癌治療剤
【課題】 新たな治療メカニズムによる癌治療剤を提供する。
【解決手段】 本発明の癌治療剤は、癌を治療するための癌治療剤であって、コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。前記コリン取り込みを阻害物質は、コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質が好ましく、この場合、有機カチオン系化合物がより好ましい。前記コリントランスポーターの発現阻害物質は、ＲＮＡ干渉により前記コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡが好ましい。前記コリントランスポーターは、例えば、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ＣＴＬ３、ＣＴＬ４、ＣＴＬ５等があげられる。
【解決手段】 本発明の癌治療剤は、癌を治療するための癌治療剤であって、コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。前記コリン取り込みを阻害物質は、コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質が好ましく、この場合、有機カチオン系化合物がより好ましい。前記コリントランスポーターの発現阻害物質は、ＲＮＡ干渉により前記コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡが好ましい。前記コリントランスポーターは、例えば、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ＣＴＬ３、ＣＴＬ４、ＣＴＬ５等があげられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、癌を治療する癌治療剤として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド等が、臨床において使用されている。さらに、近年では、腫瘍細胞の増殖、浸潤、転移に関わる分子を標的とする治療メカニズムの分子標的薬等も開発されている。このような分子標的薬として、例えば、血管新生に関わると考えられるヒトアンジオポエチン様因子２（ＡＮＧＰＴＬ２）の機能を阻害する物質を含む癌治療剤が提案されている（特許文献１）。
【０００３】
癌治療においては、癌の発生部位やその進行度合い等により癌治療剤の効果が左右される場合があり、また、既存の癌治療剤に対する耐性が生じることで、その効果が低下する場合もある。このため、常に、新たな治療メカニズムによる癌治療剤が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−９３８９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、新たな治療メカニズムによる癌治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の癌治療剤は、
癌を治療するための癌治療剤であって、
コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新たな治療メカニズムによる癌治療剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、参考例１における、各種ヒト癌細胞でのコリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、参考例２における、ヒト乳癌細胞およびヒト正常乳腺上皮細胞でのコリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、参考例３における、ヒト乳癌組織切片でのＣＴＬ２タンパク質の発現の確認結果を示す写真である。
【図４】図４は、参考例４における、ヒト乳癌細胞およびヒト正常乳腺上皮細胞でのコリン取り込み作用の確認結果を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例１における、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例２における、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性の測定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例３で使用した有機カチオン系化合物の、コリン取り込み阻害作用と細胞死誘導作用との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．癌治療剤
本発明の癌治療剤は、前述のように、癌を治療するための癌治療剤であって、コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質（以下、「コリン取り込み阻害物質」ともいう。）、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質（以下、「コリントランスポーター発現阻害物質」ともいう。）の少なくとも一方を含むことを特徴とする。すなわち、本発明の癌治療剤は、前記コリン取り込み阻害物質を含むか、前記コリントランスポーター発現阻害物質を含むか、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質の両方を含む。
【００１０】
本発明において、前記コリントランスポーターは、ｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＴＬ）であり、そのファミリーとして、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ＣＴＬ３、ＣＴＬ４、ＣＴＬ５等があげられる。
【００１１】
前記各ＣＴＬ遺伝子のｍＲＮＡ配列、および各ＣＴＬタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、下記のようにデータベースに登録されている。このため、当業者であれば、ＣＴＬタンパク質およびそれをコードする遺伝子等を容易に取得できる。
（１）ＣＴＬ１
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０８０５４６．３
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿５３６８５６．２
（２）ＣＴＬ２
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２０４２８．３
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿０６５１６１．３
（３）ＣＴＬ３
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿１５２３６９．３
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿６８９５８２．２
（４）ＣＴＬ４
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２５２５７．２
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿０７９５３３．２
（５）ＣＴＬ５
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿１５２６９７．４
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿６８９９１０．２
【００１２】
１−１．治療メカニズム
本発明の癌治療剤は、前述のように、新たな治療メカニズムにより癌を治療する癌治療剤である。すなわち、本発明の癌治療剤が癌を治療するメカニズムは、前記コリン取り込み阻害物質による、前記コリントランスポーターによるコリン取り込みの阻害もしくは前記コリントランスポーター発現阻害物質による、前記コリントランスポーターの発現の阻害、またはこれらの両方である。コリンは、全ての動物細胞にとって重要な必須栄養素であり、細胞膜の構成成分であるリン脂質の合成に利用されている。コリンは腫瘍細胞への集積性が高いことが知られており、この知見を利用して、１１Ｃ−コリンまたは１８Ｆ−コリンによるＰＥＴ／ＣＴを使用した癌の画像診断が報告されている（例えば、ＤｅＧｒａｄｏ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００１ ｐ１８０５−１８１４、およびＨａｒａ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００１ ｐ１８１５−１８１７）。これらの知見から、腫瘍細胞は、積極的にコリンを取り込み、増殖に利用していると、本発明者等は推察した。しかしながら、細胞外からコリンを取り込むために、腫瘍細胞に発現するコリントランスポーターの分子的実体は明らかではなかった。そこで、本発明者等は、鋭意研究の結果、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、神経芽腫、グリオーマ、白血病等の癌細胞へのコリンの取り込みが、ＣＴＬを介して行われることを見出した。この知見に基づき、本発明者等は、さらに研究を重ねた結果、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質が、前記ＣＴＬを標的分子とする治療メカニズムにより、癌を治療できることを見出し、本発明に至った。本発明者等は、前記両物質による癌治療のメカニズムを解明すべく、さらに研究を行った。その結果、前記両物質による癌治療の効果は、前記ＣＴＬによるコリン取り込み作用を阻害することにより、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し、細胞死を引き起こさせることによることを見出した。このような癌の治療メカニズムは、これまで全く知られていなかった新たな治療メカニズムである。
【００１３】
１−２．コリン取り込み阻害物質
前記コリン取り込み阻害物質は、前記ＣＴＬによるコリン取り込みを阻害する物質であり、その阻害機能は、例えば、コリンとの競合的拮抗作用、前記ＣＴＬの機能部位の阻害作用等があげられる。前記コリン取り込み阻害物質は、例えば、一種類の阻害機能のコリン取り込み阻害物質を単独で使用してもよいし、二種類以上の阻害機能のコリン取り込み阻害物質を併用してもよい。
【００１４】
前記コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質は、例えば、有機カチオン系化合物があげられる。前記有機カチオン系化合物は、例えば、有機第四級アンモニウム塩の化合物があげられ、具体的には、抗うつ剤等の医薬品として使用されるものがあげられる。より具体的には、例えば、ヘミコリニウム−３、キニーネ、キニジン、デシプラミン、イミプラミン、クロミプラミン、ジフェンヒドラミン、クロニジン、フルボキサミン、パロキセチン、ミルナシプラン、ベンラファキシン、レボキセチン、シタロプラム、フルオキセチン、シメチジン、プロカインアミド、ジソピラミド、クロルフェニラミン、アミロライド、アトロピン、モルヒネ、メトホルミン、アマンタジン等があげられる。これらの化合物は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。これらの化合物は、例えば、市販品を使用できる。
【００１５】
前記コリン取り込み阻害物質は、例えば、前記ＣＴＬに特異的に結合することで、前記ＣＴＬの機能を阻害する物質があげられる。前記物質は、例えば、抗体、アプタマー等があげられる。前記抗体は、例えば、免疫グロブリン(Ｉｇ)、抗体フラグメント、キメラ抗体等があげられる。前記免疫グロブリンは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等があげられる。前記抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等があげられる。前記キメラ抗体は、例えば、ヒト化抗体等があげられる。前記抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。前記抗体は、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により調製してもよいし、市販の抗体を使用してもよい。前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれでもよい。
【００１６】
１−３．コリントランスポーター発現阻害物質
前記コリントランスポーター発現阻害物質は、前記ＣＴＬの発現を阻害することにより、結果として、前記ＣＴＬによるコリン取り込みを阻害する。前記ＣＴＬの発現阻害は、例えば、前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現阻害により行える。前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現阻害は、例えば、ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現阻害により行える。ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、例えば、ｓｉＲＮＡがあげられる。
【００１７】
前記ｓｉ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡは、両鎖の３’末端が２塩基突出した２０〜２５塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路で相補的な配列を有するＲＮＡの特異的な切断を誘導する。前記ｓｉＲＮＡの配列と切断されるｍＲＮＡの対象部位の配列とは、同一性が１００％であることが最も好ましい。ただし、必ずしも同一性が１００％である必要はなく、前記同一性は、例えば、前記ｓｉＲＮＡが、前記相補的な配列を有するＲＮＡを切断する機能を有する範囲であればよい。前記ｓｉＲＮＡは、目的とするＣＴＬの配列に対し、従来公知の方法により設計できる。前記ｓｉＲＮＡは、例えば、従来公知の導入剤により、癌細胞に導入される。前記導入剤は、例えば、ウイルスベクター、リポフェクタミン等があげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、従来公知のものを使用できる。前記導入剤は、例えば、市販の導入剤を使用してもよい。
【００１８】
ＣＴＬ１のｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡは、例えば、下記（１）〜（３）のｓｉＲＮＡがあげられる。下記（１）〜（３）のｓｉＲＮＡは、それぞれ、前記ＣＴＬ１遺伝子の異なるコード領域を対して設計されたものである。各ｓｉＲＮＡについて、二本鎖の配列をそれぞれ示す。
（１）ＨＳＳ１１８７７７
AAAUUCACUGAUCCAAAUCAGGCCC（配列番号１）
GGGCCUGAUUUGGAUCAGUGAAUUU（配列番号２）
（２）ＨＳＳ１１８７７８
UUACCAGCUUCUUUCAUUGCUUUCC（配列番号３）
GGAAAGCAAUGAAAGAAGCUGGUAA（配列番号４）
（３）ＨＳＳ１１８７７９
UUAAGAUCCACACAAGUACUCUUGA（配列番号５）
UCAAGAGUACUUGUGUGGAUCUUAA（配列番号６）
【００１９】
前記ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、ｓｉＲＮＡの他に、例えば、ｓｈＲＮＡがあげられる。前記ｓｈ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子である。前記ｓｈＲＮＡも、前記ｓｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路で相補的な配列を有するＲＮＡの特異的な切断を誘導する。
【００２０】
前記ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、例えば、前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現ベクターでもよい。前記発現ベクターは、ベクターの基本骨格に、前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡをコードする核酸を挿入することで構築できる。前記発現ベクターを構築するためのベクターの基本骨格は、特に制限されず、例えば、従来公知のものを使用できる。
【００２１】
１−４．治療対象
本発明の癌治療剤が治療対象とする癌は、特に制限されず、例えば、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、神経芽種、グリオーマ、白血病、肝臓癌、咽頭癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、食道癌、腎臓癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、口腔癌、舌癌、皮膚癌、骨肉腫、悪性リンパ腫、甲状腺癌、脳腫瘍等があげられる。本発明の癌治療剤は、前述のように、癌細胞で高発現するＣＴＬの機能阻害により癌治療効果を奏するため、例えば、特定の癌種に限定されず、幅広い癌腫の治療に使用できる。前記治療は、例えば、前記癌の縮小（癌細胞の減少）、前記癌の増殖抑制、前記癌の転移抑制等を含む。また、本発明の癌治療剤の治療対象は、前記コリントランスポーター遺伝子を有する生物があげられ、具体的には、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等があげられる。
【００２２】
１−５．投与方法、投与量、剤形
本発明の癌治療剤の投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。本発明の癌治療剤の投与量は、特に制限されず、例えば、選択する物質、動物種、年齢等に応じて適宜設定できる。本発明の癌治療剤をヒト成人に投与する場合、前記有機カチオン系化合物の１日あたりの投与量は、例えば、１０〜５００ｍｇ／ｋｇであり、前記ｓｉＲＮＡおよび前記抗体の１日あたりの投与量は、例えば、癌治療において分子標的剤として使用される、他のｓｉＲＮＡおよび抗体と同様に、従来公知の範囲である。
【００２３】
本発明の癌治療剤の剤型は、特に制限されず、例えば、用途に応じて適宜決定できる。本発明の癌治療剤を非経口投与する場合、前記剤型は、例えば、注射用製剤、点滴製剤等の非経口製剤があげられる。本発明の癌治療剤を経口投与する場合、前記剤型は、例えば、固体状または液体状の経口製剤があげられ、具体的には、例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤等があげられる。
【００２４】
１−６．添加剤等
本発明の癌治療剤は、例えば、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質の他に、その剤型に応じて、添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、薬学上許容される添加剤であることが好ましく、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質の癌治療作用に、実質的に影響を与えないものが使用できる。前記添加剤は、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等があげられ、例えば、従来公知のものが使用できる。本発明の癌治療剤は、従来公知の製剤化技術等により製剤化可能である。
【００２５】
本発明の癌治療剤は、例えば、他の癌治療剤を含んでもよい。他の癌治療剤を併用することにより、本発明の癌治療剤の癌治療効果をさらに向上できる。前記他の癌治療剤は、特に制限されず、例えば、従来から臨床で使用されている、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド等、または前記ＣＴＬとは異なる遺伝子を標的とする分子標的剤等があげられる。前記他の癌治療剤は、本発明の癌治療剤に、例えば、一種類のみ含まれてもよいし、二種類以上が含まれてもよい。また、本発明の癌治療剤は、例えば、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質と、前記他の癌治療剤とが、それぞれ、別々に準備されたキットの形態でもよい。
【００２６】
２．治療方法
本発明の癌治療方法は、癌患者に、前記本発明の癌治療剤を投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の癌治療方法は、前記本発明の癌治療剤を投与することが特徴であって、その他の工程は、特に制限されない。本発明の癌治療方法は、前記本発明の癌治療剤の記載を引用できる。
【実施例】
【００２７】
つぎに、本発明の実施例について、説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（ヒト癌細胞）
ヒト癌細胞は、下記（１）〜（９）の９種類を使用した。
（１）小細胞肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ６９、入手元：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））
（２）前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ、入手元：ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）
（３）前立腺癌細胞（ＰＣ−３、入手元：ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）
（４）乳癌細胞（ＭＣＦ−７、入手元：ＡＴＣＣ）
（５）骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、入手元：ＡＴＣＣ）
（６）神経芽細胞種（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、入手元：ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
（７）神経芽細胞種（ＬＡ−Ｎ−２、入手元：ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）
（８）白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ、入手元：ＡＴＣＣ）
（９）大腸癌細胞（ＨＴ−２９、入手元：ＡＴＣＣ）
【００２９】
（ヒト正常乳腺上皮細胞）
ヒト正常乳腺上皮細胞は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞（入手元：ＡＴＣＣ）を使用した。
【００３０】
（ヒト乳癌組織切片）
ヒト乳癌組織切片は、ジェノスタッフ株式会社から入手した。
【００３１】
（有機カチオン系化合物）
有機カチオン系化合物は、下記（１）〜（１５）の１５種類を使用した。
（１）ヘミコリニウム−３（ＨＣ−３、入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（２）キニーネ（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（３）キニジン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（４）デシプラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（５）イミプラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（６）クロミプラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（７）ジフェンヒドラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（８）クロニジン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（９）フルボキサミン（入手元：株式会社明治製菓）
（１０）パロキセチン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（１１）ミルナシプラン（入手元：旭化成株式会社）
（１２）ベンラファキシン（入手元：Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｒｅｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）
（１３）レボキセチン（入手元：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）
（１４）シタロプラム（入手元：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）
（１５）フルオキセチン（入手元：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）
【００３２】
（ｓｉＲＮＡ）
Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（登録商標）のｓｉＲＮＡおよびＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ（登録商標）のｓｉＲＮＡネガティブコントロールを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、商業的に合成した。３種類のＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ二本鎖（Ｏｌｉｇｏ ＩＤ：ＨＳＳ１１８７７７、ＨＳＳ１１８７７８およびＨＳＳ１１８７７９）を、ヒトＣＴＬ１ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＭ＿０８０５４６．３）の異なるコード領域に対して設計した。前記３種類のＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ二本鎖の各鎖の配列を、下記（１）〜（３）に示す。
（１）ＨＳＳ１１８７７７
AAAUUCACUGAUCCAAAUCAGGCCC（配列番号１）
GGGCCUGAUUUGGAUCAGUGAAUUU（配列番号２）
（２）ＨＳＳ１１８７７８
UUACCAGCUUCUUUCAUUGCUUUCC（配列番号３）
GGAAAGCAAUGAAAGAAGCUGGUAA（配列番号４）
（３）ＨＳＳ１１８７７９
UUAAGAUCCACACAAGUACUCUUGA（配列番号５）
UCAAGAGUACUUGUGUGGAUCUUAA（配列番号６）
【００３３】
（ｍＲＮＡ発現量の定量）
（１）トータルＲＮＡの抽出
前記ヒト癌細胞を、滅菌したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ＷＡＫＯ）で洗浄し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒおよびＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、前記ヒト癌細胞からトータルＲＮＡを、抽出した。
【００３４】
（２）プライマーおよびプローブ
対象とするｍＲＮＡ（ＣＨＴ１およびＣＴＬ１〜５）、およびハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ））に対する、一対のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ヒトｍＲＮＡ配列に基づいて設計された、市販品を使用した。前記設計には、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
（ＴａｑＭａｎプローブ）
ＣＨＴ１用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ００２２２３６７＿ｍ１）
ＣＴＬ１用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ００９３９３５７＿ｍ１）
ＣＴＬ２用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１０５９３８＿ｍ１）
ＣＴＬ３用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１１８２９０＿ｍ１）
ＣＴＬ４用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０４６７８４＿ｍ１）
ＣＴＬ５用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１２０４８５＿ｍ１）
ＧＡＰＤＨ用プローブ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）
【００３５】
（３）リアルタイムＰＣＲ
１ステップリアルタイムＰＣＲのために、５μＬのトータルＲＮＡ（１０ｎｇ）を、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ（登録商標） １−Ｓｔｅｐ Ｋｉｔを使用して、１５μＬのｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅに添加した。前記ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅには、最終的に、ＴａｑＭａｎ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ ＭｉｘｔｕｒｅおよびＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙが含まれる。リアルタイムＰＣＲのサイクル条件は、下記のとおりとした。
（サイクル条件）
ｃＤＮＡ合成：４８℃・１５分
ＲＴ（逆転写酵素）の不活性化およびＴａｑポリメラーゼの活性化：９５℃・１０分
増幅：９５℃・１５秒および６０℃・１分を１サイクルとし、４０サイクル
【００３６】
リアルタイムＰＣＲデータを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（登録商標） Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍで分析した。前記ヒト癌細胞における対象遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを、比較Ｃｔ法により算出した。各対象のＰＣＲについて、ＧＡＰＤＨと比較した前記ｍＲＮＡ発現レベルは、下記式により算出できる。
相対的ｍＲＮＡ発現（％）＝２−（Ｃｔ ｔａｒｇｅｔ−Ｃｔ ＧＡＰＤＨ）×１００
【００３７】
（細胞生存率）
前記ヒト癌細胞の細胞数を、ＡＴＰＬｉｔｅ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で測定した。ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＡＴＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍを、製造元の説明書の記載に従って行い、発光を、２０３０ ＡＲＶＯ Ｘ５ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定した。
【００３８】
（カスパーゼ３および７活性の定量）
カスパーゼ３および７の活性の測定のために、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標） ３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造元の説明書に従って行った。このキットは、カスパーゼ３および７による発光基質のＤＥＶＤ配列の切断に基づき、発光シグナルを発する。具体的には、前記ヒト癌細胞に、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ． ＷＩ）を添加し、発光を、２０３０ ＡＲＶＯ Ｘ５ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定した。
【００３９】
（コリン取り込み）
まず、前記ヒト癌細胞を、下記組成の取り込みバッファーで２回洗浄した。
取り込みバッファー（ｐＨ７．４）
１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
４．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ
１．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２
１．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４
５．６ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース
１．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４
２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ
【００４０】
つぎに、取り込みを、［３Ｈ］コリン［（比放射能：３１８２ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）から入手］を含む取り込みバッファーの添加により開始した。所定時間インキュベーション後、氷冷した取り込みバッファーで急速に所定回数洗浄した。ついで、洗浄後の前記ヒト癌細胞を、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に溶解し、アリコートを、液体シンチレーション計数法用に採取した。放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ（登録商標） ２１００ ＴＲ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で測定した。［３Ｈ］コリンの特異的取り込みを、前記アリコートに含まれるタンパク質１ｍｇあたりにおける、３０ｍｍｏｌ／Ｌの標識化していないコリンの存在下および非存在下における、全［３Ｈ］コリン取り込みの差として算出した。前記アリコートに含まれるタンパク質の濃度は、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して決定した。
【００４１】
［参考例１］
本参考例では、各種ヒト癌細胞におけるコリントランスポーターのｍＲＮＡ発現を確認した。
【００４２】
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。前記ヒト癌細胞から、トータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量を測定した。
【００４３】
図１に、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す。図１の各グラフにおいて、横軸は、各種コリントランスポーターを示し、縦軸は、相対的ｍＲＮＡ発現（％）を示し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を１００％とする相対値で示す。
【００４４】
図１に示すように、ｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＣＴＬ１〜５）が、検討した全てのヒト癌細胞において、高発現していることが確認された。また、前記ＣＴＬ１〜５の発現パターンは、各種ヒト癌細胞において、様々であることが確認された。一方、高親和性コリントランスポーターであるＣＨＴ１は、アセチルコリン神経系の神経芽細胞腫（ＬＡ−Ｎ−２）以外のヒト癌細胞では、発現が確認できなかった。これらの結果から、前記各種ヒト癌細胞におけるコリン取り込みは、ＣＴＬ１〜５を介して行われることが明らかである。
【００４５】
［参考例２］
本参考例では、ヒト乳癌細胞およびヒト正常乳腺上皮細胞におけるコリントランスポーターのｍＲＮＡ発現を確認した。
【００４６】
前記ヒト乳癌細胞は、ＭＣＦ−７細胞を使用し、前記ヒト正常乳腺上皮細胞は、ＭＣＦ−１０Ａを使用した。まず、前記両細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で増殖させた。前記ＲＰＭＩ１６４０培地は、コーティングしていないフラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で、１０％ ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および２０ｍｇ／Ｌ カナマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を添加したものを使用した。増殖させた前記両細胞から、トータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量を測定した。
【００４７】
図２に、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す。図２において、横軸は、各種コリントランスポーターを示し、縦軸は、相対的ｍＲＮＡ発現（％）を示し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を１００％とする相対値で示す。黒のバーは、ＭＣＦ−７細胞の結果、白のバーは、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の結果を示す。
【００４８】
図２に示すように、ＭＣＦ−７細胞とＭＣＦ−１０Ａ細胞とでは、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量および発現パターンが異なっていた。具体的には、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞では、ヒト正常乳腺上皮細胞であるＭＣＦ−１０Ａ細胞と比較して、ＣＴＬ１のｍＲＮＡの発現量が約５倍、ＣＴＬ２のｍＲＮＡの発現量が約２０倍亢進していた。また、ＣＴＬ４のｍＲＮＡは、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞でのみ特異的に発現していた。
【００４９】
［参考例３］
本参考例では、ヒト乳癌組織切片について、免疫組織化学的検査を行うことで、前記ヒト乳癌組織におけるＣＴＬ２タンパク質の発現を確認した。
【００５０】
前記ヒト乳癌組織切片を、脱パラフィンし、ＰＢＳを使用して再度水和し、サンプルを調製した。このサンプルを、０．１％トリプシン中に置き、３７℃で２５分間振とうした。ついで、下記工程１〜７をこの順序で行い、ＣＴＬ２タンパク質の発現を確認した。
（工程）
１．前記サンプルを、３％Ｈ２Ｏ２を含む１×ＰＢＳ中で、室温で１０分間インキュベートする。インキュベート後の前記サンプルを再度洗浄する。
２．洗浄後の前記サンプルを、ブロッキング液（ＤＡＫＯ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ）中で、１０分間インキュベートする。
３．ブロッキング後の前記サンプルに、一次抗体（１０μｇ／ｍＬ、抗ＣＴＬ２抗体および正常マウスＩｇＧ１抗体、ブロッキング液で希釈）を添加し、前記サンプルを、４℃で一昼夜インキュベートする。インキュベート後の前記サンプルを、１×ＰＢＳで洗浄する。
４．洗浄後の前記サンプルを、二次抗体（１：５００、マウスＩｇビオチン（ＤＡＫＯ：Ｅ０４３３））と、３０分間インキュベートする。インキュベート後の前記サンプルを、ＰＢＳで洗浄する。
５．ＣＴＬ２タンパク質を、ＡＢＣ法によりＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２染色を行うことで検出する。具体的には、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ ｋｉｔを使用し、基質溶液（ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２染色）を適用する。前記基質溶液の適用後の前記サンプルを、水道水で徹底的に洗浄する。
６．洗浄後の前記サンプルを、マイヤーヘマトキシリン中で対比染色する。
７．染色後の前記サンプルを脱水し、脱水後の前記サンプルを、松浪硝子工業株式会社製の商品名「ＡＰＳコートスライドグラス」にマウントし、蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製の商品名「ＢＺ−８０００」）で観察する。
【００５１】
図３に、ＣＴＬ２タンパク質の発現の確認結果を示す。図３において、左側の写真が、１次抗体として正常マウスＩｇＧ１抗体を使用した結果（コントロール）、右側の写真が、１次抗体として抗ＣＴＬ２抗体を使用した結果を示す。倍率は、２００倍とした。
【００５２】
図３に示すように、１次抗体として抗ＣＴＬ２抗体を使用した場合にのみ、前記ヒト乳癌組織において、陽性の染色像が確認された。この結果から、ヒト乳癌組織におけるＣＴＬ２タンパク質の発現が確認された。
【００５３】
［参考例４］
本参考例では、ヒト乳癌細胞とヒト正常乳腺上皮細胞におけるコリン取り込み作用を確認した。
【００５４】
前記ヒト乳癌細胞は、ＭＣＦ−７細胞を使用し、前記ヒト正常乳腺上皮細胞は、ＭＣＦ−１０Ａを使用した。コリン取り込みを、６０分間での濃度１０μｍｏｌ／Ｌの［３Ｈ］コリン取り込みのタイムコースで試験した。具体的には、まず、前記両細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、２４穴プレートに、細胞密度８０％で増殖させた。前記ＲＰＭＩ１６４０培地は、２４穴プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で、１０％ ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および２０ｍｇ／Ｌ カナマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を添加したものを使用した。前記増殖後、前記２４穴プレートから、前記培地を除去し、前記両細胞について、コリン取り込みを測定した。前記コリン取り込みでは、前記氷冷した取り込みバッファーで、前記細胞を２回洗浄し、前記タイムコースは、［３Ｈ］コリンの添加から、５、１０、２０、３０、４５および６０分とした。
【００５５】
図４に、コリン取り込み作用の確認結果を示す。図４において、横軸は、コリン添加からの経過時間（分）を示し、縦軸は、タンパク質１ｍｇあたりの［３Ｈ］コリンの取り込み量（ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を示す。黒丸は、ＭＣＦ−７細胞の結果、白丸は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の結果を示す。
【００５６】
図４に示すように、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞では、ヒト正常乳腺上皮細胞であるＭＣＦ−１０Ａ細胞と比較して、［３Ｈ］コリンの取り込み量が約２倍に増大していた。この結果から、ヒト乳癌細胞は、ヒト正常乳腺上皮細胞と比較して、コリンを大量に取り込んでいることが明らかである。
【００５７】
［実施例１］
本実施例では、各種ヒト癌細胞に対するコリン取り込み阻害物質ＨＣ−３の、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性に及ぼす影響を確認した。
【００５８】
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。まず、前記各細胞を、細胞密度６０〜７０％で、２４穴プレートに播種した。これに、ＨＣ−３を濃度１ｍｍｏｌ／Ｌで、２日間毎日添加し、各ウェルの液量を、１．０ｍＬとした。ＨＣ−３の最初の添加から３日後に、前記各細胞について、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。コントロールは、ＨＣ−３に代えて、生理食塩水を添加し、同様にして細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。
【００５９】
図５に、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性の測定結果を示す。図５の各グラフにおいて、白のバーは、ＨＣ−３添加（１ｍｍｏｌ／Ｌ）の結果、黒のバーは、コントロール（Ｖｅｈｉｃｌｅ）の結果を示す。また、各グラフにおける左側の白のバーおよび黒のバーのセットは、細胞生存率の測定結果を示し、各グラフにおける右側の白のバーおよび黒のバーのセットは、カスパーゼ３／７活性の測定結果を示す。細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性は、コントロールでの測定結果を１００％とし、前記各種ヒト癌細胞における測定結果を、相対値（％）で示す。
【００６０】
図５に示すように、検討した全てのヒト癌細胞において、コリン取り込み阻害物質であるＨＣ−３の添加により、有意な細胞生存率の低下、および有意なカスパーゼ３／７活性の増大が確認された。これらの結果から、ＨＣ−３によるコリン取り込み阻害により、前記ヒト癌細胞において、アポトーシスが誘導され、細胞死が引き起こされていることが確認された。したがって、癌細胞におけるコリン取り込み作用を担っているコリントランスポーターが、癌治療の標的分子であることが明らかとなった。そして、前記参考例１に示すように、ヒト癌細胞において発現しているコリントランスポーターがＣＴＬ１〜５であることが明らかとなっている。以上を踏まえると、癌細胞において発現するＣＴＬ１〜５の機能を阻害する作用は、アポトーシスによる細胞死をもたらすことになり、前記コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質は、新たな治療メカニズムによる癌治療剤として、癌治療に有用といえる。
【００６１】
［実施例２］
本実施例では、小細胞肺癌細胞に対するＲＮＡ干渉法でのＣＴＬ１ ｍＲＮＡ発現抑制による、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性への影響を確認した。
【００６２】
小細胞肺癌細胞は、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞を使用した。前記細胞を、培養密度５０〜６０％で、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした２４穴組織培養プレートに播種した。前記培養後、培地を除去し、前記細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で、１回洗浄した。洗浄後の前記細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ中で、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（ウェルあたり３μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用し、前記３種類のＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡの混合物（各５０ｎｍｏｌ／Ｌ）によりトランスファーした。前記ＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡ混合物を、２日毎に３回添加した。そして、初回のトランスフェクションから７日後に、前記細胞について、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。コリン取り込みでは、１０分間のインキュベーション後、前記氷冷した取り込みバッファーで、前記細胞を３回洗浄した。コントロールは、前記ＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡ混合物に代えて、ｓｉＲＮＡネガティブコントロールを添加し、同様にしてＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。
【００６３】
図６に、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性の測定結果を示す。図６において、（ａ）はＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量の測定結果、（ｂ）はコリン取り込みの測定結果、（ｃ）は細胞生存率の測定結果、（ｄ）はカスパーゼ３／７の活性の測定結果を示す。ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を１００％とする相対値（％、相対的ｍＲＮＡ発現（％））で示す。コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性は、それぞれ、コントロールでの測定結果を１００％として、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞における測定結果を、相対値（％）で示す。
【００６４】
図６に示すように、前記ＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現は、約５０％抑制された（図６（ａ））。また、コリン取り込み作用および細胞生存率は、有意に抑制された（図６（ｂ）および図６（ｃ））。そして、カスパーゼ３／７活性は、増大された（図６（ｄ））。これらの結果から、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現を、ｓｉＲＮＡにより特異的に抑制することで、コリン取り込みの抑制と、アポトーシス誘導とによる細胞死が引き起こされることが確認された。したがって、小細胞肺癌細胞におけるＣＴＬ１分子を介するコリン取り込み作用は、癌細胞の生存に重要な役割を担っており、ＣＴＬ１分子は、癌治療の標的分子であることが明らかである。そして、ＲＮＡ干渉により前記コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、新たな治療メカニズムによる癌治療剤として、癌治療に有用といえる。
【００６５】
［実施例３］
本実施例では、各種ヒト癌細胞に対する有機カチオン系化合物の、コリン取り込み阻害作用および細胞死誘導作用を評価した。
【００６６】
（１）コリン取り込み阻害作用の評価
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。まず、前記各細胞を、１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で、２４穴プレートに、細胞密度８０％で増殖させた。一方、ＨＣ−３を除く１４種類の有機カチオン系化合物を、最終濃度１００μｍｏｌ／Ｌとなるように、生理食塩水に溶解した。前記有機カチオン系化合物の溶液を、前記［３Ｈ］コリンを含む取り込みバッファーに添加した。この［３Ｈ］コリンを含む取り込みバッファーを使用して、コリン取り込みを測定した。コリン取り込みでは、１０分間のインキュベーション後、前記氷冷した取り込みバッファーで、前記細胞を２回洗浄した。コントロールは、前記有機カチオン系化合物の溶液に代えて、生理食塩水を添加し、コリン取り込みを測定した。
【００６７】
（２）細胞死誘導作用の評価
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。まず、前記各細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）中で、２４穴プレートに、細胞密度８０％で増殖させた。前記有機カチオン系化合物の溶液を、前記培地に添加し、前記添加から２４時間後に、細胞生存率を測定した。コントロールは、前記有機カチオン系化合物の溶液に代えて、生理食塩水を添加し、同様にして細胞生存率を測定した。
【００６８】
表１に、コリン取り込みの測定結果を示し、表２に、細胞生存率の測定結果を示す。コリン取り込みおよび細胞生存率は、コントロールでの測定結果を１００％として、前記各種ヒト癌細胞における測定結果を、相対値（％）で示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
前記表１に示すように、本実施例で使用した有機カチオン系化合物は、検討した全てのヒト癌細胞へのコリン取り込みを阻害することが確認された。特に、抗うつ薬として使用される、デシプラミン、イミプラミン、クロミプラミン、フルボキサミン、パロキセチンおよびフルオキセチンは、強力なコリン取り込み阻害活性を示した。また、前記表２に示すように、本実施例で使用した有機カチオン系化合物は、各種ヒト癌細胞の細胞生存率を低下させ、細胞死を誘導することが確認された。そして、本実施例で使用した有機カチオン系化合物の、コリン取り込み阻害作用と細胞死誘導作用との間には、図７に示すように、有意な相関関係（Ｒ＝０．７６７２、Ｐ＜０．０００１）が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
以上のように、本発明によれば、新たな治療メカニズムによる癌治療剤を提供できる。本発明の癌治療剤は、癌細胞で高発現するＣＴＬの機能阻害により癌治療効果を奏するため、例えば、特定の癌種に限定されず、幅広い癌腫の治療に使用できる。このため、本発明の癌治療剤は、癌治療に極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、癌を治療する癌治療剤として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド等が、臨床において使用されている。さらに、近年では、腫瘍細胞の増殖、浸潤、転移に関わる分子を標的とする治療メカニズムの分子標的薬等も開発されている。このような分子標的薬として、例えば、血管新生に関わると考えられるヒトアンジオポエチン様因子２（ＡＮＧＰＴＬ２）の機能を阻害する物質を含む癌治療剤が提案されている（特許文献１）。
【０００３】
癌治療においては、癌の発生部位やその進行度合い等により癌治療剤の効果が左右される場合があり、また、既存の癌治療剤に対する耐性が生じることで、その効果が低下する場合もある。このため、常に、新たな治療メカニズムによる癌治療剤が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−９３８９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、新たな治療メカニズムによる癌治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の癌治療剤は、
癌を治療するための癌治療剤であって、
コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新たな治療メカニズムによる癌治療剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、参考例１における、各種ヒト癌細胞でのコリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、参考例２における、ヒト乳癌細胞およびヒト正常乳腺上皮細胞でのコリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、参考例３における、ヒト乳癌組織切片でのＣＴＬ２タンパク質の発現の確認結果を示す写真である。
【図４】図４は、参考例４における、ヒト乳癌細胞およびヒト正常乳腺上皮細胞でのコリン取り込み作用の確認結果を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例１における、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例２における、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性の測定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例３で使用した有機カチオン系化合物の、コリン取り込み阻害作用と細胞死誘導作用との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．癌治療剤
本発明の癌治療剤は、前述のように、癌を治療するための癌治療剤であって、コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質（以下、「コリン取り込み阻害物質」ともいう。）、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質（以下、「コリントランスポーター発現阻害物質」ともいう。）の少なくとも一方を含むことを特徴とする。すなわち、本発明の癌治療剤は、前記コリン取り込み阻害物質を含むか、前記コリントランスポーター発現阻害物質を含むか、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質の両方を含む。
【００１０】
本発明において、前記コリントランスポーターは、ｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＴＬ）であり、そのファミリーとして、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ＣＴＬ３、ＣＴＬ４、ＣＴＬ５等があげられる。
【００１１】
前記各ＣＴＬ遺伝子のｍＲＮＡ配列、および各ＣＴＬタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、下記のようにデータベースに登録されている。このため、当業者であれば、ＣＴＬタンパク質およびそれをコードする遺伝子等を容易に取得できる。
（１）ＣＴＬ１
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０８０５４６．３
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿５３６８５６．２
（２）ＣＴＬ２
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２０４２８．３
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿０６５１６１．３
（３）ＣＴＬ３
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿１５２３６９．３
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿６８９５８２．２
（４）ＣＴＬ４
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２５２５７．２
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿０７９５３３．２
（５）ＣＴＬ５
ｍＲＮＡ配列：ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿１５２６９７．４
アミノ酸配列：ＧｅｎＰｅｐｔ、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿６８９９１０．２
【００１２】
１−１．治療メカニズム
本発明の癌治療剤は、前述のように、新たな治療メカニズムにより癌を治療する癌治療剤である。すなわち、本発明の癌治療剤が癌を治療するメカニズムは、前記コリン取り込み阻害物質による、前記コリントランスポーターによるコリン取り込みの阻害もしくは前記コリントランスポーター発現阻害物質による、前記コリントランスポーターの発現の阻害、またはこれらの両方である。コリンは、全ての動物細胞にとって重要な必須栄養素であり、細胞膜の構成成分であるリン脂質の合成に利用されている。コリンは腫瘍細胞への集積性が高いことが知られており、この知見を利用して、１１Ｃ−コリンまたは１８Ｆ−コリンによるＰＥＴ／ＣＴを使用した癌の画像診断が報告されている（例えば、ＤｅＧｒａｄｏ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００１ ｐ１８０５−１８１４、およびＨａｒａ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００１ ｐ１８１５−１８１７）。これらの知見から、腫瘍細胞は、積極的にコリンを取り込み、増殖に利用していると、本発明者等は推察した。しかしながら、細胞外からコリンを取り込むために、腫瘍細胞に発現するコリントランスポーターの分子的実体は明らかではなかった。そこで、本発明者等は、鋭意研究の結果、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、神経芽腫、グリオーマ、白血病等の癌細胞へのコリンの取り込みが、ＣＴＬを介して行われることを見出した。この知見に基づき、本発明者等は、さらに研究を重ねた結果、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質が、前記ＣＴＬを標的分子とする治療メカニズムにより、癌を治療できることを見出し、本発明に至った。本発明者等は、前記両物質による癌治療のメカニズムを解明すべく、さらに研究を行った。その結果、前記両物質による癌治療の効果は、前記ＣＴＬによるコリン取り込み作用を阻害することにより、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し、細胞死を引き起こさせることによることを見出した。このような癌の治療メカニズムは、これまで全く知られていなかった新たな治療メカニズムである。
【００１３】
１−２．コリン取り込み阻害物質
前記コリン取り込み阻害物質は、前記ＣＴＬによるコリン取り込みを阻害する物質であり、その阻害機能は、例えば、コリンとの競合的拮抗作用、前記ＣＴＬの機能部位の阻害作用等があげられる。前記コリン取り込み阻害物質は、例えば、一種類の阻害機能のコリン取り込み阻害物質を単独で使用してもよいし、二種類以上の阻害機能のコリン取り込み阻害物質を併用してもよい。
【００１４】
前記コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質は、例えば、有機カチオン系化合物があげられる。前記有機カチオン系化合物は、例えば、有機第四級アンモニウム塩の化合物があげられ、具体的には、抗うつ剤等の医薬品として使用されるものがあげられる。より具体的には、例えば、ヘミコリニウム−３、キニーネ、キニジン、デシプラミン、イミプラミン、クロミプラミン、ジフェンヒドラミン、クロニジン、フルボキサミン、パロキセチン、ミルナシプラン、ベンラファキシン、レボキセチン、シタロプラム、フルオキセチン、シメチジン、プロカインアミド、ジソピラミド、クロルフェニラミン、アミロライド、アトロピン、モルヒネ、メトホルミン、アマンタジン等があげられる。これらの化合物は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。これらの化合物は、例えば、市販品を使用できる。
【００１５】
前記コリン取り込み阻害物質は、例えば、前記ＣＴＬに特異的に結合することで、前記ＣＴＬの機能を阻害する物質があげられる。前記物質は、例えば、抗体、アプタマー等があげられる。前記抗体は、例えば、免疫グロブリン(Ｉｇ)、抗体フラグメント、キメラ抗体等があげられる。前記免疫グロブリンは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等があげられる。前記抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等があげられる。前記キメラ抗体は、例えば、ヒト化抗体等があげられる。前記抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。前記抗体は、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により調製してもよいし、市販の抗体を使用してもよい。前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれでもよい。
【００１６】
１−３．コリントランスポーター発現阻害物質
前記コリントランスポーター発現阻害物質は、前記ＣＴＬの発現を阻害することにより、結果として、前記ＣＴＬによるコリン取り込みを阻害する。前記ＣＴＬの発現阻害は、例えば、前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現阻害により行える。前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現阻害は、例えば、ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現阻害により行える。ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、例えば、ｓｉＲＮＡがあげられる。
【００１７】
前記ｓｉ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡは、両鎖の３’末端が２塩基突出した２０〜２５塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路で相補的な配列を有するＲＮＡの特異的な切断を誘導する。前記ｓｉＲＮＡの配列と切断されるｍＲＮＡの対象部位の配列とは、同一性が１００％であることが最も好ましい。ただし、必ずしも同一性が１００％である必要はなく、前記同一性は、例えば、前記ｓｉＲＮＡが、前記相補的な配列を有するＲＮＡを切断する機能を有する範囲であればよい。前記ｓｉＲＮＡは、目的とするＣＴＬの配列に対し、従来公知の方法により設計できる。前記ｓｉＲＮＡは、例えば、従来公知の導入剤により、癌細胞に導入される。前記導入剤は、例えば、ウイルスベクター、リポフェクタミン等があげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、従来公知のものを使用できる。前記導入剤は、例えば、市販の導入剤を使用してもよい。
【００１８】
ＣＴＬ１のｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡは、例えば、下記（１）〜（３）のｓｉＲＮＡがあげられる。下記（１）〜（３）のｓｉＲＮＡは、それぞれ、前記ＣＴＬ１遺伝子の異なるコード領域を対して設計されたものである。各ｓｉＲＮＡについて、二本鎖の配列をそれぞれ示す。
（１）ＨＳＳ１１８７７７
AAAUUCACUGAUCCAAAUCAGGCCC（配列番号１）
GGGCCUGAUUUGGAUCAGUGAAUUU（配列番号２）
（２）ＨＳＳ１１８７７８
UUACCAGCUUCUUUCAUUGCUUUCC（配列番号３）
GGAAAGCAAUGAAAGAAGCUGGUAA（配列番号４）
（３）ＨＳＳ１１８７７９
UUAAGAUCCACACAAGUACUCUUGA（配列番号５）
UCAAGAGUACUUGUGUGGAUCUUAA（配列番号６）
【００１９】
前記ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、ｓｉＲＮＡの他に、例えば、ｓｈＲＮＡがあげられる。前記ｓｈ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子である。前記ｓｈＲＮＡも、前記ｓｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路で相補的な配列を有するＲＮＡの特異的な切断を誘導する。
【００２０】
前記ＲＮＡ干渉による前記ＣＴＬのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、例えば、前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現ベクターでもよい。前記発現ベクターは、ベクターの基本骨格に、前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡをコードする核酸を挿入することで構築できる。前記発現ベクターを構築するためのベクターの基本骨格は、特に制限されず、例えば、従来公知のものを使用できる。
【００２１】
１−４．治療対象
本発明の癌治療剤が治療対象とする癌は、特に制限されず、例えば、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、神経芽種、グリオーマ、白血病、肝臓癌、咽頭癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、食道癌、腎臓癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、口腔癌、舌癌、皮膚癌、骨肉腫、悪性リンパ腫、甲状腺癌、脳腫瘍等があげられる。本発明の癌治療剤は、前述のように、癌細胞で高発現するＣＴＬの機能阻害により癌治療効果を奏するため、例えば、特定の癌種に限定されず、幅広い癌腫の治療に使用できる。前記治療は、例えば、前記癌の縮小（癌細胞の減少）、前記癌の増殖抑制、前記癌の転移抑制等を含む。また、本発明の癌治療剤の治療対象は、前記コリントランスポーター遺伝子を有する生物があげられ、具体的には、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等があげられる。
【００２２】
１−５．投与方法、投与量、剤形
本発明の癌治療剤の投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。本発明の癌治療剤の投与量は、特に制限されず、例えば、選択する物質、動物種、年齢等に応じて適宜設定できる。本発明の癌治療剤をヒト成人に投与する場合、前記有機カチオン系化合物の１日あたりの投与量は、例えば、１０〜５００ｍｇ／ｋｇであり、前記ｓｉＲＮＡおよび前記抗体の１日あたりの投与量は、例えば、癌治療において分子標的剤として使用される、他のｓｉＲＮＡおよび抗体と同様に、従来公知の範囲である。
【００２３】
本発明の癌治療剤の剤型は、特に制限されず、例えば、用途に応じて適宜決定できる。本発明の癌治療剤を非経口投与する場合、前記剤型は、例えば、注射用製剤、点滴製剤等の非経口製剤があげられる。本発明の癌治療剤を経口投与する場合、前記剤型は、例えば、固体状または液体状の経口製剤があげられ、具体的には、例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤等があげられる。
【００２４】
１−６．添加剤等
本発明の癌治療剤は、例えば、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質の他に、その剤型に応じて、添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、薬学上許容される添加剤であることが好ましく、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質の癌治療作用に、実質的に影響を与えないものが使用できる。前記添加剤は、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等があげられ、例えば、従来公知のものが使用できる。本発明の癌治療剤は、従来公知の製剤化技術等により製剤化可能である。
【００２５】
本発明の癌治療剤は、例えば、他の癌治療剤を含んでもよい。他の癌治療剤を併用することにより、本発明の癌治療剤の癌治療効果をさらに向上できる。前記他の癌治療剤は、特に制限されず、例えば、従来から臨床で使用されている、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド等、または前記ＣＴＬとは異なる遺伝子を標的とする分子標的剤等があげられる。前記他の癌治療剤は、本発明の癌治療剤に、例えば、一種類のみ含まれてもよいし、二種類以上が含まれてもよい。また、本発明の癌治療剤は、例えば、前記コリン取り込み阻害物質および前記コリントランスポーター発現阻害物質と、前記他の癌治療剤とが、それぞれ、別々に準備されたキットの形態でもよい。
【００２６】
２．治療方法
本発明の癌治療方法は、癌患者に、前記本発明の癌治療剤を投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の癌治療方法は、前記本発明の癌治療剤を投与することが特徴であって、その他の工程は、特に制限されない。本発明の癌治療方法は、前記本発明の癌治療剤の記載を引用できる。
【実施例】
【００２７】
つぎに、本発明の実施例について、説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（ヒト癌細胞）
ヒト癌細胞は、下記（１）〜（９）の９種類を使用した。
（１）小細胞肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ６９、入手元：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））
（２）前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ、入手元：ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）
（３）前立腺癌細胞（ＰＣ−３、入手元：ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）
（４）乳癌細胞（ＭＣＦ−７、入手元：ＡＴＣＣ）
（５）骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、入手元：ＡＴＣＣ）
（６）神経芽細胞種（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、入手元：ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
（７）神経芽細胞種（ＬＡ−Ｎ−２、入手元：ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）
（８）白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ、入手元：ＡＴＣＣ）
（９）大腸癌細胞（ＨＴ−２９、入手元：ＡＴＣＣ）
【００２９】
（ヒト正常乳腺上皮細胞）
ヒト正常乳腺上皮細胞は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞（入手元：ＡＴＣＣ）を使用した。
【００３０】
（ヒト乳癌組織切片）
ヒト乳癌組織切片は、ジェノスタッフ株式会社から入手した。
【００３１】
（有機カチオン系化合物）
有機カチオン系化合物は、下記（１）〜（１５）の１５種類を使用した。
（１）ヘミコリニウム−３（ＨＣ−３、入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（２）キニーネ（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（３）キニジン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（４）デシプラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（５）イミプラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（６）クロミプラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（７）ジフェンヒドラミン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（８）クロニジン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（９）フルボキサミン（入手元：株式会社明治製菓）
（１０）パロキセチン（入手元：ＳＩＧＭＡ−Ａｒｄｌｉｃｈ社）
（１１）ミルナシプラン（入手元：旭化成株式会社）
（１２）ベンラファキシン（入手元：Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｒｅｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）
（１３）レボキセチン（入手元：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）
（１４）シタロプラム（入手元：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）
（１５）フルオキセチン（入手元：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）
【００３２】
（ｓｉＲＮＡ）
Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（登録商標）のｓｉＲＮＡおよびＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ（登録商標）のｓｉＲＮＡネガティブコントロールを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、商業的に合成した。３種類のＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ二本鎖（Ｏｌｉｇｏ ＩＤ：ＨＳＳ１１８７７７、ＨＳＳ１１８７７８およびＨＳＳ１１８７７９）を、ヒトＣＴＬ１ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＭ＿０８０５４６．３）の異なるコード領域に対して設計した。前記３種類のＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ二本鎖の各鎖の配列を、下記（１）〜（３）に示す。
（１）ＨＳＳ１１８７７７
AAAUUCACUGAUCCAAAUCAGGCCC（配列番号１）
GGGCCUGAUUUGGAUCAGUGAAUUU（配列番号２）
（２）ＨＳＳ１１８７７８
UUACCAGCUUCUUUCAUUGCUUUCC（配列番号３）
GGAAAGCAAUGAAAGAAGCUGGUAA（配列番号４）
（３）ＨＳＳ１１８７７９
UUAAGAUCCACACAAGUACUCUUGA（配列番号５）
UCAAGAGUACUUGUGUGGAUCUUAA（配列番号６）
【００３３】
（ｍＲＮＡ発現量の定量）
（１）トータルＲＮＡの抽出
前記ヒト癌細胞を、滅菌したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ＷＡＫＯ）で洗浄し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒおよびＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、前記ヒト癌細胞からトータルＲＮＡを、抽出した。
【００３４】
（２）プライマーおよびプローブ
対象とするｍＲＮＡ（ＣＨＴ１およびＣＴＬ１〜５）、およびハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ））に対する、一対のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ヒトｍＲＮＡ配列に基づいて設計された、市販品を使用した。前記設計には、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
（ＴａｑＭａｎプローブ）
ＣＨＴ１用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ００２２２３６７＿ｍ１）
ＣＴＬ１用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ００９３９３５７＿ｍ１）
ＣＴＬ２用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１０５９３８＿ｍ１）
ＣＴＬ３用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１１８２９０＿ｍ１）
ＣＴＬ４用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０４６７８４＿ｍ１）
ＣＴＬ５用プローブ （アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１２０４８５＿ｍ１）
ＧＡＰＤＨ用プローブ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）
【００３５】
（３）リアルタイムＰＣＲ
１ステップリアルタイムＰＣＲのために、５μＬのトータルＲＮＡ（１０ｎｇ）を、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ（登録商標） １−Ｓｔｅｐ Ｋｉｔを使用して、１５μＬのｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅに添加した。前記ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅには、最終的に、ＴａｑＭａｎ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ ＭｉｘｔｕｒｅおよびＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙが含まれる。リアルタイムＰＣＲのサイクル条件は、下記のとおりとした。
（サイクル条件）
ｃＤＮＡ合成：４８℃・１５分
ＲＴ（逆転写酵素）の不活性化およびＴａｑポリメラーゼの活性化：９５℃・１０分
増幅：９５℃・１５秒および６０℃・１分を１サイクルとし、４０サイクル
【００３６】
リアルタイムＰＣＲデータを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（登録商標） Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍで分析した。前記ヒト癌細胞における対象遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを、比較Ｃｔ法により算出した。各対象のＰＣＲについて、ＧＡＰＤＨと比較した前記ｍＲＮＡ発現レベルは、下記式により算出できる。
相対的ｍＲＮＡ発現（％）＝２−（Ｃｔ ｔａｒｇｅｔ−Ｃｔ ＧＡＰＤＨ）×１００
【００３７】
（細胞生存率）
前記ヒト癌細胞の細胞数を、ＡＴＰＬｉｔｅ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で測定した。ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＡＴＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍを、製造元の説明書の記載に従って行い、発光を、２０３０ ＡＲＶＯ Ｘ５ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定した。
【００３８】
（カスパーゼ３および７活性の定量）
カスパーゼ３および７の活性の測定のために、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標） ３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造元の説明書に従って行った。このキットは、カスパーゼ３および７による発光基質のＤＥＶＤ配列の切断に基づき、発光シグナルを発する。具体的には、前記ヒト癌細胞に、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ． ＷＩ）を添加し、発光を、２０３０ ＡＲＶＯ Ｘ５ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定した。
【００３９】
（コリン取り込み）
まず、前記ヒト癌細胞を、下記組成の取り込みバッファーで２回洗浄した。
取り込みバッファー（ｐＨ７．４）
１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
４．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ
１．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２
１．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４
５．６ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース
１．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４
２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ
【００４０】
つぎに、取り込みを、［３Ｈ］コリン［（比放射能：３１８２ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）から入手］を含む取り込みバッファーの添加により開始した。所定時間インキュベーション後、氷冷した取り込みバッファーで急速に所定回数洗浄した。ついで、洗浄後の前記ヒト癌細胞を、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に溶解し、アリコートを、液体シンチレーション計数法用に採取した。放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ（登録商標） ２１００ ＴＲ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で測定した。［３Ｈ］コリンの特異的取り込みを、前記アリコートに含まれるタンパク質１ｍｇあたりにおける、３０ｍｍｏｌ／Ｌの標識化していないコリンの存在下および非存在下における、全［３Ｈ］コリン取り込みの差として算出した。前記アリコートに含まれるタンパク質の濃度は、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して決定した。
【００４１】
［参考例１］
本参考例では、各種ヒト癌細胞におけるコリントランスポーターのｍＲＮＡ発現を確認した。
【００４２】
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。前記ヒト癌細胞から、トータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量を測定した。
【００４３】
図１に、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す。図１の各グラフにおいて、横軸は、各種コリントランスポーターを示し、縦軸は、相対的ｍＲＮＡ発現（％）を示し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を１００％とする相対値で示す。
【００４４】
図１に示すように、ｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＣＴＬ１〜５）が、検討した全てのヒト癌細胞において、高発現していることが確認された。また、前記ＣＴＬ１〜５の発現パターンは、各種ヒト癌細胞において、様々であることが確認された。一方、高親和性コリントランスポーターであるＣＨＴ１は、アセチルコリン神経系の神経芽細胞腫（ＬＡ−Ｎ−２）以外のヒト癌細胞では、発現が確認できなかった。これらの結果から、前記各種ヒト癌細胞におけるコリン取り込みは、ＣＴＬ１〜５を介して行われることが明らかである。
【００４５】
［参考例２］
本参考例では、ヒト乳癌細胞およびヒト正常乳腺上皮細胞におけるコリントランスポーターのｍＲＮＡ発現を確認した。
【００４６】
前記ヒト乳癌細胞は、ＭＣＦ−７細胞を使用し、前記ヒト正常乳腺上皮細胞は、ＭＣＦ−１０Ａを使用した。まず、前記両細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で増殖させた。前記ＲＰＭＩ１６４０培地は、コーティングしていないフラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で、１０％ ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および２０ｍｇ／Ｌ カナマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を添加したものを使用した。増殖させた前記両細胞から、トータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量を測定した。
【００４７】
図２に、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量の測定結果を示す。図２において、横軸は、各種コリントランスポーターを示し、縦軸は、相対的ｍＲＮＡ発現（％）を示し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を１００％とする相対値で示す。黒のバーは、ＭＣＦ−７細胞の結果、白のバーは、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の結果を示す。
【００４８】
図２に示すように、ＭＣＦ−７細胞とＭＣＦ−１０Ａ細胞とでは、コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現量および発現パターンが異なっていた。具体的には、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞では、ヒト正常乳腺上皮細胞であるＭＣＦ−１０Ａ細胞と比較して、ＣＴＬ１のｍＲＮＡの発現量が約５倍、ＣＴＬ２のｍＲＮＡの発現量が約２０倍亢進していた。また、ＣＴＬ４のｍＲＮＡは、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞でのみ特異的に発現していた。
【００４９】
［参考例３］
本参考例では、ヒト乳癌組織切片について、免疫組織化学的検査を行うことで、前記ヒト乳癌組織におけるＣＴＬ２タンパク質の発現を確認した。
【００５０】
前記ヒト乳癌組織切片を、脱パラフィンし、ＰＢＳを使用して再度水和し、サンプルを調製した。このサンプルを、０．１％トリプシン中に置き、３７℃で２５分間振とうした。ついで、下記工程１〜７をこの順序で行い、ＣＴＬ２タンパク質の発現を確認した。
（工程）
１．前記サンプルを、３％Ｈ２Ｏ２を含む１×ＰＢＳ中で、室温で１０分間インキュベートする。インキュベート後の前記サンプルを再度洗浄する。
２．洗浄後の前記サンプルを、ブロッキング液（ＤＡＫＯ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ）中で、１０分間インキュベートする。
３．ブロッキング後の前記サンプルに、一次抗体（１０μｇ／ｍＬ、抗ＣＴＬ２抗体および正常マウスＩｇＧ１抗体、ブロッキング液で希釈）を添加し、前記サンプルを、４℃で一昼夜インキュベートする。インキュベート後の前記サンプルを、１×ＰＢＳで洗浄する。
４．洗浄後の前記サンプルを、二次抗体（１：５００、マウスＩｇビオチン（ＤＡＫＯ：Ｅ０４３３））と、３０分間インキュベートする。インキュベート後の前記サンプルを、ＰＢＳで洗浄する。
５．ＣＴＬ２タンパク質を、ＡＢＣ法によりＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２染色を行うことで検出する。具体的には、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ ｋｉｔを使用し、基質溶液（ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２染色）を適用する。前記基質溶液の適用後の前記サンプルを、水道水で徹底的に洗浄する。
６．洗浄後の前記サンプルを、マイヤーヘマトキシリン中で対比染色する。
７．染色後の前記サンプルを脱水し、脱水後の前記サンプルを、松浪硝子工業株式会社製の商品名「ＡＰＳコートスライドグラス」にマウントし、蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製の商品名「ＢＺ−８０００」）で観察する。
【００５１】
図３に、ＣＴＬ２タンパク質の発現の確認結果を示す。図３において、左側の写真が、１次抗体として正常マウスＩｇＧ１抗体を使用した結果（コントロール）、右側の写真が、１次抗体として抗ＣＴＬ２抗体を使用した結果を示す。倍率は、２００倍とした。
【００５２】
図３に示すように、１次抗体として抗ＣＴＬ２抗体を使用した場合にのみ、前記ヒト乳癌組織において、陽性の染色像が確認された。この結果から、ヒト乳癌組織におけるＣＴＬ２タンパク質の発現が確認された。
【００５３】
［参考例４］
本参考例では、ヒト乳癌細胞とヒト正常乳腺上皮細胞におけるコリン取り込み作用を確認した。
【００５４】
前記ヒト乳癌細胞は、ＭＣＦ−７細胞を使用し、前記ヒト正常乳腺上皮細胞は、ＭＣＦ−１０Ａを使用した。コリン取り込みを、６０分間での濃度１０μｍｏｌ／Ｌの［３Ｈ］コリン取り込みのタイムコースで試験した。具体的には、まず、前記両細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、２４穴プレートに、細胞密度８０％で増殖させた。前記ＲＰＭＩ１６４０培地は、２４穴プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で、１０％ ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および２０ｍｇ／Ｌ カナマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を添加したものを使用した。前記増殖後、前記２４穴プレートから、前記培地を除去し、前記両細胞について、コリン取り込みを測定した。前記コリン取り込みでは、前記氷冷した取り込みバッファーで、前記細胞を２回洗浄し、前記タイムコースは、［３Ｈ］コリンの添加から、５、１０、２０、３０、４５および６０分とした。
【００５５】
図４に、コリン取り込み作用の確認結果を示す。図４において、横軸は、コリン添加からの経過時間（分）を示し、縦軸は、タンパク質１ｍｇあたりの［３Ｈ］コリンの取り込み量（ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を示す。黒丸は、ＭＣＦ−７細胞の結果、白丸は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の結果を示す。
【００５６】
図４に示すように、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞では、ヒト正常乳腺上皮細胞であるＭＣＦ−１０Ａ細胞と比較して、［３Ｈ］コリンの取り込み量が約２倍に増大していた。この結果から、ヒト乳癌細胞は、ヒト正常乳腺上皮細胞と比較して、コリンを大量に取り込んでいることが明らかである。
【００５７】
［実施例１］
本実施例では、各種ヒト癌細胞に対するコリン取り込み阻害物質ＨＣ−３の、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性に及ぼす影響を確認した。
【００５８】
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。まず、前記各細胞を、細胞密度６０〜７０％で、２４穴プレートに播種した。これに、ＨＣ−３を濃度１ｍｍｏｌ／Ｌで、２日間毎日添加し、各ウェルの液量を、１．０ｍＬとした。ＨＣ−３の最初の添加から３日後に、前記各細胞について、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。コントロールは、ＨＣ−３に代えて、生理食塩水を添加し、同様にして細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。
【００５９】
図５に、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性の測定結果を示す。図５の各グラフにおいて、白のバーは、ＨＣ−３添加（１ｍｍｏｌ／Ｌ）の結果、黒のバーは、コントロール（Ｖｅｈｉｃｌｅ）の結果を示す。また、各グラフにおける左側の白のバーおよび黒のバーのセットは、細胞生存率の測定結果を示し、各グラフにおける右側の白のバーおよび黒のバーのセットは、カスパーゼ３／７活性の測定結果を示す。細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性は、コントロールでの測定結果を１００％とし、前記各種ヒト癌細胞における測定結果を、相対値（％）で示す。
【００６０】
図５に示すように、検討した全てのヒト癌細胞において、コリン取り込み阻害物質であるＨＣ−３の添加により、有意な細胞生存率の低下、および有意なカスパーゼ３／７活性の増大が確認された。これらの結果から、ＨＣ−３によるコリン取り込み阻害により、前記ヒト癌細胞において、アポトーシスが誘導され、細胞死が引き起こされていることが確認された。したがって、癌細胞におけるコリン取り込み作用を担っているコリントランスポーターが、癌治療の標的分子であることが明らかとなった。そして、前記参考例１に示すように、ヒト癌細胞において発現しているコリントランスポーターがＣＴＬ１〜５であることが明らかとなっている。以上を踏まえると、癌細胞において発現するＣＴＬ１〜５の機能を阻害する作用は、アポトーシスによる細胞死をもたらすことになり、前記コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質は、新たな治療メカニズムによる癌治療剤として、癌治療に有用といえる。
【００６１】
［実施例２］
本実施例では、小細胞肺癌細胞に対するＲＮＡ干渉法でのＣＴＬ１ ｍＲＮＡ発現抑制による、細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性への影響を確認した。
【００６２】
小細胞肺癌細胞は、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞を使用した。前記細胞を、培養密度５０〜６０％で、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした２４穴組織培養プレートに播種した。前記培養後、培地を除去し、前記細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で、１回洗浄した。洗浄後の前記細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ中で、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（ウェルあたり３μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用し、前記３種類のＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡの混合物（各５０ｎｍｏｌ／Ｌ）によりトランスファーした。前記ＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡ混合物を、２日毎に３回添加した。そして、初回のトランスフェクションから７日後に、前記細胞について、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。コリン取り込みでは、１０分間のインキュベーション後、前記氷冷した取り込みバッファーで、前記細胞を３回洗浄した。コントロールは、前記ＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡ混合物に代えて、ｓｉＲＮＡネガティブコントロールを添加し、同様にしてＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性を測定した。
【００６３】
図６に、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量、コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性の測定結果を示す。図６において、（ａ）はＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量の測定結果、（ｂ）はコリン取り込みの測定結果、（ｃ）は細胞生存率の測定結果、（ｄ）はカスパーゼ３／７の活性の測定結果を示す。ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を１００％とする相対値（％、相対的ｍＲＮＡ発現（％））で示す。コリン取り込み、細胞生存率およびカスパーゼ３／７の活性は、それぞれ、コントロールでの測定結果を１００％として、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞における測定結果を、相対値（％）で示す。
【００６４】
図６に示すように、前記ＣＴＬ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現は、約５０％抑制された（図６（ａ））。また、コリン取り込み作用および細胞生存率は、有意に抑制された（図６（ｂ）および図６（ｃ））。そして、カスパーゼ３／７活性は、増大された（図６（ｄ））。これらの結果から、ＣＴＬ１ ｍＲＮＡの発現を、ｓｉＲＮＡにより特異的に抑制することで、コリン取り込みの抑制と、アポトーシス誘導とによる細胞死が引き起こされることが確認された。したがって、小細胞肺癌細胞におけるＣＴＬ１分子を介するコリン取り込み作用は、癌細胞の生存に重要な役割を担っており、ＣＴＬ１分子は、癌治療の標的分子であることが明らかである。そして、ＲＮＡ干渉により前記コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現を阻害する物質は、新たな治療メカニズムによる癌治療剤として、癌治療に有用といえる。
【００６５】
［実施例３］
本実施例では、各種ヒト癌細胞に対する有機カチオン系化合物の、コリン取り込み阻害作用および細胞死誘導作用を評価した。
【００６６】
（１）コリン取り込み阻害作用の評価
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。まず、前記各細胞を、１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で、２４穴プレートに、細胞密度８０％で増殖させた。一方、ＨＣ−３を除く１４種類の有機カチオン系化合物を、最終濃度１００μｍｏｌ／Ｌとなるように、生理食塩水に溶解した。前記有機カチオン系化合物の溶液を、前記［３Ｈ］コリンを含む取り込みバッファーに添加した。この［３Ｈ］コリンを含む取り込みバッファーを使用して、コリン取り込みを測定した。コリン取り込みでは、１０分間のインキュベーション後、前記氷冷した取り込みバッファーで、前記細胞を２回洗浄した。コントロールは、前記有機カチオン系化合物の溶液に代えて、生理食塩水を添加し、コリン取り込みを測定した。
【００６７】
（２）細胞死誘導作用の評価
前記９種類全てのヒト癌細胞を使用した。まず、前記各細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）中で、２４穴プレートに、細胞密度８０％で増殖させた。前記有機カチオン系化合物の溶液を、前記培地に添加し、前記添加から２４時間後に、細胞生存率を測定した。コントロールは、前記有機カチオン系化合物の溶液に代えて、生理食塩水を添加し、同様にして細胞生存率を測定した。
【００６８】
表１に、コリン取り込みの測定結果を示し、表２に、細胞生存率の測定結果を示す。コリン取り込みおよび細胞生存率は、コントロールでの測定結果を１００％として、前記各種ヒト癌細胞における測定結果を、相対値（％）で示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
前記表１に示すように、本実施例で使用した有機カチオン系化合物は、検討した全てのヒト癌細胞へのコリン取り込みを阻害することが確認された。特に、抗うつ薬として使用される、デシプラミン、イミプラミン、クロミプラミン、フルボキサミン、パロキセチンおよびフルオキセチンは、強力なコリン取り込み阻害活性を示した。また、前記表２に示すように、本実施例で使用した有機カチオン系化合物は、各種ヒト癌細胞の細胞生存率を低下させ、細胞死を誘導することが確認された。そして、本実施例で使用した有機カチオン系化合物の、コリン取り込み阻害作用と細胞死誘導作用との間には、図７に示すように、有意な相関関係（Ｒ＝０．７６７２、Ｐ＜０．０００１）が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
以上のように、本発明によれば、新たな治療メカニズムによる癌治療剤を提供できる。本発明の癌治療剤は、癌細胞で高発現するＣＴＬの機能阻害により癌治療効果を奏するため、例えば、特定の癌種に限定されず、幅広い癌腫の治療に使用できる。このため、本発明の癌治療剤は、癌治療に極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するための癌治療剤であって、
コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする、癌治療剤。
【請求項２】
前記コリン取り込みを阻害する物質が、コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質を含む、請求項１記載の癌治療剤。
【請求項３】
前記コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質が、有機カチオン系化合物を含む、請求項２記載の癌治療剤。
【請求項４】
前記有機カチオン系化合物が、ヘミコリニウム−３、キニーネ、キニジン、デシプラミン、イミプラミン、クロミプラミン、ジフェンヒドラミン、クロニジン、フルボキサミン、パロキセチン、ミルナシプラン、ベンラファキシン、レボキセチン、シタロプラム、フルオキセチン、シメチジン、プロカインアミド、ジソピラミド、クロルフェニラミン、アミロライド、アトロピン、モルヒネ、メトホルミンおよびアマンタジンからなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項３記載の癌治療剤。
【請求項５】
前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により前記コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項６】
前記コリントランスポーターが、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ＣＴＬ３、ＣＴＬ４およびＣＴＬ５からなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項７】
前記癌が、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、神経芽種、グリオーマ、白血病、肝臓癌、咽頭癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、食道癌、腎臓癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、口腔癌、舌癌、皮膚癌、骨肉腫、悪性リンパ腫、甲状腺癌および脳腫瘍からなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項１】
癌を治療するための癌治療剤であって、
コリントランスポーターによるコリン取り込みを阻害する物質、および前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする、癌治療剤。
【請求項２】
前記コリン取り込みを阻害する物質が、コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質を含む、請求項１記載の癌治療剤。
【請求項３】
前記コリンとの競合的拮抗作用によりコリン取り込みを阻害する物質が、有機カチオン系化合物を含む、請求項２記載の癌治療剤。
【請求項４】
前記有機カチオン系化合物が、ヘミコリニウム−３、キニーネ、キニジン、デシプラミン、イミプラミン、クロミプラミン、ジフェンヒドラミン、クロニジン、フルボキサミン、パロキセチン、ミルナシプラン、ベンラファキシン、レボキセチン、シタロプラム、フルオキセチン、シメチジン、プロカインアミド、ジソピラミド、クロルフェニラミン、アミロライド、アトロピン、モルヒネ、メトホルミンおよびアマンタジンからなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項３記載の癌治療剤。
【請求項５】
前記コリントランスポーターの発現を阻害する物質が、ＲＮＡ干渉により前記コリントランスポーターのｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項６】
前記コリントランスポーターが、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ＣＴＬ３、ＣＴＬ４およびＣＴＬ５からなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項７】
前記癌が、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、神経芽種、グリオーマ、白血病、肝臓癌、咽頭癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、食道癌、腎臓癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、口腔癌、舌癌、皮膚癌、骨肉腫、悪性リンパ腫、甲状腺癌および脳腫瘍からなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−４９６４６（Ｐ２０１３−４９６４６Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８８０５３（Ｐ２０１１−１８８０５３）
【出願日】平成２３年８月３０日（２０１１．８．３０）
【出願人】（５０５４５７９９４）学校法人東京医科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月３０日（２０１１．８．３０）
【出願人】（５０５４５７９９４）学校法人東京医科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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