癌用抗新生血管系調製物
【課題】様々な抗血管新生因子および血管新生に対して直接使用される化学療法薬を提供することを課題とする。
【解決手段】腫瘍関連新生血管系に対する細胞性免疫応答を誘導するための免疫原性組成物であって、前記組成物は、腫瘍関連新生血管系によって発現される抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含む、組成物。
【解決手段】腫瘍関連新生血管系に対する細胞性免疫応答を誘導するための免疫原性組成物であって、前記組成物は、腫瘍関連新生血管系によって発現される抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
癌治療は生物医学の前進にも関わらず依然として取組み甲斐がある。近年、かなりの将来性を示す２つのアプローチ：治療用ワクチンおよび抗血管新生について記載されている。
【背景技術】
【０００２】
治療用ワクチンは、癌性組織が概してある特定の抗原（集約的に腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ））を優先的に発現するという観察に依るものである。ＴｕＡＡとしては、通常癌が由来する組織により選択的に発現されるタンパク質（分化抗原(differentiation antigen)）、発達の種々の段階に関連したタンパク質（腫瘍胎児性抗原および癌−精巣抗原）、異常染色体再配列により創出されるタンパク質、または発癌性ウイルスに由来するタンパク質が挙げられる。次に、腫瘍細胞を死滅させることが可能な、細胞性免疫、特に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激するように意図されるワクチン中の免疫原として、これらのＴｕＡＡ、またはそれらの断片を使用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
抗血管新生アプローチは、腫瘍がその継続性成長を支持するために血液供給を補充することが必要であることを利用する。これを成し遂げるために、腫瘍は、新たな血管の成長を促進する血管新生因子を分泌する。抗血管新生アプローチは、腫瘍の栄養分の供給を崩壊させて、腫瘍を死滅させるか、または少なくとも腫瘍の成長を制限させることにねらいを定めている。このアプローチでの試みは、様々な抗血管新生因子および血管新生に対して直接使用される化学療法薬を探し求めている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書中に開示する本発明は、腫瘍関連新生血管系（ＴｕＮＶ）を標的とする細胞性免疫応答を刺激するように設計した組成物に関する。本発明の一実施形態では、上記組成物はＣＴＬ応答を刺激する。かかる組成物は、標的抗原の１つまたは複数のエピトープを包含し得る。この実施形態のある態様は具体的に、ハウスキーピングエピトープを包含し、別の態様は具体的に、免疫エピトープまたはエピトープクラスターを包含し、別の態様は具体的に、ハウスキーピングおよび免疫エピトープを組み合わせる。
【０００５】
本発明の実施形態は、上記組成物の標的抗原としての、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の使用に関する。この実施形態の態様は、直接ポリペプチドとして、またはエピトープの発現を付与することが可能な核酸として提供される、ＰＳＭＡに由来する様々なエピトープを包含する。他の実施形態は、他のＴｕＮＶ関連抗原の使用に関する。
【０００６】
本発明の他の実施形態では、組成物は、単一配合物または治療方法に両供給源に由来する免疫原を組み合わせることで、癌性細胞により発現されるＴｕＮＶおよびＴｕＡＡの両方に対して誘導される。
【０００７】
本発明の組成物の前臨床評価は、移植ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）から形成される微小血管を保有するＳＣＩＤマウスへの免疫化Ｔ細胞の養子移入を用いて成し遂げることができる。前臨床評価はまた、マウスとヒトとの間で保存されるエピトープから構成される組成物で免疫化したＨＬＡトランスジェニックマウスの使用により成し遂げることができる。
【０００８】
本発明の実施形態は、細胞媒介性免疫を評価する方法に関する。本方法は、免疫不全の哺
乳動物に血管細胞を移植する工程と、上記哺乳動物において免疫応答を確立する工程と、上記哺乳動物における細胞性免疫を判定するための特徴をアッセイする工程とを含み得る。上記細胞性免疫は、例えば、新生血管系抗原に対して誘導され得る。上記新生血管系抗原は、例えば、腫瘍関連新生血管系で優先的に発現され得、また好ましい実施形態では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等であり得る。上記確立する工程は、例えば、上記哺乳動物へのＴ細胞の養子移入により、また上記哺乳動物を抗原と接触させること等により達成され得る。上記細胞性免疫は、細胞傷害性Ｔリンパ球により媒介され得る。上記血管細胞は、例えば、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）、テロメラーゼで形質転換された内皮細胞等のような血管内皮細胞であり得る。上記免疫不全の哺乳動物は、例えば、ＳＣＩＤマウスのようなマウスであり得る。上記特徴づける工程は、例えば、血管形成、血管崩壊、血管密度、および宿主哺乳動物の血液を運搬する血管の比率等のようなパラメータを評価することを含み得る。
【０００９】
本方法は、上記マウスに腫瘍細胞または腫瘍組織を移植する工程をさらに含む。上記特徴づける工程は、例えば、腫瘍の存在、腫瘍成長、腫瘍の大きさ、腫瘍出現の速度、腫瘍樹立を阻害または防止するのに必要とされるワクチンの用量、腫瘍血管形成、および該腫瘍内の壊死組織の比率等のようなパラメータを評価することを含み得る。
【００１０】
本方法は、第１群の哺乳動物および第２群の哺乳動物を供給する工程と、上記第１群において細胞性免疫を確立する工程と、上記第２群において細胞性免疫を差次的に確立する工程と、上記第１群の哺乳動物から得られる結果を、上記第２群の哺乳動物から得られる結果と比較する工程とをさらに含み得る。上記第１群の上記細胞性免疫は、例えば、ナイーブ免疫および無関係エピトープに対する免疫等を含み得る。
【００１１】
他の実施形態は、細胞性免疫を評価する方法に関し、新生血管系抗原に対して誘導される免疫を含む。本方法は、ＭＨＣトランスジェニック哺乳動物にＭＨＣトランスジェニック腫瘍細胞を移植または注射する工程と、上記哺乳動物において免疫応答を確立する工程と、上記哺乳動物における細胞性免疫を判定するための特徴をアッセイする工程とを含み得る。上記ＭＨＣトランスジェニック哺乳動物は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック哺乳動物のようなＨＬＡトランスジェニック哺乳動物であり得る。好ましい実施形態では、上記哺乳動物はマウスであり得る。上記細胞性免疫は、ワクチン接種により確立され得、好ましい実施形態では、上記ワクチン接種は、例えば、上記腫瘍細胞の移入の前に、移入と同時に、または移入後に行われ得る。好ましい実施形態では、上記細胞性免疫は、細胞傷害性Ｔリンパ球により媒介され得る。上記新生血管系抗原は、腫瘍関連新生血管系により優先的に発現され得、また腫瘍関連抗原でもあり得る。好ましくは、上記抗原は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインであり得る。上記特徴づける工程は、例えば、腫瘍の存在、腫瘍成長、腫瘍の大きさ、腫瘍出現の速度、腫瘍樹立を阻害または防止するのに必要とされるワクチンの用量、腫瘍血管形成、該腫瘍内の壊死細胞の比率等を含むパラメータを評価することを含み得る。本方法は、第１群の哺乳動物および第２群の哺乳動物を供給する工程と、上記第１群において細胞性免疫を確立する工程と、上記第２群において細胞性免疫を差次的に確立する工程と、上記第１群の哺乳動物から得られる結果を、上記第２群の哺乳動物から得られる結果と比較する工程とをさらに含み得る。上記第１群の上記細胞性免疫は、ナイーブ免疫、無関係エピトープに対する免疫等を含み得る。
【００１２】
さらなる実施形態は、腫瘍関連新生血管系により差次的に発現される抗原に対して誘導される細胞性免疫応答を誘発するように哺乳動物を免疫化する工程を含む、腫瘍性疾患を治療する方法に関する。上記差次的に発現される抗原は、例えば、前立腺特異的膜抗原、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等のようなタンパク質であり得る。他の好ましい実施形態では、上記抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインであり得る。上記免疫化は、例えば、上記タンパク質の配列に由来する少なくとも１つのペプチド、上記タンパ
ク質またはペプチドの発現を付与することが可能な核酸等を用いて実施され得る。上記少なくとも１つのペプチドは、例えば、ハウスキーピングエピトープを含み得、好ましい実施形態では、上記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端であり得る。本方法は、免疫エピトープを含む少なくとも１つのさらなるペプチドをさらに含み得る。本方法は、上記哺乳動物が癌性細胞に対して直接的に活性な抗腫瘍療法で治療されるさらなる工程を含み得る。上記抗腫瘍療法は、腫瘍関連抗原に対する免疫化であり得る。好ましくは、上記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含み得る。
【００１３】
他の実施形態は免疫学的組成物に関する。免疫学的組成物は、腫瘍関連新生血管系により発現される抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含み得、上記組成物は、細胞性免疫応答を誘発することができる。上記免疫原は、レシピエントと同種の細胞に関連しない免疫原であり得る。上記抗原は、例えば、前立腺特異的膜抗原、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等のようなタンパク質であり得る。他の好ましい実施形態では、上記抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインであり得る。上記免疫原は少なくとも１つのペプチドを含み得る。上記組成物は、上記抗原の発現を付与することが可能な核酸を含み得、上記抗原はタンパク質またはペプチドである。上記組成物は、ハウスキーピングエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含み得、また好ましい実施形態では、上記少なくとも１つのペプチドは、上記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端であり得る。また、上記組成物は、免疫エピトープを含む少なくとも１つのペプチドをさらに含み得る。上記組成物は、腫瘍関連抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含み得る。好ましい実施形態では、上記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含み得る。
【００１４】
実施形態は、抗腫瘍ワクチン設計の方法に関する。本方法は、腫瘍関連新生血管系により差次的に発現される抗原を同定する工程と、上記抗原の構成成分をワクチンに組み込む工程とを含み得る。上記構成成分は、例えば、上記抗原のポリペプチド断片、上記抗原または上記抗原の断片をコードする核酸等を含み得る。
【００１５】
さらなる実施形態は、研究モデルを作製する方法に関する。本方法は、免疫不全の哺乳動物に血管細胞および腫瘍細胞を移植することを含み得る。上記腫瘍細胞および血管細胞は、互いに隣接して移植され得る。上記血管細胞は、例えば、ＨＤＭＥＣのような血管内皮細胞であり得る。好ましい実施形態では、上記血管内皮細胞はテロメラーゼで形質転換され得る。上記免疫不全の哺乳動物は、例えば、ＳＣＩＤマウスのようなマウスであり得る。
【００１６】
他の実施形態は、研究モデルに関する。上記研究モデルは、免疫不全の哺乳動物を含み得る。上記哺乳動物は、移植血管細胞および移植腫瘍細胞を含み得る。上記血管細胞および上記腫瘍細胞は互いに隣接して移植され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ＰＳＭＡ163-192プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図１Ｂ】ＰＳＭＡ163-192プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図１Ｃ】ＰＳＭＡ163-192プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図２】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ168-177、およびＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ288-297に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図３】ＰＳＭＡ281-310プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図４】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ461-469、ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ460-469、およびＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ663-671に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図５】ＰＳＭＡ463-471反応性ＨＬＡ−Ａ１+ＣＤ８+Ｔ細胞を検出する（γ）−ＩＦＮベースのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。
【図６】ＨＬＡ−Ａ１制限認識を実証する、抗ＨＬＡ−Ａ１ｍＡｂによる図１０で使用されるＴ細胞の反応性の阻止を示す図である。
【図７】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ663-671に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図８】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ662-671に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図９】ＥＤ−Ｂ ２９−３８ペプチドで免疫化したＨＨＤ−Ａ２マウスからのＣＴＬによるエピトープ特異的溶解を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中に開示する本発明の実施形態は、組成物、組成物またはワクチンの設計の方法、および腫瘍の新生血管系に対して誘導される細胞性免疫応答、好ましくはＴ細胞応答、より好ましくはＣＴＬ応答の生成に関する治療方法を提供する。かかる方法および組成物は、癌の治療および防止に特に有用である。他の実施形態は組成物評価モデルに関する。
【００１９】
組成物、組成物設計、および組成物を用いた治療
本発明の実施形態は、腫瘍新生血管系（ＴｕＮＶ）に対して誘導される細胞性免疫応答、特にＴ細胞応答、具体的にＣＴＬ応答の生成のための、ワクチンを含む免疫学的組成物に関する。「腫瘍新生血管系」は、広範囲に、腫瘍塊中またはその周辺に見られる任意の血管系、腫瘍成長を支持するか、またはそれに必要な血管系等を包含することを意味する。本明細書中の論考は、概して腫瘍および腫瘍新生血管系について言及するが、本発明の実施形態はまた、不適切な血管新生に関連した他の状態または病状に適用することができることを留意すべきであり、このことを当業者は理解されよう。
【００２０】
これまで、抗腫瘍ワクチンの設計は、悪性細胞自体により発現される抗原に集中してきた。しかしながら、大きな腫瘍は複雑な構造であり、単に細胞の均質塊ではない。すべての細胞、特に迅速に成長する細胞は、栄養分（酸素、グルコース、アミノ酸等）の供給、ならびに代謝的に活性でありかつ無傷のままであるための代謝廃棄物除去の手段を必要とする。これは通常、身体の様々な器官からの血液およびリンパの流れにより達成される。細胞レベルでは、身体の組織は、毛細血管（そこから栄養分および廃棄産物が拡散により周辺細胞と交換され得る小血管）の微細ネットワークにより浸透される。拡散は比較的短距離に有効である。毛細血管床が広範囲であるため、概して細胞はせいぜい毛細血管から数細胞離れたところに位置されるにすぎない。腫瘍が単にその悪性細胞の繁殖により成長する場合、塊の内部のこれらの細胞はすぐに自分自身を支えることが不可能となる。実際に、血管新生化していない腫瘍の内部は壊死組織を含有することが多い。したがって、無抑制で成長するために、腫瘍は、新たな血管の内部成長を促進する因子、すなわちＴｕＮＶを分泌する。ＴｕＮＶは壊死組織を他の組織と区別する抗原を発現するため、癌性細胞自体を直接標的とする代わりに、ＴｕＮＶに対して誘導される治療用組成物で癌を治療することができる。適切なＴｕＮＶ抗原は、例えば概して新生血管系で、またはＴｕＮＶにより優先的に発現されるものを包含し得る。
【００２１】
本発明の幾つかの実施形態では、上記組成物は、例えばエピトープペプチド（単数または複数）を包含することができる。エピトープクラスターおよびタンパク質断片に包埋された免疫エピトープを提供してもよい。適正なＣ末端を有するハウスキーピングエピトープを提供することができる。本発明の他の実施形態では、上記組成物は、例えばｐＡＰＣ上でのこれらのエピトープの発現を付与することが可能な核酸を含むことができる。
【００２２】
好ましい実施形態では、上記組成物は、治療される哺乳動物のリンパ系に直接投与することができる。このことは、ポリペプチドおよび核酸両方のベースの組成物に適用させることができる。このタイプの投与方法および関連技術は、１９９９年９月１日に出願された米国特許出願第０９／３８０，５３４号、および２００１年２月２日に出願されたそれらの一部継続出願である米国特許出願第０９／７７６，２３２（ともに、「ＣＴＬ応答を誘導する方法(A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE)」という表題）に開示されている。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明の組成物の作用による腫瘍中の血管の崩壊により、腫瘍中の細胞すべてを排除することができる。しかしながら、微小転移巣を含む小腫瘍は通常血管新生化されない。さらに、代わりとして腫瘍塊に浸透するチャネルを介した血流に依ると思われる血管新生化されていない腫瘍が報告されている(Maniotis, A.J., et al. Am. J. Pathol. 155: 739-752, 1999)。したがって、他の実施形態では、上記組成物は概して、癌細胞すべてを根絶し得ない腫瘍制御剤として有効である。したがって、本発明は、腫瘍を排除するため、腫瘍成長を制御するため、腫瘍組織量を減少させるため、臨床状態全体を改善するため等のツールを提供する。幾つかの実施形態では、癌性細胞を直接標的とする他の治療とこれらの組成物を組み合わせることが望ましい場合もある。さらに、内皮細胞および癌細胞の両方から構成される腫瘍中の血管系は本質的にモザイクであり得る証拠が存在する(Chang, Y.S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:14608-14613, 2000)。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、組成物治療行程の後に生物または化学療法剤の投与を行うことができる。特に好ましい実施形態では、治療は、抗ＴｕＮＶ組成物の投与と同時に、またはその後に、ＴｕＡＡ指向性組成物を投与することを包含することができる。
【００２４】
上述のように、組成物に適切なＴｕＮＶ抗原は、例えば概して新生血管系で、またはＴｕＮＶにより優先的に発現されるものを包含することができる。ＴｕＡＡを発見するための様々な技法が当該技術分野で既知である。これらの技法の例としては、ディファレンシャルハイブリダイゼーションおよびサブトラクティブハイブリダイゼーション（マイクロアレイの使用を含む）、発現クローニング、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の段階解析）、ＳＥＲＥＸ（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＴ、免疫組織化学（ＰＳＭＡの場合のような）、ＥＳＴ解析、バルク組織、切片組織、および／または顕微解剖組織の種々の使用等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法および他の方法の利用は、免疫学的組成物の抗原として使用され得る標的細胞内に含まれる遺伝子および遺伝子産物を同定するのに必要な技法を当業者に提供する。その技法は、標的細胞が癌細胞であるか、または内皮細胞であるかどうかに関わらず、ＴｕＡＡ発見に適用可能である。任意の同定された抗原をエピトープに関して精査することができ、それを本発明の実施形態に使用することができる。
【００２５】
血管系の内層を構成する内皮細胞は、ハウスキーピングプロテアソームを発現することができる。したがって、内皮細胞を標的とする組成物は、ハウスキーピングプロテアソームの消化産物に相当するペプチド（すなわち、ハウスキーピングエピトープ）、またはペプチドの発現を付与する核酸から構成され得る。免疫系の活性化細胞により分泌されるＩＦＮ−γ（ガンマ）は、標的細胞中の免疫プロテアソームの発現を誘発することができる。一般に、免疫プロテアソームは、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）において構成的である。したがって、標的細胞が内部に存在する状態に関わらず、標的細胞を認識することが可能なＣＴＬが確実に存在するために、ＣＴＬ誘発組成物中に免疫エピトープまたはエピトープクラスターを包含することが有用であり得る。これは、抗原提示機能を容易に呈する内皮細胞を用いた場合に特に真実であり得る。これらの概念は、２０００年４月２８日に出願された米国特許出願第０９／５６０，４６５号、２００１年１１月７日に出願された同第１０／００５，９０５号、およびその継続出願である２００１年１２月７日に出願された米国特許出願第 号（代理人整理番号ＣＴＬＩＭＭ．２１ＣＰ１Ｃ）（
これらはそれぞれ、「抗原提示細胞におけるエピトープ同調(EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS)」という表題である）により詳細に説明されている。
【００２６】
上述のように、免疫学的組成物（好ましい実施形態ではワクチンを含む）は、例えばＴｕＮＶ抗原およびエピトープを含むことができる。エピトープは、１つまたは複数のハウスキーピングエピトープおよび／または１つまたは複数の免疫エピトープを含むことができる。上記組成物に有用な特定エピトープは、２０００年４月２８日に出願された「エピトープ発見方法(METHOD OF EPITOPE DISCOVERY)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，０７４号に開示される方法を用いて同定することができる。例えば、幾つかのＭＨＣ制限要素に結合することが既知であるか、またはそれが予測されるペプチド配列を、共通Ｃ末端であるものを同定するために、プロテアソーム消化により産生される断片と比較することができる。
【００２７】
ＥＤ−ＢおよびＰＳＭＡのエピトープを含む本発明の実施形態のための有用なエピトープの例は、２００２年３月７日に本出願と同日付けで出願された「エピトープ配列(EPITOPE
SEQUENCES)」という表題の米国仮特許出願第 号（代理人整理番号ＣＴＬＩＭＭ．０２７ＰＲ）、ならびにそれぞれ「エピトープ配列(EPITOPE SEQUENCES)」という表題の２００１年４月６日に出願された出願番号第６０／２８２，２１１号、および２００１年１１月７日に出願された出願番号第６０／３３７，０１７号の２つの米国仮特許出願に開示されている。これらの出願はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２８】
ＰＳＭＡは、幾つかの実施形態で標的とされ得るＴｕＡＡの一例である。ＰＳＭＡは、ほとんどの腫瘍型の新生血管系で発現されるが、正常組織の血管内皮によって発現されない(Chang, S.M. et al., Cancer Res. 59(13):3192-8, 1999; Clin Cancer Res. 10:2674-81, 1999)。ＰＳＭＡは膜抗原であり、したがって、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によりＰＳＭＡ発現ＴｕＮＶを攻撃することが可能であり得る。しかしながら、癌治療におけるｍＡｂの有効性は、当初予想されていたよりも困難であることが証明されている。さらに、他の抗原がＴｕＮＶに関連することが発見されているように、抗原の多くは血管系表面で発現されないことが証明され、抗原をｍＡｂ攻撃しにくいようにしている。
【００２９】
他方で、Ｔ細胞、特にＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）制限抗原提示の過程により細胞の内部構成成分の発現を監視する。Ｔ細胞活性化ワクチンおよび自己抗原に対する組成物の有効性を判定するためのパラメータは難解である。適切なエピトープ選択に関する重要な特徴およびパラメータの幾つかは、２００１年４月２８日に出願した「抗原提示細胞におけるエピトープ同調(EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS)」という表題の米国特許出願第０９／５６０，４６５号、２００１年４月２８日に出願された「エピトープ発見方法(METHOD OF EPITOPE DISCOVERY)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，０７４号、および２００１年４月２８日に出願された「エピトープクラスター(EPITOPE CLUSTERS)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，５７１号に開示されている。エピトープ同調を促進するＤＮＡワクチン設計の特徴は、２００１年４月２８日に出願された「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，５７２号、および２００１年１１月７日に出願された「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクターおよびそれらの設計方法(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN)」という表題の米国仮出願第６０／３３６，９６８号に開示されている。ワクチン送達の特に有効な手段は、１９９９年９月１日に出願された米国特許出願第０９／３８０，５３４号、およびその一部継続出願である２００１年２月２日に出願された米国特許出願第０９／７７６，２３２号（ともに、「ＣＴＬ応答を誘導する方法(A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE)」という表題）に記載されている。上述の参照文献はそれぞれ、その全体が参
照により本明細書に援用される。
【００３０】
実施形態で使用することができるＴｕＮＶ抗原の別の例は、フィブロネクチン、好ましくはＥＤ−Ｂドメインである。フィブロネクチンは、発生上調節性の選択的スプライシングを受け、ＥＤ−Ｂドメインは主に癌胎児性組織で使用される単一エクソンによりコードされる。Matsuura, H. and S. Hakomori Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6517-6521, 1985; Carnemolla, B. et al. J. Cell Biol. 108:1139-1148, 1989; Loridon-Rosa, B. et al. Cancer Res. 50:1608-1612, 1990; Nicolo, G. et al. Cell Differ. Dev. 32:401-408, 1990: Borsi, L. et al. Exp. Cell Res. 199:98-105, 1992; Oyama, F. et al. Cancer Res. 53:2005-2011, 1993; Mandel, U et al. APMIS 102:695-702, 1994; Farnoud, M.R. et al. Int. J. Cancer 61:27-34, 1995; Pujuguet, P. et al. Am. J. Pathol. 148:579-592, 1996; Gabler, U. et al. Heart 75:358-362, 1996; Chevalier, X. Br. J. Rheumatol. 35:407-415, 1996; Midulla, M. Cancer Res. 60:164-169, 2000。
【００３１】
ＥＤ−Ｂドメインはまた、新生血管系のフィブロネクチンでも発現される。Kaczmarek, J. et al. Int. J. Cancer 59:11-16, 1994; Castellani, P. et al. Int. J. Cancer 59:612-618, 1994; Neri, D. et al. Nat. Biotech. 15:1271-1275, 1997; Karelina, T.V. and A.Z. Eisen Cancer Detect. Prev. 22:438-444, 1998; Tarli, L. et al. Blood 94:192-198, 1999; Castellani, P. et al. Acta Neurochir. (Wien) 142:277-282, 2000。癌胎児性ドメインとして、ＥＤ−Ｂドメインは、ＴｕＮＶにより発現されるほかに、腫瘍性細胞により発現されるフィブロネクチンで一般に見出される。したがって、ＥＤ−Ｂドメインを標的とするＣＴＬ誘発性組成物は、２つの作用機序：腫瘍細胞の直接溶解、およびＴｕＮＶの崩壊による腫瘍血液供給の崩壊を示すことができる。
【００３２】
フィブロネクチンＥＤ−Ｂドメインの発現が腫瘍関連新生血管系および正常新生血管系の両方で報告されている(Castellani, P. et al. Int. J. Cancer 59:612-618, 1994)ことに留意すべきである。したがって、フィブロネクチンＥＤ−Ｂドメイン、または同様に発現される抗原に基づく組成物は、不適切な血管新生に関連した他の状態に対して有効であり得る。さらに、この組成物を使用中止した後に、ＣＴＬ活性がすぐに減衰しうるため、正常な血管新生の妨害を最低限にすることができる。
【００３３】
免疫原組成物に関する他の標的としては、成長因子受容体（血管細胞と関連したものを含む）が挙げられる。かかる例の１つは、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）である。米国特許第６，３４２，２２１号には、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２の論考が含まれている。血管細胞と関連した任意の他の抗原またはタンパク質（現在既知であるもの、およびまだ同定されていないものを含む）が免疫原組成物に対する標的であり得ることは当業者に理解されよう。
【００３４】
動物モデル、モデルの作製方法、および組成物評価
上述の考察に基づいて設計される組成物は、様々な標的に対して有効である。しかしながら、さらなる評価は、いかなるときでも、しかし好ましくは前臨床環境で容易に実行することができる。例えば、かかる評価は、組成物設計をさらに助長するために使用することができる。本発明の他の実施形態は、免疫原組成物を評価する方法に関する。本発明の組成物は、組成物評価用の動物モデルを用いて、当業者が容易に評価することができる。例えば、以下のルーチンな手順に従って、当業者はＴｕＮＶ組成物を迅速かつ効率的に評価することができる。したがって、本明細書中に記載するモデルまたは手引きを用いて、当業者は、ほとんどまたは全く実験なしで任意のＴｕＮＶ抗原に関して任意のＴｕＮＶ組成物を評価することができる。さらなる実施形態は、動物研究モデルを作製する方法に関する。他の実施形態は、研究モデル動物に関する。これらの実施形態は以下でより詳細に記載する。
【００３５】
異種移植ヒト血管系ベースのモデル
実施形態によっては、ヒト微細血管形成のメカニズムを研究するためのモデル系に関するものもある。例えば、幾つかの実施形態では、モデル系は組成物の前臨床評価に使用することができる。モデルは、ＳＣＩＤマウスへの、ＭＡＴＲＩＧＥＬ(Becton Dickinson)と混合したテロメラーゼ形質転換ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の皮下移植を含む。テロメラーゼ形質転換ＨＣＭＥＣの皮下移植は、Yang, J. et al. Nature Biotech 19:219-224, 2001に記載されている。本発明の組成物により活性化されるＴ細胞を、例えばかかる移植マウスに養子移入させることができ、かかるヒト微小血管を破壊するか、またはその形成を防止するＴ細胞の能力を評価することができる。他の実施形態では、マウスに直接ワクチン接種して評価することができる。また、さらなる実施形態では、モデル系は、他の種由来のＤＭＥＣおよび種適合性テロメラーゼを置換することで、およびヒト系に関して以下に記載するものに類似した試薬を用いることで、非ヒト種で有効な組成物を試験するのにさらに適応させることができる。
【００３６】
試験される組成物のエピトープを提示するＭＨＣ制限要素は、好ましくは、マウスに移植されたＨＤＭＥＣ系によって共有される。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化により、またはＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化（この手順は当業者に既知であり、その例は上記の援用される特許出願において提供される）により得ることができる。ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて生成されるＴ細胞の使用により、養子移入されるＴ細胞と宿主との間の遺伝的背景の適合が可能となり、それにより結果の解釈を複雑にし得る同種異系または異種反応の可能性を低減させる。しかしながら、利用可能なマウス系統に応じて、これは、同じ遺伝的背景上でＨＬＡ導入遺伝子およびＳＣＩＤ表現型を獲得するために交雑させることが必要であり得る。代替的には、所望の集団を富化するために、またはクローンを樹立するために、１回または複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を、ドナーＴ細胞（ヒトまたはマウス）に施すことができ、それにより望ましくない反応性を同様に回避する。
【００３７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化のための技法は、当業者で既知である（例えば、Stauss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992; Salgaller et al. Cancer Res. 55:4972-4979, 1995; Tsai et al., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997; およびChung et al., J. Immunother. 22:279-287, 1999)。ｉｎ ｖｉｖｏであってもｉｎ ｖｉｔｒｏであっても、いったん生成されれば、十分数のかかるＴ細胞は、本発明の組成物および／またはサイトカイン（例えば、Kurokawa, T. et al., Int. J. Cancer 91:749-746, 2001を参照)または他の分裂促進因子を用いた刺激によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることで得ることができる。これらのＴ細胞は、１つまたは複数のエピトープを認識するクローンまたはポリクローナル集団を構成することができる。好ましい実施形態では、およそ１０5〜１０8個程度の細胞が、マウスにおける養子移入実験のために移入される（例えば、Drobyski, W.R. et al. Blood 97:2506-2513, 2001; Seeley B.M. et al. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124:436-441, 2001; Kanwar, J.R. et al. Cancer Res. 61: 1948-1956, 2001を参照）。クローンおよびそうでなければより富化された集団は、一般により少数の細胞の移入を必要とする。
【００３８】
Ｔ細胞の移入は、ＨＤＭＥＣの移植または樹立の直前に、それと同時に、またはその後に行うことができる。組成物の有効性を評価するために評価することができるパラメータとしては、血管形成、血管密度の変化、およびマウス血液を運搬する能力（Yang等に記載されるような）等が挙げられる。評価は、テロメラーゼ形質転換ＨＤＭＥＣの移植後の１週間程度の初期に、かつ少なくとも６週間程度の長さで、好ましくは２週間後に、およびＴ細胞移植の１日〜６週間後に、好ましくは１〜３週間後に実施することができる。一般に、評価は、ナイーブ（偽免疫化を含む）または無関係エピトープ反応性Ｔ細胞を施したマ
ウスと、標的抗原と反応性を有するＴ細胞を施したマウスとの比較を包含することができる。
【００３９】
関連抗原は、概して新生血管系で、またはＴｕＮＶにより優先的に発現され得る。発現は、免疫組織化学およびＲＴ−ＰＣＲを含む当該技術分野で既知の様々な技法により確認することができる。例えば、腫瘍細胞をＨＤＭＥＣと一緒に移植することができる。これは、ＴｕＮＶにより優先的に発現される抗原の発現を誘発するという結果をもたらすことができる。一例では、これは、ＨＤＭＥＣ含有ＭＡＴＲＩＧＥＬ移植片に隣接して一塊の腫瘍組織を移植することにより、移植片部位に腫瘍細胞を注射することにより、ＨＤＭＥＣ含有ＭＡＴＲＩＧＥＬ移植片に隣接して腫瘍細胞含有ＭＡＴＲＩＧＥＬを移植することにより、腫瘍細胞およびＨＤＭＥＣの両方を同じＭＡＴＲＩＧＥＬ移植片に組み込むことにより、あるいは任意の他の適切な方法により成し遂げることができる。上述のように、幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は血管細胞と一緒に移植することができる。こうして作製された動物は、研究モデルとして使用することができる。さらなる変形形態は当業者に明らかであろう。
【００４０】
ＨＬＡトランスジェニック動物モデル
ヒトとモデル種との間で、配列および／または発現プロフィールにおいて保存される抗原に関して、ＨＬＡトランスジェニック系統により別のアプローチ、すなわち同系腫瘍に対抗するためのモデル動物のワクチン接種が可能である。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインは、それが血管新生のマーカーであり、またヒトおよびマウスの両方において同一のアミノ酸配列を有するため、かかる機会を提供する(Nilsson, F. et al. Cancer Res. 61:711-716, 2001)。さらに、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの系統由来の自発性腫瘍組織を単離および繁殖させた。エピトープ発見および選択、ならびにＣＴＬ誘発性組成物に関する組成物設計および送達については上述されている。
【００４１】
腫瘍細胞系であるＭ１は、自発性唾液腺嚢胞腺癌に由来するものである。Ｍ１腫瘍細胞系およびこれの使用方法は、「ＨＬＡトランスジェニックマウス腫瘍細胞系(AN HLA-TRANSGENIC MURINE TUMOR CELL LINE)」という表題の２００１年３月７日に、本出願と同日付けで出願された米国仮出願第 号、代理人整理番号ＣＴＬＩＭＭ．０２８ＰＲに開示されている。腫瘍細胞系は、S. Pascolo他(J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997)のＨＨＤ−Ａ２トランスジェニックマウス系統の個体で発生することができる。これらのマウスは、ヒトβ（ベータ）２−ミクログロブリンを含む１つの単鎖クラスＩ分子、ならびにマウスクラスＩ分子Ｈ２Ｄbに由来する分子と平衡を保ったＨＬＡ−Ａ２．１のα１（アルファ−１）、およびα２（アルファ−２）ドメインを発現する。腫瘍塊を、通常１〜３週間以内に、腫瘍が再成長する新たな個体に移植することができ、３ｍｍの塊は３ｃｍにまで成長する。あるいは、腫瘍組織を分解して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させることができる。収集時に、腫瘍細胞を頸部または腹部に皮下注射（１〜３日連日で２．５×１０6個の細胞）することができ、初期継代細胞に関してはおよそ５〜１２週間のうちに目に見える腫瘍を生じることができる。細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで成長するのにより良好に適応されるようになった後、１×１０6個〜１×１０7個の細胞の単回注射により１０日のうちに目に見える腫瘍がもたらせる。一般に、初期腫瘍は唾液腺の付近で一貫して出現するが、二次腫瘍はまた、様々な場所（腎臓、肺、肝臓および腹筋を含む）にも出現することができる。
【００４２】
組成物の有効性を評価するために、組成物の予測メカニズムに応じて、腫瘍の樹立前に、それと同時に、またはその後に組成物を投与することができる。幾つかの種類の減量技法（例えば、手術）とともに使用されることを意図した治療用組成物に関しては、同時投与が適切であり得る。治療が始まる前に腫瘍がより良好に樹立されるほど、試験はより厳しくなる。
【００４３】
両方の動物評価モデルについて、ヒト組成物の試験に関して記載してきた。しかしながら、獣医学的組成物の用途は類似しており、種適合性内皮細胞、ＭＨＣ、ＴｕＡＡ等の置換を要するだけである。
【００４４】
以下の実施例は単なる説明の目的を意図しており、いかなる場合でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４５】
本明細書中に開示するすでに同定した抗原ＰＳＭＡおよびＥＤ−Ｂを用いて前臨床研究を実施した。研究結果より、優れた候補エピトープが明らかとなった。以下の表９を参照されたい。
【００４６】
実施例１．１
クラスター解析（ＰＳＭＡ163-192）
前立腺特異的膜抗原由来のＡ１エピトープクラスターであるＰＳＭＡ168-190（配列番号４）を含有するペプチドＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭ、すなわちＰＳＭＡ163-192（配列番号３）を、４３３Ａ ＡＢＩペプチド合成機により標準的な固相Ｆ−ｍｏｃ化学を用いて合成した。側鎖の脱保護および樹脂からの切り出しの後、まずギ酸中に溶解した後、３０％酢酸に希釈したペプチドを、以下の条件：４ｍｌ／分の流速で線形ＡＢ勾配（５％ Ｂ／分）（ここで、溶離液Ａは０．１％ＴＦＡ水であり、溶離液Ｂはアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡである）で、逆相分取ＨＰＬＣ Ｃ４カラムに流した。質量解析法により判断される場合の予測ペプチドを含有する１６．６４２分の時点の分画をプールして、凍結乾燥した。次に、本質的に上述に記載するように、ペプチドをプロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表１にまとめる。
【００４７】
【表１】
【００４８】
Ｎ末端プール配列解析
プロテアソーム消化の１時間の時点でのアリコット１つを、ＡＢＩ ４７３Ａタンパク質シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)によるＮ末端アミノ酸配列解析に付した。切断部位および切断効率の決定は、配列サイクル、タンパク質シーケンサーの反復収率、および解析配列中に特有のアミノ酸の相対収率に基づいていた。すなわち、特有の（解析配列中で）残基Ｘがｎ番目のサイクルのみに見られる場合、切断部位は、Ｎ末端方向でその前のｎ−１残基に存在する。配列に対する質量の帰属における任意の多義性を解析するのを助長するほかに、これらのデータはまた、質量解析法よりも、様々な断片の相対収率のより信頼性の高い指標を提供する。
【００４９】
ＰＳＭＡ163-192（配列番号３）に関して、このプールシーケンシングは、Ｖ177および幾つかの少量の切断部位後に、特にＹ179の１つ後に単一の主要切断部位を支持する。図１Ａ〜図１Ｃに呈示した結果を参照することにより、以下の：
基質のＮ末端の存在を示す３番目のサイクルのＳ、
基質のＮ末端の存在を示す５番目のサイクルのＱ、
Ｖ177後の切断を示す１番目のサイクルのＮ、
Ｖ175後の切断を示す３番目のサイクルのＮ（表１中の断片１７６−１９２に留意されたい）、
Ｖ177後の切断を示す５番目のサイクルのＴ、
Ｒ181、Ａ180、およびＹ179後のますます共通の切断を示す１〜３番目のサイクルのＴ（これらの最後のみが質量解析法により検出されるピークに相当する、１６３−１７９および１８０−１９２、表１参照。他のものの非存在は、それらが質量スペクトルで検査されたものよりも小さな断片上に存在することを示し得る）、
それぞれ、Ｅ183、Ｙ179、およびＶ177後の切断を示す４番目、８番目、および１０番目のサイクルのＫ（それらはすべて、質量解析法により観察される断片に相当する、表１参照）、
それぞれ、基質のＮ末端の存在、およびＶ177後の切断を示す１番目、および３番目のサイクルのＡ、
基質のＮ末端の存在を示す４番目、および８番目のサイクルのＰ、
基質のＮ末端の存在を示す６番目、および１０番目のサイクルのＧ
基質のＮ末端の存在、および／またはＦ185後の切断を示す７番目のサイクルのＭ、
Ｖ177後の切断を示す１５番目のサイクルのＭ、
Ｄ191後の切断を示すことができる１番目サイクル（表１参照）、
Ｖ177後の切断を示す４番目、および１３番目のサイクルのＲ、
Ｙ179後の切断を示す２番目、および１１番目のサイクルのＲ、
それぞれ、Ｖ175、Ｍ169後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す２番目、６番目、および１３番目のサイクルのＶ（表１の１７６および１７０から開始する断片に留意されたい）、
それぞれ、Ｖ175、Ｖ177後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す１番目、２番目、および１４番目のサイクルのＹ、
それぞれ、Ｖ177後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す１１番目、および１２番目のサイクルのＬ、
が明らかであり、他のデータとほとんど一致する解釈である。質量解析法の結果を比べることにより、２番目、５番目、および９番目のサイクルのＬは、それぞれＦ186、Ｅ183、またはＭ169、およびＹ179の切断と一致することがわかる。表１を参照されたい。
【００５０】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共通Ｃ末端の断片をさらなる解析のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ：
ＨＬＡ−Ａ２．１への候補エピトープＰＳＭＡ168-177、すなわちＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶ（配列番号６）の結合を、Stauss他の方法(Proc Natl Acad Sci USA 89(17):7871-5(1992))の変更形態を用いてアッセイした。具体的には、表面上でＭＨＣ分子を発現しないか、または不安定なＭＨＣ分子を発現するＴ２細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で２度洗浄し、３μｇ／ｍｌのヒトβ２ミクログロブリン(Sigma, St. Louis, MO)を補充し、かつ８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、および６．２５μｇ／ｍｌのペプチドを添加した無血清ＡＩＭ−Ｖ培地(Life Technologies社、 Rockville, MD)中で、３×１０5個の細胞／２００μｌ／ウェルにて９６ウェル平底プレート中で一晩培養した。再度ピペットで取ることによりペプチドを細胞と混合した後、プレートに分布させ（あるいはペプチドを個々のウェルに添加することができる）、プレートを２分間穏やかに振った。３７℃にて５％ＣＯ2インキュベータ中でインキュベーションを行った。翌日、無血清ＲＰＭＩ培地で２度洗浄することにより未結合ペプチドを除去し、飽和量の抗クラスＩ ＨＬＡモノクローナル抗体であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＨＬＡ Ａ２，Ａ２８(One Lambda, Canoga Park, CA)を添加した。４℃で３０分間インキュベーションした後、０．５％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４〜７．６）（染色緩衝液）で細胞を３回洗浄した（あるいは、Ｗ６／３２(Sigma)を、抗クラスＩ ＨＬＡモノクローナル抗体として使用し
、細胞を染色緩衝液で洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギＦ（ａｂ'）抗マウスＩｇＧ(Sigma)とともに４℃で３０分間インキュベートし、前述通りに３回洗浄することができる）。細胞を染色緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁させた。ペプチド結合により安定化される表面ＨＬＡ−Ａ２．１分子の解析を、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いてフローサイトメトリーにより実施した。フローサイトメトリーが即時に実施されない場合、１／４量の２％パラホルムアルデヒドを添加して、暗所で４℃にて保管することで細胞を固定することができる。
【００５３】
図２に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチドよりも一層低い濃度で有意な結合を示す。このアッセイで（および本開示全体にわたって）対照として使用したＭｅｌａｎ−ＡペプチドであるＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１０６）は、実際には自然配列（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号１０７）の変異体であり、このアッセイで高親和性を示す。既知のＡ２．１結合物質であるＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（ＨＢＶ18-27、配列番号１０７）もまた、陽性対照として使用した。ＨＬＡ−Ｂ４４結合ペプチドであるＡＥＭＧＫＹＳＦＹ（配列番号１０９）は、陰性対照として使用した。陰性対照から得られる蛍光は、ペプチドをアッセイで使用しなかった場合に得られるシグナルと類似していた。陽性および陰性対照ペプチドは、Current Protocols in Immunology p.18.3.2, Johon Wiley and Sons, New York, 1998の表１８．３．１から選択した。
【００５４】
実施例１．２
クラスター解析（ＰＳＭＡ281-310）
前立腺特異的膜抗原由来のＡ１エピトープクラスターであるＰＳＭＡ283-307（配列番号１９）を含有する別のペプチドＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧ、すなわちＰＳＭＡ281-310（配列番号１８）を、４３３Ａ ＡＢＩペプチド合成機により標準的な固相Ｆ−ｍｏｃ化学を用いて合成した。側鎖の脱保護および樹脂からの切り出しの後、ｄｄＨ２０中のペプチドを、以下の条件：４ｍｌ／分の流速で線形ＡＢ勾配（５％ Ｂ／分）（ここで、溶離液Ａは０．１％ＴＦＡ水であり、溶離液Ｂはアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡである）で、逆相分取ＨＰＬＣ Ｃ１８カラムに流した。質量解析法により判断される場合の予測ペプチドを含有する１７．０６１分の時点の分画をプールして、凍結乾燥した。次に、本質的に上述に記載するように、ペプチドをプロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表３にまとめる。
【００５５】
【表３】
【００５６】
Ｎ末端プール配列解析
プロテアソーム消化の１時間の時点でのアリコット１つ（上記実施例３．３参照）を、ＡＢＩ ４７３Ａタンパク質シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)によるＮ末端アミノ酸配列解析に付した。切断部位および切断効率の決定は、配列サイクル、タンパク質シーケンサーの反復収率、および解析配列中に特有のアミノ酸の相対収率に基づいていた。すなわち、特有の（解析配列中で）残基Ｘがｎ番目のサイクルのみに見られる場合、切断部位は、Ｎ末端方向でその前のｎ−１残基に存在する。配列に対する質量の帰属における任意の多義性を解析するのを助長するほかに、これらのデータはまた、質量解析法よりも、様々な断片の相対収率のより信頼性の高い指標を提供する。
【００５７】
ＰＳＭＡ281-310（配列番号１８）に関して、このプールシーケンシングは、少量の他の切断部位の中でもＶ287およびＩ297後の２つの主要な切断部位を支持する。図３に示した結果を参照することにより、以下の：
それぞれ、Ｖ287後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す４番目、および１１番目のサイクルのＳ、
Ｖ287後の切断を示す８番目のサイクルのＨ（１０および１１から見られる高さの低下に対する位置９および１０でのピーク高さの減衰の欠如は、シーケンシング反応で潜伏を表すピークではなく、Ａ286およびＥ285後の切断も同様に支持することができる）、
それぞれ、Ｙ299、Ｉ297、およびＶ294後の切断を示す２番目、４番目、および７番目のサイクルのＤ（この最後の切断は、表４中の断片のいずれにおいても、あるいは以下の注釈における代替的帰属においても観察されない）、
Ｉ297後の切断を示す６番目のサイクルのＱ、
それぞれ、Ｙ299、およびＩ297後の切断を示す１０番目、および１２番目のサイクルのＭ、
とが明らかである。
【００５８】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共Ｃ末端の断片をさらなる研究のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表４に示す。
【００５９】
【表４】
【００６０】
表４に見られるように、エピトープに対する確証配列のＮ末端付加は、多くの場合、同じか、または異なるＭＨＣ制限要素にとって依然として有用であり、さらにはより良好なエピトープを生成することができる。例えばＨＬＡ−Ａ*０２０１との（Ｇ）ＬＰＳＩＰＶＨＰＩの対形成に留意されたい。ここではＨＬＡ−Ｂ７、−Ｂ*５１０１、およびＣｗ*０４０１に関するエピトープを創出するために、Ｎ末端調整(trimming)に依存することで幾つかのＭＨＣ型とともに有用なワクチンとして１０量体を使用することができる。
【００６１】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ：
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合研究を、上記実施例１．１に本質的に記載するように、ＰＳＭＡ288-297、すなわちＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号２１）を用いて実施した。図２に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチドよりも一層低い濃度で有意な結合を示す。
【００６２】
実施例１．３
クラスター解析（ＰＳＭＡ454-481）
前立腺特異的膜抗原由来のエピトープクラスターを含有する、別のペプチドＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＬＴＫＥＬ、すなわちＰＳＭＡ454-481（配列番号２８）を、ＭＰＳにより合成し（純度＞９５％）、上述に記載するように、プロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表５にまとめる。
【００６３】
【表５】
【００６４】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共通Ｃ末端の断片をさらなる研究のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ２．１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表６に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
表６に見られるように、エピトープに対する確証配列のＮ末端付加は、多くの場合、同じか、または異なるＭＨＣ制限要素にとって依然として有用であり、さらにはより良好なエピトープを生成することができる。例えばＨＬＡ−Ｂ*２７０２／５との（Ｌ）ＲＶＤＣＴＰＬＭＹ（配列番号３５および（３６））の対形成に留意されたい。ここでは、１０量体は解離の実質的予測半減期を有し、共Ｃ末端の９量体は有さない。ＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶ（配列番号３０）の場合、エピトープを創出するために、Ｎ末端調整に依存することで、ＨＬＡ−Ｂ*５１０１とともに有用なワクチンとして使用することができる予測ＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープにも留意されたい。
【００６７】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ：
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合研究を、上記実施例１．１に本質的に記載するように、ＰＳＭＡ460-469、すなわちＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬ（配列番号３３）を用いて実施した。図４に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチドとして使用される既知のＡ２．１結合物質ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（ＨＢＶ18-27、配列番号１０８）と同程度にＨＬＡ−Ａ２．１を結合することがわかった。加えて、ＰＳＭＡ461-469（配列番号３２）もほぼ同様に結合する。
【００６８】
ＥＬＩＳＰＯＴ解析：ＰＳＭＡ463-471（配列番号３５）
ニトロセルロースで裏打ちしたマイクロタイタープレートのウェルを、コーティング緩衝液（３５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１５ｍＭ 炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中の４μｇ／ｍｌマウス抗ヒト−ＩＦＮモノクローナル抗体５０μｌ／ウェルを用いて、４℃で一晩
インキュベートすることで、捕捉抗体でコーティングした。未結合の抗体を、ＰＢＳで５分間、４回洗浄することで除去した。次に、膜上の未結合部位を、１０％血清を有するＲＰＭＩ培地２００μｌ／ウェルを添加して、室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。１：３の段階希釈物の抗原刺激ＣＤ８+Ｔ細胞を、１００μｌ／ウェルを用いてマイクロタイタープレートのウェルに播種し、２×１０5個の細胞／ウェルから開始した（先述の抗原刺激は、本質的にScheibenbogen, C. et al. Int. J. Cancer 71:932-936, 1997（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている）。ＰＳＭＡ462-471（配列番号３６）を最終濃度１０μｇ／ｍｌ、ＩＬ−２を最終濃度１００Ｕ／ｍｌとなるように添加し、細胞を５％ＣＯ2水飽和雰囲気下で３７℃にて４０時間培養した。このインキュベーション後、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン）２００μｌ／ウェルで６回、プレートを洗浄した。検出抗体であるＰＢＳ＋１０％ウシ胎児血清中の２ｇ／ｍｌビオチン化マウス抗ヒト−ＩＦＮモノクローナル抗体５０μｌ／ウェルを添加して、プレートを室温で２時間インキュベートした。未結合検出抗体を、ＰＢＳ−ツイーン２００μｌで４回洗浄することで除去した。アビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Pharmingen, San Diego, CA)１００μｌを各ウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。未結合酵素を、ＰＢＳ−ツイーン２００μｌで６回洗浄することで除去した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２．５ｍｌ中に３−アミノ−９−エチルカルバゾールの２０ｍｇタブレットを溶解させ、その溶液を０．０５Ｍ リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４７．５ｍｌに添加することで基質を調製した。３０％Ｈ2Ｏ2２５μｌを基質溶液に添加した直後に、１００μｌ／ウェルで基質を分布させ、室温でプレートをインキュベートした。発色（一般に１５〜３０分）後、プレートを水で洗浄することで反応を停止した。プレートを風乾し、立体顕微鏡を用いてスポットを計数した。
【００６９】
図５は、自家樹状細胞とペプチドとを有するＨＬＡ−Ａ１+ＣＤ８+Ｔ細胞の培養物中で予め生成されたＰＳＭＡ463-471（配列番号３５）反応性ＨＬＡ−Ａ１+ＣＤ８+Ｔ細胞の検出を示す。ペプチドなしの培養物からは反応性が検出されない（データは示さず）。この場合では、ペプチド反応性Ｔ細胞が２．２×１０4分の１〜６．７×１０4分の１の頻度で培養物に存在することが観察され得る。これがまさにＨＬＡ−Ａ１制限応答であるということは、抗ＨＬＡ−Ａ１モノクローナル抗体の、−ＩＦＮ産生を阻止する能力により実証される。図６を参照されたい。
【００７０】
実施例１．４
クラスター解析（ＰＳＭＡ653-687）
前立腺特異的膜抗原由来のＡ２エピトープクラスター、すなわちＰＳＭＡ660-681（配列番号３８）を含有する、別のペプチドＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹ、すなわちＰＳＭＡ653-687（配列番号３７）を、ＭＰＳにより合成し（純度＞９５％）、上述に記載するように、プロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表７にまとめる。
【００７１】
【表７】
【００７２】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共Ｃ末端の断片をさらなる研究のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ２．１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表８に示す。
【００７３】
【表８】
【００７４】
表８に見られるように、エピトープに対する確証配列のＮ末端付加は、同じか、または異なるＭＨＣ制限要素にとって依然として有用であり、さらにはより良好なエピトープを生成することができる。例えばＨＬＡ−Ａ*０２との（Ｒ）ＭＭＮＤＱＬＭＦＬ（配列番号３９および（４０））の対形成に留意されたい。ここでは、１０量体は実質的予測される結合の可能性を有している。
【００７５】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合研究を、上記実施例１．１に本質的に記載するように、ＰＳＭＡ663-671（配列番号３９）およびＰＳＭＡ662-671、すなわちＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬ（配列番号６７）を用いて実施した。図４、図７、および図８に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチド（ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（ＨＢＶ18-27）、配列番号１０８）よりも一層低い濃度で有意な結合を示す。平行して行ってはいないが、対照との比較は、ＰＳＭＡ662-671（これは、親和性に関してＭｅｌａｎＡペプチドに似ている）がこれらの２つのＰＳＭＡペプチドのより優れた結合活性を有することを示唆する。
【実施例２】
【００７６】
多施設臨床研究を、本明細書中に開示する組成物を用いて実施する。研究の結果から、前記組成物が固形腫瘍を減量するのに、および概して抗血管新生活性を誘発するのに有用かつ有効であることがわかる。
【実施例３】
【００７７】
標的抗原反応性ＣＴＬの異種移植ヒト血管系モデル生成におけるＰＳＭＡ組成物の評価
Ａ．マウスのｉｎ ｖｉｖｏ免疫化
ＨＨＤ１トランスジェニックＡ*０２０１マウス(Pascolo, S., et al. J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997)を麻酔して、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）５０μｌで乳化させたＰＢＳ中にＰＳＭＡ288-297（配列番号２１）１００ｎｍｏｌおよびＨＴＬエピトープペプチド２０μｇを含有する１００μｌを用いて、外側尾静脈を避けて、尾の基部に皮下注射した。
【００７８】
Ｂ．刺激細胞（ＬＰＳ芽細胞）の調製
免疫化マウスの各群に関して２匹のナイーブマウスからの脾臓を用いて、非免疫化マウスを屠殺して、それらの胴体をアルコールに入れた。滅菌装置を用いて、マウスの左側（下中切開面）上の皮膚の最上部皮膚層を切り開いて、腹膜を露出させた。腹膜をアルコールで飽和させて、脾臓を無菌摘出した。脾臓を無血清培地の入ったペトリ皿に載せた。脾臓
をつぶすために３ｍｌシリンジからの滅菌プランジャーを用いて、脾細胞を単離した。細胞を無血清培地の入った５０ｍｌコニカル管中に収集し、皿を十分にすすいだ。細胞を遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、７分）、ＲＰＭＩで一度洗浄した。新鮮な脾細胞を、ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中に１ｍｌ当たり１×１０6個の細胞の濃度に再懸濁させた。２５ｇ／ｍｌリポ多糖および７μｇ／ｍｌ硫酸デキストランを添加した。Ｔ−７５フラスコ中で、３７℃にて５％ＣＯ2を用いて３日間、細胞をインキュベートした。脾臓芽細胞を５０ｍｌ管に収集し、ペレット化し（１２，０００ｒｐｍ、７分）、ＲＰＭＩ中に３×１０7個／ｍｌで再懸濁させた。芽細胞を、５０μｇ／ｍｌのプライミングペプチドを用いて室温で４時間パルス化し、２５μｇ／ｍｌで３７℃にて２０分間マイトマイシンＣ処理し、ＤＭＥＭで３回洗浄した。
【００７９】
Ｃ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激
芽細胞のＬＰＳ刺激の３日後、およびペプチド負荷と同じ日に、プライミングしたマウスを屠殺して（免疫化の１４日目）、上述のように脾臓を取り出した。３×１０6個の脾細胞を、１０％ＦＣＳ、５×１０-5Ｍβ（ベータ）−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００ＩＵ／ｍｌペニシリンを補充したＤＭＥＭ培地中で、３７℃にて、５％ＣＯ2を用いて、２４ウェルプレートにおいて１×１０6個のＬＰＳ芽細胞／ウェルとともに共存培養した。３日目に、培養物に５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣｏｎＡ上清を供給し、７日目には移入させることができる。ＣＴＬのアリコットはまた、活性を保証するための標準的なクロム放出アッセイで試験される。
【００８０】
移植および養子移入
ＥＧＭ−２ＶＭ培地１０μｌ(Clonetics, San Diego, CA)中の１×１０6個のテロメラーゼ形質転換ＨＤＭＥＣを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ(Becton Dickinson)０．５ｍｌと氷上で混合する。混合物を、ＳＣＩＤマウスの胸郭の腹側正中線に沿って２５ゲージ針により皮下注射する。１週間後、０．２ｍｌ中の１×１０7個のＴ細胞（標的エピトープ反応性または偽免疫化）を静脈内注射する（あるいは、それらを腹腔内注射することができる）。
【００８１】
評価（微小形態測定）
移入の１週間後および２週間後に、移植片を取り出し、１０％緩衝液中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、切片化する。抗ヒトＩＶ型コラーゲンＩｇＧおよび蛍光標識した二次抗体を用いたヒトの微細血管の免疫蛍光検出のために、脱パラフィン(deparaffinize)して、１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）中で薄い切片を２×７分間マイクロ波処理(micorwave)することで抗原を回復する。血管密度は、移植片１つ当たり少なくとも３つの切片から、５個の別個のランダムに選択した２０倍視野で観察される陽性染色された環状構造の平均数の関数として評価される。
【実施例４】
【００８２】
ＨＬＡトランスジェニックマウスモデルにおけるフィブロネクチンＥＤ−Ｂワクチン
Ａ．腫瘍の樹立
１０％血清を加えた完全ＲＰＭＩ中で成長させたＭ１腫瘍細胞を培養し、遠心分離により収集し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を５×１０6個の細胞／ｍｌでＰＢＳ中に懸濁させて、懸濁液０．５ｍｌ（初期継代）を腹部に皮下注射した。
【００８３】
Ｂ．ワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ２制限フィブロネクチンＥＤ−Ｂドメイン由来ハウスキーピングエプトープ、例えばＥＤ−Ｂ29-38（配列番号１０３）をコードするヌクレオチド配列を、適切なワクチンベクター（例えば、ｐＶＡＸ１(Invitrogen Inc, Carlsbad, CA)、または２００１年４月２８日に出願された「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS)」という表題の米国特
許出願第０９／５６１，５７２号に記載されるベクターの１つに挿入する。ＨＨＤ−Ａ２マウスに、ＰＢＳ中のベクター０μｇ、２μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、および２００μｇを、１日おきに８日間にわたって（４回注射）、各注射に関して側を交互に鼡径リンパに結節内注射する（マウスまたはマウス群当たり単回投与量）。一連の注射は、腫瘍細胞注射の日、その２週間前、ならびにその４週間後および１０週間後に始める。
【００８４】
Ｃ．評価
腫瘍注射のおよそ１２週間後に、ワクチンのかわりに賦形剤を施したマウスにおいて目に見える腫瘍が観察される。ワクチンの有効性を、同じ時間枠で腫瘍を発達させることができないワクチン接種した動物の比率、同じ時点での腫瘍の相対的大きさ、ワクチン接種した動物で腫瘍が出現するまでの遅延、および腫瘍の樹立を阻害または防止するのに必要とされる組成物サイクルの用量および組成物サイクル数として表す。
【００８５】
Ｄ．代替スケジュール
より攻撃的な後期継代Ｍ１細胞の利用性により、より短縮した実験スケジュールが可能である。代わりに、１×１０6個の細胞の腫瘍細胞接種の日、その１週間および２週間前、ならびに３日後または４日後に、マウスにワクチン接種する。ワクチンの有効性は、腫瘍細胞接種のおよそ１０日後に評価する。
【００８６】
Ｅ．ペプチドによる免疫化
完全フロイントアジュバント中のＥＤ−Ｂ２９−３８（配列番号１０３）でＨＨＤ−Ａ２マウスを免疫化し、脾臓細胞を回集し、標準的な方法論を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。生じたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋であるペプチドパルス化Ｔ２細胞を特異的に溶解することが可能であった（図９）。
【実施例５】
【００８７】
エピトープおよびエピトープクラスター
表９〜１８は、本発明による組成物の構築において有用であり得るＰＳＭＡおよびＥＤ−Ｂ由来のエピトープならびにエピトープクラスターを開示する。
【００８８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【技術分野】
【０００１】
癌治療は生物医学の前進にも関わらず依然として取組み甲斐がある。近年、かなりの将来性を示す２つのアプローチ：治療用ワクチンおよび抗血管新生について記載されている。
【背景技術】
【０００２】
治療用ワクチンは、癌性組織が概してある特定の抗原（集約的に腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ））を優先的に発現するという観察に依るものである。ＴｕＡＡとしては、通常癌が由来する組織により選択的に発現されるタンパク質（分化抗原(differentiation antigen)）、発達の種々の段階に関連したタンパク質（腫瘍胎児性抗原および癌−精巣抗原）、異常染色体再配列により創出されるタンパク質、または発癌性ウイルスに由来するタンパク質が挙げられる。次に、腫瘍細胞を死滅させることが可能な、細胞性免疫、特に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激するように意図されるワクチン中の免疫原として、これらのＴｕＡＡ、またはそれらの断片を使用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
抗血管新生アプローチは、腫瘍がその継続性成長を支持するために血液供給を補充することが必要であることを利用する。これを成し遂げるために、腫瘍は、新たな血管の成長を促進する血管新生因子を分泌する。抗血管新生アプローチは、腫瘍の栄養分の供給を崩壊させて、腫瘍を死滅させるか、または少なくとも腫瘍の成長を制限させることにねらいを定めている。このアプローチでの試みは、様々な抗血管新生因子および血管新生に対して直接使用される化学療法薬を探し求めている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書中に開示する本発明は、腫瘍関連新生血管系（ＴｕＮＶ）を標的とする細胞性免疫応答を刺激するように設計した組成物に関する。本発明の一実施形態では、上記組成物はＣＴＬ応答を刺激する。かかる組成物は、標的抗原の１つまたは複数のエピトープを包含し得る。この実施形態のある態様は具体的に、ハウスキーピングエピトープを包含し、別の態様は具体的に、免疫エピトープまたはエピトープクラスターを包含し、別の態様は具体的に、ハウスキーピングおよび免疫エピトープを組み合わせる。
【０００５】
本発明の実施形態は、上記組成物の標的抗原としての、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の使用に関する。この実施形態の態様は、直接ポリペプチドとして、またはエピトープの発現を付与することが可能な核酸として提供される、ＰＳＭＡに由来する様々なエピトープを包含する。他の実施形態は、他のＴｕＮＶ関連抗原の使用に関する。
【０００６】
本発明の他の実施形態では、組成物は、単一配合物または治療方法に両供給源に由来する免疫原を組み合わせることで、癌性細胞により発現されるＴｕＮＶおよびＴｕＡＡの両方に対して誘導される。
【０００７】
本発明の組成物の前臨床評価は、移植ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）から形成される微小血管を保有するＳＣＩＤマウスへの免疫化Ｔ細胞の養子移入を用いて成し遂げることができる。前臨床評価はまた、マウスとヒトとの間で保存されるエピトープから構成される組成物で免疫化したＨＬＡトランスジェニックマウスの使用により成し遂げることができる。
【０００８】
本発明の実施形態は、細胞媒介性免疫を評価する方法に関する。本方法は、免疫不全の哺
乳動物に血管細胞を移植する工程と、上記哺乳動物において免疫応答を確立する工程と、上記哺乳動物における細胞性免疫を判定するための特徴をアッセイする工程とを含み得る。上記細胞性免疫は、例えば、新生血管系抗原に対して誘導され得る。上記新生血管系抗原は、例えば、腫瘍関連新生血管系で優先的に発現され得、また好ましい実施形態では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等であり得る。上記確立する工程は、例えば、上記哺乳動物へのＴ細胞の養子移入により、また上記哺乳動物を抗原と接触させること等により達成され得る。上記細胞性免疫は、細胞傷害性Ｔリンパ球により媒介され得る。上記血管細胞は、例えば、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）、テロメラーゼで形質転換された内皮細胞等のような血管内皮細胞であり得る。上記免疫不全の哺乳動物は、例えば、ＳＣＩＤマウスのようなマウスであり得る。上記特徴づける工程は、例えば、血管形成、血管崩壊、血管密度、および宿主哺乳動物の血液を運搬する血管の比率等のようなパラメータを評価することを含み得る。
【０００９】
本方法は、上記マウスに腫瘍細胞または腫瘍組織を移植する工程をさらに含む。上記特徴づける工程は、例えば、腫瘍の存在、腫瘍成長、腫瘍の大きさ、腫瘍出現の速度、腫瘍樹立を阻害または防止するのに必要とされるワクチンの用量、腫瘍血管形成、および該腫瘍内の壊死組織の比率等のようなパラメータを評価することを含み得る。
【００１０】
本方法は、第１群の哺乳動物および第２群の哺乳動物を供給する工程と、上記第１群において細胞性免疫を確立する工程と、上記第２群において細胞性免疫を差次的に確立する工程と、上記第１群の哺乳動物から得られる結果を、上記第２群の哺乳動物から得られる結果と比較する工程とをさらに含み得る。上記第１群の上記細胞性免疫は、例えば、ナイーブ免疫および無関係エピトープに対する免疫等を含み得る。
【００１１】
他の実施形態は、細胞性免疫を評価する方法に関し、新生血管系抗原に対して誘導される免疫を含む。本方法は、ＭＨＣトランスジェニック哺乳動物にＭＨＣトランスジェニック腫瘍細胞を移植または注射する工程と、上記哺乳動物において免疫応答を確立する工程と、上記哺乳動物における細胞性免疫を判定するための特徴をアッセイする工程とを含み得る。上記ＭＨＣトランスジェニック哺乳動物は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック哺乳動物のようなＨＬＡトランスジェニック哺乳動物であり得る。好ましい実施形態では、上記哺乳動物はマウスであり得る。上記細胞性免疫は、ワクチン接種により確立され得、好ましい実施形態では、上記ワクチン接種は、例えば、上記腫瘍細胞の移入の前に、移入と同時に、または移入後に行われ得る。好ましい実施形態では、上記細胞性免疫は、細胞傷害性Ｔリンパ球により媒介され得る。上記新生血管系抗原は、腫瘍関連新生血管系により優先的に発現され得、また腫瘍関連抗原でもあり得る。好ましくは、上記抗原は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインであり得る。上記特徴づける工程は、例えば、腫瘍の存在、腫瘍成長、腫瘍の大きさ、腫瘍出現の速度、腫瘍樹立を阻害または防止するのに必要とされるワクチンの用量、腫瘍血管形成、該腫瘍内の壊死細胞の比率等を含むパラメータを評価することを含み得る。本方法は、第１群の哺乳動物および第２群の哺乳動物を供給する工程と、上記第１群において細胞性免疫を確立する工程と、上記第２群において細胞性免疫を差次的に確立する工程と、上記第１群の哺乳動物から得られる結果を、上記第２群の哺乳動物から得られる結果と比較する工程とをさらに含み得る。上記第１群の上記細胞性免疫は、ナイーブ免疫、無関係エピトープに対する免疫等を含み得る。
【００１２】
さらなる実施形態は、腫瘍関連新生血管系により差次的に発現される抗原に対して誘導される細胞性免疫応答を誘発するように哺乳動物を免疫化する工程を含む、腫瘍性疾患を治療する方法に関する。上記差次的に発現される抗原は、例えば、前立腺特異的膜抗原、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等のようなタンパク質であり得る。他の好ましい実施形態では、上記抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインであり得る。上記免疫化は、例えば、上記タンパク質の配列に由来する少なくとも１つのペプチド、上記タンパ
ク質またはペプチドの発現を付与することが可能な核酸等を用いて実施され得る。上記少なくとも１つのペプチドは、例えば、ハウスキーピングエピトープを含み得、好ましい実施形態では、上記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端であり得る。本方法は、免疫エピトープを含む少なくとも１つのさらなるペプチドをさらに含み得る。本方法は、上記哺乳動物が癌性細胞に対して直接的に活性な抗腫瘍療法で治療されるさらなる工程を含み得る。上記抗腫瘍療法は、腫瘍関連抗原に対する免疫化であり得る。好ましくは、上記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含み得る。
【００１３】
他の実施形態は免疫学的組成物に関する。免疫学的組成物は、腫瘍関連新生血管系により発現される抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含み得、上記組成物は、細胞性免疫応答を誘発することができる。上記免疫原は、レシピエントと同種の細胞に関連しない免疫原であり得る。上記抗原は、例えば、前立腺特異的膜抗原、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等のようなタンパク質であり得る。他の好ましい実施形態では、上記抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインであり得る。上記免疫原は少なくとも１つのペプチドを含み得る。上記組成物は、上記抗原の発現を付与することが可能な核酸を含み得、上記抗原はタンパク質またはペプチドである。上記組成物は、ハウスキーピングエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含み得、また好ましい実施形態では、上記少なくとも１つのペプチドは、上記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端であり得る。また、上記組成物は、免疫エピトープを含む少なくとも１つのペプチドをさらに含み得る。上記組成物は、腫瘍関連抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含み得る。好ましい実施形態では、上記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含み得る。
【００１４】
実施形態は、抗腫瘍ワクチン設計の方法に関する。本方法は、腫瘍関連新生血管系により差次的に発現される抗原を同定する工程と、上記抗原の構成成分をワクチンに組み込む工程とを含み得る。上記構成成分は、例えば、上記抗原のポリペプチド断片、上記抗原または上記抗原の断片をコードする核酸等を含み得る。
【００１５】
さらなる実施形態は、研究モデルを作製する方法に関する。本方法は、免疫不全の哺乳動物に血管細胞および腫瘍細胞を移植することを含み得る。上記腫瘍細胞および血管細胞は、互いに隣接して移植され得る。上記血管細胞は、例えば、ＨＤＭＥＣのような血管内皮細胞であり得る。好ましい実施形態では、上記血管内皮細胞はテロメラーゼで形質転換され得る。上記免疫不全の哺乳動物は、例えば、ＳＣＩＤマウスのようなマウスであり得る。
【００１６】
他の実施形態は、研究モデルに関する。上記研究モデルは、免疫不全の哺乳動物を含み得る。上記哺乳動物は、移植血管細胞および移植腫瘍細胞を含み得る。上記血管細胞および上記腫瘍細胞は互いに隣接して移植され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ＰＳＭＡ163-192プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図１Ｂ】ＰＳＭＡ163-192プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図１Ｃ】ＰＳＭＡ163-192プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図２】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ168-177、およびＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ288-297に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図３】ＰＳＭＡ281-310プロテアソーム消化物のＴ＝６０分の時点のアリコットのＮ末端プールシーケンシングの結果を示す図である。
【図４】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ461-469、ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ460-469、およびＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ663-671に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図５】ＰＳＭＡ463-471反応性ＨＬＡ−Ａ１+ＣＤ８+Ｔ細胞を検出する（γ）−ＩＦＮベースのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。
【図６】ＨＬＡ−Ａ１制限認識を実証する、抗ＨＬＡ−Ａ１ｍＡｂによる図１０で使用されるＴ細胞の反応性の阻止を示す図である。
【図７】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ663-671に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図８】ＨＬＡ−Ａ２：ＰＳＭＡ662-671に関する結合曲線を、対照とともに示す図である。
【図９】ＥＤ−Ｂ ２９−３８ペプチドで免疫化したＨＨＤ−Ａ２マウスからのＣＴＬによるエピトープ特異的溶解を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中に開示する本発明の実施形態は、組成物、組成物またはワクチンの設計の方法、および腫瘍の新生血管系に対して誘導される細胞性免疫応答、好ましくはＴ細胞応答、より好ましくはＣＴＬ応答の生成に関する治療方法を提供する。かかる方法および組成物は、癌の治療および防止に特に有用である。他の実施形態は組成物評価モデルに関する。
【００１９】
組成物、組成物設計、および組成物を用いた治療
本発明の実施形態は、腫瘍新生血管系（ＴｕＮＶ）に対して誘導される細胞性免疫応答、特にＴ細胞応答、具体的にＣＴＬ応答の生成のための、ワクチンを含む免疫学的組成物に関する。「腫瘍新生血管系」は、広範囲に、腫瘍塊中またはその周辺に見られる任意の血管系、腫瘍成長を支持するか、またはそれに必要な血管系等を包含することを意味する。本明細書中の論考は、概して腫瘍および腫瘍新生血管系について言及するが、本発明の実施形態はまた、不適切な血管新生に関連した他の状態または病状に適用することができることを留意すべきであり、このことを当業者は理解されよう。
【００２０】
これまで、抗腫瘍ワクチンの設計は、悪性細胞自体により発現される抗原に集中してきた。しかしながら、大きな腫瘍は複雑な構造であり、単に細胞の均質塊ではない。すべての細胞、特に迅速に成長する細胞は、栄養分（酸素、グルコース、アミノ酸等）の供給、ならびに代謝的に活性でありかつ無傷のままであるための代謝廃棄物除去の手段を必要とする。これは通常、身体の様々な器官からの血液およびリンパの流れにより達成される。細胞レベルでは、身体の組織は、毛細血管（そこから栄養分および廃棄産物が拡散により周辺細胞と交換され得る小血管）の微細ネットワークにより浸透される。拡散は比較的短距離に有効である。毛細血管床が広範囲であるため、概して細胞はせいぜい毛細血管から数細胞離れたところに位置されるにすぎない。腫瘍が単にその悪性細胞の繁殖により成長する場合、塊の内部のこれらの細胞はすぐに自分自身を支えることが不可能となる。実際に、血管新生化していない腫瘍の内部は壊死組織を含有することが多い。したがって、無抑制で成長するために、腫瘍は、新たな血管の内部成長を促進する因子、すなわちＴｕＮＶを分泌する。ＴｕＮＶは壊死組織を他の組織と区別する抗原を発現するため、癌性細胞自体を直接標的とする代わりに、ＴｕＮＶに対して誘導される治療用組成物で癌を治療することができる。適切なＴｕＮＶ抗原は、例えば概して新生血管系で、またはＴｕＮＶにより優先的に発現されるものを包含し得る。
【００２１】
本発明の幾つかの実施形態では、上記組成物は、例えばエピトープペプチド（単数または複数）を包含することができる。エピトープクラスターおよびタンパク質断片に包埋された免疫エピトープを提供してもよい。適正なＣ末端を有するハウスキーピングエピトープを提供することができる。本発明の他の実施形態では、上記組成物は、例えばｐＡＰＣ上でのこれらのエピトープの発現を付与することが可能な核酸を含むことができる。
【００２２】
好ましい実施形態では、上記組成物は、治療される哺乳動物のリンパ系に直接投与することができる。このことは、ポリペプチドおよび核酸両方のベースの組成物に適用させることができる。このタイプの投与方法および関連技術は、１９９９年９月１日に出願された米国特許出願第０９／３８０，５３４号、および２００１年２月２日に出願されたそれらの一部継続出願である米国特許出願第０９／７７６，２３２（ともに、「ＣＴＬ応答を誘導する方法(A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE)」という表題）に開示されている。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明の組成物の作用による腫瘍中の血管の崩壊により、腫瘍中の細胞すべてを排除することができる。しかしながら、微小転移巣を含む小腫瘍は通常血管新生化されない。さらに、代わりとして腫瘍塊に浸透するチャネルを介した血流に依ると思われる血管新生化されていない腫瘍が報告されている(Maniotis, A.J., et al. Am. J. Pathol. 155: 739-752, 1999)。したがって、他の実施形態では、上記組成物は概して、癌細胞すべてを根絶し得ない腫瘍制御剤として有効である。したがって、本発明は、腫瘍を排除するため、腫瘍成長を制御するため、腫瘍組織量を減少させるため、臨床状態全体を改善するため等のツールを提供する。幾つかの実施形態では、癌性細胞を直接標的とする他の治療とこれらの組成物を組み合わせることが望ましい場合もある。さらに、内皮細胞および癌細胞の両方から構成される腫瘍中の血管系は本質的にモザイクであり得る証拠が存在する(Chang, Y.S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:14608-14613, 2000)。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、組成物治療行程の後に生物または化学療法剤の投与を行うことができる。特に好ましい実施形態では、治療は、抗ＴｕＮＶ組成物の投与と同時に、またはその後に、ＴｕＡＡ指向性組成物を投与することを包含することができる。
【００２４】
上述のように、組成物に適切なＴｕＮＶ抗原は、例えば概して新生血管系で、またはＴｕＮＶにより優先的に発現されるものを包含することができる。ＴｕＡＡを発見するための様々な技法が当該技術分野で既知である。これらの技法の例としては、ディファレンシャルハイブリダイゼーションおよびサブトラクティブハイブリダイゼーション（マイクロアレイの使用を含む）、発現クローニング、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の段階解析）、ＳＥＲＥＸ（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＴ、免疫組織化学（ＰＳＭＡの場合のような）、ＥＳＴ解析、バルク組織、切片組織、および／または顕微解剖組織の種々の使用等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法および他の方法の利用は、免疫学的組成物の抗原として使用され得る標的細胞内に含まれる遺伝子および遺伝子産物を同定するのに必要な技法を当業者に提供する。その技法は、標的細胞が癌細胞であるか、または内皮細胞であるかどうかに関わらず、ＴｕＡＡ発見に適用可能である。任意の同定された抗原をエピトープに関して精査することができ、それを本発明の実施形態に使用することができる。
【００２５】
血管系の内層を構成する内皮細胞は、ハウスキーピングプロテアソームを発現することができる。したがって、内皮細胞を標的とする組成物は、ハウスキーピングプロテアソームの消化産物に相当するペプチド（すなわち、ハウスキーピングエピトープ）、またはペプチドの発現を付与する核酸から構成され得る。免疫系の活性化細胞により分泌されるＩＦＮ−γ（ガンマ）は、標的細胞中の免疫プロテアソームの発現を誘発することができる。一般に、免疫プロテアソームは、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）において構成的である。したがって、標的細胞が内部に存在する状態に関わらず、標的細胞を認識することが可能なＣＴＬが確実に存在するために、ＣＴＬ誘発組成物中に免疫エピトープまたはエピトープクラスターを包含することが有用であり得る。これは、抗原提示機能を容易に呈する内皮細胞を用いた場合に特に真実であり得る。これらの概念は、２０００年４月２８日に出願された米国特許出願第０９／５６０，４６５号、２００１年１１月７日に出願された同第１０／００５，９０５号、およびその継続出願である２００１年１２月７日に出願された米国特許出願第 号（代理人整理番号ＣＴＬＩＭＭ．２１ＣＰ１Ｃ）（
これらはそれぞれ、「抗原提示細胞におけるエピトープ同調(EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS)」という表題である）により詳細に説明されている。
【００２６】
上述のように、免疫学的組成物（好ましい実施形態ではワクチンを含む）は、例えばＴｕＮＶ抗原およびエピトープを含むことができる。エピトープは、１つまたは複数のハウスキーピングエピトープおよび／または１つまたは複数の免疫エピトープを含むことができる。上記組成物に有用な特定エピトープは、２０００年４月２８日に出願された「エピトープ発見方法(METHOD OF EPITOPE DISCOVERY)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，０７４号に開示される方法を用いて同定することができる。例えば、幾つかのＭＨＣ制限要素に結合することが既知であるか、またはそれが予測されるペプチド配列を、共通Ｃ末端であるものを同定するために、プロテアソーム消化により産生される断片と比較することができる。
【００２７】
ＥＤ−ＢおよびＰＳＭＡのエピトープを含む本発明の実施形態のための有用なエピトープの例は、２００２年３月７日に本出願と同日付けで出願された「エピトープ配列(EPITOPE
SEQUENCES)」という表題の米国仮特許出願第 号（代理人整理番号ＣＴＬＩＭＭ．０２７ＰＲ）、ならびにそれぞれ「エピトープ配列(EPITOPE SEQUENCES)」という表題の２００１年４月６日に出願された出願番号第６０／２８２，２１１号、および２００１年１１月７日に出願された出願番号第６０／３３７，０１７号の２つの米国仮特許出願に開示されている。これらの出願はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２８】
ＰＳＭＡは、幾つかの実施形態で標的とされ得るＴｕＡＡの一例である。ＰＳＭＡは、ほとんどの腫瘍型の新生血管系で発現されるが、正常組織の血管内皮によって発現されない(Chang, S.M. et al., Cancer Res. 59(13):3192-8, 1999; Clin Cancer Res. 10:2674-81, 1999)。ＰＳＭＡは膜抗原であり、したがって、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によりＰＳＭＡ発現ＴｕＮＶを攻撃することが可能であり得る。しかしながら、癌治療におけるｍＡｂの有効性は、当初予想されていたよりも困難であることが証明されている。さらに、他の抗原がＴｕＮＶに関連することが発見されているように、抗原の多くは血管系表面で発現されないことが証明され、抗原をｍＡｂ攻撃しにくいようにしている。
【００２９】
他方で、Ｔ細胞、特にＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）制限抗原提示の過程により細胞の内部構成成分の発現を監視する。Ｔ細胞活性化ワクチンおよび自己抗原に対する組成物の有効性を判定するためのパラメータは難解である。適切なエピトープ選択に関する重要な特徴およびパラメータの幾つかは、２００１年４月２８日に出願した「抗原提示細胞におけるエピトープ同調(EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS)」という表題の米国特許出願第０９／５６０，４６５号、２００１年４月２８日に出願された「エピトープ発見方法(METHOD OF EPITOPE DISCOVERY)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，０７４号、および２００１年４月２８日に出願された「エピトープクラスター(EPITOPE CLUSTERS)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，５７１号に開示されている。エピトープ同調を促進するＤＮＡワクチン設計の特徴は、２００１年４月２８日に出願された「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS)」という表題の米国特許出願第０９／５６１，５７２号、および２００１年１１月７日に出願された「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクターおよびそれらの設計方法(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN)」という表題の米国仮出願第６０／３３６，９６８号に開示されている。ワクチン送達の特に有効な手段は、１９９９年９月１日に出願された米国特許出願第０９／３８０，５３４号、およびその一部継続出願である２００１年２月２日に出願された米国特許出願第０９／７７６，２３２号（ともに、「ＣＴＬ応答を誘導する方法(A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE)」という表題）に記載されている。上述の参照文献はそれぞれ、その全体が参
照により本明細書に援用される。
【００３０】
実施形態で使用することができるＴｕＮＶ抗原の別の例は、フィブロネクチン、好ましくはＥＤ−Ｂドメインである。フィブロネクチンは、発生上調節性の選択的スプライシングを受け、ＥＤ−Ｂドメインは主に癌胎児性組織で使用される単一エクソンによりコードされる。Matsuura, H. and S. Hakomori Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6517-6521, 1985; Carnemolla, B. et al. J. Cell Biol. 108:1139-1148, 1989; Loridon-Rosa, B. et al. Cancer Res. 50:1608-1612, 1990; Nicolo, G. et al. Cell Differ. Dev. 32:401-408, 1990: Borsi, L. et al. Exp. Cell Res. 199:98-105, 1992; Oyama, F. et al. Cancer Res. 53:2005-2011, 1993; Mandel, U et al. APMIS 102:695-702, 1994; Farnoud, M.R. et al. Int. J. Cancer 61:27-34, 1995; Pujuguet, P. et al. Am. J. Pathol. 148:579-592, 1996; Gabler, U. et al. Heart 75:358-362, 1996; Chevalier, X. Br. J. Rheumatol. 35:407-415, 1996; Midulla, M. Cancer Res. 60:164-169, 2000。
【００３１】
ＥＤ−Ｂドメインはまた、新生血管系のフィブロネクチンでも発現される。Kaczmarek, J. et al. Int. J. Cancer 59:11-16, 1994; Castellani, P. et al. Int. J. Cancer 59:612-618, 1994; Neri, D. et al. Nat. Biotech. 15:1271-1275, 1997; Karelina, T.V. and A.Z. Eisen Cancer Detect. Prev. 22:438-444, 1998; Tarli, L. et al. Blood 94:192-198, 1999; Castellani, P. et al. Acta Neurochir. (Wien) 142:277-282, 2000。癌胎児性ドメインとして、ＥＤ−Ｂドメインは、ＴｕＮＶにより発現されるほかに、腫瘍性細胞により発現されるフィブロネクチンで一般に見出される。したがって、ＥＤ−Ｂドメインを標的とするＣＴＬ誘発性組成物は、２つの作用機序：腫瘍細胞の直接溶解、およびＴｕＮＶの崩壊による腫瘍血液供給の崩壊を示すことができる。
【００３２】
フィブロネクチンＥＤ−Ｂドメインの発現が腫瘍関連新生血管系および正常新生血管系の両方で報告されている(Castellani, P. et al. Int. J. Cancer 59:612-618, 1994)ことに留意すべきである。したがって、フィブロネクチンＥＤ−Ｂドメイン、または同様に発現される抗原に基づく組成物は、不適切な血管新生に関連した他の状態に対して有効であり得る。さらに、この組成物を使用中止した後に、ＣＴＬ活性がすぐに減衰しうるため、正常な血管新生の妨害を最低限にすることができる。
【００３３】
免疫原組成物に関する他の標的としては、成長因子受容体（血管細胞と関連したものを含む）が挙げられる。かかる例の１つは、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）である。米国特許第６，３４２，２２１号には、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２の論考が含まれている。血管細胞と関連した任意の他の抗原またはタンパク質（現在既知であるもの、およびまだ同定されていないものを含む）が免疫原組成物に対する標的であり得ることは当業者に理解されよう。
【００３４】
動物モデル、モデルの作製方法、および組成物評価
上述の考察に基づいて設計される組成物は、様々な標的に対して有効である。しかしながら、さらなる評価は、いかなるときでも、しかし好ましくは前臨床環境で容易に実行することができる。例えば、かかる評価は、組成物設計をさらに助長するために使用することができる。本発明の他の実施形態は、免疫原組成物を評価する方法に関する。本発明の組成物は、組成物評価用の動物モデルを用いて、当業者が容易に評価することができる。例えば、以下のルーチンな手順に従って、当業者はＴｕＮＶ組成物を迅速かつ効率的に評価することができる。したがって、本明細書中に記載するモデルまたは手引きを用いて、当業者は、ほとんどまたは全く実験なしで任意のＴｕＮＶ抗原に関して任意のＴｕＮＶ組成物を評価することができる。さらなる実施形態は、動物研究モデルを作製する方法に関する。他の実施形態は、研究モデル動物に関する。これらの実施形態は以下でより詳細に記載する。
【００３５】
異種移植ヒト血管系ベースのモデル
実施形態によっては、ヒト微細血管形成のメカニズムを研究するためのモデル系に関するものもある。例えば、幾つかの実施形態では、モデル系は組成物の前臨床評価に使用することができる。モデルは、ＳＣＩＤマウスへの、ＭＡＴＲＩＧＥＬ(Becton Dickinson)と混合したテロメラーゼ形質転換ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の皮下移植を含む。テロメラーゼ形質転換ＨＣＭＥＣの皮下移植は、Yang, J. et al. Nature Biotech 19:219-224, 2001に記載されている。本発明の組成物により活性化されるＴ細胞を、例えばかかる移植マウスに養子移入させることができ、かかるヒト微小血管を破壊するか、またはその形成を防止するＴ細胞の能力を評価することができる。他の実施形態では、マウスに直接ワクチン接種して評価することができる。また、さらなる実施形態では、モデル系は、他の種由来のＤＭＥＣおよび種適合性テロメラーゼを置換することで、およびヒト系に関して以下に記載するものに類似した試薬を用いることで、非ヒト種で有効な組成物を試験するのにさらに適応させることができる。
【００３６】
試験される組成物のエピトープを提示するＭＨＣ制限要素は、好ましくは、マウスに移植されたＨＤＭＥＣ系によって共有される。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化により、またはＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化（この手順は当業者に既知であり、その例は上記の援用される特許出願において提供される）により得ることができる。ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて生成されるＴ細胞の使用により、養子移入されるＴ細胞と宿主との間の遺伝的背景の適合が可能となり、それにより結果の解釈を複雑にし得る同種異系または異種反応の可能性を低減させる。しかしながら、利用可能なマウス系統に応じて、これは、同じ遺伝的背景上でＨＬＡ導入遺伝子およびＳＣＩＤ表現型を獲得するために交雑させることが必要であり得る。代替的には、所望の集団を富化するために、またはクローンを樹立するために、１回または複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を、ドナーＴ細胞（ヒトまたはマウス）に施すことができ、それにより望ましくない反応性を同様に回避する。
【００３７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化のための技法は、当業者で既知である（例えば、Stauss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992; Salgaller et al. Cancer Res. 55:4972-4979, 1995; Tsai et al., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997; およびChung et al., J. Immunother. 22:279-287, 1999)。ｉｎ ｖｉｖｏであってもｉｎ ｖｉｔｒｏであっても、いったん生成されれば、十分数のかかるＴ細胞は、本発明の組成物および／またはサイトカイン（例えば、Kurokawa, T. et al., Int. J. Cancer 91:749-746, 2001を参照)または他の分裂促進因子を用いた刺激によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることで得ることができる。これらのＴ細胞は、１つまたは複数のエピトープを認識するクローンまたはポリクローナル集団を構成することができる。好ましい実施形態では、およそ１０5〜１０8個程度の細胞が、マウスにおける養子移入実験のために移入される（例えば、Drobyski, W.R. et al. Blood 97:2506-2513, 2001; Seeley B.M. et al. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124:436-441, 2001; Kanwar, J.R. et al. Cancer Res. 61: 1948-1956, 2001を参照）。クローンおよびそうでなければより富化された集団は、一般により少数の細胞の移入を必要とする。
【００３８】
Ｔ細胞の移入は、ＨＤＭＥＣの移植または樹立の直前に、それと同時に、またはその後に行うことができる。組成物の有効性を評価するために評価することができるパラメータとしては、血管形成、血管密度の変化、およびマウス血液を運搬する能力（Yang等に記載されるような）等が挙げられる。評価は、テロメラーゼ形質転換ＨＤＭＥＣの移植後の１週間程度の初期に、かつ少なくとも６週間程度の長さで、好ましくは２週間後に、およびＴ細胞移植の１日〜６週間後に、好ましくは１〜３週間後に実施することができる。一般に、評価は、ナイーブ（偽免疫化を含む）または無関係エピトープ反応性Ｔ細胞を施したマ
ウスと、標的抗原と反応性を有するＴ細胞を施したマウスとの比較を包含することができる。
【００３９】
関連抗原は、概して新生血管系で、またはＴｕＮＶにより優先的に発現され得る。発現は、免疫組織化学およびＲＴ−ＰＣＲを含む当該技術分野で既知の様々な技法により確認することができる。例えば、腫瘍細胞をＨＤＭＥＣと一緒に移植することができる。これは、ＴｕＮＶにより優先的に発現される抗原の発現を誘発するという結果をもたらすことができる。一例では、これは、ＨＤＭＥＣ含有ＭＡＴＲＩＧＥＬ移植片に隣接して一塊の腫瘍組織を移植することにより、移植片部位に腫瘍細胞を注射することにより、ＨＤＭＥＣ含有ＭＡＴＲＩＧＥＬ移植片に隣接して腫瘍細胞含有ＭＡＴＲＩＧＥＬを移植することにより、腫瘍細胞およびＨＤＭＥＣの両方を同じＭＡＴＲＩＧＥＬ移植片に組み込むことにより、あるいは任意の他の適切な方法により成し遂げることができる。上述のように、幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は血管細胞と一緒に移植することができる。こうして作製された動物は、研究モデルとして使用することができる。さらなる変形形態は当業者に明らかであろう。
【００４０】
ＨＬＡトランスジェニック動物モデル
ヒトとモデル種との間で、配列および／または発現プロフィールにおいて保存される抗原に関して、ＨＬＡトランスジェニック系統により別のアプローチ、すなわち同系腫瘍に対抗するためのモデル動物のワクチン接種が可能である。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインは、それが血管新生のマーカーであり、またヒトおよびマウスの両方において同一のアミノ酸配列を有するため、かかる機会を提供する(Nilsson, F. et al. Cancer Res. 61:711-716, 2001)。さらに、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの系統由来の自発性腫瘍組織を単離および繁殖させた。エピトープ発見および選択、ならびにＣＴＬ誘発性組成物に関する組成物設計および送達については上述されている。
【００４１】
腫瘍細胞系であるＭ１は、自発性唾液腺嚢胞腺癌に由来するものである。Ｍ１腫瘍細胞系およびこれの使用方法は、「ＨＬＡトランスジェニックマウス腫瘍細胞系(AN HLA-TRANSGENIC MURINE TUMOR CELL LINE)」という表題の２００１年３月７日に、本出願と同日付けで出願された米国仮出願第 号、代理人整理番号ＣＴＬＩＭＭ．０２８ＰＲに開示されている。腫瘍細胞系は、S. Pascolo他(J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997)のＨＨＤ−Ａ２トランスジェニックマウス系統の個体で発生することができる。これらのマウスは、ヒトβ（ベータ）２−ミクログロブリンを含む１つの単鎖クラスＩ分子、ならびにマウスクラスＩ分子Ｈ２Ｄbに由来する分子と平衡を保ったＨＬＡ−Ａ２．１のα１（アルファ−１）、およびα２（アルファ−２）ドメインを発現する。腫瘍塊を、通常１〜３週間以内に、腫瘍が再成長する新たな個体に移植することができ、３ｍｍの塊は３ｃｍにまで成長する。あるいは、腫瘍組織を分解して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させることができる。収集時に、腫瘍細胞を頸部または腹部に皮下注射（１〜３日連日で２．５×１０6個の細胞）することができ、初期継代細胞に関してはおよそ５〜１２週間のうちに目に見える腫瘍を生じることができる。細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで成長するのにより良好に適応されるようになった後、１×１０6個〜１×１０7個の細胞の単回注射により１０日のうちに目に見える腫瘍がもたらせる。一般に、初期腫瘍は唾液腺の付近で一貫して出現するが、二次腫瘍はまた、様々な場所（腎臓、肺、肝臓および腹筋を含む）にも出現することができる。
【００４２】
組成物の有効性を評価するために、組成物の予測メカニズムに応じて、腫瘍の樹立前に、それと同時に、またはその後に組成物を投与することができる。幾つかの種類の減量技法（例えば、手術）とともに使用されることを意図した治療用組成物に関しては、同時投与が適切であり得る。治療が始まる前に腫瘍がより良好に樹立されるほど、試験はより厳しくなる。
【００４３】
両方の動物評価モデルについて、ヒト組成物の試験に関して記載してきた。しかしながら、獣医学的組成物の用途は類似しており、種適合性内皮細胞、ＭＨＣ、ＴｕＡＡ等の置換を要するだけである。
【００４４】
以下の実施例は単なる説明の目的を意図しており、いかなる場合でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４５】
本明細書中に開示するすでに同定した抗原ＰＳＭＡおよびＥＤ−Ｂを用いて前臨床研究を実施した。研究結果より、優れた候補エピトープが明らかとなった。以下の表９を参照されたい。
【００４６】
実施例１．１
クラスター解析（ＰＳＭＡ163-192）
前立腺特異的膜抗原由来のＡ１エピトープクラスターであるＰＳＭＡ168-190（配列番号４）を含有するペプチドＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭ、すなわちＰＳＭＡ163-192（配列番号３）を、４３３Ａ ＡＢＩペプチド合成機により標準的な固相Ｆ−ｍｏｃ化学を用いて合成した。側鎖の脱保護および樹脂からの切り出しの後、まずギ酸中に溶解した後、３０％酢酸に希釈したペプチドを、以下の条件：４ｍｌ／分の流速で線形ＡＢ勾配（５％ Ｂ／分）（ここで、溶離液Ａは０．１％ＴＦＡ水であり、溶離液Ｂはアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡである）で、逆相分取ＨＰＬＣ Ｃ４カラムに流した。質量解析法により判断される場合の予測ペプチドを含有する１６．６４２分の時点の分画をプールして、凍結乾燥した。次に、本質的に上述に記載するように、ペプチドをプロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表１にまとめる。
【００４７】
【表１】
【００４８】
Ｎ末端プール配列解析
プロテアソーム消化の１時間の時点でのアリコット１つを、ＡＢＩ ４７３Ａタンパク質シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)によるＮ末端アミノ酸配列解析に付した。切断部位および切断効率の決定は、配列サイクル、タンパク質シーケンサーの反復収率、および解析配列中に特有のアミノ酸の相対収率に基づいていた。すなわち、特有の（解析配列中で）残基Ｘがｎ番目のサイクルのみに見られる場合、切断部位は、Ｎ末端方向でその前のｎ−１残基に存在する。配列に対する質量の帰属における任意の多義性を解析するのを助長するほかに、これらのデータはまた、質量解析法よりも、様々な断片の相対収率のより信頼性の高い指標を提供する。
【００４９】
ＰＳＭＡ163-192（配列番号３）に関して、このプールシーケンシングは、Ｖ177および幾つかの少量の切断部位後に、特にＹ179の１つ後に単一の主要切断部位を支持する。図１Ａ〜図１Ｃに呈示した結果を参照することにより、以下の：
基質のＮ末端の存在を示す３番目のサイクルのＳ、
基質のＮ末端の存在を示す５番目のサイクルのＱ、
Ｖ177後の切断を示す１番目のサイクルのＮ、
Ｖ175後の切断を示す３番目のサイクルのＮ（表１中の断片１７６−１９２に留意されたい）、
Ｖ177後の切断を示す５番目のサイクルのＴ、
Ｒ181、Ａ180、およびＹ179後のますます共通の切断を示す１〜３番目のサイクルのＴ（これらの最後のみが質量解析法により検出されるピークに相当する、１６３−１７９および１８０−１９２、表１参照。他のものの非存在は、それらが質量スペクトルで検査されたものよりも小さな断片上に存在することを示し得る）、
それぞれ、Ｅ183、Ｙ179、およびＶ177後の切断を示す４番目、８番目、および１０番目のサイクルのＫ（それらはすべて、質量解析法により観察される断片に相当する、表１参照）、
それぞれ、基質のＮ末端の存在、およびＶ177後の切断を示す１番目、および３番目のサイクルのＡ、
基質のＮ末端の存在を示す４番目、および８番目のサイクルのＰ、
基質のＮ末端の存在を示す６番目、および１０番目のサイクルのＧ
基質のＮ末端の存在、および／またはＦ185後の切断を示す７番目のサイクルのＭ、
Ｖ177後の切断を示す１５番目のサイクルのＭ、
Ｄ191後の切断を示すことができる１番目サイクル（表１参照）、
Ｖ177後の切断を示す４番目、および１３番目のサイクルのＲ、
Ｙ179後の切断を示す２番目、および１１番目のサイクルのＲ、
それぞれ、Ｖ175、Ｍ169後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す２番目、６番目、および１３番目のサイクルのＶ（表１の１７６および１７０から開始する断片に留意されたい）、
それぞれ、Ｖ175、Ｖ177後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す１番目、２番目、および１４番目のサイクルのＹ、
それぞれ、Ｖ177後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す１１番目、および１２番目のサイクルのＬ、
が明らかであり、他のデータとほとんど一致する解釈である。質量解析法の結果を比べることにより、２番目、５番目、および９番目のサイクルのＬは、それぞれＦ186、Ｅ183、またはＭ169、およびＹ179の切断と一致することがわかる。表１を参照されたい。
【００５０】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共通Ｃ末端の断片をさらなる解析のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ：
ＨＬＡ−Ａ２．１への候補エピトープＰＳＭＡ168-177、すなわちＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶ（配列番号６）の結合を、Stauss他の方法(Proc Natl Acad Sci USA 89(17):7871-5(1992))の変更形態を用いてアッセイした。具体的には、表面上でＭＨＣ分子を発現しないか、または不安定なＭＨＣ分子を発現するＴ２細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で２度洗浄し、３μｇ／ｍｌのヒトβ２ミクログロブリン(Sigma, St. Louis, MO)を補充し、かつ８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、および６．２５μｇ／ｍｌのペプチドを添加した無血清ＡＩＭ−Ｖ培地(Life Technologies社、 Rockville, MD)中で、３×１０5個の細胞／２００μｌ／ウェルにて９６ウェル平底プレート中で一晩培養した。再度ピペットで取ることによりペプチドを細胞と混合した後、プレートに分布させ（あるいはペプチドを個々のウェルに添加することができる）、プレートを２分間穏やかに振った。３７℃にて５％ＣＯ2インキュベータ中でインキュベーションを行った。翌日、無血清ＲＰＭＩ培地で２度洗浄することにより未結合ペプチドを除去し、飽和量の抗クラスＩ ＨＬＡモノクローナル抗体であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＨＬＡ Ａ２，Ａ２８(One Lambda, Canoga Park, CA)を添加した。４℃で３０分間インキュベーションした後、０．５％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４〜７．６）（染色緩衝液）で細胞を３回洗浄した（あるいは、Ｗ６／３２(Sigma)を、抗クラスＩ ＨＬＡモノクローナル抗体として使用し
、細胞を染色緩衝液で洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギＦ（ａｂ'）抗マウスＩｇＧ(Sigma)とともに４℃で３０分間インキュベートし、前述通りに３回洗浄することができる）。細胞を染色緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁させた。ペプチド結合により安定化される表面ＨＬＡ−Ａ２．１分子の解析を、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いてフローサイトメトリーにより実施した。フローサイトメトリーが即時に実施されない場合、１／４量の２％パラホルムアルデヒドを添加して、暗所で４℃にて保管することで細胞を固定することができる。
【００５３】
図２に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチドよりも一層低い濃度で有意な結合を示す。このアッセイで（および本開示全体にわたって）対照として使用したＭｅｌａｎ−ＡペプチドであるＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１０６）は、実際には自然配列（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号１０７）の変異体であり、このアッセイで高親和性を示す。既知のＡ２．１結合物質であるＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（ＨＢＶ18-27、配列番号１０７）もまた、陽性対照として使用した。ＨＬＡ−Ｂ４４結合ペプチドであるＡＥＭＧＫＹＳＦＹ（配列番号１０９）は、陰性対照として使用した。陰性対照から得られる蛍光は、ペプチドをアッセイで使用しなかった場合に得られるシグナルと類似していた。陽性および陰性対照ペプチドは、Current Protocols in Immunology p.18.3.2, Johon Wiley and Sons, New York, 1998の表１８．３．１から選択した。
【００５４】
実施例１．２
クラスター解析（ＰＳＭＡ281-310）
前立腺特異的膜抗原由来のＡ１エピトープクラスターであるＰＳＭＡ283-307（配列番号１９）を含有する別のペプチドＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧ、すなわちＰＳＭＡ281-310（配列番号１８）を、４３３Ａ ＡＢＩペプチド合成機により標準的な固相Ｆ−ｍｏｃ化学を用いて合成した。側鎖の脱保護および樹脂からの切り出しの後、ｄｄＨ２０中のペプチドを、以下の条件：４ｍｌ／分の流速で線形ＡＢ勾配（５％ Ｂ／分）（ここで、溶離液Ａは０．１％ＴＦＡ水であり、溶離液Ｂはアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡである）で、逆相分取ＨＰＬＣ Ｃ１８カラムに流した。質量解析法により判断される場合の予測ペプチドを含有する１７．０６１分の時点の分画をプールして、凍結乾燥した。次に、本質的に上述に記載するように、ペプチドをプロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表３にまとめる。
【００５５】
【表３】
【００５６】
Ｎ末端プール配列解析
プロテアソーム消化の１時間の時点でのアリコット１つ（上記実施例３．３参照）を、ＡＢＩ ４７３Ａタンパク質シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)によるＮ末端アミノ酸配列解析に付した。切断部位および切断効率の決定は、配列サイクル、タンパク質シーケンサーの反復収率、および解析配列中に特有のアミノ酸の相対収率に基づいていた。すなわち、特有の（解析配列中で）残基Ｘがｎ番目のサイクルのみに見られる場合、切断部位は、Ｎ末端方向でその前のｎ−１残基に存在する。配列に対する質量の帰属における任意の多義性を解析するのを助長するほかに、これらのデータはまた、質量解析法よりも、様々な断片の相対収率のより信頼性の高い指標を提供する。
【００５７】
ＰＳＭＡ281-310（配列番号１８）に関して、このプールシーケンシングは、少量の他の切断部位の中でもＶ287およびＩ297後の２つの主要な切断部位を支持する。図３に示した結果を参照することにより、以下の：
それぞれ、Ｖ287後の切断、および基質のＮ末端の存在を示す４番目、および１１番目のサイクルのＳ、
Ｖ287後の切断を示す８番目のサイクルのＨ（１０および１１から見られる高さの低下に対する位置９および１０でのピーク高さの減衰の欠如は、シーケンシング反応で潜伏を表すピークではなく、Ａ286およびＥ285後の切断も同様に支持することができる）、
それぞれ、Ｙ299、Ｉ297、およびＶ294後の切断を示す２番目、４番目、および７番目のサイクルのＤ（この最後の切断は、表４中の断片のいずれにおいても、あるいは以下の注釈における代替的帰属においても観察されない）、
Ｉ297後の切断を示す６番目のサイクルのＱ、
それぞれ、Ｙ299、およびＩ297後の切断を示す１０番目、および１２番目のサイクルのＭ、
とが明らかである。
【００５８】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共Ｃ末端の断片をさらなる研究のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表４に示す。
【００５９】
【表４】
【００６０】
表４に見られるように、エピトープに対する確証配列のＮ末端付加は、多くの場合、同じか、または異なるＭＨＣ制限要素にとって依然として有用であり、さらにはより良好なエピトープを生成することができる。例えばＨＬＡ−Ａ*０２０１との（Ｇ）ＬＰＳＩＰＶＨＰＩの対形成に留意されたい。ここではＨＬＡ−Ｂ７、−Ｂ*５１０１、およびＣｗ*０４０１に関するエピトープを創出するために、Ｎ末端調整(trimming)に依存することで幾つかのＭＨＣ型とともに有用なワクチンとして１０量体を使用することができる。
【００６１】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ：
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合研究を、上記実施例１．１に本質的に記載するように、ＰＳＭＡ288-297、すなわちＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号２１）を用いて実施した。図２に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチドよりも一層低い濃度で有意な結合を示す。
【００６２】
実施例１．３
クラスター解析（ＰＳＭＡ454-481）
前立腺特異的膜抗原由来のエピトープクラスターを含有する、別のペプチドＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＬＴＫＥＬ、すなわちＰＳＭＡ454-481（配列番号２８）を、ＭＰＳにより合成し（純度＞９５％）、上述に記載するように、プロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表５にまとめる。
【００６３】
【表５】
【００６４】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共通Ｃ末端の断片をさらなる研究のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ２．１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表６に示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
表６に見られるように、エピトープに対する確証配列のＮ末端付加は、多くの場合、同じか、または異なるＭＨＣ制限要素にとって依然として有用であり、さらにはより良好なエピトープを生成することができる。例えばＨＬＡ−Ｂ*２７０２／５との（Ｌ）ＲＶＤＣＴＰＬＭＹ（配列番号３５および（３６））の対形成に留意されたい。ここでは、１０量体は解離の実質的予測半減期を有し、共Ｃ末端の９量体は有さない。ＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶ（配列番号３０）の場合、エピトープを創出するために、Ｎ末端調整に依存することで、ＨＬＡ−Ｂ*５１０１とともに有用なワクチンとして使用することができる予測ＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープにも留意されたい。
【００６７】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ：
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合研究を、上記実施例１．１に本質的に記載するように、ＰＳＭＡ460-469、すなわちＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬ（配列番号３３）を用いて実施した。図４に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチドとして使用される既知のＡ２．１結合物質ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（ＨＢＶ18-27、配列番号１０８）と同程度にＨＬＡ−Ａ２．１を結合することがわかった。加えて、ＰＳＭＡ461-469（配列番号３２）もほぼ同様に結合する。
【００６８】
ＥＬＩＳＰＯＴ解析：ＰＳＭＡ463-471（配列番号３５）
ニトロセルロースで裏打ちしたマイクロタイタープレートのウェルを、コーティング緩衝液（３５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１５ｍＭ 炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中の４μｇ／ｍｌマウス抗ヒト−ＩＦＮモノクローナル抗体５０μｌ／ウェルを用いて、４℃で一晩
インキュベートすることで、捕捉抗体でコーティングした。未結合の抗体を、ＰＢＳで５分間、４回洗浄することで除去した。次に、膜上の未結合部位を、１０％血清を有するＲＰＭＩ培地２００μｌ／ウェルを添加して、室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。１：３の段階希釈物の抗原刺激ＣＤ８+Ｔ細胞を、１００μｌ／ウェルを用いてマイクロタイタープレートのウェルに播種し、２×１０5個の細胞／ウェルから開始した（先述の抗原刺激は、本質的にScheibenbogen, C. et al. Int. J. Cancer 71:932-936, 1997（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている）。ＰＳＭＡ462-471（配列番号３６）を最終濃度１０μｇ／ｍｌ、ＩＬ−２を最終濃度１００Ｕ／ｍｌとなるように添加し、細胞を５％ＣＯ2水飽和雰囲気下で３７℃にて４０時間培養した。このインキュベーション後、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン）２００μｌ／ウェルで６回、プレートを洗浄した。検出抗体であるＰＢＳ＋１０％ウシ胎児血清中の２ｇ／ｍｌビオチン化マウス抗ヒト−ＩＦＮモノクローナル抗体５０μｌ／ウェルを添加して、プレートを室温で２時間インキュベートした。未結合検出抗体を、ＰＢＳ−ツイーン２００μｌで４回洗浄することで除去した。アビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Pharmingen, San Diego, CA)１００μｌを各ウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。未結合酵素を、ＰＢＳ−ツイーン２００μｌで６回洗浄することで除去した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２．５ｍｌ中に３−アミノ−９−エチルカルバゾールの２０ｍｇタブレットを溶解させ、その溶液を０．０５Ｍ リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４７．５ｍｌに添加することで基質を調製した。３０％Ｈ2Ｏ2２５μｌを基質溶液に添加した直後に、１００μｌ／ウェルで基質を分布させ、室温でプレートをインキュベートした。発色（一般に１５〜３０分）後、プレートを水で洗浄することで反応を停止した。プレートを風乾し、立体顕微鏡を用いてスポットを計数した。
【００６９】
図５は、自家樹状細胞とペプチドとを有するＨＬＡ−Ａ１+ＣＤ８+Ｔ細胞の培養物中で予め生成されたＰＳＭＡ463-471（配列番号３５）反応性ＨＬＡ−Ａ１+ＣＤ８+Ｔ細胞の検出を示す。ペプチドなしの培養物からは反応性が検出されない（データは示さず）。この場合では、ペプチド反応性Ｔ細胞が２．２×１０4分の１〜６．７×１０4分の１の頻度で培養物に存在することが観察され得る。これがまさにＨＬＡ−Ａ１制限応答であるということは、抗ＨＬＡ−Ａ１モノクローナル抗体の、−ＩＦＮ産生を阻止する能力により実証される。図６を参照されたい。
【００７０】
実施例１．４
クラスター解析（ＰＳＭＡ653-687）
前立腺特異的膜抗原由来のＡ２エピトープクラスター、すなわちＰＳＭＡ660-681（配列番号３８）を含有する、別のペプチドＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹ、すなわちＰＳＭＡ653-687（配列番号３７）を、ＭＰＳにより合成し（純度＞９５％）、上述に記載するように、プロテアソーム消化および質量解析法に付した。質量スペクトルから目立ったピークを表７にまとめる。
【００７１】
【表７】
【００７２】
エピトープ同定
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはＮＩＨアルゴリズムによりＨＬＡを結合すると予測される８〜１０アミノ酸長の配列と共Ｃ末端の断片をさらなる研究のために選択した。手順の消化工程および予測工程は、任意の順序で有用に実施することができる。本明細書に記載のプロテアソーム消化に使用される基質ペプチドを、予測ＨＬＡ−Ａ２．１結合配列を包含するように具体的に設計したが、消化の実際の生成物を、他のＭＨＣ分子への実際の結合または予測結合に関する事実後に検査することができる。選択した結果を表８に示す。
【００７３】
【表８】
【００７４】
表８に見られるように、エピトープに対する確証配列のＮ末端付加は、同じか、または異なるＭＨＣ制限要素にとって依然として有用であり、さらにはより良好なエピトープを生成することができる。例えばＨＬＡ−Ａ*０２との（Ｒ）ＭＭＮＤＱＬＭＦＬ（配列番号３９および（４０））の対形成に留意されたい。ここでは、１０量体は実質的予測される結合の可能性を有している。
【００７５】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合研究を、上記実施例１．１に本質的に記載するように、ＰＳＭＡ663-671（配列番号３９）およびＰＳＭＡ662-671、すなわちＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬ（配列番号６７）を用いて実施した。図４、図７、および図８に見られるように、このエピトープは、陽性対照ペプチド（ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（ＨＢＶ18-27）、配列番号１０８）よりも一層低い濃度で有意な結合を示す。平行して行ってはいないが、対照との比較は、ＰＳＭＡ662-671（これは、親和性に関してＭｅｌａｎＡペプチドに似ている）がこれらの２つのＰＳＭＡペプチドのより優れた結合活性を有することを示唆する。
【実施例２】
【００７６】
多施設臨床研究を、本明細書中に開示する組成物を用いて実施する。研究の結果から、前記組成物が固形腫瘍を減量するのに、および概して抗血管新生活性を誘発するのに有用かつ有効であることがわかる。
【実施例３】
【００７７】
標的抗原反応性ＣＴＬの異種移植ヒト血管系モデル生成におけるＰＳＭＡ組成物の評価
Ａ．マウスのｉｎ ｖｉｖｏ免疫化
ＨＨＤ１トランスジェニックＡ*０２０１マウス(Pascolo, S., et al. J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997)を麻酔して、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）５０μｌで乳化させたＰＢＳ中にＰＳＭＡ288-297（配列番号２１）１００ｎｍｏｌおよびＨＴＬエピトープペプチド２０μｇを含有する１００μｌを用いて、外側尾静脈を避けて、尾の基部に皮下注射した。
【００７８】
Ｂ．刺激細胞（ＬＰＳ芽細胞）の調製
免疫化マウスの各群に関して２匹のナイーブマウスからの脾臓を用いて、非免疫化マウスを屠殺して、それらの胴体をアルコールに入れた。滅菌装置を用いて、マウスの左側（下中切開面）上の皮膚の最上部皮膚層を切り開いて、腹膜を露出させた。腹膜をアルコールで飽和させて、脾臓を無菌摘出した。脾臓を無血清培地の入ったペトリ皿に載せた。脾臓
をつぶすために３ｍｌシリンジからの滅菌プランジャーを用いて、脾細胞を単離した。細胞を無血清培地の入った５０ｍｌコニカル管中に収集し、皿を十分にすすいだ。細胞を遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、７分）、ＲＰＭＩで一度洗浄した。新鮮な脾細胞を、ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中に１ｍｌ当たり１×１０6個の細胞の濃度に再懸濁させた。２５ｇ／ｍｌリポ多糖および７μｇ／ｍｌ硫酸デキストランを添加した。Ｔ−７５フラスコ中で、３７℃にて５％ＣＯ2を用いて３日間、細胞をインキュベートした。脾臓芽細胞を５０ｍｌ管に収集し、ペレット化し（１２，０００ｒｐｍ、７分）、ＲＰＭＩ中に３×１０7個／ｍｌで再懸濁させた。芽細胞を、５０μｇ／ｍｌのプライミングペプチドを用いて室温で４時間パルス化し、２５μｇ／ｍｌで３７℃にて２０分間マイトマイシンＣ処理し、ＤＭＥＭで３回洗浄した。
【００７９】
Ｃ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激
芽細胞のＬＰＳ刺激の３日後、およびペプチド負荷と同じ日に、プライミングしたマウスを屠殺して（免疫化の１４日目）、上述のように脾臓を取り出した。３×１０6個の脾細胞を、１０％ＦＣＳ、５×１０-5Ｍβ（ベータ）−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００ＩＵ／ｍｌペニシリンを補充したＤＭＥＭ培地中で、３７℃にて、５％ＣＯ2を用いて、２４ウェルプレートにおいて１×１０6個のＬＰＳ芽細胞／ウェルとともに共存培養した。３日目に、培養物に５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣｏｎＡ上清を供給し、７日目には移入させることができる。ＣＴＬのアリコットはまた、活性を保証するための標準的なクロム放出アッセイで試験される。
【００８０】
移植および養子移入
ＥＧＭ−２ＶＭ培地１０μｌ(Clonetics, San Diego, CA)中の１×１０6個のテロメラーゼ形質転換ＨＤＭＥＣを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ(Becton Dickinson)０．５ｍｌと氷上で混合する。混合物を、ＳＣＩＤマウスの胸郭の腹側正中線に沿って２５ゲージ針により皮下注射する。１週間後、０．２ｍｌ中の１×１０7個のＴ細胞（標的エピトープ反応性または偽免疫化）を静脈内注射する（あるいは、それらを腹腔内注射することができる）。
【００８１】
評価（微小形態測定）
移入の１週間後および２週間後に、移植片を取り出し、１０％緩衝液中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、切片化する。抗ヒトＩＶ型コラーゲンＩｇＧおよび蛍光標識した二次抗体を用いたヒトの微細血管の免疫蛍光検出のために、脱パラフィン(deparaffinize)して、１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）中で薄い切片を２×７分間マイクロ波処理(micorwave)することで抗原を回復する。血管密度は、移植片１つ当たり少なくとも３つの切片から、５個の別個のランダムに選択した２０倍視野で観察される陽性染色された環状構造の平均数の関数として評価される。
【実施例４】
【００８２】
ＨＬＡトランスジェニックマウスモデルにおけるフィブロネクチンＥＤ−Ｂワクチン
Ａ．腫瘍の樹立
１０％血清を加えた完全ＲＰＭＩ中で成長させたＭ１腫瘍細胞を培養し、遠心分離により収集し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を５×１０6個の細胞／ｍｌでＰＢＳ中に懸濁させて、懸濁液０．５ｍｌ（初期継代）を腹部に皮下注射した。
【００８３】
Ｂ．ワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ２制限フィブロネクチンＥＤ−Ｂドメイン由来ハウスキーピングエプトープ、例えばＥＤ−Ｂ29-38（配列番号１０３）をコードするヌクレオチド配列を、適切なワクチンベクター（例えば、ｐＶＡＸ１(Invitrogen Inc, Carlsbad, CA)、または２００１年４月２８日に出願された「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS)」という表題の米国特
許出願第０９／５６１，５７２号に記載されるベクターの１つに挿入する。ＨＨＤ−Ａ２マウスに、ＰＢＳ中のベクター０μｇ、２μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、および２００μｇを、１日おきに８日間にわたって（４回注射）、各注射に関して側を交互に鼡径リンパに結節内注射する（マウスまたはマウス群当たり単回投与量）。一連の注射は、腫瘍細胞注射の日、その２週間前、ならびにその４週間後および１０週間後に始める。
【００８４】
Ｃ．評価
腫瘍注射のおよそ１２週間後に、ワクチンのかわりに賦形剤を施したマウスにおいて目に見える腫瘍が観察される。ワクチンの有効性を、同じ時間枠で腫瘍を発達させることができないワクチン接種した動物の比率、同じ時点での腫瘍の相対的大きさ、ワクチン接種した動物で腫瘍が出現するまでの遅延、および腫瘍の樹立を阻害または防止するのに必要とされる組成物サイクルの用量および組成物サイクル数として表す。
【００８５】
Ｄ．代替スケジュール
より攻撃的な後期継代Ｍ１細胞の利用性により、より短縮した実験スケジュールが可能である。代わりに、１×１０6個の細胞の腫瘍細胞接種の日、その１週間および２週間前、ならびに３日後または４日後に、マウスにワクチン接種する。ワクチンの有効性は、腫瘍細胞接種のおよそ１０日後に評価する。
【００８６】
Ｅ．ペプチドによる免疫化
完全フロイントアジュバント中のＥＤ−Ｂ２９−３８（配列番号１０３）でＨＨＤ−Ａ２マウスを免疫化し、脾臓細胞を回集し、標準的な方法論を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。生じたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋であるペプチドパルス化Ｔ２細胞を特異的に溶解することが可能であった（図９）。
【実施例５】
【００８７】
エピトープおよびエピトープクラスター
表９〜１８は、本発明による組成物の構築において有用であり得るＰＳＭＡおよびＥＤ−Ｂ由来のエピトープならびにエピトープクラスターを開示する。
【００８８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連新生血管系に対する細胞性免疫応答を誘導するための免疫原性組成物であって、
前記組成物は、腫瘍関連新生血管系によって発現される抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含む、
組成物。
【請求項２】
前記免疫原はレシピエントと同種の細胞に関連しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原はタンパク質である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原は、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫原は少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのペプチドはハウスキーピングエピトープを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのペプチドは、前記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
免疫エピトープを含む少なくとも１つのペプチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原の少なくとも一部の発現を付与することが可能な核酸を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
腫瘍関連抗原に相当する少なくとも１つの第２免疫原をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原に由来する少なくとも１つの免疫エピトープを含む第２免疫原をさらに含む、請求項8又は９に記載の組成物。
【請求項１５】
新生血管抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に相当する少なくとも一つの免疫原を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現されるものであり、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメイン（ＥＤ−Ｂ）及び血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）からなる群から選択される、
医薬。
【請求項１６】
血管新生抗原と腫瘍関連抗原に対して誘導された細胞性免疫応答を通じた腫瘍性疾患の
治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に相当する少なくとも１つの第１免疫原と腫瘍関連抗原に相当する少なくとも１つの第２免疫原を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現される、
医薬。
【請求項１７】
血管新生抗原に対して誘導された細胞性免疫応答を通じた腫瘍性疾患の治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に由来する少なくとも１つのハウスキーピングエピトープを含む第１免疫原と前記新生血管抗原に由来する少なくとも１つの免疫エピトープを含む第２免疫原を含み、
前記新生血管抗原は腫瘍関連新生血管系によって発現される、
医薬。
【請求項１８】
血管新生抗原に対して誘導された細胞性免疫応答を通じた腫瘍性疾患の治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に由来する少なくとも１つのハウスキーピングエピトープを含む免疫原を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現される、
医薬。
【請求項１９】
前記免疫原はレシピエントと同種の細胞に関連しない、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２０】
前記免疫原は、タンパク質又はそのフラグメントを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２１】
前記新生血管抗原は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項１５〜１8のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２２】
前記新生血管抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２３】
前記血管新生抗原は、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２４】
前記免疫原は、前記タンパク質の配列に由来する少なくとも１つのペプチドを含む、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのペプチドはハウスキーピングエピトープを含む、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのペプチドは、前記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端である、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのペプチドは免疫エピトープを含む、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２８】
前記免疫原の少なくとも一部の発現を付与することが可能な核酸を含む、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２９】
前記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含む、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項３０】
前記第１免疫原と前記第２免疫原は同一である、請求項１７に記載の医薬。
【請求項３１】
前記医薬が、癌性細胞に対して直接的に活性な抗腫瘍療法剤として使用するためのものである、請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項３２】
前記抗腫瘍療法剤は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導する、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
前記細胞性免疫応答は検出される、請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項３４】
前記細胞性免疫応答の検出は、腫瘍増殖抑制、腫瘍サイズの縮小、腫瘍転移の抑制又は哺乳動物の平均余命の延長の検出を含む、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
前記細胞性免疫応答の検出は、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、免疫蛍光アッセイ、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、エリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイ及び哺乳動物の健康状態の観察からなる群から選択されるアッセイを含む、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３６】
腫瘍性疾患の治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するための手段を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現され、
前記血管新生抗原は、前立腺特異的抗原（ＰＳＭＡ）、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメイン（ＥＤ−Ｂ）及び血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）からなる群から選択される、
医薬。
【請求項１】
腫瘍関連新生血管系に対する細胞性免疫応答を誘導するための免疫原性組成物であって、
前記組成物は、腫瘍関連新生血管系によって発現される抗原に相当する少なくとも１つの免疫原を含む、
組成物。
【請求項２】
前記免疫原はレシピエントと同種の細胞に関連しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原はタンパク質である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原は、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫原は少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのペプチドはハウスキーピングエピトープを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのペプチドは、前記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
免疫エピトープを含む少なくとも１つのペプチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原の少なくとも一部の発現を付与することが可能な核酸を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
腫瘍関連抗原に相当する少なくとも１つの第２免疫原をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原に由来する少なくとも１つの免疫エピトープを含む第２免疫原をさらに含む、請求項8又は９に記載の組成物。
【請求項１５】
新生血管抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に相当する少なくとも一つの免疫原を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現されるものであり、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメイン（ＥＤ−Ｂ）及び血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）からなる群から選択される、
医薬。
【請求項１６】
血管新生抗原と腫瘍関連抗原に対して誘導された細胞性免疫応答を通じた腫瘍性疾患の
治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に相当する少なくとも１つの第１免疫原と腫瘍関連抗原に相当する少なくとも１つの第２免疫原を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現される、
医薬。
【請求項１７】
血管新生抗原に対して誘導された細胞性免疫応答を通じた腫瘍性疾患の治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に由来する少なくとも１つのハウスキーピングエピトープを含む第１免疫原と前記新生血管抗原に由来する少なくとも１つの免疫エピトープを含む第２免疫原を含み、
前記新生血管抗原は腫瘍関連新生血管系によって発現される、
医薬。
【請求項１８】
血管新生抗原に対して誘導された細胞性免疫応答を通じた腫瘍性疾患の治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に由来する少なくとも１つのハウスキーピングエピトープを含む免疫原を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現される、
医薬。
【請求項１９】
前記免疫原はレシピエントと同種の細胞に関連しない、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２０】
前記免疫原は、タンパク質又はそのフラグメントを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２１】
前記新生血管抗原は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項１５〜１8のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２２】
前記新生血管抗原はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２３】
前記血管新生抗原は、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２４】
前記免疫原は、前記タンパク質の配列に由来する少なくとも１つのペプチドを含む、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのペプチドはハウスキーピングエピトープを含む、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのペプチドは、前記ハウスキーピングエピトープと共通Ｃ末端である、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのペプチドは免疫エピトープを含む、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２８】
前記免疫原の少なくとも一部の発現を付与することが可能な核酸を含む、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２９】
前記細胞性免疫応答はＣＴＬ応答を含む、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項３０】
前記第１免疫原と前記第２免疫原は同一である、請求項１７に記載の医薬。
【請求項３１】
前記医薬が、癌性細胞に対して直接的に活性な抗腫瘍療法剤として使用するためのものである、請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項３２】
前記抗腫瘍療法剤は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導する、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
前記細胞性免疫応答は検出される、請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項３４】
前記細胞性免疫応答の検出は、腫瘍増殖抑制、腫瘍サイズの縮小、腫瘍転移の抑制又は哺乳動物の平均余命の延長の検出を含む、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
前記細胞性免疫応答の検出は、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、免疫蛍光アッセイ、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、エリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイ及び哺乳動物の健康状態の観察からなる群から選択されるアッセイを含む、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３６】
腫瘍性疾患の治療のための医薬であって、
前記医薬は新生血管抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するための手段を含み、
前記新生血管抗原は、腫瘍関連新生血管系によって発現され、
前記血管新生抗原は、前立腺特異的抗原（ＰＳＭＡ）、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメイン（ＥＤ−Ｂ）及び血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）からなる群から選択される、
医薬。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−９８９８０（Ｐ２０１１−９８９８０Ａ）
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４３０７（Ｐ２０１１−２４３０７）
【出願日】平成２３年２月７日（２０１１．２．７）
【分割の表示】特願２００２−５６９０８５（Ｐ２００２−５６９０８５）の分割
【原出願日】平成１４年３月７日（２００２．３．７）
【出願人】（５０３２０８５５２）マンカインド コーポレイション (50)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月７日（２０１１．２．７）
【分割の表示】特願２００２−５６９０８５（Ｐ２００２−５６９０８５）の分割
【原出願日】平成１４年３月７日（２００２．３．７）
【出願人】（５０３２０８５５２）マンカインド コーポレイション (50)
【Ｆターム（参考）】
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