癌治療用組成物
【課題】 超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤とからなり、抗癌作用における相乗効果を有し、また、静脈注射によって体内投与することができ、さらに治療が終了した後に自然に体外へ放出されるような薬剤であるとともに、少ない投与量で治癒効果を発現することで、いわゆる副作用を軽減できるような薬剤を提供することを技術的課題とする。
【解決手段】 スピネル構造の組成物ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）などの超常磁性酸化鉄粒子とタキサン系抗癌剤などの抗癌剤とからなることを特徴とする癌治療用組成物である。
【解決手段】 スピネル構造の組成物ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）などの超常磁性酸化鉄粒子とタキサン系抗癌剤などの抗癌剤とからなることを特徴とする癌治療用組成物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤からなる癌治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、抗癌剤は癌細胞のＤＮＡを標的として、その損傷を起こさせることにより殺細胞効果を示す。その過程において、過酸化水素やスーパーオキサイドを代表とする活性酸素種（ＲＯＳ）が生成し、このＲＯＳがＤＮＡ損傷を誘発させ、殺細胞効果あるいは抗腫瘍効果に重要であることはすでに報告されている。多くの抗癌剤や放射線療法や光療法は腫瘍細胞内でのＲＯＳの産生を誘導する。一方、超常磁性酸化鉄粒子は、ＭＲＩ用造影剤としてや、癌治療の有効な方法の一つである温熱療法において重要な材料として検討されている。
【０００３】
例えば、特許文献１（特開２００５−２４７８０７号公報）には、非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分とする癌治療用組成物に関して報告されている。そのメカニズムとして、スリンダクおよびこの代謝産物であるスリンダクスルフィド、スリンダクスルホン等の活性酸素誘発効果のある非ステアロイド系炎症剤とを併用すると、各種癌細胞に酸化ストレスが増大し、酸化的ＤＮＡ傷害の増大を惹起し、抗腫瘍効果を高めると考えられている。
【０００４】
また、特許文献２（特表２００６−５２０７５２号公報）には、マンガンの有機塩または誘導体を用いてＲＯＳを生成し、癌や炎症等の酸化ストレスに関連する種々の疾病の処置に関して報告されている。
【０００５】
さらに、特許文献３〜５（特開平５−４９７０４、特開平５−１３７８０３、特開平５−２２８２１９号公報）には、４２〜９０℃のキューリー温度を有する磁性材料の表面に、抗がん剤と４０〜７０℃で溶融する感温性高分子を被覆した癌治療用温熱素子組成物に関して報告されている。
【０００６】
また、特許文献６（特開平２−９８１３号公報）には、１０〜１００メッシュの磁性体、すなわち２５４〜２５４０μｍの磁性材（酸化鉄）と生理活性物質と付着性物質を必須成分とする経口投与型磁性体含有剤形に関して報告されている。
【０００７】
前立腺癌は男性ホルモンであるアンドロゲンに対して感受性をもつ癌であり、一般的には高齢者の癌と考えられている。欧米では、前立腺癌は罹患率・死亡率が男性の悪性腫瘍の上位を占め、米国男性の最も罹患率の高い癌であり、欧米における癌死亡率の約２０％を占めている。日本では、前立腺癌の罹患率・死亡率は、比較的低い癌であったが、高齢化および食生活の欧米化により、その頻度は増加し、２０２０年にはその罹患者数は日本の男性の癌の第二位を占めると予測されている。
【０００８】
前立腺癌の治療法には、手術療法、放射線治療、内分泌療法、および特別な治療を実施せず、当面経過観察する「待機療法」がある。前立腺癌の治療の基本方針として、前立腺癌の病期によりこれらの治療法の選択及び組み合わせが決まる。
【０００９】
内分泌療法は、手術あるいは薬物により男性ホルモンを低下させたり、作用を遮断する事により前立腺癌細胞を死滅あるいは増殖を抑制させる。治療早期には９０％以上の患者に有効であるが、数年後に徐々に効果がなくなる（再燃）。この再燃した前立腺癌に対して、抗癌剤単剤あるいは多剤併用により化学療法が行われている。最近では、ドセタキセルを中心にした併用療法で、生存率が改善されたと報告され、ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅとして使用することが進められている。しかし、その予後の改善は２−３ヶ月にすぎない。
【００１０】
活性酸素種（ＲＯＳ）は細胞に対し有害であるとともに、細胞内の情報伝達に重要な役割を果たす。また、ＲＯＳは癌の発生・進展に重要な役割を果たす。特に、前立腺癌では、高年齢で発生する事と低いレベルのＲＯＳ刺激との関係が報告されている。一方、そのＲＯＳは、多くの抗癌剤や放射線療法や光療法は腫瘍細胞内で産生を誘導され、殺細胞効果をもたらす。
【００１１】
抗癌剤ドセタキセルは、微小管に結合して安定化させ脱重合を阻害することで、腫瘍細胞の分裂を阻害することにより、殺細胞の効果を発揮する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００５−２４７８０７号公報
【特許文献２】特表２００６−５２０７５２号公報
【特許文献３】特開平５−４９７０４号公報
【特許文献４】特開平５−１３７８０３号公報
【特許文献５】特開平５−２２８２１９号公報
【特許文献６】特開平２−９８１３号公報
【特許文献７】特開２００６−３４７９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記したように、活性酸素種（ＲＯＳ）誘発効果の高い抗癌剤を含む物質を癌細胞に作用させることができれば、効果的な治療を行うことができる。このＲＯＳを直接癌細胞の中で産生させる事を上昇させる事やＲＯＳを除去する機構を抑制する事で、癌細胞の中でのＲＯＳ産生を効率的に高めることができる。加えて、従来の抗癌剤とは異なる物質を機序の異なる抗癌剤に併用する事で、その副作用を軽減できる。
特定の癌細胞だけに抗癌剤を運搬するために、磁石によりターゲティングする方法が提案されている。特許文献６にも磁性材を同目的で使用している。ただし、本特許で使用している磁性材は上記のように非常に大きな材料であり、実際の使用には種々の制限が生じる。
【００１４】
一方、特許文献３〜５に記載された磁性材は、直径３０〜１００μｍ、厚さと直径のアスペクト比が３〜１０の円板状であり、この場合は、局部加熱用インプラント材として使用するためのものである。よって、抗がん剤の抗がん作用を促進させるものではない。さらに、その大きさ故に体外への自然放出は難しく、体内に滞留するものである。
【００１５】
引用文献７には、磁性酸化鉄微粒子をＣＴ診断用又は温熱治療法などに用いられることが記載されているが、磁性酸化鉄微粒子を抗癌剤と併用することは何ら考慮されていない。
【００１６】
このように、磁性体ナノ粒子と抗癌剤とからなり、抗癌作用における相乗効果を有し、また、静脈注射によって体内投与することができ、さらに治療が終了した後に自然に体外へ放出されるような薬剤が望まれている。
同時に、少ない投与量で治癒効果を発現することで、いわゆる副作用を軽減できるような薬剤が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、磁性酸化鉄の超常磁性粒子と抗癌剤との併用使用について検討し、抗癌剤の使用量を大幅に減少できるという癌細胞への優れた殺細胞効果を見出した。
【００１８】
即ち、本発明は、平均粒子径が５〜１０ｎｍである超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤とからなることを特徴とする癌治療用組成物である（本発明１）。
【００１９】
また、本発明は、抗癌剤がタキサン系抗癌剤で、且つ、対象となる癌が前立腺癌である本発明１記載の癌治療用組成物である（本発明２）。
【００２０】
また、本発明は、超常磁性酸化鉄粒子がスピネル構造の組成物ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）である本発明１又は２に記載の癌治療用組成物である（本発明３）。
【００２１】
また、本発明は、超常磁性酸化鉄粒子が生体適合性の薬剤を用いて分散させた本発明１〜３のいずれかに記載の癌治療用組成物である（本発明４）。
【００２２】
また、本発明は、超常磁性酸化鉄粒子のＢＥＴ比表面積が７０〜１８０ｍ２／ｇである本発明１〜４のいずれかに記載の癌治療用組成物である（本発明５）。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤とを併用することで、抗癌剤のみを使用する場合に比較して、抗癌剤の添加量を１／１０に低減することができる。すなわち、抗癌剤による化学療法において最大の問題とされる副作用を低減できることが可能となる。また、異なる抗癌作用のある薬剤と組み合わせることができる。一方、超常磁性酸化鉄粒子の単分散コロイド無菌水溶液を用いることで、生体への安全性を確保しながら、かつ、血管への投与が可能となることに加えて、超微粒子であることにより、投与後は体内からの排泄を容易にする等の作用効果をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
まず、本発明における超常磁性酸化鉄粒子について述べる。
【００２５】
超常磁性酸化鉄粒子として、スピネル型強磁性体ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）であり、ＭがＦｅの場合の組成はＦｅｘＯＦｅ２Ｏ３であり、この組成式のｘは２価鉄の含有量を表し、ｘ＝１はＦｅＯＦｅ２Ｏ３でマグネタイト、ｘ＝０はγ−Ｆｅ２Ｏ３でマグヘマイト、その中間（ｘ＝０〜１）のスピネル型酸化鉄も磁性酸化鉄であり、これ等の超常磁性酸化鉄粒子が用いられる。
【００２６】
超常磁性酸化鉄粒子は保磁力が１〜２０Ｏｅ．である。２０Ｏｅ．を超える大きな保磁力の場合は残留磁化を生じて磁気凝集し易くなる。好ましくは１〜１０Ｏｅ．である。飽和磁化は５０〜９０ｅｍｕ／ｇである。５０ｅｍｕ／ｇ未満の飽和磁化では磁性が不足しており、９０ｅｍｕ／ｇを超える飽和磁化はスピネル酸化鉄粒子では得難い。好ましくは５５〜８５ｅｍｕ／ｇである。
【００２７】
超常磁性酸化鉄粒子の大きさは約５ｎｍ〜１０ｎｍである。５ｎｍ未満は非晶質であり、１０ｎｍを超えると超常磁性で無くなる。磁性酸化鉄粒子の限界粒子径は５ｎｍ〜１０ｎｍである。
【００２８】
本発明における超常磁性酸化鉄粒子のＢＥＴ比表面積は７０〜１８０ｍ２／ｇが好ましく、より好ましくは１００〜１８０ｍ２／ｇである。
【００２９】
超常磁性を発現するのは保磁力がゼロの強磁性体である。即ち、強磁性体の粒子が単磁区構造であっても大きな粒子の場合は、外部磁界を印加して磁化した後、外部磁界から開放すると残留磁化を生じるが、粒子が極微細になると保磁力は減少して遂にはゼロとなり外部磁界を印加すると磁化するが、外部磁界から開放した後には残留磁化を生じない。この現象は熱擾乱作用によるものであり、このような強磁性微粒子を超常磁性であると言い、この現象が生起する粒子の大きさを限界粒子径という。
【００３０】
また、磁性粒子として超常磁性酸化鉄粒子を用いるのは、酸化鉄には生体適応性があるからであり、微粒子ほど生体内からの排泄が容易であるからである。
【００３１】
また、この超常磁性酸化鉄粒子を水に分散させた単分散コロイド水溶液は、表面磁束１００ガウスの永久磁石を近付けても凝集しない場合は長期安定な単分散コロイド水溶液であることを見出した。これは、磁性酸化鉄粒子の飽和磁化が５０〜９０ｅｍｕ／ｇの強磁性体であることと矛盾する現象であるように思えるが、しかし、この飽和磁化値とは磁性酸化鉄粒子を粉末状で測定したときの１グラム当たりの磁化値を表わしたものであるから、これを粒子１個当たりの磁化値に換算すると、微粒子であるほど１グラム中の総粒子個数が多くなるので、１個当たりの磁化値は小さな値となるのである。従って、単分散している超常磁性酸化鉄粒子１個当たりの磁化値は当然小さく、粒子間の磁気凝集も外部磁界の影響も受け難く安定した分散状態を保つことができるのである。
【００３２】
本発明における超常磁性酸化鉄粒子は無菌水に分散させて単分散コロイド無菌水溶液とすることができる。単分散コロイド無菌水溶液の濃度は、長期の分散安定性を考慮して上限値を５０ｍｇ／ｍｌと定めた。５０ｍｇ／ｍｌを超える濃度では粒子間に働くファンデアワールス力の影響が大きくなり凝集が生起し易くなり好ましくない。下限値は経済性を勘案して５ｍｇ／ｍｌと定めた。
【００３３】
保磁力が１〜２０Ｏｅ．で飽和磁化が５０〜９０ｅｍｕ／ｇの超常磁性酸化鉄粒子は、鉄塩水溶液とアルカリを用いる水溶液反応（湿式法と言う）、または、酸化鉄粉を水素等の還元性ガス中で加熱還元する方法（乾式法と言う）で合成することができる。
【００３４】
本発明における超常磁性酸化鉄粒子の合成方法は、共沈法や水酸化第一鉄コロイドの酸化反応などと呼ばれる湿式法が好ましい。共沈法とは、第一鉄塩水溶液Ｆｅ（ＩＩ）を１モルと第二鉄塩水溶液Ｆｅ（ＩＩＩ）を２モルとの混合水溶液にアルカリ水溶液を攪拌しながら加えると、Ｆｅ（ＩＩ）と２Ｆｅ（ＩＩＩ）の共沈反応が生起して黒色スピネル型磁性酸化鉄であるマグネタイト粒子が生成する反応である。この反応においてＦｅ以外の２価金属、例えばＭｇを添加した場合にはＭｇを含有したスピネル型磁性酸化鉄粒子が得られる。また、鉄塩濃度や混合温度などの反応条件により生成粒子の大きさが制御できるので、これらの反応条件を組み合わせることにより超常磁性酸化鉄粒子を合成することができる。
【００３５】
水酸化第一鉄コロイドの酸化反応法とは、第一鉄塩水溶液にアルカリ水溶液を添加すると水酸化第一鉄コロイドが生成する。この水酸化第一鉄コロイド水溶液を加熱攪拌しながら空気等の酸素含有ガスを通気すると水酸化第一鉄コロイドの酸化反応により黒色磁性酸化鉄であるマグネタイト粒子が生成する反応である。上記の共沈法と同様にＦｅ以外の２価金属を添加した場合には添加金属を含有したスピネル酸化鉄粒子が得られる。また、この反応条件を組み合わせて制御することにより超常磁性酸化鉄粒子を合成することができる。
【００３６】
磁性酸化鉄の単分散コロイド水溶液は下記の３工程により生成することができる。即ち、（１）上記した合成法で超常磁性酸化鉄粒子を生成した後、（２）反応母液から反応時に副生した水可溶性副生塩類を定法により水洗除去して超常磁性酸化鉄粒子のコロイド水溶液を精製する。
【００３７】
次に、（３）上記精製したコロイド水溶液の分散媒を超純水で置換する。例えば遠心分離機により固液分離した後、超純水を加えて再分散する方法で実施できる。
【００３８】
そして、さらに上記コロイド水溶液の濃度を超純水で５〜５０ｍｇ／ｍｌに希釈調整した後、毒性検査及びエンドトキシン検査を行い、何れも陰性であることを確認することにより、超常磁性酸化鉄粒子が無菌水に単分散している磁性粒子含有医薬用原薬を得ることができる。原薬濃度は５〜５０ｍｇ／ｍｌである。５ｍｇ／ｍｌ未満では濃度が希薄すぎて実用的でなく、また、５０ｍｇ／ｍｌを超える場合は単分散コロイドの粒子間が過密になり、粒子間引力による粒子の凝集が生じるので好ましくない。好ましい濃度は１０〜４０ｍｇ／ｍｌである。
【００３９】
さらに、得られた磁性粒子含有医薬用原薬は表面磁束１００ガウスの永久磁石を用いて磁気凝集生起の有無を確認する。
【００４０】
一方、抗癌剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗腫瘍剤等がある。これらはいずれもＤＮＡへの作用により抗癌効果を発現するものである。
【００４１】
今回、種々の抗癌剤の中でも、微小管重合阻害薬といわれる微小管が重合した状態でより安定にすることで細胞の有糸分裂を停止させ、癌細胞を死滅させるような作用機構を持った抗癌剤を用いた。
【００４２】
具体的には、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤が挙げられる。
【００４３】
超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤との添加割合は、抗癌剤１ｎＭに対して１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌが好ましい。
【００４４】
本発明においては、癌細胞に対し、超常磁性酸化鉄粒子を曝露した後、抗癌剤を投与するか、あるいは癌細胞に対し超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤との混合物を曝露することによって、癌細胞を死滅させることができる。
【００４５】
＜作用＞
本発明では、超常磁性酸化鉄粒子は、前立腺癌細胞内でＲＯＳ（活性酸素種）を生成させ、ＤＮＡ損傷を生じる事が明らかになった。それは同粒子が前立腺癌細胞内で、ＤＮＡ損傷修復遺伝子発現の誘導あるいは抑制は無く、損傷除去酵素遺伝子発現の抑制、抗酸化酵素遺伝子発現の抑制によるものである。その結果、抗癌剤ドセタキセルに併用する事により、ドセタキセルの単独使用に比べ、その容量をごく少量、例えば、１／１０量で同等の効果を得る事が出来る。
【００４６】
抗癌剤は、癌細胞内のDNA等の標的物質の損傷を誘起する作用を持っている。その過程で生じる活性酸素種（ＲＯＳ）の生成量が、抗癌剤の効果に重要な影響を与えると言われている。ところが、癌細胞のみならず正常細胞への影響も多く生じ、いわゆる副作用が最大の課題とされている。
【００４７】
そのためには、癌細胞のみに少ない抗癌剤を作用させることが求められている。一方、超常磁性酸化鉄粒子は、ＭＲＩ用造影剤や温熱療法等の癌治療薬として重要な材料として種々検討されている。また特定の臓器へ薬剤を運ぶ、ＤＤＳ用担体としての検討も種々なされている。これらは磁性酸化鉄微粒子を用い生体適応性物質と複合した磁性粒子含有医薬として検討されているが、磁性酸化鉄微粒子の粒度や磁性等の粉体特性と磁性粒子含有医薬特性との特性要因の関係は未だ十分に解明されているとは言えない。
【００４８】
すなわち、抗癌剤の機能を十分に発揮できるよう抗癌剤と磁性粒子の均質な組成物を再現性良く生成できる癌治療用組成物の開発が求められていた。
【００４９】
本発明では、超常磁性酸化鉄粒子の単分散コロイド無菌水溶液と抗癌剤とからなる組成物を提供することにより前記課題を解決した。すなわち、超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤の相乗作用により、ＲＯＳの発生を促進し、結果として癌細胞の生存率が大幅に低下し、少ない抗癌剤の添加量で同等の効果を発揮することが明らかとなった。同時に、生体への安全性を確保した超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤との組成物を用いることで、血管への投与が可能となることに加えて、超微粒子であることにより、人体に投与後の安全性及び代謝・排泄に関して何ら問題を生じない薬剤を提供することができる。将来は、温熱療法と化学療法との併用治療用としても有効に使用できる薬剤を提供することが期待できる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５１】
尚、生成物の構造解析にはＸ線回折装置を用いた。
【００５２】
平均粒子径はＸ線回折線（３１１）の半値幅からシェラーの式を用いて算出した。
【００５３】
粒度分布は透過型電子顕微鏡ＴＥＭで観測した。
【００５４】
磁気特性の測定には振動試料型磁力計ＶＳＭを用い１０ｋＯｅ．の磁場で測定した。
【００５５】
また、Ｆｅ２＋含有量はキレート滴定法により測定した。
【００５６】
生成物は無菌検査及び菌の残骸有無に関するエンドトキシン検査を行った。
【００５７】
＜実施例１＞
撹拌装置及び加熱装置を備えた５０００ｍｌの反応容器を用い、原料鉄塩と苛性ソーダは試薬特級を用い、また水はイオン交換水を用いた。生成物の超常磁性酸化鉄粒子の超純水分散液は、無菌検査及びエンドトキシン検査を行った。
【００５８】
（１）超常磁性酸化鉄粒子の合成工程
水溶液濃度０．５モルの塩化第一鉄水溶液５００ｍｌと、濃度０．５モルの塩化第二鉄水溶液１０００ｍｌを反応容器に投入し、撹拌して第一鉄と第二鉄塩の混合水溶液を調整した後、加熱昇温した。この混合鉄塩水溶液が８０℃に昇温した時、予め準備した濃度１．０モルの苛性ソーダ水溶液２３００ｍｌを該混合水溶液に撹拌しながら添加した。添加が完了してから温度を８０℃に保持して６０分間撹拌をつづけた。生成物は磁石に感応する黒色を呈したコロイド水溶液であった。生成物は、上記コロイド水溶液の一部を採取し水洗ろ過したペーストを凍結乾燥して得た粉末を分析した結果、平均粒子径が１０ｎｍのスピネル型結晶構造の粒子粉で、粒度分布もシャープ（８〜１０ｎｍ）であった。また、Ｆｅ２＋含有量が２７．５モル％の磁性酸化鉄粒子であり、磁気特性は飽和磁化σｓが６８ｅｍｕ／ｇ、保磁力Ｈｃが５Ｏｅ．の超常磁性酸化鉄粒子であった。
【００５９】
（２）コロイド粒子の精製工程
生成した黒色コロイド水溶液中には黒色コロイド粒子の合成反応で副生した可溶性塩が混在しているので、イオン交換水を用いてデカンテーション法により、副生塩を水洗除去することにより黒色コロイド水溶液を精製した。
【００６０】
（３）磁性体含有医薬用原薬の生成工程
生成物の物性を評価するために採取した残りの黒色コロイド水溶液から１００ｍｌを良く攪拌しながら採取し、該コロイド水溶液は遠心分離機を用いて固液分離して分散媒を除去した。その後、同量の超純水を注入して超音波分散機を用いて再分散した。これを１サイクルとして５サイクル繰り返し行いコロイド水溶液の分散媒を超純水に置換した。次に、該コロイド水溶液に超純水を加えてコロイド粒子濃度を２２ｍｇ／ｍｌに調整して超音波分散機で分散した。６０分後に超音波分散機を停止してコロイド水溶液を静置し、３６０分間放置した後のコロイド水溶液には沈殿が生じていないこと、さらに表面磁束が１００ガウスの永久磁石を用いて磁気凝集しないことを観測した。このコロイド水溶液は毒性検査及びエンドトキシン検査を行い何れも陰性であることを確認して超常磁性酸化鉄粒子の単分散コロイド無菌水溶液１５０ｍｌを生成した。
【００６１】
（４）超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤の併用による前立腺癌細胞への効果
培養シャーレにヒト前立腺癌細胞ＤＵ−１４５およびＰＣ−３に、実施例１で得られた超常磁性酸化鉄粒子および抗癌剤であるドセタキセルを添加し、細胞生存率の測定、細胞内の８−ＯＨｄＧ の生成量、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生量、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）１および２遺伝子、DNA修復遺伝子hOGG1、損傷除去酵素遺伝子hMTHの発現に関して評価を行った。
【００６２】
ドセタキセルの添加量を１ｎＭおよび１０ｎＭとし、そこに超常磁性酸化鉄粒子の添加量を１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの３水準で添加した。
【００６３】
結果として、ＤＵ-145細胞株では、細胞生存率（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙ）分析により、ドセタキセルを１、１０ｎＭ添加した際、細胞生存率は90.3±4.1％、84.7±6.4％であった。併用療法の効果としてドセタキセルを１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると生存率はそれぞれ、8７．７±6.4％、87.1±4.9％、84.5±4.5％となった。ドセタキセル１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１００μｇ／ｍｌを添加した時は、ドセタキセル1nMを単独で用いた時と比べて、ｐ＜０．０5で有意差をもって低下させ，またドセタキセル10nMを単独に用いた時と同じ効果，すなわちドセタキセルの約10倍の効果が認められた。
【００６４】
次に、ＰＣ-３細胞株では、ドセタキセルを１、１０ｎＭ添加した際、細胞生存率は85.9±4.6％、79.2±8.6％であった。併用療法の効果としてドセタキセルを１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると生存率はそれぞれ、83.3±4.0％、81.0±3.8％、79.5±3.7％となった。ドセタキセル１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１０、１００μｇ／ｍｌを添加した時は、ドセタキセル1nMを単独で用いた時と比べて、ｐ＜０．０５をもって低下させ，またドセタキセル10nMを単独に用いた時と同じ効果，すなわちドセタキセルの約１０倍の効果が認められた。
【００６５】
細胞生存率分析は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙを用いた。このＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙは、５７０、６００ｎｍの波長で吸光度測定をして、細胞の代謝活性による還元量により細胞生存率を算出している。前立腺癌細胞を２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、５％ＣＯ２条件下で、培養を行った。そして２４時間後に各濃度で超常磁性酸化鉄粒子を添加した。更に２４時間後に、超常磁性酸化鉄粒子とドセタキセルを添加した。その２４時間後にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ試薬を加えて、３時間発色後に５７０、６００ｎｍで吸光度を測定した。
【００６６】
また、H２ＤＣＦ−ＤＡ分析により、超常磁性酸化鉄粒子を１００μｇ／ｍｌ添加した際に、ＲＯＳの発生を確認した。
【００６７】
Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ分析により、ＤＵ−１４５細胞株において、超常磁性酸化鉄粒子を添加してない条件と比較して、超常磁性酸化鉄粒子を１、１０、１００μｇ／ｍＬ添加した際、１．０３、１．５０、２．７２倍の細胞内のＲＯＳの生成が認められた。このとき、活性酸素種の一種である過酸化水素１００μＭ添加した値は２．６０倍であった。従って、超常磁性酸化鉄粒子１００μｇ／ｍＬ添加したのは、過酸化水素１００μＭ添加した値と同等のＲＯＳが生成した。
【００６８】
次に、ＰＣ−３細胞株において、ナノ粒子を添加してない条件と比較して、超常磁性酸化鉄粒子を１、１０、１００μｇ／ｍＬ添加した際、１．０７、２．０３、２．８０倍の細胞内のＲＯＳの生成が認められた。このとき、活性酸素種の一種である過酸化水素１００μＭ添加した値は２．９８倍であった。従って、超常磁性酸化鉄粒子１００μｇ／ｍＬ添加したのは、過酸化水素１００μＭ添加した値と同等のＲＯＳが生成した。
【００６９】
Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡは、生細胞の細胞質で酸化されるまでは、細胞透過性の非蛍光物質であり、生細胞に入ると、二酢酸基が細胞内エステラーゼによって切断される。細胞内にＲＯＳ（活性酸素種）が存在すると、還元された色素が酸化され、色素が蛍光を発する。その蛍光の発光を蛍光顕微鏡で写真を撮影し、そしてイメージングソフト（ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）により定量化を行った。
【００７０】
ＤＮＡエキストラクターＷＢキット（和光純薬）に１ｍＭのｄｅｓｆｅｒａｌを抗酸化剤として加え、ＤＮＡ抽出を行った。得られたＤＮＡはＮｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１， ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅによりヌクレオシドに分解し、電気化学検出器（ＥＣＤ検出器）を備えたＨＰＬＣによって分析を行った。
結果として、未添加の場合と超常磁性酸化鉄粒子を以下の濃度０．１、１、１０μｇ／ｍＬで添加した場合０．８９、１．２８、４．１２、１３．１６［８−ＯＨ−ｄＧ／１０６ｄＧ］という結果となった。
【００７１】
酸化的ＤＮＡ損傷は、化学物質や放射線、喫煙、生活習慣などの要因によって起こる生体内酸化ストレスにともなって生じ、発がんを始めとする生活習慣病の発症に関与しているとされる。具体的な酸化的ＤＮＡ損傷として８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ：８−ＯＨ−ｄＧ）が挙げられる。ＤＮＡ中の８−ＯＨ−ｄＧの生成は、ＧＣからＴＡへの突然変異を引き起こす。８−ＯＨ−ｄＧに代表されるＤＮＡの酸化的損傷は細胞の癌化要因の一つとされている。一方、過剰に生成された場合は、癌細胞はその生存がおびやかされる。
【００７２】
Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲを用いて、８−ＯＨｄＧの修復酵素であるｈＯＧＧ１について解析を行った。ｈＯＧＧ１／ＧＡＰＤＨ比は、超常磁性酸化鉄粒子を未処理した時を１．００として相対的評価を行うと、超常磁性酸化鉄粒子１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると、１．００±０．４３、０．９２±０．１９、１．１８±０．３０、１．２１±０．２４となった。促進・抑制効果とも有意差が認められなかった。
【００７３】
次に、ｄＧＴＰはＤＮＡ中のグアニン塩基の原料として、ＤＮＡ複製の時にポリメラーゼが利用する。塩基が酸化されるのはＤＮＡ中の塩基だけではなく、このｄＧＴＰが酸化されることもある。ｄＧＴＰが酸化されると８−オキソグアニンとなる。つまり、８−オキソグアニンとしてポリメラーゼに利用される。８−オキソグアニンはシトシン以外にもアデニンとも対合する。これを阻止するために、酸化されたｄＧＴＰを使えない形にする酵素がある。この酵素はｄＧＴＰをｄＧＭＰに変化させる。ｄＧＭＰにまで変化されると再びｄＧＴＰに戻ることはなく、そのまま排泄される。この働きをする酵素がｈＭＴＨ１である。
Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲを用いて、ｈＭＴＨ遺伝子について解析を行った結果、１．００±０．２３、０．５６±０．１４、０．５７±０．１１、０．４８±０．１４となり超常磁性酸化鉄粒子の添加による抑制効果がｐ＜０．０５の有意差で認められた。
【００７４】
ＤＮＡ中の８−ＯＨｄＧの修復に直接かかわる酵素はＯＧＧ１（８−ＯＨｄＧのＤＮＡグリコシラーゼ）およびヌクレオチドプールの８−ＯＨｄＧＴＰを加水分解する損傷除去酵素ＭＴＨ１が代表的である。
【００７５】
Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲを用いて、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２両者の発現量の定量化を行った。
【００７６】
ＳＯＤは、生体内で生成したＯ２−をＨ２Ｏ２とＯ２を不均一化する酵素でこれにより生体内のＯ２−は低いレベルに保たれている。反応は非常に早く良く拡散律速反応と言われる。すなわち、反応は極めて早く基質であるＯ２−とＳＯＤが出会うと直ちに反応が終了するため、拡散によって基質と酵素がお互い出会う速度が全体の反応をむしろ律速していることになる。ＳＯＤの中で、細胞質にあるＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ（ＳＯＤ１）、ミトコンドリアにあるＭｎ−ＳＯＤ（ＳＯＤ２）について解析を行った。
【００７７】
ＳＯＤ１／ＧＡＰＤＨ比は、超常磁性酸化鉄粒子を未処理した時を１．００として相対的評価を行うと、超常磁性酸化鉄粒子を以下の濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると、１．００±０．２１、０．１６±０．０３、０．２９±０．０６、０．１３±０．０３となり、超常磁性酸化鉄粒子の添加による抑制効果がｐ＜０．０１の有意差で認められた。
【００７８】
次にＳＯＤ２／ＧＡＰＤＨ比は、超常磁性酸化鉄粒子を未処理した時を１．００として相対的評価を行うと、超常磁性酸化鉄粒子を以下の濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると、１．００±０．２１、０．１６±０．０３、０．３１±０．０６、０．１４±０．０３となり、超常磁性酸化鉄粒子の添加による抑制効果がｐ＜０．０１の有意差で認められた。
【００７９】
生成されたＲＯＳを取り除く抗酸化酵素として、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）が代表的である。
【００８０】
前記実施例に示したとおり、本発明では、超常磁性酸化鉄粒子は、前立腺癌細胞内でＲＯＳ（活性酸素種）を生成させ、ＤＮＡ損傷を生じる事が明らかになった。それは同粒子が前立腺癌細胞内で、ＤＮＡ損傷修復遺伝子発現の誘導あるいは抑制は無く、損傷除去酵素遺伝子発現の抑制、抗酸化酵素遺伝子発現の抑制によるものである。その結果、抗癌剤ドセタキセルに併用する事により、ドセタキセルの単独使用に比べ、その容量を１／１０量で同等の効果を得る事が出来た。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤からなる癌治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、抗癌剤は癌細胞のＤＮＡを標的として、その損傷を起こさせることにより殺細胞効果を示す。その過程において、過酸化水素やスーパーオキサイドを代表とする活性酸素種（ＲＯＳ）が生成し、このＲＯＳがＤＮＡ損傷を誘発させ、殺細胞効果あるいは抗腫瘍効果に重要であることはすでに報告されている。多くの抗癌剤や放射線療法や光療法は腫瘍細胞内でのＲＯＳの産生を誘導する。一方、超常磁性酸化鉄粒子は、ＭＲＩ用造影剤としてや、癌治療の有効な方法の一つである温熱療法において重要な材料として検討されている。
【０００３】
例えば、特許文献１（特開２００５−２４７８０７号公報）には、非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分とする癌治療用組成物に関して報告されている。そのメカニズムとして、スリンダクおよびこの代謝産物であるスリンダクスルフィド、スリンダクスルホン等の活性酸素誘発効果のある非ステアロイド系炎症剤とを併用すると、各種癌細胞に酸化ストレスが増大し、酸化的ＤＮＡ傷害の増大を惹起し、抗腫瘍効果を高めると考えられている。
【０００４】
また、特許文献２（特表２００６−５２０７５２号公報）には、マンガンの有機塩または誘導体を用いてＲＯＳを生成し、癌や炎症等の酸化ストレスに関連する種々の疾病の処置に関して報告されている。
【０００５】
さらに、特許文献３〜５（特開平５−４９７０４、特開平５−１３７８０３、特開平５−２２８２１９号公報）には、４２〜９０℃のキューリー温度を有する磁性材料の表面に、抗がん剤と４０〜７０℃で溶融する感温性高分子を被覆した癌治療用温熱素子組成物に関して報告されている。
【０００６】
また、特許文献６（特開平２−９８１３号公報）には、１０〜１００メッシュの磁性体、すなわち２５４〜２５４０μｍの磁性材（酸化鉄）と生理活性物質と付着性物質を必須成分とする経口投与型磁性体含有剤形に関して報告されている。
【０００７】
前立腺癌は男性ホルモンであるアンドロゲンに対して感受性をもつ癌であり、一般的には高齢者の癌と考えられている。欧米では、前立腺癌は罹患率・死亡率が男性の悪性腫瘍の上位を占め、米国男性の最も罹患率の高い癌であり、欧米における癌死亡率の約２０％を占めている。日本では、前立腺癌の罹患率・死亡率は、比較的低い癌であったが、高齢化および食生活の欧米化により、その頻度は増加し、２０２０年にはその罹患者数は日本の男性の癌の第二位を占めると予測されている。
【０００８】
前立腺癌の治療法には、手術療法、放射線治療、内分泌療法、および特別な治療を実施せず、当面経過観察する「待機療法」がある。前立腺癌の治療の基本方針として、前立腺癌の病期によりこれらの治療法の選択及び組み合わせが決まる。
【０００９】
内分泌療法は、手術あるいは薬物により男性ホルモンを低下させたり、作用を遮断する事により前立腺癌細胞を死滅あるいは増殖を抑制させる。治療早期には９０％以上の患者に有効であるが、数年後に徐々に効果がなくなる（再燃）。この再燃した前立腺癌に対して、抗癌剤単剤あるいは多剤併用により化学療法が行われている。最近では、ドセタキセルを中心にした併用療法で、生存率が改善されたと報告され、ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅとして使用することが進められている。しかし、その予後の改善は２−３ヶ月にすぎない。
【００１０】
活性酸素種（ＲＯＳ）は細胞に対し有害であるとともに、細胞内の情報伝達に重要な役割を果たす。また、ＲＯＳは癌の発生・進展に重要な役割を果たす。特に、前立腺癌では、高年齢で発生する事と低いレベルのＲＯＳ刺激との関係が報告されている。一方、そのＲＯＳは、多くの抗癌剤や放射線療法や光療法は腫瘍細胞内で産生を誘導され、殺細胞効果をもたらす。
【００１１】
抗癌剤ドセタキセルは、微小管に結合して安定化させ脱重合を阻害することで、腫瘍細胞の分裂を阻害することにより、殺細胞の効果を発揮する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００５−２４７８０７号公報
【特許文献２】特表２００６−５２０７５２号公報
【特許文献３】特開平５−４９７０４号公報
【特許文献４】特開平５−１３７８０３号公報
【特許文献５】特開平５−２２８２１９号公報
【特許文献６】特開平２−９８１３号公報
【特許文献７】特開２００６−３４７９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記したように、活性酸素種（ＲＯＳ）誘発効果の高い抗癌剤を含む物質を癌細胞に作用させることができれば、効果的な治療を行うことができる。このＲＯＳを直接癌細胞の中で産生させる事を上昇させる事やＲＯＳを除去する機構を抑制する事で、癌細胞の中でのＲＯＳ産生を効率的に高めることができる。加えて、従来の抗癌剤とは異なる物質を機序の異なる抗癌剤に併用する事で、その副作用を軽減できる。
特定の癌細胞だけに抗癌剤を運搬するために、磁石によりターゲティングする方法が提案されている。特許文献６にも磁性材を同目的で使用している。ただし、本特許で使用している磁性材は上記のように非常に大きな材料であり、実際の使用には種々の制限が生じる。
【００１４】
一方、特許文献３〜５に記載された磁性材は、直径３０〜１００μｍ、厚さと直径のアスペクト比が３〜１０の円板状であり、この場合は、局部加熱用インプラント材として使用するためのものである。よって、抗がん剤の抗がん作用を促進させるものではない。さらに、その大きさ故に体外への自然放出は難しく、体内に滞留するものである。
【００１５】
引用文献７には、磁性酸化鉄微粒子をＣＴ診断用又は温熱治療法などに用いられることが記載されているが、磁性酸化鉄微粒子を抗癌剤と併用することは何ら考慮されていない。
【００１６】
このように、磁性体ナノ粒子と抗癌剤とからなり、抗癌作用における相乗効果を有し、また、静脈注射によって体内投与することができ、さらに治療が終了した後に自然に体外へ放出されるような薬剤が望まれている。
同時に、少ない投与量で治癒効果を発現することで、いわゆる副作用を軽減できるような薬剤が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、磁性酸化鉄の超常磁性粒子と抗癌剤との併用使用について検討し、抗癌剤の使用量を大幅に減少できるという癌細胞への優れた殺細胞効果を見出した。
【００１８】
即ち、本発明は、平均粒子径が５〜１０ｎｍである超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤とからなることを特徴とする癌治療用組成物である（本発明１）。
【００１９】
また、本発明は、抗癌剤がタキサン系抗癌剤で、且つ、対象となる癌が前立腺癌である本発明１記載の癌治療用組成物である（本発明２）。
【００２０】
また、本発明は、超常磁性酸化鉄粒子がスピネル構造の組成物ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）である本発明１又は２に記載の癌治療用組成物である（本発明３）。
【００２１】
また、本発明は、超常磁性酸化鉄粒子が生体適合性の薬剤を用いて分散させた本発明１〜３のいずれかに記載の癌治療用組成物である（本発明４）。
【００２２】
また、本発明は、超常磁性酸化鉄粒子のＢＥＴ比表面積が７０〜１８０ｍ２／ｇである本発明１〜４のいずれかに記載の癌治療用組成物である（本発明５）。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤とを併用することで、抗癌剤のみを使用する場合に比較して、抗癌剤の添加量を１／１０に低減することができる。すなわち、抗癌剤による化学療法において最大の問題とされる副作用を低減できることが可能となる。また、異なる抗癌作用のある薬剤と組み合わせることができる。一方、超常磁性酸化鉄粒子の単分散コロイド無菌水溶液を用いることで、生体への安全性を確保しながら、かつ、血管への投与が可能となることに加えて、超微粒子であることにより、投与後は体内からの排泄を容易にする等の作用効果をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
まず、本発明における超常磁性酸化鉄粒子について述べる。
【００２５】
超常磁性酸化鉄粒子として、スピネル型強磁性体ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）であり、ＭがＦｅの場合の組成はＦｅｘＯＦｅ２Ｏ３であり、この組成式のｘは２価鉄の含有量を表し、ｘ＝１はＦｅＯＦｅ２Ｏ３でマグネタイト、ｘ＝０はγ−Ｆｅ２Ｏ３でマグヘマイト、その中間（ｘ＝０〜１）のスピネル型酸化鉄も磁性酸化鉄であり、これ等の超常磁性酸化鉄粒子が用いられる。
【００２６】
超常磁性酸化鉄粒子は保磁力が１〜２０Ｏｅ．である。２０Ｏｅ．を超える大きな保磁力の場合は残留磁化を生じて磁気凝集し易くなる。好ましくは１〜１０Ｏｅ．である。飽和磁化は５０〜９０ｅｍｕ／ｇである。５０ｅｍｕ／ｇ未満の飽和磁化では磁性が不足しており、９０ｅｍｕ／ｇを超える飽和磁化はスピネル酸化鉄粒子では得難い。好ましくは５５〜８５ｅｍｕ／ｇである。
【００２７】
超常磁性酸化鉄粒子の大きさは約５ｎｍ〜１０ｎｍである。５ｎｍ未満は非晶質であり、１０ｎｍを超えると超常磁性で無くなる。磁性酸化鉄粒子の限界粒子径は５ｎｍ〜１０ｎｍである。
【００２８】
本発明における超常磁性酸化鉄粒子のＢＥＴ比表面積は７０〜１８０ｍ２／ｇが好ましく、より好ましくは１００〜１８０ｍ２／ｇである。
【００２９】
超常磁性を発現するのは保磁力がゼロの強磁性体である。即ち、強磁性体の粒子が単磁区構造であっても大きな粒子の場合は、外部磁界を印加して磁化した後、外部磁界から開放すると残留磁化を生じるが、粒子が極微細になると保磁力は減少して遂にはゼロとなり外部磁界を印加すると磁化するが、外部磁界から開放した後には残留磁化を生じない。この現象は熱擾乱作用によるものであり、このような強磁性微粒子を超常磁性であると言い、この現象が生起する粒子の大きさを限界粒子径という。
【００３０】
また、磁性粒子として超常磁性酸化鉄粒子を用いるのは、酸化鉄には生体適応性があるからであり、微粒子ほど生体内からの排泄が容易であるからである。
【００３１】
また、この超常磁性酸化鉄粒子を水に分散させた単分散コロイド水溶液は、表面磁束１００ガウスの永久磁石を近付けても凝集しない場合は長期安定な単分散コロイド水溶液であることを見出した。これは、磁性酸化鉄粒子の飽和磁化が５０〜９０ｅｍｕ／ｇの強磁性体であることと矛盾する現象であるように思えるが、しかし、この飽和磁化値とは磁性酸化鉄粒子を粉末状で測定したときの１グラム当たりの磁化値を表わしたものであるから、これを粒子１個当たりの磁化値に換算すると、微粒子であるほど１グラム中の総粒子個数が多くなるので、１個当たりの磁化値は小さな値となるのである。従って、単分散している超常磁性酸化鉄粒子１個当たりの磁化値は当然小さく、粒子間の磁気凝集も外部磁界の影響も受け難く安定した分散状態を保つことができるのである。
【００３２】
本発明における超常磁性酸化鉄粒子は無菌水に分散させて単分散コロイド無菌水溶液とすることができる。単分散コロイド無菌水溶液の濃度は、長期の分散安定性を考慮して上限値を５０ｍｇ／ｍｌと定めた。５０ｍｇ／ｍｌを超える濃度では粒子間に働くファンデアワールス力の影響が大きくなり凝集が生起し易くなり好ましくない。下限値は経済性を勘案して５ｍｇ／ｍｌと定めた。
【００３３】
保磁力が１〜２０Ｏｅ．で飽和磁化が５０〜９０ｅｍｕ／ｇの超常磁性酸化鉄粒子は、鉄塩水溶液とアルカリを用いる水溶液反応（湿式法と言う）、または、酸化鉄粉を水素等の還元性ガス中で加熱還元する方法（乾式法と言う）で合成することができる。
【００３４】
本発明における超常磁性酸化鉄粒子の合成方法は、共沈法や水酸化第一鉄コロイドの酸化反応などと呼ばれる湿式法が好ましい。共沈法とは、第一鉄塩水溶液Ｆｅ（ＩＩ）を１モルと第二鉄塩水溶液Ｆｅ（ＩＩＩ）を２モルとの混合水溶液にアルカリ水溶液を攪拌しながら加えると、Ｆｅ（ＩＩ）と２Ｆｅ（ＩＩＩ）の共沈反応が生起して黒色スピネル型磁性酸化鉄であるマグネタイト粒子が生成する反応である。この反応においてＦｅ以外の２価金属、例えばＭｇを添加した場合にはＭｇを含有したスピネル型磁性酸化鉄粒子が得られる。また、鉄塩濃度や混合温度などの反応条件により生成粒子の大きさが制御できるので、これらの反応条件を組み合わせることにより超常磁性酸化鉄粒子を合成することができる。
【００３５】
水酸化第一鉄コロイドの酸化反応法とは、第一鉄塩水溶液にアルカリ水溶液を添加すると水酸化第一鉄コロイドが生成する。この水酸化第一鉄コロイド水溶液を加熱攪拌しながら空気等の酸素含有ガスを通気すると水酸化第一鉄コロイドの酸化反応により黒色磁性酸化鉄であるマグネタイト粒子が生成する反応である。上記の共沈法と同様にＦｅ以外の２価金属を添加した場合には添加金属を含有したスピネル酸化鉄粒子が得られる。また、この反応条件を組み合わせて制御することにより超常磁性酸化鉄粒子を合成することができる。
【００３６】
磁性酸化鉄の単分散コロイド水溶液は下記の３工程により生成することができる。即ち、（１）上記した合成法で超常磁性酸化鉄粒子を生成した後、（２）反応母液から反応時に副生した水可溶性副生塩類を定法により水洗除去して超常磁性酸化鉄粒子のコロイド水溶液を精製する。
【００３７】
次に、（３）上記精製したコロイド水溶液の分散媒を超純水で置換する。例えば遠心分離機により固液分離した後、超純水を加えて再分散する方法で実施できる。
【００３８】
そして、さらに上記コロイド水溶液の濃度を超純水で５〜５０ｍｇ／ｍｌに希釈調整した後、毒性検査及びエンドトキシン検査を行い、何れも陰性であることを確認することにより、超常磁性酸化鉄粒子が無菌水に単分散している磁性粒子含有医薬用原薬を得ることができる。原薬濃度は５〜５０ｍｇ／ｍｌである。５ｍｇ／ｍｌ未満では濃度が希薄すぎて実用的でなく、また、５０ｍｇ／ｍｌを超える場合は単分散コロイドの粒子間が過密になり、粒子間引力による粒子の凝集が生じるので好ましくない。好ましい濃度は１０〜４０ｍｇ／ｍｌである。
【００３９】
さらに、得られた磁性粒子含有医薬用原薬は表面磁束１００ガウスの永久磁石を用いて磁気凝集生起の有無を確認する。
【００４０】
一方、抗癌剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗腫瘍剤等がある。これらはいずれもＤＮＡへの作用により抗癌効果を発現するものである。
【００４１】
今回、種々の抗癌剤の中でも、微小管重合阻害薬といわれる微小管が重合した状態でより安定にすることで細胞の有糸分裂を停止させ、癌細胞を死滅させるような作用機構を持った抗癌剤を用いた。
【００４２】
具体的には、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤が挙げられる。
【００４３】
超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤との添加割合は、抗癌剤１ｎＭに対して１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌが好ましい。
【００４４】
本発明においては、癌細胞に対し、超常磁性酸化鉄粒子を曝露した後、抗癌剤を投与するか、あるいは癌細胞に対し超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤との混合物を曝露することによって、癌細胞を死滅させることができる。
【００４５】
＜作用＞
本発明では、超常磁性酸化鉄粒子は、前立腺癌細胞内でＲＯＳ（活性酸素種）を生成させ、ＤＮＡ損傷を生じる事が明らかになった。それは同粒子が前立腺癌細胞内で、ＤＮＡ損傷修復遺伝子発現の誘導あるいは抑制は無く、損傷除去酵素遺伝子発現の抑制、抗酸化酵素遺伝子発現の抑制によるものである。その結果、抗癌剤ドセタキセルに併用する事により、ドセタキセルの単独使用に比べ、その容量をごく少量、例えば、１／１０量で同等の効果を得る事が出来る。
【００４６】
抗癌剤は、癌細胞内のDNA等の標的物質の損傷を誘起する作用を持っている。その過程で生じる活性酸素種（ＲＯＳ）の生成量が、抗癌剤の効果に重要な影響を与えると言われている。ところが、癌細胞のみならず正常細胞への影響も多く生じ、いわゆる副作用が最大の課題とされている。
【００４７】
そのためには、癌細胞のみに少ない抗癌剤を作用させることが求められている。一方、超常磁性酸化鉄粒子は、ＭＲＩ用造影剤や温熱療法等の癌治療薬として重要な材料として種々検討されている。また特定の臓器へ薬剤を運ぶ、ＤＤＳ用担体としての検討も種々なされている。これらは磁性酸化鉄微粒子を用い生体適応性物質と複合した磁性粒子含有医薬として検討されているが、磁性酸化鉄微粒子の粒度や磁性等の粉体特性と磁性粒子含有医薬特性との特性要因の関係は未だ十分に解明されているとは言えない。
【００４８】
すなわち、抗癌剤の機能を十分に発揮できるよう抗癌剤と磁性粒子の均質な組成物を再現性良く生成できる癌治療用組成物の開発が求められていた。
【００４９】
本発明では、超常磁性酸化鉄粒子の単分散コロイド無菌水溶液と抗癌剤とからなる組成物を提供することにより前記課題を解決した。すなわち、超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤の相乗作用により、ＲＯＳの発生を促進し、結果として癌細胞の生存率が大幅に低下し、少ない抗癌剤の添加量で同等の効果を発揮することが明らかとなった。同時に、生体への安全性を確保した超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤との組成物を用いることで、血管への投与が可能となることに加えて、超微粒子であることにより、人体に投与後の安全性及び代謝・排泄に関して何ら問題を生じない薬剤を提供することができる。将来は、温熱療法と化学療法との併用治療用としても有効に使用できる薬剤を提供することが期待できる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５１】
尚、生成物の構造解析にはＸ線回折装置を用いた。
【００５２】
平均粒子径はＸ線回折線（３１１）の半値幅からシェラーの式を用いて算出した。
【００５３】
粒度分布は透過型電子顕微鏡ＴＥＭで観測した。
【００５４】
磁気特性の測定には振動試料型磁力計ＶＳＭを用い１０ｋＯｅ．の磁場で測定した。
【００５５】
また、Ｆｅ２＋含有量はキレート滴定法により測定した。
【００５６】
生成物は無菌検査及び菌の残骸有無に関するエンドトキシン検査を行った。
【００５７】
＜実施例１＞
撹拌装置及び加熱装置を備えた５０００ｍｌの反応容器を用い、原料鉄塩と苛性ソーダは試薬特級を用い、また水はイオン交換水を用いた。生成物の超常磁性酸化鉄粒子の超純水分散液は、無菌検査及びエンドトキシン検査を行った。
【００５８】
（１）超常磁性酸化鉄粒子の合成工程
水溶液濃度０．５モルの塩化第一鉄水溶液５００ｍｌと、濃度０．５モルの塩化第二鉄水溶液１０００ｍｌを反応容器に投入し、撹拌して第一鉄と第二鉄塩の混合水溶液を調整した後、加熱昇温した。この混合鉄塩水溶液が８０℃に昇温した時、予め準備した濃度１．０モルの苛性ソーダ水溶液２３００ｍｌを該混合水溶液に撹拌しながら添加した。添加が完了してから温度を８０℃に保持して６０分間撹拌をつづけた。生成物は磁石に感応する黒色を呈したコロイド水溶液であった。生成物は、上記コロイド水溶液の一部を採取し水洗ろ過したペーストを凍結乾燥して得た粉末を分析した結果、平均粒子径が１０ｎｍのスピネル型結晶構造の粒子粉で、粒度分布もシャープ（８〜１０ｎｍ）であった。また、Ｆｅ２＋含有量が２７．５モル％の磁性酸化鉄粒子であり、磁気特性は飽和磁化σｓが６８ｅｍｕ／ｇ、保磁力Ｈｃが５Ｏｅ．の超常磁性酸化鉄粒子であった。
【００５９】
（２）コロイド粒子の精製工程
生成した黒色コロイド水溶液中には黒色コロイド粒子の合成反応で副生した可溶性塩が混在しているので、イオン交換水を用いてデカンテーション法により、副生塩を水洗除去することにより黒色コロイド水溶液を精製した。
【００６０】
（３）磁性体含有医薬用原薬の生成工程
生成物の物性を評価するために採取した残りの黒色コロイド水溶液から１００ｍｌを良く攪拌しながら採取し、該コロイド水溶液は遠心分離機を用いて固液分離して分散媒を除去した。その後、同量の超純水を注入して超音波分散機を用いて再分散した。これを１サイクルとして５サイクル繰り返し行いコロイド水溶液の分散媒を超純水に置換した。次に、該コロイド水溶液に超純水を加えてコロイド粒子濃度を２２ｍｇ／ｍｌに調整して超音波分散機で分散した。６０分後に超音波分散機を停止してコロイド水溶液を静置し、３６０分間放置した後のコロイド水溶液には沈殿が生じていないこと、さらに表面磁束が１００ガウスの永久磁石を用いて磁気凝集しないことを観測した。このコロイド水溶液は毒性検査及びエンドトキシン検査を行い何れも陰性であることを確認して超常磁性酸化鉄粒子の単分散コロイド無菌水溶液１５０ｍｌを生成した。
【００６１】
（４）超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤の併用による前立腺癌細胞への効果
培養シャーレにヒト前立腺癌細胞ＤＵ−１４５およびＰＣ−３に、実施例１で得られた超常磁性酸化鉄粒子および抗癌剤であるドセタキセルを添加し、細胞生存率の測定、細胞内の８−ＯＨｄＧ の生成量、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生量、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）１および２遺伝子、DNA修復遺伝子hOGG1、損傷除去酵素遺伝子hMTHの発現に関して評価を行った。
【００６２】
ドセタキセルの添加量を１ｎＭおよび１０ｎＭとし、そこに超常磁性酸化鉄粒子の添加量を１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの３水準で添加した。
【００６３】
結果として、ＤＵ-145細胞株では、細胞生存率（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙ）分析により、ドセタキセルを１、１０ｎＭ添加した際、細胞生存率は90.3±4.1％、84.7±6.4％であった。併用療法の効果としてドセタキセルを１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると生存率はそれぞれ、8７．７±6.4％、87.1±4.9％、84.5±4.5％となった。ドセタキセル１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１００μｇ／ｍｌを添加した時は、ドセタキセル1nMを単独で用いた時と比べて、ｐ＜０．０5で有意差をもって低下させ，またドセタキセル10nMを単独に用いた時と同じ効果，すなわちドセタキセルの約10倍の効果が認められた。
【００６４】
次に、ＰＣ-３細胞株では、ドセタキセルを１、１０ｎＭ添加した際、細胞生存率は85.9±4.6％、79.2±8.6％であった。併用療法の効果としてドセタキセルを１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると生存率はそれぞれ、83.3±4.0％、81.0±3.8％、79.5±3.7％となった。ドセタキセル１ｎＭに超常磁性酸化鉄粒子１０、１００μｇ／ｍｌを添加した時は、ドセタキセル1nMを単独で用いた時と比べて、ｐ＜０．０５をもって低下させ，またドセタキセル10nMを単独に用いた時と同じ効果，すなわちドセタキセルの約１０倍の効果が認められた。
【００６５】
細胞生存率分析は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙを用いた。このＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙは、５７０、６００ｎｍの波長で吸光度測定をして、細胞の代謝活性による還元量により細胞生存率を算出している。前立腺癌細胞を２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、５％ＣＯ２条件下で、培養を行った。そして２４時間後に各濃度で超常磁性酸化鉄粒子を添加した。更に２４時間後に、超常磁性酸化鉄粒子とドセタキセルを添加した。その２４時間後にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ試薬を加えて、３時間発色後に５７０、６００ｎｍで吸光度を測定した。
【００６６】
また、H２ＤＣＦ−ＤＡ分析により、超常磁性酸化鉄粒子を１００μｇ／ｍｌ添加した際に、ＲＯＳの発生を確認した。
【００６７】
Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ分析により、ＤＵ−１４５細胞株において、超常磁性酸化鉄粒子を添加してない条件と比較して、超常磁性酸化鉄粒子を１、１０、１００μｇ／ｍＬ添加した際、１．０３、１．５０、２．７２倍の細胞内のＲＯＳの生成が認められた。このとき、活性酸素種の一種である過酸化水素１００μＭ添加した値は２．６０倍であった。従って、超常磁性酸化鉄粒子１００μｇ／ｍＬ添加したのは、過酸化水素１００μＭ添加した値と同等のＲＯＳが生成した。
【００６８】
次に、ＰＣ−３細胞株において、ナノ粒子を添加してない条件と比較して、超常磁性酸化鉄粒子を１、１０、１００μｇ／ｍＬ添加した際、１．０７、２．０３、２．８０倍の細胞内のＲＯＳの生成が認められた。このとき、活性酸素種の一種である過酸化水素１００μＭ添加した値は２．９８倍であった。従って、超常磁性酸化鉄粒子１００μｇ／ｍＬ添加したのは、過酸化水素１００μＭ添加した値と同等のＲＯＳが生成した。
【００６９】
Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡは、生細胞の細胞質で酸化されるまでは、細胞透過性の非蛍光物質であり、生細胞に入ると、二酢酸基が細胞内エステラーゼによって切断される。細胞内にＲＯＳ（活性酸素種）が存在すると、還元された色素が酸化され、色素が蛍光を発する。その蛍光の発光を蛍光顕微鏡で写真を撮影し、そしてイメージングソフト（ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）により定量化を行った。
【００７０】
ＤＮＡエキストラクターＷＢキット（和光純薬）に１ｍＭのｄｅｓｆｅｒａｌを抗酸化剤として加え、ＤＮＡ抽出を行った。得られたＤＮＡはＮｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１， ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅによりヌクレオシドに分解し、電気化学検出器（ＥＣＤ検出器）を備えたＨＰＬＣによって分析を行った。
結果として、未添加の場合と超常磁性酸化鉄粒子を以下の濃度０．１、１、１０μｇ／ｍＬで添加した場合０．８９、１．２８、４．１２、１３．１６［８−ＯＨ−ｄＧ／１０６ｄＧ］という結果となった。
【００７１】
酸化的ＤＮＡ損傷は、化学物質や放射線、喫煙、生活習慣などの要因によって起こる生体内酸化ストレスにともなって生じ、発がんを始めとする生活習慣病の発症に関与しているとされる。具体的な酸化的ＤＮＡ損傷として８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ：８−ＯＨ−ｄＧ）が挙げられる。ＤＮＡ中の８−ＯＨ−ｄＧの生成は、ＧＣからＴＡへの突然変異を引き起こす。８−ＯＨ−ｄＧに代表されるＤＮＡの酸化的損傷は細胞の癌化要因の一つとされている。一方、過剰に生成された場合は、癌細胞はその生存がおびやかされる。
【００７２】
Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲを用いて、８−ＯＨｄＧの修復酵素であるｈＯＧＧ１について解析を行った。ｈＯＧＧ１／ＧＡＰＤＨ比は、超常磁性酸化鉄粒子を未処理した時を１．００として相対的評価を行うと、超常磁性酸化鉄粒子１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると、１．００±０．４３、０．９２±０．１９、１．１８±０．３０、１．２１±０．２４となった。促進・抑制効果とも有意差が認められなかった。
【００７３】
次に、ｄＧＴＰはＤＮＡ中のグアニン塩基の原料として、ＤＮＡ複製の時にポリメラーゼが利用する。塩基が酸化されるのはＤＮＡ中の塩基だけではなく、このｄＧＴＰが酸化されることもある。ｄＧＴＰが酸化されると８−オキソグアニンとなる。つまり、８−オキソグアニンとしてポリメラーゼに利用される。８−オキソグアニンはシトシン以外にもアデニンとも対合する。これを阻止するために、酸化されたｄＧＴＰを使えない形にする酵素がある。この酵素はｄＧＴＰをｄＧＭＰに変化させる。ｄＧＭＰにまで変化されると再びｄＧＴＰに戻ることはなく、そのまま排泄される。この働きをする酵素がｈＭＴＨ１である。
Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲを用いて、ｈＭＴＨ遺伝子について解析を行った結果、１．００±０．２３、０．５６±０．１４、０．５７±０．１１、０．４８±０．１４となり超常磁性酸化鉄粒子の添加による抑制効果がｐ＜０．０５の有意差で認められた。
【００７４】
ＤＮＡ中の８−ＯＨｄＧの修復に直接かかわる酵素はＯＧＧ１（８−ＯＨｄＧのＤＮＡグリコシラーゼ）およびヌクレオチドプールの８−ＯＨｄＧＴＰを加水分解する損傷除去酵素ＭＴＨ１が代表的である。
【００７５】
Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲを用いて、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２両者の発現量の定量化を行った。
【００７６】
ＳＯＤは、生体内で生成したＯ２−をＨ２Ｏ２とＯ２を不均一化する酵素でこれにより生体内のＯ２−は低いレベルに保たれている。反応は非常に早く良く拡散律速反応と言われる。すなわち、反応は極めて早く基質であるＯ２−とＳＯＤが出会うと直ちに反応が終了するため、拡散によって基質と酵素がお互い出会う速度が全体の反応をむしろ律速していることになる。ＳＯＤの中で、細胞質にあるＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ（ＳＯＤ１）、ミトコンドリアにあるＭｎ−ＳＯＤ（ＳＯＤ２）について解析を行った。
【００７７】
ＳＯＤ１／ＧＡＰＤＨ比は、超常磁性酸化鉄粒子を未処理した時を１．００として相対的評価を行うと、超常磁性酸化鉄粒子を以下の濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると、１．００±０．２１、０．１６±０．０３、０．２９±０．０６、０．１３±０．０３となり、超常磁性酸化鉄粒子の添加による抑制効果がｐ＜０．０１の有意差で認められた。
【００７８】
次にＳＯＤ２／ＧＡＰＤＨ比は、超常磁性酸化鉄粒子を未処理した時を１．００として相対的評価を行うと、超常磁性酸化鉄粒子を以下の濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬを添加すると、１．００±０．２１、０．１６±０．０３、０．３１±０．０６、０．１４±０．０３となり、超常磁性酸化鉄粒子の添加による抑制効果がｐ＜０．０１の有意差で認められた。
【００７９】
生成されたＲＯＳを取り除く抗酸化酵素として、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）が代表的である。
【００８０】
前記実施例に示したとおり、本発明では、超常磁性酸化鉄粒子は、前立腺癌細胞内でＲＯＳ（活性酸素種）を生成させ、ＤＮＡ損傷を生じる事が明らかになった。それは同粒子が前立腺癌細胞内で、ＤＮＡ損傷修復遺伝子発現の誘導あるいは抑制は無く、損傷除去酵素遺伝子発現の抑制、抗酸化酵素遺伝子発現の抑制によるものである。その結果、抗癌剤ドセタキセルに併用する事により、ドセタキセルの単独使用に比べ、その容量を１／１０量で同等の効果を得る事が出来た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が５ｎｍ〜１０ｎｍである超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤とからなることを特徴とする癌治療用組成物。
【請求項２】
抗癌剤がタキサン系抗癌剤で、且つ、対象となる癌が前立腺癌である請求項１に記載の癌治療用組成物。
【請求項３】
超常磁性酸化鉄粒子がスピネル構造の組成物ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）である請求項１又は２に記載の癌治療用組成物。
【請求項４】
超常磁性酸化鉄粒子が生体適合性の薬剤を用いて分散されている請求項１〜３のいずれかに記載の癌治療用組成物。
【請求項５】
超常磁性酸化鉄粒子のＢＥＴ比表面積が７０〜１８０ｍ２／ｇである請求項１〜４のいずれかに記載の癌治療用組成物。
【請求項１】
平均粒子径が５ｎｍ〜１０ｎｍである超常磁性酸化鉄粒子と抗癌剤とからなることを特徴とする癌治療用組成物。
【請求項２】
抗癌剤がタキサン系抗癌剤で、且つ、対象となる癌が前立腺癌である請求項１に記載の癌治療用組成物。
【請求項３】
超常磁性酸化鉄粒子がスピネル構造の組成物ＭＯＦｅ２Ｏ３（Ｍは２価金属）である請求項１又は２に記載の癌治療用組成物。
【請求項４】
超常磁性酸化鉄粒子が生体適合性の薬剤を用いて分散されている請求項１〜３のいずれかに記載の癌治療用組成物。
【請求項５】
超常磁性酸化鉄粒子のＢＥＴ比表面積が７０〜１８０ｍ２／ｇである請求項１〜４のいずれかに記載の癌治療用組成物。
【公開番号】特開２０１２−１５３６８１（Ｐ２０１２−１５３６８１Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６６７１（Ｐ２０１１−１６６７１）
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（０００１６６４４３）戸田工業株式会社 (406)
【出願人】（５０４１８２２５５）国立大学法人横浜国立大学 (429)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（０００１６６４４３）戸田工業株式会社 (406)
【出願人】（５０４１８２２５５）国立大学法人横浜国立大学 (429)
【Ｆターム（参考）】
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