癌治療及び予防用薬学的組成物、これを含む癌改善並びに予防用健康機能食品
【課題】癌細胞の増殖のみを抑制して正常細胞には影響を及ばせず、生薬成分で長時期服用したり多量服用しても不作用が少ない癌治療及び予防用薬学的組成物、及びこれを有効成分として含む癌改善並びに予防用健康機能食品であり、健康機能飲料として飲用が容易であり、携帯及び摂取が容易である組成物を提供する。
【解決手段】紅景天、白花蛇舌草及び肉従蓉を含む組成物であり、ここで紅景天が、総組成物１００重量部に対して１０ないし７０重量部含まれ、白花蛇舌草が、総組成物１００重量部に対して２０ないし８０重量部含める。
【解決手段】紅景天、白花蛇舌草及び肉従蓉を含む組成物であり、ここで紅景天が、総組成物１００重量部に対して１０ないし７０重量部含まれ、白花蛇舌草が、総組成物１００重量部に対して２０ないし８０重量部含める。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療及び予防用薬学的組成物、これを含む癌改善並びに予防用健康機能食品に関し、具体的には、紅景天及び白花蛇舌草を含んで発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の増殖を抑制し、不作用が少ない癌治療及び予防用薬学的組成物、これを有効成分として含む癌改善並びに予防用健康機能食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は生体から栄養の供給を受けるが、生体とは独立的に過剰増殖し、生体を破壊する生体組織において発生した異常な組織の塊である。身体すべての臓器は数多い細胞から構成されているため、身体の正常細胞が異常細胞になりつつ、無秩序に分裂増殖して多くの細胞を生じさせることから癌が発生する。癌の発病には遺伝的な素因も深く関与しているが、環境的な要因も大きい影響を及ぼし、先進国であるほど癌の発病が増加する傾向がある。癌の発病原因として、農薬、殺虫剤などの使用量、及び食品内残留量の増加、食品保存剤、着色剤、防腐剤などが添加した加工食品の消費増加、水質、土壌、大気汚染の増加、現代人のストレス増加、活動量の減少、そして豊かな食生活に伴う肥満などが報告されている。最近は、正常細胞の信号伝達体系に異常が発生するか、又は癌を引き起こし得る癌遺伝子が活動する場合、ジェムザールは癌抑制遺伝子に問題が発生したときに癌が生じると知られている。
【０００３】
癌を治療する方法として外科的な治療、化学的な治療、及び放射線治療があるが、外科的な治療は癌の初期状態の除去には効果的であるが、場合に応じては臓器を除去しなければならないなどの不作用と、転移を防止することができないとの問題があり、放射線治療の場合においても特定部位の癌治療には治療効果が高い長所があるものの、放射線の照射による新たな発癌危険性と転移を防止することができないという問題、及び治療時に患者の苦痛が伴うという問題がある。化学的な治療法の場合、通常、抗ガン剤と呼ばれる薬の形態が一般的であるが、抗ガン剤は、癌細胞にのみ作用するのでなく、患者の正常細胞にも毒性を発揮してしまうことが不作用として知られている。したがって、抗ガン剤の開発は、癌組織への高い選択性と共にその毒性を最小化する方向に向かって新薬の開発が行われている。
【０００４】
天然材料成分は毒性及び不作用が少ないと知られており、最近には天然材料から坑癌成分を抽出したり加工し、各種の医薬剤又はドリンク剤に開発しようという研究が盛んに行われている。しかしながら、一部の生薬剤を含有しているドリンク剤は、癌細胞のみならず正常細胞にも作用することで髪の毛が抜けてしまうなどの毒性や不作用があり得、高価の生薬剤を使用することによって市販値段が高過ぎて広く普及できないなどの問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、紅景天及び白花蛇舌草を含んで正常細胞には不作用がなく、癌細胞にのみ作用し、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の活性を抑制させる癌治療及び予防用組成物、これを含む癌改善並びに予防用健康機能食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述の目的を達成するために、紅景天及び白花蛇舌草を含む癌治療及び予防用薬学的組成物を提供する。
前記紅景天は、総組成物１００重量部に対して１０ないし７０重量部含まれることができる。
前記白花蛇舌草は、総組成物１００重量部に対して２０ないし８０重量部含まれることができる。
前記癌治療及び予防用薬学的組成物は、肉従蓉をさらに含むことができる。
前記肉従蓉は、総組成物１００重量部に対して１０ないし４０重量部含まれることができる。
【０００７】
前記癌治療及び予防用薬学的組成物は、蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物をさらに含むことができる。
前記蛇床子、兎糸子及び遠志は、総組成物１００重量部に対して５ないし１５重量部含まれることができる。
前記癌治療及び予防用薬学的組成物は、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることができる。
前記癌は、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌及び前立腺癌であることができる。
【０００８】
本発明の他の目的を達成するために、前記癌治療及び予防用薬学的組成物を有効成分として含む癌改善及び予防用健康機能食品を提供する。
前記健康機能食品は、健康機能飲料であることができる。
また、前記健康機能食品は、天然茶であることができる。
前記癌治療及び予防用薬学的組成物の抽出物は、健康機能食品又は健康機能飲料の総１００重量部に対して０．００１ないし３０重量部含まれることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組成物は、癌細胞の増殖のみを抑制するだけであって、正常細胞には影響を及ばず、天産物からなって長期間服用したり多量服用しても従来の抗ガン剤よりも不作用が少ない。健康機能食品の形態として製造可能であるため、茶などの飲料に製造すれば美感が改善されて飲用が容易かつ簡便であることから、抗ガン剤を手軽に服用できるという長所がある。
【００１０】
また、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の活性を抑制するため、癌治療及び予防に効果的である。特に、膵臓癌の場合、治療のために手術、放射線及び化学療法などが施行されているが、いずれのものも効果的な治療法が未だ開発されていないところ、本発明の組成物は、膵臓癌治療及び補助治療剤としてその使用が期待されている。
癌治療及び予防にのみ効果的でなく、肝機能が強化されるなどの付帯効果を獲得することができ、既存のドリンク類に含まれている生薬剤よりもその値段が低いことから商業化にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明におけるｐ５３の活性による細胞死滅及び細胞周期の調節メカニズムを示した模式図である。
【図２】本発明の実施例３及び６の試料を濃度を別にして、ヒトの膵臓癌細胞株、肝臓癌細胞株及び前立腺癌細胞株に処理し、２４時間培養した後に処理前の細胞生存率（１００％）を基準にして細胞生存率を百分率で示したグラフである。
【図３】本発明の実施例３及び6の試料をＰＡＮＣ１細胞に処理した後２４時間培養して細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図４】ヒトの癌細胞株においてｐ２１蛋白質の発現程度を実施例の試料で処理したものと処理しないものとを比較して示した図である。
【図５】ヒトの癌細胞株においてＢａｘ蛋白質の発現程度を実施例の試料で処理したものと処理しないものとを比較して示した図である。
【図６】ヌードマウスにヒトの癌細胞株を移植した図である。
【図７】癌細胞移植のマウスモデルにおいて、本発明の実施例における癌治療及び予防用薬学的組成物を含む健康機能飲料が餌の摂取量に及ぼす影響を示す図である。
【図８】癌細胞移植のマウスモデルにおいて、実施例の本発明における癌治療及び予防用薬学的組成物を含む健康機能飲料が飲用水の摂取量に及ぼす影響を示す図である。
【図９】癌細胞移植のヌードマウスモデルに２週間にわたって本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物を含む健康機能飲料を飲用させた後、犠牲にした当時の姿を示す図である。
【図１０】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから腫瘍を摘出し、その重さを測定した図である。
【図１１】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから膵臓癌組織を摘出し、その重さを測定した図である。
【図１２】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから前立腺癌組織を摘出し、その重さを測定した図である。
【図１３】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから膵臓癌組織を摘出し、ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現に及ぼす影響を観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、紅景天及び白花蛇舌草を含む。
前記本発明における癌治療及び予防用薬学的組成物は、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の増殖を抑制するため、癌治療及び予防に効果がある。天産物からなって癌細胞の活性を抑制するだけであって、正常細胞にはその影響を及ばないことから不作用が少ない。
【００１４】
前記紅景天（ｒｈｏｄｉｏｌａ ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）は海抜１８００ｍないし２３００ｍの高山地帯で自生する多年生草本植物であって、紅景天の生理活性物質は発癌抑制遺伝子であるｐ５３、ｐ２１及びＢａｘの発現を増加させて癌細胞の増殖を抑制する。
【００１５】
特定遺伝子の活性化及び抑制は、腫瘍の発生及び発達の原因となるが、発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）は癌成長を促進する一方、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）は癌成長を抑制する。代表的な発癌抑制遺伝子として、ｐ５３、ｐ２１及びＢａｘがある。
【００１６】
図１は、ｐ５３の活性化による細胞死滅及び細胞周期の調節メカニズムを示す模式図である。ｐ５３は最も知られている腫瘍抑制遺伝子であるが、細胞周期を調節して細胞死滅を誘導することによって、細胞が悪性形質に転換されないよう保護する役割を果たし、ｐ５３遺伝子の変異及び欠損は、ヒトの癌腫において最もありふれた遺伝子異常の１つである。細胞がＤＮＡの損傷を受けると、ｐ５３の発現は急激に増加し、その結果としてｐ５３の下位遺伝子のうちの１つであるｐ２１の発現が誘導されることによって、細胞周期はＧ１時期に停止する。ｐ２１と共にｐ５３の調節を受ける下位遺伝子としては、細胞死滅を誘導するＣＤ９５／ＦＡＳ、Ｂａｘ、Ｎｏｘａ、Ｃａｐａｓｅ−１及びＣａｐａｓｅ−６などがある。また、ｐ５３は、ＤＮＡの回復（ＤＮＡ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ）に関与するＧＡＤＤ４５を活性化させてＤＮＡの損傷回復を促進することにより遺伝子の安定性を維持させる。
【００１７】
ｐ２１はｐ５３の下位遺伝子のうちの１つであって、細胞周期の進行をＧ１期で抑制する。細胞周期は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期に分れて進行されるが、細胞がＧ１期で停止するか、あるいはＧ１期からＳ期に移行して細胞増殖するかは網膜母細胞種（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）（Ｒｂ）のリン酸化と密接な関連がある。非リン酸化状態のｐＲｂは、転写調節因子であるＥ２Ｆと結合してＥ２Ｆの機能を抑制することによって、細胞がＳ期に進入するために必要な遺伝子の発現を抑制し、その結果、細胞周期はＧ１期に停止するようになる。
【００１８】
しかし、ｃｙｃｌｉｎとｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）の複合体によってｐＲｂがリン酸化されれば、Ｅ２Ｆとはこれ以上結合されず、これによって１期になされたＥ２Ｆの活性化に応じて、細胞はＳ期に必要な種々の遺伝子の転写が活性化されることで細胞周期が進行される。この過程において、ｐ２１は、ｃｙｃｌｉｎ−ＣＤＫの複合体の活性を抑制することによりｐＲｂのリン酸化を抑制するために、Ｅ２Ｆは、不活性化状態で続いてｐＲｂに結合されていることから細胞周期はＧ１期に停止する。したがって、発癌遺伝子の増殖が抑制されることができる。
【００１９】
Ｂａｘ蛋白質は細胞死滅を司る最も核心的な因子であって、細胞質に活性しているｐ５３の発現蛋白質が存在すればＢａｘ蛋白質の活性が増加する。Ｂａｘ蛋白質の活性増加は、細胞内部に存在するミトコンドリアの細胞膜に孔を形成する。ミトコンドリアは電子伝達系を介して細胞の生存と活動に必要なエネルギーであるＡＴＰを生産する箇所であるため、ミトコンドリア膜に形成された孔によって細胞が生存し難くなる。したがって、腫瘍細胞にＢａｘ蛋白質の発現が増加すれば、細胞死滅を促進することにより腫瘍細胞が除去されるようになる。
【００２０】
前記紅景天は全草を使用することができ、葉、葉脈、又は根などの特定部位を使用することもできる。
前記紅景天は抽出して抽出物の形態で添加することができ、抽出物を凍結乾燥又は熱風乾燥して水分含有量５％ないし２０％未満に粉末化させて添加することもできる。また、抽出せずに紅景天そのものを添加したり凍結乾燥又は熱風乾燥など、当業界に公知の粉末化方法を使用して紅景天を粉末化し、本発明の組成物に添加することもできる。前記抽出は、当業界において公知の方法が制限なく使用され得、好ましくは、有機溶媒抽出法を使用することができる。前記有機溶媒としては、飲用時の人体に無害な水、エタノール、又はこれらの混合物を使用することが好ましい。エタノールは、１０％ないし７０％濃度のエタノールを使用することができ、２５℃ないし１００℃の温度で、５時間ないし２０時間抽出することが好ましい。
【００２１】
前記紅景天は、総組成物１００重量部に対して１０重量部ないし７０重量部含まれ得る。１０重量部未満に添加されれば、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌予防及び治療に効果的であるとの本発明の目的を達成することが難しく、７０重量部を超過して添加すれば、健康機能食品などに添加されたときに紅景天特有の味と香が濃過ぎて美感を害する恐れがあり、使用量対比の効果の増加程度が微小である。
【００２２】
前記白花蛇舌草は、発癌遺伝子の成長を抑制する効果を有し、前記紅景天と同時に使用するとき癌治療及び予防効果の上昇作用がある。また、長時期服用したり大量服用したりする時にも不作用がほとんどないという長所がある。
【００２３】
前記白花蛇舌草は抽出物の形態で添加されるか、抽出物を粉末化して添加することができ、抽出せずに白花蛇舌草そのものを添加したり、当業界に知られた通常の方法で粉末化して添加したりすることもできる。抽出する場合、当業界に公知の抽出法が制限なく使用され得、好ましくは、水、１０％ないし７０％濃度のエタノール、又は水とエタノールとの混合物を使用した溶媒抽出法を利用することができる。
【００２４】
前記白花蛇舌草は、総組成物１００重量部に対して２０重量部ないし８０重量部含まれ得る。２０重量部未満に添加されれば、癌治療及び予防の効果が微小であり、８０重量部を超過して添加すれば、白花蛇舌草含有量の増加に比べて坑癌効果の増加が微小であり、弱い下痢を誘発し得る。
【００２５】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は肉従蓉をさらに含むことができる。
前記肉従蓉（ニクジュヨウ）は、前記紅景天及び白花蛇舌草と併せて使用するとき癌細胞の成長を抑制する効果を上昇させる作用を行う。
【００２６】
前記肉従蓉は抽出物の形態で添加されるか、抽出物を粉末化して添加することができ、抽出せずに肉従蓉そのものを添加したり、当業界に知られた通常の方法で肉従蓉を粉末化して添加したりすることもできる。抽出する場合、当業界に公知の抽出法が制限なく使用され得、好ましくは、水、１０％ないし７０％濃度のエタノール、又は前記成分などの混合物を使用した有機溶媒抽出法を利用することができる。
【００２７】
前記肉従蓉は、総組成物１００重量部に対して１０重量部ないし４０重量部含まれ得る。１０重量部未満に含まれれば、癌細胞の成長を抑制する効果を上昇させる程度が微小であり、４０重量部を超過して添加すれば、特異な臭いにより本発明の組成物を健康機能食品などに添加するとき好み程度を減少させ得る。
【００２８】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物をさらに含むことができる。前記蛇床子、兎糸子又は遠志などの物質をさらに含むことによって、癌治療及び予防効果をより一層上昇させることができる。
【００２９】
前記蛇床子は、腎臓を暖かくして陽気を上げ、抗炎症の効果もあって皮膚湿疹及びアレルギー性皮膚炎の治療にも活用される。本発明において蛇床子は、血管新生の抑制作用を行っていると考えられる。癌の転移は血管の生成を介して起こるため、血管新生の抑制作用に優れた蛇床子を抗ガン剤として使用する場合に癌の転移を防止し、癌の治療にも効果を示すことができる。
【００３０】
前記兎糸子は、腫物、滋養強壮などに効果があるものとして知られており、兎糸子により抗体が早期に形成され得ることで坑癌効果を上昇させることができる。
前記遠志は、遠志科に属する学名 Polygala tenuifolia Willd.の根として心気の安定に効果があり、発癌抑制遺伝子の発現増加の効果を上昇させる作用を行うものと考えられる。
【００３１】
前記蛇床子、兎糸子、及び遠志は、抽出物の形態で本発明の組成物に含まれるか、又は抽出物を凍結乾燥又は熱風乾燥し粉末化して添加することもでき、抽出せずに蛇床子、兎糸子及び遠志そのものを乾燥して粉末化した後添加することもできる。
前記蛇床子、兎糸子及び遠志は、総組成物１００重量部に対して５重量部ないし１５重量部含まれ得る。５重量部未満に含まれれば、癌治療及び予防効果を上昇させようという添加目的を達成し難く、１５重量部を超過して添加すれば、添加量に比べて坑癌効果が向上する程度が微小である。
【００３２】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、必要に応じて、甘草、蜂蜜、トウキ、五味子、高麗人参、紅蔘、ナツメ、ショウガなどの成分を選択的にさらに含み得る。
前記成分は、他の薬の作用を調和させる目的としても使用され、美感を改善させるためにも使用され得る。
【００３３】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌及び肝臓癌に効果的である。特に、膵臓癌、前立腺癌及び肝臓癌に効果的である。
膵臓癌の場合、低い濃度でも坑癌効果を示すために、化学的治療及び放射線治療など多様な治療法が施行されているものの効果的な治療法が開発されていない膵臓癌の治療剤及び補助治療剤には有用に利用され得る。
【００３４】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、前述した生薬材料を個別に抽出して抽出物や粉末状に添加する方法以外に、前記生薬剤を洗浄した後に細切して混合し、混合された生薬剤を抽出して抽出物形態に製造できる。抽出法は、当業界に公知の方法に制限されず使用され得、好ましくは、水、１０％ないし７０％のエタノール、又はこれらの混合物を溶媒として使用した溶媒抽出法を利用することができる。
【００３５】
また、前記抽出物を濃縮して凍結乾燥又は熱風乾燥し、粉末状に製造することもできる。
前記抽出及び粉末化過程を具体的に詳説すれば次の通りである。
生薬剤をきれいに洗浄し、不純物や汚染物を除去するために３０％ないし７０％のエタノール、好ましくは、５０％のエタノールに６０℃以下の温度で３０分ないし４時間程度浸漬させた後、８０℃ないし１００℃で１時間ないし１０時間抽出する。抽出後に５０００ｒｐｍないし１００００ｒｐｍで５分ないし３０分間遠心分離して上澄み液を濾過した後、３０℃ないし７０℃で７５゜Ｂｒｉｘになるよう減圧濃縮する。前記濃縮液を、水分含有量が１０％以下になるよう熱風乾燥するか、又は−４０℃以下で凍結乾燥して粉末化する。
【００３６】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、薬剤学的に許される担体と混合され得る。薬学的組成物に通常用いられる賦形剤、崩解剤、甘味剤、滑澤剤、香味剤を加えて含むことができ、当業界に公知の通常な方法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、液剤などで剤形化できる。
【００３７】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、目的とする方法に応じて経口又は非経口的に投与され得、有効成分として体重１ｋｇ当り０．０１ｇないし１０ｇの量を１回ないし数回にわたって投与できる。投与量又は服用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度に応じて変化され得る。
本発明の癌改善及び予防用健康機能食品は、前記癌治療及び予防用薬学的組成物を有効成分として含むことができる。前記健康機能食品は、健康機能飲料の形態に製造できる。前記健康機能飲料の一例として、前記癌治療及び予防用薬学的組成物を有効成分として含む天然茶を製造できる。
【００３８】
本発明の薬学的組成物を有効成分として含有する健康機能食品又は健康機能飲料は、癌の改善及び予防に効果がありつつ、不作用がないだけでなく、特に飲料の場合に容易かつ簡単に摂取することができ、さらに値段も低価である。
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、健康機能食品又は健康機能飲料の総１００重量部に対して０．００１重量部ないし３０重量部添加できる。０．００１重量部未満に添加されれば、癌改善及び予防効果が微小であり、３０重量部を超過して添加すれば、前記組成物特有の香り及び味により食品の味を妨げ、飲用や摂取が容易でない恐れがある。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例及び比較例を介して本発明を詳説する。これは本発明の説明のためのものであって、これにより本発明の範囲が制限されることはない。
【００４０】
＜実施例１＞癌治療及び予防に効果的な組成物を抽出物に製造
紅景天３０ｇ、白花蛇舌草２０ｇ、肉従蓉３０ｇ及び遠志１０ｇを水で洗浄した後、乾燥させて細切し、５０℃で５０％エタノールに１時間程度浸漬させた後、５０％エタノールで５０℃にて１０時間抽出した。前記抽出物に蜂蜜１０ｇを添加して癌治療及び予防に効果的な組成物を抽出物の形態に製造した。前記抽出物の水分含有量は２５％である。
【００４１】
＜実施例２＞癌治療及び予防に効果的な組成物を粉末に製造
前記実施例１において製造した抽出物を７５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み液を用いて濾過し、６０℃で７０気圧に減圧濃縮した。前記濃縮液を７０℃で３０分間熱風乾燥して水分含有量が５％になるよう粉末化した。
【００４２】
＜実施例３ないし６＞健康機能飲料の製造
前記実施例１において製造した抽出物及び実施例２において製造した粉末を下記表１の組成比に混合し、総体積が１４ｍｌになるよう水で希釈して健康機能飲料を製造した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
＜実験例１＞細胞増殖の抑制効力の確認
前記実施例で製造した健康機能飲料の癌細胞株の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の抑制効力は、ＭＴＴ ａｓｓａｙを利用して測定した。ヒトの膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＰＡＮＣ１細胞、ヒトの肝臓癌細胞株（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＨｅｐＧ２細胞、そしてヒトの前立腺癌細胞株（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＰＣ−３細胞を９６ウェルマイクロプレート（ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件を保ちながら２４時間培養した。Ｗｅｌｌに細胞が８０％成長すれば、前記実施例３ないし６で製造された健康機能飲料を０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理して２４時間培養した。
【００４５】
細胞成長の抑制効力を測定するために、５ｍｇ／ｍｌ ３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ；ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）溶液を各ｗｅｌｌに２０μｌずつ添加し、３７℃で４時間培養した。その後、マイクロプレートの培地を全部除去し、ｗｅｌｌごとに２００μｌのｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）溶液を添加した。ＭＴＴ溶液により形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）とＤＭＳＯ溶液の発色反応は５４０ｎｍで吸光度を測定した。その結果は下記の表２及び図２の通りである。
【００４６】
【表２】
【００４７】
前記表２は実施例３ないし６の健康機能飲料に処理しない培地で２４時間培養した細胞の生存率（１００％）を基準にして、実施例の健康機能飲料で２４時間処理した細胞の生存率（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を比較した結果である。前記表２によれば、実施例３ないし６の健康機能飲料の全てがＰＡＮＣ１細胞の増殖を抑制するものと示された。ＰＣ−３細胞の場合には、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した場合は、実施例５及び６の機能性健康飲料試料で処理した場合のみ細胞生存率が減少し、ＨｅｐＧ２細胞の場合は１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に処理した場合にのみ細胞生存率が減少した。
【００４８】
図２の結果は、前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理する前の細胞生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を基準（１００％）にして、前記実施例の健康機能飲料で処理しない状態で２４時間培養した細胞（ｎｏｎ ｔｒｅａｔｅｄ）と、前記実施例の健康機能飲料で処理した細胞の生存率（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を百分率に換算して比較した結果である。図２に示すように、実施例の試料で処理しない場合ＰＡＮＣ１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、そしてＰＣ−３細胞の生存率は、各々１４０．５％、１１６．６％、及び１４８．４％であって、処理する前よりも細胞増殖が増加した。ＰＡＮＣ１細胞の場合、本発明の組成物を含む実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合の細胞生存率は、試料を処理する前よりも減少し、試料の濃度が増加するほど増殖がさらに抑制される濃度依存的な傾向を示した。ＰＣ−３細胞及びＨｅｐＧ２細胞の場合、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理した場合に細胞生存率が減少せず、１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した場合のみ細胞生存率が減少した。
【００４９】
したがって、膵臓癌細胞株は、前記実施例３ないし６の健康機能飲料を０．０１ｍｇ／ｍｌに希釈したもので処理してもその増殖が抑制されるとみられるが、前立腺癌及び肝臓癌細胞株の場合、実施例３ないし６の健康機能飲料を０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して処理した場合は細胞増殖の抑制効力が現れないことが分かる。
【００５０】
＜実験例２＞細胞の形態学的観察
細胞の形態学的観察を介して実施例３ないし６の健康機能飲料の細胞成長の抑制効果を観察した。ＰＡＮＣ１細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度に１００ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに分注して、３７℃、５％ＣＯ２条件を保ちながら２４時間培養した。Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに細胞が８０％成長すれば前記実施例３ないし６において製造した健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理して２４時間培養した。実施例３ないし６の健康機能飲料で処理された細胞をＰＢＳバッファで２回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）した後、逆相顕微鏡（ＥＶＯＳ ｄｉｇｉｔａｌ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を利用して２つの倍率で細胞の形態を観察した。その結果を図３に示した。
【００５１】
図３に示すように、細胞の周囲が揺れて細胞数が減少した部分を矢印に表示した。「処理前」は試料を処理して２４時間培養した前の状態を意味し、「無処理」は前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理せず２４時間培養した状態を意味する。同図に示すように、実施例３ないし６の健康機能飲料で処理しない細胞の場合は細胞の成長がさらに増加し、癌細胞が高密度にかつ正常に成長することが観察された。これに対して、前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合は、細胞周囲が揺れて細胞が死んでしまうことが観察された。実施例６の健康機能飲料で処理した場合は、実施例３ないし５で処理した場合よりも細胞数が大きく減少したことからみて、本発明の組成物の濃度が増加するほど癌細胞成長の抑制効果が優れていることが分かる。
【００５２】
＜実験例３＞発癌抑制因子の発現に及ぼす影響確認
ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）方法を利用して実施例３ないし６における本発明の薬学的組成物を含む健康機能飲料がヒトの癌細胞株においてｐ５３により調節される下位遺伝子であるｐ２１及びＢａｘの発現に及ぼす影響を観察した。ＰＡＮＣ１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、そしてＰＣ−３細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度に１００ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに分注して、３７℃、５％ＣＯ２条件を保ちながら２４時間培養した。Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに細胞が８０％成長すれば、前記実施例３ないし６で製造された健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理して２４時間培養した後、細胞を回収した。
【００５３】
回収された細胞はＰＢＳバッファで３回洗浄し、４０μｌないし８０μｌのライシスバッファ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を添加した後、軽くピペット（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）した。氷で３０分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して３０秒間超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）の過程を実施した後、１３、０００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離して細胞質の分画を分離した。
【００５４】
分離された細胞質の分画はＢＣＡ試薬を利用して蛋白質の量を定量し、各々の分画３５μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌで電気泳動して蛋白質を分離した。その後、ｓｅｍｉ−ｄｒｙ機械を利用して分離された蛋白質は、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＮＣ） ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移し、ＮＣメンブレンはブロックバッファ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で４℃にて夜通しブロック（ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）してから、１Ｘ ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。ｐ２１及びＢａｘの１次抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１Ｘ ＴＢＳ−Ｔバッファにて１：１２００に希釈した後、４℃で夜通しして反応させた。
【００５５】
１次抗体の反応が終了したＮＣメンブレンを１Ｘ ＴＢＳ−Ｔバッファにて４℃で１０分ずつ３回洗浄した後、２次抗体の反応を４℃で２時間進行させた。ｐ２１に対する２次抗体は、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを使用した。Ｂａｘに対する２次抗体は、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧを使用した。反応が終了すれば、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔと反応させた後、Ｘ−ｒａｙフィルムに現像して蛋白質バンドを確認した。その結果は、実施例３ないし６の健康機能飲料で処理しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるｐ２１及びＢａｘ蛋白質の発現を基準（１．０）にして、図４及び図５に示した。すなわち、図４および図５の縦軸は、各実施例の健康機能飲料で処理した場合のｐ２１またはＢａｘ蛋白質の発現量を、対照群におけるｐ２１またはＢａｘ蛋白質の発現量に対する比（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｏｌｄ）として表している。
【００５６】
図４に示すように、ＰＡＮＣ１細胞、ＰＣ−３細胞及びＨｅｐＧ２細胞の全てにおいて、前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合は処理しない細胞に比べてｐ２１蛋白質の発現が増加した。ＰＡＮＣ１細胞は、実施例４の試料で処理した場合に処理しない場合よりも約２．４倍増加して最も増加量が多く、実施例５及び６において処理した場合も約２倍程度増加した（図４Ａ）。ＨｅｐＧ２細胞においてもｐ２１の発現は増加したが（図４Ｃ）、ＰＣ−３細胞においてはＰＡＮＣ１及びＨｅｐＧ２の分だけｐ２１の発現が増加しなかった（図４Ｂ）。
【００５７】
図５に示すように、実施例３ないし６の試料で処理してもＢａｘ蛋白質の発現は大きく増加しなかった。ただし、ＰＣ−３細胞及びＨｅｐＧ２細胞は、実施例５の試料で処理した場合Ｂａｘ蛋白質の発現が増加した。
前記の結果から、本発明の組成物による癌細胞の成長抑制は、Ｂａｘ蛋白質の発現増加によるものよりは、ｐ２１蛋白質の発現増加による細胞周期の停止による影響をさらに大きく受けるということが分かる。
【００５８】
＜実施例４＞ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて餌摂取量と飲用水摂取量の測定
ヌードマウスにヒトの膵臓癌細胞であるＰＡＮＣ１を５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌの濃度で左右の前肢の皮下脂肪層に接種した。ヒトの肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２は７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌの濃度で背中の皮下脂肪層に接種し、ヒトの前立腺癌細胞株ＰＣ−３は５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌの濃度で左右の後肢の皮下脂肪層に接種した（図６）。１つの対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と４つの実験群とに分離して２週間実験を進行した。対照群は滅菌蒸溜水を飲用水として供給し、実験群は実施例３ないし６の健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう滅菌蒸溜水に希釈して飲用水として供給した。薬物を供給している間に、マウス１個体が１日当たりに摂取する餌の摂取量（ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ）及び飲用水の摂取量（ｗａｔｅｒ ｉｎｔａｋｅ）を記録し、その結果を図７及び図８に示した。
【００５９】
図７及び図８に示すように、実験開始後の６日目までは対照群と実験群の全てが餌の摂取量と飲用水の摂取量との差はなく、一定であった。しかし、その後に時間の経過につれて対照群の餌の摂取量と飲用水の摂取量は持続的に減少したが、実施例３ないし６の健康機能飲料を摂取した実験群は、減少した後再び増加するか、あるいは減少せずに実験期間の間に一定の摂取量を維持した。
【００６０】
＜実験例５＞腫瘍成長の抑制に及ぼす影響
前記実験例５に示すような方法で癌細胞を移植したヌードマウスに実施例３ないし６の健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度で２週間飲用水として持続的に供給した後、動物を犠牲にした。犠牲にした当時の対照群及び実験群の姿を写真で撮り、腫瘍は矢印で表示した（図９）。左右の前肢にはヒトの膵臓癌細胞株を接種し、左右の後肢にはヒトの前立腺癌細胞株を接種した。図９Ａは滅菌蒸溜水を供給した対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）であり、図９Ｆは対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、図９Ｇは実施例５の健康機能飲料を摂取した個体、図９Ｈは実施例６の健康機能飲料を摂取した個体を拡大したものである。
【００６１】
本発明の組成物が腫瘍成長の抑制に及ぼす影響を観察するため、前記動物の犠牲時に取り出した腫瘍組織の重さ（ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ）を測定した。その結果を、図１０ないし図１２に示した。
癌細胞を移植してから１５日の経過後、腫瘍が形成された個体の割合を観察した結果、癌細胞を注射した全体個体のうちから７５％は膵臓癌が発生し、９６．７％は前立腺癌が発生した。しかし、肝臓癌は全体の個体のうちの０．１％のみが発生し、これは肝臓癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞の低い生存率に起因したものと考えられる。
【００６２】
図１０及び図１１に示すように、実施例３ないし６の健康機能性飲料を摂取した場合、対照群よりも膵臓癌の平均腫瘍の重さが減少し、実施例６の健康機能性飲料を摂取した場合、膵臓癌腫瘍の重さが最も減少した。すなわち、本発明の組成物の含有量が高まるほど坑癌効果が増加した。
図１０及び図１２に示すように、実施例３、４及び６の健康機能飲料を摂取した場合、対照群よりも前立腺癌腫瘍の重さが減少したが、実施例５の健康機能飲料を摂取した実験群の場合、対照群よりも腫瘍重さが増加したことが観察できた。
したがって、本発明の薬学的組成物は、同じ濃度において前立腺癌よりも膵臓癌にその効果が大きいと期待される。
【００６３】
＜実験例６＞ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現に及ぼす影響
前記実験例５のような方法で癌細胞を移植したヌードマウスに２週間実施例３ないし６の健康機能飲料を含む飲用水を供給した後、ヌードマウスから摘出した膵臓癌組織からｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現の変化をウェスタンブロット方法を介して確認した。その結果は図１３に示している。
【００６４】
図１３は、実施例３ないし６の試料を摂取しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）において、ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現を基準にして（１．０）、実施例３ないし６の試料を処理した場合の増加率（ｉｎｃｒｅａｓｅ ｆｏｌｄ）を換算して比較したものである。同図に示すように、ウェスタンブロットの結果、実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合、ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現が対照群に比べて高いことが分かる。特に、実施例５及び６の健康機能飲料を摂取した実験群の場合、ｐ５３蛋白質の発現が対照群に比べて２．０倍、３．０倍増加した。ｐ５３の下位遺伝子であるｐ２１の場合、すべての実験群において対照群に比べて６倍以上の蛋白質の発現が増加した。
【００６５】
したがって、本発明の薬学的組成物が発癌抑制因子の蛋白質の発現を増加させることによって癌細胞の成長を抑制させることが分かる。
前述したように本発明の薬学的組成物は、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の増殖を抑制する効果があり、膵臓癌、肝臓癌、及び前立腺癌などに効果があることが分かる。特に、膵臓癌の場合は低い濃度でもその効果が優れた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療及び予防用薬学的組成物、これを含む癌改善並びに予防用健康機能食品に関し、具体的には、紅景天及び白花蛇舌草を含んで発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の増殖を抑制し、不作用が少ない癌治療及び予防用薬学的組成物、これを有効成分として含む癌改善並びに予防用健康機能食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は生体から栄養の供給を受けるが、生体とは独立的に過剰増殖し、生体を破壊する生体組織において発生した異常な組織の塊である。身体すべての臓器は数多い細胞から構成されているため、身体の正常細胞が異常細胞になりつつ、無秩序に分裂増殖して多くの細胞を生じさせることから癌が発生する。癌の発病には遺伝的な素因も深く関与しているが、環境的な要因も大きい影響を及ぼし、先進国であるほど癌の発病が増加する傾向がある。癌の発病原因として、農薬、殺虫剤などの使用量、及び食品内残留量の増加、食品保存剤、着色剤、防腐剤などが添加した加工食品の消費増加、水質、土壌、大気汚染の増加、現代人のストレス増加、活動量の減少、そして豊かな食生活に伴う肥満などが報告されている。最近は、正常細胞の信号伝達体系に異常が発生するか、又は癌を引き起こし得る癌遺伝子が活動する場合、ジェムザールは癌抑制遺伝子に問題が発生したときに癌が生じると知られている。
【０００３】
癌を治療する方法として外科的な治療、化学的な治療、及び放射線治療があるが、外科的な治療は癌の初期状態の除去には効果的であるが、場合に応じては臓器を除去しなければならないなどの不作用と、転移を防止することができないとの問題があり、放射線治療の場合においても特定部位の癌治療には治療効果が高い長所があるものの、放射線の照射による新たな発癌危険性と転移を防止することができないという問題、及び治療時に患者の苦痛が伴うという問題がある。化学的な治療法の場合、通常、抗ガン剤と呼ばれる薬の形態が一般的であるが、抗ガン剤は、癌細胞にのみ作用するのでなく、患者の正常細胞にも毒性を発揮してしまうことが不作用として知られている。したがって、抗ガン剤の開発は、癌組織への高い選択性と共にその毒性を最小化する方向に向かって新薬の開発が行われている。
【０００４】
天然材料成分は毒性及び不作用が少ないと知られており、最近には天然材料から坑癌成分を抽出したり加工し、各種の医薬剤又はドリンク剤に開発しようという研究が盛んに行われている。しかしながら、一部の生薬剤を含有しているドリンク剤は、癌細胞のみならず正常細胞にも作用することで髪の毛が抜けてしまうなどの毒性や不作用があり得、高価の生薬剤を使用することによって市販値段が高過ぎて広く普及できないなどの問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、紅景天及び白花蛇舌草を含んで正常細胞には不作用がなく、癌細胞にのみ作用し、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の活性を抑制させる癌治療及び予防用組成物、これを含む癌改善並びに予防用健康機能食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述の目的を達成するために、紅景天及び白花蛇舌草を含む癌治療及び予防用薬学的組成物を提供する。
前記紅景天は、総組成物１００重量部に対して１０ないし７０重量部含まれることができる。
前記白花蛇舌草は、総組成物１００重量部に対して２０ないし８０重量部含まれることができる。
前記癌治療及び予防用薬学的組成物は、肉従蓉をさらに含むことができる。
前記肉従蓉は、総組成物１００重量部に対して１０ないし４０重量部含まれることができる。
【０００７】
前記癌治療及び予防用薬学的組成物は、蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物をさらに含むことができる。
前記蛇床子、兎糸子及び遠志は、総組成物１００重量部に対して５ないし１５重量部含まれることができる。
前記癌治療及び予防用薬学的組成物は、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることができる。
前記癌は、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌及び前立腺癌であることができる。
【０００８】
本発明の他の目的を達成するために、前記癌治療及び予防用薬学的組成物を有効成分として含む癌改善及び予防用健康機能食品を提供する。
前記健康機能食品は、健康機能飲料であることができる。
また、前記健康機能食品は、天然茶であることができる。
前記癌治療及び予防用薬学的組成物の抽出物は、健康機能食品又は健康機能飲料の総１００重量部に対して０．００１ないし３０重量部含まれることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組成物は、癌細胞の増殖のみを抑制するだけであって、正常細胞には影響を及ばず、天産物からなって長期間服用したり多量服用しても従来の抗ガン剤よりも不作用が少ない。健康機能食品の形態として製造可能であるため、茶などの飲料に製造すれば美感が改善されて飲用が容易かつ簡便であることから、抗ガン剤を手軽に服用できるという長所がある。
【００１０】
また、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の活性を抑制するため、癌治療及び予防に効果的である。特に、膵臓癌の場合、治療のために手術、放射線及び化学療法などが施行されているが、いずれのものも効果的な治療法が未だ開発されていないところ、本発明の組成物は、膵臓癌治療及び補助治療剤としてその使用が期待されている。
癌治療及び予防にのみ効果的でなく、肝機能が強化されるなどの付帯効果を獲得することができ、既存のドリンク類に含まれている生薬剤よりもその値段が低いことから商業化にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明におけるｐ５３の活性による細胞死滅及び細胞周期の調節メカニズムを示した模式図である。
【図２】本発明の実施例３及び６の試料を濃度を別にして、ヒトの膵臓癌細胞株、肝臓癌細胞株及び前立腺癌細胞株に処理し、２４時間培養した後に処理前の細胞生存率（１００％）を基準にして細胞生存率を百分率で示したグラフである。
【図３】本発明の実施例３及び6の試料をＰＡＮＣ１細胞に処理した後２４時間培養して細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図４】ヒトの癌細胞株においてｐ２１蛋白質の発現程度を実施例の試料で処理したものと処理しないものとを比較して示した図である。
【図５】ヒトの癌細胞株においてＢａｘ蛋白質の発現程度を実施例の試料で処理したものと処理しないものとを比較して示した図である。
【図６】ヌードマウスにヒトの癌細胞株を移植した図である。
【図７】癌細胞移植のマウスモデルにおいて、本発明の実施例における癌治療及び予防用薬学的組成物を含む健康機能飲料が餌の摂取量に及ぼす影響を示す図である。
【図８】癌細胞移植のマウスモデルにおいて、実施例の本発明における癌治療及び予防用薬学的組成物を含む健康機能飲料が飲用水の摂取量に及ぼす影響を示す図である。
【図９】癌細胞移植のヌードマウスモデルに２週間にわたって本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物を含む健康機能飲料を飲用させた後、犠牲にした当時の姿を示す図である。
【図１０】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから腫瘍を摘出し、その重さを測定した図である。
【図１１】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから膵臓癌組織を摘出し、その重さを測定した図である。
【図１２】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから前立腺癌組織を摘出し、その重さを測定した図である。
【図１３】癌細胞を移植したヌードマウスモデルから膵臓癌組織を摘出し、ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現に及ぼす影響を観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、紅景天及び白花蛇舌草を含む。
前記本発明における癌治療及び予防用薬学的組成物は、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の増殖を抑制するため、癌治療及び予防に効果がある。天産物からなって癌細胞の活性を抑制するだけであって、正常細胞にはその影響を及ばないことから不作用が少ない。
【００１４】
前記紅景天（ｒｈｏｄｉｏｌａ ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）は海抜１８００ｍないし２３００ｍの高山地帯で自生する多年生草本植物であって、紅景天の生理活性物質は発癌抑制遺伝子であるｐ５３、ｐ２１及びＢａｘの発現を増加させて癌細胞の増殖を抑制する。
【００１５】
特定遺伝子の活性化及び抑制は、腫瘍の発生及び発達の原因となるが、発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）は癌成長を促進する一方、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）は癌成長を抑制する。代表的な発癌抑制遺伝子として、ｐ５３、ｐ２１及びＢａｘがある。
【００１６】
図１は、ｐ５３の活性化による細胞死滅及び細胞周期の調節メカニズムを示す模式図である。ｐ５３は最も知られている腫瘍抑制遺伝子であるが、細胞周期を調節して細胞死滅を誘導することによって、細胞が悪性形質に転換されないよう保護する役割を果たし、ｐ５３遺伝子の変異及び欠損は、ヒトの癌腫において最もありふれた遺伝子異常の１つである。細胞がＤＮＡの損傷を受けると、ｐ５３の発現は急激に増加し、その結果としてｐ５３の下位遺伝子のうちの１つであるｐ２１の発現が誘導されることによって、細胞周期はＧ１時期に停止する。ｐ２１と共にｐ５３の調節を受ける下位遺伝子としては、細胞死滅を誘導するＣＤ９５／ＦＡＳ、Ｂａｘ、Ｎｏｘａ、Ｃａｐａｓｅ−１及びＣａｐａｓｅ−６などがある。また、ｐ５３は、ＤＮＡの回復（ＤＮＡ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ）に関与するＧＡＤＤ４５を活性化させてＤＮＡの損傷回復を促進することにより遺伝子の安定性を維持させる。
【００１７】
ｐ２１はｐ５３の下位遺伝子のうちの１つであって、細胞周期の進行をＧ１期で抑制する。細胞周期は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期に分れて進行されるが、細胞がＧ１期で停止するか、あるいはＧ１期からＳ期に移行して細胞増殖するかは網膜母細胞種（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）（Ｒｂ）のリン酸化と密接な関連がある。非リン酸化状態のｐＲｂは、転写調節因子であるＥ２Ｆと結合してＥ２Ｆの機能を抑制することによって、細胞がＳ期に進入するために必要な遺伝子の発現を抑制し、その結果、細胞周期はＧ１期に停止するようになる。
【００１８】
しかし、ｃｙｃｌｉｎとｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）の複合体によってｐＲｂがリン酸化されれば、Ｅ２Ｆとはこれ以上結合されず、これによって１期になされたＥ２Ｆの活性化に応じて、細胞はＳ期に必要な種々の遺伝子の転写が活性化されることで細胞周期が進行される。この過程において、ｐ２１は、ｃｙｃｌｉｎ−ＣＤＫの複合体の活性を抑制することによりｐＲｂのリン酸化を抑制するために、Ｅ２Ｆは、不活性化状態で続いてｐＲｂに結合されていることから細胞周期はＧ１期に停止する。したがって、発癌遺伝子の増殖が抑制されることができる。
【００１９】
Ｂａｘ蛋白質は細胞死滅を司る最も核心的な因子であって、細胞質に活性しているｐ５３の発現蛋白質が存在すればＢａｘ蛋白質の活性が増加する。Ｂａｘ蛋白質の活性増加は、細胞内部に存在するミトコンドリアの細胞膜に孔を形成する。ミトコンドリアは電子伝達系を介して細胞の生存と活動に必要なエネルギーであるＡＴＰを生産する箇所であるため、ミトコンドリア膜に形成された孔によって細胞が生存し難くなる。したがって、腫瘍細胞にＢａｘ蛋白質の発現が増加すれば、細胞死滅を促進することにより腫瘍細胞が除去されるようになる。
【００２０】
前記紅景天は全草を使用することができ、葉、葉脈、又は根などの特定部位を使用することもできる。
前記紅景天は抽出して抽出物の形態で添加することができ、抽出物を凍結乾燥又は熱風乾燥して水分含有量５％ないし２０％未満に粉末化させて添加することもできる。また、抽出せずに紅景天そのものを添加したり凍結乾燥又は熱風乾燥など、当業界に公知の粉末化方法を使用して紅景天を粉末化し、本発明の組成物に添加することもできる。前記抽出は、当業界において公知の方法が制限なく使用され得、好ましくは、有機溶媒抽出法を使用することができる。前記有機溶媒としては、飲用時の人体に無害な水、エタノール、又はこれらの混合物を使用することが好ましい。エタノールは、１０％ないし７０％濃度のエタノールを使用することができ、２５℃ないし１００℃の温度で、５時間ないし２０時間抽出することが好ましい。
【００２１】
前記紅景天は、総組成物１００重量部に対して１０重量部ないし７０重量部含まれ得る。１０重量部未満に添加されれば、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌予防及び治療に効果的であるとの本発明の目的を達成することが難しく、７０重量部を超過して添加すれば、健康機能食品などに添加されたときに紅景天特有の味と香が濃過ぎて美感を害する恐れがあり、使用量対比の効果の増加程度が微小である。
【００２２】
前記白花蛇舌草は、発癌遺伝子の成長を抑制する効果を有し、前記紅景天と同時に使用するとき癌治療及び予防効果の上昇作用がある。また、長時期服用したり大量服用したりする時にも不作用がほとんどないという長所がある。
【００２３】
前記白花蛇舌草は抽出物の形態で添加されるか、抽出物を粉末化して添加することができ、抽出せずに白花蛇舌草そのものを添加したり、当業界に知られた通常の方法で粉末化して添加したりすることもできる。抽出する場合、当業界に公知の抽出法が制限なく使用され得、好ましくは、水、１０％ないし７０％濃度のエタノール、又は水とエタノールとの混合物を使用した溶媒抽出法を利用することができる。
【００２４】
前記白花蛇舌草は、総組成物１００重量部に対して２０重量部ないし８０重量部含まれ得る。２０重量部未満に添加されれば、癌治療及び予防の効果が微小であり、８０重量部を超過して添加すれば、白花蛇舌草含有量の増加に比べて坑癌効果の増加が微小であり、弱い下痢を誘発し得る。
【００２５】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は肉従蓉をさらに含むことができる。
前記肉従蓉（ニクジュヨウ）は、前記紅景天及び白花蛇舌草と併せて使用するとき癌細胞の成長を抑制する効果を上昇させる作用を行う。
【００２６】
前記肉従蓉は抽出物の形態で添加されるか、抽出物を粉末化して添加することができ、抽出せずに肉従蓉そのものを添加したり、当業界に知られた通常の方法で肉従蓉を粉末化して添加したりすることもできる。抽出する場合、当業界に公知の抽出法が制限なく使用され得、好ましくは、水、１０％ないし７０％濃度のエタノール、又は前記成分などの混合物を使用した有機溶媒抽出法を利用することができる。
【００２７】
前記肉従蓉は、総組成物１００重量部に対して１０重量部ないし４０重量部含まれ得る。１０重量部未満に含まれれば、癌細胞の成長を抑制する効果を上昇させる程度が微小であり、４０重量部を超過して添加すれば、特異な臭いにより本発明の組成物を健康機能食品などに添加するとき好み程度を減少させ得る。
【００２８】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物をさらに含むことができる。前記蛇床子、兎糸子又は遠志などの物質をさらに含むことによって、癌治療及び予防効果をより一層上昇させることができる。
【００２９】
前記蛇床子は、腎臓を暖かくして陽気を上げ、抗炎症の効果もあって皮膚湿疹及びアレルギー性皮膚炎の治療にも活用される。本発明において蛇床子は、血管新生の抑制作用を行っていると考えられる。癌の転移は血管の生成を介して起こるため、血管新生の抑制作用に優れた蛇床子を抗ガン剤として使用する場合に癌の転移を防止し、癌の治療にも効果を示すことができる。
【００３０】
前記兎糸子は、腫物、滋養強壮などに効果があるものとして知られており、兎糸子により抗体が早期に形成され得ることで坑癌効果を上昇させることができる。
前記遠志は、遠志科に属する学名 Polygala tenuifolia Willd.の根として心気の安定に効果があり、発癌抑制遺伝子の発現増加の効果を上昇させる作用を行うものと考えられる。
【００３１】
前記蛇床子、兎糸子、及び遠志は、抽出物の形態で本発明の組成物に含まれるか、又は抽出物を凍結乾燥又は熱風乾燥し粉末化して添加することもでき、抽出せずに蛇床子、兎糸子及び遠志そのものを乾燥して粉末化した後添加することもできる。
前記蛇床子、兎糸子及び遠志は、総組成物１００重量部に対して５重量部ないし１５重量部含まれ得る。５重量部未満に含まれれば、癌治療及び予防効果を上昇させようという添加目的を達成し難く、１５重量部を超過して添加すれば、添加量に比べて坑癌効果が向上する程度が微小である。
【００３２】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、必要に応じて、甘草、蜂蜜、トウキ、五味子、高麗人参、紅蔘、ナツメ、ショウガなどの成分を選択的にさらに含み得る。
前記成分は、他の薬の作用を調和させる目的としても使用され、美感を改善させるためにも使用され得る。
【００３３】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌及び肝臓癌に効果的である。特に、膵臓癌、前立腺癌及び肝臓癌に効果的である。
膵臓癌の場合、低い濃度でも坑癌効果を示すために、化学的治療及び放射線治療など多様な治療法が施行されているものの効果的な治療法が開発されていない膵臓癌の治療剤及び補助治療剤には有用に利用され得る。
【００３４】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、前述した生薬材料を個別に抽出して抽出物や粉末状に添加する方法以外に、前記生薬剤を洗浄した後に細切して混合し、混合された生薬剤を抽出して抽出物形態に製造できる。抽出法は、当業界に公知の方法に制限されず使用され得、好ましくは、水、１０％ないし７０％のエタノール、又はこれらの混合物を溶媒として使用した溶媒抽出法を利用することができる。
【００３５】
また、前記抽出物を濃縮して凍結乾燥又は熱風乾燥し、粉末状に製造することもできる。
前記抽出及び粉末化過程を具体的に詳説すれば次の通りである。
生薬剤をきれいに洗浄し、不純物や汚染物を除去するために３０％ないし７０％のエタノール、好ましくは、５０％のエタノールに６０℃以下の温度で３０分ないし４時間程度浸漬させた後、８０℃ないし１００℃で１時間ないし１０時間抽出する。抽出後に５０００ｒｐｍないし１００００ｒｐｍで５分ないし３０分間遠心分離して上澄み液を濾過した後、３０℃ないし７０℃で７５゜Ｂｒｉｘになるよう減圧濃縮する。前記濃縮液を、水分含有量が１０％以下になるよう熱風乾燥するか、又は−４０℃以下で凍結乾燥して粉末化する。
【００３６】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、薬剤学的に許される担体と混合され得る。薬学的組成物に通常用いられる賦形剤、崩解剤、甘味剤、滑澤剤、香味剤を加えて含むことができ、当業界に公知の通常な方法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、液剤などで剤形化できる。
【００３７】
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、目的とする方法に応じて経口又は非経口的に投与され得、有効成分として体重１ｋｇ当り０．０１ｇないし１０ｇの量を１回ないし数回にわたって投与できる。投与量又は服用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度に応じて変化され得る。
本発明の癌改善及び予防用健康機能食品は、前記癌治療及び予防用薬学的組成物を有効成分として含むことができる。前記健康機能食品は、健康機能飲料の形態に製造できる。前記健康機能飲料の一例として、前記癌治療及び予防用薬学的組成物を有効成分として含む天然茶を製造できる。
【００３８】
本発明の薬学的組成物を有効成分として含有する健康機能食品又は健康機能飲料は、癌の改善及び予防に効果がありつつ、不作用がないだけでなく、特に飲料の場合に容易かつ簡単に摂取することができ、さらに値段も低価である。
本発明の癌治療及び予防用薬学的組成物は、健康機能食品又は健康機能飲料の総１００重量部に対して０．００１重量部ないし３０重量部添加できる。０．００１重量部未満に添加されれば、癌改善及び予防効果が微小であり、３０重量部を超過して添加すれば、前記組成物特有の香り及び味により食品の味を妨げ、飲用や摂取が容易でない恐れがある。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例及び比較例を介して本発明を詳説する。これは本発明の説明のためのものであって、これにより本発明の範囲が制限されることはない。
【００４０】
＜実施例１＞癌治療及び予防に効果的な組成物を抽出物に製造
紅景天３０ｇ、白花蛇舌草２０ｇ、肉従蓉３０ｇ及び遠志１０ｇを水で洗浄した後、乾燥させて細切し、５０℃で５０％エタノールに１時間程度浸漬させた後、５０％エタノールで５０℃にて１０時間抽出した。前記抽出物に蜂蜜１０ｇを添加して癌治療及び予防に効果的な組成物を抽出物の形態に製造した。前記抽出物の水分含有量は２５％である。
【００４１】
＜実施例２＞癌治療及び予防に効果的な組成物を粉末に製造
前記実施例１において製造した抽出物を７５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み液を用いて濾過し、６０℃で７０気圧に減圧濃縮した。前記濃縮液を７０℃で３０分間熱風乾燥して水分含有量が５％になるよう粉末化した。
【００４２】
＜実施例３ないし６＞健康機能飲料の製造
前記実施例１において製造した抽出物及び実施例２において製造した粉末を下記表１の組成比に混合し、総体積が１４ｍｌになるよう水で希釈して健康機能飲料を製造した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
＜実験例１＞細胞増殖の抑制効力の確認
前記実施例で製造した健康機能飲料の癌細胞株の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の抑制効力は、ＭＴＴ ａｓｓａｙを利用して測定した。ヒトの膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＰＡＮＣ１細胞、ヒトの肝臓癌細胞株（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＨｅｐＧ２細胞、そしてヒトの前立腺癌細胞株（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＰＣ−３細胞を９６ウェルマイクロプレート（ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件を保ちながら２４時間培養した。Ｗｅｌｌに細胞が８０％成長すれば、前記実施例３ないし６で製造された健康機能飲料を０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理して２４時間培養した。
【００４５】
細胞成長の抑制効力を測定するために、５ｍｇ／ｍｌ ３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ；ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）溶液を各ｗｅｌｌに２０μｌずつ添加し、３７℃で４時間培養した。その後、マイクロプレートの培地を全部除去し、ｗｅｌｌごとに２００μｌのｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）溶液を添加した。ＭＴＴ溶液により形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）とＤＭＳＯ溶液の発色反応は５４０ｎｍで吸光度を測定した。その結果は下記の表２及び図２の通りである。
【００４６】
【表２】
【００４７】
前記表２は実施例３ないし６の健康機能飲料に処理しない培地で２４時間培養した細胞の生存率（１００％）を基準にして、実施例の健康機能飲料で２４時間処理した細胞の生存率（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を比較した結果である。前記表２によれば、実施例３ないし６の健康機能飲料の全てがＰＡＮＣ１細胞の増殖を抑制するものと示された。ＰＣ−３細胞の場合には、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した場合は、実施例５及び６の機能性健康飲料試料で処理した場合のみ細胞生存率が減少し、ＨｅｐＧ２細胞の場合は１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に処理した場合にのみ細胞生存率が減少した。
【００４８】
図２の結果は、前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理する前の細胞生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を基準（１００％）にして、前記実施例の健康機能飲料で処理しない状態で２４時間培養した細胞（ｎｏｎ ｔｒｅａｔｅｄ）と、前記実施例の健康機能飲料で処理した細胞の生存率（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を百分率に換算して比較した結果である。図２に示すように、実施例の試料で処理しない場合ＰＡＮＣ１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、そしてＰＣ−３細胞の生存率は、各々１４０．５％、１１６．６％、及び１４８．４％であって、処理する前よりも細胞増殖が増加した。ＰＡＮＣ１細胞の場合、本発明の組成物を含む実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合の細胞生存率は、試料を処理する前よりも減少し、試料の濃度が増加するほど増殖がさらに抑制される濃度依存的な傾向を示した。ＰＣ−３細胞及びＨｅｐＧ２細胞の場合、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理した場合に細胞生存率が減少せず、１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した場合のみ細胞生存率が減少した。
【００４９】
したがって、膵臓癌細胞株は、前記実施例３ないし６の健康機能飲料を０．０１ｍｇ／ｍｌに希釈したもので処理してもその増殖が抑制されるとみられるが、前立腺癌及び肝臓癌細胞株の場合、実施例３ないし６の健康機能飲料を０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して処理した場合は細胞増殖の抑制効力が現れないことが分かる。
【００５０】
＜実験例２＞細胞の形態学的観察
細胞の形態学的観察を介して実施例３ないし６の健康機能飲料の細胞成長の抑制効果を観察した。ＰＡＮＣ１細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度に１００ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに分注して、３７℃、５％ＣＯ２条件を保ちながら２４時間培養した。Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに細胞が８０％成長すれば前記実施例３ないし６において製造した健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理して２４時間培養した。実施例３ないし６の健康機能飲料で処理された細胞をＰＢＳバッファで２回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）した後、逆相顕微鏡（ＥＶＯＳ ｄｉｇｉｔａｌ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を利用して２つの倍率で細胞の形態を観察した。その結果を図３に示した。
【００５１】
図３に示すように、細胞の周囲が揺れて細胞数が減少した部分を矢印に表示した。「処理前」は試料を処理して２４時間培養した前の状態を意味し、「無処理」は前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理せず２４時間培養した状態を意味する。同図に示すように、実施例３ないし６の健康機能飲料で処理しない細胞の場合は細胞の成長がさらに増加し、癌細胞が高密度にかつ正常に成長することが観察された。これに対して、前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合は、細胞周囲が揺れて細胞が死んでしまうことが観察された。実施例６の健康機能飲料で処理した場合は、実施例３ないし５で処理した場合よりも細胞数が大きく減少したことからみて、本発明の組成物の濃度が増加するほど癌細胞成長の抑制効果が優れていることが分かる。
【００５２】
＜実験例３＞発癌抑制因子の発現に及ぼす影響確認
ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）方法を利用して実施例３ないし６における本発明の薬学的組成物を含む健康機能飲料がヒトの癌細胞株においてｐ５３により調節される下位遺伝子であるｐ２１及びＢａｘの発現に及ぼす影響を観察した。ＰＡＮＣ１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、そしてＰＣ−３細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度に１００ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに分注して、３７℃、５％ＣＯ２条件を保ちながら２４時間培養した。Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに細胞が８０％成長すれば、前記実施例３ないし６で製造された健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度に処理して２４時間培養した後、細胞を回収した。
【００５３】
回収された細胞はＰＢＳバッファで３回洗浄し、４０μｌないし８０μｌのライシスバッファ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を添加した後、軽くピペット（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）した。氷で３０分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して３０秒間超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）の過程を実施した後、１３、０００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離して細胞質の分画を分離した。
【００５４】
分離された細胞質の分画はＢＣＡ試薬を利用して蛋白質の量を定量し、各々の分画３５μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌで電気泳動して蛋白質を分離した。その後、ｓｅｍｉ−ｄｒｙ機械を利用して分離された蛋白質は、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＮＣ） ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移し、ＮＣメンブレンはブロックバッファ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で４℃にて夜通しブロック（ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）してから、１Ｘ ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。ｐ２１及びＢａｘの１次抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１Ｘ ＴＢＳ−Ｔバッファにて１：１２００に希釈した後、４℃で夜通しして反応させた。
【００５５】
１次抗体の反応が終了したＮＣメンブレンを１Ｘ ＴＢＳ−Ｔバッファにて４℃で１０分ずつ３回洗浄した後、２次抗体の反応を４℃で２時間進行させた。ｐ２１に対する２次抗体は、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを使用した。Ｂａｘに対する２次抗体は、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧを使用した。反応が終了すれば、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔと反応させた後、Ｘ−ｒａｙフィルムに現像して蛋白質バンドを確認した。その結果は、実施例３ないし６の健康機能飲料で処理しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるｐ２１及びＢａｘ蛋白質の発現を基準（１．０）にして、図４及び図５に示した。すなわち、図４および図５の縦軸は、各実施例の健康機能飲料で処理した場合のｐ２１またはＢａｘ蛋白質の発現量を、対照群におけるｐ２１またはＢａｘ蛋白質の発現量に対する比（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｏｌｄ）として表している。
【００５６】
図４に示すように、ＰＡＮＣ１細胞、ＰＣ−３細胞及びＨｅｐＧ２細胞の全てにおいて、前記実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合は処理しない細胞に比べてｐ２１蛋白質の発現が増加した。ＰＡＮＣ１細胞は、実施例４の試料で処理した場合に処理しない場合よりも約２．４倍増加して最も増加量が多く、実施例５及び６において処理した場合も約２倍程度増加した（図４Ａ）。ＨｅｐＧ２細胞においてもｐ２１の発現は増加したが（図４Ｃ）、ＰＣ−３細胞においてはＰＡＮＣ１及びＨｅｐＧ２の分だけｐ２１の発現が増加しなかった（図４Ｂ）。
【００５７】
図５に示すように、実施例３ないし６の試料で処理してもＢａｘ蛋白質の発現は大きく増加しなかった。ただし、ＰＣ−３細胞及びＨｅｐＧ２細胞は、実施例５の試料で処理した場合Ｂａｘ蛋白質の発現が増加した。
前記の結果から、本発明の組成物による癌細胞の成長抑制は、Ｂａｘ蛋白質の発現増加によるものよりは、ｐ２１蛋白質の発現増加による細胞周期の停止による影響をさらに大きく受けるということが分かる。
【００５８】
＜実施例４＞ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて餌摂取量と飲用水摂取量の測定
ヌードマウスにヒトの膵臓癌細胞であるＰＡＮＣ１を５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌの濃度で左右の前肢の皮下脂肪層に接種した。ヒトの肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２は７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌの濃度で背中の皮下脂肪層に接種し、ヒトの前立腺癌細胞株ＰＣ−３は５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌの濃度で左右の後肢の皮下脂肪層に接種した（図６）。１つの対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と４つの実験群とに分離して２週間実験を進行した。対照群は滅菌蒸溜水を飲用水として供給し、実験群は実施例３ないし６の健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう滅菌蒸溜水に希釈して飲用水として供給した。薬物を供給している間に、マウス１個体が１日当たりに摂取する餌の摂取量（ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ）及び飲用水の摂取量（ｗａｔｅｒ ｉｎｔａｋｅ）を記録し、その結果を図７及び図８に示した。
【００５９】
図７及び図８に示すように、実験開始後の６日目までは対照群と実験群の全てが餌の摂取量と飲用水の摂取量との差はなく、一定であった。しかし、その後に時間の経過につれて対照群の餌の摂取量と飲用水の摂取量は持続的に減少したが、実施例３ないし６の健康機能飲料を摂取した実験群は、減少した後再び増加するか、あるいは減少せずに実験期間の間に一定の摂取量を維持した。
【００６０】
＜実験例５＞腫瘍成長の抑制に及ぼす影響
前記実験例５に示すような方法で癌細胞を移植したヌードマウスに実施例３ないし６の健康機能飲料を１ｍｇ／ｍｌの濃度で２週間飲用水として持続的に供給した後、動物を犠牲にした。犠牲にした当時の対照群及び実験群の姿を写真で撮り、腫瘍は矢印で表示した（図９）。左右の前肢にはヒトの膵臓癌細胞株を接種し、左右の後肢にはヒトの前立腺癌細胞株を接種した。図９Ａは滅菌蒸溜水を供給した対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）であり、図９Ｆは対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、図９Ｇは実施例５の健康機能飲料を摂取した個体、図９Ｈは実施例６の健康機能飲料を摂取した個体を拡大したものである。
【００６１】
本発明の組成物が腫瘍成長の抑制に及ぼす影響を観察するため、前記動物の犠牲時に取り出した腫瘍組織の重さ（ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ）を測定した。その結果を、図１０ないし図１２に示した。
癌細胞を移植してから１５日の経過後、腫瘍が形成された個体の割合を観察した結果、癌細胞を注射した全体個体のうちから７５％は膵臓癌が発生し、９６．７％は前立腺癌が発生した。しかし、肝臓癌は全体の個体のうちの０．１％のみが発生し、これは肝臓癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞の低い生存率に起因したものと考えられる。
【００６２】
図１０及び図１１に示すように、実施例３ないし６の健康機能性飲料を摂取した場合、対照群よりも膵臓癌の平均腫瘍の重さが減少し、実施例６の健康機能性飲料を摂取した場合、膵臓癌腫瘍の重さが最も減少した。すなわち、本発明の組成物の含有量が高まるほど坑癌効果が増加した。
図１０及び図１２に示すように、実施例３、４及び６の健康機能飲料を摂取した場合、対照群よりも前立腺癌腫瘍の重さが減少したが、実施例５の健康機能飲料を摂取した実験群の場合、対照群よりも腫瘍重さが増加したことが観察できた。
したがって、本発明の薬学的組成物は、同じ濃度において前立腺癌よりも膵臓癌にその効果が大きいと期待される。
【００６３】
＜実験例６＞ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現に及ぼす影響
前記実験例５のような方法で癌細胞を移植したヌードマウスに２週間実施例３ないし６の健康機能飲料を含む飲用水を供給した後、ヌードマウスから摘出した膵臓癌組織からｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現の変化をウェスタンブロット方法を介して確認した。その結果は図１３に示している。
【００６４】
図１３は、実施例３ないし６の試料を摂取しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）において、ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現を基準にして（１．０）、実施例３ないし６の試料を処理した場合の増加率（ｉｎｃｒｅａｓｅ ｆｏｌｄ）を換算して比較したものである。同図に示すように、ウェスタンブロットの結果、実施例３ないし６の健康機能飲料で処理した場合、ｐ５３及びｐ２１蛋白質の発現が対照群に比べて高いことが分かる。特に、実施例５及び６の健康機能飲料を摂取した実験群の場合、ｐ５３蛋白質の発現が対照群に比べて２．０倍、３．０倍増加した。ｐ５３の下位遺伝子であるｐ２１の場合、すべての実験群において対照群に比べて６倍以上の蛋白質の発現が増加した。
【００６５】
したがって、本発明の薬学的組成物が発癌抑制因子の蛋白質の発現を増加させることによって癌細胞の成長を抑制させることが分かる。
前述したように本発明の薬学的組成物は、発癌抑制遺伝子の発現を増加させることで癌細胞の増殖を抑制する効果があり、膵臓癌、肝臓癌、及び前立腺癌などに効果があることが分かる。特に、膵臓癌の場合は低い濃度でもその効果が優れた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
紅景天及び白花蛇舌草を含むことを特徴とする癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項２】
前記紅景天が、総組成物１００重量部に対して１０ないし７０重量部含まれることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項３】
前記白花蛇舌草が、総組成物１００重量部に対して２０ないし８０重量部含まれることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項４】
肉従蓉をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項５】
前記肉従蓉が、総組成物１００重量部に対して１０ないし４０重量部含まれることを特徴とする請求項４に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項６】
蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項７】
前記蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物が、総組成物１００重量部に対して５ないし１５重量部含まれることを特徴とする請求項６に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項８】
発癌抑制遺伝子の発現を増加させることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項９】
前記癌が、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌及び前立腺癌であることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項１０】
抽出物又は粉末状であることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含むことを特徴とする癌改善及び予防用健康機能食品。
【請求項１２】
健康機能飲料であることを特徴とする請求項１１に記載の癌改善及び予防用健康機能食品。
【請求項１３】
天然茶であることを特徴とする請求項１１に記載の癌改善及び予防用健康機能食品。
【請求項１４】
前記組成物の抽出物が、健康機能食品又は健康機能飲料の総１００重量部に対して０．００１ないし３０重量部含まれることを特徴とする請求項１１に記載の癌改善及び予防用健康機能食品。
【請求項１】
紅景天及び白花蛇舌草を含むことを特徴とする癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項２】
前記紅景天が、総組成物１００重量部に対して１０ないし７０重量部含まれることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項３】
前記白花蛇舌草が、総組成物１００重量部に対して２０ないし８０重量部含まれることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項４】
肉従蓉をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項５】
前記肉従蓉が、総組成物１００重量部に対して１０ないし４０重量部含まれることを特徴とする請求項４に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項６】
蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項７】
前記蛇床子、兎糸子及び遠志からなる群から選択された単独又はこれらの混合物が、総組成物１００重量部に対して５ないし１５重量部含まれることを特徴とする請求項６に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項８】
発癌抑制遺伝子の発現を増加させることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項９】
前記癌が、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌及び前立腺癌であることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項１０】
抽出物又は粉末状であることを特徴とする請求項１に記載の癌治療及び予防用薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含むことを特徴とする癌改善及び予防用健康機能食品。
【請求項１２】
健康機能飲料であることを特徴とする請求項１１に記載の癌改善及び予防用健康機能食品。
【請求項１３】
天然茶であることを特徴とする請求項１１に記載の癌改善及び予防用健康機能食品。
【請求項１４】
前記組成物の抽出物が、健康機能食品又は健康機能飲料の総１００重量部に対して０．００１ないし３０重量部含まれることを特徴とする請求項１１に記載の癌改善及び予防用健康機能食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−１０６０２４（Ｐ２０１０−１０６０２４Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５３０９０（Ｐ２００９−２５３０９０）
【出願日】平成２１年１１月４日（２００９．１１．４）
【出願人】（５０８１６９４１０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月４日（２００９．１１．４）
【出願人】（５０８１６９４１０）
【Ｆターム（参考）】
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