哺乳動物酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤（D'Amoursら、(1999) Biochem. J. 342: 249-268）を使用することができる。すなわち、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の治療に使用することができる。
【００１１】
個体におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の治療方法は、前記個体へＰＡＲＰ阻害剤を投与することを含んでよい。
【００１２】
ＰＡＲＰ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の個体における治療に使用するための医薬の製造の際に使用することができる。
【００１３】
ＰＡＲＰ阻害剤について以下でより詳細に述べる。
【００１４】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌は、その経路によってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が、正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含み、又はそれからなるものでよく、すなわち、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性が、１又は複数の癌細胞で低下又は消滅している可能性がある。
【００１５】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の１又は複数の成分の活性は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌を有する個体の１又は複数の癌細胞で消滅していて構わない。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分は、当技術分野で十分に特徴付けられており（たとえば、Woodら(2001) Science 291 1284-1289を参照のこと）、先に挙げた成分がそれに含まれる。
【００１６】
一部の好ましい実施形態では、癌細胞は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損表現型を有するものでよく、すなわち、癌細胞のＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２活性は、低下又は消滅している。この表現型を有する癌細胞は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２を欠損しているものでよく、すなわち、癌細胞のＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の発現及び／又は活性が、たとえばコード核酸の突然変異若しくは多形性によって、又は調節因子をコードする遺伝子、たとえばＢＲＣＡ２調節因子をコードするＥＭＳＹ遺伝子の突然変異若しくは多形性によって低下又は消滅していてよい（Hughes-Daviesら、Cell, Vol 115, pp523-535）。
【００１７】
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２は既知の腫瘍抑制因子であり、その野生型アレルは、ヘテロ接合性保持者の腫瘍で失われていることが多い（Jasin M. Oncogene. 2002年12月16日;21(58):8981-93; Tuttら、Trends Mol Med. (2002)8(12):571-6）。ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２突然変異と乳癌との関連は、当技術分野で十分に特徴付けられている（Radice P J Exp Clin Cancer Res. 2002年9月;21(3 Suppl):9-12）。ＢＲＣＡ２結合因子をコードするＥＭＳＹ遺伝子の増幅が、乳癌及び卵巣癌と関連付けられることも知られている。
【００１８】
ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異の保持者は、卵巣、前立腺、及び膵臓の癌のリスクも高くなっている。
【００１９】
一部の実施形態では、個体の癌状態は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌であると以前に確認されているものでありうる。
【００２０】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、個体の癌状態がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認するステップを含むことができる。
【００２１】
癌は、たとえば、個体から採取したサンプルの１又は複数の癌細胞のＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性を測定し、又はその経路の１又は複数の成分の活性を測定することによって、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌であると確認することができる。活性は、好ましくは同じ組織からの正常（すなわち、癌でない）細胞を基準として決定することができる。
【００２２】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性は、ＤＮＡ損傷剤又はＰＡＲＰ阻害剤に応答して起こる、核中にＲａｄ５１を含む焦点の形成を測定して決定することができる。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損する細胞は、そのような焦点を生成する能力がない。Ｒａｄ５１焦点が存在するかどうかは、標準の免疫蛍光技術を使用して判定することができる。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性を測定する他の方法としては、ＩＲ、及び鎖間架橋試薬、ＤＳＢ誘発剤（トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤）などの化学療法剤に対する感受性、並びにウエスタンブロット分析、免疫組織学、染色体異常、酵素若しくはＤＮＡ結合アッセイ、及びプラスミド系アッセイの使用を挙げることができる。
【００２３】
一部の実施形態では、個体の癌細胞中に、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分であるポリペプチドをコードする核酸の１又は複数の変化、たとえば、多形性又は突然変異が存在するかどうかを判定することにより、癌が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損していると確認することができる。
【００２４】
突然変異や多形性などの配列の変化には、野生型ヌクレオチド配列に対する１若しくは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含めることができる。一部の実施形態では、変化は、遺伝子増幅、たとえば、ＥＭＳＹ遺伝子（ＣＡＤ２２８８１；遺伝子記号Ｃ１１ＯＲＦ３０）の増幅でありうる。１又は複数の変化は、核酸配列のコード領域又は非コード領域にあるものでよく、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分であるポリペプチドの発現又は機能を低下又は消失させるものとしうる。言い換えれば、変異体核酸は、たとえば、調節エレメントの活性が変更されることで、活性が低下若しくは消滅している変異体ポリペプチドをコードしていてもよいし、又は細胞内でほとんど若しくはまったく発現されない野生型ポリペプチドをコードしていてもよい。変異体核酸は、野生型配列に対して１、２、３、４又はそれ以上の突然変異又は多形性を有するものでよい。
【００２５】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする核酸中に１又は複数の変化が存在するかどうかは、試験サンプルの１又は複数の細胞で、１又は複数の突然変異又は多形性を含むコード核酸配列の存在を検出するか、又はその核酸配列によってコードされる変異体構成ポリペプチドの存在を検出することによって判定できる。
【００２６】
個体から採取したサンプル中に特定の核酸配列、たとえば、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路成分の発現又は活性を低下又は消滅させる突然変異又は多形性を有する核酸配列が存在するか否かを判定するには、様々な方法が利用可能である。その上、個体又はサンプルの核酸の配列決定を行った後は、もとの核酸それ自体にたよることなく、配列情報を確保し、その後探索することができる。すなわち、たとえば、配列分析ソフトウェアを使用して、配列情報データベースを走査することで、配列の変更又は突然変異を同定することができる。
【００２７】
本発明の一部の態様に従う方法は、オリゴヌクレオチドプローブが、サンプルから得た核酸、たとえば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡに結合するかどうかの判定を含むものでもよい。プローブは、１若しくは複数の突然変異若しくは多形性を含む核酸配列に特異的に結合し、１若しくは複数の突然変異若しくは多形性を含まない核酸配列に特異的に結合しない核酸配列、又はその逆の核酸配列を含むものでよい。
【００２８】
オリゴヌクレオチドプローブは、標識を含むものでよく、プローブの結合は、標識の存在を検出して判定することができる。
【００２９】
方法は、１又は複数（たとえば２個）のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーによる標的核酸とのハイブリダイゼーションを含むものでよい。核酸が二本鎖ＤＮＡである場合では、ハイブリダイゼーションは一般に、先に変性させて一本鎖ＤＮＡを生成してから行う。ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ手順の一部としてのものでも、又はＰＣＲを含まない検出手順の一部としてのものでもよい。一例となる手順は、ＰＣＲとストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーションとの組合せでもよいはずである。
【００３０】
プローブによる標的核酸（たとえばＤＮＡ）への結合は、様々な技術のいずれかを当業者の自由裁量で使用して測定することができる。たとえば、プローブは、放射能、蛍光、又は酵素によって標識されていてよい。プローブの標識を用いない他の方法には、制限断片長多形の調査、ＰＣＲを使用する増幅、ＲＮアーゼによる切断、及び対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドによる検出が含まれる。検出は、標準のサザンブロット法を用いるものでよい。たとえば、ＤＮＡを細胞から抽出し、種々の制限酵素で消化することができる。次いで、制限断片をアガロースゲル上での電気泳動によって分離した後、変性させ、ニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識されたプローブをフィルター上のＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、結合したかどうかを判定することができる。
【００３１】
当業者ならば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成、温度などの要因を考慮しながら、選択的なハイブリダイゼーションに適する、所望のストリンジェンシーの条件をうまく用いることができる。
【００３２】
１７〜３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドに適する選択的ハイブリダイゼーションの条件には、６×ＳＳＣ中、４２℃での終夜のハイブリダイゼーション、及び６×ＳＳＣ中、４２℃から６５℃へと上昇していく一連の温度での洗浄を含む。
【００３３】
他の適切な条件及びプロトコルは、「Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition」、Sambrook & Russell(2001年)、Cold Spring Harbor Laboratory Press NY及び「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら編、John Wiley & Sons(1992年)に記載されている。
【００３４】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはｃＤＮＡ、又はその増幅された領域でよく、配列決定すると、そこに多形性又は突然変異が存在するかどうかを確認又は決定することができる。多形性又は突然変異は、上述のような成分のデータベース配列から得られる配列と比較して同定することができる。特に、ポリペプチド成分の機能の消滅又は損失を引き起こす１又は複数の多形性又は突然変異、したがって全体としてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路が存在するかどうかを決定することができる。
【００３５】
配列決定は、ある範囲の標準技術のいずれか１を使用して実施することができる。増幅産物の配列決定は、たとえば、イソプロパノール沈殿、再懸濁、及びＴａｑＦＳ＋Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定キットを使用する配列決定を利用しうる。伸長産物をＡＢＩ３７７ ＤＮＡ配列決定装置による電気泳動にかけ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェアを使用してデータを分析することができる。
【００３６】
１組又は複数のプライマー対を使用する、ＰＣＲなどの特異的増幅反応を使用すると、核酸配列内の対象の領域、たとえば、突然変異又は多形性を含む疑いのある配列部分を増幅することができて好都合である。次いで、増幅された核酸を先のように配列決定し、かつ／又はＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路成分の発現若しくは活性を低下若しくは消滅させる突然変異若しくは多形性が存在するか否かを決定する他の任意の手段で試験することができる。
【００３７】
適切な増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（たとえば、"PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Innisら編、1990, Academic Press, New York、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987)、Ehrlich (eds), "PCR technology", Stockton Press, NY, 1989、及びEhrlichら、Science, 252:1643-1650, (1991)に総説がある）が挙げられる。
【００３８】
一部の実施形態では、ＥＭＳＹなどのＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路成分の正又は負の調節因子の発現又は活性のレベルを評価することで、癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認することができる。発現レベルは、たとえば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション、又は核型分析によって決定することができる。
【００３９】
一部の好ましい実施形態では、個体は、突然変異や多形性など、ＢＲＣＡ１及び／若しくはＢＲＣＡ２又はその調節因子の１又は複数の変化についてヘテロ接合性である。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の変化の検出は、当技術分野で周知であり、たとえば、ＥＰ６９９７５４号、ＥＰ７０５９０３号、Neuhausen S. L.及びOstrander E. A. Genet. Test (1992) 1, 75-83、Chappnis, P. O. 及びFoulkes, W. D. Cancer Treat Res (2002) 107, 29-59、Janatova Mら、Neoplasma. 2003: 50(4):246-50、Jancarkova N Ceska Gynekol. 2003 68(1): 11-6に記載されている。ＢＲＣＡ２結合因子ＥＭＳＹが増幅されているかどうかの判定については、Hughes-Daviesら、Cell 115 523-535に記載されている。
【００４０】
癌に関連した突然変異及び多形性は、変異体（すなわち、突然変異体又はアレル変異体）ポリペプチドの存在を検出することによって、タンパク質レベルで検出してもよい。
【００４１】
個体からのサンプル中の癌細胞がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認する方法は、サンプルをその経路の変異体（たとえば突然変異体）ポリペプチド成分に対する特異的な結合メンバーと接触させるステップと、その特異的結合メンバーがサンプルに結合したかどうかを判定するステップとを含むものでありうる。特異的結合メンバーのサンプルへの結合は、サンプル内の細胞中にＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の変異体ポリペプチド成分が存在することの指標となり得る。
【００４２】
本発明の態様で使用するのに好ましい特異的結合分子には、抗体及びそのフラグメント若しくは誘導体（「抗体分子」）が含まれる。
【００４３】
抗体などの結合メンバーの正常サンプル及び試験サンプルに対する反応性は、任意の適切な手段によって測定することができる。個々のレポーター分子によるタグ付加は１の手段である。レポーター分子は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接又は間接的に発するものでよい。レポーター分子の結合は、直接又は間接的なものでよく、たとえばペプチド結合による共有結合によるものでも、又は共有結合によらないものでもよい。ペプチド結合による結合は、結合性分子（たとえば抗体）及びレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果として生じるものでよい。
【００４４】
結合を判定する方式は、本発明の特徴ではなく、当業者ならば、その優先度及び一般知識に従って適切な方式を選択することができる。
【００４５】
癌細胞は、一般に正常細胞と比べて異常な増殖を特徴とし、通常は癌状態の個体の中で塊又は腫瘍を形成する。
【００４６】
本明細書で述べる、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損する癌状態には、任意の種類の固形癌又は悪性リンパ腫、特に白血病、肉腫、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、直腸結腸癌、子宮頚癌、肝癌、頭頚部癌、食道癌、膵臓癌、腎癌、胃癌、及び脳腫瘍（cerebral cancer）を含めることができる。一部の実施形態では、癌状態は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌でありうる。癌は、家族性でも散発性でもよい。
【００４７】
個体から採取されるサンプルは、１又は複数の細胞を含む組織サンプル、たとえば、上述のような癌組織、又はたとえば対照として使用するための非癌組織からの生検材料でよい。
【００４８】
本発明の方法は、たとえば治療の作用経過を判定するために、癌状態の個体の評価を行うのに有用な場合もある。癌の個体の評価方法は、
個体から採取した癌細胞が、正常細胞と比べてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復が欠損していることを確認するステップと、
前記個体への投与に適するＢＥＲ経路阻害剤を準備するステップと
を含みうる。
【００４９】
一部の好ましい実施形態では、ＢＥＲ経路阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。ＰＡＲＰ阻害剤については、以下でより詳細に述べる。癌状態の評価方法は、
個体から採取した癌細胞が、正常細胞と比べてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復が欠損していることを確認するステップと、
前記個体への投与に適するＰＡＲＰ阻害剤を準備するステップと
を含みうる。
【００５０】
一部の好ましい実施形態では、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることが確認された癌細胞は、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型でありうる。
【００５１】
個体は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の素因を有する者であってもよい。本発明の方法及び手段は、そのような個体に特に有用である。
【００５２】
個体は、たとえば、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする核酸、たとえば、上述の成分をコードする核酸の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性であるものでよい。
【００５３】
個体における癌の治療方法は、
前記個体にＢＥＲ経路阻害剤を投与するステップを含み、
前記個体は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性であるものとしうる。
【００５４】
ＢＥＲ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用するための医薬の製造の際に使用することができ、また塩基除去修復阻害剤はＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用することができる。
【００５５】
一部の好ましい実施形態では、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性である個体は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性であるものでもよい。
【００５６】
本明細書に記載の方法での使用に適するＢＥＲ阻害剤は、有機小分子、ペプチド、核酸など、ＢＥＲ経路の１又は複数の成分の活性を阻害し、低減し、又は消滅させるどんな化合物又は存在でもよい。
【００５７】
一部の実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、酵素ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性を低減又は消滅させるものでよい。
【００５８】
用語ＰＡＲＰとは、本明細書では、文脈による別段の規定がない限り、ＰＡＲＰ１（ＥＣ２．４．２．３０、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ３２７２１）及び／又はＰＡＲＰ２（Ameら、J. Biol. Chem. (1999) 274 15504-15511、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＡＪ２３６９１２）を指す。
【００５９】
既知のＰＡＲＰ阻害剤であって、本発明に従って用いることができる化合物の例としては以下のものが含まれる。
【００６０】
１．ニコチンアミド類、例えば５−メチルニコチンアミド及びＯ−（２−ヒドロキシ−３−ピペリジノ−プロピル）−３−カルボン酸アミドキシム、並びにその類似体及び誘導体。
【００６１】
２．ベンズアミド類、例えば３−置換ベンズアミド類（３−アミノベンズアミド、３−ヒドロキシベンズアミド、３−ニトロソベンズアミド、３−メトキシベンズアミド及び３−クロロプロカインアミドなど）、４−アミノベンズアミド、１，５−ジ［（３−カルバモイルフェニル）アミノカルボニルオキシ］ペンタン、並びにその類似体及び誘導体。
【００６２】
３．イソキノリノン類及びジヒドロイソキノリノン類、例えば２Ｈ−イソキノリン−１−オン類、３Ｈ−キナゾリン−４−オン類、５−置換ジヒドロイソキノリノン類（５−ヒドロキシジヒドロイソキノリノン、５−メチルジヒドロイソキノリノン及び５−ヒドロキシイソキノリノンなど）、５−アミノイソキノリン−１−オン、５−ジヒドロキシイソキノリノン、３，４ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン類（３，４ジヒドロ−５−メトキシ−イソキノリン−１（２Ｈ）−オン及び３，４ジヒドロ−５−メチル−１（２Ｈ）イソキノリノンなど）、イソキノリン−１（２Ｈ）−オン類、４，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５，１−ｉｊ］キノリン−６−オン類、１，６，−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン類、１，８−ナフタルイミド類（４−アミノ−１，８−ナフタルイミドなど）、イソキノリノン、３，４−ジヒドロ−５−［４−１（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン、２，３−ジヒドロベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１−オン、１−１１ｂ−ジヒドロ−［２Ｈ］ベンゾピラノ［４，３，２−ｄｅ］イソキノリン−３−オン、四環ラクタム類、例えば、ベンズピラノイソキノリノン類（ベンゾピラノ［４，３，２−ｄｅ］イソキノリノンなど）、並びにその類似体及び誘導体。
【００６３】
４．ベンズイミダゾール類及びインドール類、例えばベンゾキサゾール−４−カルボキサミド類、ベンズイミダゾール−４−カルボキサミド類（２−置換ベンゾキサゾール４−カルボキサミド類及び２−置換ベンズイミダゾール４−カルボキサミド類、例えば２−アリールベンズイミダゾール４−カルボキサミド類及び２−シクロアルキルベンズイミダゾール−４−カルボキサミド類など、２−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズイミダゾール４−カルボキサミドを含む）、キノキサリンカルボキサミド類、イミダゾピリジンカルボキサミド類、２−フェニルインドール類、２−置換ベンゾキサゾール（２−フェニルベンゾキサゾール及び２−（３−メトキシフェニル）ベンゾキサゾールなど）、２−置換ベンズイミダゾール類（２−フェニルベンズイミダゾール及び２−（３−メトキシフェニル）ベンズイミダゾール、１，３，４，５テトラヒドロ−アゼピノ［５，４，３−ｃｄ］インドール−６−オンなど）、アゼピノインドール類及びアゼピノインドロン類（１，５ジヒドロ−アゼピノ［４，５，６−ｃｄ］インドリン−６−オン及びジヒドロジアザピノインドリノンなど）、３−置換ジヒドロジアザピノインドリノン類（３−（４−トリフルオロメチルフェニル）−ジヒドロジアザピノインドリノン、テトラヒドロジアザピノインドリノン及び５，６，−ジヒドロイミダゾ［４，５，１−ｊ，ｋ］［１，４］ベンゾジアゾピン−７（４Ｈ）−オンなど）、２−フェニル−５，６−ジヒドロ−イミダゾ［４，５，１−ｊｋ］［１，４］ベンゾジアゼピン−７（４Ｈ）−オン及び２，３，ジヒドロ−イソインドール−１−オン、並びにその類似体及び誘導体。
【００６４】
５．フタラジン−１（２Ｈ）−オン類及びキナゾリノン類、例えば４−ヒドロキシキナゾリン、フタラジノン、５−メトキシ−４−メチル−１（２）フタラジノン類、４−置換フタラジノン類、４−（１−ピペラジニル）−１（２Ｈ）−フタラジノン、四環ベンゾピラノ［４，３，２−ｄｅ］フタラジノン類及び四環インデノ［１，２，３−ｄｅ］フタラジノン類、並びに２−置換キナゾリノン類（８−ヒドロキシ−２−メチルキナゾリン−４−（３Ｈ）オンなど）、三環フタラジノン類及び２−アミノフタルヒドラジド、並びにその類似体及び誘導体。
【００６５】
６．イソインドリノン類、並びにその類似体及び誘導体。
【００６６】
７．フェナントリジン類及びフェナントリジノン類、例えば５［Ｈ］フェナントリジン−６−オン、置換５［Ｈ］フェナントリジン−６−オン類、特に２−，３−置換５［Ｈ］フェナントリジン−６−オン類及び６（５Ｈ）フェナントリジノン類のスルホンアミド／カルバミド誘導体、チエノ［２，３−ｃ］イソキノロン類（例えば９−アミノチエノ［２，３−ｃ］イソキノロン及び９−ヒドロキシチエノ［２，３−ｃ］イソキノロン、９−メトキシチエノ［２，３−ｃ］イソキノロンなど）、Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロフェナントリジン−２−イル］−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ｝アセトアミド、置換４，９−ジヒドロシクロペンタ［ｌｍｎ］フェナントリジン−５−オン類、並びにその類似体及び誘導体。
【００６７】
８．ベンゾピロン類、例えば１，２−ベンゾピロン、６−ニトロソベンゾピロン、６−ニトロソ１，２−ベンゾピロン、及び５−ヨード−６−アミノベンゾピロン、並びにその類似体及び誘導体。
【００６８】
９．不飽和ヒドロキシム酸誘導体、例えばＯ−（３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）ニコチン酸アミドキシム、並びにその類似体及び誘導体。
【００６９】
１０．ピリダジン類、例えば縮合ピリダジン類、並びにその類似体及び誘導体。
【００７０】
１１．他の化合物、例えばカフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにその類似体及び誘導体。
【００７１】
さらなるＰＡＲＰ阻害剤は、例えば米国特許第６，６３５，６４２号、米国特許第５，５８７，３８４号、ＷＯ２００３０８０５８１号、ＷＯ２００３０７０７０７号、ＷＯ２００３０５５８６５号、ＷＯ２００３０５７１４５号、ＷＯ２００３０５１８７９号、米国特許第６５１４９８３号、ＷＯ２００３００７９５９号、米国特許第６４２６４１５号、ＷＯ２００３００７９５９号、ＷＯ２００２０９４７９０号、ＷＯ２００２０６８４０７号、米国特許第６４７６０４８号、ＷＯ２００１０９００７７号、ＷＯ２００１０８５６８７号、ＷＯ２００１０８５６８６号、ＷＯ２００１０７９１８４号、ＷＯ２００１０５７０３８号、ＷＯ２００１０２３３９０号、ＷＯ２００１０２１６１５号、ＷＯ２００１０１６１３６号、ＷＯ２００１０１２１９９号、ＷＯ９５２４３７９号、Banasik et al. J. Biol. Chem., 267:3, 1569-75 (1992)、Banasik et al. Molec. Cell. Biochem. 138:185-97 (1994))、Cosi (2002) Expert Opin. Ther. Patents 12 (7)、及びSouthan & Szabo (2003) Curr Med Chem 10 321-340並びにこれに引用されている参照文献に記載されている。
【００７２】
好適なＰＡＲＰ阻害剤の好ましいクラスの１としては、フタラジノン類、例えばＷＯ０２／３６５７６号に記載されているような１（２Ｈ）−フタラジノン及びその誘導体が挙げられる。特に、下記式：
【化１】
【００７３】
の化合物、並びにその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態及びプロドラッグをＰＡＲＰの阻害に用いることができる。上記式中、
Ａ及びＢは一緒に、任意により置換されていてもよい縮合芳香環を表し、
ＲＣは−Ｌ−ＲＬにより表され、該式中、Ｌは下記式：
−（ＣＨ２）ｎ１−Ｑｎ２−（ＣＨ２）ｎ３−
〔式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３はそれぞれ０、１、２及び３から選択され、ｎ１、ｎ２及びｎ３の合計は１、２又は３であり、ＱはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）又は−ＣＲ１Ｒ２−から選択され、ここでＲ１及びＲ２は、独立して水素、ハロゲン又は任意により置換されていてもよいＣ１−７アルキルから選択されるか、あるいはそれらが結合する炭素原子と一緒に、飽和（Ｃ３−７シクロアルキル基）又は不飽和（Ｃ３−７シクロアルケニル基）であってよいＣ３−７環状アルキル基を形成するか、あるいはＲ１及びＲ２の一方がＲＬにおける原子と結合して、Ｒ１及びＲ２がＱ、−（ＣＨ２）ｎ３−（存在する場合）及びＲＬの一部に結合する炭素原子を含む不飽和Ｃ３−７シクロアルケニル基を形成する〕
であり、
ＲＬは任意により置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、
ＲＮは、水素、任意により置換されていてもよいＣ１−７アルキル、Ｃ３−２０複素環、並びにＣ５−２０アリール、ヒドロキシ、エーテル、ニトロ、アミノ、アミド、チオール、チオエーテル、スルホキシド及びスルホンから選択される。
【００７４】
好ましくは、下記式：
【化２】
【００７５】
の化合物、又はその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態若しくはプロドラッグをＰＡＲＰの阻害に用いることができ、上記式中、
Ａ及びＢは一緒に、任意により置換されていてもよい縮合芳香環を表し、
ＲＣは−ＣＨ２−ＲＬであり、
ＲＬは任意により置換されていてもよいフェニルであり、
ＲＮは水素である。
【００７６】
いくつかの好ましい実施形態において、図２に示されるＫＵ−００５８６８４又はＫＵ−００５８９４８の構造を有する化合物、又はその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態若しくはプロドラッグをＰＡＲＰの阻害に用いることができる。
【００７７】
好適なＰＡＲＰ阻害剤は、市販のものであってもよいし、あるいは公知の出発物質から公知の方法によって合成してもよい（例えば、Suto et al. Anticancer Drug Des. 6:107-17 (1991)参照）。
【００７８】
塩基除去修復阻害剤の別のクラスとしては、ＢＥＲ経路の成分のペプチド断片が挙げられる。例えば、ＰＡＲＰ配列のペプチド断片を用いてＰＡＲＰを阻害し、それによりＢＥＲ経路の活性を低減する又は無効にすることができる。ペプチド断片は、上記成分の公開されている配列、例えば公開されているＰＡＲＰ配列（アクセッション番号ＮＭ＿００１６１８）を用いて、化学合成によりその全体を又は一部を生成することができる。ペプチド断片は、その方法の概要が広く入手可能である（例えば、J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)；M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)；Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California）十分に確立されている標準的な液体ペプチド合成法（又は好ましくは固相ペプチド合成法）に従って容易に調製することができ、あるいは溶液中で、液相法により、又は固相、液相及び液体化学の任意の組み合わせにより、例えば最初に別々のペプチド部分を合成し、続いて所望又は適当であれば、存在する保護基を除去し、個々の炭酸若しくはスルホン酸又はそのそれぞれの誘導体の反応によって残基Ｘを導入することによって、調製することも可能である。
【００７９】
ＢＥＲ経路の成分（ＰＡＲＰなど）を阻害するための他の候補化合物は、その成分の３次元構造のモデル化に基づいて、合理的薬物設計法を用いることによって、特定の分子形状、サイズ及び電荷特性を有する候補化合物を得ることが可能である。候補阻害剤は、例えば、上記成分を阻害するペプチド断片又は他の化合物の「機能的類似体」でありうる。機能的類似体は、対象のペプチド又は他の化合物と同じ機能的活性を有する、すなわち、ＤＮＡ修復経路成分の相互作用又は活性を妨害可能なものである。そのような類似体の例としては、上記成分の別の成分との接触領域（特に重要と考えられるアミノ酸残基の配置）の３次元構造と類似するようにモデル化された化学化合物が挙げられる。
【００８０】
好適なＢＥＲ経路阻害剤の別のクラスとしては、ＢＥＲ経路の成分、例えばＰＡＲＰ（アクセッション番号ＮＭ＿００１６１８）のアミノ酸配列の一部若しくは全体をコードする核酸、又はその相補配列であって、活性ポリペプチドの産生をダウンレギュレートすることにより活性又は機能を阻害するものが挙げられる。
【００８１】
例えば、ＰＡＲＰ活性の阻害は、慣用的な方法、例えばドットブロット（Affar EB et al Anal Biochem. 1998;259(2):280-3）、及びＰＡＲＰがポリＡＤＰ−リボース鎖を形成する活性を直接測定するＢＥＲアッセイ（例えばトリチウム化基質ＮＡＤによる放射性アッセイ、又はＰＡＲＰ活性によって形成されるポリマー鎖に対する特異的抗体を用いて測定する）（K.J. Dillon et al, Journal of Biomolecular Screening, 8(3): 347-352 (2003)）を用いて測定することができる。
【００８２】
例えば、ＢＥＲ経路成分の発現は、アンチセンス又はＲＮＡｉ技術を用いて阻害することができる。これらの遺伝子発現をダウンレギュレートする手法の使用は、現在、当技術分野で十分に確立されている。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、プレ−ｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡの相補配列にハイブリダイズして塩基除去修復経路成分の産生を妨害して、その発現が低減するか又は完全に若しくは実質的に完全に抑止されるように設計される。コード配列の標的化に加えて、アンチセンス技術は、遺伝子の制御配列、例えば５’フランキング配列内を標的化するために用いてもよく、それによりアンチセンスオリゴヌクレオチドは発現制御配列を妨害しうる。アンチセンス配列の構築とそれらの使用は、例えばPeyman and Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990)及びCrooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:329-376, (1992)に記載されている。
【００８４】
オリゴヌクレオチドは、投与のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで生成してもよいし又はｅｘｖｉｖｏで生成してもよく、あるいはアンチセンスＲＮＡをダウンレギュレーションが望まれる細胞内でｉｎ ｖｉｖｏで生成させてもよい。従って、二本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡのアンチセンス鎖の転写によって、標的遺伝子のセンス鎖から転写される正常ｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡが生じるように、プロモーターの制御下に「逆配向」に配置することができる。相補的なアンチセンスＲＮＡ配列は、続いてｍＲＮＡと結合して二本鎖を形成し、それが標的遺伝子からタンパク質への内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられる。これが実際の作用機構であるか否かは依然として不明確である。しかしながら、この技術が機能するという事実は確立されている。
【００８５】
逆配向のコード配列に対応する完全な配列を用いる必要はない。例えば、十分な長さの断片を用いることができる。当業者には、アンチセンス阻害のレベルを最適化するように遺伝子のコード配列又はフランキング配列の種々のサイズ及び種々の部分に由来する断片からスクリーニングすることが慣用的である。開始メチオニンコドンＡＴＧを、おそらく開始コドンの１又はそれ以上のヌクレオチドの上流に含有させることが有利でありうる。好適な断片は、約１４〜２３ヌクレオチド、例えば約１５、１６又は１７ヌクレオチドを有しうる。
【００８６】
アンチセンス法の代替として、センス（すなわち標的遺伝子と同じ）配向に挿入された標的遺伝子の全体又は一部のコピーを用いて、共抑制により標的遺伝子の発現を低減させることができる（Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16,12:3675-3684; 及びVoinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: p 553）。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、センス又はアンチセンス鎖単独のいずれよりも遺伝子サイレンシングにおいてさらに有効であることが見出されている（Fire A. et al Nature 391, (1998)）。ｄｓＲＮＡにより媒介されるサイレンシングは、遺伝子特異的であり、ＲＮＡインターフェアランス（ＲＮＡｉ）と呼ばれることが多い。
【００８７】
ＲＮＡインターフェアランスは、２段階のプロセスである。第１に、ｄｓＲＮＡが細胞内で切断されて、５’末端リン酸と３’の短い突出部（約２塩基）を有する約２１〜２３塩基長の小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が生じる。そのｓｉＲＮＡは、破壊のために特異的に対応のｍＲＮＡ配列に標的化する（Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001)）。
【００８８】
ＲＮＡｉはまた、３’突出末端を有する同じ構造の化学合成されたｓｉＲＮＡ二本鎖を用いることによって効率的に誘導されうる（Zamore PD et al Cell, 101, 25-33, (2000)）。合成ｓｉＲＮＡ二本鎖は、広範な哺乳動物細胞系における内因性及び異種遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている（Elbashir SM. et al. Nature, 411, 494-498, (2001)）。
【００８９】
他の可能性としては、転写時に、核酸を特異的部位で切断し、それゆえ遺伝子発現に影響を及ぼすのにも有効なリボザイムを生成する核酸を用いることがある。リボザイムの技術背景の参考文献としては、Kashani-Sabet and Scanlon, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(3): 213-223、及びMercola and Cohen, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(1), 47-59が挙げられる。
【００９０】
本発明の方法は、ＢＥＲ阻害剤、例えばＰＡＲＰ阻害剤を個体に投与することを含みうる。これは、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌状態を有する個体を同定した後に行いうる。
【００９１】
該活性化合物を単独で投与することは可能ではあるが、その化合物を、上記で定義した活性化合物の少なくとも１種を、１種以上の製薬上許容される担体、佐剤、賦形剤、希釈剤、充填剤、バッファー、安定化剤、保存剤、滑沢剤、又はその他の当業者に周知の物質、及び任意で他の治療薬又は予防薬と共に含む医薬組成物（例えば、製剤）として提示することが好ましい。
【００９２】
上述の塩基除去修復阻害剤、例えば１種以上の本明細書に記載の製薬上許容される担体、賦形剤、バッファー、佐剤、安定化剤又は他の物質と共に混合された阻害剤を含む医薬組成物を、本明細書に記載の方法において用いることができる。
【００９３】
本明細書で用いる「製薬上許容される」という用語は、化合物、物質、組成物、及び／又は投与剤形であって、健全な医学的判断で認めうる範囲内にあり、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症をもたらさず被験体（例えばヒト）の組織との接触のための使用に適しており、妥当な利益／危険性比を示すものであることを意味する。担体、賦形剤などの各々はまた、製剤中の他の成分と適合しうるという意味でも「許容される」ものでなければならない。
【００９４】
適切な担体、賦形剤などについては、標準的な製薬の教科書、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1990中に記載されている。
【００９５】
該製剤は単位投与剤形で都合よく提供することができ、製薬業界で周知のいずれかの方法によって調製することができる。そのような方法は、該活性化合物を１種以上の補助成分からなる担体と会合させるステップを含む。一般的には、該製剤は、該活性化合物を液状担体若しくは微粉化した固体担体、又はその双方と均一に十分に会合させ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００９６】
製剤は、液剤、溶剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、シロップ剤、錠剤、ロゼンジ、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、アンプル剤、坐剤、ペッサリー、軟膏、ゲル剤、ペースト、クリーム、噴霧剤、ミスト、フォーム、ローション、オイル、ボーラス剤、舐剤、又はエアロゾルの形態とすることができる。
【００９７】
ＢＥＲ阻害剤又は該阻害剤を含む医薬組成物は、任意の都合のよい投与経路により被験体に投与することができる。投与経路は、全身／末梢に、又は所望の作用部位に対してであるかどうかにかかわらず、例えば限定されるものではないが、経口（例えば摂取により）、局所（例えば経皮、鼻腔内、眼内、口腔内及び舌下）、経肺（例えば、例としてエアロゾルを用いて、例として口若しくは鼻から、吸入若しくは吸送療法により）、直腸内、経膣内、非経口、例えば注射（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心腔内、くも膜下腔内、髄腔内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、及び胸骨内、デポーの移植により（例えば皮下又は筋肉内）が挙げられる。
【００９８】
経口投与（例えば摂取により）に適した製剤は、別個の単位として提供することができ、それは例えば、カプセル、カシェ剤、若しくは錠剤で、各々が定量の該活性化合物を含有しているもの；粉末剤又は顆粒剤；水性若しくは非水性液体中の溶剤若しくは懸濁剤；又は水中油型乳剤若しくは油中水型乳剤；ボーラス剤；舐剤；又はペーストなどである。
【００９９】
錠剤は、例えば圧縮又は成形などの従来法で任意で１種以上の補助成分と共に作製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械中で、粉末や顆粒などの自由流動体とした該活性化合物を圧縮する、任意で１種以上の結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、トラガカント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤若しくは希釈剤（例えば、乳糖、微晶質セルロース、リン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）；崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）；界面活性剤又は分散剤又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）；及び保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸）と混合して圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性の液状希釈剤で湿潤化した粉末の化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって作製することができる。錠剤は任意でコーティング又は切れ目を入れることができ、また、錠剤に含まれる該活性化合物の遅延放出若しくは制御放出が行われるように、例えば、所望の放出プロフィールを得るためにヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で用いることによって製剤化することができる。錠剤は任意で腸溶性コーティングを施したものとすることができ、胃ではなく腸の一部で放出するようにすることができる。
【０１００】
非経口投与（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内注射を含む注射）に適した製剤としては、さらに、抗酸化剤、バッファー、保存剤、安定化剤、静菌剤、及び該製剤を、意図しているレシピエントの血液と等張とする溶質などを含んでいてよい、水性及び非水性の等張で発熱性物質不含の無菌の注射用液体；並びに、懸濁剤及び増粘剤を含んでいてよい、水性及び非水性無菌懸濁液；並びに該化合物が血液成分若しくは１以上の器官に標的化されるよう設計されているリポソーム又はその他の微粒子系、が挙げられる。このような製剤中に用いられる適切な等張のビヒクルの例としては、注射用塩化ナトリウム水溶液、リンゲル液、又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。典型的には、その液体中の活性化合物の濃度は約１ｎｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬである。該製剤は単位投与量又は多数回投与量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアルに入れた形で提供することができ、無菌の液状担体、例えば注射用水を使用直前に添加することのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）された条件で保存することができる。即時使用の注射用溶液及び懸濁液は無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。製剤はリポソーム又はその他の微粒子系の形態とすることができ、それらは該活性化合物が血液成分若しくは１以上の器官に標的化されるよう設計されている。
【０１０１】
当業者であれば、該活性化合物、及び該活性化合物を含む組成物の適切な投与量は、患者毎に異なることが理解されよう。最適な投与量の決定は、通常は本発明の治療の治療上の有益性のレベルと有害な副作用の危険性とのバランスを取ることを必要とする。選択された投与量のレベルは様々な因子によって変わり、そのような因子としては、限定されるものではないが、その特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、該化合物の排泄速度、治療期間、組み合わせて用いられるその他の薬剤、化合物、及び／又は物質、並びに患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、及び病歴が挙げられる。一般的には投与量は作用部位で有害な副作用を実質的に起こすことなく所望の効果を達成できるような局所濃度が選択されるが、化合物の量と投与経路は究極的には医師の裁量で決定されることとなる。
【０１０２】
ＢＥＲ経路阻害剤を含む組成物は、癌細胞ＤＮＡに損傷を与える標準的な化学療法と組み合わせて本明細書に記載の方法で用いることができる。好適な薬剤としては、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ活性の阻害剤（カムプトテシンなど）、イリノテカン、トポテカン及びルビテカンなどの薬剤、アルキル化剤（テモゾロミド及びＤＴＩＣ（ダカルバジン）など）、並びに白金薬剤（シスプラチン、シスプラチン−ドキソルビシン−シクロホスファミド、カルボプラチン及びカルボプラチン−パクリタキセルなど）が挙げられる。
【０１０３】
他の好適な化学療法剤としては、ドキソルビシン−シクロホスファミド、カペシタビン、シクロホスファミド−メトトレキセート−５−フルオロウラシル、ドセタキセル、５−フロウラシル−エピルビシン−シクロホスファミド、パクリタキセル、ビノレルビン、エトポシド、ＰＥＧ付加リポソームドキソルビシン、及びトポテカンが挙げられる。
【０１０４】
かかる薬剤を用いた個体の処置は当技術分野で周知である。
【０１０５】
ｉｎ ｖｉｖｏの投与は１回の投与で、持続的投与で、又は治療の全期間にわたって間欠的に（例えば、適切な間隔をおいて分割した投与量で）行うことができる。最も効果的な投与方法と投与量を決定するための方法は当業者にはよく知られており、治療に用いる製剤、治療の目的、治療しようとする標的の細胞、及び治療しようとする被験体によって異なる。単回又は複数回の投与は治療担当医師によって選択された投与量及び投与パターンで行うことができる。
【０１０６】
通常は、該活性化合物の適切な投与量は、被験体の体重１ｋｇあたり１日に約１００μｇから約２５０ｍｇの範囲である。該活性化合物が塩、エステル、プロドラッグなどである場合には、投与量は親化合物に基づいて計算され、用いられる実際の重量は相応に増加する。
【０１０７】
本発明の方法はまた、個体における癌状態の調査及び評価において有用でありうる。
【０１０８】
癌状態におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性を評価する方法は、
塩基除去修復阻害剤を上記状態を有する個体から採取した癌細胞サンプルと接触させるステップ、及び
対照サンプルと比較して上記サンプル中の細胞死の量を測定するステップ
を含みうる。
【０１０９】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性のレベルが正常な対照細胞と比較して上記サンプル中の細胞死が増大していることは、上記癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損することを示す。
【０１１０】
個体は、癌状態を有しているものであり、サンプルは、癌細胞サンプル、例えば腫瘍生検に由来するものでありうる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、塩基除去修復阻害剤はＰＡＲＰ阻害剤である。従って、癌状態におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を評価する方法は、
ＰＡＲＰ阻害剤を癌状態を有する個体から採取した癌細胞サンプルと接触させるステップ、及び
対照サンプルと比較して上記サンプル中の細胞死の量を測定するステップ
を含みうる。
【０１１２】
対照細胞と比較して上記サンプルの細胞におけるＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性が増大していることは、上記癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を欠損することを示す。
【０１１３】
ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性の増大は、癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損表現型、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ１発現又は活性の低減又は消失を有することを示しうる。
【０１１４】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を欠損すると同定された癌状態、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損表現型を有する状態は、そのような状態を特異的に対象とする治療に供することができる。好適な治療としては、ＤＮＡ架橋剤、例えばマイトマイシンＣ、シスプラチン又はカルボプラチンなどの使用が挙げられる。
【０１１５】
上記方法を用いて、ＨＲを標的とする治療、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損表現型を有する癌に特異的な治療に対する、個体の癌状態の応答を予測しうる。
【０１１６】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌を標的とする治療に対する、個体の癌状態の応答の予測方法は、
ＢＥＲ阻害剤、例えばＰＡＲＰ阻害剤を、癌状態を有する個体から採取した癌細胞サンプルと接触させるステップ、及び
対照サンプルと比較して上記サンプル中の細胞死の量を測定するステップ
を含みうる。
【０１１７】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性のレベルが正常な対照細胞と比較して上記サンプル中の細胞死が増大していること（ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性の増大）は、上記癌が上記治療に対して応答性であることを示す。
【０１１８】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損癌を標的とする治療としては、例えばＤＮＡ架橋剤（マイトマイシンＣ、シスプラチン又はカルボプラチンなど）が挙げられる。
【０１１９】
本発明の他の態様は、塩基除去修復を欠損する癌の治療における、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の阻害剤の使用に関する。
【０１２０】
個体における塩基除去修復を欠損する癌の治療方法は、
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路阻害剤を上記個体に投与するステップ
を含みうる。
【０１２１】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路阻害剤は、個体における塩基除去修復を欠損する癌の治療において使用するための医薬の製造において用いることができる。
【０１２２】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の阻害剤は、上述した１又はそれ以上の経路成分の阻害剤を含みうる。好適な阻害剤としては、ＡＴＭ阻害剤が挙げられる。
【０１２３】
ＡＴＭ阻害剤は、例えば式Ｉ：
【化３】
【０１２４】
〔式中、
ＹはＯ又はＳのいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、水素、任意により置換されていてもよいＣ１−７アルキル基、Ｃ３−２０複素環基、又はＣ５−２０アリール基であるか、あるいはそれらが結合する窒素原子と共に、４〜８個の環原子を有し任意により置換されていてもよい複素環を形成してもよく、
Ｒ３は、任意により置換されていてもよいＣ５−２０カルボアリール基とエーテル架橋若しくはチオエーテル架橋により結合したフェニル基；フェニル基；及びさらなる架橋基により任意に連結されていてもよい、任意により置換されていてもよいＣ５−２０カルボアリール基（両方の基上のエーテル架橋若しくはチオエーテル架橋に隣接して結合して、フェニル基及びＣ５−２０カルボアリール基の両方と縮合した任意により置換されていてもよいＣ５−７酸素若しくは硫黄含有複素環を形成する）；さらに任意により置換されていてもよいフェニル基〕
の化合物、又はその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態若しくはプロドラッグでありうる。
【０１２５】
かかる阻害剤は、ＷＯ０３／０７０７２６号にさらに詳細に記載されている。
【０１２６】
他の阻害剤としては、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の成分のペプチジル断片であり、上述の核酸をコードするものが挙げられる。
【０１２７】
癌状態は、上述の方法を使用してＢＥＲ活性を欠損することが確認されたものでよい。
【０１２８】
ここからは、本発明の態様を、限定するものではなく例として、以下で述べる添付の図面及び実験による実例に即して説明する。当業者には、別の態様及び実施形態が明らかとなろう。
【０１２９】
本発明の様々なパラメーター及び特徴は先に述べている。疑いを回避するために、それらのパラメーター及び特徴のすべての組合せ及び副次的な組合せが本発明に含まれることを述べておく。
【０１３０】
本明細書で言及するすべての文書は、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１３１】
材料及び方法
ＲＮＡ干渉
次のＲＮＡｉ標的配列、すなわち、（ｉ）マウスParp1 5'-GCGGAGUACGCCAAGUCCA-3'、（ｉｉ）スクランブル対照5'-CAUGCCUGAUCCGCUAGUC-3'を発現させる遺伝子特異的なｐＳＵＰＥＲ（T. R. Brummelkampら、Science 296, 550-3 (2002)）構築物を作製した。
【０１３２】
ＣＭＶ ＩＥプロモーター及びｅＣＦＰ（強化型シアン蛍光タンパク質）を含む１．６ｋｂの断片を、ｐＥＣＦＰ−Ｍｉｔｏ（Invitrogen）から、得られたｐＳＵＰＥＲ構築物のＳａｐＩ部位にサブクローニングし、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１及びｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを作製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）を製造者の使用説明書に従って使用しながら、Ｄ３ ＥＳ細胞にこれらのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトしてから４８時間後、２０ｍＭトリスｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、及びプロテアーゼ阻害剤からなる緩衝液を使用して、全体の細胞溶解物を作製した。各溶解物３０μｇをＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｐｒｅ Ｃａｓｔ Ｇｅｌｓ（Novex）上で電気泳動にかけ、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Biorad）上にブロットした。ウサギポリクローナル抗ＰＡＲＰ−１抗体（Cell Signalling、カタログ番号9542）又はウサギ抗ＧＦＰ／ＣＦＰ抗血清（Invitrogen、カタログ番号R970-01）を用いてブロットを検出した後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰとの２回目のハイブリダイゼーションを行い、その後ＥＣＬ（商標）（英国Amersham）を使用して化学発光を検出した。
【０１３３】
ＰＡＲＰの小分子阻害剤：
ＰＡＲＰ阻害剤をＷＯ０２／３６５７６号に記載のとおりに合成した。化学阻害剤は、ＤＭＳＯに１０ｍＭで溶解させ、−２０℃の暗所で保管した。
【０１３４】
細胞系
ＶＣ８細胞及びマウスＢｒｃａ２ ＢＡＣを補完した誘導体は、M. Kraakman-van der Zwetら、Mol Cell Biol 22, 669-79 (2002)に記載されているとおりのものとした。Ｂｒｃａ２機能を欠損するＥＳ細胞は、以前から記載されている（Tuttら、(2002) EMBO Rep 3, 255-60）。Ｂｒｃａ１を欠損するＥＳ細胞の構築は、以前から確認されているが（Forayら、(2003) Embo J 22 2860-71)、他でも記載があるであろう。ＨＢＬ１００細胞にｐＳＵＰＥＲ ＢＲＣＡ１ ＲＮＡｉプラスミドをトランスフェクトし、ジェネテシンを用いて３週間かけて選択した。ノーザンブロットによって分析してＢＲＣＡ１が発現されているかどうかを基準にクローンを選択した。
【０１３５】
クローン原性アッセイ
Ｐａｒｐ１ ＲＮＡノックダウンに対する感受性を測定するために、０．１％ゼラチンでコートした組織培養皿で維持したＥＳ細胞に、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１又はｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを、抗生物質ブラストサイジン（ｐＥＦ−Ｂｓｄ、Invitrogen）への耐性を示すベクターと共に先のようにトランスフェクトした。トランスフェクトしてから２４時間後、細胞をトリプシン処理し、６ウェルプレートに播いた。トランスフェクトしてから４８時間後、ブラストサイジンでの処理を開始し、細胞に３日毎に与え直した。１０〜１４日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。細胞を約５０個より多くを含むコロニーをカウントした。
【０１３６】
化学阻害剤に対する感受性を測定するために、指数関数的に増殖させた細胞培養物をトリプシン処理し、様々な密度で６ウェルプレートのマイトマイシンＣ不活性化マウス胚性線維芽細胞上に播き、適切な場合では、１８時間後に阻害剤で処理した。連続的暴露のために、細胞に新鮮な培地及び阻害剤を４日毎に与え直した。定期的に暴露するために、阻害剤を指定の期間にわたって加え、次いで細胞を洗浄し、新鮮な培地を与え直した。１０〜１４日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。細胞を約５０個より多くを含むコロニーをカウントした。実験は、少なくとも３回３連で実施した。
【０１３７】
ＦＡＣＳ分析
ＤＮＡ含有量の測定では、細胞を７０％のエタノールで固定し、ＲｎアーゼＡ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共にインキュベートし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）によって分析した。ホスホ−ヒストンＨ３分析では、細胞を７０％エタノールで固定し、０．２５％トリトンＸ−１００で透過性にし、抗ホスホ−ヒストンＨ３抗体（Upstate Biotechnology）と共に３時間、次いでＦＩＴＣ−抗ウサギＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共に３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ分析のための処理は先のとおりである。
【０１３８】
アポトーシス分析
細胞をトリプシン処理し、培養上清及び培地洗浄物を保持した。これらをプールし、細胞を冷ＰＢＳ−Ａで洗浄した後、結合用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ７．４））に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。１００μｌの懸濁液を暗所で５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（BD Biosciences）／０．１μｇのヨウ化プロピジウムと共に１５分間室温でインキュベートし、４００μｌの結合用緩衝液を加え、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）によって直ちに分析した。
【０１３９】
Ｒａｄ５１焦点の形成
ＥＳ細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した様々な濃度のＰＡＲＰ阻害剤中で４８時間培養し、ＰＢＳ中０．２％トリトンＸ１００で透過性にした。細胞を、ウサギ抗Ｒａｄ５１ポリクローナル抗体（Ａｂ５５１９２２、BD-Pharmingen、英国オックスフォード）の１００倍希釈物で染色した。洗浄した後、一次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Alexa）で可視化し、核をＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物（Molecular Probes）で可視化した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用してＲａｄ５１焦点を視覚化し、定量した。
【０１４０】
コメットアッセイ
ＶＣ８細胞及びＶＣ８−ＢＡＣ細胞をプレートに播いてから２４時間後に、１μＭ ＫＵ００５８６８４で３０時間処理した。それ以降の作業はすべて暗所で実施した。記載されているとおり（Lemay及びWood, 1999）、細胞をＰＢＳで洗浄摩砕してからコメット分析を行った。ＬＭＰアガロース（ＰＢＳ中０．５％）に懸濁させた細胞を、コメットスライド（Trevigen、米国ゲーサーズバーグ）上に広げ、固まるまで４℃に置いておいてから、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス塩基、１％ラウリルサルコシン酸ナトリウム、０．０１％トリトンＸ−１００中で４５分間可溶化した。スライドを５分間かけてＴＢＥにトランスファーしてから、１８Ｖで１５分間の電気泳動にかけた。次いで、スライドを１００％エタノールで５分間かけて固定し、風乾した後、ＳＹＢＲグリーン色素を加え、フルオレセインフィルター（Nikon）を使用して落射蛍光によって可視化した。Ｎｉｋｏｎを供給元とするＬｕｃｉａ Ｇ画像処理パッケージのコメットソフトウェアモジュールを使用してコメットを分析した。３回の独立した実験それぞれについてデータ点あたり５０コメットを調べ、平均テールモーメントを算出した。
【０１４１】
有糸分裂染色体分析
ＥＳ細胞をゼラチン上に播き、２４時間かけて化学阻害剤で処理した後、１時間コルセミド処理した。細胞を収集し、固定し、スライドに滴下し、乾燥させ、ＤＡＰＩで染色した後、顕微鏡で染色体を分析した。
【０１４２】
ＥＳ細胞の異種移植片及びＫＵ００５８６８４による処置
ＥＳ細胞由来の腫瘍（奇形腫）は、２×１０８個のＥＳ細胞を６〜８週齢の胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスに皮下注射して生成した。２０匹のマウスにＢｒｃａ２を欠損するＥＳ細胞を注射し、同等の集団に同質遺伝子野生型細胞を注射した。細胞を注射してから２日後、ＫＵ００５８６８４又はビヒクルでの処置を開始した。３日間続けて、２回分のＫＵ００５８６８４（又はビヒクル）をそれぞれ動物１ｋｇあたり１５ｍｇの投与量で６時間の間隔をおいて腹腔内投与した。次いでこの処置を５日間休止し、次いでさらに３日続けて（前のように）再開した。腫瘍の増殖を最低０．３ｃｍ３の体積からモニターした。図１６のデータは、合計４０匹を使用する２件の別個の実験を表すものである。
【０１４３】
ＢＲＣＡ１細胞欠損系統の生成
ＭＣＦ７スクランブル細胞系及びＭＣＦ７−３．２３細胞系は、ＭＣＦ７乳腺癌細胞に遺伝子特異的なｐＳＵＰＥＲ構築物を安定にトランスフェクトして作製した。次のＲＮＡｉ標的配列、すなわち、（ｉ）ヒトＢＲＣＡ１ 5'-GGAACCTGTCTCCACAAAG-3'、（ｉｉ）スクランブル対照5'-CATGCCTGATCCGCTAGTC-3'を発現させる遺伝子特異的なｐＳＵＰＥＲ構築物を作製した。ヒトＥＦ１ａプロモーター及びブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｄ）を含む１．８ｋｂ断片を、ｐＥＦＢｓｄ（Invitrogen）から、得られたｐＳＵＰＥＲ構築物のＳａｐＩ部位にサブクローニングし、ｐＳＵＰＥＲ−Ｂｓｄ−ＢＲＣＡ１及びｐＳＵＰＥＲ−Ｂｓｄ−ｓｃｒａｍｂｌｅｄを作製した。ＦｕＧｅｎｅ６（Roche）を製造者の使用説明書に従って使用しながら、ＭＣＦ７細胞にこれらのプラスミドをトランスフェクトした。ブラストサイジン中で選択した後、耐性クローンをリアルタイムＰＣＲによって、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡのサイレンシングについて評価した（Egawaら、Oncology. 2001; 61(4): 293-8、Egawaら、Int J Cancer. 2001年7月;95(4):255-9）。ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡのレベルが低下しているクローンを（ブラストサイジン選択を行いながら）８継代にわたって培養し、リアルタイムアッセイを繰り返した。細胞系ＭＣＦ７−３．２３は、構築物ｐＳＵＰＥＲ−Ｂｓｄ−ｓｃｒａｍｂｌｅｄを有するＭＣＦ７クローンの３０％しかＢＲＣＡ１を発現しないことが示された。
【０１４４】
結果
ｓｉＲＮＡによるＰａｒｐ１タンパク質レベルの低下
Ｈ１プロモーター（T. R. Brummelkampら、Science 296, 550-3 (2002)）の制御下でＰａｒｐ１特異的なｓｉＲＮＡを発現させ、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下で強化型シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）を発現させるプラスミド（ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１）を、Ｄ３マウス胚幹細胞にトランスフェクトした。対照として、無関係のスクランブルｓｉＲＮＡを発現させるプラスミドｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを別途トランスフェクトした。トランスフェクトしてから４８時間後、細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロッティングによって分析した。ブロットをポリクローナル抗ＰＡＲＰ−１抗体又は抗ＧＦＰ／ＣＦＰ抗血清で検出した。
【０１４５】
ＰＡＲＰ１特異的ｓｉＲＮＡ発現細胞中のＰＡＲＰ１レベルは、対照細胞中のＰＡＲＰ１レベルよりもはるかに低いことが認められた。ｅＣＦＰのレベルは、Ｐａｒｐ１ ｓｉＲＮＡ発現細胞中でも対照細胞中でも同様であった。
【０１４６】
Ｐａｒｐ１特異的ｓｉＲＮＡによるノックダウン後のＢＲＣＡ１欠損及びＢＲＣＡ２欠損細胞の生存度の低下
野生型、Ｂｒｃａ１−／−、及びＢｒｃａ２−／−のマウス胚幹（ＥＳ）細胞に、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１又はｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを１０：１の比でブラストサイジン耐性をコードするプラスミドｐＥＦ−Ｂｓｄと共にトランスフェクトした。ブラストサイジン耐性クローンを選択し、定量した。結果は、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌトランスフェクト後のコロニー数に対するｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１トランスフェクト後のコロニー数をプロットした図１に示す。エラーバーは、平均周辺の一標準偏差に等しい。
【０１４７】
対照ｓｉＲＮＡを使用してトランスフェクション効率について補正を行った後、Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損のどちらのＥＳ細胞の生存度も、Ｐａｒｐ１の発現が阻害されたときかなり低下したことは明らかであった。
【０１４８】
化学ＰＡＲＰ阻害剤処理後のＢＲＣＡ１欠損及びＢＲＣＡ２欠損細胞の生存度の低下
Ｐａｒｐ活性の化学阻害剤を使用して、先に認められたＢｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞の選択的な阻害を確認した。２種の異なるＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５８９４８と、活性は弱いが化学的に同類の化合物ＫＵ００５１５２９を使用した（図２）。これらの新規なＰＡＲＰ阻害剤は、フタラジン−１−オンのコアを中核とし、ＰＡＲＰ基質ＮＡＤ＋の競合的阻害剤である。ＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５８９４８は、タンパク質ＰＡＲＰ−１及びＰＡＲＰ−２のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ活性の強力かつ特異的な阻害剤であり、１μＭまでの濃度ではヴォールトＰＡＲＰ、タンキラーゼ、又はＰＡＲＰ−３を阻害しない。逆に、ＫＵ００５１５２９は、化学的に同類であるにもかかわらず、これらの酵素の阻害では約２５０分の１の効果しかもたない。
【０１４９】
ＫＵ００５８６８４、ＫＵ００５８９４８、及びＫＵ００５１５２９を使用して、Ｂｒｃａ１又はＢｒｃａ２を欠損する細胞の、ＰＡＲＰ活性の阻害に対する感受性を調べた。クローン原性アッセイでは、Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損のどちらの細胞系も、この点を除いて同質遺伝子的な細胞と比べるとＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５８９４８に対する感受性が極めて高かったことが示された（図３、図４）。ＫＵ００５８６８４のＳＦ５０（細胞の５０％が生存する投与量）は、Ｂｒｃａ１では３．５×１０−８Ｍ、Ｂｒｃａ２では１．５×１０−８Ｍであり、野生型の細胞では３．５×１０−８Ｍ程度であった。これは、Ｂｒｃａ１及びＢｒｃａ２突然変異細胞では、野生型と比べてそれぞれ５７倍及び１３３倍感受性が高まっていたということである。Ｂｒｃａ２を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞でも同様の結果が得られ、Ｂｒｃａ２が補完された誘導体と比べて感受性が１０００倍以上高まっていたことが示された（図１４及び図１５）。Ｂｒｃａ１及びＢｒｃａ２突然変異細胞のＫＵ００５８９４８に対する感受性は、ＫＵ００５８６８４さえも凌ぐものであった。対照的に、ＫＵ００５１５２９は、野生型Ｂｒｃａ１又はＢｒｃａ２を欠く細胞に対して、野生型細胞と比べると選択的な効果を及ぼさなかった。このことは、ｓｉＲＮＡデータと共に、感受性の機序が特にＰＡＲＰの阻害によるものであることを示している。どの阻害剤も、Ｂｒｃａ１又はＢｒｃａ２突然変異についてヘテロ接合性である細胞に対して選択的な効果を及ぼさなかったことは注目に値する。
【０１５０】
Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞のクローン原性生存に対するＫＵ００５８６８４の効果の時間経過依存性
細胞を、規定された時間をかけて異なる濃度のＫＵ００５８６８４に暴露した。次いで阻害剤を除去し、クローン原性アッセイを使用して効果を測定した。ＫＵ００５８６８４のクローンの増殖に対する阻害効果は、比較的短い暴露時間、すなわち４時間後に明らかとなり、２４時間の暴露によって本質的に完全なものになった（図５及び図６）。ＰＡＲＰ阻害効果は、短い暴露の後に阻害剤なしで１０〜１４日置いても増殖を妨げるので、可逆的であることがわかった。
【０１５１】
細胞周期の停止についてのＰＡＲＰ阻害の影響
ＦＡＣＳ分析を使用して、ＰＡＲＰ阻害が細胞周期の停止をもたらしたかどうかを判定した。細胞を様々な時間をかけてＫＵ００５８６８４に暴露し、次いでＢｒｄＵで標識し、細胞周期の各期の細胞の割合を調べた。結果は図７及び図８に示す。ＫＵ００５８６８４は、細胞の完全な停止状態を誘発することが認められ、四倍体ＤＮＡ含有量から、細胞周期のＧ２期又はＭ期での停止状態であることが示唆された。この停止状態をさらに特徴付けるために、細胞の分析を、ＤＮＡ含有量、及びＭ期のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ３について行った。この停止状態をさらに特徴付けるために、細胞の分析を、ＤＮＡ含有量、及びＭ期のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ３について行った。（図１２及び図１３）。停止状態にある細胞の大半は、抗ホスホヒストンＨ３抗体によって標識されず、細胞の大半がＧ２で停止したことが示唆された。
【０１５２】
Ｒａｄ５１焦点の形成
Ｂｒｃａ依存的二本鎖切断修復の１の証明は、Ｒａｄ５１を含む核中の焦点の形成である。ＫＵ００５８６８４が野生型細胞並びにＢｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞中でＲａｄ５１焦点を引き出す能力を調査した。
【０１５３】
野生型細胞、並びにＢｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損ＥＳ細胞を、４８時間かけて異なる濃度のＫＵ００５８６８４に暴露した。次いで、Ｔａｒｓｏｕｎａｓによって記載されているとおりに細胞を固定し、ＲＡＤ５１焦点の染色を行った（Tarsounas Mら、Oncogene. 2003 22(8):1115-23）。
【０１５４】
野生型ＥＳ細胞では、ＫＵ００５８６８４が用量依存的にＲａｄ５１焦点の形成を引き起こした（図９）。対照的に、Ｂｒｃａ１欠損又はＢｒｃａ２欠損細胞では焦点が誘導されなかった。この後者の発見は、ＤＮＡ損傷剤がＢｒｃａ１欠損又はＢｒｃａ２欠損細胞中ではＲａｄ５１焦点形成を引き起こし得ないという以前からの観察と一致する。
【０１５５】
したがって、ＫＵ００５８６８４は、二本鎖ＤＮＡ切断などの損傷又は二本鎖ＤＮＡ切断へと変性する損傷を引き起こし、これらの損傷は、Ｒａｄ５１を含みＢｒｃａ１及びＢｒｃａ２を必要とする複合体によって修復されることがわかる。重要なことであるが、ＫＵ００５１５２９は、同等の用量でＲａｄ５１焦点形成を引き起こさず、感受性の機序の特異性が強調された。
【０１５６】
コメットアッセイ
ＰＡＲＰ活性の阻害がＤＮＡ二本鎖切断を生じるかどうかを判定するために、Ｂｒｃａ２突然変異細胞及びその同質遺伝子対応物で中性コメットアッセイを実施した。結果を図１０に示す。１μＭ ＫＵ００５８６８４に３０時間暴露した後、Ｂｒｃａ２欠損ＶＣ８細胞のテールモーメントは４．７倍に増大し、補完ＶＣ８−ＢＡＣ系統ではテールモーメントの有意な増大がなかった。この結果は、ＰＡＲＰｉによって引き起こされたＤＮＡ二本鎖切断が、Ｂｒｃａ２欠損系統では修復されないままであることを示すものである。
【０１５７】
有糸分裂染色体分析
Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞の有糸分裂染色体を調べると、ＫＵ００５８６８４処置が頻繁に重大な異常をもたらしたことが明らかになった。それらには、染色分体切断、並びに三放射状及び四放射状の染色体が含まれる。これらの表現型は、姉妹染色分体遺伝子の変換によって二本鎖切断が修復されていないこと、並びにそれに代わるエラープローン経路の使用が多くなっていることの指標となる。
【０１５８】
ＥＳ細胞の異種移植片及びＫＵ００５８６８４による処置
同質遺伝子ＥＳ細胞及びＢｒｃａ２欠損ＥＳ細胞由来の腫瘍（奇形腫）を上述のように胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス中に生成させた。
【０１５９】
野生型及びＢｒｃａ２欠損異種移植片腫瘍の増殖に対するＫＵ００５８６８４の効果を測定し、その結果を図１６に示す。
【０１６０】
ＫＵ００５８６８４は、Ｂｒｃａ２欠損腫瘍の増殖を野生型腫瘍と比べて劇的に低減することが認められた。
【０１６１】
ＢＲＣＡ１細胞欠損系統におけるＰＡＲＰ阻害効果
ＭＣＦ７スクランブル細胞系及びＭＣＦ７−３．２３細胞系を上述のように生成した。ＭＣＦ７−３．２３は、ＢＲＣＡ１をＭＣＦ７スクランブルの３０％だけ発現することがわかった。
【０１６２】
ＭＣＦ７スクランブル細胞及びＭＣＦ７−３．２３細胞をＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５１５２９で処理し、細胞の生存度を測定した（図１７及び図１８）。ＫＵ００５８６８４は、強力なＰＡＲＰ阻害剤であり、ＫＵ００５１５２９はそれよりも効果が弱い。
【０１６３】
ＭＣＦ７スクランブル細胞もＭＣＦ７−３．２３細胞も、ＫＵ００５１５２９に対して有意な感受性を示さなかった（図１８）。しかし、両方の細胞系がＫＵ００５８６８４に対して感受性であった。
【０１６４】
ＭＣＦ７−３．２３細胞は、ＫＵ００５８６８４に対する感受性がＭＣＦ７スクランブル細胞よりも有意に高いことがわかった。
【０１６５】
ＰＡＲＰのＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ経路との相互作用
本発明の範囲をいかようにも限定することなく、ＰＡＲＰとＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ経路の相互作用について考えられるモデルを図１１に示す。
【０１６６】
ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）は、酸化的損傷及びその修復のために形成する。Ｐａｒｐ−１ ＰＡＲポリメラーゼ活性を阻害すると、ＸＲＣＣ１骨格タンパク質の動員、及びその後ＤＮＡポリメラーゼによるＳＳＢギャップの補充が妨げられる（図１１Ａ）。
【０１６７】
多数のＳＳＢが残り、ＤＮＡ複製フォークと接触する。ＳＳＢの箇所に鋳型鎖がないために、ＤＳＢになり、位置によっては複製フォークの崩壊を引き起こすこともある（図１１Ｂ）。
【０１６８】
損傷のない姉妹染色分体鋳型が近くにあると、ＲＡＤ５１でコートされた一本鎖ＤＮＡフィラメントが姉妹染色分体に侵入し、姉妹染色分体の組換え修復が開始されるようになる。この過程は、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に依存しており、複数のＲＡＤ５１核焦点の形成を伴う。崩壊した複製フォークは、同様の機序によって再出発することができる（図１１Ｃ）。
【０１６９】
組換え中間体のホリデー接合点が分割されると、姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）が起こる場合もある。Ｐａｒｐ−１阻害の際に余分な数のＳＳＢが複製フォークと接触すると、ＳＣＥが増加することになる（図１１Ｄ）。
【０１７０】
機能的ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２が存在しないと、ＲＡＤ５１焦点形成及び姉妹染色分体組換えがひどく損なわれる。過剰の未修復ＳＳＢは、ＤＮＡ複製の際にＤＮＡ ＤＳＢを生じ、姉妹染色分体組換えは起こらない。これらは、染色分体が切断され、未修復のままとなるか又はエラープローンＲＡＤ５１依存性の機序によって修復されて、複雑な染色体の再配列が引き起こされる。これらの細胞は、Ｇ２／Ｍ ＤＮＡ損傷チェックポイントに差し掛かるときに停止状態になり、さらに永久に停止状態になり、又はアポトーシスに至る（図１１Ｅ）。
【０１７１】
本明細書で示すＲＮＡｉデータは、ＫＵ００５１５２９が有効でなかったという観察と共に、ＰＡＲＰ阻害が、観察された感受性誘発効果の一因であることを示すものである。
【０１７２】
ＰＡＲＰ阻害には、通常は姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）によって修復される損傷が含まれる（Wang ZQら、(1997) Genes Dev. Vol. 11(18):2347-58並びに'From DNA damage and stress signalling to cell death' G. de Murcia及びS. Shall編、Oxford University Press (2000)）。ＰＡＲＰ阻害は、ＳＣＥを増進させることがわかっているが、ＤＳＢの遺伝子変換の増進を相伴わず、したがって、Ｒａｄ５１依存的な組換え経路は全体として強化されない（Schultz Nら、2003, Nucleic Acids Research; vol.31 (17): 4959-4964）。
【０１７３】
本明細書に記載の人工的致死手法は、ａ）ＢＲＣＡキャリアの腫瘍、ｂ）ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の他の成分が欠損している腫瘍のどちらの治療でも有用となり得る。
【０１７４】
ＢＲＣＡ突然変異のキャリアでは、発症年齢及び腫瘍病理が異なることが記載されているとはいえ、治療は、現在のところ散発性疾患の患者と同じものである。本発明は、これらの腫瘍に対する新しい手法を提供するものである。
【０１７５】
意味深いことに、ヘテロ接合に対する効果は認められなかった。このことは、たとえばＢＲＣＡ１／２突然変異を含むＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路突然変異のヘテロ接合キャリアにおける記載した方法の治療用途にとって重要である。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】Ｐａｒｐ１レベルの低下が、野生型細胞と比べてＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２突然変異細胞の生存度を低下させることを示す。
【図２】ＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８６８４、ＫＵ００５８９４８、及びＫＵ００５１５２９、並びにＰＡＲＰ−１酵素活性に対するそのＩＣ５０を示す図である。
【図３】ＰＡＲＰ阻害剤に暴露した細胞のクローン原性生存曲線を示す。ＰＡＲＰ阻害剤（ＫＵ００５８６８４（上）、ＫＵ００５８９４８（中）、ＫＵ００５１５２９（下））に連続的に暴露したＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：■）、Ｂｒｃａ１ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ１欠損（Ｃｒｅ１０：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図４】ＰＡＲＰ阻害剤に暴露した細胞のクローン原性生存曲線を示す。ＰＡＲＰ阻害剤（ＫＵ００５８６８４（上）、ＫＵ００５８９４８（中）、ＫＵ００５１５２９（下））に連続的に暴露したＢｒｃａ２野生型（Ｄ３：■）、Ｂｒｃａ２ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ２欠損（Ｃｒｅ２４：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図５】ＫＵ００５８６８４に１時間、４時間、及び２４時間暴露した後のクローン原性生存曲線を示す。ＫＵ００５８６８４に１時間（上）、４時間（中）、及び２４時間（右）暴露した後のＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：■）、Ｂｒｃａ１ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ１欠損（Ｃｒｅ１０：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図６】ＫＵ００５８６８４に１時間、４時間、及び２４時間暴露した後のクローン原性生存曲線を示す。ＫＵ００５８６８４に１時間（上）、４時間（中）、及び２４時間（右）暴露した後のＢｒｃａ２野生型（Ｄ３：■）、Ｂｒｃａ２ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ２欠損（Ｃｒｅ２４：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図７】ＰＡＲＰ阻害剤で処理したＢＲＣＡ−１及びＢＲＣＡ−２突然変異細胞におけるＰＡＲＰ阻害が、Ｇ２／Ｍでの停止を増大したことを示す。０ｎＭ（左）、１０ｎＭ（中）、又は１μＭ（右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理し、ＦＡＣＳによって分析したＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：上）及びＢｒｃａ１突然変異（Ｃｒｅ１０：下）細胞を示す。
【図８】ＰＡＲＰ阻害剤で処理したＢＲＣＡ−１及びＢＲＣＡ−２突然変異細胞におけるＰＡＲＰ阻害が、Ｇ２／Ｍでの停止を増大したことを示す。０ｎＭ（左）、１０ｎＭ（中）、又は１μＭ（右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理し、ＦＡＣＳによって分析したＢｒｃａ２野生型（Ｄ３）及びＢｒｃａ２突然変異（Ｃｒｅ２４）細胞を示す。
【図９】野生型細胞でのＰＡＲＰ阻害によって誘発されるがＢｒｃａ１又はＢｒｃａ２欠損細胞では誘発されないＲａｄ５１焦点形成の定量分析を示す。
【図１０】ＢＲＣＡ２−／−ＶＣ８及びＢＲＣＡ２補完ＶＣ８−ＢＡＣの中性コメット分析を示す。ＫＵ００５８６８４（１μＭ）による３０時間の処理によって、ＢＲＣＡ２−／−細胞ではテールモーメントの増大が認められるが、ＢＲＣＡ２補完系統ではテールモーメントの有意な増大が認められないことから判断されるように、ＤＮＡ ＤＳＢを有意な増大が誘導される。３回の独立した実験の平均データに＋／−ＳＥＭが示され、各実験で５０コメットのテールモーメントの得点が付けられる。
【図１１】ＢＲＣＡ１突然変異及びＢＲＣＡ２突然変異細胞に対するＰＡＲＰ阻害の選択的効果について考えられるモデルを示す図である。
【図１２】０ｎＭ（左）、１０ｎＭ（中）、又は１μＭ（右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理し、ＦＡＣＳによって分析したＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：上）及びＢｒｃａ１突然変異（Ｃｒｅ１０：）ＥＳ細胞と、Ｂｒｃａ２野生型（Ｄ３）及びＢｒｃａ２突然変異（Ｃｒｅ２４）細胞についてのホスホ−ヒストンＨ３ ＦＡＣＳデータを示す。
【図１３】０μＭ、１００μＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭ（それぞれ左から右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理したＶＣ８細胞及びＶＣ８ＢＡＣ細胞についてのホスホ−ヒストンＨ３ ＦＡＣＳを示す。
【図１４】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能を欠いている他の細胞におけるＰＡＲＰ阻害の効果の分析を示す。ＰＡＲＰ阻害剤（ＫＵ００５８６８４：上、ＫＵ００５８９４８：中、及びＫＵ００５１５２９：下）に連続的に暴露したＢｒｃａ２欠損（Ｖ−Ｃ８：■）及びＢｒｃａ２補完（Ｖ−Ｃ８ ＢＡＣ＋：黒三角）細胞のクローン原性生存曲線を示す。
【図１５】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能を欠いている他の細胞におけるＰＡＲＰ阻害の効果の分析を示す。ＫＵ００５８６８４に１時間（上）、４時間（中）、及び２４時間（下）暴露した後のＢｒｃａ２欠損（Ｖ−Ｃ８：■）及びＢｒｃａ２補完（Ｖ−Ｃ８ ＢＡＣ＋：黒三角）細胞のクローン原性生存曲線を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図１６】ＥＳ異種移植片における腫瘍生成及びＫＵ００５８６８４処置の効果を示す。点線はビヒクル処置した野生型、太い実線は薬物ＫＵ００５８６８４処置した野生型、実線はビヒクル処置したＢｒｃａ２欠損、破線はＫＵ００５８６８４処置したＢｒｃａ２欠損を示す。
【図１７】一定範囲の濃度のＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８６８４に１２〜１４日間連続的に暴露したＢＲＣＡ１野生型（ＭＣＦ７スクランブル）及びＢＲＣＡ１サイレンシング型（ＭＣＦ７−３．２３）細胞のクローン生存曲線を示す。阻害剤の対数濃度を細胞の対数生存率に対してプロットしてある。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図１８】一定範囲の濃度のＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５１５２９に１２〜１４日間連続的に暴露したＢＲＣＡ１野生型（ＭＣＦ７スクランブル）及びＢＲＣＡ１サイレンシング型（ＭＣＦ７−３．２３）細胞のクローン生存曲線を示す。阻害剤の対数濃度を細胞の対数生存率に対してプロットしてある。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞、特に、相同組換え（ＨＲ）依存的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復を欠損する癌細胞中への細胞致死性の導入に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞中のＤＮＡ損傷の有効な修復は、損傷を感知した後、損傷シグナルを下流エフェクターへと伝達し、細胞周期チェックポイントで停止し、ＤＮＡ損傷を修復する機序によるものである。細胞は、種々のＤＮＡ損傷の修復を媒介するシグナル及びエフェクターからなるいくつかの異なる経路を含んでいる。これらの経路には、塩基除去修復（ＢＥＲ）、相同組換え（ＨＲ）依存的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、及びミスマッチ修復（ＭＭＲ）が含まれる。様々なＤＮＡ修復経路間の相互作用及び相互依存性は、未だ十分には理解されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、たとえばポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害によるＢＥＲ経路の阻害が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損する癌細胞に対して選択的に致死性であることを発見した。このことは、癌状態の治療において重要な意味を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一態様は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を欠損する癌の個体における治療に使用するための医薬の製造における塩基除去修復経路の阻害剤の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
個体における癌の治療方法は、前記個体へ塩基除去修復経路の阻害剤を投与するステップを含んでよく、前記癌は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損するものである。
【０００６】
癌は、前記の第二の修復経路によってＤＮＡを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含み得る。
【０００７】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路は、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を相同的な機序によって修復して、切れ目のないＤＮＡヘリックスを再構成する（K. K. Khanna及びS. P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)）。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分には、ＡＴＭ（ＮＭ＿００００５１）、ＲＡＤ５１（ＮＭ＿００２８７５）、ＲＡＤ５１Ｌ１（ＮＭ＿００２８７７）、ＲＡＤ５１Ｃ（ＮＭ＿００２８７６）、ＲＡＤ５１Ｌ３（ＮＭ＿００２８７８）、ＤＭＣ１（ＮＭ＿００７０６８）、ＸＲＣＣ２（ＮＭ＿００５４３１）、ＸＲＣＣ３（ＮＭ＿００５４３２）、ＲＡＤ５２（ＮＭ＿００２８７９）、ＲＡＤ５４Ｌ（ＮＭ＿００３５７９）、ＲＡＤ５４Ｂ（ＮＭ＿０１２４１５）、ＢＲＣＡ１（ＮＭ＿００７２９５）、ＢＲＣＡ２（ＮＭ＿００００５９）、ＲＡＤ５０（ＮＭ＿００５７３２）、ＭＲＥ１１Ａ（ＮＭ＿００５５９０）、及びＮＢＳ１（ＮＭ＿００２４８５）が挙げられる。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路に関与する他のタンパク質としては、ＥＭＳＹなどの調節因子が挙げられる（Hughes-Daviesら、Cell, Vol 115, pp 523-535）。
【０００８】
塩基除去修復（ＢＥＲ）経路は、ＤＮＡ一本鎖切断及びギャップを修復し、特定の損傷塩基を除去する。ＤＮＡヘリックス中のギャップは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）及びリガーゼの連続する作用によって埋められる（K. K. Khanna及びS. P. Jackson, Nat. Genet., 27(3): 247-254 (2001)、F. Dantzerら、Biochemistry 39, 7559-69 2000、J. H. Hoeijmakers, Nature 411 366-74 (2001)）。塩基除去修復の阻害剤は、塩基除去修復経路の成分のいずれか１を阻害し得るものである。ＢＥＲ経路の成分には、ＵＮＧ（ＮＭ＿００３３６２）、ＳＭＵＧ１（ＮＭ＿０１４３１１）、ＭＢＤ４（ＮＭ＿００３９２５）、ＴＤＧ（ＮＭ＿００３２１１）、ＯＧＧ１（ＮＭ＿００２５４２）、ＭＹＨ（ＮＭ＿０１２２２２）、ＮＴＨＬ１（ＮＭ＿００２５２８）、ＭＰＧ（ＮＭ＿００２４３４）、ＮＥＩＬ１（ＮＭ＿０２４６０８）、ＮＥＩＬ２（ＮＭ＿１４５０４３）、ＮＥＩＬ３（ＮＭ＿０１８２４８）、ＡＰＥ１（ＮＭ＿００１６４１）、ＡＰＥ２（ＮＭ＿０１４４８１）、ＬＩＧ３（ＮＭ＿０１３９７５）、ＸＲＣＣ１（ＮＭ＿００６２９７）、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ１）（ＮＭ＿００１６７１８）、及びＡＤＰＲＴＬ２（ＰＡＲＰ２）（ＮＰ＿００５４７５）が挙げられる。
【０００９】
ＢＥＲ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復が欠損している癌の治療に、ＤＮＡ損傷剤と組み合わせて使用することができる。ＤＮＡ損傷剤は、ＢＥＲ阻害剤なしでは、細胞にとって致死的でない投与量又は処方で使用することが好ましい。適切なＤＮＡ損傷化学療法剤について以下で述べる。
【００１０】
一部の好ましい実施形態では、哺乳動物酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤（D'Amoursら、(1999) Biochem. J. 342: 249-268）を使用することができる。すなわち、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の治療に使用することができる。
【００１１】
個体におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の治療方法は、前記個体へＰＡＲＰ阻害剤を投与することを含んでよい。
【００１２】
ＰＡＲＰ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の個体における治療に使用するための医薬の製造の際に使用することができる。
【００１３】
ＰＡＲＰ阻害剤について以下でより詳細に述べる。
【００１４】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌は、その経路によってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が、正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含み、又はそれからなるものでよく、すなわち、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性が、１又は複数の癌細胞で低下又は消滅している可能性がある。
【００１５】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の１又は複数の成分の活性は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌を有する個体の１又は複数の癌細胞で消滅していて構わない。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分は、当技術分野で十分に特徴付けられており（たとえば、Woodら(2001) Science 291 1284-1289を参照のこと）、先に挙げた成分がそれに含まれる。
【００１６】
一部の好ましい実施形態では、癌細胞は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損表現型を有するものでよく、すなわち、癌細胞のＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２活性は、低下又は消滅している。この表現型を有する癌細胞は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２を欠損しているものでよく、すなわち、癌細胞のＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の発現及び／又は活性が、たとえばコード核酸の突然変異若しくは多形性によって、又は調節因子をコードする遺伝子、たとえばＢＲＣＡ２調節因子をコードするＥＭＳＹ遺伝子の突然変異若しくは多形性によって低下又は消滅していてよい（Hughes-Daviesら、Cell, Vol 115, pp523-535）。
【００１７】
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２は既知の腫瘍抑制因子であり、その野生型アレルは、ヘテロ接合性保持者の腫瘍で失われていることが多い（Jasin M. Oncogene. 2002年12月16日;21(58):8981-93; Tuttら、Trends Mol Med. (2002)8(12):571-6）。ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２突然変異と乳癌との関連は、当技術分野で十分に特徴付けられている（Radice P J Exp Clin Cancer Res. 2002年9月;21(3 Suppl):9-12）。ＢＲＣＡ２結合因子をコードするＥＭＳＹ遺伝子の増幅が、乳癌及び卵巣癌と関連付けられることも知られている。
【００１８】
ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異の保持者は、卵巣、前立腺、及び膵臓の癌のリスクも高くなっている。
【００１９】
一部の実施形態では、個体の癌状態は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌であると以前に確認されているものでありうる。
【００２０】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、個体の癌状態がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認するステップを含むことができる。
【００２１】
癌は、たとえば、個体から採取したサンプルの１又は複数の癌細胞のＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性を測定し、又はその経路の１又は複数の成分の活性を測定することによって、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌であると確認することができる。活性は、好ましくは同じ組織からの正常（すなわち、癌でない）細胞を基準として決定することができる。
【００２２】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性は、ＤＮＡ損傷剤又はＰＡＲＰ阻害剤に応答して起こる、核中にＲａｄ５１を含む焦点の形成を測定して決定することができる。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損する細胞は、そのような焦点を生成する能力がない。Ｒａｄ５１焦点が存在するかどうかは、標準の免疫蛍光技術を使用して判定することができる。ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性を測定する他の方法としては、ＩＲ、及び鎖間架橋試薬、ＤＳＢ誘発剤（トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤）などの化学療法剤に対する感受性、並びにウエスタンブロット分析、免疫組織学、染色体異常、酵素若しくはＤＮＡ結合アッセイ、及びプラスミド系アッセイの使用を挙げることができる。
【００２３】
一部の実施形態では、個体の癌細胞中に、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分であるポリペプチドをコードする核酸の１又は複数の変化、たとえば、多形性又は突然変異が存在するかどうかを判定することにより、癌が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損していると確認することができる。
【００２４】
突然変異や多形性などの配列の変化には、野生型ヌクレオチド配列に対する１若しくは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含めることができる。一部の実施形態では、変化は、遺伝子増幅、たとえば、ＥＭＳＹ遺伝子（ＣＡＤ２２８８１；遺伝子記号Ｃ１１ＯＲＦ３０）の増幅でありうる。１又は複数の変化は、核酸配列のコード領域又は非コード領域にあるものでよく、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分であるポリペプチドの発現又は機能を低下又は消失させるものとしうる。言い換えれば、変異体核酸は、たとえば、調節エレメントの活性が変更されることで、活性が低下若しくは消滅している変異体ポリペプチドをコードしていてもよいし、又は細胞内でほとんど若しくはまったく発現されない野生型ポリペプチドをコードしていてもよい。変異体核酸は、野生型配列に対して１、２、３、４又はそれ以上の突然変異又は多形性を有するものでよい。
【００２５】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする核酸中に１又は複数の変化が存在するかどうかは、試験サンプルの１又は複数の細胞で、１又は複数の突然変異又は多形性を含むコード核酸配列の存在を検出するか、又はその核酸配列によってコードされる変異体構成ポリペプチドの存在を検出することによって判定できる。
【００２６】
個体から採取したサンプル中に特定の核酸配列、たとえば、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路成分の発現又は活性を低下又は消滅させる突然変異又は多形性を有する核酸配列が存在するか否かを判定するには、様々な方法が利用可能である。その上、個体又はサンプルの核酸の配列決定を行った後は、もとの核酸それ自体にたよることなく、配列情報を確保し、その後探索することができる。すなわち、たとえば、配列分析ソフトウェアを使用して、配列情報データベースを走査することで、配列の変更又は突然変異を同定することができる。
【００２７】
本発明の一部の態様に従う方法は、オリゴヌクレオチドプローブが、サンプルから得た核酸、たとえば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡに結合するかどうかの判定を含むものでもよい。プローブは、１若しくは複数の突然変異若しくは多形性を含む核酸配列に特異的に結合し、１若しくは複数の突然変異若しくは多形性を含まない核酸配列に特異的に結合しない核酸配列、又はその逆の核酸配列を含むものでよい。
【００２８】
オリゴヌクレオチドプローブは、標識を含むものでよく、プローブの結合は、標識の存在を検出して判定することができる。
【００２９】
方法は、１又は複数（たとえば２個）のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーによる標的核酸とのハイブリダイゼーションを含むものでよい。核酸が二本鎖ＤＮＡである場合では、ハイブリダイゼーションは一般に、先に変性させて一本鎖ＤＮＡを生成してから行う。ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ手順の一部としてのものでも、又はＰＣＲを含まない検出手順の一部としてのものでもよい。一例となる手順は、ＰＣＲとストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーションとの組合せでもよいはずである。
【００３０】
プローブによる標的核酸（たとえばＤＮＡ）への結合は、様々な技術のいずれかを当業者の自由裁量で使用して測定することができる。たとえば、プローブは、放射能、蛍光、又は酵素によって標識されていてよい。プローブの標識を用いない他の方法には、制限断片長多形の調査、ＰＣＲを使用する増幅、ＲＮアーゼによる切断、及び対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドによる検出が含まれる。検出は、標準のサザンブロット法を用いるものでよい。たとえば、ＤＮＡを細胞から抽出し、種々の制限酵素で消化することができる。次いで、制限断片をアガロースゲル上での電気泳動によって分離した後、変性させ、ニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識されたプローブをフィルター上のＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、結合したかどうかを判定することができる。
【００３１】
当業者ならば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成、温度などの要因を考慮しながら、選択的なハイブリダイゼーションに適する、所望のストリンジェンシーの条件をうまく用いることができる。
【００３２】
１７〜３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドに適する選択的ハイブリダイゼーションの条件には、６×ＳＳＣ中、４２℃での終夜のハイブリダイゼーション、及び６×ＳＳＣ中、４２℃から６５℃へと上昇していく一連の温度での洗浄を含む。
【００３３】
他の適切な条件及びプロトコルは、「Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition」、Sambrook & Russell(2001年)、Cold Spring Harbor Laboratory Press NY及び「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら編、John Wiley & Sons(1992年)に記載されている。
【００３４】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはｃＤＮＡ、又はその増幅された領域でよく、配列決定すると、そこに多形性又は突然変異が存在するかどうかを確認又は決定することができる。多形性又は突然変異は、上述のような成分のデータベース配列から得られる配列と比較して同定することができる。特に、ポリペプチド成分の機能の消滅又は損失を引き起こす１又は複数の多形性又は突然変異、したがって全体としてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路が存在するかどうかを決定することができる。
【００３５】
配列決定は、ある範囲の標準技術のいずれか１を使用して実施することができる。増幅産物の配列決定は、たとえば、イソプロパノール沈殿、再懸濁、及びＴａｑＦＳ＋Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定キットを使用する配列決定を利用しうる。伸長産物をＡＢＩ３７７ ＤＮＡ配列決定装置による電気泳動にかけ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェアを使用してデータを分析することができる。
【００３６】
１組又は複数のプライマー対を使用する、ＰＣＲなどの特異的増幅反応を使用すると、核酸配列内の対象の領域、たとえば、突然変異又は多形性を含む疑いのある配列部分を増幅することができて好都合である。次いで、増幅された核酸を先のように配列決定し、かつ／又はＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路成分の発現若しくは活性を低下若しくは消滅させる突然変異若しくは多形性が存在するか否かを決定する他の任意の手段で試験することができる。
【００３７】
適切な増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（たとえば、"PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Innisら編、1990, Academic Press, New York、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987)、Ehrlich (eds), "PCR technology", Stockton Press, NY, 1989、及びEhrlichら、Science, 252:1643-1650, (1991)に総説がある）が挙げられる。
【００３８】
一部の実施形態では、ＥＭＳＹなどのＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路成分の正又は負の調節因子の発現又は活性のレベルを評価することで、癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認することができる。発現レベルは、たとえば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション、又は核型分析によって決定することができる。
【００３９】
一部の好ましい実施形態では、個体は、突然変異や多形性など、ＢＲＣＡ１及び／若しくはＢＲＣＡ２又はその調節因子の１又は複数の変化についてヘテロ接合性である。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の変化の検出は、当技術分野で周知であり、たとえば、ＥＰ６９９７５４号、ＥＰ７０５９０３号、Neuhausen S. L.及びOstrander E. A. Genet. Test (1992) 1, 75-83、Chappnis, P. O. 及びFoulkes, W. D. Cancer Treat Res (2002) 107, 29-59、Janatova Mら、Neoplasma. 2003: 50(4):246-50、Jancarkova N Ceska Gynekol. 2003 68(1): 11-6に記載されている。ＢＲＣＡ２結合因子ＥＭＳＹが増幅されているかどうかの判定については、Hughes-Daviesら、Cell 115 523-535に記載されている。
【００４０】
癌に関連した突然変異及び多形性は、変異体（すなわち、突然変異体又はアレル変異体）ポリペプチドの存在を検出することによって、タンパク質レベルで検出してもよい。
【００４１】
個体からのサンプル中の癌細胞がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認する方法は、サンプルをその経路の変異体（たとえば突然変異体）ポリペプチド成分に対する特異的な結合メンバーと接触させるステップと、その特異的結合メンバーがサンプルに結合したかどうかを判定するステップとを含むものでありうる。特異的結合メンバーのサンプルへの結合は、サンプル内の細胞中にＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の変異体ポリペプチド成分が存在することの指標となり得る。
【００４２】
本発明の態様で使用するのに好ましい特異的結合分子には、抗体及びそのフラグメント若しくは誘導体（「抗体分子」）が含まれる。
【００４３】
抗体などの結合メンバーの正常サンプル及び試験サンプルに対する反応性は、任意の適切な手段によって測定することができる。個々のレポーター分子によるタグ付加は１の手段である。レポーター分子は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接又は間接的に発するものでよい。レポーター分子の結合は、直接又は間接的なものでよく、たとえばペプチド結合による共有結合によるものでも、又は共有結合によらないものでもよい。ペプチド結合による結合は、結合性分子（たとえば抗体）及びレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果として生じるものでよい。
【００４４】
結合を判定する方式は、本発明の特徴ではなく、当業者ならば、その優先度及び一般知識に従って適切な方式を選択することができる。
【００４５】
癌細胞は、一般に正常細胞と比べて異常な増殖を特徴とし、通常は癌状態の個体の中で塊又は腫瘍を形成する。
【００４６】
本明細書で述べる、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損する癌状態には、任意の種類の固形癌又は悪性リンパ腫、特に白血病、肉腫、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、直腸結腸癌、子宮頚癌、肝癌、頭頚部癌、食道癌、膵臓癌、腎癌、胃癌、及び脳腫瘍（cerebral cancer）を含めることができる。一部の実施形態では、癌状態は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌でありうる。癌は、家族性でも散発性でもよい。
【００４７】
個体から採取されるサンプルは、１又は複数の細胞を含む組織サンプル、たとえば、上述のような癌組織、又はたとえば対照として使用するための非癌組織からの生検材料でよい。
【００４８】
本発明の方法は、たとえば治療の作用経過を判定するために、癌状態の個体の評価を行うのに有用な場合もある。癌の個体の評価方法は、
個体から採取した癌細胞が、正常細胞と比べてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復が欠損していることを確認するステップと、
前記個体への投与に適するＢＥＲ経路阻害剤を準備するステップと
を含みうる。
【００４９】
一部の好ましい実施形態では、ＢＥＲ経路阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。ＰＡＲＰ阻害剤については、以下でより詳細に述べる。癌状態の評価方法は、
個体から採取した癌細胞が、正常細胞と比べてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復が欠損していることを確認するステップと、
前記個体への投与に適するＰＡＲＰ阻害剤を準備するステップと
を含みうる。
【００５０】
一部の好ましい実施形態では、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることが確認された癌細胞は、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型でありうる。
【００５１】
個体は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌の素因を有する者であってもよい。本発明の方法及び手段は、そのような個体に特に有用である。
【００５２】
個体は、たとえば、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする核酸、たとえば、上述の成分をコードする核酸の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性であるものでよい。
【００５３】
個体における癌の治療方法は、
前記個体にＢＥＲ経路阻害剤を投与するステップを含み、
前記個体は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性であるものとしうる。
【００５４】
ＢＥＲ阻害剤は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用するための医薬の製造の際に使用することができ、また塩基除去修復阻害剤はＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用することができる。
【００５５】
一部の好ましい実施形態では、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性である個体は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異又は多形性についてヘテロ接合性であるものでもよい。
【００５６】
本明細書に記載の方法での使用に適するＢＥＲ阻害剤は、有機小分子、ペプチド、核酸など、ＢＥＲ経路の１又は複数の成分の活性を阻害し、低減し、又は消滅させるどんな化合物又は存在でもよい。
【００５７】
一部の実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、酵素ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性を低減又は消滅させるものでよい。
【００５８】
用語ＰＡＲＰとは、本明細書では、文脈による別段の規定がない限り、ＰＡＲＰ１（ＥＣ２．４．２．３０、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ３２７２１）及び／又はＰＡＲＰ２（Ameら、J. Biol. Chem. (1999) 274 15504-15511、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＡＪ２３６９１２）を指す。
【００５９】
既知のＰＡＲＰ阻害剤であって、本発明に従って用いることができる化合物の例としては以下のものが含まれる。
【００６０】
１．ニコチンアミド類、例えば５−メチルニコチンアミド及びＯ−（２−ヒドロキシ−３−ピペリジノ−プロピル）−３−カルボン酸アミドキシム、並びにその類似体及び誘導体。
【００６１】
２．ベンズアミド類、例えば３−置換ベンズアミド類（３−アミノベンズアミド、３−ヒドロキシベンズアミド、３−ニトロソベンズアミド、３−メトキシベンズアミド及び３−クロロプロカインアミドなど）、４−アミノベンズアミド、１，５−ジ［（３−カルバモイルフェニル）アミノカルボニルオキシ］ペンタン、並びにその類似体及び誘導体。
【００６２】
３．イソキノリノン類及びジヒドロイソキノリノン類、例えば２Ｈ−イソキノリン−１−オン類、３Ｈ−キナゾリン−４−オン類、５−置換ジヒドロイソキノリノン類（５−ヒドロキシジヒドロイソキノリノン、５−メチルジヒドロイソキノリノン及び５−ヒドロキシイソキノリノンなど）、５−アミノイソキノリン−１−オン、５−ジヒドロキシイソキノリノン、３，４ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン類（３，４ジヒドロ−５−メトキシ−イソキノリン−１（２Ｈ）−オン及び３，４ジヒドロ−５−メチル−１（２Ｈ）イソキノリノンなど）、イソキノリン−１（２Ｈ）−オン類、４，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５，１−ｉｊ］キノリン−６−オン類、１，６，−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン類、１，８−ナフタルイミド類（４−アミノ−１，８−ナフタルイミドなど）、イソキノリノン、３，４−ジヒドロ−５−［４−１（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン、２，３−ジヒドロベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１−オン、１−１１ｂ−ジヒドロ−［２Ｈ］ベンゾピラノ［４，３，２−ｄｅ］イソキノリン−３−オン、四環ラクタム類、例えば、ベンズピラノイソキノリノン類（ベンゾピラノ［４，３，２−ｄｅ］イソキノリノンなど）、並びにその類似体及び誘導体。
【００６３】
４．ベンズイミダゾール類及びインドール類、例えばベンゾキサゾール−４−カルボキサミド類、ベンズイミダゾール−４−カルボキサミド類（２−置換ベンゾキサゾール４−カルボキサミド類及び２−置換ベンズイミダゾール４−カルボキサミド類、例えば２−アリールベンズイミダゾール４−カルボキサミド類及び２−シクロアルキルベンズイミダゾール−４−カルボキサミド類など、２−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズイミダゾール４−カルボキサミドを含む）、キノキサリンカルボキサミド類、イミダゾピリジンカルボキサミド類、２−フェニルインドール類、２−置換ベンゾキサゾール（２−フェニルベンゾキサゾール及び２−（３−メトキシフェニル）ベンゾキサゾールなど）、２−置換ベンズイミダゾール類（２−フェニルベンズイミダゾール及び２−（３−メトキシフェニル）ベンズイミダゾール、１，３，４，５テトラヒドロ−アゼピノ［５，４，３−ｃｄ］インドール−６−オンなど）、アゼピノインドール類及びアゼピノインドロン類（１，５ジヒドロ−アゼピノ［４，５，６−ｃｄ］インドリン−６−オン及びジヒドロジアザピノインドリノンなど）、３−置換ジヒドロジアザピノインドリノン類（３−（４−トリフルオロメチルフェニル）−ジヒドロジアザピノインドリノン、テトラヒドロジアザピノインドリノン及び５，６，−ジヒドロイミダゾ［４，５，１−ｊ，ｋ］［１，４］ベンゾジアゾピン−７（４Ｈ）−オンなど）、２−フェニル−５，６−ジヒドロ−イミダゾ［４，５，１−ｊｋ］［１，４］ベンゾジアゼピン−７（４Ｈ）−オン及び２，３，ジヒドロ−イソインドール−１−オン、並びにその類似体及び誘導体。
【００６４】
５．フタラジン−１（２Ｈ）−オン類及びキナゾリノン類、例えば４−ヒドロキシキナゾリン、フタラジノン、５−メトキシ−４−メチル−１（２）フタラジノン類、４−置換フタラジノン類、４−（１−ピペラジニル）−１（２Ｈ）−フタラジノン、四環ベンゾピラノ［４，３，２−ｄｅ］フタラジノン類及び四環インデノ［１，２，３−ｄｅ］フタラジノン類、並びに２−置換キナゾリノン類（８−ヒドロキシ−２−メチルキナゾリン−４−（３Ｈ）オンなど）、三環フタラジノン類及び２−アミノフタルヒドラジド、並びにその類似体及び誘導体。
【００６５】
６．イソインドリノン類、並びにその類似体及び誘導体。
【００６６】
７．フェナントリジン類及びフェナントリジノン類、例えば５［Ｈ］フェナントリジン−６−オン、置換５［Ｈ］フェナントリジン−６−オン類、特に２−，３−置換５［Ｈ］フェナントリジン−６−オン類及び６（５Ｈ）フェナントリジノン類のスルホンアミド／カルバミド誘導体、チエノ［２，３−ｃ］イソキノロン類（例えば９−アミノチエノ［２，３−ｃ］イソキノロン及び９−ヒドロキシチエノ［２，３−ｃ］イソキノロン、９−メトキシチエノ［２，３−ｃ］イソキノロンなど）、Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロフェナントリジン−２−イル］−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ｝アセトアミド、置換４，９−ジヒドロシクロペンタ［ｌｍｎ］フェナントリジン−５−オン類、並びにその類似体及び誘導体。
【００６７】
８．ベンゾピロン類、例えば１，２−ベンゾピロン、６−ニトロソベンゾピロン、６−ニトロソ１，２−ベンゾピロン、及び５−ヨード−６−アミノベンゾピロン、並びにその類似体及び誘導体。
【００６８】
９．不飽和ヒドロキシム酸誘導体、例えばＯ−（３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）ニコチン酸アミドキシム、並びにその類似体及び誘導体。
【００６９】
１０．ピリダジン類、例えば縮合ピリダジン類、並びにその類似体及び誘導体。
【００７０】
１１．他の化合物、例えばカフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにその類似体及び誘導体。
【００７１】
さらなるＰＡＲＰ阻害剤は、例えば米国特許第６，６３５，６４２号、米国特許第５，５８７，３８４号、ＷＯ２００３０８０５８１号、ＷＯ２００３０７０７０７号、ＷＯ２００３０５５８６５号、ＷＯ２００３０５７１４５号、ＷＯ２００３０５１８７９号、米国特許第６５１４９８３号、ＷＯ２００３００７９５９号、米国特許第６４２６４１５号、ＷＯ２００３００７９５９号、ＷＯ２００２０９４７９０号、ＷＯ２００２０６８４０７号、米国特許第６４７６０４８号、ＷＯ２００１０９００７７号、ＷＯ２００１０８５６８７号、ＷＯ２００１０８５６８６号、ＷＯ２００１０７９１８４号、ＷＯ２００１０５７０３８号、ＷＯ２００１０２３３９０号、ＷＯ２００１０２１６１５号、ＷＯ２００１０１６１３６号、ＷＯ２００１０１２１９９号、ＷＯ９５２４３７９号、Banasik et al. J. Biol. Chem., 267:3, 1569-75 (1992)、Banasik et al. Molec. Cell. Biochem. 138:185-97 (1994))、Cosi (2002) Expert Opin. Ther. Patents 12 (7)、及びSouthan & Szabo (2003) Curr Med Chem 10 321-340並びにこれに引用されている参照文献に記載されている。
【００７２】
好適なＰＡＲＰ阻害剤の好ましいクラスの１としては、フタラジノン類、例えばＷＯ０２／３６５７６号に記載されているような１（２Ｈ）−フタラジノン及びその誘導体が挙げられる。特に、下記式：
【化１】
【００７３】
の化合物、並びにその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態及びプロドラッグをＰＡＲＰの阻害に用いることができる。上記式中、
Ａ及びＢは一緒に、任意により置換されていてもよい縮合芳香環を表し、
ＲＣは−Ｌ−ＲＬにより表され、該式中、Ｌは下記式：
−（ＣＨ２）ｎ１−Ｑｎ２−（ＣＨ２）ｎ３−
〔式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３はそれぞれ０、１、２及び３から選択され、ｎ１、ｎ２及びｎ３の合計は１、２又は３であり、ＱはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）又は−ＣＲ１Ｒ２−から選択され、ここでＲ１及びＲ２は、独立して水素、ハロゲン又は任意により置換されていてもよいＣ１−７アルキルから選択されるか、あるいはそれらが結合する炭素原子と一緒に、飽和（Ｃ３−７シクロアルキル基）又は不飽和（Ｃ３−７シクロアルケニル基）であってよいＣ３−７環状アルキル基を形成するか、あるいはＲ１及びＲ２の一方がＲＬにおける原子と結合して、Ｒ１及びＲ２がＱ、−（ＣＨ２）ｎ３−（存在する場合）及びＲＬの一部に結合する炭素原子を含む不飽和Ｃ３−７シクロアルケニル基を形成する〕
であり、
ＲＬは任意により置換されていてもよいＣ５−２０アリールであり、
ＲＮは、水素、任意により置換されていてもよいＣ１−７アルキル、Ｃ３−２０複素環、並びにＣ５−２０アリール、ヒドロキシ、エーテル、ニトロ、アミノ、アミド、チオール、チオエーテル、スルホキシド及びスルホンから選択される。
【００７４】
好ましくは、下記式：
【化２】
【００７５】
の化合物、又はその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態若しくはプロドラッグをＰＡＲＰの阻害に用いることができ、上記式中、
Ａ及びＢは一緒に、任意により置換されていてもよい縮合芳香環を表し、
ＲＣは−ＣＨ２−ＲＬであり、
ＲＬは任意により置換されていてもよいフェニルであり、
ＲＮは水素である。
【００７６】
いくつかの好ましい実施形態において、図２に示されるＫＵ−００５８６８４又はＫＵ−００５８９４８の構造を有する化合物、又はその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態若しくはプロドラッグをＰＡＲＰの阻害に用いることができる。
【００７７】
好適なＰＡＲＰ阻害剤は、市販のものであってもよいし、あるいは公知の出発物質から公知の方法によって合成してもよい（例えば、Suto et al. Anticancer Drug Des. 6:107-17 (1991)参照）。
【００７８】
塩基除去修復阻害剤の別のクラスとしては、ＢＥＲ経路の成分のペプチド断片が挙げられる。例えば、ＰＡＲＰ配列のペプチド断片を用いてＰＡＲＰを阻害し、それによりＢＥＲ経路の活性を低減する又は無効にすることができる。ペプチド断片は、上記成分の公開されている配列、例えば公開されているＰＡＲＰ配列（アクセッション番号ＮＭ＿００１６１８）を用いて、化学合成によりその全体を又は一部を生成することができる。ペプチド断片は、その方法の概要が広く入手可能である（例えば、J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)；M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)；Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California）十分に確立されている標準的な液体ペプチド合成法（又は好ましくは固相ペプチド合成法）に従って容易に調製することができ、あるいは溶液中で、液相法により、又は固相、液相及び液体化学の任意の組み合わせにより、例えば最初に別々のペプチド部分を合成し、続いて所望又は適当であれば、存在する保護基を除去し、個々の炭酸若しくはスルホン酸又はそのそれぞれの誘導体の反応によって残基Ｘを導入することによって、調製することも可能である。
【００７９】
ＢＥＲ経路の成分（ＰＡＲＰなど）を阻害するための他の候補化合物は、その成分の３次元構造のモデル化に基づいて、合理的薬物設計法を用いることによって、特定の分子形状、サイズ及び電荷特性を有する候補化合物を得ることが可能である。候補阻害剤は、例えば、上記成分を阻害するペプチド断片又は他の化合物の「機能的類似体」でありうる。機能的類似体は、対象のペプチド又は他の化合物と同じ機能的活性を有する、すなわち、ＤＮＡ修復経路成分の相互作用又は活性を妨害可能なものである。そのような類似体の例としては、上記成分の別の成分との接触領域（特に重要と考えられるアミノ酸残基の配置）の３次元構造と類似するようにモデル化された化学化合物が挙げられる。
【００８０】
好適なＢＥＲ経路阻害剤の別のクラスとしては、ＢＥＲ経路の成分、例えばＰＡＲＰ（アクセッション番号ＮＭ＿００１６１８）のアミノ酸配列の一部若しくは全体をコードする核酸、又はその相補配列であって、活性ポリペプチドの産生をダウンレギュレートすることにより活性又は機能を阻害するものが挙げられる。
【００８１】
例えば、ＰＡＲＰ活性の阻害は、慣用的な方法、例えばドットブロット（Affar EB et al Anal Biochem. 1998;259(2):280-3）、及びＰＡＲＰがポリＡＤＰ−リボース鎖を形成する活性を直接測定するＢＥＲアッセイ（例えばトリチウム化基質ＮＡＤによる放射性アッセイ、又はＰＡＲＰ活性によって形成されるポリマー鎖に対する特異的抗体を用いて測定する）（K.J. Dillon et al, Journal of Biomolecular Screening, 8(3): 347-352 (2003)）を用いて測定することができる。
【００８２】
例えば、ＢＥＲ経路成分の発現は、アンチセンス又はＲＮＡｉ技術を用いて阻害することができる。これらの遺伝子発現をダウンレギュレートする手法の使用は、現在、当技術分野で十分に確立されている。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、プレ−ｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡの相補配列にハイブリダイズして塩基除去修復経路成分の産生を妨害して、その発現が低減するか又は完全に若しくは実質的に完全に抑止されるように設計される。コード配列の標的化に加えて、アンチセンス技術は、遺伝子の制御配列、例えば５’フランキング配列内を標的化するために用いてもよく、それによりアンチセンスオリゴヌクレオチドは発現制御配列を妨害しうる。アンチセンス配列の構築とそれらの使用は、例えばPeyman and Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990)及びCrooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:329-376, (1992)に記載されている。
【００８４】
オリゴヌクレオチドは、投与のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで生成してもよいし又はｅｘｖｉｖｏで生成してもよく、あるいはアンチセンスＲＮＡをダウンレギュレーションが望まれる細胞内でｉｎ ｖｉｖｏで生成させてもよい。従って、二本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡのアンチセンス鎖の転写によって、標的遺伝子のセンス鎖から転写される正常ｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡが生じるように、プロモーターの制御下に「逆配向」に配置することができる。相補的なアンチセンスＲＮＡ配列は、続いてｍＲＮＡと結合して二本鎖を形成し、それが標的遺伝子からタンパク質への内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられる。これが実際の作用機構であるか否かは依然として不明確である。しかしながら、この技術が機能するという事実は確立されている。
【００８５】
逆配向のコード配列に対応する完全な配列を用いる必要はない。例えば、十分な長さの断片を用いることができる。当業者には、アンチセンス阻害のレベルを最適化するように遺伝子のコード配列又はフランキング配列の種々のサイズ及び種々の部分に由来する断片からスクリーニングすることが慣用的である。開始メチオニンコドンＡＴＧを、おそらく開始コドンの１又はそれ以上のヌクレオチドの上流に含有させることが有利でありうる。好適な断片は、約１４〜２３ヌクレオチド、例えば約１５、１６又は１７ヌクレオチドを有しうる。
【００８６】
アンチセンス法の代替として、センス（すなわち標的遺伝子と同じ）配向に挿入された標的遺伝子の全体又は一部のコピーを用いて、共抑制により標的遺伝子の発現を低減させることができる（Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16,12:3675-3684; 及びVoinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: p 553）。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、センス又はアンチセンス鎖単独のいずれよりも遺伝子サイレンシングにおいてさらに有効であることが見出されている（Fire A. et al Nature 391, (1998)）。ｄｓＲＮＡにより媒介されるサイレンシングは、遺伝子特異的であり、ＲＮＡインターフェアランス（ＲＮＡｉ）と呼ばれることが多い。
【００８７】
ＲＮＡインターフェアランスは、２段階のプロセスである。第１に、ｄｓＲＮＡが細胞内で切断されて、５’末端リン酸と３’の短い突出部（約２塩基）を有する約２１〜２３塩基長の小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が生じる。そのｓｉＲＮＡは、破壊のために特異的に対応のｍＲＮＡ配列に標的化する（Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001)）。
【００８８】
ＲＮＡｉはまた、３’突出末端を有する同じ構造の化学合成されたｓｉＲＮＡ二本鎖を用いることによって効率的に誘導されうる（Zamore PD et al Cell, 101, 25-33, (2000)）。合成ｓｉＲＮＡ二本鎖は、広範な哺乳動物細胞系における内因性及び異種遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている（Elbashir SM. et al. Nature, 411, 494-498, (2001)）。
【００８９】
他の可能性としては、転写時に、核酸を特異的部位で切断し、それゆえ遺伝子発現に影響を及ぼすのにも有効なリボザイムを生成する核酸を用いることがある。リボザイムの技術背景の参考文献としては、Kashani-Sabet and Scanlon, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(3): 213-223、及びMercola and Cohen, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(1), 47-59が挙げられる。
【００９０】
本発明の方法は、ＢＥＲ阻害剤、例えばＰＡＲＰ阻害剤を個体に投与することを含みうる。これは、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌状態を有する個体を同定した後に行いうる。
【００９１】
該活性化合物を単独で投与することは可能ではあるが、その化合物を、上記で定義した活性化合物の少なくとも１種を、１種以上の製薬上許容される担体、佐剤、賦形剤、希釈剤、充填剤、バッファー、安定化剤、保存剤、滑沢剤、又はその他の当業者に周知の物質、及び任意で他の治療薬又は予防薬と共に含む医薬組成物（例えば、製剤）として提示することが好ましい。
【００９２】
上述の塩基除去修復阻害剤、例えば１種以上の本明細書に記載の製薬上許容される担体、賦形剤、バッファー、佐剤、安定化剤又は他の物質と共に混合された阻害剤を含む医薬組成物を、本明細書に記載の方法において用いることができる。
【００９３】
本明細書で用いる「製薬上許容される」という用語は、化合物、物質、組成物、及び／又は投与剤形であって、健全な医学的判断で認めうる範囲内にあり、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症をもたらさず被験体（例えばヒト）の組織との接触のための使用に適しており、妥当な利益／危険性比を示すものであることを意味する。担体、賦形剤などの各々はまた、製剤中の他の成分と適合しうるという意味でも「許容される」ものでなければならない。
【００９４】
適切な担体、賦形剤などについては、標準的な製薬の教科書、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1990中に記載されている。
【００９５】
該製剤は単位投与剤形で都合よく提供することができ、製薬業界で周知のいずれかの方法によって調製することができる。そのような方法は、該活性化合物を１種以上の補助成分からなる担体と会合させるステップを含む。一般的には、該製剤は、該活性化合物を液状担体若しくは微粉化した固体担体、又はその双方と均一に十分に会合させ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００９６】
製剤は、液剤、溶剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、シロップ剤、錠剤、ロゼンジ、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、アンプル剤、坐剤、ペッサリー、軟膏、ゲル剤、ペースト、クリーム、噴霧剤、ミスト、フォーム、ローション、オイル、ボーラス剤、舐剤、又はエアロゾルの形態とすることができる。
【００９７】
ＢＥＲ阻害剤又は該阻害剤を含む医薬組成物は、任意の都合のよい投与経路により被験体に投与することができる。投与経路は、全身／末梢に、又は所望の作用部位に対してであるかどうかにかかわらず、例えば限定されるものではないが、経口（例えば摂取により）、局所（例えば経皮、鼻腔内、眼内、口腔内及び舌下）、経肺（例えば、例としてエアロゾルを用いて、例として口若しくは鼻から、吸入若しくは吸送療法により）、直腸内、経膣内、非経口、例えば注射（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心腔内、くも膜下腔内、髄腔内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、及び胸骨内、デポーの移植により（例えば皮下又は筋肉内）が挙げられる。
【００９８】
経口投与（例えば摂取により）に適した製剤は、別個の単位として提供することができ、それは例えば、カプセル、カシェ剤、若しくは錠剤で、各々が定量の該活性化合物を含有しているもの；粉末剤又は顆粒剤；水性若しくは非水性液体中の溶剤若しくは懸濁剤；又は水中油型乳剤若しくは油中水型乳剤；ボーラス剤；舐剤；又はペーストなどである。
【００９９】
錠剤は、例えば圧縮又は成形などの従来法で任意で１種以上の補助成分と共に作製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械中で、粉末や顆粒などの自由流動体とした該活性化合物を圧縮する、任意で１種以上の結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、トラガカント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤若しくは希釈剤（例えば、乳糖、微晶質セルロース、リン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）；崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）；界面活性剤又は分散剤又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）；及び保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸）と混合して圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性の液状希釈剤で湿潤化した粉末の化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって作製することができる。錠剤は任意でコーティング又は切れ目を入れることができ、また、錠剤に含まれる該活性化合物の遅延放出若しくは制御放出が行われるように、例えば、所望の放出プロフィールを得るためにヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で用いることによって製剤化することができる。錠剤は任意で腸溶性コーティングを施したものとすることができ、胃ではなく腸の一部で放出するようにすることができる。
【０１００】
非経口投与（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内注射を含む注射）に適した製剤としては、さらに、抗酸化剤、バッファー、保存剤、安定化剤、静菌剤、及び該製剤を、意図しているレシピエントの血液と等張とする溶質などを含んでいてよい、水性及び非水性の等張で発熱性物質不含の無菌の注射用液体；並びに、懸濁剤及び増粘剤を含んでいてよい、水性及び非水性無菌懸濁液；並びに該化合物が血液成分若しくは１以上の器官に標的化されるよう設計されているリポソーム又はその他の微粒子系、が挙げられる。このような製剤中に用いられる適切な等張のビヒクルの例としては、注射用塩化ナトリウム水溶液、リンゲル液、又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。典型的には、その液体中の活性化合物の濃度は約１ｎｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬである。該製剤は単位投与量又は多数回投与量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアルに入れた形で提供することができ、無菌の液状担体、例えば注射用水を使用直前に添加することのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）された条件で保存することができる。即時使用の注射用溶液及び懸濁液は無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。製剤はリポソーム又はその他の微粒子系の形態とすることができ、それらは該活性化合物が血液成分若しくは１以上の器官に標的化されるよう設計されている。
【０１０１】
当業者であれば、該活性化合物、及び該活性化合物を含む組成物の適切な投与量は、患者毎に異なることが理解されよう。最適な投与量の決定は、通常は本発明の治療の治療上の有益性のレベルと有害な副作用の危険性とのバランスを取ることを必要とする。選択された投与量のレベルは様々な因子によって変わり、そのような因子としては、限定されるものではないが、その特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、該化合物の排泄速度、治療期間、組み合わせて用いられるその他の薬剤、化合物、及び／又は物質、並びに患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、及び病歴が挙げられる。一般的には投与量は作用部位で有害な副作用を実質的に起こすことなく所望の効果を達成できるような局所濃度が選択されるが、化合物の量と投与経路は究極的には医師の裁量で決定されることとなる。
【０１０２】
ＢＥＲ経路阻害剤を含む組成物は、癌細胞ＤＮＡに損傷を与える標準的な化学療法と組み合わせて本明細書に記載の方法で用いることができる。好適な薬剤としては、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ活性の阻害剤（カムプトテシンなど）、イリノテカン、トポテカン及びルビテカンなどの薬剤、アルキル化剤（テモゾロミド及びＤＴＩＣ（ダカルバジン）など）、並びに白金薬剤（シスプラチン、シスプラチン−ドキソルビシン−シクロホスファミド、カルボプラチン及びカルボプラチン−パクリタキセルなど）が挙げられる。
【０１０３】
他の好適な化学療法剤としては、ドキソルビシン−シクロホスファミド、カペシタビン、シクロホスファミド−メトトレキセート−５−フルオロウラシル、ドセタキセル、５−フロウラシル−エピルビシン−シクロホスファミド、パクリタキセル、ビノレルビン、エトポシド、ＰＥＧ付加リポソームドキソルビシン、及びトポテカンが挙げられる。
【０１０４】
かかる薬剤を用いた個体の処置は当技術分野で周知である。
【０１０５】
ｉｎ ｖｉｖｏの投与は１回の投与で、持続的投与で、又は治療の全期間にわたって間欠的に（例えば、適切な間隔をおいて分割した投与量で）行うことができる。最も効果的な投与方法と投与量を決定するための方法は当業者にはよく知られており、治療に用いる製剤、治療の目的、治療しようとする標的の細胞、及び治療しようとする被験体によって異なる。単回又は複数回の投与は治療担当医師によって選択された投与量及び投与パターンで行うことができる。
【０１０６】
通常は、該活性化合物の適切な投与量は、被験体の体重１ｋｇあたり１日に約１００μｇから約２５０ｍｇの範囲である。該活性化合物が塩、エステル、プロドラッグなどである場合には、投与量は親化合物に基づいて計算され、用いられる実際の重量は相応に増加する。
【０１０７】
本発明の方法はまた、個体における癌状態の調査及び評価において有用でありうる。
【０１０８】
癌状態におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性を評価する方法は、
塩基除去修復阻害剤を上記状態を有する個体から採取した癌細胞サンプルと接触させるステップ、及び
対照サンプルと比較して上記サンプル中の細胞死の量を測定するステップ
を含みうる。
【０１０９】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性のレベルが正常な対照細胞と比較して上記サンプル中の細胞死が増大していることは、上記癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損することを示す。
【０１１０】
個体は、癌状態を有しているものであり、サンプルは、癌細胞サンプル、例えば腫瘍生検に由来するものでありうる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、塩基除去修復阻害剤はＰＡＲＰ阻害剤である。従って、癌状態におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を評価する方法は、
ＰＡＲＰ阻害剤を癌状態を有する個体から採取した癌細胞サンプルと接触させるステップ、及び
対照サンプルと比較して上記サンプル中の細胞死の量を測定するステップ
を含みうる。
【０１１２】
対照細胞と比較して上記サンプルの細胞におけるＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性が増大していることは、上記癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を欠損することを示す。
【０１１３】
ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性の増大は、癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損表現型、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ１発現又は活性の低減又は消失を有することを示しうる。
【０１１４】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を欠損すると同定された癌状態、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損表現型を有する状態は、そのような状態を特異的に対象とする治療に供することができる。好適な治療としては、ＤＮＡ架橋剤、例えばマイトマイシンＣ、シスプラチン又はカルボプラチンなどの使用が挙げられる。
【０１１５】
上記方法を用いて、ＨＲを標的とする治療、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損表現型を有する癌に特異的な治療に対する、個体の癌状態の応答を予測しうる。
【０１１６】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌を標的とする治療に対する、個体の癌状態の応答の予測方法は、
ＢＥＲ阻害剤、例えばＰＡＲＰ阻害剤を、癌状態を有する個体から採取した癌細胞サンプルと接触させるステップ、及び
対照サンプルと比較して上記サンプル中の細胞死の量を測定するステップ
を含みうる。
【０１１７】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性のレベルが正常な対照細胞と比較して上記サンプル中の細胞死が増大していること（ＰＡＲＰ阻害剤に対する感受性の増大）は、上記癌が上記治療に対して応答性であることを示す。
【０１１８】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌、例えばＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２欠損癌を標的とする治療としては、例えばＤＮＡ架橋剤（マイトマイシンＣ、シスプラチン又はカルボプラチンなど）が挙げられる。
【０１１９】
本発明の他の態様は、塩基除去修復を欠損する癌の治療における、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の阻害剤の使用に関する。
【０１２０】
個体における塩基除去修復を欠損する癌の治療方法は、
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路阻害剤を上記個体に投与するステップ
を含みうる。
【０１２１】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路阻害剤は、個体における塩基除去修復を欠損する癌の治療において使用するための医薬の製造において用いることができる。
【０１２２】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の阻害剤は、上述した１又はそれ以上の経路成分の阻害剤を含みうる。好適な阻害剤としては、ＡＴＭ阻害剤が挙げられる。
【０１２３】
ＡＴＭ阻害剤は、例えば式Ｉ：
【化３】
【０１２４】
〔式中、
ＹはＯ又はＳのいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、水素、任意により置換されていてもよいＣ１−７アルキル基、Ｃ３−２０複素環基、又はＣ５−２０アリール基であるか、あるいはそれらが結合する窒素原子と共に、４〜８個の環原子を有し任意により置換されていてもよい複素環を形成してもよく、
Ｒ３は、任意により置換されていてもよいＣ５−２０カルボアリール基とエーテル架橋若しくはチオエーテル架橋により結合したフェニル基；フェニル基；及びさらなる架橋基により任意に連結されていてもよい、任意により置換されていてもよいＣ５−２０カルボアリール基（両方の基上のエーテル架橋若しくはチオエーテル架橋に隣接して結合して、フェニル基及びＣ５−２０カルボアリール基の両方と縮合した任意により置換されていてもよいＣ５−７酸素若しくは硫黄含有複素環を形成する）；さらに任意により置換されていてもよいフェニル基〕
の化合物、又はその異性体、塩、溶媒和物、化学的保護形態若しくはプロドラッグでありうる。
【０１２５】
かかる阻害剤は、ＷＯ０３／０７０７２６号にさらに詳細に記載されている。
【０１２６】
他の阻害剤としては、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の成分のペプチジル断片であり、上述の核酸をコードするものが挙げられる。
【０１２７】
癌状態は、上述の方法を使用してＢＥＲ活性を欠損することが確認されたものでよい。
【０１２８】
ここからは、本発明の態様を、限定するものではなく例として、以下で述べる添付の図面及び実験による実例に即して説明する。当業者には、別の態様及び実施形態が明らかとなろう。
【０１２９】
本発明の様々なパラメーター及び特徴は先に述べている。疑いを回避するために、それらのパラメーター及び特徴のすべての組合せ及び副次的な組合せが本発明に含まれることを述べておく。
【０１３０】
本明細書で言及するすべての文書は、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１３１】
材料及び方法
ＲＮＡ干渉
次のＲＮＡｉ標的配列、すなわち、（ｉ）マウスParp1 5'-GCGGAGUACGCCAAGUCCA-3'、（ｉｉ）スクランブル対照5'-CAUGCCUGAUCCGCUAGUC-3'を発現させる遺伝子特異的なｐＳＵＰＥＲ（T. R. Brummelkampら、Science 296, 550-3 (2002)）構築物を作製した。
【０１３２】
ＣＭＶ ＩＥプロモーター及びｅＣＦＰ（強化型シアン蛍光タンパク質）を含む１．６ｋｂの断片を、ｐＥＣＦＰ−Ｍｉｔｏ（Invitrogen）から、得られたｐＳＵＰＥＲ構築物のＳａｐＩ部位にサブクローニングし、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１及びｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを作製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）を製造者の使用説明書に従って使用しながら、Ｄ３ ＥＳ細胞にこれらのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトしてから４８時間後、２０ｍＭトリスｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、及びプロテアーゼ阻害剤からなる緩衝液を使用して、全体の細胞溶解物を作製した。各溶解物３０μｇをＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｐｒｅ Ｃａｓｔ Ｇｅｌｓ（Novex）上で電気泳動にかけ、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Biorad）上にブロットした。ウサギポリクローナル抗ＰＡＲＰ−１抗体（Cell Signalling、カタログ番号9542）又はウサギ抗ＧＦＰ／ＣＦＰ抗血清（Invitrogen、カタログ番号R970-01）を用いてブロットを検出した後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰとの２回目のハイブリダイゼーションを行い、その後ＥＣＬ（商標）（英国Amersham）を使用して化学発光を検出した。
【０１３３】
ＰＡＲＰの小分子阻害剤：
ＰＡＲＰ阻害剤をＷＯ０２／３６５７６号に記載のとおりに合成した。化学阻害剤は、ＤＭＳＯに１０ｍＭで溶解させ、−２０℃の暗所で保管した。
【０１３４】
細胞系
ＶＣ８細胞及びマウスＢｒｃａ２ ＢＡＣを補完した誘導体は、M. Kraakman-van der Zwetら、Mol Cell Biol 22, 669-79 (2002)に記載されているとおりのものとした。Ｂｒｃａ２機能を欠損するＥＳ細胞は、以前から記載されている（Tuttら、(2002) EMBO Rep 3, 255-60）。Ｂｒｃａ１を欠損するＥＳ細胞の構築は、以前から確認されているが（Forayら、(2003) Embo J 22 2860-71)、他でも記載があるであろう。ＨＢＬ１００細胞にｐＳＵＰＥＲ ＢＲＣＡ１ ＲＮＡｉプラスミドをトランスフェクトし、ジェネテシンを用いて３週間かけて選択した。ノーザンブロットによって分析してＢＲＣＡ１が発現されているかどうかを基準にクローンを選択した。
【０１３５】
クローン原性アッセイ
Ｐａｒｐ１ ＲＮＡノックダウンに対する感受性を測定するために、０．１％ゼラチンでコートした組織培養皿で維持したＥＳ細胞に、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１又はｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを、抗生物質ブラストサイジン（ｐＥＦ−Ｂｓｄ、Invitrogen）への耐性を示すベクターと共に先のようにトランスフェクトした。トランスフェクトしてから２４時間後、細胞をトリプシン処理し、６ウェルプレートに播いた。トランスフェクトしてから４８時間後、ブラストサイジンでの処理を開始し、細胞に３日毎に与え直した。１０〜１４日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。細胞を約５０個より多くを含むコロニーをカウントした。
【０１３６】
化学阻害剤に対する感受性を測定するために、指数関数的に増殖させた細胞培養物をトリプシン処理し、様々な密度で６ウェルプレートのマイトマイシンＣ不活性化マウス胚性線維芽細胞上に播き、適切な場合では、１８時間後に阻害剤で処理した。連続的暴露のために、細胞に新鮮な培地及び阻害剤を４日毎に与え直した。定期的に暴露するために、阻害剤を指定の期間にわたって加え、次いで細胞を洗浄し、新鮮な培地を与え直した。１０〜１４日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。細胞を約５０個より多くを含むコロニーをカウントした。実験は、少なくとも３回３連で実施した。
【０１３７】
ＦＡＣＳ分析
ＤＮＡ含有量の測定では、細胞を７０％のエタノールで固定し、ＲｎアーゼＡ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共にインキュベートし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）によって分析した。ホスホ−ヒストンＨ３分析では、細胞を７０％エタノールで固定し、０．２５％トリトンＸ−１００で透過性にし、抗ホスホ−ヒストンＨ３抗体（Upstate Biotechnology）と共に３時間、次いでＦＩＴＣ−抗ウサギＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共に３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ分析のための処理は先のとおりである。
【０１３８】
アポトーシス分析
細胞をトリプシン処理し、培養上清及び培地洗浄物を保持した。これらをプールし、細胞を冷ＰＢＳ−Ａで洗浄した後、結合用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ７．４））に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。１００μｌの懸濁液を暗所で５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（BD Biosciences）／０．１μｇのヨウ化プロピジウムと共に１５分間室温でインキュベートし、４００μｌの結合用緩衝液を加え、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）によって直ちに分析した。
【０１３９】
Ｒａｄ５１焦点の形成
ＥＳ細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した様々な濃度のＰＡＲＰ阻害剤中で４８時間培養し、ＰＢＳ中０．２％トリトンＸ１００で透過性にした。細胞を、ウサギ抗Ｒａｄ５１ポリクローナル抗体（Ａｂ５５１９２２、BD-Pharmingen、英国オックスフォード）の１００倍希釈物で染色した。洗浄した後、一次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Alexa）で可視化し、核をＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物（Molecular Probes）で可視化した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用してＲａｄ５１焦点を視覚化し、定量した。
【０１４０】
コメットアッセイ
ＶＣ８細胞及びＶＣ８−ＢＡＣ細胞をプレートに播いてから２４時間後に、１μＭ ＫＵ００５８６８４で３０時間処理した。それ以降の作業はすべて暗所で実施した。記載されているとおり（Lemay及びWood, 1999）、細胞をＰＢＳで洗浄摩砕してからコメット分析を行った。ＬＭＰアガロース（ＰＢＳ中０．５％）に懸濁させた細胞を、コメットスライド（Trevigen、米国ゲーサーズバーグ）上に広げ、固まるまで４℃に置いておいてから、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス塩基、１％ラウリルサルコシン酸ナトリウム、０．０１％トリトンＸ−１００中で４５分間可溶化した。スライドを５分間かけてＴＢＥにトランスファーしてから、１８Ｖで１５分間の電気泳動にかけた。次いで、スライドを１００％エタノールで５分間かけて固定し、風乾した後、ＳＹＢＲグリーン色素を加え、フルオレセインフィルター（Nikon）を使用して落射蛍光によって可視化した。Ｎｉｋｏｎを供給元とするＬｕｃｉａ Ｇ画像処理パッケージのコメットソフトウェアモジュールを使用してコメットを分析した。３回の独立した実験それぞれについてデータ点あたり５０コメットを調べ、平均テールモーメントを算出した。
【０１４１】
有糸分裂染色体分析
ＥＳ細胞をゼラチン上に播き、２４時間かけて化学阻害剤で処理した後、１時間コルセミド処理した。細胞を収集し、固定し、スライドに滴下し、乾燥させ、ＤＡＰＩで染色した後、顕微鏡で染色体を分析した。
【０１４２】
ＥＳ細胞の異種移植片及びＫＵ００５８６８４による処置
ＥＳ細胞由来の腫瘍（奇形腫）は、２×１０８個のＥＳ細胞を６〜８週齢の胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスに皮下注射して生成した。２０匹のマウスにＢｒｃａ２を欠損するＥＳ細胞を注射し、同等の集団に同質遺伝子野生型細胞を注射した。細胞を注射してから２日後、ＫＵ００５８６８４又はビヒクルでの処置を開始した。３日間続けて、２回分のＫＵ００５８６８４（又はビヒクル）をそれぞれ動物１ｋｇあたり１５ｍｇの投与量で６時間の間隔をおいて腹腔内投与した。次いでこの処置を５日間休止し、次いでさらに３日続けて（前のように）再開した。腫瘍の増殖を最低０．３ｃｍ３の体積からモニターした。図１６のデータは、合計４０匹を使用する２件の別個の実験を表すものである。
【０１４３】
ＢＲＣＡ１細胞欠損系統の生成
ＭＣＦ７スクランブル細胞系及びＭＣＦ７−３．２３細胞系は、ＭＣＦ７乳腺癌細胞に遺伝子特異的なｐＳＵＰＥＲ構築物を安定にトランスフェクトして作製した。次のＲＮＡｉ標的配列、すなわち、（ｉ）ヒトＢＲＣＡ１ 5'-GGAACCTGTCTCCACAAAG-3'、（ｉｉ）スクランブル対照5'-CATGCCTGATCCGCTAGTC-3'を発現させる遺伝子特異的なｐＳＵＰＥＲ構築物を作製した。ヒトＥＦ１ａプロモーター及びブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｄ）を含む１．８ｋｂ断片を、ｐＥＦＢｓｄ（Invitrogen）から、得られたｐＳＵＰＥＲ構築物のＳａｐＩ部位にサブクローニングし、ｐＳＵＰＥＲ−Ｂｓｄ−ＢＲＣＡ１及びｐＳＵＰＥＲ−Ｂｓｄ−ｓｃｒａｍｂｌｅｄを作製した。ＦｕＧｅｎｅ６（Roche）を製造者の使用説明書に従って使用しながら、ＭＣＦ７細胞にこれらのプラスミドをトランスフェクトした。ブラストサイジン中で選択した後、耐性クローンをリアルタイムＰＣＲによって、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡのサイレンシングについて評価した（Egawaら、Oncology. 2001; 61(4): 293-8、Egawaら、Int J Cancer. 2001年7月;95(4):255-9）。ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡのレベルが低下しているクローンを（ブラストサイジン選択を行いながら）８継代にわたって培養し、リアルタイムアッセイを繰り返した。細胞系ＭＣＦ７−３．２３は、構築物ｐＳＵＰＥＲ−Ｂｓｄ−ｓｃｒａｍｂｌｅｄを有するＭＣＦ７クローンの３０％しかＢＲＣＡ１を発現しないことが示された。
【０１４４】
結果
ｓｉＲＮＡによるＰａｒｐ１タンパク質レベルの低下
Ｈ１プロモーター（T. R. Brummelkampら、Science 296, 550-3 (2002)）の制御下でＰａｒｐ１特異的なｓｉＲＮＡを発現させ、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下で強化型シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）を発現させるプラスミド（ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１）を、Ｄ３マウス胚幹細胞にトランスフェクトした。対照として、無関係のスクランブルｓｉＲＮＡを発現させるプラスミドｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを別途トランスフェクトした。トランスフェクトしてから４８時間後、細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロッティングによって分析した。ブロットをポリクローナル抗ＰＡＲＰ−１抗体又は抗ＧＦＰ／ＣＦＰ抗血清で検出した。
【０１４５】
ＰＡＲＰ１特異的ｓｉＲＮＡ発現細胞中のＰＡＲＰ１レベルは、対照細胞中のＰＡＲＰ１レベルよりもはるかに低いことが認められた。ｅＣＦＰのレベルは、Ｐａｒｐ１ ｓｉＲＮＡ発現細胞中でも対照細胞中でも同様であった。
【０１４６】
Ｐａｒｐ１特異的ｓｉＲＮＡによるノックダウン後のＢＲＣＡ１欠損及びＢＲＣＡ２欠損細胞の生存度の低下
野生型、Ｂｒｃａ１−／−、及びＢｒｃａ２−／−のマウス胚幹（ＥＳ）細胞に、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１又はｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌを１０：１の比でブラストサイジン耐性をコードするプラスミドｐＥＦ−Ｂｓｄと共にトランスフェクトした。ブラストサイジン耐性クローンを選択し、定量した。結果は、ｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌトランスフェクト後のコロニー数に対するｐＳＵＰＥＲ−ｅＣＦＰ−Ｐａｒｐ１トランスフェクト後のコロニー数をプロットした図１に示す。エラーバーは、平均周辺の一標準偏差に等しい。
【０１４７】
対照ｓｉＲＮＡを使用してトランスフェクション効率について補正を行った後、Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損のどちらのＥＳ細胞の生存度も、Ｐａｒｐ１の発現が阻害されたときかなり低下したことは明らかであった。
【０１４８】
化学ＰＡＲＰ阻害剤処理後のＢＲＣＡ１欠損及びＢＲＣＡ２欠損細胞の生存度の低下
Ｐａｒｐ活性の化学阻害剤を使用して、先に認められたＢｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞の選択的な阻害を確認した。２種の異なるＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５８９４８と、活性は弱いが化学的に同類の化合物ＫＵ００５１５２９を使用した（図２）。これらの新規なＰＡＲＰ阻害剤は、フタラジン−１−オンのコアを中核とし、ＰＡＲＰ基質ＮＡＤ＋の競合的阻害剤である。ＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５８９４８は、タンパク質ＰＡＲＰ−１及びＰＡＲＰ−２のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ活性の強力かつ特異的な阻害剤であり、１μＭまでの濃度ではヴォールトＰＡＲＰ、タンキラーゼ、又はＰＡＲＰ−３を阻害しない。逆に、ＫＵ００５１５２９は、化学的に同類であるにもかかわらず、これらの酵素の阻害では約２５０分の１の効果しかもたない。
【０１４９】
ＫＵ００５８６８４、ＫＵ００５８９４８、及びＫＵ００５１５２９を使用して、Ｂｒｃａ１又はＢｒｃａ２を欠損する細胞の、ＰＡＲＰ活性の阻害に対する感受性を調べた。クローン原性アッセイでは、Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損のどちらの細胞系も、この点を除いて同質遺伝子的な細胞と比べるとＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５８９４８に対する感受性が極めて高かったことが示された（図３、図４）。ＫＵ００５８６８４のＳＦ５０（細胞の５０％が生存する投与量）は、Ｂｒｃａ１では３．５×１０−８Ｍ、Ｂｒｃａ２では１．５×１０−８Ｍであり、野生型の細胞では３．５×１０−８Ｍ程度であった。これは、Ｂｒｃａ１及びＢｒｃａ２突然変異細胞では、野生型と比べてそれぞれ５７倍及び１３３倍感受性が高まっていたということである。Ｂｒｃａ２を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞でも同様の結果が得られ、Ｂｒｃａ２が補完された誘導体と比べて感受性が１０００倍以上高まっていたことが示された（図１４及び図１５）。Ｂｒｃａ１及びＢｒｃａ２突然変異細胞のＫＵ００５８９４８に対する感受性は、ＫＵ００５８６８４さえも凌ぐものであった。対照的に、ＫＵ００５１５２９は、野生型Ｂｒｃａ１又はＢｒｃａ２を欠く細胞に対して、野生型細胞と比べると選択的な効果を及ぼさなかった。このことは、ｓｉＲＮＡデータと共に、感受性の機序が特にＰＡＲＰの阻害によるものであることを示している。どの阻害剤も、Ｂｒｃａ１又はＢｒｃａ２突然変異についてヘテロ接合性である細胞に対して選択的な効果を及ぼさなかったことは注目に値する。
【０１５０】
Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞のクローン原性生存に対するＫＵ００５８６８４の効果の時間経過依存性
細胞を、規定された時間をかけて異なる濃度のＫＵ００５８６８４に暴露した。次いで阻害剤を除去し、クローン原性アッセイを使用して効果を測定した。ＫＵ００５８６８４のクローンの増殖に対する阻害効果は、比較的短い暴露時間、すなわち４時間後に明らかとなり、２４時間の暴露によって本質的に完全なものになった（図５及び図６）。ＰＡＲＰ阻害効果は、短い暴露の後に阻害剤なしで１０〜１４日置いても増殖を妨げるので、可逆的であることがわかった。
【０１５１】
細胞周期の停止についてのＰＡＲＰ阻害の影響
ＦＡＣＳ分析を使用して、ＰＡＲＰ阻害が細胞周期の停止をもたらしたかどうかを判定した。細胞を様々な時間をかけてＫＵ００５８６８４に暴露し、次いでＢｒｄＵで標識し、細胞周期の各期の細胞の割合を調べた。結果は図７及び図８に示す。ＫＵ００５８６８４は、細胞の完全な停止状態を誘発することが認められ、四倍体ＤＮＡ含有量から、細胞周期のＧ２期又はＭ期での停止状態であることが示唆された。この停止状態をさらに特徴付けるために、細胞の分析を、ＤＮＡ含有量、及びＭ期のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ３について行った。この停止状態をさらに特徴付けるために、細胞の分析を、ＤＮＡ含有量、及びＭ期のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ３について行った。（図１２及び図１３）。停止状態にある細胞の大半は、抗ホスホヒストンＨ３抗体によって標識されず、細胞の大半がＧ２で停止したことが示唆された。
【０１５２】
Ｒａｄ５１焦点の形成
Ｂｒｃａ依存的二本鎖切断修復の１の証明は、Ｒａｄ５１を含む核中の焦点の形成である。ＫＵ００５８６８４が野生型細胞並びにＢｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞中でＲａｄ５１焦点を引き出す能力を調査した。
【０１５３】
野生型細胞、並びにＢｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損ＥＳ細胞を、４８時間かけて異なる濃度のＫＵ００５８６８４に暴露した。次いで、Ｔａｒｓｏｕｎａｓによって記載されているとおりに細胞を固定し、ＲＡＤ５１焦点の染色を行った（Tarsounas Mら、Oncogene. 2003 22(8):1115-23）。
【０１５４】
野生型ＥＳ細胞では、ＫＵ００５８６８４が用量依存的にＲａｄ５１焦点の形成を引き起こした（図９）。対照的に、Ｂｒｃａ１欠損又はＢｒｃａ２欠損細胞では焦点が誘導されなかった。この後者の発見は、ＤＮＡ損傷剤がＢｒｃａ１欠損又はＢｒｃａ２欠損細胞中ではＲａｄ５１焦点形成を引き起こし得ないという以前からの観察と一致する。
【０１５５】
したがって、ＫＵ００５８６８４は、二本鎖ＤＮＡ切断などの損傷又は二本鎖ＤＮＡ切断へと変性する損傷を引き起こし、これらの損傷は、Ｒａｄ５１を含みＢｒｃａ１及びＢｒｃａ２を必要とする複合体によって修復されることがわかる。重要なことであるが、ＫＵ００５１５２９は、同等の用量でＲａｄ５１焦点形成を引き起こさず、感受性の機序の特異性が強調された。
【０１５６】
コメットアッセイ
ＰＡＲＰ活性の阻害がＤＮＡ二本鎖切断を生じるかどうかを判定するために、Ｂｒｃａ２突然変異細胞及びその同質遺伝子対応物で中性コメットアッセイを実施した。結果を図１０に示す。１μＭ ＫＵ００５８６８４に３０時間暴露した後、Ｂｒｃａ２欠損ＶＣ８細胞のテールモーメントは４．７倍に増大し、補完ＶＣ８−ＢＡＣ系統ではテールモーメントの有意な増大がなかった。この結果は、ＰＡＲＰｉによって引き起こされたＤＮＡ二本鎖切断が、Ｂｒｃａ２欠損系統では修復されないままであることを示すものである。
【０１５７】
有糸分裂染色体分析
Ｂｒｃａ１欠損及びＢｒｃａ２欠損細胞の有糸分裂染色体を調べると、ＫＵ００５８６８４処置が頻繁に重大な異常をもたらしたことが明らかになった。それらには、染色分体切断、並びに三放射状及び四放射状の染色体が含まれる。これらの表現型は、姉妹染色分体遺伝子の変換によって二本鎖切断が修復されていないこと、並びにそれに代わるエラープローン経路の使用が多くなっていることの指標となる。
【０１５８】
ＥＳ細胞の異種移植片及びＫＵ００５８６８４による処置
同質遺伝子ＥＳ細胞及びＢｒｃａ２欠損ＥＳ細胞由来の腫瘍（奇形腫）を上述のように胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス中に生成させた。
【０１５９】
野生型及びＢｒｃａ２欠損異種移植片腫瘍の増殖に対するＫＵ００５８６８４の効果を測定し、その結果を図１６に示す。
【０１６０】
ＫＵ００５８６８４は、Ｂｒｃａ２欠損腫瘍の増殖を野生型腫瘍と比べて劇的に低減することが認められた。
【０１６１】
ＢＲＣＡ１細胞欠損系統におけるＰＡＲＰ阻害効果
ＭＣＦ７スクランブル細胞系及びＭＣＦ７−３．２３細胞系を上述のように生成した。ＭＣＦ７−３．２３は、ＢＲＣＡ１をＭＣＦ７スクランブルの３０％だけ発現することがわかった。
【０１６２】
ＭＣＦ７スクランブル細胞及びＭＣＦ７−３．２３細胞をＫＵ００５８６８４及びＫＵ００５１５２９で処理し、細胞の生存度を測定した（図１７及び図１８）。ＫＵ００５８６８４は、強力なＰＡＲＰ阻害剤であり、ＫＵ００５１５２９はそれよりも効果が弱い。
【０１６３】
ＭＣＦ７スクランブル細胞もＭＣＦ７−３．２３細胞も、ＫＵ００５１５２９に対して有意な感受性を示さなかった（図１８）。しかし、両方の細胞系がＫＵ００５８６８４に対して感受性であった。
【０１６４】
ＭＣＦ７−３．２３細胞は、ＫＵ００５８６８４に対する感受性がＭＣＦ７スクランブル細胞よりも有意に高いことがわかった。
【０１６５】
ＰＡＲＰのＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ経路との相互作用
本発明の範囲をいかようにも限定することなく、ＰＡＲＰとＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ経路の相互作用について考えられるモデルを図１１に示す。
【０１６６】
ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）は、酸化的損傷及びその修復のために形成する。Ｐａｒｐ−１ ＰＡＲポリメラーゼ活性を阻害すると、ＸＲＣＣ１骨格タンパク質の動員、及びその後ＤＮＡポリメラーゼによるＳＳＢギャップの補充が妨げられる（図１１Ａ）。
【０１６７】
多数のＳＳＢが残り、ＤＮＡ複製フォークと接触する。ＳＳＢの箇所に鋳型鎖がないために、ＤＳＢになり、位置によっては複製フォークの崩壊を引き起こすこともある（図１１Ｂ）。
【０１６８】
損傷のない姉妹染色分体鋳型が近くにあると、ＲＡＤ５１でコートされた一本鎖ＤＮＡフィラメントが姉妹染色分体に侵入し、姉妹染色分体の組換え修復が開始されるようになる。この過程は、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に依存しており、複数のＲＡＤ５１核焦点の形成を伴う。崩壊した複製フォークは、同様の機序によって再出発することができる（図１１Ｃ）。
【０１６９】
組換え中間体のホリデー接合点が分割されると、姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）が起こる場合もある。Ｐａｒｐ−１阻害の際に余分な数のＳＳＢが複製フォークと接触すると、ＳＣＥが増加することになる（図１１Ｄ）。
【０１７０】
機能的ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２が存在しないと、ＲＡＤ５１焦点形成及び姉妹染色分体組換えがひどく損なわれる。過剰の未修復ＳＳＢは、ＤＮＡ複製の際にＤＮＡ ＤＳＢを生じ、姉妹染色分体組換えは起こらない。これらは、染色分体が切断され、未修復のままとなるか又はエラープローンＲＡＤ５１依存性の機序によって修復されて、複雑な染色体の再配列が引き起こされる。これらの細胞は、Ｇ２／Ｍ ＤＮＡ損傷チェックポイントに差し掛かるときに停止状態になり、さらに永久に停止状態になり、又はアポトーシスに至る（図１１Ｅ）。
【０１７１】
本明細書で示すＲＮＡｉデータは、ＫＵ００５１５２９が有効でなかったという観察と共に、ＰＡＲＰ阻害が、観察された感受性誘発効果の一因であることを示すものである。
【０１７２】
ＰＡＲＰ阻害には、通常は姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）によって修復される損傷が含まれる（Wang ZQら、(1997) Genes Dev. Vol. 11(18):2347-58並びに'From DNA damage and stress signalling to cell death' G. de Murcia及びS. Shall編、Oxford University Press (2000)）。ＰＡＲＰ阻害は、ＳＣＥを増進させることがわかっているが、ＤＳＢの遺伝子変換の増進を相伴わず、したがって、Ｒａｄ５１依存的な組換え経路は全体として強化されない（Schultz Nら、2003, Nucleic Acids Research; vol.31 (17): 4959-4964）。
【０１７３】
本明細書に記載の人工的致死手法は、ａ）ＢＲＣＡキャリアの腫瘍、ｂ）ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復の他の成分が欠損している腫瘍のどちらの治療でも有用となり得る。
【０１７４】
ＢＲＣＡ突然変異のキャリアでは、発症年齢及び腫瘍病理が異なることが記載されているとはいえ、治療は、現在のところ散発性疾患の患者と同じものである。本発明は、これらの腫瘍に対する新しい手法を提供するものである。
【０１７５】
意味深いことに、ヘテロ接合に対する効果は認められなかった。このことは、たとえばＢＲＣＡ１／２突然変異を含むＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路突然変異のヘテロ接合キャリアにおける記載した方法の治療用途にとって重要である。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】Ｐａｒｐ１レベルの低下が、野生型細胞と比べてＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２突然変異細胞の生存度を低下させることを示す。
【図２】ＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８６８４、ＫＵ００５８９４８、及びＫＵ００５１５２９、並びにＰＡＲＰ−１酵素活性に対するそのＩＣ５０を示す図である。
【図３】ＰＡＲＰ阻害剤に暴露した細胞のクローン原性生存曲線を示す。ＰＡＲＰ阻害剤（ＫＵ００５８６８４（上）、ＫＵ００５８９４８（中）、ＫＵ００５１５２９（下））に連続的に暴露したＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：■）、Ｂｒｃａ１ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ１欠損（Ｃｒｅ１０：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図４】ＰＡＲＰ阻害剤に暴露した細胞のクローン原性生存曲線を示す。ＰＡＲＰ阻害剤（ＫＵ００５８６８４（上）、ＫＵ００５８９４８（中）、ＫＵ００５１５２９（下））に連続的に暴露したＢｒｃａ２野生型（Ｄ３：■）、Ｂｒｃａ２ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ２欠損（Ｃｒｅ２４：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図５】ＫＵ００５８６８４に１時間、４時間、及び２４時間暴露した後のクローン原性生存曲線を示す。ＫＵ００５８６８４に１時間（上）、４時間（中）、及び２４時間（右）暴露した後のＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：■）、Ｂｒｃａ１ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ１欠損（Ｃｒｅ１０：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図６】ＫＵ００５８６８４に１時間、４時間、及び２４時間暴露した後のクローン原性生存曲線を示す。ＫＵ００５８６８４に１時間（上）、４時間（中）、及び２４時間（右）暴露した後のＢｒｃａ２野生型（Ｄ３：■）、Ｂｒｃａ２ヘテロ接合性（Ｃｒｅ６：黒三角）、及びＢｒｃａ２欠損（Ｃｒｅ２４：●）の各ＥＳ細胞を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図７】ＰＡＲＰ阻害剤で処理したＢＲＣＡ−１及びＢＲＣＡ−２突然変異細胞におけるＰＡＲＰ阻害が、Ｇ２／Ｍでの停止を増大したことを示す。０ｎＭ（左）、１０ｎＭ（中）、又は１μＭ（右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理し、ＦＡＣＳによって分析したＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：上）及びＢｒｃａ１突然変異（Ｃｒｅ１０：下）細胞を示す。
【図８】ＰＡＲＰ阻害剤で処理したＢＲＣＡ−１及びＢＲＣＡ−２突然変異細胞におけるＰＡＲＰ阻害が、Ｇ２／Ｍでの停止を増大したことを示す。０ｎＭ（左）、１０ｎＭ（中）、又は１μＭ（右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理し、ＦＡＣＳによって分析したＢｒｃａ２野生型（Ｄ３）及びＢｒｃａ２突然変異（Ｃｒｅ２４）細胞を示す。
【図９】野生型細胞でのＰＡＲＰ阻害によって誘発されるがＢｒｃａ１又はＢｒｃａ２欠損細胞では誘発されないＲａｄ５１焦点形成の定量分析を示す。
【図１０】ＢＲＣＡ２−／−ＶＣ８及びＢＲＣＡ２補完ＶＣ８−ＢＡＣの中性コメット分析を示す。ＫＵ００５８６８４（１μＭ）による３０時間の処理によって、ＢＲＣＡ２−／−細胞ではテールモーメントの増大が認められるが、ＢＲＣＡ２補完系統ではテールモーメントの有意な増大が認められないことから判断されるように、ＤＮＡ ＤＳＢを有意な増大が誘導される。３回の独立した実験の平均データに＋／−ＳＥＭが示され、各実験で５０コメットのテールモーメントの得点が付けられる。
【図１１】ＢＲＣＡ１突然変異及びＢＲＣＡ２突然変異細胞に対するＰＡＲＰ阻害の選択的効果について考えられるモデルを示す図である。
【図１２】０ｎＭ（左）、１０ｎＭ（中）、又は１μＭ（右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理し、ＦＡＣＳによって分析したＢｒｃａ１野生型（１１ＣＯ：上）及びＢｒｃａ１突然変異（Ｃｒｅ１０：）ＥＳ細胞と、Ｂｒｃａ２野生型（Ｄ３）及びＢｒｃａ２突然変異（Ｃｒｅ２４）細胞についてのホスホ−ヒストンＨ３ ＦＡＣＳデータを示す。
【図１３】０μＭ、１００μＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭ（それぞれ左から右）のＫＵ００５８６８４で２４時間処理したＶＣ８細胞及びＶＣ８ＢＡＣ細胞についてのホスホ−ヒストンＨ３ ＦＡＣＳを示す。
【図１４】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能を欠いている他の細胞におけるＰＡＲＰ阻害の効果の分析を示す。ＰＡＲＰ阻害剤（ＫＵ００５８６８４：上、ＫＵ００５８９４８：中、及びＫＵ００５１５２９：下）に連続的に暴露したＢｒｃａ２欠損（Ｖ−Ｃ８：■）及びＢｒｃａ２補完（Ｖ−Ｃ８ ＢＡＣ＋：黒三角）細胞のクローン原性生存曲線を示す。
【図１５】ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の機能を欠いている他の細胞におけるＰＡＲＰ阻害の効果の分析を示す。ＫＵ００５８６８４に１時間（上）、４時間（中）、及び２４時間（下）暴露した後のＢｒｃａ２欠損（Ｖ−Ｃ８：■）及びＢｒｃａ２補完（Ｖ−Ｃ８ ＢＡＣ＋：黒三角）細胞のクローン原性生存曲線を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図１６】ＥＳ異種移植片における腫瘍生成及びＫＵ００５８６８４処置の効果を示す。点線はビヒクル処置した野生型、太い実線は薬物ＫＵ００５８６８４処置した野生型、実線はビヒクル処置したＢｒｃａ２欠損、破線はＫＵ００５８６８４処置したＢｒｃａ２欠損を示す。
【図１７】一定範囲の濃度のＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８６８４に１２〜１４日間連続的に暴露したＢＲＣＡ１野生型（ＭＣＦ７スクランブル）及びＢＲＣＡ１サイレンシング型（ＭＣＦ７−３．２３）細胞のクローン生存曲線を示す。阻害剤の対数濃度を細胞の対数生存率に対してプロットしてある。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図１８】一定範囲の濃度のＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５１５２９に１２〜１４日間連続的に暴露したＢＲＣＡ１野生型（ＭＣＦ７スクランブル）及びＢＲＣＡ１サイレンシング型（ＭＣＦ７−３．２３）細胞のクローン生存曲線を示す。阻害剤の対数濃度を細胞の対数生存率に対してプロットしてある。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における癌の治療に使用するための医薬の製造における塩基除去修復（ＢＥＲ）経路の阻害剤の使用であって、前記癌は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損しているものである、上記使用。
【請求項２】
前記癌が、ＨＲによってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記癌細胞がＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損している、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてホモ接合性である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記個体が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記個体は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰの活性を阻害する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＢＥＲ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰのペプチド断片である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ＰＡＲＰの一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、ＤＮＡ損傷化学療法剤をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記治療が、ＤＮＡ損傷化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
個体における癌の治療方法であって、前記個体へＢＥＲ経路の阻害剤を投与するステップを含み、前記癌は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損しているものである、上記方法。
【請求項１９】
個体がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損している癌状態であることを確認するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体へＤＮＡ損傷化学療法剤を投与するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
癌状態の個体の評価方法であって、
個体から採取した癌細胞が、正常細胞と比べてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損していることを確認するステップと、
前記個体への投与に適するＢＥＲ経路阻害剤を準備するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記個体への投与に適するＤＮＡ損傷化学療法剤を準備するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、ＨＲによってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含む、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌細胞がＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌細胞は、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてホモ接合性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
個体からの癌細胞のＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を正常細胞と比較して判定することにより、前記癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌であることを確認する、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
個体からの癌細胞中に、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする核酸配列の１又は複数の突然変異又は多形性が存在するかどうかを判定することにより、前記癌がＨＲ依存的ＤＳＢ修復を欠損する癌であることを確認する、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記個体が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記個体が、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰ活性を阻害する、請求項１８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記塩基除去修復阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＢＥＲ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記阻害剤がＰＡＲＰのペプチド断片である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ＰＡＲＰアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
個体における癌の治療方法であって、
前記個体へＢＥＲ阻害剤を投与するステップを含み、
前記個体は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である、上記方法。
【請求項４０】
前記癌が、ＨＲによってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
個体が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてホモ接合性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰを阻害する、請求項３９から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＢＥＲ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰのペプチド断片である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、ＰＡＲＰアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記個体へＤＮＡ損傷化学療法剤を投与するステップを含む、請求項３９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用するための医薬の製造におけるＢＥＲ経路阻害剤の使用。
【請求項５４】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用するためのＢＥＲ経路阻害剤。
【請求項５５】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損している癌の治療に使用するためのＢＥＲ経路阻害剤。
【請求項５６】
個体の癌状態におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性の評価方法であって、
ＢＥＲ阻害剤と癌状態の患者から採取した癌細胞サンプルとを接触させるステップと、
前記サンプル中の細胞死の量を測定するステップと
を含む方法。
【請求項５７】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ＢＥＲの阻害剤がＰＡＲＰ阻害剤である、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＰＡＲＰ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＰＡＲＰ阻害剤がＰＡＲＰ配列のペプチド断片である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、ＰＡＲＰアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認する、請求項５６から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
癌がＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有することを確認する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌を標的とする治療に対する、個体の癌状態の応答を予測する方法であって、
ＢＥＲ阻害剤と癌状態の個体から採取した癌細胞サンプルとを接触させるステップと、
前記サンプル中の細胞死の量を測定するステップと
を含む方法。
【請求項６７】
実質的に添付の図面に記載のとおりかつそれに準拠したＢＥＲ阻害剤の使用。
【請求項１】
個体における癌の治療に使用するための医薬の製造における塩基除去修復（ＢＥＲ）経路の阻害剤の使用であって、前記癌は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損しているものである、上記使用。
【請求項２】
前記癌が、ＨＲによってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記癌細胞がＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損している、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてホモ接合性である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記個体が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記個体は、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰの活性を阻害する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＢＥＲ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰのペプチド断片である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ＰＡＲＰの一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、ＤＮＡ損傷化学療法剤をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記治療が、ＤＮＡ損傷化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
個体における癌の治療方法であって、前記個体へＢＥＲ経路の阻害剤を投与するステップを含み、前記癌は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損しているものである、上記方法。
【請求項１９】
個体がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損している癌状態であることを確認するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体へＤＮＡ損傷化学療法剤を投与するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
癌状態の個体の評価方法であって、
個体から採取した癌細胞が、正常細胞と比べてＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損していることを確認するステップと、
前記個体への投与に適するＢＥＲ経路阻害剤を準備するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記個体への投与に適するＤＮＡ損傷化学療法剤を準備するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、ＨＲによってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含む、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌細胞がＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌細胞は、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてホモ接合性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
個体からの癌細胞のＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復活性を正常細胞と比較して判定することにより、前記癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌であることを確認する、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
個体からの癌細胞中に、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする核酸配列の１又は複数の突然変異又は多形性が存在するかどうかを判定することにより、前記癌がＨＲ依存的ＤＳＢ修復を欠損する癌であることを確認する、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記個体が、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記個体が、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰ活性を阻害する、請求項１８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記塩基除去修復阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＢＥＲ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記阻害剤がＰＡＲＰのペプチド断片である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ＰＡＲＰアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
個体における癌の治療方法であって、
前記個体へＢＥＲ阻害剤を投与するステップを含み、
前記個体は、ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の成分をコードする遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である、上記方法。
【請求項４０】
前記癌が、ＨＲによってＤＮＡ ＤＳＢを修復する能力が正常細胞と比べて低下又は消失している１又は複数の癌細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
個体が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてヘテロ接合性である、請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌細胞が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異についてホモ接合性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰを阻害する、請求項３９から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＢＥＲ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記ＢＥＲ阻害剤がＰＡＲＰのペプチド断片である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、ＰＡＲＰアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記個体へＤＮＡ損傷化学療法剤を投与するステップを含む、請求項３９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用するための医薬の製造におけるＢＥＲ経路阻害剤の使用。
【請求項５４】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性である個体における癌治療に使用するためのＢＥＲ経路阻害剤。
【請求項５５】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路を欠損している癌の治療に使用するためのＢＥＲ経路阻害剤。
【請求項５６】
個体の癌状態におけるＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復経路の活性の評価方法であって、
ＢＥＲ阻害剤と癌状態の患者から採取した癌細胞サンプルとを接触させるステップと、
前記サンプル中の細胞死の量を測定するステップと
を含む方法。
【請求項５７】
ＢＥＲ阻害剤がＢＥＲ経路の成分のペプチド断片である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＢＥＲ阻害剤が、ＢＥＲ経路の成分のアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ＢＥＲの阻害剤がＰＡＲＰ阻害剤である、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＢＥＲ阻害剤が、ニコチンアミド類、ベンズアミド類、イソキノリノン類、ジヒドロイソキノリノン類、ベンゾイミダゾール類、インドール類、フタラジン−１（２Ｈ）−オン類、キナゾリノン類、イソインドリノン類、フェナントリジン類、ベンゾピロン類、不飽和ヒドロキシム酸誘導体、カフェイン、テオフィリン、及びチミジン、並びにこれらの類似体及び誘導体からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＰＡＲＰ阻害剤がフタラジン−１（２Ｈ）−オン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＰＡＲＰ阻害剤がＰＡＲＰ配列のペプチド断片である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、ＰＡＲＰアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする核酸、又はその相補配列である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
癌がＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損していることを確認する、請求項５６から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
癌がＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２を欠損する表現型を有することを確認する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＨＲ依存的ＤＮＡ ＤＳＢ修復を欠損する癌を標的とする治療に対する、個体の癌状態の応答を予測する方法であって、
ＢＥＲ阻害剤と癌状態の個体から採取した癌細胞サンプルとを接触させるステップと、
前記サンプル中の細胞死の量を測定するステップと
を含む方法。
【請求項６７】
実質的に添付の図面に記載のとおりかつそれに準拠したＢＥＲ阻害剤の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００７−５１６２４１（Ｐ２００７−５１６２４１Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４０６２５（Ｐ２００６−５４０６２５）
【出願日】平成１６年１１月３０日（２００４．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００５０２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５３６６２
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０３１６０６２９）クドス ファーマシューティカルズ リミテッド (23)
【出願人】（５０４０５２９５８）ザ インスティチュート オブ キャンサー リサーチ，ロイヤル キャンサー ホスピタル (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月３０日（２００４．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００５０２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５３６６２
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０３１６０６２９）クドス ファーマシューティカルズ リミテッド (23)
【出願人】（５０４０５２９５８）ザ インスティチュート オブ キャンサー リサーチ，ロイヤル キャンサー ホスピタル (7)
【Ｆターム（参考）】
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